JPWO2017179660A1 - マイクロrna−143誘導体 - Google Patents
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Abstract
Description
また、第1鎖が配列番号3記載の配列であり、かつ、3’末端修飾を有さず、第2鎖が配列番号4(つまり、SEQ−01の第2鎖の3’末端の2塩基が欠失)であり、かつ、3’末端修飾を有する本発明のmiR-143誘導体(実施例中のSEQ−10〜12、19〜21、24〜144)が、SEQ−01以上の腫瘍増殖抑制効果を示し、天然型のmiR-143や他のmiR-143誘導体(実施例中のSEQ−02〜04、07〜09、13〜18)と比較して、優れた細胞増殖抑制効果を示すことを見出した(図1〜3、表13)。本発明のmiR-143誘導体は、核酸医薬品、特に癌の治療又は悪性化の抑制のための医薬として非常に有用である。
(I−1)第1鎖が
配列番号3記載の配列、又は、
配列番号3記載の配列において、1若しくは2塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、3’末端修飾は有さず、5’末端修飾を有していてもよく、
第2鎖が
配列番号4記載の配列、若しくは、
配列番号4記載の配列において、1若しくは2塩基が置換、欠失若しくは挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、3’末端修飾を有し、5’末端修飾を有していてもよく、
又は
配列番号5記載の配列、若しくは、
配列番号5記載の配列において、1若しくは2塩基が置換若しくは挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、3’末端修飾は有さず、5’末端修飾を有していてもよく、
ここで、
3’末端修飾は、ヌクレオシド誘導体及び/若しくは修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよい1〜5merのオリゴヌクレオチド誘導体又はベンゼン‐ピリジン誘導体であり、
5’末端修飾は、リン酸エステル部分又は式:=CQ1−P(=O)(OH)2(式中、Q1は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。)で示される基である、
マイクロRNA−143誘導体。
(I−2)第1鎖が、配列番号3記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖が、配列番号4又は5記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、(I−1)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(I−3)オリゴヌクレオチド誘導体が、1又は2merである、(I−1)又は(I−2)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(I−4)該ヌクレオシド誘導体が、
糖の2’位に置換基を有するヌクレオシド、又は
糖の4’位と2’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである、(I−1)〜(I−3)記載いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体。
(I−5)該置換基が、F、OCH3又はOCH2CH2OCH3である、(I−4)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(I−6)該架橋構造が、4’−(CH2)m−O−2’(mは1〜4の整数)又は4’−C(=O)−NR3−2’(R3は、水素原子又はアルキルである)である、(I−4)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(I−7)修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、(I−1)〜(I−6)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体。
(I−8)SEQ−12、SEQ−19、SEQ−29、SEQ−51、SEQ−52、SEQ−56、SEQ−60、SEQ−73、SEQ−74、SEQ−86、SEQ−89、SEQ−94、SEQ−106、SEQ−122、SEQ−123、SEQ−124、SEQ−127、SEQ−139、SEQ−140、SEQ−141、SEQ−142、SEQ−143及びSEQ−144からなる群から選択される、(I−1)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(I−9)(I−1)〜(I−8)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体を含有する医薬組成物。
(I−11)配合剤である、(I−10)記載の医薬。
(I−12)(I−1)〜(I−8)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体及びEGFR阻害剤が併用されることを特徴とする、(I−10)記載の医薬。
(I−13)(I−1)〜(I−8)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体及びEGFR阻害剤が同時又は順次に投与されることを特徴とする、(I−12)記載の医薬。
(I−14)(I−1)〜(I−8)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体及びEGFR阻害剤が別々に投与されることを特徴とする、(I−12)記載の医薬。
(I−15)EGFR阻害剤が、セツキシマブである、(I−10)〜(I−14)いずれかに記載の医薬。
(I−16)癌の治療又は悪性化の抑制のために用いられる、(I−10)〜(I−15)いずれかに記載の医薬。
(I−17)(I−1)〜(I−8)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体を含有する、EGFR阻害剤の癌の治療効果の増強剤。
(I−18)EGFR阻害剤を含有する、(I−1)〜(I−8)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体の癌の治療効果の増強剤。
(I−19)(I−1)〜(I−8)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体を有効成分として含む、EGFR阻害剤と併用するための医薬組成物。
(I−20)EGFR阻害剤を有効成分として含む、(I−1)〜(I−8)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体と併用するための医薬組成物。
(I−21)癌の治療又は悪性化の抑制のために用いられる、(I−19)又は(I−20)記載の医薬組成物。
(II−1)第1鎖がヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であるRNAオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖がヌクレオシド誘導体及び/又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖の3’末端に、式:dX1dX2(ここで、X1又はX2は、それぞれ独立してA、G、C又はTである)で示される基又はベンゼン‐ピリジン誘導体が結合している
マイクロRNA−143誘導体。
(II−2)ヌクレオシド誘導体が、
糖の2’位に置換基を有するヌクレオシド及び/又は
糖の4’位と2’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである、(II−1)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(II−3)該置換基が、F、OCH3又はOCH2CH2OCH3である、(II−2)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(II−4)該架橋構造が、4’−(CH2)m−O−2’(mは1〜4の整数)又は4’−C(=O)−NR3−2’(R3は、水素原子又はアルキルである)である、(II−2)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(II−5)修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、(II−1)〜(II−4)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体。
(II−6)第2鎖の5’末端に、リン酸エステル部分が結合している、(II−1)〜(II−5)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体。
(II−7)X1及びX2が、Tである、(II−1)〜(II−6)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体。
(II−8)第1鎖が、配列番号1若しくは3に記載の配列、又は、
配列番号1若しくは3に記載の配列において、1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び/若しくは付加された配列を含む
30塩基以下のオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖が、配列番号2若しくは4に記載の配列、又は、
配列番号2若しくは4に記載の配列において、1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び/若しくは付加された配列を含む
30塩基以下のオリゴヌクレオチドである、
(II−1)〜(II−7)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体。
(II−9)第1鎖が配列番号3記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖が配列番号4記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、(II−8)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(II−10)(II−1)〜(II−9)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体を含有する医薬組成物。
第2鎖が配列番号5記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、マイクロRNA−143誘導体。
(II−12)(II−11)記載のマイクロRNA−143誘導体を含有する医薬組成物。
(II−14)配合剤である、(II−13)記載の医薬。
(II−15)(II−1)〜(II−9)及び(II−11)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体及びEGFR阻害剤が併用されることを特徴とする、(II−13)記載の医薬。
(II−16)(II−1)〜(II−9)及び(II−11)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体及びEGFR阻害剤が同時又は順次に投与されることを特徴とする、(II−15)記載の医薬。
(II−17)(II−1)〜(II−9)及び(II−11)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体及びEGFR阻害剤が別々に投与されることを特徴とする、(II−15)記載の医薬。
(II−18)EGFR阻害剤が、セツキシマブである、(II−13)〜(II−17)いずれかに記載の医薬。
(II−19)癌の治療又は悪性化の抑制のために用いられる、(II−13)〜(II−18)いずれかに記載の医薬。
(II−20)(II−1)〜(II−9)及び(II−11)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体を含有する、EGFR阻害剤の癌の治療効果の増強剤。
(II−21)EGFR阻害剤を含有する、(II−1)〜(II−9)及び(II−11)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体の癌の治療効果の増強剤。
(II−22)(II−1)〜(II−9)及び(II−11)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体を有効成分として含む、EGFR阻害剤と併用するための医薬組成物。
(II−23)EGFR阻害剤を有効成分として含む、(II−1)〜(II−9)及び(II−11)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体と併用するための医薬組成物。
(II−24)癌の治療又は悪性化の抑制のために用いられる、(II−22)又は(II−23)記載の医薬組成物。
本発明においては、当該分野で公知の遺伝子操作方法の使用が可能である。例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2003)に記載された方法等が挙げられる。
オリゴヌクレオチドとは、同一又は異なるヌクレオシドがヌクレオシド間結合で複数個結合したヌクレオチドを意味する。
(式中、BX1(核酸塩基)は、アデニン、グアニン、シトシン又はチミンである。)
「天然のRNAヌクレオシド」とは、以下を意味する。
(式中、BX2(核酸塩基)は、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルである。)
国際公開第98/39352号、国際公開第99/014226号、国際公開第2000/056748号、国際公開第2005/021570号、国際公開第2003/068795号、国際公開第2011/052436号、国際公開第2004/016749号、国際公開第2005/083124号、国際公開第2007/143315号、国際公開第2009/071680号、国際公開第2014/112463号、国際公開第2014/126229号等。
また、例えば、以下の糖の4’位と2’位との間の架橋構造が挙げられる。
4’−(CR1R2)m−O−2’、4’−(CR1R2)m−S−2’、4’−(CR1R2)m−O−C(=O)−2’、4’−(CR1R2)m−NR3−O−(CR1R2)m1−2’、4’−(CR1R2)m1-C(=O)−NR3−2’ 、4’−(CR1R2)m2-C(=O)−NR3−Y4−2’、4’−(CR1R2)m1−SO2−NR3−2’、4’−(CR1R2)m−NR3−2’又は
であり、
ここで、
Y4は、O、S、NH又はCH2であり、
R1は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
R2は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
R3は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の芳香族複素環アルキル又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環アルキルであり、
Y1はCR4又はNであり、
Y2はCR5又はNであり、
Y3はCR6又はNであり、
R4、R5及びR6はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換のアミノ、置換若しくは非置換のアルキルオキシ、置換若しくは非置換のアルキルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルケニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキルカルバモイル、置換若しくは非置換のアルケニルカルバモイル又は置換若しくは非置換のアルキニルカルバモイルであり、
mは、1〜4の整数であり、
m1は、0〜3の整数であり、
m2は、0又は1である。
α群は、ヒドロキシ基、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。
ここで、
R1は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
R2は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
R3は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
mは、1〜4の整数であり、
m1は、0〜2の整数である。
4’−(CH2)m−O−2’(mは1〜4の整数)の中で、特に好ましくは4’−CH2−O−2’(LNA、Locked nucleic acid)である。具体例及びその調製方法は、国際公開第98/39352号、国際公開第2003/068795号、国際公開第2005/021570号等に記載されている。
4’−C(=O)−NR3−2’(R3は、水素原子又はアルキルである)の中で、特に好ましくは4’−C(=O)−NCH3−2’である。具体例及びその調製方法は、国際公開第2011/052436号に記載されている。
(式中、BX3は、修飾されていてもよい核酸塩基である。)
で示される糖が開環した基も含まれる。その他、2’,5’−RNA(Biochemistry 1998, 37, 7478−7486)も含まれる。
「アルキル」の好ましい態様として、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチルが挙げられる。さらに好ましい態様として、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、tert−ブチルが挙げられる。
「アルケニル」の好ましい態様として、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニルが挙げられる。
「アルキニル」の好ましい態様として、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルが挙げられる。
「アルキルカルボニルアミノ」、「アルケニルカルボニルアミノ」又は「アルキニルカルボニルアミノ」とは、それぞれアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル又はアルキニルカルボニルがアミノ基の窒素原子と結合している水素原子1個又は2個と置き換わった基を意味する。2個の場合、2つのアルキルカルボニル基、アルケニルカルボニル基又はアルキニルカルボニル基は、同一でも異なっていてもよい。
「アルキルカルバモイル」、「アルケニルカルバモイル」又は「アルキニルカルバモイル」とは、それぞれアルキル、アルケニル又はアルキニルがカルバモイル基の窒素原子と結合している水素原子1個又は2個と置き換わった基を意味する。2個の場合、2つのアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は、同一でも異なっていてもよい。
置換基:ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。なお、上記α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。
「芳香族炭素環式基」の好ましい態様として、フェニルが挙げられる。
さらに、「非芳香族炭素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
単環の非芳香族炭素環式基としては、炭素数3〜16が好ましく、より好ましくは炭素数3〜12、さらに好ましくは炭素数4〜8である。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル等が挙げられる。
2環以上の非芳香族炭素環式基としては、例えば、インダニル、インデニル、アセナフチル、テトラヒドロナフチル、フルオレニル等が挙げられる。
2環以上の芳香族複素環式基は、単環又は2環以上の芳香族複素環式基に、上記「芳香族炭素環式基」及び/又は「非芳香族炭素環式基」における環が縮合したものも包含する。
単環の芳香族複素環式基としては、5〜8員が好ましく、より好ましくは5員又は6員である。例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル等が挙げられる。
2環の芳香族複素環式基としては、例えば、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、プリニル、プテリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジル、トリアゾロピリジル、イミダゾチアゾリル、ピラジノピリダジニル、オキサゾロピリジル、チアゾロピリジル等が挙げられる。
3環以上の芳香族複素環式基としては、例えば、カルバゾリル、アクリジニル、キサンテニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、ジベンゾフリル等が挙げられる。
2環以上の非芳香族複素環式基は、単環又は2環以上の非芳香族複素環式基に、上記「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」及び/又は「芳香族複素環式基」におけるそれぞれの環が縮合したものも包含する。
さらに、「非芳香族複素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
単環の非芳香族複素環式基としては、3〜8員が好ましく、より好ましくは5員又は6員である。例えば、ジオキサニル、チイラニル、オキシラニル、オキセタニル、オキサチオラニル、アゼチジニル、チアニル、チアゾリジニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロチアゾリル、テトラヒドロチアゾリル、テトラヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジニル、ヘキサヒドロアゼピニル、テトラヒドロジアゼピニル、テトラヒドロピリダジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ジオキソラニル、ジオキサジニル、アジリジニル、ジオキソリニル、オキセパニル、チオラニル、チイニル、チアジニル等が挙げられる。
2環以上の非芳香族複素環式基としては、例えば、インドリニル、イソインドリニル、クロマニル、イソクロマニル等が挙げられる。
「非芳香族複素環」の環上の置換基としては、次の置換基が挙げられる。環上の任意の位置の原子が次の置換基から選択される1以上の基と結合していてもよい。
置換基:ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルオキシアルキル、アルキルオキシアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル、非芳香族複素環アルキル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、芳香族複素環アルキルオキシアルキル、非芳香族複素環アルキルオキシアルキル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。なお、上記α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよい。
(式中、X1及びX2は、それぞれ独立してアデニン、グアニン、シトシン又はチミンである。Y1及びY2は、それぞれ独立してO又はSである。)
(式中、X3及びX4は、それぞれ独立してN又はCHを意味し、Zは、
であり、Y3及びY’は、それぞれ独立してO又はSである。)
具体例及びその調製方法は、特許文献1、国際公開第2011/071078号等に記載されている。
本発明は下記「miR-143誘導体(I)」を包含する。
(I)第1鎖が
配列番号3記載の配列、又は、
配列番号3記載の配列において、1若しくは2塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、3’末端修飾は有さず、5’末端修飾を有していてもよく、
第2鎖が
配列番号4記載の配列、若しくは、
配列番号4記載の配列において、1若しくは2塩基が置換、欠失若しくは挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、3’末端修飾を有し、5’末端修飾を有していてもよく、
又は
配列番号5記載の配列、若しくは、
配列番号5記載の配列において、1若しくは2塩基が置換若しくは挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、3’末端修飾は有さず、5’末端修飾を有していてもよく、
ここで、
3’末端修飾は、ヌクレオシド誘導体及び/若しくは修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよい1〜5merのオリゴヌクレオチド誘導体又はベンゼン‐ピリジン誘導体であり、
5’末端修飾は、リン酸エステル部分又は式:=CQ1−P(=O)(OH)2(式中、Q1は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。)で示される基である、
マイクロRNA−143誘導体。
(A)第1鎖がヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であるRNAオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖がヌクレオシド誘導体及び/又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖の3’末端に、式:dX1dX2(ここで、X1又はX2は、それぞれ独立してA、G、C又はTである)で示される基又はベンゼン‐ピリジン誘導体が結合している
マイクロRNA−143誘導体。
第1鎖が、配列番号1若しくは3に記載の配列、又は、
配列番号1若しくは3に記載の配列において、1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び/若しくは付加された配列
を含む30塩基以下のオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖が、配列番号2若しくは4に記載の配列、又は、
配列番号2若しくは4に記載の配列において、1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び/若しくは付加された配列
を含む30塩基以下のオリゴヌクレオチドである。
miR-143誘導体(A)の第2鎖のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド誘導体及び/又は修飾ヌクレオシド間結合を1以上含む。
(式中、Xは水素又はOHであり、BX3は、修飾されていてもよい核酸塩基である。)
で示される基も挙げられる。ヌクレオチド誘導体として「Abasic」を用いる場合は、核酸塩基が存在しないことから、塩基配列上、該当箇所の塩基は欠失する。
例えば、第1鎖(センス鎖)のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズする部位が、第2鎖(アンチセンス鎖)のオリゴヌクレオチドの相補配列と少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、もっとも好ましくは95%以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。ここで、相同性は、例えば、Altschulら(The Journal of Molecular Biology,215,403−410(1990))の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムBLASTを用いることにより、スコアで類似度が示される。
天然型のヒトmiR-143の二本鎖オリゴヌクレオチド(配列番号1及び配列番号2)は4箇所のミスマッチを有している。特許文献1に記載のように、該ミスマッチ配列のうちセンス鎖の少なくとも1〜3箇所をマッチさせ、活性を向上させることもでき得る。miR-143誘導体(I)のミスマッチ数として、特に好ましくは、天然型のヒトmiR-143のミスマッチを含めて3〜5個である。
(式中、BX3は、修飾されていてもよい核酸塩基である。)
で示される基も挙げられる。ヌクレオチド誘導体として「Abasic」を用いる場合は、核酸塩基が存在しないことから、塩基配列上、該当箇所の塩基は欠失する。
miR-143誘導体(A)は、第2鎖のオリゴヌクレオチドの3’末端に、式:dX1dX2(ここで、X1又はX2は、それぞれ独立してA、G、C又はTである)で示される基又はベンゼン‐ピリジン誘導体が結合している。
式:dX1dX2として好ましくは、
(式中、X1及びX2は、それぞれ独立してアデニン、グアニン、シトシン又はチミンである。Y1及びY2は、それぞれ独立してO又はSである。)で示される基である。さらに好ましくは、X1及びX2が、チミン(T)であり、Y1及びY2はSである。
また、miR-143誘導体(A)の第2鎖のオリゴヌクレオチドの5’末端はリン酸エステル部分が結合していてもよい。
5’末端修飾がリン酸エステル部分の場合、オリゴヌクレオチドの5’末端の水酸基にリン酸エステル部分が結合する。
5’末端修飾が式:=CQ1−P(=O)(OH)2(式中、Q1は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。)で示される基の場合、以下の様にオリゴヌクレオチドに結合する。Q1として好ましくは、水素、ハロゲン、アルキル又はアルキルオキシであり、特に好ましくは水素又はハロゲンである。
(式中X’は、水素、OH、F、OCH3又はOCH2CH2OCH3であり、Q1は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。)
「リン酸エステル部分」とは、リン酸エステル並びに修飾リン酸エステルが含まれる、末端リン酸基を意味する。具体的には、式:−P(=O)(OH)2で示される基又はその修飾基である。つまり、O及びOHの1以上が、H、O、S、N(R’)(ここでR’は、H、アミノ保護基又は置換若しくは非置換のアルキルである)又はアルキルで置換されていてもよい。リン酸エステル部分は、置換又は非置換の1〜3のリン酸基を含んでいてもよい。
(B)第1鎖が配列番号3記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、かつ、
第2鎖が配列番号5記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、マイクロRNA−143誘導体。
第1鎖及び第2鎖共に、好ましくは、RNAオリゴヌクレオチドである。また、ヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合が好ましい。
よって、本発明のmiR-143誘導体として、特に以下のmiR-143誘導体が好ましいと考えられる。
(III−1)第1鎖が
配列番号3記載の配列において、5位、7位、15位、22位の核酸塩基のうち1塩基が置換された配列、又は、
配列番号3記載の配列において、5位、7位、15位、22位以外の核酸塩基のうち1塩基が置換された配列
からなるオリゴヌクレオチドである、(I−1)記載のマイクロRNA−143誘導体。
よって、本発明のmiR-143誘導体として、特に以下のmiR-143誘導体が好ましいと考えられる。
(IV−1)第1鎖が
配列番号3記載の配列、又は、
配列番号3記載の配列において、1若しくは2塩基が置換された配列
からなる修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよいRNAオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖が
配列番号4記載の配列からなるヌクレオシド誘導体及び/又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドである、(I−1)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(V−1)第1鎖が
配列番号3記載の配列、又は、
配列番号3に記載の配列において、1若しくは2塩基が置換された配列
からなるヌクレオシド誘導体及び/又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖が
配列番号4記載の配列からなり、
該配列中全てのヌクレオシドがヌクレオシド誘導体からなり、修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよいオリゴヌクレオチドである、(I−1)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(VI−1)第1鎖が
配列番号3記載の配列、又は、
配列番号3に記載の配列において、1若しくは2塩基が置換された配列
からなる修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよいオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖が
配列番号4記載の配列からなる
修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよいオリゴヌクレオチドであり、
該オリゴヌクレオチドのピリミジン塩基を有するヌクレオシドは全て同一種類のヌクレオシド誘導体であり、プリン塩基を有するヌクレオシドは全てRNAヌクレオシドである、(I−1)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(VI−2)該ヌクレオシド誘導体が、糖の2’位に置換基を有するヌクレオシドであり、該置換基が、F又はOCH3である、(VI−1)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(VII−1)第2鎖が
配列番号4記載の配列からなり、
配列番号4の3’末端から1〜6番目までの修飾ヌクレオシド間結合の少なくとも1以上がホスホロチオエート結合であるオリゴヌクレオチドである、(I−1)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(VII−2)配列番号4の3’末端から1〜6番目までの修飾ヌクレオシド間結合の少なくとも3以上がホスホロチオエート結合である、(VII−1)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(VII−3)配列番号4の3’末端から1〜6番目までの修飾ヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエート結合である、(VII−1)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(VII−4)配列番号4の5’末端から2〜14位に位置する修飾ヌクレオシド間結合に、式:N’^N’*(式中、N’はヌクレオシド、^は−P(S)OH−を、*は―P(O)OH−を意味する。)で示される形式を連続して1〜7個有するオリゴヌクレオチドである、(VII−1)〜(VII−3)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体。
(VII−5)式:N’^N’*で示される形式を連続して7個有する、(VII−4)記載のマイクロRNA−143誘導体。
(VII−6)第2鎖が5’末端修飾を有する、(VII−1)〜(VII−5)いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体。
Nature Review Drug Discovery, 13, 622−638(2014)
特許文献1、国際公開第2010/050328号、国際公開第2011/064130号、国際公開第2011/153542号、国際公開第2013/163258号、国際公開第2013/192486号等。
経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
非経口、硬膜下腔、又は、脳室内投与用組成物としては、バッファー、希釈剤及びその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
公知の抗腫瘍剤としては、具体的には、タキサン類(例えば、パクリタキセル、ドセタキセル)等の微小管作用薬、アルキル化剤(例えば、イホスファミド、シクロホスファミド)、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、フルオロウラシル)、抗腫瘍性抗生物質(例えば、マイトマイシンC、アドリアマイシン)、抗腫瘍性抗体・分子標的薬(例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、メシル酸イマチニブ)、その他の抗腫瘍剤(例えば、シスプラチン、ニブルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ)等が挙げられる。
EGFR阻害剤は、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤又はEGFR標的の細胞外ドメインを標的とするものが挙げられる。好ましくは、抗EGFR抗体、さらに好ましくは、モノクローナル抗体である。具体的には、チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ)、又はEGFR細胞外ドメインを標的とする分子(例えば、セツキシマブ、パニツムマブ)等が挙げられる。
(I−20)及び(II−23)に記載の「EGFR阻害剤を有効成分として含む、miR-143誘導体と併用するための医薬組成物」には、同一パッケージ内に、EGFR阻害剤を含む医薬組成物、及び、miR-143誘導体を併用する使用方法を記載した添付文書を含むキットが包含される。
固相合成
すべてのオリゴヌクレオチドは、DNA自動合成装置nS−8(Gene Design Inc.)を用いて、1umolスケールにてホスホロアミダイト法により合成した。モノマーは標準的な保護基を有するRNAアミダイト、2’F−RNAアミダイト、2’OMe−RNAアミダイト(すべてProligo Reagentsより購入)を用いて、0.1Mアセトニトリル溶液に調製した。カップリング時間は5分間とし、1つのモノマーの縮合に10当量のアミダイト体を用いた。PO酸化には0.02mol/Lヨウ素(テトラヒドロフラン/水/ピリジン/ヨウ素=90.54/9.05/0.41/0.43(v/v/v/w)を使用し、PS酸化には0.05mol/L[(ジメチルアミノ―メチリデン)アミノ]―3H−1,2,4―ジチアゾリン―3−チオン(DDTT)のアセトニトリル/ピリジン1/4(v/v)溶液を用いた。
RNA含有オリゴヌクレオチド(S−1〜3、7、8、AS−1〜3)の切り出しは28%アンモニア水/メチルアミン/エタノール=6/1/3(v/v)を用いて、室温下で24時間振とうした。樹脂を50%エタノール水で洗浄後、ろ過液を減圧下で濃縮した後、凍結乾燥にて白色粉末を得た。
その他オリゴヌクレオチド(S−4、9、10、AS−4、7)の切り出しは28%アンモニア水/40%メチルアミン水溶液/エタノール混液7/1/2(v/v)を用いて、室温下で15時間振とうした。樹脂を50%エタノール水で洗浄後、減圧下で濃縮した。
得られた白色粉末に、N−メチルピロリドン/トリエチルアミン/3−フッ化水素トリエチルアミン=6/1/2(v/v)を加えて65℃下で1.5時間撹拌した。反応液に同量のエトキシトリメチルシランを加えて室温下で10分間激しく撹拌すると沈殿物が得られた。2500xg(2分間)にて遠心分離後、有機溶媒層を注意深く除去した。得られた沈殿物にジエチルエーテルを加えて激しく撹拌後、同様に遠心分離を行い、有機溶媒を除去して、粗RNA体(白色固体)を得た。
すべてのオリゴヌクレオチドは、逆相モードで精製を行った。精製条件は以下の通り。移動相A液:10mmol/L TEAA(pH7)、B液:アセトニトリル、B濃度グラジエント5−20%(20分間)、Column:YMC Hydrosphere C18(20x100mm)(YMC)、流速4mL/min。各フラクションを逆相HPLCにより分析し、純度85%以上のフラクションを回収し、減圧下濃縮した。
得られたオリゴヌクレオチド(S−1〜10、AS−1〜7)は、UPLC/MS測定による実測分子量が理論分子量と一致することで、目的の配列が合成できていることを確認した。Xevo G2 Tof System(Waters),Column:Aquity OST C18(2.1x50mm)(Waters),移動相A液:200mM 1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール/8mMトリエチルアミン,B液:メタノール,B濃度グラジエント:10−30%(10min),温度50℃,流速0.2mL/min。
なお、5’末端にVP体を含むオリゴ(AS−42)の合成はChemBioChem 2016,17,985〜989の記載を参考に合成し、上記と同様の手法で目的の配列が合成できていることを確認した。
S−11〜26、 AS−8、24〜26、29、30、35、36、38、39に関しては、Gene Design Inc.より購入した。MALDI−TOF−MS測定(autoflex speed、Bruker)による実測分子量が理論分子量と一致することで、目的の配列が合成できていることを確認した。
SEQ−01〜21の二重鎖核酸は以下のようにして調製した。各オリゴヌクレオチドを等モル量混合した後、蒸留水を加えて濃度0.1mmol/L溶液とした。その後85℃下で10分間静置後、室温まで自然冷却させることで二重鎖核酸を得た。二重鎖形成の確認は、サイズ排除クロマトグラフィーにより実施した。Column:YMC−PAC Diol−120(4.6x300mm)(YMC製),移動相:10%アセトニトリル含有1xPBS溶液、流速0.5mL/min,温度:室温。
SEQ−22〜144の二重鎖核酸は以下のようにして調製した。各オリゴヌクレオチドを等モル量混合した後、1xPBS溶液を加えて濃度0.01mmol/L溶液とした。その後95℃下で5分間静置後、室温まで自然冷却させることで二重鎖核酸を得た。
細胞培養
ヒト大腸がん細胞株 DLD−1(KRAS mutant;G13D)はJapanese Collection Research Bioresources Cell Bankより購入した。DLD−1細胞は10%FBS含有Dulbecco’s Modified Eagle Medium(08456−65;Nacalai Tesque)において5%CO2、37℃の条件下で培養した。
生細胞数は、CellTiter−Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay Kit(G7570;Promega)を使用して評価した。あらかじめ96ウェルホワイトプレートにて培養している各ウェルに対して、培地と当量のCellTiter−Glo(登録商標) Reagentを添加し、細胞を溶解させるためにシェーカーで2分間撹拌した。その後、発光シグナルを安定させるために、室温で10分間プレートを静置し、ルミノメーター(SpectraMax L MicroPlate Reader, Molecular Devices)にて570nmの発光を測定した。コントロール細胞に対する生細胞数(%)を細胞生存率とした。
DLD−1細胞は8×103cells/wellで96ウェルホワイトプレートに播種した。Opti−MEM I培地(invitrogen)4.6μLにLipofectamine 3000を0.4μL加え、室温で5分間放置した。別のチューブで、Opti−MEM I培地4μLに10μMの各miRNA 1μLを加えた。両チューブの内容物を混ぜ、5分放置し、miRNA−Lipofectamine 3000複合体を調製した。培養細胞液中に濃度(40nM)になるようにmiRNA−Lipofectamine 3000複合体を10μL/wellで加え、これを72時間培養した。次いで、生細胞数の測定を行なった。
ヒト大腸がん細胞株 DLD−1に対して、濃度40nMの各miR-143誘導体とともに72時間培養した後、残存する生細胞数をCellTiter−Glo(登録商標) Reagentを用いて発光シグナルとして検出した。なお、図1〜3及び10のNT(non treatment)はmiRNAを導入していないコントロール細胞であり、SEQ−05、06はネガティブコントロールである。
まずwild type(配列番号1及び2からなる天然型のヒトmiR-143)と比較してセンス鎖(第1鎖)の3’末端が1塩基だけ短く、アンチセンス鎖(第2鎖)は同じであるSEQ−22と本発明のmiR-143誘導体であるSEQ−01を比較すると、SEQ−22と比較して、SEQ−01は強い腫瘍増殖抑制効果を示した(図10)。さらに、本発明のSEQ−22のアンチセンス鎖の3’末端のUCの代わりにオリゴヌクレオチド誘導体(^dT^dT)を導入したSEQ−23と比較しても、SEQ−01は強い腫瘍増殖抑制効果を示した(図10)。
次に、miR-143の安定性向上を狙い、二重鎖中に存在する4つのミスマッチ塩基対のうち2つをマッチ塩基対とし、さらに両鎖の3’末端にオリゴヌクレオチド誘導体を導入した(SEQ−02,03,04)。その結果、wild typeとミスマッチ塩基対が同じであり、かつ、ヌクレオシド誘導体を有さないSEQ−01と比較して、腫瘍増殖抑制効果が向上する配列は認められなかった(図1)。
次に、アンチセンス鎖をwild typeと同様のホスホジエステル結合かつRNAに固定し、センス鎖の3’末端にオリゴヌクレオチド誘導体の導入を検討したところ、いずれも腫瘍増殖抑制効果が認められなかった(図2 SEQ−07〜09,図3 SEQ−13〜15)。なお、SEQ−07〜09は、二重鎖中に存在する4つのミスマッチ塩基対のうち2つをマッチ塩基対とした配列であり、SEQ−13〜15は、wild typeと同様の4つのミスマッチ塩基対を有する配列である。
一方、センス鎖をwild typeと同様のホスホジエステル結合かつRNAに固定し、アンチセンス鎖の3’末端へのヌクレオシド誘導体の導入を検討した結果、SEQ−01と比較して、腫瘍増殖抑制効果の向上が認められた(図2 SEQ−10〜12)。特にアンチセンス鎖の配列内部を2’−OMe体と2’−F体で交互に修飾したSEQ−12において、強い増殖抑制効果が確認できた。さらに、SEQ−12のアンチセンス鎖の5’末端に末端修飾としてリン酸エステル部分を導入すると、抑制効果がさらに向上することが認められた(図2 SEQ−19)。なお、SEQ−10〜12及び19は、wild typeと同様の4つのミスマッチ塩基対を有する配列である。
また、アンチセンス鎖の3’末端へのヌクレオシド誘導体の導入し、かつ、両鎖の配列内部にヌクレオシド誘導体及び/又は修飾ヌクレオシド間結合の導入を検討した結果、SEQ−1と同等以上の腫瘍増殖抑制効果が認められた(図3 SEQ−20及び21)。しかし、センス鎖の3’末端にもオリゴヌクレオチド誘導体を導入すると、腫瘍増殖抑制効果が低下した(図3 SEQ−16〜18)。なお、SEQ−16〜21は、wild typeと同様の4つのミスマッチ塩基対を有する配列である。
同様に、SEQ−24〜SEQ−143に関しても、SEQ−1以上の腫瘍増殖抑制効果が認められた。特に活性が強かったmiR-143誘導体の結果を以下に示す。
上記結果のように、miR-143誘導体の配列においては、第1鎖の3’末端の化学修飾(オリゴヌクレオチド誘導体)の許容性は低く、一方で、第2鎖の3’末端へのオリゴヌクレオチド誘導体又はベンゼン‐ピリジン誘導体の導入により、腫瘍増殖抑制効果を向上させることが可能である。さらに配列内部に対するヌクレオシド誘導体及び/又は修飾ヌクレオシド間結合の導入やアンチセンス鎖の5’末端にリン酸エステル部分又は式:=CQ1−P(=O)(OH)2(式中、Q1は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。)で示される基を導入することにより、腫瘍増殖抑制効果を向上させることが可能である。
細胞培養
ヒト大腸がん細胞株 DLD−1(KRAS mutant;G13D)はJapanese Collection Research Bioresources Cell Bankより購入した。細胞は購入後6カ月以内もしくはMycoAlert Mycoplasma Detection Kit(LT07−118;Lonza)で管理したものを使用した。DLD−1は10%FBS含有RPMI−1640 medium(189−02025;Invitrogen)において5%CO2、37℃の条件下で培養した。
生細胞数は、トリプシンで処理し、トリパンブルー色素排除試験法により評価した。培養後の細胞溶液をトリパンブルーと等量混合し、血球計算盤にて生細胞数を計数した。コントロール細胞に対する生細胞数(%)を細胞生存率とした。
各細胞は0.5×105cells/mLの細胞密度で6ウェルプレートに播種した。DLD−1細胞をトランスフェクションを行う24時間前に播種し、プレートに接着させた。コントロールとして、negaitive miRNAをDharmaconより購入した。公知のmiR−143誘導体として、mirVanaTM miRNA mimic(以下、該誘導体を「ambion」と記載)をAmbionから購入した。各miRNAはLipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)を使用してカチオン性リポソームを形成させ、細胞内に導入した。アービタックス(登録商標)(メルク)は導入後、48時間で投与し、その24時間後に生細胞の計数及びウェスタンブロット解析を行った。
KRASは低分子GTP結合タンパクであり、EGFR(上皮成長因子受容体)からの増殖シグナルを下流に伝達する。しかし、大腸癌の約40%でKRAS変異が認められており、これまでに数々の抗EGFR抗体、EGFR阻害剤が開発されているが、KRAS変異のため効果は十分でないと言われている。G13D変異を有するヒト大腸がん細胞株 DLD−1に対して、アービタックス(登録商標)を濃度を変えて24時間作用させても、有意な細胞増殖抑制効果は確認できなかった(図4)。そこで、Oncogene,2009,28(10),1385−92.、Oncotarget,5(14),5416−27.等でRasタンパク質の発現を抑制していることが報告されているmiR−143と抗EGFR抗体の併用療法について検討を行った。ヒト大腸がん細胞株 DLD−1に対して、最初に濃度10nMの各miR-143誘導体(ambion、SEQ−01、12)又はnegaitive miRNA(Control)とともに48時間培養し、続いて各濃度のアービタックス(登録商標)を添加後、さらに24時間培養した。残存する生細胞数をトリパンブルー色素排除試験法によりカウントした。その結果、miR-143誘導体を加えない場合(アービタックス(登録商標)処置のみ、Control)ではKRASに変異を持つDLD−1細胞増殖抑制効果は確認されなかった。また、公知のmiR-143誘導体(ambion)を用いても有意な抑制効果は確認できなかった。一方、鋭意検討により見出したmiR-143誘導体(SEQ−01、12)は、単独でも増殖抑制効果を示すが、併用するアービタックス(登録商標)の添加量を増やしていくと、濃度依存的にその効果が増強されることが確認された(図5)。また、ヌクレオシド誘導体及び修飾ヌクレオシド間結合の導入により核酸分解酵素に対する耐性能を向上させたSEQ−12がより強い増殖抑制効果を示すことが明らかになった(図5)。
ウェスタンブロット解析
1)タンパク質抽出
タンパク質抽出液には、Protein lysis buffer(10mM Tris−HCl、0.1%SDS、1%NP−40、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、150mM NaCl、1mM EDTA)に1% Protease inhibitor cocktail、Phosphatase inhibitor cocktail II及びIIIを混合して用いた。タンパク質抽出液に回収した細胞を懸濁させ、20分間氷中に静置させた。その後、13,000rpm、4℃、20分間遠心分離した。遠心分離した上清を回収し、タンパク質サンプルとした。核及び細胞質のタンパク質の分画抽出にはCelLytic nuclear Extraction Kit(Sigma−Aldrich)を使用した。タンパク質定量は、DC Protein assay kit(Biorad)を用いて行った。定量したタンパク質をSDS sample buffer(62.5mM Tris−HCl、2%SDS、10%グリセロール、50mM DTT、0.01%ブロモフェノールブルー)と混和して50μg/μLに調整し、98℃で5分間煮沸処理した後、氷上で5分間静置した。
2)電気泳動及び転写
電気泳動には、イージーセパレーター(Wako)及びSuper Sep Ace(Wako)を用いた。泳動後、ゲルをblotting buffer(25mM Tris、0.2M グリシン、20%メタノール)に5分間浸した。PVDFメンブレン(PerkinElmer Life Sciences)はメタノールに3分間浸し、超純水に5分間浸した。その後、blotting bufferに5分間浸した。陽極側から、blotting bufferに浸したろ紙、PVDFメンブレン、ゲル、ろ紙の順に重ね、15V、370mAで40分間転写した。
転写後、0.1%Tween 20含有50mM Tris−HCl buffer(TBST)で洗浄し、5%スキムミルク溶液に浸して1時間ブロッキングした。TBSTで洗浄し、抗体希釈液(2%BSA、0.01%アジ化ナトリウム、TBST)で希釈した一次抗体に浸して4℃で一晩反応させた。TBSTで洗浄した後、5%スキムミルク溶液で希釈した二次抗体に浸して室温で1時間静置させた。その後再びTBSTで洗浄し、Luminata Forte Western HRP Substrate(WBLUF0500;Millipore)で発光させた後に、Luminescent image analyzer LAS−4000 UV mini(Fujifilm)を用いて検出した。コントロールにはanti−β−actin antibody(A5316;Sigma−Aldrich)を使用した。
1)RNA抽出
細胞及び組織中のRNAはNucleoSpin miRNA kit(TaKaRa)を使用し抽出した。RNA量はUV spectrophotometryにて定量した。
2)mRNAの定量
PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa)を使用し、37℃ 15分、85℃ 5秒、4℃ でRNAサンプルの逆転写反応を行い、鋳型cDNAを合成した。Quantitative reverse transcription−PCR(qRT−PCR)反応にはUniversal SYBR select Master Mix(Applied Biosystems)を使用した。GAPDHのmRNA量を内部コントロールとした。95℃ 30秒で初期変性を行った後、95℃ 5秒の変性反応及び60℃ 60秒のアニーリング・伸長反応を40サイクル行い、95℃ 15秒、60℃ 30秒、95℃ 15秒のステップで融解曲線を分析した。各サンプルの反応は3回ずつ行い、ΔΔCt法にてmRNA量を計算した。
抗体
ウェスタンブロッティングに用いた抗体PARP−1(#9542)、LC3B(#3868)、Akt(#9272)、phospho−Akt(Ser473;#4060)、Erk、phospho−Erk、ERK5はCell Signaling Technologyより購入した。KRASに対する抗体はabcamから購入した。
KRAS標的siRNAの準備
図8に示すように、KRASにはKRASa及びKRASbの2つのアイソフォームの存在が知られている。KRASノックダウン用として、2つの遺伝子配列に対するsiRNAを、インビトロジェン社の設計ソフトにより導き出されるリストからランクの高いものを購入した。以下には各siRNAのアンチセンス鎖配列を記載しており、センス鎖はアンチセンス鎖と100%相補的な配列となる。
(1)siRNA for KRAS(3’UTR領域、NM004985.4)
5’−AAUGCAUGACAACACUGGAUGACCG(配列番号10)
(2)siRNA for KRASa(KRASa特異的エクソン4a、ORF領域、NM033360.3)
5’−UAUUGUCGGAUCUCCCUCACCAAUG(配列番号11)
ヒト大腸がん細胞株 DLD−1に対して、濃度10nMの各miR-143誘導体(SEQ−01、12)とともに48時間培養し、続いて各濃度のアービタックス(登録商標)を添加後、さらに24時間培養した。ウェスタンブロット解析の結果、標的遺伝子ERK5と同様、KRASのmRNA及び蛋白発現を顕著に低下させることが確認された(図6、7)。また、下流の増殖シグナルであるPI3K/AKT、MAPK(ERK1/2)シグナルを抑制することが明らかとなった。一方で、siRNAと抗EGFR抗体との併用効果を検討した。インビトロジェン社から購入した2種類のsiRNAのうち、3’UTR(非翻訳領域)に設計したsiR−KRASがKRASタンパク質の発現量を抑えることが認められた(図9上)。このsiR−KRASを用いて事前にKRASをノックダウンした場合は、アービタックス(登録商標)の有意な併用効果は認められなかったことから、KRAS生成をsiRNAで抑えるだけでは抗EGFR抗体の腫瘍増殖抑制効果を向上させない(図9下)。以上のことから、本発明のmiR-143誘導体(SEQ−01、12)は、標的遺伝子KRASのmRNAの分解、タンパク質への翻訳抑制が顕著に高く、さらにKRASの生成過程に関わる複数の遺伝子をサイレンシングすることで、KRASのmRNAレベルを顕著に低下させていることが示唆される。その結果、KRASの発現亢進を抑制し、EGFR阻害剤(例えば、アービタックス(登録商標))が効果的に働くと考えられる。
KRAS変異を有するヒト膀胱癌由来細胞株(Caki−1)を3.0×106 cells/100uLでマウスの背部皮下へ移植した。移植日を0日に設定した。Control dsRNA(北海道システムサイエンス社(HSS, Sapporo)にて合成)及び本発明のmiR143誘導体(SEQ−12)(各0.1 nmol)の 50uL Opti−MEM溶液に2uLのカチオン性リポソーム試薬(LipoTrust, HSS, Sapporo)を混合し、移植後14日目のマウス腫瘍に投与を開始した。移植後14日目から移植後23日目まで、これらの各混合物をマウスの右心房より72時間毎に投与し、腫瘍体積を経時的に測定した。腫瘍体積は次の式により算出した。腫瘍体積=0.5236×L1×(L2)2、 L1は腫瘍長径、L2は腫瘍短径を表す。コントロールRNA二重鎖を投与されたマウス群と比較して、SEQ−12を投与されたマウス群では、約44%の腫瘍増殖抑制効果が示された(図11)。なお、本実施例で使用したControl dsRNAの配列は以下のとおりである。
(第1鎖) 5’−GUAGGAGUAGUGAAAGGCC−3’ (配列番号23)
(第2鎖) 5’−GGCCUUUCACUACUCCUAC−3’ (配列番号24)
Claims (9)
- 第1鎖が
配列番号3記載の配列、又は、
配列番号3記載の配列において、1若しくは2塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、3’末端修飾は有さず、5’末端修飾を有していてもよく、
第2鎖が
配列番号4記載の配列、若しくは、
配列番号4記載の配列において、1若しくは2塩基が置換、欠失若しくは挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、3’末端修飾を有し、5’末端修飾を有していてもよく、
又は
配列番号5記載の配列、若しくは、
配列番号5記載の配列において、1若しくは2塩基が置換若しくは挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、3’末端修飾は有さず、5’末端修飾を有していてもよく、
ここで、
3’末端修飾は、ヌクレオシド誘導体及び/若しくは修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよい1〜5merのオリゴヌクレオチド誘導体又はベンゼン‐ピリジン誘導体であり、
5’末端修飾は、リン酸エステル部分又は式:=CQ1−P(=O)(OH)2(式中、Q1は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。)で示される基である、
マイクロRNA−143誘導体。 - 第1鎖が、配列番号3記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第2鎖が、配列番号4又は5記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、
請求項1記載のマイクロRNA−143誘導体。 - オリゴヌクレオチド誘導体が、1又は2merである、
請求項1又は2記載のマイクロRNA−143誘導体。 - 該ヌクレオシド誘導体が、
糖の2’位に置換基を有するヌクレオシド、又は
糖の4’位と2’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである、
請求項1〜3記載いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体。 - 該置換基が、F、OCH3又はOCH2CH2OCH3である、請求項4記載のマイクロRNA−143誘導体。
- 該架橋構造が、4’−(CH2)m−O−2’(mは1〜4の整数)又は4’−C(=O)−NR3−2’(R3は、水素原子又はアルキルである)である、請求項4記載のマイクロRNA−143誘導体。
- 修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項1〜6いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体。
- SEQ−12、SEQ−19、SEQ−29、SEQ−51、SEQ−52、SEQ−56、SEQ−60、SEQ−73、SEQ−74、SEQ−86、SEQ−89、SEQ−94、SEQ−106、SEQ−122、SEQ−123、SEQ−124、SEQ−127、SEQ−139、SEQ−140、SEQ−141、SEQ−142、SEQ−143及びSEQ−144からなる群から選択される、請求項1記載のマイクロRNA−143誘導体。
- 請求項1〜8いずれかに記載のマイクロRNA−143誘導体を含有する医薬組成物。
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AKAO, YUKIHIRO ET AL.: "MicroRNAs 143 and 145 are possible common onco-microRNAs in human cancers", ONCOLOGY REPORT, vol. 16, JPN6017022440, 2006, pages 845 - 850, XP002463963, ISSN: 0004223837 * |
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