CN114144526A - Eph2a适配体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因疗法的领域。特别地，本发明涉及基于EphA2特异性RNA的构建体，所述构建体可用于治疗、预防和诊断EphA2表达癌症。

Description

EPH2A适配体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月3日提交的欧洲专利申请EP19382451.3的权益。
技术领域
本发明属于基因构建体和疗法的领域。特别地，其涉及特异性结合EphA2的RNA适配体及其用途。
背景技术
肝配蛋白(Eph)受体是参与若干种过程(包括血管生成、组织边界形成、细胞迁移和细胞塑性)的受体酪氨酸激酶的最广泛亚家族。这些受体是细胞-细胞相互作用和运动中充分确立的介体，并且在人类癌症中表达，所述人类癌症诸如黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和食道癌。在这些受体中，EphA2(肝配蛋白A型受体2)已经与许多对恶性进展至关重要的过程有牵连，所述过程诸如迁移、侵袭、转移、增殖、存活和血管生成。为此，在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌的多种临床前模型中，对EphA2的抑制导致减少的肿瘤生长、存活期和肿瘤诱导的血管生成(Tandon等人；Kasinski和Slack；Quinn等人)。常常向患有高级别疾病的患者施用较高的治疗剂量；这些患者常常由于对正常组织的非特异性靶向而遭受毒性。这突出了对具有改善安全性和功效概况的新方式的需要。
肉瘤是罕见的高级别肿瘤，其具有高的发病率和死亡率。在过去的二十年中，其总体发生率一直在以26％的估计速率增加。三分之一的肉瘤落在低突变负担的类别内，并且其特征在于称为染色体易位的特定复发性遗传变化。该类别的肉瘤被称为易位相关肉瘤(在下文中为TAS)，其尤其包括尤文肉瘤(在下文中为ES)、腺泡状横纹肌肉瘤(在下文中为ARMS)、滑膜肉瘤(在下文中为SS)。这些染色体易位(及其相关融合产物)的两个非常重要的特性是其一致性和特异性。多项研究已经表明，在给定肉瘤的大多数情况下发生相同的易位(或在一些情况下，相关的易位组之一)，因此易位或易位组在肉瘤类别内是一致的(Xiao等人，在该参考文献中公开了这些易位的染色体中的确切位置和所得融合物，并且将其通过引用并入本文)。此外，该易位或相关易位组之一不会发生在任何其他类型的肉瘤中，因此易位对于肉瘤类别具有特异性。因此，在易位或其融合产物与肉瘤类别之间存在非常密切的关系。
最近，已经显示EphA2在ES细胞中表达，并且为以非激酶依赖性方式对ES的侵袭性特性所必需的。因此，阻断EphA2表达或其功能对于治疗ES可以具有治疗性用途(Garcia-Monclús等人)。
RNA技术的最新进展为开发针对肉瘤和其他癌症的疗法提供了新的和有希望的工具。这些技术之一是适配体技术。作为治疗性试剂，RNA适配体与小分子抑制剂或基于蛋白质的试剂相比具有若干个优点。与大多数小分子抑制剂不同，适配体是高度特异性的并且可用于靶向疗法。与抗体相反，适配体可以容易地化学合成，并且适于化学修饰，所述化学修饰使其对核酶有抗性并且改善其体内药代动力学。此外，化学修饰的RNA适配体几乎没有免疫原性，因此对临床应用安全得多。
然而，即使已知适配体是至少具有上面所指出的优点的强大治疗性工具，但最新技术进展中仍然存在悬而未决的使用RNA适配体的有效癌症治疗。
发明内容
感兴趣地，本发明的作者已开发了可用于治疗、预防和诊断癌症、特别是EphA2表达癌症的RNA适配体和基于它们的构建体。
到目前为止，所有的尝试都集中于将作为EphA2靶向载体的适配体用于EphA2表达细胞。
令人惊讶的是，本发明人已发现包含序列SEQ ID NO:1的适配体能够通过其自身对EphA2表达癌细胞施加显著的治疗作用。实施例4，图3C显示了包含序列SEQ ID NO:1的适配体的施用降低肿瘤细胞的克隆能力。
将SEQ ID NO:1掺入除了所述适配体之外还包含siRNA的复合物内证实了癌细胞的克隆活性的该降低。从图10中可以得出结论，当所述复合物包括序列SEQ ID NO:1时，EphA2表达癌细胞的克隆活性显著降低。
下面的实施例6显示了包含序列SEQ ID NO:1的适配体的施用延迟肿瘤的发生。
这是首次基于与EphA2表达癌细胞的结合报道了具有这种治疗行为的RNA适配体。
因此，在第一方面，本发明涉及特异性结合EphA2的RNA适配体，所述RNA适配体：
(i)由序列SEQ ID NO:1组成；或者可替代地，
(ii)由序列SEQ ID NO:1组成，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶部分是取代的嘧啶；或者可替代地，
(iii)包含序列SEQ ID NO:1，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的所述嘧啶部分是取代的嘧啶；
其中所述术语“取代的嘧啶”在所述核苷酸是胞嘧啶时是具有式(I)的嘧啶，或在所述核苷酸是尿嘧啶时是具有式(II)的嘧啶，
Figure BDA0003391898400000031
其中与形成式(I)或(II)的嘧啶环的碳或氮原子中的至少一个结合的至少一个氢基团被非氢基团取代，所述非氢基团赋予所述适配体针对降解的稳定性。已经在现有技术中报道为通过取代嘧啶环改善适配体稳定性(体外或体内)的基团中的任一种可以用作“非氢基团”。
本发明人进行结构分析并且得出结论：获得环二级结构的SEQ ID NO:1与EphA2蛋白结合。为了内化细胞，与EphA2的结合是必需的。但是本发明的适配体不仅能够作为其他靶向元件被内化，而且它一旦在EphA2表达细胞内就能够通过其自身提供抗癌作用。
序列SEQ ID NO:1所赋予的技术作用在与EphA2的结合和内化方面是稳健的，使得当形成较长适配体(SEQ ID NO:4)的一部分进行测试时和当形成较大构建体(如可以为序列SEQ ID NO:17的复合物)的一部分进行测试时，发现相同的行为。在两种情况下，所述序列保持与EphA2表达癌细胞有效结合，并内化细胞的能力。
本发明还提供了RNA适配体，其特异性结合EphA2并且：
(i)由序列SEQ ID NO:1组成；或者
(ii)包含序列SEQ ID NO:2，任选地包含位于序列SEQ ID NO:2的位置1-20和46-51中任一者内的一个、两个或三个取代。
除上述之外，图10还显示了本发明的适配体不仅将siRNA携带至靶细胞，而且适配体和siRNA两者一旦被内化就可以对癌细胞施加有益的治疗作用。图3B已经显示了当适配体被内化时，癌细胞的克隆能力大幅度降低，所述能力在适配体和siRNA两者(形成复合物的一部分)均被内化在癌细胞中时几乎完全无效(图10)。这指示了单独的适配体的治疗效率(图3B)，而且还指示了适配体与功能性物质即siRNA的组合的治疗效率(图10)。
除上述之外，这些数据还支持本发明的适配体也可以充当功能性物质的有效递送载体。这也有着重要意义，因为最新技术进展报道了与抗癌治疗分子的稳定性和安全递送相关的若干个缺点。例如，siRNA已经报道为是高度不稳定的，因为其一旦施用就可以迅速降解。现有技术教导了使用脂质体来保护它们免于降解，但在脂质体中的包封已经被报道为有毒。
有利地，本发明的适配体允许功能性物质的安全和稳定递送，从而克服了到目前为止报道的递送载体的缺点。
因此，在第二方面，本发明涉及复合物，其包含与功能性物质偶联的本发明的RNA适配体。
在第三方面，本发明涉及组合物，其包含本发明的适配体或复合物。
在其他方面，本发明提供了用于在疗法或诊断学中使用的RNA适配体、或包含所述适配体或复合物的组合物，所述RNA适配体特异性结合EphA2并且包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸。在本发明中，表述“修饰的核苷酸”是指通过在糖或碱基部分中的化学修饰与位于序列SEQID NO:1中相同位置的核苷酸不同的核苷酸。负责适配体稳定化的此类化学修饰是充分确立的。
在第四方面，本发明涉及用于在治疗或预防癌症或癌症转移中使用的RNA适配体、或包含与功能性物质偶联的所述适配体的复合物、或包含所述适配体或复合物的组合物，所述RNA适配体特异性结合EphA2并且包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸，其中所述癌症的特征在于表达EphA2。该方面可以可替代地表述为用于治疗或预防癌症或癌症转移的方法，其中所述癌症的特征在于表达EphA2，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的RNA适配体、或包含与功能性物质偶联的所述适配体的复合物、或包含所述适配体或复合物的组合物，所述RNA适配体特异性结合EphA2并且包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸。该方面可以替代地表述为RNA适配体、或包含与功能性物质偶联的所述适配体的复合物、或包含所述适配体或复合物的组合物在制造用于治疗或预防癌症或癌症转移的药物中的用途，所述RNA适配体特异性结合EphA2并且包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸，其中所述癌症的特征在于表达EphA2。
在第五方面，本发明涉及RNA适配体、或包含与功能性物质偶联的所述适配体的复合物、或包含所述适配体或复合物的组合物用于体外或离体诊断癌症或癌症转移的用途，所述RNA适配体特异性结合EphA2并且包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸；其中所述癌症的特征在于表达EphA2。该方面可以可替代地表述为用于体外或离体诊断受试者的癌症或癌症转移的方法，其中所述癌症的特征在于表达EphA2，所述方法包括使所述受试者的分离测试样品与RNA适配体、或包含与功能性物质偶联的所述适配体的复合物、或包含所述适配体或复合物的组合物接触；以及检测所述适配体或复合物的位置，所述RNA适配体特异性结合EphA2并且包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸。
在第六方面，本发明涉及用于在体内诊断癌症的方法中使用的RNA适配体、或包含与功能性物质偶联的所述适配体的复合物、或包含所述适配体或复合物的组合物，所述癌症的特征在于表达EphA2，所述RNA适配体特异性结合EphA2并且包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸。该方面可以可替代地表述为用于体内诊断受试者的癌症或癌症转移的方法，其中所述癌症的特征在于表达EphA2，所述方法包括施用RNA适配体、或包含与功能性物质偶联的所述适配体的复合物、或包含所述适配体或复合物的组合物；以及检测所述适配体或复合物的位置，所述RNA适配体特异性结合EphA2并且包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸。
在第七方面，本发明涉及诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含RNA适配体、或包含与功能性物质偶联的所述适配体的复合物、或包含所述适配体或复合物的组合物，所述RNA适配体特异性结合EphA2并且包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸。
根据以下描述和所附权利要求，本申请的其他目的、特征、优点和方面将对本领域技术人员显而易见。
附图说明
图1中，图1A示出了一组横纹肌肉瘤(RMS)细胞系中的总EphA2表达及其在S897残基处的磷酸化的代表性蛋白质印迹。RH4、RH41、RH28(表达低量的EphA2)、RMS13、RH30、CW9019是ARMS细胞系。RD、RH36、RUCH2、A204是胚胎性RMS细胞系。图1B示出了在由RH4细胞产生的沉默模型(RH4shE2和RH4shE17)中、在RH4细胞中以及在RH4/CMV(沉默的阳性对照)中的EphA2表达的代表性蛋白质印迹。图1C使用EphA2沉默模型在博伊登(Boyden)室中进行的迁移测定的结果的图示。RH4/SCR代表用加扰适配体(非特异性RNA序列)处理的RH4细胞。
图2.-在所指示的时间点(6、24、48和72小时)后通过内化的RNA的qPCR进行的定量图示。
图3中，图3A在加扰适配体处理后14天，A673细胞集落的照片。图3B在EphA2适配体处理后14天，A673细胞集落的照片。图3C示出了对于A673(A6)和TC252(TC2)、RH4和RMS13的每种细胞系(x3)中计数的集落数(作为中值百分比)，将所述每种细胞系每3天用加扰(SCR)或EphA2适配体(EPH)以100nM处理，持续14天。A673和TC252是ES细胞系。
图4中，图4A和图4B分别示出了在加扰和EphA2适配体后A673迁移细胞的显微照片。在将细胞放置于博伊登室处前6小时，将它们用加扰或EphA2适配体处理，一次为250nM。在接种后48小时拍摄显微照片。图4C在48小时(A673，在绘图中表示为A6)和6小时(RMS13)处测量迁移细胞。绘图表示横坐标中迁移细胞的百分比。
图5.-比较在用加扰(n＝8，连续线)或EphA2适配体(n＝9，虚线)治疗的小鼠腓肠肌中生长的A673细胞的差别存活率(测量为达到足够用于手术的肿瘤体积的时间)的Kaplan-Meier曲线。使用对数秩(Mantel-Cox检验)分析来产生p值。P＝0.0237。
图6中，图6A表示加扰治疗的小鼠中的肺微转移的显微照片。图6B表示来自EphA2适配体治疗的小鼠的健康肺的显微照片。图6C对全部17只小鼠中转移的定量：加扰治疗的小鼠(SCR，n＝8)和EphA2适配体治疗的小鼠(APT，n＝9)。
图7.-表示通过qPCR测量的EWS/FLI1表达的绘图。在不使用任何附壁式(lepidic)系统的情况下将A673细胞(A6)用非靶向嵌合体(NT嵌合体)或不同的浓度(2μM和3μM)的特异性嵌合体(Apt-siEF)处理48h。
图8中，图8A使用VARNA 3.7预测的序列SEQ ID NO:2或4的二级结构的表示。用虚线矩形标记的部分对应于被认为是功能性环的部分，并且分别对应于SEQ ID NO:1或3。图8B适配体-siRNA复合物的二级结构的模型。复合物由两条链组成，其中较短链(包含siRNA指导链序列-描绘为空心圆圈)是与较长链(深灰色圆圈)的3′末端区的反向互补。较长链包括适配体序列及siRNA的有义(过客，黑色圆圈)部分，两者由3个核苷酸接头(UUU，浅灰色)分开。为了易于表示，适配体不是小图A的适配体。
图9.-本发明的主要假设的模型。在图中，插图显示了适配体-siRNA嵌合体如何识别血浆膜中的受体并进入细胞。在右侧，图片模拟适配体-siRNA嵌合体(根据本发明的复合物)的结构。
图10.-在加扰适配体-EWS/FLI1 siRNA嵌合体处理后(上面孔)和在EphA2-EWS/FLI1 siRNA嵌合体处理后(下面孔)14天A673细胞集落的照片。
具体实施方式
必须指出，除非上下文另外清楚地规定，否则如本申请中所用，单数形式例如“一个/一种”和“所述”包括其对应复数形式。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
为了有利于理解和阐明在本发明的上下文中具体术语的含义，提供了适用于本发明不同方面的所有实施方式的以下定义及其特定且优选的实施方式：
如本文所用的术语“适配体”一般是指单一定义序列的寡核苷酸或所述寡核苷酸的混合物，其中所述混合物保留特异性结合EphA2的特性。如本文所用，“适配体”是指单链核酸。在结构上，本公开的适配体是特异性结合的寡核苷酸。
如本文所用的术语“寡核苷酸”通用于多脱氧核糖核苷酸(含有2′-脱氧-D-核糖或其修饰修饰)，即DNA；多核糖核苷酸(含有D核糖或其修饰修饰)，即RNA；以及作为嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基或基本核苷酸的N-配醣体或C-配醣体的任何其他类型多核苷酸。根据本公开，术语“寡核苷酸”不仅包括具有常规碱基、糖残基和核苷酸间键的那些，而且还包括含有对这些三部分中的任一种或所有的修饰的那些(在下文也称为“修饰的核苷酸”)。
如本文所用的术语“RNA适配体”是包含核糖核苷单元的适配体，诸如腺苷、鸟苷、5-甲基尿苷、尿苷、5-甲基胞苷、胞苷、假尿苷、肌苷、N6-甲基腺苷、黄苷和怀丁苷。
如本文所用，术语“特异性结合”将意指与用替代性细胞或物质的情况相比，RNA适配体更频繁地、更迅速地、以更久的持续时间和/或以更大的亲和性与特定细胞或物质反应或缔合。例如，与结合不相关的蛋白质和/或其表位或免疫原性片段相比，特异性结合靶蛋白的RNA适配体以更大的亲和性、亲合性、更容易地和/或以更久的持续时间结合蛋白质或其表位或免疫原性片段。通过读取该定义还应理解，例如，特异性结合第一靶标的RNA适配体可以或可以不特异性结合第二靶标。因此，“特异性结合”不一定要求排它性结合或与另一种分子的不可检测结合，这被术语“选择性结合”涵盖。通常但不一定地，对结合的提及意指特异性结合。
本发明的适配体的特征在于其结合EphA2的能力。可以通过允许确定两个分子之间的结合的任何合适方法来确定适配体结合EphA2的能力。在一个实施方式中，通过使EphA2表达细胞与先前已经进行免疫荧光标记的适配体接触来确定适配体结合EphA2的能力。如果荧光信号位于细胞内，则这将表明置于适配体与EphA2结合且随后被内化。在一个替代性实施方式中，将EphA2表达细胞与适配体接触，并且在一段时间之后，使用扩增适配体序列的引物(如实施例3中使用的那些，即SEQ ID NO:24和25)，通过RT-PCR确定细胞内RNA适配体的量。EPH受体A2(肝配蛋白A型受体2)是在人中由EPHA2基因编码的蛋白质。该基因属于蛋白质-酪氨酸激酶家族的肝配蛋白受体亚家族。EPH和EPH相关受体已经与介导特别是在神经系统中的发育事件有牵连。EPH亚家族中的受体通常具有单一激酶结构域以及含有一个富含Cys的结构域和2个纤连蛋白III型重复序列的细胞外区域。将肝配蛋白受体基于其细胞外结构域序列的相似性及其结合肝配蛋白A和肝配蛋白B配体的亲和力分为两组。该基因编码结合肝配蛋白A配体的蛋白质。人受体的Uniprot登录号：P29317。
如本文所用的术语“与......偶联”旨在涵盖RNA适配体与如本文所述的功能性物质连接、附接或接合所凭借的任何结构。用于实现偶联的方法将是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于缀合、经由肽接头连接或通过将RNA和功能性物质直接化学合成为整个链。
如本文所用，术语“治疗”应理解为意指施用治疗有效量的如本文公开的RNA适配体、复合物或组合物，并且减少或抑制与癌症相关或尤其引起的临床病症的至少一种症状。
如本文所用，术语“预防”应意指施用预防有效量的根据本发明的RNA适配体、复合物或组合物，并且停止或阻碍或延迟癌症的至少一种症状的发生或进展。
表述“治疗有效量”是指根据本发明的RNA适配体、复合物或组合物足以减少或抑制EphA2表达癌细胞的数量和/或癌症的一种或多种症状的量。本领域技术人员将意识到这种量将根据例如特定受试者和/或疾病的类型或严重程度或水平而变化。所述术语不被解释为将本公开限制为具体量的RNA适配体、复合物或组合物。
表述“预防有效量”是指根据本发明的RNA适配体、复合物或组合物足以停止或阻碍或延迟癌症的至少一种症状的发生或进展的量。本领域技术人员将意识到这种量将根据例如特定受试者和/或疾病的类型或严重程度或水平而变化。所述术语不被解释为将本公开限制为具体量的RNA适配体、复合物或组合物。
如本文所用，术语“受试者”应意指任何受试者，包括人或非人受试者。非人受试者可以包括非人灵长类动物、有蹄类动物(牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛)、犬类、猫类、兔类(兔、野兔和鼠兔)、啮齿动物(小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠)、鸟类和鱼。优选地，受试者是人。
如本文所用，表述“特征在于表达EphA2的癌症”或“EphA2表达癌症”是指包含表达EphA2的细胞(EphA2阳性细胞)的肿瘤或癌症。更特别地，它是指过表达EphA2的癌症，即具有细胞过表达EphA2的细胞的癌症。本领域技术人员充分理解的是，所述癌症被表述“特征在于表达EphA2的癌症”或“EphA2表达癌症”涵盖(Zhou Y.等人,“Emerging and DiverseFunctions of the EphA2Noncanonical Pathway in Cancer Progression”,Biol.Pharm.Bull.40,1616–1624(2017))。
如本文所用的术语“EphA2+”或“EphA2表达细胞”可以互换使用。所述术语涵盖可以通过任何合适的手段检测到的EphA2的细胞表面表达。
适配体的若干种独特特性使其具有用于在广泛的分子生物学应用中使用的有吸引力的工具，并且使其作为潜在的药剂。作为治疗性试剂，RNA适配体与小分子抑制剂或基于蛋白质的试剂相比具有若干个优点。与大多数小分子抑制剂不同，适配体是高度特异性的并且可用于靶向疗法。适配体的结合位点包括靶分子的裂隙和沟槽，导致与许多当前可用的药剂非常相似的拮抗活性。此外，适配体在广泛范围的温度和储存条件下在结构上是稳定的。与抗体相反，适配体可以容易地化学合成，并且适于化学修饰，所述化学修饰使其对核酶有抗性并且改善其体内药代动力学。此外，化学修饰的RNA适配体几乎没有免疫原性，因此对临床应用安全得多。鉴于其特性，RNA适配体正在迅速成为强大的新治疗工具。
令人惊讶的是，本发明的作者开发了RNA适配体，其特异性结合EphA2(即特异性结合EphA2的RNA适配体)，并且不仅能够内化EphA2阳性细胞，而且还能够通过其自身施加治疗作用，如在上文已详细说明的。
因此，在第一方面，本发明涉及特异性结合EphA2的RNA适配体，所述RNA适配体：
(i)由序列SEQ ID NO:1组成；或者可替代地，
(ii)由序列SEQ ID NO:1组成，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶是取代的嘧啶；或者可替代地，
(iii)包含序列SEQ ID NO:1，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶是取代的嘧啶；
其中术语“取代的嘧啶”意指在所述核苷酸是胞嘧啶时形成式(I)的嘧啶环或在所述核苷酸是尿嘧啶时形成式(II)的嘧啶环的碳或氮原子中的至少一个的氢基团被非氢基团取代：
Figure BDA0003391898400000111
本发明还提供了RNA适配体，其特异性结合EphA2并且
(i)由序列SEQ ID NO:1(gucgucuugcguccccagacgacuc)组成；或者
(ii)包含序列SEQ ID NO:2(gggaggacgaugcgguccuugucgucuugcguccccagacgacucgcccga)，任选地包含位于序列SEQ ID NO:2的位置1-20和46-51中任一者内的一个、两个或三个取代。
特别地，适配体是分离的适配体。在特定实施方式中，本发明还提供了分离的RNA适配体，其具有与本发明中定义的适配体基本相同的结合EphA2的能力。
在特定实施方式中，适配体的序列长度在25与100个碱基之间，优选地在25与70个碱基之间且更优选地在25与55个碱基之间，从而使得能够易于化学合成。术语“碱基”可以与“核糖核苷单元”或“核苷酸碱基”或“残基”，诸如鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)互换使用。碱基可以在胞嘧啶与鸟嘌呤、腺嘌呤与尿嘧啶之间以及鸟嘌呤与尿嘧啶之间形成氢键。
在一个实施方式中，适配体包含序列SEQ ID NO:2。
本发明的适配体可以通过本领域已知的任何方法合成。在优选的实施方式中，适配体通过细胞-SELEX(通过指数富集的配体系统进化)产生，更优选通过本文所述的方法(参见实施例1)产生。有利地，细胞-SELEX方法允许通过复制蛋白质细胞外区域的天然构象和糖基化模式来产生针对细胞表面靶标的适配体。因此，适配体将结合细胞环境中的EphA2，并且内化至EphA2表达细胞(即EphA2阳性细胞)中。
在使用核酸作为治疗剂时遇到的一个潜在问题是呈其磷酸二酯形式的寡核苷酸可能在所需的作用显现之前在体液中被细胞内和细胞外酶(诸如内切核酸酶和外切核酸酶)迅速降解。最新技术进展中熟知的是，适配体可以包含改善适配体稳定性(体外或体内)的一种或多种修饰，例如使适配体对核酸酶有抗性的修饰(修饰的适配体)。用于产生对核酸酶有抗性的寡核苷酸的修饰是本领域技术人员熟知的，并且可以包括一种或多种取代的核苷酸键、改变的糖、改变的碱基或其组合。产生“修饰的核苷酸”的此类修饰包括2′位糖修饰、2’位嘧啶修饰、5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫代尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、主链修饰、硫代磷酸或(C1-C10)烷基磷酸修饰、甲基化和稀有碱基配对组合(诸如异碱基异胞苷和异尿苷)、3′和5′修饰(诸如加帽)、与分子量的缀合非免疫原性化合物的缀合、与亲脂性化合物的缀合以及磷酸主链修饰。
在本发明的特定实施方式中，“修饰的核苷酸”是修饰的胞嘧啶或尿嘧啶。在另一个实施方式中，“修饰的核苷酸”是胞嘧啶或尿嘧啶，其中嘧啶部分是如上所定义的“修饰的嘧啶”。
在本发明中，第一方面的适配体包含至少一个取代的嘧啶。RNA寡核苷酸可以包括两种类型的嘧啶衍生物：
Figure BDA0003391898400000131
除非另外说明，否则当在本发明中提及“取代的嘧啶”时，应理解为式(I)或(II)的嘧啶，其中与形成嘧啶环部分的碳或氮原子中的至少一个结合的至少一个氢基团已经被不同的基团置换。
在一个实施方式中，RNA适配体包含序列SEQ ID NO:2或由其组成，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶是取代的嘧啶。在另一个实施方式中，本发明的RNA适配体由序列SEQ ID NO:2组成，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶是取代的嘧啶。
在另一个实施方式中，至少约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％的嘧啶是取代的嘧啶。特别地，核苷酸序列的所有嘧啶是取代的嘧啶。
在另一个实施方式中，一个或多个取代的嘧啶是具有式(I)或(II)、在2′位包含非氢基团的嘧啶。术语“在2′位包含非氢基团”意指嘧啶部分在2′位包括非氢基团，而不排除嘧啶环可以还包含在环的其他位置中的其他取代的可能性。
在另一个实施方式中，一个或多个取代的嘧啶由2′取代的嘧啶组成。术语“由2′取代的嘧啶组成”意指嘧啶部分仅显示出在2′位的单一修饰(即，被非氢基团的取代)，并且排除在环的其他位置中的另外取代。
在另一个实施方式中，本发明的适配体包含在2′位包含一个非氢基团的一个或多个取代的嘧啶和由如上所定义的2′取代的嘧啶组成的一个或多个取代的嘧啶。
在另一个实施方式中，本发明的适配体仅包含由如上所定义的2′取代的嘧啶组成的取代的嘧啶。
在另一个实施方式中，适配体包含两个或更多个如上所定义的取代的嘧啶，并且非氢基团在所有取代的嘧啶中是相同的。
在另一个实施方式中，非氢基团选自卤素、-NR1R2、-O-(C1-C6)烷基、-SR3、叠氮化物、以及任选地被-OH取代的(C1-C6)烷基，其中R1、R2和R3选自-H、(C1-C6)烷基和(C1-C6)烯基。在另一个实施方式中，非氢基团是卤素，特别是氟化物。
术语(C1至C6)烷基是指具有1至6个碳原子的饱和直链或支链烷基链。例示性非限制性实例是：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、N-戊基、新戊基和正己基。
术语(C2至C6)烯基是指含有2至6个碳原子并且还含有一个或多个双键的饱和直链或支链烷基链。例示性非限制性实例是：乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1基等。
术语“卤素”是指周期表中由五种化学相关元素组成的族：氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)和砹(At)。
在另一个特定实施方式中，通过以下方式来修饰适配体：将5′端和/或3′端与荧光团或反向dT或与聚亚烷基二醇、优选地聚乙二醇(PEG)分子偶联。
特别地，当通过修饰的核苷(例如，2′-氟-嘧啶)进行修饰时，适配体对核酸酶介导的降解有高抗性，因此可以用于细胞培养中以及动物/受试者中。在另一个优选的实施方式中，嘧啶碱基是2′-氟(2′-F)修饰的，更优选地如序列SEQ ID NO:3(gUCgUCUUgCgUCCCCagaCgaCUC，大写字母表示2′F修饰的碱基)和SEQ ID NO:4(gggaggaCgaUgCggUCCUUgUCgUCUUgCgUCCCCagaCgaCUC gCCCga，大写字母表示2′F修饰的碱基)中任一者中所指示的。因此，在优选的实施方式中，适配体(i)由序列SEQ ID NO:3组成；或(ii)包含序列4或由其组成，任选地包含位于序列SEQ ID NO:4的位置1-20和46-51中任一者内的一个、两个或三个取代。更优选地，所述适配体包含SEQ ID NO:4，如实施例中所示，其特异性结合并内化EphA2阳性细胞，并且其是功能性物质(例如，siRNA)的成功递送剂。
特别地，当通过末端添加PEG进行修饰时，PEG的分子量不受特别限制，并且优选地是1000-100000、更优选地20000-90000。PEG可以是线性的或分支成两个或更多个链(多臂PEG)。关于终端添加PEG，可以将其添加至仅3′端和5′端中的一者或者3′端和5′端中的两者。优选地，将PEG添加至适配体的5′端。
有利地，这将适配体保持血流中，并且不被肾脏过滤。
这种PEG不受特别限制，并且本领域技术人员可以适当地选择和使用可商购获得的或已知的PEG。在本发明中，可以将PEG直接添加至末端。更优选的是，应将具有可以结合PEG等的基团的接头添加至其末端，并且应经由接头将PEG添加至本文提供的适配体。作为PEG和接头，可以优选地使用可商购获得的产品。与PEG、接头和本文提供的适配体的结合相关的反应条件等可以通过本领域技术人员适当地确定。
在另一个实施方式中，本发明的适配体选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4。
适配体结合高度依赖于由适配体寡核苷酸形成的二级结构。使用VARNA3.7预测本发明的适配体的RNA链的二级结构。SEQ ID NO:2或4的适配体的预测二级结构如图8A所示。可以看出，预测二级结构具有环，其具有SEQ ID NO:1或3(图8A中的虚线矩形)。虽然不希望受理论的束缚，但本发明人认为该环是功能性环、结合受体的环，因此由该序列组成的适配体可以是功能性的并且对于EphA2具有特异性。在特定实施方式中，本发明的适配体具有图8A中所示的二级结构。
适配体以各种结合模式结合靶分子，所述各种结合模式诸如基于磷酸基团的负电荷的离子键、基于核糖的疏水键和氢键以及基于核酸碱基的氢键和堆积相互作用。特别是，基于磷酸基团的负电荷的离子键(其以与构成核苷酸的数目相同的数目存在)较强，并且与存在于蛋白质的正电荷表面上的赖氨酸和精氨酸结合。为此，可以取代不参与直接结合靶分子的核酸碱基。特别是，因为茎结构的区域已形成碱基对并且朝向双螺旋结构的内部，因此核酸碱基不太可能直接结合靶分子。因此，即使当碱基对被另一个碱基对置换时，适配体的活性也往往不减小。因此，如上所定义，本发明的适配体可以包含在预测功能性环之外，即在SEQ ID NO:4的位置1-20和46-51内的任何位置处的一个、两个或三个取代。
关于核糖2′位的修饰，核糖2′位的官能团很少与靶分子直接相互作用，但在许多情况下，它不具有相关性，并且可以被另一个修饰的分子取代。在根据前述实施方式中任一项的另一个特定实施方式中，适配体特异性结合EphA2阳性(癌症)细胞。例如，在实施例3中示出了该情况，其中SEQ ID NO:4的适配体特异性结合ES细胞。在所述实施例中，还显示适配体能够内化所述EphA2阳性细胞。由于细胞迁移和集落形成在具有稳定敲低的EphA2的RMS细胞中被阻断(参见图1C和图3)，因此预期适配体内化EphE2阳性RMS细胞，就像其在ES细胞中那样。因此，在特定实施方式中，适配体内化EphA2阳性(癌症)细胞，因此，它可以用作所述特定细胞的递送系统。
本发明的适配体可以与形成复合物(在下文中也称为嵌合体)的功能性物质偶联。这样，适配体不仅提供治疗作用，而且还充当到EphA2阳性癌细胞的功能性物质的递送剂。因此，在第二方面，本发明涉及复合物，其包含与功能性物质偶联的根据本发明的第一方面的任一个实施方式的RNA适配体。
上文关于适配体提供的所有实施方式也是本发明的第二方面的实施方式。
复合物中适配体与功能性物质之间的偶联可以是共价键或非共价键。本发明的复合物可以是这样的复合物，其中本发明的适配体和相同种类或不同种类的一种或多种(例如2或3种)功能性物质结合在一起。
优选地，功能性物质与适配体的3′端偶联。
在根据前述实施方式中任一项的复合物的特定实施方式中，功能性物质通过间隔子或接头(优选地具有2-5个核苷酸、更优选地具有3个核苷酸(例如，UUU))与适配体偶联，并且/或者功能性物质在其3′端包含尾，优选地具有2-5个核苷酸、更优选地具有2或3个核苷酸(例如，UU或UUU)的尾。有利地，该接头和/或尾改善复合物的稳定性。
在本发明的复合物的一个实施方式中，间隔子包含一个或多个尿嘧啶核苷酸。在另一个实施方式中，间隔子由尿嘧啶核苷酸组成。在另一个实施方式中，间隔子由2-5个尿嘧啶核苷酸、特别地2-3个尿嘧啶核苷酸、更特别地3个尿嘧啶核苷酸组成。
功能性物质不受特别限制，只要其对本发明适配体新添加了某一功能，或者其能够改变(例如，改善)本发明适配体可以具有的某种特征。作为功能性物质的实例，可以提及蛋白质(诸如核酶)、肽、氨基酸、脂质、糖、单糖、多核苷酸和核苷酸。作为功能性物质的另外实例，可以提及亲和性物质(例如，生物素、链霉亲和素、具有对靶互补序列的亲和性的多核苷酸(诸如siRNA、微RNA(也称为miR、mir或miRNA)、shRNA)、抗体、谷胱甘肽琼脂糖、组氨酸)、用于标记的物质(例如，荧光物质、发光物质、放射性同位素)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、药物(例如，化学治疗剂诸如多柔比星、吉西他滨等)。
在本发明的第二方面的复合物的特定实施方式中，功能性物质是：
(i)siRNA、微RNA、shRNA或核酶，优选地siRNA或微RNA；或者
(ii)选自以下的部分：放射性核素、化学治疗剂及其组合，优选地化学治疗剂。
优选地，功能性物质是siRNA、微RNA、化学治疗剂或siRNA或miRNA和化学治疗剂的组合。负载有少量化学疗法分子的具有siRNA或miRNA的复合物降低化学治疗剂的不利影响。
在另一个实施方式中，功能性物质是siRNA或miRNA，并且在其3′端包含核苷酸尾，优选地由2-5个核苷酸、更优选地由2或3个核苷酸组成的尾。在另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，功能性物质是siRNA或miRNA，并且其包含含有一个或多个尿嘧啶核苷酸的3′端尾。在另一个实施方式中，功能性物质是siRNA或miRNA，并且其包含由2-5个尿嘧啶核苷酸、特别地3个核苷酸组成的3′端尾。
在另一个实施方式中，复合物包含通过间隔子(由2-5个核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-5个核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的本发明的适配体。在另一个实施方式中，复合物包含通过间隔子(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的本发明的适配体。在另一个实施方式中，复合物包含通过间隔子(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)的siRNA偶联的本发明的适配体。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的本文提供的适配体。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的本文提供的适配体。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个核苷酸组成)的siRNA偶联的本文提供的适配体。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)的siRNA偶联的本文提供的适配体。
在另一个实施方式中，复合物包含通过间隔子(由2-5个核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-5个核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:2或由其组成，其中所有嘧啶是取代的嘧啶，优选地2′取代的嘧啶。在另一个实施方式中，复合物包含通过间隔子(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:2或由其组成，其中所有嘧啶是取代的嘧啶，优选地2′取代的嘧啶。在另一个实施方式中，复合物包含通过间隔子(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)的siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:2或由其组成，其中所有嘧啶是取代的嘧啶，优选地2′取代的嘧啶。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:2或由其组成，其中所有嘧啶是取代的嘧啶，优选地2′取代的嘧啶。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ IDNO:2或由其组成，其中所有嘧啶是取代的嘧啶，优选地2′取代的嘧啶。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个核苷酸组成)的siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:2或由其组成，其中所有嘧啶是取代的嘧啶，优选地2′取代的嘧啶。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)的siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:2或由其组成，其中所有嘧啶是取代的嘧啶，优选地2′取代的嘧啶。
在另一个实施方式中，复合物包含通过间隔子(由2-5个核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-5个核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:4或由其组成。在另一个实施方式中，复合物包含通过间隔子(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:4或由其组成。在另一个实施方式中，复合物包含通过间隔子(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-5个尿嘧啶核苷酸组成)的siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:4或由其组成。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:4或由其组成。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)的miRNA或siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:4或由其组成。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个核苷酸组成)的siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:4或由其组成。在另一个实施方式中，本发明的复合物包含通过间隔子(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)与包含3′端尾(由2-3个尿嘧啶核苷酸组成)的siRNA偶联的适配体，所述适配体包含序列SEQ IDNO:4或由其组成。
在根据前述实施方式中任一项的优选实施方式中，功能性物质是siRNA。优选地，siRNA由20-30个核苷酸、更优选地23-27个核苷酸组成，并且甚至更优选地由25个核苷酸组成。有利地，这些siRNA有利于dicer复合物释放成熟siRNA的活性。
由于RNAi技术易于修改为抑制人基因组中几乎任何基因的表达，因此它已成为用于阐明在恶性肿瘤期间失调细胞生长和存活的机制的有价值的工具。此外，其作为癌症治疗工具的潜在用途也变得明显并得到高度追求。然而，尽管有若干种有效的抗癌细胞siRNA的开发，但迄今为止没有批准的基于siRNA的疗法用于治疗癌症。siRNA成功转化为用于在临床中使用的有效疗法的主要问题是递送和安全性(由于毒性问题)。令人惊讶的是，本发明的作者开发了适配体，其在与siRNA连接时充当进入EphA2阳性细胞中的递送剂。此外，siRNA被保护免于降解，并且其被DICER正确加工，从而导致所述siRNA的靶基因沉默(参见实施例8)。
如早前所提及的，TAS的特征在于由于肿瘤特异性染色体易位引起的特定融合蛋白的独特存在。因此，在根据先前段落的优选实施方式中，siRNA针对为EphA2表达癌症的特征的特异性易位产物，诸如TAS。例如，其针对为ES特征的特异性易位产物EWS/FLI1、为ARMS特征的特异性易位产物PAX3/FOXO1、为SS特征的特异性易位产物SS18/SSX1-2、为尤文样肉瘤特征的特异性易位产物CIC/DUX4和BCOR-CCNB3、为促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤(DSRCT)特征的特异性易位产物EWS/WT1以及为粘液样脂肪肉瘤(MLS)特征的特异性易位产物EWS/DDIT3和FUS/DDIT3。
在根据前述实施方式中任一项的优选实施方式中，适配体与siRNA偶联并且所述siRNA包含序列SEQ ID NO:5(cgggcagcagaacccuucuuaugac)、SEQ ID NO:6(auggccucucaccucagaauucaau)和SEQ ID NO:7(ugcccaagaagccagcagaggaauu)中的任一个或由其组成。这些序列中的每一个对于为ES、ARMS和SS特征的染色体易位具有特异性。更优选地，本发明的复合物包含选自以下的序列或由其组成：
SEQ ID NO:11:gggaggacgaugcgguccuugucgucuugcguccccagacgacucgcccgauuucgggcagcagaacccuucuuaugacuu,
SEQ ID NO:12:gucgucuugcguccccagacgacucuuucgggcagcagaacccuucuuaugacuu,
SEQ ID NO:13:gggaggacgaugcgguccuugucgucuugcguccccagacgacucgcccgauuuauggccucucaccucagaauucaauuu,
SEQ ID NO:14:gucgucuugcguccccagacgacucuuuauggccucucaccucagaauucaauuu,
SEQ ID NO:15:gggaggacgaugcgguccuugucgucuugcguccccagacgacucgcccgauuuugcccaagaagccagcagaggaauuuu，以及
SEQ ID NO:16:gucgucuugcguccccagacgacucuuuugcccaagaagccagcagaggaauuuu。
这些复合物具有通过3UUU间隔子与具有序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或在3′端具有UU尾的SEQ ID NO:7的siRNA连接的本发明的适配体(SEQ ID NO:3或4)，并且因此可分别用作ES、ARMS或SS的治疗剂。
在根据前述实施方式中任一项的复合物的另一个优选实施方式中，功能性物质是一种或多种miR。特别地，miRNA是肿瘤抑制剂(suppressor)(肿瘤抑制剂(onco-suppressor))miRNA，更具体地特征在于表达EphA2的肿瘤的肿瘤抑制剂miRNA。在优选的实施方式中，miRNA选自由以下组成的组：mir-130a(前列腺癌的肿瘤抑制剂)；mir-143(的肿瘤抑制剂骨肉瘤和SS)；mir-145(ES、骨肉瘤、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和结直肠癌的肿瘤抑制剂)；mir-302、mir-505或mir-520c(结肠癌的肿瘤抑制剂)；mir-202(胰腺癌的肿瘤抑制剂)；mir-34a(ES和前列腺癌的肿瘤抑制剂)；mir-206和mir-29(RMS的肿瘤抑制剂)和mir-424(乳腺癌的肿瘤抑制剂)。
虽然适配体-siRNA或适配体-miRNA复合物的产生显著改善siRNA或miRNA生物药物特性，但是另外的修饰可以进一步改善产物。在最近的研究中，20kDa PEG基团的化学缀合延长适配体-siRNA复合物的循环半衰期。将这种PEG分子通过化学合成置于siRNA过客链处而不影响与适配体靶标的结合或靶基因沉默活性(Dassie等人)。因此，在根据前述实施方式中任一项所述的本发明复合物的特定实施方式中，功能性物质是PEG分子在siRNA过客链处与其偶联的siRNA，优选地通过化学合成偶联PEG。
此外，已经显示纳米技术延长血清中核酸的稳定性，并且通过增强的渗透性和保留效应来增强携带药剂的肿瘤分布，所述保留效应包括由于异常和泄漏的肿瘤脉管系统和肿瘤淋巴管的不存在而导致的纳米颗粒在肿瘤微环境中的积累。与非PEG化纳米颗粒相比，可生物降解且FDA批准的聚合物的诸如聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)的PEG化纳米颗粒增加全身性循环时间，并且改善肿瘤分布。此外，PEG可用于将靶向分子缀合至纳米颗粒的表面(Cheng和Saltzman)。因此，在根据前述实施方式中任一项的特定实施方式中，复合物呈携带PEG缀合的适配体siRNA或miRNA复合物的PEG化纳米颗粒的形式。
有利地，可以在保护适配体免于其降解时，在没有脂质体的情况下配制该复合物。不必在脂质体内配制复合物具有多种优点。尤其是，它可以防止脂质体固有的毒性，所述毒性占大约20％的细胞死亡增加。
在根据前述实施方式中任一项的另一个特定实施方式中，siRNA或微RNA可以包含修饰以保护其免于核酸酶降解。上文针对本发明的适配体说明的修饰适用于siRNA和微RNA。在特定实施方式中，siRNA或微RNA包含修饰的核苷(例如，2′-氟-嘧啶)，如此其对核酸酶介导的降解有高抗性，因此可以用于细胞培养中以及动物/受试者中。优选地，形成miRNA或siRNA的一部分的一种或多种嘧啶碱基是取代的嘧啶。上文针对适配体中的“取代的嘧啶”提供的所有实施方式适用，并且因此也是任选地包括在形成本发明复合物的一部分的siRNA或微RNA中的“取代的嘧啶”的实施方式。在一个实施方式中，miRNA或siRNA的全部或部分嘧啶碱基是2′修饰的嘧啶，基团选自卤素、-NR1R2、-O-(C1-C6)烷基、-SR3、叠氮化物、以及任选地被-OH取代的(C1-C6)烷基，其中R1、R2和R3选自-H、(C1-C6)烷基和(C1-C6)烯基。在另一个实施方式中，miRNA或siRNA的取代的嘧啶碱基全部是2′-氟(2′-F)修饰的。如此，在优选的实施方式中，siRNA包含SEQ ID NO:8(CgggCagCagaaCCCUUCUUaUgaC，大写字母表示2′-F修饰的碱基)、SEQ ID NO:9(aUggCCUCUCaCCUCagaaUUCaaU，大写字母表示2′-F修饰的碱基)或SEQ ID NO:10(UgCCCaagaagCCagCagaggaaUU，大写字母表示2′-F修饰的碱基)的序列或由其组成。
更优选地，复合包含选自以下的序列(其中大写字母表示2′-F修饰的碱基)或由其组成：
SEQ ID NO:17:gggaggaCgaUgCggUCCUUgUCgUCUUgCgUCCCCagaCgaCUCgCCCgauuuCgggCagCagaaCCCUUCUUaUgaCuu，
SEQ ID NO:18:gUCgUCUUgCgUCCCCagaCgaCUCuuuCgggCagCagaaCCCUUCUUaUgaCuu，
SEQ ID NO:19:gggaggaCgaUgCggUCCUUgUCgUCUUgCgUCCCCagaCgaCUCgCCCgauuuaUggCCUCUCaCCUCagaaUUCaaUuu，
SEQ ID NO:20:gUCgUCUUgCgUCCCCagaCgaCUCuuuaUggCCUCUCaCCUCagaaUUCaaUuu，
SEQ ID NO:21:gggaggaCgaUgCggUCCUUgUCgUCUUgCgUCCCCagaCgaCUCgCCCgauuuUgCCCaagaagCCagCagaggaaUUuu，以及
SEQ ID NO:22:gUCgUCUUgCgUCCCCagaCgaCUCuuuUgCCCaagaagCCagCagaggaaUUuu。
这些复合物在适配体和siRNA中包含2′-氟修饰的嘧啶，从而使它们对核酸酶降解有抗性并且可用作用于ES、ARMS或SS的治疗剂。
在本发明的复合物的另一个优选实施方式中，功能性物质是化学治疗剂。在一个实施方式中，化学治疗剂选自由以下组成的组：多柔比星、吉西他滨、多西他赛、曲贝替定(trabectedin)、替莫唑胺、艾日布林(eribuline)及其组合。更优选地，化学治疗剂选自由以下组成的组：多柔比星、吉西他滨、多西他赛及其组合。
在根据本发明的复合物的另一个具体实施方式中，功能性物质是可检测标记，其优选地选自由以下组成的组：酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、电子密标记、用于磁共振成像的标记、放射性物质以及这些的组合。如此，复合物可以充当诊断剂，因为它可以检测EphA2阳性细胞。
本发明的适配体或复合物可以例如以药物组合物的形式使用。因此，在第三方面，本发明涉及组合物，其包含治疗有效量的本发明的RNA适配体或复合物以及可接受的或药物的赋形剂和/或载体。表述“赋形剂和/或载体”是指可接受的材料、组合物或媒介物。每种组分在可与组合物的其他成分相容的意义上必须是药学上可接受的。它们还必须适用于与人和非人动物的组织或器官接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症且与合理的益处/风险比相称。合适的可接受赋形剂的实例是溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非在任何常规的赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，诸如通过产生任何不希望的生物作用或以其他方式与用药物或美容组合物的任何其他组分相互作用非人情况下，否则其用途被考虑在本发明的范围内。
本文所述的药物组合物的配制品可以通过药理学领域已知的或今后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分(适配体或复合物)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分联合，并且然后如果必要和/或希望，将产物成形和/或包装成所希望的单剂量或多剂量单位。
本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量进行制备、包装和/或批量出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的个别量。
本发明的组合物中活性成分(本发明的适配体或复合物)、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、体型和/或病症并且进一步根据所述组合物被施用的途径而变化。
药学上可接受的载体的实例包括但不限于赋形剂诸如蔗糖、淀粉、甘露糖醇(mannit)、山梨糖醇(sorbit)、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙和碳酸钙；粘合剂诸如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖和淀粉；崩解剂诸如淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、乙二醇淀粉钠(sodium-glycol-starch)、碳酸氢钠、磷酸钙和柠檬酸钙；润滑剂诸如硬脂酸镁、
Figure BDA0003391898400000241
滑石和十二烷基硫酸钠；调味剂诸如柠檬酸、薄荷醇、甘草甜素铵盐、甘氨酸和橘粉；防腐剂诸如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯；稳定剂诸如柠檬酸、柠檬酸钠和乙酸；助悬剂诸如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和硬脂酸铝；分散剂诸如表面活性剂；稀释剂诸如水、生理盐水和桔汁；底蜡诸如可可脂、聚乙二醇和白色煤油等。
本发明的组合物可以由本领域技术人员已知的适用于所需施用(例如，口服、肠胃外、吸入剂)非任何形式配制。
在根据前述实施方式中任一项的特定实施方式中，本发明的组合物或药物的适配体和/或复合物是组合物的活性物质。
本发明还提供了将本发明的适配体和/或复合物固定在其上的固体支持物。作为固体支持物的实例，可以提及基底、树脂、板(例如，多孔板)、滤器、药筒、柱和多孔材料。基底可以是用于DNA芯片、蛋白质芯片等的基底；例如，可以提及镍-PTFE(聚四氟乙烯)基底、玻璃基底、磷灰石基底、硅基底、氧化铝基底等以及通过用聚合物等涂覆这些基底制备的基底。作为树脂的实例，可以提及琼脂糖颗粒、二氧化硅颗粒、丙烯酰胺和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物、聚苯乙烯交联的二乙烯基苯颗粒、与表氯醇交联的葡聚糖的颗粒、纤维素纤维、芳基葡聚糖和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合物、单分散性合成聚合物、单分散性亲水性聚合物、
Figure BDA0003391898400000251
等，并且也包括通过将各种官能团结合至这些树脂而制备的树脂。本发明的固体支持物可用于例如纯化、检测和定量EphA2。可以通过技术人员已知的方法将本发明的适配体和/或复合物固定至固体支持物上。
如早前所提及的，本发明的适配体可用作递送系统并且具有诊断和治疗潜力。因此，在第四方面，本发明涉及根据上文提供的实施方式中任一项的适配体、复合物或组合物，用于在治疗或预防癌症或癌症转移中使用，其中癌症的特征在于表达EphA2(EphA2表达癌症)。
上文针对本发明的适配体、复合物和组合物提供的所有实施方式也是本发明的第四方面的实施方式。
第四方面还包括治疗受试者的特征在于表达EphA2的癌症或癌症转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据上文提供的实施方式中任一项的RNA适配体、复合物或组合物。
第四方面还包括预防受试者的EphA2表达癌症或EphA2表达癌症转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防有效量的根据上文提供的实施方式中任一项的RNA适配体、复合物或组合物。
在第四方面的一个实施方式中，本发明提供了如本文定义的适配体、复合物或组合物以及另外的抗癌物质/疗法在治疗特征在于表达EphA2的癌症或癌症转移中的组合用途。它们可以依序、同时、一起或分开施用。
在第四方面的特定实施方式中，适配体包含序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:4、或由其组成，并且复合物包含序列SEQ ID NO:17或由其组成。在第五方面，本发明涉及根据上文提供的实施方式中任一项的适配体、复合物或组合物用于体外或离体诊断癌症或癌症转移的用途，其中癌症是EphA2表达癌症。
第五方面还包括诊断受试者的特征在于表达EphA2的癌症或癌症转移的体外方法，所述方法包括使根据本发明的第三方面的实施方式中任一项的RNA适配体或复合物与受试者的测试样品接触。
上文针对本发明的适配体、复合物和组合物提供的所有实施方式也是本发明的第五方面的实施方式。
在第五方面的特定实施方式中，适配体包含序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:4、或由其组成，并且复合物包含序列SEQ ID NO:17或由其组成。
在第六方面，本发明涉及根据上文提供的实施方式中任一项的适配体、复合物或组合物，用于在体内诊断癌症或癌症转移的方法中使用，其中癌症是EphA2表达癌症。
第六方面还包括诊断受试者的特征在于表达EphA2的癌症或癌症转移的体内方法，所述方法包括向有需要的受试者施用RNA适配体、根据本发明的第二方面的实施方式中任一项的复合物或如本发明中定义的组合物。
上文针对本发明的适配体、复合物和组合物提供的所有实施方式也是本发明的第六方面的实施方式。
在第六方面的特定实施方式中，适配体包含序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3或SEQ ID NO:4、或由其组成，并且复合物包含序列SEQ ID NO:17或由其组成。
在根据本发明的第四、第五和第六方面的实施方式中任一项的特定实施方式中，特征在于表达EphA2的癌症(EphA2表达癌症)是包含EphA2阳性细胞的癌症。因此，在特定实施方式中，癌症是包含EphA2阳性细胞的癌症。同样地，在另一个特定实施方式中，癌症是过表达EphA2的癌症。过表达EphA2意指EphA2的表达比健康组织中的EphA2表达高至少2、3、4或5倍。
优选地，EphA2表达癌症选自由以下组成的组：软组织和骨骼肉瘤，特别是TAS诸如ES、ARMS、SS；尤文样肉瘤(CIC重排、BCOR重排和EWSR1与非ETS基因重排)；DSRCT；MLS；胚胎横纹肌肉瘤、骨肉瘤；乳腺癌，特别是三重阴性乳腺癌；结直肠癌；黑色素瘤；肾细胞癌；胰腺癌；前列腺癌及其组合。更优选地，EphA2表达癌症选自由以下组成的组：软组织和骨骼肉瘤，特别是TAS诸如ES、ARMS、SS；尤文样肉瘤(CIC重排、BCOR重排和EWSR1与非ETS基因重排)；DSRCT；MLS；骨肉瘤；乳腺癌，特别是三重阴性乳腺癌；结直肠癌；黑色素瘤；肾细胞癌；胰腺癌；前列腺癌及其组合。更特别地，EphA2表达癌症是TAS，优选地ES、ARMS、SS；尤文样肉瘤(例如，CIC重排、BCOR重排和EWSR1与非ETS基因重排)；DSRCT；MLS；或乳腺癌，优选地三阴性乳腺癌。甚至更优选地，癌症是ES、ARMS或SS。
本发明的适配体、复合物或组合物的施用剂量根据活性成分的种类及活性、疾病的严重程度、施用的受试者、施用的受试者的药物耐受性、体重、年龄等而变化，并且对于成年人，常用剂量(基于活性成分量/天)可以是约0.0001至约100mg/kg，例如约0.0001至约10mg/kg，优选地约0.005至约1mg/kg。
本发明的适配体、复合物和/或组合物可以包含在成套试剂盒内。因此，本发明的第七方面涉及诊断试剂盒，其包含根据本发明的第一方面的实施方式中任一项的适配体、根据本发明的第二方面的实施方式中任一项的复合物和/或根据本发明的第三方面的实施方式中任一项的组合物。其还涉及该试剂盒用于体外或离体诊断癌症或癌症转移的用途，其中癌症的特征在于表达EphA2。优选地，试剂盒包含用于检测适配体的装置。更优选地，试剂盒包含其使用说明书。
上文针对适配体、复合物或组合物提供的所有实施方式也是本发明的第七方面的实施方式。
在本发明的第七方面的一个实施方式中，适配体包含序列SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4、或由其组成，并且复合物包含序列SEQ ID NO:17或由其组成。
虽然已经出于清楚和理解的目的相当详细地描述了前述发明，但是本领域技术人员通过读取本发明将理解，可以在不脱离本发明和所附权利要求的真实范围的情况下进行形式和细节的各种变化。
以下实施例用于进一步说明本发明，并非旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1.-材料和方法
1.-细胞内化SELEX
使用突变型Y639F T7 RNA聚合酶和化学合成的DNA模板(IDT)通过体外转录产生具有30个核苷酸(nt)可变区(gggaggacgaugcggnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncagacgacucgcccga，SEQ ID NO:23)的RNA文库。使用于文库和所有后续轮次的SELEX的体外转录反应补充有2′-氟修饰的CTP和UTP(TriLink Biotechnologies)以产生有核酸酶抗性的RNA。在每轮次的细胞SELEX中，首先将补充100μg/ml酵母tRNA(Invitrogen)的RNA适配体池(150nM)在非靶MCF10A(EphA2-)细胞上孵育30min以除去结合非靶细胞且内化至所述非靶细胞中的适配体。接下来，将上清液(含有未内化至非靶细胞中的RNA适配体)转移至靶MDA-MB 231(EphA2+)细胞，持续30min。为了增加后来轮次的细胞内化SELEX的选择的严格性，还减少了内化时间和细胞数。为了去除未结合的适配体和表面结合的适配体，将靶细胞(MDA-MB 231)用调整至0.5M NaCl的冰冷DPBS(高盐洗涤液)洗涤5min。然后使用TRIzol试剂(Invitrogen)根据制造商的说明书回收内化的RNA适配体，将其反转录为DNA，通过PCR(Sel25′引物：taatacgactcactatagggaggacgatgcgg,SEQ ID NO:24；Sel2 3′引物：tcgggcgagtcgtctg,SEQ ID NO:25)扩增，并且体外转录以产生RNA适配体的富集池用于下一轮次的细胞内化SELEX。
使用70Illumina深度测序(Iowa State DNA设施)测序来自选择的人EphA2轮次的适配体池。为了确定富集百分比，将每个轮次中独特序列的总数除以每个轮次中获得的序列总数。通过将每个单独的适配体序列与选择中的所有其他适配体序列进行比较，将适配体分组成族。将最高度代表的适配体用于测试其进入细胞的能力。
所有实施例中使用的适配体的序列是：
gggaggaCgaUgCggUCCUUgUCgUCUUgCgUCCCCagaCgaCUCgCCCga(SEQ ID NO:4)，其中 大写字母表示2′氟修饰的碱基。
2.-内化测定
在37℃下在5％CO2下将靶(A673和SKNMC)细胞与100nM适配体或适配体-siRNA嵌合体一起孵育30min。用冰冷的高盐洗涤液洗涤细胞，并且使用TRIzol试剂回收RNA。将样品标准化为内部RNA参考对照。具体地，将0.5pmol/样品的M12-23适配体连同作为参考对照的TRIzol添加至每个样品。使用具有SYBR绿的iScript单步RT-PCR试剂盒(Biorad)用BioradiCycler定量回收的RNA。将所有反应在50μl体积中用对RNA适配体具有特异性的引物(Sel25′引物(SEQ ID NO:24)；Sel 2 3′引物(SEQ ID NO:25))和M12-23参考对照(Sel1 5′引物：gggggaattctaatacgactcactatagggagagaggaagagggatggg，SEQ ID NO:26；Sel 1 3′引物：ggggggatccagtactatcgacctctgggttatg，SEQ ID NO:27))一式三份进行。将样品针对M12-23归一化，并且将每种适配体的PCR扩增效率相对于SCR1对照适配体归一化。
3.-RNA提取和逆转录
在所述浓度下进行适配体或嵌合体处理后，将通过使用nucleoSpin RNA或NucleoSpin miRNA(出于微阵列目的)从Macherey-Nagel提取的总RNA(2μg)用于用SuperScript II逆转录酶(Life Technologies)的cDNA合成。
4.- 定量实时PCR(qPCR)
在通用循环条件下在LightCycler 480II仪器(Roche)上使用来自LifeTechnologies的TaqMan PCR主混合物和TaqMan探针进行定量逆转录PCR。
实施例2.-EPHA2的表达
将细胞用含有蛋白酶抑制剂(Complete，微型；蛋白酶抑制剂混合物片剂)和磷酸酶抑制剂(PhosStop，磷酸酶抑制剂混合物片剂，Roche)的RIPA缓冲液在冰上；裂解30min。将裂解物超声处理，在13,000rpm下以4℃离心30min，并且回收上清液。通过8％、10％或12％SDS-PAGE解析样品(50μg)并且转移至硝酸纤维素膜上(0.2μm，Bio-Rad,Hercules,California,USA)。用在含有0.1％Tween20(Sigma-Aldrich)的PBS中的5％脱脂奶在室温下进行膜封闭1小时。接下来，将膜用适当的一抗(EphA2 1:1,000#6997)在4℃下孵育过夜。然后在室温下将印迹与辣根过氧化物酶缀合的二抗(山羊抗兔，Life Technologies)一起孵育1小时，并且通过增强的化学发光(Thermo Fisher Scientific)根据制造商的说明书检测过氧化物酶活性。将来自Abcam的α-微管蛋白(#ab28439)或β-肌动蛋白(#ab49900)的免疫检测用作加载对照。如图1所示，EphA2在RMS细胞中高度表达(图1A)。此外，RH4细胞中EphA2的稳定敲低(图1B)导致这些细胞尤其是在迁移上的肿瘤表型的减少(图1C)。因此，EphA2在RMS细胞中过表达，并且其下调导致细胞迁移的减少。
实施例3.-识别和内化
将表达EphA2的A673细胞用100nM加扰适配体、非特异性RNA序列或EphA2特异性适配体处理。将细胞固定，并且进行EphA2的免疫荧光。绿色染色细胞的细胞膜上的EphA2，DAPI染色细胞核，并且红颜色由附接至已内化细胞的EphA2适配体的Cy3标签产生。在处理后3小时拍摄照片。
发现本发明的EphA2适配体识别并进入ES A673细胞(EphA2表达细胞)，因为细胞被红色染色。因此，证明了本发明的适配体识别并内化EphA2阳性细胞的能力。如此，本发明的适配体是完美的治疗性候选物和至所述EphA2阳性细胞的与其偶联的任何功能性物质的递送剂。
此外，将EphA2(EPH)和加扰(SCR)RNA适配体与ES EphA2+A673细胞一起孵育。在指示的时间点之后，通过TRIzol提取回收内化至细胞中的RNA，并且使用QPCR进行定量(图2)。将SCR RNA适配体用作该测定中的细胞内化的阴性对照。如预测的那样，EphA2 RNA适配体特异性内化至A673细胞中，在6h处具有峰值，并且使用SCR RNA适配体几乎没有观察到内化。黑条表示对适配体具有特异性的内化RNA(作为用于产生文库的特异性引物，使用了SEL2/SEL1)，浅灰色条涉及特异性引物与来自细胞的内部RNA的比率(L32表示存在于细胞中的来自核糖体蛋白的RNA)。
实施例4.-克隆测定
在证明适配体内化细胞的能力之后，本发明人通过克隆测定测试了其是否可以具有任何治疗作用。
对于克隆测定，将500个细胞接种在6孔板的孔中。当集落达到饱和时(在接种后大约14天)，将细胞用冷甲醇固定10min，用杜尔贝科氏(Dulbecco′s)磷酸盐缓冲盐水(PBS，Biowest)洗涤，用晶体紫(Sigma-Aldrich)染色20min，并且用水洗涤。使用ImageJ手动计数总集落数。在一些情况下，将集落用10％冰醋酸溶液脱色，并且通过光谱法定量晶体紫。
将ES细胞(A673(A6)和TC252(TC2))和ARMS细胞(RH4和RMS13)用加扰(SCR)或EphA2适配体(EPH)每3天以100nM处理，持续14天。
图3A和B分别示出了SCR和EphA2适配体处理的细胞中的染色集落数的代表性实验。图3C的绘图示出了每个细胞系(x3)中计数的集落数(作为中值百分比)。与加扰适配体相比，本发明的EphA2适配体能够降低代表ES和ARMS实体的细胞的克隆能力(图3C)。
实施例5.-TRANSWELL迁移测定
在用加扰或EphA2适配体处理的A673(ES)和RMS13(ARMS)细胞上进行迁移测定。
照常收获细胞。在用RPMI再洗涤后，将在150μL无血清培养基中的1.5×105个细胞添加至8-μm孔聚碳酸酯transwell(Transwell渗透性载体-Corning)的顶部室。同时，在底部室中，添加500μL完全培养基(10％FBS)。对于在250nM适配体存在下的迁移测定，在接种前6h用适配体预处理细胞，并且将适配体添加至两个室。对于A673 48h并且对于RMS136 6h后，用棉签除去上室上的细胞。使用70％乙醇固定在膜的下侧上仍然附接的迁移细胞，持续30min，并且用晶体紫色染色。
在加扰和EphA2适配体处理之后迁移的A673细胞的代表性显微照片分别示出在图4A和图4B中。
收集Transwell膜，并且通过光学显微镜(100×)获取每个Transwell的5张照片。通常，将膜用10％冰醋酸溶液脱色，并且通过光谱法定量晶体紫。在一些情况下，我们选择使用ImageJ直接手动计数膜中的迁移细胞数。将结果呈现为指定对照条件的百分比(图4C)。
如图4C所示，本发明的适配体减少了ES和RMS细胞两者的迁移，这强烈表明适配体模拟了敲低EphA2的效应。
实施例6.-肿瘤发生率
基于体外结果，本发明人通过使用本发明人开发的原位模型来测试适配体在体内的作用(Lagares-Tena等人)。将A673细胞(2x106个)注射在balb/c雌性小鼠的腓肠肌中(8只小鼠用于加扰治疗并且9只小鼠用于EphA2适配体治疗)，并且2天后，每3天以2nmol浓度通过尾静脉全身性地施加加扰和EphA2适配体(施加4至5次注射)。如图5所示，所有加扰治疗的小鼠到18天发展有权手术的肿瘤。相比之下，由于治疗的结果，在用特异性适配体治疗的9只小鼠中的3只小鼠中肿瘤没有发展，并且在另外小鼠中的四只中发展的肿瘤具有显著的生长延迟。此外，延迟了到达手术体积的时间。
实施例7.-原位异种移植物转移测定
因为原位模型在肿瘤切除后发展肺瘤转移，本发明人测量了每组动物中的肺瘤转移数。
简而言之，将重悬于100μL PBS中的2×106个细胞注射至来自Harlan的6周龄雌性无胸腺裸小鼠(BALB/cnu/nu)的腓肠肌中(8只小鼠用于加扰治疗并且9只小鼠用于EphA2适配体治疗)，并且2天后，每3天以2nmol浓度通过尾静脉全身性地施加加扰和EphA2适配体(施加4至5次注射)。一旦携带原发性肿瘤的肢体达到800mm3的体积，就将腓肠肌肌肉手术切除。在注射后的第60天，对小鼠实施安乐死，并且将肺固定在4％多聚甲醛中并且包埋在石蜡中。用苏木精和曙红对肺切片进行染色，并且在光学显微镜下计数转移。
代表加扰治疗的小鼠中的肺瘤微转移和来自EphA2适配体治疗的小鼠的健康肺的显微照片分别c示出在图6A和图6B中。
如图6C所见，仅2只用EphA2适配体治疗的小鼠在肺中显示出微转移，占样本的28％。相反，在7只用加扰适配体治疗的小鼠中在肺中发现微转移，占样本的77％。
实施例8.-适配体-siRNA复合物
嵌合体产生
通过将与EWS/FLI1反义序列互补的核苷酸(在下面的SEQ ID NO:17中加下划线)添加至EphA2 RNA适配体的3′端来工程化EphA2适配体-EWS/FLI1siRNA嵌合体的较长链。在适配体与siRNA之间包括接头子uuu，并且在siRNA的3′端包括尾uu(中SEQ ID NO:17中为斜体)。将通过体外转录产生的所有RNA产生为具有2′-氟修饰的嘧啶(序列中的大写字母)，以使RNA对核酸酶降解有抗性。通过以下方式来将4倍摩尔过量的EWS/FLI1反义序列退火至每条长RNA链(终浓度为1μM)：将长RNA链在95℃下加热10分钟、将4倍过量的反义siRNA链添加至未折叠的适配体溶液并且将混合物转移至65℃干燥浴，持续7min。将RNA混合物在25℃下冷却20min，以允许两条RNA链的退火。然后将RNA适配体和siRNA折叠并在1XBB(20mM HEPESpH 7.4，150mM NaCl，2mM CaCl2)中退火。通过以下方式去除过量的反义siRNA链：通过Amicon Y-30柱(Millipore，UFC803024)过滤折叠的RNA。
该实施例中使用的嵌合体是：
gggaggaCgaUgCggUCCUUgUCgUCUUgCgUCCCCagaCgaCUCgCCCgauuuCgggCagCagaaCC CUUCUUaUgaCuu(SEQ ID NO:17)
在不使用任何附壁式系统的情况下将A673细胞用非靶向(NT)嵌合体和不同的浓度的特异性嵌合体(Apt-siEF)处理48h。使用来自Life Technologies ACTB 4333762F和EWS-FLI1 Hs03024497的TaqMan探针通过qPCR测量EWS/FLI1表达。在siRNA递送后融合基因的水平降低约80％(参见图7)。因此，用与针对EWS/FLI1的siRNA复合的该EPhA2特异性适配体处理48h的A673细胞导致EWS/FLI1的有效下调。
该实施例显示，根据本发明的适配体-siRNA复合物能够内化至特定细胞类型(EphA2阳性细胞)中，并且可以将功能性物质(在这种情况下为对EWS/FLI1具有特异性的siRNA)递送至体外细胞中，从而导致siRNA的靶基因(在这种情况下为EWS/FLI1)表达的下调。因此，证明了本发明的适配体是良好的递送剂，其允许与其复合的siRNA的内化，并且保护所述siRNA免于其降解。
这些结果强烈表明根据本发明的适配体将特异性siRNA递送至细胞中从而有效地被加工以抑制siRNA靶标的表达的有用性。
关于EphA2适配体-siRNA嵌合体如何在细胞水平上工作的假设模型描绘于图9中。适配体-siRNA嵌合体识别血浆膜中的受体并进入细胞。
实施例9.-使用本发明的复合物的克隆测定
进行与上文实施例4中公开的方案相同的方案，但将适配体替换为实施例8的序列SEQ ID NO:17的复合物并且测试在A673细胞上的作用。
将结果汇总于图10中。清楚的是，复合物在降低ES细胞的克隆能力方面是显著有效的。
文献
–Xiao等人，Advances in chromosomal translocations and fusion genes insarcomas and potential therapeutic applications.Cancer Treat Rev.2018；63:61-70.
-Tandon等人，Emerging strategies for EphA2 receptor targeting forcancer therapeutics.Expert Opin Ther Targets.2011；15(1):31-51.
–Kasinski和Slack,Small RNAs deliver a blow to ovarian cancer.CancerDiscov.2013；3:1220-1221.
-Quinn等人，Therapy of pancreatic cancer via an EphA2 receptor-targeted delivery of Gemcitabine.Oncotarget.2016；7:17103-17110.
-García-Monclús等人，EphA2 receptor is a key player in the metastaticonset of Ewing sarcoma.Int.J.Cancer.2018；143:1188-1201.
-Lagares-Tena等人，Caveolin-1promotes Ewing sarcoma metástasisregulating MMP-9expression through MAPK/ERK pathway.Oncotarget.2016；7:56889-56903.
-Dassie等人，Systemic administration of optimized aptamer-siRNAchimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.Nat Biotechnol.2009；27(9):839-49.
–Cheng和Saltzman.Enhanced siRNA delivery into cells by exploiting thesynergy between targeting ligands and cell-penetrating peptides.Biomaterials2011；32(26):6194-203.
-Zhou Y.等人，“Emerging and Diverse Functions of the EphA2Noncanonical Pathway in Cancer Progression”,Biol.Pharm.Bull.40,1616–1624(2017).
出于完整性的原因，本发明的各个方面在以下编号的条款中阐述：
条款
1.-一种RNA适配体，其特异性结合EphA2并且：
(i)由序列SEQ ID NO:1组成；或者
(ii)包含序列SEQ ID NO:2，任选地包含位于SEQ ID NO:2的位置1-20和46-51中任一者内的一个、两个或三个取代。
2.-根据条款1所述的适配体，其中所述适配体被修饰以保护其免于核酸酶消化，优选地通过包含2′-氟(2′-F)修饰的嘧啶碱基而被修饰，或通过将聚乙二醇与所述适配体的5′端偶联而被修饰。
3.-根据条款2所述的适配体，其中所述适配体包含2′-氟(2′-F)修饰的嘧啶碱基并且
(i)由序列SEQ ID NO:3组成；或者
(ii)包含序列SEQ ID NO:4，任选地包含位于SEQ ID NO:4的位置1-20和46-51中任一者内的一个、两个或三个取代。
4.-根据条款1至3中任一项所述的适配体，所述适配体包含序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4、优选地SEQ ID NO:4，或由其组成。
5.-一种复合物，其包含与功能性物质偶联的根据条款1至4中任一项所述的RNA适配体，所述功能性物质优选地在所述适配体的3′端偶联。
6.-根据条款5所述的复合物，其中所述功能性物质通过间隔子，优选地具有2-5个核苷酸、更优选地具有3个核苷酸的间隔子与所述适配体偶联，并且/或者其中所述功能性物质包含3′端尾，优选地具有2-5个核苷酸、更优选地具有2或3个核苷酸的尾。
7.-根据条款5或6所述的复合物，其中所述功能性物质是：
(i)siRNA、微RNA、shRNA或核酶，优选地siRNA或微RNA；或者
(ii)选自以下的部分：放射性核素、化学治疗剂及其组合，优选地化学治疗剂。
8.-根据条款7所述的复合物，其中所述适配体与siRNA偶联，并且优选地，所述siRNA包含序列SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:10中的任一个。
9.-根据条款7所述的复合物，其包含序列SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:22中的任一个。
10.-根据条款5或6所述的复合物，其中所述功能性物质是可检测标记，其优选地选自由以下组成的组：酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、电子密标记、用于磁共振成像的标记、放射性物质以及这些的组合。
11.-一种组合物，所述组合物包含根据条款1至4中任一项所述的适配体和/或根据条款5至10中任一项所述的复合物，以及药学上和/或生理上可接受的载体。
12.-根据条款1至4中任一项所述的适配体、或根据条款5-10中任一项所述的复合物、或根据条款11所述的组合物，其用于在治疗或预防受试者的癌症或癌症转移的方法中使用，其中所述癌症的特征在于表达EphA2，优选地所述癌症选自由以下组成的组：软组织和骨骼肉瘤，特别是易位相关肉瘤诸如尤文肉瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；尤文样肉瘤；骨肉瘤；乳腺癌，诸如三阴性乳腺癌；结直肠癌；黑色素瘤；肾细胞癌；胰腺癌；前列腺癌及其组合。
13.-根据条款1至4中任一项所述的适配体、或根据条款10中任一项所述的复合物、或根据条款11所述的组合物用于体外或离体诊断癌症或癌症转移的用途，其中所述癌症的特征在于表达EphA2，优选地所述癌症选自由以下组成的组：软组织和骨骼肉瘤，特别是易位相关肉瘤诸如尤文肉瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；尤文样肉瘤；骨肉瘤；乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌；结直肠癌；黑色素瘤；肾细胞癌；胰腺癌；前列腺癌及其组合。
14.-根据条款1至4中任一项所述的RNA适配体、或根据条款10中任一项所述的复合物、或根据条款11所述的组合物，其用于在体内诊断特征在于表达EphA2的癌症的方法中使用，优选地所述癌症选自由以下组成的组：软组织和骨骼肉瘤，特别是易位相关肉瘤诸如尤文肉瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；尤文样肉瘤；骨肉瘤；乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌；结直肠癌；黑色素瘤；肾细胞癌；胰腺癌；前列腺癌及其组合。
15.-一种诊断试剂盒，其包含根据条款1至4中任一项所述的RNA适配体、或根据条款10中任一项所述的复合物、或根据条款11所述的组合物，并且任选地包含用于检测所述适配体的装置。
序列表
<110> 生物医学研究所(IDIBELL)
阿尔巴·佩雷斯·卢卡癌症防治基金会（FUNDACION ALBA PEREZ LUCHA CONTRA ELCANCER INFANTIL）
<120> EPH2A适配体及其用途
<130> P5471PC00
<150> EP19382451.3
<151> 2019-06-03
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 适配体
<400> 1
gucgucuugc guccccagac gacuc 25
<210> 2
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 适配体
<400> 2
gggaggacga ugcgguccuu gucgucuugc guccccagac gacucgcccg a 51
<210> 3
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的适配体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(25)
<223> 所有嘧啶为2-氟
<400> 3
gucgucuugc guccccagac gacuc 25
<210> 4
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的适配体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(51)
<223> 所有嘧啶为2-氟
<400> 4
gggaggacga ugcgguccuu gucgucuugc guccccagac gacucgcccg a 51
<210> 5
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 5
cgggcagcag aacccuucuu augac 25
<210> 6
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 6
auggccucuc accucagaau ucaau 25
<210> 7
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 7
ugcccaagaa gccagcagag gaauu 25
<210> 8
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的siRNA
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(25)
<223> 所有嘧啶为2-氟
<400> 8
cgggcagcag aacccuucuu augac 25
<210> 9
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的siRNA
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(25)
<223> 所有嘧啶为2-氟
<400> 9
auggccucuc accucagaau ucaau 25
<210> 10
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的siRNA
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(25)
<223> 所有嘧啶为2-氟
<400> 10
ugcccaagaa gccagcagag gaauu 25
<210> 11
<211> 81
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 复合适配体-siRNA
<400> 11
gggaggacga ugcgguccuu gucgucuugc guccccagac gacucgcccg auuucgggca 60
gcagaacccu ucuuaugacu u 81
<210> 12
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 复合适配体-siRNA
<400> 12
gucgucuugc guccccagac gacucuuucg ggcagcagaa cccuucuuau gacuu 55
<210> 13
<211> 81
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 复合适配体-siRNA
<400> 13
gggaggacga ugcgguccuu gucgucuugc guccccagac gacucgcccg auuuauggcc 60
ucucaccuca gaauucaauu u 81
<210> 14
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 复合适配体-siRNA
<400> 14
gucgucuugc guccccagac gacucuuuau ggccucucac cucagaauuc aauuu 55
<210> 15
<211> 81
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 复合适配体-siRNA
<400> 15
gggaggacga ugcgguccuu gucgucuugc guccccagac gacucgcccg auuuugccca 60
agaagccagc agaggaauuu u 81
<210> 16
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 复合适配体-siRNA
<400> 16
gucgucuugc guccccagac gacucuuuug cccaagaagc cagcagagga auuuu 55
<210> 17
<211> 81
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的复合适配体-siRNA
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(79)
<223> 所有嘧啶为2-氟, 除了位置52-54
<400> 17
gggaggacga ugcgguccuu gucgucuugc guccccagac gacucgcccg auuucgggca 60
gcagaacccu ucuuaugacu u 81
<210> 18
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的复合适配体-siRNA
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(53)
<223> 所有嘧啶为2-氟, 除了位置26-28
<400> 18
gucgucuugc guccccagac gacucuuucg ggcagcagaa cccuucuuau gacuu 55
<210> 19
<211> 81
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的复合适配体-siRNA
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(79)
<223> 所有嘧啶为2-氟, 除了位置52-54
<400> 19
gggaggacga ugcgguccuu gucgucuugc guccccagac gacucgcccg auuuauggcc 60
ucucaccuca gaauucaauu u 81
<210> 20
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的复合适配体-siRNA
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(53)
<223> 所有嘧啶为2-氟, 除了位置26-28
<400> 20
gucgucuugc guccccagac gacucuuuau ggccucucac cucagaauuc aauuu 55
<210> 21
<211> 81
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的复合适配体-siRNA
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(79)
<223> 所有嘧啶为2-氟, 除了位置52-54
<400> 21
gggaggacga ugcgguccuu gucgucuugc guccccagac gacucgcccg auuuugccca 60
agaagccagc agaggaauuu u 81
<210> 22
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的复合适配体-siRNA
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(53)
<223> 所有嘧啶为2-氟, 除了位置26-28
<400> 22
gucgucuugc guccccagac gacucuuuug cccaagaagc cagcagagga auuuu 55
<210> 23
<211> 60
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA文库可变区
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (15)..(44)
<223> n为a, c, g或u
<400> 23
ggaggacgau gcggnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncagacg acucgcccga 60
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sel2 5' 引物
<400> 24
taatacgact cactataggg aggacgatgc gg 32
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sel2 3' 引物
<400> 25
tcgggcgagt cgtctg 16
<210> 26
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sel1 5' 引物
<400> 26
gggggaattc taatacgact cactataggg agagaggaag agggatggg 49
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sel 1 3' 引物
<400> 27
ggggggatcc agtactatcg acctctgggt tatg 34

Claims (28)

1.一种特异性结合EphA2的RNA适配体，所述RNA适配体：
(i)由序列SEQ ID NO:1组成；或者可替代地，
(ii)由序列SEQ ID NO:1组成，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶部分是取代的嘧啶；或者可替代地，
(iii)包含序列SEQ ID NO:1，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶部分是取代的嘧啶；
其中所述术语“取代的嘧啶”当所述核苷酸是胞嘧啶时是式(I)的嘧啶，或当所述核苷酸是尿嘧啶时是式(II)的嘧啶，
Figure FDA0003391898390000011
其中与形成式(I)或式(II)的嘧啶环的碳或氮原子中的至少一个结合的至少一个氢基团被非氢基团取代。
2.根据权利要求1所述的RNA适配体，其包含SEQ ID NO:2或由其组成，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶是取代的嘧啶。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的RNA适配体，其包含序列SEQ ID NO:2或由其组成，并且形成所述序列的核苷酸中的至少一者的嘧啶是取代的嘧啶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的RNA适配体，其中所述核苷酸序列的所有嘧啶部分是取代的嘧啶。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的RNA适配体，其中所述取代的嘧啶在2'位包含一个非氢基团。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的RNA适配体，其中所述非氢基团选自卤素、-NR1R2、-O-(C1-C6)烷基、-SR3、叠氮化物、以及任选地被-OH取代的(C1-C6)烷基，其中R1、R2和R3选自-H、(C1-C6)烷基和(C1-C6)烯基；特别是卤素。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的RNA适配体，其选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。
8.一种复合物，其包含与功能性物质偶联的根据权利要求1-7中任一项所定义的RNA适配体。
9.根据权利要求8所述的复合物，其中所述RNA适配体通过间隔子与所述功能性物质偶联，所述间隔子优选地由2-5个核苷酸组成。
10.根据权利要求9所述的复合物，其中所述间隔子由3个核苷酸组成。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的复合物，其中形成所述间隔子的部分或所有所述核苷酸是嘧啶核苷酸。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的复合物，其中所述功能性物质选自：
(i)siRNA、微RNA、shRNA或核酶，优选地siRNA或微RNA；
(ii)选自以下的部分：放射性核素、化学治疗剂及其组合，优选地化学治疗剂；以及
(iii)可检测标记；优选地，所述可检测标记选自由以下组成的组：酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、电子密标记、用于磁共振成像的标记、放射性物质及其组合。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的复合物，其中所述功能性物质是siRNA。
14.根据权利要求13所述的复合物，其中形成所述siRNA的一部分的至少一个核苷酸是修饰的核苷酸，特别地，所述修饰的核苷酸是修饰的胞嘧啶或尿嘧啶，更特别地，形成所述siRNA的至少一个胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸的所述嘧啶是取代的嘧啶，其中所述术语“取代的嘧啶”根据权利要求1中所定义。
15.根据权利要求8-14中任一项所述的复合物，其中所述功能性物质是包含选自SEQID NO:5至SEQ ID NO:10的序列的siRNA。
16.根据权利要求8-15中任一项所述的复合物，其中所述siRNA包含3'端核苷酸尾，所述核苷酸尾优选地由2-5个核苷酸、更优选地由2或3个核苷酸形成。
17.根据权利要求16所述的复合物，其中所述3'端核苷酸尾包含尿嘧啶核苷酸或由尿嘧啶核苷酸组成。
18.根据权利要求8-17中任一项所述的复合物，其包含选自SEQ ID NO:11至SEQ IDNO:22的序列，或由其组成。
19.根据权利要求8-18中任一项所述的复合物，其固定在固体支持物上。
20.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1-7中任一项所定义的RNA适配体、或根据权利要求8-19中任一项所定义的复合物，以及可接受的药物赋形剂和/或载体。
21.一种特异性结合EphA2的RNA适配体，其用于在疗法或诊断中使用，所述RNA适配体包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸在核苷酸间键、糖部分、碱基部分或其组合处被化学修饰以改善所述适配体的稳定性。
22.一种特异性结合EphA2的RNA适配体、包含与生物物质偶联的所述适配体的复合物、或包含治疗有效量的所述适配体或复合物以及可接受的药物赋形剂和/或载体的药物组合物，其用于在治疗或预防受试者的癌症或癌症转移的方法中使用，所述RNA适配体包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸在核苷酸间键、糖部分、碱基部分或其组合处被化学修饰以改善所述适配体的稳定性，其中所述癌症的特征在于表达EphA2，特别地尤文肉瘤、尤文样肉瘤或腺泡状横纹肌肉瘤。
23.一种特异性结合EphA2的RNA适配体、包含与生物物质偶联的所述适配体的复合物、或包含所述适配体或复合物的组合物，其用于在诊断受试者的癌症或癌症转移的体内方法中使用，所述RNA适配体包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸在核苷酸间键、糖部分、碱基部分或其组合处被化学修饰以改善所述适配体的稳定性，其中所述癌症的特征在于表达EphA2，特别地尤文肉瘤、尤文样肉瘤或腺泡状横纹肌肉瘤。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的使用的RNA适配体，其中所述适配体根据权利要求1-7中任一项所定义，所述复合物根据权利要求8-19中任一项所定义，或者所述组合物根据权利要求20所定义。
25.特异性结合EphA2的RNA适配体、包含与生物物质偶联的所述适配体的复合物、或包含所述适配体或复合物的组合物作为体外或离体诊断特征在于表达EphA2的癌症或癌症转移，特别是尤文肉瘤、尤文样肉瘤或腺泡状横纹肌肉瘤中的诊断剂的用途，所述RNA适配体包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，形成所述适配体的所述序列的一个或多个核苷酸是修饰的核苷酸。
26.根据权利要求25所述的使用的RNA适配体的用途，其中所述适配体根据权利要求1-7中任一项所定义，所述复合物根据权利要求8-19中任一项所定义，或者所述组合物根据权利要求20所定义。
27.一种诊断试剂盒，其包含：适配体、包含与生物物质偶联的所述适配体的复合物、或包含所述适配体或复合物的组合物；以及用于检测所述适配体的装置，所述适配体包含序列SEQ ID NO:1或由其组成，其中任选地，所述核苷酸中的一个是修饰的核苷酸。
28.根据权利要求27所述的诊断试剂盒，其中所述适配体根据权利要求1-7中任一项所定义，所述复合物根据权利要求8-19中任一项所定义，或者所述组合物根据权利要求20所定义。
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