JP5976643B2 - 二本鎖ｒｎａによるベータ−カテニンの特異的阻害に対する方法と組成物 - Google Patents

二本鎖ｒｎａによるベータ−カテニンの特異的阻害に対する方法と組成物 Download PDF

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Description

（関連明細書の相互参照）
本明細書は、「二本鎖ＲＮＡによるベータ−カテニンの特異的阻害に対する方法と化合物」という表題の２０１０年７月６日に申請された、米国仮特許出願第６１／３６１，７７６号明細書の優先権、ならびに米国特許法第１１９（ｅ）条下の利益を請求する。本明細書の全教義が、参考文献にて本明細書に組み込まれている。
本発明は、ＣＴＮＮＢ１（β−カテニン）遺伝子発現および／または活性の調節に応答する形質、疾患および病態の試験、診断および治療のための化合物、組成物および方法に関する。
Ｗｎｔ経路シグナル伝達は、発現、発生、細胞増殖および幹細胞形成を仲介する（Ｆｕｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ９：１３４−８）。異常Ｗｎｔ経路シグナル伝達が、癌を含む、広い範囲の疾患原因となってきた（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．５：６９１−７０１）。（ヒトのＣＴＮＮＢ１遺伝子によってコードされた）β−カテニン−Ｗｎｔシグナル伝達の鍵となるメディエーターである癌遺伝子−における変異は、とりわけ、直腸、類腱、子宮内皮、胃、肝細胞、肝芽腫、腎臓（ウェルムス腫瘍）、髄芽細胞腫、メラノーマ、卵巣（類内膜）、膵臓、石灰化上皮腫、前立腺、甲状腺（未分化）および子宮（子宮内膜）癌の原因となってきた。（Ｐｏｌａｋｉｓ Ｐ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：１８３７−５１；Ｓａｍｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：１４４２−４；Ｉｗａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：１０２１−６；Ｍｉｒａｂｅｌｌｉ−Ｐｒｉｍｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：３３４６−５１；Ｓｈｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈ．５２：６９５−６；Ｔｅｊｐａｒ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：６６１５−２０；Ｋｉｔａｅｖａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４４７８−８１；Ｓｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：１１３０−４；Ｍｉｙａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４５０６−９；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４２５７−６０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５５： １７９５−８０１；Ｎｈｉｅｕ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５５： ７０３−１０；Ｌｅｇｏｉｘ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：４０４４−６；Ｊｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１５２：４５−５１；Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２６９−７３；Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：４９８−５０４；Ｋｏｅｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：３８８０−２；Ｍａｉｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：６２８８−９２；Ｚｕｒａｗｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：８９６−９；Ｇａｍａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５５：５２７−３６；Ｐａｌａｃｉｏｓ ａｎｄ Ｇａｍａｌｌｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：１３４４−７；Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８２：６２５−９；Ｇｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ６０：５４４−８；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２１：４１０−３；Ｖｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８： ２５２０−３；Ｇａｒｃｉａｒｏｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９： １８１１−５；Ｆｕｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：３５２６−８）。β−カテニンにおける多くのそのような変異は、β−カテニンタンパク質に対する安定性の増加を与えると考えられており、β−カテニンを、β−カテニンタンパク質のレベルを阻害および／または減少させる治療薬の開発に対する、魅力的な標的とする。癌および他の疾患および／または障害の発現におけるβ−カテニンの役割を考慮すると（例えば、適切なβ−カテニン活性は、毛包／上皮幹細胞機能に対して重要であり、β−カテニンの特定の阻害剤が、脱毛特性を有することを意味する）、β−カテニンの治療に効果的な阻害剤に対する未だ対処されていない必要性が残っている。
２５〜３５ヌクレオチドの鎖長を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）試薬が、哺乳動物細胞における標的遺伝子発現の効果的な阻害剤として記述されてきた（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， 米国特許出願公開第２００５／０２４４８５８号明細書および米国特許出願公開第２００５／０２７７６１０号明細書）。そのような長さのｄｓＲＮＡ試薬が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路のＤｉｃｅｒ酵素によって処理されると考えられており、そのような試薬を、「Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）試薬と呼ぶ。ＤｓｉＲＮＡ試薬のその他の修飾構造がすでに記述されている（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願第２００７／０２６５２２０号明細書）。
本発明は、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含む組成物、およびそれらの調製するための方法を指向する。本発明のｄｓＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは哺乳動物対象中いずれかで、細胞内の（β−カテニンをコードしている）標的ＣＴＮＮＢ１遺伝子の発現を減少することができる。より具体的には、本発明は、効果的かつ非常に強力なβ−カテニン阻害試薬として働き、また長期間の阻害効果を有する構造と修飾パターンを持つ、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）に関する。多くのそのようなＤｓｉＲＮＡが、同一の標的ＲＮＡに対して指向した２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡに対して有意に増強された標的特異的阻害能と有効性を有する。
１つの態様において、本発明は、第一および第二核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、第一鎖は長さにして２５〜３４ヌクレオチドであり、第二鎖は長さにして２６〜３５ヌクレオチドであり、かつその３’末端にて１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドにそって、配列番号：２２２６〜３３３４の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。任意に、第二オリゴヌクレオチド鎖は、最大で２７ヌクレオチドの長さにそって、配列番号：１〜３および５〜６の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に相補的である。
１つの実施形態において、第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端での第一ヌクレオチド（位置１）から開始して、位置１、２および／または３が、修飾ヌクレオチドによって置換される。特定の実施形態において、第一鎖の３’末端の修飾ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドまたは蛍光分子である。関連した実施形態において、第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端の位置１はデオキシリボヌクレオチドである。
さらなる実施形態において、第一鎖の３’末端と、第二鎖の５’末端は平滑末端を形成する。
他の実施形態において、第一鎖は長さにして２５ヌクレオチドであり、第二鎖は長さにして２７ヌクレオチドである。
１つの実施形態において、第二鎖は、配列番号：１１１７〜２２２５の配列を含む。
他の実施形態において、第一鎖は、配列番号：８〜１１１６、３３３５〜３８２２および３８２３〜４４４３を含む。
さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表２〜４、６、９または１１のＤｓｉＲＮＡ試薬に関して示したような、一対の第一鎖／第二鎖配列を含む。
１つの実施形態において、各第一および第二鎖はそれぞれ、少なくとも２６ヌクレオチドの長さを持つ。
他の実施形態において、３’オーバーハングのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。任意に、３’オーバーハングの修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。関連する実施形態において、３’オーバーハングのすべてのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。
さらなる実施形態において、第一および第二オリゴヌクレオチド鎖の一方または双方は、５’リン酸を含む。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アルキル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノまたは２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）である。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの３’オーバーハングは、長さにして１〜３ヌクレオチドである。任意に３’オーバーハングは、長さにして１〜２ヌクレオチドである。関連する実施形態において、３’オーバーハングは長さにして２ヌクレオチドであり、３’のオーバーハングの修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである。
さらなる実施形態において、第二オリゴヌクレオチド鎖は、第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的である第二鎖のヌクレオチド残基から開始して、交互修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含む。他の実施形態において、第二オリゴヌクレオチド鎖は、第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的である第二鎖のヌクレオチド残基から開始して、第二オリゴヌクレオチド鎖の位置１８から５’末端までの全ての位置で、非修飾ヌクレオチドを含む。
他の実施形態において、各第一および第二鎖は、少なくとも２６および多くて３０ヌクレオチドの長さを持つ。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって細胞内で内因的に開裂される。
さらなる実施形態において、標的遺伝子の発現を減少させるのに十分に単離された二本鎖核酸の量は、細胞の環境において、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下である。
さらなる実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞内で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下の細胞環境中、効果的な濃度にてアッセイされた時に、標的β−カテニン遺伝子発現を減少させることにおいて、標的β−カテニンｃＤＮＡの同一の少なくとも１５のヌクレオチドを指向した、単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも大きな強度を持つ。
他の実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、二本鎖核酸が哺乳動物内に導入された時に、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％まで、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために、標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
さらなる実施形態において、第一および第二鎖は、化学的リンカーによって連結する。関連した実施形態において、第一鎖の３’末端と第二鎖の５’末端が、化学的リンカーによって連結する。
１つの実施形態において、第二または第一鎖のヌクレオチドは、Ｄｉｃｅｒ開裂の開始を指示する、修飾ヌクレオチドで置換される。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）のヌクレオチド一リン酸塩、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）と２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のヌクレオチド一リン酸塩、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチドまたはロックされた核酸である、修飾ヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡはリン酸塩、ホスホロチオエート、またはホスホトリエステルホスフェート骨格修飾を持つ。
１つの実施形態において、本発明は、細胞内の標的β−カテニンの発現を減少させるのに十分な量で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞を、記述されたような単離ｄｓＲＮＡと接触させることを含む、哺乳動物細胞内の標的β−カテニン遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。
１つの実施形態において、標的β−カテニン遺伝子発現は、少なくとも１０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０〜９０％まで減少する。他の実施形態において、標的β−カテニンｍＲＮＡレベルは、細胞をｄｓＲＮＡと接触させた少なくとも８日後に、少なくとも９０％減少する。さらなる実施形態において、β−カテニンｍＲＮＡレベルは、細胞をｄｓＲＮＡと接触させた少なくとも１０日後に、少なくとも７０％まで減少する。
さらなる実施形態において、本発明は、哺乳動物中の標的β−カテニン遺伝子の発現を減少させるために十分な量で、哺乳動物に対して、記述したような単離したｄｓＲＮＡを投与することによって、哺乳動物中の標的β−カテニン遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。
１つの実施形態において、単離したｄｓＲＮＡを、１マイクログラム〜５ミリグラム／哺乳動物キログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．１０〜５マイクログラム／キログラム、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラムの投与量で投与する。
他の実施形態において、単離ｄｓＲＮＡは、１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、標的β−カテニン遺伝子発現を減少させることにおいて、標的β−カテニンｃＤＮＡの同一の少なくとも１５ヌクレオチドを指向した、単離された２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな強度を有する。
さらなる実施形態において、投与段階には、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアゾル、腸、膣、局所、経口または吸入伝達が含まれる。
さらなる実施形態において、本発明は、細胞の増殖を阻害するのに十分な量で、細胞を記述したような単離ｄｓＲＮＡの量と接触させることによって、細胞の増殖を選択的に阻害するための方法を提供する。
１つの実施形態において、細胞は対象の腫瘍細胞である。任意に、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞である。関連する実施形態において、細胞はヒト細胞である。
さらなる実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む処方を提供し、そこで、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１０％、少なくとも５０％または少なくとも８０〜９０％まで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて哺乳動物に導入され、ｓｄＲＮＡは１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、標的β−カテニンＲＮＡレベルを減少させることにおいて、標的β−カテニンｃＤＮＡの同一の少なくとも１５ヌクレオチドを指向した、単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも大きな強度を有する。
１つの実施形態において、効果的な量は、細胞の環境中、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下である。
他の実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む処方を提供し、そこでｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが少なくとも１０％、少なくとも５０％または少なくとも８０〜９０％まで、哺乳動物対象の細胞内に導入された時に、標的ＲＮＡレベルを減少させる効果的な量で存在し、ｄｓＲＮＡは１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、標的β−カテニンＲＮＡレベルを減少させることにおいて、標的β−カテニンｃＤＮＡの同一の少なくとも１５ヌクレオチドを指向した、単離された２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな強度を有する。
１つの実施形態において、効果的な量は、１マイクログラム〜５ミリグラム／哺乳動物キログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．１０〜５マイクログラム／キログラム、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラムの投与量である。
さらなる実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む哺乳動物細胞を提供する。
本発明の他の実施形態は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡと、薬理学的に許容可能な担体を含む薬理学的組成物を提供する。本発明のさらなる実施形態は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡと、その利用のための説明書を含むキットを提供する。
さらなる態様において、本発明は、第一および第二核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的になる、β−カテニン阻害活性を有する組成物を提供し、そこで第一鎖は長さにして２５〜３４ヌクレオチドであり、第二鎖は長さにして２６〜３５ヌクレオチドであり、その３’末端にて１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドにそって、配列番号：２２２６〜３３３４の標的β−カテニンｃＤＮＡに十分に相補的である。
他の実施形態において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡおよび／またはｄｓＲＮＡ含有組成物と薬理学的担体を、対象中のβ−カテニン関連疾患または疾病を治療するため、または予防するために十分な量で、対象に投与することによって、対象中のβ−カテニン関連疾患または疾病を治療するまたは予防するための方法を提供する。関連する実施形態において、β−カテニン関連疾患または疾病は、結腸直腸癌または肝細胞癌である。任意に、β−カテニン−関連疾患または疾病はメラノーマである。
他の態様において、本発明は、第一および第二核酸と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、そこで、ｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、各第一および第二オリゴヌクレオチド鎖は、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、そこで第二オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドにそって、配列番号：２２２６〜３３３４の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、細胞の環境下、１ナノモル以下の濃度で、標的遺伝子発現を減少可能である。他の実施形態において、各第一および第二鎖は、少なくとも２６ヌクレオチドである長さを持つ。関連実施形態において、各第一および第二鎖は、２６〜３０ヌクレオチドの長さを持つ。任意に、各第一および第二鎖は、２７ヌクレオチドである長さを持つ。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡの第二鎖には、配列番号：１１１７〜２２２５から選択された配列が含まれる（任意に、第二鎖は、配列番号：１１１７〜２２２５から選択される配列である）。関連実施形態において、ｄｓＲＮＡの第一鎖には、配列番号：５５５３〜７７７０から選択された配列が含まれる（任意に、第一鎖は、配列番号：５５５３〜７７７０から選択された配列である）。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表７〜８または１２〜１３から選択された、第一鎖と相当する第二鎖の組を含む。
本発明の他の態様は、第一および第二核酸と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、そこで、ｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、各第一および第二オリゴヌクレオチド鎖は、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、第一鎖の３’末端の最後および最後から二番目の残基と、第二鎖の５’末端の最後および最後から二番目の残基が、１つまたは２つのミスマッチ塩基対を形成し、第二オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドにそって、配列番号：２２２６〜３３３４の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
１つの実施形態において、第一鎖は、配列番号：５５５３〜６６６１の配列を含む。
さらなる態様において、本発明は、第一および第二核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｓｄＲＮＡ）から本質的になるβ−カテニン阻害活性を有する組成物を提供し、そこでｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、第一および第二オリゴヌクレオチド鎖それぞれは、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、第二オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドにそって、配列番号：２２２６〜３３３４の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に十分に相補的であり、第二オリゴヌクレオチド鎖は、その長さの多くて３５ヌクレオチドにそって、配列番号：１〜３および５〜６の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に相補的である。
他の態様において、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域からなる単離されたｄｓＲＮＡ分子を提供し、そこでセンス領域およびアンチセンス領域は一緒に、１９〜３５塩基対からなる二本鎖領域を形成し、アンチセンス領域は、配列番号：４４４４〜５５５２の配列の相補体である配列を含み、単離されたｄｓＲＮＡはさらに、各オーバーハング領域が、長さにして６またはそれ以下のヌクレオチドである、０〜２の３’オーバーハング領域を含む。任意に、二本鎖領域は、２５〜３５塩基対からなる。
さらなる態様において、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域からなるｓｉＲＮＡ分子を提供し、そこでセンス領域およびアンチセンス領域は一緒に、１９〜２３塩基対からなる二本鎖領域を形成し、アンチセンス領域は、配列番号：４４４４〜５５５２の配列の相補体である配列を含み、単離されたｄｓＲＮＡはさらに、各オーバーハング領域が、長さにして６またはそれ以下のヌクレオチドである、０〜４のオーバーハング領域を含む。
さらなる態様において、本発明は、第一および第二核酸鎖を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、そこで第一鎖は長さにして１５〜３５ヌクレオチドであり、第二鎖は長さにして１９〜３５ヌクレオチドであり、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１８の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に対して十分に相補的である。特定の実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を有する。１つの実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡの第二鎖は、第二鎖の３’末端にて、第一鎖の１〜５ヌクレオチド一本鎖オーバーハングを含む。他の実施形態において、第一鎖は長さにして２５〜３５ヌクレオチドである。任意に、第二オリゴヌクレオチド鎖は、第二オリゴヌクレオチド鎖長の多くて２７ヌクレオチドにそって、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ＿００１９０４．３、ＮＭ＿００１０９８２０９．１またはＮＭ＿００１０９８２１０．１の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に相補的である。
１つの実施形態において、第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端での、第一ヌクレオチド（位置１）から開始して、位置１、２および／または３は、修飾ヌクレオチドで置換される。特定の実施形態において、第一鎖の３’末端の修飾ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドまたは蛍光分子である。関連した実施形態において、第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端の位置１はデオキシリボヌクレオチドである。
さらなる実施形態において、第一鎖の３’末端と、第二鎖の５’末端は平滑末端を形成する。
他の実施形態において、第一鎖は長さにして２５ヌクレオチドであり、第二鎖は長さにして２７ヌクレオチドである。
１つの実施形態において、第二鎖は、配列番号：１１２２、１１２６、１２１６、１２３９、１２８２、１３６８、１１６５、１５０９、１５３６および１５５２の配列を含む。
他の実施形態において、第一鎖は、配列番号：１３、１７、１０７、１３０、１７３、２５９、５６、４００、４２７および４４３の配列を含む。
さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表２〜３、６〜９および１１〜１３のＤｓｉＲＮＡ試薬に関して示したような、第一鎖／第二鎖配列の組を含む。
１つの実施形態において、各第一および第二鎖は、少なくとも２６ヌクレオチドの長さを持つ。
他の実施態様において、３’オーバーハングのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。任意に、３’オーバーハングの修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。関連した実施形態において、３’オーバーハングのすべてのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
さらなる実施形態において、１つまたは両方の第一および第二オリゴヌクレオチド鎖は５’リン酸塩を含む。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＡＮ、２’−アミノまたは２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）である。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの３’オーバーハングは、長さにして１〜３ヌクレオチドである。任意に、３’オーバーハングは長さにして１〜２ヌクレオチドである．関連した実施形態において、３’オーバーハングは、長さにして２ヌクレオチドであり、３’オーバーハングの修飾したヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである。
さらなる実施形態において、第二オリゴヌクレオチド鎖は、第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基と相補的な第二鎖のヌクレオチド残基から開始して、交互に修飾および未修飾ヌクレオチド残基を含む。他の実施形態において、第二オリゴヌクレオチド鎖は、第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基と相補的な第二鎖のヌクレオチド残基から開始して、第二オリゴヌクレオチド鎖の位置１８から５’末端までのすべての位置で、未修飾ヌクレオチド残基を含む。
他の実施形態において、各第一および第二鎖は、少なくとも２６、多くて３０ヌクレオチドである長さを持つ。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡはＤｉｃｅｒによって細胞中で内生的に開裂される。
さらなる実施形態において、標的遺伝子の発現を減少させるのに十分な単離された二本鎖核酸の量は、細胞の環境下１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下である。
さらなる実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下の細胞の環境下での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、標的Β−カテニン遺伝子発現を減少させることにおいて、標的β−カテニンｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドを指向した、単離された２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな強度を持つ。
他の実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％まで、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために、標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
さらなる実施形態において、第一および第二鎖は化学的リンカーによって連結する。関連した実施形態において、第一鎖の３’末端および第二鎖の５’末端が化学的リンカーによって連結する。
１つの実施形態において、第二または第一鎖のヌクレオチドは、Ｄｉｃｅｒ開裂の開始を指向する修飾ヌクレオチドで置換される。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）のヌクレオチド一リン酸塩、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）と２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のヌクレオチド一リン酸塩、４−チオウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチドまたはロックされた核酸である、修飾ヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡはリン酸、ホスホロチオエート、またはホスホトリエステルホスフェート骨格修飾を持つ。
さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、モルホリノ核酸またはオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
１つの実施形態において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞を、細胞内で標的β−カテニン遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、記述したような単離されたｄｓＲＮＡと接触させることを含む、哺乳動物における標的β−カテニン遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。
１つの実施形態において、標的β−カテニン遺伝子発現は、すくなくとも１０％、少なくとも５０％または少なくとも８０〜９０％まで減少する。他の実施形態において、標的β−カテニンｍＲＮＡレベルは、細胞がｄｓＲＮＡに接触してから少なくとも８日後に、少なくとも９０％減少する。さらなる実施形態において、β−カテニンｍＲＮＡレベルは、細胞がｄｓＲＮＡに接触してから少なくとも１０日後に、少なくとも７０％減少する。
さらなる実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを、哺乳動物中の標的β−カテニン遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、哺乳動物に投与することによって、哺乳動物中の標的β−カテニン遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。
１つの実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、１マイクログラム〜５ミリグラム／哺乳動物キログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．１０〜５マイクログラム／キログラム、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラムの投与量で投与される。
他の実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下効果的な濃度で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞内でアッセイした時に、標的β−カテニン遺伝子発現を減少させることにおいて、標的β−カテニンＲＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドを指向した、単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも大きな強度を持つ。
さらなる実施形態において、投与段階には、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアロゾル、腸、膣、局所、経口または吸入伝達が含まれる。
さらなる実施形態において、本発明は、細胞の増殖を阻害するのに十分な量で、細胞を記述したような単離ｄｓＲＮＡと接触させることによって、細胞の増殖を選択的に阻害するための方法を提供する。
１つの実施形態において、細胞は対象の腫瘍細胞である。任意に、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞、例えば肝細胞（例えばＨｅｐＧ２またはＨｕＨ７）または結腸直腸（例えばＨＣＴ１１６）がん細胞またはＨｅＬａまたは他のがん細胞である。特定の実施形態において、細胞は哺乳動物肝細胞である。関連する実施形態において、細胞はヒト細胞である。
さらなる実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤を提供し、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏにて哺乳動物に導入された時に、少なくとも１０％、少なくとも５０％または少なくとも８０〜９０％まで、標的β−カテニンＲＮＡレベルを減少させるために効果的な量で存在し、ｄｓＲＮＡは、１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下、効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、標的β−カテニンＲＮＡレベルを減少することにおいて、標的β−カテニンｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドを指向した、単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも大きな強度を持つ。
１つの実施形態において、効果的な量は、細胞の環境中、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下である。
他の実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤を提供し、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが哺乳動物対象の細胞内に導入された時に、少なくとも１０％、少なくとも５０％または少なくとも８０〜９０％まで、標的ＲＮＡを減少させる効果的な量で存在し、ｄｓＲＮＡは１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、標的β−カテニンＲＮＡレベルを減少させることにおいて、標的β−カテニンｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドを指向した、単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも大きな強度を持つ。
１つの実施形態において、効果的な量は、１マイクログラム〜５ミリグラム／哺乳動物キログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．１０〜５マイクログラム／キログラム、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラムの投与量である。
さらなる実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む哺乳動物細胞を提供する。
本発明の他の実施形態は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡと、薬理学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。本発明のさらなる実施形態は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡと、その利用のための説明書を含むキットを提供する。
さらなる態様において、本発明は、第一および第二核酸鎖を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的になる、β−カテニン阻害活性を有する組成物を提供し、第一鎖は長さにして１５〜３５ヌクレオチドであり、第二鎖は長さにして１９〜３５ヌクレオチドであり、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１８の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
他の実施形態において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡおよび／またはｄｓＲＮＡ含有組成物と薬理学的担体を、対象中のβ−カテニン関連疾患または障害を治療するため、または予防するために十分な量で、対象に投与することによって、対象中のβ−カテニン関連疾患または障害を治療するまたは予防するための方法を提供する。関連する実施形態において、β−カテニン関連疾患または障害は、肝細胞癌または結腸直腸癌、または任意に腎臓、乳、胚、卵巣、子宮頸、食道、口腔咽頭または膵臓がんである。
他の態様において、本発明は、第一および第二核酸鎖を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、そこでｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、各第一および第二オリゴヌクレオチド鎖は、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１８の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、細胞の環境において、１ナノモル以下の濃度で、標的遺伝子発現を減少可能である。他の実施形態において、第一および第二鎖はそれぞれ、少なくとも２６ヌクレオチドである長さを持つ。関連した実施形態において，第一および第二鎖はそれぞれ、２６〜３０ヌクレオチドである長さを持つ。任意に第一および第二鎖はそれぞれ、２７ヌクレオチドである長さを持つ。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡの第二鎖は、配列番号：１１２２、１１２６、１２１６、１２３９、１２８１、１４６８，１１６５、１５０９、１５３６および１５５２から選択される配列を含む。関連した実施形態において、ｄｓＲＮＡの第一鎖は、配列番号：６６６７、６６７１、６７６１、６７８４、６８２７、６９１３、６７１０、７０５４、７０８１および７０９７から選択される配列を含む。さらなる実施形態において、ｄｓＤＮＡは、表２〜３、６〜９および１１〜１３から選択される、第一鎖と相当する第二鎖の配列を含む。
本発明の他の態様は、第一およびと第二核酸鎖を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、ｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、第一および第二オリゴヌクレオチド鎖それぞれは、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、第一鎖の３’末端の最後および最後から二番目の残基と、第二鎖の前記５’末端の最後および最後から二番目の残基が、１つまたは２つのミスマッチ塩基対を形成し、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１８の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
１つの実施形態において、第一鎖は、配列番号：５５５８、５５６２、５６５２、５６７５、５７１８、５８０４、５６０１、５９４４、５９７２および５９８８の配列を含む。
さらなる態様において、本発明は、第一および第二核酸鎖を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的になる、β−カテニン阻害活性を有する組成物を提供し、前記ｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、第一および第二オリゴヌクレオチドそれぞれは、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１８の標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
他の態様において、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域からなる単離されたｄｓＲＮＡ分子を提供し、センス領域およびアンチセンス領域は一緒に、１５〜３５塩基対からなる二本鎖領域を形成し、アンチセンス領域は、表１８の配列の相補配列を含み、単離されたｄｓＲＮＡはさらに、各オーバーハング領域が、長さにして６またはそれ以下のヌクレオチドである、０〜２の３’オーバーハング領域を含む。任意に、二本鎖領域は、１９〜３５塩基対からなる。特定の実施形態において、二本鎖領域は、２５〜３０塩基対からなる。さらなる実施形態において、二本鎖領域は２５〜３０塩基対からなる。
さらなる態様において、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域からなるｓｉＲＮＡ分子を提供し、そこでセンス領域およびアンチセンス領域は一緒に、１９〜２３塩基対からなる二本鎖領域を形成し、アンチセンス領域は、表１８の配列と相補的である配列を含み、単離されたｄｓＲＮＡはさらに、各オーバーハング領域が、長さにして６またはそれ以下のヌクレオチドである、０〜４のオーバーハング領域を含む。
態様において、本発明は、効果的かつ非常に強力なβ−カテニン阻害剤試薬として働き、任意に延長された阻害効果期間を有する、構造および修飾パターンを持つ、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）を指向する。多数のそのようなＤｓｉＲＮＡは、同一の標的ＲＮＡに対して、１９〜２３塩基対二本鎖核酸（例えば２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ）に対して有意に増強された、標的特異的な阻害強度と有効性を有する。特定のそのような実施形態において、そのようなＤｓｉＲＮＡは、１ｎＭまたはそれ以下の濃度で好適に処方された時に、哺乳動物細胞内のβ−カテニン標的遺伝子発現を減少させる際に、その中に含まれる１９、２０、２１、２２または２３塩基対配列より強力である。
本発明は、形質、疾患および病態の維持または発現を仲介する、ＣＴＮＮＢ１遺伝子発現経路または他の細胞性工程に関与する遺伝子の発現および／または活性の調節に応答する、形質、疾患および病態に関連している化合物、組成物および方法も指向する。とりわけ、本発明は、ＣＴＮＮＢ１（β−カテニン）遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介可能なＤｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）のような、Ｄｉｃｅｒ酵素によって処理されうる小核酸分子に関する。そのような抗β−カテニンＤｓｉＲＮＡは、例えば、癌および／または他の増殖性疾患、障害または病態のような、対象中のβ−カテニンの調節に応答可能な形質、疾患および病態の治療のための組成物を提供することにおいて、有用である。抗β−カテニンＤｓｉＲＮＡの有効性、強度、毒性および他の効果を、増殖性疾患の１つまたはそれ以上の動物モデルで検討可能である（典型的で好適な増殖性疾患の動物モデルを以下に列記している）。
図１は、「βｃ−１５６９」標的部位として本明細書を引用した、β−カテニンＲＮＡ中の部位を標的としている例示ＤｓｉＲＮＡ試薬の構造を示している。上部ケース＝未修飾ＲＮＡ、下部ケース＝ＤＮＡ、太字＝ミスマッチ塩基対ヌクレオチド、矢頭は、推定Ｄｉｃｅｒ酵素開裂部位を示唆している。点線は、標的化β−カテニン配列内の突出したｇｏｎａｕｔｅ２（Ａｇｏ２）開裂部位に相当するセンス鎖（トップ鎖）配列を示唆している。 図２は、ヒトβ−カテニン転写産物にわたり５’〜３’を有するＤｓｉＲＮＡ標的化部位に対する、ＨｅＬａ細胞の環境下、１ｎＭにて観察されたヒトβ−カテニン阻害有効性のプロットを示している。ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴとＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。 図３は、ヒトβ−カテニン転写産物にわたり５’〜３’を有するＤｓｉＲＮＡ標的化部位に対する、ＨｅＬａ細胞の環境下、１ｎＭにて観察されたヒトβ−カテニン阻害有効性のプロットを示している。ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴとＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。 図４は、マウスβ−カテニン転写産物にわたり５’〜３’を有するＤｓｉＲＮＡ標的化部位に対する、Ｈｅｐａ １−６細胞の環境下、１ｎＭにて観察されたマウスβ−カテニン阻害有効性のプロットを示している。マウスβ−カテニンレベルをＨＰＲＴとＲｐｌ２３レベルに対して標準化した。 図５は、マウスβ−カテニン転写産物にわたり５’〜３’を有するＤｓｉＲＮＡ標的化部位に対する、Ｈｅｐａ １−６細胞の環境下、１ｎＭにて観察されたマウスβ−カテニン阻害有効性のプロットを示している。マウスβ−カテニンレベルをＨＰＲＴとＲｐｌ２３レベルに対して標準化した。 図６は、ヒトβ−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡが、ヒトＨＣＴ１１６大腸癌細胞にて、９０％またはそれ以上まで、β−カテニンＲＮＡレベルを効果的に減少させたことを示している。ＨＣＴ１１６細胞に、３ｎＭまたは１０ｎＭで示されたＤｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏにてトランスフェクトし、細胞を、２４時間時点で、β−カテニンＲＮＡレベルに関してアッセイした。 図７は、ヒトβ−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡが、ヒトＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞の増殖を有意に阻害したことを示している。ＨｅｐＧ２細胞に、３ｎＭで示されたＤｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏにてトランスフェクトし、ＨｅｐＧ２細胞株を、３日の時点で、増殖に関してアッセイした。 図８は、示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察された、ヒトβ−カテニン阻害効果のヒストグラムである。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均ヒトβ−カテニンレベルを表し、標準誤差で示している。ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。発現レベルを、Ｈｓ ＣＴＮＮＢ１中、位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方に位置するプローブアンプリコンでアッセイした。（図８のヒストグラムは、基準以下のトランスフェクションに対して得られた相２の値を反映していることに留意のこと。） 図９は、示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察された、ヒトβ−カテニン阻害効果のヒストグラムである。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均ヒトβ−カテニンレベルを表し、標準誤差で示している。ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。発現レベルを、Ｈｓ ＣＴＮＮＢ１中、位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方に位置するプローブアンプリコンでアッセイした。（図８のヒストグラムは、基準以下のトランスフェクションに対して得られた相２の値を反映していることに留意のこと。） 図１０は、示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察された、ヒトβ−カテニン阻害効果のヒストグラムである。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均ヒトβ−カテニンレベルを表し、標準誤差で示している。ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。発現レベルを、Ｈｓ ＣＴＮＮＢ１中、位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方に位置するプローブアンプリコンでアッセイした。（図８のヒストグラムは、基準以下のトランスフェクションに対して得られた相２の値を反映していることに留意のこと。） 図１１は、示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察された、ヒトβ−カテニン阻害効果のヒストグラムである。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均ヒトβ−カテニンレベルを表し、標準誤差で示している。ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。発現レベルを、Ｈｓ ＣＴＮＮＢ１中、位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方に位置するプローブアンプリコンでアッセイした。（図８のヒストグラムは、基準以下のトランスフェクションに対して得られた相２の値を反映していることに留意のこと。） 図１２は、示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスβ−カテニン阻害効果のヒストグラムを示している。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、マウスＨｅｐａ １−６細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、マウスＨｅｐａ １−６細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均ヒトβ−カテニンレベルを表し、標準誤差を示している。ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＲＰＬ２３レベルに対して標準化した。発現レベルを、Ｍｍ ＣＴＮＮＢ１中、位置１２３２〜１３９４および２８４８〜２９３０両方に位置するプローブアンプリコンでアッセイした。（図１３のヒストグラムは、基準以下のトランスフェクションに対して得られた相２の値を反映していることに留意のこと。） 図１３は、示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスβ−カテニン阻害効果のヒストグラムを示している。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、マウスＨｅｐａ １−６細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、マウスＨｅｐａ １−６細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均ヒトβ−カテニンレベルを表し、標準誤差を示している。ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＲＰＬ２３レベルに対して標準化した。発現レベルを、Ｍｍ ＣＴＮＮＢ１中、位置１２３２〜１３９４および２８４８〜２９３０両方に位置するプローブアンプリコンでアッセイした。（図１３のヒストグラムは、基準以下のトランスフェクションに対して得られた相２の値を反映していることに留意のこと。） 図１４は、示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスβ−カテニン阻害効果のヒストグラムを示している。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、マウスＨｅｐａ １−６細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、マウスＨｅｐａ １−６細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均ヒトβ−カテニンレベルを表し、標準誤差を示している。ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＲＰＬ２３レベルに対して標準化した。発現レベルを、Ｍｍ ＣＴＮＮＢ１中、位置１２３２〜１３９４および２８４８〜２９３０両方に位置するプローブアンプリコンでアッセイした。（図１３のヒストグラムは、基準以下のトランスフェクションに対して得られた相２の値を反映していることに留意のこと。） 図１５は、示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスβ−カテニン阻害効果のヒストグラムを示している。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、マウスＨｅｐａ １−６細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、マウスＨｅｐａ １−６細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均ヒトβ−カテニンレベルを表し、標準誤差を示している。ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＲＰＬ２３レベルに対して標準化した。発現レベルを、Ｍｍ ＣＴＮＮＢ１中、位置１２３２〜１３９４および２８４８〜２９３０両方に位置するプローブアンプリコンでアッセイした。（図１３のヒストグラムは、基準以下のトランスフェクションに対して得られた相２の値を反映していることに留意のこと。） 図１６は、相３アッセイにて使用した、アンチセンス（ガイド）鎖２’−Ｏ−メチル修飾パターンを示している。 図１７は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭでの、ヒトＨｅＬａ細胞中、それぞれ３２β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡにわたる、６つの異なるガイド鎖修飾パターンに対する、相３の有効性データを示しているヒストグラムを表している。発現レベルを、Ｈｕ ＣＴＮＮＢ１中位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方で位置するプローブアンプリコンでアッセイし、ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。 図１８は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭでの、ヒトＨｅＬａ細胞中、それぞれ３２β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡにわたる、６つの異なるガイド鎖修飾パターンに対する、相３の有効性データを示しているヒストグラムを表している。発現レベルを、Ｈｕ ＣＴＮＮＢ１中位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方で位置するプローブアンプリコンでアッセイし、ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。 図１９は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭでの、ヒトＨｅＬａ細胞中、それぞれ３２β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡにわたる、６つの異なるガイド鎖修飾パターンに対する、相３の有効性データを示しているヒストグラムを表している。発現レベルを、Ｈｕ ＣＴＮＮＢ１中位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方で位置するプローブアンプリコンでアッセイし、ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。 図２０は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭでの、ヒトＨｅＬａ細胞中、それぞれ３２β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡにわたる、６つの異なるガイド鎖修飾パターンに対する、相３の有効性データを示しているヒストグラムを表している。発現レベルを、Ｈｕ ＣＴＮＮＢ１中位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方で位置するプローブアンプリコンでアッセイし、ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。 図２１は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭでの、ヒトＨｅＬａ細胞中、それぞれ３２β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡにわたる、６つの異なるガイド鎖修飾パターンに対する、相３の有効性データを示しているヒストグラムを表している。発現レベルを、Ｈｕ ＣＴＮＮＢ１中位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方で位置するプローブアンプリコンでアッセイし、ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。 図２２は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭでの、ヒトＨｅＬａ細胞中、それぞれ３２β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡにわたる、６つの異なるガイド鎖修飾パターンに対する、相３の有効性データを示しているヒストグラムを表している。発現レベルを、Ｈｕ ＣＴＮＮＢ１中位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方で位置するプローブアンプリコンでアッセイし、ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。 図２３は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭでの、ヒトＨｅＬａ細胞中、それぞれ３２β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡにわたる、６つの異なるガイド鎖修飾パターンに対する、相３の有効性データを示しているヒストグラムを表している。発現レベルを、Ｈｕ ＣＴＮＮＢ１中位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方で位置するプローブアンプリコンでアッセイし、ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。 図２４は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭでの、ヒトＨｅＬａ細胞中、それぞれ３２β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡにわたる、６つの異なるガイド鎖修飾パターンに対する、相３の有効性データを示しているヒストグラムを表している。発現レベルを、Ｈｕ ＣＴＮＮＢ１中位置１２９７〜１３９７および３５０６〜３６５９両方で位置するプローブアンプリコンでアッセイし、ヒトβ−カテニンレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。 図２５は、アッセイした、ヒトβ−カテニンを標的としているＤｓｉＲＮ（βｃａｔ−ｈ１５６９、βｃａｔ−ｈ１６８３、βｃａｔ−ｈ２６１２およびβｃａｔ−ｈ３３９３）が、ＨＣＴ１１６（大腸癌）およびＨｅｐＧ２（肝細胞癌）細胞株両方で、β−カテニンの下流標的である、Ａｘｉｎ−２の発現を効果的に阻害したことを示している。細胞を、指定のＤｓｉＲＮＡで、示された濃度（３ｎＭおよび１０ｎＭ）にてトランスフェクション２日後にアッセイした。 図２６は、ヒトβ−カテニンを標的としている特定のＤｓｉＲＮＡ（βｃａｔ−ｈ１６８３、βｃａｔ−ｈ２６１２およびβｃａｔ−ｈ３３９３）での、ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞のトランスフェクションが、対照ＤｓｉＲＮＡを投与した細胞と比較して、トランスフェクション５日後に、細胞の増殖を阻害したことを示している。細胞増殖阻害は、トランスフェクション５日後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイした。 図２７は、ヒトβ−カテニンを標的化しているＤｓｉＲＮＡでの、ヒト肝細胞癌細胞株ＨｕＨ７細胞のトランスフェクションが、対照ＤｓｉＲＮＡを投与した細胞と比較して、トランスフェクション５日後に、細胞の増殖を阻害したことを示している。細胞増殖阻害は、トランスフェクション５日後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイした。 図２８は、ヒトβ−カテニンを標的化しているＤｓｉＲＮＡ（特に、アンチセンス鎖の５’末端（位置１）から開始して以下の位置、１、２、３、４、１１、１３、２５および２７にて、２’−Ｏ−メチル修飾からなる「Ｍ１１」修飾アンチセンス（ガイド）鎖を有するβｃ−ｈ３３９３ ２５／２７ｍｅｒ）での、ヒト肝細胞癌細胞株ＨｕＨ７細胞のトランスフェクションが、対照ＤｓｉＲＮＡと一緒に投与した時に、対照ＤｓｉＲＮＡのみ投与した細胞と比較して、トランスフェクション２日後に、およそ８０％のβ−カテニンのノックダウンを産出したことを示している。 図２９は、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＨｅｐＧ２（肝細胞肝癌）およびＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）細胞株にて認められた、画分化されたヒトβ−カテニンタンパク質レベルを示している。β−カテニンの核および細胞質レベルをウエスタンブロットを介して各細胞株について確認し、β−アクチンレベルを内部対照としてアッセイした。細胞抽出物を、ＮＥ−ＰＥＲ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、コンフルエントな６ウェルパテ（ｐａｔｅ）より得た。タンパク質７５μｇを各細胞株からロードした。β−カテニンタンパク質の公知の短縮変異体が、ＨｅｐＧ２細胞中に観察された。 図３０は、正常マウス肝臓中ｉｎ ｖｉｖｏにて、ヒトβ−カテニンを標的としているＤｓｉＲＮＡが活性であることを示し、正常マウス（ｎ＝５マウス／群）に１０ｍｇ／ｋｇの単一用量で静脈内に投与し、Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２．０（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ、カールスバッド，カリフォルニア州）中に処方した時に、β−カテニンｍＲＮＡ（上パネル）およびタンパク質（下パネル）レベル両方を有意に減少させた（例えば多くの例で、およそ７０〜９０％のノックダウンが観察された）、。肝組織を、投与後７２時間で回収した。すべてのヒトβ−カテニンを標的としているＤｓｉＲＮＡは、「Ｍ１１」修飾アンチセンス（ガイド）鎖を有していた。 図３１は、正常マウス肝臓中ｉｎ ｖｉｖｏにて、ヒトβ−カテニンを標的としているＤｓｉＲＮＡが活性であることを示し、正常マウス（ｎ＝５マウス／群）に１０ｍｇ／ｋｇの単一用量で静脈内に投与し、Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２．０（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ、カールスバッド，カリフォルニア州）中に処方した時に、β−カテニンｍＲＮＡ（上パネル）およびＡｘｉｎ−２ ｍＲＮＡ（下パネル）レベル両方を有意に減少させた（例えば多くの例で、およそ７０〜９０％ノックダウンが観察された）。生組織を、投与後７２時間で回収した。ヒトβ−カテニンを標的としているＤｓｉＲＮＡは、例えば２’−Ｏ−メチル化の「Ｍ１１」パターンを持つ未修飾センス（パッセンジャー）鎖と修飾アンチセンス（ガイド）鎖を有する２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡに相当する「Ｍ０／Ｍ１１」パターンなど、示唆したような種々の修飾パターンを有していた。センス鎖の「Ｍ１４」修飾パターンは、センス鎖の５’−末端（位置１）から開始して、以下の位置２、４、６、８、１２、１４、１６および１８での、センス鎖の修飾に相当することに留意したい。 図３２は、４８時間の時点でも、ヒトβ−カテニンを標的としているＤｓｉＲＮＡが活性であったことを示し、正常マウス（ｎ＝５マウス／群）に１０ｍｇ／ｋｇの単一用量で静脈内に投与し、Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２．０（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ、カールスバッド，カリフォルニア州）中に処方した時に、β−カテニンｍＲＮＡ（上パネル）およびＡｘｉｎ−２ ｍＲＮＡ（下パネル）レベル両方を有意に減少させた（例えば多くの例で、およそ７０〜９０％ノックダウンが観察された）、正常マウス肝臓中ｉｎ ｖｉｖｏにて、。肝組織を、投与後４８時間で回収した。ヒトβ−カテニンを標的としているＤｓｉＲＮＡは、上に示し、記述したように、種々の修飾パターンを有した。対照ＤｓｉＲＮＡは、センスおよびアンチセンス鎖の同一の修飾パターンを有した。
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにてβ−カテニン遺伝子のレベルおよび／または発現を減少可能な、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含む組成物、それらを調製するための方法を指向する。ｄｓＲＮＡの鎖の１つは、標的化β−カテニン転写産物の破壊および／または転写阻害を指向可能な１９〜３５ヌクレオチドの範囲の長さを持つヌクレオチド配列の領域を含む。
定義
他に定義しない限り、本明細書で使用するところの全ての技術および科学的用語用語が、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を持つ。以下の参照は、本発明内で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９１）； ａｎｄ Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用するように、以下の用語は、他に特定しない限り、以下のそれらに帰する意味を持つ。
本発明は、β−カテニン発現を調節（たとえば阻害）可能な１つまたはそれ以上のＤｓｉＲＮＡ分子を特徴とする。本発明のＤｓｉＲＮＡは任意に、β−カテニン誤調節に関連した疾患または障害（例えば腫瘍形成および／または増殖など）の維持または発現に関連した他の遺伝子および／または遺伝子産物のモジュレータとの組み合わせで使用可能である。本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は、一般的に「β−カテニン」として以下で列挙し、本明細書に対して引用する、ＧｅｎＢａｎｋ 寄託番号ＮＭ＿００１９０４．３（ヒトβ−カテニン、転写産物変異体１）、ＮＭ＿００１０９８２０９．１（ヒトβ−カテニン、転写産物変異体２）、ＮＭ＿００１０９８２１０．１（ヒトβ−カテニン、転写産物変異体３）およびＮＭ＿００７６１４．２およびＮＭ＿００７６１４．３（マウスβ−カテニン）によって引用されたｃＤＮＡ配列に相当するもののように、β−カテニンＲＮＡを調節する。
本発明の種々の態様および実施形態の以下の記述が、典型的β−カテニンＲＮＡに対する参照で提供され、一般的にβ−カテニンと本明細書で引用される。しかしながら、そのような参照は、例示のみであると意味され、本発明の種々の態様および実施形態はまた、齧歯類β−カテニンＲＮＡまたはさらなるβ−カテニンスプライスバリアントのような、他のβ−カテニンＲＮＡも指向する。特定の態様および実施形態がまた、治療に対して標的化されうる表現型の効果（例えば腫瘍形成および／または増殖など）を産出するために、その誤調節が、β−カテニンのものと関連して働く（またはβ−カテニン調節に効果を与えたか、または与える）遺伝子を含む、β−カテニン経路に関与する他の遺伝子も指向する。そのようなさらなる遺伝子は、β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡの利用に関して本明細書で記述されたＤｓｉＲＮＡおよび方法を用いて標的化可能である。したがって、他の遺伝子のそのような阻害剤の阻害および効果を、本明細書で記述したように実施可能である。
用語「β−カテニン」および「ＣＹＮＮＢ１」は、β−カテニンタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を意味する（例えば、β−カテニンＧｅｎｂａｎｋ 寄託番号ＮＭ＿００１９０４．３、ＭＮ＿００１０９８２０９．１、ＮＭ＿００１０９８２１０．１、ＮＭ＿００７６１４．２およびＮＭ＿００７６１４．３の配列のような、β−カテニン転写産物）。特定の実施形態において、用語「β−カテニン」はまた、他のβ−カテニンアイソフォーム、変異体β−カテニン遺伝子、β−カテニン遺伝子のスプライスバリアント、およびβ−カテニン遺伝子多型のような、他のΒ−カテニンコード配列を含むことも意味する。用語「β−カテニン」は、β−カテニン遺伝子／転写産物のポリペプチド遺伝子産物、例えば、β−カテニンＧｅｎｂａｎｋ 寄託番号ＮＭ＿００１９０４．３、ＭＮ＿００１０９８２０９．１、ＮＭ＿００１０９８２１０．１、ＮＭ＿００７６１４．２およびＮＭ＿００７６１４．３によってコードされたもののような、β−カテニンタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを意味するために使用される。
本明細書で使用するところの、「β−カテニン関連疾患または障害」は、変化したβ−カテニン発現、レベルおよび／または活性に関連すると本技術分野で公知の疾患または障害を意味する。とりわけ、「β−カテニン関連疾患または疾病」は、癌および／または増殖性疾患、病態または障害を含む。２つの典型的「β−カテニン関連疾患または障害」は結腸直腸癌とメラノーマである。
本明細書で使用するところの「増殖性疾患」または「癌」によって、単独または他の治療との組み合わせで、白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、および慢性リンパ性白血病、カポジ肉腫のようなＡＩＤＳ関連癌、乳癌、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、繊維肉腫、巨細胞腫、アダマンチノーマおよび脊索腫のような骨癌、髄膜腫、膠芽細胞腫、下級星状細胞腫、オリゴデンドロサイトーマ、下垂体腫瘍、神経鞘腫および転移脳腫瘍のような脳腫瘍、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、アデノーマ、扁平上皮癌、喉頭癌、胆嚢および胆管癌、網膜芽腫のような網膜の癌、食道癌、胃癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、精巣癌、子宮内膜腺癌、メラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、（非小細胞肺癌を含む）肺癌、膵臓癌、肉腫、腎芽細胞腫、子宮頸癌、頭頸部癌、皮膚癌、鼻咽腔癌、脂肪肉腫、上皮性腫瘍、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、子宮内膜肉腫、多剤耐性癌のような種々のリンパ腫を含む頭頸部癌、および腫瘍血管形成に関連した新血管形成、黄斑変性（例えば湿／乾ＡＭＤ）、角膜血管新生、糖尿病性レチオパシー、血管新生緑内障、近視性変性のような増殖性疾患および状態、および再狭窄および多発性嚢胞腎のような他の増殖性疾患および状態、細胞または組織内での疾患関連遺伝子発現の調節に応答可能な他の癌または増殖性疾患、病態、形質、遺伝型または表現型を含む、本技術分野で公知のように、制御されていない細胞増殖または複製によって特徴付けられる疾患、病態、形質、遺伝型または表現型を意味する。
特定の実施形態において、β−カテニン標的配列のｄｓＲＮＡ−仲介阻害を評価する。そのような実施形態において、β−カテニンＲＮＡレベルは、任意に、そのような抗−β−カテニンｄｓＲＮＡが存在しないことに対する、本発明の抗−β−カテニンｄｓＲＮＡの存在におけるβ−カテニンレベルの比較を介して、本技術分野で認識された方法（例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザン法、発現アレイなど）によって評価可能である。特定の実施形態において、抗−β−カテニンｄｓＲＮＡの存在下のβ−カテニンレベルを、賦形剤のみの存在下、関連しない標的ＲＮＡに対して指向したｄｓＲＮＡの存在下、または任意の治療のない状態で、観察したものと比較する。
β−カテニンタンパク質のレベルを、β−カテニンタンパク質のレベルが、β−カテニンＲＮＡレベルに直接的または間接的に関連するかどうか、与えられた細胞および／または組織条件の設定下、公知である程度まで、および／またはｄｓＲＮＡがβ−カテニン発現を阻害する程度を、β−カテニンＲＮＡレベルの指示として評価可能であり、したがってβ−カテニンタンパク質レベルを査定する本技術分野で認識されている方法（例えばウエスタンブロット、免疫沈降、他の抗体に基づく方法など）もまた、本発明のｄｓＲＮＡの阻害効果を検討するために使用可能である。
選択された対照と比較して、システム（例えば、細胞がないｉｎ ｖｉｔｒｏシステム）、細胞、組織または生命体に投与された時に、β−カテニンＲＮＡにおける統計学的に有意な減少が見られた場合に、本発明の抗β−カテニンｄｓＲＮＡが、「β−カテニン阻害活性」を有すると見なされる。実験値と、実施された複数アッセイ数の分布によって、（％または絶対値のいずれかとして）β−カテニンＲＮＡにおけるどんな減少レベルが、（本技術分野で公知の統計学的有意差を決定する標準の方法によって査定されたように）統計学的に有意と判断するかのパラメータが決定づけられる傾向にある。しかしながら、特定の実施形態において、「β−カテニン阻害活性」は、システム、細胞、組織または生命体におけるβ−カテニンＲＮＡのレベルにおける減少の％または絶対レベルに基づいて定義される。例えば、特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、好適な対照に対して見られるΒ−カテニンレベルに対して、本発明のＤｓｉＲＮＡの存在下で、β−カテニンＲＮＡにおいて、少なくとも５％減少または少なくとも１０％減少が観察される場合に、β−カテニン阻害活性を有すると見なされる。（例えば、特定の実施形態において、対照に対して、β−カテニンレベルにおける例えば５％または１０％の減少が観察される場合に、組織および／または対象中のｉｎ ｖｉｖｏβ−カテニンレベルが、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬によって阻害されると見なされうる。）特定の他の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、β−カテニンＲＮＡレベルが、選択された対照に対して、少なくとも１５％まで、選択された対照に対して、少なくとも２０％まで、選択された対照に対して、少なくとも２５％まで、選択された対照に対して、少なくとも３０％まで、選択された対照に対して、少なくとも３５％まで、選択された対照に対して、少なくとも４０％まで、選択された対照に対して、少なくとも４５％まで、選択された対照に対して、少なくとも５０％まで、選択された対照に対して、少なくとも５５％まで、選択された対照に対して、少なくとも６０％まで、選択された対照に対して、少なくとも６５％まで、選択された対照に対して、少なくとも７０％まで、選択された対照に対して、少なくとも７５％まで、選択された対照に対して、少なくとも８０％まで、選択された対照に対して、少なくとも８５％まで、選択された対照に対して、少なくとも９０％まで、選択された対照に対して、少なくとも９５％まで、選択された対照に対して、少なくとも９６％まで、選択された対照に対して、少なくとも９７％まで、選択された対照に対して、少なくとも９８％まで、選択された対照に対して、少なくとも９９％まで減少するのが観察される場合に、β−カテニン阻害活性を持つと見なされる。いくつかの実施形態において、β−カテニンの完全阻害が、Β−カテニン阻害活性をもつと見なされるために、ＤｓｉＲＮＡに対して要求される。特定のモデル（例えば細胞培養）において、ＤｓｉＲＮＡは、好適な対照に対して、β−カテニンレベルの少なくとも５０％の減少が観察される場合に、β−カテニン阻害活性を有すると見なされる。特定の他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、好適な対照に対して、β−カテニンレベルの少なくとも８０％の減少が観察される場合に、β−カテニン阻害活性を有すると見なされる。
特定の例の方法によって、以下の実施例において、一連のＤｓｉＲＮＡ標的化Β−カテニンを、そのような細胞の環境下、およびトランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、１ｎＭ濃度にて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてヒトＨｅＬａまたはマウスＨｅｐａ １−６細胞中のβ−カテニン ｍＲＮＡレベルを減少させる能力に関して試験した。以下の実施例中、β−カテニン阻害活性はまず、アッセイした条件下、β−カテニンｍＲＮＡレベルの少なくとも７０％の減少に効果があると観察されたＤｓｉＲＮＡに対してまずみなした。β−カテニン阻害活性は、同一またはほとんど同じアッセイおよび条件が使用された時でさえ、以下の実施例に対して使用したものとくらべて、よりストリンジェントか、それほどストリンジェントでない条件下のいずれかで、ｄｓＲＮＡに帰することも企図される。例えば、特定の実施形態において、試験した本発明のｄｓＲＮＡは、β−カテニンｍＲＮＡレベルにおいて、好適な対照に対して、少なくとも１０％減少、少なくとも２０％減少、少なくとも３０％減少、少なくとも４０％減少、少なくとも５０％減少、少なくとも６０％減少、少なくとも７５％減少、少なくとも８０％減少、少なくとも８５％減少、少なくとも９０％減少、少なくとも９５％減少が、細胞環境下、１ｎＭ ｄｓＲＮＡ濃度またはそれ以下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞内で観察された場合に、β−カテニン阻害活性を有するとみなされる。
本発明の二本鎖ＲＮＡがβ−カテニン阻害活性を有するかどうかを決定するための他のエンドポイントの利用も企図される。特に、１つの実施形態において、β−カテニンｍＲＮＡレベルを査定することに加えて、またはそれとは別に、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにて、哺乳動物細胞を接触させた４８時間後にて）試験したｄｓＲＮＡの、β−カテニンタンパク質レベルを減少させる能力を査定し、試験したｄｓＲＮＡが、好適な対照と比べて、β−カテニンタンパク質レベルにて、少なくとも１０％減少、少なくとも２０％減少、少なくとも３０％減少、少なくとも４０％減少、少なくとも５０％減少、少なくとも６０％減少、少なくとも７０％減少、少なくとも７５％減少、少なくとも８０％減少、少なくとも８５％減少、少なくとも９０％減少、少なくとも９５％減少が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにて、アッセイした二本鎖ＲＮＡに接触させた哺乳動物内で観察される場合に、β−カテニン阻害活性を有するとみなされる。企図されたさらなるエンドポイントには、例えばβ−カテニンレベルの減少の原因となる表現型−例えば、より詳細に本明細書の他の場所で記述したような、腫瘍または癌細胞レベルの増殖を停止させること、または減少させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて接触させた哺乳動物細胞株の増殖の減少および／またはｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍の増殖の減少の評価が含まれる。
β−カテニン阻害活性をまた、なにが、投与した濃度、および投与後の時間間隔にしたがって調整したβ−カテニン阻害活性を有するｄｓＲＮＡを構成するかという評価で、時間（間隔）にわたり、濃度範囲（強度）にわたり評価可能でもある。したがって、特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、β−カテニン活性において少なくとも５０％の減少が、投与が観察され、存続した後、２時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上の期間で観察される場合に、β−カテニン阻害活性を有すると見なす。さらなる実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、例えば本明細書で記述したようなβ−カテニン阻害活性に対するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ内で、細胞の環境中、１ｎＭまたはそれ以下、５００ｐＭまたはそれ以下、２００ｐＭまたはそれ以下、１００ｐＭまたはそれ以下、５０ｐＭまたはそれ以下、２０ｐＭまたはそれ以下、１０ｐＭまたはそれ以下、５ｐＭまたはそれ以下、２ｐＭまたはそれ以下、または１ｐＭまたはそれ以下の濃度にて、β−カテニン阻害活性（例えば特定の実施形態において、少なくとも５０％のβ−カテニン阻害）が観察された場合、強力なβ−カテニン阻害試薬であると見なす。特定の実施形態において、本発明の強力なβ−カテニン阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達賦形剤（例えば効果的な脂質ナノ粒子製剤）中で対象に投与した時に、１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下の処方された濃度にて、β−カテニン阻害活性（例えば特定の実施形態において、少なくとも２０％のβ−カテニンレベルの減少）を可能なものとして定義される。好ましくは、本発明の強力なβ−カテニン阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達賦形剤中対象に投与された時に、５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下の処方された濃度にて、β−カテニン阻害活性（例えば特定の実施形態において、少なくとも５０％のβ−カテニンレベルの減少）を可能なものとして定義される。より好ましくは、本発明の強力なβ−カテニン阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達賦形剤中対象に投与された時に、５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下の処方された濃度にて、β−カテニン阻害活性（例えば特定の実施形態において、少なくとも５０％のβ−カテニンレベルの減少）を可能なものとして定義される。任意に、本発明の強力なβ−カテニン阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達賦形剤中対象に投与された時に、２ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下、または１ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下の処方された濃度にて、β−カテニン阻害活性（例えば特定の実施形態において、少なくとも５０％のβ−カテニンレベルの減少）を可能なものとして定義される。
特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡの強度を、特定のレベルの標的遺伝子ノックダウンを達成するために必要な標的細胞の細胞質内に存在する、ｄｓＲＮＡのコピー数に対する参照で明らかにする。例えば、特定の実施形態において、強力なｄｓＲＮＡは、１０００またはそれ以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖のコピー数／細胞にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％またはそれより大きなノックダウンを引き起こしうるものである。より好ましくは、強力なｄｓＲＮＡは、５００またはそれ以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖のコピー数／細胞にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％またはそれより大きなノックダウンを引き起こしうるものである。任意に、強力なｄｓＲＮＡは、３００またはそれ以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖のコピー数／細胞にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％またはそれより大きなノックダウンを引き起こしうるものである。
さらなる実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡの強度は、同一の標的遺伝子内の同一の標的配列を指向した１９〜２３ｍｅｒのｄｓＲＮＡに対する参照で定義可能である。例えば、相当する１９〜２３ｍｅｒのｄｓＲＮＡに対して増強した強度を有する本発明のＤｓｉＲＮＡは、強度の差の検出を許容するのに十分低い濃度（例えば、本明細書で記述したようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ中、細胞の環境中１ｎＭまたはそれ以下の、細胞の環境中１００ｐＭまたはそれ以下、細胞の環境中１０ｐＭまたはそれ以下、細胞の環境中１ｎＭまたはそれ以下のトランスフェクション濃度）、とりわけ強度の差は、用量応答曲線を産生し、ＤｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＮＡに関連したＩＣ５０値を同定する目的のための濃度範囲−例えば０．１ｐＭ〜１０ｎＭにわたり、そのようなアッセイを実施することを介してもっともよく検出可能である）にて、本明細書で記述したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでアッセイした時に、相当する１９〜２３ｍｅｒのｄｓＲＮＡと比較して、さらに５％またはそれ以上、さらに１０％またはそれ以上、さらに２０％またはそれ以上、さらに３０％またはそれ以上、さらに４０％またはそれ以上、さらに５０％またはそれ以上まで標的遺伝子を減少させるＤｓｉＲＮＡでありうる。
β−カテニン阻害レベルおよび／またはβ−カテニンレベルはまた、間接的に評価してもよく、例えば、ＭＹＣ、サイクリンＤ１またはＡｘｉｎ２のようなβ−カテニン関連疾患マーカータンパク質または標的遺伝子における減少、または対象中のポリープまたは腫瘍の大きさまたは数の減少の測定を、本発明の二本鎖核酸のβ−カテニンレベルおよび／またはβ−カテニン阻害効果を評価るために使用してよい。
特定の実施形態において、用語「から本質的になる」は、本発明の抗−β−カテニンｄｓＲＮＡの参照にて使用される。いくつかのそのような実施形態において、「から本質的になる」は、β−カテニン阻害活性の少なくとも特定のレベル（例えば、少なくとも５０％のβ−カテニン阻害活性）を有する本発明のｄｓＲＮＡを含み、およびまた、ｄｓＲＮＡのβ−カテニン阻害活性に有意に影響を与えない１つまたはそれ以上のさらなる構成要素および／または修飾も含む組成物を意味する。例えば、特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡおよび／または組成物のｄｓＲＮＡ−関連構成要素の修飾が、単離において、本発明のｄｓＲＮＡに対して、３％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上まで（任意にβ−カテニン阻害活性の強度または間隔を含む）β−カテニン阻害活性を変えない場合、組成物は、本発明のｄｓＲＮＡ「から本質的になる」。特定の実施形態において、組成物は、β−カテニン阻害活性のより劇的な減少（例えば有効性、間隔および／または強度において、８０％減少、９０％減少など）が、さらなる構成要素または修飾の存在下で発生し、そこでまだβ−カテニン阻害活性が、さらなる構成要素および／または修飾の存在下、有意に上昇しない（例えばβ−カテニン阻害活性の観察されたレベルが、本発明の単離されたｄｓＲＮＡに対して観察されたものの１０％以内である）場合でさえ、本発明のｄｓＲＮＡから本質的になると見なされる。
本明細書で使用するところの、用語「ｄｓＲＮＡが、哺乳動物細胞内で、１ナノモルまたはそれ以下の前記細胞の環境下の効果的な濃度にてｉｎ ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、少なくともＸ％までβ−カテニンｍＲＮＡレベルを減少させる」は、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）の存在下、１ナノモルまたはそれ以下のトランスフェクション濃度にて、製造業者の取扱説明書にそってアッセイした時に、少なくともＸ％まで、ＨｅＬａ細胞集団の天然のβ−カテニンｍＲＮＡレベルを減少させるためのｄｓＲＮＡに対する要求を意味する。そのようなＨｅＬａ細胞は、ＡＴＣＣより入手され、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中、３７℃、５％のＣＯ２下で維持する。ついで、β−カテニンｍＲＮＡレベルをトランスフェクション後２４時または４８時でアッセイし、本明細書の他で記述したような適切な対照に関して、％阻害を評価する。特定の実施形態において、そのようなアッセイのＨｅＬａ細胞を、ＨｅｐＧ２、ＨＣＴ１１６、ＨｕＨ７または他の細胞株で置換する。
本明細書で使用するところの用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖形状での、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドおよびそれらのポリマーを意味する。本用語用語は、合成、天然に存在するおよび天然に存在せず、参照の核酸と同様の結合特性を持ち、参照ヌクレオチドとほぼ同じ様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体、または修飾骨格残基または結合を含む核酸を企図する。そのような類似体の例には、ホスホロチオエート類、ホスホルアミデート類、メチルリン酸塩類、キラル−メチルリン酸塩類、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド類、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定はされない。
本明細書で使用するところの「ヌクレオチド」は、天然塩基（標準）および本技術分野でよく知られている修飾塩基を持つものを含み、本技術分野で認識されたように使用される。そのような塩基は一般的に、ヌクレオチド糖部位の１’位に位置している。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸および／または塩基部位にて修飾されないか、修飾されうる（ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドおよびその他として交互に引用される、例えば本明細書にて参考文献によってすべて組み込まれている、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、上記； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．， 国際ＰＣＴ特許第９２／０７０６５号パンフレット；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，国際ＰＣＴ特許第ＷＯ ９３／１５１８７号パンフレット；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ、米国特許第６，３２６，４８７号明細書を参照のこと）。Ｌｉｍｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３，１９９４によって要約されたような、本技術分野で公知の修飾核酸塩基の種々の例が存在する。核酸分子内に導入可能な塩基修飾の非限定例のいくつかは、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン−４−オン、フェニル、ピリジン−２−オン、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン類（例えば５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン類（例えばリボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジン類または６−アルキルピリミジン類（例えば６−メチルウリジン）、プロピンおよびその他（Ｂｕｒｇｉｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４０９０，１９９６；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ，上記）が挙げられる。本態様において、「修飾塩基」は、１’位でのアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルまたはそのそれらの等価物以外のヌクレオチド塩基を意味する。
本明細書で使用するところの「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、ペントース環またはリン酸基への１つまたはそれ以上の修飾を持つヌクレオチドを意味する。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸およびシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド類、およびデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸およびデオキシシチジン一リン酸を含むデオキシリボヌクレオチド類を除外する。修飾には、メチルトランスフェラーゼのような、ヌクレオチドを修飾する酵素による修飾の結果である、天然に発生するものが含まれる。修飾ヌクレオチドにはまた、合成または天然に発生しないヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドにおける合成または天然に存在しない修飾には、２’修飾、例えば２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）を持つもの、または塩基類似体を含むものが含まれる。本明細書のために記述されたような、２’−修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」によって、２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２が意味され、修飾されてよく、または修飾されなくてよい。そのような修飾基は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６７２，６９５号明細書およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，２４８，８７８号明細書にて記述されている。
本明細書の核酸分子に関して、修飾は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の１つまたは両方の鎖上のパターンで、これらの試薬上に存在しうる。本明細書で使用するところの「交互部位」は、すべての他のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであるか、または定義された長さのｄｓＲＮＡの鎖にわたるすべての修飾ヌクレオチド間で修飾されていないヌクレオチド（例えば、修飾されていないリボヌクレオチド）が存在する（例えば５’−ＭＮＭＮＭＮ−３’、３’−ＭＮＭＮＭＮ−５’、式中Ｍは修飾ヌクレオチドであり、Ｎは修飾されていないヌクレオチドである）パターンを意味する。修飾パターンは、例えば本明細書で記述したような、位置ナンバリング慣例にしたがって、５’または３’末端いずれかの第一ヌクレオチド位置から開始する（特定の実施形態において、位置１は、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬の推定されるＤｉｃｅｒ開裂事象に続く鎖の終末残基に関して指定される。したがって位置１は常に、本発明の前処理試薬の３’末端または５’末端残基を構成しない）。交互位置での修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長で走ってよいが、しかし特定の実施形態で、それぞれ、少なくとも２、３、４、５、６または７つの修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４ヌクレオチドが含まれる。本明細書で使用するところの、「位置の交互対」は、２つの連続した修飾ヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡの鎖の定義された長さにわたり、２つの連続した修飾されていないヌクレオチドによって分離されるパターンを意味する（例えば、５’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−３’、３’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−５’、式中Ｍは修飾ヌクレオチドであり、Ｎは修飾されていないヌクレオチドである）。修飾パターンは、本明細書で記述したもののような、位置ナンバリング慣例にしたがって、５’または３’末端いずれかでの、第一ヌクレオチド位置から開始する。交互位置における修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長を走ってよいが、好ましくは、それぞれ、少なくとも４、６、８、１０、１２または１４の修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも８、１２、１６、２０、２４、２８ヌクレオチドが含まれる。上記修飾パターンは例示であり、本発明の範囲における制限は意図しないことを強調したい。
本明細書で使用するところの「塩基類似体」は、核酸二本鎖に組み込むことが可能な修飾ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部位の１’位（または核酸二本鎖内に組み込むことが可能なヌクレオチド糖部位置換中の等価の位置）に位置するヘテロ環状部位を意味する。本発明のｄｓＲＮＡにおいて、塩基類似体は一般的に、一般的塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を除く、プリンまたはピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、ｄｓＲＮＡ中他の塩基または塩基類似体と二本鎖となりうる。塩基類似体には、本発明の化合物および方法にて有用なもの、たとえば、参考文献によって本明細書に組み込まれている、Ｂｅｎｎｅｒに付与された米国特許第５，４３２，２７２号明細書および第６，００１，９８３号明細書、およびＭａｎｏｈａｒａｎに付与された米国公開第２００８０２１３８９１号明細書に開示されたものが含まれる。塩基の非限定例には、ハイポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３−β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソ−シトシン（イソ−Ｃ）、イソ−グアニン（イソ−Ｇ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）およびピロール−２−カルボアルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピローロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボシチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造誘導体（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）；Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（１５）：２９１１−２９１４（２０００）；Ｍｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：２０５６−２０５７（１９９７）；Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：２３２３−２３２４（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１８２−８１８３（１９９６）；Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（６）：１００１−１００７（２０００）；ＭｃＭｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８５−１１５８６（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３：９６５２−９６５６（１９９８）；Ｍｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：１０５０６−１０５１１（１９９７）；Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．，１：１９７−２０６（２００２）；Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．，１：１６０５−１６１１（２００１）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（３２）：７６２１−７６３２（２０００）；Ｏ'Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７：５８６９−５８７５（２００２）；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７：１０４３４−１０４４２（１９９５）；および米国特許第６，２１８，１０８号明細書）が含まれる。塩基類似体はまたユニバーサル塩基であってよい。
本明細書で使用するところの「ユニバーサル塩基」は、核酸二本鎖中に存在する場合に、二本鎖ヘリックス構造（例えばリン酸骨格の構造）を変化させずに、１つ以上の型の塩基と反対に位置可能な、修飾ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部位の１’位、またはヌクレオチド糖部位置換基中の等価位置に位置するヘテロ環状部位を意味する。さらに、ユニバーサル塩基は、標的核酸に対して二本鎖とする一本鎖核酸の能力を破壊しない。ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸の、標的核酸を二本鎖とする能力を、当業者に理解される方法（例えば、ＵＶ吸収、円偏光二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性など）によってアッセイ可能である。さらに、二本鎖形成が観察される条件は、二本鎖安定性または形成を明らかにするために変化してよく、融解温度（Ｔｍ）が、核酸二本鎖の安定性と相関するので、例えば温度が変化してよい。標的核酸に厳密に相補的である参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的核酸と形成された核酸二本鎖よりも低いＴｍを持つ標的核酸と一緒に二本鎖を形成する。しかしながら、ユニバーサル塩基が単一ミスマッチを産出するために塩基で置換された参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチした塩基を持つ核酸と形成された二本鎖よりも、より高いＴｍを持つ標的核酸と二本鎖を形成する。
いくつかのユニバーサル塩基は、塩基対形成条件下、ユニバーサル塩基と、すべての塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）間で水素結合を形成することによって塩基対化可能である。ユニバーサル塩基は、ただ１つの単一相補塩基と塩基対を形成する塩基ではない。二本鎖内で、ユニバーサル塩基は、水素結合を形成しなくてよく、また二本鎖の反対の鎖上、それと反対の各Ｇ、Ｃ、Ａ、ＴおよびＵと１つの水素結合または１つ以上の水素結合を形成してよい。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二本鎖の反対の鎖上で、それと反対の塩基と相互作用しない。二本鎖において、ユニバーサル塩基が関与する塩基対化は、リン酸骨格の二本ヘリックス構造を変えずに発生する。ユニバーサル塩基はまた、スタッキング相互作用によって、同一の核酸鎖上の隣接ヌクレオチド中の塩基と相互作用してもよい。そのようなスタッキング相互作用は、とりわけ、ユニバーサル塩基が、二本鎖の反対の鎖上で、それとは反対に位置する塩基と、任意の水素結合を形成しない条件下で、二本鎖を安定化させる。ユニバーサル−結合ヌクレオチドの非限定例には、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、および／または１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが含まれる（Ｑｕａｙ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第２００７０２５４３６２号、Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ａｃｙｃｌｉｃ ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ａｓ ａｍｂｉｇｕｏｕｓ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９５ Ｎｏｖ １１；２３（２１）：４３６３−７０；Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ ａｎｄ ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ ａｓ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９５ Ｊｕｌ １１；２３（１３）：２３６１−６；Ｌｏａｋｅｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ ａｓ ａｎ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４ Ｏｃｔ １１；２２（２０）：４０３９−４３）。
本明細書で使用するところの「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域の側面の相補領域が、相補領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が、二本鎖形成またはワトソン−クリック塩基対化から除外される方法でハイブリッド形成する、核酸の一本鎖によって形成される構造を意味する。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例には、ヘパリン、ステムループまたは伸長ループのような構造中に存在する、対になっていないヌクレオチドが含まれる。
本明細書で使用するところの、ｄｓＲＮＡの文脈中の「伸長ループ」は、一本鎖ループ、および加えて、１、２、３、４、５、６または２０までの塩基対またはループの側面の二本鎖を意味する。伸長ループ中、５’側上のループの側面に存在するヌクレオチドは、３’側上でループの側面に存在するヌクレオチドと二本鎖を形成する。伸長ループはヘアピンまたはステムループを形成してよい。
本明細書で使用するところの、ｄｓＲＮＡの文脈中の「テトラループ」は、隣接するワトソン−クリックハイブリッド形成ヌクレオチドの安定性に寄与する、安定二次構造を形成する４つのヌクレオチドからなるループ（一本鎖領域）を意味する。理論に制限されることなしに、テトラループは、スタッキング相互作用によって、隣接するワトソン−クリック塩基対を安定化させてよい。加えて、テトラループ中の４つのヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン−クリック塩基対化、スタッキング相互作用、水素結合、および接触相互作用が含まれるが、これらに限定はされない（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９０ Ａｕｇ １６；３４６（６２８５）：６８０−２；Ｈｅｕｓ ａｎｄ Ｐβ−カテニンｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１ Ｊｕｌ １２；２５３（５０１６）：１９１−４）。テトラループは、４つの無作為塩基からなる単一モデルループ配列から推測されるものよりも高い隣接二本鎖の融解温度（Ｔｍ）における増加を与える。例えば、テトラループは、長さにして少なくとも２塩基対の二本鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭ ＮａＨＰＯ４中、少なくとも５５℃の融解温度を与えうる。テトラループには、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよびそれらの混合物が含まれてよい。ＲＮＡテトラループの例には、テトラループのＵＮＣＧファミリ−（例えばＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えばＧＡＡＡ）、およびＣＵＵＧテトラループが含まれる（Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９０ Ｎｏｖ；８７（２１）：８４６７−７１；Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９１ Ｎｏｖ １１；１９（２１）：５９０１−５）。ＤＮＡテトラループの例には、テトラフープのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ）、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ））ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、テトラフープのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えばｄ（ＴＴＣＧ））が含まれる。（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（４８），１４２８１−１４２９２，２００２．；ＳＨＩＮＪＩ ｅｔ ａｌ．Ｎｉｐｐｏｎ Ｋａｇａｋｋａｉ Ｋｏｅｎ Ｙｏｋｏｓｈｕ ＶＯＬ．７８ｔｈ；ＮＯ．２；ＰＡＧＥ．７３１（２０００）．）。
本明細書で使用するところの用語用語「ｓｉＲＮＡ」は、各鎖が、ＲＮＡ、ＲＮＡ類似体（複数可）またはＲＮＡおよびＤＮＡを含む二本鎖核酸を意味する。ｓｉＲＮＡは、１９〜２３ヌクレオチドを含み、または２１ヌクレオチドを含む。ｓｉＲＮＡは典型的には、ｓｉＲＮＡ中の二本鎖領域が１７〜２１ヌクレオチド、または１９ヌクレオチドを含むように、各鎖の３’末端上に２ｂｐオーバーハングを持つ。典型的には、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、β−カテニン遺伝子／ＲＮＡの標的配列と十分に相補的である。
本発明の抗−β−カテニンＤｉＲＮＡは、少なくとも２５ヌクレオチドの鎖長を有する。したがって、特定の実施形態において、抗−β−カテニン ＤｓｉＲＮＡは、１つのオリゴヌクレオチド配列、長さにして少なくとも２５ヌクレオチドであり、３５または５０まででしかない、またはそれ以上のヌクレオチドである、第一配列を含む。ＲＮＡの本配列は、長さにして２６〜３５、２６〜３４、２６〜３３、２６〜３２、２６〜３１、２６〜３０、２６〜２９ヌクレオチドでありうる。本配列は、長さにして２７または２８ヌクレオチドでありえ、長さにして２７ヌクレオチドであり得る。ＤｓｉＲＮＡ試薬の第二配列は、真核細胞の細胞質内のような、生物学的状態下第一配列にアニールする配列でありうる。一般的に、第二オリゴヌクレオチド配列は、第一オリゴヌクレオチドと少なくとも１９の相補塩基対を持ち、より典型的には、第二オリゴヌクレオチド配列は、第一オリゴヌクレオチド配列と、２１またはそれ以上の相補塩基対を持ち、または２５以上の相補塩基対を持つ。１つの実施形態において、第二配列は、第一配列と同一の長さであり、ＤｓｉＲＮＡ試薬は平滑末端である。他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬の末端は１つまたはそれ以上のオーバーハングを持つ。
特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬の第一および第二オリゴヌクレオチド配列は、典型的に化学的に合成される別のオリゴヌクレオチド鎖上に存在する。幾つかの実施形態において、両方の鎖は、長さにして２６〜３５ヌクレオチドである。他の実施形態において、両方の鎖は、長さにして、２５〜３０または２６〜３０である。１つの実施形態において、両方の鎖は、長さにして２７ヌクレオチドであり、完全に相補的であり、平滑末端を持つ。本発明の特定の実施形態において、抗−Β−カテニンＤｓｉＲＮＡの第一および第二配列は、別のＲＮＡオリゴヌクレオチド（鎖）上に存在する。１つの実施形態において、１つまたは両方のオリゴヌクレオチド鎖は、Ｄｉｃｅｒに対する基質として働くことが可能である。他の実施形態において、少なくとも１つの修飾が、遺伝子発現を阻害することにおいて、二本鎖ＲＮＡ構造の有効性を最大化する方向で、Ｄｉｃｅｒに二本鎖ＲＮＡ構造に結合することを促して存在する。本発明の特定の実施形態において、抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡ試薬は、第一鎖（センス鎖）の３’末端で平滑末端を有し、第二鎖（アンチセンス鎖）の３’末端で３’オーバーハングを有する抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡと、長さの異なる２つのオリゴヌクレオチド鎖からなる。ＤｓｉＲＮＡはまた、１つまたはそれ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基置換基を含んでもよい。
２つの別のオリゴヌクレオチドを含む好適なＤｓｉＲＮＡ組成物は、化学結合基によって、それらのアニーリング領域外で化学的に連結可能である。多くの好適な化学連結基が、本技術分野で公知であり、使用可能である。好適な基は、ＤｓｉＲＮＡにおけるＤｉｃｅｒ活性を妨げず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指向性破壊と干渉しない。あるいは、２つの別のオリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造が、ＤｓｉＲＮＡ組成物を作製している２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際して産出されるように、第三オリゴヌクレオチドによって連結可能である。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ上のＤｉｃｅｒ活性を妨げず、標的ＲＮＡの指向性破壊を干渉しない。
本明細書で使用するように、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列（例えばΒ−カテニンｍＲＮＡ）に「十分に相補的な」配列を持つｄｓＲＮＡ、例えばＤｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉ機構（例えばＲＩＳＣ複合体）または工程によって、標的ＲＮＡ（ｃＤＮＡ配列が列挙される場合、列挙されたｃＤＮＡ配列に相当するＲＮＡ配列）の崩壊を引き起こすのに十分な配列を持つことを意味する。例えば、ＲＮＡｉ機構または工程によって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に「十分に相補的な」ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ活性の適切なアッセイ（例えば、以下実施例２にて記述したようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ）中の、標的ＲＮＡのレベルにおける検出可能な減少を引き起こすｄｓＲＮＡとして同定可能であり、またはさらなる実施例において、ＲＮＡｉ機構または工程によって、標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡに十分に相補的なｄｓＲＮＡを、ｄｓＲＮＡ活性の適切なアッセイ中の、標的ＲＮＡのレベルにおける、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の減少を産出するｄｓＲＮＡとして同定可能である。さらなる実施例において、ＲＮＡｉ機構または工程によって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡに十分に相補的なｄｓＲＮＡは、細胞または生物における標的ＲＮＡまたはタンパク質レベルに関して、阻害活性の特定のレベルの期間の評価に基づいて同定可能である。例えば、ＲＮＡｉ機構または工程によって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡに十分に相補的なｄｓＲＮＡは、細胞または生物への前記ｄｓＲＮＡの投与少なくとも４８時間後に、少なくとも２０％まで、標的ｍＲＮＡレベルを減少可能なｄｓＲＮＡとして同定可能である。好ましくは、ＲＮＡｉ機構または工程によって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡに十分に相補的なｄｓＲＮＡは、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも７２時間後に、少なくとも４０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも４、５または７日に、少なくとも４０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも４８時間に、少なくとも５０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも７２時間に、少なくとも５０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも４、５または７日に、少なくとも５０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも４８時間に、少なくとも８０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも７２時間に、少なくとも８０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与後少なくとも４、５または７日に、少なくとも８０％まで、標的ｍＲＮＡレベルを減少可能なｓｄＲＮＡとして同定可能である。
ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖のすべての残基が、標的分子内の残基に相補的であるようにデザイン可能である。あるいは、置換を、分子の安定性を増加させ、および／または処理活性を増強するために、前記分子内で実施可能である。置換は、鎖内にて実施可能であり、または鎖の末端での残基にて実施可能である。特定の実施形態において、置換および／または修飾は、ＤｓｉＲＮＡ試薬内の特定の残基にて実施される。そのような置換および／または修飾には、例えばＤｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端位置からナンバリングした場合、１つまたはそれ以上の位置１、２および３でのデオキシ−修飾、ＤｓｉＲＮＡ試薬のアンチセンス鎖の３’末端残基での、２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）修飾の導入が含まれ、そのような修飾はまた、アンチセンス鎖の３’末端のオーバーハング位置、および活性ｓｉＲＮＡ試薬を形成するために処理されるＤｓｉＲＮＡ試薬の領域内に含まれるＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の交互残基にて実施される。以上の修飾は、例として提供され、任意の様式にて制限の意図はない。本発明の抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡ試薬において実施可能な修飾および置換のさらなる記述を含む、好ましいＤｓｉＲＮＡ試薬の構造のさらなる考慮を以下で見ることが可能である。
第一配列が、本明細書の第二配列に関して「本質的に相補的である」として引用される場合、２つの配列は完全に相補的であってよく、またはそれらの根本的な適用にもっとも関連のある条件下、ハイブリッド形成する能力を維持したまま、それらはハイブリッド形成に際して、１つまたはそれ以上に、しかし一般的に４、３または２以下のミスマッチ塩基を形成してよい。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリッド形成に際して、１つまたはそれ以上の一本鎖オーバーハングを形成するようにデザインされる場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関して、ミスマッチとして見なされるものではない。例えば、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含む場合、長さにして２１ヌクレオチドの１つのオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡと、長さにして２３ヌクレオチドの他のオリゴヌクレオチドがまた、本発明の目的に対して、「完全に相補的である」としてまた引用されてよい。
本明細書で使用する、用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、以上で定義したような、２つの逆平行および本質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を持つ、リボ核酸分子の複合体を意味する。二本鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより長いＲＮＡ分子の異なる位置であってよく、別々のＲＮＡ分子であってよい。別々のＲＮＡ分子の場合、そのようなｄｓＲＮＡはしばしば、ｓｉＲＮＡ（「短い干渉ＲＮＡ」）またはＤｓｉＲＮＡ（「Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ」）として引用される。２つの鎖が１つのより長い分子の一部分である場合、したがって二本鎖構造を形成する１つの鎖の３’末端と、個々の他の鎖の５’末端間のヌクレオチドの干渉しない鎖によって連結される場合、連結しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」、「短ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」として引用される。２つの鎖が、二本鎖構造を形成する１つの鎖の３’末端と、個々の他の鎖の５’末端間のヌクレオチドの干渉しない鎖以外の方法によって共有的に連結する場合、連結している構造は、「リンカー」として引用される。ＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを持ってよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡのもっとも短い鎖中のヌクレオチドの数から二本鎖中に存在する任意のオーバーハングを引いたものである。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。加えて、本明細書で使用するところの「ｄｓＲＮＡ」には、多重ヌクレオチドにおける本質的な修飾を含み、本明細書で開示されたか、本技術分野で公知のすべての型の修飾を含む、リボヌクレオチド、ヌクレオシド間結合、末端基、キャップおよび共役部位への化学的修飾が含まれうる。ｓｉＲＮＡ−またはＤｓｉＲＮＡ−型分子内で使用されるような、任意のそのような修飾は、本明細書および請求項の目的に対して、「ｄｓＲＮＡ」によって包含される。
用語「二本鎖領域」は、ワトソン−クリック塩基対化または相補的であるか、または本質的に相補的であるオリゴヌクレオチド鎖間の二本鎖に対して許容する他の様式のいずれかによって、互いに塩基対を形成する２つの相補的であるか、または本質的に相補的なオリゴヌクレオチド中の領域を意味する。例えば、２１ヌクレオチドユニットを持つオリゴヌクレオチド鎖は、２１ヌクレオチドユニットの他のオリゴヌクレオチドと塩基対化可能であり、「二本鎖領域」が１９塩基対からなるように、各鎖上の１９塩基のみが、相補的であるか、本質的に相補的である。残りの塩基対は、例えば、５’および３’オーバーハングとして存在する。さらに、二本鎖領域内で、１００％の相補性は要求されず、本質的な相補性が二本鎖領域内で許容可能である。本質的な相補性は、生物学的条件下でアニーリング可能であるような、鎖間の相補性を意味する。２つの鎖が、生物学的条件下でアニーリング可能であるかどうかを実験的に明らかにするための技術が、本技術分野でよく公知である。あるいは、２つの鎖を、それらが互いにアニールするかどうかを明らかにするために、合成し、生物学的条件下で一緒に加えることが可能である。
多数の塩基にわたり塩基対を形成する一本鎖核酸が、「ハイブリダイズする」と呼ばれる。ハイブリッド形成は、生理学的および生物学的に関連のある条件（例えば、細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン、細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）下で典型的に決定される。ハイブリッド形成条件は一般的に、一価カチオンと生物学的に許容可能な緩衝液を含み、二価カチオン、複合体アニオン、例えばグルタミン酸カリウムからのグルタミン酸、スクロースのような非荷電種、および例えばＰＥＧといった試料中の水の活性を減少させるための不活性ポリマーを含んでよく、または含まなくてよい。そのような条件には、塩基対が形成される条件が含まれる。
ハイブリッド形成は、二本鎖を形成している一本鎖核酸を乖離させるために必要な温度、すなわち（融解温度、Ｔｍ）によって測定される。ハイブリッド形成条件はまた、塩基対が形成されうる条件である。種々のストリンジェントな条件を使用して、ハイブリッド形成を決定可能である（Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ．Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照のこと）。ストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約３０℃の、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。長さにして５０塩基対以下であると予想されるハイブリッドに対するハイブリッド形成温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の５〜１０℃下であるべきであり、そこでＴｍは、以下の等式にしたがって決定される。長さにして１８塩基対以下のハイブリッドに対して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さにして１８〜４９塩基対のハイブリッドに対して、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍに対する［Ｎａ＋］）。例えば、ハイブリッド形成決定緩衝液を表１に示す。
表１
Figure 0005976643
ハイブリッド形成条件における有用な変化が、当業者に容易に理解されるであろう。ハイブリッド形成技術は、当業者によく公知であり、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにて記述されている。
本明細書で使用するところの、「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド（例えば２’修飾を持つヌクレオチド、合成塩基類似体など）またはそれらの組み合わせを含んでよい。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取込の増強、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加のような特性のために、天然の形態より好ましい。
本明細書で使用するところの用語「リボヌクレオチド」は、天然および合成、非修飾および修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分に対する、塩基部分に対する、および／またはオリゴヌクレオチド中のリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの用語「リボヌクレオチド」はとりわけ、２’リボース環位置にて、単一プロトン基を有するヌクレオチドである、デオキシリボヌクレオチドを除外する。
本明細書で使用するところの用語「デオキシリボヌクレオチド」は、天然および合成、非修飾および修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分に対する、塩基部分に対する、および／またはオリゴヌクレオチド中のデオキシリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの用語「デオキシリボヌクレオチド」にはまた、ｄｓＲＮＡ試薬のＤｉｃｅｒ開裂を許容しない修飾リボヌクレオチド、例えば、そのような残基の結合においてＤｉｃｅｒ開裂が発生することを許容しない、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート−修飾リボヌクレオチド残基なども含まれる。
本明細書で使用するところの用語「ＰＳ−ＮＡ」は、ホスホロチオエート−修飾ヌクレオチド残基を意味する。用語「ＰＳ−ＮＡ」はしたがって、ホスホロチオエート−修飾リボヌクレオチド（「ＰＳ−ＲＮＡ」）およびホスホロチオエート−修飾デオキシリボヌクレオチド（「ＰＳ−ＤＮＡ」）両方を包含する。
本明細書で使用するところの「Ｄｉｃｅｒ」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−含有分子、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはプレ−ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、通常３’末端に２塩基オーバーハングを持つ、二本鎖核酸断片１９〜２５ヌクレオチド長に開裂する、ＲＮａｓｅ ＩＩＩファミリー内のエンドリボヌクレアーゼを意味する。本発明のｄｓＲＮＡに関して、本発明の試薬のｄｓＲＮＡ領域によって形成される二本鎖は、Ｄｉｃｅｒによって認識され、二本鎖の少なくとも１つの鎖上Ｄｉｃｅｒ基質である。Ｄｉｃｅｒは、ＲＮＡ干渉経路中の第一段階を触媒し、結果として、標的ＲＮＡの分解にいたる。ヒトＤｉｃｅｒのタンパク質配列は、寄託番号ＮＰ＿０８５１２４下、ＮＣＢＩデータベースにて提供され、引用によって本明細書で組み込まれる。
Ｄｉｃｅｒ「開裂」は、以下に明らかにされている（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：１８７-２００（２００８）を参照のこと）。Ｄｉｃｅｒ開裂アッセイにおいて、ＲＮＡ二本鎖（１００ｐｍｏｌ）を、１ユニットの組換え体ヒトＤｉｃｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ，カリフォルニア州）あり、またはなしで、２０μＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２中、３７℃にて１８〜２４時間インキュベートする。試料を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ ＳＲ９６−穴プレート（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ゲイザースバーグ，メリーランド州）を用いて脱塩する。Ｄｉｃｅｒでの前処理および後処理二本鎖ＲＮＡの電子噴霧イオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＴＳＱ７０００、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム、ＰｒｏＭａｓｓデータ処理ソフトウェアおよびＰａｒａｄｉｇｍ ＭＳ４ ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，オーバーン，カリフォルニア州）からなるＯｌｉｇｏ ＨＴＣＳシステム（Ｎａｖａｔｉａ，プリンストン，ニュージャージー州：Ｈａｉｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）を用いて実施する。本アッセイにおいて、Ｄｉｃｅｒ開裂が、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のＤｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ（すなわち２５〜３０ｂｐ、ｄｓＲＮＡ、好ましくは２６〜３０ｂｐ ｄｓＲＮＡ）が、より短いｄｓＲＮＡ（例えば、１９〜２３ｂｐ ｄｓＲＮＡ、好ましくは２１〜２３ｂｐ ｄｓＲＮＡ）に開裂される場で発生する。
本明細書で使用するところの「Ｄｉｃｅｒ開裂部位」は、ＤｉｃｅｒがｄｓＲＮＡ（例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬のｄｓＲＮＡ領域）を開裂する部位を意味する。Ｄｉｃｅｒは、典型的にｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖両方を開裂する、２つのＲＮａｓｅＩＩＩドメインを含む。ＲＮａｓｅＩＩＩドメインとＰＡＺドメイン間の平均距離が、産出する短い二本鎖核酸断片の長さを決定し、この距離は、変化可能である（Ｍａｃｒａｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１：１９５−８）。図１に示すように、Ｄｉｃｅｒは、アンチセンス鎖の３’末端から除去された、２１番目と２２番目のヌクレオチド間の部位にて、およびセンス鎖の５’末端より除去された、２１番目と２２番目のヌクレオチド間の相当する部位で、２ヌクレオチド３’オーバーハングを持つアンチセンス鎖を有する、本発明の特定の二本鎖リボ核酸を開裂すると予想される。図１にて描写したものと異なる、ｄｓＲＮＡ分子に対する予想された、および／または一般的なＤｉｃｅｒ開裂部位（複数可）は、Ｍａｃｒａｅ ｅｔ ａｌ．にて記述されたものを含む、本技術分野で認識される方法を介して、同様に同定されうる。図１に記述のＤｉｃｅｒ開裂事象が、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡを産出する一方で、ｄｓＲＮＡ（例えばＤｓｉＲＮＡ）のＤｉｃｅｒ開裂が結果として、長さにして１９〜２３ヌクレオチドのＤｉｃｅｒ−処理ｓｉＲＮＡ長の産出となりうることに留意されたい。実際、特定の実施形態において、二本鎖ＤＮＡ領域は、２１ｍｅｒではなく、一般的にに好ましくない１９ｍｅｒまたは２０ｍｅｒのｓｉＲＮＡの一般的なＤｉｃｅｒ切除を指向する目的のために、ｄｓＲＮＡ内に含まれてよい。
本明細書で使用するところの、「オーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの５’末端または３’末端にて１つまたはそれ以上の遊離末端を持つ二本鎖の文脈において、対になっていないヌクレオチドを意味する。特定の実施形態において、オーバーハングは、アンチセンス鎖またはセンス鎖上の３’または５’オーバーハングである。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、１〜６ヌクレオチド、任意に１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６ヌクレオチド、または１、２、３、４、５または６ヌクレオチドの長さを持つ３’オーバーハングである。
本発明のｄｓＲＮＡは、二本鎖構造を形成するためにハイブリッド形成するのに十分に相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの１つの鎖（アンチセンス鎖）は、β−カテニン標的遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列から誘導された、標的配列に本質的に相補的な、一般的には完全に相補的な相補性の領域を含み、他の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、それによって２つの鎖は、好適な条件下で結合した時に、ハイブリッド形成し、二本鎖構造を形成する。一般的に、二本鎖構造は、長さにして１５〜３５、任意に２５〜３０、２６〜３０、１８〜２５、１９〜２４または１９〜２１塩基対である。同様に、標的配列に相補的な領域は、長さにして、１５〜３５、任意に１８〜３０、２５〜３０、１９〜２４または１９〜２１ヌクレオチドである。本発明のｄｓＲＮＡはさらに、１つまたはそれ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング（複数可）を含んでよい。（一般的に長さにして２５塩基対の）ＤｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ（特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖構造は、２０〜２３、任意に特に２１塩基対）を含む、長さにして１５〜３５塩基対の二本鎖構造を含むｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導することにおいて効果的であり得ることが明らかにされてきた（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２０：６８７７−６８８８）。また、２０塩基対より短い二本鎖を有するｄｓＲＮＡも同様に効果的であり得ることが同定されてきた（例えば１５、１６、１７、１８または１９塩基対）。特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、１９ヌクレオチドまたはそれ以上の長さの少なくとも１つの鎖を含みうる。特定の実施形態において、以下の表１０の配列の１つに相補的な配列から１つまたは両方の末端上の２〜３個のヌクレオチドを引くことを含む、より短いｄｓＲＮＡが、上述および表２〜５および７〜１０にて記述したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得る。したがって、表１０の配列の１つに十分に相補的な、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の近接するヌクレオチドの部分配列を含み、完全な配列を含むｄｓＲＮＡから５、１０、１５、２０、２５または３０％以下の阻害まで、本発明で記述したようなアッセイにて、Β−カテニン標的遺伝子の発現を阻害する能力において異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって企図される。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端が、１〜５、任意に１〜４、特定の実施形態において、１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを持つ。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを持つ特定のｄｓＲＮＡ構造は、ｄｓＲＮＡ分子の両端にて、塩基対形成平滑末端を有する相当物と比較して、優れた阻害特性を有する。
本明細書で使用するところの用語「ＲＮＡ処理」は、以下により詳細に記述されている（以下「ＲＮＡ処理」項目を参照のこと）ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはＲＮａｓｅ Ｈ経路の構成要素（例えばＤｒｏｓｈａ、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２または他のＲＩＳＣエンドリボヌクレアーゼおよびＲＮａｓｅＨ）によって行われる処理活性を意味する。本用語は、ＲＮＡの５’キャッピングの転写後工程と、非ＲＩＳＣまたは非ＲＮａｓｅ Ｈ−仲介工程を介したＲＮＡの分解と明示的に区別される。ＲＮＡのそのような「分解」は、例えば脱アデニル化（３’ポリ（Ａ）テールの除去）、および／または１つまたはそれ以上の種々のエンド−またはエキソ−ヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅＡ（１、２、３、４／５）、オリゴヌクレオチダーゼなど）による、ＲＮＡの本体の部分または全てのヌクレアーゼ消化といった種々の形態を取り得る。
「相同配列」によって、遺伝子、遺伝子転写産物および／または非コードポリヌクレオチドのような、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列によって共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は、サイトカインおよびその対応する受容体のような、遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質イソフォームまたは完全に相違する遺伝子のような、関係性はあるが異なるタンパク質をコードしている２つまたはそれ以上の遺伝子によって共有されるヌクレオチド配列でありうる。相同配列は、非コードＤＮＡまたはＲＮＡ、制御配列、イントロン、および転写制御または調節の部位のような、２つまたはそれ以上の非コードポリヌクレオチドによって共有されるヌクレオチド配列でありうる。相同配列はまた、１つ以上のポリヌクレオチド配列によって共有される保存配列領域を含みうる。相同性は、部分相同配列（例えば９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％など）もまた本発明で企図されるので、完全相同性（例えば１００％）である必要はない。実際、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬のデザインおよび利用は、本明細書で記述したＤｓｉＲＮＡ試薬と完全な相補性を有するβ−カテニンの標的ＲＮＡに対してのみでなく、前記ＤｓｉＲＮＡ試薬に対して例えば９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％等だけ相補的である配列を有するβ−カテニンＲＮＡに対しての、そのようなＤｓｉＲＮＡ試薬を利用する可能性を企図する。同様に、本発明の本明細書で記述されたＤｓＲＮＡ試薬は、前記ＤｓｉＲＮＡ試薬と標的β−カテニンＲＮＡ、例えばβ−カテニンの特定の対立変異体（例えば増強された治療対象の対立遺伝子）間の相補性の程度を増強するために、当業者によって簡単に変更されうる。実際、標的β−カテニン配列に関する挿入、欠損および単一点変異を持つＤｓｉＲＮＡ試薬配列がまた、阻害に対して効果的であり得る。あるいは、ヌクレオチド類似体置換または挿入を持つＤｓｉＲＮＡ試薬配列が阻害に対して効果的であり得る。
配列同一性は、本技術分野で公知の配列比較および整列アルゴリズムによって明らかしてよい。２つの核酸配列の（または２つのアミノ酸配列の）パーセント同一性を明らかにするために、配列を比較の目的で整列させる（例えばギャップを、最適配列のために、第一配列または第二配列中に導入可能である）。対応するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置でのヌクレオチド（またはアミノ酸残基）をついで比較する。第一配列中の位置が、第二配列中の相当する位置と同様の残基によって占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有された同一の位置の数の関数であり（すなわち％相同性＝同一位置の＃／位置．時間．１００の総＃）、任意に、導入されたギャップの数および／または導入されたギャップの長さに対するスコアをを科してもよい。
２つの配列間の配列の比較と、パーセント同一性の決定を、数学的アルゴリズムを用いて実施可能である。１つの実施形態において、整列は、十分な同一性をもって整列させた整列の特定の部分にわたり、しかし低度の同一性を持つ部分にはわたらず（すなわち局所配列）産出された。配列の比較のために使用した局所整列アルゴリズムの好ましい、非限定例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７７にてのように修飾された、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれる。
他の実施形態において、ギャップ整列は、適切なギャップを導入することによって形成され、パーセント同一性が、整列した配列の長さにわたり決定される（すなわちギャップ整列）。比較の目的のために、ギャップ整列を得るために、ギャップＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２にて記述したように使用可能である。他の実施形態において、グローバル整列が、適切なギャップを導入することによって形成され、パーセント同一性が、整列した配列の全長にわたり決定される。配列のグローバル比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する時に、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用可能である。
ＤｓｉＲＮＡアンチセンス鎖およびβ−カテニンＲＮＡ配列の部分間の８０％より大きな配列同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性が好ましい。あるいは、ＤｓｉＲＮＡは、β−カテニンＲＮＡの一部とハイブリッド形成可能なヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義してよい（例えば、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２〜１６時間の５０℃または７０℃ハイブリッド形成とそれに続く洗浄）。さらなる好ましいハイブリッド形成条件には、１×ＳＳＣ中７０℃、または１×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリッド形成と、続く０．３×ＳＳＣ中７０℃での洗浄、または４×ＳＳＣ中７０℃、または４×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリッド形成と、続く１×ＳＳＣ中６７℃での洗浄が含まれる。長さにして５０塩基対以下であると見込まれるハイブリッドに対するハイブリッド形成温度は、当該ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低いものであり、Ｔｍは以下の等式にしたがって決定される。長さにして１８塩基対より少ないハイブリッドに対して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さにして１８〜４９塩基対のハイブリッドに対して、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍに対する［Ｎａ＋］）。ポリヌクレオチドハイブリッド形成に対するストリンジェントな条件のさらなる例が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，９および１１章、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，項目２．１０および６．３〜６．４にて提供される。等しいヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７または３０塩基であってよい。
「保存配列領域」によって、ポリヌクレオチド内の１つまたはそれ以上の領域のヌクレオチド配列が、世代間で、または１つの生物学的システム、対象または生命体から、他の生物学的システム、対象または生命体の間に有意に変化しないことを意味する。ポリヌクレオチドは、コードおよび非コードＤＮＡおよびＲＮＡ両方を含みうる。
「センス領域」によって、ＤｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を持つＤｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ＤｓｉＲＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を持つ核酸配列を含みうる。
「アンチセンス領域」によって、標的核酸配列に対して相補性を持つＤｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ＤｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域は、ＤｓｉＲＮＡ分子のセンス領域に対して相補性を持つ核酸配列を含む。
本明細書で使用するところの「アンチセンス鎖」は、標的ＲＮＡのものに対して相補的な配列を持つ、一本鎖核酸分子を意味する。アンチセンス鎖が、塩基類似体で修飾されたヌクレオチドを含む場合、その全長にわたり相同的である必要はないが、少なくとも標的ＲＮＡでハイブリッドしなければならない。
本明細書で使用するところの「センス鎖」は、アンチセンス鎖のものに対して相補的な配列を持つ、一本鎖核酸分子を意味する。アンチセンス鎖が、塩基類似体で修飾されたヌクレオチドを含む場合、センス鎖は、アンチセンス鎖の全長にわたり相補的である必要はないが、しかしアンチセンス鎖と少なくとも二本鎖を形成しなければならない。
本明細書で使用するところの「ガイド鎖」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−含有分子の一本鎖核酸分子を意味し、結果としてＲＮＡ干渉となる、標的ＲＮＡのものと十分に相補的である配列を持つ。ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子の開裂後、ガイド鎖の断片が、ＲＩＳＣに結合したままとなり、ＲＩＳＣ複合体の一成分として標的ＲＮＡに結合し、ＲＩＳＣによって標的ＲＮＡの開裂を促進する。本明細書で使用するように、ガイド鎖は、連続一本鎖核酸を意味する必要はなく、好ましくはＤｉｃｅｒによる開裂の部位で、不連続性を含んでよい。ガイド鎖はアンチセンス鎖である。
本明細書で使用するところの「パッセンジャー鎖」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を意味し、ガイド鎖のものと相補的である配列を持つ。本明細書で使用するように、パッセンジャー鎖は、連続一本鎖核酸を意味する必要はなく、好ましくはＤｉｃｅｒによる開裂の部位で、不連続性を含んでよい。パッセンジャー鎖はセンス鎖である。
「標的核酸」によって、その発現、レベルまたは活性が調整されるべきである核酸配列を意味する。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。ＡＲを標的とする試薬に関して、特定の実施形態において、標的核酸はβ−カテニンＲＮＡでありうる。β−カテニンＲＮＡ標的部位はまた、相当するｃＤＮＡ配列によって互換的に参照されうる。β−カテニンのレベルはまた、β−カテニンの上流効果器の標的化を介して標的化されてよく、または調整されたまたは誤調節されたβ−カテニンの効果がまた、β−カテニンシグナル伝達経路中のβ−カテニンの下流の分子の標的化によって調整されてもよい。
「相同性」によって、核酸が、伝統的なワトソン−クリック、または他の非伝統的な型のいずれかによって、他の核酸配列と水素結合（複数可）を形成可能であることを意味する。本発明の核酸分子に関して、その相補的な配列を持つ核酸分子に対する結合自由エネルギーは、核酸の関連ある機能、例えばＲＮＡｉ活性を進めることを許容するのに十分である。核酸分子に対する結合自由エネルギーの決定が、本技術分野でよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照のこと）。パーセント相補性は、第二核酸配列と水素結合を形成可能な（例えばワトソン−クリック塩基対化）核酸分子中の近接する残基の割合を示唆する（例えば１０ヌクレオチドを持つ第二核酸配列に対して対となる、第一オリゴヌクレオチド中の合計１０ヌクレオチドのうち５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相同性を表す）。「完全に相補的」は、核酸配列の近接する残基の全てが、第二核酸配列中の同一の数の近接する残基と水素結合することを意味する。１つの実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、１つまたはそれ以上の標的核酸分子またはそれらの部分に対して相補的である、１９〜３０（例えば１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０またはそれ以上）のヌクレオチドを含む。
１つの実施形態において、β−カテニン遺伝子発現を下方制御または減少させる本発明のＤｓｉＲＮＡ分子を、対象または生命体内のΒ−カテニン関連疾患または障害（例えば癌）を治療する、予防するまたは減少させるために使用する。
本発明の１つの実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の各配列は、独立して、長さにして２５〜３５ヌクレオチド、特定の実施形態において、長さにして２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチドである。他の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ二本鎖は独立して、２５〜３０塩基対（例えば２５、２６、２７、２８、２９または３０）を含む。他の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の１つまたはそれ以上の鎖は、標的（ＡＲ）核酸分子に相補的である、１９〜３５ヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５）を含む。特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、長さにして２５〜３４ヌクレオチド（例えば長さにして２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４ヌクレオチド、全てのそのようなヌクレオチドは、反対の鎖の同種ヌクレオチドと塩基対を形成する）の二本鎖ヌクレオチドの長さを有する。（本発明の典型的ＤｓｉＲＮＡ分子を図１および以下に示す。
本明細書で使用するところの「細胞」は、その通常の生物学的意味において使用され、全多細胞生物を意味せず、例えば特にヒトを意味しない。細胞は、生命体、例えば鳥類、植物およびヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌおよびネコのような哺乳動物中に存在しうる。細胞は、原核生物（例えば細菌細胞）または真核生物（例えば哺乳動物または植物細胞）でありうる。細胞は、体細胞または生殖細胞由来、全能細胞または多能性細胞、分裂細胞または非分裂細胞でありうる。細胞はまた、配偶子または胚、幹細胞または完全に分化した細胞から由来してもよく、または含んでもよい。特定の態様内で、用語「細胞」は、本明細書の１つまたはそれ以上の単離されたｄｓＲＮＡ分子を含むヒト細胞のような特に哺乳動物細胞を意味する。特定の態様において、細胞は、結果として標的核酸のＲＮＡ干渉となる、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子を有し、ＲＮＡｉに対して必要とされるタンパク質およびタンパク質複合体、例えばＤｉｃｅｒおよびＲＩＳＣを含む。
特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ（「
ＤｓｉＲＮＡ」）である。ＤｓｉＲＮＡは、ｄｉｃｅｒ基質ではない阻害核酸（「非ＤｓｉＲＮＡ」）と比較して、特定の利点を有しうる。そのような利点には、非ＤｓｉＲＮＡに対して、ＤｓｉＲＮＡの効果の期間の増強、ならびに各阻害核酸が好適に処方され、同一の濃度で、哺乳動物細胞内の阻害活性に関して評価される時、非ＤｓｉＲＮＡ（例えば１９〜２３ｍｅｒ１のｓｉＲＮＡ）と比較した、ＤｓｉＲＮＡの阻害活性の増強が含まれるが、これらに限定はされない（後者のシナリオの場合、ＤｓｉＲＮＡは、非ＤｓｉＲＮＡよりもより強力なものとして同定されうる）。非ＤｓｉＲＮＡに対するＤｓｉＲＮＡの強度の増強の検出はしばしば、結果としてＤｉｓＲＮＡが、標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）におけるおよそ３０〜７０％のノックダウン活性を誘発することとなる、処方された濃度（例えばｄｓＲＮＡのトランスフェクション濃度）でほぼ容易に達成される。活性ＤｓｉＲＮＡに関して、そのようなノックダウン活性のレベルは、ほとんどの場合、１ｎＭまたはそれ以下の好適に処方されたｉｎ ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞のＤｓｉＲＮＡ形質移入濃度で達成され、特定の例において、２００ｐＭまたはそれ以下、１００ｐＭまたはそれ以下、５０ｐＭまたはそれ以下、２０ｐＭまたはそれ以下、１０ｐＭまたはそれ以下、５ｐＭまたはそれ以下、または１ｐＭまたはそれ以下のＤｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度で観察される。実際、標的ＲＮＡの３０〜７０％ノックダウンが観察される正確な濃度のＤｓｉＲＮＡ間の変動に起因して、効果的な濃度の範囲にわたる、ＤｓｉＲＮＡおよび非ＤｓｉＲＮＡの阻害活性の評価を介した、ＩＣ５０曲線の構築が、非ＤｓｉＲＮＡ阻害試薬に対するＤｓｉＲＮＡの強度の増強した能力を検出するための好ましい方法である。
特定の実施形態において、（Ｄｉｃｅｒ開裂前、最初に形成されたような状態での）ＤｓｉＲＮＡは、その中に含まれる１９、２０、２１、２２または２３塩基対配列よりも、哺乳動物細胞中のβ−カテニン標的遺伝子発現を減少させることにおいて、より強力である。特定のそのような実施形態において、ｄｉｃｅｒ開裂前のＤｓｉＲＮＡは、その中に含まれる１９〜２１ｍｅｒより強力である。任意に、ｄｉｃｅｒ開裂前のＤｓｉＲＮＡは、（それによって、ｄＴｄＴオーバーハングを持つ２１ヌクレオチド鎖長を有するｓｉＲＮＡを形成する）対称ｄＴｄＴオーバーハングで合成される、その中に含まれた１９塩基対二本鎖よりも強力である。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される２１ヌクレオチド標的配列の少なくとも１５ヌクレオチドを標的とする、１９〜２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡ（例えばｄＴｄＴオーバーハングを持つ１９塩基対二本鎖）よりも強力である（理論に結びつける希望はなしに、ＤｓｉＲＮＡに対するそのような標的部位の同一性は、ＤｓｉＲＮＡに対するＡｇｏ２開裂部位の同定を介して明らかにされる。いったんＤｓｉＲＮＡのＡｇｏ２開裂部位がＤｓｉＲＮＡに対して決定されたらば、任意の他の阻害ｄｓＲＮＡに対するＡｇｏ２開裂部位の同定が実施され、それらのＡｇｏ２開裂部位を整列可能であり、それによって多数のｄｓＲＮＡに対する予想された標的ヌクレオチド配列の整列が決定される）。特定の関連した実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される２１ヌクレオチド標的配列の少なくとも２０ヌクレオチドを標的とする、１９〜２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも強力である。任意に、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、１９〜２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも強力である。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、任意の２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも強力である。任意に、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、任意の２１または２２ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも強力である。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする任意の２１、２２または２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡより強力である。以上に言及するように、そのような強度の評価は、１ｎＭまたはそれ以下の濃度で、好適に処方された（例えば適切なトランスフェクト試薬で処方された）ｄｓＲＮＡにおいてもっとも効果的に実施される。任意に、ＩＣ５０による評価を、効果的な阻害濃度の範囲にわたる活性を評価するために実施し、それによって、アッセイされたｄｓＲＮＡの相対的な強度のしっかりとした比較が許容される。
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、直接加えられ、または脂質（例えばカチオン性脂質）と複合体化、リポソーム内にパッケージ、または標的細胞または組織に伝達可能である。核酸または核酸複合体を、バイオポリマー内への組み込みあり、またはなしで、直接皮膚適用、経皮適用、または注射を介して、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、関連する組織に局所的に投与可能である。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、図１に示す配列と、以下の典型構造を含む。そのような核酸分子の実施例は、これらの図および典型構造にて定義した構造から本質的になる。さらに、そのような試薬を、ＤｓｉＲＮＡ試薬の修飾パターン化の以下の記述にしたがって修飾する場合、図１にて記述された構造物の化学的に修飾された形態、および以下の典型構造を、図１および以下の典型構造のＤｓｉＲＮＡ試薬に対して記述した全ての使用において利用可能である。
他の態様において、本発明は、本発明の１つまたはそれ以上のＤｓｉＲＮＡを含む哺乳動物細胞を提供する。１つまたはそれ以上のＤｓｉＲＮＡ分子は独立して、同一または異なる部位を標的とすることが可能である。
「ＲＮＡ」は、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも４、８および１２リボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。少なくとも４、８または１２のＲＮＡ残基は近接してよい。「リボヌクレオチド」によって、β−Ｄ−リボフラノース部位の２’位でヒドロキシル基を持つヌクレオチドを意味する。本用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製したＲＮＡのような単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えで産出されたＲＮＡ、ならびに１つまたはそれ以上のヌクレオチドの添加、欠損、置換および／または変更によって、天然に存在するＲＮＡとは異なる変更ＲＮＡが含まれる。そのような変更には、ＤｓｉＲＮＡの末端（複数可）または例えばＲＮＡの１つまたはそれ以上のヌクレオチドで内部で、非ヌクレオチド物質の添加が含まれる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのような、非標準のヌクレオチドも含みうる。これらの変化したＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体として引用可能である。
「対象」は、移植された細胞のドナーまたはレシピエントまたは細胞それら自身である、生命体を意味する。「対象」はまた、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を投与可能な生命体を意味する。対象は、ヒトまたはヒト細胞を含む、哺乳動物または哺乳動物細胞でありうる。
用語「薬理学的に許容可能な担体」は、治療薬剤の投与のための担体を意味する。典型的な担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせが含まれる。経口で投与される薬物に対して、薬理学的に許容可能な担体には、不活性希釈液、分散剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味料、着色料および保存料などのような、薬理学的に許容可能な賦形剤が含まれるが、これらに限定はされない。好適な不活性希釈液には、炭酸ナトリウムおよびカリウム、リン酸ナトリウムおよびカリウムおよびラクトースが含まれ、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸が好適な分散剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが含まれてよく、潤滑剤は存在するのであれば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクが一般的である。望むのならば、消化器管での吸収を遅延させるために、錠剤を一ステアリン酸塩グリセリルまたは二ステアリン酸塩グリセリルのような物質でコーティングしてよい。開示されたｄｓＲＮＡの薬理学的に許容可能な担体は、リポソーム、カプシド、カプソイド、ポリマー性ナノカプセルまたはポリマー性ミクロカプセルのようなミセル構造であってよい。
ポリマー性ナノカプセルまたはマイクロカプセルは、カプセル封入されたか、または結合したｄｓＲＮＡの細胞内への伝達および放出を促進する。これらには、とりわけポリブチルシアノアクリレートを含む、ポリマー性および単量体物質が含まれる。物質および製造法の要約が発行されている（Ｋｒｅｕｔｅｒ，１９９１を参照のこと）。ポリマー化／ナノ粒子産出段階で、単量体および／または多量体前駆体から形成されるポリマー性物質は、ナノ粒子を製造する領域の当業者が通常の技術にしたがって好適に選択してよいポリマー性物質の分子量および分子量分布であるように、先行技術からそれ自体公知である。
本発明の種々の方法には、本明細書で「適切な制御」として互換的に引用される、「好適な制御」に対して、値、レベル、機能、特徴、特性などを比較することを含む段階が含まれる。「好適な制御」または「適切な制御」は、比較の目的のために有用な、当業者によく知られた制御または標準である。１つの実施形態において、「好適な制御」または「適切な制御」は、本明細書で記述したような、ＲＮＡｉ法を実施する前に決定される、値、レベル、機能、特徴、特性などである。例えば、転写率、ｍＲＮＡレベル、翻訳率、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞特徴または特性、遺伝子型、表現型などを、本発明のＲＮＡサイレンシング試薬（例えばＤｓｉＲＮＡ）を細胞または生物内に導入する前に決定可能である。他の実施形態において、「好適な制御」または「適切な制御」は、細胞または生物内で決定される値、レベル、機能、特徴、特性など、例えば正常な形質を示している対照または正常な細胞または生命体である。また他の実施形態において、「好適な制御」または「適切な制御」は、前もって定義された値、レベル、機能、特徴、特性などである。
用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、当該分野で認識された意味を持ち、例えば、精製された試薬または抽出物、例えば細胞抽出物を含む。用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」はまた、当該分野で認識された意味を持ち、例えば、生細胞、例えば不死化細胞、初代細胞、細胞株および／または生物内の細胞を含む。
本明細書で使用するところの「治療」または「治療すること」は、治療薬剤（例えばＤｓｉＲＮＡ試薬またはそれをコードしているベクターまたはトランスジーン）の、疾患または障害を、または疾患または障害の症状を治癒させる、直す、緩和する、軽減する、変化させる、治療する、改善する、改良するまたは影響を与える目的で、疾病をもつ患者への適用または投与、または治療薬剤の患者からの単離した組織または細胞株への適用または投与として定義される。用語「治療」または「治療する」はまた、予防的に薬剤を投与する文脈でも使用される。用語「効果的用量」または「効果的投与量」は、望む効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するために十分な量として定義される。用語「治療に効果的な用量」は、疾患をすでに患っている患者における疾患またはその合併症を治癒する、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量として定義される。用語「患者」には、予防的または治療的治療いずれかを受けるヒトまたは他の哺乳動物対象が含まれる。
抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡ試薬の構造
特定の実施形態において、本発明の抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡ試薬は以下の構造を持つ。
１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡおよび「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインである。関連の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡおよび「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
本発明のＤｓｉＲＮＡは、広範囲の修飾パターン（例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡパターン、例えば伸長ＤｓｉＲＮＡ試薬内）を持ちうる。本発明のＤｓｉＲＮＡの第二鎖の特定の修飾パターンを以下に示す。
１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線の残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡおよび「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
以上の修飾パターンをまた、例えば、以下記述した伸長ＤｓｉＲＮＡ構造およびミスマッチおよび／またはほつれたＤｓｉＲＮＡ構造内に組み込むことも可能である。
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（とりわけ、３’−末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第一鎖上の位置１、２または３の１つまたはそれ以上が、第一および第二鎖が互いにアニールする時に、第二鎖上の５’末端領域の相当する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ典型的２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ試薬を示し、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の相当する「Ｍ」残基と対を形成しない（水素結合）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または修飾核酸）。そのような試薬の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、上記非対称試薬に関して示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が、上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ試薬中でも使用可能である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
特定のさらなる実施形態において、本発明は、推定されるセンス鎖Ｄｉｃｅｒ開裂部位の３’と、推定されるアンチセンス鎖Ｄｉｃｅｒ開裂部位の相当する５’に位置する、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の領域内に１つまたはそれ以上の塩基対化デオキシリボヌクレオチドを有するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に対する組成物を提供する。本発明の組成物は、前駆体分子であるｄｓＲＮＡを含み、すなわち本発明のｄｓＲＮＡが、活性小干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を産出するようにｉｎ ｖｉｖｏで処理される。ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって、ＲＩＳＣ内に組み込まれる活性ｓｉＲＮＡに処理される。
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は、以下の典型的構造を持ちうる（任意の以下の典型的構造は、例えば、上記構造の下鎖修飾パターンと組み合わせ可能であることに留意のこと−１つの特定の実施例において、任意の上記構造中で示した下鎖修飾パターンが、任意の以下の構造の下鎖の２７のほとんどの３’残基に適用される。他の特定の実施例にて、下鎖の２３のほとんどの３’残基における、任意の上記構造にて示した下鎖修飾パターンが、任意の以下の構造の下鎖の２３のほとんどの３’残基に適用される）。
１つのそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み（典型的「右伸長」、「ＤＮＡ伸長」ＤｓｉＲＮＡ）、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡおよび「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中に描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡおよび「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡおよび「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡおよび「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の相当するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意にＤ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、相当するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、Ｄ１Ｎ＋２は、相当するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成するなどである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
本明細書で描写した構造において、センス鎖またはアンチセンス鎖いずれかの５’末端が任意にリン酸基を含む。
他の実施形態において、ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（とりわけ、３’−末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第一鎖上の位置１、２または３の１つまたはそれ以上が、第一および第二鎖が互いにアニールする時に、第二鎖上の５’末端領域の相当する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ典型的ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡ試薬を示し、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の相当する「Ｍ」残基と対を形成しない（水素結合）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または修飾核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜１５、または任意１〜８であり、「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。そのような試薬の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、上記非対称試薬に関して示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が、上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ試薬中でも使用可能である。１つの実施形態において、上鎖（第一鎖）はセンス鎖であり、下鎖（第二鎖）はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称／オーバーハング試薬に関して上で示したものと平行である修飾およびＤＮＡ：ＤＮＡ伸長パターンもまた、そのような「平滑／ほつれ」試薬内に組み込むことが可能である。
１つの実施形態において、伸長したＤｓｉＲＮＡ試薬が、ｄｓＲＮＡ構造中の塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、Ｄｉｃｅｒ開裂の特定の方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むように提供される。そのような分子の典型的な構造を示し、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。以上の構造は、Ｄｉｃｅｒが、その第一処理後形態として、最小２１ｍｅｒの二本鎖を開裂するようにさせるようにモデルとする。上記構造の下鎖がアンチセンスである実施形態において、アンチセンス鎖の５’の最後および最後から二番目の残基で２つのデオキシリボヌクレオチド残基が存在することが、当該化合物に対する的外れの効果を減少させるのを助けうる。
１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み（典型的「左伸長」、「ＤＮＡ伸長」ＤｓｉＲＮＡ）、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡである。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡである。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインである。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、そこで少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の相当するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意にＤ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、相当するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、Ｄ１Ｎ＋２は、相当するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成するなどである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
Figure 0005976643
 を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、そこで少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の相当するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意にＤ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、相当するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、Ｄ１Ｎ＋２は、相当するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成するなどである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
他の実施形態において、ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（とりわけ、３’−末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第一鎖上の位置１、２または３の１つまたはそれ以上が、第一および第二鎖が互いにアニールする時に、第二鎖上の５’末端領域の相当する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ典型的ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡ試薬を示し、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の相当する「Ｍ」残基と対を形成しない（水素結合しない）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または修飾核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜１５、または任意１〜８であり、「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。そのような試薬の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、上記非対称試薬に関して示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が、上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ試薬中でも使用可能である。１つの実施形態において、上鎖（第一鎖）はセンス鎖であり、下鎖（第二鎖）はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。対称／オーバーハング試薬に関して上で示したものと平行である修飾およびＤＮＡ：ＤＮＡ伸長パターンもまた、そのような「平滑／ほつれ」試薬内に組み込むことが可能である。
もう１つ別の実施形態において、伸長したＤｓｉＲＮＡ試薬が、ｄｓＲＮＡ構造中の塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、Ｄｉｃｅｒ開裂の特定の方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むように提供される。そのような分子の典型的な構造を示し、
Figure 0005976643
 または
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
上記構造の下鎖がアンチセンス鎖である任意の以上の実施形態において、アンチセンス鎖の５’の最後および最後から二番目の残基での２つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置が、的外れの効果を減少させるのを助けうる。
特定の実施形態において、上記構造の「Ｄ」残基には、少なくとも１つのＰＳ−ＤＮＡまたはＰＳ−ＲＮＡが含まれる。任意に、上記構造の「Ｄ」残基には、Ｄｉｃｅｒ開裂を阻害する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが含まれる。
上記「ＤＮＡ−伸長」ＤｓｉＲＮＡ試薬は、「左伸長」または「右伸長」のいずれかとして分類される一方で、単一の試薬内で左および右伸長ＤＮＡ−含有配列両方を含むＤｓｉＲＮＡ試薬（例えば、コアｄｓＲＮＡ構造を取り囲む側面がｄｓＤＮＡ伸長である）をまた、「右伸長」および「左伸長」試薬に関して本明細書で記述したものと同様の様式で、産出し、使用可能である。
いくつかの実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡはさらに、ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡ試薬のセンスおよびアンチセンス鎖を連結する結合部位またはドメインを含む。任意に、そのような結合部位ドメインは、センス鎖の３’末端と、アンチセンス鎖の５’末端を連結する。結合部位は、オリゴメチレンジオールリンカー、オリゴエチレングリコールリンカー、または他の本技術分野で認識されるリンカー部位のような、化学的（非ヌクレオチド）リンカーでありうる。あるいは、リンカーは、任意に伸長ループおよび／またはテトラループを含む、ヌクレオチドリンカーでありうる。
１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬は、２５塩基対長を持つセンス鎖と、１〜４塩基３’−オーバーハング（例えば１塩基３’オーバーハング、２塩基３’−オーバーハング、３塩基３’−オーバーハングまたは４塩基３’−オーバーハング）を持つ２７塩基対長を持つセンス鎖を持つ、非対称構造を持つ。他の実施形態において、本ＤｓｉＲＮＡ試薬は、アンチセンス鎖の３’末端にて、２つのデオキシヌクレオチドをさらに含む、非対称構造を持つ。
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬は、２５塩基対長を持つアンチセンス鎖と、１〜４塩基３’−オーバーハング（例えば１塩基３’オーバーハング、２塩基３’−オーバーハング、３塩基３’−オーバーハングまたは４塩基３’−オーバーハング）を持つ２７塩基対長を持つセンス鎖を持つ、非対称構造を持つ。他の実施形態において、本ＤｓｉＲＮＡ試薬は、アンチセンス鎖の３’末端にて、２つのデオキシヌクレオチドをさらに含む、非対称構造を持つ。
本発明の典型的β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡ試薬は以下を含む。
表２
Figure 0005976643
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表３
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表４
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以上の表２〜４の、および以下表６〜８の各ＤｓｉＲＮＡに対する推定される２１ヌクレオチド標的配列を、表５に示す。
表５
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表６
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表７
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表８
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表９
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上記表９および下記表１１〜１３の各ＤｓｉＲＮＡに対する推定２１ヌクレオチド標的配列を表１０に示す。
表１０
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表１１
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表１２
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表１３
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上記表２〜４および９内で、下線の残基は、２’−Ｏ−メチル残基を示す。上記表２〜４、６〜９および１１〜１３中ＵＰＰＥＲ ＣＡＳＥはリボヌクレオチド類を示し、下ケースはデオキシリボヌクレオチドを意味する。上記表２〜４および９のＤｓｉＲＮＡ試薬は、平滑末端を有する２５／２７ｍｅｒの試薬である。表２〜４、６、９および１１の試薬の構造および／または修飾パターンを、上記の一般的な配列構造に対して容易に適合可能であり、例えば、第二鎖の３’オーバーハングを伸長させるか、または短縮させることが可能であり、第二鎖の２’−Ｏ−メチル化を第二鎖の５’末端まで、任意に交互部位で伸長させることが可能である。そのような修飾をもつ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡをまた、上記ＤｓｉＲＮＡ試薬から簡単にデザイン可能であり、β−カテニン発現の機能的阻害剤としても予想されるので、そのようなさらなる修飾は任意である。同様に、上記表７〜８および１２〜１３の試薬の、２７ｍｅｒの「平滑／ほつれ」および「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ構造および／または修飾パターンを、例えばそのような構造に対するアンチセンス鎖の修飾パターンの適用、および／またはそのような配列の上記の一般的な構造への適用のために、上記の一般的な配列構造に容易に適用可能である。
特定の実施形態において、各２７ヌクレオチドの独立した鎖長を有する２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡｓを、本明細書表２〜４、６、９および１１にて示した、非対称「２５／２７」構造と同一のβ−カテニン転写物内の部位の標的化のために、デザインし、合成する。典型的な「２７／２７」ＤｓｉＲＮＡは、上記表７および１２のＤｓｉＲＮＡに関して示したような「平滑／ほつれ」構造で、または上記表８および１３のＤｓｉＲＮＡに関して示したような「平滑／平滑」構造で、任意にデザインされる。
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は、第一鎖の、たとえば少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、または少なくとも２６の残基が、第二鎖の相当する残基に相補的であることを要求する。特定の関連実施形態において、第二鎖の相当する残基に相補的なこれらの第一鎖残基は任意に連続残基である。
本明細書で使用するところの「ＤｓｉＲＮＡｍｍ」は、ＤｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖によって形成された二本鎖の１、２、３または４つのミスマッチ塩基対を含む、「ミスマッチ耐性領域」を持つＤｓｉＲＮＡを意味し、そこでそのようなミスマッチは、ＤｓｉＲＮＡのいずれかの末端の２つの末端塩基対間に横たわっている（およびしたがって末端塩基対を含まない）場所（複数可）で、ＤｓｉＲＮＡ内に位置する。ミスマッチ塩基対は、相当する標的核酸の推定されるＡｇｏ２切断部位の局所に関して本明細書で定義した、「ミスマッチ−耐性領域」内に局在する。ミスマッチ耐性領域は、標的鎖の推定Ａｇｏ２切断部位「の上流」に局在する。本文脈中の「上流」は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ二本鎖の５’−のほとんどの部位として理解され、５’はＤｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖の方向を意味する。したがって、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の推定Ａｇｏ２切断部位に相当するセンス（パッセンジャー）鎖上の塩基の上流であり（図１）、あるいは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス（ガイド）鎖に対していう場合、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の推定Ａｇｏ２切断部位に相補的な塩基の下流に位置すると記述することも可能であり、すなわち、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の３’のほとんどの部分として記述可能である（アンチセンス鎖の位置１は、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドである、図１を参照のこと）。
１つの実施形態において、例えば図１に描写したようなナンバリングで、ミスマッチ耐性領域は、二本鎖のセンス鎖の５’末端で開始したヌクレオチドからナンバリングした場合、塩基対３〜９の間、または塩基対３〜９を含んで位置する。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、右手伸長ＤｓｉＲＮＡのセンス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９のいずれか１つにおいて、単一のミスマッチ塩基対を有する（位置１は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、位置９は、センス鎖配列に相当する標的β−カテニンＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位の５’に接したセンス鎖のヌクレオチド残基である）。特定の実施形態において、センス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９の任意の位置で、ミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに対して、アンチセンス鎖の相当するミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的β−カテニンＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断され、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的β−カテニンＲＮＡ配列間で同様に中断される）。他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の相当するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、その相当する標的β−カテニンＲＮＡ配列ヌクレオチドとも塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断されるが、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的β−カテニンＲＮＡ配列との間で維持される）。
上述したように、ミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内で単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、センス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９のいずれか１つにてミスマッチヌクレオチド残基をもつＤｓｉＲＮＡｍｍ）はさらに、１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対を含みうる。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対は、センス鎖の位置（複数可）３、４、５、６、７、８および／または９にて（そしてアンチセンス鎖の相当する残基にて）発生する。１つのさらなるミスマッチ塩基対が、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する１つの実施形態において、センス鎖の２つのミスマッチ塩基対が、例えば（アンチセンス鎖の相当するヌクレオチド残基にて発生もするミスマッチとともに）センス鎖の位置４および位置６の両方のヌクレオチドで発生しうる。
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬において、ミスマッチは、連続して発生可能である（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列にそった連続位置にて）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって分散可能である（例えば、位置４および５ではなく、位置３および６にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖位置３および６のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の相当する残基とマッチした塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって分散される）。例えば、相当するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）センス鎖の２つの残基が、これらのミスマッチ塩基対間に局在する、０、１、２、３、４または５のマッチ塩基対で発生可能である。
３つのミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬において、ミスマッチは、連続して発生可能である（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列にそって三重に）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって分散可能である（例えば、位置５、６および７ではなく、位置３、４および８にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖位置３および４のミスマッチ残基は、互いに隣接し、センス鎖位置４および８のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の相当する残基とマッチした塩基対を形成する３つの残基によって分散される）。例えば、相当するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）センス鎖の３つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３または４のマッチ塩基対で発生可能である。
４つのミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬に関して、ミスマッチは、連続して発生可能である（たとえば、センス鎖ヌクレオチド配列にそって四重に）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって分散可能である（例えば、位置４および６ではなく、位置３、５、７および８にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖位置７および８のミスマッチ残基は、互いに隣接し、センス鎖位置３および５のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の相当する残基とマッチした塩基対を形成する１つの残基によって分散される。同様に、センス鎖位置５および７のミスマッチ残基がまた、アンチセンス鎖の相当する残基と、マッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによっても分散される）例えば、相当するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）センス鎖の４つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２または３のマッチ塩基対で発生可能である。
例えば図１でまた描写したようなナンバリングで、他の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の位置１７，１８、１９、２０、２１、２２または２３の任意の１つにて、単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するミスマッチ耐性領域を含む（位置１はアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、位置１７は、アンチセンス鎖配列に十分に相補的な標的β−カテニンＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖中の３’（下流）隣接であるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に関して、アンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の任意でミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに対して、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とのみミスマッチ塩基対を形成するのみでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的β−カテニンＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断され、相補性は同様に、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的β−カテニンＲＮＡ配列間で中断される）。他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の相当するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけであるが、その相当する標的β−カテニンＲＮＡ配列ヌクレオチドと塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基で中断し、また相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的β−カテニンＲＮＡ配列間で維持される）。
以上で記述したように、ミスマッチ耐性領域内で単一ミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３にてミスマッチヌクレオチド残基を持つＤｓｉＲＮＡｍｍ）はさらに、１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対を含みうる。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対が、アンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２および／または２３で（そしてセンス鎖の相当する残基にて）発生する。１つのさらなるミスマッチ塩基対がＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する１つの実施形態において、アンチセンス鎖の２つのミスマッチ塩基対が、（センス鎖の相当するヌクレオチド残基にてまた発生しているミスマッチと）アンチセンスの位置１８および位置２０の両方のヌクレオチドで発生しうる。
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬において、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置にて）発生しうる。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対形成するヌクレオチドによって分散されうる（例えば位置１８および１９ではなく、位置１７および２０でミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに対して、アンチセンス鎖位置１７および２０のミスマッチ残基が、センス鎖の相当する残基とマッチ塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって分散する）。例えば、相当するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の２つの残基は、これらのミスマッチ塩基対間に局在する０、１、２、３、４、５、６または７マッチ塩基対で発生可能である。
３つのミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬に関して、ミスマッチは連続して起こりうる（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列にそって三重に）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチ鎖のヌクレオチドが、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって分散可能である（例えば、位置１９、２０および２１ではなく、位置１７、１８および２２にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、アンチセンス鎖位置１７および１８のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８および１２２のミスマッチ残基は、センス鎖の相当する残基とマッチした塩基対を形成する３つの残基によって分散される）。例えば、相当するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の３つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３、４、５または６のマッチ塩基対で発生可能である。
４つのミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬に関して、ミスマッチは、連続して発生可能である（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列にそって四重に）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、センス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって分散可能である（例えば、位置１９および２１ではなく、位置１８、２０、２２および２３にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、アンチセンス鎖位置２２および２３のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８および２０のミスマッチ残基は、センス鎖の相当する残基とマッチした塩基対を形成する１つの残基によって分散される−同様に、アンチセンス鎖位置２０および２２のミスマッチ残基がまた、センス鎖の相当する残基とマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって分散される）。例えば、相当するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の４つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３、４または５のマッチ塩基対で発生可能である。
明確化のために、上記ＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬内のミスマッチヌクレオチド残基の配置（複数可）を、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンスまたはアンチセンス鎖いずれかの５’末端残基に関してナンバリングする。アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内に配置される位置のナンバリングが、推定Ａｇｏ２開裂部位に対するセンスまたはアンチセンス鎖の５’末端の近位での変動をもってシフト可能である。したがって、アンチセンス鎖またはセンス鎖いずれか内の好ましいミスマッチ部位の配置（複数可）をまた、推定Ａｇｏ２切断部位に対して、そのようなミスマッチの許容される近位として同定可能でもある。したがって、１つの好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、相当する標的β−カテニンＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２開裂部位の５’（上流）直近に配置されるセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、推定Ａｇｏ２開裂部位の２ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の３ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の４ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の５ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の６ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の７ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の８ヌクレオチド５’（上流）または推定Ａｇｏ２開裂部位の９ヌクレオチド５’（上流）に局在するセンス鎖のヌクレオチド残基にて位置する。
典型的な単一ミスマッチ−含有２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、以下の構造を含む（そのようなミスマッチ−含有構造はまた、本明細書で示した他の典型的ＤｓｉＲＮＡ構造内に組み込んでもよい）。
Figure 0005976643
 式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡおよび「Ｍ」＝鎖がアニールする時に、他の相補的鎖の相当する「Ｍ」残基と塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは修飾核酸）。そのような試薬の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、−以上で示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡの交互配置をまた、以上のＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬中で使用可能でもある。上記ミスマッチ構造に関して、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの２つの鎖内のミスマッチ塩基対として必ずしも存在しない、標的β−カテニンＲＮＡ配列に関して存在するミスマッチを含みうる−したがって、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの第一および第二鎖間で完全な相補性を有してよく、また（特定の実施形態において、有効性および／または強度および／または効果の期間を促進することにおいて有益であり得る）標的β−カテニンＲＮＡに関してミスマッチ残基を有する。ミスマッチが、アンチセンス鎖と標的β−カテニンＲＮＡ配列間で発生する、特定の実施形態において、ミスマッチの位置が、標的領域の推定Ａｇｏ２切断部位の５’に局在したセンス鎖の配列に相当する位置で、アンチセンス内で配置される−例えば標的配列の推定Ａｇｏ２切断部位に相補的であるアンチセンス残基の３’に対して、アンチセンス鎖内に位置するアンチセンス鎖残基（複数可）。
標的配列に関する単一ミスマッチ残基を持つ典型的な２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡｓは以下の構造を含む。
Figure 0005976643
 式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡおよび「Ｅ」＝鎖がアニールする時に、他の相補的（標的）鎖の相当する「Ａ」ＲＮＡ残基と塩基対（水素結合）を形成せず、また任意に相当する「Ｂ」残基と塩基対形成する（「Ｂ」残基はまた、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは修飾核酸）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは修飾核酸）。そのような試薬の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、−以上で示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡの交互配置をまた、以上のＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬中で使用可能でもある。
以上で例示した構造に加えて、本発明のＤｓｉＲＮＡはまた、標的β−カテニンＲＮＡ配列とさらなるミスマッチを形成する、１、２または３のさらなる残基を有しうる。そのようなミスマッチは連続であってよく、または標的β−カテニンＲＮＡ配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって分散しうる。マッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって分散される場合、ミスマッチ残基は、そのようなミスマッチ形成残基間の１、２、３、４、５、６、７または８塩基対形成ヌクレオチドの間隔にて単一鎖内で互いに離れて隔たりうる。
上記ＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬に対してのように、（また相当するセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチを形成してよく、または形成しなくてよい）標的β−カテニンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖ヌクレオチドに関して、ＤｓｉＲＮＡ内の好ましい配置が、ＤｓｉＲＮＡの推定Ａｇｏ２切断部位に相補的なアンチセンス鎖配列の３’（下流）に局在するアンチセンス鎖領域内にある（たとえば、図１において、推定Ａｇｏ２切断部位の３’であるアンチセンス鎖の領域が、ミスマッチ形成残基に関して好ましく、図１にて示した２５／２７ｍｅｒの試薬に対するアンチセンス鎖の位置１７〜２３に局在する）。したがって、１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の（標的β−カテニンＲＮＡ配列に関する）ミスマッチヌクレオチドの位置が、相当する標的β−カテニンＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２開裂部位のアンチセンス鎖配列内の３’（下流）直近に局在するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態において、（標的β−カテニンＲＮＡ配列に関する）ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の２ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の３ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の４ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の５ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の６ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の７ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の８ヌクレオチド３’（下流）または相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の９ヌクレオチド３’（下流）に局在するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基にて位置する。
アンチセンス鎖の２つのミスマッチ形成ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡ試薬において（ミスマッチ形成ヌクレオチドは、標的β−カテニンＲＮＡ配列に関してミスマッチ形成している）、ミスマッチは連続して発生しうる（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列にそって連続した位置で）。あるいは、標的β−カテニンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的β−カテニンＲＮＡ配列と塩基対形成するヌクレオチドによって分散されうる（例えば、図１で示した２５／２７ｍｅｒの試薬のアンチセンス鎖の５’末端（位置１）から開始して）位置１８および１９ではなく、位置１７および２０でミスマッチ形成ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡに関して、センス鎖位置１７および２０のミスマッチ残基が、標的β−カテニンＲＮＡ配列の相当する残基とマッチした塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって分散する）。例えば、相当する標的β−カテニンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）アンチセンス鎖の２つの残基は、これらのミスマッチ形成塩基対間に局在する（標的β−カテニンＲＮＡ配列に関する）０、１、２、３、４または５つのマッチした塩基対で発生しうる。
（標的β−カテニンＲＮＡ配列に関してミスマッチを形成している）３つのミスマッチ形成塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡに関して、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して発生しうる（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列にそって三重に）。あるいは、標的β−カテニンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、標的β−カテニンＲＮＡ配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって分散可能である（例えば、位置１９、２０および２１ではなく、位置１７、１８および２２にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡに関して、アンチセンス鎖位置１７および１８のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８および２２のミスマッチ形成残基は、標的β−カテニンＲＮＡ配列の相当する残基とマッチした塩基対を形成する３つの残基によって分散される）。例えば、相当する標的β−カテニンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）センス鎖の３つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３または４のマッチ塩基対で発生可能である。
（標的β−カテニンＲＮＡ配列に関してミスマッチを形成している）４つのミスマッチ形成塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡに関して、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して発生しうる（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列にそって四重に）。あるいは、標的β−カテニンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、標的β−カテニンＲＮＡ配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって分散可能である（例えば、位置１８および２０ではなく、位置１７、１９、２１および２２にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡに関して、アンチセンス鎖位置２１および２２のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１７および１９のミスマッチ形成残基は、標的β−カテニンＲＮＡ配列の相当する残基とマッチした塩基対を形成する１つの残基によって分散される−同様に、アンチセンス鎖位置１９および２１のミスマッチ形成残基はまた、標的β−カテニンＲＮＡの相当するヌクレオチドとマッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって分散される）。例えば、相当する標的β−カテニンＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の４つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２または３のマッチ塩基対で発生可能である。
上記ＤｓｉＲＮＡｍｍと他のＤｓｉＲＮＡ構造を、ＤｓｉＲＮＡｍｍとＤｓｉＲＮＡ試薬の特定の構造を例示するために記述する。上記ＤｓｉＲＮＡｍｍとＤｓｉＲＮＡ構造のデザインを、例えば以下に示した他のＤｓｉＲＮＡ構造のＤｓｉＲＮＡｍｍ形態を産出するために適合可能である。以上で例示したように、ＤｓｉＲＮＡはまた、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列間の単一ミスマッチ（または２、３または４ミスマッチ）を有するようにデザイン可能であり、また任意に、ＤｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖配列間の完全な相補性を維持可能である。
以下に例示するＤｓｉＲＮＡ試薬はまた、それらの二本鎖および／または標的β−カテニンＲＮＡ−整列構造内に、挿入／欠損（ｉｎ／ｄｅｌ）構造を有しうる。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡは、例えば、ミスマッチおよび／またはミスマッチ形成塩基対の位置に関して以上に記述したそれらの局所に相当する、そのようなｉｎ／ｄｅｌヌクレオチドの配置に対して最適な局所（複数可）で、標的β−カテニンＲＮＡ配列と比較したアンチセンス配列、および／またはセンス鎖配列と比較したアンチセンス配列中、ｉｎ／ｄｅｌ変化を有するようにデザイン可能である。
本発明のＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって処理され、ＲＩＳＣへ積み込むガイド鎖配列から自由であるようにモデル化されるので、センス鎖の３’−末端領域／アンチセンス鎖の５’−末端領域内でミスマッチを許容可能である。そのようなミスマッチを持つ本発明の典型的ＤｓｉＲＮＡ構造には、以下が含まれ、
Figure 0005976643
 式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡおよび「Ｉ」および「Ｊ」＝互いに塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは修飾核酸）で、また任意に「Ｊ」は、標的ＲＮＡ配列ヌクレオチド「Ｈ」に相補的である。そのような試薬の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、−以上で示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡの交互配置−または任意の上記メチル化パターン−をまた、以上のＤｓｉＲＮＡ試薬中で使用可能でもある。上記ミスマッチはまた、本発明のＤｓｉＲＮＡ内で組み合わせ可能である。
以下の構造において、そのようなミスマッチは、非対称βｃ１５６９ ＤｓｉＲＮＡ（新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である）内に導入される。
βｃ１５６９ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝（５’末端より）センス鎖の２２
Figure 0005976643
 任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
βｃ１５６９ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３
Figure 0005976643
 任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
βｃ１５６９ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４
Figure 0005976643
 任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ａ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｇ」である。
βｃ１５６９ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５
Figure 0005976643
 任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ｃ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｇ」である。
βｃ１５６９ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１
Figure 0005976643
 任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ｇ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
βｃ１５６９ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２
Figure 0005976643
 任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ｇ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
βｃ１５６９ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３
Figure 0005976643
 任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
βｃ１５６９ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４
Figure 0005976643
 任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ｇ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
さらなる実施例として、そのようなミスマッチは、非対称βｃ−３３９３ ＤｓｉＲＮＡｓに導入される（新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である）。
βｃ−３３９３ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝（５’−末端から）センス鎖の２２
Figure 0005976643
 任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
βｃ−３３９３ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３
Figure 0005976643
 任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｕ」である。
βｃ−３３９３ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４
Figure 0005976643
 任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ｃ」残基は、あるいは「ａ」または「ｇ」である。
βｃ−３３９３ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５
Figure 0005976643
 任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ａ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｇ」である。
βｃ−３３９３ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１
Figure 0005976643
 任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｃ」である。
βｃ−３３９３ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２
Figure 0005976643
 任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｕ」である。
βｃ−３３９３ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３
Figure 0005976643
 任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ａ」である。
βｃ−３３９３ ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４
Figure 0005976643
 任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ａ」である。
以上で記したように、そのようなミスマッチの導入は、本明細書で記述した任意のＤｓｉＲＮＡ上で実施可能である。
そのようなＤｓｉＲＮＡ構造のミスマッチは、例えばセンス鎖の３’末端４ヌクレオチド／アンチセンス鎖５’末端４ヌクレオチド内の２、３または４ミスマッチを有するＤｓｉＲＮＡを産出するために混合可能である。
実際、センス鎖の３’末端残基／アンチセンス鎖の５’末端残基にてＤｓｉＲＮＡ内に導入可能な配列の柔軟性に関して、特定の実施形態において、本発明の非対称ＤｓｉＲＮＡの配列要求を以下の（典型的なβｃ−１５６９ ＤｓｉＲＮＡ配列に関して示した）（ミニマリスト）構造で表すことが出来る。
Figure 0005976643
 式中ｎ＝１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜５０、または１〜８０またはそれ以上。
βｃ−１５６９標的：
Figure 0005976643
β−カテニン標的目標はまた、その相補的標的部位が、規定された標的部位と重なる、１つまたはそれ以上の種々のオリゴヌクレオチドによって標的とされる部位であり得る。例えば、典型的βｃ−２８８ ＤｓｉＲＮＡに関して、β−カテニン配列に重なり、わずかばかり補正されたΒ−カテニン配列を標的としている特定のＤｓｉＲＮＡが、βｃ−２８８のものとほとんど同じ活性レベルを示しうる（特に、以下図１４のβｃ−２８４、βｃ−２８５、βｃ−２８６、βｃ−２８７、βｃ−２８９、βｃ−２９０およびβｃ−２９１ＤｓｉＲＮＡを参照のこと）。したがって、特定の実施形態において、デザインされた標的配列領域は、広く重なっている配列を有している一連のＤｓｉＲＮＡによって効果的に標的とされる（例えばβｃ−２８８部位の周辺のＤｓｉＲＮＡを考慮する場合、より包括的なβ−カテニン標的配列が、例えば５’−ＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番号：７７８６）として引用されえ、そこで任意の当該ＤｓｉＲＮＡ（例えば、βｃ−２８４、βｃ−２８５、βｃ−２８６、βｃ−２８７、βｃ−２８８、βｃ−２８９、βｃ−２９０およびβｃ−２９１）のみが、そのような配列領域内のサブ配列を標的とし、また全配列は、そのような一連のＤｓｉＲＮＡに対する実行可能な標的と考慮可能である。
さらに、および／またはあるいは、センス鎖の３’末端４ヌクレオチド／アンチセンス鎖の５’末端４ヌクレオチド内のミスマッチを、以上で記述したように、他のミスマッチ耐性位置にて位置するミスマッチと混合可能である。
特定のβ−カテニン配列の標的化を介して、β−カテニンレベルの阻害剤として、上記Ｄｉｃｅｒ基質試薬（ＤｓｉＲＮＡ）の本同定を考慮して、本明細書で記述したものと同様の構造を持つＤｓｉＲＮＡがまた、配列番号：１〜３または配列番号：５〜６のβ−カテニン配列内、またはそれらの変異体（例えば、配列番号：１〜３または配列番号：５〜６の配列に対して、８０％同一性、９０％同一性、９５％同一性、９６％同一性、９７％同一性、９８％同一性、９９％同一性またはそれ以上の同一性を有する標的配列）内の他の配列を標的とするように合成可能であることも認識される。
抗−β−カテニン ＤｓｉＲＮＡデザイン／合成
２５〜３５ヌクレオチド、とりわけ２５〜３０ヌクレオチドのより長いｄｓＲＮＡ種（ＤｓｉＲＮＡ）が、１９〜２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡ試薬と比較して、活性の強度および期間に関して、予期せぬ効果的な結果を与えることが、実験的にわかってきた。ｄｓＲＮＡ処理機構の根本的な理論にとらわれずに、より長いｄｓＲＮＡ種が細胞の細胞質中のＤｉｃｅｒ酵素に対する基質として働くことが考えられる。本発明のｄｓＲＮＡをより短い区画に分割することに加えて、Ｄｉｃｅｒは、分割されたｄｓＲＮＡから由来する一本鎖分割産物の、標的遺伝子β−カテニン（またはβ−カテニン関連疾患または疾病と関連する他の遺伝子の、または当該遺伝子から由来する細胞質ＲＮＡ（例えばβ−カテニンＲＮＡ）の崩壊に関与するＲＩＳＣ複合体内への導入を促進すると考えられる。先行する研究（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第２００７／０２６５２２０号明細書）は、ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡ種（特にＤｓｉＲＮＡ試薬）の開裂性が、ｄｓＲＮＡ種の活性の強度および期間の増加と一致することを示した。
特定の好ましい抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡ試薬を、プレスクリーンした集団から選択した。ＤｓｉＲＮＡｓのデザインは任意に、配列の領域に広がっている可能性のある多数のＤｓｉＲＮＡ試薬の推定有効性／効率のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価にて実施する予測スコアリングアルゴリズムの利用を含みうる。より最近の「ｖ３」アルゴリズムは、本技術分野ですでに利用可能なｓｉＲＮＡスコアリングアルゴリズムに関する理論的に改善されたアルゴリズムを表すけれども、そのようなスコアリングアルゴリズムのデザインに関する情報は、例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００６，７：５１６）で見ることができる（例えば「ｖ３」および「ｖ４」スコアリングアルゴリズムは、ヒト配列中の任意のバイアスに依存していない機械学習アルゴリズムである。さらに、「ｖ３」および「ｖ４」アルゴリズムは、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．にて記述されたような、より古い「ｖ２」アルゴリズムから由来するものよりも、複数倍大きいデータ組から由来する）。
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬の第一および第二オリゴヌクレオチドは、完全に相補的であることを必要としない。実際、１つの実施形態において、センス鎖の３’−末端は、１つまたはそれ以上のミスマッチを含む。１つの態様において、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれる。他の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、それぞれが長さにおいて２７ヌクレオチドであり、互いにアニールした時に、センス鎖の３’末端（アンチセンス鎖の５’末端）上に平滑筋末端と２つのヌクレオチド末端を持つ、２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ分子である。（特に３’−センス／５’−アンチセンス位置での）ミスマッチまたは熱力学的安定性の減少の利用が、おそらくｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの進入とともに発生する速度制限巻き戻し段階に影響を与えることによって、アンチセンス鎖のＲＩＳＣへの進入を促進するまたは有利に働かせるために提案されてきた（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ １１５：１９９−２０８；Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ １１５：２０９−２１６）。したがって、末端塩基組成物は、活性２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ二本鎖を選択するためのデザインアルゴリズムに含まれてきた（Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２：９３６−９４８；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３２６−３３０）。本実施形態のｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ開裂で、ミスマッチを含む小さな最終末端配列が、アンチセンス鎖と対を形成しないままであるか（３’−オーバーハングの一部となる）、または最終２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡを完全に開裂して除去されるか、いずれかである。これらの「ミスマッチ」はしたがって、ＲＩＳＣの最終ＲＮＡ組成物中のミスマッチとして持続しない。Ｄｉｃｅｒ基質のセンス鎖の３’−末端での塩基ミスマッチまたは区画の不安定化がおそらくＤｉｃｅｒによる処理を促進することによって、ＲＮＡｉ中の合成二本鎖の強度を改善したという所見が、２５〜３０ｍｅｒのｄｓＲＮＡのデザインと利用を記述している過去の働きの意外な発見であった（また本明細書で「ＤｓｉＲＮＡ」と呼ぶ。米国特許第２００５／０２７７６１０号明細書、第２００５／０２４４８５８号明細書および第２００７／０２６５２２０号明細書）。
抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡの修飾
二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）の効果を阻害する１つの主要な因子は、ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）の分解である。３’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する第一ヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’−末端の修飾が、分解を予防するために重要である（Ｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ Ｄｅｖ，１：１４１−１５１）。ＲＮａｓｅ−Ｔファミリーヌクレアーゼは同定され、ｓｉＲＮＡの制御および分解に関与する３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を持つＥＲＩ−１と呼ばれた（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４２７：６４５−６４９；Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，３９０：６７５−６７９）。この遺伝子はまた、マウス内でのＴｈｅｘ１（ＮＭ＿０２０６７）またはヒト内でのＴＨＥＸ１（ＮＭ＿１５３３３２）として知られ、ヒストンｍＲＮＡの分解に関与し、またｓｉＲＮＡ中の３’−オーバーハングの分解を仲介するが、二本鎖ＲＮＡを分解しない（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８１：３０４４７−３０４５４）。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡを含む、ｄｓＲＮＡｓの３’−末端−安定化が安定性を改善すると予測することが合理的である。
ＸＲＮ１（ＮＭ＿０１９００１）は、Ｐ−体中に存在し、ｍｉＲＮＡによって標的化されたｍＲＮＡの分解に関与してきた５’から３’エキソヌクレアーゼであり（Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５，ＲＮＡ １１：１６４０−１６４７）、またｓｉＲＮＡによって指向されるような内部開裂によって開始される分解を完了するのに関与しうる。ＸＲＮ２（ＮＭ＿０１２２５５）は、核ＲＮＡ処理に関与する異なる５’から３’エキソヌクレアーゼである。
ＲＮａｓｅ Ａは、ＲＮＡを分解する哺乳動物における主要なエンドヌクレアーゼ活性である。ｓｓＲＮＡに対して特異的であり、ピリミジン塩基の３’−末端で開裂する。ＲＮａｓｅ Ａ開裂と一致するｓｉＲＮＡ分解産物は、血清中でのインキュベーション後、質量分析によって検出可能である（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ ３：４３〜５０）。３’−オーバーハングは、ＲＮａｓｅ分解に対するｓｉＲＮＡの感受性を増強する。血清からのＲＮａｓｅ Ａの枯渇が、ｓｉＲＮＡの分解を減少させ、この分解が配列優先傾向を見せ、末端上でポリＡ／Ｕ配列を持つ配列に対してより悪い（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｂｉｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７１：７０２−７１０）。このことは、二本鎖のより安定性の低い領域が、「呼吸をし」え、ＲＮａｓｅ Ａによる分解に対して利用可能な一時的な一本鎖種を提供する。ＲＮａｓｅ Ａ阻害剤を血清に加え、ｓｉＲＮＡ寿命および強度を改善可能である（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２１：２０６−２１０）。
２１ｍｅｒ中、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェート修飾が、ヌクレオチド内リン酸結合を直接安定化させる。ボラノホスフェート修飾ＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性が高く、サイレンシング試薬として強力であり、比較的無毒性である。ボラノホスフェート修飾ＲＮＡは、標準の化学合成方法を用いて製造できず、代わりにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって作製される（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２：５９９１−６０００；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：２７７３−２７８１）。ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾は、任意の望む位置で、ＲＮＡ二本鎖中容易に配置可能であり、標準の化学合成方法を用いて作製可能である。ＰＳ修飾は、用量依存毒性を示し、それにより、ほとんどの研究者は、ｓｉＲＮＡ内への組み込みの制限を推奨し、ヌクレアーゼからの保護が最も重要な３’−末端が好まれる（Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １３：８３−１０５；Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，２００３，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：５４９−５６１； Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：７９６７−７９７５； Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：５８９−５９５）。より広範囲なＰＳ修飾が、強力なＲＮＡｉ活性と両立可能であるが、しかし（２’−Ｏ−メチルＲＮＡのような）糖修飾の利用がよりすぐれている可能性がある（Ｃｈｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３４２：９１９−９２７）。
種々の置換基を、一般的に二本鎖安定性（Ｔｍ）を増加させ、ヌクレアーゼ耐性を大きく改善可能な、リボースの２’−位置に配置可能である。２’−Ｏ−メチルＲＮＡは、哺乳動物リボソームＲＮＡおよび転写ＲＮＡにて見られる、天然に存在する修飾である。ｓｉＲＮＡ中の２’−Ｏ−メチル修飾が公知であるが、二本鎖内の修飾塩基の実際の位置が、強度を保つために重要である。ＲＮＡに対する２’−Ｏ−メチルＲＮＡの完全な置換は、ｓｉＲＮＡを不活性化する。例えば、交互２’−Ｏ−メチル塩基を使用するパターンは、修飾されていないＲＮＡと等価の強度を持ち得、血清中極めて安定である（Ｃｈｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３４２：９１９−９２７；Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：２７０５−２７１６）。
２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾はまた、ｄｓＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）機能と両立可能であり、（試薬コストおよび利用可能性のため）最も一般的にはピリジン部位に位置し、プリン位置にて２’−Ｏ−メチル修飾と組み合わせ可能であり、２’−Ｆプリンが利用でき、使用可能である。この種類の非常に修飾された二本鎖は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、ＲＮＡｉの強力なトリガーでありえ（Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４８：９０１−９０４；Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４８：４２４７−４２５３；Ｋｒａｙｎａｃｋ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，２００６，ＲＮＡ １２：１６３−１７６）、ｉｎ ｖｉｖｏで使用した時に、活性の性能を改善し、期間を延長可能である（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１： １３４９−１３５６；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：１００２−１００７）。非常に強力で、ヌクレアーゼ安定である、交互２’−Ｆおよび２’−Ｏ−Ｍｅ塩基を含む平滑１９ｍｅｒの二本鎖が、Ａｌｌｅｒｏｎによって教示された。このデザインにおいて、交互２’−Ｏ−Ｍｅ残基は、Ｃｚａｕｄｅｒｎａによって使用されたものと同一の位置で配置されるが、しかし残りのＲＮＡ残基は２’−Ｆ修飾塩基に変換される。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙによって使用された、非常に強力な、ヌクレアーゼ耐性のｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、非常に強力な、ヌクレアーゼ耐性ｓｉＲＮＡを使用した。２’−Ｏ−Ｍｅ ＲＮＡおよび２’−Ｆ ＲＮＡに加えて、この二本鎖は、β−カテニンＤＮＡ、逆脱塩基残基、および３’−末端ＰＳヌクレオシド内結合を含む。広範囲の修飾は、特定の利点を持つ一方で、二本鎖のより制限された修飾もまた、ｉｎ ｖｉｖｏ性能を改善し、製造がより単純で、よりコストがかからない。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００４， Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８）は、ｉｎ ｖｉｖｏで二本鎖を使用し、主に２つの２’−Ｏ−Ｍｅ ＲＮＡ塩基および制限された３’−末端ＰＳヌクレオシド内結合を持つＲＮＡであった。
ロック核酸（ＬＮＡ）は、ｄｓＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）を安定させるために使用可能な異なる種類の２’−修飾である。強度を維持するＬＮＡ組み込みのパターンは、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｆ−塩基よりも制限され、そのように制限された修飾が好ましい（Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：７９６７−７９７５；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：３１８５−３１９３；Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：４３９−４４７）。制限された組み込みでさえ、ＬＮＡ修飾の利用は、ｉｎ ｖｉｖｏにてｄｓＲＮＡの性能を改善可能であり、標的効果特性を変えるか、改善しうる（Ｍｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ６：８３３−８４３）。
細胞内または生動物内に導入された合成核酸は、「外来」として認識され、免疫応答を引き起こしうる。免疫刺激は、劇的に実験結果を変化させ、細胞死を導きさえする的外れの効果の主な種類を構成する。生来の免疫システムには、これらの応答を仲介するＤＮＡおよびＲＮＡととりわけ相互作用する受容体分子の集団が含まれ、その幾つかは、細胞質内に局在し、その幾つかはエンドソーム内に存在する（Ｍａｒｑｕｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，２００５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：１３９９−１４０５；Ｓｃｈｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４：４６３−４７０））。カチオン性脂質またはリポソームによるｓｉＲＮＡの伝達は、ｓｉＲＮＡを、細胞質およびエンドソーム区画の両方に曝露し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ両方で、１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を引き起こすリスクを最大化する（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：１００２−１００７；Ｓｉｏｕｄ ａｎｄ Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３１２：１２２０−１２２５；Ｓｉｏｕｄ，２００５，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４８：１０７９−１０９０；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３３０： ７５５−７５９）。細胞内に転写されたＲＮＡは免疫原性が少なく（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｌ ２４：５６６−５７１）、脂質に基づく方法を用いて伝達した時に免疫原性である合成ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでさえ、機械的方法によって細胞内に導入された時に、免疫刺激を逃れる（Ｈｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２： １５７９−１５８２）。しかしながら、脂質に基づく伝達方法は一般的で、効果的で、広く使用される。とりわけ、全ての細胞型が存在し、免疫応答が産出されるリスクが最も高いｉｎ ｖｉｖｏ適用に対して、免疫応答を防止するためのいくつかの一般的な戦略が必要である。化学的に修飾したＲＮＡの利用が、これらの問題のほとんどまたはすべてを解決しうる。
特定の実施形態において、修飾がβ−カテニン阻害活性を有することからＤｓｉＲＮＡを阻害しない限り、修飾を本発明の抗β−カテニンＤｓｉＲＮＡ中に含められる。１つの実施形態において、１つまたはそれ以上の修飾が、ＤｓｉＲＮＡ試薬のＤｉｃｅｒ処理を増強するように実施される（ＤｓｉＲＮＡのＤｉｃｅｒ処理を測定するためのアッセイが上述されている）。第二実施形態において、１つまたはそれ以上の修飾が、より効果的なβ−カテニン阻害となるように実施される（本明細書で記述したように。ＤｓｉＲＮＡのβ−カテニン阻害／β−カテニン阻害活性は、ＲＮＡレベルを測定するため、またはΒ−カテニンポリペプチドレベルを測定するための本技術分野で認識されている方法を介してアッセイ可能であり、そのようなレベルは、たとえばβ−カテニンｍＲＮＡレベルの評価の代わりに、または加えて評価されるべきである）。第三の実施形態において、１またはそれ以上の修飾が、より大きなβ−カテニン阻害活性を支持するように実施される（β−カテニン阻害活性を決定する方法は上記されている）。第四の実施形態において、１つまたはそれ以上の修飾が、細胞に伝達されるべき各ＤｓｉＲＮＡ試薬分子あたりのβ−カテニン阻害活性がより強力な強度となるように実施される（β−カテニン阻害活性の強度が上記されている）。修飾は、配列内の３’−末端領域、５’−末端領域にて、３’−末端領域と５’−末端領域両方にて、または例えば種々の位置で組み入れることが可能である。以上で記した制限を考慮して、修飾の数および組み合わせをＤｓｉＲＮＡ試薬内に組み込むことが可能である。多数の修飾が存在する場合、それらは同一であるか、または異なってよい。塩基、糖部位、リン酸骨格およびそれらの組み合わせに対する修飾が企図される。いずれかの５’−末端がリン酸化可能である。
リン酸骨格に対して企図される修飾の例には、メチルホスフェート、ホスホロチオエート、およびアルキルホスホトリエステルのようなホスホトリエステル修飾などを含むリン酸塩が含まれる。糖部位に対して企図される修飾の例には、２’−Ｏ−メチルのような２’−アルキルピリミジン、２’−フルオロ、アミノおよびデオキシ修飾など含まれる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：５８９−５９５を参照のこと）。塩基に対して企図される修飾の例には、脱塩基２−Ｏ−アルキル修飾ピリミジン類、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシルおよび５−（３−アミノアルキル）−ウラシルなどが含まれる。ロック核酸すなわちＬＮＡも組み込むことが可能である。多くの他の修飾が公知で有り、以上の基準を満足させる限り使用可能である。修飾の例はまた、米国特許題５，６８４，１４３号明細書、第５，８５８，９８８号明細書および第６，２９１，４３８号明細書、および米国特許第２００４／０２０３１４５ Ａ１号明細書に開示されている。他簿修飾は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ （２０００， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １０：２９７−３１０），Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １０：１１７−２１）、Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １０：３３３−３４５）、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １１：３１７−２５）、Ｖｏｒｏｂｊｅｖ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １１：７７−８５）にて開示されている。
企図される１つまたはそれ以上の修飾をいずれかの鎖内に組み込むことが可能である。ＤｓｉＲＮＡ試薬中の修飾の位置は、より強力な強度および安定性の授与、毒性の減少、Ｄｉｃｅｒ処理の増強および免疫応答の最小化を含む、ＤｓｉＲＮＡ試薬の特徴に大きく影響を与えうる。１つの実施形態において、アンチセンス鎖またはセンス鎖、または両方の鎖が、１つまたはそれ以上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを持つ。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドからなる３’オーバーハングを含む。アンチセンス鎖はまた、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含みうる。
本発明の特定の実施形態において、抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡ試薬は、１つまたはそれ以上の以下の特性を持つ。（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ試薬は非対称であり、例えばアンチセンス鎖上に３’オーバーハングを持つ、および（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ試薬は、活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ結合と処理の方向を指向するために、センス鎖上に修飾３’末端を持つ。本実施形態にしたがって、ｄｓＲＮＡ中最も長い鎖は、２５〜３５ヌクレオチド（例えば２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチド）を含む。特定のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬は、センス鎖が２５〜３４ヌクレオチドを含み、センス鎖の３’末端が、アンチセンス鎖の５’末端と平滑末端を形成し、一方アンチセンス鎖が２６〜３５ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖の３’末端上にオーバーハングを形成するように非対称である。１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬は、センス鎖が２５〜３８ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が２５〜３０ヌクレオチドを含むように非対称である。したがって、得られたｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端上にオーバーハングを持つ。オーバーハングは、１〜４ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。センス鎖はまた５’リン酸を持ちうる。
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬のセンス鎖を、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によるＤｉｃｅｒ処理のために修飾し、すなわちＤｓｉＲＮＡ試薬が、Ｄｉｃｅｒ結合および処理の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および蛍光分子などのような立体的に込み入った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに、２−ヒドロキシエトキシメチル基を置換する。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’、３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、および３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）の一リン酸ヌクレオチド、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’、３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）が含まれうる。１つの実施形態において、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、１〜３ヌクレオチド修飾因子、または２ヌクレオチド修飾因子を、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドの代わりに使用する。立体的に込み入った分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに接続する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにともなって変化しない。他の実施形態において、本発明は、アンチセンス鎖のＤｉｃｅｒ処理の方向を指向するために、ＤｓｉＲＮＡ試薬中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを企図する。本発明のさらなる実施形態において、２つの末端ＤＮＡ塩基を、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端上で、二本鎖の平滑末端を形成しているセンス鎖の３’−末端上の２つのリボヌクレオチドの代わりに使用し、２つのヌクレオチドＲＮＡオーバーハングは、アンチセンスの３’−末端に位置する。これは、平滑末端上にＤＮＡ、オーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を持つ、非対称組成物である。
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬のセンスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件のような、生物学的条件下でアニールする。さらに、ＤｓｉＲＮＡ試薬の、とりわけアンチセンス鎖の、１つの配列の一領域が、少なくとも１５（特定の実施形態において、１９）ヌクレオチドの配列長を持ち、そこでこれらの残基は、（例えば、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する２１−ヌクレオチド領域中）アンチセンス鎖の３’末端に隣接し、標的β−カテニンＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。
さらに、ＤｓｉＲＮＡ試薬構造は、Ｄｉｃｅｒの開裂から産出されるオリゴヌクレオチド区画が、遺伝子発現を阻害することにおいてもっとも効果的であるオリゴヌクレオチドの部分であり得ることを確かにするために最適化可能である。例えば、本発明の１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬構造の２７−ｂｐオリゴヌクレオチドが合成され、そこで予想される遺伝子発現を阻害する２１〜２２−ｂｐ区画が、アンチセンス鎖の３’末端上に局在する。アンチセンス鎖の５’−末端上に局在する残りの塩基は、Ｄｉｃｅｒによって開裂され、捨てられる。この開裂された部分は均一であるか（すなわち標的配列の配列に基づく）、または不均一であり、核酸鎖を伸長するために加えられる。
ＤｓｉＲＮＡ試薬はまた、１つまたはそれ以上の以下のさらなる特性を持ちうる。（ａ）アンチセンス鎖は、典型的に２１ｍｅｒから右シフトを持つ（例えば、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡ内の推定Ｄｉｃｅｒ開裂部位の５’まで伸長するアンチセンス鎖ヌクレオチドの長さを含み、そのようなアンチセンス鎖ヌクレオチドは、センス鎖中の推定Ｄｉｃｅｒ開裂の３’を伸長しているセンス鎖の相当するヌクレオチドと塩基対を形成する）、（ｂ）鎖は、完全に相補的でなくてよい、すなわち鎖は、単一のミスマッチ塩基対を含んでよい（ミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡのβ−カテニン阻害活性が、十分なレベルで維持される（例えばミスマッチ塩基対を有しない相当するＤｓｉＲＮＡと比較して、少なくとも５０％β−カテニン阻害活性またはそれ以上、少なくとも６０％β−カテニン阻害活性またはそれ以上、少なくとも７０％β−カテニン阻害活性またはそれ以上、少なくとも８０％β−カテニン阻害活性またはそれ以上、少なくとも９０％β−カテニン阻害活性またはそれ以上または少なくとも９５％β−カテニン阻害活性またはそれ以上を維持する）という条件で、特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、１、２、３、４または５またはそれ以上のミスマッチ塩基対を有する。特定の実施形態において、ミスマッチ塩基対は、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンスとセンス鎖の間に存在する。いくつかの実施形態において、ミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖と標的ＲＮＡ間に存在する（または存在すると予想される）。特定の実施形態において、アンチセンス鎖残基と、想定Ａｇｏ２開裂部位の標的ＲＮＡ配列中３’に局在する標的ＲＮＡ内の相当する残基間でのミスマッチ塩基対の存在が維持され、本発明のＤｓｉＲＮＡのΒ−カテニン阻害活性を増強してもよい）、（ｃ）ロック核酸（複数可）のような塩基修飾が、センス鎖の５’末端に含まれてよい。「典型的」２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡは、従来の技術を用いてデザインされる。１つの技術において、種々の部位が、平行して、または試薬の１つが効果的であるという希望とともに、同一の標的に特異的な種々の異なるｓｉＲＮＡ二本鎖を含むプール中で一般に試験される（Ｊｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５５２：２４７−２５２）。他の技術は、活性ＲＮＡｉ効果器分子を得る可能性を増加させるためのデザインルールおよびアルゴリズムを使用する（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ １１５：１９９−２０８；Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ １１５： ２０９−２１６；Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２：９３６−９４８；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３２６−３３０；Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：４２２３０−４２２３９；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２（ウェブ発行）：Ｗ１３０−１３４；Ｂｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３９２：７３−９６）。ＳｉＲＮＡのハイスループット選別もまた開発されてきた（米国特許第２００５．００４２６４１ Ａ１号明細書）。潜在的標的部位をまた、二次構造予測によって解析可能である（Ｈｅａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３（３）： ｅ３０）。ついで、この２１ｍｅｒを、２１ｍｅｒの５’末端上に３〜９のさらなるヌクレオチドを含めるために、右シフトをデザインするために使用する。これらのさらなるヌクレオチドの配列は制限されない。１つの実施形態において、追加したリボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づく。本実施形態においてさえ、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡ間の完全な相補性は要求されない。
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬の第一および第二オリゴヌクレオチドは、完全な相補性を要求されない。これらは、生物学的条件下でアニールするのに、また標的配列に対して十分に相補的なｓｉＲＮＡを産出するＤｉｃｅｒに対する基質を提供するのに十分に相補的である必要があるのみである。ロック核酸すなわちＬＮＡが当業者によく公知である（Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：４３９−４４７；Ｋｕｒｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：１９１１−１９１８；Ｃｒｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：２４３５−２４４３；Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ， ２００１，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ８：１−７；Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０００，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６：２６８７−２６９５；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：５６３３−５６３８）。１つの実施形態において、ＬＮＡをセンス鎖の５’末端に組み込む。他の実施形態において、ＬＮＡを、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを含むようにデザインされた二本鎖中のセンス鎖の５’末端に組み込む。
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は、２５−塩基対長を持つセンス鎖と、２塩基３’−オーバーハングを持つ２７−塩基対長を持つアンチセンス鎖の非対称構造を持つ。他の実施形態において、非対称構造を持つこのＤｓｉＲＮＡ試薬はさらに、２つのリボヌクレオチドの代わりに、センス鎖の３’末端にて２−デオキシヌクレオチドを含む。
２つの別々のオリゴヌクレオチドを含む、特定のＤｓｉＲＮＡ試薬組成物が、三次構造によって連結可能である。三次構造は、ＤｓｉＲＮＡ試薬上のＤｉｃｅｒ活性を阻害せず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指向崩壊を干渉しない。１つの実施形態において、三次構造は、化学結合基であってよい。多くの好適な化学結合基が本技術分野で公知であり、使用可能である。あるいは、三次構造は、ヘアピン構造が、ｄｓＲＮＡ組成物を作製している２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際して産出されるような様式で、ＤｓｉＲＮＡ試薬の２つのオリゴヌクレオチドを結合させるオリゴヌクレオチドであってよい。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ試薬上のＤｉｃｅｒ活性を阻害せず、β−カテニンＲＮＡの指向崩壊を干渉しない。
特定の実施形態において、本発明の抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡ試薬は、Ｄｉｃｅｒによるその処理を増強する種々の特性を持つ。そのような実施形態にしたがって、ＤｓｉＲＮＡ試薬は、ｓｉＲＮＡを産出するためにＤｉｃｅｒによって有され、以下の特性の少なくとも１つを有すように十分な長さを持つ。（ｉ）ＤｓｉＲＮＡは非対称である、例えばセンス鎖上に３’オーバーハングを持つ、および（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ試薬は、活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ結合と処理の方向を指向するために、センス鎖上に修飾３’末端を持つ。これらの実施形態にしたがって、ＤｓｉＲＮＡ中最も長い鎖は、２５〜３５ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、センス鎖は２５〜３０ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は２５〜２８ヌクレオチドを含む。したがって、得られるｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端上にオーバーハングを持つ。オーバーハングは、２ヌクレオチドのような、１〜４ヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、５’リン酸を持ってもよい。
特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬のセンス鎖を、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によるＤｉｃｅｒ処理のために修飾し、すなわちＤｓｉＲＮＡ試薬が、Ｄｉｃｅｒ結合および処理の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および蛍光分子などのような立体的に込み入った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに、２−ヒドロキシエトキシメチル基を使う。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’、３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、および３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）の一リン酸ヌクレオチド、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’、３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）が含まれうる。１つの実施形態において、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、１〜３ヌクレオチド修飾因子、または２ヌクレオチド修飾因子を、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドの代わりに使用する。立体的に込み入った分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに接続する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにともなって変化しない。他の実施形態において、本発明は、アンチセンス鎖のＤｉｃｅｒ処理の方向を指向するために、ＤｓｉＲＮＡ試薬中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを企図する。さらなる本発明において、２つの末端ＤＮＡ塩基を、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端上で、二本鎖の平滑末端を形成している２つのリボヌクレオチドの代わりに３’−末端上に配置し、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングをアンチセンス鎖の３’末端上に配置する。これは、平滑末端上にＤＮＡ、オーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を持つ、非対称組成物である。
特定の他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬のアンチセンス鎖を、アンチセンス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によるＤｉｃｅｒ処理のために修飾し、すなわちＤｓｉＲＮＡ試薬が、Ｄｉｃｅｒ結合および処理の直接の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および蛍光分子などのような立体的に込み入った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに、２−ヒドロキシエトキシメチル基を使う。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’、３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、および３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）の一リン酸ヌクレオチド、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’、３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）が含まれうる。１つの実施形態において、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、１〜３ヌクレオチド修飾因子、または２ヌクレオチド修飾因子を、アンチセンス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドの代わりに使用する。立体的に込み入った分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに接続する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにともなって変化しない。実施形態において、本発明は、Ｄｉｃｅｒ処理の方向を指向するために、ｄｓＲＮＡ試薬中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを企図する。さらなる発明において、２つの末端ＤＮＡ塩基を、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端上で、二本鎖の平滑末端を形成している２つのリボヌクレオチドの代わりにアンチセンス鎖の３’−末端上に配置し、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングをセンス鎖の３’末端上に配置する。これはまた、平滑末端上にＤＮＡ、オーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を持つ、非対称組成物である。
センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件のような、生物学的条件下でアニールする。さらに、ｄｓＲＮＡ試薬の、とりわけアンチセンス鎖の、１つの配列の一領域が、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長を持ち、そこでこれらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接し、標的β−カテニンＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。
さらに、ＤｓｉＲＮＡ試薬構造は、Ｄｉｃｅｒの開裂に基づいた２つの部分を含み、第一部分はＤｉｃｅｒ−開裂工程を生き延び、ＲＩＳＣ複合体の一部として、標的ＲＮＡを活発にかみ合うように進み、第二部分はＲＩＳＣでは活性ではない。第一部分は、標的ＲＮＡ／ＲＩＳＣレベルにてＲＮＡ干渉でもっとも効果的である知られる配列を持ち、一方、第二部分は、標的配列と相補的であってよく、またはそうでなくてもよい。例えば、本発明の１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬構造の２７−ｂｐオリゴヌクレオチドが合成され、そこで予想される遺伝子発現を阻害する２１〜２２−ｂｐ区画が、アンチセンス鎖の３’末端上に局在する。アンチセンス鎖の５’−末端上に局在する残りの塩基は、Ｄｉｃｅｒによって開裂され、したがって、Ｄｉｃｅｒ開裂ＲＮＡｉ分子の連続部位ではない。この第二部分は均一であるか（すなわち標的配列の配列に基づく）、または不均一であり、核酸鎖を伸長するために加えられる。
米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号明細書は、２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡが、化学修飾がない場合でさえ、相当する２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ組成物に対して、血清中での改善された安定性を示すことを開示している。５’リン酸塩の添加と組み合わせた時に、以上で詳述したようなパターンで、アンチセンス鎖中の２’−Ｏ−メチルＲＮＡの挿入のような、ＤｓｉＲＮＡの修飾が、ＤｓｉＲＮＡ試薬の安定性を改善可能である。合成ＲＮＡ二本鎖中のすべての鎖への５’−リン酸塩の添加が、ヌクレアーゼ安定性の程度の制御を与えるための、それほど費用のかからない、生理学的方法でありうる。
本発明のｄｓＲＮＡ試薬の化学修飾パターンは、そのような試薬の有効性を増強するためにデザインする。したがってそのような修飾は、ｄｓＲＮＡの強度の減少を避けるため、ＤｓｉＲＮＡ試薬のＤｉｃｅｒ処理との干渉を避けるため、ｄｓＲＮＡ試薬の生物学的流体中の安定性を改善するため（ヌクレアーゼ感受性を減少させるため）、または生来の免疫システムによる検出を阻害する、または回避するためにデザインする。そのような修飾はまた、毒性であることを避けるため、および本発明の即時ｄｓＲＮＡ試薬の製造コストの増加を避けるため、またはその簡便さに影響を与えるためにもデザインされる。
β−カテニン生物学および生化学
公知のヒトおよびマウスβ−カテニンｃＤＮＡおよびポリペプチド配列は以下を含む。
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β−カテニンは、ＣＴＮＮＢ１遺伝子によってコードされるヒト中でのタンパク質であり（Ｋｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：２７２−４）、したがって具体的にはヒト「β−カテニン遺伝子」に対する本明細書の引用は、ＣＴＮＮＢ１遺伝子を意味する。β−カテニンは、カドヘリンタンパク質複合体のサブユニットであり、Ｗｎｔシグナル伝達中の統合構成要素として示されてきた。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｒｍａｄｉｌｌｏは、β−カテニン相同体であり、アルマジロファミリーの一メンバーであるβ−カテニンを表す。
アルマジロファミリーの一メンバーとして、β−カテニンタンパク質は、アルマジロ反復ドメインと呼ばれる多数のコピーを含み、タンパク質−タンパク質結合に対して特異的なドメインである。β−カテニンは、カドヘリンとアルファ−カテニンとは結合せず、ＩＣＡＴおよびＡＰＣのような他のタンパク質と相互作用する。
機能的に、カドヘリンは、接着結合（Ａｊｓ）を構成し、細胞増殖の制御と、近隣細胞間の接着を介して上皮細胞層の創造および維持に必要である。β−カテニンはまた、アクチン細胞骨格をしっかりと固定し、いったん上皮シートが完成したならば細胞が分裂を停止するのを引き起こす接触阻害シグナルを伝達することに対して応答するようにモデル化される（ＥｎｔｅｒｚＧｅｎｅ：カテニン）。β−カテニンは、肝臓生物学、例えば肝臓発達（胎児性および出生後両方）、部分的肝切除後の肝臓再生、ＨＧＦ−誘導肝腫大、肝帯状および肝がんの病理において重要な役割を果たすことが示されてきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ａｎｄ Ｍｏｎｇａ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４５：１２９８−１３０５）。
理論にとらわれずに、β−カテニンは、以下の様式で、Ｗｎｔシグナル伝達経路中で機能するようにモデル化される。Ｗｎｔが存在しない場合、ＧＳＫ−３（キナーゼの一つ）は、β−カテニンタンパク質を構造的にリン酸化する。β−カテニンは、ＧＳＫ３およびＡＰＣ（大腸腺腫症）と複合化したアキシン（足場タンパク質）と結合する。この複合体の創造が、ＧＳＫ３の活性を促進することによって、β−カテニンのリン酸化を本質的に増加させるように働く。β−カテニンがリン酸化される時、それは分解され、したがってβ−カテニンは、有意なレベルまで細胞内で増大しない。Ｗｎｔがｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）に結合する時、その受容体であるｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）が膜に対して補充される。ＧＳＫ３はＦｚによるＤｓｈの活性化により阻害される。このため、β−カテニンが細胞質ゾル中で増大することが許され、続いて核内に転座可能であり、そこで種々の機能を果たす。β−カテニンは、ＴＣＦおよびＬＥＦと共役して働き、異なる工程に関与する特定の標的遺伝子を活性化可能である。
β−カテニンはがん遺伝子である。β−カテニン産出における増加が、基底細胞がんの対象中で指摘されており、そのような増加が、関連する腫瘍の増殖の増加を導く（Ｓａｌｄａｎｈａ ｅｔ ａｌ．Ｂｒ．Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１５１：１５７−６４）。β−カテニン中の変異は、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、石灰化上皮腫（ＰＴＲ）、髄芽細胞腫（ＭＤＢ）および卵巣がんの原因である。β−カテニンはまた、結腸の線腫瘍ポリープ中の変異であるＡＰＣ遺伝子の産物に結合する。
β−カテニンの他のタンパク質に結合する能力は、チロシンキナーゼ（Ｌｉｌｉｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｓａｍｏ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７：４５９−６５）およびＧＳＫ−３のようなセリンキナーゼ（Ｃａｓｔｅｌｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：１５０４−１０）によって制御される。β−カテニンがカドヘリンとの複合体中でアセンブルされない時に、アキシンと複合体を形成可能である。アキシンに結合する一方で、β−カテニンは、ＧＳＫ−３によってリン酸化され、プロテオソームによるβ−カテニンの急速ユビキチン依存分解のためのシグナルを産出する。Ｗｎｔシグナル伝達経路のような種々のシグナルが、β−カテニンのＧＳＫ３−仲介リン酸化を阻害可能であり（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｕｒ．Ｂｉｏｌ．１５：１９８９−９７）、β−カテニンが細胞核に進み、転写因子と相互作用し、遺伝子転写を調節することが許容される。
β−カテニンは、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）のような他のキナーゼによってリン酸化可能である。ＰＫＡによるβ−カテニンのリン酸化は、β−カテニンの分解の減少、核内のβ−カテニンのレベルの増加、遺伝子発現を制御するためのＴＣＦファミリー転写因子とのβ−カテニンの相互作用に関連付けられている（Ｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２５：９０６３−７２）。
β−カテニンは、以下のタンパク質と相互作用することが示されている。アンドロゲン受容体、ＡＰＣ、ＡＸＩＮ１、ＣＢＹ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ３、ＣＤＫ５Ｒ１、ＣＨＵＫ、ＣＴＮＮＡ１、ＣＴＮＮＤ１、ＥＧＦＲ、ＦＨＬ２、ＧＳＫ３Ｂ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＮＦ４Ａ、ＩＫＫ２、ＬＥＦ１、ＭＡＧＩ１、ＭＵＣ１、ＮＲ５Ａ１、ＰＣＡＦ、ＰＨＦ１７、プラコグロビン、ＰＴＰＮ１４、ＰＴＰＲＦ、ＰＲＰＲＫ、ＰＳＥＮ１、ＲｕｖＢ−様１、ＳＭＡＤ７、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＵＳＰ９ＸおよびＶＥ−カドヘリン（ｈｈｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ）。
ＤｓｉＲＮＡβ−カテニン阻害活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
細胞フリー系でのＲＮＡｉを繰り返すｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、β−カテニンＲＮＡ配列（複数可）を標的化しているＤｓｉＲＮＡ構造物を評価し、したがって、ＤｓｉＲＮＡのβ−カテニン−特異的遺伝子阻害活性（またβ−カテニン阻害活性として本明細書に引用する）を評価可能である。アッセイには、β−カテニンＲＮＡに対して指向したＤｓｉＲＮＡ試薬との利用に適合した、Ｔｕｓｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７およびＺａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３によって記述されたシステムが含まれる。合胞体胚盤葉から由来したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ抽出物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてＲＮＡｉ活性を再構築するために使用する。標的ＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる選択されたβ−カテニン発現プラスミドからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を介して、または化学合成を介して産出される。センスおよびアンチセンスＤｓｉＲＮＡ鎖（例えば各２０μＭ）を、９０℃にて１分間、ついで３７℃にて１時間（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウムのような）緩衝液中でのインキュベーションによってアニールし、溶解緩衝液（例えば１００ｍＭ 酢酸カリウム、ｐＨ７．４での３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で希釈する。アニーリングをＴＢＥ緩衝液中アガロースゲル上のゲル電気泳動によってモニターし、臭化エチジウムで染色可能である。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ溶解物を、脱塩素化し、溶解した酵母糖蜜寒天上で回収したＯｒｅｇｏｎ Ｒハエからの０〜２時間齢胚を用いて調製する。溶解物を遠心し、上清を単離する。アッセイには、５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ（１０〜５０ｐＭ最終濃度）、およびＤｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ最終濃度）を含む１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝液を含む反応混合物が含まれる。反応混合液はまた、１０ｍＭリン酸クレアチン、１０ｕｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕｍ ＧＴＰ、１００ｕＭ ＵＴＰ、１００ｕＭ ＣＴＰ、５００ｕＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および１００ｕＭの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度を１００ｍＭに調節する。反応を氷上でプレアセンブルし、ＲＮＡを加える前に１０分間、２５℃にてプレインキュベートし、２５℃にてさらに６０分間インキュベートする。反応を４容量の１．２５×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でクエンチする。標的ＲＮＡ開裂をＲＴ−ＰＣＲ解析または本技術分野で公知の他の方法によってアッセイし、ＤｓｉＲＮＡが反応より除外された対照反応と比較する。
あるいは、アッセイのために内部標識した標的ＲＮＡを、［アルファ−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製し、スピンクロマトグラフィーによるＧ５０Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを通し、さらなる精製なしに標的ＲＮＡとして使用する。任意に、標的ＲＮＡは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて、５’−３２Ｐ−末端標識する。アッセイを、上記のように実施し、標的ＲＮＡとＲＮＡｉによって産出される特定のＲＮＡ開裂産物を、ゲルの自動写真上で可視化する。開裂の割合を、無傷の対照ＲＮＡ、またはＤｓｉＲＮＡなしの対照反応物からのＲＮＡ、およびアッセイによって産出された開裂産物を表すバンドのＰＨＯＳＰＨＯＲ ＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（自動写真）定量によって決定する。
１つの実施態様において、本アッセイを、ＤｓｉＲＮＡ仲介ＲＮＡｉ開裂に対するβ−カテニンＲＮＡ標的中の標的部位を明らかにするために使用し、そこで多数のＤｓｉＲＮＡ構造物を、例えば標識化標的ＲＮＡの電気泳動またはノーザン法によって、ならびに本技術分野でよく知られている他の方法論によってアッセイ反応を解析することで、β−カテニンＲＮＡ標的のＲＮＡｉ仲介開裂に関して選別する。
特定の実施形態において、好適な対照に対して、本発明のＤｓｉＲＮＡは、例えばβ−カテニンレベルにおける５０％減少がシステム、細胞、組織または生命体にて観察された場合、β−カテニン阻害活性を持つと見なされる。本発明のＤｓｉＲＮＡのβ−カテニン阻害活性の決定に対するさらなる境界および限界が以上に記述されている。
抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡ試薬の共役と伝達
特定の実施形態において、本発明は、β−カテニン−関連疾患または障害、またはβ−カテニン関連疾患または障害を発達させるリスクを持つ患者を治療するための方法に関する。そのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、β−カテニン関連疾患または障害を制御するための新規治療薬剤として働きうる。方法には、本発明の医薬組成物を患者（例えばヒト）に投与し、それによって、β−カテニンＲＮＡの発現、レベルおよび／または活性が減少することが含まれる。β−カテニンＲＮＡによってコードされたポリペプチドの発現、レベルおよび／または活性がまた、前記ＤｓｉＲＮＡがβ−カテニン転写産物の非コード領域に対して指向する場合（例えば標的化５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ配列）でさえ本発明のＤｓｉＲＮＡによって減少しうる。それらの高い特異性のために、本発明のＤｓｉＲＮＡは、任意に多型対立遺伝子が個々および／または集団内で存在する対立遺伝子特異的様式にて、細胞および組織のβ−カテニン配列を特に標的化可能である。
β−カテニン−関連疾患または疾病の治療において、ＤｓｉＲＮＡを、対象の細胞または組織、例えばβ−カテニンレベルの減少に対して標的化されたβ−カテニンおよび／または他の脱制御を示している対象の細胞または組織との接触に持ち込むことが可能である。例えば、β−カテニンＲＮＡ配列の全てまたは部分に、本質的に同一のＤｓｉＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏいずれかで、そのような細胞との接触に持ち込むか、またはそのような細胞内へ導入してよい。同様に、β−カテニンＲＮＡ配列のすべてまたは一部に本質的に同一のＤｓｉＲＮＡを、β−カテニン−関連疾患または疾病を持つ、または発達させるリスクの対象に直接投与してよい。
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬の治療的利用は、多数の異なるＤｓｉＲＮＡ試薬配列を含むＤｓｉＲＮＡ試薬の処方の利用を含みうる。例えば、２またはそれ以上、３またはそれ以上、４またはそれ以上、５またはそれ以上などの本明細書で記述した試薬を、例えばβ−カテニンＲＮＡの多数の異なる領域を標的とする、または標的β−カテニンＲＮＡのみでなく、標的、例えばβ−カテニン関連疾患または障害と関連した細胞性標的遺伝子も標的とする処方を産出するように組み合わせることができる。本発明のＤｓｉＲＮＡはまた、ＤｓｉＲＮＡ試薬のいずれかの鎖が、２つまたはそれ以上のβ−カテニンＲＮＡの領域を独立して標的するように、またはＤｓｉＲＮＡ試薬の鎖の１つが、本技術分野で公知のβ−カテニンの細胞性標的遺伝子を標的とするように構築してもよい。
標的核酸分子の１つ以上の領域を標的とする多機能ＤｓｉＲＮＡ分子の利用がまた、β−カテニンＲＮＡレベルおよび発現の強力な阻害剤を提供可能である。例えば、本発明の単一の多機能ＤｓｉＲＮＡ構造物が、同時にβｃ−１５６９とβｃ−１６８３部位両方を同時に標的としえ、さらにおよび／またはあるいは、本発明の単一または多機能薬剤を、他に対して、β−カテニンの１つのスプライスバリアントを選択的に標的とするためにデザイン可能である。
したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は個々に、または他の薬剤との組み合わせまたは併せて、β−カテニン関連疾病または障害を治療する、阻害する、減少させるまたは予防するために使用可能である。例えば、ＤｓｉＲＮＡ分子を、治療に好適な条件下、単独で、または１つまたはそれ以上の薬剤との組み合わせで、対象に投与可能であり、当業者にとって明白な他の適切な細胞に投与可能である。
ＤｓｉＲＮＡ分子をまた、対象または生体中のβ−カテニン関連疾患または障害を治療する、阻害する、減少させるまたは予防するための他の公知の治療との組み合わせで使用可能である。例えば、記述した分子を、本技術分野で公知のように、対象または生体内のβ−カテニン関連疾患または障害を治療する、阻害する、減少させるまたは予防するために、１つまたはそれ以上の公知の化合物、治療または手順と組み合わせて使用可能である。
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は、他の部位（例えばペプチドのような非核酸部位）、有機化合物（例えば染料、コレステロールなど）と（例えばそのセンスまたはアンチセンス鎖のその５’または３’末端で）共役可能であり、または共役していなくてよい。この方法でＤｓｉＲＮＡ試薬を修飾することは、相当する非共役ＤｓｉＲＮＡ試薬と比較して細胞取込を改善し、得られるＤｓｉＲＮＡ試薬誘導体の細胞標的化活性を増強してよく、細胞内のＤｓｉＲＮＡ試薬誘導体をトレースするために有用であり、または相当する非共役ＤｓｉＲＮＡ試薬と比較してＤｓｉＲＮＡ試薬誘導体の安定性を改善する。
核酸、ベクターおよび宿主細胞を導入する方法
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を、直接細胞に（すなわち細胞内に）導入してよく、または空洞、間質腔内、生命体の循環中に細胞外で導入してよく、経口で導入してよく、または核酸を含む溶液中細胞または生命体を浴させることによって導入してよい。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液が、核酸を導入してよい部位である。
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を、核酸を含む溶液の注射、核酸によって覆われた粒子の照射、核酸溶液中の細胞または生命体の浸漬、または核酸の存在下での細胞膜の電気泳動を含む、本技術分野で公知の核酸伝達方法を用いて導入可能である。脂質仲介担体伝達、化学仲介伝達、リン酸カルシウムのようなカチオン性リポソームトランスフェクションなどのような核酸を細胞に導入するための本技術分野で公知の他の方法を使用してよい。核酸を、以下の活性、細胞による核酸取込を増強する、または標的β−カテニンＲＮＡの阻害を増加させる、の１つまたはそれ以上を達成する他の成分と一緒に導入してよい。
標的β−カテニンＲＮＡを持つ細胞は、生殖系または体性、分化全能性または多能性、分裂または非分裂、柔組織または上皮、不死化または形質導入などからであってよい。細胞は、幹細胞または分化細胞であってよい。分化した細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、顆粒球、ケラチノサイト、コンドロサイト、骨芽細胞、破骨細胞、幹細胞、内分泌または外分泌腺の細胞が含まれる。
特定の標的β−カテニンＲＮＡ配列と、伝達されたＤｓｉＲＮＡ試薬物質の用量に依存して、本工程は、β−カテニンＲＮＡに対して部分的または完全な機能の欠損を提供しうる。標的細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％またはそれ以上でのＲＮＡレベルまたは発現（β−カテニンＲＮＡ発現またはコードされたポリペプチド発現いずれか）の減少または欠損が例である。β−カテニンＲＮＡレベルまたは発現の阻害は、β−カテニンＲＮＡまたはβ−カテニンＲＮＡ−コードタンパク質のレベルにおける不在（または観察可能な減少）を意味する。特異性は、細胞の他の遺伝子における明らかな効果なしに、β−カテニンＲＮＡを阻害する能力を意味する。阻害の結果は、細胞または生命体の外部特性の試験によって、またはＲＮＡ溶液ハイブリッド形成、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリッド形成、逆転写、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、他の免疫アッセイ、および蛍光活性化細胞解析（ＦＡＣＳ）のような生化学的技術によって確認可能である。本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬による標的β−カテニンＲＮＡ配列（複数可）の阻害は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏいずれかで、β−カテニン関連疾患または障害の発達／進行、例えば腫瘍形成、増殖、転移などにおける、そのようなＤｓｉＲＮＡ試薬の投与の効果に基づいて測定可能でもある。腫瘍またはがん細胞レベルの処置および／または減少には、腫瘍またはがん細胞レベルの増殖の停止または減少、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％またはそれ以上の減少が含まれ、また細胞、組織または対象への本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬の投与を介して達成可能であるがん細胞レベルにおける、対数言語、例えば１０倍、１００倍、１０００倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍減少で測定可能もある。
細胞株または全生命体でのＲＮＡ仲介阻害に関して、そのタンパク質産物が容易にアッセイされる、レポーターまたは薬物体制遺伝子の発現を測定可能である。そのようなレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グリーンフルオレセントタンパク質（ＧＦＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｆ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトパインシンターゼ（ＯＣＳ）およびそれらの誘導体が含まれる。多数の選別可能なマーカーが利用可能であり、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノリシン、プロマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性を供与する。アッセイに依存して、遺伝子発現の量の定量により、本発明に記載の処理されない細胞と比較して、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％以上である阻害の程度が決定可能である。
より低用量の注射物質、およびＲＮＡサイレンシング薬剤の投与後のより長い時間が、結果として、より小さな細胞画分における阻害となりうる（例えば少なくとも標的細胞の１０％、２０％、５０％、７５％、９０％または９５％）。細胞内での遺伝子発現の定量化は、標的β−カテニンＲＮＡの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルにてほぼ同じ量の阻害を示しうる。例として、阻害の効率を、細胞内の遺伝子産物の量を評価することによって決定してよく、ＲＮＡは、阻害ＤｓｉＲＮＡのために使用した領域の外側にヌクレオチド配列を持つハイブリッド形成プローブで検出してよく、または翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列に対して作製された抗体で検出してよい。
ＤｓｉＲＮＡ試薬は、少なくとも１つのコピー／細胞の伝達を許容する量で導入してよい。より高用量（例えば少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー／細胞）の物質が、より効果的な阻害を産出し得、より低い用量がまた特定の適用のために有用であり得る。
医薬組成物
特定の実施形態において、本発明は、本発明のＤｓｉＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。ＤｓｉＲＮＡ試薬試料は、好適に処方され、それが発生する場合に、試料の十分な部分が、遺伝子サイレンシングを誘導するために細胞内に入ることを許容する任意の方法によって細胞の環境内に導入可能である。ｄｓＲＮＡに関する多くの製剤は、当該技術分野で公知であり、ｄｓＲＮＡが標的細胞内に入り、働くことができる限り使用可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５ Ａ１明細書および第２００５／００５４５９８ Ａ１号明細書を参照のこと。例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を、リン酸緩衝食塩水溶液、リポソーム、ミセル構造およびカプシドのような緩衝溶液中に処方可能である。カチオン性脂質でのＤｓｉＲＮＡ試薬の製剤を、ＤｓｉＲＮＡ試薬の細胞内へのトランスフェクションを促進するために使用可能である。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号明細書）のようなカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリシン（ＰＣＴ国際特許公開第９７／３０７３１号明細書）のようなポリカチオン性分子を使用可能である。好適な脂質には、すべて製造業者の取扱説明書にしたがって使用可能な、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈβ−カテニンｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ボールダー，コロラド州）、またはＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）が含まれる。
そのような組成物には典型的に、核酸分子と薬理学的に許容可能な担体が含まれる。本明細書で使用するところの用語「薬理学的に許容可能な担体」には、薬理学的投与に適合可能な食塩水、溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤、抗心筋剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。補助的な活性化合物もまた組成物内に組み込むことができる。
医薬組成物を、その意図する投与経路に適用するように処方する。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮膚内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および腸投与が含まれる。非経口、皮膚内または皮下適用のために使用される溶液および懸濁液には、以下の構成要素が含まれる。注射のための水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような無菌希釈液、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類のような抗菌剤、アスコルビン酸または二硫化ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸のようなｃＨｅＬａｔｉｎｇ薬剤、酢酸、クエン酸またはリン酸のような緩衝液および塩化ナトリウム、デキストロースのような張力の調節のための薬剤。ｐＨを塩酸または水酸化物といった酸または塩基で調節することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックからなるアンプル、使い捨てシリンジまたは多重用量バイアル内に同封可能である。
注射可能な利用のために好適な医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性である場合）または分散液、および無菌注射可能な溶液または分散液の即時の調整のための無菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、好適な担体には、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ．ＴＭ．（ＢＡＳＦ、パーシッパニー，ニュージャージー州）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合で、組成物は無菌でなければならず、容易にシリンジ注入可能な程度まで流動的であるべきである。製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌のような微生物の共雑活性に対して防止されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレンングリコールなど）、およびこれらの好適な混合液を含む、溶媒または分散培地でありうる。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの利用によって、分散液の場合、要求される粒子の大きさの維持によって、および界面活性剤の利用によって、維持可能である。微生物の活性の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成可能である。多くの場合、組成物中の等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール類、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長を、組成物内に、吸収を遅延させる試薬、例えばアルミニウム一ステアリン酸およびゼラチンを加えることによって達成可能である。
無菌注射可能溶液は、要求された量で活性化合物を、要求されたように、１つまたは以上で列挙した成分の組み合わせとともに、選択された溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製可能である。一般的に、分散液は、基礎分散培地と、以上で列記した要求された他の成分を含む、無菌賦形剤内に活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、吸引乾燥と、その先に無菌濾過した溶液から活性成分＋任意のさらなる望む成分の粉末を産出する凍結乾燥である。
経口組成物は一般的に、不活性希釈液または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を、賦形剤と組み込み、錠剤、トローチまたは例えばゼラチンカプセルのようなカプセルの形態で使用可能である。経口組成物を口腔洗浄剤として使用する流体の担体を用いて調整することもできる。薬理学的に適合可能な結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の部分として含めることが可能である。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、任意の以下の成分、微晶質性セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチンのような結合剤、デンプンまたはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、プリモゲルまたはトウモロコシデンプンのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓのような潤滑油、二酸化コロイドシリコーンのような流動促進剤、スクロースまたはサッカリンのような甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料のような香味料、または同様の性質の化合物を含んでよい。
吸入による投与のために、化合物を、好適な高圧ガス、例えば二酸化炭素のような気体、またはネブライザーを含む、加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形状で伝達する。そのような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記述されたものが含まれる。
全身投与がまた、経粘膜または経皮法によって可能でもある。経粘膜または経皮投与のために、浸潤されるべきバリアに対して適切な浸潤剤が製剤内で使用される。そのような浸潤剤は一般的に当該技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与のために、合成洗剤、胆汁酸およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは座薬の利用を通して実施可能である。経皮投与のために、活性化合物を、本技術分野で一般的に公知の軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ジェルまたはクリーム内に処方する。
化合物をまた、（例えばココアバターまたは他のグリセリド類のような従来の座薬基体で）座薬、または腸伝達のための停留かん腸の形態で調製可能である。
化合物はまた、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９３），３８−９（流体力学トランスフェクション）；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（１０），１００６−１０（ウイルス仲介伝達）；またはＰｕｔｎａｍ （１９９６），Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ．Ｐｈβ−カテニンｍ．５３（２），１５１−１６０，ｅｒｒａｔｕｍ ａｔ Ａｍ． Ｊ． Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（３），３２５（１９９６）にて記述された方法を含むが、これらに限定はされない、本技術分野で公知の方法を用いてトランスフェクションまたは感染によって投与可能である。
化合物をまた、ＤＮＡワクチンのような核酸試薬の投与に好適な方法によって投与可能である。これらの方法には、遺伝子銃、生物注入器、および皮膚パッチならびに米国特許第６，１９４，３８９号明細書にて開示されたマイクロ粒子ＤＮＡワクチン技術のようなニードルフリー方法、および米国特許第６，１６８，５８７号明細書にて開示されたような粉末形状ワクチンによる哺乳動物経皮ニードルフリーワクチン化が含まれる。さらに、とりわけＨａｍａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５−１０．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、例えば、米国特許第６，４７２，３７５号明細書にて記述されたような）で開示されたように、経鼻伝達が可能であり、（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号明細書にて記述されたような）マイクロカプセル化も利用可能である。生物分解性、標的化可能マイクロ粒子伝達システムもまた使用可能である。
１つの実施形態において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化伝達系を含む、放出制御処方のような、体からの急速な消失に対して化合物を保護する担体で調製する。酢酸エチレンビニル、ポリアンヒドリド類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル類およびポリ酢酸のような生物分解性、生物適合性ポリマーが使用可能である。そのような処方は、標準技術を用いて調製可能である。物質はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社から市販されており入手可能である。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞を標的化したリポソームを含む）リポソーム懸濁液を、薬理学的に許容可能な担体として使用可能でもある。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書にて記述されたような、当業者に公知の方法にしたがって調製可能である。
そのような化合物の毒性および治療効果を、例えばＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％中の治療に効果的な用量）を明らかにするために、細胞培養液または実験動物における標準薬理学的手順によって決定可能である。毒性および治療効果の間の用量比が、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことが可能である。高い治療指数を表す化合物が好ましい。毒性副作用を表す化合物を使用してよい一方で、感染していない細胞への可能性のあるダメージを最小化し、それによって副作用を減少させるために、影響を受けた組織の部位へ、そのような化合物を標的化する伝達系をデザインすることに注意が払われるべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトにおける使用のための用量の範囲を定式化することにおいて使用可能である。そのような化合物の用量は、好ましくは毒性がほとんどないか、全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。用量は、使用する用量および利用した投与経路に依存して、この範囲内で変化してよい。本発明の方法にて使用される化合物に対して、治療に効果的な用量は、細胞培養アッセイからまず推定可能である。用量を、細胞培養液中で測定するＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにて定式化してよい。そのような情報を、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用可能である。血漿中のレベルを、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定してよい。
本明細書で定義したように、治療に効果的な量の核酸分子（すなわち効果的用量）は、選択した核酸に依存する。例えば、ＤｓｉＲＮＡ試薬をコードしているプラスミドを選択した場合、およそ１ｐｇ〜１０００ｍｇの範囲の単一投与用量を投与してよく、いくつかの実施形態において、１０、３０、１００または１０００ｐｇ、または１０、３０、１００または１０００ｎｇ、または１０、３０、１００または１０００μｇ、または１０、３０、１００または１０００ｍｇを投与してよい。いくつかの実施形態において、１〜５ｇの組成物を投与可能である。組成物は、２日に一回を含む、１またはそれ以上の回数／日〜１またはそれ以上の回数／週投与可能である。当業者は、疾患または疾病の重症度、先行治療、対象の一般的健康および／または年齢、他の疾患の存在を含むが、限定はしない、特定の要因が、対象を効果的に処置するために要求される用量およびタイミングに影響を与えうることを理解するであろう。さらに、治療に効果的な量のタンパク質、ポリペプチド、または抗体での対象の治療には、単一治療が含まれてよく、または好ましくは一連の治療が含まれてよい。
本発明の核酸分子は、例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，（２００２）上記にて記述されたものを含むが、限定はされない、本技術分野で公知の方法を用いて、発現構造物、例えばウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクター内に挿入可能である。発現構造物は、例えば、吸入、経口、静脈注射、局所投与によって（米国特許第５，３２８，４７０号明細書を参照のこと）、または定位注射によって（例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，３０５４−３０５７）対象に伝達可能である。伝達ベクターの薬理学的調製物には、適切な希釈液中のベクターが含まれてよく、伝達賦形剤が埋め込まれる徐放マトリックスを含んでよい。あるいは、完全な伝達ベクター、例えばレトロウイルスベクターを、組換え体細胞から完全なまま産出可能である場合、薬理学的調製物は、遺伝子伝達系を産出する１つまたはそれ以上の細胞を含みうる。
発現構造物は、適切な発現系での使用のために好適な構造物であってよく、当該技術分野で公知のような、レトロウイルスベクター、直線発現カセット、プラスミドおよびウイルスまたはウイルス由来ベクターを含むが、限定はされない。そのような発現構造物には、１つまたはそれ以上の誘導可能なプロモーター、Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモーターまたはＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター系、または本技術分野で公知の他のプロモーターのような、を含んでよい。構造物は、ｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖を含みうる。両方の鎖を発現している発現構造物にはまた、両方の鎖を連結しているループ構造が含まれてよく、または各鎖は、同一の構造物内の別々のプロモーターから別々に転写されうる。各鎖はまた、別々の発現構造物、例えばＴｕｓｃｈｌ（２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：５００５−５０５）から転写可能でもある。
細胞の環境内にＤｓｉＲＮＡ試薬を導入する方法が、細胞の型、およびその環境の構成に依存しうることが理解可能である。例えば、細胞が液体内でみられる時に、１つの好ましい製剤は、リポフェクタミン中のような液体製剤でであり、ＤｓｉＲＮＡ試薬を細胞の液体環境に直接加えることが可能である。脂質製剤をまた、静脈内、筋肉内または腹腔内注射によって、または経口で、または吸入または当該技術分野で公知のような他の方法によって動物に投与可能である。製剤が、哺乳動物、とりわけヒトのような動物内への投与のために好適である場合、製剤はまた薬理学的に許容可能である。オリゴヌクレオチドを投与するための薬理学的に許容可能な製剤が公知であり、利用可能である。いくつかの例において、ＤｓｉＲＮＡ試薬を緩衝液または生理食塩水溶液中で処方し、処方したＤｓｉＲＮＡ試薬を、卵母細胞での試験でのように、直接細胞内に注入することが好ましい可能性がある。ＤｓｉＲＮＡ試薬二本鎖の直接注射もまた実施されうる。ｄｓＲＮＡ（例えばＤｓｉＲＮＡ試薬）を導入する好適な方法に関して、米国特許公開第２００４／０２０３１４５ Ａ１号明細書を参照のこと。
好適な量のＤｓｉＲＮＡ試薬を導入しなければならず、これらの量は、標準の方法を用いて実験的に決定可能である。典型的には、細胞の環境中の効果的な濃度の個々のＤｓｉＲＮＡ試薬種は、５０ナノモルまたはそれ以下、１０ナノモルまたはそれ以下であり、または１ナノモルまたはそれ以下の濃度での組成物を使用可能である。他の実施形態において、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、および１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下の濃度を用いる方法を、多くの環境で使用可能である。
ＤｓｉＲＮＡ試薬組成物が処方され、それによって十分な量のＤｓｉＲＮＡ試薬が細胞内に入り、その効果を発揮するという条件で、細胞が生きることが出来る細胞外マトリックスにＤｓｉＲＮＡ試薬組成物を添加することによって方法を実施可能である。例えば、液体培養液または細胞増殖培地のような液体中、組織外植片中、または哺乳動物、とりわけヒトのような動物を含む全生命体中に存在する細胞での利用に方法が従う。
β−カテニンＲＮＡのレベルまたは活性は、当該技術分野で公知の、または後に開発される好適な方法によって決定可能である。標的ＲＮＡおよび／または標的遺伝子の「発現」を測定するために使用する方法が、標的遺伝子とそのコードされたＲＮＡの性質に依存しうることが理解可能である。例えば、標的β−カテニンＲＮＡ配列が、タンパク質をコードする場合、用語「発現」は、β−カテニン遺伝子（ゲノムまたは外来由来のいずれか）から由来する、タンパク質またはβ−カテニンＲＮＡ／転写産物を意味しうる。そのような例において、標的β−カテニンＲＮＡの発現を、β−カテニンＲＮＡ／転写産物の量を直接測定することによって、またはβ−カテニンタンパク質の量を測定することによって決定可能である。タンパク質を、染色または免疫ブロッティングによって、またはタンパク質が測定可能な反応を触媒する場合、反応速度を測定することによってのような、タンパク質アッセイにて測定可能である。すべてのそのような方法が、当該技術分野で公知であり、使用可能である。標的β−カテニンＲＮＡレベルが測定されるべきである場合、ＲＮＡレベルを検出するための当該技術分野で認識された方法を使用可能である（例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法など）。本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬にてβ−カテニンＲＮＡを標的化することにおいて、対象、組織中ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏいずれかでの、細胞中の、または細胞抽出物中の、β−カテニンＲＮＡまたはタンパク質のレベルを減少させることにおける、ＤｓｉＲＮＡ試薬の有効性の測定をまた、β−カテニン関連表現型（例えばがんまたは腫瘍形成、増殖、転移、拡散などのような、たとえば疾患または障害）の減少の程度を決定するために使用可能でもある。上記測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物または他の好適な供給源物質上で実施可能である。
β−カテニンＲＮＡの発現が、「減少」したかどうかの決定は、ＲＮＡレベルにおける変換を正確に検出可能な好適な方法によってでありうる。典型的には、決定は、それによって、少なくとも一部の当該ＤｓｉＲＮＡ試薬が細胞質に入るように細胞の環境内へ、消化していないＤｓｉＲＮＡを導入し、ついで標的ＲＮＡのレベルを測定することによって実施される。同様の測定を、同一の未処理細胞上で行い、それぞれの測定から得られた結果を比較する。
ＤｓｉＲＮＡ試薬は、薬理学的に効果的な量のＤｓｉＲＮＡ試薬と、薬理学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物として処方可能である。薬理学的、または治療に効果的な量は、意図する薬理学的、治療または予防結果を産出するのに効果的なＤｓｉＲＮＡ試薬の量を意味する。用語「薬理学的に効果的な量」および「治療に効果的な量」または単に「効果的な量」は、意図する薬理学的、治療または予防結果を産出するのに効果的なＲＮＡの量を意味する。例えば、当該臨床治療が、疾患または障害に関連した測定可能なパラメータにおいて、少なくとも２０％の減少が見られた時に、効果的であると認識され、当該疾患または障害の治療に対する薬物の治療に効果的な量は、当該パラメータにおける少なくとも２０％減少に影響を与えるのに必要な量である。
本発明の好適な処方された医薬組成物を、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、空路（エアロゾル）、腸、膣および（バッカルおよびサブリンガルを含む）局所投与を含む、非経口経路によってのような、当該技術分野で公知の方法によって投与可能である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、静脈または非経口内点滴または注射によって投与される。
一般に、ｄｓＲＮＡの好適な用量ユニットは、０．００１〜０．２５ミリグラム／レシピエントの体重キログラム／日の範囲、０．０１〜２０マイクログラム／レシピエントの体重キログラム／日の範囲、０．０１〜１０マイクログラム／レシピエントの体重キログラム／日の範囲、０．０１〜５マイクログラム／レシピエントの体重キログラム／日の範囲、０．１〜２．５マイクログラム／レシピエントの体重キログラム／日の範囲である。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、１日一回投与可能である。しかしながら、治療薬剤はまた、一日を通して適切な間隔で投与される、２、３、４、５、６またはそれ以上の分割投与量を含む用量ユニットで投与されうる。この場合、各分割投与量に含まれるｄｓＲＮＡは、一日の総用量ユニットを達成するために相応により小さくなければいけない。用量ユニットはまた、例えば数日間隔にわたり、ｄｓＲＮＡの持続および一定放出を提供する従来の徐放処方を用いて、数日にわたる単一用量に対して合成可能である。徐放製剤が当該技術分野でよく公知である。本実施形態において、用量ユニットは、相当する複数の一日量を含む。製剤に関係なく、医薬組成物は、処置されている動物またはヒト中の標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で、ｄｓＲＮＡを含まなければいけない。組成物は、ｄｓＲＮＡの複数ユニットの合計が、一緒に十分な容量を含む方法で合成可能である。
ヒトに対する好適な用量範囲を処方するために、データを細胞培養アッセイと動物研究から得ることができる。本発明の組成物の用量は、毒性がほとんどまたは全くない、（公知の方法によって決定したような）ＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内にある。用量は、使用した用量および利用した投与経路に依存して、この範囲内で変化してよい。本発明の方法にて使用する化合物に対して、治療に効果的な用量は、細胞培養アッセイよりまず推定可能である。細胞培養中で決定したような、ＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む化合物の循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにて用量を定式化してよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用可能である。血漿中のｄｓＲＮＡのレベルを、標準方法によって、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定してよい。
医薬組成物は、投与のための取扱説明書とともに、キット、容器、パックまたはディスペンサー内に含まれてよい。
治療方法
本発明は、β−カテニン（例えばβカテニン転写産物および／またはβ−カテニンタンパク質レベルの誤調節および／または上昇）によって、全体または部分的に引き起こされる、またはβ−カテニンを選択的に標的化することを介して処置可能な疾患または障害のリスク（または受けやすい）対象を治療する予防的および治療的両方の方法を提供する。
本明細書で使用するところの「治療」または「治療すること」は、疾患または、疾患または疾病の症状、または疾患に向かう傾向を治癒させる、治す、緩和する、軽減する、変化させる、治療する、改善する、好転させるまたは影響を与えるための目的で、疾患または障害、疾患または障害の症状、または疾患または障害に向かう傾向を持つ患者への治療的薬剤（例えばＤｓｉＲＮＡ試薬またはそれをコードしているベクターまたはトランスジーン）の投与、またはそのような患者から単離した組織または細胞株への治療薬剤の適用または投与として定義される。
１つの態様において、本発明は、対象に治療薬剤（例えばＤｓｉＲＮＡ試薬またはそれをコードしているベクターまたはトランスジーン）を投与することによって、対象中で、（例えばβ−カテニン発現の阻害を介して対象内での形質転換事象の開始を防止することを含む）上記のような疾患または障害を予防するための方法を提供する。疾患に対してリスクを有する対象を、例えば、本明細書で記述したような診断または予後アッセイの１つまたは組み合わせによって明らかにすることが可能である。予防的薬剤の投与は、例えば対象中の癌の検出、または疾患または障害の症状特徴の顕在化の前に実施可能であり、それによって疾患または障害が予防され、あるいはその進行が遅延する。
本発明の他の態様は、対象を治療的に治療する方法、すなわち疾患または障害の症状の開始を変更することに関する。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ試薬とともに細胞を培養することによって）、あるいはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば対象にＤｓｉＲＮＡ試薬を投与することによって）で実施可能である。
治療の予防的および治療的両方の方法に関して、そのような治療はとりわけ、ファーマコジェノミクスの領域から得られた知識に基づいてあつらえ、または修飾してよい。本明細書で使用するところの「ファーマコジェノミクス」は、遺伝子シークエンシング、統計学的遺伝学、および臨床試験および市場における薬物に対する遺伝子発現解析のような、ゲノミクス技術の適用を意味する。よりとりわけ、本用語は、どのようにして患者の遺伝子が、彼または彼女の薬物に対する応答を決定するか（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）の研究を意味する。したがって、本発明の他の態様は、個々の薬物応答遺伝子型にしたがって、本発明の標的β−カテニンＲＮＡ分子または標的β−カテニンＲＮＡモジュレータいずれかでの個々の予防的または治療的治療をあつらえるための方法を提供する。ファーマコジェノミクスは、臨床医または医師が、治療より最も利益を得る患者へ、予防的または治療的処置を標的化し、毒性薬物関連副作用を経験する患者の治療を避けることを可能にする。
治療薬剤を、選択した動物モデルで試験可能である。例えば、本明細書で記述したようなＤｓｉＲＮＡ試薬（またはそれをコードしている発現ベクターまたはトランスジーン）は、前記試薬での治療の有効性、毒性または副作用を明らかにするために、動物モデルにて使用可能である。あるいは、試薬（例えば治療薬剤）を、そのような試薬の作用機序を決定するために、動物モデルにて使用可能である。
β−カテニンｍＲＮＡレベルと発現の下方調節を評価するために有用なモデル
細胞培養
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を、ｉｎ ｖｉｖｏにて、例えば以下の手順を用いて、開裂活性に対して試験可能である。本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬によって標的化されたβ−カテニンｃＤＮＡ内のヌクレオチド配列を、以上のβ−カテニン配列中に示す。
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を、β−カテニンＲＮＡおよびβ−カテニンタンパク質阻害の程度を明らかにするために、ＨｅＬａまたは他の哺乳動物細胞を用いて、細胞培養液中で試験可能である。ＤｓｉＲＮＡ試薬（例えば図１および上述構造を参照のこと）を、本明細書で記述したように、β−カテニン標的に対して選択する。β−カテニンＲＮＡ阻害は、たとえば、培養ＨｅＬａ細胞、または培養液中に形質転換されたか、形質転換されていないその他の哺乳動物細胞への、好適なトランスフェクション薬剤によるこれらの試薬の伝達後に測定する。標的β−カテニンＲＮＡの相対量を、増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリングを用いて、アクチンまたは他の適切な対照に対して測定する（例えばＡＢＩ７７００ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））。比較を、関係しない標的、または同一の総長および化学式を持つが、各位置において無作為に置換された無作為化ＤｓｉＲＮＡ対照、または単に適切な賦形剤処理または未処理対照に対して実施したオリゴヌクレオチド配列の混合物に対して実施する。第一および第二リード試薬を、標的に対して選択し、最適化を実施した。最適なトランスフェクション試薬濃度を選択した後に、阻害のＲＮＡ経時変化を、リードＤｓｉＲＮＡ分子で実施する。
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）とｍＲＮＡのライトサイクラー定量化
総ＲＮＡを、例えば大規模抽出のためにＡｍｂｉｏｎ Ｒｎａｑｕｅｏｕｓ ４−ＰＣＲ精製キット、または９６−ウェルプレートに対してＰｒｏｍｅｇａ ＳＶ９６を用いて、ＤｓｉＲＮＡ伝達に続く細胞から調製する。Ｔａｑｍａｎ解析のために、二重標識化プローブを、例えば５’末端にて共有結合したレポーター色素ＦＡＭまたはＶＩＣと３’末端に共役したクエンサー色素ＴＡＭＡＲＡで合成した。ＰＣＲ増幅を、例えば１０μＬ総ＲＮＡ、１００ｎＭフォワードプライマー、１００ｍＭリバースプライマー、１００ｍＭ プローブ、１×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．２Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．０２５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および０．２Ｕ Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のからなる５０μＬ反応液を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ検出器上で実施する。温度サイクル条件は、４８℃にて３０分間、９５℃にて１０分間、続いて９５℃にて１５秒間と６０℃にて１分間の４０サイクルからなる。標的β−カテニンｍＲＮＡレベルの定量を、連続希釈総細胞ＲＮＡ（３００、１００、３０、１０ｎｇ／ｒｘｎ）から産出した標準に対して測定し、例えば、平行または同一チューブＴａｑＭａｎ反応中いずれかでの３６Ｂ４ ｍＲＮＡに対して標準化する。
ウエスタンブロット法
細胞タンパク質抽出物を、（例えばＲＩＰＡ緩衝液を使用して）標準マイクロ調製技術を用いて調製可能である。細胞タンパク質抽出物を、４〜１２％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル上で走らせ、膜上に移す。非特異的結合を、例えば５％無脂肪ミルクとの１時間のインキュベーションにて阻害し、続いて４℃にて１６時間一次抗体でインキュベーション可能である。洗浄に続いて、二次抗体を、例えば室温にて１時間（１：１０，０００希釈）適用し、シグナルを、ＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステム上で検出する。
種々の細胞培養系において、カチオン性脂質が、培養液中の細胞に対するオリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティを増強することが示されてきた（Ｂｅｎｎｅｔ， ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４１，１０２３−１０３３）。１つの実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子を、細胞培養実験のために、カチオン性脂質と複合体化する。ＤｓｉＲＮＡとカチオン性脂質混合物を、細胞への添加の直前に、血清を含まないＯｐｔｉｍＭＥＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）中で調製する。ＯｐｔｉＭＥＭを室温（約２０〜２５℃）まで温め、カチオン性脂質を最終の望む濃度まで加える。ＤｓｉＲＮＡ分子をＯｐｔｉＭＥＭに、望む濃度まで加え、溶液を希釈したＤｓｉＲＮＡに加え、１５分間室温にてインキュベートする。用量応答実験において、ＲＮＡ複合体を、カチオン性脂質の添加前に、ＯｐｔｉＭＥＭ内に連続希釈する。
動物モデル
動物モデルにおける抗−β−カチオンＤｓｉＲＮＡの有効性の評価を以下のように実施する。当該技術分野で公知のような癌および／または増殖性疾患、状態または障害の動物モデルを、抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡｓの有効性、強度、毒性などの評価のために使用可能である。増殖性疾患の好適な動物モデルには、例えばプロト癌遺伝子（例えばＭｙｅ、Ｓｒｃ）の機能を得る、および／または腫瘍抑制タンパク質（例えばｐ５３、Ｒｂ）の機能の欠損を持つトランスジェニック齧歯類（例えばマウス、ラット）、または新生物形成を促進するＤＮＡ変化を誘導する照射または化学突然変異原誘発物質に曝露した齧歯類が含まれる。多くのそのような動物モデルは、例えばＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡから市販されている。これらの動物モデルは、本発明の組成物のアッセイのための、供給源細胞または組織として使用してよい。そのようなモデルはまた、治療での使用に向かってβ−カテニン遺伝子発現を調節することにおいて、本発明のＤｓｉＲＮＡ組成物の有効性の前臨床評価のための使用のために使用または適合可能である。
細胞培養モデルでのように、ほとんどのβ−カテニン関連マウス腫瘍異種移植片が、ＳＷ４８０またはＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞のような、β−カテニンタンパク質を発現する癌細胞から由来したものである。β−カテニンを調節することの抗腫瘍効果の研究に関連する結腸直腸癌の異種移植片モデルが種々のグループによって記述されてきた。本発明にしたがって有用な異種移植片動物モデルが、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９：１２９１−１３００にて記述されている。これらのモデルの利用は、抗−β−カテニンによるβ−カテニン発現の阻害が、動物における腫瘍増殖の阻害を引き起こすことを示した。
そのようなモデルを、本β−カテニンレベル、発現、腫瘍／癌形成、増殖、拡散、他のβ−カテニン関連表現型、疾患または障害の発達などを阻害する発明のＤｓｉＲＮＡ分子の有効性を評価することにおいて使用可能である。これらのモデルおよび他を同様に、前臨床設定にて、本発明のＤｉｓＲＮＡ分子の安全性／毒性および有効性を評価するために使用可能である。
本発明のβ−カテニン−標的化ＤｓｉＲＮＡの評価のために有用な動物モデル系の例には、野生型マウス、および同所性または皮下ＳＷ４８０またはＨＣＴ１１６異種移植片腫瘍モデルマウスが含まれる。ｉｎ ｖｉｖｏ実験における例において、本発明のＤｓｉＲＮＡを、そのようなマウスモデルに、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で尾静脈注射するか、または繰り返し用量を、単一用量ＩＣ５０レベルで投与し、臓器（例えば前立腺、肝臓、腎臓、肺、膵臓、結腸、皮膚、脾臓、骨髄、リンパ節、乳腺脂肪体など）を、最終用量の投与から２４時間後に回収する。そのような臓器をついで、使用するモデルに依存して、マウスおよび／またはヒトβ−カテニンレベルに関して評価する。活性期間も最終ＤｓｉＲＮＡ投与後１、４、７、１４、２１またはそれ以上で試験可能である。
本発明の実施は、他に指摘しない限り、当業者の技術内である、化学、分子生物学、微生物学、組換え体ＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来の技術を使用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ，１９９２；Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，１９９１；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｊａｋｏｂｙ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ，１９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）； Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８；Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｂｏｏｋ．Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｕｓｅ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ），（４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００）を参照のこと。
他に定義しない限り、本明細書で使用したすべての技術および化学的用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を持つ。本明細書で記述したものと同様の、または等価の方法および物質を、本発明の実施または試験で使用可能であり、好適な方法および物質が以下に記述されている。すべての発行物、特許明細書、特許、および本明細書で言及された他の参考文献が、その全てが参考文献によって組み込まれている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御する。さらに、物質、方法および実施例は、例示のみであり、制限する意図はない。
（実施例）
本発明は、任意の様式で本発明の例示の方法を提供し、制限する意図はない、以下の実施例を参照して記述される。当該技術分野でよく公知の標準技術、または以下でとくに記述される技術を使用した。
抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡ
抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡ試薬は以下のように提供された。
実施例１
二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの調製と評価
オリゴヌクレオチド合成および精製
本発明に記載のＤｓｉＲＮＡ分子は、ヒトβ−カテニン配列またはマウスβ−カテニン配列上の部位を標的とする（そのようなＤｓｉＲＮＡは「一般的」ＤｓｉＲＮＡと呼ばれる）。各ＤｓｉＲＮＡ分子の１つの鎖の配列は、以上に記述した標的β−カテニン部位配列と相補的であった。ＤｓｉＲＮＡ分子は、本明細書に記述した方法を用いて化学的に合成した。一般に、ＤｓｉＲＮＡ構造物を、１９〜２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡに対して記述したような固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した（例えば、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８０４，６８３号明細書；第５，８３１，０７１号明細書；第５，９９８，２０３号明細書；第６，１１７，６５７号明細書；第６，３５３，０９８号明細書；第６，３６２，３２３号明細書；第６，４３７，１１７号明細書；第６，４６９，１５８； Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，１１１，０８６号明細書；第６，００８，４００号明細書；第６，１１１，０８６号明細書を参照のこと）。
個々のＲＮＡ鎖を合成し、標準の方法にしたがってＨＰＬＣ精製した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，コラルヴィル，アイオワ州）。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、標準技術（Ｄａｍｈａ ａｎｄ Ｏｌｇｉｖｉｅ， １９９３， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０： ８１−１１４； Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３： ２６７７−８４）を用いて、固相ホスホロアミダイト化学反応を用いて合成し、脱保護し、ＮＡＰ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）上で脱塩した。オリゴマーを、１５分間段階直線勾配を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ ｃｏｌｕｍｎ （１．０ ｃｍ ｘ ２５ ｃｍ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）上のイオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）を用いて精製した。勾配は、９０：１０ 緩衝液Ａ：Ｂ〜５２：４８ 緩衝液Ａ：Ｂで変化し、ここで緩衝液Ａは１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５であり、緩衝液Ｂは１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌである。試料を２６０ｎｍでモニターし、全長オリゴヌクレオチド種に相当するピークを回収し、プールし、ＮＡＰ−５カラム上で脱塩し、凍結乾燥した。
各オリゴマーの精度を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＰＡＣＥ ５０００ （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社，フラートン，カリフォルニア州）上でのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定した。ＣＥキャピラリーは、１００μｍ内径を持ち、ｓｓＤＮＡ １００Ｒ Ｇｅｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含む。典型的に、約０．６ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドをキャピラリー内に注入し、４４４Ｖ／ｃｍの電場中で走らせ、２６０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出した。変性Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−７Ｍ−尿素ランニング緩衝液をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。オリゴリボヌクレオチドを、以下に記述する実験での使用のために、ＣＥによって評価したように、少なくとも９０％純度で得た。化合物同一性を、製造業者の推奨プロトコールにしたがって、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ．ＴＭ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，カリフォルニア州）上での、マトリックス補助レーザー吸収イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって確認した。多くは０．２％の予測分子量内で、すべてのオリゴマーの比較分子量を得た。
二本鎖の調製
一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）オリゴマーを、例えば１００ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５からなる二本鎖緩衝液中１００μＭ濃度で、再懸濁した。相補的センスおよびアンチセンス鎖を等モル量で混合し、例えば５０μＭ二本鎖の最終溶液を得た。試料をＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中５’間１００℃まで熱し、使用の前に室温まで冷却した。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴマーを−２０℃で保存した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、凍結乾燥または−８０℃にてヌクレアーゼが含まれていないの水中で保存した。
命名法
一貫性のために、以下の命名法を本明細書で使用した。二本鎖に与えた名前は、オリゴマーの長さと、オーバーハングの有無を示唆する。「２５／２７」は、２５塩基センス鎖と、２−塩基３’−オーバーハングを含む、２７塩基アンチセンス鎖を持つ非対称二本鎖である。「２７／２５」は、２７塩基センス鎖と２５塩基アンチセンス鎖を持つ非対称二本鎖である。
細胞培養およびＲＮＡトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、ＡＴＣＣより得、５％ＣＯ２下、３７℃にて、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充したＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で維持した。Ｈｅｐａ １−６細胞をＡＴＣＣより得、５％ＣＯ２下、３７℃にて、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で維持した。ＲＮＡトランスフェクションのために、細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の取り扱い説明書にしたがって、１ｎＭまたは０．１ｎＭの最終濃度で、示唆したようなＤｓｉＲＮＡｓでトランスフェクトした。端的に記すと、各ＤｓｉＲＮＡのストック溶液の一部を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、容量８７．５μＬとした。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ ＲＮＡｉＭＡＸを、ＯｐｔｉＭＥＭ中に８７．５μまで希釈した。得られた１５０μＬ混合液を、５０μＬ／ウェルにて、９６ウェルプレートの個々のウェルに三重で加え、ＲＴにて２０分間インキュベートして、ＤｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ複合体を形成させた。一方、ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁させた。最後に、各細胞懸濁液１００μＬを各ウェル加え（最終用量１５０μＬ）、プレートを２４時間インキュベーター内に配置した。
β−カテニン阻害の評価
β−カテニン標的遺伝子ノックダウンを、値をＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９ハウスキーピング遺伝子に対して、そして対照ＤｓｉＲＮＡｓでのトランスフェクションに対して標準化して、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。
ＲＮＡ単離および解析
培地を吸引し、総ＲＮＡをＳＶ９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて抽出した。およそ１００ｎｇの総ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ、Ｏｌｉｇｏ ｄＴおよびランダムヘキサマーを用いて逆転写した。典型的に、得られたｃＤＮＡの１／６を、β−カテニン遺伝子、およびヒト遺伝子ＨＰＲＴ−１およびＳＦＲＳ９両方に特異的なプライマーとプローブを用いて、ｑＰＣＲによって解析した。ＡＢＩ７７００を、増幅反応のために使用した。各試料を三重に試験した。相対β−カテニンＲＮＡレベルを、ＨＰＲＴ１およびＳＦＲＳ９ ＲＮＡレベルに対して標準化し、対照ＤｓｉＲＮＡｓで処理した対照試料中に得たＲＮＡレベルと比較した。
実施例２
β−カテニンのＤｓｉＲＮＡ阻害−一次スクリーン
β−カテニンを標的としているＤｓｉＲＮＡ分子を、上述のようにデザインして合成し、阻害に関してＨｅＬａ細胞中で試験した。トランスフェクションのために、アニールしたＤｓｉＲＮＡを、５０μｌ／ウェルの容量で、トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温にて２０分間インキュベートした。ＨｅＬａ（ヒト）またはＨｅｐａ １−６（マウス）細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁し、ウェルに加え（１００μＬ／ウェル）、１５０μｌの容量で、１ｎＭの最終ＤｓｉＲＮＡ濃度を得た。各ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合液を、三重のＤｓｉＲＮＡ処理のために３ウェルに加えた。細胞を３７℃にて２４時間、ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合液の継続存在下、インキュベートした。２４時間の時点で、ＲＮＡを処理した細胞の各ウェルから調製した。トランスフェクション混合液を含む上清をまず除去して捨て、ついで細胞を溶解し、各ウェルからＲＮＡを調製した。処理後の標的β−カテニンＲＮＡレベルを、値を対照から得られた値に対して標準化して、β−カテニン標的遺伝子に対してｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。三重のデータを平均し、％エラーを各処置に対して決定した。標準化データをグラフにし、対照との比較で、活性ＤｓｉＲＮＡｓによる標的ｍＲＮＡの減少を明らかにした。
上記表２〜４のＤｓｉＲＮＡを標的としているβ−カテニンを、β−カテニン阻害有効性に関して試験した
４８８非対称ＤｓｉＲＮＡ（試験ＤｓｉＲＮＡｓは、２５／２７ｍｅｒの構造を有した）を調製し、１ｎＭの濃度でそのようなＤｓｉＲＮＡｓの存在下インキュベートしたヒトＨｅＬａおよびマウスＨｅｐａ １−６細胞におけるβ−カテニン阻害有効性に関して試験した。すべての４８８の試験した非対称ＤｓｉＲＮＡの配列と構造を、表２〜４にて以上に示しており、下線で示すヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル修飾残基を示唆し、リボヌクレオチド残基をＵＰＰＥＲ ＣＡＳＥとして示しており、一方デオキシリボヌクレオチド残基を下場合として示している。
１ｎＭでのヒトＨｅＬａおよびマウスＨｅｐａ １−６細胞中のこれらの４８８のβ−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡｓのアッセイは、表１４〜１７にて示した、以下のβ−カテニン阻害有効性を明らかにした。β−カテニンレベルを、β−カテニン転写産物内の位置で配置されたｑＰＣＲアッセイを用いて決定した（ヒトＨｅＬａ細胞実験に対して、対となるｑＰＣＲアッセイをヒトβ−カテニン１２９７−１３９７アンプリコン（Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ）およびヒトβ−カテニン３５０６−３６５９アンプリコン（ＦＡＭ）に対して実施した。マウスＨｅｐａ １−６細胞実験に対して、対となるｑＰＣＲアッセイを、マウスβ−カテニン１２３２−１３９４アンプリコン（ＦＡＭ）およびマウスβ−カテニン２８４８−２９３０アンプリコン（ＭＡＸ）に対して実施した。以下表１４〜１７に示した値は、これらの対となるｑＰＣＲアッセイの平均値である）。
表１４
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表１５
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表１６
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以上表１６で示したデータをまたグラフでプロットした（図４および５を参照のこと）。
表１７
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以上の表１４にて示したように、ヒトＨｅＬａ細胞中で試験した４４０の非対称ＤｓｉＲＮＡの内３４８が、１ｎＭにてＨｅＬａ細胞内で、ヒトβ−カテニンレベルの７０％以上の減少を示した。これらの３４８ＤｓｉＲＮＡのうち、３１７が、１ｎＭにて、ＨｅＬａ細胞中のヒトβ−カテニンレベルの８０％またはそれ以上の減少を示し、２２９が、１ｎＭにて、ＨｅＬａ細胞中のヒトβ−カテニンレベルの９０％またはそれ以上の減少を示した。多数のこれらのＤｓｉＲＮＡは、一意的にヒトβ−カテニンを標的とした。
以上の表１６で示した様に、マウスＨｅｐａ １−６細胞中で試験した４１６の非対称ＤｓｉＲＮＡｓの内２９５が、１ｎＭにてＨｅｐａ １−６細胞内で、マウスβ−カテニンレベルの７０％以上の減少を示した。これら２９５のＤｓｉＲＮＡのうち、２２５が１ｎＭにて、Ｈｅｐａ １−６細胞内で、マウスβ−カテニンレベルの８０％またはそれ以上の減少を示し、６８が、１ｎＭにて、Ｈｅｐａ １−６細胞内で、マウスβ−カテニンレベルの９０％またはそれ以上の減少を示した。多数のこれらのＤｓｉＲＮＡｓは、一意的にマウスβ−カテニンを標的とした。
実施例３
β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡは、腫瘍細胞内のβ−カテニンＲＮＡレベルを効果的に減少させ、腫瘍細胞増殖を阻害した
細胞培養、ＲＮＡトランスフェクションおよび解析
ＨＣＴ１１６細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ Ｍｅｄｉｕｍ中に維持した。ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＭＥＭ中で維持した（両方の培地はペニシリンとストレプトマイシンを含んだ）。トランスフェクションのために、細胞をトランスフェクションの前日に、抗生物質を含まない培地中、４０，０００細胞／ウェルにて２４−ウェルプレート内に播いた。トランスフェクトするために、ＤｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭｅｍ培地中、脂質トランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡＸと複合体形成させ、ついで培地中の細胞に加えて、示した最終ＤｓｉＲＮＡ濃度を産出した。対照には、トランスフェクトされていない細胞、ＤｓｉＲＮＡなしのＲＮＡｉＭＡＸで処理したＭｏｃｋ細胞、およびＣｏｎｔｒｏｌ ＤｓｉＲＮＡ＃１１４（特定の配列なし）が含まれた。曝露から６時間後、細胞培養培地を除去し、細胞を洗浄し、新鮮な培地を加えた。
ＲＮＡ発現解析のために、Ｐｒｏｍｅｇａ ＳＶ９６ ＲＮＡ単離キットを用いて、ＲＮＡをトランスフェクション１日後に単離した。ＲＮＡを逆転写し、ついで標準化のために、ＣＴＮＮＢ１／β−カテニンおよびハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１に対して特異的なプライマーおよびプローブ組を用いて多重で、Ｔａｑｍａｎ定量ＰＣＲをＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６上で実施した。
細胞増殖を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（ＣＴＢ試薬）を用いて、トランスフェクション３日後にアッセイした。端的に記すと、培養液培地を、ＣＴＢ試薬を含む新鮮な培地に交換し、１時間後、適切な波長での蛍光を、プレートリーダー上で測定した。細胞数の値を、Ｍｏｃｋ処置に対してグラフにした。
ＨｅＬａ細胞中、β−カテニン転写産物レベルの減少において効果的であることが明らかとなったヒトβ−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡがまた、結腸癌細胞におけるβ−カテニンの効果的な阻害剤であるかどうかを試験するために、４つのＤｓｉＲＮＡ（βｃ−１５６９、βｃ−１６８３、βｃ−２６１２およびβｃ−３３９３）を、結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６内にトランスフェクトした。図６で示すように、βｃ−１５６９、βｃ−１６８３、βｃ−２６１２およびβｃ−３３９３ ＤｓｉＲＮＡｓは、結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６において、これらの細胞の環境下、３ｎＭおよび１０ｎＭ両方で、ヒトβ−カテニン転写産物レベルを劇的に（＞８０％）減少させた。
β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡのβｃ−１５６９、βｃ−１６８３、βｃ−２６１２およびβｃ−３３９３の効果をまた、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２においても試験し、肝癌細胞株の増殖におけるＤｓｉＲＮＡ処置の効果を評価した。図７に示すように、ＨｅｐＧ２細胞の環境下、３ｎＭ濃度でのインキュベーションから３日後、全ての４つのアッセイしたβ−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡが、腫瘍細胞数の有意な減少を示した（モック処理および対照ＤｓｉＲＮＡ処理細胞に対して、およそ３０％〜６０％またはそれ以上の細胞増殖阻害がトランスフェクション後３日の時点で観察された）。とりわけ、β−カテニン標的化βｃ−１５６９ ＤｓｉＲＮＡは、腫瘍細胞数のおよそ７０％減少を示し、これは、本β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡの、治療的優位性の表現型における明らかな有効性を示唆している。
実施例４
β−カテニンのＤｓｉＲＮＡ阻害−二次スクリーン
以上の実験の９６の非対称ＤｓｉＲＮＡを、二次アッセイで試験する（「相２」）。特に、９６非対称ＤｓｉＲＮＡ（例えば、βｃ−２８４、βｃ−２８８、βｃ−６３９、βｃ−８３０、βｃ−８９３、βｃ−８９４、βｃ−８９５、βｃ−９００、βｃ−１３０６、βｃ−１３１０、βｃ−１３１４、βｃ−１５４１、βｃ−１５４５、βｃ−１５６６、βｃ−１５６７、βｃ−１５６８、βｃ−１５６９、βｃ−１６５２、βｃ−１６６２、βｃ−１６６７、βｃ−１６８１、βｃ−１６８２、βｃ−１６８３、βｃ−１８２０、βｃ−２０９７、βｃ−２１４４、βｃ−２１５１、βｃ−２２７７、βｃ−２３５０、βｃ−２４４２、βｃ−２４４５、βｃ−２５１７、βｃ−２５２１、βｃ−２５２５、βｃ−２６１１、βｃ−２６１２、βｃ−２６２０、βｃ−３１１１、βｃ−３１９５、βｃ−３３８９、βｃ−３３９３、βｃ−３３９９、βｃ−３５００、βｃ−３５３４、βｃ−３５８９、βｃ−３５９１、βｃ−３６５３、βｃ−３６５９、βｃ−３７０８、βｃ−３７１２、βｃ−２４０、βｃ−２４４、βｃ−２５３、βｃ−２５９、βｃ−２６４、βｃ−４９６、βｃ−５１６、βｃ−５４０、βｃ−５８２、βｃ−６８６、βｃ−６９２、βｃ−６９７、βｃ−７０７、βｃ−７５３、βｃ−８７０、βｃ−８８９、βｃ−１０６０、βｃ−１０７０、βｃ−１１５４、βｃ−１１８０、βｃ−１４１２、βｃ−１４１８、βｃ−１５７９、βｃ−１６２０、βｃ−１８１６、βｃ−２２８２、βｃ−３２０３、βｃ−３３３３、βｃ−３３５４、βｃ−３４２６、βｃ−３４３１、βｃ−３６０５、βｃ−３６１５、βｃ−３６７４、βｃ−３６８６、βｃ−３６９１、βｃ−ｍ１３５４、βｃ−ｍ１５１５、βｃ−ｍ１７６３、βｃ−ｍ２５６８、βｃ−ｍ２８０６、βｃ−ｍ３０９２、βｃ−ｍ３２０７、βｃ−ｍ３４４４、βｃ−ｍ３４４９およびβｃ−ｍ３５３３）を、ヒトＨｅＬａ細胞の環境中１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて、ヒトβ−カテニンの阻害に関して評価した。これらの９６非対称ＤｓｉＲＮＡをまた、マウスＨｅｐａ １−６細胞の環境中１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて、マウスβ−カテニンの阻害に関して評価した。図８〜１１にて示すように、顕著な数の非対称ＤｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ細胞の環境中でアッセイした時に、サブナノモル濃度にて、強いヒトβ−カテニン阻害有効性を再現可能に示した。さらに、図１２〜１５に示すように、多数のこれらの非対称ＤｓｉＲＮＡがまた、マウスＨｅｐａ １−６細胞の環境中でアッセイした時に、１ｎＭ、３００ｐＭおよび１００ｐＭにて、強いマウスＨＩＦ−１α阻害有効性を示した。（一方、ヒトβ−カテニン特異的、およびマウスβ−カテニン特異的阻害非対称ＤｓｉＲＮＡ両方をまた同定した。）
ＩＣ５０値を二次スクリーニングの間に正式に計算しなかった一方で、図８〜１１より、サブナノモル（および実際サブ−１００ｐＭ）ＩＣ５０値が、広く主なＤｓｉＲＮＡに対して観察されたことが明らかである。したがってβ−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡは、β−カテニン発現の明らかに強力で効果的な阻害剤であることが示された。
実施例５
β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡの修飾形態が、β−カテニンレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏで減少させる
３２のβ−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡ（βｃ−１５４５、βｃ−１６８３、βｃ−２０９７、βｃ−２２７７、βｃ−２６１２、βｃ−３１１１、βｃ−３１９５、βｃ−３３８９、βｃ−３３９３、βｃ−３３９９、βｃ−３５３４、βｃ−３６５３、βｃ−３６５９、βｃ−３７０８、βｃ−３７１２、βｃ−２５３、βｃ−２５９、βｃ−６８６、βｃ−６９２、βｃ−６９７、βｃ−８７０、βｃ−８８９、βｃ−１１５４、βｃ−１１８０、βｃ−１４１２、βｃ−２２８２、βｃ−３２０３、βｃ−３４３１、βｃ−ｍ１７６３、βｃ−ｍ２８０６、βｃ−ｍ３２０７およびβｃ−ｍ３５３３）を、図１６の略図に示したように、２’−Ｏ−メチル修飾パターンで調製した。３２ＤｓｉＲＮＡ配列のそれぞれに対して、それぞれの６アンチセンス（ガイド）鎖修飾パターンを有するＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境中、０．１ｎＭ（平行アッセイにて）および１．０ｎＭ濃度にて、ヒトＨｅＬａ細胞中のβ−カテニン阻害に関してアッセイした。これらの実験の結果を、図１７〜２４にてヒストグラムとして示す。一般に、３２のＤｓｉＲＮＡ配列は、ガイド鎖の２’−Ｏ−メチル修飾の程度が増加するように、β−カテニン阻害有効性を何らかの形で減少させる傾向を示した。しかしながら、試験したほとんどすべてのＤｉＲＮＡ配列に関して、修飾パターンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて有意なβ−カテニン阻害有効性をＤｓｉＲＮＡが維持するように同定可能であった。また、多くのＤｓｉＲＮＡｓ（例えば、βｃ−１５４５、βｃ−１６８３、βｃ−３１９５、βｃ−３３８９、βｃ−３３９３、βｃ−３３９９、βｃ−３５３４、βｃ−３６５９、βｃ−３７１２、βｃ−２５３およびβｃ−３２０３）が、試験した最も高く修飾した状態においてさえも、強力なβ−カテニン阻害有効性を示したことに注目すべきであった。これらのデータは、修飾に対して確実に耐性のある、きわめて効果的なβ−カテニン阻害ＤｓｉＲＮＡを同定することが可能であり、それによって、そのようなＤｓｉＲＮＡを安定化させるのに十分な修飾レベルおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにて対象に治療的に投与した時の、そのようなＤｓｉＲＮＡの免疫原性の減少を、これらのＤｓｉＲＮＡに適用可能であることを確認する。
特定の実施形態において、本発明は、以下の１つまたはそれ以上から選択されたＤｓｉＲＮＡを提供する。
表１８
Figure 0005976643
上記修飾ＤｓｉＲＮＡアッセイにて試験した、表１８のＤｓｉＲＮＡの内、βｃ−１５４５、βｃ−３２０３およびβｃ−３３９９が、修飾をした時にさえ、確実に効果的なＤｓｉＲＮＡ配列であることが示された（そしてβｃ−１５４５およびβ−３３９９は、試験した全ての修飾条件下で、β−カテニンの非常に効果的な阻害剤であることが観察された）。
実施例６
β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡｘｉｎ−２レベルを減少させた
β−カテニンの公知の下流標的である、Ａｘｉｎ−２におけるβ−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡの影響を、ＨＣＴ１１６（結腸癌）とＨｅｐＧ２（肝細胞癌）細胞株両方で試験した。図２６に示すように、βｃａｔ−ｈ１５６９、βｃａｔ−ｈ１６８３、βｃａｔ−ｈ２６１２およびβｃａｔ−ｈ３３９３はすべて、およそ８０〜９０％のノックダウが両方の細胞株におけるこれらのＤｓｉＲＮＡのそれぞれに関して観察され、すべてＡｘｉｎ−２の強力な阻害剤であった。細胞を、示唆した濃度（３ｎＭおよび１０ｎＭ）にて消化したＤｓｉＲＮＡでのトランスフェクション２日後にアッセイした。したがって、β−カテニンノックダウンの効果がまた、β−カテニンの下流標的、Ａｘｉｎ−２のｍＲＮＡレベルにて観察された。
実施例７
β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡは、結腸直腸および肝細胞癌細胞株において腫瘍細胞増殖を阻害した
上記のように、図７は、ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞における、β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡの増殖阻害の影響を示している。そのような細胞増殖抑制効果がまた、他の癌細胞株にて観察されるかどうかを明らかにするために、ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）およびＨｕＨ７（肝細胞癌）細胞株両方の増殖における、β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡの影響も試験した。図２６に示すように、ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞の、特定のＤｓｉＲＮＡ標的化ヒトβ−カテニン（βｃ−１６８３、βｃ−２６１２およびβｃ−３３９３）でのトランスフェクションが、対照ＤｓｉＲＮＡを投与した細胞と比較して、トランスフェクション後５日の時点でそのような細胞の増殖を阻害した。細胞増殖阻害は、トランスフェクション５日後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイした。
癌細胞増殖のより強力な阻害が、βｃ−３３９３ ＤｓｉＲＮＡのヒト肝細胞癌細胞ＨｕＨ７細胞への投与に続いて観察された（図２７）。トランスフェクション５日後、対照ＤｓｉＲＮＡを投与した細胞と比較して、およそ４０％のＨｕＨ７細胞増殖の阻害が観察された。細胞増殖阻害は、トランスフェクション５日後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイした。したがって、β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡｓの癌細胞株増殖阻害効果が、少なくとも３つの特異的な細胞株にわたり一般化されることが観察され（試験した２つの異なる肝細胞癌細胞株、ＨｅｐＧ２とＨｕＨ７にて以外にも強力であった）。
図２８にて示すように、ヒト肝細胞癌細胞株ＨｕＨ７細胞の、ＤｓｉＲＮＡ標的化ヒトβ−カテニン（特に、アンチセンス鎖の５’−末端（位置１）から開始した以下の位置、１、２、３、４，１１、１３、２５および２７で、２’−Ｏ−メチル修飾からなる「Ｍ１１」修飾アンチセンス（ガイド）鎖を有するβｃ−３３９３ ２５／２７ｍｅｒ）でのトランスフェクションが、対照ＤｓｉＲＮＡのみを投与した細胞と比較して、対照ＤｓｉＲＮＡで投与した時に、トランスフェクション２日後に、およそ８０％のβ−カテニンｍＲＮＡレベルのノックダウンを産出した。したがって、β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡは、β−カテニン発現レベルの、そして肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ７における細胞増殖の強力な阻害剤であった。
ヒトＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２およびＨＣＴ１１６腫瘍細胞株におけるβ−カテニンの発現を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて確認し、発現したβ−カテニンタンパク質の細胞下分布も試験した。β−カテニンの核および細胞質レベルを、ウエスタンブロットを介して各細胞株に対して同定し（図２９）、β−アクチンレベルを内部対照としてアッセイした。細胞抽出物を、ＮＥ−ＰＥＲ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、コンフルエントな６ウェルパテから得た。７５ｕｇのタンパク質を各細胞株からロードした。ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＨｅｐＧ２（肝細胞肝癌）およびＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）細胞株それぞれが強いレベルでβ−カテニンタンパク質を発現し、（有意な核画分もまた各細胞型について観察されたけれども）β−カテニンタンパク質は主に各細胞型の細胞質中に見られた。注目すべきことに、β−カテニンタンパク質の公知の切頂変異体形態がＨｅｐＧ２細胞にて観察された。
実施例８
β−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡは、β−カテニンｍＲＮＡとタンパク質レベルをｉｎ ｖｉｖｏにて減少させた
β−カテニン発現レベルにおけるβ−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡの影響をｉｎ ｖｉｖｏにて試験した。特に、（先にマウスβ−カテニンの活性阻害剤であるとまた言及した）ヒトβ−カテニン標的化ＤｓｉＲＮＡ βｃ−１６８３、βｃ−１８２０およびβ−３３９３が、正常マウス肝臓にて、ｉｎ ｖｉｖｏにて、マウスβ−カテニン発現の明らかに効果的な阻害剤であることが示され、１０ｍｇ／ｋｇにて、正常マウス（ｎ＝５マウス／群）に静脈内で単一用量として投与し、Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２．０（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ、カールスバッド，カリフォルニア州）中に処方した時に、有意に、β−カテニンｍＲＮＡ（図３０、上パネル）およびタンパク質（図３０、下パネル）レベル両方を阻害する（例えば、これらのＤｓｉＲＮＡに対して、およそ７０〜９０％ノックダウンが観察された）。そのような実験において、肝臓組織を投与から７２時間後に回収した。すべてのＤｓｉＲＮＡ標的化β−カテニンは、「Ｍ１１」修飾アンチセンス（ガイド）鎖を有した。特に、βｃ−１６５３はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにてβ−カテニンｍＲＮＡレベルの強力な阻害を示したが、しかし相当するβ−カテニンタンパク質レベルは、本ＤｓｉＲＮＡに関して評価しなかった。一方βｃ−２６１２はまた、βｃ−１６５３、βｃ−１６８３、βｃ−１８２０およびβｃ−３３９３に関して観察された程度まで、または以下に記述した追加実験におけるβｃ−２６１２の特定の修飾形態に関して観察された程度までではなくとも、β−カテニンｍＲＮＡレベルを阻害することが観察された。
以上のｉｎ ｖｉｖｏ結果を、特定のＤｓｉＲＮＡの修飾形態をまた使用する続く実験において、異なる条件下において確認し、展開した。図３１にて示すように、ＤｓｉＲＮＡ標的β−カテニンは、正常マウス肝臓にて、β−カテニンおよびＡｘｉｎ−２両方の活性ｉｎ ｖｉｖｏ阻害剤であることが示され、１０ｍｇ／ｋｇにて、正常マウス（ｎ＝５マウス／群）に静脈内で単一用量として投与し、Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カールスバッド，カリフォルニア州）中に処方した時に、有意に、β−カテニンｍＲＮＡ（上パネル）およびＡｘｉｎ−２ ｍＲＮＡ（下パネル）レベル両方を阻害する（例えば、多くの例で、およそ７０〜９０％ノックダウンが観察された）。そのような実験のために、肝臓組織を投与から７２時間後に回収した。これらの実験において、βｃ−３３９３およびβｃ−２６１２ ＤｓｉＲＮＡは、例えば未修飾センス（パッセンジャー）鎖と、２’−Ｏ−メチル化の「Ｍ１１」パターンを持つ修飾アンチセンス（ガイド）鎖を有する２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡに相当する「Ｍ０／Ｍ１１」パターンで、図３１に示したような異なる修飾パターンを有した（一方で、βｃ−３３９３−Ｍ１４／Ｍ１２に対して使用したセンス鎖の「Ｍ１４」修飾パターンは、センス鎖の５’−末端（位置１）から開始して、以下の位置２、４、６、８、１２、１４、１６および１８にてセンス鎖の修飾に相当する）。全ての３つのアッセイしたＤｓｉＲＮＡ（βｃ−２６１２−Ｍ０／Ｍ１１およびβｃ−３３９３の平行した異なった修飾形態）は、正常マウス肝臓において、ｉｎ ｖｉｖｏにてβ−カテニンレベルの８０％以上の阻害、およびＡｘｉｎ−２の少なくとも６０％ノックダウンを示した。
βｃ−３３９３およびβｃ−２６１２ ＤｓｉＲＮＡの修飾形態がまた、正常マウス肝臓において、ｉｎ ｖｉｖｏで、４８時間の時点にて、β−カテニンおよびＡｘｉｎ−２発現の活性阻害剤であると観察された。特に、図３２において示したように、βｃ−３３９３−Ｍ０／Ｍ１１（ＭＳ）、βｃ−３３９３−Ｍ０／Ｍ１１（ＬＳ）、βｃ−３３９３−Ｍ１４／Ｍ１２およびβｃ−２６１２−Ｍ０／Ｍ１１ ＤｓｉＲＮＡはすべて、１０ｍｇ／ｋｇにて、正常マウス（ｎ＝５マウス／群）に静脈内で単一用量として投与し、Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２．０（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ、カールスバッド，カリフォルニア州）中に処方した時に、強力に、有意にβ−カテニンｍＲＮＡ（上パネル）およびＡｘｉｎ−２ ｍＲＮＡ（下パネル）レベル両方を阻害した（例えば、全ての場合で、およそ７０〜９０％のノックダウンが観察された）。これらの実験において、肝臓組織を投与から４８時間後に回収した。ＤｓｉＲＮＡ標的化β−カテニンは、図３２にて示し、以上で記述したように、種々の修飾パターンを有した。対照ＤｓｉＲＮＡは、センスおよびアンチセンス鎖の修飾の同様のパターンを有した。
したがって、β−カテニンＤｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにて、β−カテニン発現の、意外なほどに強力で、効果的な阻害剤であると観察された。
実施例９
その他の好ましいＤｓｉＲＮＡによるβ−カテニンの阻害
示したようなセンスおよびアンチセンス鎖配列と、標的化β−カテニン野生型配列（および適用可能な場合、バリアント配列）を有する、表９に示した残りのＤｓｉＲＮＡ分子を、以上に記述したようにデザインおよび合成し、ＨｅＬａ細胞（および任意に、マウスＨｅｐａ １−６細胞）中で、以上実施例３および４で記述したように阻害有効性に関して試験した。これらのＤｓｉＲＮＡ試薬の、β−カテニン発現を阻害する能力を任意に、相当するβ−カテニン標的配列指向２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡと比較して評価した（本明細書で記述したβ−カテニンｄｓＲＮＡ試薬の２１ヌクレオチド標的配列を、以上表５および１０で示している）。これらのその他のＤｓｉＲＮＡおよび本明細書で試験したＤｓｉＲＮＡをまた、同族２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ試薬と比べて、β−カテニン標的のレベルを減少させることにおける有効性の測定を介して明らかにしたように、同族ｓｉＲＮＡをしのぐ能力に関しても検討する。そのような阻害効果の期間をまた、試験した０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭおよび５ｎＭの濃度で、投与後２４時間および４８時間で試験する。本発明のＤｓｉＲＮＡを、効果の強度および／または期間の測定を介して明らかにしたように、それらの同族２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡをしのぐ能力に関して検討する。
任意に、以上表６〜８および１１〜１３にて示したＤｓｉＲＮＡ分子をまた同様に合成し、試験する。
実施例１０
適応症
本明細書に記述したように、本発明の核酸分子を、β−カテニンレベルに関連した疾患状態を診断するために、アッセイ中で使用する。さらに、核酸分子を、β−カテニン誤調節、レベルなど関連する疾患状態を処置するために使用可能である。
β−カテニン発現調節に関連する可能性のある特定の疾患および障害には、単独または他の治療との組み合わせで、癌および／または増殖性疾患、病態または障害、および細胞または組織中のβ−カテニンのレベルに関連する、または応答しうる他の疾患、病態または障害が含まれるが、限定はされない。β−カテニン発現調節に関連した特定の変性および疾患状態には、例えば前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、膵臓癌および乳癌が含まれるが、限定はされない。
特定の治療実施形態において、処理されるべき疾患または障害は、結腸直腸癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、悪性メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、下垂体癌、食道癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、造血系癌、子宮頸癌、ＣＮＳ癌、骨癌、胆管癌および副腎癌からなる群より選択される癌のような、癌のような過形成障害からなる群より選択される。任意に、疾患または障害は、結腸直腸癌、肝細胞癌、子宮内膜癌および悪性メラノーマからなる群より選択される癌である。特定の実施形態において、障害は、肝癌および腎臓癌からなる群より選択される癌である。特定の実施形態において、疾患または障害は、ＡＰＣ遺伝子のような、β−カテニン遺伝子、または、そのタンパク質産物がβ−カテニンに結合し、または相互作用する遺伝子における変異に関連する。したがって、種々の実施形態において、標的ｍＲＮＡは、β−カテニン配列の変異形態であり、例えば、癌に関連したＳＮＰのような、１つまたはそれ以上の単一の点変異を含んでよい。
β−カテニンまたはＡＰＣ遺伝子中の変異が、異常なレベルのβ−カテニン活性を導くそのような疾患の例は、（１）結腸直腸癌、ＡＰＣおよびβ−カテニンは、全ての場合の７０％以上で互いに変異する（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２；Ｍｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７；Ｓｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９８）、（２）肝細胞癌、β−カテニンは、２５％以上の場合で変異する（ｄｅ Ｌａ Ｃｏｓｔｅ Ａ，ＰＮＡＳ，１９９８）、（３）子宮内膜癌、β−カテニンは１０％以上の場合で変異する、（４）悪性メラノーマ、β−カテニンは１０％以上の場合で変異する（Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７）、である。
そのような疾患のさらなる例は、卵巣、膵臓、下垂体、食道、肺、乳、腎臓、造血系、子宮頸、ＣＮＳ、骨、胆管及び副腎の癌である。β−カテニンまたはＡＰＣ遺伝子における変異がこれらの疾患に関連することが示されてきた（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（英国）ホームページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）。
特定の実施形態において、疾患または障害は、異常なレベルの、β−カテニンの変異形態が原因となる。特定の実施形態において、疾患または障害は、異常なレベルのβ−カテニンの野生型形態が原因となる。本発明の１つの態様は、治療に効果的な量の、β−カテニンを標的とする本発明のＤｓｉＲＮＡまたはその種々の組成物または共役物を哺乳動物に投与することを含む、β−カテニンの異常なレベルに関連した病態を患っている、またはそのような状態を受けやすい哺乳動物を治療するための方法を指向する。
ゲムシタビンおよびシクロホスファミドは、本発明の核酸分子（例えばＤｓｉＲＮＡ分子）との組み合せ可能、または併用可能な化学治療剤の非限定例である。当業者は、抗癌化合物および治療のような、他の薬剤を同様に、本発明の核酸分子（例えばＤｓｉＲＮＡ分子）と容易に混合可能であり、したがって本発明の範囲内であることを認識するであろう。そのような化合物および治療は、本技術分野で公知であり（たとえば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２， ｅｄｓ Ｄｅｖｉｔａ，Ｖ．Ｔ．，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．， ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，フィラデルフィア州，米国を参照のこと）、抗葉酸類、フルオロピリミジン類、シタラビン、プリン類似体、アデノシン類似体、アムサクリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤類、アントラピラゾール類、レチノイド類、ブレオマイシン、アントラサイクリン類、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのような抗生物質類、ヘキサメチルメラミン、デカルバジン、１−アスペルギナーゼ、白金類似体、窒素マスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、イホスファミド、４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド、ニトロソウレア、チオテパのようなアルキル化剤、ビンカアルカロイド類、エピポドフィロトキシン類、タキソールのような植物由来化合物、タモキシフェン、放射線治療、手術、栄養補助剤、遺伝子治療、３Ｄ−ＣＲＴのような放射療法、リシン、モノクローナル抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎのような免疫毒素療法などが含まれるが、これらに限定はされない。組み合わせ療法のために、本発明の核酸を２つの方法のうち１つで調製する。第一に、試薬を、静脈内投与のための溶液中の、リポソーム内にカプセル封入した本発明の核酸と、イホスファミドの混合液のような、核酸と化学療法剤の調製において物理的に混合し、そこで両方の薬剤は、治療に効果的な濃度で存在する（例えば１０００〜１２５０ｍｇ／ｍ２／日を伝達するための溶液中のイホスファミドと、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日を伝達するための同一の溶液中の本発明のリポソーム結合核酸）。あるいは、試薬を、それぞれの効果的な用量で別々に、しかし同時に投与する（例えば、イホスファミド１０００〜１２５０ｍｇ／ｍ２／ｄと本発明の核酸０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日）。
当業者は、本明細書で記述した疾患および病態を治療するために使用する他の化合物および治療を、本発明の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）と同様に混合可能であり、したがって本発明の範囲内である。
実施例１１
ＤｓｉＲＮＡの血清安定性
ＤｓｉＲＮＡ試薬の血清安定性を、３７℃にて種々の時間間隔（〜２４時間）の間、５０％ウシ胎児血清中でのＤｓｉＲＮＡ試薬のインキュベーションを介して評価する。血清を抽出し、核酸を、２０％非変性ＰＡＧＥ上で分離し、Ｇｅｌｓｔａｒ染色によって可視化可能である。ヌクレアーゼ分解からの保護の相対レベルを、（修飾ありおよびなしで）ＤｓｉＲＮＡｓに関して評価する。
実施例１２
β−カテニン遺伝子発現の下方制御を評価するための、その他の細胞培養モデルの利用
抗−β−カテニン試薬での処置の後のβ−カテニン−仲介効果を見るために、種々のエンドポイントが細胞培養モデルで使用されてきた。表現型エンドポイントには、細胞増殖の阻害、ＲＮＡ発現、およびβ−カテニンタンパク質発現の減少が含まれる。β−カテニン変異が、特定の腫瘍細胞の増殖の増加の直接の原因となるので、細胞増殖アッセイに対する増殖エンドポイントは、例えば以上の実施例にて記録されたように、スクリーンとして使用可能である。本エンドポイントを測定可能な種々の方法が存在する。ＤｓｉＲＮＡでの細胞の処置後、細胞を増殖させ（一般的には５日間）、その後細胞生存能力、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞ＤＮＡ内への取込および／または細胞密度を測定する。細胞密度のアッセイは、例えば、（Ｓｙｔｏ（登録商標）１３またはＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）のような）市販されている蛍光核酸鎖を用いることによって、９６−ウェルフォーマットで実施可能である。第二の、確認エンドポイントとして、β−カテニンタンパク質発現のレベルにおけるＤｓｉＲＮＡ−仲介減少を、β−カテニン−特異的ＥＬＩＳＡを用いて評価可能である。
実施例１３
β−カテニン誤調節のマウスモデルにおける、抗β−カテニンＤｓｉＲＮＡ有効性の評価
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから選んだ抗−β−カテニンＤｓｉＲＮＡをさらに、例えば異種移植片および以上で引用したような他の動物モデルを含む、マウスモデルにてさらに試験可能である。１つの例において、誤調節された（例えば上昇した）β−カテニンレベルを有するマウスに、流体力学尾静脈注射を介して、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を投与する。３〜４匹のマウス／群（試験した特定のＤｓｉＲＮＡ試薬に基づき分割）に、５０μｇまたは２００μｇのＤｓｉＲＮＡを注射する。β−カテニンＲＮＡのレベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて評価する。さらに、またはあるいは、β−カテニンのレベル（例えばβ−カテニンタンパク質レベルおよび／または癌細胞／腫瘍形成、増殖または拡散）を、本技術分野で認識される方法を用いて評価可能であり、またはβ−カテニンの誤調節に関連する表現型（例えば腫瘍形成、増殖、転移など）を、（任意にβ−カテニン転写産物またはβ−カテニンタンパク質レベルの測定のための代理として）モニターする。そのような動物モデルにおける活性ＤｓｉＲＮＡを、標準の化学療法との組み合わせで続けて試験可能でもある。
実施例１４
診断利用
本発明のＤｓｉＲＮＡ分子を、種々の適用、例えば臨床、工業、環境、農業および／または研究設定にて、分子標的（例えばＲＮＡ）の同定においてのような、種々の診断適用で使用可能である。ＤｓｉＲＮＡ分子のそのような診断利用には、再構築ＲＮＡｉ系を利用すること、例えば、細胞溶解物または部分的に精製した細胞溶解物を用いることが含まれる。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、疾患細胞内の遺伝的ドリフトおよび変異を検討するための診断ツールとして使用可能である。ＤｓｉＲＮＡ活性と、標的β−カテニンＲＮＡの構造間の近い関係により、標的β−カテニンＲＮＡの塩基対形成と三次元構造を変化させる、β−カテニン分子の領域における変異の検出が許容される。本発明にて記述された多数のＤｓｉＲＮＡ分子を用いることによって、ＲＮＡ構造およびｉｎ ｖｉｔｒｏかつ細胞および組織内での機能に対して重要である、ヌクレオチド変化をマッピング可能である。標的β−カテニンＲＮＡのＤｓｉＲＮＡ分子での開裂を、遺伝子発現を阻害し、β−カテニン関連疾患または障害の進行における、特定の遺伝子産物の役割を定義するために使用可能である。この様式において、他の遺伝的標的を、疾患の重要なメディエータとして定義可能である。これらの実験は、組み合わせ療法（例えば異なる遺伝子を標的とした多数のＤｓｉＲＮＡ分子、公知の低分子阻害剤と結合したＤｓｉＲＮＡ分子、またはＤｓｉＲＮＡ分子および／または他の化学または生物学的物質と組み合わせでの断続的な治療）の可能性を提供することによって、疾患の進行のよりよい治療を導きうる。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の他のｉｎ ｖｉｔｒｏ利用が本技術分野でよく公知であり、疾患または関係する病態の原因となるＲＮＡの存在の検出が含まれる。そのようなＲＮＡは、標準の方法、例えば蛍光共鳴放射移動（ＦＲＥＴ）を用いて、ＤｓｉＲＮＡでの治療後、開裂産物を測定することによって検出する。
特定の例において、標的β−カテニンＲＮＡの野生型または変異体または多型形態のみを開裂するＤｓｉＲＮＡ分子をアッセイのために使用する。第一ＤｓｉＲＮＡ分子（すなわち、標的β−カテニンＲＮＡの野生型形態のみを開裂するもの）を使用して、試料中に存在する野生型β−カテニンＲＮＡを同定し、第二ＤｓｉＲＮＡ分子（すなわち標的ＲＮＡの変異体または多型形態のみを開裂するもの）を使用して、試料中の変異体または多型β−カテニンＲＮＡを同定する。反応対照として、野生型、および変異体または多型β−カテニンＲＮＡ両方の合成基質が、両方のＤｓｉＲＮＡ分子によって開裂され、反応物中の相対ＤｓｉＲＮＡ効率と、「非標的化」β−カテニンＲＮＡ種の開裂がないことを示す。合成基質からの開裂産物がまた、試料集団中の野生型および変異体β−カテニンＲＮＡの解析のために、サイズマーカーを産出するために働く。したがって、各解析は、２つのＤｓｉＲＮＡ分子、２つの基質および１つの未知の試料を必要とし、６つの反応物にあわせる。開裂産物の存在を、各β−カテニンＲＮＡの全長および開裂断片を、ポリアクリルアミドゲルの１つのレーン内で解析可能であるように、ＲＮａｓｅ保護アッセイを用いて明らかにする。変異体または多型β−カテニンＲＮＡの発現、および標的細胞内のβ−カテニン関連表現型変化の推定リスクへの洞察を得るために結果を定量化する必要はまったくない。そのタンパク質産物が、表現型（すなわち疾患相関／関連）の発達において暗示されるβ−カテニンｍＲＮＡの発現が、リスクを確立するのに十分である。比較可能な特定の活性のプローブを、両方の転写産物のために使用する場合、β−カテニンＲＮＡレベルの定性的比較が十分であり、初期診断のコストを減少させる。より高い変異体または多型形態の野生型に対する比が、β−カテニンＲＮＡレベルを定性的または定量的に比較するかどうかのより高いリスクと相関する。
本明細書に言及されたすべての特許および発行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルの指標である。本明細書で引用したすべての参考文献は、各参考文献が、その全てが個々に参考文献によって組み込まれたのと同様の程度まで、参考文献によって組み込まれている。
当業者は、本発明が目的を実施するためによく適合することを容易に理解し、言及した結果および利点ならびにその中の固有のものを得る。好ましい実施形態の代表例として本明細書で記述する方法および組成物は例示であり、本発明の範囲を制限する意図はない。そこでの変化および他の利用が当業者に対して存在し、本発明の精神の範囲内で企図され、請求項の範囲によって定義される。
種々の置換および修飾を、本発明の範囲および精神から逸脱せずに本明細書で開示された本発明に対して実施可能であることが、当業者に容易に理解されるであろう。したがって、そのような追加実施形態は、本発明および続く請求項の範囲内にある。本発明は、ＲＮＡｉ活性を仲介するために、改善された活性をもつ核酸構造物を産出することに対して、本明細書で記述した化学的修飾の種々の組み合わせおよび／または置換を試験することを当業者に教示する。そのような改善された活性は、改善された安定性、改善されたバイオアベイラビリティ、および／またはＲＮＡｉ仲介細胞応答の改善された活性を含みうる。したがって、本明細書に記述した特定の実施形態は、限定ではなく、当業者は、本明細書で記述した修飾の特定の組み合わせが、改善されたＲＮＡｉ活性を持つＤｓｉＲＮＡ分子を同定することに対して、不必要な実験なしに試験可能であることを容易に理解可能である。
本明細書に例示的に記述された発明は、本明細書に特に開示されていない、任意の要素または複数の要素、制限または複数の制限なしに好適に実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、任意の用語「含む」、「から本質的になる」および「からなる」は、他の２つの用語のいずれかに置換してよい。使用された用語および表現は、制限をするための用語ではなく記述の用語として使用され、示し、記述した機能の任意の等価物またはその部分を除外するそのような用語および発現の利用において意図しておらず、種々の修飾が、請求された本発明の目的の範囲内にある可能性が認識される。したがって、本発明が、好ましい実施形態によって特に開示されているけれども、本明細書で開示されたコンセプトの任意の特徴、修飾およびバリエーションが、当業者によって頼みとなり得ること、およびそのような修飾およびバリエーションが、記述ならびに付随する請求項によって定義されたように、本発明の範囲内であると考慮されることが理解されるものである。
さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュグループまたは他の代替グルーピングにて記述される場合、当業者は、マーカッシュグループまたは他のグループの任意の個々のメンバー、またはメンバーのサブグループに関してそれによって記述もされることを理解されうる。
本発明を記述する文脈中（特に続く請求項の文脈中）用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の参照は、本明細書の他で指摘するか、または文脈によって明確に矛盾しない限り、単数および複数両方をカバーすると理解されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「持つ（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に言及しない限り、無制限の用語として構築されるべきである（すなわち、「含むが、限定されない」と意味する）。本明細書の値の範囲の口述は単に、本明細書で他に指摘しない限り、その範囲内にある各別々の値を個々に引用する簡潔にした方法として供給する意図があり、各別々の値は、本明細書で個々に引用されるものとして、本明細書内に組み込まれる。本明細書で記述されたすべての方法を、本明細書他に引用しない限り、または文脈において明確に他に矛盾しない限り、好適な順番で実施可能である。任意の、そしてすべての例、または本明細書で定義される例示的言語（「たとえば「のような」）の利用は、単に本発明をよりよく例示する意図であり、他に請求しない限り、本発明の範囲における制限を提起するものではない。明細書中言及がないものは、本発明の実施に必須であるような、任意の非請求要素を示唆しているとして構成されるべきである。
本発明の実施形態が本明細書に記述されており、本発明を実施するために本発明者等に公知の最適な様式が含まれる。これらの実施形態のバリエーションが、以下の記述を読むことに際して、当業者に明確になり得る。
本発明者らは、当業者が、適切にそのようなバリエーションを利用することを期待しており、本発明に関して、本明細書で特に記述したもの以外で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許可されるように、本明細書に付随する請求項にて引用された対象のすべての修飾および等価物を含む。さらに、全ての可能性あるそれらのバリエーションにおける任意の上記要素の任意の組み合わせが、他に指摘されない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、本明細書によって企図される。当業者は、ただ通常の実験を使用して、本明細書で記述される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または究明することが出来る。そのような等価物は、以下の請求項によって含まれることを企図する。

Claims (15)

  1. 哺乳動物細胞内のβ−カテニンの発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡは、配列番号：１２３９と、配列番号：１３０または配列番号：３４５７とを含む、ｄｓＲＮＡ。
  2. ａ）第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の多くとも２７ヌクレオチドにそって、配列番号：１〜３および５〜６からなる群より選択される標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に相補的である、または
    ｂ）第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端での、第一ヌクレオチド（位置１）から開始して、位置１、２および／または３が修飾ヌクレオチドで置換される、または
    ｃ）前記第一鎖の前記３’末端と、前記第二鎖の５’末端が平滑末端を形成する、または
    ｄ）前記第一鎖が長さにして２５ヌクレオチドであり、かつ前記第二鎖が長さにして２７ヌクレオチドである、または
    ｅ）前記第二鎖が長さにして２５〜５０ヌクレオチドである、または
    ｆ）前記第一鎖が、配列番号：１３０を含む、または
    ｇ）前記第一鎖が、配列番号：１３０である、または
    ｈ）前記第一鎖の前記３’末端の前記修飾ヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドおよび蛍光分子からなる群より選択される、または
    ｉ）前記ｄｓＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒによって前記細胞中で内因的に開裂される、または
    ｊ）標的遺伝子の発現を減少させるために十分な前記二本鎖核酸の量が、前記細胞の環境中、１ナノモルまたはそれ以下である、または
    ｋ）前記第二鎖が、その３’末端にて１〜５一本鎖ヌクレオチドを含む、または
    ｌ）前記第一および第二鎖が、化学的リンカーによって連結する、
    請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  3. 哺乳動物細胞内の標的β−カテニン遺伝子の発現を減少させるための方法であって、
    ｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞を、前記細胞中の標的β−カテニン遺伝子の発現を減少させるために、請求項１のｄｓＲＮＡと接触させることを含み、
    標的β−カテニン遺伝子発現が、少なくとも１０％の量（％で表示）減少する、
    方法。
  4. ヒトを除く哺乳動物内の標的β−カテニン遺伝子の発現を減少させるための請求項１のｄｓＲＮＡの使用。
  5. ｍ）前記ｄｓＲＮＡが、１マイクログラム〜５ミリグラム／前記哺乳動物のキログラム／日の用量で投与される、または
    ｎ）投与段階が、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣、局所、経口および吸入伝達からなる群より選択された様式を含む、
    請求項４に記載の使用。
  6. 細胞を、前記細胞の増殖を阻害するために請求項１に記載のｄｓＲＮＡとｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させることを含み、
    前記細胞が対象の腫瘍細胞である、
    細胞の増殖を選択的に阻害するための方法。
  7. 前記ｄｓＲＮＡが、前記ｄｓＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞内に導入する時に、少なくとも１０％の量（％で表示）で標的β−カテニンＲＮＡレベルを減少させるのに効果的な量で存在し、
    前記効果的な量が、前記細胞の環境中、１ナノモルまたはそれ以下である、
    請求項１のｄｓＲＮＡを含む製剤。
  8. 請求項１のｄｓＲＮＡを含む哺乳動物細胞。
  9. 請求項１のｄｓＲＮＡと、薬理学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  10. 請求項１のｄｓＲＮＡと、その利用のための取扱説明書を含むキット。
  11. ヒトを除く対象のβ−カテニン関連疾患または障害を治療するため、または予防するための、請求項１のｄｓＲＮＡの使用であって、
    前記対象の前記β−カテニン関連疾患または障害を治療する、または予防するために、対象に請求項１のｄｓＲＮＡと薬理学的に許容可能な担体を投与することを含み、
    前記β−カテニン関連疾患または障害が、結腸直腸癌または肝細胞癌である、
    使用。
  12. 第一および第二核酸鎖を含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、
    前記第一鎖が長さにして１５〜３５ヌクレオチドであり、前記ｄｓＲＮＡの前記第二鎖が配列番号：１２３９を含み、
    前記ｄｓＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞内に導入される時に、β−カテニン標的遺伝子発現を減少させる、
    ｄｓＲＮＡ。
  13. ｐ）前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、または
    ｑ）前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、その３’末端にて、１〜５一本鎖ヌクレオチドを含む、または
    ｒ）前記第一鎖が、長さにして２５〜３５ヌクレオチドである、または
    ｓ）前記第二鎖が、長さにして２５〜３５ヌクレオチドである、または
    ｔ）前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の多くとも２７ヌクレオチドにそって、配列番号：２２２６〜３３３４からなる群より選択される標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に相補的である、または
    ｕ）前記第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端での第一ヌクレオチド（位置１）から開始して、位置１、２および／または３が修飾ヌクレオチドで置換される、または
    ｖ）前記第一鎖の前記３’末端と、前記第二鎖の５’末端が、平滑末端を形成する、または
    ｗ）前記第一鎖が長さにして２５ヌクレオチドであり、前記第二鎖が長さにして２７ヌクレオチドである、
    請求項１２に記載のｄｓＲＮＡ。
  14. （ａ）センス領域およびアンチセンス領域であり、前記センス領域および前記アンチセンス領域が一緒に、１５〜３５塩基対からなる二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス領域が、配列番号：４９６４を含む配列の相補体である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域、および
    （ｂ）０〜２の３’オーバーハング領域であり、各３’オーバーハング領域は、長さにして６またはそれ以下のヌクレオチドである、０〜２の３’オーバーハング領域
    を含み、
    好ましくは、前記二本鎖領域が、１９〜３５塩基対からなる、
    ｄｓＲＮＡ分子。
  15. ｘ）前記アンチセンス領域は、配列番号：２３４８を含む配列の相補体である配列を含む、または
    ｙ）前記ｄｓＲＮＡは、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、または
    ｚ）前記アンチセンス領域は、その３’末端にて１〜５一本鎖ヌクレオチドを含む、または
    ａａ）前記センス領域は、長さにして２５〜３５ヌクレオチドである、または
    ａｂ）前記アンチセンス領域は、長さにして２５〜５０ヌクレオチドである、または
    ａｃ）前記アンチセンス領域は、前記アンチセンス領域長の多くとも２７ヌクレオチドにそって、配列番号：２２２６〜３３３４からなる群より選択される標的β−カテニンｃＤＮＡ配列に相補的である、または
    ａｄ）前記センス領域の３’末端での、第一ヌクレオチド（位置１）から開始して、位置１、２および／または３が修飾ヌクレオチドで置換される、または
    ａｅ）前記センス領域の前記３’末端と、前記アンチセンス領域の５’末端が平滑末端を形成する、または
    ａｆ）前記センス領域が長さにして２５ヌクレオチドであり、かつ前記アンチセンス領域が長さにして２７ヌクレオチドである、または
    ａｇ）前記センス領域が、配列番号：１３０を含む、または
    ａｈ）前記センス領域が、配列番号：１３０である、または
    ａｉ）前記センス領域の前記３’末端の前記修飾ヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドおよび蛍光分子からなる群より選択される、または
    ａｊ）前記ｄｓＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒによって前記細胞中で内因的に開裂される、または
    ａｋ）標的遺伝子の発現を減少させるために十分な前記二本鎖核酸の量が、前記細胞の環境中、１ナノモルまたはそれ以下である、または
    ａｌ）前記センスおよびアンチセンス領域が、化学的リンカーによって連結する、
    請求項１４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
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