JP2015529467A - 二本鎖rnaによるmycの特異的阻害に関する方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、dsRNA、例えばDicer基質siRNA(DsiRNA)剤の利用を介して、MYC標的RNAおよびタンパク質レベルを減少させるために有用な化合物、組成物、および方法に関する。【選択図】図1
Description
関連明細書の相互参照
本明細書は、2012年9月14日に出願した「Methods and Compositions for the Specific Inhibition of MYC by Double−Stranded RNA(二本鎖RNAによるMYCの特異的阻害のための方法および組成物)」との表題の米国仮特許出願第61/701,136号、2013年3月15日に出願した“Methods and Compositions for the Specific Inhibition of MYC by Double−Stranded RNA”との表題の米国仮特許出願第61/786,695号の優先権ならびに利益を米国特許法119条(e)の下請求する。上記の特許出願の内容全体は本明細書に援用される。
本明細書は、2012年9月14日に出願した「Methods and Compositions for the Specific Inhibition of MYC by Double−Stranded RNA(二本鎖RNAによるMYCの特異的阻害のための方法および組成物)」との表題の米国仮特許出願第61/701,136号、2013年3月15日に出願した“Methods and Compositions for the Specific Inhibition of MYC by Double−Stranded RNA”との表題の米国仮特許出願第61/786,695号の優先権ならびに利益を米国特許法119条(e)の下請求する。上記の特許出願の内容全体は本明細書に援用される。
本発明は、c‐Myc遺伝子の発現および/または活性の調節に応答する特性、疾患および状態の研究、診断および処置のための化合物、組成物、および方法に関する。
c‐MYC(MYC)遺伝子は、細胞の増殖および分化の鍵となる分子である調節因子である。Mycタンパク質は、コンセンサス配列(エンハンサーボックス配列(E‐ボックス))の結合およびヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)の動員を介して、多くの遺伝子発現を活性化する転写因子である。また、Mycは、転写抑制因子としても作用できる。Miz−1転写因子と結合し、p300コアクティベーターと置き換わることにより、MycはMiz−1標的遺伝子の発現を阻害する。MycはDNAの複製の制御において直接的な役割を有する(Dominguez−Sola et al. Nature 448(7152):445-51)。
Wnt、Shh、およびEGF(MAPK/ERK経路を介する)を含む様々な分裂促進性のシグナリング経路は、Mycを活性化することが例証されている。その標的遺伝子の発現を改変する際のMycの役割により、多くの生物学的作用が引き起こされることが示されている。この作用として、細胞増殖を駆動する能力(サイクリンをアップレギュレートし、p21をダウンレギュレートする)が最初に発見されたが、Mycはまた、細胞の生育(リボソームRNAおよびタンパク質をアップレギュレート)、アポトーシス(Bcl‐2をダウンレギュレート)、分化、および幹細胞の自己再生を調節する際にも非常に重要な役割を果たす。Mycは、強力なプロト癌遺伝子であり、そのアップレギュレーションは、多くの種類の癌で述べられている。Mycの過剰発現は、DNAの過剰複製に関与するとされる機構を介して遺伝子増幅を刺激する(Denis et al. Oncogene 6(8): 1453-7)。
少なくとも、特異的に変異または過剰発現する際に細胞増殖を増大させるMYCプロト癌遺伝子の性質により、MYCは、MYCの小分子阻害剤および核酸阻害剤を含む抑制型癌治療にとって魅力的な標的である。
25〜35の長さのヌクレオチド鎖を有する二本鎖RNA(dsRNA)剤が、哺乳類細胞での標的遺伝子発現の効果的な阻害剤として記述されている(Rossi et al.,米国特許公開公報第2005/0244858号および米国特許公開公報第2005/0277610号)。このような長さのdsRNA剤は、RNA干渉(RNAi)経路のDicer酵素によって処理されると考えられており、このような薬剤は「Dicer基質siRNA」(「DsiRNA」)剤と呼ばれている。DsiRNA剤のさらなる改変構造は従来より記述されている(Rossi et al.,米国特許公開公報第2007/0265220号)。
本明細書では、MYCを標的とする改善型核酸薬剤が提供される。特に、MYCの標的化が特異的に例示される。
本発明は、MYCの発現を低減する核酸組成物を目的とする。このような組成物は、二本鎖RNA(「dsRNA」)などの核酸を含み、および(本発明は)それらを調製する方法を目的とする。本発明の核酸は、in vitroまたは哺乳類の対象中のいずれかで、細胞内の標的MYC遺伝子の発現を低減できる。
1つの態様では、本発明は、15〜35の長さのヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド鎖を有する単離核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、核酸が哺乳類細胞の中に導入される際に、MYC標的mRNA発現を低減させるために、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、表15の標的MYC mRNA配列と十分に相補的である、核酸を提供する。
本発明の別の態様は、19〜35の長さのヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド鎖を有する単離核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、核酸が哺乳類細胞の中に導入される際に、MYC標的mRNA発現を低減するために、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って、表14の標的MYC mRNA配列と十分に相補的である、核酸を提供する。
本発明のさらなる態様は、RNAを備える第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有する単離二本鎖核酸(dsNA)であって、dsNAの第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入される際にMYC標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って表15の標的MYC mRNA配列と十分に相補的である、核酸を提供する。
本発明のさらなる態様は、第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有する単離二本鎖核酸(dsNA)であって、dsNAの第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入される際にMYC標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って表14の標的MYC mRNA配列と十分に相補的である、核酸を提供する。
本発明の別の態様は、第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有する単離二本鎖核酸(dsNA)であって、dsNAの第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入される際に、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、MYC標的mRNA発現を低減するために、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って表13の標的MYC mRNA配列と十分に相補的であり、かつ表13のMYC mRNA配列の5´末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断する、核酸を提供する。
本発明の追加的な態様は、(a)センス領域およびアンチセンス領域であって、センス領域およびアンチセンス領域が25〜35塩基対の二本鎖領域を共に形成し、アンチセンス領域が表12の配列に相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域;ならびに(b)0〜2つの3´オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が6以下の長さのヌクレオチドである、オーバーハング領域により形成される単離dsNA分子を提供する。
本発明のさらなる態様は、(a)センス領域およびアンチセンス領域であって、センス領域およびアンチセンス領域が25〜35の塩基対の二本鎖領域を共に形成し、アンチセンス領域が表12の配列に相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域;ならびに(b)0〜2つの3´オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が6以下の長さのヌクレオチドであるオーバーハング領域:により形成される単離dsNA分子であって、かつ二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入される際に、表11(位置1)のMYC mRNA配列の5´末端から開始して、哺乳類のAgo2が配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断する単離dsNA分子を提供する。
本発明の別の態様は、第1の核酸鎖および第2の核酸鎖、ならびに少なくとも25の塩基対の二本鎖領域を有する単離二本鎖核酸(dsNA)であって、dsNAの第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドであり、かつその3´末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを有し、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入される際に、MYC標的遺伝子発現を低減させるために、第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って表11の標的MYC mRNA配列に十分に相補的である、核酸を提供する。
別の態様では、本発明は、第1の核酸鎖および第2の核酸鎖、ならびに少なくとも25の塩基対の二本鎖領域を有する単離二本鎖核酸(dsNA)であって、dsNAの第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドであり、かつその3´末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを有し、第1のオリゴヌクレオチド鎖の3´末端および第2のオリゴヌクレオチド鎖の5´末端が平滑末端を形成し、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入される際に、MYC mRNA発現を低減するために、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1309〜1635および1963〜3270の標的MYC配列に十分に相補的である、核酸を提供する。
1つの実施形態では、単離dsNAは、少なくとも25の塩基対、19〜21の塩基対または21〜25の塩基対の二本鎖領域を有する。別の実施形態では、第2のオリゴヌクレオチド鎖はその3´末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを有する。さらなる実施形態では、第1の鎖は25〜35の長さのヌクレオチドである。特定の実施形態では、本発明はまた、単離dsNAであって、第1の鎖が26〜35の長さのヌクレオチド、27〜35の長さのヌクレオチド、28〜35の長さのヌクレオチド、29〜35の長さのヌクレオチド、30〜35の長さのヌクレオチド、31〜35の長さのヌクレオチド、33〜35の長さのヌクレオチド、34〜35の長さのヌクレオチド、17〜35の長さのヌクレオチド、19〜35の長さのヌクレオチド、21〜35の長さのヌクレオチド、23〜35の長さのヌクレオチド、17〜33の長さのヌクレオチド、17〜31の長さのヌクレオチド、17〜29の長さのヌクレオチド、17〜27の長さのヌクレオチド、21〜35の長さのヌクレオチドまたは19〜33の長さのヌクレオチドである、dsNAを提供する。
1つの実施形態では、第2の鎖は25〜35の長さのヌクレオチドである。特定の実施形態では、本発明はまた、単離dsNAであって、第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチド、27〜35の長さのヌクレオチド、28〜35の長さのヌクレオチド、29〜35の長さのヌクレオチド、30〜35の長さのヌクレオチド、31〜35の長さのヌクレオチド、33〜35の長さのヌクレオチド、34〜35の長さのヌクレオチド、21〜35の長さのヌクレオチド、23〜35の長さのヌクレオチド、25〜35の長さのヌクレオチド、27〜35の長さのヌクレオチド、19〜33の長さのヌクレオチド、19〜31の長さのヌクレオチド、19〜29の長さのヌクレオチド、19〜27の長さのヌクレオチドまたは19〜25の長さのヌクレオチドである、dsNAを提供する。
別の実施形態では、第2のオリゴヌクレオチド鎖は、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち最大27の長さのヌクレオチドに沿って、GenBank寄託番号第NM_002467.4号および第NM_010849.4号の標的MYC cDNA配列に相補的である。
1つの実施形態では、dsNAは改変ヌクレオチドである。任意に、改変ヌクレオチド残基は2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、2’−アミノまたは2’−O−(N−メチルカルバマート(methlycarbamate))である。
特定の実施形態では、第1のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端での第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、位置1、2および/または3が、改変ヌクレオチドに置換される。任意に、第1の鎖の3’末端の改変ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドまたは蛍光分子である。特定の実施形態では、第1のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端の位置1はデオキシリボヌクレオチドである。
1つの実施形態では、第1の鎖の3’末端および第2の鎖の5’末端は平滑末端を形成する。
別の実施形態において、第1の鎖は25の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖は27の長さのヌクレオチドである。さらなる実施形態では、表10のMYC mRNA配列の5´末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断し、それにより、二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入される際にMYC標的mRNA発現が低減される。特定の実施形態では、配列番号1309〜1635または1963〜2289のMYC mRNA配列の5´末端から開始して、哺乳類のAgo2がmRNA配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断し、それにより、二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入される際にMYC標的mRNA発現を低減する。
1つの実施形態では、第2の鎖は配列番号328〜654の配列を含む。
別の実施形態では、第1の鎖は配列番号1〜327、982〜1308および1636〜1962の配列を含む。
特定の実施形態では、本発明のdsNAは表2の一対の第1の鎖/第2の鎖の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第1の鎖および第2の鎖のそれぞれは、少なくとも26の長さのヌクレオチドを有する。本発明はまた、単離dsNAであって、第1の鎖および第2の鎖のそれぞれが、少なくとも27の長さのヌクレオチド、少なくとも28の長さのヌクレオチド、少なくとも29の長さのヌクレオチド、少なくとも30の長さのヌクレオチド、少なくとも31の長さのヌクレオチド、少なくとも32の長さのヌクレオチド、少なくとも33の長さのヌクレオチド、少なくとも34の長さのヌクレオチドまたは少なくとも35の長さのヌクレオチドを有する、dsNAを提供する。
特定の実施形態では、第2の鎖の3´末端の1〜5の一本鎖ヌクレオチドは改変ヌクレオチドを含む。任意に、第2の鎖の3´末端の1〜5の一本鎖の改変ヌクレオチドは、2´‐O‐メチルリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第2の鎖の3´末端の1〜5の一本鎖ヌクレオチドのすべてのヌクレオチドは改変ヌクレオチドである。1つの実施形態では、第2の鎖の3´末端の1〜5の一本鎖ヌクレオチドは、1〜3または、任意に1〜2の長さのヌクレオチドである。特定の実施形態では、第2の鎖の3´末端の1〜5の一本鎖ヌクレオチドは、2つの長さのヌクレオチドであり、2´‐O‐メチル改変リボヌクレオチドを含む。
1つの実施形態では、第2のオリゴヌクレオチド鎖は、AS‐M1〜AS‐M46およびAS‐M1*〜AS‐M46*の改変パターンを有する。別の実施形態では、第1のオリゴヌクレオチド鎖はSM1〜SM22の改変パターンを有する。
別の実施形態では、第1の鎖および第2の鎖のそれぞれが、少なくとも26かつ最大30の長さのヌクレオチドを有する。本発明はまた、単離dsNAであって、第1の鎖および第2の鎖のいずれかまたはそれぞれが、少なくとも27かつ最大30の長さのヌクレオチド、少なくとも28かつ最大30の長さのヌクレオチドおよび少なくとも29または最大30の長さのヌクレオチドを有する単離dsNAを提供する。
特定の実施形態では、dsNAはDicerにより細胞中で内因的に切断される。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現を低減するために十分な単離核酸の量は、細胞環境において1ナノモル濃度以下、200ピコモル濃度以下、100ピコモル濃度以下、50ピコモル濃度以下、20ピコモル濃度以下、10ピコモル濃度以下、5ピコモル濃度以下、2ピコモル濃度以下または1ピコモル濃度以下である。
1つの実施形態では、本発明の単離dsNAは、1ナノモル濃度以下の細胞環境中で有効濃度で、哺乳類細胞中のインビトロでアッセイする際に、標的MYC mRNA発現の低減において標的MYC mRNAの同一の少なくとも19ヌクレオチドを対象とした単離型21マーsiRNAよりも大きな効力を有する。
別の実施形態では、本発明の単離dsNAは、二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入される際に、少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも80〜90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の量(%により表される)でMYC標的mRNA発現を低減するため、標的MYC mRNA配列に十分に相補的である。関連する実施形態では、本発明は、dsNAが哺乳類細胞に導入される際に、MYC標的mRNA発現を低減するために、第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の長さのヌクレオチドに沿って標的MYC mRNA配列に十分に相補的である単離dsNAを提供する。
1つの実施形態では、本発明のdsNAの第1の鎖および第2の鎖は化学的なリンカーにより結合される。任意に、第1の鎖の3´末端および第2の鎖の5´末端は化学的なリンカーにより結合される。
特定の実施形態では、第2の鎖または第1の鎖のヌクレオチドは、Dicer開裂の方向を指示する改変ヌクレオチドで置換される。
いくつかの実施形態では、本発明の単離核酸は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、3’−デオキシアデノシン(コルジセピン)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’、3’−ジデオキシイノシン(ddI)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)、2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)のヌクレオチド一リン酸塩と2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)のヌクレオチド一リン酸塩、4−チオウラシル、5−ブロモウラシル、5−ヨードウラシル、5−(3−アミノアリル)−ウラシル、2’−O−アルキルリボヌクレオチド、2’−O−メチルリボヌクレオチド、2’−アミノリボヌクレオチド、2’−フルオロリボヌクレオチド、またはロックド核酸である、改変ヌクレオチドを持つ。
1つの実施形態では、本発明のdsNAはホスホン酸塩、ホスホロチオエートまたはホスホトリエステルであるリン酸塩骨格改変を有する。
任意に、本発明のdsNAは、モルフォリノ核酸またはペプチド核酸(PNA)である改変を有する。
本発明の別の態様は、in vitroにて哺乳類細胞を本発明の単離dsNAと、細胞内で標的MYC遺伝子発現を低減させるのに十分な量で接触させることを含む、哺乳類細胞中の標的MYC mRNA遺伝子発現を低減させる方法を提供する。
1つの実施形態では、MYC mRNAレベルは、細胞がdsNAと接触してから少なくとも8日後に、少なくとも90%の量(%により表される)が減少する。別の実施形態では、MYC mRNAレベルは、細胞がdsNAと接触してから少なくとも10日後に、少なくとも70%の量(%により表される)が減少する。
本発明のさらなる態様は、哺乳類において標的MYC mRNAの発現を低減する方法であって、哺乳類において標的MYC mRNAの発現を低減するために十分な量の本発明の単離核酸を投与することを含む、方法を提供する。
本発明の別の態様は、哺乳類において腫瘍負荷を低減する方法であって、哺乳類において腫瘍負荷を低減するために十分な量の本発明の単離核酸を哺乳類に投与することを含む、方法を提供する。
1つの実施形態では、腫瘍は肝細胞癌である。別の実施形態では、腫瘍負荷は適切な対照と比較して、50〜80%減少する。
特定の実施形態では、単離核酸は脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化される。
いくつかの実施形態では、本単離核酸は、1マイクログラム〜5ミリグラム/哺乳類キログラム/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/キログラム、0.001〜0.25ミリグラム/キログラム、0.01〜20マイクログラム/キログラム、0.01〜10マイクログラム/キログラム、0.10〜5マイクログラム/キログラム、または0.1〜2.5マイクログラム/キログラムの投与量で投与される。
特定の実施形態では、本発明の単離核酸は、1ナノモル濃度以下の細胞の環境下で有効な濃度でin vitroにて哺乳類細胞内でアッセイした時に、標的MYC mRNA発現の低減において、標的MYC mRNAの同一の少なくとも19ヌクレオチドを対象とした単離型21マーsiRNAよりも大きな効力を有する。
1つの実施形態では、MYC mRNAレベルは、単離dsNAが哺乳類に投与されてから少なくとも3日後に、少なくとも70%の量(%により表される)が哺乳類の組織で減少する。任意に、組織は肝臓組織である。
いくつかの実施形態では、投与ステップには、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアゾル、腸、膣、局所、経口または吸入送達が含まれる。
本発明のさらなる態様は、細胞の生育を阻害するのに十分な量の本発明の単離核酸と細胞を接触させることを含む、細胞の生育を選択的に阻害する方法を提供する。
1つの実施形態では、細胞は対象の腫瘍細胞である。任意に、細胞はin vitroで腫瘍細胞である。関連する実施形態では、細胞はヒト細胞である。
本発明の別の態様は、本発明の単離核酸を含む製剤であって、核酸が哺乳類細胞にインビトロで導入される際に、少なくとも10%、少なくとも50%または少なくとも80〜90%の量(%により表される)で標的MYC mRNAレベルを低減するために有効な量で核酸が存在する、製剤を提供する。
1つの実施形態では、有効量は、細胞の環境中で1ナノモル濃度以下、200ピコモル濃度以下、100ピコモル濃度以下、50ピコモル濃度以下、20ピコモル濃度以下、10ピコモル濃度以下、5ピコモル濃度以下、2ピコモル濃度以下または1ピコモル濃度以下である。
本発明のさらなる態様は、本発明の単離dsNAを含む製剤であって、dsNAが対象となる哺乳類細胞に導入される際に、少なくとも10%、少なくとも50%、および少なくとも80〜90%からなる群の量(%により表される)で標的MYC mRNAレベルを低減するために有効な量でdsNAが存在する、製剤を提供する。
1つの実施形態では、有効量は、1マイクログラム〜5ミリグラム/キログラム対象/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/キログラム、0.001〜0.25ミリグラム/キログラム、0.01〜20マイクログラム/キログラム、0.01〜10マイクログラム/キログラム、0.10〜5マイクログラム/キログラム、または0.1〜2.5マイクログラム/キログラムの投与量である。
本発明の別の態様は、本発明の単離核酸を含む哺乳類細胞を提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明の単離核酸および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明の追加的な態様は、本発明の単離核酸およびその使用のための説明書を含むキットを提供する。
別の態様では、本発明は、対象のMYC関連疾患または障害を治療または予防する方法であって、本発明の単離核酸および薬学的に許容可能な担体を、対象のMYC関連疾患または障害を治療または予防するために十分な量で対象に投与し、それにより、対象のMYC関連疾患または障害を治療または予防することを含む、方法を提供する。
1つの実施形態では、MYC関連疾患または障害は肝臓癌、腎臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、中咽頭癌または膵臓癌である。任意に、MYC関連疾患または障害は肝細胞癌である。
本発明の別の態様は、本発明の単離核酸を本質的に含む、MYC阻害活性を備える組成物を提供する。
本発明はまた、形質、疾患および病態の維持または発症を媒介する、MYC遺伝子発現経路または他の細胞過程に関与する遺伝子の発現および/または活性の調節に応答する形質、疾患および疾病に関連する化合物、組成物、および方法も目的とする。特定の態様では、本発明は、MYC遺伝子発現に対するRNA干渉(RNAi)を媒介可能なDicer基質siRNA(DsiRNA)のような、Dicer酵素によって処理できる小核酸分子に関する。本発明の抗MYC dsRNAは、例えば、癌および/または他の増殖性疾患、障害、もしくは状態などの、対象のMYCの調節に応答可能な形質、疾患および状態の治療のための組成物を提供することにおいて、有用である。抗MYC dsRNAの有効性、効力、毒性および他の効果は、増殖性疾患の1つ以上の動物モデルで試験可能である(増殖性疾患の例示的な動物モデルを以下に列記している)。
本発明は、in vivoまたはin vitroにてMYC遺伝子のレベルおよび/または発現を低減することが可能な、たとえば二本鎖RNA(「dsRNA」)のような核酸を含む組成物、ならびにそれらを調製する方法を目的とする。dsRNAの鎖の1つは、標的とするMYC転写産物の破壊および/または翻訳阻害を対象とし得る19〜35ヌクレオチドの範囲の長さを持つヌクレオチド配列の領域を含む。
定義
他に定義しない限り、本明細書で使用するところの全ての技術的かつ科学的語句は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を持つ。以下の参照は、本発明で使用される多くの語句の一般的な定義を当業者に提供する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed.,1988);The Glossay of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag (1991); 及び Hale & Maham,The Harper Collins Dictionay of Biology(1991)。本明細書で使用するように、以下の語句は、他で特定しない限り、以下のそれらに帰する意味を持つ。
他に定義しない限り、本明細書で使用するところの全ての技術的かつ科学的語句は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を持つ。以下の参照は、本発明で使用される多くの語句の一般的な定義を当業者に提供する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed.,1988);The Glossay of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag (1991); 及び Hale & Maham,The Harper Collins Dictionay of Biology(1991)。本明細書で使用するように、以下の語句は、他で特定しない限り、以下のそれらに帰する意味を持つ。
本発明は、MYC発現を調節(たとえば阻害)可能な1つ以上のDsiRNA分子を特徴とする。本発明のDsiRNAは任意に、MYC誤調節に関連した疾患または障害(例えば腫瘍形成および/または増殖など)の維持または発展に関連した他の遺伝子および/または遺伝子産物のモジュレータと組み合わせて使用可能である。本発明のDsiRNA剤は、GenBank寄託番号第NM_002467.4号(ヒトMYC)および第NM_010849.4号(マウスMYC、転写変異体1)によって表されるcDNA配列に対応するもののようなMYC RNAを調節し、それらは本明細書で一般的に「MYC」と呼ばれる。
本発明の種々の態様および実施形態の以下の記述が、本明細書中で一般的にMYCと呼ばれる例示的なMYC RNAに関して提供される。しかしながら、このような記載は単なる例示を意味するのみであり、本発明の種々の態様および実施形態はまた、変異体MYC RNAまたはさらなるMYCスプライスバリアントのような、代替的なMYC RNAも対象とする。また、特定の態様および実施形態はMYC経路に関与する他の遺伝子をも対象とし、その誤調節がMYCの誤調節に関連して作用する(たとえばMYCの調節に影響されるか、またはMYCの調節に影響を与える)ことにより治療のために標的化されうる表現型効果(例えば腫瘍形成および/または増殖など)を産出する遺伝子を含む。BAK1、Noxa、BCL2L11、Bcl−2関連死プロモーター、PCNA、DAD1、TNKSおよびBH3共役ドメインデスアゴニストは、MYCと相互作用する遺伝子の例である。このような、MYCと共に作用する経路の遺伝子を含む追加的な遺伝子は、MYC標的化dsRNAの利用に関して本明細書で記述されたdsRNAおよび方法を用いて標的とできる。したがって、他の遺伝子の阻害ならびにこのような阻害の効果を、本明細書で記述したように実施できる。
語句「MYC」は、MYCタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸配列を意味する(例えば、MYC Genbank寄託番号第NM_002467.4号および第NM_010849.4号の配列のような、MYC転写産物)。特定の実施形態では、語句「MYC」はまた、他のMYCアイソフォーム、変異体MYC遺伝子、MYC遺伝子のスプライスバリアント、およびMYC遺伝子多型などの、他のMYCコード配列を含むことも意味する。語句「MYC」は、MYC遺伝子/転写産物のポリペプチド遺伝子産物、例えば、MYC Genbank寄託番号第NP_002458.2号および第NP_034979.3号によってコードされたものなどの、MYCタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド指すために使用される。
本明細書で使用するところの、「MYC関連疾患または障害」は、変化したMYC発現、レベルおよび/または活性に関連すると当業者に知られている疾患または障害を意味する。とりわけ、「MYC−関連疾患または障害」は癌および/または増殖性疾患、状態、もしくは障害を含む。特定の例示的な「MYC関連疾患または障害」は、肝臓癌(たとえば肝細胞癌あるいはHCC)、肺癌(たとえばNSCLC)、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、脳癌(たとえば神経膠芽腫)、腎臓癌(たとえば乳頭状腎細胞癌)、胃癌、食道癌、髄芽腫(medulloblasoma)、甲状腺癌、横紋筋肉腫、骨肉腫、扁平上皮癌(たとえば口腔扁平上皮細胞癌)、黒色腫、乳癌、ならびに造血性障害(たとえば、白血病およびリンパ腫、および他の免疫細胞関連障害)を含む。他の過剰増殖性疾患または障害は、たとえば、膀胱、子宮頸部(子宮)、子宮内膜(子宮)、頭頸部、および中咽頭の癌を含み、これらの疾患または障害が標的とされてもよい。
本明細書で使用するところの「増殖性疾患」または「癌」は、肝細胞癌(HCC)、白血病、例えば急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ性白血病(ALL)、および慢性リンパ性白血病、カポジ肉腫などのAIDS関連癌;乳癌;骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、繊維肉腫、巨細胞腫、アダマンチノーマおよび脊索腫などの骨癌;髄膜腫、膠芽細胞腫、下級星状細胞腫、オリゴデンドロサイトーマ、下垂体腫瘍、シュワン腫、および転移脳腫瘍などの脳腫瘍;マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、アデノーマ、扁平上皮癌、喉頭癌、胆嚢および胆管癌、網膜芽腫などの網膜の癌、食道癌、胃癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、精巣癌、子宮内膜腺癌、メラノーマ、結腸直腸癌、膀胱癌、前立腺癌、(非小細胞肺癌を含む)肺癌、膵臓癌、肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、頭頸部癌、皮膚癌、鼻咽腔癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、子宮内膜肉腫、多剤耐性癌;ならびに腫瘍血管形成に関連した新血管形成、黄斑変性(例えば湿/乾AMD)、角膜血管新生、糖尿病性レチオパシー、血管新生緑内障、近視性変性などの増殖性疾患および状態、ならびに再狭窄および多発性嚢胞腎などの他の増殖性疾患および状態、ならびに単独または他の療法と併用して細胞または組織内での疾患関連遺伝子発現の調節に応答可能な他の癌または増殖性疾患、状態、形質、遺伝型または表現型を含む、本技術分野で公知のような制御されていない細胞増殖または複製によって特徴付けられる疾患、状態、形質、遺伝型または表現型を意味する。
特定の実施形態では、MYC標的配列のdsRNA−媒介阻害を評価する。このような実施形態では、MYC RNAレベルは、任意に、このような抗−MYC dsRNAが存在しないものに対する本発明の抗−MYC dsRNAの存在下でのMYCレベルの比較を介して、本技術分野で認識された方法(例えばRT−PCR、ノザンブロット、発現アレイなど)によって評価可能である。特定の実施形態では、抗−MYC dsRNAの存在下でのMYCレベルを、ビヒクルのみの存在下、関連のない標的RNAを対象とするdsRNAの存在下、または処置を全く行っていない状態で、観察したものと比較する。
また、MYCタンパク質のレベルを評価可能であること、ならびにMycタンパク質のレベルが、異なる条件下で、MYC RNAレベルおよび/またはdsRNAが、MYC発現を阻害する程度まで直接的もしくは間接的に関連することが認識されており、したがってMycタンパク質レベルを評価する本技術分野で認識されている方法(例えばウエスタンブロット、免疫沈降、他の抗体に基づく方法など)もまた、本発明のdsRNAの阻害効果を試験するために使用できる。
選択された対照と比較して、本発明の抗MYC dsRNAがある系(例えば、無細胞のin vitro系)、細胞、組織または生命体に投与された時にMYC RNA(またはMycタンパク質が評価される場合、MYCタンパク質レベル)における統計学的に有意な減少が見られた場合に、本発明の抗MYC dsRNAが「MYC阻害活性」を有すると見なされる。実験値の分布と実施された再現アッセイ数が、どのレベルのMYC RNAの減少(%または絶対値のいずれかとして)が(本技術分野で公知の統計学的有意差を決定する標準の方法によって評価されるように)統計学的に有意と判断されるかのパラメータを決定づける傾向にある。しかしながら、特定の実施形態では、「MYC阻害活性」は、系、細胞、組織もしくは生命体におけるMYCのレベルの減少の%または絶対レベルに基づいて定義される。例えば、特定の実施形態では、本発明のdsRNAの存在下で、好適な対照に対して見られるMYCレベルと比較して、MYC RNAの少なくとも5%の減少または少なくとも10%の減少が観察される場合に、本発明のdsRNAは、MYC阻害活性を有すると見なされる。(例えば、特定の実施形態では、対照と比較して、MYCレベルの5%または10%の減少が観察される場合に、組織および/または対象のin vivoでのMYCレベルが、本発明のdsRNA剤によって阻害されると見なすことができる。)特定の他の実施形態では、本発明のdsRNAは、MYC RNAレベルが、選択された対照と比較して少なくとも15%、選択された対照と比較して少なくとも20%、選択された対照と比較して少なくとも25%、選択された対照と比較して少なくとも30%、選択された対照と比較して少なくとも35%、選択された対照と比較して少なくとも40%、選択された対照と比較して少なくとも45%、選択された対照と比較して少なくとも50%、選択された対照と比較して少なくとも55%、選択された対照と比較して少なくとも60%、選択された対照と比較して少なくとも65%、選択された対照と比較して少なくとも70%、選択された対照と比較して少なくとも75%、選択された対照と比較して少なくとも80%、選択された対照と比較して少なくとも85%、選択された対照と比較して少なくとも90%、選択された対照と比較して少なくとも95%、選択された対照と比較して少なくとも96%、選択された対照と比較して少なくとも97%、選択された対照と比較して少なくとも98%、または選択された対照と比較して少なくとも99%減少することが観察される場合に、MYC阻害活性を持つと見なされる。いくつかの実施形態では、MYCの完全阻害が、dsRNAがMYC阻害活性をもつと見なされるために必要とされる。特定のモデル(例えば細胞培養液)において、dsRNAは、好適な対照と比較してMYCレベルの少なくとも50%減少が観察される場合に、MYC阻害活性を有すると見なされる。特定の他の実施形態では、dsRNAは、好適な対照と比較してMYCレベルの少なくとも80%減少が観察される場合に、MYC阻害活性を有すると見なされる。
特定の例として、以下の実施例2において、一連のDsiRNA標的化MYCをin vitroにてヒトA549またはマウスHepa 1−6細胞中のMYC mRNAレベルを減少させる能力に関して、このような細胞の環境下およびトランスフェクション試薬(Lipofectamine(商標) RNAiMAX、Invitrogen)の存在下で1nM濃度にて、試験した。以下の実施例2では、アッセイした条件下でMYC mRNAレベルの少なくとも70%の減少に効果があると観察されたDsiRNAに対してMYC阻害活性があるとみなした。またMYC阻害活性は、以下の実施例2に対して使用したものと比較して、より厳しいか、より厳しくないいずれかの条件下の、すなわち同一または同様のアッセイおよび条件が使用された場合のdsRNAにも起因し得ると考えられる。例えば、特定の実施形態では、試験した本発明のdsRNAは、好適な対照と比較したMYC mRNAレベルの、少なくとも10%の減少、少なくとも20%の減少、少なくとも30%の減少、少なくとも40%の減少、少なくとも50%の減少、少なくとも60%の減少、少なくとも75%の減少、少なくとも80%の減少、少なくとも85%の減少、少なくとも90%の減少、または少なくとも95%の減少がin vitroにて哺乳類細胞内で、細胞環境下で1nM以下のdsRNA濃度で観察された場合に、MYC阻害活性を有するとみなされる。
本発明の二本鎖RNAがMYC阻害活性を有するかどうかを決定するための他の評価項目の利用も考慮される。特に、1つの実施形態では、MYC mRNAレベルを評価することに加えて、またはこの評価に代えて、試験したdsRNAのMYCタンパク質レベルを減少させる能力を(例えば、in vitroまたはin vivoにて、哺乳類細胞を接触させてから48時間後に)評価し、好適な対照と比較して、MYCタンパク質レベルの少なくとも10%の減少、少なくとも20%の減少、少なくとも30%の減少、少なくとも40%の減少、少なくとも50%の減少、少なくとも60%の減少、少なくとも70%の減少、少なくとも75%の減少、少なくとも80%の減少、少なくとも85%の減少、少なくとも90%の減少、または少なくとも95%の減少がin vitroまたはin vivoにて、アッセイした二本鎖RNAに接触させた哺乳類細胞内で観察される場合に、試験したdsRNAがMYC阻害活性を有するとみなされる。さらに考慮される評価項目には、例えばMYCレベルの減少に関する表現型−例えば、より詳細に本明細書の他の場所で記述したような、腫瘍または癌細胞の増殖レベルを停止または減少させることを含む、in vitroにて接触させた哺乳類細胞株の増殖の減少および/またはin vivoでの腫瘍の増殖の減少、の評価が含まれる。
また、投与される濃度および投与後の持続時間にしたがって調整したMYC阻害活性を有するdsRNAを構成するものの評価により、MYC阻害活性を時間(持続時間)および、濃度範囲(効力)に関して評価することもできる。したがって、特定の実施形態では、MYC活性の少なくとも50%の減少が、dsRNAの細胞または臓器への投与後2時間、5時間、10時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日以上の持続期間で観察/持続される場合に、本発明のdsRNAをMYC阻害活性を有すると見なす。さらなる実施形態では、MYC阻害活性(例えば特定の実施形態では、少なくとも50%のMYC阻害)が、1nM以下、500pM以下、200pM以下、100pM以下、50pM以下、20pM以下、10pM以下、5pM以下、2pM以下、または1pM以下の濃度にて細胞の環境中で、例えば、本明細書で記述したようなMYC阻害活性に関するin vitroアッセイ内で観察された場合、本発明のdsRNAを強力なMYC阻害剤であると見なす。特定の実施形態では、本発明の強力なMYC阻害dsRNAは、有効な送達ビヒクル(たとえば有効な脂質ナノ粒子製剤)で対象に投与する場合10mg/kg以下の製剤化濃度でMYC阻害活性(特定の実施形態では、少なくとも20%MYCレベルを減少させる)を有し得るdsRNAであると定義される。好ましくは、本発明の強力なMYC阻害dsRNAは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合5mg/kg以下の製剤化濃度でMYC阻害活性(例えば特定の実施形態では、少なくとも50%のMYCレベルの減少)を有し得るものとして定義される。より好ましくは、本発明の強力なMYC阻害dsRNAは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合5mg/kg以下の製剤化濃度にてMYC阻害活性(例えば特定の実施形態では、少なくとも50%のMYCレベルの減少)を有し得るものとして定義される。任意に、本発明の強力なMYC阻害dsRNAは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合2mg/kg以下、またはさらには1mg/kg以下の製剤化濃度にてMYC阻害活性(例えば特定の実施形態では、少なくとも50%のMYCレベルの減少)を有し得るものとして定義される。
特定の実施形態では、本発明のdsRNAの効力を、特定のレベルの標的遺伝子ノックダウンを達成するために必要な、標的細胞の細胞質内に存在するdsRNAのコピー数を参照して決定する。例えば、特定の実施形態では、強力なdsRNAは、細胞あたり1000以下のRISC−ロードアンチセンス鎖コピー数にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的mRNAの50%以上のノックダウンを引き起こしうるdsRNAである。より好ましくは、強力なdsRNAは、細胞あたり500以下のRISC−ロードアンチセンス鎖コピー数にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的mRNAの50%以上のノックダウンを引き起こしうるdsRNAである。任意に、強力なdsRNAは、細胞あたり300以下のRISC−ロードアンチセンス鎖のコピー数にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的mRNAの50%以上のノックダウンを引き起こしうるdsRNAである。
さらなる実施形態では、本発明のDsiRNAの効力は、同一の標的遺伝子内の同一の標的配列を対象とした19〜23マー dsRNAを参照して定義可能である。例えば、対応する19〜23マー dsRNAに対して増強した効力を有する本発明のDsiRNAは、効力差の検出を許容するのに十分低い濃度(例えば、本明細書で記述したようなin vitroアッセイ中、細胞の環境中1nM以下の、細胞の環境中100pM以下、細胞の環境中10pM以下、細胞の環境中1nM以下のトランスフェクション濃度;とりわけ効力差は、用量応答曲線を作成してDsiRNA/dsRNAに関連したIC50値を同定する目的のための濃度範囲−例えば0.1pM〜10nM−にわたり、このようなアッセイを実施することを介して最もよく検出可能であると認識されている)にて本明細書で記述したin vitroアッセイでアッセイした場合に、対応する19〜23マー dsRNAと比較して、さらに5%以上、さらに10%以上、さらに20%以上、さらに30%以上、さらに40%以上、またはさらに50%以上標的遺伝子を減少させるDsiRNAでありうる。
MYC阻害レベルおよび/またはMYCレベルはまた間接的に評価してもよく、例えば、対象中のポリープまたは腫瘍の大きさ、数および/もしくは増殖率もしくは拡散率の低減の測定を、MYCレベルおよび/または本発明の二本鎖核酸のMYC阻害効果を評価するために使用してよい。
特定の実施形態では、語句「から本質的になる」は、本発明の抗−MYC dsRNAに関連して使用される。いくつかのこのような実施形態では、「から本質的になる」は、MYC阻害活性の少なくとも特定のレベル(例えば、少なくとも50%のMYC阻害活性)を有する本発明のdsRNAを含み、かつ、dsRNAのMYC阻害活性に有意に影響を与えない1つ以上のさらなる構成要素および/または改変をも含む、組成物を意味する。例えば、特定の実施形態では、本発明のdsRNAの改変および/または組成物中のdsRNA−関連構成要素が、本発明のdsRNA単独と比較して3%超、5%超、10%超、15%超、20%超、25%超、30%超、35%超、40%超、45%超、または50%超まで(任意にMYC阻害活性の効力または持続期間を含む)MYC阻害活性を変えない場合、組成物は、本発明のdsRNA「から本質的になる」。特定の実施形態では、MYC阻害活性のより劇的な減少(例えば、効果、持続期間および/または効力において80%減少、90%減少など)がさらなる構成要素または改変の存在下で発生したとしても、まだMYC阻害活性がさらなる構成要素および/または改変の存在下で有意に上昇しない(例えば観察されるMYC阻害活性のレベルが、本発明の単離されたdsRNAに対して観察されるレベルの10%以内である)場合、組成物は本発明のdsRNAから本質的になると見なされる。
本明細書で使用するところの語句「核酸」は、一本鎖または二本鎖形状のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または改変ヌクレオチド、およびそれらのポリマーを意味する。本語句は公知のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基あるいは結合を含む核酸を網羅し、それらは合成の、天然に存在する、また天然に存在しない核酸であり、参照核酸と同様の結合特性を持ち、かつ参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。このような類似体の例には、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホン酸塩、キラル−メチルホスホン酸塩、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(PNA)およびアンロックド核酸(UNA、たとえばJensen et al. Nucleic Acids Symposium Series 52: 133−4参照)、ならびにそれらの誘導体が含まれる。
本明細書で使用するところの「ヌクレオチド」は、本技術分野で認識されているように天然塩基(標準)、および本技術分野でよく知られている改変塩基を持つヌクレオチドを含んで使用される。このような塩基は一般的に、ヌクレオチド糖部分の1’位に位置している。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは非改変であるか、糖、リン酸および/または塩基部分にて改変されうる(またヌクレオチド類似体、改変ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドおよびその他としても互換的に指す;たとえば、Usman and McSwiggen、上記;Eckstein,et al.,国際特許公開公報第92/07065号;Usman et al,国際特許公開公報第WO 93/15187号;Uhlman & Peyman参照、これらすべては参照により本明細書に援用される)。Limbach,et al,Nucleic Acids Res.22:2183,1994によって要約されたような、本技術分野で公知の改変核酸塩基の種々の例が存在する。核酸分子内に導入可能な塩基改変の非限定例のいくつかとして、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン−4−オン、ピリジン−2−オン、フェニル、シュードウラシル、2,4,6−トリメトキシベンゼン、3−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、5−アルキルシチジン類(例えば5−メチルシチジン)、5−アルキルウリジン類(例えばリボチミジン)、5−ハロウリジン(例えば5−ブロモウリジン)または6−アザピリミジン類または6−アルキルピリミジン類(例えば6−メチルウリジン)、プロピン、およびその他(Burgin, et al.,Biochemistry 35:14090,1996;Uhlman & Peyman,上記)が挙げられる。本態様において、「改変塩基」は、1’位でのアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルまたはそれらの等価物以外のヌクレオチド塩基を意味する。
本明細書で使用するところの「改変ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、ペントース環、またはリン酸基への1つ以上の改変を持つヌクレオチドを意味する。例えば、改変ヌクレオチドはアデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、およびシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド類ならびにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、およびデオキシシチジン一リン酸を含むデオキシリボヌクレオチド類を除外する。改変には、メチルトランスフェラーゼのようなヌクレオチドを改変する酵素による改変に由来する天然に発生するものが含まれる。改変ヌクレオチドにはまた、合成または天然に発生しないヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドにおける合成のまたは天然に存在しない改変には、2’改変、例えば2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNAまたは他の二環もしくは「架橋型」ヌクレオシド類似体、および2’−O−(N−メチルカルバメート)または塩基類似体を含むものが含まれる。本開示のために記述されたような2’−改変ヌクレオチドに関しては、「アミノ」によっては2’−NH2または2’−O−NH2が意味され、これらは改変されてよく、または改変されなくてよい。このような改変基は、例えば、Eckstein et al.,米国特許公開公報第5,672,695号およびMatulic−Adamic et al.,米国特許第6,248,878号にて記述されている。本発明の「改変ヌクレオチド」はまた、上述のヌクレオチド類似体を含むことができる。
本明細書の核酸分子に関して、改変は、二本鎖リボ核酸(dsRNA)の1つまたは両方の鎖上のパターンで、これらの薬剤上に存在してもよい。本明細書で使用するところの「交互位置」は、すべての他のヌクレオチドが改変ヌクレオチドであるか、または定義された長さのdsRNAの鎖にわたる各改変ヌクレオチド間で改変されていないヌクレオチド(例えば、改変されていないリボヌクレオチド)が存在する(例えば5’−MNMNMN−3’、3’−MNMNMN−5’、式中Mは改変ヌクレオチドであり、Nは改変されていないヌクレオチドである)パターンを意味する。改変パターンは、例えば本明細書で記述したような、位置ナンバリングの慣例にしたがって、5’または3’末端のいずれかの第1のヌクレオチド位置から開始する(特定の実施形態では、位置1は、本発明のDsiRNA剤のの推定されるDicer開裂事象の後の鎖の終末残基に関して指定される。したがって位置1は毎回本発明の前処理剤の3’末端または5’末端残基を構成するものではない)。交互位置での改変ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長を移動してよいが、特定の実施形態では、それぞれ、少なくとも2、3、4、5、6または7つの改変ヌクレオチドを含む、少なくとも4、6、8、10、12、14のヌクレオチドが含まれる。本明細書で使用するところの、「位置の交互対」は、2つの連続した改変ヌクレオチドが、dsRNAの鎖の定義された長さにわたり、2つの連続した改変されていないヌクレオチドによって分離されるパターンを意味する(例えば、5’−MMNNMMNNMMNN−3’、3’−MMNNMMNNMMNN−5’、式中Mは改変ヌクレオチドであり、Nは改変されていないヌクレオチドである)。改変パターンは、本明細書で記述したもののような、位置ナンバリングの慣例にしたがって、5’または3’末端いずれかでの、第1のヌクレオチド位置から開始する。交互位置における改変ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長を移動してよいが、好ましくは、それぞれ、少なくとも4、6、8、10、12または14の改変ヌクレオチドを含む、少なくとも8、12、16、20、24、28のヌクレオチドが含まれる。上記改変パターンは例示であり、本発明の範囲における限定は意図されないことが強調される。
本明細書で使用するところの「塩基類似体」は、核酸二本鎖に組み込むことが可能な改変ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部位の1’位(または核酸二本鎖内に組み込むことが可能なヌクレオチド糖部位置換中の等価の位置)に位置するヘテロ環状部位を意味する。本発明のdsRNAにおいて、塩基類似体は一般的に、塩基グアニン(G)、シトシン(C)、アデニン(A)、チミン(T)およびウラシル(U)を除く、プリンまたはピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、dsRNA中他の塩基または塩基類似体と二本鎖となりうる。塩基類似体には、本発明の化合物および方法にて有用なもの、たとえば、参考文献によって本明細書に組み込まれている、Bennerに付与された米国特許第5,432,272号および第6,001,983号、およびManohARanに付与された米国特許公開公報第20080213891号に開示されたものが含まれる。塩基の非限定例には、ハイポキサンチン(I)、キサンチン(X)、3β−D−リボフラノシル−(2,6−ジアミノピリミジン)(K)、3−β−D−リボフラノシル−(1−メチル−ピラゾロ[4,3−d]ピリミジン−5,7(4H,6H)−ジオン)(P)、イソ−シトシン(iso−C)、イソ−グアニン(iso−G)、1−β−D−リボフラノシル−(5−ニトロインドール)、1−β−D−リボフラノシル−(3−ニトロピロール)、5−ブロモウラシル、2−アミノプリン、4−チオ−dT、7−(2−チエニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン(Ds)およびピロール−2−カルボアルデヒド(Pa)、2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン(S)、2−オキソピリジン(Y)、ジフルオロトリル、4−フルオロ−6−メチルベンズイミダゾール、4−メチルベンゾイミダゾール、3−メチルイソカルボスチリリル、5−メチルイソカルボスチリリルおよび3−メチル−7−プロピニルイソカルボスチリリル、7−アザインドリル、6−メチル−7−アザインドリル、イミジゾピリジニル、9−メチル−イミジゾピリジニル、ピローロピリジニル、イソカルボスチリリル、7−プロピニルイソカルボシチリリル、プロピニル−7−アザインドリル、2,4,5−トリメチルフェニル、4−メチルインドリル、4,6−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造誘導体(Schweitzer et al.,J.Org.Chem.,59:7238−7242(1994);Berger et al.,Nucleic Acids Research,28(15):2911−2914(2000);Moran et al.,J.Am.Chem.Soc.,119:2056−2057(1997);Morales et al.,J.Am.Chem.Soc.,121:2323−2324(1999);Guckian et al.,J.Am.Chem.Soc.,118:8182−8183(1996);Morales et al.,J.Am.Chem.Soc.,122(6):1001−1007(2000);McMinn et al.,J.Am.Chem.Soc.,121:11585−11586(1999);Guckian et al.,J.Org.Chem.,63:9652−9656(1998);Moran et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,94:10506−10511(1997);Das et al.,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.,1:197−206(2002);Shibata et al.,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.,1:1605−1611(2001);Wu et al.,J.Am.Chem.Soc.,122(32):7621−7632(2000);O’Neill et al.,J.Org.Chem.,67:5869−5875(2002);Chaudhuri et al.,J.Am.Chem.Soc.,117:10434−10442(1995);および米国特許第6,218,108号)が含まれる。塩基類似体はまたユニバーサル塩基であってよい。
本明細書で使用するところの「ユニバーサル塩基」は、核酸二本鎖中に存在する場合に、二本鎖ヘリックス構造(例えばリン酸塩骨格の構造)を変化させずに、1超の型の塩基と反対に位置可能な、改変ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部位の1’位、またはヌクレオチド糖部位置換基中の等価位置に位置するヘテロ環状部位を意味する。さらに、ユニバーサル塩基は、標的核酸に対する二本鎖に属する、一本鎖の核酸の能力を破壊しない。標的核酸である二本鎖にユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸の能力を、当業者に理解される方法(例えば、UV吸収、円偏光二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性など)によってアッセイ可能である。さらに、二本鎖形成が観察された条件は、二本鎖安定性または形成を決定するために変化してよく、たとえば融解温度(Tm)は、核酸二本鎖の安定性と相関するので、温度を変化させてもよい。標的核酸と正確に相補的である参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的核酸で形成された核酸二本鎖よりも低いTmを有する標的核酸と共に二本鎖を形成する。しかしながら、ユニバーサル塩基が単一ミスマッチを産生するために塩基で置換された参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチした塩基を持つ核酸で形成された二本鎖よりも、高いTmを有する標的核酸を備える二本鎖を形成する。
いくつかのユニバーサル塩基は、塩基対形成条件下、ユニバーサル塩基と、すべての塩基グアニン(G)、シトシン(C)、アデニン(A)、チミン(T)およびウラシル(U)との間で水素結合を形成することによって塩基対化可能である。ユニバーサル塩基は、単一相補塩基とのみ塩基対を形成する塩基ではない。二本鎖内で、ユニバーサル塩基は、水素結合を形成しなくてよく、また二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対の各G、C、A、TおよびUと1つの水素結合または1つ超の水素結合を形成してよい。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対の塩基と相互作用しない。二本鎖において、ユニバーサル塩基間の塩基対化は、リン酸骨格の二本ヘリックス構造を変えずに発生する。ユニバーサル塩基はまた、スタッキング相互作用によって、同一の核酸鎖上の隣接ヌクレオチド中の塩基と相互作用してもよい。このようなスタッキング相互作用は、とりわけ、ユニバーサル塩基が、二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対に位置する塩基と任意の水素結合を形成しない条件下で、二本鎖を安定化させる。ユニバーサル−結合ヌクレオチドの非限定例には、イノシン、1−β−D−リボフラノシル−5−ニトロインドール、および/または1−β−D−リボフラノシル−3−ニトロピロールが含まれる(Quay et al.に付与された米国特許出願番号第20070254362号、Van Aerschot et al.,An acyclic 5−nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside.Nucleic Acids Res.1995 Nov 11;23(21):4363−70;Loakes et al.,3−Nitropyrrole and 5−nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR.Nucleic Acids Res.1995 Jul 11;23(13):2361−6;Loakes and Brown,5−Nitroindole as an universal base analogue.Nucleic Acids Res.1994 Oct 11;22(20):4039−43)。
本明細書で使用するところの「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補領域が、相補領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が、二本鎖形成またはワトソン−クリック塩基対化から除外される方法でハイブリッド形成する、核酸の一本鎖によって形成される構造を意味する。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例には、ヘパリン、ステムループまたは伸長ループのような構造中に存在する、対になっていないヌクレオチドが含まれる。
本明細書で使用するところの、dsRNAの文脈中の「伸長ループ」は、一本鎖ループ、および加えて、1、2、3、4、5、6または最大20の塩基対またはループに隣接する二本鎖を意味する。伸長ループ中、5’側上のループに隣接するヌクレオチドは、3’側上でループに隣接するヌクレオチドと二本鎖を形成する。伸長ループはヘアピンまたはステムループを形成してよい。
本明細書で使用するところの、dsRNAの文脈中の「テトラループ」は、隣接するワトソン−クリックハイブリッド形成ヌクレオチドの安定性に寄与する、安定二次構造を形成する4つのヌクレオチドからなるループ(一本鎖領域)を意味する。理論に限定されるものではないが、テトラループは、スタッキング相互作用によって、隣接するワトソン−クリック塩基対を安定化させてよい。加えて、テトラループ中の4つのヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン−クリック塩基対化、スタッキング相互作用、水素結合、および接触相互作用が含まれるが、これらに限定されるものではない(Cheong et al.,Nature 1990 Aug 16;346(6285):680−2;Heus and PARdi,Science 1991 Jul 12;253(5016):191−4)。テトラループは、4つの無作為塩基からなる単一モデルループ配列から推測されるものよりも高い隣接二本鎖融解温度(Tm)における増加をもたらす。例えば、テトラループは、長さにして少なくとも2塩基対の二本鎖を含むヘアピンに、10mM NaHPO4中、少なくとも55℃の融解温度をもたらしうる。テトラループには、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変ヌクレオチドおよびそれらの混合物が含まれてよい。RNAテトラループの例には、テトラループのUNCGファミリ−(例えばUUCG)、テトラループのGNRAファミリー(例えばGAAA)、およびCUUGテトラループが含まれる(Woese et al.,Proc Natl Acad Sci USA.1990 Nov;87(21):8467−71;Antao et al.,Nucleic Acids Res.1991 Nov 11;19(21):5901−5)。DNAテトラループの例には、テトラフープのd(GNNA)ファミリー(例えば、d(GTTA)、テトラループのd(GNRA))ファミリー、テトラループのd(GNAB)ファミリー、テトラループのd(CNNG)ファミリー、テトラフープのd(TNCG)ファミリー(例えばd(TTCG))が含まれる。(Nakano et al.Biochemistry,41(48),14281−14292,2002.;SHINJI et al.Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL.78th;NO.2;PAGE.731(2000).)。
本明細書で使用するところの語句「siRNA」は、各鎖が、RNA、RNA類似体(類)またはRNAおよびDNAを含む二本鎖核酸を意味する。siRNAは、19〜23ヌクレオチドを含み、または21ヌクレオチドを含む。siRNAは、概して、siRNA中の二本鎖領域が17〜21ヌクレオチド、または19ヌクレオチドを含むように、各鎖の3’末端上に2bpオーバーハングを有する。概して、siRNAのアンチセンス鎖は、MYC遺伝子/RNAの標的配列と十分に相補的である。
本発明の抗−MYC DiRNAは、少なくとも25ヌクレオチドの鎖長を有する。したがって、特定の実施形態では、抗−MYC DsiRNAは、1つのオリゴヌクレオチド配列、長さにして少なくとも25ヌクレオチドであり、長くても35、または最大50以上のヌクレオチドである、第1の配列を含む。このRNA配列は、長さにして26〜35、26〜34、26〜33、26〜32、26〜31、26〜30、26〜29ヌクレオチドでありうる。本配列は、長さにして27または28ヌクレオチドでありえ、長さにして27ヌクレオチドであり得る。DsiRNA剤の第2の配列は、真核細胞の細胞質内のような生物学的条件下で第1の配列にアニールする配列でありうる。一般的に、第2のオリゴヌクレオチド配列は、第1のオリゴヌクレオチドと少なくとも19の相補塩基対を持ち、より典型的には、第2のオリゴヌクレオチド配列は、第1のオリゴヌクレオチド配列と、21以上の相補塩基対を持ち、または25以上の相補塩基対を持つ。1つの実施形態では、第2の配列は、第1の配列と同一の長さであり、DsiRNA剤は平滑末端である。別の実施形態では、DsiRNA剤の末端は1つ以上のオーバーハングを有する。
特定の実施形態では、DsiRNA剤の第1および第2のオリゴヌクレオチド配列は、化学的に合成可能で、典型的に化学的に合成される別のオリゴヌクレオチド鎖上に存在する。いくつかの実施形態では、両方の鎖は、長さにして26〜35ヌクレオチドである。他の実施形態では、両方の鎖は、長さにして、25〜30または26〜30である。1つの実施形態では、両方の鎖は、長さにして27ヌクレオチドであり、完全に相補的であり、平滑末端を有する。本発明の特定の実施形態では、抗−MYC DsiRNAの第1および第2の配列は、別のRNAオリゴヌクレオチド(鎖)上に存在する。1つの実施形態では、1つまたは両方のオリゴヌクレオチド鎖は、Dicerに対する基質として働くことが可能である。他の実施形態では、少なくとも1つの改変が、遺伝子発現を阻害することにおいて、二本鎖RNA構造の有効性を最大化する方向で、Dicerが二本鎖RNA構造に結合することを促進して存在する。本発明の特定の実施形態では、抗−MYC DsiRNA剤は、第1の鎖(センス鎖)の3’末端で平滑末端を有し、第2の鎖(アンチセンス鎖)の3’末端で3’オーバーハングを有する抗−MYC DsiRNAと、異なる長さの2つのオリゴヌクレオチド鎖からなる。DsiRNAはまた、1つ以上のデオキシリボ核酸(DNA)塩基置換基を含んでもよい。
2つの別のオリゴヌクレオチドを含む好適なDsiRNA組成物は、化学結合基によって、それらのアニーリング領域外で化学的に連結可能である。多くの好適な化学連結基が、本技術分野で公知であり、使用可能である。好適な基は、DsiRNAにおけるDicer活性を妨げず、標的遺伝子から転写されたRNAの指向性破壊と干渉しない。あるいは、2つの別のオリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造が、DsiRNA組成物を作製している2つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際して産生されるように、第3のオリゴヌクレオチドによって連結可能である。ヘアピン構造は、DsiRNA上のDicer活性を妨げず、標的RNAの指向性破壊と干渉しない。
本明細書で使用するように、標的RNAまたはcDNA配列(例えばMYC mRNA)に「十分に相補的な」配列を有するdsRNA、例えばDsiRNAまたはsiRNAは、dsRNAが、RNAi機構(例えばRISC複合体)または工程によって、標的RNA(cDNA配列が列挙される場合、列挙されたcDNA配列に相当するRNA配列)の破壊を引き起こすのに十分な配列を持つことを意味する。例えば、RANi機構または工程によって、標的RNAの破壊を引き起こすための、標的RNAまたはcDNA配列に「十分に相補的な」dsRNAは、dsRNA活性の適切なアッセイ(例えば、以下実施例2にて記述したようなin vitroアッセイ)中の、標的RNAのレベルにおける検出可能な減少を引き起こすdsRNAとして同定可能であり、またはさらなる実施例において、RNAi機構または工程によって、標的RNAの破壊を引き起こすための標的RNAまたはcDNAに十分に相補的なdsRNAを、dsRNA活性の適切なアッセイ中の標的RNAのレベルにおける、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の減少を産出するdsRNAとして同定可能である。さらなる例において、RNAi機構または工程によって標的RNAの破壊を引き起こすための、標的RNAまたはcDNA配列に十分に相補的なdsRNAは、細胞または生命体における標的RNAまたはタンパク質レベルに関する阻害活性の特定のレベルの持続期間の評価に基づいて同定可能である。例えば、RNAi機構または工程によって標的RNAの破壊を引き起こすための、標的RNA配列またはcDNA配列に十分に相補的なdsRNAは、細胞または生命体への前記dsRNAの投与から少なくとも48時間後に、少なくとも20%まで、標的mRNAレベルを減少可能なsdRNAとして同定可能である。好ましくは、RNAi機構または工程によって標的RNAの破壊を引き起こすための、標的RNAまたはcDNA配列に十分に相補的なdsRNAは、細胞または生命体への前記dsRNAの投与から少なくとも72時間後に少なくとも40%まで、細胞または生命体への前記dsRNAの投与から少なくとも4、5または7日後に少なくとも40%まで、細胞または生命体への前記dsRNAの投与から少なくとも48時間後に少なくとも50%まで、細胞または生命体への前記dsRNAの投与から少なくとも72時間後に少なくとも50%まで、細胞または生命体への前記dsRNAの投与から少なくとも4、5または7日後に少なくとも50%まで、細胞または生命体への前記dsRNAの投与から少なくとも48時間後に少なくとも80%まで、細胞または生命体への前記dsRNAの投与から少なくとも72時間後に少なくとも80%まで、細胞または生命体への前記dsRNAの投与から少なくとも4、5または7日後に少なくとも80%まで、標的mRNAレベルを減少可能なdsRNAとして同定可能である。
dsRNA分子は、アンチセンス鎖のすべての残基が、標的分子内の残基に相補的であるようにデザイン可能である。あるいは、置換を、分子の安定性を増大させ、かつ/または処理活性を増強するために、分子内で実施可能である。置換は、鎖内にて実施可能であり、または鎖の末端での残基にて実施可能である。特定の実施形態では、置換および/または改変は、DsiRNA剤内の特定の残基にて実施される。このような置換および/または改変には、例えばDsiRNA剤のセンス鎖の3’末端位置からナンバリングした場合、位置1、2および3の残基の1つ以上でのデオキシ−改変、ならびにDsiRNA剤のアンチセンス鎖の3’末端残基での、2’−O−アルキル(例えば2’−O−メチル)改変の導入が含まれ、このような改変はまた、アンチセンス鎖の3’末端のオーバーハング位置、および活性siRNA剤を形成するために処理されるDsiRNA剤の領域内に含まれるDsiRNAのアンチセンス鎖の交互残基にて実施される。以上の改変は、例示的なものとして提供され、任意の様式にて限定されるよう意図するものではない。本発明の抗−MYC DsiRNA剤において実施可能な改変および置換のさらなる記述を含む、好ましいDsiRNA剤の構造のさらなる考慮を以下で見ることが可能である。
第1の配列が、本明細書の第2の配列に関して「実質的に相補的である」配列を指す場合、2つの配列は完全に相補的であってよく、またはそれらの最終的な適用に最も関連する条件下でハイブリッド形成する能力を維持したまま、それら2つの配列は、ハイブリッド形成に際して、1つ以上、しかしながら一般的に4、3または2以下のミスマッチ塩基を形成してよい。しかしながら、2つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリッド形成に際して、1つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するようにデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関して、ミスマッチとして見なされるものではない。例えば、1つの21の長さのオリゴヌクレオチドおよび別の23の長さのオリゴヌクレオチドを含むdsRNAであって、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な21のオリゴヌクレオチドを含むdsRNAが、本発明の目的となる「完全に相補的である」ことをさらに意味してもよい。
本明細書で使用する、語句「二本鎖RNA」または「dsRNA」は、上記で定義したような、2つの逆平行および実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を持つ、リボ核酸分子の複合体を意味する。二本鎖構造を形成する2つの鎖は、1つの大きなRNA分子の異なる部分であってよく、または別々のRNA分子であってよい。別々のRNA分子の場合、このようなdsRNAは、多くの場合siRNA(「短い干渉RNA」)またはDsiRNA(「Dicer基質siRNA」)を指す。2つの鎖が1つの大きな分子の一部分であり、したがって二本鎖構造を形成する1つの鎖の3’末端と、別の他の鎖の5’末端間のヌクレオチドの連鎖によって連結される場合、連結しているRNA鎖は、「ヘアピンループ」、「短ヘアピンRNA」または「shRNA」を指す。2つの鎖が、二本鎖構造を形成する1つの鎖の3’末端と、別の他の鎖の5’末端との間のヌクレオチドの連鎖以外の方法によって共有的に連結する場合、連結している構造は、「リンカー」を指す。RNA鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有していてもよい。塩基対の最大数は、dsRNAの最も短い鎖中のヌクレオチドの数マイナス二本鎖中に存在する任意のオーバーハングである。二本鎖構造に加えて、dsRNAは、1つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。加えて、本明細書で使用するところの「dsRNA」は、多重ヌクレオチドにおける実質的改変を含み、かつ本明細書で開示されたか、本技術分野で公知のすべての型の改変を含む、リボヌクレオチド、ヌクレオシド間結合、末端基、キャップおよび共役部位への化学的改変が含まれうる。siRNA−またはDsiRNA−型分子内で使用されるような、任意のこのような改変は、本明細書および特許請求の範囲のための「dsRNA」によって包含される。
語句「二本鎖領域」は、ワトソン−クリック塩基対化、もしくは相補的であるか、もしくは実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド鎖間の二本鎖を許容する他の様式のいずれかによって、互いに塩基対を形成する2つの相補的であるか、または本質的に相補的なオリゴヌクレオチド中の領域を意味する。例えば、21ヌクレオチドユニットを有するオリゴヌクレオチド鎖は、別の21ヌクレオチドユニットのオリゴヌクレオチドと塩基対化可能であり、さらには、「二本鎖領域」が19塩基対からなるように、各鎖上の19塩基のみが、相補的であるか、または実質的に相補的である。残りの塩基対は、例えば、5’および3’オーバーハングとして存在してもよい。さらに、二本鎖領域内で、100%相補性は必要ではなく、実質的な相補性が二本鎖領域内で許容可能である。実質的な相補性は、生物学的条件下でアニーリング可能であるような、鎖間の相補性を意味する。2つの鎖が、生物学的条件下でアニーリング可能であるかどうかを実験的に決定するための技術は、当業者によく知られている。あるいは、2つの鎖を、互いにアニールするかどうかを決定するために、合成でき、かつ生物学的条件下で共に添加できる。
多数の塩基にわたり塩基対を形成する一本鎖核酸が、「ハイブリッドする」と呼ばれる。ハイブリッド形成は、概して、生理学的または生物学的に関連のある条件(例えば、細胞内:pH7.2、140mMカリウムイオン、細胞外pH7.4、145mMナトリウムイオン)下で決定される。ハイブリッド形成条件は一般的に、一価カチオンと生物学的に許容可能な緩衝液とを含み、二価カチオン、複合体アニオン、例えばグルタミン酸カリウム由来のグルタミン酸、スクロースのような非荷電種、および試料中の水の活性を減少させるための不活性ポリマー、例えばPEGを含んでよく、または含まなくてよい。このような条件には、塩基対が形成される条件が含まれる。
ハイブリッド形成は、二本鎖を形成している一本鎖核酸を乖離させるために必要な温度、すなわち(融解温度;Tm)によって測定される。ハイブリッド形成条件はまた、塩基対が形成されうる条件下でありうる。種々の厳密性条件を使用して、ハイブリッド形成を決定可能である(たとえばWahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399;Kimmel.A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507を参照のこと)。厳密性温度条件は通常、少なくとも約30℃の、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。長さにして50塩基対未満であると予想されるハイブリッドに対するハイブリッド形成温度は、ハイブリッドの融解温度(Tm)よりも5〜10℃低くあるべきであり、ここでTmは、以下の等式にしたがって決定される。長さにして18塩基対以下のハイブリッドでは、Tm(℃)=2(A+T塩基の#)+4(G+C塩基の#)。長さにして18〜49塩基対のハイブリッドにでは、Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−(600/N)、式中Nはハイブリッド中の塩基数であり、[Na+]はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である(1×SSC=0.165Mでの[Na+])。例えば、ハイブリッド形成決定緩衝液を表1に示す。
ハイブリッド形成条件における有用な変化が、当業者に簡単に理解されるであろう。ハイブリッド形成技術は、当業者によく知られており、例えば、Benton and Davis(Science 196:180,1977);Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975);Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York, 2001);Berger and Kimmel(Antisense to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York);およびSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Yorkにて記述されている。
本明細書で使用するところの、「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変ヌクレオチド(例えば2’改変、合成塩基類似体などを持つヌクレオチド)またはそれらの混合物を含んでよい。このような改変オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取込の増強、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増大のような特性のために、天然の形態に対して好ましい。
本明細書で使用するところの語句「リボヌクレオチド」は、天然および合成の、非改変および改変リボヌクレオチドを包含する。改変には、オリゴヌクレオチド中の糖部分に対する、塩基部分に対する、および/またはリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの語句「リボヌクレオチド」はとりわけ、2’リボース環位置にて、単一プロトン基を有するヌクレオチドである、デオキシリボヌクレオチドを除外する。
本明細書で使用するところの語句「デオキシリボヌクレオチド」は、天然および合成の、非改変および改変デオキシリボヌクレオチドを包含する。改変には、オリゴヌクレオチド中の、糖部分に対する、塩基部分に対する、および/またはデオキシリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの語句「デオキシリボヌクレオチド」にはまた、dsRNA剤のDicer開裂を許容しない改変リボヌクレオチド、例えば、このような残基の結合においてDicer開裂が発生することを許容しない、2’−O−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート−改変リボヌクレオチド残基なども含まれる。
本明細書で使用するところの語句「PS−NA」は、ホスホロチオエート−改変ヌクレオチド残基を意味する。語句「PS−NA」はしたがって、ホスホロチオエート−改変リボヌクレオチド(「PS−RNA」」)およびホスホロチオエート−改変デオキシリボヌクレオチド(「PS−DNA」)の両方を包含する。
本明細書で使用するところの「Dicer」は、dsRNAもしくはdsRNA−含有分子、例えば二本鎖RNA(dsRNA)またはプレ−ミクロRNA(miRNA)を、通常3’末端に2塩基オーバーハングを持つ、二本鎖核酸断片19〜25ヌクレオチド長に開裂する、RNase IIIファミリーのエンドリボヌクレアーゼを意味する。本発明の特定のdsRNA(たとえば「DsiRNA」)に関して、本発明の薬剤のdsRNA領域によって形成される二本鎖は、Dicerによって認識され、二本鎖の少なくとも1つの鎖上Dicer基質である。Dicerは、RNA干渉経路中の第一段階を触媒し、結果として、標的RNAの分解をもたらす。ヒトDicerのタンパク質配列が、参考文献によって本明細書で組み込まれた寄託番号第NP_085124号の下、NCBIデータベースにて提供される。
Dicer「開裂」は、以下のように決定できる(例えば、Collingwood et al.,Oligonucleotides 18:187-200(2008)を参照のこと)。Dicer開裂アッセイにおいて、RNA二本鎖(100pmol)を、1ユニットの組換え体ヒトDicer(Stratagene、La Jolla,CA)あり、またはなしで、20μLの20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、2.5mM MgCl2中、37℃にて18〜24時間インキュベートする。試料を、Performa SR96−ウェルプレート(Edge Biosystemsメリーランド州ゲイザースバーグ)を用いて脱塩する。Dicerでの二本鎖RNAの処理前および処理後の電子噴霧イオン化液体クロマトグラフィー質量分析(ESI−LCMS)を、ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータ処理ソフトウェアおよびParadigm MS4 HPLC(Michrom BioResources,カリフォルニア州オーバーン)からなるOligo HTCSシステム(Navatia,Princeton,NJ:Hail et al.,2004)を用いて実施する。本アッセイにおいて、Dicer開裂が、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または100%のDicer基質dsRNA(すなわち25〜30bp、dsRNA、好ましくは26〜30bp dsRNA)が、より短いdsRNA(例えば、19〜23bp dsRNA、好ましくは21〜23bp dsRNA)に開裂される場で発生する。
本明細書で使用するところの「Dicer開裂部位」は、DicerがdsRNA(例えば、本発明のDsiRNA剤のdsRNA領域)を開裂する部位を意味する。Dicerは、概してdsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を開裂する、2つのRNaseIIIドメインを含む。RNaseIIIドメインとPAZドメインとの間の平均距離が、産出する短い二本鎖核酸断片の長さを決定し、この距離は変動可能である(Macrae et al.(2006)Science 311:195−8)。図1で示すように、Dicerは、アンチセンス鎖の3’末端から除去された21番目と22番目とのヌクレオチド間の部位にて、およびセンス鎖の5’末端より除去された21番目と22番目とのヌクレオチド間の対応する部位で、2ヌクレオチド3’オーバーハングを持つアンチセンス鎖を有する、本発明の特定の二本鎖リボ核酸を開裂すると考えられる。図1にて描写したものと異なる、dsRNA分子に対する、考えられる、かつ/または一般的なDicer開裂部位は、Macraeらにて記述されたものを含む、本技術分野で認識される方法を介して同様に同定されてもよい。図1で描写したDicer開裂事象が、21ヌクレオチドsiRNAを産出する一方で、dsRNA(例えばDsiRNA)のDicer開裂が結果として、長さにして19〜23ヌクレオチドのDicer−処理したsiRNA長の産出となりうることが留意されい。実際、特定の実施形態では、二本鎖DNA領域は、21マーではなく、概して好ましくない19マーまたは20マーsiRNAの一般的なDicer切除を指向するために、dsRNA内に含まれてよい。
本明細書で使用するところの、「オーバーハング」は、dsRNAの5’末端または3’末端にて1つ以上の遊離末端を有する二本鎖の文脈において、対になっていないヌクレオチドを意味する。特定の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖またはセンス鎖上の3’または5’オーバーハングである。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、1〜6ヌクレオチド、任意に1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、3〜6、3〜5、3〜4、4〜6、4〜5、5〜6ヌクレオチド、または1、2、3、4、5または6ヌクレオチドの長さを持つ3’オーバーハングである。「平滑末端化」または「平滑末端」は、dsRNAの末端に対でないヌクレオチドがない、すなわちヌクレオチドのオーバーハングがないことを意味する。明確にすると、siRNAの3´末端または5´末端に結合した化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学的部分は、siRNAがオーバーハングを有しているかまたは平滑末端化されているかどうかを判定する際に考慮されるものではない。特定の実施形態では、本発明は、細胞または哺乳類中のMYC標的遺伝子の発現を阻害するdsRNA分子であって、dsRNAがMYC標的遺伝子の発現において形成されるmRNAの少なくとも一部に相補的である相補領域を含むアンチセンス鎖を含み、かつ上記相補領域が35未満の長さのヌクレオチド、任意に19〜24の長さのヌクレオチドまたは25〜30の長さのヌクレオチドであり、かつdsRNAが、MYC標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、MYC標的遺伝子の発現を少なくとも10%、25%、または40%阻害する、dsRNA分子を提供する。
本発明のdsRNAは、二本鎖構造を形成するためにハイブリッド形成するのに十分に相補的である2つのRNA鎖を含む。dsRNAの1つの鎖(アンチセンス鎖)は、MYC標的遺伝子の発現の間に形成されたmRNAの配列から誘導された、標的配列に実質的に相補的な、一般的には完全に相補的な相補性の領域を含み、他の鎖(センス鎖)は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、それによって2つの鎖は、好適な条件下で混合した時に、ハイブリッド形成し、二本鎖構造を形成する。一般的に、二本鎖構造は、長さにして15〜35、任意に25〜30、26〜30、18〜25、19〜24または19〜21塩基対である。同様に、標的配列に相補的な領域は、長さにして、15〜35、任意に18〜30、25〜30、19〜24または19〜21ヌクレオチドである。本発明のdsRNAはさらに、1つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。(一般的に長さにして少なくとも25塩基対の)DsiRNAおよびsiRNA(特定の実施形態では、siRNAの二本鎖構造は、20〜23、任意に特に21塩基対)を含む、長さにして15〜35塩基対の二本鎖構造を含むdsRNAが、RNA干渉を誘導することにおいて効果的であり得ることが同定されてきた(Elbashir et al.,EMBO 20:6877−6888)。また、20塩基対より短い(例えば15、16、17、18または19塩基対二本鎖)を有するdsRNAも同様に効果的であり得ることが同定されてきた。特定の実施形態では、本発明のdsRNAは、19以上の長さのヌクレオチドのうち少なくとも1つの鎖を含みうる。特定の実施形態では、以下の表5の配列の1つに相補的な配列マイナス1つまたは両方の末端上の数個のヌクレオチドを含む、より短いdsRNAが、上記および表2〜4および6〜7にて記述したdsRNAと比較して同様に効果的であり得ることが合理的に予測できる。したがって、表5の配列の1つに十分に相補的な、少なくとも15、16、17、18、19、20またはそれ以上の隣接ヌクレオチドの部分配列を含み、完全配列を含むdsRNAから最高5、10、15、20、25または30%阻害まで、本発明で記述したアッセイにて、MYC標的遺伝子の発現を阻害するそれらの能力において異なるdsRNAが、本発明によって考慮される。1つの実施形態では、dsRNAの少なくとも1つの末端が、1〜5、任意に1〜4、特定の実施形態では、1または2ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを有する特定のdsRNA構造は、dsRNA分子の両方の間端にて、塩基対形成平滑末端を有する同等のものと比較して、優れた阻害特性を有する。
本明細書で使用するところの語句「RNA処理」は、siRNA、miRNAまたはRNase H経路の構成要素(例えばDrosha、Dicer、MYCgonaute2または他のRISCエンドリボヌクレアーゼおよびRNaseH)によって実施される処理活性を意味し、以下でより詳細に記述されている(以下「RNA処理」項目を参照のこと)。本語句は、RNAの5’キャッピングの転写後工程と、非−RISCまたは非−RNase H−媒介工程を介したRNAの分解とから明確に区別される。このようなRNAの「分解」は、種々の形態、例えば脱アデニル化(3’ポリ(A)テールの除去)、および/または1つ以上の種々のエンド−もしくはエキソ−ヌクレアーゼ(例えばRNaseIII、RNaseP、RNaseT1、RNaseA(1、2、3、4/5)、オリゴヌクレオチダーゼなど)によるRNAの本体の一部または全てのヌクレアーゼ消化、を取り得る。
「相同配列」は、遺伝子、遺伝子転写産物および/または非コードポリヌクレオチドのような、1つ以上のポリヌクレオチド配列によって共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は、サイトカインおよびそれと対応する受容体のような、遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォームまたは完全に相違する遺伝子のような、関連するが異なるタンパク質をコードしている2つ以上の遺伝子によって共有されるヌクレオチド配列でありうる。相同配列は、非コードDNAまたはRNA、制御配列、イントロン、および転写制御または調節の部位のような、2つ以上の非コードポリヌクレオチドによって共有されるヌクレオチド配列でありうる。相同配列はまた、1つ超のポリヌクレオチド配列によって共有される保存配列領域を含みうる。相同性は、部分相同配列(例えば99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%など)もまた本発明で考慮されるので、完全相同性(例えば100%)である必要はない。実際、本発明のdsRNA剤のデザインおよび利用は、本明細書で記述したdsRNA剤と完全な相補性を有するMYCの標的RNAに対してのみでなく、上記dsRNA剤に対して例えば99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%などのみ相補的である配列を有するMYC RNAに対しての、このようなdsRNA剤を利用する可能性も考慮する。同様に、本明細書で記述された本発明のdsRNA剤は、上記DsRNA剤と標的MYC RNA例えばMYCの特定の対立バリアント(例えば増強された治療的対象の対立遺伝子)との間の相補性の程度増強するために、当業者によって簡単に変更されうる。実際、標的MYC配列に関する挿入、欠損および単一点変異を持つdsRNA剤配列がまた、阻害に対して効果的であり得る。あるいは、ヌクレオチド類似体置換または挿入を持つdsRNA剤配列が阻害に対して効果的であり得る。
配列同一性は、本技術分野で公知の配列比較およびアライメントアルゴリズムによって決定してよい。2つの核酸配列の(または2つのアミノ酸配列の)パーセント同一性を決定するために、配列を比較の目的でアライメントさせる(例えばギャップを、最適配列のために、第1の配列または第2の配列中に導入可能である)。次に、対応するヌクレオチド(またはアミノ酸)位置でのヌクレオチド(またはアミノ酸残基)を比較する。第1の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置と同一の残基によって占有される場合、分子はその位置で同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有された同一の位置の数の関数であり(すなわち%相同性=同一位置の#/位置×100の合計#)、任意に、導入されたギャップの数および/または導入されたギャップの長さに対するスコアにペナルティーを課す。
配列の比較と、2つの配列間の配列パーセント同一性の決定とを、数学的アルゴリズムを用いて実施可能である。1つの実施形態では、アライメントは、十分な同一性をもってアライメントさせたアライメントの特定の部分にわたり、しかし低度の同一性を持つ部分にはわたらず(すなわち局所アライメント)産出された。配列の比較のために使用した局所アライメントアルゴリズムの好ましい、非限定例は、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−77にてのように改変された、Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−68のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altshul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403−10のBLASTプログラム(バージョン2.0)内に組み込まれる。
別の実施形態では、アライメントが最適化されるギャップアライメントは、適切なギャップを導入することによって形成され、パーセント同一性が、アライメントした配列(すなわちギャップアライメント)の長さにわたり決定される。比較の目的のためギャップアライメントを得るために、ギャップBLASTを、Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389−3402にて記述したように使用可能である。別の実施形態では、アライメントが最適化されるグローバルアライメントが、適切なギャップを導入することによって形成され、パーセント同一性が、アライメントした配列の全長(すなわちグローバルアライメント)にわたり決定される。配列のグローバル比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定例は、Myers and Miller,CABIOS(1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部である、ALIGNプログラム(バージョン2.0)内に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する時に、PAM120ウェイト残基表、12のギャップ長ペナルティー、および4のギャップペナルティーを使用可能である。
dsRNAアンチセンス鎖およびMYC RNA配列の一部の間の80%超の配列同一性、例えば、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性が好ましい。あるいは、dsRNAは、MYC RNAの一部とハイブリッド形成可能なヌクレオチド配列(またはオリゴヌクレオチド配列)として機能的に定義してよい(例えば、400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、12〜16時間の50℃または70℃ハイブリッド形成と続く洗浄)。さらなる好ましいハイブリッド形成条件には、1×SSC中70℃、または1×SSC中50℃、50%ホルムアミドでのハイブリッド形成と、続く0.3×SSC中70℃での洗浄、または4×SSC中70℃もしくは4×SSC中50℃、50%ホルムアミドでのハイブリッド形成と、続く1×SSC中67℃での洗浄が含まれる。長さにして50塩基対未満であると予測されるハイブリッドでのハイブリッド形成温度は、当該ハイブリッドの融解温度(Tm)より5〜10℃低いべきであり、Tmは以下の等式にしたがって決定される。長さにして18塩基対より少ないハイブリッドでは、Tm(℃)=2(A+T塩基の#)+4(G+C塩基の#)。長さにして18〜49塩基対のハイブリッドでは、Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−(600/N)、式中Nはハイブリッド中の塩基数であり、[Na+]はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である(1×SSC=0.165Mでの[Na+])。ポリヌクレオチドハイブリッド形成に対する厳密性条件のさらなる例が、Sambrook,J.,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,9および11章、およびCurrent Protocols in Molecular Biology,1995,F.M.Ausubel et al.,eds.,John Wiley & Sons,Inc.,項目2.10および6.3〜6.4にて提供される。等しいヌクレオチド配列の長さは、少なくとも10、12、15、17、20、22、25、27または30塩基であってよい。
「保存配列領域」は、世代間で、または1つの生物系、対象もしくは生命体から別の生物系、対象もしくは生命体までで有意に変化しないポリヌクレオチドの1つ以上の領域のヌクレオチド配列を意味する。ポリヌクレオチドは、コードおよび非コードのDNAおよびRNA両方を含みうる。
「センス領域」は、dsRNA分子のアンチセンス領域に相補性を持つdsRNA分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、dsRNA分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を持つ核酸配列を含みうる。
「アンチセンス領域」は、標的核酸配列に相補性を持つdsRNA分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、dsRNA分子のアンチセンス領域は、dsRNA分子のセンス領域に相補性を持つ核酸配列を含む。
本明細書で使用するところの「アンチセンス鎖」は、標的RNAの配列に相補的な配列を持つ一本鎖核酸分子を意味する。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する改変ヌクレオチドを含む場合、その全長にわたり相同的である必要はないが、少なくとも標的RNAにハイブリッドしなければならない。
本明細書で使用するところの「センス鎖」は、アンチセンス鎖の配列に相補的な配列を持つ一本鎖核酸分子を意味する。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する改変ヌクレオチドを含む場合、センス鎖は、アンチセンス鎖の全長にわたり相補的である必要はないが、アンチセンス鎖と少なくとも二本鎖を形成しなければならない。
本明細書で使用するところの「ガイド鎖」は、dsRNAまたはdsRNA−含有分子の一本鎖核酸分子を意味し、結果としてRNA干渉をもたらす標的RNAの配列と十分に相補的である配列を持つ。DicerによるdsRNAまたはdsRNA−含有分子の開裂後、ガイド鎖の断片が、RISCに結合したままとなり、RISC複合体の一成分として標的RNAに結合し、RISCによって標的RNAの開裂を促進する。本明細書で使用するように、ガイド鎖は、連続一本鎖核酸を意味する必要はなく、好ましくはDicerによる開裂の部位で、不連続性を含んでよい。ガイド鎖はアンチセンス鎖である。
本明細書で使用するところの「パッセンジャー鎖」は、dsRNAまたはdsRNA−含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を意味し、ガイド鎖の配列と相補的である配列を持つ。本明細書で使用するように、パッセンジャー鎖は、連続一本鎖核酸を意味する必要はなく、好ましくはDicerにより開裂する部位で、不連続性を含んでよい。パッセンジャー鎖はセンス鎖である。
「標的核酸」は、その発現、レベルまたは活性が調整されるべきである核酸配列を意味する。標的核酸は、DNAまたはRNAでありうる。MYCを標的とする薬剤に関して、特定の実施形態では、標的核酸はMYC RNA、たとえば特定の実施形態ではMYC mRNAである。MYC RNA標的部位はまた、対応するcDNA配列によって互換的に参照されうる。MYCのレベルはまた、MYCの上流エフェクターの標的化を介して標的化されてよく、または調整されたもしくは誤調節されたMYCの効果がまた、MYCシグナル伝達経路中のMYCの下流の分子の標的化によって調整されてもよい。
「相同性」は、核酸が、従来のワトソン−クリック、または他の従来にはない型のいずれかによって、他の核酸配列と水素結合を形成可能であることを意味する。本発明の核酸分子に関して、その相補的な配列を備える核酸分子に対する結合自由エネルギーは、核酸の関連ある機能、例えばRNAi活性を進行できるために十分なエネルギーである。核酸分子に対する結合自由エネルギーの決定が、本技術分野でよく知られている(例えば、Turner et al.,1987,CSH Symp.Quant.Biol.LII pp.123−133;Frier et al.,1986,Proc.Nat.Acad.Sci. USA 83:9373−9377;Turner et al.,1987,J.Am. Chem.Soc.109:3783−3785を参照のこと)。パーセント相補性は、第2の核酸配列と水素結合(例えばワトソン−クリック塩基対化)を形成可能な核酸分子中の近接残基の割合を示唆する(例えば10ヌクレオチドを持つ第2の核酸配列に対して塩基対形成する第1のオリゴヌクレオチド中の合計10ヌクレオチドのうち5、6、7、8、9または10ヌクレオチドが、それぞれ50%、60%、70%、80%、90%および100%相同性を表す)。「完全に相補的」は、核酸配列の近接残基の全てが、第2の核酸配列中の同一の数の近接残基と水素結合することを意味する。1つの実施形態では、本発明のdsRNA分子は、1つ以上の標的核酸分子またはそれらの一部に対して相補的である、19〜30(例えば19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30以上)のヌクレオチドを含む。
1つの実施形態では、MYC遺伝子発現を下方制御または低減させる本発明のdsRNA分子を、対象または生命体内のMYC−関連疾患または障害(例えば癌)を治療、予防または減少させるために使用する。
本発明の1つの実施形態では、本発明のDsiRNA分子の各配列は、独立して、長さにして25〜35ヌクレオチド、特定の実施形態では、長さにして25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35ヌクレオチドである。別の実施形態では、本発明のDsiRNA二本鎖は独立して、25〜30塩基対(例えば25、26、27、28、29または30)を含む。別の実施形態では、本発明のDsiRNA分子の1つ以上の鎖は、標的(MYC)核酸分子に相補的である、19〜35ヌクレオチド(例えば、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35)を独立して含む。特定の実施形態では、本発明のDsiRNA分子は、長さにして25〜34ヌクレオチド(例えば長さにして25、26、27、28、29、30、31、32、33または34ヌクレオチド、任意に全てのこのようなヌクレオチドは、反対の鎖の同種ヌクレオチドと塩基対を形成する)の長さの二本鎖ヌクレオチドを有する。(本発明の例示的なDsiRNA分子を図1および以下に示す。
本明細書で使用するところの「細胞」は、その通常の生物学的意味において使用され、全多細胞生物を意味せず、例えば特にヒトを意味するものではない。細胞は、生命体、例えば鳥類、植物ならびにヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌおよびネコのような哺乳類中に存在しうる。細胞は、原核生物(例えば細菌細胞)または真核生物(例えば哺乳類細胞または植物細胞)でありうる。細胞は、体細胞または生殖細胞由来、全能細胞または多能性細胞、分裂細胞または非分裂細胞でありうる。細胞はまた、配偶子または胚、幹細胞または完全に分化した細胞から分化してよく、または含んでよい。特定の態様内で、語句「細胞」は、本開示の1つ以上の単離dsRNA分子を含むヒト細胞のような哺乳類細胞を特に意味する。特定の態様において、細胞は、結果として標的核酸のRNA干渉をもたらす、dsRNAまたはdsRNA−含有分子を有し、RNAiに対して必要とされるタンパク質およびタンパク質複合体、例えばDicerおよびRISCを含む。
特定の実施形態では、本発明のdsRNAは、Dicer基質siRNA(「DsiRNA」)である。DsiRNAは、dicer基質ではない阻害核酸(「非DsiRNA」)と比較して、特定の利点を有しうる。このような利点には、限定するものではないが、非DsiRNAに対して、DsiRNAの効果の持続期間の増強、ならびに各阻害核酸が好適に処方され、同一の濃度で、哺乳類細胞内の阻害活性に関して評価される時、非DsiRNA(例えば19〜23マーsiRNA)と比較したDsiRNAの阻害活性の増強が含まれる(後者のシナリオの場合、DsiRNAは、非−DsiRNAよりも強力なものとして同定されうる)。非−DsiRNAに対するDsiRNAの効力の増大の検出はしばしば、結果としてDisRNAが、標的RNA(例えばmRNA)におけるおよそ30〜70%のノックダウン活性を誘発することとなる、製剤化濃度(例えばdsRNAのトランスフェクション濃度)でほとんど容易に達成される。活性DsiRNAに関して、このようなノックダウン活性のレベルは、ほとんどの場合、1nM以下の好適に処方されたin vitro哺乳類細胞DsiRNAトランスフェクション濃度で達成され、特定の例においては、200pM以下、100pM以下、50pM以下、20pM以下、10pM以下、5pM以下、または1pM以下のDsiRNAトランスフェクション濃度で観察される。実際、標的RNAの30〜70%ノックダウンが観察される正確な濃度のDsiRNA間の変動に起因して、効果的な濃度の範囲にわたる、DsiRNAおよび非DsiRNAの阻害活性の評価を介したIC50曲線の構築が、非DsiRNA阻害剤に対するDsiRNAの効力の増強を検出する好ましい方法である。
特定の実施形態では、(Dicer開裂前、最初に形成されたような状態での)DsiRNAは、その中に含まれる19、20、21、22または23の塩基対配列よりも、哺乳類細胞中のMYC標的遺伝子発現を低減させる際により効力がある。特定のこのような実施形態では、dicer開裂前のDsiRNAは、その中に含まれる19〜21マーよりもより強力である。任意に、dicer開裂前のDsiRNAは、(それによって、dTdTオーバーハングを持つ21ヌクレオチド鎖長を有するsiRNAを形成する)対称dTdTオーバーハングで合成される配列中に含まれた19塩基対二本鎖よりも強力である。特定の実施形態では、DsiRNAは、本発明のDsiRNAで列挙される21ヌクレオチド標的配列の少なくとも19ヌクレオチドを標的とする、19〜23マーsiRNA(例えばdTdTオーバーハングを持つ19塩基対二本鎖)よりも強力である(いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、このようなDsiRNAに対する標的部位の同一性は、DsiRNAに対するAgo2開裂部位の同定を介して同定される。いったんDsiRNAのAgo2開裂部位がDsiRNAに対して決定されたならば、任意の他の阻害dsRNAに対するAgo2開裂部位の同定が実施され、これらのAgo2開裂部位をアライメント可能であり、それによって多数のdsRNAに対して考えられる標的ヌクレオチド配列のアライメントが決定される)。特定の関連した実施形態では、DsiRNAは、本発明のDsiRNAに関して記載される21ヌクレオチド標的配列のうち少なくとも20ヌクレオチドを標的とする、19〜23マーsiRNAよりも強力である。任意に、DsiRNAは、本発明のDsiRNAに関して記載される同一の21ヌクレオチド標的配列を標的とする、19〜23マーsiRNAよりも強力である。特定の実施形態では、DsiRNAは、本発明のDsiRNAに関して記載される同一の21ヌクレオチド標的配列を標的とする、任意の21マーsiRNAよりも強力である。任意に、DsiRNAは、本発明のDsiRNAに関して記載される同一の21ヌクレオチド標的配列を標的とする、任意の21または22マーsiRNAよりも強力である。特定の実施形態では、DsiRNAは、本発明のDsiRNAに関して記載される同一の21ヌクレオチド標的配列を標的とする任意の21、22または23マーsiRNAより強力である。上述のように、このような効力の評価は、1nM以下の濃度で、好適に製剤化(例えば適切なトランスフェクト試薬で製剤化された)dsRNAにおいて最も効果的に実施される。任意に、IC50評価を、効果的な阻害濃度の範囲にわたる活性を評価するために実施し、それによって、アッセイされたdsRNAの相対効力のの確固とした比較が可能となる。
本発明のdsRNA分子は、直接加えられ、または脂質(例えばカチオン性脂質)と複合体化、リポソーム内にパッケージでき、または標的細胞もしくは組織に伝達可能である。核酸または核酸複合体を、バイポリマー内への組み込みを用い、またはこの組み込みを用いることなく、直接的な皮膚適用、経皮適用、または注射を介して、ex vivoまたはin vivoで、関連する組織に局所投与できる。特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、図1で示す配列と、以下の例示的構造を含む。このような核酸分子の例は、これらの図面および例示的構造にて定義した配列から本質的になる。さらに、このような薬剤を、DsiRNA剤の改変パターン化の以下の記述にしたがって改変する場合、図1にて記述された構造物の化学的に改変された形態、および以下の例示的構造を、図1および以下の例示的構造のDsiRNA剤に対して記述した全ての使用において利用可能である。
別の態様において、本発明は、本発明の1つ以上のdsRNAを含む哺乳類細胞を提供する。1つ以上のdsRNA分子は独立して、同一または異なる部位を標的とすることが可能である。
「RNA」は、少なくとも1つの、好ましくは少なくとも4、8および12のリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。少なくとも4、8または12のRNA残基は近接してよい。「リボヌクレオチド」は、β−D−リボフラノース部位の2’位でヒドロキシル基を持つヌクレオチドを意味する。本語句には、二本鎖RNA、一本鎖RNA、部分的に精製したRNAのような単離RNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換え体産出RNA、ならびに1つ以上のヌクレオチドの添加、欠損、置換および/または変質によって天然に存在するRNAとは異なる変質RNAが含まれる。このような変質には、例えばRNAのうち1つ以上のヌクレオチドでの、dsRNAの末端または内部などへの非ヌクレオチド物質の添加が含まれる。本発明のRNA分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのような、非標準ヌクレオチドも含みうる。これらの変質RNAは、類似体または天然に存在するRNAの類似体を指すことができる。
「対象」は、外植された細胞のドナーもしくはレシピエントまたはこれらの細胞自体である、生命体を意味する。「対象」はまた、本発明のdsRNA剤を投与可能な生命体を意味する。対象は、ヒトまたはヒト細胞を含む、哺乳類または哺乳類細胞でありうる。
語句「薬学的に許容可能な担体」は、治療薬剤の投与のための担体を意味する。例示的な担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの混合物が含まれる。経口で投与される薬物に関する薬学的に許容可能な担体には、限定するものではないが、不活性希釈液、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味料、着色料および保存料などのような、薬理学的に許容可能な賦形剤が含まれる。好適な不活性希釈液には、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウムならびにラクトースが含まれ、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが含まれてよく、潤滑剤は存在するのであれば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクが一般的である。望ましい場合、胃腸管での吸収を遅延させるために、錠剤を一ステアリン酸グリセリルまたは二ステアリン酸グリセリルのような物質で被覆してよい。開示されたdsRNAの薬学的に許容可能な担体は、リポソーム、カプシド、カプソイド、ポリマー性ナノカプセルまたはポリマー性ミクロカプセルのようなミセル構造であってよい。
ポリマー性ナノカプセルまたはマイクロカプセルは、カプセル封入または結合したdsRNAの細胞内への伝達および放出を促進する。これらには、特にポリブチルシアノアクリレートを含む、ポリマー性および単量体物質が含まれる。物質および製造法の要約が公開されている(Kreuter,1991を参照のこと)。ポリマー化/ナノ粒子産出段階で単量体および/またはオリゴマー前駆体から形成されるポリマー性物質は、ナノ粒子を製造する領域の当業者が通常の技術にしたがって好適に選択してよいポリマー性物質の分子量および分子量分布であるため、先行技術からそれ自体が公知である。
本発明の種々の方法には、本明細書で「適切な対照(appropriate control)」を互換的に意味する、「適切な対照(suitable control)」に対して、値、レベル、特徴、特性、性質などを比較することを含む段階が含まれる。「適切な対照」または「適切な対照」は、比較の目的のために有用な、当業者によく知られた対照または標準である。1つの実施形態では、「適切な対照」または「適切な対照」は、本明細書で記述したような、RNAi法を実施する前に決定される、値、レベル、特徴、特性、性質などである。例えば、転写率、mRNAレベル、翻訳率、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞特徴または性質、遺伝子型、表現型などを、本発明のRNAサイレンシング剤(例えばDsiRNA)を細胞または生命体内に導入する前に決定可能である。別の実施形態では、「適切な対照」または「適切な対照」は、細胞または生物内で決定される値、レベル、特徴、特性、性質などであり、例えば正常な特質を示している対照または正常細胞または生命体である。さらなる別の実施形態では、「適切な対照」または「適切な対照」は、あらかじめ定義された値、レベル、特徴、特性、性質などである。
語句「in vitro」は、その業界で認識された意味を持ち、例えば、精製された試薬または抽出物、例えば細胞抽出物を含む。語句「in vivo」はまた、その業界で認識された意味を持ち、例えば生細胞を含み、例えば不死化細胞、初代細胞、細胞株および/または生命体内の細胞を含む。
本明細書で使用するところの「治療」または「治療すること」は、治療薬剤(例えばdsRNA剤またはそれをコードしているベクターもしくはトランスジーン)を、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を治癒、治す、緩和、軽減、変化、治療、改善、改良または影響する目的で、障害を有する患者への適用もしくは投与、または治療薬剤の患者由来の単離した組織または細胞株への適用もしくは投与として定義される。語句「治療」または「治療する」はまた、予防的に薬剤を投与する文脈でも使用される。語句「有効用量(effective dose)」または「有効用量(effective dosage)」は、望ましい効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するための十分な量として定義される。語句「治療上有効量」は、疾患をすでに患っている患者における疾患またはその合併症を治癒する、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量として定義される。語句「患者」には、予防的治療または治療的治療のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳類対象が含まれる。
抗−MYC DsiRNA剤の構造
特定の実施形態では、本発明の抗−MYC DsiRNA剤は以下の構造を持つことができる。
特定の実施形態では、本発明の抗−MYC DsiRNA剤は以下の構造を持つことができる。
1つのこのような実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNAであり、かつ「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインである。関連実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNAであり、かつ「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNAである。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
本発明のDsiRNAは、広範囲の改変パターン(例えば、2’−O−メチルRNAパターン、例えば伸長DsiRNA剤内)を持ちうる。本発明のDsiRNAの第2の鎖の特定の改変パターンを以下に示す。
1つの実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーである。関連実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
別のこのような実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーである。関連実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
別のこのような実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーである。関連実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーである。関連実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。さらなる関連実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAおよび「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「AS−M7」または「M7」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーである。関連実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「AS−M6」または「M6」改変パターンを指す。
他の実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態では、DsiRNAは
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は2’−O−メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「AS−M5」または「M5」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中、「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書では「AS−M4」または「M4」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、および「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「AS−M8」または「M8」改変パターンを指す。
他の実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「AS−M3」または「M3」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、および「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「AS−M2」または「M2」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「AS−M1」または「M1」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンは、本明細書中で「AS−M9」または「M9」改変パターンを指す。
他の実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、および「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。この改変パターンは、本明細書中で「AS−M10」または「M10」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、および「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「AS−M11」または「M11」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M12」または「M12」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M13」または「M13」改変パターンを指す。
他の実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M21」または「M21」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M14」または「M14」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、および「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M15」または「M15」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、および「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M16」または「M16」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、および「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M17」または「M17」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M18」または「M18」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M19」または「M19」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M20」または「M20」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M22」または「M22」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M24」または「M24」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M25」または「M25」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M26」または「M26」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M27」または「M27」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この改変パターンは、本明細書中で「AS−M28」または「M28」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M29」または「M29」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M30」または「M30」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M31」または「M31」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M32」または「M32」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M34」または「M34」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M35」または「M35」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M37」または「M37」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M38」または「M38」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M40」または「M40」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M41」または「M41」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M36」または「M36」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M42」または「M42」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M43」または「M43」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M44」または「M44」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M45」または「M45」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M46」または「M46」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M47」または「M47」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M48」または「M48」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M52」または「M52」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M54」または「M54」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M55」または「M55」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M56」または「M56」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M57」または「M57」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M58」または「M58」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M59」または「M59」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M60」または「M60」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M61」または「M61」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M62」または「M62」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M63」または「M63」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M64」または「M64」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M65」または「M65」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M66」または「M66」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M67」または「M67」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M68」または「M68」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M69」または「M69」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M70」または「M70」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M71」または「M71」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M72」または「M72」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。1つの関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M73」または「M73」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M7*」または「M7*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M6*」または「M6*」改変パターンを指す。
他の実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M5*」または「M5*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M4*」または「M4*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M8*」または「M8*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M2*」または「M2*」改変パターンを指す。
他の実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M10*」または「M10*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M11*」または「M11*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M13*」または「M13*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M14*」または「M14*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M15*」または「M15*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M16*」または「M16*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M17*」または「M17*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M18*」または「M18*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M19*」または「M19*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAであり、「Y」は、任意に2´‐O‐メチルRNAモノマーである1‐4 RNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、下線が引かれた残基は2´‐O‐メチルRNAモノマーであり、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M20*」または「M20*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M22*」または「M22*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M24*」または「M24*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M25*」または「M25*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M26*」または「M26*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M27*」または「M27*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M28*」または「M28*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAを含む。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M29*」または「M29*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M34*」または「M34*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M35*」または「M35*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M37*」または「M37*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M38*」または「M38*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M40*」または「M40*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M41*」または「M41*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M36*」または「M36*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M42*」または「M42*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M43*」または「M43*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M44*」または「M44*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M46*」または「M46*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M47*」または「M47*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M48*」または「M48*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M52*」または「M52*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M54*」または「M54*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M55*」または「M55*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M56*」または「M56*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M57*」または「M57*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M58*」または「M58*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M59*」または「M59*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M60*」または「M60*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M61*」または「M61*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M62*」または「M62*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M63*」または「M63*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M64*」または「M64*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M65*」または「M65*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M66*」または「M66*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M67*」または「M67*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M68*」または「M68*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M69*」または「M69*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M70*」または「M70*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M71*」または「M71*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M72*」または「M72*」改変パターンを指す。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連する実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNAである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。またこの改変パターンは、本明細書中で「AS−M73*」または「M73*」改変パターンを指す。
特定の実施形態では、本発明のDsiRNAのセンス鎖は改変されており、-特定のセンス鎖改変の例示的な形態を以下に示す。このような改変センス鎖は上記に示すDsiRNAのいずれかのセンス鎖に代わって上述のアンチセンス鎖とアニールする以下に記載のセンス鎖を含むDsiRNAを作製することが考えられる。例示的なセンス鎖改変パターンは以下
であって、
式中、「X」=RNA、「X」=2´-O-メチルRNA、「D」=DNA
を含む。
式中、「X」=RNA、「X」=2´-O-メチルRNA、「D」=DNA
を含む。
上記の改変パターンをまた、例えば、以下に記述した伸長DsiRNA構造およびミスマッチならびに/またはほころびたDsiRNA構造内に組み込むことも可能である。
別の実施形態では、DsiRNAは、Dicer開裂を正しい方向にするように働く、1〜3ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む(とりわけ、3’−末端残基からナンバリングした時に、DsiRNAの第1の鎖上の位置1、2または3のうちの1つ以上が、第1の鎖および第2の鎖が互いにアニールする時に、第2の鎖上の5’末端領域の対応する残基とミスマッチする)。2つの末端ミスマッチ残基を持つ例示的27マーDsiRNA剤を
に示し、
式中「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または改変核酸)である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーでありえ、上記非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
式中「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または改変核酸)である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーでありえ、上記非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
特定のさらなる実施形態では、本発明は、推定されるセンス鎖Dicer開裂部位の3’と、推定されるアンチセンス鎖Dicer開裂部位の対応する5’とに位置する、二本鎖リボ核酸(dsRNA)の領域内に1つ以上の塩基対化デオキシリボヌクレオチドを有するRNA干渉(RNAi)に関する組成物を提供する。本発明の組成物は、前駆体分子であるdsRNAを含み、すなわち本発明のdsRNAが、活性小干渉核酸(siRNA)を産生するようにin vivoで処理される。dsRNAは、Dicerによって、RISC内に組み込まれる活性siRNAに処理される。
特定の実施形態では、本発明のDsiRNA剤は、以下の例示的構造を持ちうる(任意の以下の例示的構造は、例えば、上述の構造の下鎖改変パターンと組み合わせ可能であることに留意のこと−1つの特定の例において、任意の上記構造中で示した下鎖改変パターンが、任意の以下の構造の下鎖の27のほとんどの3’残基に適用される。別の特定の例にて、下鎖の23のほとんどの3’残基における、任意の上記構造にて示した下鎖改変パターンが、任意の以下の構造の下鎖の23のほとんどの3’残基に適用される)。
1つのこのような実施形態では、DsiRNAは、以下の(例示的「右伸長」、「DNA伸長」DsiRNA)、
を含み、
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、および「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、および「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
関連実施形態では、DsiRNAは、以下を含み、
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、および「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、以下を含み、
式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、かつN」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
別のこのような実施形態では、DsiRNAは、以下を含み、
式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、かつ「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
別のこのような実施形態では、DsiRNAは、以下を含み、
式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、かつ「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
別の実施形態では、DsiRNAは、以下を含み、
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、かつ「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10であり、少なくとも1つのD1Nが上鎖中に存在し、下鎖中の対応するD2Nと塩基対を形成する。任意にD1NとD1N+1は、対応するD2NとD2N+1と塩基対を形成し、D1N、D1N+1、およびD1N+2は、対応するD2N、D1N+1およびD1N+2などと塩基対を形成する。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
本明細書で描写した構造において、センス鎖またはアンチセンス鎖いずれかの5’末端が任意にリン酸基を含む。
別の実施形態では、DNA:DNA−伸長DsiRNAは、Dicer開裂を正しい方向にするように働く、1〜3ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む(とりわけ、3’−末端残基からナンバリングした時に、DsiRNAの第1の鎖上の位置1、2または3のうちの1つ以上が、第1の鎖および第2の鎖が互いにアニールする時に、第2の鎖上の5’末端領域の対応する残基とミスマッチする)。2つの末端ミスマッチ残基を持つ例示的DNA:DNA−伸長DsiRNA剤が
に示され、
式中「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または改変核酸)、「D」=DNA、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜15、または任意1〜8であり、「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーでありえ、上記非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が、上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖(第1の鎖)はセンス鎖であり、下鎖(第2の鎖)はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称/オーバーハング薬剤に関して上述のものと並行する改変パターンおよびDNA:DNA伸長パターンもまた、このような「平滑/ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
式中「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または改変核酸)、「D」=DNA、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜15、または任意1〜8であり、「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーでありえ、上記非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が、上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖(第1の鎖)はセンス鎖であり、下鎖(第2の鎖)はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称/オーバーハング薬剤に関して上述のものと並行する改変パターンおよびDNA:DNA伸長パターンもまた、このような「平滑/ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
1つの実施形態では、伸長したDsiRNA剤が、dsRNA構造中の塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、Dicer開裂の特定の方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むように提供される。このような分子の例示的な構造を、
に示し、
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNAである。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。上記の構造は、Dicerがその第一処理後形態として、最小21マーの二本鎖を開裂するようにさせるようにモデル化されている。上記構造の下鎖がアンチセンス鎖である実施形態では、アンチセンス鎖の5’末端の最後および最後から2番目の残基で2つのデオキシリボヌクレオチド残基が存在することが、的外れの効果の低減を支援する(先行研究では、的外れの効果を低減させるために、アンチセンス鎖の5’末端から少なくとも最後から2番目の2’−O−メチル改変が示される。例えば、米国特許公開公報第2007/0223427号を参照のこと)。
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNAである。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。上記の構造は、Dicerがその第一処理後形態として、最小21マーの二本鎖を開裂するようにさせるようにモデル化されている。上記構造の下鎖がアンチセンス鎖である実施形態では、アンチセンス鎖の5’末端の最後および最後から2番目の残基で2つのデオキシリボヌクレオチド残基が存在することが、的外れの効果の低減を支援する(先行研究では、的外れの効果を低減させるために、アンチセンス鎖の5’末端から少なくとも最後から2番目の2’−O−メチル改変が示される。例えば、米国特許公開公報第2007/0223427号を参照のこと)。
1つの実施形態では、DsiRNAは、以下を含み(例示的「左伸長」、「DNA伸長」DsiRNA)、
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、および「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
関連実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、任意に2’−O−メチルRNAモノマー、「D」=DNA、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
さらなる実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、任意に2’−O−メチルRNAモノマー、「D」=DNA、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。「Z」=DNAまたはRNAである。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
別のこのような実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、任意に2’−O−メチルRNAモノマー、「D」=DNA、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。「Z」=DNAまたはRNAである。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
別のこのような実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、および「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
別のこのような実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「X」=2’−O−メチルRNA、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、および「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10である。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインである。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
別の実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「D」=DNA、「Z」=DNAまたはRNA、および「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10であり、ここで少なくとも1つのD1Nが上鎖中に存在し、下鎖中の対応するD2Nと塩基対を形成する。任意にD1NとD1N+1は、対応するD2NとD2N+1と塩基対を形成し、D1N、D1N+1、D1N+2は、対応するD2N、D1N+1およびD1N+2などと塩基対を形成する。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
関連実施形態では、DsiRNAは、
を含み、式中「X」=RNA、「D」=DNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8または1〜10であり、ここで少なくとも1つのD1Nが上鎖中に存在し、下鎖中の対応するD2Nと塩基対を形成する。任意にD1NとD1N+1は、対応するD2NとD2N+1と塩基対を形成し、D1N、D1N+1、D1N+2は、対応するD2N、D1N+1およびD1N+2などと塩基対を形成する。「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、2’−O−メチルRNAモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
別の実施形態では、DNA:DNA−伸長DsiRNAは、Dicer開裂を正しい方向にするように働く、1〜3ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む(とりわけ、3’−末端残基からナンバリングした時に、DsiRNAの第1の鎖上の位置1、2または3のうちの1つ以上が、第1の鎖および第2の鎖が互いにアニールする時に、第2の鎖上の5’末端領域の対応する残基とミスマッチする)。2つの末端ミスマッチ残基を持つ例示的DNA:DNA−伸長DsiRNA剤が、
に示され、
式中「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または改変核酸)、「D」=DNA、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8、または任意1〜10であり、「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーでありえ、上記非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が、上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖(第1の鎖)はセンス鎖であり、下鎖(第2の鎖)はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称/オーバーハング薬剤に関して上で示したものと並行する改変パターンおよびDNA:DNA伸長パターンもまた、このような「平滑/ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
式中「X」=RNA、「M」=鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対を形成しない(水素結合しない)核酸残基(RNA、DNAまたは非天然または改変核酸)、「D」=DNA、「N」=1〜50以上であるが、任意に1〜8、または任意1〜10であり、「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。このような薬剤の任意の残基は任意に、2’−O−メチルRNAモノマーでありえ、上記非対称薬剤に関して示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAモノマーの交互位置が、上記「平滑/ほつれ」DsiRNA剤中でも使用可能である。1つの実施形態では、上鎖(第1の鎖)はセンス鎖であり、下鎖(第2の鎖)はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称/オーバーハング薬剤に関して上で示したものと並行する改変パターンおよびDNA:DNA伸長パターンもまた、このような「平滑/ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
別の実施形態では、伸長したDsiRNA剤が、dsRNA構造中の塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、Dicer開裂の特定の方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むように提供される。このような分子の例示的な構造が
または
に示され、
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
式中「X」=RNA、「Y」は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーである0〜10RNAモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、特定の実施形態では「Y」は任意に2’−O−メチルRNAモノマーである、1〜4RNAモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「D」=DNA、「N*」=0〜15以上であるが任意に0、1、2、3、4、5または6である。1つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
上記構造の下鎖がアンチセンス鎖である上記のいずれかの実施形態では、アンチセンス鎖の5’末端の最後および最後から二番目の残基での2つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置が、的外れの効果の低減を支援する(先行研究では、的外れの効果を低減させるために、アンチセンス鎖の5’末端から少なくとも最後から二番目の2’−O−メチル改変が示される。例えば、米国特許公開公報第2007/0223427号を参照のこと)。
特定の実施形態では、上記構造の「D」残基には、少なくとも1つのPS−DNAまたはPS−RNAが含まれる。任意に、上記構造の「D」残基には、Dicer開裂を阻害する少なくとも1つの改変ヌクレオチドが含まれる。
上記「DNA−伸長」DsiRNA剤は、「左伸長」または「右伸長」のいずれかとして分類される一方で、単剤内で左および右の両方の伸長DNA−含有配列を含むDsiRNA剤(例えば、コアdsRNA構造を取り囲むフランキングがdsDNA伸長である)をまた、「右伸長」および「左伸長」剤に関して本明細書で記述したものと同様の様式で、作製し、かつ使用できる。
いくつかの実施形態では、本発明のDsiRNAはさらに、DNA:DNA−伸長DsiRNA剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を連結する結合部位またはドメインを含む。任意に、このような結合部位ドメインは、センス鎖の3’末端と、アンチセンス鎖の5’末端とを連結する。結合部位は、オリゴメチレンジオールリンカー、オリゴエチレングリコールリンカー、または他の本技術分野で認識されるリンカー部位のような、化学的(非ヌクレオチド)リンカーであってもよい。あるいは、リンカーは、任意に伸長ループおよび/またはテトラループを含む、ヌクレオチドリンカーでありうる。
1つの実施形態では、DsiRNA剤は、25塩基対長を持つセンス鎖と、1〜4塩基3’−オーバーハング(例えば1塩基3’オーバーハング、2塩基3’−オーバーハング、3塩基3’−オーバーハングまたは4塩基3’−オーバーハング)を持つ27塩基対長を持つアンチセンス鎖を持つ、非対称構造を有する。別の実施形態では、本DsiRNA剤は、センス鎖の3’末端にて、2つのデオキシヌクレオチドをさらに含む、非対称構造を有する。
別の実施形態では、DsiRNA剤は、25塩基対長を持つアンチセンス鎖と、1〜4塩基3’−オーバーハング(例えば1塩基3’オーバーハング、2塩基3’−オーバーハング、3塩基3’−オーバーハングまたは4塩基3’−オーバーハング)を持つ27塩基対長を持つセンス鎖を持つ、非対称構造を有する。別の実施形態では、本DsiRNA剤は、アンチセンス鎖の3’末端にて、2つのデオキシヌクレオチドをさらに含む、非対称構造を有する。
本発明の例示的なMYC標的化DsiRNA剤、およびそれらの関連するMYC標的配列は、下の一連の表に示される以下のものを含む:
表番号:
(2)選択したヒト抗MYC DsiRNA剤(非対称);
(3)選択したヒト抗MYC DsiRNA、非改変の二本鎖(非対称);
(4)選択したマウス抗MYC DsiRNA(非対称);
(5)MYC mRNA中のDsiRNA標的配列(21マー);
(6)選択したヒト抗MYC「平滑/ほつれ」DsiRNA;
(7)選択したヒト抗MYC「平滑/平滑」DsiRNA;および
(8)MYC mRNA中のDsiRNA成分である19のヌクレオチド標的配列
表番号:
(2)選択したヒト抗MYC DsiRNA剤(非対称);
(3)選択したヒト抗MYC DsiRNA、非改変の二本鎖(非対称);
(4)選択したマウス抗MYC DsiRNA(非対称);
(5)MYC mRNA中のDsiRNA標的配列(21マー);
(6)選択したヒト抗MYC「平滑/ほつれ」DsiRNA;
(7)選択したヒト抗MYC「平滑/平滑」DsiRNA;および
(8)MYC mRNA中のDsiRNA成分である19のヌクレオチド標的配列
上記の表2〜4および6〜7内で、下線残基は、2’−O−メチル残基を示し、大文字はリボヌクレオチド類を示し、小文字はデオキシリボヌクレオチド類を意味する。上記の表2〜4のDsiRNA剤は、平滑末端を有する25/27マーの薬剤である。上記の表2〜4の薬剤の構造および/または改変パターンを、上記の遺伝的配列構造に対して容易に適合でき、例えば、第2の鎖の3’オーバーハングを伸長させるか、または短縮させることが可能であり、第2の鎖の2’−O−メチル化を第2の鎖の5’末端に向かって、任意に交互部位にて拡大させることが可能である。このような改変をもつ25/27マーDsiRNAをまた、上記DsiRNA剤から簡単にデザイン可能であり、MYC発現の機能的阻害剤としても予測されるため、このようなさらなる改変は任意である。同様に、上記の表6〜7の薬剤の、27マー「平滑/ほつれ」および「平滑/平滑」DsiRNA構造および/または改変パターンを、例えばこのような構造に対するアンチセンス鎖の改変パターンの適用、および/またはこのような配列の上記遺伝的構造への適用のために、上記遺伝的配列構造に容易に適用できる。
特定の実施形態では、各27ヌクレオチドの独立した鎖長を有する27マーDsiRNAを、本明細書の表2〜4にて示した、非対称「25/27」構造と同一のMYC転写物内の部位の標的化のために、デザインし、合成する。例示的「27/27」DsiRNAは、上記表6のDsiRNAに関して示したような「平滑/ほつれ」構造で、または上記表7のDsiRNAに関して示したような「平滑/平滑」構造で、任意にデザインされる。
特定の実施形態では、本発明のdsRNA剤は、第1の鎖の、たとえば少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、または少なくとも26の残基が、第2の鎖の対応する残基に相補的であることを必要とする。特定の関連実施形態では、第2の鎖の対応する残基に相補的なこれらの第1の鎖残基は任意に連続残基である。
定義により、「十分に相補的な」(たとえば「100%相補的な」と対比される)は、dsRNAがRNAi機構(たとえば、RISC複合体)または工程により標的RNAの破壊を起こすのに十分な相補性を有する場合、本発明のdsRNAおよび標的RNAまたはcDNA配列(たとえばMYC mRNA)の間に1つ以上のミスマッチが存在することを許容する。特定の実施形態では、「十分に相補的な」本発明のdsRNAは、dsRNA配列および標的RNAまたはcDNA配列の間に1、2、3または4つ以上ものミスマッチを有することができる(たとえば、このような特定の実施形態では、dsRNAのアンチセンス鎖は、標的RNAまたはcDNA配列とアライメントされる際、1、2、3、4、5または6つ以上ものミスマッチを有する)。さらに、本発明の特定のdsRNA内のこのようなミスマッチの好ましい位置は、以下により詳細に考慮されている。
本明細書で使用するところの「DsiRNAmm」は、DsiRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖によって形成された二本鎖の1、2、3または4つのミスマッチ塩基対を含む、「ミスマッチ耐性領域」を持つDsiRNAを意味し、ここでこのようなミスマッチは、DsiRNAのいずれかの末端の2つの末端塩基対間で横たわっている(したがって末端塩基対を含まない)場所で、DsiRNA内に位置する。ミスマッチ塩基対は、対応する標的核酸の推定されるAgo2切断部位の局所に関して本明細書で定義した、「ミスマッチ−耐性領域」内に局在する。ミスマッチ耐性領域は、標的鎖の推定Ago2切断部位「の上流」に局在する。本文脈中の「上流」は、DsiRNAmm二本鎖の5’−の大部分の部位として理解され、5’はDsiRNA二本鎖のセンス鎖の方向を意味する。したがって、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の推定Ago2切断部位に対応するセンス(パッセンジャー)鎖上の塩基の上流であり(図1)、あるいは、DsiRNAmmのアンチセンス(ガイド)鎖を指す場合、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の推定Ago2切断部位に相補的な塩基の下流に位置すると記述することも可能であり、すなわち、DsiRNAmmのアンチセンス鎖の3’の大部分と記述可能である(アンチセンス鎖の位置1は、アンチセンス鎖の5’末端ヌクレオチドである、図1を参照のこと)。
1つの実施形態では、例えば図1にて描写したようなナンバリングで、ミスマッチ耐性領域は、二本鎖のセンス鎖の5’末端で開始したヌクレオチドからナンバリングした場合、塩基対3〜9の間、または塩基対3〜9を含んで位置する。したがって、本発明のDsiRNAmmは、右手伸長DsiRNAのセンス鎖の位置3、4、5、6、7、8または9のいずれか1つにおいて、単一のミスマッチ塩基対を有する(位置1は、センス鎖の5’末端ヌクレオチドであり、位置9は、センス鎖配列に対応する標的MYC RNA配列の推定Ago2切断部位の5’に接したセンス鎖のヌクレオチド残基である)。特定の実施形態では、センス鎖の位置3、4、5、6、7、8または9の任意の位置でミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するDsiRNAmmでは、アンチセンス鎖の対応するミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmのセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、DsiRNAmm標的MYC RNA配列ともミスマッチ塩基対を形成する(したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、DsiRNAmm内のミスマッチ塩基対にて中断され、相補性は、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的MYC RNA配列との間で同様に中断される)。代替的なの実施形態では、DsiRNAmmのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、その対応する標的MYC RNA配列ヌクレオチドとも塩基対を形成する(したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、DsiRNAmm内のミスマッチ塩基対にて中断され、また相補性は、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的MYC RNA配列との間で維持される)。
上述のように、ミスマッチ耐性領域(ミスマッチ領域)内で単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のDsiRNAmm(例えば、センス鎖の位置3、4、5、6、7、8または9のいずれか1つにてミスマッチヌクレオチド残基をもつDsiRNAmm)はさらに、1、2または3つのさらなるミスマッチ塩基対を含みうる。好ましい実施形態では、これらDsiRNAmmの1、2または3つのさらなるミスマッチ塩基対は、センス鎖の位置3、4、5、6、7、8および/または9にて(そしてアンチセンス鎖の対応する残基にて)発生する。1つのさらなるミスマッチ塩基対が、DsiRNAmm内に存在する1つの実施形態では、センス鎖の2つのミスマッチ塩基対が、例えば(アンチセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にて発生もするミスマッチとともに)センス鎖の位置4および位置6両方のヌクレオチドで発生しうる。
2つのミスマッチ塩基対を有するDsiRNAmm剤において、ミスマッチは、連続して(例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置にて)発生可能である。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である(例えば、位置4および5ではなく、位置3および6にてミスマッチヌクレオチドを有するDsiRNAmmに関して、センス鎖位置3および6のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する2つのヌクレオチドによって散在される)。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する(センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する)センス鎖の2つの残基が、これらのミスマッチ塩基対間に局在する、0、1、2、3、4または5のマッチした塩基対で発生可能である。
3つのミスマッチ塩基対を有する特定のDsiRNAmm剤において、ミスマッチは、連続して発生可能である(例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って三重に発生可能である)。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である(例えば、位置5、6および7ではなく、位置3、4および8にてミスマッチヌクレオチドを有するDsiRNAmmに関して、センス鎖位置3および4のミスマッチ残基は、互いに隣接し、センス鎖位置4および8のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する3つの残基によって散在される)。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する(センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する)センス鎖の3つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の2つの間に局在する、0、1、2、3または4つのマッチした塩基対で発生可能である。
4つのミスマッチ塩基対を有する特定のDsiRNAmm剤に関して、ミスマッチは、連続して発生可能である(たとえば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四重に発生可能である)。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である(例えば、位置4および6ではなく、位置3、5、7および8にてミスマッチヌクレオチドを有するDsiRNAmmに関して、センス鎖位置7および8のミスマッチ残基は、互いに隣接し、センス鎖位置3および5のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つの残基によって散在される。同様に、センス鎖位置5および7のミスマッチ残基がまた、アンチセンス鎖の対応する残基と、マッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによっても散在される)。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する(センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する)センス鎖の4つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の2つの間に局在する、0、1、2または3つのマッチした塩基対で発生可能である。
例えば図1でまた描写したようなナンバリングで、別の実施形態では、本発明のDsiRNAmmは、DsiRNAのアンチセンス鎖の位置17、18、19、20、21、22または23のいずれか1つにて、単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するミスマッチ耐性領域を含む(位置1はアンチセンス鎖の5’末端ヌクレオチドであり、位置17は、アンチセンス鎖配列に十分に相補的な標的MYC RNA配列の推定Ago2切断部位のアンチセンス鎖中の3’(下流)隣接であるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である)。特定の実施形態では、DsiRNAmmのセンス鎖に関して、アンチセンス鎖の位置17、18、19、20、21、22または23のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するDsiRNAmmでは、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、DsiRNAmm標的MYC RNA配列ともミスマッチ塩基対を形成する(したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、DsiRNAmm内のミスマッチ塩基対にて中断い申し上げます。され、相補性は同様に、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的MYC RNA配列との間で中断される)。代替的な実施形態では、DsiRNAmmのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、DsiRNAmmのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、その対応する標的MYC RNA配列ヌクレオチドと塩基対を形成する(したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、DsiRNAmm内のミスマッチ塩基で中断され、また相補性は、DsiRNAmmのアンチセンス鎖配列と標的MYC RNA配列との間で維持される)。
上述のように、ミスマッチ耐性領域内で単一ミスマッチ塩基対を有する本発明のDsiRNAmm(例えば、アンチセンス鎖の位置17、18、19、20、21、22または23にてミスマッチヌクレオチド残基を持つDsiRNAmm)はさらに、1、2または3つのさらなるミスマッチ塩基対を含みうる。好ましい実施形態では、これらDsiRNAmmのさらなる1、2または3つのミスマッチ塩基対が、アンチセンス鎖の位置17、18、19、20、21、22および/または23で(そしてセンス鎖の対応する残基にて)発生する。1つのさらなるミスマッチ塩基対がDsiRNAmm内に存在する1つの実施形態では、アンチセンス鎖の2つのミスマッチ塩基対が、(センス鎖の対応するヌクレオチド残基にて同様に発生しているミスマッチと共に)アンチセンス鎖の位置18および位置20の両方のヌクレオチドで発生しうる。
2つのミスマッチ塩基対を有するDsiRNAmm剤において、ミスマッチは連続して(例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置にて)発生しうる。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対形成するヌクレオチドによって散在されうる(例えば位置18および19ではなく、位置17および20でミスマッチヌクレオチドを有するDsiRNAmmでは、アンチセンス鎖位置17および20のミスマッチ残基が、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する2つのヌクレオチドによって散在する)。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する(センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する)アンチセンス鎖の2つの残基は、これらのミスマッチ塩基対間に局在する0、1、2、3、4、5、6または7マッチ塩基対で発生可能である。
3つのミスマッチ塩基対を有する特定のDsiRNAmm剤に関して、ミスマッチは連続して起こりうる(例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三重に起こりうる)。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である(例えば、位置19、20および21ではなく、位置17、18および22にてミスマッチヌクレオチドを有するDsiRNAmmでは、アンチセンス鎖位置17および18のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置18および122のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する3つの残基によって散在される)。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する(アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する)アンチセンス鎖の3つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の2つの間に局在する、0、1、2、3、4、5または6のマッチした塩基対で発生可能である。
4つのミスマッチ塩基対を有する特定のDsiRNAmm剤では、ミスマッチは、連続して発生可能である(たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って四重に発生可能である)。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である(例えば、位置19および21ではなく、位置18、20、22および23にてミスマッチヌクレオチドを有するDsiRNAmmでは、アンチセンス鎖位置22および23のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置18および20のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つの残基によって散在される−同様に、アンチセンス鎖位置20および22のミスマッチ残基がまた、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在される)。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する(アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する)アンチセンス鎖の4つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の2つの間に局在する、0、1、2、3、4または5のマッチ塩基対で発生可能である。
明確化の理由のために、上記DsiRNAmm剤内のミスマッチヌクレオチド残基の配置を、DsiRNAmmのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの5’末端残基に関してナンバリングする。アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域(ミスマッチ領域)内に配置される位置のナンバリングが、推定Ago2開裂部位に対するセンス鎖またはアンチセンス鎖の5’末端の近位での変動を伴ってシフト可能である。したがって、アンチセンス鎖またはセンス鎖いずれかの好ましいミスマッチ部位の配置をまた、推定Ago2切断部位に対して、このようなミスマッチの許容される近位にあると同定可能でもある。したがって、1つの好ましい実施形態では、DsiRNAmmのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的MYC RNA配列の推定Ago2開裂部位の5’(上流)直近に配置されるセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態では、DsiRNAmmのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、推定Ago2開裂部位の2ヌクレオチド5’(上流)、推定Ago2開裂部位の3ヌクレオチド5’(上流)、推定Ago2開裂部位の4ヌクレオチド5’(上流)、推定Ago2開裂部位の5ヌクレオチド5’(上流)、推定Ago2開裂部位の6ヌクレオチド5’(上流)、推定Ago2開裂部位の7ヌクレオチド5’(上流)、推定Ago2開裂部位の8ヌクレオチド5’(上流)または推定Ago2開裂部位の9ヌクレオチド5’(上流)に局在するセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
例示的単一ミスマッチ−含有25/27マーDsiRNA(DsiRNAmm)は、以下の構造を含む(このようなミスマッチ−含有構造はまた、本明細書で示した他の例示的DsiRNA構造内に組み込んでもよい)。
式中、「X」=RNA、「D」=DNAおよび「M」=鎖がアニールする時に、他の相補的鎖の対応する「M」残基と塩基対(水素結合)を形成しない核酸残基(RNA、DNAまたは天然に存在しないまたは改変核酸)である。このような薬剤の任意の残基は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーでありえ、−上記示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAの交互配置を、上記ののDsiRNAmm剤中で使用可能でもある。上記ミスマッチ構造では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
特定の実施形態では、本発明のDsiRNAは、DsiRNAの2つの鎖内のミスマッチ塩基対として必ずしも存在せず、標的MYC RNA配列に関して存在するミスマッチを含みうる−したがって、DsiRNAは、DsiRNAの第1の鎖および第2の鎖間で完全な相補性を有してよく、また(特定の実施形態では、有効性および/または効力および/または効果の持続期間を促進することにおいて有益であり得る)標的MYC RNAに関してミスマッチ残基を有し得る。ミスマッチが、アンチセンス鎖と標的MYC RNA配列との間で発生する特定の実施形態では、ミスマッチの位置が、標的領域の推定Ago2切断部位の5’に局在したセンス鎖の配列に対応する位置で、−例えば標的配列の推定Ago2切断部位に相補的であるアンチセンス残基の3’に対して、アンチセンス鎖内に位置するアンチセンス鎖残基で、アンチセンス内に配置される。
標的配列に関する単一ミスマッチ残基を持つ例示的25/27マーDsiRNAは以下の構造を含む。
式中、「X」=RNA、「D」=DNAおよび「E」=鎖がアニールする時に、他の相補的(標的)鎖の対応する「A」RNA残基と塩基対(水素結合)を形成せず、また任意に対応する「B」残基と塩基対形成する(「B」残基はまた、RNA、DNAまたは天然に存在しないまたは改変核酸)核酸残基(RNA、DNAまたは天然に存在しないまたは改変核酸)である。このような薬剤の任意の残基は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーでありえ、−上記示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAの交互配置をまた、上記のDsiRNA剤中で使用可能でもある。
特定の実施形態では、標的遺伝子発現を低減するよう標的遺伝子配列の少なくとも19のヌクレオチドに沿った標的RNA(たとえばmRNA)に十分に相補的である、本発明のdsRNAのガイド鎖は、少なくとも19のヌクレオチドである長い標的遺伝子配列に完全に相補的ではない。むしろ、標的遺伝子発現を低減するよう標的遺伝子配列の少なくとも19のヌクレオチドに沿った標的mRNAに十分に相補的である本発明のdsRNAのガイド鎖が、19以上の長さのヌクレオチドである標的鎖配列とミスマッチを形成する1、2、3、または4つ以上ものヌクレオチドを有することができる。したがって、19のヌクレオチドの標的RNA配列に対し、本発明のdsRNAのガイド鎖は、標的遺伝子レベルを低減するよう標的RNA配列に十分に相補的であり、その一方でたとえば、ガイド鎖および標的RNA配列の間に15/19、16/19、17/19、または18/19のみがマッチしたヌクレオチド残基を有する。
上記で例示した構造に加えて、本発明のdsRNAはまた、標的MYC RNA配列とさらなるミスマッチを形成する、1、2または3つのさらなる残基を有しうる。このようなミスマッチは連続であってよく、または標的MYC RNA配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在しうる。マッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在される場合、ミスマッチ残基は、このようなミスマッチ形成残基間の1、2、3、4、5、6、7または8つの塩基対形成ヌクレオチドの間隔にて一本鎖内で互いに離れて隔たりうる。
上記DsiRNAmm剤に関しては、(また対応するセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチを形成してよく、または形成しなくてよい)標的MYC RNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖ヌクレオチドに関して、dsRNA(たとえばDsiRNA)内の好ましい配置が、DsiRNAの推定Ago2切断部位に相補的なアンチセンス鎖配列の3’(下流)に局在するアンチセンス鎖領域内である(たとえば、図1において、推定Ago2切断部位の3’であるアンチセンス鎖の領域が、ミスマッチ形成残基に関して好ましく、図1にて示した25/27マー薬剤に対するアンチセンス鎖の位置17〜23に局在する)。したがって、1つの実施形態では、DsiRNAmmのアンチセンス鎖の(標的MYC RNA配列に関する)ミスマッチヌクレオチドの位置が、対応する標的MYC RNA配列の推定Ago2開裂部位のアンチセンス鎖配列内の3’(下流)直近に局在するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態では、(標的MYC RNA配列に関する)DsiRNAmmのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、対応する推定Ago2開裂部位の2ヌクレオチド3’(下流)、対応する推定Ago2開裂部位の3ヌクレオチド3’(下流)、対応する推定Ago2開裂部位の4ヌクレオチド3’(下流)、対応する推定Ago2開裂部位の5ヌクレオチド3’(下流)、対応する推定Ago2開裂部位の6ヌクレオチド3’(下流)、対応する推定Ago2開裂部位の7ヌクレオチド3’(下流)、対応する推定Ago2開裂部位の8ヌクレオチド3’(下流)または対応する推定Ago2開裂部位の9ヌクレオチド3’(下流)に局在するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
アンチセンス鎖の2つのミスマッチ形成ヌクレオチドを有するdsRNA剤において(ミスマッチ形成ヌクレオチドは、標的MYC RNA配列に関してミスマッチ形成している)、ミスマッチは連続して発生しうる(例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って連続した位置で発生しうる)。あるいは、標的MYC RNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的MYC RNA配列と塩基対形成するヌクレオチドによって散在されうる(例えば、図1で示した25/27マー薬剤のアンチセンス鎖の5’末端(位置1)から開始して)位置18および19ではなく、位置17および20でミスマッチ形成ヌクレオチドを有するDsiRNAでは、センス鎖位置17および20のミスマッチ残基が、標的MYC RNA配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する2つのヌクレオチドによって散在する)。例えば、対応する標的MYC RNA配列とミスマッチ塩基対を形成する(アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する)アンチセンス鎖の2つの残基は、これらのミスマッチ形成塩基対間に局在する(標的MYC RNA配列に関する)0、1、2、3、4または5つのマッチした塩基対で発生しうる。
(標的MYC RNA配列に関してミスマッチを形成している)3つのミスマッチ形成塩基対を有する特定のdsRNAでは、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して発生しうる(例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三重に発生し得る)。あるいは、標的MYC RNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、標的MYC RNA配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である(例えば、位置19、20および21ではなく、位置17、18および22にてミスマッチヌクレオチドを有するDsiRNAでは、アンチセンス鎖位置17および18のミスマッチ形成残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置18および22のミスマッチ形成残基は、標的MYC RNA配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する3つの残基によって散在される)。例えば、対応する標的MYC RNA配列とミスマッチ塩基対を形成する(アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する)アンチセンス鎖の3つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の2つの間に局在する、0、1、2、3または4つのマッチ塩基対で発生可能である。
(標的MYC RNA配列に関してミスマッチを形成している)4つのミスマッチ形成塩基対を有する特定のdsRNAでは、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して発生しうる(例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四重に発生しうる)。あるいは、標的MYC RNA配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、標的MYC RNA配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である(例えば、位置18および20ではなく、位置17、19、21および22にてミスマッチ形成ヌクレオチドを有するDsiRNAでは、アンチセンス鎖位置21および22のミスマッチ形成残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置17および19のミスマッチ形成残基は、標的MYC RNA配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在される−同様に、アンチセンス鎖位置19および21のミスマッチ形成残基はまた、標的MYC RNAの対応する残基とマッチした塩基対を形成する1つのヌクレオチドによって散在される)。例えば、対応する標的MYC RNA配列とミスマッチ塩基対を形成する(アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する)アンチセンス鎖の4つの残基が、これらのミスマッチ形成塩基対の任意の2つの間に局在する、0、1、2または3つのマッチした塩基対で発生可能である。
上記DsiRNAmmと他のdsRNA構造を、DsiRNAmmとdsRNA剤との特定の構造を例示するために記述する。上記DsiRNAmmとdsRNA構造とのデザインを、例えば以下に示した他のDsiRNA構造のDsiRNAmm形態を産出するために適合可能である。上記で例示したように、dsRNAはまた、dsRNAのアンチセンス鎖と標的配列との間の単一ミスマッチ(または2、3または4つのミスマッチ)を有するようにデザイン可能であり、また任意に、dsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖配列間の完全な相補性を維持可能である。
なお、以下で例示するdsRNA剤はまた、それらの二本鎖および/または標的MYC RNA−整列構造内に、挿入/欠損(in/del)構造を有しうる。したがって、本発明のdsRNAは、例えば、ミスマッチおよび/またはミスマッチ形成塩基対の位置に関して上述のそれらの局所に対応する、このようなin/delヌクレオチドの配置に対して好ましい局所で、標的MYC RNA配列と比較したアンチセンス配列、および/またはセンス鎖配列と比較したアンチセンス配列中、in/del変化を有するようにデザイン可能である。
なお、本発明のDsiRNAは、Dicerによって処理され、RISCへ積み込むガイド鎖配列から自由であるようにモデル化されるので、センス鎖の3’−末端領域/アンチセンス鎖の5’−末端領域内でもミスマッチを許容可能である。このようなミスマッチを持つ本発明の例示的DsiRNA構造には、以下が含まれ、
式中「X」=RNA、「D」=DNAおよび「I」および「J」=互いに塩基対(水素結合)を形成しない核酸残基(RNA、DNAまたは天然に存在しない核酸もしくは改変核酸)で、また任意に「J」は、標的RNA配列ヌクレオチド「H」に相補的である。このような薬剤の任意のの残基は、任意に2’−O−メチルRNAモノマーでありえ、−上記で示したように、下(第2の)鎖の3’−末端残基から始まる2’−O−メチルRNAの交互配置−または上述のいずれかのメチル化パターン−をまた、以上のDsiRNA剤中で使用可能でもある。上記ミスマッチはまた、本発明のDsiRNA内で組み合わせ可能である。
以下の構造において、このようなミスマッチは、非対称MYC−622 DsiRNA(新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である)内に導入される。
MYC−622 25/27merのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5’末端より)
MYC−622 25/27merのDsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5’末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「C」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「t」残基は、あるいは「a」または「g」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「a」残基は、あるいは「c」または「g」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「U」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または」Gである。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「C」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−622 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
別の例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称のMYC−953 DsiRNA内に導入される(新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である)。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「U」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「G」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「g」残基は、あるいは「t」または「c」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「a」残基は、あるいは「c」または「g」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「U」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「C」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「C」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「C」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−953 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
追加的な例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称性のMYC−1364 DsiRNA内に導入される(新規に導入したミスマッチ残基はイタリック体である)。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「G」残基は、あるいは「A」または「C」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「t」残基は、あるいは「a」または「c」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「a」残基は、あるいは「c」または「g」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「U」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「C」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1364 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
さらなる例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称性MYC−1370 DsiRNA内に導入される(新規に導入されるミスマッチ残基はイタリック体である)。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチの位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「A」残基は、あるいは、「C」または「G」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「t」残基は、あるいは「a」または「c」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「a」残基は、あるいは「c」または「g」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「U」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1370 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
別の例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称性MYC−1711 DsiRNA内に導入される(新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である)。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「t」残基は、あるいは「a」または「c」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「t」残基は、あるいは「c」または「g」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「A」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「C」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1711 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
さらなる例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称性MYC−1769 DsiRNA内に導入される(新規に導入されるミスマッチ残基はイタリック体である)。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「g」残基は、あるいは「t」または「c」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「a」残基は、あるいは「t」または「g」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「C」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「C」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「C」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1769 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
さらなる例として、以下の構造では、このようなミスマッチが非対称性MYC−1965 DsiRNA内に導入される(新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である)。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「g」残基は、あるいは「a」または「c」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「a」残基は、あるいは「t」または「c」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「C」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−1965 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
別の例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称性MYC−2099 DsiRNA内に導入される(新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である)。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「U」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「t」残基は、あるいは「a」または「c」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「t」残基は、あるいは「c」または「g」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「A」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2099 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
さらなる例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称性MYC−2115 DsiRNA内に導入される(新規に導入したミスマッチ残基はイタリック体である)。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「G」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「g」残基は、あるいは「a」または「c」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「a」残基は、あるいは「c」または「g」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「U」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「C」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「C」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2115 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
さらなる例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称性MYC−2120 DsiRNA内に導入される(新規に導入したミスマッチ残基はイタリック体である)。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「C」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「G」残基は、あるいは「A」または「C」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「g」残基は、あるいは「a」または「c」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「a」残基は、あるいは「c」または「g」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「U」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「C」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「C」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「G」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2120 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
別の例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称性MYC−2196 DsiRNA内に導入される(新規に導入したミスマッチ残基はイタリック体である)。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「C」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「g」残基は、あるいは「a」または「c」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「a」残基は、あるいは「c」または「g」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「U」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「C」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「U」残基は、あるいは「A」または「C」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2196 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
さらなる例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称性MYC−2233 DsiRNA内に導入される(新規に導入されるミスマッチ残基はイタリック体である)。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の19(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置19のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の20(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置20のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の21(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置21のミスマッチ「U」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の22(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置22のミスマッチ「G」残基は、あるいは「A」または「C」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の23(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置23のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の24(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置24のミスマッチ「t」残基は、あるいは「a」または「c」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=センス鎖の25(5´末端より)
任意に、センス鎖の位置25のミスマッチ「a」残基は、あるいは「c」または「g」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の1(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置1のミスマッチ「U」残基は、あるいは「G」または「C」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の2(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置2のミスマッチ「A」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の3(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置3のミスマッチ「A」残基は、「C」または「G」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の4(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置4のミスマッチ「C」残基は、あるいは「U」または「G」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の5(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置5のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の6(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置6のミスマッチ「U」残基は、あるいは「C」または「G」である。
MYC−2233 25/27mer DsiRNA、ミスマッチ位置=アンチセンス鎖の7(5´末端より)
任意に、アンチセンス鎖の位置7のミスマッチ「A」残基は、あるいは「C」または「G」である。
上記のオリゴヌ クレオチド鎖配列では、描写される1つの二本鎖のセンス鎖配列を描写される別の二本鎖のアンチセンス鎖と組み合わせることができ、これにより異なる二本鎖を形成でき、特定の例ではこのような二本鎖は、MYC標的転写配列に関するミスマッチ残基を含み、その一方でこのようなセンス鎖およびアンチセンス鎖は、お互いに関してこの残基でのミスマッチを示さないことが考慮される(たとえば、配列番号3707および3720、配列番号3708および3719、配列番号3709および3718などを含む二本鎖が、このような二本鎖の例として考慮される)。
上述のように、ミスマッチの導入は本明細書で記述した任意のDsiRNA上で実施可能である。
このようなDsiRNA構造のミスマッチを組み合わせて、例えばセンス鎖の3’末端の4〜7ヌクレオチド/アンチセンス鎖の5’末端の4〜7ヌクレオチド内に2、3または4つものミスマッチを有するDsiRNAを産出してもよい。
実際、センス鎖の3’末端残基/アンチセンス鎖の5’末端残基にてDsiRNA内に組み込み可能な配列の柔軟性に関して、特定の実施形態では、本発明の非対称DsiRNAの配列の必要条件を以下の(例示的なMYC−953 DsiRNA配列に関して示した)(ミニマリスト)構造で表すことが出来る。
式中、n=1〜5、1〜10、1〜20、1〜30、1〜50、または1〜80以上である。
MYC−953 mRNA標的:
MYC−953 mRNA標的:
MYC標的部位はまた、その相補的標的部位が、規定された標的部位と重なる、1つ以上の種々のオリゴヌクレオチドによって標的とされる部位であり得る。例えば、例示的MYC−953DsiRNAに関して、MYC配列に重なり、わずかばかり補正されたMYC配列を標的としている特定のDsiRNAが、MYC−953のものと同様の活性レベルを示しうる(特に、以下の表9のMYC−952を参照のこと。したがって、特定の実施形態では、デザインされた標的配列領域は、広く重なっている配列を有する一連のDsiRNAによって効果的に標的とされる(例えばMYC−952およびMYC−953標的部位のDsiRNAを考慮する場合、より包括的なMYC転写標的配列が、例えば5’−CGGACGACGAGACCUUCAUCAAAAACAU−3’(配列番号:3878)を指してもよく、ここで所定のいずれかのDsiRNA(例えば、MYC−952およびMYC−953から選択されるDsiRNA)のみが、このような配列領域内のサブ配列を標的とし、また全配列は、このような一連のDsiRNAに対する実行可能な標的と考慮可能である)。
さらに、かつ/またはあるいは、センス鎖の3’末端7ヌクレオチド/アンチセンス鎖の5’末端7ヌクレオチド内のミスマッチを、上述のように、他のミスマッチ耐性位置にて配置されるスマッチと組み合わせることができる。
特定のMYC配列の標的化を介して、MYCレベルの阻害剤として、上記Dicer基質剤(DsiRNA)の本同定を考慮して、本明細書で記述したものと同様の構造を持つdsRNAがまた、NM_002467.4またはNM_010849.4のMYC配列内、またはそれらの変異体(例えば、NM_002467.4および/またはNM_010849.4の配列に対して、80%同一性、90%同一性、95%同一性、96%同一性、97%同一性、98%同一性、99%同一性またはそれ以上の同一性を有する標的配列)内の他の配列を標的とするように合成可能である。
抗−MYC DsiRNAデザイン/合成
25〜35ヌクレオチド、とりわけ25〜30ヌクレオチドのより長いdsRNA種(DsiRNA)が、19〜23マーsiRNA剤と比較して、活性の効力および持続期間に関して、予期せぬ効果的な結果を与えることが、実験的にわかってきた。dsRNA処理機構の根本的な理論に拘束されることを望むものではないが、、より長いdsRNA種が細胞の細胞質中のDicer酵素に対する基質として働くことが考えられる。本発明のdsRNAをより短いセグメントに分割することに加えて、Dicerは、分割されたdsRNA由来の一本鎖分割産物の、標的遺伝子MYC(またはMYC−関連疾患もしくは障害と関連する他の遺伝子)由来の細胞質RNA(例えばMYC RNA)の崩壊に関与するRISC複合体内への組み込みを促進すると考えられる。先行する研究(Rossi et al.,米国特許公開公報第2007/0265220号)は、DicerによるdsRNA種(特にDsiRNA剤)の開裂性が、dsRNA種の活性の効力および持続期間の増大と一致することを示した。
25〜35ヌクレオチド、とりわけ25〜30ヌクレオチドのより長いdsRNA種(DsiRNA)が、19〜23マーsiRNA剤と比較して、活性の効力および持続期間に関して、予期せぬ効果的な結果を与えることが、実験的にわかってきた。dsRNA処理機構の根本的な理論に拘束されることを望むものではないが、、より長いdsRNA種が細胞の細胞質中のDicer酵素に対する基質として働くことが考えられる。本発明のdsRNAをより短いセグメントに分割することに加えて、Dicerは、分割されたdsRNA由来の一本鎖分割産物の、標的遺伝子MYC(またはMYC−関連疾患もしくは障害と関連する他の遺伝子)由来の細胞質RNA(例えばMYC RNA)の崩壊に関与するRISC複合体内への組み込みを促進すると考えられる。先行する研究(Rossi et al.,米国特許公開公報第2007/0265220号)は、DicerによるdsRNA種(特にDsiRNA剤)の開裂性が、dsRNA種の活性の効力および持続期間の増大と一致することを示した。
特定の好ましい抗−MYC DsiRNA剤を、プレスクリーニングした集合から選択した。DsiRNAのデザインは任意に、配列の領域に広がっている可能性のある多数のDsiRNA剤の推定有効性/効果のin silico評価にて実施する予測スコアリングアルゴリズムの利用を含みうる。より最近の「v3」アルゴリズムは本技術分野ですでに利用可能なsiRNAスコアリングアルゴリズム対して理論的に改善されたアルゴリズムを表すが、このようなスコアリングアルゴリズムのデザインに関する情報は、例えば、Gong et al.(BMC Bioinformatics 2006,7:516)で見ることができる(例えば「v3」および「v4」スコアリングアルゴリズムは、ヒト配列中の任意のバイアスに依存していない機械学習アルゴリズムである。さらに、「v3」および「v4」アルゴリズムは、Gong et al.にて記述されたデバイスのような、より古い「v2」アルゴリズムからのものよりも、複数倍大きいデータ組に由来する)。
本発明のDsiRNA剤の第1および第2のオリゴヌクレオチドは、完全に相補的であることを必要としない。実際、1つの実施形態では、センス鎖の3’−末端は、1つ以上のミスマッチを含む。1つの態様において、2つのミスマッチが、センス鎖の3’末端に組み込まれる。別の実施形態では、本発明のDsiRNAは、それぞれが長さにおいて27ヌクレオチドであり、互いにアニールした時に、センス鎖の3’末端(アンチセンス鎖の5’末端)上に平滑末端と2つのヌクレオチド末端とを持つ、2つのRNAオリゴヌクレオチドを含む二本鎖RNA分子である。(特に3’−センス/5’−アンチセンス位置での)ミスマッチまたは減少した熱力学的安定性の利用が、おそらくsiRNAのRISCへの進入とともに発生する速度が限定された巻き戻し段階に影響を与えることによって、アンチセンス鎖のRISCへの進入を促進するまたは有利に働かせることが提案されてきた(Schwarz et al.,2003,Cell 115:199−208;Khvorova et al.,2003,Cell 115:209−216)。したがって、末端塩基組成物は、活性21マーsiRNA二本鎖を選択するためのデザインアルゴリズムに含まれてきた(Ui−Tei et al.,2004,Nucleic Acids Res 32:936−948;Reynolds et al.,2004,Nat Biotechnol 22:326−330)。本実施形態のdsRNAのDicer開裂で、ミスマッチを含む小さな最終末端配列は、アンチセンス鎖と対を形成しないままである(3’−オーバーハングの一部となる)か、または最終21−マーsiRNAを完全に開裂して除去される。これらの「ミスマッチ」はしたがって、RISCの最終RNA成分中のミスマッチとして持続しない。Dicer基質のセンス鎖の3’−末端での塩基ミスマッチまたはセグメントの不安定化がおそらくDicerによる処理を促進することによって、RNAi中の合成二本鎖の効力を改善したという発見が、25〜30マーdsRNA(また本明細書で「DsiRNA」と呼ぶ。米国特許公開公報第2005/0277610号、第2005/0244858号および第2007/0265220号明)のデザインと利用を記述している過去の働きの驚くべき発見であった。
抗−MYC dsRNAの改変
二本鎖RNA(「dsRNA」)の効果を阻害する1つの主要な因子は、ヌクレアーゼによるdsRNA(例えばsiRNAおよびDsiRNA)の分解である。3’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する第一ヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドの3’−末端の改変が、分解を防止するために重要である(Eder et al.,1991,Antisense Res Dev,1:141−151)。RNase−Tファミリーヌクレアーゼは同定され、siRNAの制御および分解に関与する3’から5’エキソヌクレアーゼ活性を持つERI−1と呼ばれている(Kennedy et al.,2004,Nature 427:645−649;Hong et al.,2005,Biochem J,390:675−679)。この遺伝子はまた、マウスのThex1(NM_02067)またはヒトのTHEX1(NM_153332)として知られ、ヒストンmRNAの分解に関与し、またsiRNA中の3’−オーバーハングの分解を媒介するが、二本鎖RNAを分解しない(Yang et al.,2006,J Biol Chem,281:30447−30454)。したがって、本発明のDsiRNAを含む、dsRNAの3’−末端−安定化が安定性を改善すると予測することが合理的である。
二本鎖RNA(「dsRNA」)の効果を阻害する1つの主要な因子は、ヌクレアーゼによるdsRNA(例えばsiRNAおよびDsiRNA)の分解である。3’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する第一ヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドの3’−末端の改変が、分解を防止するために重要である(Eder et al.,1991,Antisense Res Dev,1:141−151)。RNase−Tファミリーヌクレアーゼは同定され、siRNAの制御および分解に関与する3’から5’エキソヌクレアーゼ活性を持つERI−1と呼ばれている(Kennedy et al.,2004,Nature 427:645−649;Hong et al.,2005,Biochem J,390:675−679)。この遺伝子はまた、マウスのThex1(NM_02067)またはヒトのTHEX1(NM_153332)として知られ、ヒストンmRNAの分解に関与し、またsiRNA中の3’−オーバーハングの分解を媒介するが、二本鎖RNAを分解しない(Yang et al.,2006,J Biol Chem,281:30447−30454)。したがって、本発明のDsiRNAを含む、dsRNAの3’−末端−安定化が安定性を改善すると予測することが合理的である。
XRN1(NM_019001)は、P−体中に存在し、miRNAによって標的化されたmRNAの分解に関与してきた5’から3’エキソヌクレアーゼであり(Rehwinkel et al.,2005,RNA 11:1640−1647)、またsiRNAによって指向されるような内部開裂によって開始される分解を完了するのに関与しうる。XRN2(NM_012255)は、核RNA処理に関与する異なる5’から3’エキソヌクレアーゼである。
RNase Aは、RNAを分解する哺乳類における主要なエンドヌクレアーゼ活性である。ssRNAに対して特異的であり、ピリミジン塩基の3’−末端で開裂する。RNase A開裂と一致するsiRNA分解産物は、血清中でのインキュベーション後、質量分析によって検出可能である(Turner et al.,2007,Mol Biosyst 3:43〜50)。3’−オーバーハングは、RNase分解に対するsiRNAの感受性を増強する。血清からのRNase Aの枯渇が、siRNAの分解を減少させ、この分解が配列優先傾向を見せ、末端上でポリA/U配列を持つ配列に対してより悪い(Haupenthal et al.,2006 Bichem Pharmacol 71:702−710)。このことは、二本鎖のより安定性の低い領域が、「呼吸をし」てもよく、RNase Aによる分解に対して利用可能な一時的な一本鎖種を提供することを示唆している。RNase A阻害剤を血清に加え、siRNA寿命および効力を改善することができる(Haupenthal et al.,2007,Int J.Cancer 121:206−210)。
21マー中、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェート改変が、ヌクレオチド内リン酸結合を直接安定化させる。ボラノホスフェート改変RNAは、ヌクレアーゼ耐性が高く、サイレンシング剤として強力であり、比較的無毒性である。ボラノホスフェート改変RNAは、標準的な化学合成方法を用いて製造できず、代わりにin vitro転写(IVT)によって作製される(Hall et al.,2004,Nucleic Acids Res 32:5991−6000;Hall et al.,2006,Nucleic Acids Res 34:2773−2781)。ホスホロチオエート(PS)改変は、任意の所望の位置で、RNA二本鎖中容易に配置可能であり、標準的な化学合成方法を用いて作製可能である。PS改変は、用量依存毒性を示し、それにより、ほとんどの研究者は、siRNA内への限定した組み込みを推奨し、ここでヌクレアーゼからの保護が最も重要な3’−末端が好まれる(Harborth et al.,2003,Antisense Nucleic Acid Drug Dev 13:83−105;Chiu and Rana,2003,Mol Cell 10:549−561; Braasch et al.,2003,Biochemistry 42:7967−7975; Amarzguioui et al.,2003,Nucleic Acids Research 31:589−595)。より広範囲のPS改変が、強力なRNAi活性と互換可能であるが、しかし(2’−O−メチルRNAのような)糖改変の利用がよりすぐれている可能性がある(Choung et al.,2006,Biochem Biophys Res Commun 342:919−927)。
種々の置換基を、一般的に二本鎖安定性(Tm)を増大させ、ヌクレアーゼ耐性を大きく改善できるリボースの2’−位置に配置可能である。2’−O−メチルRNAは、哺乳類リボソームRNAおよび転写RNAにて見られる、天然に存在する改変である。siRNA中の2’−O−メチル改変は公知であるが、二本鎖内の改変塩基の精確な位置が、効力を保つために重要であり、RNAに対する2’−O−メチルRNAの完全な置換は、siRNAを不活性化する。例えば、交互2’−O−メチル塩基を使用するパターンは、改変されていないRNAと等価の効力を有することができ、血清中極めて安定である(Choung et al.,2006,Biochem Biophys Res Commun 342:919−927;Czauderna et al.,2003,Nucleic Acids Research 31:2705−2716)。
2’−フルオロ(2’−F)改変はまた、dsRNA(例えばsiRNAおよびDsiRNA)機能と互換可能であり、(試薬コストおよび利用可能性のため)最も一般的にはピリジン部位に位置し、プリン位置にて2’−O−メチル改変と組み合わせ可能であり、2’−Fプリンが利用でき、使用可能である。この種類の非常に改変された二本鎖は、in vitroにて、RNAiの強力なトリガーでありえ(Allerson et al.,2005,J Med Chem 48:901−904;Prakash et al.,2005,J Med Chem 48:4247−4253;Kraynack and Baker,2006,RNA 12:163−176)、in vivoで使用した時に、活性の性能を改善し、持続期間を延長できる(Morrissey et al.,2005,Hepatology 41: 1349−1356;Morrissey et al.,2005,Nat Biotechnol 23:1002−1007)。非常に強力で、ヌクレアーゼ安定である、交互2’−Fおよび2’−O−Me塩基を含む平滑19マーの二本鎖が、Alleronによって教示された。このデザインにおいて、交互2’−O−Me残基は、Czaudernaによって使用されたものと同一のパターンで配置されるが、残りのRNA残基は2’−F改変塩基に変換される。Morrisseyによって使用された、非常に強力な、ヌクレアーゼ耐性のsiRNAは、in vivoにおいて、非常に強力な、ヌクレアーゼ耐性siRNAを使用した。2’−O−Me RNAおよび2’−F RNAに加えて、この二本鎖は、DNA、RNA、逆脱塩基残基、および3’−末端PSヌクレオシド内結合を含む。広範囲の改変は、特定の利点を持つ一方で、より限定される二本鎖の改変もまた、in vivoで性能を改善し、製造がより単純で、よりコストがかからなくすることができる。Soutschekら(2004, Nature 432:173−178)は、in vivoで二本鎖を使用し、主に2つの2’−O−Me RNA塩基および限定された3’−末端PSヌクレオシド内結合を持つRNAであった。
ロック核酸(LNA)は、dsRNA(例えばsiRNAおよびDsiRNA)を安定させるために使用可能な異なる種類の2’−改変である。効力を維持するLNA組み込みのパターンは、2’−O−メチルまたは2’−F−塩基よりも制限され、このように限定された改変が好ましい(Braasch et al.,2003,Biochemistry 42:7967−7975;Grunweller et al.,2003, Nucleic Acids Res 31:3185−3193;Elmen et al.,2005,Nucleic Acids Res 33:439−447)。限定された組み込みでさえ、LNA改変の利用は、in vivoにてdsRNAの性能を改善可能であり、標的効果特性を変えるか、または改善し得る(Mook et al.,2007,Mol Cancer Ther 6:833−843)。
細胞内または生動物内に導入された合成核酸は、「外来」として認識され、免疫応答を引き起こしうる。免疫刺激は、劇的に実験結果を変化させ、細胞死を導きさえする的外れな効果の主な種類を構成する。生来の免疫システムには、これらの応答を媒介するDNAおよびRNAと特異的に相互作用する受容体分子の集合が含まれ、その幾つかは、細胞質内に局在し、その幾つかはエンドソーム内に存在する(Marques and Williams,2005,Nat Biotechnol 23:1399−1405;Schlee et al.,2006,Mol Ther 14:463−470)。カチオン性脂質またはリポソームによるsiRNAの伝達は、siRNAを、細胞質およびエンドソームセグメントの両方へ曝露させ、in vitroおよびin vivo両方で、1型インターフェロン(IFN)応答を引き起こすリスクを最大化する(Morrissey et al.,2005,Nat Biotechnol 23:1002−1007;Sioud and Sorensen,2003,Biochem Biophys Res Commun 312:1220−1225;Sioud,2005,J Mol Biol 348:1079−1090;Ma et al.,2005,Biochem Biophys Res Commun 330: 755−759)。細胞内に転写されたRNAは免疫原性が少なく(Robbins et al.,2006 Nat Biotechnl 24:566−571)、脂質に基づく方法を用いて伝達した時に免疫原性である合成RNAは、in vivoでさえ、機械的方法によって細胞内に導入された時の免疫刺激を回避する可能性がある(Heidel et al.,2004,Nat Biotechnol 22: 1579−1582)。しかしながら、脂質に基づく伝達方法は一般的でかつ効果的であり、広く使用される。とりわけ、全ての細胞型が存在し、免疫応答が産出されるリスクが最も高いin vivo適用に対して、免疫応答を防止するためのいくつかの一般的な戦略が必要である。化学的に改変したRNAの利用が、これらの問題のほとんどまたはすべてを解決しうる。
特定の実施形態では、改変がMYC阻害活性を有することからdsRNA剤を阻害しない限り、改変を本発明の抗MYC dsRNA剤中に含めることができる。1つの実施形態では、1つ以上の改変が、DsiRNA剤のDicer処理を増強するように実施される(DsiRNAのDicer処理を判定するためのアッセイが本明細書中他の部分に記されている)。第2の実施形態では、1つ以上の改変が、より効果的なMYC阻害をもたらすように作製される(本明細書で記述したように、dsRNAのMYC阻害/MYC阻害活性は、RNAレベルを判定、またはMYCポリペプチドレベルを判定するための本技術分野で認識されている方法を介してアッセイ可能であり、このようなレベルは、たとえばMYC mRNAレベルの評価の代わりに、またはこの評価に加えて評価されるべきである)。第3の実施形態では、1以上の改変が、より大きなMYC阻害活性を支持するように作製される(MYC阻害活性を判定する方法は上記されている)。第4の実施形態では、1つ以上の改変が、細胞に伝達されるべき各dsRNA剤分子あたりのMYC阻害活性のより強力な効力をもたらすように作製される(MYC阻害活性の効力は上記されている)。改変は、配列内の3’−末端領域、5’−末端領域にて、3’−末端領域と5’−末端領域両方にて、または例えば種々の位置に組み込むことができる。上述の限定を考慮して、改変の数および組み合わせをdsRNA剤内に組み込むことが可能である。多数の改変が存在する場合、それらは同一であるか、または異なってもよい。塩基、糖部位、リン酸骨格およびそれらの組み合わせに対する改変が考慮される。いずれかの5’−末端がリン酸化可能である。
リン酸骨格に関して考慮される改変の例には、メチルホスホネート、ホスホロチオエートを含むホスホン酸塩、およびアルキルホスホトリエステルのようなホスホトリエステル改変などを含むリン酸塩が含まれる。糖部位に関して考慮される改変の例には、2’−O−メチルのような2’−アルキルピリミジン、2’−フルオロ、アミノおよびデオキシ改変などが含まれる(例えば、Amarzguioui et al.,2003,Nucleic Acids Research 31:589−595を参照のこと)。塩基に関して考慮される改変の例には、脱塩基糖、2−O−アルキル改変ピリミジン類、4−チオウラシル、5−ブロモウラシル、5−ヨードウラシルおよび5−(3−アミノアリル)−ウラシルなどが含まれる。ロック核酸またはLNA’sも組み込むことが可能である。多くの他の改変が公知であり、上記の基準を満たす限り使用可能である。改変の例はまた、米国特許題5,684,143号、第5,858,988号および第6,291,438号、および米国特許公開公報第2004/0203145 A1号に開示されている。他の改変は、Herdewijn (2000, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10:297−310),Eckstein(2000,Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10:117−21)、Rusckowski et al.(2000,Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10:333−345)、Stein et al.(2001,Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11:317−25)、Vorobjev et al.(2001,Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11:77−85)にて開示されている。
考慮される1つ以上の改変をいずれかの鎖の中に組み込むことが可能である。dsRNA剤中の改変の位置は、より強力な効力および安定性の授与、毒性の低減、Dicer処理の増強および免疫応答の最小化を含む、dsRNA剤の特徴に大きく影響を与えることができる。1つの実施形態では、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖、または両方の鎖が、1つ以上の2’−O−メチル改変ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、2’−O−メチル改変ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、2’−O−メチル改変ヌクレオチドからなる3’オーバーハングを含む。アンチセンス鎖はまた、さらなる2’−O−メチル改変ヌクレオチドを含むことができる。
特定の実施形態では、本発明の抗−MYC DsiRNA剤は、Dicerによるその処理を増強する種々の特徴を持つ。このような実施形態にしたがって、DsiRNA剤は、siRNAを産出するためにDicerにより処理され、以下の特徴の少なくとも1つを有すように十分な長さを持つ。(i)DsiRNA剤は非対称であり、例えばセンス鎖上に3’オーバーハングを持つ、および(ii)DsiRNA剤は、活性siRNAへのdsRNAのDicer結合と処理の方向を指向するために、アンチセンス鎖上に改変3’末端を持つ。これらの実施形態にしたがって、DsiRNA剤において最も長い鎖は、25〜30ヌクレオチドを含む。1つの実施形態では、センス鎖は25〜30ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は25〜28ヌクレオチドを含む。したがって、得られるdsRNAは、センス鎖の3’末端上にオーバーハングを持つ。オーバーハングは、2ヌクレオチドのような、1〜4ヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、5’リン酸を有していてもよい。
特定の実施形態では、DsiRNA剤のセンス鎖を、センス鎖の3’末端に位置する好適な修飾因子によるDicer処理のために改変し、すなわちDsiRNA剤が、Dicer結合および処理の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド類、および蛍光分子などのような立体的に込み入った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、dNMP中に通常存在する2’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに、2−ヒドロキシエトキシメチル基を用いる。他のヌクレオチド修飾因子には、3’−デオキシアデノシン(コルジセピン)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデヒドロ‐2´,3‐ジデオキシイノシン(ddI)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)、2’,3’− ジデヒドロ‐2´,3‐ジデオキシチミジン(d4T)、ならびに3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデヒドロ‐2´,3‐ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)および2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)の一リン酸ヌクレオチドが含まれうる。1つの実施形態では、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、1〜3ヌクレオチド修飾因子、または2ヌクレオチド修飾因子を、センス鎖の3’末端上のリボヌクレオチドの代わりに使用する。立体的に込み入った分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の3’末端にてリボヌクレオチドに付着する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みに伴って変化するものではない。別の実施形態では、本発明は、Dicer処理の方向を指向するために、dsRNA剤中の2つのDNA塩基を置換することを考慮する。さらなる本発明において、アンチセンス鎖の5´末端およびセンス鎖の3´末端上の二本鎖の平滑末端を形成する2つのリボヌクレオチドの代わりに、2つの末端のDNA塩基を、センス鎖の3´末端上に配置し、2ヌクレオチドRNAオーバーハングをアンチセンス鎖の3’末端上に配置する。これは、平滑末端上にDNA、オーバーハング末端上にRNA塩基を持つ、非対称組成物である。
特定の他の実施形態では、DsiRNA剤のアンチセンス鎖を、アンチセンス鎖の3’末端に位置する好適な修飾因子によりDicer処理のために改変し、すなわちDsiRNA剤が、Dicer結合および処理の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド類、および蛍光分子などのような立体的に込み入った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、dNMP中に通常存在する2’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに、2−ヒドロキシエトキシメチル基を使用する。他のヌクレオチド修飾因子には、3’−デオキシアデノシン(コルジセピン)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシイノシン(ddI)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)、2’,3’−デヒドロ2´,3−ジデオキシチミジン(d4T)、ならびに3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)および2’、3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)の一リン酸ヌクレオチドが含まれうる。1つの実施形態では、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、1〜3ヌクレオチド修飾因子、または2ヌクレオチド修飾因子を、アンチセンス鎖の3’末端上のリボヌクレオチドの代わりに使用する。立体的に込み入った分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の3’末端にてリボヌクレオチドに付着する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みに伴い変化するものではない。別の実施形態では、本発明は、Dicer処理の方向を指向するために、dsRNA剤中の2つのDNA塩基を置換することを考慮する。さらなる発明において、2つの末端DNA塩基を、センス鎖の5’末端とアンチセンス鎖の3’末端上で、二本鎖の平滑末端を形成している2つのリボヌクレオチドの代わりにアンチセンス鎖の3’−末端上に配置し、2ヌクレオチドRNAオーバーハングをセンス鎖の3’末端上に配置する。これはまた、平滑末端上にDNA、オーバーハング末端上にRNA塩基を持つ、非対称組成物である。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件のような、生物学的条件下でアニールする。さらに、dsRNA剤の、とりわけアンチセンス鎖の、1つの配列の一領域が、少なくとも19ヌクレオチドの配列長を持ち、ここでこれらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3’末端に隣接し、標的MYC RNAのヌクレオチド配列に十分に相補的である。
さらに、DsiRNA剤の構造は、Dicerの開裂から産出されるオリゴヌクレオチドセグメントが、遺伝子発現を阻害することにおいて最も効果的であるオリゴヌクレオチドの一部であることを確かにするために最適化することができる。例えば、本発明の1つの実施形態では、DsiRNA剤構造の27−bpオリゴヌクレオチドが合成され、ここで遺伝子発現を阻害する21〜22−bpセグメントが、アンチセンス鎖の3’末端上に局在することが予想される。アンチセンス鎖の5’−末端上に局在する残りの塩基は、Dicerによって開裂され、廃棄される。この開裂された部分は均一であるか(すなわち標的配列の配列に基づく)、または不均一であり、核酸鎖を伸長するために添加される。
米国特許出願公開第2007/0265220号は、27マーDsiRNAが、化学改変がない場合でさえ、対応する21マーsiRNA組成物に対して、血清中での改善された安定性を示したことを開示している。5’リン酸塩の添加と組み合わせた時に、上述のようなパターンで、アンチセンス鎖中の2’−O−メチルRNAの包含のような、DsiRNAの改変が、DsiRNA剤の安定性を改善できる。合成RNA二本鎖中のすべての鎖への5’−リン酸塩の添加が、ある程度限定したヌクレアーゼ安定性を与えるための、高額でない、生理学的方法であってもよい。
本発明のdsRNA剤の化学改変パターンは、このような薬剤の有効性を増強するためにデザインする。したがってこのような改変は、dsRNA剤の効力の低下を避けるため、DsiRNA剤のDicer処理との干渉を避けるため、dsRNA剤の生物学的流体中の安定性を改善するため(ヌクレアーゼ感受性を低減させるため)、または自然免疫系による検出を阻害もしくは回避するためにデザインされる。このような改変はまた、毒性であることを避けるため、かつ本発明の即時dsRNA剤の製造コストの上昇を避けるため、またはその簡便さに影響を与えるためにもデザインされる。
本発明の特定の実施形態では、抗−MYC DsiRNA剤は、以下のうち1つ以上の特徴を持つ。(i)DsiRNA剤は非対称であり、例えばアンチセンス鎖上に3’オーバーハングを持つ、および(ii)DsiRNA剤は、活性siRNAへのdsRNAのDicer結合と処理の方向を指向するために、センス鎖上に改変3’末端を持つ。本実施形態にしたがって、dsRNAにおける最も長い鎖は、25〜35ヌクレオチド(例えば25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35ヌクレオチド)を含む。特定のこのような実施形態では、DsiRNA剤は、センス鎖が25〜34ヌクレオチドを含み、センス鎖の3’末端が、アンチセンス鎖の5’末端と平滑末端を形成し、一方アンチセンス鎖が26〜35ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖の3’末端上にオーバーハングを形成するように非対称である。1つの実施形態では、DsiRNA剤は、センス鎖が25〜28ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が25〜30ヌクレオチドを含むように非対称である。したがって、得られたdsRNAは、アンチセンス鎖の3’末端上にオーバーハングを持つ。オーバーハングは、1〜4ヌクレオチド、例えば2ヌクレオチドである。センス鎖はまた5’リン酸塩を有してもよい。
DsiRNA剤はまた、以下のうち1つ以上の特徴をさらに持つことができる。(a)アンチセンス鎖は、典型的21マーから右シフトを持つ(例えば、DsiRNAは、DsiRNA内の推定Dicer開裂部位の5’まで伸長するアンチセンス鎖ヌクレオチド長を含み、このようなアンチセンス鎖ヌクレオチドは、センス鎖中の推定Dicer開裂の3’を伸長しているセンス鎖の対応するヌクレオチドと塩基対を形成する)、(b)鎖は、完全に相補的でなくてよく、すなわちこの鎖は、単一のミスマッチ塩基対を含んでよい(ミスマッチ塩基対を有するDsiRNAのMYC阻害活性が、十分なレベルで維持される(例えばミスマッチ塩基対を有しない対応するDsiRNAと比較して、少なくとも50%以上のMYC阻害活性、少なくとも60%以上のMYC阻害活性、少なくとも70%以上のMYC阻害活性、少なくとも80%以上のMYC阻害活性、少なくとも90%以上のMYC阻害活性または少なくとも95%以上のMYC阻害活性を維持する)という条件で、特定の実施形態では、本発明のDsiRNAは、1、2、3、4または5以上のミスマッチ塩基対を有する。特定の実施形態では、ミスマッチ塩基対は、DsiRNAのアンチセンス鎖とセンス鎖との間に存在する。いくつかの実施形態では、ミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖と標的RNAとの間に存在する(または存在すると予想される)。特定の実施形態では、アンチセンス鎖残基と、想定Ago2開裂部位の標的RNA配列中3’に局在する標的RNA内の対応する残基との間でのミスマッチ塩基対の存在が維持され、本発明のDsiRNAのMYC阻害活性を増強さえしてもよい)、(c)ロック核酸のような塩基改変が、センス鎖の5’末端に含まれてよい。「典型的」21マーsiRNAは、従来の技術を用いてデザインされる。1つの技術において、種々の部位が、並行して、または試薬の1つが効果的であるという希望とともに、同一の標的に特異的な種々の異なるsiRNA二本鎖を含むプール中で一般に試験される(Ji et al.,2003,FEBS Lett 552:247−252)。他の技術は、活性RNAiエフェクター分子を得る可能性を上げるためのデザインルールおよびアルゴリズムを使用する(Schwarz et al.,2003,Cell 115:199−208;Khvorova et al.,2003,Cell 115: 209−216;Ui−Tei et al.,2004,Nucleic Acids Res 32:936−948;Reynolds et al.,2004,Nat Biotechnol 22:326−330;Krol et al.,2004,J Biol Chem 279:42230−42239;Yuan et al.,2004,Nucl Acids Res 32(ウェブ発行):W130−134;Boese et al.,2005,Methods Enzymol 392:73−96)。siRNAのハイスループット選別もまた開発されてきた(米国特許公開公報第2005.0042641 A1号)。潜在的標的部位をまた、二次構造予測によって解析できる(Heale et al.,2005,Nucleic Acids Res 33(3): e30)。ついで、この21マーを使用して右シフトをデザインし、21マーの5’末端上に3〜9のさらなるヌクレオチドを含める。これらのさらなるヌクレオチドの配列は制限されない。1つの実施形態では、追加したリボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づく。本実施形態においてさえ、標的配列とアンチセンスsiRNAとの間の完全な相補性は必要とされるものではない。
本発明のDsiRNA剤の第1および第2のオリゴヌクレオチドは、完全な相補性を必要とするものではない。これらは、生物学的条件下でアニールすし、かつ標的配列に対して十分に相補的なsiRNAを産出するDicerに対する基質を提供するために十分に相補的であることのみが必要である。ロック核酸またはLNA’sは当業者によく公知である(Elmen et al.,2005,Nucleic Acids Res 33:439−447;Kurreck et al.,2002,Nucleic Acids Res 30:1911−1918;Crinelli et al.,2002,Nucleic Acids Res 30:2435−2443;Braasch and Corey, 2001,Chem Biol 8:1−7;Bondensgaard et al., 2000,Chemistry 6:2687−2695;Wahlestedt et al.,2000,Proc Natl Acad Sci USA 97:5633−5638)。1つの実施形態では、LNAをセンス鎖の5’末端に組み込む。別の実施形態では、LNAを、アンチセンス鎖上に3’オーバーハングを含むようにデザインされた二本鎖中のセンス鎖の5’末端に組み込む。
特定の実施形態では、本発明のDsiRNA剤は、25−塩基対長を持つセンス鎖と、2塩基3’−オーバーハングを持つ27−塩基対長を持つアンチセンス鎖の非対称構造を持つ。他の実施形態では、非対称構造を持つこのDsiRNA剤はさらに、2つのリボヌクレオチドの代わりに、センス鎖の3’末端にて2−デオキシヌクレオチドを含む。
2つの別々のオリゴヌクレオチドを含む、特定のDsiRNA剤組成物は、三次構造によって連結可能である。三次構造は、DsiRNA剤上のDicer活性を阻害せず、標的遺伝子から転写されたRNAの指向された崩壊と干渉するものではない。1つの実施形態では、三次構造は、化学結合基であってよい。多くの好適な化学結合基が本技術分野で公知であり、使用可能である。あるいは、三次構造は、ヘアピン構造が、dsRNA組成物を作製している2つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際して産出されるような様式で、DsiRNA剤の2つのオリゴヌクレオチドを結合させるオリゴヌクレオチドであってよい。ヘアピン構造は、DsiRNA剤上のDicer活性を阻害せず、MYC RNAの指向された崩壊と干渉しない。
MYC cDNAおよびポリペプチド配列
知られているヒトおよびマウスのMYC cDNAは、以下の:ヒトMYC NM_002467.4および対応するヒトMYCポリペプチドヒト配列GenBank寄託番号第NP_002458.2号;およびマウス野生型MYC配列GenBank寄託番号第NM_010849.4号(マウス 筋肉、C57BL/6 MYC転写物、変異体1)および対応するマウスMYCポリペプチド配列GenBank寄託番号第NP_034979.3号を含む。
知られているヒトおよびマウスのMYC cDNAは、以下の:ヒトMYC NM_002467.4および対応するヒトMYCポリペプチドヒト配列GenBank寄託番号第NP_002458.2号;およびマウス野生型MYC配列GenBank寄託番号第NM_010849.4号(マウス 筋肉、C57BL/6 MYC転写物、変異体1)および対応するマウスMYCポリペプチド配列GenBank寄託番号第NP_034979.3号を含む。
dsRNA MYC阻害活性を評価するためのin vitroアッセイ
無細胞系でのRNAiを繰り返すin vitroアッセイを使用して、MYC RNA配列(類)を標的化しているdsRNA構築物を評価し、したがって、dsRNAのMYC特異的遺伝子阻害活性(また本明細書中でMYC阻害活性を指す)を評価できる。このアッセイには、MYC RNAに対して指向したdsRNA(たとえばDsiRNA)剤との利用に適合した、Tushl et al.,1999,Genes and Development,13,3191−3197およびZamore et al.,2000,Cell,101,25−33によって記述されたシステムが含まれる。合胞体胚盤葉由来のDrosophila抽出物を、in vitroにてRNAi活性を再構築するために使用する。標的RNAは、T7 RNAポリメラーゼを用いる選択されたMYC発現プラスミドからのin vitro転写を介して、または化学合成を介して産出される。センスおよびアンチセンスのdsRNA鎖(例えば各20μM)を、90℃で1分間、ついで37℃で1時間(100mM酢酸カリウム、30mM HEPES−KOH、pH7.4、2mM酢酸マグネシウムのような)緩衝液中でのインキュベーションによってアニールし、ついで溶解緩衝液(例えば100mM 酢酸カリウム、pH7.4での30mM HEPES−KOH、2mM酢酸マグネシウム)中で希釈する。アニーリングをTBE緩衝液中アガロースゲル上のゲル電気泳動によってモニタし、臭化エチジウムで染色できる。Drosophila溶解物を、脱塩素化し、溶解した酵母糖蜜寒天上で回収したOregon Rハエ由来の0〜2時間齢胚を用いて調製する。溶解物を遠心し、上清を単離する。本アッセイには、50%溶解物[vol/vol]、RNA(10〜50pM最終濃度)、およびdsRNA(10nM最終濃度)を含む10%[vol/vol]溶解緩衝液を含む反応混合物が含まれる。反応混合液はまた、10mM リン酸クレアチン、10ug/mlクレアチンホスホキナーゼ、100um GTP、100uM UTP、100uM CTP、500uM ATP、5mM DTT、0.1U/μL RNasin(Promega)および100uMの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度を100mMに調節する。反応を氷上でプレアセンブルし、RNA添加する前に10分間、25℃にてプレインキュベートし、25℃にてさらに60分間インキュベートする。反応を4容量の1.25×Passive Lysis Buffer(Promega)で反応停止する。標的RNA開裂をRT−PCR解析または本技術分野で公知の他の方法によってアッセイし、dsRNAが反応より除外された対照反応と比較する。
無細胞系でのRNAiを繰り返すin vitroアッセイを使用して、MYC RNA配列(類)を標的化しているdsRNA構築物を評価し、したがって、dsRNAのMYC特異的遺伝子阻害活性(また本明細書中でMYC阻害活性を指す)を評価できる。このアッセイには、MYC RNAに対して指向したdsRNA(たとえばDsiRNA)剤との利用に適合した、Tushl et al.,1999,Genes and Development,13,3191−3197およびZamore et al.,2000,Cell,101,25−33によって記述されたシステムが含まれる。合胞体胚盤葉由来のDrosophila抽出物を、in vitroにてRNAi活性を再構築するために使用する。標的RNAは、T7 RNAポリメラーゼを用いる選択されたMYC発現プラスミドからのin vitro転写を介して、または化学合成を介して産出される。センスおよびアンチセンスのdsRNA鎖(例えば各20μM)を、90℃で1分間、ついで37℃で1時間(100mM酢酸カリウム、30mM HEPES−KOH、pH7.4、2mM酢酸マグネシウムのような)緩衝液中でのインキュベーションによってアニールし、ついで溶解緩衝液(例えば100mM 酢酸カリウム、pH7.4での30mM HEPES−KOH、2mM酢酸マグネシウム)中で希釈する。アニーリングをTBE緩衝液中アガロースゲル上のゲル電気泳動によってモニタし、臭化エチジウムで染色できる。Drosophila溶解物を、脱塩素化し、溶解した酵母糖蜜寒天上で回収したOregon Rハエ由来の0〜2時間齢胚を用いて調製する。溶解物を遠心し、上清を単離する。本アッセイには、50%溶解物[vol/vol]、RNA(10〜50pM最終濃度)、およびdsRNA(10nM最終濃度)を含む10%[vol/vol]溶解緩衝液を含む反応混合物が含まれる。反応混合液はまた、10mM リン酸クレアチン、10ug/mlクレアチンホスホキナーゼ、100um GTP、100uM UTP、100uM CTP、500uM ATP、5mM DTT、0.1U/μL RNasin(Promega)および100uMの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度を100mMに調節する。反応を氷上でプレアセンブルし、RNA添加する前に10分間、25℃にてプレインキュベートし、25℃にてさらに60分間インキュベートする。反応を4容量の1.25×Passive Lysis Buffer(Promega)で反応停止する。標的RNA開裂をRT−PCR解析または本技術分野で公知の他の方法によってアッセイし、dsRNAが反応より除外された対照反応と比較する。
あるいは、アッセイのために内部標識した標的RNAを、[α−32P]CTPの存在下、in vitro転写によって調製し、スピンクロマトグラフィーによるG50Sephadexカラムを通し、さらに精製することなく標的RNAとして使用する。任意に、標的RNAを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて、5’−32P−末端標識する。アッセイを、上記のように実施し、標的RNAとRNAiによって産出される特定のRNA開裂産物を、ゲルのオートラジオグラフィー上で可視化する。開裂の割合を、未処置の対照RNAまたはdsRNAなしの対照反応由来のRNA、およびアッセイによって産出された開裂産物を表すバンドのPHOSPHOR IMAGER(登録商標)(オートラジオグラフィー)定量によって決定する。
1つの実施形態において、本アッセイを、dsRNA媒介RNAi開裂に対するMYC RNA標的中の標的部位を決定するために使用し、ここで複数のdsRNA構築物を、例えば標識化標的RNAの電気泳動またはノザンブロットによって、ならびに本技術分野でよく知られている他の方法論によってアッセイ反応を解析することで、MYC RNA標的のRNAi媒介開裂に関してスクリーニングする。
特定の実施形態では、好適な対照に対して、例えばMYCレベルにおける50%減少が系、細胞、組織または生命体にて観察された場合、本発明のdsRNAはMYC阻害活性を持つと見なされる。本発明のdsRNAのMYC阻害活性の決定に対するさらなる境界(mets andbounds)は上に記載されている。
抗−MYC dsRNA剤の共役と伝達
特定の実施形態では、本発明は、MYC−関連疾患もしくは障害、またはMYC−関連疾患もしくは障害を発症させるリスクを持つ対象を治療する方法に関する。このような実施形態では、dsRNAは、MYC−関連疾患または障害を制御するための新規治療薬剤として働きうる。本方法は、本発明の薬学的組成物を患者(例えばヒト)に投与し、それによって、MYC RNAの発現、レベルおよび/または活性が低減することを含む。MYC RNAによってコードされたポリペプチドの発現、レベルおよび/または活性はまた、dsRNAがMYC転写産物の非コード領域に対して指向する場合(例えば標的化5’UTRまたは3’UTR配列)でさえ、本発明のdsRNAによって低減してもよい。これらの高い特異性のために、本発明のdsRNAは、任意に多型対立遺伝子が個々および/または集団内で存在する対立遺伝子特異的様式にて、細胞および組織のMYC配列を特に標的化できる。
特定の実施形態では、本発明は、MYC−関連疾患もしくは障害、またはMYC−関連疾患もしくは障害を発症させるリスクを持つ対象を治療する方法に関する。このような実施形態では、dsRNAは、MYC−関連疾患または障害を制御するための新規治療薬剤として働きうる。本方法は、本発明の薬学的組成物を患者(例えばヒト)に投与し、それによって、MYC RNAの発現、レベルおよび/または活性が低減することを含む。MYC RNAによってコードされたポリペプチドの発現、レベルおよび/または活性はまた、dsRNAがMYC転写産物の非コード領域に対して指向する場合(例えば標的化5’UTRまたは3’UTR配列)でさえ、本発明のdsRNAによって低減してもよい。これらの高い特異性のために、本発明のdsRNAは、任意に多型対立遺伝子が個々および/または集団内で存在する対立遺伝子特異的様式にて、細胞および組織のMYC配列を特に標的化できる。
MYC−関連疾患または障害の治療において、dsRNAを、対象の細胞または組織、たとえば、MYCの脱制御を示し、かつ/またはMYCレベルの低減のために標的化された対象の細胞または組織との接触に持ち込むことが可能である。例えば、MYC RNA配列の全てまたは一部と実質的に同一のdsRNAを、in vivoまたはin vitroいずれかで、このような細胞との接触に持ち込むか、またはこのような細胞内へ導入してよい。同様に、MYC RNA配列のすべてまたは一部と実質的に同一のdsRNAを、MYC−関連疾患または障害を持つ、または発症させるリスクのある対象に直接投与してよい。
本発明のdsRNA剤の治療的利用は、多数の異なるdsRNA剤配列を含むdsRNA剤の製剤の利用を含みうる。例えば、2以上、3以上、4以上、5以上などの本明細書で記述した薬剤を、例えばMYC RNAの多数の異なる領域を標的とする、または標的MYC RNAだけでなく、例えばMYC−関連疾患または障害と関連した細胞性標的遺伝子といった標的をも標的とする製剤を産出するように組み合わせることができる。本発明のdsRNA剤をまた、dsRNA剤のいずれかの鎖が、2以上のMYC RNAの領域を独立して標的するように、またはdsRNA剤の鎖の1つが、本技術分野で公知のMYCの細胞性標的遺伝子を標的とするように構築してもよい。
標的核酸分子の1超の領域を標的とする多機能dsRNA分子の利用がまた、MYC RNAレベルおよび発現の強力な阻害を提供できる。例えば、本発明の単一多機能dsRNA構築物が、MYC−1916とMYC−1572の部位両方を同時に標的とすることができ、さらにおよび/またはあるいは、本発明の単一または多機能薬剤を、他に対して、MYCの1つのスプライスバリアントを選択的に標的とするためにデザインできる。
したがって、本発明のdsRNA剤は個々に、または他の薬剤との組み合わせまたは併せて、MYC−関連疾病または障害を治療、阻害、低減または予防するために使用できる。例えば、dsRNA分子を、治療に好適な条件下、単独で、または1つ以上の薬剤との組み合わせで、対象に投与可能であり、当業者にとって明白な他の適切な細胞に投与可能である。
dsRNA分子をまた、対象または生体中のMYC−関連疾患または障害を治療する、阻害、低減または予防するための他の公知の治療との組み合わせて使用できる。例えば、記述した分子を、本技術分野で公知のように、対象または生体内のMYC−関連疾患または障害を治療、阻害、低減または予防するために、1つ以上の公知の化合物、治療または手順と組み合わせて使用できる。
本発明のdsRNA剤は、他の部位(例えばペプチドのような非核酸部位)、有機化合物(例えば染料、コレステロールなど)と(例えばそのセンス鎖またはアンチセンス鎖のその5’または3’末端で)共役可能であり、または共役していなくてよい。この方法でdsRNA剤を改変することは、対応する非共役dsRNA剤と比較して細胞取込を改善し、得られるdsRNA剤誘導体の細胞標的化活性を増強してよく、細胞内のdsRNA剤誘導体をトレースするために有用であり、または対応する非共役dsRNA剤と比較してdsRNA剤誘導体の安定性を改善する。
核酸、ベクターおよび宿主細胞を導入する方法
本発明のdsRNA剤を、直接細胞に(すなわち細胞内に)導入してよく、または空洞、間質腔内、生命体の循環中に細胞外で導入してよく、経口で導入してよく、または核酸を含む溶液で細胞または生命体を浴させることによって導入してよい。血管または血管外の循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液が、核酸を導入してよい部位である。
本発明のdsRNA剤を、直接細胞に(すなわち細胞内に)導入してよく、または空洞、間質腔内、生命体の循環中に細胞外で導入してよく、経口で導入してよく、または核酸を含む溶液で細胞または生命体を浴させることによって導入してよい。血管または血管外の循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液が、核酸を導入してよい部位である。
本発明のdsRNA剤を、核酸を含む溶液の注射、核酸によって覆われた粒子の照射、核酸溶液中の細胞または生命体の浸漬、または核酸の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む、本技術分野で公知の核酸伝達方法を用いて導入可能である。脂質媒介担体伝達、化学媒介伝達、リン酸カルシウムのようなカチオン性リポソームトランスフェクションなどのような核酸を細胞に導入するための本技術分野で公知の他の方法を使用してよい。核酸を、以下の、細胞による核酸取込を増強する、または標的MYC RNAの阻害を増加させる、といった活性の1つ以上を実施する他の成分と一緒に導入してよい。
標的MYC RNAを持つ細胞は、生殖系または体性、分化全能性または多能性、分裂または非分裂、柔組織または上皮、不死化または形質導入した系などが由来であってよい。細胞は、幹細胞または分化細胞であってよい。分化した細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、コンドロサイト、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、内分泌または外分泌腺の細胞が含まれる。
特定の標的MYC RNA配列と、伝達されたdsRNA剤物質の用量に依存して、本工程は、MYC RNAに対しての部分的または完全な機能の欠損を提供しうる。標的細胞の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%以上でのRNAレベルまたは発現(MYC RNA発現またはコードされたポリペプチド発現のいずれか)の減少または欠損が例として挙げられる。MYC RNAレベルまたは発現の阻害は、MYC RNAまたはMYC RNA−コードタンパク質のレベルの欠如(または観察可能な減少)を意味する。特異性は、細胞の他の遺伝子における明らかな効果なしに、MYC RNAを阻害する能力を意味する。この阻害の結果は、細胞または生命体の外部特性の試験によって、またはRNA溶液ハイブリッド形成、ヌクレアーゼ保護、ノザンハイブリッド形成、逆転写、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素免疫測定法(ELISA)、ウエスタンブロッティング、放射免疫アッセイ(RIA)、他の免疫アッセイ、および蛍光活性化細胞解析(FACS)のような生化学的技術によって確認可能である。本発明のdsRNA剤による標的MYC RNA配列の阻害は、in vivoまたはin vitroのいずれかで、MYC−関連疾患または障害の発症/進行、例えば腫瘍形成、増殖、転移などにおける、このようなdsRNA剤の投与の効果に基づいて測定可能でもある。腫瘍または癌細胞レベルの処置および/または減少には、腫瘍または癌細胞レベルの増殖の停止または減少、例えば10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%以上の減少が含まれ、かつ、対数の観点で測定可能であり、たとえば、細胞、組織または対象への本発明のdsRNA剤の投与を介して癌細胞レベルにおいて10倍、100倍、1000倍、105倍、106倍、107倍減少を達成できる。
細胞株または全生命体でのRNA媒介阻害では、そのタンパク質産物が容易にアッセイされる、レポーターまたは薬物耐性遺伝子の発現を測定できる。このようなレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)、アルカリホスファターゼ(AP)、βガラクトシダーゼ(LacZ)、ベータグルコロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)、ルシフェラーゼ(Luc)、ノパリンシンターゼ(NOS)、オクトパインシンターゼ(OCS)およびそれらの誘導体が含まれる。多数の選別可能なマーカーが利用可能であり、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノリシン、プロマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性を供与する。アッセイに応じて、遺伝子発現の量の定量化により、本発明にしたがって処理されない細胞と比較して、10%、33%、50%、90%、95%または99%超程度阻害を判定できる。
注射物質の用量が少なくなり、およびRNAサイレンシング薬剤の投与後の時間が長くなると、より小さな細胞画分における阻害がもたらされ得る(例えば少なくとも標的細胞の10%、20%、50%、75%、90%または95%)。細胞内での遺伝子発現の定量化は、標的MYC RNAの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルにて同様の量の阻害を示してもよい。例として、阻害の効果を、細胞内の遺伝子産物の量を評価することによって判定してもよく、RNAは、阻害dsRNAのために使用した領域の外側にヌクレオチド配列を持つハイブリッド形成プローブで検出してよく、または翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列に対して作製された抗体で検出してよい。
dsRNA剤は、少なくとも1つのコピー/細胞の伝達を許容する量で導入してよい。より大きな用量(例えば少なくとも5、10、100、500または1000コピー/細胞)の物質が、より効果的な阻害を産出してもよく、より低い用量がまた、特定の適用のために有用であってもよい。
MYCの生物学およびMYC標的化療法
MYC(c−MYC)は、プロト癌遺伝子であり、幅広い範囲のヒトの癌で過剰発現する。特異的に変異または過剰発現した場合、MYCは細胞増殖を増大させかつ癌遺伝子として機能する。MYC遺伝子は転写因子をコードしており、この転写因子はエンハンサーボックス配列(E−ボックス)上での結合およびヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)の動員を介して全ての遺伝子の15%の発現を調節する。MYCは、転写因子のMYCファミリーに属しており、N−MYCおよびL−MYC遺伝子をも含む。MYCファミリー転写因子はbHLH/LZ(塩基性ヘリックスループ−ヘリックスロイシンジッパー)ドメインを含む。Mycタンパク質は、そのbHLHドメインを介して、DNAに結合でき、一方でMycのロイシンジッパードメインは、パートナータンパク質、別のbHLH転写因子であるMax、との二量体化を可能とする。
MYC(c−MYC)は、プロト癌遺伝子であり、幅広い範囲のヒトの癌で過剰発現する。特異的に変異または過剰発現した場合、MYCは細胞増殖を増大させかつ癌遺伝子として機能する。MYC遺伝子は転写因子をコードしており、この転写因子はエンハンサーボックス配列(E−ボックス)上での結合およびヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)の動員を介して全ての遺伝子の15%の発現を調節する。MYCは、転写因子のMYCファミリーに属しており、N−MYCおよびL−MYC遺伝子をも含む。MYCファミリー転写因子はbHLH/LZ(塩基性ヘリックスループ−ヘリックスロイシンジッパー)ドメインを含む。Mycタンパク質は、そのbHLHドメインを介して、DNAに結合でき、一方でMycのロイシンジッパードメインは、パートナータンパク質、別のbHLH転写因子であるMax、との二量体化を可能とする。
MYC遺伝子は、当初はバーキットリンパ腫の患者中で同定され特徴付けられた。バーキットリンパ腫では、癌細胞は、多くの場合8番染色体を含む、染色体転座を示す。融合した染色体の切断点のクローニングにより、骨髄細胞腫症のウイルス性癌遺伝子(v−MYC)と同様の遺伝子が明らかとなった。これにより、新規に発見された細胞内の遺伝子がc−MYCと名付けられた。
Mycタンパク質は、コンセンサス配列(エンハンサーボックス配列(Eボックス))上での結合およびヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)の動員を介して多くの遺伝子の発現を活性化する転写因子である。また、Mycタンパク質は転写抑制因子としても作用する。Miz‐1転写因子を結合してp300コアクティベーターと置き換わることにより、Mycタンパク質はMiz−1標的遺伝子の発現を阻害する。
Mycは、Wnt、ShhおよびEGFなどの多様な分裂促進性のシグナリング経路を介して(MAPK/ERK経路を介して)活性化される。その標的遺伝子の発現を改変することにより、Mycの活性化は、細胞増殖の亢進(サイクリンをアップレギュレート、p21をダウンレギュレート)、細胞増殖の調節(リボソームRNAおよびタンパク質をアップレギュレート)、アポトーシス(Bcl−2をアップレギュレート)、分化ならびに幹細胞の自己再生を含む、多くの生物学的作用をもたらす。MYCは強力なプロト癌遺伝子であり、かつ多くの種類の癌においてアップレギュレートされていることが見出されている。
MYCの発見の最中、8番染色体に転座された染色体は、切断点でイムノグロブリン(Ig)遺伝子を含むと同定された。転座後、イムノグロブリン遺伝子のエンハーサーは、代わりにリンパ腫細胞でMYCの過剰発現を引き起こした。MYCを過剰発現する遺伝子導入マウスモデルがその後バーキットリンパ腫の腫瘍形成の機構を試験するために開発された。たとえば、MYC(IgM重鎖エンハーサーの制御下でのMYC)を過剰発現する遺伝子導入マウスは、IgM重鎖エンハーサーの制御下にMYCを置く際にリンパ腫を、またはMYCの過剰発現が他の組織(たとえば肝臓、乳房)で起こった場合に他の種類の腫瘍を発症したことは、癌遺伝子としてのMYCの能力を示している。
cMYCの生物学を理解するために有益な参考文献は、Gearhart J, Pashos E E, Prasad M K, Pluripotency Redeux−advances in stem−cell researcg, N Engl J Med 357(15):1469. Ruf I K, Rhyne P W, Yang H, et al. (2002). “EBV regulates c−MYC, apoptosis, and tumorigenicity in Burkitt’s lymphoma,” Curr. Top. Microbiol. Immunol. 258: 153−60. PMID 11443860. Luscher B (2001). “Function and regulation of the transcription factors of the Myc/Max/Mad network,”. Gene 277 (1−2): 1−14. PMID 11602341. Hoffman B, Amanullah A, Shafarenko M, Liebermann D A (2002), “The proto−oncogene c−myc in hematopoietic development and leukemogenesis,” Oncogene 21 (21): 3414−21, doi:10.1038/sj.one.1205400. PMID 12032779. Pelengaris S, Khan M, Evan G (2002), “c−MYC: more than just a matter of life and death,” Nat. Rev. Cancer 2 (10): 764−76, doi:10.1038/nrc904. PMID 12360279. Nilsson J A, Cleveland J L (2004), “Myc pathways provoking cell suicide and cancer,” Oncogene 22 (56): 9007−21. doi:10.1038/sj.one.1207261. PMID 14663479. Dang C V, O′ donnell K A, Juopperi T (2005), “The great MYC escape in tumorigenesis,” Cancer Cell 8 (3): 177−8, doi:10.1016/j.ccr.2005.08.005. PMID 16169462. Dang C V, Li F, Lee L A (2007), “Could MYC induction of mitochondrial biogenesis be linked to ROS production and genomic instability?” Cell Cycle 4 (11): 1465−6, PMID 16205115. Coller H A, Forman J J, Legesse−Miller A (2007), “‘Myc’ed messages’: myc induces transcription of E2F1 while inhibiting its translation via a microRNA polycistron,” PLoS Genet. 3(8): e146, doi:10.1371/journal.pgen.0030146. PMID 17784791. Astrin S M, Laurence J (1992), “Human immunodeficiency virus activates c−myc and Epstein−Barr virus in human B lymphocytes,” Ann. N.Y. Acad. Sci. 651: 422−32, PMID 1318011. Bernstein P L, Herrick D J, Prokipcak R D, Ross J (1992), “Control of c−myc mRNA half−life in vitro by a protein capable of binding to a coding region stability determinant,” Genes Dev. 6 (4): 642−54, PMID 1559612. lijima S, Teraoka H, Date T, Tsukada K (1992), “DNA−activated protein kinase in Raji Burkitt’s lymphoma cells. Phosphorylation of c−Myc oncoprotein,” Eur. J. Biochem. 206 (2): 595−603, PMID 1597196. Seth A, Alvarez E, Gupta S, Davis R J (1992), “A phosphorylation site located in the NH2−terminal domain of c−Myc increases transactivation of gene expression,” J. Biol. Chem. 266 (35): 23521−4, PMID 1748630. Takahashi E, Hori T, O’Connell P, et al. (1991), “Mapping of the MYC gene to band 8q24.12−q24.13 by R−banding and distal to fra(8)(q24.11), FRA8E, by fluorescence in situ hybridization,” Cytogenet. Cell Genet. 57 (2−3): 109−11, PMID 1914517. Blackwood E M, Eisenman R N (1991), “Max: a helix−loop−helix zipper protein that forms a sequence−specific DNA−binding complex with Myc,” Science 251 (4998): 1211−7, PMID 2006410. Gazin C, Rigolet M, Briand J P, et al. (1986), “Immunochemical detection of proteins related to the human c−myc exon 1,” EMBO J. 5 (9): 2241−50, PMID 2430795. Luscher B, Kuenzel E A, Krebs E G, Eisenman R N (1989), “Myc oncoproteins are phosphorylated by casein kinase II,” EMBO J. 8 (4): 1111−9, PMID 2663470. Finver S N, Nishikura K, Finger L R, et al. (1988), “Sequence analysis of the MYC oncogene involved in the t(8; 14)(q24;q11) chromosome translocation in a human leukemia T−cell line indicates that putative regulatory regions are not altered,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (9): 3052−6, PMID 2834731. Showe L C, Moore R C, Erikson J, Croce C M (1987), “MYC oncogene involved in a t(8; 22) chromosome translocation is not altered in its putative regulatory regions,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (9): 2824−8, PMID 3033665. Guilhot S, Petridou B, Syed−Hussain S, Galibert F (1989), “Nucleotide sequence 3′ to the human c−myc oncogene; presence of a long inverted repeat,” Gene 72 (1−2): 105−8, PMID 3243428. Hann S R, King M W, Bentley D L, et al. (1988), “A non−AUG translational initiation in c−myc exon 1 generates an N−terminally distinct protein whose synthesis is disrupted in Burkitt’s lymphomas,” Cell 52 (2): 185−95; PMID 3277717を含む。
最近MYC−阻害小分子が同定された(Moyer. Nature Medicine 17: 1325)。本発明のMYC阻害二本鎖核酸は単独で使用でき、または本明細書中に記載されるような当業者に認識されているMYC標的治療剤と組み合わせて使用できる。
薬学的組成物
特定の実施形態では、本発明は、本発明のdsRNA剤を含む薬学的組成物を提供する。dsRNA剤試料は、好適に製剤化され、それが存在する場合に、十分な試料の一部が、遺伝子サイレンシングを誘導するために細胞内に入ることを許容する任意の方法によって細胞の環境内に導入可能である。dsRNAに関する多くの製剤は、本技術分野で公知であり、dsRNAが標的細胞内に入り、働くことができる限り使用可能である。例えば、米国特許出願公開第2004/0203145号および第2005/0054598 A号を参照のこと。例えば、本発明のdsRNA剤を、リン酸緩衝食塩水溶液、リポソーム、ミセル構造およびカプシドのような緩衝溶液中に製剤化できる。カチオン性脂質を備えたdsRNA剤の製剤を、dsRNA剤の細胞内へのトランスフェクションを促進するために使用可能である。例えば、リポフェクチン(米国特許第5,705,188号)のようなカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリシン(PCT国際特許公開第97/30731号)のようなポリカチオン性分子を使用できる。好適な脂質には、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン(Life Technologies)、NC388(Ribozyme PhARmaceuticals、Inc.Boulder,Colo.)、またはFuGene6(Roche)が含まれ、これら全ては製造業者の取扱説明書にしたがって使用できる。
特定の実施形態では、本発明は、本発明のdsRNA剤を含む薬学的組成物を提供する。dsRNA剤試料は、好適に製剤化され、それが存在する場合に、十分な試料の一部が、遺伝子サイレンシングを誘導するために細胞内に入ることを許容する任意の方法によって細胞の環境内に導入可能である。dsRNAに関する多くの製剤は、本技術分野で公知であり、dsRNAが標的細胞内に入り、働くことができる限り使用可能である。例えば、米国特許出願公開第2004/0203145号および第2005/0054598 A号を参照のこと。例えば、本発明のdsRNA剤を、リン酸緩衝食塩水溶液、リポソーム、ミセル構造およびカプシドのような緩衝溶液中に製剤化できる。カチオン性脂質を備えたdsRNA剤の製剤を、dsRNA剤の細胞内へのトランスフェクションを促進するために使用可能である。例えば、リポフェクチン(米国特許第5,705,188号)のようなカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリシン(PCT国際特許公開第97/30731号)のようなポリカチオン性分子を使用できる。好適な脂質には、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン(Life Technologies)、NC388(Ribozyme PhARmaceuticals、Inc.Boulder,Colo.)、またはFuGene6(Roche)が含まれ、これら全ては製造業者の取扱説明書にしたがって使用できる。
このような組成物には、概して核酸分子と薬学的に許容可能な担体が含まれる。本明細書で使用するところの語句「薬学的に許容可能な担体」には、薬学的投与に適合可能な食塩水、溶媒、分散培地、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。補助的な活性化合物もまた組成物内に組み込むことができる。
薬学的組成物を、その意図する投与経路に適合するように製剤化する。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮膚内、皮下、経口(例えば吸入)、経皮(局所)、経粘膜および腸投与が含まれる。非経口、皮膚内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液には、以下の、注射用の水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような無菌希釈液、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類のような抗菌剤、アスコルビン酸または二硫化ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝液および塩化ナトリウム、デキストロースのような浸透圧の調節のための薬剤といった成分を含むことができる。pHを、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調節可能である。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックからなるアンプル、使い捨てシリンジまたは多重用量バイアル内に同封可能である。
注射可能な用途に好適な薬学的組成物には、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液、および無菌注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、好適な担体には、生理学的食塩水、静菌水、Cremophor EL.TM.(BASF、PARsippany,NJ)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)が含まれる。全ての場合で、本組成物は無菌でなければならず、簡単にシリンジ注入可能な程度まで流動的であるべきである。製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌のような微生物の汚染作用にが防止されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレンングリコールなど)、ならびにこれらの好適な混合液を含む、溶媒または分散培地とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの利用によって、分散液の場合、要求される粒子の大きさの維持によって、かつ界面活性剤の利用によって、維持可能である。微生物の活性の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成可能である。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール類、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能組成物の長期間の吸収を、組成物内に、吸収を遅延させる薬剤、例えばアルミニウム一ステアリン酸およびゼラチンを加えることによって達成可能である。
無菌注射可能溶液は、必要に応じて、上記に列挙した成分のうち1つ以上の組み合わせと、選択した溶媒中の必要量の活性化合物を組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散液は、基礎分散培地と上記に列挙した必要な他の成分とを含む、無菌ビヒクル内に活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前もって濾過滅菌したその溶液から活性成分+任意の所望な成分を回収する吸引乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物は一般的に、不活性希釈液または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を、賦形剤と組み込み、錠剤、トローチまたは例えばゼラチンカプセルのようなカプセルの形態で使用可能である。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての利用のために流体の担体を用いて調製可能である。薬学的に適合可能な結合剤、および/またはアジュバント物質を、組成物の一部として含めることが可能である。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の、結晶セルロース、ガムトラガカントもしくはゼラチンのような結合剤、デンプンもしくはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、プリモゲルもしくはトウモロコシデンプンのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはSterotesのような潤滑油、二酸化コロイドシリコーンのような流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンのような甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料のような香味料、といった成分または同様の性質の化合物のいずれかを含んでよい。
吸入による投与のために、化合物を、例えば二酸化炭素のような気体といった高圧ガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザー由来のエアゾルスプレーの形状で伝達する。このような方法には、米国特許第6,468,798号に記述されたものが含まれる。
全身投与がまた、経粘膜または経皮的手段によって可能でもある。経粘膜投与または経皮投与では、浸潤されるべきバリアに対して適切な浸透剤が製剤で使用される。このような浸透剤剤は一般的に本技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与では、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは座薬の使用を介して実施可能である。経皮投与では、活性化合物を、本技術分野で一般的に公知の軟膏(ointments)、軟膏(salves)、ジェルまたはクリームに製剤化する。
本化合物をまた、(例えばココアバターおよび他のグリセリド類のような従来の座薬基体を備えた)座薬、または腸伝達のための停留かん腸の形態で調製可能である。
本化合物はまた、限定するものではないが、McCaffrey et al.(2002),Nature,418(6893),38−9(流体力学トランスフェクション);Xia et al.(2002),Nature Biotechnol.,20(10),1006−10(ウイルス媒介伝達);またはPutnam (1996),Am.J.Health Syst.PhARm.53(2),151−160,erratum at Am. J. Health Syst.Pharm.53(3),325(1996)にて記述された方法を含む、本技術分野で公知の方法を用いてトランスフェクションまたは感染によって投与可能である。
また、本化合物を、DNAワクチンのような核酸剤の投与に好適な方法によって投与可能である。これらの方法には、遺伝子銃、生物注入器、および皮膚パッチならびに米国特許第6,194,389号にて開示されたマイクロ粒子DNAワクチン技術のようなニードルフリー方法、および米国特許第6,168,587号にて開示されたような粉末形状ワクチンによる哺乳類経皮ニードルフリーワクチン化が含まれる。さらに、とりわけHamajima et al.(1998),Clin.Immunol.Immunopathol.,88(2),205−10.Liposomesに記載されるように(例えば、米国特許第6,472,375号にて記述されたような)、経鼻伝達が可能であり、マイクロカプセル化も利用可能である。(例えば、米国特許第6,471,996号にて記述されたような)生物分解性、標的化可能マイクロ粒子伝達システムもまた使用可能である。
1つの実施形態では、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化伝達系を含む、徐放製剤のような、体からの急速な消失に対して化合物を保護する担体で調製する。酢酸エチレンビニル、ポリアンヒドリド類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル類およびポリ酢酸のような生物分解性、生物適合性ポリマーを使用可能である。このような製剤は、標準技術を用いて調製可能である。物質はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.から商業的に入手可能である。(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞に標的化したリポソームを含む)リポソーム懸濁液を、薬学的に許容可能な担体として使用可能でもある。これらは、例えば米国特許第4,522,811号にて記述されたような、当業者に公知の方法にしたがって調製可能である。
このような化合物の毒性および治療効果を、例えばLD50(集団の50%が致死する用量)およびED50(集団の50%の治療上有効量)を決定するために、細胞培養液または実験動物における標準薬学的手順によって決定できる。毒性および治療効果の間の用量比が治療指数であり、比率LD50/ED50で表すことが可能である。高い治療指数を表す化合物が好ましい。毒性副作用を表す化合物を使用してよい一方で、感染していない細胞への損傷の可能性を最小限にし、それによって副作用を低減させるために、罹患組織の部位へ、このような化合物を標的化する伝達系をデザインすることに注意が払われるべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトにおける使用のための用量の範囲を定式化する際に使用可能である。このような化合物の用量は、好ましくは毒性がほとんどないか、全くないED50を含む循環濃度範囲内にある。用量は、使用する用量形態および利用した投与経路に応じてこの範囲内で変化してよい。本発明の方法にて使用される化合物では、治療上有効量は、細胞培養アッセイからまず推定可能である。用量を、細胞培養液中で測定したようなIC50(すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにて定式化してよい。このような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定するできる。血漿中のレベルを、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定してよい。
本明細書で定義したように、治療的有効量の核酸分子(すなわち有効用量)は、選択した核酸に依存する。例えば、dsRNA(または、たとえばこのようなdsRNAをコードする構築物)を、およそ1pg〜1000mgの範囲の単一投与用量で投与してよく、いくつかの実施形態では、10、30、100、もしくは1000pg、または10、30、100、もしくは1000ng、または10、30、100、もしくは1000μg、または10、30、100、もしくは1000mgを投与してよい。いくつかの実施形態では、1〜5gの組成物を投与可能である。本組成物は、2日に1回を含む、1以上の回数/日〜1以上の回数/週投与可能である。当業者は、限定するものではないが、疾患または障害の重症度、先行治療、対象の一般的健康および/または年齢、他の疾患の存在を含む特定の要因が、対象を効果的に処置するために要求される用量およびタイミングに影響を与えうることを理解するであろう。さらに、治療的有効量の核酸(たとえばdsRNA)、タンパク質、ポリペプチド、または抗体での対象の治療には、単一治療が含まれてよく、または好ましくは一連の治療が含まれてよい。
本発明の核酸分子は、限定するものではないが、例えば、Xiaらにより(2002)上記にて記述されたものを含む、本技術分野で公知の方法を用いて、発現構築物、例えばウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクター内に挿入可能である。発現構築物は、例えば、吸入、経口、静脈注射、局所投与によって(米国特許第5,328,470号明細書を参照のこと)、または定位注射によって(例えばChen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,3054−3057)対象に伝達可能である。伝達ベクターの薬学的調製物には、適切な希釈液中のベクターが含まれてよく、または伝達ビヒクルが埋め込まれる徐放マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な伝達ベクター、例えばレトロウイルスベクターを、組換え細胞から完全なまま産出可能である場合、薬学的調製物は、遺伝子伝達系を産出する1つ以上の細胞を含むことができる。
発現構築物は、適切な発現系での使用に好適な構築物であってよく、限定するものではないが、本技術分野で公知のような、レトロウイルスベクター、直線発現カセット、プラスミドおよびウイルスまたはウイルス由来ベクターを含んでもよい。このような発現構築物には、1つ以上の誘導可能なプロモーター、U6 snRNAプロモーターまたはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモーターのような、RNA Pol IIIプロモーター系、または本技術分野で公知の他のプロモーターを含んでよい。本構築物は、siRNAの1つまたは両方の鎖を含みうる。両方の鎖を発現している発現構築物にはまた、両方の鎖を連結しているループ構造が含むことができ、または各鎖は、同一の構築物内の別々のプロモーターから別々に転写されうる。各鎖はまた、別々の発現構築物、例えばTuschl(2002,Nature Biotechnol 20:5005−505)から転写可能でもある。
細胞の環境内にdsRNA剤を導入する方法が、細胞の型、およびその環境の構成に依存しうることが理解できる。例えば、細胞が液体内で見られる時に、1つの好ましい製剤は、リポフェクタミン中でのような脂質製剤によるものであり、dsRNA剤を細胞の液体環境に直接添加できる。脂質製剤をまた、静脈内、筋肉内または腹腔内注射によって、または経口で、または吸入または本技術分野で公知のような他の方法によって動物に投与できる。本製剤が、哺乳類、とりわけヒトのような動物内への投与に好適である場合、本製剤はまた薬学的に許容可能である。オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容可能な製剤が公知であり、利用可能である。いくつかの例において、dsRNA剤を緩衝液または生理食塩水溶液中で製剤化し、製剤化したdsRNA剤を、卵母細胞での研究でのように、直接細胞内に注入することが好ましい場合がある。dsRNA剤二本鎖の直接注射もまた実施されうる。dsRNA(例えばDsiRNA剤)を導入する好適な方法に関して、米国特許公開公報第2004/0203145号を参照のこと。
好適な量のdsRNA剤を導入しなければならず、これらの量は、標準の方法を用いて実験的に決定できる。概して、細胞の環境中の個々のdsRNA剤種の効果的な濃度は、50ナノモル濃度以下、10ナノモル濃度以下であり、または1ナノモル濃度以下で濃度での組成物を使用できる。別の実施形態では、200ピコモル濃度以下、100ピコモル濃度以下、50ピコモル濃度以下、20ピコモル濃度以下、および10ピコモル濃度以下、5ピコモル濃度以下、2ピコモル濃度以下、または1ピコモル濃度以下の濃度を用いる方法を、多くの環境で使用できる。
十分な量のdsRNA剤が細胞に入りその効果を発揮するようにdsRNA剤組成物が製剤化される場合、本方法は、細胞が生存可能な細胞外マトリックスにdsRNA剤組成物を添加することにより実行できる。例えば、本方法は、液体培養液または細胞増殖培地のような液体中、組織外植片中、または哺乳類、とりわけヒトのような動物を含む全生命体中に存在する細胞を用いて使用できる。
MYC RNAのレベルまたは活性は、本技術分野で公知の、または後に開発される好適な方法によって決定できる。標的RNAおよび/または標的RNAの発現を測定するために使用する方法が、標的RNAの性質に依存しうることが理解できる。例えば、標的MYC RNA配列がタンパク質をコードする場合、語句「発現」は、MYC遺伝子(ゲノムまたは外来源由来のいずれか)から由来する、タンパク質またはMYC RNA/転写産物を意味することができる。このような例において、標的MYC RNAの発現を、MYC RNA/転写産物の量を直接測定することによって、またはMycタンパク質の量を測定することによって決定可能である。タンパク質を、染色または免疫ブロッティングによって、またはタンパク質が測定可能な反応を触媒する場合、反応速度を測定することによってなどのタンパク質アッセイにて測定可能である。すべてのこのような方法が、本技術分野で公知であり、使用可能である。標的MYC RNAレベルが測定されるべきである場合、RNAレベルを検出するための本技術分野で認識された方法を使用可能である(例えばRT−PCR、ノザンブロッディングなど)。本発明のdsRNA剤でのMYC RNAの標的化で、対象、組織中、in vitroまたはin vivoいずれかでの、細胞中の、または細胞抽出物中の、MYC RNAまたはタンパク質のレベルを減少させる際の、dsRNA剤の有効性の測定をまた、MYC−関連表現型(例えば癌または腫瘍形成、増殖、転移、拡散などのような、たとえば疾患または障害)の低減の程度を決定するために使用可能でもある。上記測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物または他の好適な供給源物質で実施できる。
MYC RNAの発現が低減したかどうかの決定は、RNAレベルにおける変化を正確に検出可能な好適な方法とすることができる。概して、この決定は、dsRNA剤の少なくとも一部が細胞質に入るように未消化のdsRNAを細胞環境に導入し、その後標的RNAのレベルを測定することによって実施される。
同様の測定を、同一の未処理細胞上で行い、それぞれの測定から得られた結果を比較する。
同様の測定を、同一の未処理細胞上で行い、それぞれの測定から得られた結果を比較する。
dsRNA剤は、薬理学的に有効量のdsRNA剤と、薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物として製剤化できる。薬学的、または治療的に有効な量は、意図する薬理学的、治療上または予防上の結果を産出するのに効果的なdsRNA剤の量を意味する。語句「薬理学的有効量」および「治療上有効量」または単に「有効量」は、意図する薬理学的、治療上または予防上の結果を産出するのに効果的なRNAの量を意味する。例えば、当該臨床治療が、疾患または疾病に関連した測定可能なパラメータにおいて、少なくとも20%の減少が見られた時に有効とされる場合、当該疾患または障害の治療に対する薬物の治療上有効量は、当該パラメータにおける少なくとも20%減少に影響を与えるのに必要な量である。
本発明の好適な製剤化された薬学的組成物を、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、空路(エアゾル)、腸、膣および(バッカルおよびサブリンガルを含む)局所投与を含む、非経口経路などによるような、本技術分野で公知の方法によって投与可能である。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、静脈または非経口内点滴または注射によって投与される。
一般に、dsRNAの好適な用量ユニットは、0.001〜0.25ミリグラム/レシピエントのキログラム体重/日の範囲、または0.01〜20マイクログラム/キログラム体重/日の範囲、または0.001〜5マイクログラム/キログラム体重/日の範囲、または1〜500ナノグラム/キログラム体重/日の範囲、または0.01〜10マイクログラム/レシピエントのキログラム体重/日の範囲、または0.10〜5マイクログラム/レシピエントのキログラム体重/日の範囲、または0.1〜2.5マイクログラム/キログラム体重/日の範囲である。dsRNAを含む薬学的組成物は、1日1回投与可能である。しかしながら、治療薬剤はまた、1日を通して適切な間隔で投与される、2、3、4、5、6またはそれ以上のサブ用量を含む用量ユニットで投与されてもよい。この場合、各サブ用量に含まれるdsRNAは、総合一日用量ユニットを達成するために相応により小さくなければいけない。用量ユニットはまた、例えば数日の間隔にわたり、dsRNAの持続しかつ一定した放出を提供する従来の徐放製剤を用いて、数日にわたる単一用量のために合成可能である。徐放製剤は本技術分野でよく知られている。本実施形態では、用量ユニットは、対応する複数の一日用量を含む。製剤に関係なく、薬学的組成物は、処置される動物またはヒトの標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で、dsRNAを含まなければいけない。本組成物は、dsRNAの複数ユニットの合計が、まとめて十分な用量を含む方法で合成可能である。
ヒトに好適な用量範囲を製剤化するために、データを細胞培養アッセイと動物研究から得ることができる。本発明の組成物の用量は、毒性がほとんどまたは全くない、(公知の方法によって決定したような)ED50を含む、循環濃度の範囲内である。用量は、使用した剤形および利用した投与経路に応じて、この範囲内で変化してよい。本発明の方法にて使用する化合物では、治療上有効用量は、まず細胞培養アッセイより推定できる。細胞培養中で決定したような、IC50(すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む化合物の循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにて用量を定式化してよい。このような情報は、ヒトに有用な用量をより正確に決定するために使用できる。血漿中のdsRNAのレベルを、標準方法によって、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定してよい。
薬学的組成物は、投与のための取扱説明書とともに、キット、容器、パックまたはディスペンサー内に含まれることができる。
治療方法
本発明は、MYC(例えばMYC転写産物および/もしくはMycタンパク質レベルの誤調節および/もしくは上昇)によって、全体としてもしくは部分的に引き起こされる、もしくはMYCの選択的標的化介して処置可能な疾患または障害のリスクのある(または受けやすい)対象を治療する予防的および治療的方法の両方を提供する。
本発明は、MYC(例えばMYC転写産物および/もしくはMycタンパク質レベルの誤調節および/もしくは上昇)によって、全体としてもしくは部分的に引き起こされる、もしくはMYCの選択的標的化介して処置可能な疾患または障害のリスクのある(または受けやすい)対象を治療する予防的および治療的方法の両方を提供する。
本明細書で使用するところの「治療」または「治療すること」は、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、もしくは疾患に向かう傾向を治癒させる、治す、緩和する、軽減する、変化させる、治療する、改善する、好転させるまたは影響を与える目的で、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、もしくは疾患もしくは障害に向かう傾向を持つ患者への治療的薬剤(例えばdsRNA剤またはそれをコードしているベクターまたはトランスジーン)の適用もしくは投与、またはこのような患者から単離した組織もしくは細胞株への治療薬剤の適用もしくは投与として定義される。
1つの態様において、本発明は、対象に治療薬剤(例えばdsRNA剤またはそれをコードしているベクターもしくはトランスジーン)を投与することによって、対象中で、(例えばMYC発現の阻害を介して対象内での形質転換事象の開始を防止することを含む)上述の疾患または障害を予防する方法を提供する。疾患に対してリスクを有する対象を、例えば、本明細書で記述したような診断または予後アッセイの1つまたは組み合わせによって同定できる。予防的薬剤の投与は、例えば対象中の癌の検出、または疾患もしくは障害の症状特徴の顕在化の前に実施可能であり、それによって疾患または障害が予防され、あるいはその進行が遅延する。
本発明の別の態様は、対象を治療的に治療する方法、すなわち疾患または障害の症状の開始を変更する方法に関する。これらの方法は、in vitro(例えば、dsRNA剤とともに細胞を培養することによって)、あるいはin vivo(例えば対象にdsRNA剤を投与することによって)で実施可能である。
治療の予防的および治療的方法の両方に関して、このような治療はとりわけ、ファーマコジェノミクスの領域から得られた知識に基づいてあつらえ、または改変してよい。本明細書で使用するところの「ファーマコジェノミクス」は、遺伝子シークエンシング、統計学的遺伝学、および臨床試験および市場における薬物に対する遺伝子発現解析のような、ゲノミクス技術の適用を意味する。より具体的には、本語句は、どのようにして患者の遺伝子が、彼または彼女の薬物に対する応答を決定するか(例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」)の研究を意味する。したがって、本発明の別の態様は、個々の薬物応答遺伝子型にしたがって、本発明の標的MYC RNA分子または標的MYC RNAモジュレータいずれかでの個々の予防的または治療的治療をあつらえるための方法を提供する。ファーマコジェノミクスは、臨床医または医師が、治療より最も利益を得る患者へ、予防的または治療的処置を標的化し、毒性薬物関連副作用を経験する患者の治療を避けることを可能にする。
治療薬剤を、選択した動物モデルで試験可能である。例えば、本明細書で記述したようなdsRNA剤(またはそれをコードしている発現ベクターもしくはトランスジーン)は、上記薬剤での治療の有効性、毒性または副作用を決定するために、動物モデルにて使用可能である。あるいは、薬剤(例えば治療薬剤)を、このような薬剤の作用機序を決定するために、動物モデルにて使用可能である。
MYC mRNAレベルおよび発現の下方調節を評価するために有用なモデル
細胞培養
本発明のdsRNA剤を、in vivoにて、例えば以下の手順を用いて、開裂活性に対して試験可能である。本発明のdsRNA剤によって標的化されたMYC cDNA内のヌクレオド配列を、上記のMYC配列中に示す。
細胞培養
本発明のdsRNA剤を、in vivoにて、例えば以下の手順を用いて、開裂活性に対して試験可能である。本発明のdsRNA剤によって標的化されたMYC cDNA内のヌクレオド配列を、上記のMYC配列中に示す。
本発明のdsRNA試薬を、MYC RNAおよびMycタンパク質阻害の程度を決定するために、A549または他の哺乳類細胞を用いて、細胞培養液中で試験できる。特定の実施形態では、DsiRNA試薬(例えば図1および上述構造を参照のこと)を、本明細書で記述したように、MYC標的に対して選択する。MYC RNA阻害は、たとえば、培養A549細胞、または培養液中の他の形質転換されたか、形質転換されていない哺乳類細胞への、好適なトランスフェクション薬剤によるこれらの試薬の送達後に測定する。標的MYC RNAの相対量を、増幅のリアルタイムPCRモニタリングを用いて、アクチンまたは他の適切な対照に対して測定する(例えばABI7700TAQMAN(登録商標))。比較を、関係しない標的、または同一の総長および化学式を持つ無作為化DsiRNA対照、または単に適切なビヒクル処理もしくは未処理の対照に対して実施したオリゴヌクレオチド配列の活性に対して実施する。第一および第二リード試薬を、標的に対して選択し、最適化を実施した。
TAQMAN(登録商標)(増幅のリアルタイムPCRモニタリング)およびmRNAのライトサイクラー定量化
総RNAを、例えば大規模抽出用のAmbion Rnaqueous 4−PCR精製キット、または96−ウェルプレート用のPromega SV96を用いて、DsiRNA伝達後の細胞から調製する。Taqman解析のために、二重標識化プローブを、例えば5’末端にて共有結合したレポーター色素FAMまたはVICと3’末端に共役したクエンサー色素TAMMYCAで合成した。PCR増幅を、例えば10μL総RNA、100nMフォワードプライマー、100mMリバースプライマー、100mM プローブ、1×TaqMan PCR反応緩衝液(PE−Applied Biosystems)、5.5mM MgCl2、100μMの各dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、0.2U RNase Inhibitor(Promega)、0.025U AmpliTaq Gold(PE−Applied Biosystems)および0.2U M−MLV 逆転写酵素(Promega)からなる50μL反応液を用いて、ABI PRISM 7700 配列検出器上で実施する。温度サイクル条件は、48℃にて30分間、95℃にて10分間、続いて95℃にて15秒間と60℃の40サイクル、および、および60℃で1分間からなることができる。標的MYC mRNAレベルの定量を、段階希釈した総細胞RNA(300、100、30、10ng/rxn)から産出した標準物質に対して決定し、例えば、平行または同一のいずれかのチューブTaqMan反応におけるHPRT1 mRNAに対して標準化する。
総RNAを、例えば大規模抽出用のAmbion Rnaqueous 4−PCR精製キット、または96−ウェルプレート用のPromega SV96を用いて、DsiRNA伝達後の細胞から調製する。Taqman解析のために、二重標識化プローブを、例えば5’末端にて共有結合したレポーター色素FAMまたはVICと3’末端に共役したクエンサー色素TAMMYCAで合成した。PCR増幅を、例えば10μL総RNA、100nMフォワードプライマー、100mMリバースプライマー、100mM プローブ、1×TaqMan PCR反応緩衝液(PE−Applied Biosystems)、5.5mM MgCl2、100μMの各dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、0.2U RNase Inhibitor(Promega)、0.025U AmpliTaq Gold(PE−Applied Biosystems)および0.2U M−MLV 逆転写酵素(Promega)からなる50μL反応液を用いて、ABI PRISM 7700 配列検出器上で実施する。温度サイクル条件は、48℃にて30分間、95℃にて10分間、続いて95℃にて15秒間と60℃の40サイクル、および、および60℃で1分間からなることができる。標的MYC mRNAレベルの定量を、段階希釈した総細胞RNA(300、100、30、10ng/rxn)から産出した標準物質に対して決定し、例えば、平行または同一のいずれかのチューブTaqMan反応におけるHPRT1 mRNAに対して標準化する。
ウエスタンブロッディング
細胞タンパク質抽出物を、標準マイクロ調製技術を用いて(例えばRIPA緩衝液を使用して)、または好ましくは、NE−PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction kit (サーモフィッシャーサイエンティフィック)などの方法により核タンパク質を抽出することにより、調製可能である。細胞タンパク質抽出物を、Tris−Glycineポリアクリルアミドゲル上で泳動し、膜上に移す。非特異的結合を、例えば5%不脂肪ミルクとの1時間のインキュベーションにて阻害し、続いて4℃にて16時間一次抗体でインキュベーションできる。洗浄後、二次抗体を、例えば室温にて1時間(1:10,000希釈)適用し、シグナルを、VersaDocイメージングシステム上で検出する。
細胞タンパク質抽出物を、標準マイクロ調製技術を用いて(例えばRIPA緩衝液を使用して)、または好ましくは、NE−PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction kit (サーモフィッシャーサイエンティフィック)などの方法により核タンパク質を抽出することにより、調製可能である。細胞タンパク質抽出物を、Tris−Glycineポリアクリルアミドゲル上で泳動し、膜上に移す。非特異的結合を、例えば5%不脂肪ミルクとの1時間のインキュベーションにて阻害し、続いて4℃にて16時間一次抗体でインキュベーションできる。洗浄後、二次抗体を、例えば室温にて1時間(1:10,000希釈)適用し、シグナルを、VersaDocイメージングシステム上で検出する。
いくつかの細胞培養系において、カチオン性脂質が、培養液中の細胞に対するオリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティを増強することが示されてきた(Bennet, et al.,1992,Mol.Pharmacology,41,1023−1033)。1つの実施形態では、本発明のdsRNA分子を、細胞培養実験のために、カチオン性脂質と複合体化する。dsRNAとカチオン性脂質との混合物を、細胞への添加の直前に、血清を含まないOptimMEM(InVitrogen)中で調製する。OptiMEMを室温(約20〜25℃)まで温め、カチオン性脂質を最終の所望濃度まで加える。dsRNA分子をOptiMEMに、所望の濃度まで加え、溶液を希釈したdsRNAに加え、15分間室温にてインキュベートする。用量応答実験において、RNA複合体を、カチオン性脂質の添加前に、OptiMEMで段階希釈する。
動物モデル
抗−MYC dsRNA剤の有効性を、動物モデルにおいて評価してよい。本技術分野で公知のような癌および/または増殖性疾患、状態または障害の動物モデルを、抗−MYC dsRNAの有効性、効力、毒性などの評価のために使用可能である。増殖性疾患の好適な動物モデルには、例えばプロト癌遺伝子(例えばMyc、Src)の機能を得た、かつ/もしくは腫瘍抑制タンパク質(例えばp53、Rb)の機能の欠損を持つトランスジェニック齧歯類(例えばマウス、ラット)、または新生物形質変換を促進するDNA変化を誘導する照射もしくは化学突然変異原誘発物質に曝露した齧歯類が含まれる。多くのこのような動物モデルは、例えばアメリカメイン州バー・ハーバーのThe Jackson Laboratoryから市販されている。これらの動物モデルは、本発明の組成物のアッセイのための、供給源細胞または組織として使用できる。このようなモデルはまた、治療的利用に向けてMYC遺伝子発現の調節における、本発明のdsRNA組成物の有効性の前臨床評価のために使用できるか、または使用のために適合でき。
抗−MYC dsRNA剤の有効性を、動物モデルにおいて評価してよい。本技術分野で公知のような癌および/または増殖性疾患、状態または障害の動物モデルを、抗−MYC dsRNAの有効性、効力、毒性などの評価のために使用可能である。増殖性疾患の好適な動物モデルには、例えばプロト癌遺伝子(例えばMyc、Src)の機能を得た、かつ/もしくは腫瘍抑制タンパク質(例えばp53、Rb)の機能の欠損を持つトランスジェニック齧歯類(例えばマウス、ラット)、または新生物形質変換を促進するDNA変化を誘導する照射もしくは化学突然変異原誘発物質に曝露した齧歯類が含まれる。多くのこのような動物モデルは、例えばアメリカメイン州バー・ハーバーのThe Jackson Laboratoryから市販されている。これらの動物モデルは、本発明の組成物のアッセイのための、供給源細胞または組織として使用できる。このようなモデルはまた、治療的利用に向けてMYC遺伝子発現の調節における、本発明のdsRNA組成物の有効性の前臨床評価のために使用できるか、または使用のために適合でき。
細胞培養モデルでのように、ほとんどのMYC−関連マウス腫瘍異種移植片が、Mycタンパク質を発現する癌細胞から由来したものである。MYCの調節の抗腫瘍効果の研究に関連する癌の異種移植片マウスモデルが種々のグループによって記述されてきた(たとえば、Leonetti et al., J. NCI 1996 April; 88: 419; Iversen et al., Clin Cancer Res 2003 July; 9: 2510; Devi et al., Clin Cancer Res 2005 May; 11: 3930; Chen et al., Mol Ther 2010 April; 18:828; Kessler et al., Science 2012 Jan; 335: 348)。これらのモデルの利用は、抗−MYC剤によるMYC発現の阻害が、動物における腫瘍増殖の阻害を引き起こすことを実証した。
このようなモデルを、MYCレベル、発現、腫瘍/癌形成、増殖、拡散、他のMYC−関連表現型、疾患または障害の発症などを阻害する本発明のdsRNA分子の有効性を評価において使用できる。これらのモデルおよび他のモデルを同様に、前臨床設定にて、本発明のdsRNA分子の安全性/毒性および有効性を評価するために使用できる。
本発明のMYC標的化dsRNAの評価のために有用な動物モデル系の特異的な例には、野生型マウス、および同所性もしくは皮下のHT1080、HCT116、SW480、SW620、Hep3B、M14、JR8、PLF2、LLC1、LNCaP、PC3、SUM159、MDAMB−231、22Rv1、518A2、MHCC97、A549、H1299、HepG2、SNU398、HuH7、NCI−H196、NCI−H1975、HT29、MKN−45、MDA−MB−231、NCI−H441、Panc−1、MIA PaCa−2、BxPC3、DU−145、M2182、VCaP、OvCar−3、MCF−7、U937、K562、HeLa、T98G、またはSHP−77腫瘍モデルマウスが含まれる。in vivo実験における例において、本発明のdsRNAを、このようなマウスモデルに、1〜10mg/kgの範囲の用量で尾静脈注射するか、または繰り返し用量を、単一用量のIC50レベルで投与し、臓器(例えば前立腺、肝臓、腎臓、肺、膵臓、結腸、皮膚、脾臓、骨髄、リンパ節、乳腺脂肪体など)を、最終用量を投与してから24時間後に回収する。ついでこのような臓器を、使用するモデルに応じてマウスおよび/またはヒトMYCレベルに関して評価する。活性期間も最終dsRNA投与から1、4、7、14、21日またはそれ以上で試験できる。
本発明の実施は、他に指摘がない限り、当業者の技術内である、化学、分子生物学、微生物学、組換え体DNA、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来の技術を使用する。例えば、Maniatis et al.,1982, Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.);Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.);Sambrook and Russell,2001,Molecular Cloning,3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.);Ausubel et al.,1992),Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,including periodic updates);Glover,1985,DNA Cloning(IRL Press,Oxford);Anand,1992;Guthrie and Fink,1991;Harlow and Lane,1988,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.);Jakoby and Pastan,1979;Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984);Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984);Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Methods In Enzymology,Vols.154 and 155(Wu et al.eds.),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I−IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986);Riott,Essential Immunology,6th Edition,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988;Hogan et al.,Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986);Westerfield,M.,The zebrafish book.A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio),(4th Ed.,Univ.of Oregon Press,Eugene,2000)を参照のこと。
他に定義しない限り、本明細書で使用したすべての技術的かつ化学的語句は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を持つ。本明細書で記述したものと同様または等価の方法および物質を、本発明の実施または試験で使用できるが、好適な方法および物質が以下で記述されている。すべての発行物、特許明細書、特許、および本明細書で言及された他の参考文献が、参考文献として援用される。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が制御する。さらに、物質、方法および実施例は単なる例示であり、限定する意図はない。
本発明は、以下の実施例を参照して記述され、これらは例示するために共されるものであり、任意の方法で本発明の限定を意図するものではない。本技術分野でよく知られている標準技術、または以下で特に記述される技術を使用した。
実施例1:二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチド合成および精製
DsiRNA分子は、RNAメッセージ中の種々の部位、例えば本明細書で記述したRNA配列内の標的配列と相互作用するようにデザインできる。本例示の薬剤において、327のヒト標的MYC配列および144のマウス標的MYC配列を評価するため選択した(327のヒト標的MYC部位のうち183が、マウスMYC転写配列中の対応する部位と共に保存されていることが予測された)。DsiRNA分子の1つの鎖の配列は、上述の標的MYC部位配列と相補的であった。DsiRNA分子は、本明細書で記述した方法を用いて化学的に合成した。一般に、DsiRNA構築物を、19〜23マーsiRNAに対して記述したような固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した(例えば、Usmanらの米国特許第5,804,683号;第5,831,071号;第5,998,203号;第6,117,657号;第6,353,098号;第6,362,323号;第6,437,117号;第6,469,158号; Scaringeらの米国特許第6,111,086号;第6,008,400号;第6,111,086号を参照のこと)。
オリゴヌクレオチド合成および精製
DsiRNA分子は、RNAメッセージ中の種々の部位、例えば本明細書で記述したRNA配列内の標的配列と相互作用するようにデザインできる。本例示の薬剤において、327のヒト標的MYC配列および144のマウス標的MYC配列を評価するため選択した(327のヒト標的MYC部位のうち183が、マウスMYC転写配列中の対応する部位と共に保存されていることが予測された)。DsiRNA分子の1つの鎖の配列は、上述の標的MYC部位配列と相補的であった。DsiRNA分子は、本明細書で記述した方法を用いて化学的に合成した。一般に、DsiRNA構築物を、19〜23マーsiRNAに対して記述したような固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した(例えば、Usmanらの米国特許第5,804,683号;第5,831,071号;第5,998,203号;第6,117,657号;第6,353,098号;第6,362,323号;第6,437,117号;第6,469,158号; Scaringeらの米国特許第6,111,086号;第6,008,400号;第6,111,086号を参照のこと)。
個々のRNA鎖を合成し、標準の方法にしたがってHPLC精製した(Integrated DNA Technologies,アイオワ州 コーラルビル)。例えば、RNAオリゴヌクレオチドを、標準技術(Damha and Olgivie, 1993, Methods Mol Biol 20: 81−114; Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res 23: 2677−84)を用いて、固相ホスホロアミダイト化学反応を用いて合成し、脱保護し、NAP−5カラム(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,N.J.)上で脱塩した。オリゴマーを、15分間段階直線勾配を用いて、Amersham Source 15Qカラム(1.0cm×25cm; Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ)上のイオン交換高性能液体クロマトグラフィー(IE−HPLC)を用いて精製した。勾配は、90:10 緩衝液A:B〜52:48 緩衝液A:Bで変化し、ここで緩衝液Aは100mM Tris pH8.5であり、緩衝液Bは100mM Tris pH8.5、1M NaClである。試料を260nmでモニタし、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークを回収し、プールし、NAP−5カラム上で脱塩し、凍結乾燥した。
各オリゴマーの精度を、Beckman PACE 5000(Beckman Coulter, Inc.、カリフォルニア州フラートン)上でのキャピラリー電気泳動(CE)によって決定した。CEキャピラリーは、100μm内径を持ち、ssDNA 100R Gel(Beckman−Coulter)を含む。概して、約0.6nmolのオリゴヌクレオチドをキャピラリー内に注入し、444V/cmの電場中で走らせ、260nmでのUV吸光度によって検出した。変性Tris−ホウ酸塩−7M−尿素ランニング緩衝液をBeckman−Coulterから購入した。オリゴリボヌクレオチドを、以下に記述する実験での使用のために、CEによって評価したように、少なくとも90%純度で得た。化合物同一性を、製造業者の推奨プロトコールにしたがって、Voyager DE.TM.Biospectometry Work Station(Applied Biosystems,カリフォルニア州フォスターシティ)上での、マトリックス補助レーザー吸収イオン化飛行時間(MALDI−TOF)質量分析によって確認した。しばしば0.2%の予測分子量内で、すべてのオリゴマーの相対分子量を得た。
二本鎖の調製
一本鎖RNA(ssRNA)オリゴマーを、例えば100mM 酢酸カリウム、30mM HEPES pH7.5からなる二本鎖緩衝液中100μM濃度で、再懸濁した。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を等モル量で混合し、例えば50μM二本鎖の最終溶液を得た。試料をRNA緩衝液(IDT)中5’間100℃まで熱し、使用の前に室温まで冷却した。二本鎖RNA(dsRNA)オリゴマーを−20℃で保存した。一本鎖RNAオリゴマーを、凍結乾燥または−80℃にてヌクレアーゼフリーの水中で保存した。
一本鎖RNA(ssRNA)オリゴマーを、例えば100mM 酢酸カリウム、30mM HEPES pH7.5からなる二本鎖緩衝液中100μM濃度で、再懸濁した。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を等モル量で混合し、例えば50μM二本鎖の最終溶液を得た。試料をRNA緩衝液(IDT)中5’間100℃まで熱し、使用の前に室温まで冷却した。二本鎖RNA(dsRNA)オリゴマーを−20℃で保存した。一本鎖RNAオリゴマーを、凍結乾燥または−80℃にてヌクレアーゼフリーの水中で保存した。
命名法
一貫性のために、以下の命名法を本明細書で使用した。二本鎖に与えた名前は、オリゴマーの長さと、オーバーハングの有無とを示唆する。「25/27」は、2−塩基3’−オーバーハングを含む、25塩基センス鎖と、27塩基アンチセンス鎖とを持つ非対称二本鎖である。「27/25」は、27塩基センス鎖と25塩基アンチセンス鎖とを持つ非対称二本鎖である。
一貫性のために、以下の命名法を本明細書で使用した。二本鎖に与えた名前は、オリゴマーの長さと、オーバーハングの有無とを示唆する。「25/27」は、2−塩基3’−オーバーハングを含む、25塩基センス鎖と、27塩基アンチセンス鎖とを持つ非対称二本鎖である。「27/25」は、27塩基センス鎖と25塩基アンチセンス鎖とを持つ非対称二本鎖である。
細胞培養およびRNAトランスフェクション
A549細胞を、ATCCより得、5%CO2下、37℃にて、10%ウシ胎児血清(HyClone)を含むDMEM(HyClone)中で維持した。Hepa 1−6細胞をATCCより得、5%CO2下、37℃にて、10%ウシ胎児血清(HyClone)を含むDMEM(HyClone)中で維持した。RNAトランスフェクションのために、細胞を、Lipofectamine(商標)RNAiMAX(Invitorogen)を用いて、製造業者の取り扱い説明書にしたがって、1nM、0.3nM、または0.1nMの最終濃度で示唆したようなDsiRNAでトランスフェクトした。簡単に記すと、たとえば以下の実施例3の0.1nMのトランスフェクションでは、各DsiRNAのストック溶液の一定分量を、Opti−MEM I(Invitrogen)およびLipofectamin(商標)RNAiMAXと、150μL(0.3nM DsiRNAを備える)の容量に達するまで混合した。得られた150μL混合液を、室温にて20分間インキュベートして、DsiRNA:Lipofectamine(商標)RNAiMAX複合体を形成させた。一方、標的細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁させた。20分間の複合体形成の終わりに、ウェルあたり50μLのsiRNA:RNAiMAX混合物を、96ウェルプレート中の3組のウェルに添加した。最後に、細胞懸濁液100μLを各ウェル加え(最終容量150μL)、プレートを24時間インキュベーター内に配置した。
A549細胞を、ATCCより得、5%CO2下、37℃にて、10%ウシ胎児血清(HyClone)を含むDMEM(HyClone)中で維持した。Hepa 1−6細胞をATCCより得、5%CO2下、37℃にて、10%ウシ胎児血清(HyClone)を含むDMEM(HyClone)中で維持した。RNAトランスフェクションのために、細胞を、Lipofectamine(商標)RNAiMAX(Invitorogen)を用いて、製造業者の取り扱い説明書にしたがって、1nM、0.3nM、または0.1nMの最終濃度で示唆したようなDsiRNAでトランスフェクトした。簡単に記すと、たとえば以下の実施例3の0.1nMのトランスフェクションでは、各DsiRNAのストック溶液の一定分量を、Opti−MEM I(Invitrogen)およびLipofectamin(商標)RNAiMAXと、150μL(0.3nM DsiRNAを備える)の容量に達するまで混合した。得られた150μL混合液を、室温にて20分間インキュベートして、DsiRNA:Lipofectamine(商標)RNAiMAX複合体を形成させた。一方、標的細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁させた。20分間の複合体形成の終わりに、ウェルあたり50μLのsiRNA:RNAiMAX混合物を、96ウェルプレート中の3組のウェルに添加した。最後に、細胞懸濁液100μLを各ウェル加え(最終容量150μL)、プレートを24時間インキュベーター内に配置した。
MYC阻害の評価
MYC標的遺伝子ノックダウンを、HPRTおよびSFRS9ハウスキーピング遺伝子に対して、そして対照DsiRNAおよび/またはモックトランスフェクション対照でのトランスフェクションに対して標準化した値を用い、qRT−PCRによって決定した。
MYC標的遺伝子ノックダウンを、HPRTおよびSFRS9ハウスキーピング遺伝子に対して、そして対照DsiRNAおよび/またはモックトランスフェクション対照でのトランスフェクションに対して標準化した値を用い、qRT−PCRによって決定した。
RNA単離および解析
培地を吸引し、総RNAをSV96キット(Promega)を用いて抽出した。総RNAを、製造業者の取扱説明書にしたがって、SuperscriptII、Oligo dTおよびランダムヘキサマーを用いて逆転写した。概して、得られたcDNAを、MYC遺伝子、ならびにヒト遺伝子HPRT−1およびSFRS9に特異的なプライマーとプローブとを用いて、qPCRによって解析した。ABI7700を、増幅反応のために使用した。各試料を三重で試験した。相対MYC RNAレベルを、HPRT1およびSFRS9 RNAレベルに対して標準化し、トランスフェクション対照試料中で得たRNAレベルと比較した。
培地を吸引し、総RNAをSV96キット(Promega)を用いて抽出した。総RNAを、製造業者の取扱説明書にしたがって、SuperscriptII、Oligo dTおよびランダムヘキサマーを用いて逆転写した。概して、得られたcDNAを、MYC遺伝子、ならびにヒト遺伝子HPRT−1およびSFRS9に特異的なプライマーとプローブとを用いて、qPCRによって解析した。ABI7700を、増幅反応のために使用した。各試料を三重で試験した。相対MYC RNAレベルを、HPRT1およびSFRS9 RNAレベルに対して標準化し、トランスフェクション対照試料中で得たRNAレベルと比較した。
実施例2:MYCのDsiRNA阻害
MYCを標的としているDsiRNA分子を、上述のようにデザインして合成し、阻害有効性に関してヒトA549細胞またはマウスHepa 1−6細胞中で試験した。トランスフェクションのために、アニールしたDsiRNAを、トランスフェクション試薬(Lipofectamin(商標)RNAiMAX、Invitrogen)と混合し、室温にて20分間インキュベートした。A549(ヒト)またはHepa 1−6(マウス)細胞をトリプシン処理し、培地中で再懸濁し、ウェルに加え(100μL/ウェル)、150μlの容量で、1nMの最終DsiRNA濃度を得た。各DsiRNAトランスフェクション混合液を、三重DsiRNA処理のために3つのウェルに加えた。細胞を37℃にて24時間、DsiRNAトランスフェクション混合液の継続存在下、インキュベートした。24時間の時点で、RNAを処理した細胞の各ウェルから調製した。トランスフェクション混合液を含む上清をまず除去して廃棄し、ついで細胞を溶解し、各ウェルからRNAを調製した。処理後の標的MYC RNAレベルを、値を対照から得られた値に対して標準化して、MYC標的遺伝子に対してqRT−PCRによって評価した。三重のデータを平均し、%エラーを各処置に対して決定した。標準化データをグラフにし、対照との比較で、活性DsiRNAによる標的mRNAの減少を決定した。
MYCを標的としているDsiRNA分子を、上述のようにデザインして合成し、阻害有効性に関してヒトA549細胞またはマウスHepa 1−6細胞中で試験した。トランスフェクションのために、アニールしたDsiRNAを、トランスフェクション試薬(Lipofectamin(商標)RNAiMAX、Invitrogen)と混合し、室温にて20分間インキュベートした。A549(ヒト)またはHepa 1−6(マウス)細胞をトリプシン処理し、培地中で再懸濁し、ウェルに加え(100μL/ウェル)、150μlの容量で、1nMの最終DsiRNA濃度を得た。各DsiRNAトランスフェクション混合液を、三重DsiRNA処理のために3つのウェルに加えた。細胞を37℃にて24時間、DsiRNAトランスフェクション混合液の継続存在下、インキュベートした。24時間の時点で、RNAを処理した細胞の各ウェルから調製した。トランスフェクション混合液を含む上清をまず除去して廃棄し、ついで細胞を溶解し、各ウェルからRNAを調製した。処理後の標的MYC RNAレベルを、値を対照から得られた値に対して標準化して、MYC標的遺伝子に対してqRT−PCRによって評価した。三重のデータを平均し、%エラーを各処置に対して決定した。標準化データをグラフにし、対照との比較で、活性DsiRNAによる標的mRNAの減少を決定した。
試験の一次段階でのMYC阻害の効果に関して試験したMYC標的化DsiRNAは、以下の表8に示される。この例では、471の非対称性DsRNA(試験したDsiRNAは25/27マー構造を有した)が構築され、1nMの濃度で、このようなDsiRNAが存在する中でインキュベートしたヒトA549細胞およびマウスHepa 1−6細胞におけるMYC阻害の効果を試験した。最初のスクリーニングで試験した471の非対称性のDsiRNAは、上記の表2および4に示される2´‐O‐メチル改変残基を有するDsiRNAを含んだ。ここで、下線が引かれたヌクレオチド残基は、2´‐O‐メチル改変残基を示し、リボヌクレオチド残基は、大文字で示され、デオキシリボヌクレオチド残基は、小文字で示される。
1nMでのヒトA549細胞およびマウスHepa 1−6細胞における471のMYC標的化DsiRNAのアッセイにより、以下のMYCの阻害有効性が明らかとなり、この結果を表9および10に表した。MYCレベルを、MYC転写物内の指定の位置に配置したqPCRアッセイを使用して判定した(ヒトA549細胞の実験では、3つの異なるqPCRアッセイを実施し、「Hs MYC 514−620」(FAM)、「Hs MYC 1227−1347」(MAX)、および「Hs MYC 1771−1882」(MAX)と表し;マウスHepa 1−6細胞では、3つの異なるqPCRアッセイを実施し、「Mm MYC 539−663」(FAM)、「Mm MYC 1339−1428」(MAX)および「Mm MYC 1971−2062」(MAX)と表した。
上記の表9に示されるように、ヒトA549細胞での試験でアッセイした327の非対称性DsiRNAうちの24が、平均で、1nMにてA549細胞におけるヒトMYCレベルの50%超の低減を再現的に示した(MYC−607、MYC−1364、MYC−1370、MYC−1382、MYC−1457、MYC−1465、MYC−1698、MYC−1734、MYC−1769、MYC−1779、MYC−1795、MYC−1808、MYC−1823、MYC−1828、MYC−1845、MYC−1855、MYC−1882、MYC−1911、MYC−1931、MYC−2099、MYC−2120、MYC−2306、MYC−1360およびMYC−1468)。ヒト細胞で実施したアッセイ間で顕著なばらつきが観察され、28の異なる二本鎖は実施した3つのアッセイのうち少なくとも2つでMycレベルにおける50%超の低減を示した(MYC−1116、MYC−1346、MYC−1351、MYC−1364、MYC−1370、MYC−1382、MYC−1457、MYC−1465、MYC−1584、MYC−1698、MYC−1734、MYC−1769、MYC−1779、MYC−1795、MYC−1808、MYC−1823、MYC−1828、MYC−1845、MYC−1855、MYC−1882、MYC−1911、MYC−1931、MYC−2306、MYC−1360、MYC−1468、MYC−1483、MYC−1711およびMYC−1712)。一方で、47の異なる二本鎖は、1次スクリーニング中の1つのアッセイのみでヒトMycレベルにおける少なくとも50%の低減を示した:MYC−548、MYC−601、MYC−607、MYC−920、MYC−949、MYC−970、MYC−1111、MYC−1340、MYC−1555、MYC−1599、MYC−1639、MYC−1687、MYC−1850、MYC−1893、MYC−1921、MYC−1926、MYC−1944、MYC−1965、MYC−1970、MYC−1976、MYC−1981、MYC−1989、MYC−1994、MYC−2001、MYC−2006、MYC−2013、MYC−2026、MYC−2031、MYC−2040、MYC−2048、MYC−2066、MYC−2073、MYC−2083、MYC−2094、MYC−2099、MYC−2114、MYC−2120、MYC−2176、MYC−2188、MYC−2233、MYC−2300、MYC−622、MYC−952、MYC−953、MYC−1482、MYC−2115およびMYC−2196。
また、マウス細胞で実施したアッセイ間でも顕著なばらつきが観察され、3つの異なる二本鎖のみが実施した3つのアッセイのうち少なくとも2つのアッセイでMycレベルにおける50%超の低下を示した(MYC−953、MYC−1360、およびMYC−2187)。一方で、23の異なる二本鎖が1つのアッセイのみでマウスMycレベルにおける少なくとも50%超の低下を示した:MYC−952、MYC−1468、MYC−m1391、MYC−m1396、MYC−m2016、MYC−m2034、MYC−m2039、MYC−m2064、MYC−m2069、MYC−m2110、MYC−m2117、MYC−m2125、MYC−m2131、MYC−m2136、MYC−m2159、MYC−m2166、MYC−m2171、MYC−m2194、MYC−m2200、MYC−m2208、MYC−m2255およびMYC−m2296。
上記の表9および10のアッセイの結果をプロットし、図2A〜2Hに示した。
実施例3:MYCのDsiRNA阻害−二次スクリーニング
上記の実験の96の非対称DsiRNA(92のHsMYC標的化および4つのMmMYC固有標的化)を、ついで二次アッセイで試験し(「相2」)、このようなアッセイの結果を、図3A〜3Hにてヒストグラムの形態で示した。特に、上記で試験した327から選択した96の非対称DsiRNAを、ヒトA549細胞の環境中1nMおよび0.1nMにて、ヒトMYCの阻害に関して二重に評価した(図3A〜3D)。これらの96非対称DsiRNAをまた、マウスHepa 1−6細胞の環境中1nMおよび0.1nMにて、マウスMYCの阻害に関して評価した(図3E〜3H)。図3A〜3Dにて示すように、多くの非対称DsiRNAが、A549細胞の環境中でアッセイした時に、サブナノモル濃度にて、顕著なヒトMYC阻害有効性を再現可能に示した。さらに、図3E〜3Hで示すように、多数の非対称DsiRNAがまた、マウスHepa1−6細胞の環境中でアッセイした時に、サブナノモル濃度にて、顕著なマウスMYC阻害有効性を有すると同定された。(特に、ヒトMYC特異的にまたはマウスMYC特異的にのいずれかで阻害できるDsiRNAならびに、両方の種において顕著にMYCを阻害できるDsiRNAが全て同定された。)
上記の実験の96の非対称DsiRNA(92のHsMYC標的化および4つのMmMYC固有標的化)を、ついで二次アッセイで試験し(「相2」)、このようなアッセイの結果を、図3A〜3Hにてヒストグラムの形態で示した。特に、上記で試験した327から選択した96の非対称DsiRNAを、ヒトA549細胞の環境中1nMおよび0.1nMにて、ヒトMYCの阻害に関して二重に評価した(図3A〜3D)。これらの96非対称DsiRNAをまた、マウスHepa 1−6細胞の環境中1nMおよび0.1nMにて、マウスMYCの阻害に関して評価した(図3E〜3H)。図3A〜3Dにて示すように、多くの非対称DsiRNAが、A549細胞の環境中でアッセイした時に、サブナノモル濃度にて、顕著なヒトMYC阻害有効性を再現可能に示した。さらに、図3E〜3Hで示すように、多数の非対称DsiRNAがまた、マウスHepa1−6細胞の環境中でアッセイした時に、サブナノモル濃度にて、顕著なマウスMYC阻害有効性を有すると同定された。(特に、ヒトMYC特異的にまたはマウスMYC特異的にのいずれかで阻害できるDsiRNAならびに、両方の種において顕著にMYCを阻害できるDsiRNAが全て同定された。)
実施例4:MYC‐標的化DsiRNAの改変形態がIn vitroでMYCレベルを低減する。
24のMYC‐標的化DsiRNA(MYC−607、MYC−622、MYC−953、MYC−1360、MYC−1364、MYC−1370、MYC−1698、MYC−1711、MYC−1712、MYC−1769、MYC−1926、MYC−1931、MYC−1944、MYC−1965、MYC−1981、MYC−2040、MYC−2066、MYC−2099、MYC−2114、MYC−2115、MYC−2120、MYC−2176、MYC−2196およびMYC−2233)を、上記に示すように2´‐O‐メチルガイド鎖改変パターン「M17」、「M35」、「M48」、および「M8」で調製した。24のDsiRNA配列の各配列について、4つのガイド鎖改変パターンM17、M35、M48およびM8のそれぞれを有するDsiRNAを、A549細胞の環境中、1.0nMおよび0.1nMの濃度でヒトA549細胞中でのMYC阻害に関して(二重に)アッセイした。これらの実験の結果を、図4A〜4Dにてヒストグラムとして示す。また、これらの同じ二本鎖をマウスHepa 1−6細胞においてもアッセイし、図4E〜4Hに対応する結果を示した。一般に、24のDsiRNA配列は、ガイド鎖の2’−O−メチル改変の程度が増加するように、MYC阻害有効性を減少させる傾向を示した。しかしながら、試験した多くのDsiRNA配列に関して、改変パターンは、in vitroにて有意なMYC阻害有効性をDsiRNAが維持することが同定可能であった。また、これらのDsiRNAの多く(たとえばMYC−1712、MYC−1931、MYC−1944、MYC−1965、MYC−2066、MYC−2114、MYC−2120およびMYC−2233)は、試験した最も多く改変した状態においてさえも、MYC阻害有効性が明らかに減少しなかったことも注目された。したがって、このような活性型の改変DsiRNA配列は、in vivoで対象に治療的に投与される際に、このようなDsiRNAを安定化させ、かつ/またはこのようなDsiRNAの免疫原性を低減させることができると考えられる改変パターンを有する。
24のMYC‐標的化DsiRNA(MYC−607、MYC−622、MYC−953、MYC−1360、MYC−1364、MYC−1370、MYC−1698、MYC−1711、MYC−1712、MYC−1769、MYC−1926、MYC−1931、MYC−1944、MYC−1965、MYC−1981、MYC−2040、MYC−2066、MYC−2099、MYC−2114、MYC−2115、MYC−2120、MYC−2176、MYC−2196およびMYC−2233)を、上記に示すように2´‐O‐メチルガイド鎖改変パターン「M17」、「M35」、「M48」、および「M8」で調製した。24のDsiRNA配列の各配列について、4つのガイド鎖改変パターンM17、M35、M48およびM8のそれぞれを有するDsiRNAを、A549細胞の環境中、1.0nMおよび0.1nMの濃度でヒトA549細胞中でのMYC阻害に関して(二重に)アッセイした。これらの実験の結果を、図4A〜4Dにてヒストグラムとして示す。また、これらの同じ二本鎖をマウスHepa 1−6細胞においてもアッセイし、図4E〜4Hに対応する結果を示した。一般に、24のDsiRNA配列は、ガイド鎖の2’−O−メチル改変の程度が増加するように、MYC阻害有効性を減少させる傾向を示した。しかしながら、試験した多くのDsiRNA配列に関して、改変パターンは、in vitroにて有意なMYC阻害有効性をDsiRNAが維持することが同定可能であった。また、これらのDsiRNAの多く(たとえばMYC−1712、MYC−1931、MYC−1944、MYC−1965、MYC−2066、MYC−2114、MYC−2120およびMYC−2233)は、試験した最も多く改変した状態においてさえも、MYC阻害有効性が明らかに減少しなかったことも注目された。したがって、このような活性型の改変DsiRNA配列は、in vivoで対象に治療的に投与される際に、このようなDsiRNAを安定化させ、かつ/またはこのようなDsiRNAの免疫原性を低減させることができると考えられる改変パターンを有する。
実施例5:MYC‐標的化DsiRNAのさらなる改変形態は、In vitroでMYCレベルを低減する。
19のMYC標的化DsiRNA(MYC−622、MYC−953、MYC−1364、MYC−1370、MYC−1698、MYC−1711、MYC−1769、MYC−1926、MYC−1931、MYC−1944、MYC−1965、MYC−2040、MYC−2066、MYC−2099、MYC−2115、MYC−2120、MYC−2176、MYC−2196およびMYC−2233)を、2´‐O‐メチルパッセンジャー鎖およびガイド鎖改変パターンの両方で調製した。19のDsiRNA配列のそれぞれで、SM12、SM14、SM24および SM31から選択されるパッセンジャー鎖改変パターン(図5A〜5Fおよび6A〜6Dでは単純に「M12」、「M14」、「M24」、および「M31」と呼び、ここではパッセンジャー鎖改変パターンが最初に列挙される改変パターンであり、それにガイド鎖改変パターンが続く、たとえば図5A〜5Fおよび6A〜6Dにおける「M12−M48」は、パッセンジャー鎖改変パターン「SM12」およびガイド鎖改変パターン「M48」を有する二本鎖を示す)、ならびに、M17、M35、M48およびM8から選択されるガイド鎖改変パターンを有するDsiRNAを、A549細胞環境中1.0nMおよび0.1Mの濃度で、ヒトA549細胞中でのMYC阻害に関して(二重に)アッセイした。これらの実験の結果を、図5A〜5F中にヒストグラムとして表した。上記の実施例4のように、概して、19のDsiRNA配列は、パッセンジャー鎖およびガイド鎖の両方の2´‐O‐メチル改変の度合いが増大するにつれてMYC阻害の効力を低減する傾向を示した。しかしながら、試験した多くのDsiRNA配列について、パッセンジャー鎖およびガイド鎖の改変パターンの組み合わせは、in vitroでDsiRNAが顕著なMYC阻害有効性を保持できたことが確認された。また、これらのDsiRNAのうちの一部(たとえばMYC−1769およびMYC−1965)が試験した最も高度に改変された状態においてでさえ明らかなMYC阻害有効性の減少をみせなかったことは、注目すべきことであった。したがって、このような活性型の改変DsiRNA配列は、in vivoで対象に治療的に投与される際、このようなDsiRNAを安定化でき、かつ/またはこのようなDsiRNAの免疫原性を低減できると考えられる改変パターンを有する。
19のMYC標的化DsiRNA(MYC−622、MYC−953、MYC−1364、MYC−1370、MYC−1698、MYC−1711、MYC−1769、MYC−1926、MYC−1931、MYC−1944、MYC−1965、MYC−2040、MYC−2066、MYC−2099、MYC−2115、MYC−2120、MYC−2176、MYC−2196およびMYC−2233)を、2´‐O‐メチルパッセンジャー鎖およびガイド鎖改変パターンの両方で調製した。19のDsiRNA配列のそれぞれで、SM12、SM14、SM24および SM31から選択されるパッセンジャー鎖改変パターン(図5A〜5Fおよび6A〜6Dでは単純に「M12」、「M14」、「M24」、および「M31」と呼び、ここではパッセンジャー鎖改変パターンが最初に列挙される改変パターンであり、それにガイド鎖改変パターンが続く、たとえば図5A〜5Fおよび6A〜6Dにおける「M12−M48」は、パッセンジャー鎖改変パターン「SM12」およびガイド鎖改変パターン「M48」を有する二本鎖を示す)、ならびに、M17、M35、M48およびM8から選択されるガイド鎖改変パターンを有するDsiRNAを、A549細胞環境中1.0nMおよび0.1Mの濃度で、ヒトA549細胞中でのMYC阻害に関して(二重に)アッセイした。これらの実験の結果を、図5A〜5F中にヒストグラムとして表した。上記の実施例4のように、概して、19のDsiRNA配列は、パッセンジャー鎖およびガイド鎖の両方の2´‐O‐メチル改変の度合いが増大するにつれてMYC阻害の効力を低減する傾向を示した。しかしながら、試験した多くのDsiRNA配列について、パッセンジャー鎖およびガイド鎖の改変パターンの組み合わせは、in vitroでDsiRNAが顕著なMYC阻害有効性を保持できたことが確認された。また、これらのDsiRNAのうちの一部(たとえばMYC−1769およびMYC−1965)が試験した最も高度に改変された状態においてでさえ明らかなMYC阻害有効性の減少をみせなかったことは、注目すべきことであった。したがって、このような活性型の改変DsiRNA配列は、in vivoで対象に治療的に投与される際、このようなDsiRNAを安定化でき、かつ/またはこのようなDsiRNAの免疫原性を低減できると考えられる改変パターンを有する。
特定の実施形態では、MYC mRNAにおける以下の配列を標的とする二本鎖核酸を選択した。
さらに選択したMYC mRNA標的配列は、
を含む。
さらに選択したMYCmRNA標的配列は、
を含む。
MYC mRNA標的のうちさらに特定して選択したものは以下を含む。
MYC mRNA標的のうちさらに特定して選択したものは以下を含む。
実施例6:MYC‐標的化DsiRNAの標的mRNAミスマッチ耐性
7つの異なる天然のMYC mRNA標的化DsiRNA(MYC−622、MYC−953、MYC−1364、MYC−1370、MYC−1711、MYC−1769、およびMYC−1965)が標的mRNA配列に関するミスマッチを組み込み、それにも関わらず強力な阻害活性を依然として保持することができるかどうかを試験した。図6A〜6Dに示すように、以下のDsiRNA二本鎖配列(表示されるようなパッセンジャー鎖−ガイド鎖改変パターンを有する)のMYCノックダウン活性を試験した(太字は標的MYC転写配列に関するミスマッチを形成する残基を表す)。
7つの異なる天然のMYC mRNA標的化DsiRNA(MYC−622、MYC−953、MYC−1364、MYC−1370、MYC−1711、MYC−1769、およびMYC−1965)が標的mRNA配列に関するミスマッチを組み込み、それにも関わらず強力な阻害活性を依然として保持することができるかどうかを試験した。図6A〜6Dに示すように、以下のDsiRNA二本鎖配列(表示されるようなパッセンジャー鎖−ガイド鎖改変パターンを有する)のMYCノックダウン活性を試験した(太字は標的MYC転写配列に関するミスマッチを形成する残基を表す)。
図6A〜6Dに示されるように、標的MYC転写配列に関するミスマッチを有する上記の二本鎖の大部分はMYCノックダウン活性を保持した。多くの場合、このようなノックダウンの効力は、天然の二本鎖配列で観察された効力と同様の効力であった。
実施例7:in vitroでのMYC標的化DsiRNAのさらなる改変パターンの評価
3つのMYC標的化二本鎖配列(MYC−622、MYC−953およびMYC−1711)の抗MYC活性の頑強性を、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の様々な改変を有する(上述のように、また使用した二本鎖改変パターンの概要に関しては図7Aおよび7Hを参照、およびセンス鎖およびアンチセンス鎖の個々の改変パターンの概要は図7Iおよび7Jを参照)状態でさらに試験した。図7Kおよび7Lに示されるように、MYC−622、MYC−953およびMYC 1711二本鎖のそれぞれの高度に改変された多くの形態が強力な阻害活性を有すると確認され、このような新規に試験した改変二本鎖は「相5」でM12−M48改変二本鎖について観察される活性レベルを改善した(上に記載)。したがって、高度に改変されており、強力に活性な多くのMYC二本鎖が同定された。
3つのMYC標的化二本鎖配列(MYC−622、MYC−953およびMYC−1711)の抗MYC活性の頑強性を、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の様々な改変を有する(上述のように、また使用した二本鎖改変パターンの概要に関しては図7Aおよび7Hを参照、およびセンス鎖およびアンチセンス鎖の個々の改変パターンの概要は図7Iおよび7Jを参照)状態でさらに試験した。図7Kおよび7Lに示されるように、MYC−622、MYC−953およびMYC 1711二本鎖のそれぞれの高度に改変された多くの形態が強力な阻害活性を有すると確認され、このような新規に試験した改変二本鎖は「相5」でM12−M48改変二本鎖について観察される活性レベルを改善した(上に記載)。したがって、高度に改変されており、強力に活性な多くのMYC二本鎖が同定された。
実施例8:MYC標的化DsiRNAのIn vivoでの効力
特定の、活性MYC標的化DsiRNAがヒトの肝細胞癌(HCC)の2つの同所性モデル、Hep3BおよびHepG2内での腫瘍負荷を低減する能力を試験した。このような実験を実施するために、オスのヌードマウスに、50%のマトリゲル中の2×106のHep3B細胞(ATCC)を同所的に移植した。移植後12日目に、ヒトαフェトプロテイン(AFP)分析のために血清を収集した(ヒトAFPはHCC腫瘍、たとえば、Hep3BおよびHepG2腫瘍の確立および進行を表す血清マーカーである)。動物をランダム化し、AFPレベルに基づき複数のグループに分けた(n=7/グループ)。DsiRNAを含む脂質ナノ粒子(LNP)(ここでは、EnCore−2072と名付けられたLNP製剤を使用した)の動物への投与を13日目に開始した。動物は、5mg/kg、静脈内投与、1週間に3回×2(合計6回投与)で投与した。動物を、最後の投与から48時間後(移植後27日目)に屠殺した。腫瘍を肝臓から切り取り重量を測定した。図8に示されるように、試験した全てのMYC標的化DsiRNAは、未処置の対照と比較して、顕著な腫瘍の減少を示した。特に、試験したMYC標的化DsiRNA MYC−622、MYC−953、MYC−1364、MYC−1370、MYC−1711およびMYC−1769の示された全ての改変形態は、PBS処置の対照と比較して、61%〜81%の間の程度の腫瘍阻害を表した。これらのHep3B腫瘍減少のレベルと一致して、AFPレベルの減少も観察された(図示せず)。明らかに、ヒトおよびマウスのMYCの両方を標的とするDsiRNAならびにヒトのMYCのみを標的とするDsiRNAは、腫瘍レベルの有効な減少を示しており、観察された効果がヒトMYCのDsiRNA媒介型標的化によるものであることが確認された。
特定の、活性MYC標的化DsiRNAがヒトの肝細胞癌(HCC)の2つの同所性モデル、Hep3BおよびHepG2内での腫瘍負荷を低減する能力を試験した。このような実験を実施するために、オスのヌードマウスに、50%のマトリゲル中の2×106のHep3B細胞(ATCC)を同所的に移植した。移植後12日目に、ヒトαフェトプロテイン(AFP)分析のために血清を収集した(ヒトAFPはHCC腫瘍、たとえば、Hep3BおよびHepG2腫瘍の確立および進行を表す血清マーカーである)。動物をランダム化し、AFPレベルに基づき複数のグループに分けた(n=7/グループ)。DsiRNAを含む脂質ナノ粒子(LNP)(ここでは、EnCore−2072と名付けられたLNP製剤を使用した)の動物への投与を13日目に開始した。動物は、5mg/kg、静脈内投与、1週間に3回×2(合計6回投与)で投与した。動物を、最後の投与から48時間後(移植後27日目)に屠殺した。腫瘍を肝臓から切り取り重量を測定した。図8に示されるように、試験した全てのMYC標的化DsiRNAは、未処置の対照と比較して、顕著な腫瘍の減少を示した。特に、試験したMYC標的化DsiRNA MYC−622、MYC−953、MYC−1364、MYC−1370、MYC−1711およびMYC−1769の示された全ての改変形態は、PBS処置の対照と比較して、61%〜81%の間の程度の腫瘍阻害を表した。これらのHep3B腫瘍減少のレベルと一致して、AFPレベルの減少も観察された(図示せず)。明らかに、ヒトおよびマウスのMYCの両方を標的とするDsiRNAならびにヒトのMYCのみを標的とするDsiRNAは、腫瘍レベルの有効な減少を示しており、観察された効果がヒトMYCのDsiRNA媒介型標的化によるものであることが確認された。
MYC標的化DsiRNAがHCCのHepG2モデルでの腫瘍負荷を低減する能力もまた試験した。これらの実験では、オスのヌードマウスに、50%マトリゲル中の3×106のHepG2細胞(ATCC)を同所的に移植した。移植後12日目に、AFP分析用に血清を収集した。動物をランダム化し、AFPレベルに基づき複数のグループに分けた(n=15/グループ)。DsiRNAを含む脂質ナノ粒子(LNP)(ここでは、EnCore−2072と名付けられたLNP製剤を使用した)の動物への投与を13日目に開始した。動物は、5mg/kg、静脈内投与、1週間に3回×2(合計7回)で投与した。動物を、最後の投与から48時間後(移植後29日目)に屠殺した。肝臓から腫瘍を切り取り重量を測定した。図9に示されるように、HepG2腫瘍負荷の顕著な減少が、β‐2カテニン標的化DsiRNA(HepG2はβカテニン依存性であると知られる)またはMYC−622 DsiRNAのいずれかを投与したマウスで観察された。ここで、腫瘍低減の度合いを、HPRT1ハウスキーピング遺伝子を標的とするDsiRNAと比較し、これにより、MYC−622 DsiRNAで処置したマウスにおいて腫瘍負荷の39%が顕著に低下したことが示された。腫瘍レベルにおけるこのような減少は、AFPレベルにおいて観察された減少と再び相関した(データ不図示)。
したがって、確立された腫瘍のMYC標的化DsiRNAによる処置は、2つの異なる肝臓癌モデルにおいて腫瘍負荷およびAFPレベルを低減した(ここでは、Hep3BおよびHepG2腫瘍を、当業者が認識したヒトHCCモデルとして使用した)。
In vivoでのMYC−1711二本鎖のノックダウンの効力を、用量依存性に関してさらに調査した。このような実験では、Hep3B同所性肝臓腫瘍を有するマウスにPBSを、または脂質ナノ粒子(LNP2141)中に製剤化されたMYC−1711−M12/M48 DsiRNAを用量1、3、5、10および15mg/kgで静脈内投与した。2日後、マウスを屠殺して腫瘍RNAを単離し、qPCRにより分析した。図10に示されるように、MYC mRNA発現は全ての用量で有効にノックダウンされ、観察されたノックダウンの度合いは、1mg/kg用量で約50%〜5mg/kg以上の全ての用量で約75%以上の範囲である。したがって、in vivoのMYC mRNAノックダウンの用量依存性がMYC−1711二本鎖について示された。
MYC標的化DsiRNAによるin vivoでのMYC発現のノックダウンの持続期間も、Hep3B同所性肝臓腫瘍を有するマウスにおいて評価した。このようなマウスにPBSを、または脂質ナノ粒子(LNP2141)中に製剤化されたMYC−1711−M12/M48 DsiRNAを用量1および5mg/kgで静脈内に投与した。単回投与後48時間、96時間および168時間の時点で、マウスを屠殺して腫瘍RNAを単離し、qPCRにより解析した。MYC mRNA発現は1mg/kgおよび5mg/kgの用量のMYC−1711二本鎖いずれでも、複数日にわたり効率よくノックダウンされた。この時、1mg/kg用量では2日目および4日目にMYC mRNAレベルは約40%の低下を示し、一方5mg/kg用量では2日目、4日目および168時間目にそれぞれMYC mRNAレベルは約60%の低下、約50%の低下および約40%の低下を示した。したがって、MYC−1711二本鎖はin vivoにて持続性のあるノックダウン効果を示し、このような効果の持続性はまた用量依存性であった。
さらなる実験では、DsiRNA製剤のレベルを0.5mg/kg〜1mg/kg、〜2mg/kg、〜5mg/kgへと進行させながら、Hep3B腫瘍の処置の用量依存性を観察した(図12)。具体的には、Hep3B同所性肝臓腫瘍を有するマウスにPBSを、または脂質ナノ粒子(LNP2141)中に製剤化されたHPRT1−716−M21/M36もしくはMYC−1711−M12/M48 DsiRNAを、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kgまたは5mg/kg用量で1週間に3回(TIW、合計7回投与)で、または1mg/kgを1週間に2回(BIW、合計6回)で、静脈内に投与した。最終投与の48時間後に、マウスを屠殺して腫瘍の重量を測定した。図12に示されるように、腫瘍の増殖は全ての用量のMYC−1711 DsiRNAにより顕著に阻害されたが、HPRT1 DsiRNAでは阻害されなかった。特に、平均して、0.5mg/kgのTIW MYC−1711(M12/M48)では腫瘍の重量が約35〜40%減少したことが観察され、1mg/kgのTIW MYC−1711 (M12/M48)では腫瘍の重量が約55%減少したことが観察され、3mg/kgのTIW MYC−1711(M12/M48)では腫瘍の重量が約60%減少したことが観察され、5mg/kgのTIW MYC−1711(M12/M48)では腫瘍の重量が約75〜80%減少したことが観察され、および1mg/kgのBIW MYC−1711 (M12/M48)では腫瘍の重量が約55%低減したことが観察された。したがって、in vivoのHep3B同所性肝臓モデルでの腫瘍重量の低減におけるMYC標的化二本鎖の抗腫瘍作用は、顕著でありかつ用量依存性であることが観察された。
MYC−1711二本鎖を、in vivoでのMYCノックダウン効果および/または腫瘍の低減を保持しながら過度の2´O‐メチル化を有する能力に関して試験した。Hep3B同所性の肝臓の腫瘍を有するマウスにPBSを、または脂質ナノ粒子(ここではLNP2141)中で製剤化された以下のMYC−1711 DsiRNA:MYC−1711−M12−M48、MYC−1711−M32−M48、MYC−1711−M50−M73およびMYC−1711−M50−M48を1mg/kgで(BIW、合計5回の投与)、静脈内投与した。最終的な投与の48時間後に、マウスを屠殺して腫瘍の重量を測定した。図13に示されるように、Hep3Bの腫瘍の増殖は、試験したすべての2´‐O‐メチル改変MYC‐1711DsiRNAにより顕著に阻害された。
改変型MYC標的化二本鎖の寸法および頻度を変更する抗腫瘍作用に関する影響を試験した。Hep3B同所性肝臓腫瘍を有するマウスにPBSを、または脂質ナノ粒子(LNP2141)中で製剤化されたHPRT1−716-M21/M36もしくはMYC−1711−M50/M48 DsiRNAを1、3、もしくは5mg/kgの用量で静脈内に投与した(3mg/kgおよび5mg/kgの製剤は1週間に2回(BIW、合計5回の投与)または1週間に1回(QW、合計3回の投与)のいずれかで投与し、1mg/kgの製剤は1週間に2回(BIW)のみで投与した)。最終的な投与の48時間後に、マウスを屠殺して腫瘍の重量を測定した。図14に示されるように、腫瘍の増殖は、すべての用量でのMYC−1711 DsiRNAにより顕著に阻害されるが((**、P<0.01;***、P<0.001;****、P<0.0001)、HPRT1 DsiRNAでは阻害されなかった。したがって、低用量のDsiRNAの投与はin vivoでのHep3Bの腫瘍の寸法の低減に非常に有効であった。
また、いずれかの薬剤を個々に投与した場合、Hep3B腫瘍含有マウスへのMYC標的化DsiRNAの投与は、ソラフェニブで観察されるものよりも腫瘍負荷の減少を多く誘導することが観察され、かつソラフェニブおよびMYC標的化DsrRNAの両方をHep3B腫瘍モデルに投与した場合、MYC標的化DsiRNAは腫瘍負荷の有効な阻害剤であることが観察され、実際にこのような組み合わせは十分に忍容性を示し、このような併用療法で処置したマウスにおいて顕著な体重減少または脾臓もしくは肝臓の重量の低下はみられない(データ不図示)。Hep3B腫瘍含有マウスへのMYC標的化DsiRNAの投与はまた、用量依存型形式でこのような腫瘍中のMYC転写物およびタンパク質のレベル、ならびにLDHAタンパク質(LDHAは、MYCシグナリング経路におけるMYCのダウンストリームである)のレベルを低下することが確認された。またMYC DsiRNAは、PEG IgM誘導に関するアッセイで同定されたように、免疫賦活性能力が低いことが確認されており、ここで、LNP製剤EnCore 2072中で製剤化されたすべてのMYC標的化DsiRNAは、PBSで処置した動物よりも多い度合いのPEG IgMを誘導せず、さらに免疫賦活性であるよう設計されたLNP中に製剤化された場合でさえも、大部分のMYC標的化DsiRNAは、モック処置した動物と比較してPEG IgMの誘導を示さなかった(データ不図示)。また、MYC標的化DsiRNAのIC50値を計算し、Hep3BおよびHepa 1‐6細胞の両方で5〜50pMの範囲であることを観察した。
MYC標的化二本鎖が非肝臓腫瘍の増殖を低減する能力も試験した。1つのこのような実験では、皮下HT−29腫瘍を有するマウスにPBSを、または脂質ナノ粒子(これらの実験ではLNP2163)中で製剤化されたHPRT1−716−M21/M36またはMYC−621−M12/M12 DsiRNAを10mg/kgで1週間に1回、合計2回のDsiRNA投与により、静脈内に投与した。処置期間の最中および終わりに、腫瘍の寸法を測定した。図15に示されるように、HT−29(結腸癌モデル)腫瘍増殖は、MYC−621 DsiRNAにより顕著に阻害された(*,P<0.05)が、HPRT1 DsiRNAによっては阻害されなかった。別のこのような実験では、皮下MIA PaCa−2(脾臓癌)腫瘍を有するマウスにPBSを、または脂質ナノ粒子中のHPRT1−716−M21/M36もしくはMYC−621−M12/M12 DsiRNA(LNP2163;10mg/kg/1週間に1回、合計3回の投与)を静脈内に投与した。処置期間の最中および最後に、腫瘍の寸法を測定した。図16に示されるように、腫瘍の増殖は、MYC−621 DsiRNAにより顕著に阻害された(***,P<0.001)。
したがって、MYCに対して有効なDsiRNAであって、Hep3B細胞内に遺伝子導入した場合ピコモル濃度のmRNAノックダウン活性を有するDsiRNAを同定した。一方で、多くのこのようなDsiRNAは2´‐O‐メチル基で改変された場合、in vivoで低度の免疫賦活性を有することが観察された。さらに、LNP製剤化MYC標的化DsiRNAは、ヒトの肝細胞癌(ここでは、Hep3BおよびHepG2腫瘍モデル)のin vivoモデルにおいて有効であることが見出され、ここでMYC標的化DsiRNAは、確立された同所性HepG2およびHep3B腫瘍の顕著な腫瘍低減をもたらすことが確認された。また、腫瘍由来のMYC mRNAのノックダウンが抗腫瘍活性に十分であることが確認され、かつこのような活性は用量依存性であり複数の異なる種類の腫瘍において、複数の異なるDsiRNAで観察されることが確認された。さらに、低減したMYC mRNA、Mycタンパク質およびダウンストリームLDHAタンパク質のレベルは、このような抗腫瘍活性と相関した。このような処置はまた、ソラフェニブとの組み合わせで十分な忍容性があることが観察された。したがって、MYC標的化DsiRNAはin vitroおよびin vivoでのMYC mRNAノックダウン活性を示し、かつHepG2、Hep3B、HT−29およびMIA PaCa2同所性腫瘍モデルにおける顕著な抗腫瘍性活性を示した。このような結果は、進行したHCCを有する患者における、従来より「新薬とすることができない(undruggable)」標的であるMYCに対するDsiRNA分子の臨床評価に関する理論的根拠を提供する。
実施例9:適応症
MYC研究における現在の知識により、MYC活性をアッセイするための方法、ならびに研究、診断および治療利用のために、MYC発現を制御可能な化合物が必要とされることが示される。本明細書で記述したように、本発明の核酸分子を、MYCレベルに関連した疾患状態を診断するために、アッセイで使用可能である。さらに、核酸分子を、MYC誤調節、レベルなどに関連する疾患状態を処置するために使用可能である。
MYC研究における現在の知識により、MYC活性をアッセイするための方法、ならびに研究、診断および治療利用のために、MYC発現を制御可能な化合物が必要とされることが示される。本明細書で記述したように、本発明の核酸分子を、MYCレベルに関連した疾患状態を診断するために、アッセイで使用可能である。さらに、核酸分子を、MYC誤調節、レベルなどに関連する疾患状態を処置するために使用可能である。
MYC発現調節に関連可能な特定の疾患および障害には、限定するものではないが、単独または他の免疫関連障害(たとえば炎症性障害もしくは自己免疫障害)などの他の治療との組み合わせで、癌および/または増殖性疾患、状態または障害、ならびに細胞または組織中のMYCのレベルに関連する、または応答しうる他の疾患、状態または障害が含まれる。MYC発現調節に関連した特定の変性および疾患状態には、限定するものではないが、例えば腎臓癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、中咽頭癌および膵臓癌が含まれる。
ゲムシタビンおよびシクロホスファミドは、本発明の核酸分子(例えばDsiRNA分子)と組み合せ可能、または併用可能な化学治療剤の非限定例である。同様に、当業者は、抗癌化合物および治療のような他の薬剤を本発明の核酸分子(例えばDsiRNA分子)と容易に混合でき、したがってこの混合物が本発明の範囲内であることを認識するものである。このような化合物および治療は、本技術分野で公知であり(たとえば、Cancer:Principles and Practice of Oncology,Volumes 1 and 2、eds Devita,V.T.,Hellman,S.、and Rosenberg,S.A.,J.B.Lippincott Company、Philadelphia,USAを参照のこと)、限定するものではないが、抗葉酸類、フルオロピリミジン類、シタラビン、プリン類似体、アデノシン類似体、アムサクリン、トポイソメラーゼI阻害剤類、アントラピラゾール類、レチノイド類、ブレオマイシン、アントラサイクリン類、マイトマイシンC、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのような抗生物質、ヘキサメチルメラミン、デカルバジン、1−アスペルギナーゼ、白金類似体、窒素マスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、イホスファミド、4−ヒドロペルオキシシクロホスファミド、ニトロソウレア、チオテパのようなアルキル化剤、ビンカアルカロイド類、エピポドフィロトキシン類、タキソールのような植物由来化合物、タモキシフェン、放射線治療、手術、栄養補助剤、遺伝子治療、3D−CRTのような放射療法、リシン(recin)などの免疫毒性療法、Herceptinのようなモノクローナル抗体、タルセバ、ソラフェニブ、obatoclax、apogossypolone、およびnavitoclaxなどの他の療法などが含まれる。併用療法では、本発明の核酸を2つの方法のうち1つで調製する。第一に、薬剤を、静脈内投与用溶液中に、リポソーム内にカプセル封入した本発明の核酸とイホスファミドとの混合などのように、核酸と化学療法剤との調製において物理的に組み合わせる。ここで、両方の薬剤は、治療的に効果的な濃度で存在する(例えば1000〜1250mg/m2/日を伝達する溶液中のイホスファミドと、0.1〜100mg/kg/日を伝達する同一の溶液中の本発明のリポソーム結合核酸)。あるいは、これらの薬剤を、それぞれの効果的な用量で別々に、しかし同時にまたは連続して投与する(例えば、1000〜1250mg/m2/dのイホスファミドと0.1〜100mg/kg/日の本発明の核酸)。
当業者は、本明細書で記述した疾患および状態を治療するために使用する他の化合物および治療が、同様に本発明の核酸分子(例えばsiNA分子)と混合可能であり、したがって本発明の範囲内であることを理解するものである。
実施例10:DsiRNAに関する血清安定性
DsiRNA剤の血清安定性を、37℃にて種々の時間間隔(〜24時間)の間、50%ウシ胎児血清におけるDsiRNA剤のインキュベーションを介して評価する。血清を抽出し、核酸を、20%非変性PAGE上で分離し、Gelstar染色によって可視化可能である。ヌクレアーゼ分解からの保護の相対レベルを、(任意に修飾ありおよびなしで)DsiRNAに関して評価する。
DsiRNA剤の血清安定性を、37℃にて種々の時間間隔(〜24時間)の間、50%ウシ胎児血清におけるDsiRNA剤のインキュベーションを介して評価する。血清を抽出し、核酸を、20%非変性PAGE上で分離し、Gelstar染色によって可視化可能である。ヌクレアーゼ分解からの保護の相対レベルを、(任意に修飾ありおよびなしで)DsiRNAに関して評価する。
実施例11:MYC遺伝子発現の下方制御を評価するための、追加的な細胞培養モデルの利用
抗−MYC剤での処置の後のMYC媒介効果を見るために、種々の評価項目が細胞培養モデルで使用されてきた。表現型評価項目には、細胞増殖の阻害、RNA発現、およびMycタンパク質発現の低減が含まれる。MYC変異は特定の腫瘍細胞の増殖の増大に直接関連するため、細胞培養アッセイに関する増殖評価項目が、スクリーニングとして使用できる。本評価項目を測定可能な種々の方法が存在する。DsiRNAでの細胞の処置後、細胞を増殖させ(概して5日間)、その後細胞生存能力、ブロモデオキシウリジン(BrdU)の細胞DNA内への取込みおよび/または細胞密度を測定する。細胞密度のアッセイは、(Syto(登録商標)13またはCyQuant(登録商標)のような)市販されている蛍光核酸鎖を用いることによって、96−ウェルフォーマットで実施できる。二次的確認評価項目として、Mycタンパク質発現のレベルにおけるDsiRNA−媒介型の減少を、MYCに特異的なウェスタンアッセイを用いて評価できる。以下は、このようなアッセイ(たとえば、Mcl−1発現の検出のために、Schulze−Bergkamen et al., BMC Cancer 2006, 6:232,に記載されるように実施されるアッセイ)に使用する例示的な細胞系統である:A549、H1299、HepG2、SNU398、A549、NCI−H196、NCI−H1975、MDA−MB−231、NCI−H441、Panc−1、MIA PaCa、BxPC3、DU−145、VCaP、MCF−7、U937、K562、HeLa、またはT98G細胞。
抗−MYC剤での処置の後のMYC媒介効果を見るために、種々の評価項目が細胞培養モデルで使用されてきた。表現型評価項目には、細胞増殖の阻害、RNA発現、およびMycタンパク質発現の低減が含まれる。MYC変異は特定の腫瘍細胞の増殖の増大に直接関連するため、細胞培養アッセイに関する増殖評価項目が、スクリーニングとして使用できる。本評価項目を測定可能な種々の方法が存在する。DsiRNAでの細胞の処置後、細胞を増殖させ(概して5日間)、その後細胞生存能力、ブロモデオキシウリジン(BrdU)の細胞DNA内への取込みおよび/または細胞密度を測定する。細胞密度のアッセイは、(Syto(登録商標)13またはCyQuant(登録商標)のような)市販されている蛍光核酸鎖を用いることによって、96−ウェルフォーマットで実施できる。二次的確認評価項目として、Mycタンパク質発現のレベルにおけるDsiRNA−媒介型の減少を、MYCに特異的なウェスタンアッセイを用いて評価できる。以下は、このようなアッセイ(たとえば、Mcl−1発現の検出のために、Schulze−Bergkamen et al., BMC Cancer 2006, 6:232,に記載されるように実施されるアッセイ)に使用する例示的な細胞系統である:A549、H1299、HepG2、SNU398、A549、NCI−H196、NCI−H1975、MDA−MB−231、NCI−H441、Panc−1、MIA PaCa、BxPC3、DU−145、VCaP、MCF−7、U937、K562、HeLa、またはT98G細胞。
実施例12:MYC誤調節の追加的なマウスモデルにおける、抗MYC DsiRNA有効性の評価
in vitroアッセイから選択した抗−MYC DsiRNAをさらに、例えば異種移植片および上記に引用したような他の動物モデルを含む、マウスモデルにてさらに試験できる。上述のように、異種移植片アッセイに使用される例示的であり適切な細胞系統は、HT1080、HCT116、SW480、SW620、Hep3B、M14、JR8、PLF2、LLC1、LNCaP、PC3、SUM159、MDAMB−231、22Rv1、518A2、MHCC97、A549、H1299、HepG2、SNU398、HuH7、NCI−H196、NCI−H1975、HT29、MKN−45、MDA−MB−231、NCI−H441、Panc−1、MIA PaCa−2、BxPC3、DU−145、M2182、VCaP、OvCar−3、MCF−7、U937、K562、HeLa、T98G、またはSHP−77を含む。1つの例において、誤調節された(例えば上昇した)MYCレベルを有するマウスに、流体力学尾静脈注射および/または脂質ナノ粒子系の送達様式を介して、本発明のDsiRNA剤を投与する。3〜4匹のマウス/群(試験した特定のDsiRNA剤に基づき分割)に、50μgまたは200μgのDsiRNAを注射する。MYC RNAのレベルを、RT−qPCRを用いて評価する。さらに、またはあるいは、MYCのレベル(例えばMycタンパク質レベルおよび/または癌細胞/腫瘍形成、増殖または拡散)を、本技術分野で認識される方法を用いて評価でき、またはMYCの誤調節に関連する表現型(例えば腫瘍形成、増殖、転移など)を、(任意にMYC転写産物またはMycタンパク質レベルの測定のための代わりとして)モニタする。このような動物モデルにおける活性DsiRNAを、標準の化学療法との組み合わせで続けて試験可能でもある。
in vitroアッセイから選択した抗−MYC DsiRNAをさらに、例えば異種移植片および上記に引用したような他の動物モデルを含む、マウスモデルにてさらに試験できる。上述のように、異種移植片アッセイに使用される例示的であり適切な細胞系統は、HT1080、HCT116、SW480、SW620、Hep3B、M14、JR8、PLF2、LLC1、LNCaP、PC3、SUM159、MDAMB−231、22Rv1、518A2、MHCC97、A549、H1299、HepG2、SNU398、HuH7、NCI−H196、NCI−H1975、HT29、MKN−45、MDA−MB−231、NCI−H441、Panc−1、MIA PaCa−2、BxPC3、DU−145、M2182、VCaP、OvCar−3、MCF−7、U937、K562、HeLa、T98G、またはSHP−77を含む。1つの例において、誤調節された(例えば上昇した)MYCレベルを有するマウスに、流体力学尾静脈注射および/または脂質ナノ粒子系の送達様式を介して、本発明のDsiRNA剤を投与する。3〜4匹のマウス/群(試験した特定のDsiRNA剤に基づき分割)に、50μgまたは200μgのDsiRNAを注射する。MYC RNAのレベルを、RT−qPCRを用いて評価する。さらに、またはあるいは、MYCのレベル(例えばMycタンパク質レベルおよび/または癌細胞/腫瘍形成、増殖または拡散)を、本技術分野で認識される方法を用いて評価でき、またはMYCの誤調節に関連する表現型(例えば腫瘍形成、増殖、転移など)を、(任意にMYC転写産物またはMycタンパク質レベルの測定のための代わりとして)モニタする。このような動物モデルにおける活性DsiRNAを、標準の化学療法との組み合わせで続けて試験可能でもある。
実施例13:診断利用
本発明のDsiRNA分子を、種々の適用、例えば臨床、工業、環境、農業および/または研究設定にて、分子標的(例えばRNA)の同定などにおける種々の診断への適用で使用できる。DsiRNA分子のこのような診断利用には、再構築RNAi系を利用すること、例えば、細胞溶解物または部分的に精製した細胞溶解物を用いることが含まれる。本発明のDsiRNA分子は、疾患細胞内の遺伝的ドリフトおよび変異を試験するための診断ツールとして使用できる。DsiRNA活性と、標的MYC RNAの構造との間の近い関係により、標的MYC RNAの塩基対形成と三次元構造を変化させる、MYC分子の領域における変異の検出が許容される。本発明にて記述された多重DsiRNA分子を用いることによって、RNA構造ならびにin vitroかつ細胞および組織内での機能に対して重要である、ヌクレオチド変化をマッピングできる。標的MYC RNAのDsiRNA分子での開裂を、遺伝子発現を阻害し、MYC−関連疾患または障害の進行における、特定の遺伝子産物の役割を定義するために使用できる。この様式において、他の遺伝的標的を、疾患の重要なメディエータとして定義可能である。これらの実験は、併用療法(例えば異なる遺伝子を標的とした多重DsiRNA分子、公知の低分子阻害剤と結合したDsiRNA分子、またはDsiRNA分子および/もしくは他の化学的もしくは生物学的物質と組み合わせでの断続的な治療)の可能性を提供することによって、疾患進行のよりよい治療を導きうる。本発明のDsiRNA分子のin vitroでの他の利用は、本技術分野でよく知られており、疾患または関連状態と関連したRNAの存在の検出が含まれる。このようなRNAは、標準の方法、例えば蛍光共鳴放射移動(FRET)を用いて、DsiRNAでの治療後、開裂産物の存在を測定することによって検出する。
本発明のDsiRNA分子を、種々の適用、例えば臨床、工業、環境、農業および/または研究設定にて、分子標的(例えばRNA)の同定などにおける種々の診断への適用で使用できる。DsiRNA分子のこのような診断利用には、再構築RNAi系を利用すること、例えば、細胞溶解物または部分的に精製した細胞溶解物を用いることが含まれる。本発明のDsiRNA分子は、疾患細胞内の遺伝的ドリフトおよび変異を試験するための診断ツールとして使用できる。DsiRNA活性と、標的MYC RNAの構造との間の近い関係により、標的MYC RNAの塩基対形成と三次元構造を変化させる、MYC分子の領域における変異の検出が許容される。本発明にて記述された多重DsiRNA分子を用いることによって、RNA構造ならびにin vitroかつ細胞および組織内での機能に対して重要である、ヌクレオチド変化をマッピングできる。標的MYC RNAのDsiRNA分子での開裂を、遺伝子発現を阻害し、MYC−関連疾患または障害の進行における、特定の遺伝子産物の役割を定義するために使用できる。この様式において、他の遺伝的標的を、疾患の重要なメディエータとして定義可能である。これらの実験は、併用療法(例えば異なる遺伝子を標的とした多重DsiRNA分子、公知の低分子阻害剤と結合したDsiRNA分子、またはDsiRNA分子および/もしくは他の化学的もしくは生物学的物質と組み合わせでの断続的な治療)の可能性を提供することによって、疾患進行のよりよい治療を導きうる。本発明のDsiRNA分子のin vitroでの他の利用は、本技術分野でよく知られており、疾患または関連状態と関連したRNAの存在の検出が含まれる。このようなRNAは、標準の方法、例えば蛍光共鳴放射移動(FRET)を用いて、DsiRNAでの治療後、開裂産物の存在を測定することによって検出する。
特定の例において、標的MYC RNAの野生型または変異体または多型体の形態のみを開裂するDsiRNA分子をアッセイのために使用する。第1のDsiRNA分子(すなわち、標的MYC RNAの野生型形態のみを開裂するもの)を使用して、試料に存在する野生型MYC RNAを同定し、第2のDsiRNA分子(すなわち標的RNAの変異体または多型体の形態のみを開裂するもの)を使用して、試料中の変異体または多型体のMYC RNAを同定する。反応対照として、野生型および変異体または多型体のMYC RNAの両方の合成基質が、両方のDsiRNA分子によって開裂され、反応中の相対DsiRNA有効性と、「非標的化」MYC RNA種の開裂がないことを実証する。合成基質からの開裂産物がまた、試料集合中の野生型および変異体MYC RNAの解析のために、サイズマーカーを産出するために作用する。したがって、各解析は、2つのDsiRNA分子、2つの基質および1つの未知の試料を必要とし、これにより6つの反応を組み合わせる。開裂産物の存在を、各MYC RNAの全長および開裂断片を、ポリアクリルアミドゲルの1つのレーン内で解析可能であるように、RNase保護アッセイを用いて決定する。変異体または多型体のMYC RNAの発現、および標的細胞内のMYC−関連表現型の変化の推定リスクへの洞察を得るために結果を定量化することは必ずしも必要ではない。そのタンパク質産物が、表現型(すなわち疾患相関/関連)の発達において暗示されるMYC mRNAの発現が、リスクを確立するのに十分である。比較可能な特定の活性のプローブを、両方の転写産物のために使用する場合、MYC RNAレベルの定性的比較が適切であり、初期診断のコストを減少させる。より高い変異体または多型体の形態の野生型に対する比が、MYC RNAレベルを定性的または定量的に比較するかどうかの高いリスクと相関する。
本明細書で言及されたすべての特許および公開公報は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルの指標である。本明細書で引用したすべての参考文献は、各参考文献が、個々に全体にわたり援用されたものと同様の程度まで、参考文献により援用される。
当業者は、本発明が目的を実行し、かつ、言及した結果および利点ならびにその中の固有のものを得るために適合されていることを容易に認識するものである。好ましい実施形態の代表例として本明細書に記載の方法および組成物は例示的なものであり、本発明の範囲を限定よう意図するものではないい。上記方法および組成物の変化および他の利用が当業者に対して起こるものであり、これらは本発明の趣旨の範囲内に含まれ、かつ特許請求の範囲により定義される。。
種々の置換および改変を、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく本明細書で開示された本発明に対して実施可能であることが、当業者に簡単に理解されるであろう。したがって、このような追加的な実施形態は、本発明および以下の特許請求の範囲内である。本発明は、RNAi活性を媒介するために、改善された活性をもつ核酸構築物を産出することを目的とする、本明細書で記述した化学的改変の種々の組み合わせおよび/または置換を試験することを当業者に教示する。このような改善された活性は、改善された安定性、改善されたバイオアベイラビリティ、および/またはRNAiを媒介する細胞応答の改善された活性を含みうる。したがって、本明細書で記述した特定の実施形態は、限定ではなく、かつ本明細書で記述した改変の特定の組み合わせが改善されたRNAi活性を持つDsiRNA分子を同定するために、過度に実験を行うことなく試験できることを当業者は容易に理解するものである。
本明細書で例示的に記述された発明は、本明細書で特に開示されていない、任意の要素または要素類、制限または制限類なしに好適に実施可能である。したがって、例えば、本明細書中の各例において、任意の語句「含む」、「から本質的になる」および「からなる」は、他の2つの語句いずれかと置き換えても良い。使用された語句および表現は、記述のために使用される語句であり、限定を意味するものではなく、、かつ、示し、記述した特徴の任意の等価物またはそれらの一部を除外するこのような語句および表現の利用において意図しておらず、種々の改変が、請求された本発明の目的の範囲内である可能性が認識される。したがって、本発明が、好ましい実施形態によって特に開示されているが、本明細書で開示された概念の任意の特徴、改変およびバリエーションが、当業者によって変更されてもよく、このような改変およびバリエーションが、記述ならびに付随する特許請求の範囲によって定義されたように、本発明の範囲内であると考慮されることが理解されるべきである。
さらに、本発明の特徴または態様が、Markushグループまたは他の代替グルーピングの観点で記述される場合、当業者は、それにより本発明がMarkushグループまたは他のグループの任意の個々のメンバー、またはメンバーのサブグループに関して記述もされることを理解するものである。
本発明を記述する文脈中(特に以下の特許請求の範囲の文脈中)語句「a」、「an」および「the」ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書で他の指摘がある、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数両方をカバーすると理解されるべきである。語句「含む(comprising)」、「持つ(having)」、「含む(including)」および「含む(containing)」は、他に言及しない限り、無制限語句として構築されるべきである(すなわち、「含むが、限定されない」と意味する)。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書で他の指摘がない限り、その範囲内にあるそれぞれ別々の値を個々に指す単なる省略表現方法を意図するものであり、それぞれ別々の値は、本明細書で個々に記載されるものとして、本明細書内に組み込まれる。本明細書で記述されたすべての方法を、本明細書中他の指摘がない限り、または文脈において明確に他に矛盾しない限り、好適な順番で実施できる。本明細書で定義される任意かつすべての例、または例示的言語(「たとえば「のような」)の利用は、単に本発明をよりよく例示することを意図するものであり、他に請求しない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。明細書中言及がないものは、本発明の実施に必須であるような、任意の非請求要素を表すとして構成されるべきである。
本発明の実施形態が本明細書で記述されており、本発明を実行するために本発明者等に公知の最適な様式が含まれる。これらの実施形態のバリエーションが、上記の記述を読むことにより当業者に明確になり得る。
本発明者らは、当業者が、適切にこのようなバリエーションを利用することを予測しており、本発明に関して、本明細書で特に記述したもの以外で実施されるべきと意図している。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許可されるように、本明細書に付随する特許請求の範囲にて記載される対象のすべての改変および等価物を含む。さらに、全ての可能性あるそれらのバリエーションにおける上記要素の任意の組み合わせが、本発明で他に指摘されない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、本発明に含まれる。当業者は、単なる通常の実験を使用して、本明細書で記述される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または究明することが出来る。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。
Claims (75)
- 15〜35の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む単離核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際にMYC標的 mRNAの発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15のヌクレオチドに沿って表15から選択される標的MYC mRNAに十分に相補的である、単離核酸。
- 19〜35の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む単離核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際にMYC 標的mRNAの発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19のヌクレオチドに沿って表14から選択される標的MYC mRNA配列に十分に相補的である、単離核酸。
- RNAを含む第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含む単離二本鎖核酸(dsNA)であって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり前記第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にMYC 標的mRNAの発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って表15から選択される標的MYC mRNA配列に十分に相補的である、単離二本鎖核酸。
- 第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含む単離二本鎖核酸(dsNA)であって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり前記第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にMYC標的mRNAの発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチドが前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って表14から選択される標的MYCmRNA配列に十分に相補的である、単離二本鎖核酸。
- 第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含む単離二本鎖核酸(dsNA)であって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり前記第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、MYC標的mRNAの発現を低減するように前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って表13から選択される標的MYC mRNA配列に十分に相補的であり、かつ表13から選択されるMYC mRNA配列の5´末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が前記配列の位置9および10の間の部位で前記mRNAを切断する、単離二本鎖核酸。
- 単離dsNA分子であって、(a)センス領域およびアンチセンス領域であって、前記センス領域および前記アンチセンス領域が25〜35の塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、かつ前記アンチセンス領域が表12から選択される配列と相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域;および(b)0〜2つの3´オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が6以下の長さのヌクレオチドである3´オーバーハング領域からなり、かつ前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、表11から選択されるMYC mRNA配列の5´末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が前記配列の位置9および10の間の部位で前記mRNAを切断する、単離dsNA分子。
- 第1の核酸鎖および第2の核酸鎖ならびに少なくとも25塩基対の二本鎖領域を含む単離二本鎖核酸(dsNA)であって、前記第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり前記第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドでありかつ3´末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にMYC標的遺伝子発現を低減するように前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って表11から選択される標的MYC mRNA配列に十分に相補的である、単離二本鎖核酸。
- 第1の核酸鎖および第2の核酸鎖ならびに少なくとも25塩基対の二本鎖領域を含む単離二本鎖核酸(dsNA)であって、前記第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり前記第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドでありかつ3´末端に1〜5の一本鎖のヌクレオチドを含み、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の3´末端および前記第2のオリゴヌクレオチドの5´末端が平滑末端を形成し、かつ前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にMYC mRNA発現を低減するように前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1309〜1635および1963〜3270からなる群から選択される標的MYC配列に十分に相補的である、単離二本鎖核酸。
- 少なくとも25の塩基対;19〜21の塩基対および21〜25の塩基対からなる群から選択される二本鎖領域を含む、請求項3〜5のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が3´末端に1〜5の一本鎖のヌクレオチドを含む、請求項3〜6のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第1の鎖が25〜35の長さのヌクレオチドである、請求項3〜6のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第2の鎖が25〜35の長さのヌクレオチドである、請求項3〜6のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の最大27の長さのヌクレオチドに沿ってGenbank寄託番号第NM_002467.4号および第NM_010849.4号からなる群から選択される標的MYC cDNA配列に相補的である、請求項3〜12のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 第1のオリゴヌクレオチド鎖の3´末端の第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、位置1、2および/または3が改変ヌクレオチドと置換される、請求項3〜12のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第1の鎖の前記3´末端および前記第2の鎖の前記5´末端が平滑末端を形成する、請求項3〜12のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第1の鎖が25の長さのヌクレオチドであり前記第2の鎖が27の長さのヌクレオチドである、請求項3〜12のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 表10から選択されるMYC mRNA配列の5´末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が前記配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断し、それにより前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にMYC標的mRNAの発現を低減する、請求項3〜4または6〜16のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 配列番号1309〜1635および1963〜2289から選択されるMYC mRNA配列の5´末端から開始して、哺乳類のAgo2が前記mRNA配列の位置9および10の間の部位で前記mRNAを切断し、それにより前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にMYC 標的mRNAの発現を低減する、請求項8〜17のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第2の鎖が配列番号328〜654からなる群から選択される配列を含む、請求項3〜18のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第1の鎖が配列番号1〜327、982〜1308および1636〜1962からなる群から選択される配列を含む、請求項3〜19のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 表2から選択される一対の第1の鎖/第2の鎖配列を含む、請求項3〜20のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第1の鎖および前記第2の鎖のそれぞれが少なくとも26のヌクレオチドの長さを有する、請求項3〜21のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第1の鎖の前記3´末端の前記改変ヌクレオチド残基がデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド(acyclonucleotide)および蛍光分子からなる群から選択される、請求項14に記載の単離dsNA。
- 第1のオリゴヌクレオチド鎖の前記3´末端の位置1がデオキシリボヌクレオチドである、請求項23に記載の単離dsNA。
- 前記第2の鎖の前記3´末端の前記1〜5の一本鎖ヌクレオチドの前記ヌクレオチドが改変ヌクレオチドを含む、請求項6、7または10に記載の単離dsNA。
- 前記第2の鎖の前記3´末端の前記1〜5の一本鎖ヌクレオチドの前記改変ヌクレオチドが2´‐O‐メチルリボヌクレオチドである、請求項25に記載の単離dsNA。
- 前記第2の鎖の前記3´末端の前記1〜5の一本鎖ヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが改変ヌクレオチドである、請求項25または26に記載の単離dsNA。
- 前記dsNAが改変ヌクレオチドを含む、請求項3〜27のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記改変ヌクレオチド残基が2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、2’−アミノおよび2’−O−(N−メチルカルバマート(methlycarbamate))からなる群から選択される、請求項28に記載の単離dsNA。
- 前記第2の鎖の3´末端の前記1〜5の一本鎖ヌクレオチドが1〜3の長さのヌクレオチドである、請求項6、7または10に記載の単離dsNA。
- 前記第2の鎖の前記3´末端の前記1〜5の一本鎖ヌクレオチドが1〜2の長さのヌクレオチドである、請求項6、7または10に記載の単離dsNA。
- 前記第2の鎖の前記3´末端の前記1〜5の一本鎖ヌクレオチドが2の長さのヌクレオチドでありかつ2´‐O‐メチル改変リボヌクレオチドを含む、請求項6、7または10に記載の単離dsNA。
- 前記第2のオリゴヌクレオチド鎖がAS−M1〜AS‐M73およびAS−M1*〜AS−M73*からなる群から選択される改変パターンを含む、請求項3〜32のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第1のオリゴヌクレオチド鎖がSM1〜SM52からなる群から選択される改変パターンを含む、請求項3〜33のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第1の鎖および前記第2の鎖のそれぞれが少なくとも26かつ最大30の長さのヌクレオチドを有する、請求項3〜34のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記dsNAがDicerにより前記細胞中で内因的に切断される、請求項3〜35のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記標的遺伝子の発現を低減するために十分な前記単離核酸の量が、前記細胞の環境中で1ナノモル濃度以下、200ピコモル濃度以下、100ピコモル濃度以下、50ピコモル濃度以下、20ピコモル濃度以下、10ピコモル濃度以下、5ピコモル濃度以下、2ピコモル濃度以下および1ピコモル濃度以下からなる群から選択される、請求項1〜36のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記単離dsNAが、1ナノモル濃度以下の細胞の環境中での有効濃度においてin vitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的MYC mRNAの発現の低減において同一の前記標的MYC mRNAの少なくとも19のヌクレオチドを対象とする単離21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、請求項6〜37のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記単離dsNAが、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも80〜90%、少なくとも95%、少なくとも98%、および少なくとも99%からなる群から選択される量(%により表される)のMYC 標的mRNAを低減するように、標的MYC mRNA配列に十分に相補的である、請求項3〜38のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 第1の鎖および第2の鎖が化学的なリンカーにより結合される、請求項3〜39のいずれか1項に記載の単離dsNA。
- 前記第1の鎖の前記3´末端および前記第2の鎖の前記5´末端が化学的なリンカーにより結合される、請求項3〜40のいずれか1項に記載の単離二本鎖核酸。
- 前記第2の鎖または第1の鎖のヌクレオチドがDicer分裂の配向を方向付ける改変ヌクレオチドと置換される、請求項3〜41のいずれか1項に記載の単離二本鎖核酸。
- デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、3’−デオキシアデノシン(コルジセピン)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシイノシン(ddI)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)、2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)の一リン酸ヌクレオチドおよび2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)の一リン酸ヌクレオチド、4−チオウラシル、5−ブロモウラシル、5−ヨードウラシル、5−(3−アミノアリル)−ウラシル、2’−O−アルキルリボヌクレオチド、2’−O−メチル リボヌクレオチド、2’−アミノリボヌクレオチド、2’−フルオロ リボヌクレオチド、ならびにロックド核酸からなる群から選択される改変ヌクレオチドを含む、請求項1〜42のいずれか1項に記載の単離核酸。
- ホスホン酸塩、ホスホロチオエートおよびホスホトリエステルからなる群から選択されるリン酸塩骨格改変を含む、請求項1〜43のいずれか1項に記載の単離核酸。
- モルフォリノ核酸およびペプチド核酸(PNA)からなる群から選択される改変を含む、請求項1〜44のいずれか1項に記載の単離核酸。
- 哺乳類細胞中で標的MYC遺伝子の発現を低減する方法であってin vitroで哺乳類細胞を前記細胞中で標的MYC mRNAの発現を低減するために十分な量の請求項3〜45のいずれか1項に記載の単離dsNAと接触させることを含む、方法。
- 標的MYC mRNA発現が少なくとも10%、少なくとも50%および少なくとも80〜90%からなる群から選択される量(%により表される)で低減される、請求項46に記載の方法。
- MYC mRNAレベルが、前記細胞を前記dsNAと接触させてから8日後に、少なくとも90%の量(%により表される)で低減される、請求項46または47に記載の方法。
- MYC mRNAレベルが、前記細胞を前記dsNAと接触させてから少なくとも10日後に、少なくとも70%の量(%により表される)で低減される、請求項46〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳類中で標的MYC mRNAの発現を低減する方法であって、哺乳類中で標的MYC mRNAの発現を低減するために十分な量の請求項1〜45のいずれか1項に記載の単離核酸を哺乳類に投与することを含む、方法。
- 哺乳類中で腫瘍負荷を低減する方法であって、哺乳類中での腫瘍負荷を低減するために十分な量の請求項1〜45のいずれか1項に記載の単離核酸を前記哺乳類に投与することを含む、方法。
- 前記腫瘍が肝細胞癌である、請求項51に記載の方法。
- 前記腫瘍負荷が、適切な対照と比較して50〜80%低減される、請求項51に記載の方法。
- 前記単離核酸が脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化される、請求項51に記載の方法。
- 前記単離核酸が1マイクログラム〜5ミリグラム/kg前記哺乳類/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/kg、0.001〜0.25ミリグラム/kg、0.01〜20マイクログラム/kg、0.01〜10マイクログラム/kg、0.10〜5マイクログラム/kg、および0.1〜2.5/kgからなる群から選択される用量で投与される、請求項50〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単離核酸が、1ナノモル濃度以下の細胞環境中での有効濃度でin vitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的MYC mRNAの発現の低減において同一の前記標的MYC mRNAの少なくとも19のヌクレオチドを対象とする単離21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、請求項50〜55のいずれか1項に記載の方法。
- MYC mRNAレベルが、前記単離dsNAを前記哺乳類に投与してから少なくとも3日後に、少なくとも70%の量(%により表される)が前記哺乳類の組織中で低減される、請求項50〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組織が肝臓組織である、請求項57に記載の方法。
- 前記投与するステップが静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮注射、エアロゾル、直腸送達、膣送達、局所送達、経口送達および吸入送達からなる群から選択される様式を含む、請求項50〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞の生育を選択的に阻害する方法であって、細胞を、細胞の生育を阻害するために十分な量の請求項1〜45のいずれか1項に記載の単離核酸と接触させることを含む、方法。
- 前記細胞が対象の腫瘍細胞である、請求項60に記載の方法。
- 前記細胞がin vitroの腫瘍細胞である、請求項60または61に記載の方法。
- 前記細胞がヒトの細胞である、請求項60〜62のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜45のいずれか1項に記載の単離核酸を含む製剤であって、前記核酸がin vitroの哺乳類細胞内に導入される際に、少なくとも10%、少なくとも50%および少なくとも80〜90%からなる群から選択される量(%により表される)で標的MYC mRNAレベルを低減するために有効な量で前記核酸が存在する、製剤。
- 前記有効量が、前記細胞の環境中で1ナノモル濃度以下、200ピコモル濃度以下、100ピコモル濃度以下、50ピコモル濃度以下、20ピコモル濃度以下、10ピコモル濃度以下、5ピコモル濃度以下、2ピコモル濃度以下および1ピコモル濃度以下からなる群から選択される、請求項64に記載の製剤。
- 請求項6〜45のいずれか1項に記載の単離dsNAを含む製剤であって、前記dsNAが哺乳類の対象の細胞内に導入される際に、少なくとも10%、少なくとも50%および少なくとも80〜90%からなる群から選択される量(%により表される)で標的MYC mRNAレベルを低減するために有効な量で前記dsNAが存在する、製剤。
- 前記有効量が、1マイクログラム〜5ミリグラム/kg前記対象/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/kg、0.001〜0.25ミリグラム/kg、0.01〜20マイクログラム/kg、0.001〜10マイクログラム/kg, 0.10〜5マイクログラム/kg、および0.1〜2.5マイクログラム/kgからなる群から選択される用量である、請求項66に記載の製剤。
- 前記dsNAが、1ナノモル濃度以下の細胞環境中での有効濃度でin vitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的MYC mRNAのレベルの低減において同一の前記標的MYC mRNAの少なくとも19のヌクレオチドを対象とする単離21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、請求項64〜67のいずれか1項に記載の製剤。
- 請求項1〜45のいずれか1項に記載の単離核酸を含む哺乳類細胞。
- 請求項1〜45のいずれか1項に記載の単離核酸および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
- 請求項1〜45のいずれか1項に記載の単離核酸およびその使用のための説明書を含むキット。
- 対象においてのMYC関連疾患または障害を処置または予防する方法であって、請求項1〜45のいずれか1項に記載の単離核酸および薬学的に許容可能な担体を前記対象における前記MYC関連疾患または障害を処置または予防するために十分な量で対象に投与し、それにより前記対象における前記MYC関連疾患または障害を処置または予防することを含む、方法。
- 前記MYC関連疾患または障害が肝臓癌、腎臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、中咽頭癌および膵臓癌からなる群から選択される、請求項72に記載の方法。
- 前記MYC関連疾患または障害が肝細胞癌である、請求項73に記載の方法。
- 請求項1〜45のいずれか1項に記載の単離核酸を本質的に含むMYC阻害活性を有する組成物。
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