TW202137987A - 用於治療ｈｂｖ之靶向ｈｂｖ的治療性寡核苷酸及ｔｌｒ７促效劑之醫藥組合 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於用於治療 B 型肝炎病毒感染之組成物及方法。特別而言，本發明係關於一種組合療法，該組合療法包含投予用於治療慢性 B 型肝炎患者之靶向 HBV 的治療性寡核苷酸及 TLR7 促效劑。

Description

用於治療　HBV　之靶向　HBV　的治療性寡核苷酸及　TLR7　促效劑之醫藥組合
本發明係關於用於治療 B 型肝炎病毒感染之組成物及方法。特別而言，本發明係關於一種組合療法，該組合療法包含投予用於治療慢性 B 型肝炎患者之靶向 HBV 的治療性寡核苷酸及 TLR7 促效劑。
HBV 感染仍然是遍及全球之重要的健康問題，涉及估計 3.5 億慢性帶原者。可以預測大約 25% 的帶原者死於慢性肝炎、肝硬化或肝癌。B 型肝炎病毒是僅次於菸草的第二大致癌物，佔所有原發性肝癌的 60% 至 80%。
HBV 的外套膜蛋白統稱為 B 型肝炎表面抗原 (HBsAg)。HBsAg 由三個相關的多肽組成，稱為 S、M 和 L，其由重疊的開讀框 (ORF) 編碼。最小的套膜蛋白是具有 226 個胺基酸的 S，稱為 S-ORF。M 和 L 由上游轉譯起始位產生並分別向 S 添加 55 和 108 個胺基酸。HBV S、M 和 L 的醣蛋白存在於完整的傳染性 HBV 病毒粒子的病毒套膜中，被稱為 Dane 顆粒，且三種醣蛋白的產生和分泌都過多，形成發現與慢性 HBV 患者血液中的非感染性亞病毒之球形和絲狀的顆粒（均稱為誘餌顆粒）。誘餌顆粒表面的大量 HBsAg 被認為抑制了慢性 HBV 感染 (CHB) 患者的體液免疫和自發清除。
當前用於慢性 HBV 感染的護理標準是使用口服核苷（酸）類似物（例如恩替卡韋 (entecavir) 或替諾福韋 (tenofovir) ）進行治療，它們藉由抑制 HBV DNA 合成但並不直接作用於病毒抗原（例如 HBsAg）來抑制 HBV 複製。核苷（酸）類似物，即使經過長期治療，也只能顯示出低水準的 HBsAg 清除率。在這方面，慢性 B 型肝炎患者表現出非常弱的 HBV T 細胞反應，並且缺乏抗 HBs 抗體，這被認為是這些患者無法清除病毒的原因之一。
臨床上重要的目標是實現對慢性 HBV 感染的功能性治愈，其定義為 HBsAg 血清轉化和血清 HBV-DNA 排除。預期這將導致持久的反應，從而防止肝硬化和肝癌的發展，並延長生存期。目前，由於作為被感染肝細胞核中的共價閉合環狀 DNA (cccDNA) 的病毒基因組長期或永久性的殘存，因此無法完全消除慢性 HBV 感染。要完全治愈慢性 HBV 感染，就需要從感染的肝細胞中排除這種 cccDNA。
綜述文章 Soriano 等人 2017 年《研究藥物的專家意見》第 26 卷，第 843 頁描述了現行藥物開發的狀態是致力於達成功能性 HBV 治愈或完全治癒。本文著重介紹了目前正在 HBV 治療中測試的 30 多種藥物中的一些，同時提到任何有效的治愈方法都可能需要結合病毒靶向療法和免疫療法。
類鐸受體 (toll-like receptor) TLR7 是對病毒感染的先天免疫反應的組成部分，其主要在漿細胞和 B 細胞上表現。此類免疫細胞的反應性改變可能會導致慢性病毒感染期間先天免疫反應降低。因此，促效劑誘導的 TLR7 活化代表了使用免疫療法治療慢性病毒感染的一種可能的方法。一些 TLR 促效劑正在臨床試驗中進行測試，包括 GS-9620。替代的 TLR7 促效劑例如 WO 2006/066080、WO 2016/055553 及 WO 2016/91698 所述。
反義寡核苷酸基本上是單股寡核苷酸，其能夠藉由與目標核酸雜交來調節目標基因的表現。目標調節可以經由核糖核酸酶 H 介導的降解或藉由轉錄的封阻而調降。反義寡核苷酸還可以調升目標，例如經由剪接切換或微小 RNA 壓抑。對於肝臟中的目標，已證明 GalNAc 結合作用對於遞輸反義寡核苷酸非常有效。WO 2014/179627 和 WO2015/173208 描述了 HBV 治療，其透過使用單股反義寡核苷酸結合 GalNAc 結合作用，來降解肝細胞中的 HBV mRNA。WO2015/173208 中簡要提及了各種組合療法，包括 TLR7 促效劑 GS-9620。
WO2016/077321 描述了 HBV 治療，其透過使用雙股 siRNA 結合有義股上的 GalNAc 結合作用，來降解肝細胞中的 HBV mRNA。各種包括 TLR7 促效劑在內的組合療法已被簡要提及了。
據我們所知，尚未在體外或體內測試過治療性寡核苷酸和 TLR7 組效劑的特定組合。
本發明確認了靶向 HBV 的治療性寡核苷酸和 TLR7 促效劑之新穎組合，其就延長血清 HBV-DNA 降低和延遲 HBsAg 反彈而言，其提供了優於單一化合物治療的優勢。此外，由於當使用組合治療時，使用比單一治療中使用的藥物濃度低 3 至 5 倍的劑量即可獲得顯著改善效果，且使用比相同組合之高劑量低 3 至 5 倍的劑量，組合治療可以達到基本上相同的效果，因此組合治療可以實現治療範圍的增加。
本發明之一方面是醫藥組合，其包含或由第一醫學化合物和第二醫學化合物所組成，該第一醫學化合物為治療性寡核苷酸，該第二醫學化合物為如下式 (I) 或式 (II) 所定義之 TLR7 促效劑。本發明一個優選的實施例是醫藥組合，其包含或由第一醫學化合物以及第二醫學化合物所組成，該第一醫學化合物為 RNAi 寡核苷酸，優選地為用於降低 HBsAg mRNA 表現的寡核苷酸，該寡核苷酸包含長度為 19 至 30 個核苷酸的反義股，其中，該反義股包含與 ACAANAAUCCUCACAAUA (SEQ ID NO: 33) 中列出的 HBsAg mRNA 序列互補之區域，該二醫學化合物為如下式 (I) 或式 (II) 所定義之 TLR7 促效劑。本發明另一個實施例是醫藥組合，其包含或由第一醫學化合物以及第二醫學化合物所組成，該第一醫學化合物是反義寡核苷酸，優選地長度為 13 至 22 個核苷酸之 GalNAc 結合的反義寡核苷酸，其具有至少 12 個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO: 1 的位置 1530 至 1602 的連續序列 100% 互補，該第二醫學化合物為如下式 (I) 或式 (II) 所定義之 TLR7 促效劑。
式 (I) 及式 (II)：
Figure 02_image001
其中，X 為 CH2 或 S； 針對式 (I)，R1 為 -OH 或 -H 且 R2 為 1-羥丙基或羥甲基， 針對式 (II)，R1 為 -OH 或 -H 或乙醯氧基且 R2 為 1-乙醯氧基丙基或 1-羥丙基或 1-羥甲基或乙醯氧基（環丙基）甲基或乙醯氧基（丙炔-1-基）甲基， 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
本發明的另一方面涉及用於治療 HBV 感染受試者的醫藥組合，特別是患有慢性 HBV 的受試者。
本發明的另一方面是治療性寡核苷酸用於製備治療 B 型肝炎病毒感染之第一藥物的用途，其中該第一藥物是如本申請中所述之治療性寡核苷酸，且其中將該第一藥物與第二藥物組合投予，其中該第二藥物是如本申請中所述之 TLR7 促效劑。
在一個實施例中，將治療性寡核苷酸化合物（第一藥物或第一醫學化合物）調製成用於皮下注射，並將 TLR7 促效劑化合物（第二藥物或第二醫學化合物）調製成用於口服投予。由於醫學化合物將透過兩種不同的投予途徑投予，因此它們可以遵循不同的投予方案。為了達到最佳的組合效果，第一和第二醫學化合物的投予間隔小於一個月，例如間隔小於一周，例如間隔兩天，例如在同一天。
本發明的另一方面是部件套組，其包括第一醫學化合物（第一藥物）和包裝插頁，其具有在 HBV 的治療中之第二醫學化合物（第二藥物）的投予說明。在一個實施例中，部分套組包含第一和第二醫學化合物兩者。
本發明的另一方面是用於治療 B 型肝炎病毒感染的方法，其包括將治療有效量之如本申請中所述的治療性寡核苷酸（第一藥物），以及治療有效量之如本申請中所述的 TLR7 促效劑（第二藥物），組合投予感染 B 型肝炎病毒的個體，例如慢性感染的受試者。
在高度優選的實施例中，本申請中提及的治療性寡核苷酸是 RNAi 寡核苷酸，優選地為小干擾 RNA (siRNA)，優選地為用於降低 HBsAg mRNA 表現的 RNAi 寡核苷酸或 siRNA。在不同的實施例中，治療性寡核苷酸是反義寡核苷酸，優選地為 GalNAc 結合的反義寡核苷酸，優選地為靶向 HBV 的反義寡核苷酸或 GalNAc 結合的反義寡核苷酸。 【圖式簡要說明】
圖 1 ：說明示例性的反義寡核苷酸結合物，其顯示各種立體異構體，其中寡核苷酸以波浪線（A 至 D）或「寡核苷酸」（E 至 H 和 K）或 T2 （I 至 J）表示，且去唾液酸糖蛋白受體靶向結合物部分為三價 N-乙醯半乳胺糖部分。化合物 A 至 D 包含二離胺酸支鏈分子、PEG3 間隔基和三個末端 GalNAc 碳水化合物部分。在化合物 A 和 B 中，寡核苷酸不具有連接子 (linker)，其係直接連附至靶向結合物部分的去唾液酸糖蛋白受體。在化合物 C 和 D 中，寡核苷酸經由 C6 連接子連附至靶向結合物部分的去唾液酸糖蛋白受體。化合物 E 至 J 包含市售的三支鏈分子 (trebler brancher molecule) 和不同長度和結構的間隔基以及三個末端 GalNAc 碳水化合物部分。化合物 K 由單體 GalNAc 亞磷醯胺組成，X ＝ S 或 O，且 n ＝ 1 至 3（參見 WO 2017/178656），其添加到寡核苷酸中但同時仍在固相支持物上作為合成的一部分。圖 1B 和 1D 在本文中也分別稱為 GalNAc2 或 GN2，分別不具有和具有 C6 連接子。圖 2 ： CMP ID NO: 29_1 的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如 Na+ 、K+ 和 Ca2+ 或這些與化合物結合的混合物。圖 3 ： CMP ID NO: 23_1 的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如 Na+ 、K+ 和 Ca2+ 或這些與化合物結合的混合物。圖 4 ：CMP ID NO: 16_1 的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如 Na+ 、K+ 和 Ca2+ 或這些與化合物結合的混合物。圖 5 ： CMP ID NO: 15_1 的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如 Na+ 、K+ 和 Ca2+ 或這些與化合物結合的混合物。圖 6 ： CMP ID NO: 15_2 的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如 Na+ 、K+ 和 Ca2+ 或這些與化合物結合的混合物。圖 7 ： CMP ID NO: 26_1 的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如 Na+ 、K+ 和 Ca2+ 或這些與化合物結合的混合物。圖 8 ： CMP ID NO: 20_1 的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如 Na+ 、K+ 和 Ca2+ 或這些與化合物結合的混合物。圖 9 ： 顯示各種單一和組合治療對 AAV/HBV 小鼠血清中 HBV-DNA 的影響。圖 A：用食鹽水（媒液，虛線和圓圈）；CMP ID NO: VI（TLR7 促效劑），每隔一天 (QOD) 以 100 mg/kg 的劑量投予（虛線；矩形）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）以 1.5 mg/kg 的劑量給藥（虛線；三角形）；或兩者的組合（實線和正方形）治療後。圖 B：用食鹽水（媒液，虛線和圓圈）；CMP ID NO: VI（TLR7 促效劑），每週 (QW) 以 100 mg/kg 的劑量投予（虛線，矩形）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）以 1.5 mg/kg 的劑量給藥（虛線；三角形）；或兩者的組合（實線和正方形）治療後。圖 C：用食鹽水（媒液，虛線和圓圈）；CMP ID NO: VI（TLR7 促效劑），每隔一天 (QOD) 以 100 mg/kg 的劑量投予（虛線；矩形）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）以 7.5 mg/kg 的劑量給藥（虛線；三角形）；或兩者的組合（實線和正方形）治療後。圖 D：用食鹽水（媒液，虛線和圓圈）；CMP ID NO: VI（TLR7 促效劑），每週 (QW) 以 100 mg/kg 的劑量投予（虛線，矩形）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）以 7.5 mg/kg 的劑量給藥（虛線；三角形）；或兩者的組合（實線和正方形）治療後。圖 10 ： 顯示各種單一和組合治療對 AAV/HBV 小鼠血清中 HBsAg 的影響。圖 A：用食鹽水（媒液，虛線和圓圈）；CMP ID NO: VI（TLR7 促效劑），每隔一天 (QOD) 以 100 mg/kg 的劑量投予（虛線；矩形）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）以 1.5 mg/kg 的劑量給藥（虛線；三角形）；或兩者的組合（實線和正方形）治療後。圖 B：用食鹽水（媒液，虛線和圓圈）；CMP ID NO: VI（TLR7 促效劑），每週 (QW) 以 100 mg/kg 的劑量投予（虛線，矩形）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）以 1.5 mg/kg 的劑量給藥（虛線；三角形）；或兩者的組合（實線和正方形）治療後的小鼠。圖 C：用食鹽水（媒液，虛線和圓圈）；CMP ID NO: VI（TLR7 促效劑），每隔一天 (QOD) 以 100 mg/kg 的劑量投予（虛線；矩形）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）以 7.5 mg/kg 的劑量給藥（虛線；三角形）；或兩者的組合（實線和正方形）治療後。圖 D：用食鹽水（媒液，虛線和圓圈）；CMP ID NO: VI（TLR7 促效劑），每週 (QW) 以 100 mg/kg 的劑量投予（虛線，矩形）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）以 7.5 mg/kg 的劑量給藥（虛線；三角形）；或兩者的組合（實線和正方形）治療後。圖 11 ：在 HBV 基因組組織的示意圖上顯示 RNAi 目標位的實例。圖 12 ：顯示用於降低 HDI 小鼠中 HBsAg 表現之寡核苷酸的單一劑量評估。圖 13 ：顯示使用靶向 HBsAg 的寡核苷酸的指定給藥方案期間，血漿 HBsAg 水準隨時間變化的圖示。如該實例中所示，寡核苷酸顯示出臨床前的效力，並且在給藥期間後仍保持減少的水準。圖 14 ：顯示的圖表描述了使用報告測定法 (reporter assay) 在 HeLa 細胞中進行 HBsAg 作圖的結果。靶向 HBV 基因組之位置 254 的未修飾 siRNA，在指定濃度下，用以作為正調控。由市售的 Thermo Fisher 的 Silencer siRNA 作為這些實驗的負調控。誤差線代表 SEM。圖 15 ：顯示基因型保守性比較，其顯示在靶向 HBsAg 的寡核苷酸 (HBV-219) 中經設計的錯配，增加 HBV 基因型中的覆蓋率。圖 16 ：說明為 psiCHECK2 報告測定法設計的載體，使用 HBV 基因型 A 作為原型序列。圖 17 ：顯示一些寡核苷酸的實例，該寡核苷酸被設計來以評估導入錯配的影響。針對親代和錯配股的寡核苷酸序列在框中對齊且具有錯配位置顯示。進一步描述在 psiCHECK2 報告測定法中使用之對應的報告序列。圖 18 ：顯示在錯配研究中評估寡核苷酸的單一劑量滴定圖，其說明在體內可耐受引導股中的錯配。圖 19 ：顯示體內的劑量滴定圖，其說明對靶向 HBsAg 的寡核苷酸中錯配的併入，不會對體內效力產生不利的影響。圖 20 ：顯示具有化學修飾且呈雙股螺旋形式之靶向 HBsAg 的寡核苷酸 (HBV(s)-219) 的實例。較深的陰影表示 2’–O–甲基核糖核苷酸。較淺的陰影表示 2’–氟–去氧核糖核苷酸。圖 21A ：描述免疫組織化學染色的結果，其檢測肝細胞中 HBV 核心抗原 (HBcAg) 的次細胞分佈。圖 21B ：描述 RNA 定序結果，其將檢測到之針對 HBV pgRNA 的 RNA 轉錄序列作圖。圖 22A ：描述在 HBV 的流體動力學注射 (HDI) 模型中，與媒劑調控和靶向 HBV X 抗原 (HBxAg) mRNA 的 RNAi 寡核苷酸相比，使用靶向 HBsAg mRNA 的 HBV(s)-219 寡核苷酸前驅物 HBV(s)-219P2 治療後之 HBsAg mRNA 表現的時間進程。圖 22B ：描述在 AAV-HBV 模型中，與媒劑調控和靶向 HBxAg mRNA 的 RNAi 寡核苷酸相比，使用靶向 HBsAg mRNA 的 HBV(s)-219 寡核苷酸前驅物 HBV(s)-219P2 治療後之 HBsAg mRNA 表現的時間進程。圖 23 ：顯示免疫組織化學染色的結果，該結果顯示肝細胞中 HBcAg 的次細胞分佈，與媒劑調控和靶向 HBxAg mRNA (GalXC-HBVX) 的 RNAi 寡核苷酸相比，該肝細胞是取自使用靶向 HBsAg mRNA 的 HBV(s)-219 寡核苷酸治療後的 HBV 的 AAV-HBV 模型和 HDI 模型。圖 24A–24D ：顯示在 PXB-HBV 模型中，HBV(s)-219 前驅物 1 (HBV(s)-219 P1) 的抗病毒活性。向 9 隻小鼠的分群皮下投予 3 週 劑量為 0 或 3 mg/kg 的 HBV(s)-219P1 PBS 溶液。在所示的每個時間點（圖 24A 和 24B），藉由非末端下頜頰出血 (non-terminal mandibular cheek bleeds) 分析來自每個分群之六隻小鼠的血清 HBsAg 和血清 HBV DNA。在第 28 天（從 HBV(s)-219P1 的第一劑開始），對所有剩餘的小鼠實施安樂死，並收集肝臟生檢以藉由 RT-qPCR 看肝的 HBV DNA（圖 24C）和肝的 cccDNA（圖 24D）。圖 25A–25C ：顯示 HBV(s)-219 前驅物 2 (HBV(s)-219P2) 增強了恩替卡韋的抗病毒活性。在 HBV 小鼠流體動力學注射 (HDI) 模型中，在第 1 天皮下投予小鼠單一劑量之 HBV(s)-219P2，之後每天透過口服投藥 500 ng/kg 的恩替卡韋 (ETV)，持續 14 天。藉由 qPCR 測量循環病毒量 (HBV DNA)（圖 25A）。藉由 ELISA 測量血漿 HBsAg 水準（圖 25B）。藉由 qPCR 測量肝臟 HBV mRNA 和 pgRNA 水準（圖 25C）。結果顯示組合療法具有明顯的累加效果。單獨的 ETV 療法顯示對循環 HBsAg 或肝臟病毒 RNAs 無效。藉由 HBsAg 或 HBV RNA 測量之 HBV(s)-219P2 的抗病毒活性，不受 ETV 共同給藥的影響。「BLOD」是指「低於檢測極限」。圖 26A–26B ：顯示靶向 S 抗原 (HBV(s)-219P2) 或 X 抗原（命名為 GalXC-HBVX）之 GalNac 結合的寡核苷酸之 HBsAg 抑制活性的比較。結果顯示，與 GalXC-HBVX 或兩種 RNAi 試劑的等莫耳組合相比，HBVS-219P2 抑制 HBsAg 的持續時間更長。圖 26A 顯示 RNAi 目標位在 HBV 基因組中的位置，會影響表現 HBV 之小鼠的 HBsAg 恢復動力學。圖 26B 顯示投藥後 2 週（左圖）和投藥後 9 週（右圖）的血漿 HBsAg 水準，說明靶向 HBVX 編碼區域（單獨或與 HBV(s)-219P2 組合）可縮短活性持續時間。顯示受試者動物數據。幾個數據點（最淺的灰色圓圈）低於檢測極限。圖 27A–27C ：顯示在用 HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX 或 1:1 組合來治療表現 HBV 的小鼠中，HBV 核心抗原 (HBcAg) 的次細胞位置。圖 27A 顯示肝臟切片中代表性的肝細胞，其在投予後第 1、2、6、9 和 13 週取得，並對 HBcAg 染色。圖 27B 顯示每隻動物中核染色之 HBcAg 陽性細胞的百分比（n＝3/組，在給藥後 2 週，每隻動物計數 50 個細胞）。設計並測試具有靶向 X 和 S 開讀框內的替代序列。圖 27C 顯示肝細胞中 HBcAg 的次細胞分佈，該肝細胞是在投予靶向 S 抗原或 X 抗原的替代 RNAi 寡核苷酸後之第 2、3 和 9 週取得的。圖 28 ：顯示分群劑量資訊，其是為了評估在健康患者中 HBV(s)-219 的安全性和耐受性，以及在 HBV 患者中 HBV(s)-219 的治療功效所設計的研究。圖 29A–29B ：顯示 HBV(s)-219 和 HBV(s)-219P2 的化學結構。（圖 29A）HBV(s)-219 的化學結構。（圖 29B）HBV(s)-219P2 的化學結構。圖 30 ：顯示 HBV-LNA（CMP ID NO: 15_1，如本發明所述之反義寡核苷酸）和 DCR-S219（如本發明所述之 RNAi 寡核苷酸，特別是 siRNA）隨時間降低 HBsAg 力價的效果。「DCR-AUD1」（靶向 HBV 以外之序列的對照 siRNA）和「媒液」（無菌水）是負調控。圖 30 中的 HBV-LNA 劑量為 6.6 mg/kg，而 DCR-S219 的劑量為 9 mg/kg，但 HBV-LNA 的莫耳劑量約為 DCR-S219 的劑量的三倍。
定義
寡核苷酸
本文所用的術語「寡核苷酸」一詞的定義如同具有通常技術者所知，是指包含兩個或多個共價連接核苷的分子。該等共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在實驗室中製作，先經固相化學合成後再加以純化和分離。提及寡核苷酸的序列時，是指共價連接核苷酸或核苷的核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸為人造的，且為化學合成的，通常經過純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一個或多個修飾核苷或核苷酸，例如 2’ 糖修飾核苷。
此外，寡核苷酸是短核酸，例如，長度為小於 100 個核苷酸。寡核苷酸可以是單股或雙股。寡核苷酸可以具有或可以不具有雙股螺旋區域。舉一組非限制性的實例，寡核苷酸可以是但不限於小干擾 RNA (siRNA)、微小 RNA (miRNA)、小髮夾 RNA (shRNA)、切丁酶底物干擾 RNA (dsiRNA)、反義寡核苷酸、短 siRNA 或單股 siRNA。在一些實施例中，雙股寡核苷酸是 RNAi 寡核苷酸。
合成
如本文所使用，術語「合成物 (synthetic)」是指人工合成的核酸或其他分子（例如，使用機器（例如，固相核酸合成儀）），或不是由其他通常產生該分子之天然來源（例如，細胞或生物體）所獲得的核酸或其他分子。
雙股寡核苷酸
如本文所使用，術語「雙股寡核苷酸 (double-stranded oligonucleotide)」是實質呈雙股螺旋形式的寡核苷酸。在一些實施例中，在共價分離的核酸股之核苷酸的反向平行序列之間，形成雙股寡核苷酸之雙股螺旋區域的互補鹼基配對。在一些實施例中，在共價連接的核酸股之核苷酸的反向平行序列之間，形成雙股寡核苷酸之雙股螺旋區域的互補鹼基配對。在一些實施例中，雙股寡核苷酸之雙股螺旋區域的互補鹼基配對是由單一核酸股形成，該單一核酸股是折疊的（例如，經由髮夾），以提供鹼基配對在一起之核苷酸的互補反向平行序列。在一些實施例中，雙股寡核苷酸包含彼此完全雙股螺旋的兩條共價分離的核酸股。然而，在一些實施例中，雙股寡核苷酸包含部分雙股螺旋的兩條共價分離的核酸股，例如，在一個或兩個末端具有突出。在一些實施例中，雙股寡核苷酸包含部分互補之核苷酸的反向平行序列，因此可以具有一個或多個錯配，其可以包括內部錯配或末端錯配。
股
如本文所使用，術語「股」是指透過核苷酸間鍵聯（例如，磷酸二酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯）連接在一起之核苷酸的單一連續序列。在一些實施例中，一股具有兩個自由端，例如 5' 端和 3' 端。
雙股螺旋
如本文所使用，關於核酸（例如，寡核苷酸）的術語「雙股螺旋」是指透過核苷酸的兩個反向平行序列的互補鹼基配對形成的結構。
突出
如本文所使用，術語「突出 (overhang)」是指末端非鹼基配對核苷酸，其由延伸超過互補股之末端的一股或一個區域所形成，該一股或一個區域與該互補股形成雙股螺旋。在一些實施例中，突出包含從雙股寡核苷酸的 5' 末端或 3' 末端的雙股螺旋區域延伸的一個或多個未配對的核苷酸。在某些實施例中，突出是在雙股寡核苷酸的反義股或有義股上的 3' 或 5' 突出。
環圈
如本文所使用，術語「環圈 (loop)」是指核酸（例如，寡核苷酸）的未配對區域，其側翼為核酸的兩個彼此充分互補的反向平行區域，從而在適當的雜交條件下（例如，在磷酸鹽緩衝液中、在細胞中），兩個反向平行區域（為未配對區域的側翼）雜交形成雙股螺旋（稱為「主幹」）。
RNAi 寡核苷酸
如本文所使用，術語「RNAi 寡核苷酸 (RNAi oligonucleotide) 」是指 (a) 具有有義股（隨從）和反義股（引導）的雙股寡核苷酸，其中藉由 Argonaute 2 (Ago2) 核酸內切酶使用該反義股或部份的該反義股分切割目標 mRNA，或 (b) 具有單獨反義股的單股寡核苷酸，其中藉由 Ago2 核酸內切酶使用該反義股（或部分的該反義股）切割目標 mRNA。
RNAi 試劑
本文中可互換使用的術語「iRNA」、「RNAi 試劑 (RNAi agent)」、「iRNA 試劑 (iRNA agent)」和「RNA 干擾劑 (RNA interference agent)」，是指一種試劑（例如，RNAi 寡核苷酸），在本文中，該試劑包含 RNA 核苷並經由 RNA 誘導型緘黙化複合體 (RISC) 途徑，中介 RNA 轉錄本之靶向切割。iRNA 透過稱為 RNA 干擾 (RNAi) 的過程引導 mRNA 的序列特異性降解。iRNA 調節（例如抑制）細胞中目標核酸的表現，例如哺乳動物個體的細胞中。RNAi 試劑包括單股 RNAi 試劑和雙股 siRNA，以及小髮夾 RNAs (shRNAs)。本發明的寡核苷酸或其連續核苷酸序列可以是 RNAi 試劑的形式，或者是 RNAi 試劑的一部分，例如 siRNA 或 shRNA。在本發明的一些實施例中，本發明的寡核苷酸或其連續核苷酸序列是 RNAi 試劑，例如 siRNA。
siRNAs
術語 siRNA 是指小干擾核糖核酸 RNAi 試劑，是一類雙股 RNA 分子，在本領域中也稱為短干擾 RNA 或緘黙化 RNA。siRNAs 通常包含有義股（也稱為隨從股）和反義股（也稱為引導股），其中每股的長度為 17 至 30 個核苷酸，通常長度為 19 至 25 個核苷，其中反義股與目標核酸（合適地是成熟的 mRNA 序列）互補（例如完全互補），且有義股與反義股互補，使得有義股和反義股形成雙股螺旋或雙股螺旋區域。siRNA 股可形成鈍端雙股螺旋，或有利地，正義和反義股的 3' 端可形成例如 1、2 或 3 個核苷的 3' 突出。在一些實施例中，有義股和反義股均具有 2nt 3'突出。因此，雙股螺旋區域的長度可以為例如 17 至 25 個核苷酸，例如 21 至 23 個核苷酸。
一旦進入細胞內，反義股就被併入 RISC 複合體中，該複合物中介目標核酸的目標降解或目標抑制。siRNAs 除了 RNA 核苷外，通常還包含經修飾的核苷，或者在某些實施例中，可以修飾 siRNA 股的所有核苷酸（可以將正義 2' 糖修飾的核苷，例如 LNA（參見 WO2004083430、WO2007085485 為例））、2'-氟、2'-O-甲基或 2'-O-甲氧基乙基併入 siRNAs）。在一些實施例中，siRNA 的隨從股可以是不連續的（參見 WO2007107162 為例）。已經報導了在 siRNA 之反義股的種子區域 (seed region) 中出現的熱不穩定核苷酸的併入，對於降低 siRNA 的脫靶活性是有用的（參見 WO18098328 為例）。
在一些實施例中，dsRNA 試劑，例如本發明的 siRNA，包含至少一個經修飾的核苷酸。在一些實施例中，有義股之實質上所有核苷酸均包含修飾；反義股之實質上所有核苷酸均包含修飾；或有義股之實質上所有核苷酸和反義股之實質本上所有核苷酸均包含修飾。在其他實施例中，有義股之所有核苷酸均包含修飾；反義股之所有核苷酸均包含修飾；或有義股之有核苷酸和反義股之所有核苷酸均包含修飾。
在一些實施例中，修飾的核苷酸可獨立地選自由以下各項組成之群組或其組合：去氧核苷酸、3’–末端去氧胸腺嘧啶 (dT) 核苷酸、經 2'–O–甲基修飾的核苷酸、經 2'–氟修飾的核苷酸、經 2'–去氧修飾的核苷酸、鎖核苷酸、未鎖核苷酸、構型上限制的核苷酸、受拘乙基核苷酸、無鹼基的核苷酸、經 2'–胺基修飾的核苷酸、經 2'–O–烯丙基修飾的核苷酸、經 2'–C–烷基修飾的核苷酸、經 2'–羥基修飾的核苷酸、經 2'–甲氧基乙基修飾的核苷酸、經 2'–O–烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、胺基磷酸酯、包含核苷酸的非天然鹼基、未連接的核苷酸、經四氫哌喃修飾的核苷酸、經 1,5–去水己糖醇修飾的核苷酸、經環己烯基修飾的核苷酸、包含硫代磷酸酯基團的核苷酸、包含甲基膦酸酯基團的核苷酸、包含 5'–磷酸鹽的核苷酸、包含 5'-磷酸模擬物的核苷酸、經乙二醇修飾的核苷酸和經 2–O–（N–甲基乙醯胺）修飾的核苷酸。適當地，siRNA 在反義股的 5' 端包含 5' 磷酸基團或 5'-磷酸模擬物。在一些實施例中，反義股的 5' 端是 RNA 核苷。
在一個實施例中，dsRNA 試劑還包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯。硫代磷酸酯或甲基磷酸酯的核苷酸間鍵聯可以在一或兩股的 3’–末端（例如，反義股；或有義股）上；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷間鍵聯可以在一或兩股的 5’–末端（例如，反義股；或有義股）上；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷間鍵聯可以在一或兩股的 3’–末端及 5’–末端兩者（例如，反義股；或有義股）上。在一些實施例中，剩餘的核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。
dsRNA 試劑可以進一步包含配體。在一些實施例中，該配體結合至有義股的 3’ 端。在生物學分佈，例如，可將 siRNA 結合至靶向配體及/或調製成脂質奈米顆粒。
本發明的其他方面涉及包含這些 dsRNA 的醫藥組成物，例如適合治療用途的 siRNA 分子，以及藉由投予 dsRNA 分子（例如本發明的 siRNA）來抑制目標基因表現的方法，例如用於治療本文所揭露之各種疾病狀況。
四鹼基環圈
如本文所使用，術語「四鹼基環圈 (tetraloop)」是指藉由核苷酸之兩旁序列的雜交，形成增加相鄰雙股螺旋之穩定性的環。穩定性的增加是可檢測到的，由於相鄰的主幹雙股螺旋 (adjacent stem duplex) 之熔解溫度 (Tm ) 的升高，比一組可比長度的環所預期之相鄰的主幹雙股螺旋之平均 Tm 高，該可比長度之環是由隨機選擇的核苷酸序列所組成的。例如，在 10 mM NaHPO4 中，四鹼基環圈可以賦予包含至少 2 個鹼基對長度之雙股螺旋的髮夾至少 50℃、至少 55℃、至少 56℃、至少 58℃、至少 60℃、至少 65℃ 或至少 75°C 的熔解溫度。在一些實施例中，四鹼基環圈可藉由堆疊的相互作用來穩定相鄰之主幹雙股螺旋中的鹼基對。另外，四鹼基環圈中核苷酸之間的相互作用包括但不限於非瓦特生克立克鹼基配對 (non-Watson-Crick base-pairing,)、堆疊的相互作用、氫鍵和接觸相互作用（Cheong 等人，Nature 1990 年 8 月 16 日，346(6285):680-2；Heus 和 Pardi，Science 1991 年 7 月 12 日，253(5016):191-4）。在一些實施例中，四鹼基環圈包含 4 至 5 個核苷酸。在某些實施例中，四鹼基環圈包含或由三、四、五或六個核苷酸所組成，該核苷酸可以被或可以不被修飾（例如，可以與或可以不與靶向部分結合）。在一個實施例中，四鹼基環圈由四個核苷酸組成。在四鹼基環圈中可以使用任何核苷酸，此類核苷酸可以使用的標準 IUPAC-IUB 符號如 Cornish-Bowden (1985)，Nucl. Acids Res.，13，3021-3030 中所述。例如，字母「N」可以用來表示任何鹼基都可以在該位置，字母「R」可以用來表示 A（腺嘌呤）或 G（鳥嘌呤）可以在該位置，而「B」可用於表示 C（胞嘧啶）、G（鳥嘌呤）或 T（胸腺嘧啶）可以在該位置。四鹼基環圈的實例包括四鹼基環圈的 UNCG 家族（例如，UUCG）、四鹼基環圈的 GNRA 家族（例如，GAAA）和 CUUG 四鹼基環圈（Woese 等人，Proc Natl Acad Sci USA ，1990 年 11 月，87(21)，8467-71；Antao 等人，Nucleic Acids Res ，1991 年 11 月 11 日，19(21)：5901-5）。DNA 四鹼基環圈的實例包括四鹼基環圈的 d(GNNA) 家族（例如 d(GTTA)）、四鹼基環圈的 d(GNRA) 家族、四鹼基環圈的 d(GNAB) 家族、四鹼基環圈的 d(CNNG) 家族和四鹼基環圈的 d(TNCG) 家族（例如 d(TTCG)）。參見，例如：Nakano 等人，Biochemistry，41(48)，14281-14292，2002 年。SHINJI 等人，Nippon Kagakkai Koen Yokoshu，第 78 卷，第 2 期，第  731 頁 (2000)，其相關公開內容藉由引用併入本文。在一些實施例中，四鹼基環圈包含在帶切口的四鹼基環圈結構內。
「帶切口的四鹼基環圈結構」
「帶切口的四鹼基環圈結構 (nicked tetraloop structure)」是 RNAi 寡核苷酸的結構，其特徵在於存在分離的正義（隨從）和反義（引導）股，其中有義股具有與反義股互補之區域，且其中至少一股（通常是有義股）具有四鹼基環圈，該四鹼基環圈經組態以穩定在該至少一股中所形成之相鄰的主幹區域。
反義寡核苷酸
本文所用的術語「反義寡核苷酸」的定義是能夠藉由與目標核酸雜交而調節目標基因之表現的寡核苷酸，其所雜交的對象具體而言是目標核酸上的連續序列。反義寡核苷酸實質上並非雙股，因此不是 siRNA 或 shRNA。本發明之反義寡核苷酸較佳的是單股。應理解的是，只要在寡核苷酸全長內或全長間，自我互補性低於 50%，本發明之單股寡核苷酸便可形成髮夾或分子間雙股螺旋結構 (同一寡核苷酸之兩個分子之間的雙股螺旋)。
有利的是，本發明之單股反義寡核苷酸不包含 RNA 核苷，因為這樣會降低核酸酶抗性。
有利的是，本發明之反義寡核苷酸含有一個或多個修飾核苷或核苷酸，例如 2’ 糖修飾核苷。此外，有利的是，所述未經修飾的核苷是 DNA 核苷。
連續核苷酸序列
術語「連續核苷酸序列」意指寡核苷酸的與目標核酸互補的區域。在本文中，該術語可與「連續核鹼基序列」和「寡核苷酸模體序列」交替使用。在某些實施例中，所述寡核苷酸的全部核苷酸構成所述連續核苷酸序列。在某些實施例中，寡核苷酸包含連續核苷酸序列，例如 F-G-F’ 缺口體區域，且可隨選包含其他核苷酸，例如可用於將官能基團附加至該連續核苷酸序列的核苷酸連接子區域。所述核苷酸連接子區域可與目標核酸互補或不互補。應當理解的是，寡核苷酸的連續核苷酸序列不能比寡核苷酸本身長，且寡核苷酸不能短於連續核苷酸序列。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸及聚核苷酸的建構組元，在本發明中包括自然產生及非自然產生核苷酸。在本質上，例如 DNA 及 RNA 核苷酸等核苷酸包含核糖部分、核鹼基部分以及一個或多個磷酸根 (核苷中則無磷酸根)。核苷及核苷酸亦可互換稱為「單元」或「單體」。
去氧核糖核苷酸
如本文所使用，術語「去氧核糖核苷酸 (deoxyribonucleotide)」是指與核糖核苷酸相比，在其五碳糖的 2' 位置具有氫代替羥基的核苷酸。經修飾的去氧核糖核苷酸是在 2' 位置以外，具有一個或多個原子之修飾或取代的去氧核糖核苷酸，包括在糖、磷酸基或鹼基中的修飾或取代，或者包含糖、磷酸基或鹼基的修飾或取代。
核糖核苷酸
如本文所使用，術語「核糖核苷酸 (ribonucleotide)」是指具有核糖作為其五碳糖的核苷酸，其在其 2' 位置含有羥基。經修飾的核糖核苷酸是在 2' 位置以外，具有一個或多個原子之修飾或取代的核糖核苷酸，包括在核糖、磷酸基或鹼基中的修飾或取代，或者包含核糖、磷酸基或鹼基的修飾或取代。
修飾核苷
本文中所用的術語「修飾核苷」或「核苷修飾」意指藉由導入糖部分或 (核) 鹼基部分的一個或多個修飾，對照相等 DNA 或 RNA 核苷進行修飾的核苷。於一較佳實施例中，所述修飾核苷包含修飾糖部分。術語經修飾之核苷在本文中亦可與「核苷類似物」或修飾「單元」或修飾「單體」等詞互換使用。本文中將具有未修飾 DNA 或 RNA 糖部分的核苷稱為 DNA 或 RNA 核苷。在 DNA 或 RNA 核苷的鹼基區域中包含修飾的核苷，若允許瓦特生克立克 (Watson Crick) 鹼基配對，則大體上仍稱為 DNA 或 RNA。
經修飾的核苷酸
如本文所使用，術語「經修飾的核苷酸 (modified nucleotide)」是指與選自以下相應之參考核苷酸相比，具有一種或多種化學修飾的核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤去氧核糖核苷酸、鳥嘌呤去氧核糖核苷酸、胞嘧啶去氧核糖核苷酸及胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸。在一些實施例中，經修飾的核苷酸是非自然產生的核苷酸。在一些實施例中，經修飾的核苷酸在其糖、核鹼基及/或磷酸基團中具有一個或多個化學修飾。在一些實施例中，經修飾的核苷酸具有一個或多個化學部分結合至相應的參考核苷酸。通常，經修飾的核苷酸給予其中存在經修飾之核苷酸的核酸一個或多個所需的特性。例如，經修飾的核苷酸可以改善熱穩定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解性、生體可用率、生物活性、降低的免疫原性等。
經修飾之核苷間鍵聯
術語「經修飾之核苷間鍵聯」，如具有通常技術者所知之定義，是指除磷酸二酯 (PO) 鍵聯以外，可將兩個核苷共價耦接在一起的鍵聯。因此本發明之寡核苷酸可包含修飾核苷間鍵聯。在某些實施例中，所述修飾核苷間鍵聯可使寡核苷酸的核酸酶抗性相較於磷酸二酯鍵聯增加。就自然產生寡核苷酸而言，核苷間鍵聯包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵結的磷酸根。經修飾的核苷間鍵聯特別能夠穩定寡核苷酸，利於體內使用，且可防於止在本發明之寡核苷酸中，在 DNA 或 RNA 核苷區域發生核酸酶切割的情形，例如在缺口體寡核苷酸的缺口區域 G 內，以及在經修飾的核苷區域內，例如區域 F 及 F’。
在一個實施例中，寡核苷酸包含經天然磷酸二酯修飾的一個或多個核苷間鍵聯，例如對核酸酶攻擊更具抗性的一個或多個經修飾的核苷間鍵聯。核酸酶抗性可以藉由在血清中培養寡核苷酸，或藉由使用核酸酶抗性測定法（例如蛇毒磷酸二酯酶 (SVPD)）來確定，這都是本領域眾所周知的。能夠增強寡核苷酸之核酸酶抗性的核苷間鍵聯稱為核酸酶抗性核苷間鍵聯。在某些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少 50% 的該核苷間經修飾，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的例如至少 60%，例如至少 70%，例如至少 75%，例如至少 80% 或例如至少 90% 的該鍵聯核苷間鍵聯經修飾。在某些實施例中，修飾範圍包括所述寡核苷酸的全部所述核苷間鍵聯或其連續核苷酸序列。應知在某些實施例中，將本發明之寡核苷酸連結至例如結合物等非核苷酸功能基團的核苷可為磷酸二酯。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列的全部所述核苷間鍵聯皆為抗核酸酶核苷間鍵聯。
有利的是在本發明之寡核苷酸中使用硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
硫代磷酸酯核苷間鍵聯由於具有核酸酶抗性、優良藥物動力學且易於製造，因此特別適用。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少 50% 的所述核苷間鍵聯為硫代磷酸酯，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的例如至少 60%，例如至少 70%，例如至少 75%，例如至少 80% 或例如至少 90% 的所述核苷間鍵聯為硫代磷酸酯。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的全部所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸除了包含二硫代磷酸酯鍵聯外，還包含硫代磷酸酯核苷間鍵聯和至少一個磷酸二酯鍵聯，例如2、3或4個磷酸二酯鍵聯。在缺口體寡核苷酸中，當存在磷酸二酯鍵聯時，該磷酸二酯鍵聯適當地不位於缺口區域 G 中的連續 DNA 核苷之間。
核酸酶抗性鍵聯 （例如硫代磷酸酯鍵聯）在寡核苷酸區域中特別有用，其在與目標核酸形成雙股螺旋時能夠招募核酸酶，例如缺口體的區域 G 中。然而，硫代磷酸酯鍵聯也可用於非核酸酶招募區及/或親和力增強區，如缺口體的區域 F 和 F′。在一些實施例中，缺口體寡核苷酸可在區域 F 或 F′，或區域 F 和 F′ 兩者中，包含一個或多個磷酸二酯鍵聯，其中在區域 G 中的所有核苷間鍵聯可為硫代磷酸酯。
有利的是，所述寡核苷酸的連續核苷酸序列的所有所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯，或所述寡核苷酸的所有所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯鍵聯。特別是，該反義寡核苷酸的連續核苷酸序列的所有核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯，或該反義寡核苷酸的所有核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯鍵聯。
應當理解的是，如 EP 2 742 135 中所揭露，治療性寡核苷酸可包含其他核苷間鍵聯 (磷酸二酯及硫代磷酸酯除外)，例如磷酸烷酯/磷酸甲酯核苷間連結，其依據 EP 2 742 135 可例如耐受於缺口區域中不同狀態之 DNA 硫代磷酸酯。
核鹼基
術語核鹼基包括存在於核苷及核苷酸中的嘌呤 (例如腺嘌呤及鳥嘌呤) 和嘧啶 (例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶) 部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明範圍內，術語核鹼基亦包含與自然產生核鹼基不同但在核酸雜交過程中具有功能性的修飾核鹼基。於本說明書中，「核鹼基」意指例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤等自然產生核鹼基以及非自然產生變異體。此類變體例如是 Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 以及 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1 中所描述的變異體。
在某些實施例中，核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變為經修飾的嘌呤或嘧啶而經修飾，例如被取代的嘌呤或被取代的嘧啶，例如選自異胞嘧啶、偽異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及 2-氯-6-胺基嘌呤的核鹼基。
所述核鹼基部分可用每一對應核鹼基的字母代碼表示，例如 A、T、G、C 或 U，其中各字母可隨選包括對等功能的修飾核鹼基。例如，在例示的寡核苷酸中，所述核鹼基部分選自 A、T、G、C 及 5-甲基胞嘧啶。隨選的是，5-甲基胞嘧啶 LNA 核苷可用於 LNA 缺口體。
經修飾之寡核苷酸
術語經修飾之寡核苷酸描述包含一個或多個糖修飾核苷及/或修飾核苷間鍵聯的寡核苷酸。有些文獻中使用的術語「嵌合 (chimeric)」寡核苷酸來描述具有經修飾核苷的寡核苷酸。
互補性
如本文所用，「互補 (complementary)」是指兩個核苷酸之間的結構關係（例如，在兩個相對的核酸上或在單一核酸股的相對區域上），或在兩個核苷酸序列之間，其允許兩個核苷酸或兩個核苷酸序列彼此形成鹼基對。舉例而言，與相對核酸之嘧啶核苷酸互補的核酸之嘌呤核苷酸，可以藉由彼此形成氫鍵將鹼基配對在一起。在一些實施例中，互補的核苷酸可以以瓦特生克立克方式或以允許形成穩定雙股螺旋的任何其他方式將鹼基配對。瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基對是鳥嘌呤 (G) - 胞嘧啶 (C) 及腺嘌呤 (A) - 胸腺嘧啶 (T)/尿嘧啶 (U)。應知寡核苷酸可包含具有修飾核鹼基的核苷，例如 5-甲基胞嘧啶經常用來取代胞嘧啶，因此术语互補性包括非修飾核鹼基與修飾核鹼基之間的瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對 (見例如 Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 以及 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl 37 1.4.1)。
本文所使用的術語「% 互補 (% complementary)」是指核酸分子（例如寡核苷酸）中的連續核苷酸序列中與參考序列（例如標靶序列或序列模體）互補之核苷酸所佔的比例（百分比），該核酸分子橫跨該連續核苷酸序列。因此，互補性百分率的計算方式是先算出兩個序列間互補(例如形成瓦特生克立克鹼基對)之對齊核鹼基 (當對齊於標靶序列 5’-3’ 及寡核苷酸序列從 3’-5’) 的數目，將該數字除以該寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以 100。在該等比對中，未對齊 (例如形成鹼基對) 的核鹼基/核苷酸稱為錯配。計算連續核苷酸序列的 % 互補性時不可進行插入和刪除。應當理解的是，在判定互補性時，只要在形成例如瓦特生克立克鹼基配對時能保持核鹼基的功能，即可不考量核鹼基的化學修飾(例如在計算 % 相同度時，5’-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。
術語「完全互補」意指具有 100% 互補性。
以下是與 HBV 轉錄物之區域完全互補的連續核苷酸序列的實例。
以下是與 HBV 目標區域 (SEQ ID NO: 28) 完全互補的連續核苷酸序列 (SEQ ID NO: 6) 的實例。
Figure 02_image003
在一些實施例中，兩個核酸可具有多個彼此互補的多核苷酸區域，以形成如本文所述的互補性區域。
互補之區域
如本文所使用，術語「互補之區域 (region of complementarity)」是指核酸的核苷酸序列（例如，雙股寡核苷酸），其與核苷酸的反向平行序列充分互補，以允許兩個核苷酸序列之間在適當的雜交條件下（例如在磷酸鹽緩衝液、在細胞等中）雜交。
相同度
本文所使用的術語「相同度 (Identity)」是指核酸分子（例如寡核苷酸）中的連續核苷酸序列中與參考序列（例如序列模體）相同的核苷酸所佔的比例（以百分比表示），該核酸分子橫跨該連續核苷酸序列。相同度百分比的計算方式是，算出兩個序列 (在本發明之化合物的連續核苷酸序列中及在參考序列中) 之間相同 (為一個匹配) 的對齊核鹼基的數目，將該數字除以寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以 100。因此，相同度百分比 = (匹配數 x 100)/對齊區域 (例如連續核苷酸序列) 長度。計算連續核苷酸序列的相同度百分比時，不可進行插入和刪除。應知在判定相同度時，只要核鹼基形成瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基的化學修飾 (例如在計算 % 相同度時，5’-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。
雜交
本文所用的術語「雜交」是指兩股核酸 (例如一股寡核苷酸及一股目標核酸) 在相對股上的鹼基對之間形成氫鍵，從而形成雙股螺旋。兩股核酸之間的結合親和力是指雜交的強度。其通常用融化溫度 (Tm ) 來描述，所述融化溫度的定義是一半寡核苷酸與目標核酸形成雙股螺旋時的溫度。在生理條件下，Tm 並非完全地與親和力成比例 (Mergny 與 Lacroix, 2003 年，Oligonucleotides 13:515–537)。標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 更能準確代表結合親和力，並且與反應的離解常數 (Kd ) 之間具有 ΔG°=-RTln(Kd ) 的關係，其中 R 是氣體常數，而 T 是絕對溫度。因此，寡核苷酸與目標核酸之間反應的非常低的 ΔG° 體現所述寡核苷酸與目標核酸之間的強勢雜交。ΔG° 是與含水濃度為 1M、pH 為 7、溫度為 37℃ 的反應關聯的能量。寡核苷酸與目標核酸的雜交是自發性反應，而自發性反應的 ΔG° 小於零。ΔG° 可經由實驗來測量，例如，利用如 Hansen 等人 1965 年在Chem.C omm . 36–38 及 Holdgate 等人 2005 年在Drug Discov Today 中所描述的等溫滴定微量熱法 (ITC)。具有通常技術者應知，市面上可購得用於測量 ΔG° 的商用設備。ΔG° 亦可透過數值方式進行估計，例如藉由利用 SantaLucia 於 1998 年在Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460–1465 中所描述的最近鄰模型或利用 Sugimoto 等人於 1995 年在Biochemistry 34:11211–11216 中及 McTigue 等人於 2004 年在Biochemistry 43:5388–5405 中所描述的適當取得的熱動力學參數。為了能夠經由雜交調節本發明之寡核苷酸的預期核酸目標，將長度為 10-30 個核苷酸的寡核苷酸以低於 -10 千卡的估計 ΔG° 值雜交至目標核酸。在某些實施例中，雜交的程度或強度是以標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 來測量。長度為 8 至 30 個核苷酸的寡核苷酸可以低於 -10 千卡範圍的估計 ΔG° 值雜交至目標核酸，例如低於 -15 千卡，例如低於 -20 千卡，及例如低於 -25 千卡。在某些實施例中，寡核苷酸以 -10 至 -60 千卡，例如 -12 至 -40 千卡，例如自 -15 至 -30 千卡或 -16 至 -27 千卡，例如 -18 至 -25 千卡的估計 ΔG° 值雜交至目標核酸。
目標核酸
依據本發明，目標核酸是將 Ｂ 型肝炎病毒編碼的核酸，且可為例如基因、RNA、mRNA、病毒 mRNA 或 cDNA 序列。目標核酸由 SEQ ID NO: 1 及其自然產生的變異體表示。
在體內或體外應用上，本發明之寡核苷酸通常能夠在表現 HBV 目標核酸的細胞中，抑制 HBV 目標核酸的表現。本發明之寡核苷酸的核鹼基之連續序列，在整個寡核苷酸長度上測量的結果通常是與 HBV 目標核酸為互補，隨選的是有一個或兩個錯配的例外，且隨選的是不包含能夠將寡核苷酸連結至例如結合物等隨選官能基團，或其他非互補的末端核苷酸 (例如區域 D’ 或 D’’) 之核苷酸基連接子區域。
標靶序列
本文所用的術語「標靶序列」意指出現在目標核酸中的核苷酸的一個序列，其包含與本發明之寡核苷酸為互補的核鹼基序列。在某些實施例中，所述標靶序列包含目標核酸上的一個區域，所述區域的核鹼基序列與本發明之寡核苷酸的連續核苷酸序列為互補。所述目標核酸的此一區域也可互換地稱為目標核苷酸序列、標靶序列或目標區域。在某些實施例中，所述標靶序列比單一寡核苷酸的互補序列更長，且可能例如代表所述目標核酸的較容易受本發明之數種寡核苷酸所標定的區域。
本文所述的是治療性寡核苷酸的 HBV mRNA 目標區域，該區域由 SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO: 28 的位置 1530 至 1602 的序列表示。可以將該目標區域分成較小的標靶序列，並選自由以下位置組成之群組：SEQ ID NO: 1 的位置 1530 至 1602、1530 至 1598、1530 至 1543、1530 至 1544、1531 至 1543、1551 至 1565、1551 至 1566、1577 至 1589、1577 至 1591、1577 至 1592、1578 至 1590、1578 至 1592、1583 至 1598、1584 至 1598、1585 至 1598 或 1583 至 1602。
在一個實施例中，本發明之治療性寡核苷酸包含與 SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO: 28 的位置 1530 至 1602 之標靶序列互補或雜交的連續核苷酸序列。特別是選自以下各項所組成之群組的標靶序列 1530 至 1544、1531 至 1543、1585 至 1598 和 1583 至 1602。
與反義寡核苷酸互補或雜交的標靶序列，通常包含至少 10 個核苷酸的連續核鹼基序列。該目標區域的連續核苷酸序列具有 10 至 50 個核苷酸，例如 12 至 30 個，例如 14 至 20 個，例如 15 至 18 個連續核苷酸。
目標細胞
本文所用的術語「目標細胞」是指正在表現目標核酸的細胞。在某些實施例中，所述目標細胞可以是體內或體外的。在一些實施例中，目標細胞是 HBV 感染的哺乳動物細胞，例如囓齒動物細胞，例如小鼠細胞或人類細胞，特別是 HBV 感染的肝細胞。
在優選的實施例中，目標細胞表現 HBV mRNA，並分泌 HBsAg 和 HBeAg。
肝細胞
如本文所使用，術語「肝細胞 (hepatocyte或hepatocytes)」是指肝實質組織的細胞。這些細胞約佔肝臟質量的 70% 至 85%，並製造血清白蛋白、纖維蛋白原和凝血因子（因子 3 和 4 除外）的凝血酶原群。肝細胞譜系細胞的標記可能包括但不限於：運甲狀腺素蛋白 (Ttr)、麩醯胺酸合成酶 (Glul)、肝細胞核因子 1a (Hnf1a)和肝細胞核因子 4a (Hnf4a)。成熟肝細胞的標記可能包括但不限於：細胞色素 P450 (Cyp3a11)、延胡索醯乙醯乙酸水解酶 (Fah)、6-磷酸葡萄糖 (G6p)、白蛋白 (Alb) 和 OC2-2F8。參見，例如，Huch 等人，(2013)，Nature，494（7436），247-250，其與肝細胞標記有關的內容藉由引用併入本文。
降低表現
如本文所使用，術語基因的「降低表現 (reduced expression)」是指與適當的參考細胞或個體相比，在一個細胞或個體中，由基因編碼的 RNA 轉錄物或蛋白質之量的減少及/或基因活性之量的減少。例如，用醫藥組合或雙股寡核苷酸（例如，一個具有與 HBsAg mRNA 序列互補的反義股）治療細胞的行為，與未分別用醫藥組合或雙股寡核苷酸治療的細胞相比，可能導致 RNA 轉錄物、蛋白質及/或酶活性（例如，由 HBV 基因組的 S 基因編碼）的減少。類似地，本文所用的「降低表現」是指導致基因（例如，HBV 基因組的 S 基因）表現降低的行為。
自然產生變體
術語「其自然產生的變異體 (naturally occurring variant thereof)」是指目標核酸的變異體，其在所定義的分類群中是自然存在的，例如 HBV 基因型 A-H。通常，當提及多核苷酸之「自然產生的變異體 (naturally occurring variants)」時，該術語還可涵蓋任何藉由染色體易位或重複發現之編碼基因體 DNA 的標靶序列之對偶變異體，以及 RNA（例如由其衍生的 mRNA）。「自然產生的變異體 (naturally occurring variants)」也可以包括衍生自標靶序列 mRNA 之選擇式剪接的變異體。引用時，例如對於特定的多肽序列而言，該術語還包括蛋白質之自然產生的形式，其因此可以進行處理，例如藉由轉譯中或轉譯後修飾，例如訊息肽切割、蛋白酶切割、糖基化等。
高親和力經修飾之核苷
高親和力經修飾之核苷是一種修飾的核苷酸，當其併入寡核苷酸中時，可提升寡核苷酸對其互補目標的親和力，例如以融化溫度 (Tm ) 所測定者。本發明之高親和力經修飾之核苷較佳的是造成每一修飾核苷的融化溫度增加 +0.5 至 +12℃，更佳的是 +1.5 至 +10℃，最佳的是 +3 至 +8℃。此技術領域中已有眾多為人所知的高親和力經修飾之核苷，包括例如許多 2’ 取代核苷以及鎖核酸 (LNA) (見例如 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。
糖修飾
本發明之寡聚物可包含一個或多個具有修飾糖部分的核苷，亦即與 DNA 及 RNA 中的核糖部分相較為經過修飾的糖部分。
目前已製成了眾多包含經修飾核糖部分的核苷，主要目的為改善寡核苷酸的特定特性，例如親和力及/或核酸酶抗性。
這些修飾包括對核糖環結構的修飾，例如取代為己糖環 (HNA)，或通常在核糖環上的 C2 與 C4 碳原子之間具有雙自由基橋的雙環 (LNA)，或通常在 C2 與 C3 碳原子之間無鍵結的未連結核糖環 (例如 UNA)。其他糖修飾核苷包括，例如，雙環己糖核酸 (WO2011/017521) 或三環核酸 (WO2013/154798)。修飾核苷也包括將糖部分取代為非糖部分的核苷，例如胜肽核酸 (PNA) 或嗎啉基核酸的情形。
糖修飾也包括經由將核糖環上的取代基團改變為除在 DNA 及 RNA 核苷中自然存有的氫或 2’-OH 基團以外的基團來進行修飾。取代基可例如在 2’、3’、4’ 或 5’位置導入。
2’ 糖修飾核苷
2’ 糖修飾核苷是在 2’ 位置 (2’ 取代核苷) 具有非 H 或 –OH 的取代基的核苷或包含能夠在核糖環中的 2’ 碳與第二碳之間形成架橋的 2’ 連結雙自由基的核苷，例如 LNA (2’ – 4’ 雙自由基架橋) 核苷。
更確切地，2’ 糖取代核苷的開發頗受關注，目前也已發現許多 2’ 取代核苷在併入寡核苷酸中時具有助益特性。例如，2’ 修飾糖可加強所述寡核苷酸的結合親和力及/或增加所述寡核苷酸的核酸酶抗性。2’ 取代修飾核苷的實例包括 2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟基-RNA 及 2’-F-ANA 核苷。更多實例請參看例如 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 以及 Deleavey 與 Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。以下為 2’ 取代修飾核苷的圖解。
Figure 02_image005
在本發明中，2’ 取代糖修飾核苷並不包括 2’ 橋接核苷，如 LNA。
鎖核酸核苷 (LNA 核苷 )
「LNA 核苷」是一種 2’- 修飾核苷，所述 2’- 修飾核苷包含連結所述核苷的核糖環之 C2’ 與 C4’ 的雙自由基 (此雙自由基亦稱為「2’ - 4’ 架橋」)，其可限制或鎖定所述核糖環的構造。該等核苷於文獻中也稱為橋接核酸或雙環核酸 (BNA)。鎖定核糖的構造，可在將 LNA 併入寡核苷酸中而產生互補 RNA 或 DNA 分子時提升雜交親和力 (雙股螺旋穩定化)。藉由測量寡核苷酸/補體雙股螺旋的融化溫度，可對此進行常規的判定。
非限制性地，例示性 LNA 核苷已於 WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita 等人，Bioorganic & Med. Chem. Lett.12，73-76；Seth 等人 J. Org.Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81 及 Mitsuoka 等人，Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238 以及 Wan 與 Seth，J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667 中揭露。
方案 1 中揭露了其他非限制性例示 LNA 核苷。
方案 1 ：
Figure 02_image007
特定 LNA 核苷為 β-D-氧基-LNA、6’-甲基-β-D-氧基 LNA，例如 (S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA (ScET) 及 ENA。具有特定優勢的 LNA 為 β-D-氧基-LNA。
磷酸酯類似物
如本文所使用，術語「磷酸酯類似物 (phosphate analog)」是指模擬磷酸基的靜電及/或立體特性的化學部分。在一些實施例中，磷酸酯類似物位於寡核苷酸之 5' 末端的核苷酸處替代 5'-磷酸鹽，其通常易於以酶除去。在一些實施例中，5'磷酸酯類似物含有抗磷酸酶鍵聯。磷酸酯類似物的實例包括 5'膦酸酯，例如 5'亞甲基膦酸酯 (5'-MP)和 5'-(E)-乙烯基膦酸酯 (5'-VP)。在一些實施例中，寡核苷酸在 5'-末端的核苷酸之糖的 4'-碳位置上，具有磷酸酯類似物（稱為「4'-磷酸酯類似物」）。4′-磷酸酯類似物的一個實例是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子結合到糖部分（例如在其 4′-碳上）或其類似物。參見例如，2016 年 9 月 2 日提交的美國臨時申請號 62/383,207 和 2016 年 9 月 12 日提交的美國臨時申請號 62/393,401，其各自涉及磷酸酯類似物的內容藉由引用併入本文。針對寡核苷酸之 5' 端的其他修飾已被開發（參見，例如，WO 2011/133871；美國專利號 8,927,513；和 Prakash 等人 (2015)，Nucleic Acids Res.，43（6），2993-3011，其各自涉及磷酸酯類似物的內容藉由引用併入本文。
核酸酶中介降解
核酸酶中介降解意指一寡核苷酸能夠在與互補核苷酸序列形成雙股螺旋時，居中影響所述序列的降解。
在某些實施例中，反義寡核苷酸可經由該目標核酸的核酸酶介導的降解而發揮作用，在其中，本發明之寡核苷酸能夠招募核酸酶，特別是核酸內切酶，較佳的是核糖核酸酶 (RNase)，例如核糖核酸酶 H。在經由核酸酶中介機轉而運作的寡核苷酸設計實例中，該寡核苷酸通常包含一個長度為至少 5 或 6 個連續 DNA 核苷的區域，且在該區域的一側或兩側上側接有親和力提升型核苷，例如缺口體、頭聚物及尾聚物。
核糖核酸酶 H 活性與招募
在一個實施例中，治療性寡核苷酸是能夠招募核糖核酸酶 H 的反義寡核苷酸。反義寡核苷酸的核糖核酸酶 H 活性是指當其與互補的 RNA 分子在雙股螺旋中時，招募核糖核酸酶 H 的能力。WO01/23613 提供用於確定核糖核酸酶 H 活性的體外方法，其可用於確定招募核糖核酸酶 H 的能力。以具有與受測修飾之寡核苷酸相同的鹼基序列但在寡核苷酸中的全部單體之間，僅包含具有硫代磷酸酯鍵聯的 DNA 單體之寡核苷酸為基準，使用 WO01/23613 (經參照併入於此) 提供的實例 91 至 95 所描述的方法，以皮莫耳/公升/分鐘 (pmol/l/min) 為單位判定初始速率，如果一寡核苷酸與互補目標核酸序列反應的初始速率為上述基準初始速率的至少 5%，例如至少 10% 或超過 20%，則通常認為該寡核苷酸能夠招募核糖核酸酶 H。在判定核糖核酸酶 H 活性時，可使用瑞士琉森 Lubio Science GmbH 的重組型人類核糖核酸酶 H1。
缺口體
在一些實施例中，本發明的治療性寡核苷酸是反義寡核苷酸，本發明的核酸分子或其連續核苷酸序列是缺口體反義寡核苷酸。反義缺口體常用於透過 核糖核酸酶 H 中介降解來抑制目標核酸。在本發明的一個實施例中，本發明的反義寡核苷酸能夠朝招募核糖核酸酶 H。
一個缺口體反義寡核苷酸包含至少三個有區別的結構區域，也就是一個 5’-側翼、一個缺口和一個 3’-側翼，F-G-F’ 為 ‘5 -＞ 3’ 方向。所述「缺口」區域 (G) 包含一段讓寡核苷酸能夠招募 核糖核酸酶 H 的連續 DNA 核苷酸。所述缺口區域側接包含一或多個糖修飾核苷的 5’ 側翼區域 (F)，有利的是高親和力糖修飾核苷，且側接包含一或多個糖修飾核苷的 3’ 側翼區域 (F’)，有利的是高親和力糖修飾核苷。區域 F 及 F’ 中的一個或多個糖修飾核苷可提升寡核苷酸對於目標核酸的親和力 (亦即其為親和力提升型糖修飾核苷)。在某些實施例中，區域 F 及 F’ 中的一或多個糖修飾核苷是 2’ 糖修飾核苷，例如高親和力 2’ 糖修飾，例如獨立選自 LNA 及 2’-MOE。
在缺口體設計中，缺口區域的 5’ 及 3’ 多數核苷為 DNA 核苷，且位置分別鄰近 5’ (F) 或 3’ (F’) 區域的糖修飾核苷。該側翼可進一步定義為在距離該缺口區域最遠之端具有至少一個糖修飾核苷，也就是在 5’ 側翼的 5’ 端及在 3’ 側翼的 3’ 端。
區域 F-G-F’ 形成一個連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸，或其連續核苷酸序列，可包含式 F-G-F’ 的缺口體區域。
該缺口體設計 F-G-F’ 的整體長度可為，例如 12 至 30 個核苷，例如 13 至 24 個，例如 14 至 22 個核苷，例如 13 至 17 個，例如 14 至 16 個核苷。
舉例而言，本發明之缺口體寡核苷酸可由下式代表： F1-6 -G6-16 -F’1-6 ，例如 F1-4 -G7-10 -F’2-4 附帶條件是所述缺口體區域 F-G-F’ 的整體長度為至少 12 個，例如至少 13 個核苷酸。
在本發明的一個方面，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含或由式 5’-F-G-F’-3’ 的缺口體所組成，其中區域 F 和 F' 獨立地包含或由 1 至 8 個核苷所組成，其中 1 至 4 個核苷是 2' 糖修飾的，並定義區域 F 和 F' 的 5' 和 3' 端，而 G 是 6 至 16 個核苷之間的區域，其具有招募核糖核酸酶 H 的能力。
在本發明的一個實施例中，連續核苷酸序列是式 5’-F-G-F’-3’ 的缺口體，其中區域 F 和 F' 獨立地由 2 至 4 個 2' 糖修飾的核苷酸所組成，並定義區域 F 和 F' 的 5' 和 3' 末端，而 G 是 6 至 10 個 DNA 核苷之間的區域，其具有招募核糖核酸酶 H 的能力。
在一些實施例中，缺口區域 G 可以由 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 個連續的硫代磷酸酯連接的 DNA 核苷所組成。在一些實施例中，缺口區域 G 由 7 至 10 個 DNA 核苷所組成。在一些實施例中，缺口中的所有核苷間鍵聯是硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，區域 F 和 F′ 獨立地包括或由糖修飾的核苷的連續序列所組成。在一些實施例中，區域 F 之糖修飾的核苷可獨立地選自 2'-O-烷基-RNA 單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA 單元、2'-氟-DNA 單元、2'-烷氧基-RNA、MOE 單元、LNA 單元、阿拉伯糖核酸 (ANA) 單元和 2'-氟-ANA 單元。
在一些實施例中，區域 F 或 F′或 F 和 F′ 的所有核苷均為 LNA 核苷，例如獨立地選自 β-D-氧基 LNA、ENA 或 ScET 核苷。在一些實施例中，區域 F 由 1 至 5 個，例如 2 至 4 個，例如 3 至 4 個，例如 1、2、3、4 或 5 個連續的 LNA 核苷所組成。在一些實施例中，區域 F 和 F′ 的所有核苷都是 β-D-氧基 LNA 核苷。
在一些實施例中，區域 F 或 F’或 F 和 F’ 的所有核苷都是 2’ 取代的核苷，例如 OMe 或 MOE 核苷。在一些實施例中，區域 F 由 1、2、3、4、5、6、7 或 8 個連續的 OMe 或 MOE 核苷所組成。在一些實施例中，僅一個側翼區域可以由 2′ 取代的核苷所組成，例如 OMe 或 MOE 核苷。在一些實施例中，是 5' (F) 側翼區域由 2' 取代的核苷所組成，例如 OMe 或 MOE 核苷，而 3' (F') 側翼區域包含至少一個 LNA 核苷，例如 β-D-氧基 LNA 核苷或 cET 核苷。在一些實施例中，是 3' (F') 側翼區域由 2' 取代的核苷所組成，例如 OMe 或 MOE 核苷，而 5' (F) 側翼區域包括至少一個 LNA 核苷，例如 β-D-氧基 LNA 核苷或 cET 核苷。
其他缺口體設計已於 WO2004/046160，WO2007/146511 和 WO2008/113832 中揭露，在此藉由引用併入本文。
LNA 缺口體
LNA 缺口體是指其中區域 F 及 F’ 中任一者或兩者都包含或具有 LNA 核苷的缺口體。β-D-氧基缺口體是指其中區域 F 及 F’ 中任一者或兩者都包含或具有 β-D-氧基 LNA 核苷的缺口體。
在某些實施例中，所述 LNA 缺口體係如下式：[LNA]1–5 -[區域 G]6-10 -[LNA]1-5 ，其中區域 G 具有如該缺口體區域 G 定義中的定義。
MOE 缺口體
MOE 缺口體是其中區域 F 及 F’ 由 MOE 核苷所構成的缺口體。在某些實施例中，MOE 缺口體的設計為 [MOE]1-8 -[區域 G]5-16 -[MOE]1-8 ，例如 [MOE]2-7 -[區域 G]6-14 -[MOE]2-7 ，例如 [MOE]3-6 -[區域 G]8-12 -[MOE]3-6 ，其中區域 G 具有如該缺口體定義中的定義。具有 5-10-5 設計 (MOE-DNA-MOE) 的 MOE 缺口體已廣泛用於本技術領域中。
混合型翼缺口體
混合型翼缺口體是一種 LNA 缺口體，其中區域 F 及 F’ 中的一者或兩者都包含 2’ 取代的核苷，例如獨立選自以下各項所組成之群組的 2’ 取代核苷：2’-O-烷基-RNA 單元、2’-O-甲基-RNA、2’-胺基-DNA 單元、2’-氟-DNA 單元、2’-烷氧基-RNA、MOE 單元、阿拉伯糖核酸 (ANA) 單元及 2’-氟-ANA 單元，例如 MOE 核苷。在某些實施例中，其中區域 F 及 F’ 中之至少一者或區域 F 及 F’ 兩者均包含至少一個 LNA 核苷，區域 F 及 F’ 的其餘核苷係獨立選自以 MOE 及 LNA 所構成之群組。在某些實施例中，其中區域 F 或 F’ 中的至少一者或區域 F 及 F’ 兩者均包含至少兩個 LNA 核苷，區域 F 及 F’ 的其餘核苷係獨立選自以 MOE 及 LNA 所構成之群組。在某些混合型翼的實施例中，區域 F 及 F’ 中的一或兩者可進一步包含一或多個 DNA 核苷。
混合型翼缺口體設計已於 WO2008/049085 及 WO2012/109395 中揭露，這兩個文獻均藉由引用併入本文。
寡核苷酸中的區域 D’ 或 D’’
本發明之寡核苷酸可在某些實施例中包含或具有所述寡核苷酸的所述連續核苷酸序列，其與所述目標核酸互補，所述連續核苷酸序列如是缺口體 F-G-F’ 以及進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷。所述進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷可與或不與所述目標核酸為完全互補。該等進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷本文中可稱為區域 D’ 及 D’’。
區域 D’ 或 D’’ 的加入可用於將所述連續核苷酸序列，例如缺口體，連接至結合物部分或另一官能基團。當用於接合連續核苷酸序列與結合物部分時，其可做為生物可切割型連接子。或者其可用於提供外核酸酶保護或促進合成或製造。
區域 D’ 及 D’’ 可分別連附至區域 F 的 5’ 端或區域 F’ 的 3’ 端，以產生下式設計：D’-F-G-F’、F-G-F’-D’’ 或D’-F-G-F’-D’’。在此實例中，F-G-F’ 是所述寡核苷酸的缺口體部位，且區域 D’ 或 D’’ 構成所述寡核苷酸的一個分離部分。區域 D' 和 F 區域之間以及區域 F' 和 D'' 區域之間轉換的特徵是核苷具有朝向 D' 或 D'' 區域的磷酸二酯鍵聯，以及朝向 F 或 F' 區域的硫代磷酸酯鍵聯，且核苷被視為是缺口體的一部分（與目標核酸互補的連續核苷酸序列）。
區域 D’ 或 D’’ 可獨立包含或具有 1、2、3、4 或 5 個外加核苷酸，其可與所述目標核酸為互補或不為互補。鄰接 F 或 F’ 區域的核苷酸並非糖修飾核苷酸，例如 DNA 或 RNA 或其鹼基修飾版本。D’ 或 D’’ 區域可做為對核酸酶易感的生物可切割型連接子 (見連接子定義)。在某些實施例中，所述外加 5’ 及/或 3’ 端核苷酸是與磷酸二酯鍵聯連結，且為 DNA 或 RNA。適用為區域 D’ 或 D’’ 的核苷酸基生物可切斷型連接子可參照 WO2014/076195 的揭露，舉例而言可包括磷酸二酯連結 DNA 二核苷酸。在一些實施例中，區域 D’ 或 D’’ 與目標核酸不互補或包含至少 50% 的錯配。
在一些實施例中，區域 D' 或 D'' 包含或由以下各項組成：序列的二核苷酸 AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC 或 GG，其中 C 可以是 5-甲基胞嘧啶，及/或 T 可以被 U 取代。二核苷酸中的核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，區域 D' 或 D'' 包含或由以下各項組成：序列的三核苷酸 AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC 和 GGG，其中 C 可以是 5-甲基胞嘧啶及/或 T 可以被 U 取代。核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。應知悉的是，當提及（自然產生的）核鹼基 A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、U（尿嘧啶）、G（鳥嘌呤）、C（胞嘧啶）時，它們可以被核鹼基類似物取代，該核鹼基類似物的功能相當於天然的核鹼基（例如鹼基配對至互補的核苷）。
在一實施例中，本發明之反義寡核苷酸除包含構成缺口體的連續核苷酸序列之外，還包含區域 D’ 及/或 D’’。
在某些實施例中，本發明之反義寡核苷酸可由下式代表： D’-F-G-F’；特別是 D’1-3 -F1-4 -G6-10 -F’2-4 F-G-F’-D’’；特別是 F1-4 -G6-10 -F’2-4 -D’’1-3 D’-F-G-F’-D’’；特別是 D’1-3 - F1-4 -G6-10 -F’2-4 -D’’1-3
在某些實施例中，所述位在區域 D’ 與區域 F 之間的核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。在某些實施例中，所述位在區域 F’ 與區域 D’’ 之間的核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。
結合物
本文所用的術語結合物是指可以與治療性寡核苷酸共價連接的非核苷酸部分（結合物），例如 GalNAc 簇。術語結合物和簇或結合物部分可以互換使用。在某些情況下，結合的治療性寡核苷酸也可以稱為寡核苷酸結合物。在一個實施例中，結合物是靶向配體。
靶向配體
如本文所使用，術語「靶向配體 (targeting ligand)」是指與關注之組織或細胞的同源分子（例如，受體）選擇性結合的一分子（例如，碳水化合物、胺醣、膽固醇、多肽或脂質），且該分子為了將其他物質靶向至關注之組織或細胞，可與另一種物質結合。例如，在一些實施例中，可以將靶向配體與寡核苷酸結合，以將寡核苷酸靶向感興趣的特定組織或細胞。在一些實施例中，靶向配體選擇性結合細胞表面受體。因此，在一些實施例中，靶向配體當結合至寡核苷酸時，透過選擇性結合至細胞表面表現的受體和複合體細胞的核內體內化作用，從而促進將寡核苷酸遞輸至特定細胞中，該複合體包含寡核苷酸、靶向配體和受體。在一些實施例中，靶向配體經由連接子與寡核苷酸結合，該連接子在細胞的內化作用之後或過程中切割，從而在細胞中使靶向配體釋放寡核苷酸。
寡核苷酸連接子
鍵聯或連接子是兩個原子之間的連接，用以將一個關注中的化學基團或區段經由一或多個共價鍵連結至另一個關注中的化學基團或區段。結合物基團可直接或透過連結部分(例如連接子或繫鏈) 連附至寡核苷酸。連接子用於將結合物基團共價連接至與目標核酸互補的寡核苷酸或連續核苷酸序列。
在本發明的一些實施例中，治療性寡核苷酸可任選地包含連接子區域，該連接子區域位於與目標核酸和結合物互補的寡核苷酸或連續核苷酸序列之间的连接区域。
這種連接子可以是生物可切割型連接子，其包含或由生理不安定鍵結所組成，該生理不安定鍵在正常情況下或類似於哺乳動物體內遇到的條件下是可切割的在一實施例中，所述生物可切割型連接子易感於 S1 核酸酶切割。
對於置於結合物和治療性寡核苷酸之間的生物可切割型連接子，優選地在目標組織（例如肌肉、肝臟、腎臟或腫瘤）中看到的切割速率大於在血清中發現的切割速率。在「材料與方法」部分中，描述了合適確定目標組織中相對於血清或由 S1-核酸酶切割水準 (%) 的方法。在一些實施例中，當與標準品相比時，生物可切割型連接子至少約 20% 被切割，例如至少約 30% 被切割，例如至少約 40% 被切割，例如至少約 50% 被切割，例如至少約 60% 被切割，例如至少約 70% 被切割，例如至少約 75% 被切割。
於一較佳實施例中，所述核酸酶易感連接子包含的核苷數量在 1 與 10 之間，例如 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個或 10 個核苷，更佳的是 2 個至 6 個核苷，最佳的是 2 個至 4 個相連結的核苷，所述相連結的核苷包含至少兩個連續磷酸二酯鍵聯，例如至少 3 個或 4 個或 5 個連續磷酸二酯鍵聯。該核苷較佳的是 DNA 或 RNA。包含磷酸二酯的生物可切割型連接子（PO 連接子）在 WO 2014/076195 中進行了更詳細的描述（在此藉由引用併入本文）。
其他或替代的連接子也可以單獨或與 PO 連接子組合使用，其不一定要是生物可切割型，但要是主要用於將結合物共價連接至寡核苷酸的連接子。不可切割型連接子可包含鏈結構或重複單元的寡聚物，例如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基團。在一些實施例中，不可切割型連接子是胺基烷基，例如 C2 至 C36 胺基烷基團，包括例如 C6 至 C12 胺基烷基團。於一較佳實施例中，連接子是一個 C6 胺基烷基團。
B 型肝炎病毒
如本文所用，「B 型肝炎病毒」或「HBV」是指具有約 3,200 個鹼基對之小雙股 DNA 基因組且對肝細胞向性的肝病毒科家族成員。「HBV」包括感染各種哺乳動物（例如人類、非人類靈長類動物等）和禽類（鴨等）宿主中的任何一種的 B 型肝炎病毒。「HBV」括任何已知的 HBV 基因型，例如血清型 A、B、C、D、E、F 和 G；任何 HBV 血清型或 HBV 亞型；任何 HBV 分離株；HBV 變異體，例如，HBeAg 陰性變異體、抗藥性 HBV 變異體等（例如，抗拉米夫定 (lamivudine) 變異體、抗阿德福韋 (adefovir) 突變、抗替諾福韋 (tenofovir) 突變、抗恩替卡韋 (entecavir) 突變等）。
「HBV」是屬於肝病毒科 家族的小 DNA 病毒，被歸類為正肝去氧核糖核酸病毒 属 (Orthohepadnavirus) 的類型物種。HBV 病毒顆粒（病毒粒子）包含外部脂質套膜和由蛋白質組成的二十面體核酸蛋白殼核心。核酸蛋白殼通常包封病毒 DNA 和 DNA 聚合酶，其具有與反轉錄病毒相似的反轉錄酶活性。HBV 外套膜包含嵌入的蛋白質，這些蛋白質參與易感細胞的病毒結合並進入易感細胞。攻擊肝臟的 HBV 已基於序列根據至少十種基因型 (A-J) 進行了分類。一般而言，基因組編碼四個基因，這些基因分別稱為 C、P、S 和 X。核心蛋白由基因 C (HBcAg) 編碼，其起始密碼子之前是上游框內 AUG 起始密碼子，由此產生前核心蛋白。HBeAg 是藉由蛋白酶處理前核心蛋白而產生的。DNA 聚合酶由基因 P 編碼。基因 S 編碼表面抗原 (HBsAg)。HBsAg 基因是一個長開讀框，但包含三個框內的「起始」(ATG) 密碼子，可將基因分為三個部分，即前 S1 (pre-S1)、前 S2 (pre-S2) 和 S。由於存在多個起始密碼子，因此產生了稱為大、中和小的三個不同大小的多肽（前 S1 + 前 S2 + Ｓ、前 S2 + S 或 S）。它們的比例可以為 1:1:4（Heermann 等人，1984 年）。
B 型肝炎病毒 (HBV) 蛋白可以分為幾種類別和功能。聚合酶具有反轉錄酶 (RT) 的功能，可從前基因組 RNA (pgRNA) 製備病毒 DNA，還具有 DNA 依賴性聚合酶的功能，可從病毒 DNA 製備共價閉合環狀 DNA (cccDNA)。它們共價地連附於負股的 5' 端。核心蛋白構成病毒殼體和分泌的 E 抗原。表面抗原是肝細胞內化作用的配體，也是病毒球形和絲狀顆粒的主要成分。產生的病毒顆粒是 Dane 顆粒（感染性病毒粒子）的 1000 倍以上，並可以作為免疫誘餌。
B 型肝炎病毒表面抗原
如本文所使用，術語「B 型肝炎病毒表面抗原 (hepatitis B virus surface antigen)」或「HBsAg」是指由 HBV 基因組的基因 S（例如，ORF　S）編碼的 S 結構域蛋白。B 型肝炎病毒顆粒在核心顆粒中帶有病毒核酸，該核心顆粒被由基因 S 編碼的三種蛋白包封，這三種蛋白是大表面、中表面和主要表面蛋白。在這些蛋白中，主要表面蛋白質通常約為 226 個胺基酸，並僅包含 S 結構域。
感染
如本文所使用，術語「感染 (infection)」是指個體中病原的入侵及/或微生物的擴展，例如病毒。感染可能是溶原性的，例如病毒 DNA 在細胞內處於休眠狀態。或者，感染可以是裂解性的，例如其中病毒活躍地增殖並引起被感染細胞的破壞。感染可能會或可能不會導致臨床上明顯的症狀。感染可能停留在局部也可能擴散，例如透過個體的血液或淋巴系統。可以藉由測定病毒量、表面抗原 (HBsAg)、e 抗原 (HBeAg) 和本領域已知的各種其他檢測 HBV 感染的方法中之一種或多種，來鑑定患有 HBV 感染的受試者。用於測定 HBV 感染的檢測方法可包括測試血清或血液樣本中 HBsAg 及/或 HBeAg 的存在，並可選地進一步篩選一種或多種病毒抗體（例如 IgM 及/或 IgG）的存在，以彌補在任何時期中 HBV 抗原可能處於不可檢測的水準。
HBV 感染
術語「B 型肝炎病毒感染 (hepatitis B virus infection)」或「HBV 感染 (HBV infection)」在本領域中是眾所周知的，並且是指由 B 型肝炎病毒 (HBV) 引起並影響肝臟的傳染病。HBV 感染可以是急性或慢性感染。一些感染者在初次感染期間並沒有症狀，有些感染者會迅速出現嘔吐、皮膚發黃、疲倦、小便黃赤和腹痛的疾病（「Hepatitis B Fact sheet N°204」。世界衛生組織官方網站 ，2014 年 7 月，檢索日期 2014 年 11 月 4 日）。這些症狀通常會持續數週，並可能導致死亡。出現症狀可能需要 30 到 180 天。在出生前後被感染的人中，有 90% 會發展為慢性 B 型肝炎，而在五歲以後才感染的人只有不到 10% 會發展為慢性 B 型肝炎。（「Hepatitis B FAQs for the Public - Transmission」，美國疾病控制和預防中心 (CDC)，檢索日期 2011-11-29）。大多數患有慢性疾病的人沒有症狀，然而，最終可能會發展為肝硬化和肝癌 (Chang，2007，Semin Fetal Neonatal Med，12，160-167)。這些併發症導致 15% 至 25% 患有慢性疾病的人死亡（「Hepatitis B Fact sheet N°204」。世界衛生組織官方網站 ，2014 年 7 月，檢索日期 2014 年 11 月 4 日）。在本文中，術語「HBV 感染 (HBV infection)」包括急性和慢性 B 型肝炎感染。術語「HBV 感染 (HBV infection)」還包括初始感染的漸進階段、症狀階段以及 HBV 感染的漸進慢性階段。
肝臟發炎
如本文所使用，術語「肝臟發炎 (liver inflammation)」或「肝炎 (hepatitis)」是指其中肝臟變得腫脹、功能障礙及/或疼痛的身體狀況，特別是由於受傷或感染所致，這可能是由於暴露於肝毒性介質而引起的。症狀可能包括黃疸（皮膚或眼睛發黃）、疲勞、虛弱、噁心、嘔吐、食慾下降和體重減輕。如果不加以治療，肝炎可能會發展為纖維化、肝硬化、肝衰竭或肝癌。
肝纖維化
如本文所使用，術語「肝纖維化 (liver fibrosis)」或「肝的纖維化(fibrosis of the liver)」是指由發炎和肝細胞死亡引起的細胞外基質蛋白在肝中的過度積累，該細胞外基質蛋白可能包括膠原蛋白（I，III 和 IV）、纖連蛋白、粗纖維調節素、彈性蛋白、層連結蛋白、玻尿酸和蛋白多醣。如果不加以治療，肝纖維化可能會發展為肝硬化，肝衰竭或肝癌。
TLR7
如本文所使用，「TLR7」是指任何物種起源（例如人類、鼠類、土撥鼠等）的類鐸受體 7 (Toll-like receptor 7)。
TLR7 促效劑
如本文所用，「TLR7 促效劑」是指作為 TLR7 促效劑的化合物。除非另有說明，否則 TLR7 促效劑可以包括任何藥學上可接受形式的化合物，包括任何異構體（例如，非鏡像異構物或鏡像異構物）、鹽、溶劑合物、多晶型物等。對特定化合物的 TLR 促效作用可以以任何合適的方式確定。例如，用於檢測待測化合物之 TLR 促效作用的檢測法，已描述於如在 2002 年 12 月 11 日提交的美國臨時專利申請案序號 60/432,650 中，以及適用於這種測定法的重組細胞株，已描述於如 2002 年 12 月 11 日提交的美國臨時專利申請案序號 60/432,651 中。評估 TLR7 促效劑的另一種檢測法是 WO2016/091698 之實例 43 中所述的 HEK293-Blue-hTLR-7 細胞檢測法（該測定法藉由引用併入本文）。
非鏡像異構物
如本文所使用，術語「非鏡像異構物 (diastereomer)」是指具有兩個或更多個手性中心並且其分子不是彼此的鏡像的立體異構體。非鏡像異構物具有不同的物理性質，例如熔點、沸點、光譜性質、活性和反應性。
含有一個或多個手性中心的通式 (I)-(V) 化合物，可以以外消旋物、非鏡像混合物或光學活性單一異構體的形式存在。可以根據已知的方法將外消旋物分離為鏡像異構物。特別是，可藉由結晶而分離出非鏡像異構的鹽，該結晶是藉由與光學活性酸（例如，D- 或 L-酒石酸、杏仁酸、蘋果酸、乳酸或樟腦磺酸）反應，從外消旋的混合物所形成的。
藥學上可接受之鹽
如本發明之化合物可以以其藥學上可接受之鹽的形式存在。
術語「藥學上可接受之鹽」意指保有生物效應及自由鹼或自由酸特性，且並非在生物上或在其他方面有不利之處的鹽。該鹽是以無機酸形成，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、特別是鹽酸，以及以有機酸形成，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苄甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、N-乙醯半胱胺酸等。
或者，這些鹽可由將無機鹼或有機鹼加到游離酸中來製備。衍生自無機鹼的鹽包括但不限於鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂鹽。衍生自有機鹼的鹽包括但不限於一級胺、二級胺、和三級胺的鹽、取代胺，包括天然存在的取代胺、環胺和鹼性離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、離胺酸、精胺酸、N-乙基哌啶、哌啶、多胺樹脂。式 (I) 的化合物也可以兩性離子的形式存在。特別優選地，式 (I) 化合物之藥學上可接受之鹽是鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和甲磺酸的鹽。
將藥物化合物進行化學修飾成鹽是藥物化學家眾所周知的技術，以獲得改善之化合物的物理和化學穩定性、吸濕性、流動性和溶解性。例如，在 Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435，或在 Ansel 的以下文獻中對此進行了描述：Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第六版，(1995)，第 196 頁和第 1456-1457 頁。例如，本文提供之化合物的醫藥上可接受之鹽可以是鈉鹽。
醫藥組合
如本文所使用，醫藥組合應理解為至少兩種不同之活性化合物或前藥（醫學化合物或藥物）的組合，用於治療疾病。醫藥組合可以包括物理、化學或其他方式組合（例如，在同一小瓶中）的化合物；包裝在一起的化合物（例如，作為同一包裝（部件套組）中的兩個分開的物體，用於同時投予或分開投予）；或單獨提供但意圖一起使用的化合物（例如，該組合在化合物標籤或包裝插頁上明確說明）。在一個實施例中，醫藥組合由調製為用於口服投予的醫學化合物和調製為用於皮下注射的醫學化合物所組成。
大約
如本文所使用，術語「大約 (approximately) 或約 (about)」，如應用於一個或多個關注值，是指類似於所述參考值的值。在某些實施例中，除非另有說明或從上下文中可以明顯看出（除非其中此類數字會超過可能值的 100%），術語「大約（approximately 或 about）」是指在所述參考值的任一方向（大於或小於），值的範圍落入 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%，11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1% 或更少的範圍內。
投予或給藥
如本文所使用，術語「投予或給藥 (administering 或 administration)」是指以藥理學上有用的方式（例如，治療個體的狀況）向個體提供物質（例如，醫藥組合或寡核苷酸）。
去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR)
如本文所使用，術語「去唾液酸糖蛋白受體 (Asialoglycoprotein receptor)」或「ASGPR」是指由主要 48 kDa (ASGPR-1) 和次要 40 kDa 次單位 (ASGPR-2) 所形成的二分 C 型凝集蛋白。ASGPR 主要在肝細胞的正弦表面表現，並在結合、內化作用和隨後循環醣蛋白（包含末端半乳糖或 N-乙醯半乳胺糖殘基）（去唾液酸糖蛋白）的清除中具有主要作用。
前藥
如本文所使用，術語「前藥 (prodrug)」是指一種化合物的形式或衍生物，其在體內代謝（例如，藉由個體在投予後透過生物體液或酶）為該化合物的藥理活性形式，以產生所需的藥理作用。前藥描述於如 Richard B. Silverman 撰寫的 Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action，聖地亞哥，學術出版社，2004 年，第 8 章 Prodrugs and Drug Delivery Systems，第 497-558 頁。
個體
如本文所使用，術語「個體 (subject)」是指任何哺乳動物，包括小鼠、兔子和人類。在一些實施例中，個體是人類或非人類的靈長類動物。術語「受試者(individual)」或「患者 (patien)」可以與「個體 (subject)」互換使用。
治療
本文所使用的術語「治療（treatment、treating 或 treats 等）」通常是指獲得所需之藥理及/或生理的作用。就部分或完全治癒疾病及/或歸因於該疾病的不良影響而言，該作用是治療性的。透過向個體投予治療劑（例如，醫藥組合或寡核苷酸）來提供效果，用以針對存在的病症（例如，HBV 感染）改善個體的身體及/或健康，或者預防或減少病症發生的可能性（例如，預防肝纖維化、肝炎、肝癌或其他與 HBV 感染有關的病症）。如本文所使用，術語「治療 (treatment)」涵蓋個體中任何 HBV 感染的治療，包括：(a) 抑制疾病，即像是抑制 HBsAg 及/或 HBeAg 的增長一樣抑制其發展；(b) 改善（即緩解）疾病，即導致疾病消退，例如壓抑 HBsAg 及/或 HBeAg 的產生。因此，改善及/或抑制 HBV 感染的化合物或化合物組合是治療 HBV 發明的化合物或化合物組合。優選地，本文所使用的術語「治療」涉及已經表現出的疾病的醫學介入，例如治療已經定義和表現出的 HBV 感染，特別是慢性 HBV 感染的治療。
在一些實施例中，治療涉及降低個體經歷的病症（例如，HBV 感染或相關病症）的至少一種體徵、症狀或促成因素的頻率或嚴重性。在 HBV 感染期間，個體可能表現出諸如皮膚和眼睛發黃（黃疸）、小便黃赤、極度疲勞、噁心、嘔吐和腹痛等症狀。因此，在一些實施例中，治療，例如使用本文提供的醫藥組合治療可導致一種或多種此類症狀的頻率或嚴重性降低。但是，HBV 感染會發展為一種或多種肝病，例如肝硬化、肝纖維化、肝炎或肝癌。因此，在一些實施例中，治療，例如使用本文提供的醫藥組合治療可導致一種或多種這樣的病症的頻率或嚴重性降低，或預防或減輕。
治療有效量
術語「治療有效量 (therapeutically effective amount)」表示本發明之醫藥組合之化合物的量，當將其投予於個體時，(i) 治療或預防特定的疾病、病症或障礙；(ii) 減輕、改善或消除一種或多種特定疾病、病症或障礙的症狀；或 (iii) 預防或延遲本文所述的一種或多種特定疾病、病症或障礙之症狀的發作。治療有效量取決於化合物、所治療的疾病狀態、所治療疾病的嚴重程度、個體的年齡和相對健康狀況、投予途徑和形式、主治醫師或獸醫師的判斷以及其他因素而有不同。
賦形劑
如本文所使用，術語「賦形劑 (excipient)」是指可以包含在一種或多種包含藥物之組成物中的非治療劑，該非治療劑是醫藥組合的一部分，例如用以提供或有助於所需的黏稠度或穩定作用。
本發明涉及一種醫藥組合，包含兩類化合物：i）治療性寡核苷酸和 ii）TLR7 促效劑，其各自在藥學上可接受之載體中。該醫藥組合用於治療 B 型肝炎病毒感染，特別是治療慢性 HBV 患者。
以下將分別描述組合中每種化合物的類別，但應當理解的是，醫藥組合中存在每種類別之至少一種化合物。該化合物可以同時或分開投予。靶向 HBV 的治療性寡核苷酸類別之化合物，可以以非腸胃道的方式投予（例如靜脈、皮下或肌內）。TLR7 促效劑可以以經腸道的方式投予（例如口服或透過胃腸道）。
在第一個實施例中，靶向 HBV 的治療性寡核苷酸是 RNAi 寡核苷酸，優選地是用於降低 HBsAg mRNA 之表現的 RNAi 寡核苷酸。在第二個實施例中，靶向 HBV 的治療性寡核苷酸是反義寡核苷酸，優選地是靶向 HBV 之 GalNAc 結合的反義寡核苷酸。
1. 本發明之 RNAi 寡核苷酸
在一些實施例中，本發明之醫藥組合中的第一藥物是 HBV 表面抗原表現之基於寡核苷酸的抑製劑，其可用於達成治療的益處。透過 HBV 表面抗原 mRNA 的審查和不同寡核苷酸的測試，已開發出有效的寡核苷酸可，降低 HBV 表面抗原 (HBsAg) 的表現以治療 HBV 感染。在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸被設計為靶向 HBsAg mRNA 序列，其涵蓋所有已知基因型中 ＞ 95% 之已知 HBV 基因組。在一些實施例中，此類寡核苷酸造成肝臟中的 HBV 前基因組 RNA (pgRNA) 和 HBsAg mRNA 降低超過 90%。在一些實施例中，在單一劑量或治療方案後，HBsAg 表現降低會持續延長一段時間。
因此，在一些實施例中，為了在細胞中靶向轉錄物並抑制其表現，本文所提供的寡核苷酸是被設計為具有與 HBsAg mRNA 有互補性的區域。互補之區域通常具有合適的長度和鹼基含量，以使寡核苷酸（或其股）能夠對 HBsAg mRNA 退火，以抑制其表現。在一些實施例中，互補之區域的長度為至少 12 個、至少 13 個、至少 14 個至少 15 個、至少 16 個、至少 17 個、至少 18 個、至少 19 個或至少 20 個核苷酸。在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸具有與 HBsAg mRNA 互補之區域，該區域的長度為 12 至 30（例如 12 至 30、12 至 22、15 至 25、17 至 21、18 至 27、19 至 27或 15 至 30）個核苷酸。在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸具有與 HBsAg mRNA 互補之區域，該區域的長度為 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸。
在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸被設計為靶向編碼 HBsAg 的 mRNA 序列。例如，在一些實施例中，提供具有反義股的寡核苷酸，該反義股具有與下述序列互補之區域：ACAANAAUCCUCACAAUA (SEQ ID NO: 33)，其中 N 是指任何核苷酸（A、G、T 或 C）。在一些實施例中，寡核苷酸進一步包含有義股，其與反義股形成雙股螺旋區域。在一些實施例中，有義股具有與如下序列互補之區域：UUNUUGUGAGGAUUN (SEQ ID NO: 34)。在一些實施例中，有義股包含與以下所示之序列（顯示 5' 至 3'）互補之區域：UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC (SEQ ID NO: 35)。
在一些實施例中，反義股包含以下序列或由以下序列所組成：UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG (SEQ ID NO: 36)。在一些實施例中，反義股包含以下序列或由以下序列所組成：UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG (SEQ ID NO: 37)。在一些實施例中，反義股包含以下序列或由以下序列所組成：UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38)。在一些實施例中，有義股包含以下序列或由以下序列所組成：ACAANAAUCCUCACAAUAA (SEQ ID NO: 39)。在一些實施例中，有義股包含以下序列或由以下序列所組成：GACAANAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 40)。在一些實施例中，有義股包含以下序列或由以下序列所組成：GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41)。在一些實施例中，有義股包含以下序列或由以下序列所組成：GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 42)。
在一些實施例中，用於減少 HBsAg mRNA 表現的寡核苷酸包含有義股，其與反義股形成雙股螺旋區域，其中該有義股包含如 SEQ ID NO: 39-42 中任一項的序列，且該反義股包含如 SEQ ID NO: 36-38 中任一項的序列。在一些實施例中，有義股包含經 2'-氟和 2'-O-甲基修飾之核苷酸，以及至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，有義股結合至 N-乙醯半乳胺糖 (GalNAc) 部分。在一些實施例中，反義股包含經 2'-氟和 2'-O-甲基修飾之核苷酸，以及至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，反義股的 5'-核苷酸之糖的 4'-碳包含磷酸酯類似物。在一些實施例中，每個反義股和有義股均包含經 2'-氟和 2'-O-甲基修飾之核苷酸，以及至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中反義股的 5'-核苷酸之糖的 4'-碳包含磷酸酯類似物，且有義股結合至 N-乙醯半乳胺糖 (GalNAc) 部分。
在一些實施例中，有義股包含如 SEQ ID NO: 40-42 中任一項序列，其在 3、8 至 10、12、13 和 17 的位置包含經 2'-氟修飾之核苷酸。在一些實施例中，該有義股在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 和 31 至 36 包含經 2'-O-甲基修飾之核苷酸。在一些實施例中，該有義股包含一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，該有義股在位置 1 和 2 的核苷酸之間包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，有義股結合至 N-乙醯半乳胺糖 (GalNAc) 部分。
在一些實施例中，反義股包含如 SEQ ID NO: 36-38 中任一項的序列，其在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 和 19 包含 經 2'-氟修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 和 20 至 22 包含經 2'-O-甲基修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股包含三個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，該反義股在位置 1 和 2 的核苷酸之間、位置 2 和 3 的核苷酸之間、位置 3 和 4 的核苷酸之間、位置 20 和 21 的核苷酸之間以及位置 21 和 22 的核苷酸之間包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，反義股的 5'-核苷酸之糖的 4'-碳包含磷酸酯類似物。
I. 靶向 HBsAg mRNA 的雙股寡核苷酸
有多種寡核苷酸的結構可用於如本文所公開之醫藥組合中靶向 HBsAg mRNA 表現，包括 RNAi、反義、miRNA 等。本文或其他地方所描述之任何結構，均可用作結合或靶向本文所述之序列的架構。用於靶向 HBV 抗原表現（例如，經由 RNAi 途徑）的雙股寡核苷酸，其通常具有彼此形成雙股螺旋的有義股和反義股。在一些實施例中，正義和反義股不是共價連接的。然而，在一些實施例中，正義和反義股是共價連接的。
在本發明的一些實施例中，用於降低 HBsAg mRNA 表現的雙股寡核苷酸從事 RNA 干擾 (RNAi)。例如，已被開發出之 RNAi 寡核苷酸每股具有 19 至 25 個核苷酸的大小，並具有至少一個 1 至 5 個核苷酸的 3' 突出（參見，例如，美國專利號 8,372,968）。更長的寡核苷酸也已被開發出來，其藉由切丁進行加工以產生活性 RNAi 產物（參見，例如，美國專利號 8,883,996）。進一步的工作產生出延伸的雙股寡核苷酸，其中至少一股的至少一端延伸超出了雙股螺旋靶向區域，包括其中一股中含熱力學穩定之四鹼基環圈結構的結構（參見，例如，美國專利號 8,513,207 及 8,927,705，以及 WO2010033225，其所揭露之該些寡核苷酸藉由引用併入本文）。這些結構可以包括單股延伸（在分子的一側或兩側）以及雙股延伸。
在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸是可被切丁酶切割的。此類寡核苷酸在有義股的 3' 端可以具有突出（例如，長度為 1、2 或 3 個核苷酸）。此類寡核苷酸（例如，siRNA）可包含與目標 RNA 反義之 21 個核苷酸引導股以及互補的隨從股，其中兩股退火以形成 19-bp 雙股螺旋，且在一個或兩個 3' 端具有 2 個核苷酸突出。還可以使用更長的寡核苷酸設計，包括具有 23 個核苷酸之引導股和 21 個核苷酸之隨從股的寡核苷酸，其中分子的右側（隨從股的 3' 端/引導股 5' 端）有一個鈍端，且在分子的左側（隨從股的 5' 端/引導股的 3' 端）有 2 個核苷酸 3'- 引導股突出。在這樣的分子中，有 21 個鹼基對的雙股螺旋區域。參見，例如，US9012138、US9012621 和 US9193753，它們各自的相關揭露併入本文。
在一些實施例中，本文所揭露之寡核苷酸可包含正義和反義股，其長度都在 17 至 26 個（例如 17 至 26、20 至 25、19 至 21 或 21 至 23）核苷酸範圍內。在一些實施例中，正義和反義股具有相等的長度。在一些實施例中，對於具有長度均在 21 至 23 個核苷酸範圍內的正義和反義股寡核苷酸，其在正義、反義或正義和反義股兩者上具有長度為 1 或 2 個核苷酸的 3' 突出。在一些實施例中，寡核苷酸具有 23 個核苷酸之引導股以及 21 個核苷酸之隨從股，其中分子的右側（隨從股的 3 '端/引導股 5' 端）有一個鈍端，且在分子的左側（隨從股的 5' 端/引導股的 3' 端）有 2 個核苷酸 3' 引導股突出。在這樣的分子中，有 21 個鹼基對的雙股螺旋區域。在一些實施例中，寡核苷酸包含 25 個核苷酸之有義股以及 27 個核苷酸之反義股，當藉由切丁酶在該寡核苷酸上作用時，其導致反義股被併入到成熟的 RISC 中。
與本文所揭露之組成物和方法一起使用的其他寡核苷酸設計包括：16-聚體 siRNA（參見，例如，Nucleic Acids in Chemistry and Biology.Blackburn（編輯），Royal Society of Chemistry，2006）、shRNA（例如，具有 19 bp 或更短的主幹；參見，例如，Moore 等人，Methods Mol. Biol. 2010; 629:141-158）、鈍端 siRNAs（例如，長度為 19 bps；參見：例如，Kraynack 和 Baker，RNA 卷 12，第 163-176 頁 (2006)）、不對稱的 siRNA（aiRNA；參見，例如，Sun 等人，Nat.Biotechnol. 26，1379–1382 (2008)）、不對稱之較短的雙股螺旋 siRNA（參見，例如，Chang 等人，Mol Ther.，2009 年 4 月，17(4): 725-32）、分叉 siRNAs（參見，例如，Hohjoh，FEBS Letters，第 557 卷，第 1-3 期，2004 年 1 月，第 193-198 頁）、單股 siRNA (Elsner,Nature Biotechnology 30, 1063 (2012))、啞鈴形環狀 siRNA（參見，例如，Abe 等人，J Am Chem Soc 129: 15108-15109 (2007)）和小內部分段干擾 RNA（sisiRNA；參見，例如，Bramsen 等人，Nucleic Acids Res.，2007 年 9 月，35(17): 5886-5897）。前述每個參考文獻中相關之揭露全文，藉由引用併入本文。寡核苷酸結構之其他非限制性實例可用於一些實施例的醫藥組合中，以降低或抑制 HBsAg 表現，該寡核苷酸結構為微小 RNA (miRNA)、小髮夾 RNA (shRNA) 和短 siRNA（參見，例如，Hamilton 等人，Embo J., 2002, 21(17): 4671-4679；也參見美國申請號 20090099115）。
a. 反義股
在一些實施例中，寡核苷酸的反義股可被稱為「引導股」。例如，若反義股可以與 RNA 誘導的緘黙化複合體 (RISC) 接合以及與 Argonaut 蛋白結合，或者與一種或多種類似的因子接合或結合，並指揮目標基因沉默，則該反義股可以稱為引導股。在一些實施例中，與引導股互補的有義股可以被稱為「隨從股」。
在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸包含長度為最多 50 個核苷酸（例如，長度最多 30、最多 27、最多 25、最多 21 或最多 19 個核苷酸）的反義股。在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸包含長度至少 12 個核苷酸（例如，長度為至少 12、至少 15、至少 19、至少 21、至少 25 或至少 27 個核苷酸）的反義股。在一些實施例中，本文所揭露之寡核苷酸的反義股，其長度在 12 至 50 或 12 至 30（例如 12 至 30、11 至 27、11 至 25、15 至 21、15 至 27、17 至 21、17 至 25、19 至 27 或 19 至 30）個核苷酸的範圍內。在一些實施例中，本文所揭露之任何寡核苷酸的反義股，其長度是 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 個核苷酸。
在一些實施例中，反義股包含與以下所示之序列（顯示 5' 至 3'）互補之區域：AATCCTCACA( SEQ ID NO: 43)。在一些實施例中，反義股包含以下所示的序列（顯示 5' 至 3'）：UGUGAGGAUU( SEQ ID NO: 44)。在一些實施例中，反義股包含以下所示的序列（顯示 5' 至 3'）：TGTGAGGATT( SEQ ID NO: 45)。
在一些實施例中，用於減少 HBsAg mRNA 表現的寡核苷酸可包含反義股，該反義股具有與 SEQ ID NO: 43 所示序列互補之區域，以及在其 3' 末端具有一個或兩個不互補的核苷酸。在一些實施例中，反義股包含 SEQ ID NO: 36-38 中任一項所示的核苷酸序列。
在一些實施例中，用於降低 HBsAg mRNA 表現的寡核苷酸可包含反義股，該反義股具有與 SEQ ID NO: 43 所示序列互補之區域，其中該反義股不具有任何以下所示的序列（顯示 5' 至 3'）：TATTGTGAGGATTCTTGTCA( SEQ ID NO: 46)；CGGTATTGTGAGGATTCTTG( SEQ ID NO: 47)；TGTGAGGATTCTTGTCAACA( SEQ ID NO: 48)；UAUUGUGAGGAUUUUUGUCAA( SEQ ID NO: 49)；UGCGGUAUUGUGAGGAUUCTT( SEQ ID NO: 50)；ACAGCATTGTGAGGATTCTTGTC( SEQ ID NO: 51)；UAUUGUGAGGAUUUUUGUCAACA( SEQ ID NO: 52)；AUUGUGAGGAUUUUUGUCAACAA( SEQ ID NO: 53)；和 UUGUGAGGAUUUUUGUCAACAAG( SEQ ID NO: 54)。在一些實施例中，反義股與 SEQ ID NO: 36、37 或 38 所示的核苷酸序列相差不超過三個核苷酸。
b. 有義股
在一些實施例中，雙股寡核苷酸可具有長度最多 40 個核苷酸的有義股（例如，長度最多 40、最多 35、最多 30、最多 27、最多 25、最多 21、最多 19、最多 17 個或最多 12 個核苷酸）。在一些實施例中，寡核苷酸可具有長度至少 12 個核苷酸的有義股（例如，長度至少 12、至少 15、至少 19、至少 21、至少 25、至少 27、至少 30、至少 35 個或至少 38 個核苷酸）。在一些實施例中，寡核苷酸可具有長度在 12 至 50 個核苷酸範圍內的有義股（例如，12 至 40、12 至 36、12 至 32、12 至 28、15 至 40、15 至 36、15 至 32、15 至 28、17 至 21、17 至 25、19 至 27、19 至 30、20 至 40、22 至 40、25 至 40 或 32 至 40）。在某些實施例中，寡核苷酸可具有長度在 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 個核苷酸的有義股。在一些實施例中，寡核苷酸的有義股長於 27 個核苷酸（例如 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 個核苷酸）。在一些實施例中，寡核苷酸的有義股長於 25 個核苷酸（例如 26、27、28、29 或 30 個核苷酸）。
在一些實施例中，有義股在其 3' 端包括主幹-環圈。在一些實施例中，有義股在其 5' 端包括主幹-環圈。在一些實施例中，包含主幹環圈之一股，其長度為 2 至 66 個核苷酸範圍內（例如，2 至 66、10 至 52、14 至 40、2 至 30、4 至 26、8 至 22、12 至 18、10 至 22、14 至 26 或 14 至 30 個核苷酸長）。在某些實施例中，包含主幹環圈之一股，其為 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸長。在某些實施例中，主幹包含長度為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 或 14 個核苷酸的雙股螺旋。在一些實施例中，主幹-環圈為分子提供了更好之針對降解（例如，酶降解）的保護，並促進靶向特徵以遞輸至目標細胞。例如，在一些實施例中，環圈提供額外的核苷酸，在實質上不影響寡核苷酸之基因表現抑制活性上，可以在該核苷酸上進行修飾。在某些實施例中，本文所提供之寡核苷酸，其中之有義股包含（例如，在其 3' 端）主幹-環圈，該主幹–環圈表示為：S1 -L-S2 ，其中 S1 與 S2 互補，並且 L 在 S1 和 S2 之間形成長度為 10 個核苷酸的環圈（例如，長度為 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個核苷酸）。
在一些實施例中，主幹-環圈之環圈 （L） 為四鹼基環圈（例如在帶切口的四鹼基環圈結構內）。四鹼基環圈可包含核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、經修飾之核苷酸及其組合。通常，四鹼基環圈具有 4 至 5 個核苷酸。
c. 雙股螺旋長度
在一些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其長度為至少 12（例如，至少 15、至少 16、至少 17、至少 18、至少 19、至少 20 或至少 21）個核苷酸。在一些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其長度在 12 至 30 個核苷酸的範圍內（例如，長度在 12 至 30、12 至 27、12 至 22、15 至 25、18 至 30、18 至 22、18 至 25、18 至 27、18 至 30、19 至 30 或 21 至 30 個核苷酸）。在一些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其長度為 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸。在一些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其並不橫跨有義股及/或反義股的整個長度。在一些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其橫跨正義或反義股的整個長度。在某些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其橫跨有義股及反義股兩者的整個長度。
d. 寡核苷酸端
在一些實施例中，寡核苷酸包含正義和反義股，可在有義股或反義股、或者有義股和反義股兩者上具有 3' 突出。在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸具有一個 5' 末，該 5' 端與其他 5' 端相比在熱力學上不穩定。在一些實施例中，提供不對稱的寡核苷酸，其包括在有義股之 3' 端的鈍端，以及在反義股之 3' 端的突出。在一些實施例中，反義股上 3' 突出的長度為 1 至 8 個核苷酸（例如，長度為 1、2、3、4、5、6、7 或 8 個核苷酸）。
通常，用於 RNAi 的寡核苷酸在反義（引導）股的 3' 端具有兩個核苷酸突出。然而，其他突出也是可能的。在一些實施例中，突出是 3' 突出，其包含長度在 1 至 6 個之間的核苷酸，任選地為 1 至 5、1 至 4、1 至 3、1 至 2、2 至 6、2 至 5、2 至 4，2 至 3、3 至 6、3 至 5、3 至 4、4 至 6、4 至 5、5 至 6 個核苷酸，或者 1、2、3、4、5 或 6 個核苷酸。然而，在一些實施例中，突出是 5' 突出，其包含長度在 1 至 6 個之間的核苷酸，任選地為 1 至 5、1 至 4、1 至 3、1 至 2、2 至 6、2 至 5、2 至 4，2 至 3、3 至 6、3 至 5、3 至 4、4 至 6、4 至 5、5 至 6 個核苷酸，或者 1、2、3、4、5 或 6 個核苷酸。
在一些實施例中，正義及/或反義股之 3' 端或 5' 端的一個或多個（例如，2、3、4）末端核苷酸被修飾。例如，在一些實施例中，反義股之 3' 端的一個或兩個末端核苷酸被修飾。在一些實施例中，反義股之 3' 端的最後一個核苷酸被修飾，例如，包含 2’–修飾，例如，2'–O–甲氧基乙基。在一些實施例中，反義股之 3' 端的最後一個或兩個末端核苷酸與目標互補。在一些實施例中，反義股之 3' 端的最後一個或兩個核苷酸與目標不互補。
在一些實施例中，提供在有義股 3' 端上具有帶切口的四鹼基環圈結構之雙股寡核苷酸，且在其反義股的 3' 端具有兩個末端突出的核苷酸。在一些實施例中，該兩個末端突出的核苷酸是 GG。通常，該反義股的兩個末端 GG 核苷酸之一或兩者與目標互補或不互補。
在一些實施例中，正義或反義股的 5' 端及/或 3' 端具有反向的帽核苷酸。
在一些實施例中，在正義及/或反義股的 3' 端或 5' 端的末端核苷酸之間，提供一個或多個（例如 2、3、4、5、6）經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，在正義及/或反義股的 3' 端或 5' 端的突出核苷酸之間，提供經修飾的核苷酸間鍵聯。
e. 錯配
在一些實施例中，寡核苷酸可在正義和反義股之間具有一個或多個（例如 1、2、3、4、5）錯配。如果正義和反義股之間存在一個以上之錯配，則它們可以被置於連續的位置（例如，2、3 或更多個接續），或者散佈在整個互補之區域中。在一些實施例中，有義股的 3' 末端包含一個或多個錯配。在一個實施例中，在有義股的 3' 末端併入兩個錯配。在一些實施例中，可能透過促進切丁的加工，在寡核苷酸有義股之 3' 端片段的鹼基錯配或去穩定作用，而改善 RNAi 中合成雙股螺旋的效力。
在一些實施例中，反義股可具有與 HBsAg 轉錄物有互性補之區域，與相應的轉錄物序列相比，其包含一個或多個錯配。只要寡核苷酸在適當的雜交條件下，保持與轉錄物形成互補之鹼基對的能力，該寡核苷酸上的互補之區域可具有最多 1 個、最多 2 個、最多 3 個、最多 4 個、最多 5 個等的錯配。可替代地，只要寡核苷酸在適當的雜交條件下，保持與 HBsAg mRNA 形成互補之鹼基對的能力，該寡核苷酸的互補之區域可以具有不超過 1、不超過 2、不超過 3、不超過 4 或不超過 5 個錯配。在一些實施例中，若在有互補性的區域中具有一個以上的錯配，只要寡核苷酸在適當的雜交條件下，保持與 HBsAg mRNA 形成互補之鹼基對的能力，則該些錯配可以被置於連續的位置（例如，2、3、4 或更多個接續），或者散佈在整個互補之區域中。
II. 單股寡核苷酸
在一些實施例中，如本文所述之用於降低 HBsAg 表現的 RNAi 寡核苷酸，是具有與 HBsAg mRNA 有互補性的單股寡核苷酸。這樣的結構可以包括但不限於單股 RNAi 寡核苷酸。近期的成果已經證明單股 RNAi 寡核苷酸的活性（參見，例如，Matsui 等人（2016 年 5 月），Molecular Therapy，卷 24(5)，946-955）。
儘管這種單股 RNAi 寡核苷酸在技術上可以被認為是反義寡核苷酸，但它仍可以透過 RNA 干擾機制來發揮作用，並具有如本文所述之 RNAi 寡核苷酸的特徵。
2. 本發明之特異性 RNAi 寡核苷酸
為了便於參考並避免不必要的重複，本文中闡述之本發明的一些 RNAi 寡核苷酸的定義，以下也稱為「RNAi ID NOs」。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的 RNAi 寡核苷酸是靶向 HBV 的寡核苷酸。該 RNAi 寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO: 1 。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的 RNAi 寡核苷酸是靶向 HBsAg mRNA 的寡核苷酸。該 RNAi 寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO: 2 。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的 RNAi 寡核苷酸是降低 HBsAg mRNA 表現的寡核苷酸。該 RNAi 寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO: 3 。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的 RNAi 寡核苷酸是包含長度為 19 至 30 個核苷酸之反義股的寡核苷酸，其中該反義股包含與 ACAANAAUCCUCACAAUA (SEQ ID NO: 33) 所示之 HBsAg mRNA 序列互補之區域。該 RNAi 寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO: 4 。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的 RNAi 寡核苷酸是用於降低 HBsAg mRNA 表現的寡核苷酸，該寡核苷酸包含長度為 19 至 30 個核苷酸的反義股，其中該反義股包含與 ACAANAAUCCUCACAAUA (SEQ ID NO: 33) 所示之 HBsAg mRNA 序列互補之區域。該 RNAi 寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO: 5 。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的 RNAi 寡核苷酸是用於降低 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) mRNA 表現的寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域的有義股，其中： 該有義股由如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列組成，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之硫代磷酸酯鍵聯，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸之各者經結合至單價 GalNac 部分；並且 該反義股由如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列組成，且其包含在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 的經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間、介於在位置 2 與 3 的核苷酸之間、介於在位置 3 與 4 的核苷酸之間、介於在位置 20 與 21 的核苷酸之間、及介於在位置 21 與 22 的核苷酸之間之硫代磷酸酯鍵聯， 其中反義股的 5′–核苷酸之糖的 4′–碳包含甲氧基膦酸酯 (MOP)。該 RNAi 寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO: 6 。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的 RNAi 寡核苷酸，是包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股的寡核苷酸，其中： 該有義股包含如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13及 17 的經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸中之各者經結合至單價 GalNac 部分，其中，該 –GAAA– 序列包含下列結構：
Figure 02_image009
；並且 該反義股包含如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列，且其包含在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 的經 2′-氟修飾之核苷酸，在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸，及介於核苷酸 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21及 21 與 22 之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳具有下列結構：
Figure 02_image011
。
該 RNAi 寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO: 7 。在一個實施例中，RNAi ID NO: 7 是用於降低 HBsAg mRNA 表現的寡核苷酸。在一個實施例中，RNAi ID NO: 7 的有義股或反義股或反義和有義股兩者，是由上文對 RNAi ID NO: 7 所描述之該些股的各個序列所組成。在 RNAi ID NO: 7 的一個實施例中，SEQ ID NO: 41 是 5’-GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC-3’ 及/或 SEQ ID NO: 38 是 5’-UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG-3’。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的 RNAi 寡核苷酸具有圖 29A 所示的結構。該 RNAi 寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO: 8 。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的 RNAi 寡核苷酸是寡核苷酸 HBV(s)-219。該 RNAi 寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO: 9 。
3. 本發明之 RNAi 試劑的寡核苷酸修飾
在本節中討論的修飾，對於在本發明之 RNAi 寡核苷酸中的實施是特別優選的。
寡核苷酸可以以各種方式修飾，以改善或控制特異性、穩定性、遞輸、生體可用率、核酸酶降解的抗性、免疫原性、鹼基配對特性、RNA 分佈和細胞攝入以及與治療或研究用途相關的其他特徵。參見，例如，Bramsen 等人，Nucleic Acids Res., 2009, 37, 2867-2881；Bramsen 和 Kjems (Frontiers in Genetics,3(2012): 1-22)。因此，在一些實施例中，本揭露之治療性寡核苷酸可包括一種或多種合適的修飾。在一些實施例中，經修飾的核苷酸在其鹼基（或核鹼基）、糖（例如核糖、去氧核糖）或磷酸基團中具有修飾。
寡核苷酸上的修飾數目和那些核苷酸修飾的位置可能影響寡核苷酸的性質。例如，寡核苷酸可以藉由將它們結合或包裹在脂質奈米顆粒 (LNP) 或類似載體中而在體內遞輸。然而，當寡核苷酸沒有 LNP 或類似載體的保護時，將至少一些核苷酸進行修飾會是有利的。因此，在本文所提供的任何治療性寡核苷酸的某些實施例中，寡核苷酸之所有或實質上所有核苷酸均被修飾。在某些實施例中，多於一半的核苷酸被修飾。在某些實施例中，少於一半的核苷酸被修飾。通常，在無包覆遞輸的情況下，每個糖都在 2' 位置被修飾。這些修飾可以是可逆的或不可逆的。在一些實施例中，本文所揭露之寡核苷酸具有足以造成所需特徵（例如，防止酶降解、在體內投予後靶向所需細胞的能力及/或熱力學穩定性）之數量和類型的經修飾之核苷酸。
I. 糖修飾
在一些實施例中，經修飾的糖（本文也稱為醣類似物）包含經修飾的去氧核糖或核糖部分，例如其中一個或多個修飾發生在糖的 2’、3’、4' 及/或 5’ 碳的位置。在一些實施例中，經修飾的糖還可以包括非天然的替代碳結構，例如那些存在於鎖核酸（「LNA」）（參見，例如，Koshkin 等人 (1998)，Tetrahedron 54, 3607-3630）、未鎖核酸（「UNA」）（參見，例如，Snead 等人 (2013)，Molecular Therapy – Nucleic Acids, 2, e103）、以及橋接核酸（「BNA」）（參見，例如，Imanishi 和 Obika (2002), The Royal Society of Chemistry, Chem. Commun.,1653-1659）。Koshkin 等人、Snead 等人以及 Imanishi 和 Obika，針對他們涉及糖修飾的揭露藉由引用併入本文。
在一些實施例中，糖中的核苷酸修飾包括 2’–修飾。2'–修飾可以是 2'–胺基乙基、2'–氟、2'–O–甲基、2’–O–甲氧基乙基和 2’–去氧–2’–氟–β–d–阿糖核酸。通常，該修飾是 2'–氟、2'–O–甲基或 2'–O–甲氧基乙基。在一些實施例中，糖中的修飾包括糖環的修飾，其可以包含糖環之一個或多個碳的修飾。例如，核苷酸之糖的修飾可以包含糖的 2'–氧連接至糖的 1'–碳或 4'–碳，或 2'–氧經由乙烯或亞甲基橋連接至 1'–碳或 4’–碳。在一些實施例中，經修飾的核苷酸具有缺乏 2'–碳至 3'–碳鍵結的非環糖。在一些實施例中，經修飾的核苷酸置具有巰醇基團，例如在糖的 4' 位置。
在一些實施例中，末端 3'–端基團（例如 3'–羥基）是磷酸基團或其他基團，其可用於例如連附連接子、轉接子或標記，或用於指揮寡核苷酸連接至另一個核酸。
II. 5′ 末端磷酸鹽
在一些實施例中，寡核苷酸的 5’–末端磷酸基團可增強與 Argonaut 2 的相互作用。然而，包含 5’–磷酸基團的寡核苷酸易於經由磷酸酶或其他酶降解，其可限制它們在體內的生體可用率。在一些實施例中，寡核苷酸包含抗此類降解的 5' 磷酸鹽之類似物。在一些實施例中，磷酸酯類似物可以是氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二醯基膦酸酯。在某些實施例中，寡核苷酸股的 5' 端連附至模擬天然 5’–磷酸基團之靜電和空間特性的化學部分（「磷酸鹽模擬物」）（參見，例如，Prakash 等人 (2015)，Nucleic Acids Res.,Nucleic Acids Res.，2015 年 3 月 31 日，43(6): 2993-3011，其與磷酸酯類似物有關的內容，藉由引用併入本文）。許多可以連附到 5' 端的磷酸鹽模擬物已被開發出來（參見，例如，美國專利號 8,927,513，其與磷酸酯類似物有關的內容，藉由引用併入本文）。針對寡核苷酸之 5' 端已經開發出其他修飾（參見，例如，WO 2011/133871，其與磷酸酯類似物有關的內容，藉由引用併入本文）。在某些實施例中，羥基連附至寡核苷酸的 5' 端。
在一些實施例中，寡核苷酸在糖的 4’–碳位置具有磷酸類似物（稱為「4’–磷酸酯類似物」）。參見，例如，2016 年 9 月 2 日提交之題為4′-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same 的美國臨時申請號 62/383,207 和 2016 年 9 月 12 日提交之題為4′-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same 的美國臨時申請號 62/393,401，其各自與磷酸酯類似物有關的內容，藉由引用併入本文。在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸在 5’–末端核苷酸包含 4’–磷酸酯類似物。在一些實施例中，磷酸酯類似物是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子鍵聯至糖部分（例如，在其 4'–碳）或其類似物。在其他實施例中，4'–磷酸酯類似物是硫代甲基膦酸酯或胺基甲基膦酸酯，其中硫代甲基的硫原子或胺基甲基的氮原子與糖部分或其類似物的 4’–碳鍵聯。在某些實施例中，4’–磷酸酯類似物是氧甲基膦酸酯。在一些實施例中，氧甲基膦酸酯由式 -O-CH2 -PO(OH)2 或 –O–CH2 –PO(OR)2 表示，其中 R 獨立地選自 H、CH3 、烷基、CH2 CH2 CN、CH2 OCOC(CH3 )3 、CH2 OCH2 CH2 Si(CH3 )3 或保護基。在某些實施例中，烷基為 CH2 CH3 。更典型地，R 獨立地選自 H、CH3 或 CH2 CH3 。
在某些實施例中，連附至寡核苷酸的磷酸酯類似物是甲氧基膦酸酯 (MOP)。在某些實施例中，連附至寡核苷酸的磷酸酯類似物是 5' 單–甲基保護的 MOP。在一些實施例中，可以在例如引導（反義）股的第一位置使用以下包含磷酸酯類似物的尿苷核苷酸：
Figure 02_image013
， 該經修飾的核苷酸稱為[MePhosphonate-4O-mU]或 5'-甲氧基、膦酸酯–4'氧基–2'–O–甲基尿苷。
III. 經修飾的核苷間鍵聯
在一些實施例中，磷酸修飾或取代可以產生包含至少一個（例如，至少 1、至少 2、至少 3 或至少 5 個）經修飾之核苷酸間鍵聯的寡核苷酸。在一些實施例中，本文所揭露之任何寡核苷酸包含 1 至 10（例如，1 至 10、2 至 8、4 至 6、3 至 10、5 至 10、1 至 5、1 至 3 或 1 至 2）個經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，本文所揭露之任何寡核苷酸包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個經修飾的核苷酸間鍵聯。
經修飾的核苷酸間鍵聯可以是硫代磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、硫代烷基膦酸酯鍵聯、硫代烷基磷酸三酯鍵聯、亞磷醯胺鍵聯、膦酸酯鍵聯或硼酸磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，本文所揭露之任何一種寡核苷酸的至少一個經修飾的核苷酸間鍵聯是硫代磷酸酯鍵聯。
IV. 鹼基修飾
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸具有一個或多個經修飾的核鹼基。在一些實施例中，經修飾的核鹼基（在本文中也稱為鹼基類似物）在核苷酸糖部分的 1' 位置連接。在某些實施例中，經修飾的核鹼基是含氮鹼基。在某些實施例中，經修飾的核鹼基不包含氮原子。參見，例如，美國專利申請號 20080274462。在一些實施例中，經修飾的核苷酸包含通用鹼基。然而，在某些實施例中，經修飾的核苷酸不包含核鹼基（無鹼基）。
在一些實施例中，通用鹼基是位於經修飾之核苷酸中核苷酸糖部分之 1' 位置上的雜環部分，或核苷酸糖部分取代中的等同位置，當存在於雙股螺旋中時，其可位於相對於一種類型以上的鹼基，而不會實質上改變雙股螺旋的結構。在一些實施例中，與目標核酸完全互補的參考單股核酸（例如，寡核苷酸）相比，含有通用鹼基的單股核酸與目標核酸所形成之雙股螺旋，相較於該單股核酸與互補之核酸所形成之雙股螺旋，具有較低的 Tm 。然而，在一些實施例中，與其中通用鹼基已被鹼基替代以產生單個錯配的參考單股核酸相比，含有通用鹼基的單股核酸與目標核酸所形成之雙股螺旋，相較於該單股核酸與含錯配鹼基之核酸所形成之雙股螺旋，具有較高的 Tm 。
通用結合核苷酸的非限制性實例包括肌苷、1-β-D-核呋喃糖苷基-5-硝基吲哚及/或 1-β-D-核呋喃糖苷基-3-硝基吡咯（美國專利申請公開號 20070254362，授予 Quay 等人；Van Aerschot 等人，An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguousnucleoside, Nucleic Acids Res.，1995 年 9 月 11 日，23(21):4363-70；Loakes 等人，3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR, Nucleic Acids Res.，1995 年 7 月 11 日，23(13):2361-6；Loakes 和 Brown，5-Nitroindole as an universal base analogue, Nucleic Acids Res.，1994 年 10 月 11 日，22(20):4039-43。前述中與鹼基修飾有關的揭露，各自藉由引用併入本文。
V. 可逆的修飾
儘管可以進行某些修飾以保護寡核苷酸在到達目標細胞之前不受體內環境的影響，但是一旦寡核苷酸到達目標細胞的胞質液，它們可以降低寡核苷酸的效力或活性。可以進行可逆的修飾，使得分子在細胞外保留所期望的特性，然後在進入細胞的胞質環境時將其除去。可以藉由例如細胞內酶的作用或藉由細胞內部的化學條件（例如，透過細胞內麩胱甘肽的還原）來去除可逆的修飾。
在一些實施例中，可逆地經修飾的核苷酸包含麩胱甘肽敏感部分。通常，核酸分子已用環狀二硫化物部分進行化學修飾，以掩蓋核苷酸間二磷酸鍵聯所產生的負電荷，並改善細胞攝入和核酸酶抗性。參見最初給予 Traversa Therapeutics, Inc.（「Traversa」）的美國公開申請號 2011/0294869，Solstice Biologics, Ltd. （「Solstice」）的 PCT 公開號 WO 2015/188197，Meade 等人，Nature Biotechnology, 2014, 32:1256-1263（「Meade」），Merck Sharp & Dohme Corp 的 PCT 公開號 WO 2014/088920，其關於此類修飾之揭露，各自藉由引用併入本文。核苷酸間二磷酸鍵聯的此類可逆的修飾，被設計成藉由胞質液的還原環境在細胞內被切割（例如麩胱甘肽）。較早的實例包括中和磷酸三酯修飾，據報導該修飾在細胞內是可切割的（Dellinger 等人，J . Am.Chem.Soc. 2003, 125:940-950）。
在一些實施例中，此類可逆的修飾在體內投予期間提供保護（例如，透過血液及/或細胞之胞溶體/胞內體的腔室轉運），其中寡核苷酸將暴露於核酸酶和其他惡劣的環境條件（例如 pH）。當將釋放到細胞之胞質液中的麩胱甘肽水準比在細胞外空間更高時，修飾被逆轉，結果是寡核苷酸被切割。與使用不可逆的化學修飾所能獲得的選擇相比，使用可逆的麩胱甘肽敏感部分，可以將空間較大的化學基團引入感興趣的寡核苷酸中。這是因為這些較大的化學基團將在胞質液中被去除，因此不應干擾細胞胞質液內寡核苷酸的生物學活性。結果，這些較大的化學基團可以被設計以賦予核苷酸或寡核苷酸各種優點，例如核酸酶抗性、親脂性、電荷、熱穩定性、特異性和降低的免疫原性。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分的結構可以被設計以改變其釋放的動力學。
在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分連附至核苷酸的糖  在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分連附至經修飾的核苷酸之糖的 2'-碳。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分位於糖的 5'-碳上，特別是當經修飾的核苷酸是寡核苷酸的 5'-末端核苷酸時。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分位於糖的 3'-碳上，特別是當經修飾的核苷酸是寡核苷酸的 3'-末端核苷酸時。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分包含磺醯基。參見，例如於 2016 年 8 月 23 日提交的名稱為 Compositions Comprising Reversibly Modified Oligonucleotides and Uses Thereof 的美國臨時申請號 62/378,635，其相關揭露內容藉由引用併入本文。
IV. 靶向配體
在一些實施例中，可以期望將本揭露之寡核苷酸靶向一個或多個細胞或一個或多個器官。這樣的策略可以幫助避免在其他器官中之不期望的作用，或者可以避免寡核苷酸在不會有益於寡核苷酸的細胞、組織或器官中的不當損失。因此，在一些實施例中，可以修飾本文所揭露之寡核苷酸以促進靶向特定組織、細胞或器官，例如促進寡核苷酸向肝臟的遞輸。在某些實施例中，本文所揭露之寡核苷酸可以被修飾以促進寡核苷酸向肝臟的肝細胞的遞輸。在一些實施例中，寡核苷酸包含與一個或多個靶向配體結合的核苷酸。
靶向配體可以包含碳水化合物、胺基糖、膽固醇、肽、多肽、蛋白或蛋白的部分（例如抗體或抗體片段）或脂質。在一些實施例中，靶向配體是適體。例如，靶向配體可以是用於靶向腫瘤血管系統或神經膠質瘤細胞的 RGD 肽、用於靶向腫瘤血管系統或氣孔的 CREKA 肽、運鐵蛋白，乳鐵蛋白或靶向 CNS 血管系統上表現之運鐵蛋白受體的適體，或靶向神經膠質瘤細胞上之 EGFR 的抗 EGFR 抗體。在某些實施例中，靶向配體是一個或多個 GalNAc 部分。
在一些實施例中，寡核苷酸的 1 個或更多個（例如 1、2、3、4、5 或 6）核苷酸各自與單獨的靶向配體結合。在一些實施例中，寡核苷酸的 2 至 4 個核苷酸各自與單獨的靶向配體結合。在一些實施例中，靶向配體在正義或反義股的任一端與 2 至 4 個核苷酸結合（例如，配體在正義或反義股的 5' 或 3' 端與 2 至 4 個核苷酸的突出或延伸結合），使得靶向配體類似於牙刷的刷毛，而寡核苷酸類似於牙刷。例如，寡核苷酸可在有義股的 5' 或 3' 端包含主幹-環圈，且主幹之環圈的 1、2、3 或 4 個核苷酸可分別與靶向配體結合。
在一些實施例中，可以期望將降低 HBV 抗原表現的寡核苷酸靶向個體的肝細胞。任何合適的肝細胞靶向部分均可用於該目的。
GalNAc 是去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR) 的高親和力配體，其主要在肝細胞的正弦表面表現，並在結合、內化作用和隨後循環醣蛋白（包含末端半乳糖或 N-乙醯半乳胺糖殘基（去唾液酸糖蛋白））的清除中具有主要作用。GalNAc 部分與本揭露之寡核苷酸的結合作用（間接或直接），可用於將這些寡核苷酸靶向到在這些肝細胞上表現的 ASGPR。
在一些實施例中，本即時揭露之寡核苷酸直接或間接結合至單價 GalNAc。在一些實施例中，寡核苷酸直接或間接結合至一個以上的單價 GalNAc（即，結合至 2、3 或 4 個單價 GalNAc 部分，且通常結合至 3 或 4 個單價 GalNAc部分）。在一些實施例中，本即時揭露之寡核苷酸與一個或多個二價 GalNAc、三價 GalNAc 或四價 GalNAc 部分結合。
在一些實施例中，寡核苷酸的 1 個或更多個(例如 1、2、3、4、5 或 6 個)核苷酸各自與 GalNAc 部分結合。在一些實施例中，主幹-環圈之環圈 (L) 的 2 至 4 個核苷酸各自與單獨的 GalNAc 結合。在一些實施例中，靶向配體在正義或反義股的任一端與 2 至 4 個核苷酸結合（例如，配體在正義或反義股的 5' 或 3' 端與 2 至 4 個核苷酸的突出或延伸結合），使得 GalNAc 部分類似於牙刷的刷毛，而寡核苷酸類似於牙刷。例如，寡核苷酸可在有義股的 5' 或 3' 端包含主幹-環圈，且主幹之環圈的 1、2、3 或 4 個核苷酸可分別與 GalNAc 部分結合。在一些實施例中，GalNAc 部分與有義股的核苷酸結合。例如，可以將四個 GalNAc 部分與有義股之四鹼基環圈中的核苷酸結合，其中每個 GalNAc 部分都與一個核苷酸結合。
在一些實施例中，本文之寡核苷酸包含連附至胍核苷酸的單價 GalNAc，稱為[ademG-GalNAc]或 2'-胺基二乙氧基甲醇-胍-GalNAc，如下所示：
Figure 02_image015
在一些實施例中，本文之寡核苷酸包含連附至腺嘌呤核苷酸的單價 GalNAc，稱為[ademA-GalNAc]或 2'-胺基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所示。
Figure 02_image017
例如，以下顯示這些結合作用的實例，其顯示了包含 5' 至 3' 的核苷酸序列 GAAA（L＝連接子，X＝雜原子）主幹連附點的環圈。例如，這樣的環圈可以存在於例如圖 20 所示分子的位置 27 至 30。在化學式中，
Figure 02_image019
是寡核苷酸股的連附點。
Figure 02_image021
可以使用適當的方法或化學(例如點擊化學)將靶向配體連接至核苷酸。在一些實施例中，使用點擊連接子 (click linker) 將靶向配體與核苷酸結合。在一些實施例中，基於縮醛的連接子用於將靶向配體與本文所述之任一寡核苷酸的核苷酸結合。基於縮醛的連接子已被揭露，例如公開於 2016 年 6 月 23 日的國際專利申請公開號 WO2016100401 A1 中，且其涉及這種連接子之內容，藉由引用併入本文。在一些實施例中，連接子是不穩定的連接子。然而，在其他實施例中，連接子是相當穩定的。
以下顯示了一個實例，為包含 5' 至 3' 核苷酸 GAAA 的環圈，其中 GalNAc 部分使用縮醛連接子連附至環圈的核苷酸。例如，這樣的環圈可以存在於例如圖 20 所示分子的位置 27 至 30。在化學式中，
Figure 02_image023
是寡核苷酸股的連附點。
Figure 02_image025
4. 靶向 HBV 之其他 GalNAc 結合的治療性寡核苷酸
在一個實施例中，本發明之寡核苷酸是治療性寡核苷酸，其靶向 HBV mRNA，並且透過靶向結合物（諸如二價、三價或四價的 GalNAc 簇（圖 1 中的示例））之去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR) 的結合作用，改善向肝臟，特別是向肝細胞的遞輸。WO2015/173208 描述了靶向 HBV mRNA 的此類 GalNAc 結合的反義寡核苷酸 (SEQ ID NO: 1) 及其製作。
在本發明之醫藥組合中，經 GalNAc 結合之治療性寡核苷酸能夠降低 HBV mRNA（目標核酸）的表現，特別是均由 SEQ ID NO: 1 編碼的 B 型肝炎病毒之 HBsAg 和 HBx 的表現。此外，本發明之經 GalNAc 結合之治療性寡核苷酸，優選地能夠從染色體整合的 HBV 片段降低 HBsAg 表現。
在一些實施例中，本發明之經 GalNAc 結合之治療性寡核苷酸與目標核酸結合，且與正常表現水準相比，降低表現至少 10% 或 20%，更優選地與正常表現水準相比，降低表現至少至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 95%（例如在不存在 GalNAc 結合的治療性寡核苷酸的表現水準）。
在一個實施例中，本發明之經 GalNAc 結合之治療性寡核苷酸能夠下調（例如抑制、降低或去除）HBx 或 HBsAg 基因的表現。這種調降通常可以發生在目標細胞，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞，例如肝臟細胞，例如肝細胞，特別是在 HBV 感染的肝細胞中。在一些實施例中，與正常表現水準相比，本發明之經 GalNAc 結合之治療性寡核苷酸結合至目標核酸，並影響至少 50% 表現的抑制，更優選地與正常表現水準相比，影響至少 60%、70%、80%、90% 或 95% 的抑制（例如在不存在 GalNAc 結合的治療性寡核苷酸的表現水準）。可以使用「材料和方法」部分中所描述的方法確定 HBV mRNA 和 HBsAg 和 HBV DNA 的表現水準的調節。
本發明之一方面涉及治療性寡核苷酸，其包含長度為 12 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO: 1 之位置 1530 至 1602 具有至少 90% 的互補性。
在本發明的一個實施例中，治療性寡核苷酸與選自 SEQ ID NO: 1 之位置 1530 至 1602、1530 至 1598、1530 至 1543、1530 至 1544、1531 至 1543、1551 至 1565、1551 至 1566、1577 至 1589、1577 至 1591、1577 至 1592、1578 至 1590、1578 至 1592、1583 至 1598、1584 至 1598、1585 至 1598 及 1583 至 1602 的序列互補。特別是，與位置 1530 至 1544、1531 至 1543、1583 至 1602 和 1583 至 1598 的標靶序列有 100% 互補性的治療性寡核苷酸是有利的。
在某些實施例中，治療性寡核苷酸包含長度為 12 個至 30 個核苷酸的連續序列，該連續序列與目標核酸或標靶序列的區域至少 91% 互補，例如至少 92%，例如至少 93%，例如至少 94%，例如至少 95%，例如至少 96%，例如至少 97%，例如至少 98%， 99% 或 100% 互補。
如果連續核苷酸序列與標靶序列中的連續序列（選自由以下各項所組成之群組：SEQ ID NO: 1 之位置 1530 至 1602、1530 至 1598、1530 至 1543、1530 至 1544、1531 至 1543、1551 至 1565、1551 至 1566、1577 至 1589、1577 至 1591、1577 至 1592、1578 至 1590、1578 至 1592、1583 至 1598、1584 至 1598、1585 至 1598 或 1583 至 1602）完全互補（100% 互補），或在一些實施例中，可在治療性寡核苷酸和標靶序列之間包含一個或兩個錯配，這會是有利的。
在本發明的一個實施例中，經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸，其長度為 13 至 20 個核苷酸，具有至少 12 個核苷酸的連續核苷酸序列，其與 SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO: 28 的位置 1530 至 1602 的連續序列 100% 互補。應當理解的是，如關於 TLR7 促效劑部分所述，該化合物與 TLR7 促效劑結合。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為 13 至 24 個核苷酸，例如長度為 13 至 22，例如 14 至 20 個連續核苷酸。於一較佳實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為 13 至 18 ，例如 15 至 18 個核苷酸。
在一些實施例中，其連續核苷酸序列包含或由以下各項組成：長度為 12 至 20 個核苷酸，例如 12 至 18，例如 13 至 17，例如 13 至 15 個核苷酸，例如長度為 13、14、15、16 或 17 個核苷酸。應當理解的是，連續核苷酸序列始終等於或短於反義寡核苷酸的總長度，因為反義寡核苷酸可以包含另外的核苷，例如，其用作連續核苷酸序列和結合物之間的生物可切割型連接子。應當理解的是，在本文中給定之所有範圍均包括範圍端點。據此，若本文所述之寡核苷酸包括 12 至 30 個核苷酸，則 12 及 30 個核苷酸均包含在內。
在一些實施例中，連續核苷酸序列包含或由以下各項所組成之群組中選擇的序列組成： gcgtaaagagagg (SEQ ID NO: 2)； gcgtaaagagaggt (SEQ ID NO: 3)； cgcgtaaagagaggt (SEQ ID NO 4)； agaaggcacagacgg (SEQ ID NO 5)； gagaaggcacagacgg (SEQ ID NO 6)； agcgaagtgcacacgg (SEQ ID NO 7)； gaagtgcacacgg (SEQ ID NO 8)； gcgaagtgcacacgg (SEQ ID NO 9)； agcgaagtgcacacg (SEQ ID NO: 10)； cgaagtgcacacg (SEQ ID NO 11)； aggtgaagcgaagtgc (SEQ ID NO: 12)； aggtgaagcgaagtg (SEQ ID NO: 13)； aggtgaagcgaagt (SEQ ID NO 14) 及 gcagaggtgaagcgaagtgc (SEQ ID NO: 29)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下項或由以下項組成：長度為 12 至 22 個核苷酸，其具有至少 12 個核苷酸之連續核苷酸序列，與選自由以下各項所組成之群組的序列具有至少 90% 的相同度，較佳地 100% 的相同度： gcgtaaagagagg (SEQ ID NO: 2)； gcgtaaagagaggt (SEQ ID NO: 3) 及 cgcgtaaagagaggt (SEQ ID NO 4)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為 12 至 22 個核苷酸，其具有至少 12 個核苷酸之連續核苷酸序列，與選自以下之序列具有至少 90% 的相同度，較佳地 100% 的相同度： agaaggcacagacgg  (SEQ ID NO 5)；或 gagaaggcacagacgg (SEQ ID NO 6)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下項或由以下項組成：長度為 12 至 22 個核苷酸，其具有至少 12 個核苷酸之連續核苷酸序列，與選自由以下各項所組成之群組的序列具有至少 90% 的相同度，較佳地 100% 的相同度： agcgaagtgcacacgg (SEQ ID NO 7)； gaagtgcacacgg (SEQ ID NO 8)； gcgaagtgcacacgg (SEQ ID NO 9)； agcgaagtgcacacg (SEQ ID NO: 10)； cgaagtgcacacg (SEQ ID NO 11)； aggtgaagcgaagtgc  (SEQ ID NO: 12) aggtgaagcgaagtg (SEQ ID NO: 13)； aggtgaagcgaagt (SEQ ID NO 14) 及 gcagaggtgaagcgaagtgc (SEQ ID NO: 29)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下項或由以下項組成：長度為 12 至 22 個核苷酸，其具有至少 12 個核苷酸之連續核苷酸序列，與選自由以下各項所組成之群組的序列具有至少 90% 的相同度，較佳地 100% 的相同度： aggtgaagcgaagtgc (SEQ ID NO: 12) aggtgaagcgaagtg (SEQ ID NO: 13)； aggtgaagcgaagt (SEQ ID NO 14) 及 gcagaggtgaagcgaagtgc (SEQ ID NO: 29)。
5. 本發明之反義寡核苷酸的寡核苷酸修飾
在本節中討論的修飾，對於在本發明之反義寡核苷酸中的實施是特別優選的。
應當理解的是，例如可以修飾連續的核鹼基序列（模體序列）以增加核酸酶抗性及/或對目標核酸結合的親和力。
在一個實施例中，寡核苷酸的連續核鹼基序列包含至少一個經修飾之核苷間鍵聯。合適的核苷間修飾描述於「定義」部分中「經修飾之核苷間鍵聯」下。如果連續核苷酸序列內的至少 75%（例如所有）的核苷間鍵聯是核苷間鍵聯，則會是有利的。在一些實施例中，寡核苷酸的連續序列中，所有的核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。
用經修飾之核苷和 DNA 核苷來設計本發明之寡核苷酸。有利的是，使用高親和力經修飾之核苷。
在一個實施例中，寡核苷酸包含至少 3 個經修飾之核苷，例如至少 4 個、至少 5 個、至少 6 個、至少 7 個、至少 8 個、至少 9 個、至少 10 個、至少 11 個、至少 12 個至少 13 個、至少 14 個、至少 15 個或至少 16 個經修飾之核苷。在一個實施例中，寡核苷酸包含 3 至 8 個經修飾之核苷，例如 4 至 6 個經修飾之核苷，例如 4、5 或 6 個核苷，例如 5 或 6 個經修飾之核苷。合適的修飾描述在「定義」部分中「經修飾之核苷」、「高親和力經修飾之核苷」、「糖修飾」、「2′ 糖修飾」和「鎖核酸 (LNA)」下。
在一個實施例中，寡核苷酸包含一個或多個糖修飾的核苷，例如 2’ 糖修飾的核苷。本發明之較佳的寡核苷酸包含一個或多個 2’ 糖修飾的核苷，其獨立地選自由以下各項所組成的群組：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟基-DNA、阿拉伯糖核酸 (ANA)、2’-氟基-ANA 及 LNA 核苷。如果一個或多個或所有的經修飾之核苷是鎖核酸 (LNA)，則會是有利的。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸，例如連續核苷酸序列，包含至少一個 LNA 核苷，例如 1、2、3、4、5、6、7 或 8 個 LNA 核苷，例如 2 至 6 個 LNA 核苷，例如 3 至 6 個 LNA 核苷、4 至 6 個 LNA 核苷或 4、5 或 6 個 LNA 核苷。
在一些實施例中，寡核苷酸中至少 75% 經修飾之核苷是 LNA 核苷，例如至少 80%，例如至少 85%，例如至少 90% 經修飾之核苷是 LNA 核苷。在另一個實施例中，寡核苷酸中所有經修飾之核苷均為 LNA 核苷。在另一個實施例中，LNA 核苷選自 β-D-氧基-LNA、硫代-LNA、胺基-LNA、氧基-LNA、ScET 及/或 ENA 於 β-D或α-L 構型或其組合。在另一個實施例中，所有 LNA 核苷均為 β-D-氧基-LNA。在另一個實施例中，胞嘧啶單元是 5-甲基-胞嘧啶。對於寡核苷酸或連續核苷酸序列的核酸酶穩定性而言，有利的是在核苷酸序列的 5’ 端具有至少 1 個 LNA 核苷並且在核苷酸序列的 3’ 端具有至少 2 個 LNA 核苷。
6. 用於核糖核酸酶 H 招募的反義寡核苷酸設計
在本發明的一個實施例中，其中治療性寡核苷酸是反義寡核苷酸，當與目標核酸雜交時，本發明之寡核苷酸能夠招募核糖核酸酶 H。
將經修飾之核苷（例如高親和力經修飾之核苷）併入寡核苷酸序列的模式，通常稱為寡核苷酸設計。
在本發明的一個實施例中，其中治療性寡核苷酸是反義寡核苷酸，有利的結構設計是缺口體設計，如在「定義」部分中，例如在「缺口體」、「LNA 缺口體」、「MOE 缺口體」、和「混合型翼缺口體」下所描述的。缺口體設計包括具有均質側和混合型翼側的缺口體。在本發明中，如果本發明之連續核苷酸序列是具有 F-G-F’ 設計的缺口體，則會是有利的。在一些實施例中，缺口體是具有以下均質側設計 3-7-3 、3-8-2、3-8-3、2-9-4、3-9-3、3-10-3 或 5-10-5 的 LNA 或 MOE 缺口體。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為 12 至 22 個核苷酸，且具有選自由以下項所組成之群組的連續核苷酸序列： GCGtaaagagaGG (SEQ ID NO: 2)； GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO: 2)； GCGtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 3)； CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 4)； AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 5)； GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 6)； AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 7)； GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO: 8)； GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO: 8)； GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 9)； AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO: 10)； CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO: 11)； AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO: 12)； AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO: 13) AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO: 13)；及 AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO: 14)； 其中大寫字母表示 LNA 核苷，例如 β-D-氧基-LNA，而小寫字母表示 DNA 核苷。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為 12 至 22 個核苷酸，且具有選自由以下項所組成之群組的連續核苷酸序列： GCGtaaagagaGG (SEQ ID NO: 2)； GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO: 2)； GCGtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 3) 及 CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 4)； 其中大寫字母表示 LNA 核苷，例如 β-D-氧基-LNA，而小寫字母表示 DNA 核苷。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為 12 至 22 個核苷酸，且具有由以下項所組成的連續核苷酸序列： AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 5)；或 GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 6)； 其中大寫字母表示 LNA 核苷，例如 β-D-氧基-LNA，而小寫字母表示 DNA 核苷。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為 12 至 22 個核苷酸，且具有選自由以下項所組成之群組的連續核苷酸序列： AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 7)； GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO: 8)； GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO: 8)； GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 9)； AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO: 10)； CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO: 11)； AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO: 12)； AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO: 13) AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO: 13)；及 AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO: 14)； 其中大寫字母表示 LNA 核苷，例如 β-D-氧基-LNA，而小寫字母表示 DNA 核苷。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為 12 至 22 個核苷酸，且具有選自由以下項所組成之群組的連續核苷酸序列： AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO: 12)； AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO: 13) AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO: 13)；及 AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO: 14)； 其中大寫字母表示 LNA 核苷，例如 β-D-氧基-LNA，而小寫字母表示 DNA 核苷。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下項或由以下項組成：長度為 20 至 24 個核苷酸，其具有GCAGA ggtgaagcgaAGTGC (SEQ ID NO: 29) 之連續核苷酸序列。 其中，劃有底線的大寫字母表示 MOE 核苷，而小寫字母表示 DNA 核苷。
以下表 1 總結了靶向 SEQ ID NO: 1 之位置 1530 至 1602 的反義寡核苷酸之連續核苷酸序列的模體序列，以及這些意圖用於本發明的缺口體設計。
表 1
序列識別號 SEQ ID NO: 1 上的位置 模體序列 設計
2 1531-1543 gcgtaaagagagg GCGtaaagagaGG
GCGtaaagagAGG
3 1530-1543 gcgtaaagagaggt GCGtaaagagaGGT
4 1530-1544 cgcgtaaagagaggt CGCgtaaagagaGGT
5 1551-1565 agaaggcacagacgg AGAaggcacagaCGG
6 1551-1566 gagaaggcacagacgg GAGaaggcacagaCGG
7 1577-1592 agcgaagtgcacacgg AGCgaagtgcacaCGG
8 1577-1589 gaagtgcacacgg GAAgtgcacacGG
GAAgtgcacaCGG
9 1577-1591 gcgaagtgcacacgg GCGaagtgcacaCGG
10 1578-1592 agcgaagtgcacacg AGCgaagtgcacACG
11 1578-1590 cgaagtgcacacg CGAagtgcacaCG
12 1583-1598 aggtgaagcgaagtgc AGGtgaagcgaagTGC
13 1584-1598 aggtgaagcgaagtg AGGtgaagcgaaGTG
AGgtgaagcgaAGTG
14 1585-1598 aggtgaagcgaagt AGGtgaagcgaAGT
29 1583-1602 gcagaggtgaagcgaagtgc GCAGAggtgaagcgaAGTGC
在表 1 的「設計」欄中，大寫字母表示 2′-糖修飾的核苷，特別是 LNA 核苷，例如 β-D-氧基-LNA 或 MOE 核苷，而小寫字母表示 DNA 核苷。核苷間鍵聯可以是磷酸二酯或硫代磷酸酯。在一些實施例中，所有核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯。
在所有情況下，反義寡核苷酸還可在 F-G-F’ 設計的 5’ 或 3’ 端進一步包括區域 D’ 及/或 D’’，如「定義」部分中「寡核苷酸中的區域 D’ 或 D’’」下所描述的。在一些實施例中，本發明的反義寡核苷酸在缺口體區域的 5′ 或 3′ 端具有 1 至 5 個（例如 1、2 或 3 個）磷酸二酯連接的核苷單元，例如 DNA 單元。DNA 核苷通常具有如核鹼基定義所定義的核鹼基，例如自然產生的 DNA 核苷，其具有選自嘌呤（例如腺嘌呤和鳥嘌呤）和嘧啶（例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶）的核鹼基。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸是由兩個 5’ 磷酸二酯連接的 DNA 核苷，後接如「定義」部分所定義的 F-G-F’ 缺口體區域所組成。寡核苷酸在 5’ 或 3’ 端含有磷酸二酯連接的 DNA 單元，其適用於結合作用，並可以進一步包含本文所述的結合物部分。對於遞輸至肝臟的 ASGPR 靶向部分，其作為結合物部分是特別有利的。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項所組成之群組中選擇的序列組成： cagcgtaaagagagg        (SEQ ID NO: 15) cagcgtaaagagaggt       (SEQ ID NO: 16) cacgcgtaaagagaggt     (SEQ ID NO: 17) caagaaggcacagacgg    (SEQ ID NO: 18) cagagaaggcacagacgg  (SEQ ID NO: 19) caagcgaagtgcacacgg   (SEQ ID NO: 20) cagaagtgcacacgg        (SEQ ID NO: 21) cagcgaagtgcacacgg     (SEQ ID NO: 22) caagcgaagtgcacacg     (SEQ ID NO: 23) cacgaagtgcacacg         (SEQ ID NO: 24) caaggtgaagcgaagtgc    (SEQ ID NO: 25) caaggtgaagcgaagtg     (SEQ ID NO: 26) caaggtgaagcgaagt       (SEQ ID NO: 27) 在位置 1 至 3（從 5’ 端開始）的核苷之間，其中核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯，並且在位置 3 和 4 的核苷之間，其核苷間鍵聯是硫代磷酸酯鍵聯（其中位置 3 之核苷是連續核苷酸序列的 5’ 端）。如果在寡核苷酸之 3’ 端的位置 4 之後，所有的核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯鍵聯的話，則其會是有利的。在一個實施例中，連續核苷酸序列具有表 1 中相應序列的設計。
7. 結合物結合至去唾液酸糖蛋白
能夠結合去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR) 的結合物，對於靶向肝臟中的肝細胞特別有用。結合物包含至少兩個選自以下各項所組成之群組的碳水化合物部分：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯半乳胺糖、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正丁醯基-半乳胺糖和 N-異丁醯基半乳胺糖，其通常能夠結合至 ASGPR。N-乙醯半乳胺糖 (GalNAc) 部分已顯示出在靶向 ASGPR 方面是有利的，但也可以使用以上列之替代物，例如半乳糖。在一個實施例中，結合物由連接至間隔基的 2 至 4 個末端 GalNAc 部分組成，該間隔基將每個 GalNAc 部分連接至支鏈分子，從而形成可以結合至治療性寡核苷酸的簇。
例如，可以藉由將 GalNAc 部分透過其 C-l 碳連接至間隔基來生成 GalNAc 簇。優選的間隔基是柔性親水性間隔基（美國專利 5885968；Biessen 等人，J. Med. Chem. 1995，卷 39，第 1538-1546 頁）。優選的柔性親水性間隔基是 PEG 間隔基。優選的 PEG 間隔基是 PEG3 間隔基。分支點可以是允許兩個至三個 GalNAc 部分（或其他去唾液酸糖蛋白受體靶向部分）連附並且進一步允許分支點與寡核苷酸連附的任何小分子，此類構建體稱為 GalNAc 簇或 GalNAc 結合物。示例性的分支點基團是二離胺酸。二離胺酸分子包含三個胺基和羧基反應基團，透過該三個胺基可連接三個 GalNAc 部分或其他去唾液酸糖蛋白受體靶向部分，而透過該羧基反應基團可將二離胺酸連附至寡聚物。Khorev 等人，2008 Bioorg. Med. Chem.，卷 16，第 5216 頁中也描述了合適之三價支鏈的合成。其他商業上可獲得的支鏈是 1,3-雙-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)戊醯胺基]丙基-2-[((2-氰乙基)-(N, N-二異丙基)]亞磷醯胺（Glen Research 目錄號：10-1920-xx）；三-2,2,2-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基氧甲基]乙基-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺（Glen Research 目錄號：10-1922-xx）及三-2,2,2-[3-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙基氧甲基]亞甲氧基丙基-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺；和 1-[5-(4,4'-二甲氧基-三苯甲氧基)戊醯胺基]-3-[5-氟甲氧基-羰基-氧基-戊醯胺基]-丙基-2-[(2-氰乙基)-(N, N-二異丙基)]-亞磷醯胺（Glen Research 目錄號：10-1925-xx）。其他 GalNAc 簇可以是連附有 GalNAc 部分的小肽，例如 Tyr-Glu-Glu-（氨基己基 GalNAc）3 (YEE(ahGalNAc)3；與肝細胞上去唾液酸糖蛋白受體結合的糖三肽，參見，例如，Duff 等人 ，Methods Enzymol, 2000, 313, 297；離胺酸為基礎的半乳糖簇（例如，L3G4；Biessen 等人，Cardovasc.Med., 1999, 214）；以及膽烷為基礎的半乳糖簇（例如，去唾液酸糖蛋白受體的碳水化合物識別模體）。
在本發明的一個實施例中，將本發明之治療性寡核苷酸結合至 GalNAc 簇，以改善該寡核苷酸的藥理學，例如，藉由影響細胞分佈，特別是寡核苷酸在肝細胞中的細胞攝入。
合適的 GalNAc 結合物是能夠結合至去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR) 的那些，例如二價、三價或四價 GalNAc 簇。特別是，三價 N-乙醯半乳胺糖結合物適合用於與 ASGPR 結合，參見例如 WO 2014/076196、WO 2014/207232、WO 2014/179620、WO 2016/055601 和 WO 2017/178656（藉由引用併入本文）。圖 1 是合適的 GalNAc 結合物代表，其已至少進行了體外測試。然而，如果替代的 GalNAc 結合物能夠結合去唾液酸糖蛋白受體，那麼它們也可能是合適的。此類結合物用於增強寡核苷酸向肝臟的攝入，同時減少其在腎臟中的存在，從而增加經 GalNAc 結合之寡核苷酸之肝臟/腎臟比率（與相同寡核苷酸的非經結合之形式相比）。
可以使用本領域已知的方法將 GalNAc 簇連附至寡核苷酸的 3'-或 5'-端。在一個實施例中，GalNAc 簇連接至寡核苷酸的 5'-端。
可以在結合物（例如在結合物部分的支鏈部分）和寡核苷酸之間插入一個或多個連接子。在結合物部分和治療性寡核苷酸之間具有生物可切割型連接子是有利的，任選地可與不可切割型連接子（例如 C6 連接子）結合。該連接子可以選自描述於「定義」部分中「連接子」下的連接子，特別是生物可切割型區域 D’ 或 D’’ 的連接子是有利的。在結合物和缺口體或連續核苷酸序列之間，具有生物可切割型連接子之經 GalNAc 結合之寡核苷酸，是有效地前藥，由於 GalNAc 簇和生物可切割型 PO 連接子一旦進入細胞中，就會從缺口體或連續核苷酸序列中被去除。
在一個實施例中，結合物部分是三價 N-乙醯半乳胺糖 (GalNAc)，例如圖 1 所示的那些。
在一個實施例中，其中與經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸選自以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsG -3' SEQ ID NO: 15
5'-GN2-C6o co ao G sm C sG stsasasasgsasgsA sG sG -3' SEQ ID NO: 15
5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsGsT -3' SEQ ID NO: 16
5'-GN2-C6o co ao mCsGsmCs gstsasasasgsasgsasGsGsT -3' SEQ ID NO: 17
5'-GN2-C6o co ao AsGsAs asgsgscsascsasgsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 18
5'-GN2-C6o co ao GsAsGs asasgsgscsascsasgsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 19
5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 20
5'- GN2-C6o co ao GsAsAs gstsgscsascsasmcsGsG -3' SEQ ID NO: 21
5’-GN2-C6o co ao GsAsA sgstsgscsascsasm CsGsG -3’ SEQ ID NO: 21
5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs asasgstsgscsascsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 22
5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsAsmCsG -3' SEQ ID NO: 23
5'-GN2-C6o co ao mCsGsAs asgstsgscsascsasmCsG -3' SEQ ID NO: 24
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasgsTsGsmC -3' SEQ ID NO: 25
5’-GN2-C6o co ao A sG sgstsgsasasgsmcsgsasA sG sT sG -3' SEQ ID NO: 26
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasGsTsG -3' SEQ ID NO: 26 及
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasAsGsT -3' SEQ ID NO: 27
其中，大寫粗體字母表示 β-D-氧基-LNA 單元；小寫字母表示 DNA 單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標 m 表示含有 5-甲基胞嘧啶鹼基的 DNA 或 β-D-氧-LNA 單元；GN2-C6 表示帶有 C6 連接子的 GalNAc2 結合物。
在一個實施例中，其中與經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸選自以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsG -3' SEQ ID NO: 15
5'-GN2-C6o co ao G sm C sG stsasasasgsasgsA sG sG -3' SEQ ID NO: 15
5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsGsT -3' SEQ ID NO: 16 及
5'-GN2-C6o co ao mCsGsmCs gstsasasasgsasgsasGsGsT -3' SEQ ID NO: 17
其中，大寫粗體字母表示 β-D-氧基-LNA 單元；小寫字母表示 DNA 單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標 m 表示含有 5-甲基胞嘧啶鹼基的 DNA 或 β-D-氧-LNA 單元；GN2-C6 表示帶有 C6 連接子的 GalNAc2 結合物。
在一個實施例中，其中經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸是
5'-GN2-C6o co ao AsGsAs asgsgscsascsasgsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 18 或
5'-GN2-C6o co ao GsAsGs asasgsgscsascsasgsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 19
其中，大寫粗體字母表示 β-D-氧基-LNA 單元；小寫字母表示 DNA 單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標 m 表示含有 5-甲基胞嘧啶鹼基的 DNA 或 β-D-氧-LNA 單元；GN2-C6 表示帶有 C6 連接子的 GalNAc2 結合物。
在一個實施例中，其中與經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸選自以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 20
5'- GN2-C6o co ao GsAsAs gstsgscsascsasmcsGsG -3' SEQ ID NO: 21
5’-GN2-C6o co ao GsAsA sgstsgscsascsasm CsGsG -3’ SEQ ID NO: 21
5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs asasgstsgscsascsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 22
5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsAsmCsG -3' SEQ ID NO: 23
5'-GN2-C6o co ao mCsGsAs asgstsgscsascsasmCsG -3' SEQ ID NO: 24
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasgsTsGsmC -3' SEQ ID NO: 25
5’-GN2-C6o co ao A sG sgstsgsasasgsmcsgsasA sG sT sG -3' SEQ ID NO: 26
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasGsTsG -3' SEQ ID NO: 26 及
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasAsGsT -3' SEQ ID NO: 27
其中，大寫粗體字母表示 β-D-氧基-LNA 單元；小寫字母表示 DNA 單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標 m 表示含有 5-甲基胞嘧啶鹼基的 DNA 或 β-D-氧-LNA 單元；GN2-C6 表示帶有 C6 連接子的 GalNAc2 結合物。
在一個實施例中，其中與經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸選自以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasgsTsGsmC -3' SEQ ID NO: 25
5’-GN2-C6o co ao A sG sgstsgsasasgsmcsgsasA sG sT sG -3' SEQ ID NO: 26
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasGsTsG -3' SEQ ID NO: 26 及
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasAsGsT -3' SEQ ID NO: 27
其中，大寫粗體字母表示 β-D-氧基-LNA 單元；小寫字母表示 DNA 單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標 m 表示含有 5-甲基胞嘧啶鹼基的 DNA 或 β-D-氧-LNA 單元；GN2-C6 表示帶有 C6 連接子的 GalNAc2 結合物。
在一個實施例中，其中與經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸選自以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsG -3' SEQ ID NO: 15
5'-GN2-C6o co ao G sm C sG stsasasasgsasgsA sG sG -3' SEQ ID NO: 15
5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsGsT -3' SEQ ID NO: 16
5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 20
5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsAsmCsG -3' SEQ ID NO: 23 及
5’-GN2-C6o co ao A sG sgstsgsasasgsmcsgsasA sG sT sG -3' SEQ ID NO: 26
其中，大寫粗體字母表示 β-D-氧基-LNA 單元；小寫字母表示 DNA 單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標 m 表示含有 5-甲基胞嘧啶鹼基的 DNA 或 β-D-氧-LNA 單元；GN2-C6 表示帶有 C6 連接子的 GalNAc2 結合物。
在下表 2 中，顯示在 5’ 端具有生物可切斷型 CA 連接子（如果存在）的反義寡核苷酸序列，以及顯示靶向 SEQ ID NO: 1 之位置 1530 至 1602 的經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸。
表 2: 本發明之經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸用單獨的化合物識別號 (CMP ID NO) 識別。
序列識別號 反義寡核苷酸序列 化合物 CMP 識別號
15 cagcgtaaagagagg 5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsG -3' 15_1 圖 5
5'-GN2-C6o co ao G sm C sG stsasasasgsasgsA sG sG -3' 15_2 圖 6
16 cagcgtaaagagaggt 5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsGsT -3' 16_1 圖 4
17 cacgcgtaaagagaggt 5'-GN2-C6o co ao mCsGsmCs gstsasasasgsasgsasGsGsT -3' 17_1
18 caagaaggcacagacgg 5'-GN2-C6o co ao AsGsAs asgsgscsascsasgsasmCsGsG -3' 18_1
19 cagagaaggcacagacgg 5'-GN2-C6o co ao GsAsGs asasgsgscsascsasgsasmCsGsG -3' 19_1
20 caagcgaagtgcacacgg 5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsasmCsGsG -3' 20_1 圖 8
21 cagaagtgcacacgg 5'- GN2-C6o co ao GsAsAs gstsgscsascsasmcsGsG -3' 21_1
5’-GN2-C6o co ao GsAsA sgstsgscsascsasm CsGsG -3’ 21_2
22 cagcgaagtgcacacgg 5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs asasgstsgscsascsasmCsGsG -3' 22_1
23 caagcgaagtgcacacg 5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsAsmCsG -3' 23_1 圖 3
24 cacgaagtgcacacg 5'-GN2-C6o co ao mCsGsAs asgstsgscsascsasmCsG -3' 24_1
25 caaggtgaagcgaagtgc 5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasgsTsGsmC -3' 25_1
26 caaggtgaagcgaagtg 5’-GN2-C6o co ao A sG sgstsgsasasgsmcsgsasA sG sT sG -3' 26_1 圖 7
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasGsTsG -3' 26_2
27 caaggtgaagcgaagt 5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasAsGsT -3' 27_1
29 gcagaggtgaagcgaagtgc 5’-Fig1J-o G sC sA sG sA sgsgstsgsasasgscsgsasA sG sT sG sC -3’ 29_1 圖 2
其中，大寫粗體 字母表示 β-D-氧基-LNA 單元；劃有底線的 大寫字母表示 MOE；小寫字母表示 DNA 單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標 m 表示含有 5-甲基胞嘧啶鹼基的 DNA 或 β-D-氧-LNA 單元；GN2-C6 表示帶有 C6 連接子的 GalNAc2 結合物（圖 1D）。化合物 15_ 至 27_1 全部描述在 WO2015/173208 中，化合物 29_1 描述在 WO2014/179627 中，一些化合物也列於表 2 所示的圖中。
8.     TLR7 促效劑
本發明之 TLR7 促效劑是具有類鐸受體促效活性的 3-取代的 5-胺基-6H-噻唑并[4,5-d ]嘧啶-2, 7-二酮化合物及其前藥。WO 2006/066080、WO 2016/055553 和 WO 2016/091698 描述了此類 TLR7 促效劑及其前藥和它們的製造（藉由引用併入本文）。
在本發明的一個方面，本發明之醫藥組合中的 TLR7 促效劑由式 (I) 表示：
Figure 02_image027
其中，X 為 CH2 或 S； R1 為 -OH 或 -H 及 R2 為 1-羥丙基或羥甲基； 或式 (II) ：
Figure 02_image029
其中，X 為 CH2 或 S； R1 為 -OH 或 -H 或乙醯氧基，及 R2 為 1-乙醯氧基丙基或 1─羥丙基或 1-羥甲基或乙醯氧基（環丙基）甲基或乙醯氧基（丙炔-1-基）甲基， 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
式 (I) 化合物是活性 TLR7 促效劑。
在本發明的一個實施例中，式 (I) 的活性 TLR7 促效劑的子集合由式 (V) 表示：
Figure 02_image031
其中，R1 為 -OH 且 R2 為 1-羥丙基或羥甲基， 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
在本發明的一個實施例中，式 (I) 或式 (V) 中 R2 上的取代基選自：
Figure 02_image033
、
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
及
Figure 02_image039
式 (II) 化合物是 TLR7 促效劑前藥。在一個實施例中，該前藥是在 R2 上具有取代基的單一前藥 (single prodrug)，其選自：
Figure 02_image041
及
Figure 02_image043
。
在另一個實施例中，前藥是在 R2 上具有取代基的雙重前藥 (double prodrug)，其選自：
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
及
Figure 02_image049
。
式 (II) 之 TLR7 促效劑前藥的子集合由式 (III) 表示：
Figure 02_image051
其中，R1 為 -OH 或乙醯氧基且 R2 為 1-乙醯氧基丙基或 1-羥丙基或 1-羥甲基或
Figure 02_image053
或
Figure 02_image055
或
Figure 02_image057
。 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物； 或式 (IV)：
Figure 02_image059
其中，R1 為乙醯氧基（環丙基）甲基或乙醯氧基（丙炔-1-基）甲基或
Figure 02_image061
或
Figure 02_image063
， 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
如同式 (III) 之化合物，式 (IV)之化合物是雙重前藥，其中 R1 為 OH 且 R2 為 1─乙醯氧基丙基。式 (III) 之化合物，其中 R1 是乙醯氧基且 R2 是三重前藥 (triple prodrug)。
在投予後，式 (II)、式 (III) 或式 (IV) 之化合物被代謝為其活性形式，其為有用的 TLR7 效劑。
在一個實施例中，在本發明之醫藥組合中使用的 TLR7 促效劑選自以下相所組成之群組： [(1S )-1-[(2S ,4R ,5R )-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d ]嘧啶-3-基)-4-羥基-四氫呋喃-2-基]丙基] 乙酸酯 (CMP ID NO: VI)； 5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮 (CMP ID NO: VII)； 5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮 (CMP ID NO: VIII)； 5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮 (CMP ID NO: IX)； 5-胺基-3-(2'-O-乙醯基-3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮 (CMP ID NO: X)； 5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮 (CMP ID NO: XI)； [(S )-[(2S ,5R )-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d ]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]-環丙基-甲基] 乙酸酯 (CMP ID NO: XII) 及 (1S)-1-[(2S,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]丁-2-炔基] 乙酸酯 (CMP ID NO: XIII) 及其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
表 3 列出了本發明中的 TLR7 促效劑，包括描述其製備的參考文獻。
表 3：用單獨的化合物識別號 (CMP ID NO) 識別 TLR7 促效劑化合物
CMP 識別號 化合物名稱 結構 參考文獻
VI [(1S )-1-[(2S ,4R ,5R )-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d ]嘧啶-3-基)-4-羥基-四氫呋喃-2-基]丙基] 乙酸酯
Figure 02_image065
 WO2016091698
VII 5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮
Figure 02_image067
 WO2016091698
VIII 5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮
Figure 02_image069
 WO2016091698
IX 5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮
Figure 02_image071
 WO2006066080
X 5-胺基-3-(2'-O-乙醯基-3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮
Figure 02_image073
 WO2006066080
XI 5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮
Figure 02_image075
 WO2006066080
XII [(S )-[(2S ,5R )-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d ]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]-環丙基-甲基] 乙酸酯
Figure 02_image077
 WO2016055553
XIII (1S)-1-[(2S,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]丁-2-炔基] 乙酸酯
Figure 02_image079
 WO2016055553
在特別優選的實施例中，TLR7 促效劑是 CMP ID NO: VI。
9. 醫藥組成物
在另一方面，本發明提供之醫藥組成物包含任一上述治療性寡核苷酸或 TLR7 促效劑或其鹽以及一種藥學上可接受之稀釋劑、載體、鹽及/或佐劑。在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的治療性寡核苷酸和 TLR7 促效劑是以單獨的組成物投予。在一個實施例中，將治療性寡核苷酸調製在磷酸鹽緩衝液中，用於皮下投予，並將 TLR7 促效劑調製為錠劑，用於口服投予。
本發明之醫藥組合中的治療性寡核苷酸可與藥學上可接受之有效或惰性物質混合，用以製備醫藥組成物或製劑。組成物及用以形成醫藥組成物製劑的方法取決於若干標準，包括但不限於，投予途徑、疾病程度或要施予的劑量。治療性寡核苷酸之藥學上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽緩衝食鹽水 (PBS)，而醫藥上可接受之鹽包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在某些實施例中，治療性寡核苷酸之藥學上可接受之稀釋劑為無菌磷酸鹽緩衝液。在某些實施例中，寡核苷酸用於藥學上可接受之稀釋劑的濃度為 50 至 150 mg/ml 溶液。治療性寡核苷酸或醫藥組成物包含藉由腸胃外途徑投予的治療性寡核苷酸，該腸胃外途徑包括靜脈、動脈、皮下或肌內注射或輸注。在一個實施例中，寡核苷酸結合物為靜脈投予。對於治療性寡核苷酸，如果將其皮下投予是有利的。在一些實施例中，本發明的寡核苷酸結合物或醫藥組成物以 0.5~6.0 mg/kg，例如 0.75~5.0 mg/kg，例如 1.0~4 mg/kg的劑量投予。可以每週一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次或間隔更長的時間投予。
對於本發明之醫藥組合中的 TLR7 促效劑，醫藥有效量之本發明之化合物是經腸道（例如口服或透過胃腸道）投予。本發明的 TLR7 促效劑化合物可以以任何方便之投予形式的單位劑量進行投予，例如以錠劑、粉劑、膠囊，溶液、分散劑，懸浮液、糖漿劑、噴霧、栓劑、凝膠、乳化劑。特別是，可以使用口服單位劑型，例如錠劑和膠囊。在一實施例中，醫藥有效量之本發明之 TLR7 促效劑化合物將在每劑量約 75~250 mg，例如 100~200 mg，例如每劑 150~170 mg 的範圍內。可以每天、每隔一天 (QOD) 或每週 (QW) 投予。
合適的載體和賦形劑是本領域技術人員眾所周知的，並且詳細描述在例如，Ansel，Howard C.等人，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems。Philadelphia: Lippincott，Williams ＆ Wilkins，2004；Gennaro，Alfonso R.等人，Remington: The Science and Practice of Pharmacy。Philadelphia: Lippincott，Williams ＆ Wilkins，2000；和 Rowe，Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients.Chicago, Pharmaceutical Press, 2005。
這些組成物可經由習知消毒技術消毒或經過濾滅菌。如此製成的水溶液可經包裝後直接使用，或經凍乾，使用前先將凍乾製劑與無菌水性載體結合再行投予。製劑的 pH 通常為介於 3 和 11 之間，更佳的是介於 5 和 9 之間或是介於 6 和 8 之間，最佳的是介於 7 和 8 之間，例如 7 至 7.5。製成的固態組成物可分為單劑包裝，每劑中包含固定數量的上述作用劑，例如為藥錠或膠囊的密封包裝。
10. 治療性寡核苷酸的配方
各種促進治療性寡核苷酸使用的配方已被開發出來，其可以適用於本發明之醫藥組合中使用的治療性寡核苷酸。例如，可使用使降解最小化、促進遞輸及/或攝入、或者為配方中的寡核苷酸提供另一種有益特性的配方，將寡核苷酸遞輸至個體或細胞環境。在一些實施例中，本文提供了包含第一藥物的醫藥組合，該第一藥物是包含減少 HBV 抗原（例如，HBsAg）表現之寡核苷酸（例如，單股或雙股寡核苷酸）的組成物。可以適當地調製這樣的組成物使得投予於個體時，在目標細胞的直接環境中或全身性地，能有足夠部分的寡核苷酸進入細胞以減少 HBV 抗原表現。如本文所揭露的，多種合適的寡核苷酸配方中的任一種皆可用於遞輸寡核苷酸以降低 HBV 抗原。在一些實施例中，將本發明之醫藥組合的寡核苷酸調製在緩衝溶液中，例如磷酸鹽緩衝食鹽水溶液、脂質體、微胞結構和殼體。
具有陽離子脂質的寡核苷酸配方可用於促進寡核苷酸轉染到細胞中。例如，可以使用陽離子脂質（例如 lipofectin）、陽離子甘油衍生物和聚陽離子分子（例如，聚離胺酸）。合適的脂質包括 Oligofectamine，Lipofectamine（美國生命技術公司），NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colo.) 或 FuGene 6（羅氏公司），所有脂質均可根據製造商的說明使用。
因此，在一些實施例中，寡核苷酸配方包含脂質奈米顆粒。在一些實施例中，賦形劑包含脂質體、脂質、脂質複合體、微球、微粒、奈米球或奈米顆粒、或者其他可以調製用於向有需要之個體的細胞、組織、器官或身體投予（例如，參見，Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第 22 版，Pharmaceutical Press，2013）。
在一些實施例中，本文所揭露的配方包含賦形劑。在一些實施例中，賦形劑給予組成物之活性成分改善的穩定性、改善的吸收、改善的溶解性和/或治療性增強。在一些實施例中，賦形劑是緩沖試劑（例如，檸檬酸鈉、磷酸鈉、tris 鹼或氫氧化鈉）或媒液（例如，緩衝溶液、凡士林、二甲基亞碸或礦物油）。在一些實施例中，將寡核苷酸凍乾以延長其保存期限，然後在使用前（例如，投予個體）製成溶液。因此，包含在本文所述的任何一種寡核苷酸之組成物中的賦形劑可以是凍乾保護劑（例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮）或崩解溫度調節劑（例如，葡聚醣、聚蔗糖或明膠）。
在本發明之醫藥組合的一些實施例中，將包含寡核苷酸的組成物調製成與其意圖投予之途徑相容。投予途徑的實例包括腸胃外（例如，靜脈、皮內、皮下）、口服（例如，吸入）、經皮（局部）、經粘膜和直腸投予。當本發明之醫藥組合中的寡核苷酸是 RNAi 寡核苷酸時，皮下配方是特別有利的。
適用於注射使用的醫藥組成物包括無菌水溶液（當藥物是水溶性時）或分散液，以及用於即時調配無菌注射溶液或分散液的無菌粉劑。合適的載體包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF,Parsippany,N.J.) 或磷酸鹽緩衝液 (PBS)。載體可以是水或溶劑或分散介質。溶劑或分散介質可包含例如，水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液態聚乙二醇等）及其合適的混合物。在許多情況下，優選地在組成物中包括等張試劑（例如，糖）、多元醇（例如，甘露醇、山梨糖醇）和氯化鈉。可以藉由將所需量的寡核苷酸與所需的一種或上述列舉之成分的組合，摻入到選定的溶劑中來製備無菌注射溶液，然後過濾滅菌。
在本發明之醫藥組合的一些實施例中，儘管活性成分的百分比可以為總組成物之重量或體積的約 1% 至約 80% 或更多，組合物中的組成物可包含至少約 0.1% 或更多的治療劑（例如，用於減少 HBV 抗原表現的寡核苷酸）。製備此類醫藥配方領域的技術人員將考慮諸如溶解度、生體可用率、生物學半衰期、投予途徑、產品保存期限以及其他藥理學條件等因素，因此可能需要各種劑量及治療方案。
即使許多實施例係關於本文所揭露之任何寡核苷酸的肝臟靶向遞輸，但也可以考慮靶向其他組織。
11. 醫藥組合和部分之套組
本發明的一個方面涉及一種醫藥組合，其將本文所述之靶向 HBV 的治療性寡核苷酸和 TLR7 促效劑分別調製於藥學上可接受之載體。
與單獨包含治療性寡核苷酸或 TLR7 促效劑相比，本發明的醫藥組合可以更有效地用於治療 HBV 感染。在一個實施例中，與單獨包含治療性寡核苷酸或 TLR7 促效劑相比，本發明之醫藥組合可以用於更迅速地抑制 HBV、延長抑制 HBV 的延續時間及/或在抑制 HBV 方面有更好的效果。可藉由 HBsAg 力價的降低來測量這些效果。在一個實施例中，與單獨包含治療性寡核苷酸或 TLR7 促效劑相比，本發明之醫藥組合引起更快的 HBsAg 力價降低。在一個實施例中，與單獨包含治療性寡核苷酸或 TLR7 促效劑相比，本發明之醫藥組合引起更持久的 HBsAg 力價降低。在一個實施例中，與單獨包含治療性寡核苷酸或 TLR7 促效劑相比，本發明之醫藥組合引起更多的 HBsAg 力價降低。
在本發明一個優選的實施例中，醫藥組合包含或由以下各項組成：本文所述的 RNAi 寡核苷酸和 TLR7 促效劑。
在本發明的一個實施例中，醫藥組合包含或由以下各項組成：RNAi 寡核苷酸和式 (I) 或式 (II) 之 TLR7 促效劑：
Figure 02_image081
其中，X 為 CH2 或 S； 針對式 (I)，R1 為 -OH 或 -H 且 R2 為 1-羥丙基或羥甲基， 針對式 (II)，R1 為 -OH 或 -H 或乙醯氧基且 R2 為 1-乙醯氧基丙基或 1-羥丙基或 1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基， 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
上文已經分別描述了本發明之 RNAi 寡核苷酸和 TLR7 促效劑，例如。在上述之部分 1 至 3 和 8 中。
在本發明的一個實施例中，醫藥組合可以選自表 4 垂直列中之化合物以及水平列中之化合物。每個可能的組合都用「x」表示。
表 4：可能的 RNAi 寡核苷酸、TLR7 促效劑組合
   TLR7 促效劑 CMP ID NO
VI VII VIII IX X XI XII XIII
RNAi IDNO 1 x x x x x x x x
2 x x x x x x x x
3 x x x x x x x x
4 x x x x x x x x
5 x x x x x x x x
6 x x x x x x x x
7 x x x x x x x x
8 x x x x x x x x
9 x x x x x x x x
以下表 5 和表 6 顯示 RNAi 寡核苷酸（垂直）和 TLR7 促效劑（水平）的選定組合。
表 5
   TLR7 促效劑 CMP ID NO
VI VII
Figure 02_image083
Figure 02_image085
RNAi ID NO 1 x x
2 x x
3 x x
4 x x
5 x x
6 x x
7 x x
8 x x
9 x x
表 6
   TLR7 促效劑 CMP ID NO
VIII XIII
Figure 02_image087
Figure 02_image089
RNAi ID NO 1 x x
2 x x
3 x x
4 x x
5 x x
6 x x
7 x x
8 x x
9 x x
在本發明的一個實施例中，醫藥組合選自以下各項所組成之群組： RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: VI； RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: VII； RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: VIII； RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: XIII； 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合的治療性寡核苷酸由 RNAi 寡核苷酸所組成，其為 RNAi ID NO: 7：
一種用於減少 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg ) mRNA 表現的寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域的有義股，其中： 該有義股包含如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸中之各者經結合至單價 GalNac 部分，其中，該 –GAAA– 序列包含下列結構：
Figure 02_image091
；並且 該反義股包含如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列，且其包含在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 的經 2′-氟修飾之核苷酸，在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸，及介於核苷酸 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21及 21 與 22 之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳具有下列結構：
Figure 02_image093
; 且該 TLR7 促效劑為 CMP ID NO: VI：
Figure 02_image095
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
在特別優選的實施例中，醫藥組合包含 RNAi 寡核苷酸和 TLR7 促效劑，該 TLR7 促效劑為 CMP ID NO: VI。
在一個實施例中，醫藥組合包含本發明之 RNAi 寡核苷酸和 TLR7 促效劑，進一步還包含 CpAM（核心蛋白別構調節劑）。
在一個優選的實施例中，CpAM 為根據化合物 (CpAM1)。化合物 (CpAM1) 是 CpAM，其藉由靶向 HBV 殼體用於在人類中治療及/或預防 HBV，此揭露於 WO2015132276 中。化合物 (CpAM1) 的結構如下所示：
Figure 02_image097
化合物 (CpAM1) 其中 R1 為氫、鹵素或 C1-6 烷基； R2 為氫或鹵素； R3 為氫或鹵素； R4 為 C1-6 烷基； R5 為氫、羥C1-6 烷基、胺基羰基、C1-6 烷氧基羰基或羧基； R6 為氫、C1-6 烷氧基羰基或羧基-Cm H2m -， X 為羰基或磺醯基； Y 為 -CH2 -、-O- 或 -N(R7 )-， 其中，R7 為氫、C1-6 烷基、鹵C1-6 烷基、C3-7 環烷基-Cm H2m -、C1-6 烷氧基羰基-Cm H2m -、-Ct H2t -COOH、-鹵C1-6 烷基-COOH、-(C1-6 烷氧基)C1-6 烷基-COOH、-C1-6 烷基-O-C1-6 烷基-COOH、-C3-7 環烷基-Cm H2m -COOH、-Cm H2m -C3-7 環烷基-COOH、羥-Ct H2t -、羧基螺[3.3]庚基或羧基苯基-Cm H2m -、羧基吡啶基-Cm H2m -； W 為 -CH2 -、-C(C1-6 烷基)2 -、-O- 或羰基； n 為 0 或 1； m 為 0 至 7； t 為 1 至 7； 或其醫藥上可接受之鹽、或鏡像異構物或非鏡像異構物。
在另一個優選的實施例中，CpAM 為根據化合物 (CpAM2) 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。化合物 (CpAM2) 是 CpAM，其藉由靶向 HBV 殼體用於在人類中治療和/或預防 HBV，此揭露於 WO2015132276 的實例 76 中，並且可以依照其製備。化合物 (CpAM2) 的結構如下所示：
Figure 02_image099
化合物 (CpAM2)
在另一個優選的實施例中，CpAM 是3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-yl-1,4-二氫嘧啶-6-基]甲基]-3-側氧基-5,6,8,8a-四氫-1H-咪唑並[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸，此揭露於 WO2015132276 的實例 76 中，並且可以依照其製備。
在本發明的另一個實施例中，醫藥組合包含或由以下各項組成：長度為 13 至 22 個核苷酸的經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸，其具有至少 12 個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與來自 SEQ ID NO: 1 的位置 1530 至 1602 之連續序列 100% 互補，以及式 (I) 或式 (II) 之 TLR7 促效劑：
Figure 02_image101
其中，X 為 CH2 或 S； 針對式 (I)，R1 為 -OH 或 -H 且 R2 為 1-羥丙基或羥甲基， 針對式 (II)，R1 為 -OH 或 -H 或乙醯氧基且 R2 為 1-乙醯氧基丙基或 1-羥丙基或 1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基， 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
上文已經分別描述了本發明之靶向 HBV 的經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸和 TLR7 促效劑，例如，在上述之部分 4 至 6 和 8 中。
在本發明的一個實施例中，醫藥組合可以選自表 7 中垂直列中的化合物和水平列中的化合物。每個可能的組合都用「x」表示。
表 7：可能的經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸、TLR7 促效劑組合
CMP 識別號 TLR7 促效劑
VI VII VIII IX X XI XII XIII
經 GalNAc 結合之寡核苷酸 15_1 x x x x x x x x
15_2 x x x x x x x x
16_1 x x x x x x x x
17_1 x x x x x x x x
18_1 x x x x x x x x
19_1 x x x x x x x x
20_1 x x x x x x x x
21_1 x x x x x x x x
21_2 x x x x x x x x
22_1 x x x x x x x x
23_1 x x x x x x x x
24_1 x x x x x x x x
25_1 x x x x x x x x
26_1 x x x x x x x x
26_2 x x x x x x x x
27_1 x x x x x x x x
以下表 8 和表 9 顯示經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸（垂直）和 TLR7 促效劑（水平）的選定組合。
表 8
CMP 識別號    VI VII
   化合物
Figure 02_image103
Figure 02_image105
15_1 GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsG ' x x
15_2 GN2-C6o co ao G sm C sG stsasasasgsasgsA sG sG x x
16_1 GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsGsT x x
20_1 GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsasmCsGsG x x
23_1 GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsAsmCsG x x
26_1 GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasGsTsG x x
29_1 5’-Fig1J-o G sC sA sG sA sgsgstsgsasasgscsgsasA sG sT sG sC -3’ x x
表 9
CMP 識別號    VIII XIII
   化合物
Figure 02_image107
Figure 02_image109
15_1 GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsG ' x x
15_2 GN2-C6o co ao G sm C sG stsasasasgsasgsA sG sG x x
16_1 GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsGsT x x
20_1 GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsasmCsGsG x x
23_1 GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsAsmCsG x x
26_1 GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasGsTsG x x
29_1 5’-Fig1J-o G sC sA sG sA sgsgstsgsasasgscsgsasA sG sT sG sC -3’ x x
在本發明的一個實施例中，醫藥組合選自以下各項所組成之群組： CMP ID NO: 15_1 及 VI、CMP ID NO: 15_2 及 VI；CMP ID NO: 16_1 及 VI；CMP ID NO: 20_1 及 VI；CMP ID NO: 23_1 及 VI；CMP ID NO: 26_1 及 VI；CMP ID NO: 29_1 及 VI； CMP ID NO: 15_1 及 VII、CMP ID NO: 15_2 及 VII；CMP ID NO: 16_1 及 VII；CMP ID NO: 20_1 及 VII；CMP ID NO: 23_1、VII;CMP ID NO: 26_1 及 VII；CMP ID NO: 29_1 及 VII； CMP ID NO: 15_1 及 VIII、CMP ID NO: 15_2 及 VIII；CMP ID NO: 16_1 及 VIII；CMP ID NO: 20_1 及 VIII；CMP ID NO: 23_1 及 VII；CMP ID NO: 26_1 及 VIII；CMP ID NO: 29_1 及 VIII；及 CMP ID NO: 15_1 及 XIII、CMP ID NO: 15_2 及 XIII；CMP ID NO: 16_1 及 XIII；CMP ID NO: 20_1 及 XIII；CMP ID NO: 23_1 及 XIII；CMP ID NO: 26_1 及 XIII；CMP ID NO: 29_1 及 XIII； 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
在一個實施例中，醫藥組合由圖 5 所示的 CMP ID NO: 15_1 的經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸組成，且 TLR7 促效劑是 CMP ID NO: VI：
Figure 02_image111
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
在特別優選的實施例中，醫藥組合包含反義寡核苷酸，TLR7 促效劑為 CMP ID NO: VI。
術語「套組」或「部件套組」是指用於執行 HBV 感染受試者之治療的材料組裝，包含有關如何進行治療的說明。
本發明的一個方面是包含一種、兩種或多種治療性有效成分（例如藥物成分或藥物）的部件套組，其中兩種選自本文所述之治療性寡核苷酸和本文所述的 TLR7 促效劑。
本發明的一個實施例是部件套組，其包含如本文所述的治療性寡核苷酸和如本文所述的 TLR7 促效劑作為藥物成分。
在一個實施例中，本發明的套組包含第一藥物及第二藥物，該第一藥物是調製為用於皮下注射之本文所述的治療性寡核苷酸，該第二藥物是調製為用於口服投予之本文所述的 TLR7 促效劑。可以將治療性寡核苷酸調製成小瓶中的液體，劑量為一劑或多劑，或在載藥注射器中配成一種藥學上有效之劑量。或者，治療性寡核苷酸可以是凍乾粉末的形式，且套組包含用於製備注射用治療性寡核苷酸的溶劑。可以理解的是，所有用於注射的藥物都是無菌的。套組中的 TLR7 促效劑可以是錠劑形式（或口服投予的替代單位劑量形式，例如膠囊和凝膠），每錠劑具有藥學上有效之單一劑量，該套組可包含多個錠劑。
在另一個實施例中，本發明的部件套組進一步包括包裝插頁，其說明將治療性寡核苷酸併以 TLR7 促效劑投予以治療 B 型肝炎病毒感染。特別是，包裝插頁說明慢性 B 型肝炎病毒感染之治療。
套組可僅包含一種藥物成分以及包裝插頁，說明其併以其他藥物成分來投予。在一個實施例中，本發明的部件套組包含或包括如本文所述之治療性寡核苷酸的第一藥物以及包裝插頁，該包裝插頁說明該第一藥物併以本文所述之 TLR7 促效劑作為的第二種藥物來使用，但該第二藥物需單獨購買。在另一個實施例中，本發明的部件套組包含或包括如本文所述之 TLR7 促效劑的第一藥物以及包裝插頁，該包裝插頁說明該第一藥物併以本文所述之治療性寡核苷酸作為的第二種藥物來使用，但該第二藥物需單獨購買。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合可以併以第三或其他治療劑來使用，所述第三或其他治療劑可以包括在部件套組中或單獨提供。該其他治療劑可以是例如治療 HBV 感染的護理標準，特別是慢性 HBV 感染。
12. 應用
本發明之醫藥組合是用於治療 B 型肝炎病毒感染，特別是治療慢性 HBV 患者。
本發明之醫藥組合可以用作治療劑和預防治療。
本發明之醫藥組合可以用作組合的 B 型肝炎病毒靶向療法和免疫療法。特別是，當用於在感染細胞中的 HBV 治療時，本發明之醫藥組合能夠影響以下一個或多個 HBV 感染參數：i) 減少細胞的 HBV mRNA，ii) 減少血清中的 HBV DNA 及/或 iii) 減少 HBV 病毒抗原，例如 HBsAg 和 HBeAg。在本發明的一個實施例中，與使用醫藥組合中之單個藥物成分進行治療時所能達到的效果相比，該一個或多個參數具有改善效果。
可以使用 HBV 感染的初代人類肝細胞或 HBV 感染的 HepaRG 細胞或 ASGPR-HepaRG 細胞，在體外測量對 HBV 感染的效果（參見例如 PCT/EP2018 078136）。還可以使用 AAV/HBV 小鼠模型在體內測量 HBV 感染的效果，該模型的小鼠感染了攜帶 HBV 基因組 (AAV/HBV) 的重組腺相關病毒 (AAV)（Dan Yang 等人 2014 Cellular＆Molecular Immunology 11, 71-78）或 HBV 微型圓形小鼠（可在 Covance Shanghai 獲得，另見 Guo 等人 2016 Sci Rep 6: 2552 和 Yan 等人 2017 J Hepatology 66（6）:1149-1157）或人源化肝細胞 PXB 小鼠模型（可在 PhoenixBio 獲得，另請參見 Kakuni 等人 2014 Int. J. Mol. Sci.15:58-74）。HBsAg 及/或 HBeAg 之分泌的抑制可以藉由 ELISA 測定，例如根據製造商的說明使用 CLIA ELISA 套組 (Autobio Diagnostic)。HBV mRNA 和 pgRNA 的減少可藉由 qPCR 測定，例如如「材料和方法」部分所述。評估測試化合物是否抑制 HBV 感染的其他方法，是藉由 qPCR（例如 WO 2015/173208 中所述）或使用北方墨點法、原位雜交技術或免疫發光法來測定 HBV DNA 的分泌。
在本發明的一個實施例中，如本文所述之靶向 HBV mRNA 的治療性寡核苷酸和如本文所述之 TLR7 促效劑的醫藥組合，提供了優於單一化合物治療（單獨治療性寡核苷酸或單獨 TLR7 促效劑）的優勢。例如，優點可以是：i) 與單一療法相比，血清 HBV-DNA 降低的時間延長；ii) 與單一療法相比，HBsAg 的反彈延遲及/或 iii) 治療範圍的延長。關於藥物的術語「治療範圍 (therapeutic window)」或「藥物範圍 (pharmaceutical window)」是可以有效治療疾病而沒有毒性作用的藥物劑量範圍。在本發明的一個實施例中，與單一療法相比，可以藉由組合治療達成治療範圍的增加。
在本申請的研究中，與使用單一療法時所需的劑量相比，已經觀察到使用組合治療時可以以低 3 至 5 倍的劑量獲得顯著改善的效果，且與較高劑量下的相同組合相比，組合治療以低 3 至 5 倍的劑量可以達到基本相同的效果。例如，已顯示對於單一療法而言，需要高劑量（7.5 mg/kg 抗 HBV 反義寡核苷酸或 100 mg 每 2 天 (QOD) 的 TLR7 促效劑）才能有效減少 HBsAg，當以較低劑量（1.5 mg/kg 和每週 100 mg (QW)）組合使用時，HBsAg 減少至檢測極限以下，且與較高劑量的單一療法相比，其反彈時間顯著延長。此外，當使用抗 HBV 治療性寡核苷酸以低 5 倍之劑量 (1.5 mg/kg vs 7.5 mg/kg) 併以 TLR7 促效劑以每週一次取代每隔一天（相當於劑量減少 4 倍）投予的醫藥組合時，病毒參數 HBsAg 的反彈可延遲至相同程度。對於 HBV-DNA 的減少，觀察到相似的結果。
本發明提供用以治療或預防 HBV 感染的方法，該方法包含對罹有或易於罹患 HBV 感染的個體，投予治療或預防有效量之本發明之醫藥組合。
本發明的另一方面涉及本發明之醫藥組合在抑制慢性 HBV 感染發展或治療的用途。
本發明的一個方面是一種治療感染 HBV受試者的方法，例如受試者具有慢性 HBV 感染，該方法包括投予醫藥有效量之本文所定義的治療性寡核苷酸和醫藥有效量的式 (I) 或式 (II) 之 TLR7 促效劑：
Figure 02_image113
其中，X 為 CH2 或 S； 針對式 (I)，R1 為 -OH 或 -H 且 R2 為 1-羥丙基或羥甲基， 對於式 (II) 而言，對於感染了 HBV 的受試者，R1 是-OH 或-H 或乙醯氧基，R2 是 1-乙醯氧基丙基或 1-羥丙基或 1-羥甲基或乙醯氧基（環丙基）甲基或乙醯氧基（丙炔-1-基）甲基。
本發明還涉及如本申請中所述的治療性寡核苷酸，其用作組合治療中的藥物。本發明還涉及如本申請中所述的 TLR7 促效劑，其用作組合治療中的藥物。
特別是，本文所定義的治療性寡核苷酸和式 (I) 或式 (II) 之 TLR7 促效劑：
Figure 02_image115
其中，X 為 CH2 或 S； 針對式 (I)，R1 為 -OH 或 -H 且 R2 為 1-羥丙基或羥甲基， 針對式 (II)，R1 為 -OH 或 -H 或乙醯氧基且 R2 為 1-乙醯氧基丙基或 1-羥丙基或 1-羥甲基或乙醯氧基（環丙基）甲基或乙醯氧基（丙炔-1-基）甲基； 它們是用於治療 B 型肝炎病毒感染。
本發明的一個實施例是治療性寡核苷酸在製備用於治療 B 型肝炎病毒感染（例如慢性 HBV 病毒感染）之第一藥物中的用途，其中該第一藥物是如本申請中所述的治療性寡核苷酸，並且其中該第一藥物併以第二藥物投予，其中該第二藥物是如本申請中所述的 TLR7 促效劑。
在本發明的一個實施例中，含有治療性寡核苷酸的藥物組成物將以皮下劑量投予。在本發明的另一個實施例中，TLR7 促效劑以口服劑量投予。由於藥物組成物將透過兩種不同的投予途徑進行投予，因此它們可以遵循不同的投予方案。
如本發明之醫藥組合通常是以有效量投予。
在一個實施例中，以 1 mg/kg 至 4 mg/kg 的劑量範圍皮下投予如本申請中所述的治療性寡核苷酸，每週一次或每月一次給藥，持續 24 至 72 週之間，例如 36 至 60 週之間，例如 48 週，並且每隔一天 (QOD) 以 150 至 170 mg 的口服單位劑量投予本申請中所述的 TLR7 促效劑，持續 8 至 26 週，例如 10 至 24 週，例如 12 或 13 週，隨後每週一次 (QW) 投予，持續 24 至 48 週，例如 30 至 40 週，例如 35 週。每隔一天投予之期間中，可能需要 10 到 14 週，例如 12 週的治療期間。在整個治療期間，TLR7 促效劑的投予劑量數在 60 至 100 劑之間，例如在 75 至 90 劑之間，例如 81、82、83 或 84 劑。治療性寡核苷酸的投予劑量數在 6 至 72 之間，例如在 9 至 15 之間，例如 12 或 48 劑。
為了獲得最佳的組合效果，將治療性寡核苷酸和 TLR7 促效劑的投予間隔少於一個月，例如間隔少於一周，例如間隔兩天，例如在同一天。
13. 使用方法
I. 減少 HBsAg 表現
在一些實施例中，提供了用於將有效量之本發明的任何一種醫藥組合遞輸至細胞的方法，其包含本文所揭露之寡核苷酸，特別是本文所揭露之 RNAi 寡核苷酸，用以減少 HBsAg 的表現。本文所提供的方法可用於任何合適的細胞類型。在一些實施例中，細胞是表現 HBV 抗原的任何細胞（例如，肝細胞、巨噬細胞、單核細胞衍生的細胞、前列腺癌細胞、腦細胞、內分泌組織、骨髓、淋巴結、肺、膽囊、肝臟、十二指腸、小腸、胰腺、腎臟、胃腸道、膀胱、脂、軟組織和皮膚）。在一些實施例中，細胞是已經從個體獲得的初代細胞，且可以經歷有限次數的傳代，使得該細胞基本上保持其天然表型特性。在一些實施例中，寡核苷酸被遞輸至的細胞是離體的或體外的（即，可以被遞輸至培養中的細胞或該細胞所駐留的生物體）。在特定的實施例中，提供了用於向細胞遞輸醫藥組合的方法，該醫藥組合包含有效量之本文所揭露之任何一種寡核苷酸，特別是本文所揭露之一種 RNAi 寡核苷酸，用以僅在肝細胞中減少 HBsAg 的表現。
在一些實施例中，本文所揭露之醫藥組合中的寡核苷酸可以使用適當的核酸遞輸方法引入，該方法包括注射包含寡核苷酸的溶液、由被寡核苷酸覆蓋的顆粒轟擊、將細胞或生物體暴露於包含寡核苷酸的溶液中或在存在寡核苷酸中將細胞膜的電穿孔。可以使用其他合適的方法將寡核苷酸遞輸至細胞，例如脂質媒介的載體轉運、化學媒介的轉運和陽離子脂質體轉染，例如磷酸鈣等。
抑制的結果可以藉由評估細胞或個體一種或多種特性的適當測定法，或者解由評估指示 HBV 抗原表現的分子（例如，RNA、蛋白質）的生化技術來證實。在一些實施例中，通過將 HBV 抗原的表現水準（例如，mRNA 或蛋白質水準）與適當的對照（例如，未遞輸藥物組合或遞輸負調控的細胞或細胞群中之 HBV 抗原表現水準）進行比較，來評估本文提供之醫藥組合的寡核苷酸降低 HBV 抗原的表現水準的程度。在一些實施例中，HBV 抗原表現的適當調控水準，可以是預定的水準或數值，如此便不需要每次都測量調控水準。預定的水準或數值可以採取多種形式。在一些實施例中，預定的水準或數值可以是單個截止值，例如中位數或平均值。
在一些實施例中，投予包含如本文所述之寡核苷酸的醫藥組合，特別是本文所述之 RNAi 寡核苷酸，可引起細胞中 HBV 抗原（例如，HBsAg）表現水準降低。在一些實施例中，與 HBV 抗原的適當控制水平相比，HBV 抗原表現水準的降低可以是降低至 1% 或更低，5% 或更低，10% 或更低，15% 或更低，20% 或更低，25% 或更低，30% 或更低，35% 或更低，40% 或更低，45% 或更低，50% 或更低，55% 或更低，60% 或更低，70% 或更低，80% 或更低，或者 90% 或更低。合適的對照水準可以是未與包含本文所述之寡核苷酸（特別是 RNAi 寡核苷酸）之醫藥組合接觸的細胞或細胞群中 HBV 抗原表現的水準。在一些實施例中，在有限的期間後評估根據本文所揭露之方法，將本發明之醫藥組合的寡核苷酸遞輸至細胞的效果。例如，在將寡核苷酸引入細胞後至少8小時、12小時、18小時、24小時；或至少一、二、三、四、五、六、七、十四、二十一、二十八、三十五、四十二、四十九、五十六、六十三、七十、七十七、八十四、九十一、九十八、105、112、119、126、133、140 或 147 天後，可以在細胞中分析 HBV 抗原的水準。
在一些實施例中，HBV 抗原（例如，HBsAg）表現水準的下降在投予後持續一段時間。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，HBsAg 的可檢測之表現減少持續在 7 至 70 天的期間內。例如，在一些實施例中，在投予寡核苷酸後，可檢測的減少持續在 10 至 70、10 至 60、10 至 50、10 至 40、10 至 30 或 10 至 20 天的期間內。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在 20 至 70、20 至 60、20 至 50、20 至 40 或 20 至 30 天的期間內。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在 30 至 70、30 至 60、30 至 50 或 30 至 40 天的期間內。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在 40 至 70、40 至 60、40 至 50、50 至 70、50 至 60 或 60 至 70 天的期間內。
在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測之 HBsAg 表現的減少持續在 2 至 21 週的期間內。例如，在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在 2 至 20、4 至 20、6 至 20、8 至 20、10 至 20、12 至 20、14 至 20、16 至 20 或 18 至 20 週的期間內。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在 2 至 16、4 至 16、6 至 16、8 至 16、10 至 16、12 至 16 或 14 至 16 週的期間內。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在 2 至 12、4 至 12、6 至 12、8 至 12 或 10 至 12 週的期間內。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在 2 至 10、4 至 10、6 至 10 或 8 至 10 週的期間內。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合的寡核苷酸，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，其是以轉殖基因的形式被遞輸，該轉殖基因經工程改造以在細胞中表現寡核苷酸（例如，其正義和反義股）。在一些實施例中，本發明之醫藥組合的寡核苷酸，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，其是使用轉殖基因被遞輸，該轉殖基因經工程改造以表現本文所揭露之任何寡核苷酸  可以使用病毒載體（例如，腺病毒、反轉錄病毒、牛痘病毒、痘病毒、腺相關病毒或單純皰疹病毒）或非病毒載體（例如質體或合成的 mRNA）遞輸轉殖基因。在一些實施例中，本發明之醫藥組合的轉殖基因可以直接注射至個體。
II. 治療方法
本揭露之方面涉及用於減少 HBsAg 表現（例如，減少 HBsAg 表現）以治療個體 HBV 感染的方法。在一些實施例中，該方法可以包括向所需個體投予醫藥組合，該醫藥組合包含有效量之本文所揭露之任何一種寡核苷酸。本揭露提供了預防和治療方法，治療處於 HBV 感染風險（易於感染）及/或與 HBV 感染相關的疾病或病症之個體。
在某些方面，本揭露提供了藉由向個體投予治療劑（例如，治療組合、寡核苷酸或載體或編碼相同的轉殖基因）來在個體中預防如本文所述的疾病或病症的方法。在一些實施例中，特別是在治療組合之寡核苷酸是 RNAi 寡核苷酸的情況下，待治療的個體是將從 HBsAg 蛋白量減少（例如肝臟中）中受有治療上之利益的個體。例如，可以藉由本領域已知的診斷或預後測定中的一種或組合（例如，鑑定肝硬化及/或肝臟發炎）來鑑定具有疾病或病症風險的個體。預防試劑的投予可以在疾病或病症的特徵性症狀的檢測或表現之前進行，使得疾病或病症可被預防或替代地延緩其發展。
本文所述之方法通常涉及向個體投予有效量的治療組合，即能夠產生期望之治療結果的量。治療上可接受的量可以是能夠治療疾病或病症的量。任何一位個體的合適劑量取決於某些因素，包括個體的身材、體表面積、年齡、要投予的特定組合物、組合物中的活性成分、投予時間和途徑、總體健康狀況和其他同時投予的藥物。例如，劑量可以在 0.1 mg/kg 至 12 mg/kg 的範圍內。劑量也可以在 0.5 至 10 mg/kg 的範圍內。或者，劑量可以在 1.0 至 6.0 mg/kg 的範圍內。劑量也可以在 3.0 至 5.0 mg/kg 的範圍內。
在一些實施例中，藉由腸胃內（例如，口服，藉由胃飼管、藉由十二指腸飼管、藉由胃造口術或直腸）、腸胃外（例如，皮下注射、靜脈注射或輸注，動脈內注射或輸注、骨內輸注、肌內注射、腦內注射、腦室內注射、鞘內）、局部（例如，表皮、吸入、經由滴眼液或透過粘膜）或通過直接注射入目標器官（例如，個體的肝臟）向個體投予本文所揭露之治療組合的任何一種組成物。通常，本文所揭露之治療組合的寡核苷酸試通過靜脈或皮下投予。
如一組非限制性實例，本即時揭露之治療組合的寡核苷酸通常是每季（每三個月一次）、每兩個月（每兩個月一次）、每月或每週一次投予。例如，寡核苷酸可以每一、二或三週投予一次。寡核苷酸可以每天投予。
在一個優選的實施例中，本發明之 RNAi 化合物是靶向 HBV 的 siRNA，其以 0.1 mg/kg 至 7 mg/kg 之間的劑量皮下投予，優選地在 0.5 mg/kg 至 6.5 mg/kg 之間，最優選地在 1 mg/kg 至 6 mg/kg 之間。在一個實施例中，該劑量每兩週一次、每四周一次或每六週一次投予。在一個優選的實施例中，該劑量每月一次投予。在一個特別優選的實施例中，每月一次投予 1 mg/kg 至 6 mg/kg 之間的劑量。每月一次被理解為是指以大約一個日曆月的長度間隔投予連續劑量。
在一些實施例中，待治療的個體是人類或非人類的靈長類動物或其他哺乳動物個體。其他示例性的個體包括家養動物，例如狗和貓；家畜，例如馬、牛、豬、綿羊、山羊和雞等；以及例如小鼠、大鼠、豚鼠和倉鼠等動物。
實施例
本發明之以下實施例可與本文所述之任何其他實施例結合運用： 1. 一種醫藥組合，其包含以下項或由以下項組成：治療性寡核苷酸、及式 (I) 或式 (II) 之 TLR7 促效劑：
Figure 02_image117
其中，X 為 CH2 或 S； 針對式 (I)，R1 為 -OH 或 -H 且 R2 為 1-羥丙基或羥甲基， 針對式 (II)，R1 為 -OH 或 -H 或乙醯氧基且 R2 為 1-乙醯氧基丙基或 1-羥丙基或 1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基， 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。 2. 如實施例 1 之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸為 RNAi 寡核苷酸。 3. 如實施例 2 之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為靶向 HBV 之寡核苷酸 (RNAi ID NO: 1 )。 4. 如實施例 2 或 3 之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為靶向 HBsAg mRNA 之寡核苷酸 (RNAi ID NO: 2 )。 5. 如實施例 2 至 4 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為減少 HBsAg mRNA 表現之寡核苷酸 (RNAi ID NO: 3 )。 6. 如實施例 2 至 5 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為包含長度為 19 至 30 個核苷酸的反義股之寡核苷酸，其中，該反義股包含與如ACAANAAUCCUCACAAUA  (SEQ ID NO: 33) 中所示之 HBsAg mRNA 序列互補之區域 (RNAi ID NO: 4 )。 7. 實施例 2 至 5 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為用於減少 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) mRNA 表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含長度為 19 至 30 個核苷酸的反義股，其中，該反義股包含與如ACAANAAUCCUCACAAUA  (SEQ ID NO: 33) 中所示之 HBsAg mRNA 序列互補之區域 (RNAi ID NO: 5 )。 8. 實施例 6 或 7 之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸進一步包含長度為 19 至 50 個核苷酸的有義股，其中，該有義股與該反義股形成雙股螺旋區域。 9. 如實施例 8 之醫藥組合，其中，該有義股包含與如UUNUUGUGAGGAUUN  (SEQ ID NO: 34) 中所示之序列互補之區域。 10. 如實施例 8 或 9 之醫藥組合，其中，該有義股包含與如5′-UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC  (SEQ ID NO: 35) 中所示之序列互補之區域。 11. 如實施例 9 之醫藥組合，其中，該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG  (SEQ ID NO: 36) 中所示之序列。 12. 如實施例 9 之醫藥組合，其中，該反義股由如UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG  (SEQ ID NO: 37) 中所示之序列組成。 13. 如實施例 9 之醫藥組合，其中，該反義股由如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG  (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列組成。 14. 如實施例 8 至 12 中任一實施例之醫藥組合，其中，該有義股包含如ACAANAAUCCUCACAAUAA  (SEQ ID NO: 39) 中所示之序列。 15. 如實施例 8 至 14 中任一實施例之醫藥組合，其中，該有義股包含如GACAANAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC  (SEQ ID NO: 40) 中所示之序列。 16. 如實施例 8 至 14 中任一實施例之醫藥組合，其中，該有義股由如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列組成。 17. 如實施例 8 至 14 中任一實施例之醫藥組合，其中，該有義股由如 GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC  (SEQ ID NO: 42) 中所示之序列組成。 18. 如實施例 2 至 5 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為用於減少 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) mRNA 表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中，該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC  (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，其中，該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列， 其中，該反義股及該有義股之各者包含一個或多個經 2′-氟及 2′-O-甲基修飾之核苷酸及至少一個硫代磷酸酯鍵聯，其中，反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳包含磷酸酯類似物，並且其中，有義股經結合至一個或多個 N-乙醯半乳胺糖 (GalNAc) 部分。 19. 如實施例 2 至 5 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為用於減少 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) mRNA 表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中： 該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2′-氟修飾之核苷酸；在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸；及至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股經結合至一個或多個 N-乙醯半乳胺糖 (GalNAc) 部分；並且 該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列，且其包含在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 的經 2′-氟修飾之核苷酸；在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸；及至少三個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳包含磷酸酯類似物。 20. 如實施例 19 所示之醫藥組合，其中，該有義股包含介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。 21. 如實施例 19 或 20 之醫藥組合，其中，該反義股包含介於核苷酸 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21、及 21 與 22 之間的五個硫代磷酸酯鍵聯。 22. 如實施例 19 至 21 中任一實施例之醫藥組合，其中，該反義股的 5’-核苷酸具有下列結構：
Figure 02_image119
23. 如實施例 19 至 22 中任一實施例之醫藥組合，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸中之一個或多個經結合至單價 GalNAc 部分。 24. 如實施例 23 之醫藥組合，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸中之各者經結合至單價 GalNAc 部分。 25. 如實施例 24 之醫藥組合，其中，該 –GAAA– 模體包含下列結構：
Figure 02_image121
， 其中： L 代表鍵結、點擊化學控點或長度為 1 至 20 個含連續共價鍵結原子的連接子，其選自由以下各項所組成之群組：取代和未取代之伸烷基 (alkylene)、取代和未取代之伸烯基 (alkenylene)、取代和未取代之伸炔基 (alkynylene)、取代和未取代之伸雜烷基 (heteroalkylene)、取代和未取代之伸雜烯基 (heteroalkenylene)、取代和未取代之伸雜炔基 (heteroalkynylene)、及其組合；並且 X 為 O、S或 N。 26. 如實施例 25 之醫藥組合，其中，L 為縮醛連接子。 27. 如實施例 25 或 26 之醫藥組合，其中，X 為 O。 28. 如實施例 20 之醫藥組合，其中，該 –GAAA– 序列包含下列結構：
Figure 02_image123
29. 如實施例 8 之醫藥組合，其中，該有義股在其 3′ 端包含如下所示之主幹-環圈：S1 -L-S2 ，其中，S1 與 S2 互補，並且其中，L 形成長度達至 6 個核苷酸的介於 S1 與 S2 之間之環圈。 30. 如實施例 29 之醫藥組合，其中，L 為四鹼基環圈。 31. 如實施例 29 或 30 之醫藥組合，其中，L 形成長度為 4 個核苷酸的介於 S1 與 S2 之間之環圈。 32. 如實施例 29 至 31 中任一實施例之醫藥組合，其中，L 包含 GAAA 所示之序列。 33. 如實施例 29 至 32 中任一實施例之醫藥組合，其中，該主幹-環圈的 L 之達至 4 個核苷酸各自結合至單獨的 GalNAc。 34. 如實施例 6 至 16 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。 35. 如實施例 34 之醫藥組合，其中，該經修飾之核苷酸包含 2′-修飾。 36. 如實施例 35 之醫藥組合，其中，該 2′-修飾為選自以下各項之修飾：2′-胺基乙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基及 2′-去氧-2′-氟-β-d-阿糖核酸。 37. 如實施例 6 至 16 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸之所有核苷酸為經修飾之核苷酸。 38. 如實施例 6 至 16 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯。 39. 如實施例 38 之醫藥組合，其中，該至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。 40. 如實施例 6 至 16 中任一實施例之醫藥組合，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳包含磷酸酯類似物。 41. 如實施例 6 至 16 中任一實施例之醫藥組合，其中，該寡核苷酸的至少一個核苷酸經結合至靶向配體。 42. 如實施例 41 之醫藥組合，其中，該靶向配體為 N-乙醯半乳胺糖 (GalNAc) 部分。 43. 如實施例 2 至 5 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為用於減少 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) mRNA 表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中： 該有義股由如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列組成，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之硫代磷酸酯鍵聯，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸之各者經結合至單價 GalNAc 部分；並且 該反義股由如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列組成，且在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 包含經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 包含經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及包含介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間、介於在位置 2 與 3 的核苷酸之間、介於在位置 3 與 4 的核苷酸之間、介於在位置 20 與 21 的核苷酸之間及介於在位置 21 與 22 的核苷酸之間之硫代磷酸酯鍵聯， 其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳包含甲氧基膦酸酯 (MOP) (RNAi ID NO: 6 )。 44. 如實施例 2 至 5 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為用於減少 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) mRNA 表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中： 該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2’-氟修飾之核苷酸；在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸；及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸之各者經結合至單價 GalNAc 部分，其中，該 –GAAA– 序列包含下列結構：
Figure 02_image125
；並且 該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG  (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列，且在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 包含經 2′-氟修飾之核苷酸；在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 包含經 2′-O-甲基修飾之核苷酸；及包含介於核苷酸 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21及 21 與 22 之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳具有下列結構：
Figure 02_image127
(RNAi ID NO: 7 )。 45. 如實施例 2 至 5 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸具有如圖 29A 中所繪示之結構 (RNAi ID NO: 8 )。 46. 如實施例 2 至 5 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為寡核苷酸 HBV(s)-219 (RNAi ID NO: 9 )。 47. 如實施例 1 之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸為長度為 13 至 22 個核苷酸的經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸，其具有至少 12 個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與來自 SEQ ID NO: 1 的位置 1530 至 1602 之連續序列為 100% 互補。 48. 如實施例 47 之醫藥組合，其中，該連續核苷酸序列與選自由以下各項所組成之群組之標靶序列為 100% 互補：SEQ ID NO: 1 的位置 1530 至 1598；1530 至 1543；1530 至 1544；1531 至 1543；1551 至 1565；1551 至 1566；1577 至 1589；1577 至 1591；1577 至 1592；1578 至 1590；1578 至 1592；1583 至 1598；1584 至 1598；1585 至 1598 及 1583 至 1602。 49. 如實施例 47 或 48 之醫藥組合，其中，該連續核苷酸序列的長度為介於 12 至 16 個核苷酸之間。 50. 實施例 47 至 49 中任一實施例之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列選自由以下各項所組成之群組： gcgtaaagagagg (SEQ ID NO: 2)； gcgtaaagagaggt (SEQ ID NO: 3)； cgcgtaaagagaggt (SEQ ID NO 4)； agaaggcacagacgg (SEQ ID NO 5)； gagaaggcacagacgg (SEQ ID NO 6)； agcgaagtgcacacgg (SEQ ID NO 7)； gaagtgcacacgg (SEQ ID NO 8)； gcgaagtgcacacgg (SEQ ID NO 9)； agcgaagtgcacacg (SEQ ID NO: 10)； cgaagtgcacacg (SEQ ID NO 11)； aggtgaagcgaagtgc (SEQ ID NO: 12) aggtgaagcgaagtg (SEQ ID NO: 13)； aggtgaagcgaagt (SEQ ID NO 14) 及 gcagaggtgaagcgaagtgc (SEQ ID NO: 29)，或其醫藥上可接受之鹽。 51. 如實施例 47 至 50 中任一實施例之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列為式 5’-F-G-F’-3’ 之缺口體，其中，區域 F 及 F’ 獨立地由 2 至 5 個經 2’ 糖修飾之核苷酸組成，且界定該區域 F 及 F’ 的 5’及 3’端，且 G 為介於 6 與 10 個 DNA 核苷之間的能夠招募核糖核酸酶 H 之區域。 52. 如實施例 51 之醫藥組合，其中，該 2’ 糖修飾核苷獨立地選自由以下各項所組成之群組：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、2’-氟-ANA 及 LNA 核苷。 53. 如實施例 51 或 52 中任一實施例之醫藥組合，其中，該一個或多個 2’ 糖修飾核苷為 MOE 核苷。 54. 如實施例 51 或 52 中任一實施例之醫藥組合，其中，該一個或多個 2’ 糖修飾核苷為 LNA 核苷。 55. 如實施例 54 之醫藥組合，其中，該經修飾之 LNA 核苷選自氧-LNA、胺基-LNA、硫代-LNA、cET 及 ENA。 56. 如實施例 54 或 55 之醫藥組合，其中，該經修飾之 LNA 核苷為氧-LNA，其具有下列 2’-4’ 橋 –O-CH2 -。 57. 如實施例 56 之醫藥組合，其中，該氧-LNA 為 β-D-氧-LNA。 58. 如實施例 54 或 55 之醫藥組合，其中，該經修飾之 LNA 核苷為 cET，其具有下列 2’-4’ 橋 –O-CH(CH3 )-。 59. 如實施例 58 之醫藥組合，其中，該 cET 為 (S)cET，即 6’(S)甲基-β-D-氧-LNA。 60. 如實施例 54 或 55 之醫藥組合，其中，該 LNA 為 ENA，其具有下列 2’ – 4’ 橋 –O-CH2 -CH2 -。 61. 如實施例 47 至 60 中任一實施例之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列選自由以下各項所組成之群組： GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO: 2)； GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO: 2)； GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO: 3)； CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 4)； AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 5)； GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 6)； AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 7)； GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO: 8)； GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO: 8)； GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 9)； AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO: 10)； CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO: 11)； AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO: 12)； AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO: 13) AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO: 13)； AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO: 14) 及 GCAGAGgtgaagcgaAGTGC (SEQ ID NO: 29) 其中，大寫字母表示 LNA 或 MOE 核苷且小寫字母表示 DNA 核苷。 62. 如實施例 47 至 61 中任一實施例之醫藥組合，其中，連續核苷酸序列內的至少 50% 之該核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 63. 如實施例 47 至 62 中任一實施例之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸的連續核苷酸序列內的所有核苷間鍵聯均為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 64. 如實施例 47 至 63 中任一實施例之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸之 GalNAc 結合物為二價、三價或四價 GalNAc 簇。 65. 如實施例 64 之醫藥組合，其中，該 GalNAc 結合物選自圖 1B、1D 或 1J。 66. 如實施例 47 至 65 中任一實施例之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸之 GalNAc 結合物及連續核苷酸序列是藉由包含兩、三、四或五個經磷酸二酯連接的 DNA 核苷之 PO 連接子共價連接的。 67. 如實施例 66 的實施例之醫藥組合，其中，該 PO 連接子為反義寡核苷酸一部分且由胞嘧啶及腺嘌呤 (CA) 之二核苷酸序列加上至少兩個磷酸二酯鍵聯組成，該磷酸二酯鍵聯一個介於 C 與 A 之間且一個接至 GalNAc 簇。 68. 如實施例 47 至 67 中任一實施例之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸長度為 12 至 18 個核苷酸。 69. 如實施例 47 至 68 中任一實施例之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸選自由以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsG -3' SEQ ID NO: 15
5'-GN2-C6o co ao G sm C sG stsasasasgsasgsA sG sG -3' SEQ ID NO: 15
5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsGsT -3' SEQ ID NO: 16
5'-GN2-C6o co ao mCsGsmCs gstsasasasgsasgsasGsGsT -3' SEQ ID NO: 17
5'-GN2-C6o co ao AsGsAs asgsgscsascsasgsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 18
5'-GN2-C6o co ao GsAsGs asasgsgscsascsasgsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 19
5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 20
5'- GN2-C6o co ao GsAsAs gstsgscsascsasmcsGsG -3' SEQ ID NO: 21
5’-GN2-C6o co ao GsAsA sgstsgscsascsasm CsGsG -3’ SEQ ID NO: 21
5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs asasgstsgscsascsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 22
5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsAsmCsG -3' SEQ ID NO: 23
5'-GN2-C6o co ao mCsGsAs asgstsgscsascsasmCsG -3' SEQ ID NO: 24
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasgsTsGsmC -3' SEQ ID NO: 25
5’-GN2-C6o co ao A sG sgstsgsasasgsmcsgsasA sG sT sG -3' SEQ ID NO: 26
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasGsTsG -3' SEQ ID NO: 26 及
5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasAsGsT -3' SEQ ID NO: 27
其中，大寫粗體字母表示 β-D-氧-LNA 單元；小寫字母表示 DNA 單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標 m 表示含有 5-甲基胞嘧啶鹼基的 DNA 或 β-D-氧-LNA 單元；GN2-C6 表示帶有 C6 連接子的 GalNAc2 結合物，或其醫藥上可接受之鹽。 69. 如實施例 47 至 68 中任一實施例之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸為5’-Fig1J-o G sC sA sG sA sgsgstsgsasasgscsgsasA sG sT sG sC -3’ (圖 2)，其中，劃有底線的大寫字母表示 MOE 單元；小寫字母表示 DNA 單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯。 70. 如實施例 1 至 69 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 TLR7 促效劑為式 (III) 所示者：
Figure 02_image129
其中，R1 為 –OH 或乙醯氧基且 R2 為 1-乙醯氧基丙基或 1-羥丙基或 1-羥甲基 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。 71. 如實施例 1 至 69 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 TLR7 促效劑為式 (IV) 所示者：
Figure 02_image131
其中，R1 為乙醯氧基（環丙基）甲基或乙醯氧基（丙炔-1-基）甲基。 72. 如實施例 1 至 69 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 TLR7 促效劑為式 (V) 所示者：
Figure 02_image133
其中，R1 為 -OH 且 R2 為 1-羥丙基或羥甲基 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。 73. 如實施例 0 至 72 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 TLR7 促效劑選自由以下各項所組成之群組： [(1S )-1-[(2S ,4R ,5R )-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d ]嘧啶-3-基)-4-羥基-四氫呋喃-2-基]丙基] 乙酸酯 (CMP ID NO: VI)； 5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮 (CMP ID NO: VII)； 5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮 (CMP ID NO: VIII)； 5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮 (CMP ID NO: IX)； 5-胺基-3-(2'-O-乙醯基-3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮 (CMP ID NO: X)； 5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮 (CMP ID NO: XI)； [(S )-[(2S ,5R )-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d ]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]-環丙基-甲基] 乙酸酯 (CMP ID NO: XII) 及 (1S)-1-[(2S,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]丁-2-炔基] 乙酸酯 (CMP ID NO: XIII)； 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。 74. 如實施例 2 至 46 及 70 至 73 中任一實施例之醫藥組合，其中，包含 RNAi 寡核苷酸及 TLR7 促效劑之組合選自由以下組合所組成之群組： RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: VI； RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: VII； RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: VIII； RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: XIII，或 RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: XIII； 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。 75. 如實施例 2 至 46 及 70 至 73 中任一實施例之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為 RNAi ID NO: 7： 包含與反義股形成雙股螺旋區域的有義股之寡核苷酸，其中： 該有義股包含如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸中之各者經結合至單價 GalNac 部分，其中，該 –GAAA– 序列包含下列結構：
Figure 02_image135
；並且 該反義股包含如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列，且其包含在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 的經 2′-氟修飾之核苷酸，在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸，及介於核苷酸 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21及 21 與 22 之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳具有下列結構：
Figure 02_image137
； 且該 TLR7 促效劑為 CMP ID NO: VI：
Figure 02_image139
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。 76. 如實施例 47 至 73 中任一實施例之醫藥組合，其中，包含經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸及 TLR7 促效劑之組合選自由以下組合所組成之群組：CMP ID NO: 15_ 1 及 VI；CMP ID NO: 15_ 2 及 VI；CMP ID NO: 16_ 1 及 VI；CMP ID NO: 20_ 1 及 VI；CMP ID NO: 23_ 1 及 VI；CMP ID NO: 26_ 1 及 VI；CMP ID NO: 29_ 1 及 VI；CMP ID NO: 15_ 1 及 VII；CMP ID NO: 15_ 2 及 VII；CMP ID NO: 16_ 1 及 VII；CMP ID NO: 20_ 1 及 VII；CMP ID NO: 23_ 1 及 VII；CMP ID NO: 26_ 1 及 VII；CMP ID NO: 29_ 1 及 VII；CMP ID NO: 15_ 1 及 VIII；CMP ID NO: 15_ 2 及 VIII；CMP ID NO: 16_ 1 及 VIII；CMP ID NO: 20_ 1 及 VIII；CMP ID NO: 23_ 1 及 VII；CMP ID NO: 26_ 1 及 VIII；CMP ID NO: 29_ 1 及 VIII；CMP ID NO: 15_ 1 及 XIII；CMP ID NO: 15_ 2 及 XIII；CMP ID NO: 16_ 1 及 XIII；CMP ID NO: 20_ 1 及 XIII；CMP ID NO: 23_ 1 及 XIII；CMP ID NO: 26_ 1 及 XIII；及 CMP ID NO: 29_ 1 及 XIII，或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。 77. 如實施例 47 至 73 中任一實施例之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸為如圖 5 中所示之 CMP ID NO: 15_1 且該 TLR7 促效劑為 CMP ID NO: VI：
Figure 02_image141
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。 78. 如實施例 1 至 77 中任一實施例之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是以醫藥上可接受之鹽來調製的。 79. 如實施例 78 之醫藥組合，其中，該醫藥上可接受之鹽為金屬陽離子，其中較佳的是，該醫藥上可接受之鹽為 Na+ 或 K+ 。 80. 如實施例 1 至 79 中任一實施例之醫藥組合，其中，如實施例 1 至 79 中任一實施例所述之治療性寡核苷酸及 TLR7 促效劑是以醫藥上可接受之載體來調製的。 81. 如實施例 80 之醫藥組合，其中，該醫藥上可接受之載體為水。 82. 如實施例 1 至 81 中任一實施例之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是調製於磷酸鹽緩衝液中的。 83. 如實施例 1 至 82 中任一實施例之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是調製用於皮下注射的，且該 TLR7 促效劑是調製用於口服投予的。 84. 如實施例 1 至 82 中任一實施例之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是調製用於靜脈內注射的，且該 TLR7 促效劑是調製用於口服投予的。 85. 如實施例 2 至 46、74、75 和 78 至 82 中任一實施例之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸為調製用於皮下注射之 siRNA 且該 TLR7 促效劑是調製用於口服投予的。 86. 如實施例 1 至 85 中任一實施例之醫藥組合，其中，該醫藥組合包含 RNAi 寡核苷酸及 TLR7 促效劑，其中，該醫藥組合進一步包含 CpAM(核心蛋白別構調節劑)。 87. 如實施例 86 之醫藥組合，其中，該 CpAM 具有根據下面所示的化合物 (CpAM1) 之式：
Figure 02_image143
化合物 (CpAM1) 其中 R1 為氫、鹵素或 C1-6 烷基； R2 為氫或鹵素； R3 為氫或鹵素； R4 為 C1-6 烷基； R5 為氫、羥C1-6 烷基、胺基羰基、C1-6 烷氧基羰基或羧基； R6 為氫、C1-6 烷氧基羰基或羧基-Cm H2m -， X 為羰基或磺醯基； Y 為 -CH2 -、-O- 或 -N(R7 )-， 其中，R7 為氫、C1-6 烷基、鹵C1-6 烷基、C3-7 環烷基-Cm H2m -、C1-6 烷氧基羰基-Cm H2m -、-Ct H2t -COOH、-鹵C1-6 烷基-COOH、-(C1-6 烷氧基)C1-6 烷基-COOH、-C1-6 烷基-O-C1-6 烷基-COOH、-C3-7 環烷基-Cm H2m -COOH、-Cm H2m -C3-7 環烷基-COOH、羥-Ct H2t -、羧基螺[3.3]庚基或羧基苯基-Cm H2m -、羧基吡啶基-Cm H2m -； W 為 -CH2 -、-C(C1-6 烷基)2 -、-O- 或羰基； n 為 0 或 1； m 為 0 至 7； t 為 1 至 7； 或其醫藥上可接受之鹽、或鏡像異構物或非鏡像異構物。 88. 如實施例 86 或 87 之醫藥組合，其中，該 CpAM 為化合物 (CpAM2)
Figure 02_image145
化合物 (CpAM2) 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。 89. 一種醫藥組合，其包含 RNAi 寡核苷酸、TLR7 促效劑及 CpAM，其中，該 RNAi 寡核苷酸為 RNAi ID NO: 7： 包含與反義股形成雙股螺旋區域的有義股之寡核苷酸，其中： 該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸中之各者經結合至單價 GalNAc 部分，其中，該 –GAAA– 序列包含下列結構：
Figure 02_image147
；並且 該反義股包含如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列，且其包含在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 的經 2′-氟修飾之核苷酸，在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸，及介於核苷酸 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21及 21 與 22 之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳具有下列結構：
Figure 02_image149
； 其中，該 TLR7 促效劑為 CMP ID NO: VI：
Figure 02_image151
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物； 並且其中，該 CpAM 為化合物 (CpAM2)：
Figure 02_image153
化合物 (CpAM2)， 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。 90. 一種醫藥組成物，其包含如實施例 1 至 89 中任一實施例之醫藥組合。 91. 一種部件套組，其包含如實施例 1 至 89 中任一實施例之治療性寡核苷酸和具有有關投予 TLR7 促效劑以治療 B 型肝炎病毒感染之說明的包裝插頁。 92. 如實施例 91 之部件套組，其中，於該包裝插頁中所述之 TLR7 促效劑為如實施例 1 至 89 中任一項之 TLR7 促效劑。 93. 如實施例 91 或 92 之部件套組，其中，該套組包含如實施例 1 至 89 中任一實施例之治療性寡核苷酸及如實施例 1 至 89 中任一實施例之 TLR7 促效劑。 94. 如實施例 91 至 93 中任一實施例之部件套組，其中，該治療性寡核苷酸是調製用於皮下注射的，且該 TLR7 促效劑是調製用於口服投予的。 95. 如實施例 91 至 94 中任一實施例之部件套組，其中，該包裝插頁說明慢性 B 型肝炎病毒感染之治療。 96. 如實施例 1 至 95 中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸為經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式。 97. 一種如實施例 1 至 96 中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組用於治療 B 型肝炎病毒感染之用途。 98. 如實施例 97 之用途，其中，待治療的 B 型肝炎病毒感染為慢性 B 型肝炎病毒感染。 99. 如實施例 97 或 98 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑是以醫藥有效量投予的。 100. 如實施例 97 至 99 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該 TLR7 促效劑是每隔一天投予的。 101. 如實施例 97 至 100 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予 1 至 4 mg/kg 的劑量給藥的，且該 TLR7 促效劑是以每次投予 150 至 170 mg 的劑量給藥的。 102. 如實施例 97 至 101 中任一實施例之用途，其中，投予該治療性寡核苷酸達 48 週，且投予 84 劑的 TLR7 促效劑。 103. 如實施例 97 至 102 中任一實施例之用途，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及 TLR7 促效劑之投予。 104. 如實施例 97 至 103 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該 TLR7 促效劑為用於口服投予之劑型。 105. 如實施例 97 至 104 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為 100 至 150 mg/ml，且該 TLR7 促效劑之劑量為 150 至 170 mg。 106. 如實施例 97 至 105 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼 HBV mRNA 轉錄本的非表面抗原的 RNAi 寡核苷酸治療的情況下投予的。 107. 如實施例 97 至 106 中任一實施例之用途，其中，該個體未被投予選擇性靶向 HBxAg mRNA 轉錄本的 RNAi 寡核苷酸。 108. 如實施例 97 至 107 中任一實施例之用途，其進一步包含將有效量之恩替卡韋投予該個體。 109. 如實施例 97 至 108 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。 110. 如實施例 1 至 96 中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組，其用於醫藥中。 111. 如實施例 1 至 96 中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組，其用於治療 B 型肝炎病毒感染。 112. 如實施例 110 或 111 所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，待治療的 B 型肝炎病毒感染為慢性 B 型肝炎病毒感染。 113. 如實施例 110 至 112 中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑是以醫藥有效量投予的。 114. 如實施例 110 至 113 中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該 TLR7 促效劑是每隔一天投予的。 115. 如實施例 110 至 114 中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予 1 至 4 mg/kg 的劑量給藥的，且該 TLR7 促效劑是以每次投予 150 至 170 mg 的劑量給藥的。 116. 如實施例 110 至 115 中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，投予該治療性寡核苷酸達 48 週，且投予 84 劑的 TLR7 促效劑。 117. 如實施例 110 至 116 中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑之投予。 118. 如實施例 110 至 117 中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該 TLR7 促效劑為用於口服投予之劑型。 119. 如實施例 110 至 118 中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為 100 至 150 mg/ml，且 TLR7 促效劑之劑量為 150 至 170 mg。 120. 如實施例 110 至 119 中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼 HBV mRNA 轉錄本的非表面抗原的 RNAi 寡核苷酸治療的情況下投予的。 121. 如實施例 110 至 120 中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該個體未被投予選擇性靶向 HBxAg mRNA 轉錄本的 RNAi 寡核苷酸。 122. 如實施例 110 至 121 中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其進一步包含將有效量之恩替卡韋投予該個體。 123. 如實施例 110 至 122 中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。 124. 一種治療性寡核苷酸在製造用於治療 B 型肝炎病毒感染的第一藥物中之用途，其中，該第一藥物為如實施例 1 至 96 中任一實施例之治療性寡核苷酸，並且其中，該第一藥物是併以第二藥物來投予的，其中，該第二藥物為如實施例 1 至 96 中任一實施例之 TLR7 促效劑。 125. 一種如實施例 1 至 96 中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組在製造藥物中之用途。 126. 一種如實施例 1 至 96 中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組在製造用於治療 B 型肝炎病毒感染之藥物中之用途。 127. 如實施例 124 至 126 中任一實施例之用途，其中，待治療的 B 型肝炎病毒感染為慢性 B 型肝炎病毒感染。 128. 如實施例 124 至 127 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑是以醫藥有效量投予的。 129. 如實施例 124 至 128 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該 TLR7 促效劑是每隔一天投予的。 130. 如實施例 124 至 129 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予 1 至 4 mg/kg 的劑量給藥的，且該 TLR7 促效劑是以每次投予 150 至 170 mg 的劑量給藥的。 131. 如實施例 124 至 130 中任一實施例之用途，其中，投予該治療性寡核苷酸達 48 週，且投予 84 劑的 TLR7 促效劑。 132. 如實施例 124 至 131 中任一實施例之用途，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑之投予。 133. 如實施例 124 至 132 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該 TLR7 促效劑為用於口服投予之劑型。 134. 如實施例 124 至 133 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為 100 至 150 mg/ml，且該 TLR7 促效劑之劑量為 150 至 170 mg。 135. 如實施例 124 至 134 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼 HBV mRNA 轉錄本的非表面抗原的 RNAi 寡核苷酸治療的情況下投予的。 136. 如實施例 124 至 135 中任一實施例之用途，其中，該個體未被投予選擇性靶向 HBxAg mRNA 轉錄本的 RNAi 寡核苷酸。 137. 如實施例 124 至 136 中任一實施例之用途，其進一步包含將有效量之恩替卡韋投予該個體。 138. 如實施例 124 至137 中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。 139. 一種用於治療 B 型肝炎病毒感染之方法，該方法包含將治療有效量之如實施例錯誤 ! 找不到參照來源。 至 96 中任一實施例之治療性寡核苷酸併以治療有效量之如實施例錯誤 ! 找不到參照來源。 至 90 或 93 至 96 中任一實施例之 TLR7 促效劑投予受 B 型肝炎病毒感染之個體。 140. 一種用於治療 B 型肝炎病毒感染之方法，該方法包含將治療有效量之如實施例錯誤 ! 找不到參照來源。 至 96 中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組投予受 B 型肝炎病毒感染之個體。 141. 如實施例 139 或 140 之方法，其中，待治療的 B 型肝炎病毒感染為慢性 B 型肝炎病毒感染。 142. 如實施例 139 至 141 中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑是以醫藥有效量投予的。 143. 如實施例 139 至 142 中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該 TLR7 促效劑是每隔一天投予的。 144. 如實施例 139 至 143 中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予 1 至 4 mg/kg 的劑量給藥的，且該 TLR7 促效劑是以每次投予 150 至 170 mg 的劑量給藥的。 145. 如實施例 139 至 144 中任一實施例之方法，其中，投予該治療性寡核苷酸達 48 週，且投予 84 劑的 TLR7 促效劑。 146. 如實施例 139 至 145 中任一實施例之方法，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑之投予。 147. 如實施例 139 至 146 中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該 TLR7 促效劑為用於口服投予之劑型。 148. 如實施例 139 至 147 中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為 100 至 150 mg/ml，且該 TLR7 促效劑之劑量為 150 至 170 mg。 149. 如實施例 139 至 148 中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼 HBV mRNA 轉錄本的非表面抗原的 RNAi 寡核苷酸治療的情況下投予的。 150. 如實施例 139 至 149 中任一實施例之方法，其中，該個體未被投予選擇性靶向 HBxAg mRNA 轉錄本的 RNAi 寡核苷酸。 151. 如實施例 139 至 150 中任一實施例之方法，其進一步包含將有效量之恩替卡韋投予該個體。 152. 如實施例 139 至 151 中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。 153. 一種減少 B 型肝炎病毒表面抗原在細胞中的表現之方法，該方法包含將如實施例 1 至 90 中任一實施例之醫藥組合或組成物遞輸至該細胞。 154. 如實施例 153 之方法，其中，該細胞為肝細胞。 155. 如實施例 153 或 154 之方法，其中，該細胞是在體內。 156. 如實施例 153 或 154 之方法，其中，該細胞是在體外。 157. 如實施例 153 至 156 中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在該細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。 158. 一種實質上如本文中所述並參照附圖之醫藥組合、組成物、套組、用途或方法。
實例
A 部分： RNAi 寡核苷酸的效果
實例 A1 有效之 HBsAg 表現的寡核苷酸抑製劑的開發
HBV 表面抗原被識別作為 RNAi 為基礎療法的目標，以治療 HBV 感染。如圖 20 顯示的 HBV 基因組結構所示，HBsAg 由從單一 ORF 轉錄的三個 RNA 分子所編碼。設計寡核苷酸是為了使一個或多個有助於 HBsAg 組裝（示例 RNAi 目標位在圖 20 中用「X」表示）的 RNA 轉錄本緘黙化。在體外和體內設計並評估靶向 HBsAg 之寡核苷酸 HBV-254。選擇 HBV-254 ，且 HBV-254 是根據直接靶向四種 HBV RNA 種類之 mRNA 轉錄本的能力而設計的。實驗中使用的 HBV-254 雙股螺旋寡核苷酸包含以下所示之序列（顯示 5’ 至 3’）的有義股：GUGGUGGACUUCUCUCAAUAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 55)；以及以下所示之序列（顯示 5’ 至 3’）的反義股：UAUUGAGAGAAGUCCACCACGG (SEQ ID NO: 56)。
對 HDI 小鼠進行單一劑量寡核苷酸 HBV-254 的評估，以證明皮下靶向 HBsAg 病毒轉錄本的能力（圖 20）。如圖所示，HBV-254 隨著劑量的增加而系統性地減少小鼠中 HBsAg 水準。在小鼠中進一步評估臨床前效力，採用 QW×3 給藥方案，以 3 mg/kg 皮下投予 HBV-254（圖 23）。投予點在圖中用箭頭表示。在經過寡核苷酸治療和未經治療的對照小鼠中監測 HBsAg 水準，持續 147 天。在整個研究中，經治療之小鼠的 HBsAg 水準持續降低，在首次投予後約兩個月，其表現水準（相對於對照）顯示穩定在降低的基線水平。
藉由使用未經修飾之四鹼基環圈形式的寡核苷酸進行 psiCHECK 報告測定法，通過體外篩選鑒定出其他有效的靶向 HBsAg 之寡核苷酸。來自三個不同孔盤的結果如圖 14 所示。使用發光為基礎的報告測定法，在 HeLa 細胞中以三種濃度（1、10 和 100 pM）評估包含 HBV-254 在內的每種寡核苷酸。與正調控（8、40 和 200 pM）、負調控 (1 nM) 和模擬轉染相比,每個孔盤的報告結果進一步顯示。以方框強調顯示的寡核苷酸按比例增加以用於體內測試，其中發現 HBV-219 和 HBV-258 是在 HBV-254 和從篩選所鑑定出的那些寡核苷酸中最有效的寡核苷酸。與 HBV-254 相比，HBV-219 在效力上表現出多對數的改善，因此被選定進行進一步的評估。
實例 A2 序列保守性分析和經工程改造之錯配以增加整體治療效用
將實例 A1 中評估的幾種最有效的寡核苷酸與 HBV 基因型 A-I 的基因組序列進行比較。初步保守性分析的結果列於表 10。如表所示，HBV-219 在這些基因組中的保守性相對較低。然而，如果在引導股的位置 15 引入錯配 (MM)，則保守性百分率將顯著提高（從 66% 增至 96%）。生物信息學的策展和比對是使用來自 GenBank 公共數據庫的基因型 B 型肝炎病毒 (HBV) 序列數據（藉由引用併入本文）。
表 10.最重要之 HBV 序列的初步保守性分析
寡核苷酸 引導股中的錯配用粗體 顯示 跨基因組的保守性百分比 若錯配被耐受之保守性百分比
HBV-0217 UUUGUGAGGAUUU UUGUCAAGG 66 97
HBV-0219 UUAUUGUGAGGAUUU UUGUCGG 66 96
HBV-0254 UC UGAGAGAAGUCCACCACGGG 94 98
HBV-0255 UAC UGAGAGAAGUCCACCACGG 95 99
HBV-0258 UAAAAC UGAGAGAAGUCCACGG 94 98
隨後進行保守性分析，其聚焦於表 10 中的幾種寡核苷酸，並涉及更廣泛的檢索參數。例如，鑒於初步分析僅包括全長基因組序列，聚焦分析包括全長和部分（與目標位 ＞ 80% 相同度）的序列。此外，檢測的基因組數量從初步分析中的 5628 個增加到聚焦分析中的 17000 個以上。聚焦分析的結果與初步分析中觀察到的趨勢基本上一致（表 11）。如圖 15 所示，並在圖中進一步說明，除非引導股在位置 15 的錯配被耐受，否則預期 HBV-219 對 HBV 基因型 B、E、F、H 和 I 無活性。
表 11. 聚焦保守性百分比
HBV-219 HBV-254 HBV-258
ORF 目標 S S S
正義 19-聚體 GACAAGAATCCTCACAATA CGTGGTGGACTTCTCTCAA GTGGACTTCTCTCAATTTT
正義 19-聚體 w/模糊鹼基 GACAAN AATCCTCACAATA CGTGGTGGACTTCTCTCAN GTGGACTTCTCTCAN TTTT
引導股中錯配的位置 15 2 6
基因型保守性* 基因型 A  97/99 [3278] 94/97 [4002] 94/97 [4005]
基因型 B  03 /95 [2563] 81 /97 [2700] 82 /99 [2700]
基因型 C 92/97 [4783] 95/97 [4938] 96/98 [4938]
基因型 D  95/97 [4311] 96/99 [4395] 96/98 [4398]
基因型 E  01 /98 [1039] 93/95 [1234] 93/95 [1232]
基因型 F  01 /90 [425] 94/96 [501] 95/96 [501]
基因型 G  92/99 [83] 98/98 [85] 99/99 [85]
基因型 H  03 /92 [71] 86 /97 [78] 87 /99 [78]
基因型 I  00 /100 [18] 95/100 [22] 95/100 [22]
總計 （聚焦分析） 72 /97 [17021] 93/97 [17995] 93/98 [17959]
總計 （初步分析） 66 /96 [5628] 94/98 [5628] 94/98 [5628]
* 保守性百分率報告為（完全配對／錯配 ），＜ 90% 的數值以粗體顯示；[總計 N#]
使用 psiCHECK-2 雙發光素酶報告系統評估 HBV-217、HBV-219、HBV-254、HBV-255 和 HBV-258 中各自在選定位置上錯配的影響。psiCHECK 載體能夠監測與報告基因融合之目標基因表現的變化，其中活性 RNAi 降解融合構建體，從而產生相應的報告信號降低。圖 16 中的圖式概括地描述了這些測定法中使用的載體。親代部分報告序列包含 120 個鹼基對片段，該鹼基對片段來自基因型 A (GenBank：AM282986.1) 在 S ORF 中感興趣的目標位周圍。親代寡核苷酸雙股螺旋序列與報告質體在圖 16 所示的相應位，具有 100% 的同源性，其中錯配寡核苷酸雙股螺旋序列對報告質體具有單個錯配。圖 17 中顯示了所測試之寡核苷酸的親代和錯配序列，其與相應的親代部分報告序列對齊。
對於錯配測定的實例，所測試的寡核苷酸包含相同的修飾模式。根據圖 17 中各寡核苷酸顯示的編號方案，修飾係如下：在位置 1 之 5'-甲氧基、膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷；在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 和 19 的經 2′-氟修飾之核苷酸；在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 和 20 至 22 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸；及介於在位置 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21 以及 21 與 22 的核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。對每個親代和錯配子集的錯配位置都不同，如圖 17 中的方框所示。
每種寡核苷酸的 psiCHECK2 報告測定法歷時三天，其使用從 1 nM 開始的 6 點、5 倍系列稀釋轉染至 HeLa 細胞中。在第 1 天，以 10,000 個 HeLa 細胞/孔（96-孔）種入黑壁透明底的孔盤中（80% 至 90% 融合）。在第 2 天，將載體 DNA 和 RNAi 分子在適量之無血清的 Opti-MEM® I 培養基中稀釋，並輕輕混合。將 Lipofectamine® 2000 輕輕混合後，取 0.2 μL 稀釋到 25 μL 之無血清的 Opti-MEM® I 培養基中，用於每個反應。將稀釋液輕輕混合並在室溫下孵育 5 分鐘。孵育 5 分鐘後，將等體積之稀釋的 DNA 和 RNAi 分子與稀釋的 Lipofectamine® 2000 合併。將合併的混合物輕輕混合，並在室溫下孵育 20 分鐘，以使複合體生成。隨後，將 DNA-RNAi 分子–Lipofectamine® 2000 複合體添加到每個包含細胞和培養基的孔中，並藉由前後搖動孔盤來輕輕混合。然後將細胞在 CO2 培養箱中於 37°C 下進行孵育，直至準備好收穫細胞並測定目標基因。在第 3 天，將 100 μL 的 Dual-Glo 試劑添加到每個孔中，混合並孵育 10 分鐘，然後讀取發光值。向每個孔中再添加 100 μL 的 Dual-Glo Stop＆Glo，混合並孵育 10 分鐘，然後讀取發光值。為每個親代和錯配寡核苷酸生成劑量-反應曲線，以評估錯配對活性的影響。在表 12 中顯示每種寡核苷酸確定的 EC50 值以及其他規格。
表 12.靶向 HBsAg 之寡核苷酸的錯配評估
HBV-217 HBV-219 HBV-254 HBV-255 HBV-258
ORF 目標 S S S S S
正義 19-聚體 TGTTGACAAGAATCCTCACAAT GACAAGAATCCTCACAATA CGTGGTGGACTTCTCTCAA TCGTGGTGGACTTCTCTCAAT GTGGACTTCTCTCAATTTT
正義 19-聚體 w/模糊鹼基 TGTTGACAAN AATCCTCACAAT GACAAN AATCCTCACAATA CGTGGTGGACTTCTCTCAN TCGTGGTGGACTTCTCTCAN T GTGGACTTCTCTCAN TTTT
引導股中錯配的位置 13 15 2 3 6
親代 EC50 (pM) 20 5 37 35 10
錯配 EC50 (pM) 25 8 96 366 ＞1000
如相對 EC50 值所示，HBV-219 雙股螺旋的體外劑量-反應曲線顯示，在引導股的位置 15 存在單個錯配的情況下，沒有活性損失。隨後的體內分析比較了 HBV-219 親代（此處稱為 HBV(s)-219P1）和錯配寡核苷酸（此處稱為 HBV(s)-219P2），其證實引入錯配沒有產生活性損失（圖 18）。如圖 19 顯示的單一劑量滴定圖所示，HBV-219 錯配寡核苷酸雙股螺旋 (HBV(s)-219P2) 在投予體內後 70 天 的期間被耐受。
圖 20 顯示具有併入錯配的 HBV-219（在此稱為 HBV(s)-219），其經修飾之雙股螺旋結構的實例。根據圖 17 中各寡核苷酸顯示的編號方案，有義股橫跨有核苷酸 1 到 36，且反義股橫跨有寡核苷酸 1 到 22，後者之股從右到左的方向顯示編號。所示的雙股螺旋形式在有義股之位置 36 和反義股之位置 1 的核苷酸之間具有切口。有義股中的修飾如下：在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2′-氟修飾之核苷酸；在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸；介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯；在位置 27 至 30 的 2'-OH 核苷酸；在位置 27 的 2'-胺基二乙氧基甲醇-胍-GalNAc；及分別在位置 28、29 和 30 的 2'-胺基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc。反義股中的修飾如下：在位置 1 的 5'-甲氧基、膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷硫代磷酸酯；在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 和 19 的經 2′-氟修飾之核苷酸；在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 和 20 至 22 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸；及介於在位置 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21 以及 21 與 22 的核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。反義股在位置 15 包含併入的錯配。同樣如圖所示，雙股螺旋的反義股包含橫跨位置 21 至 22 的「GG」突出。
表 13 顯示有關 HBV(s)-219 和上述兩種前驅物（HBV(s)-219P1 和 HBV(s)-219P2）的詳細資訊。
表 13.HBV(s)-219 和前驅物
RNAi 寡核苷酸 長度 （正義/反義） 序列/化學修飾
HBV(s)-219 36/22 聚體。 在反義股的位置 15 含有錯配。使用縮醛為基礎的 GalNAc 連接子。在反義股的位置 1 使用甲氧基，膦酸酯–4'氧基–2'–O–甲基尿苷 (MeMOP)。 參見圖 20 和 29A
HBV(s)-219P2 36/22 聚體。 在反義股的位置 15 含有錯配。點擊化學為基礎的結合作用併入三唑為基礎的 GalNAc 連接子。在反義股的位置 1 使用完全脫保護的 5'-膦酸酯–4'氧基–2'–O–甲基尿苷 (MOP)。參見圖 29B
HBV(s)-219P1 36/22 聚體。 在反義股的位置 15 不包含錯配。與 HBV(s)-219P2 相同的化學修飾。
實例 A3 ： HBV(s)-219 前驅物的抗病毒活性
評估 HBV(s)-219 前驅物對 HBV 核心抗原 (HBcAg) 次細胞定位的治療效果。對 NODscid 小鼠進行 HBV 基因組的頭尾二聚體之流體動力學注射 (HDI)。HDI 後 2 週開始用寡核苷酸治療。治療後從小鼠中分離出肝細胞進行免疫組織化學染色，其顯示 HBV 核心抗原 (HBcAg) 的表現急劇減少。
進行 RNA 定序以檢測 HBsAg 減弱 (knockdown) 對 HBV 病毒轉錄本整體表現的影響。在三輪每週一次、每次 3 mg/kg 的劑量給藥後四天，從 HDI 小鼠中分離出肝細胞。從肝細胞中提取總 RNA，並使用 HiSeq 平台進行 Illumina 定序。圖 21B 描述 RNA 定序結果，其中將檢測到的 RNA 轉錄序列與 HBV RNA 進行作圖 (map)。其還描述 HBV(s)-219 及其前驅物的目標位，顯示寡核苷酸靶向 pgRNA (3.5kb)、S1 (2.4kb) 及 S2 (2.1kb) 轉錄本。結果顯示，與媒劑調控相比，用 HBV(s)-219P1 治療的結果是使所有 HBV 病毒轉錄本緘黙化超過 90%。
HBV(s)-219P1 寡核苷酸之持續時間的效果在兩種不同的 HBV 小鼠模型中進行了檢測，一種是 cccDNA 依賴性的 HDI 模型，另一種是 cccDNA 依賴性的 AAV 模型。與用媒劑調控及靶向 HBxAg mRNA 之 RNAi 寡核苷酸相比，在 HBV 之 HDI 模型中進行三輪每週一次 3 mg/kg 之劑量的靶向 HBsAg mRNA 之 HBV(s)-219P1 寡核苷酸給藥的治療情況下，對 HBsAg mRNA 表現的時間進程（12 週）進行分析（圖 22A）。HBV(s)-219P1 寡核苷酸產生了 ≥3.9 log 的減少，並具有超過 7 週之相對較長的活性持續期間；相比之下，HBV(x) 靶向之寡核苷酸產生了約 3.0 log 的減少，且持續期間較短。
與用媒劑調控及靶向 HBxAg mRNA 之 RNAi 寡核苷酸相比，在 AAV-HBV 模型中進行三輪每週一次 3 mg/kg 之劑量的靶向 HBsAg mRNA 之 HBV(s)-219P2 寡核苷酸給藥的治療情況下，對 HBsAg mRNA 表現的時間進程（12 週）進行分析（圖 22B）。在該模型中，HBV(s)-219P2 寡核苷酸產生之對數的減少及持續時間與 HBV(x) 靶向之寡核苷酸相當。圖 22A 和 22B 中使用之靶向 HBxAg mRNA 的 RNAi 寡核苷酸，具有 UGCACUUCGCGUCACCUCUAGCAGCCGAAAGGCUGC  的有義股序列及 UAGAGGUGACGCGAAGUGCAGG 的反義股序列。該靶向 HBxAg 的 RNAi 寡核苷酸在本文中稱為 GalXC-HBVX。
如上所述，與使用媒劑調控與靶向 HBxAg mRNA 的 RNAi 寡核苷酸相比，使用如上述靶向 HBsAg mRNA 之 HBV(s)-219 前驅物寡核苷酸治療後，進行免疫組織化學染色以檢測從 HBV 的 AAV-HBV 模型和 HDI 模型中所取得之肝細胞中 HBcAg 的次細胞分佈。（圖 23）在 HDI 模型中，治療後殘留的核心蛋白 (HBcAg) 在兩種 RNAi 寡核苷酸之間的次細胞定位上表現出顯著差異，但在 AAV 模型中無差異。
實例 A4 ：在 PXB-HBV 嵌合人類肝臟模型基因型 C 中 HBV(s)-219P1 的評估
在 PXB-HBV 模型中評估 HBV(s)-219P1 的抗病毒活性，在 HBV 文獻中也稱為嵌合人類肝臟模型。該技術基於將人類肝細胞移植到嚴重免疫受損的小鼠中，然後使用遺傳機制使宿主鼠肝細胞中毒（Tateno 等人，2015）。該過程導致小鼠含有 ＞ 70% 之源自人體組織的肝臟，與野生型小鼠不同，其可以感染 HBV（Li 等人，2014）。PXB-HBV 模型在 HBV(s)-219 藥理學中可用於多種目的：(1) 確認寡核苷酸可在體內與人類 RNAi 機制 (RISC) 接合，(2) 確認靶向 GalNAc 配體構型可在體內經由人類 ASGR 內化進入肝細胞，以及 (3) 確認在真正 HBV 感染之模型的功效（與 HBV 表現的工程模型相反）。儘管移植人類肝細胞導致不規則的嵌合肝生理功能存在局限性（Tateno 等人，2015），但在該模型中可以觀察到顯著的抗病毒功效。
在小鼠初次感染 HBV 基因型 C 後約 8 週，收集每隻小鼠的血漿以作為基線 HBsAg 測定。然後，9 隻小鼠的分群（n = 3 用於 PK，n = 6 用於 PD）每隻接受 3 輪每週一次之 0 (PBS) 或 3 mg/kg HBV-219P1 的 SC 注射。給藥的第一天視為是第 0 天。每週進行非末端採血以確定每隻小鼠的血清 HBsAg 和循環 HBV DNA 的水準（圖 24A 至 24D）。在第 28 天對小鼠實施安樂死用於期終的組織終點。分析第 28 天之肝臟樣本的肝內 HBV DNA 和 cccDNA 水準。在用 HBV-219P1 治療的小鼠中，分析的所有終點均觀察到顯著的抗病毒活性，包括 HBsAg 減少 ＞ 80%，以及循環 HBV DNA、肝內 HBV DNA 和 cccDNA 顯著的降低（圖 24A 至 24D）。這些數據表明，在全身性地投予後，HBV(s)-219 治療可在感染的人類肝細胞中引起抗病毒活性。
實例 A5 ： HBV(s)-219P2 增強恩替卡韋的抗病毒活性
在現行的護理標準中，核苷酸類似物（例如恩替卡韋）可有效減少循環 HBV 基因體 DNA，但不能減少循環 HBsAg。然而這種治療會導致可控制的病毒血症，需要終生治療且很少能實現功能性的治愈。靶向 S 抗原的 RNAi 寡核苷酸會影響病毒聚合酶和 HBsAg 蛋白。在這項研究中，在表現 HBV 之小鼠（HDI 模型）中探討 HBV(s)-219P2 作為單一療法和與恩替卡韋的組合治療，針對抗病毒活性的組合效果。
每天投予小鼠口服劑量 500 ng/kg 恩替卡韋 (ETV)，持續 14 天。皮下投予單一 HBV(s)-219P2。藉由 qPCR 測量循環病毒量 (HBV DNA)（圖 25A），藉由 ELISA 測量血漿 HBsAg 水準（圖 25B），並且藉由 qPCR 測量肝臟 HBV mRNA 和 pgRNA 水準。可觀察到 HBV-219P2 和 ETV 組合療法有明顯的累加效果。結果顯示單獨的 ETV 療法對循環 HBsAg 或 肝病毒 RNA 無效。此外，由 HBsAg 或 HBV RNA 測量到的 HBV(s)-219P2 抗病毒活性不受與 ETV 共給藥的影響（圖 25B 至 25C）。
如圖 25A 至 25C 所示，相對於 PBS 治療的小鼠 (n ＝ 6)，每天以 500 ng/kg 的劑量口服給藥恩替卡韋 14 天的單一療法引起血漿中檢測到的 HBV DNA 平均降低 ~1.6 log。而循環 HBsAg 或肝病毒 RNA 均未見顯著的降低。相對於 PBS (n ＝ 7)，在第 0 天以單一劑量 1 mg/kg 或 3 mg/kg 皮下給藥 HBV-219P2 的單一療法，引起血漿中檢測到的 HBV DNA 分別平均降低 ~0.8 log 或 ~1.8 log。在第 0 天以單一劑量 6 mg/kg 皮下給藥 HBV-219P2 的單一療法，引起血漿中的 HBV DNA 平均降低 ~2.5 log，且兩隻小鼠中的水準降至檢測極限以下 (n = 7)。在第 0 天以單一劑量皮下給藥 HBV-219P2 的單一療法，引起循環 HBsAg 和肝病毒 RNA 兩者之劑量依賴性的降低。每天以 500 ng/kg 的劑量口服恩替卡韋 14 天且在第 0 天以單一劑量 1 mg/kg 皮下給藥 HBV-219P2 的組合療法，引起在血漿中檢測到的 HBV DNA 加成的平均減少 ~2.3 log。與單一劑量 1 mg/kg 皮下給藥 HBV-219P2 的單一療法所觀察到的血漿 HBsAg 和肝病毒轉錄本水準的降低相似，其顯示血漿 HBV DNA 減少的加成性，但在循環 HBsAg 或肝病毒轉錄本則未顯示。
實例 A6 HBV(s)-219P2 和 GalXC-HBVX 的抗病毒活性比較
在這項研究中，對表現 HBV 之小鼠（HDI 模型）投予 HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX（與圖 22A 和 22B 中使用的 GalXC-HBVX 序列相同）或兩種 RNAi 寡核苷酸的組合，並在給藥後兩週或九週監測血漿 HBsAg 水準。如圖 26B 所示，在用單一飽和的 9 mg/kg 劑量皮下給藥 HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX 或兩者的組合治療後 2 週，觀察到相似的 HBsAg 抑制水準。在以靶向 S 之 HBV(s)-219P2 治療的小鼠中觀察到 HBsAg 的抑制時間延長，而用 GalXC-HBVX 或二者之組合治療的小鼠在治療後 9 週具有明顯的 HBsAg 恢復 (n = 3)。
也對接受 HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX 或兩種 RNAi 寡核苷酸之組合的小鼠，評估表現 HBV 之小鼠中的 HBV 核心抗原 (HBcAg) 的次細胞定位。 對表現 HBV 之小鼠（HDI 模型），用單一飽和劑量（9 mg/kg，皮下）之 HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX 或 1:1 組合進行治療。在圖 27A 所示的時間點，對肝臟切片進行 HBcAg 染色；顯示代表性的肝細胞。用 HBV(s)-219P2 治療的分群，無論是作為單一療法或組合 GalXC-HBVX，在核 HBcAg 起作用。僅用 GalXC-HBVS 治療的分群，僅顯示 HBcAg 的胞質定位，據報告是治療反應的有利預後指標（Huang 等人，J. Cell. Mol. Med. 2018）。每隻動物中具有核染色之 HBcAg 陽性細胞的百分比顯示在圖 27B 中（n = 3/組，每隻動物在給藥後 2 週計數 50 個細胞）。為了確認對 HBcAg 次細胞定位的影響是由於 HBV 轉錄組的區域，而不是由於 RNAi 序列的未知特性，設計並測試具有靶向 X 和 S 開讀框內的替代序列。（參見圖 27C ）。圖 27C 中使用 HBV-254。HBV-254 的序列描述於實例 A1 中。圖 27C 中使用之靶向 HBxAg 的替代寡核苷酸，具有 GCACCUCUCUUUACGCGGAAGCAGCCGAAAGGCUGC 之有義股序列以及 UUCCGCGUAAAGAGAGGUGCGG 之反義股序列。與圖 26B 中使用的 RNAi 寡核苷酸相比，這兩個替代 RNAi 寡核苷酸在 S 或 X 抗原中具有不同的 RNAi 標靶序列。然而，它們對血漿水準 HBcAg 表現出相同的差別效果，表明該效果對靶向 S 抗原本身俱有特異性，但對所使用的寡核苷酸則無特異性。
實例 A7 ：在健康的人類個體中評估安全性、耐受性以及在 HBV 患者中評估 HBV(s)-219 的功效
本研究旨在在健康個體（A 組）中評估安全性和耐受性以及在 HBV 患者中評估 HBV(s)-219 的功效（B 組）。分群的劑量資訊顯示在圖 28 中。HBV(s)-219 的分子結構如圖 20、圖 29A 所示，並在下方顯示：
Figure 02_image155
患者選擇標準如下所示。
A 組 – 健康個體
入選標準 1. 簽署知情同意書時，年齡為 18 歲（或法律准許的年齡，以較大者為準）至 65 歲（含 65 歲）。 2. 篩選時根據醫學評估（包括病史、體格檢查和實驗室檢查）確定明顯健康 a. 沒有正在患病的症狀 b. 體溫、脈搏、呼吸頻率、血壓無臨床上顯著的異常 c. 沒有臨床上顯著的心血管或肺部疾病，也沒有需要藥物治療的心血管或肺部疾病。 3. 在篩選和第 1 天時，研究者認為 12 導聯心電圖 (ECG) 在正常範圍內或無床顯上顯著的異常 4. 在篩選隨訪 1 和住院時（第 1 天）負向篩選濫用酒精或藥物者 5. 在篩選隨訪 1 之前至少 5 年的非吸煙者，在篩選隨訪 1 時尿液尼古丁濃度為陰性 6. 身體質量指數 (BMI) 在 18.0 至 32.0 kg/m2 （含）的範圍內。 7. 男性或女性： a. 男性參與者： 男性參與者必須同意在治療期間以及研究性介入的給藥後至少兩週內使用避孕藥，並且在此期間不能捐贈精子。 b. 女性參與者： 如果女性參與者未懷孕、未哺乳且至少符合以下條件之一，則符合參加條件：不具有有生育能力的女性 (WOCBP)，或者，取決於地區；從篩選後的研究招募開始持續整個治療期間，並在研究性介入的給藥後至少 12 週，同意遵循避孕指南的 WOCBP。 8. 能夠提供簽署的知情同意書 1，其中包括遵守要求和限制。
排除標準， A 組 1. 任何可能干擾本研究藥物吸收、分佈或消除，或干擾本研究中臨床和實驗室評估的醫學病史，包括（但不限於）；慢性或複發性腎臟疾病、功能性腸病（例如頻繁的腹瀉或便秘）、胃腸道疾病、胰腺炎、癲癇、皮膚粘膜或肌肉骨骼疾病、自殺企圖或自殺觀念歷史記錄、或臨床上顯著的抑鬱症或其他神經精神病學需要藥物介入的疾病 2. 高血壓控制不佳或不穩定；或篩選時持續收縮壓 ＞ 150 mmHg 或舒張壓 ＞ 95 mmHg 3. 胰島素或降血糖劑治療的糖尿病病史 4. 過去 12 個月內需要住院的哮喘病史 5. 根據中央研究實驗室的篩選結果確定的 G-6-PD 缺乏症的證據 6. 目前內分泌疾病控制不佳，但甲狀腺疾病（甲狀腺機能亢進/甲狀腺功能低下等）除外，任何經過藥理治療的甲狀腺疾病均被排除。 7. 如果參與者的惡性腫瘤在過去三年中通過化療完全緩解，並且沒有其他醫學或外科手術介入，則可以接受惡性腫瘤病史 8. 多種藥物過敏史或對寡核苷酸或 GalNAc 的過敏反應史 9. 對皮下注射不耐受的歷史或明顯的腹部疤痕，其可能會阻礙研究性介入的投予或局部耐受性的評估者 10. 臨床上相關的手術史 11. 過去 3 年內持續濫用乙醇（每天 ＞ 40 gm 乙醇）或使用非法藥物的歷史。 12. 研究性介入投予前 7 天內有臨床上顯著的疾病 13. 在投予研究性介入之前的 2 個月內捐贈 500 mL 以上的血液，或在篩選之前的 7 天內捐贈血漿 14. 篩選時正處於重大感染或已知的發炎過程（研究者認為） 15. 有慢性或複發性尿路感染 (UTI)，或篩選前一個月內有 UTI 16. 計劃在研究進行期間進行選擇性外科手術 17. 在進行研究性介入之前的 4 週內投予處方藥 18. 在首次給藥後的 7 天內使用非處方 (OTC) 藥物或草藥補給品（常規維生素除外），除非研究者和試驗委託者同意不具有臨床意義。 19. 在給藥前 3 個月內已接受研究藥物，或在研究招募前正在進行另一項臨床研究追蹤。 20. 篩選時對 HBV、HIV、HCV 或 HDV 抗體呈血清反應陽性（如果在篩選前 3 個月內進行，則可使用歷史檢測） 21. 篩選隨訪或住院時（第 1 天）的丙胺酸胺基轉移酶 (ALT)、天門冬胺酸胺基轉移酶 (AST)、γ-麩胺醯基轉移酶 (GGT)、總膽紅素、鹼性磷酸酶 (ALP) 或白蛋白超出參考範圍 22. 研究者認為臨床上相關且無法接受的全血細胞計數測試異常；血紅蛋白 ＜ 12.0 g/dL（相當於 120 g/L）；血小板超出正常範圍。 23. 血紅蛋白 A1C (HbA1C) ＞ 7% 24. 研究者認為其臨床上顯著且無法接受的任何其他安全實驗室測試結果 25. 從進入臨床研究中心前的 48 小時到研究結束為止，已經進行或計劃進行運動水準的重大改變。 26. 研究者認為之任何條件都可能使參與者不適合招募，或者可能干擾參與或完成研究。
具有 B 型肝炎的 B 組成人
B 組入選標準 1. 簽署知情同意書時，年齡為 18 歲（或法律准許的年齡，以較大者為準）至 65 歲（含 65 歲）。 2. 慢性 B 型肝炎感染，記錄於： a. 與 CHB 兼容的臨床病史，根據兼容的臨床資訊，以及先前對 HBsAg 和可能的其他 HBV 血清學標誌物 (HBeAg, HBV DNA) 的血清陽性 b. 對 HBeAg 陽性患者進行篩選時血清 HBsAg ＞ 1000 IU/mL，或對 HBeAg 陰性患者 ＞ 500 IU/mL c. 篩選時對未接受過治療的患者在中心研究實驗室藉由 TaqMan™ HBV DNA v2.0 測定法，測定血清 HBV DNA ＞ 20,000 IU/mL d. 血清 IgM 抗 HBc 陰性 3. 臨床病史與代償性肝病兼容，無肝硬化跡象： a. 無食道或胃腸道靜脈曲張出血史 b. 無腹水史 c. 無因慢性肝病引起的黃疸病史 d. 無肝性腦病病史 e. 無門脈高壓的生理特徵–蜘蛛狀血管瘤等 f. 沒有先前的肝臟活檢、肝臟成像研究或彈性成像結果表明肝硬化 4. 未接受過 B 型肝炎治療：先前沒有針對 B 型肝炎的抗病毒治療（先前沒有 HBV 核苷酸或含干擾素的治療）或在篩選隨訪前連續至少 12 週使用核苷酸療法（恩替卡韋或替諾福韋），具有令人滿意的耐受性和順服性 5. 血清 ALT ＞ 60 U/L（男性）或 ＞ 38 U/L（女性）（美國肝病研究協會 (AASLD) HBV 指導標準的 2 倍 ULN，Terrault 等人，2016） 6. 在篩選和第 1 天時，12 導聯心電圖無臨床上顯著的異常（研究者認為） 7. 沒有其他已知的肝病病因 8. 除了良好控制的高血壓和他汀類藥物對高膽固醇血症的控制外，沒有其他需要持續醫療管理或長期或反復藥物介入的醫療狀況 9. BMI 在 18.0 至 32.0 kg/m2 （含）的範圍內 10. 男女不限 a. 男性參與者： 男性參與者必須同意在治療期間以及研究性介入之最後給藥的 12 週內使用避孕藥並且在此期間不能捐贈精子。 b. 女性參與者： 如果女性參與者未懷孕、未哺乳且至少符合以下條件之一，則符合參加條件：非 WOCBP，或者，取決於地區；在治療期間並在研究性介入給藥後至少 12 週，同意遵循避孕指南的 WOCBP。 11. 能夠提供簽署的知情同意書，包括遵守要求和限制。
排除標準， B 組 1. 任何可能干擾本研究藥物吸收、分佈或消除，或干擾本研究中臨床和實驗室評估的醫學病史，包括（但不限於）；慢性或複發性腎臟疾病、功能性腸病（例如頻繁的腹瀉或便秘）、胃腸道疾病、胰腺炎、癲癇、皮膚粘膜或肌肉骨骼疾病、自殺企圖或自殺觀念歷史記錄、或臨床上顯著的抑鬱症或其他神經精神病學需要藥物介入的疾病 2. 高血壓控制不良或不穩定 3. 胰島素或降血糖劑治療的糖尿病病史 4. 過去 12 個月內需要住院的哮喘病史 5. 根據中央研究實驗室的篩選結果確定的 G-6-PD 缺乏症的證據 6. 目前內分泌疾病控制不佳，但甲狀腺疾病（例如甲狀腺機能亢進/甲狀腺功能低下等）除外，任何經過藥理治療的甲狀腺疾病均被排除。 7. 慢性或複發性 UTI 病史，或篩選前一個月內有 UTI 8. 肝癌病史 9. 如果患者的惡性腫瘤在過去三年中通過化療完全緩解，並且沒有其他醫學或外科手術介入，則可以接受 HCC 以外的惡性腫瘤病史 10. 過去 3 年內持續濫用乙醇（每天 ＞ 40 gm 乙醇）或使用非法藥物的歷史。 11. 對皮下注射不耐受的歷史或明顯的腹部疤痕，其可能會阻礙研究性介入的投予或局部耐受性的評估者。 12. 在治療前的最近 6 週接受輸血，或預期在透過試驗後追蹤期間進行輸血。 13. 篩選前 2 個月內捐獻或失去血液 ＞ 500 mL，或篩選前 7 天內捐獻血漿 14. 篩選的 3 個月內進行抗病毒治療（恩替卡韋或替諾福韋除外）或過去 3 年使用干擾素治療 15. 在過去 6 個月內（或預期需要）使用抗凝血劑、全身性地投予皮質類固醇、全身性地投予免疫調節劑或全身性地投予免疫抑製劑 16. 在進行研究性介入的投予之前的 14 天內使用處方藥，試驗主持人或試驗委託者認為會干擾研究執行者。沒有全身吸收的局部用藥、他汀類藥物（瑞舒伐他汀除外）、高血壓藥物、OTC 和處方止痛藥或激素避孕藥（女性）是可以接受的。 17. 在研究性介入的投予之前 3 個月內長效注射或植入任何藥物，可注射/可植入的避孕措施除外。 18. 持續使用草藥補給品或全身性非處方藥；參與者必須願意在研究期間停止該用藥 19. 在給藥前 3 個月內已接受研究藥物，或在研究招募前正在進行另一項臨床研究追蹤。 20. 篩選時肝臟彈性成像（即 FibroScan®）kPa ＞ 10.5 21. 篩選時仰臥休息 10 分鐘後收縮壓 ＞ 150 mmHg，舒張壓 ＞ 95 mmHg。 22. 肝轉胺酶（ALT 或 AST）在篩選時確認 ＞ 7 x ULN 23. 持續性或複發性高膽紅素血症的病史，除非已知吉爾伯特病或杜賓-約翰遜綜合症 24. 對人類免疫缺陷病毒 (HIV) 或 C 型肝炎病毒 (HCV) 或 D 型肝炎病毒 (HDV) 的抗體呈血清反應陽性 25. Hgb ＜ 12 g/dL（男性）或 ＜ 11 g/dL（女性） 26. 篩選時血清白蛋白 ＜ 3.5 g/dL。 27. 篩選時白血球總計數 ＜ 4,000 細胞/μL 或嗜中性細胞絕對計數 (ANC) ＜ 1800 細胞/μL。 28. 篩選時血小板計數每μL ≤ 100,000。 29. 篩選時國際標準化比率 (INR) 或凝血酶原時間 (PT) 高於正常參考範圍（根據當地實驗室參考範圍）的上限。 30. 血清 BUN 或肌酐 ＞ ULN 31. 血清澱粉酶或脂肪酶 ＞ 1.25 x ULN 32. 血清 HbA1c ＞ 7.0% 33. 血清甲型胎兒蛋白 (AFP) 值 ＞ 100 ng/mL。如果篩選時的 AFP ＞ ULN 但 ＜ 100 ng/mL，若肝臟成像研究顯示無可疑之可能的 HCC 病灶，則患者符合條件 34. 研究者認為其臨床上顯著且無法接受的任何其他安全實驗室測試結果 35. 從進入臨床研究中心前的 48 小時到研究結束為止，已經進行或計劃進行運動水準的重大改變。 36. 研究者認為之任何條件都可能使參與者不適合招募，或者可能干擾參與或完成研究。
B 部分：經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸的效果
材料與方法
AAV/HBV 小鼠模型
AAV-HBV 小鼠模型是藉由向 C57BL/6 小鼠注射帶有可複制 HBV 基因組 (AAV-HBV) 的重組腺相關病毒而生成的。rAAV8-1.3 HBV ayw 病毒懸液購自北京五加和分子醫學研究有限公司（中國北京）。從 SLAC 實驗室動物有限公司（中國上海）購買動物（雄性，到達時年齡 4-5 週），使其在動物設施中適應 5-7 天，然後透過尾靜脈注射 1 × 1011 AAV-HBV 的載體基因組（稀釋於 200 μL PBS）。可以在三週後建立 HBV 基因組的持續表現，並在小鼠血清中檢測到高水準的 HBV 病毒標誌物，包括 HBV DNA、HBsAg 和 HBeAg。具有穩定的 HBV 病毒血症和 C57BL/6 小鼠之合格的免疫系統，AAV-HBV小鼠模型是用於評估化合物在體內的抗 HBV 功效。AAV-HBV 研究的生命中部分是透過科文斯藥物研發（上海）有限公司 (Covance Shanghai) 的契約服務進行的，使用血清進行的生命後分析是在上海羅氏創新中心內部進行的 (RICS)。
化合物治療前 7 天，採集血液樣本進行血清製備 (~15μL)，並根據 HBV DNA、血清中 HBsAg 水準和體重，將感染 AAV-HBV 的動物分為不同的治療組。
以 1.5 或 7.5 mg/kg 的劑量，在第 0 至 49 天期間的第 0、7、14、21、28、35、42 和 49 天每週一次皮下給藥食鹽水（01 組）以及 CMP ID NO: 15_1 的抗 HBV ASO。以 100 mg/kg 的劑量，在第 0 至 55天期間每隔一天 (QOD) ，或在 0 至 49 天期间的第 0、7、14、21、28、35、42 和 49 天每週一次 (QW)，藉由餵食管餵食投予 CMP ID NO: VI 的 TLR7 促效劑。在整個研究期間，每週經由眼窩靜脈竇給動物放血以收集樣本。
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成已為此技術領域中所公知。以下就可採用的合成方式加以說明。本發明之寡核苷酸的製造方法可能在所用裝置、撐體及濃度方面略有差異。
在 Oligomaker 48 上，以 1 微莫耳刻度，透過亞磷醯胺法，於脲苷通用撐體上合成寡核苷酸。在合成結束時，以氨水於 60℃ 處理 5 至 16 小時，將所述寡核苷酸自固相支持物上裂解。使用逆相 HPLC (RP-HPLC) 或固相萃取來進行所述寡核苷酸的純化，之後以 UPLC 進行特性分析，再用 ESI-MS 進一步確定分子質量。
寡核苷酸的延長：
利用 5’-O-DMT-保護醯胺在乙腈中的 0.1 莫耳溶液以及 DCI （4,5–二氰基咪唑）的乙腈（0.25 莫耳）溶液做為激活物，進行 β-氰乙基-亞磷醯胺 （DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf) 或 LNA-T）的耦合。於最終循環時，可使用具有所需修飾的亞磷醯胺，所需修飾例如用以連附結合基團的 C6 連接子，或結合基團本身。為導入硫代磷酸酯鍵聯，使用氫化黃原素（0.01 莫耳於乙腈/吡啶 9:1）執行硫醇化處理。可利用 0.02 莫耳的碘於 THF/吡啶/水 7:2:1 導入磷酸二酯鍵聯。其餘試劑為通常用於寡核苷酸合成者。
可於固相合成的最後循環使用經商購取得的 C6 胺基連接子亞磷醯胺來進行後固相合成接合，在脫保護及自固相支持物切割後，便可分離出胺基連結脫保護寡核苷酸。接著使用標準合成方法，透過官能基團的活化來導入結合物。
以 RP-HPLC 純化：
使用製備性 RP-HPLC 在 Phenomenex Jupiter C18 10µ 150x10 毫米管柱上對粗產化合物進行純化。使用 0.1 莫耳 pH 為 8 的乙酸銨及乙腈為緩衝液，流速為每分鐘 5 毫升。將蒐集而得的碎片凍乾以產生純化的化合物，其通常為白色固體狀。
縮寫： DCI：           4,5-二氰基咪唑 DCM：         二氯甲烷 DMF：         二甲基甲醯胺 DMT：         4,4’-二甲氧三苯甲基 THF：          四氫呋喃 Bz：             苯甲醯基 Ibu：            異丁醯基 RP-HPLC：  逆相高效液相層析
Tm 測定：
將寡核苷酸及 RNA 目標（磷酸鹽連結，PO）雙股螺旋在 500 ml 無核糖核酸酶水中稀釋至 3 mM，而後與 500 ml 2x Tm 緩衝液（200 mM 氯化鈉、0.2 mM EDTA、20 mM 磷酸鈉，pH 7.0）混合。將所述溶液加熱至 95ºC 並維持 3 分鐘，而後放置在室溫中退火 30 分鐘。在配備有 Peltier 溫度編程器 PTP6 的 Lambda 40 UV/VIS 分光光度計上利用 PE Templab 軟體 (Perkin Elmer) 測量雙股螺旋熔解溫度 (Tm )。溫度自 20℃ 漸升至 95℃，然後降至 25℃，於 260 奈米處記錄吸收度。利用第一衍生物及融化和退火的局部最大值來評估雙股螺旋 Tm 。
組織特異性體外連接子切割試驗
使用相關組織（例如肝臟或腎臟）的均質物及血清，對具有待測生物可切割型連接子（例如 DNA 磷酸二酯連接子（PO 連接子））的 FAM 標記之寡核苷酸進行體外切割。
從合適的動物（例如小鼠、猴子、豬或大鼠）收集組織和血清樣本，並在均質化緩衝液（0.5% Igepal CA-630、25 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl，pH 8.0（用 1 N NaOH 調整））中均質化。將組織均質物和血清摻入寡核苷酸至 200 µg/g 組織的濃度。將樣本在 37° C 下孵育 24 小時，然後用苯酚-氯仿萃取樣本。使用 Dionex DNApac p-100 管柱在 Dionex Ultimate 3000 上對溶液進行 AIE HPLC 分析，梯度範圍為 10 mM 至 1 M 過氯酸鈉，pH 7.5。使用 615 nm 的發光檢測器和 260 nm 的 UV 檢測器，針對標準測定切割的和未切割的寡核苷酸含量。
S1 核酸酶切割試驗
將具有 S1 核酸酶易感性連接子（例如 DNA 磷酸二酯連接子（PO 連接子））的 FAM 標記之寡核苷酸，在 S1 核酸酶提取物或血清中進行體外切割。
藉由核酸酶緩衝液（每 100 µL 60 U）中的 S1 核酸酶對 100 µM 寡核苷酸進行體外切割，持續 20 和 120 分鐘。藉由向緩衝溶液中添加 EDTA 來停止酶活性。使用 Dionex DNApac p-100 管柱在 Dionex Ultimate 3000 上對溶液進行 AIE HPLC 分析，梯度範圍為 10 mM 至 1 M 過氯酸鈉，pH 7.5。使用 615 nm 的發光檢測器和 260 nm 的 UV 檢測器，針對標準測定切割的和未切割的寡核苷酸含量。
HBsAg 抗原測量
根據製造商的實驗方案，使用 HBsAg 化學發光免疫測定法 (CLIA)（中國鄭州安圖生物診斷有限公司，目錄號 CL0310-2）測定感染 AAV-HBV 小鼠血清中的 HBsAg 水準。簡要地說明，將 50 μl 的血清轉移至抗體塗佈的微孔盤，並加入50 μl 的酶結合物試劑。將該孔盤於室溫下在振盪器上孵育 60 分鐘，然後使用自動清洗機以清洗緩衝液洗滌所有孔洞六次。加入 25 μl 的基質 A，然後加入 25 μl 的基質 B 到每個孔洞中。將孔盤在室溫下孵育 10 分鐘，然後使用 Envision 發光讀數器 (Perkin Elmer) 測量發光值。HBsAg 的單位為 IU/ml；其中 1 ng HBsAg = 1.14 IU。
同樣，也可以根據製造商的實驗方案和上述 HBsAg 的簡要說明，使用 CLIA ELISA 套組 (Autobio Diagnostic＃CL0310-2) 測量 HBeAg 的水準。
即時聚合酶連鎖反應檢測 HBV 感染細胞的細胞內 HBV mRNA
可以使用 QuantStudio 12K Flex (Applied Biosystems)、TaqMan RNA-to-CT 1-Step 套組 (Applied Biosystems, #4392938)、人類 ACTB 內源性對照 (Applied Biosystems, #4310881E)，藉由 qPCR 在技術的複製物中定量 HBV mRNA。Taqman 試劑與以下市售的 ThermoFisher Scientific 引子 (HBV Pa03453406_s1, ACTB 4310881E) 一起使用。使用比較週期閾值 2-ΔΔCt 方法分析 mRNA 表現，該方法針對參考基因 ACTB 和 PBS 治療的細胞進行了標準化。
HBV DNA 提取和 qPCR
最初，用磷酸鹽緩衝液 (PBS) 將小鼠血清稀釋 10 倍 (1:10)。使用 MagNA Pure 96 (Roche) 機器人提取 DNA。將 50 μl 之稀釋的血清在處理匣中與 200 μl 的 MagNA Pure 96 外部裂解緩衝液（Roche，目錄號 06374913001）混合，並孵育 10 分鐘。然後使用「MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid Small Volume Kit」（Roche，目錄號 06543588001）和「Viral NA Plasma SV external lysis 2.0」的實驗方案提取 DNA。DNA 洗脫體積為 50 μl。
使用 Taqman qPCR 機 (ViiA7, life technologies) 對提取的 HBV DNA 進行定量。在 PCR 中以複製品測試每個 DNA 樣本。在 384 孔盤中，將 5 μl 的 DNA 樣本添加到 15 μl 的 PCR mastermix 中，其包含 10 μl 的 TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems，目錄號 4369016)、0.5 μl 的 PrimeTime XL qPCR Primer/Probe (IDT) 以及 4.5 μl 的蒸餾水，並使用以下設置進行 PCR：UDG 孵育（2 分鐘，50°C）、酶活化（10 分鐘，95°C）和 PCR（15 秒之 40 個循環，95° 用於變性且 1 分鐘，60°C 退火和延長）。藉由 ViiA7 軟體基於 HBV 質體 DNA 標準曲線由 Ct 值計算 DNA 拷貝數。
TaqMan 引子的序列顯示在表 14 中。
表 14：HBV 核心特異性 TaqMan 探針
   名稱 染劑 序列 序列識別號
HBV 核心引子 前置 (F3_HBVcore)    CTG TGC CTT GGG TGG CTT T 30
反置 (R3_HBVcore)    AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA 31
TaqMan 探針 (P3_HBVcore) 56-FAM 56-FAM/AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G/3IABkFQ 32
ZEN 是內部淬滅體
實例 B1
這項研究旨在提供證據證明，使用 HBV 體內功效小鼠模型，靶向 HBV 的經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸（抗 HBV ASO）和 TLR7 促效劑的組合，會具有有益的抗病毒效果。
在慢性 HBV 治療中，直接作用的抗病毒藥物（例如靶向 HBV 的經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸） (抗 HBV ASO) 和免疫調節劑（例如類鐸受體 7 的促效劑（TLR7 促效劑））組合，可能以每種單獨化合物之單一療法的活性中無法預知的方式，影響組合的效果。
為了評估體內系統中抗 HBV ASO 和 TLR7 促效劑的組合，使用慢性 HBV 感染的小鼠模型。在「材料和方法」中描述的 AAV/HBV 小鼠模型中，建立了持續 HBV 感染，其引起病毒標誌物 (HBsAg, HBeAg, HBV DNA) 表現在血漿中可檢測。在單一療法或組合中已評估治療後對這些病毒標誌物的效果，該治療是 CMP ID NO: 15_1（表 2 和圖 4）之抗 HBV ASO 以 1.5 mg/kg 或 7.5 mg/kg 劑量給藥，以及 CMP ID NO: VI （表 3）之 TLR7 促效劑以 100 mg 劑量每隔一天 (QOD) 或每週一次 (QW) 給藥。
表 15 至 18 顯示用不同劑量治療後，AAV/HBV 小鼠血清中的 HBV-DNA 水準。該數據還表示在圖 9A 至 9D 中。
表 15：在以下治療後，AAV/HBV 小鼠血清中的 HBV-DNA 水準：食鹽水（媒液）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）每週以 1.5 mg/kg 的劑量給藥；CMP ID NO: VI (TLR7) 每隔一天 (QOD) 投予 100 mg/kg；或兩者的組合。與抗 HBV ASO 1.5 mg/kg 和 TLR7 QOD 相比，計算出該組合的 p 值；* p 值 ≤ 0.05； ** p 值 ≤ 0.01； *** p 值 ≤ 0.001； ns 不顯著； † 定量下限。
媒劑 抗 HBV ASO TLR7 QOD 抗 HBV ASO 1.5 mg/kg +
1.5 mg/kg TLR7 QOD
平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 組合的 p 值
vs. 抗 HBV ASO vs. TLR7
D0 7.66 ± 0.39 7.69 ± 0.15 7.69 ± 0.19 7.67 ± 0.34 n/a n/a
D7 7.38 ± 0.6 4.92 ± 0.19 5.74 ± 0.62 4.82 ± 0.09 ns ***
D14 7.24 ± 0.68 4.30† ± 0 5.73 ± 1.2 4.30† ± 0 ns ***
D21 7.12 ± 0.43 5.3† ± 0 5.55 ± 0.32 5.3† ± 0 ns ***
D28 7.44 ± 0.48 4.30† ± 0 5.23 ± 1.02 4.30† ± 0 ns ***
D35 7.4 ± 0.44 4.30† ± 0 4.69 ± 0.71 4.30† ± 0 ns *
D42 7.34 ± 0.46 4.30† ± 0 4.72 ± 0.76 4.30† ± 0 ns *
D49 7.4 ± 0.44 4.30† ± 0 4.5 ± 0.55 4.30† ± 0 ns ns
D56 7.4 ± 0.44 4.30† ± 0 4.59 ± 0.65 4.30† ± 0 ns ns
D63 7.5 ± 0.41 4.61 ± 0.7 5.3 ± 1.21 4.30† ± 0 ns ***
D70 7.41 ± 0.45 5 ± 1.02 5.95 ± 1.17 4.30† ± 0 ** ***
D77 7.25 ± 0.59 5.92 ± 0.98 6.01 ± 1.17 4.52 ± 0.61 *** ***
D84 7.2 ± 0.55 6.47 ± 0.69 6.26 ± 1.08 5.44 ± 1 *** ***
D91 7.13 ± 0.4 6.75 ± 0.51 5.81 ± 1.09 5.7 ± 1.02 *** ns
D98 7.1 ± 0.21 6.89 ± 0.59 6.02 ± 1.17 6.08 ± 1.04 ** ns
D105 7.35 ± 0.33 7.16 ± 0.5 6.23 ± 1.29 6.54 ± 0.66 * ns
D111 7.69 ± 0.27 7.23 ± 0.55 6.77 ± 0.64 6.85 ± 0.6 ns ns
表 16：在以下治療後，AAV/HBV 小鼠血清中的 HBV-DNA 水準：食鹽水（媒液）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）每週以 1.5 mg/kg 的劑量給藥；CMP ID NO: VI (TLR7) 每週 (QW) 投予 100 mg/kg；或兩者的組合。與抗 HBV ASO 1.5 mg/kg 和 TLR7 QW 相比，計算出該組合的 p 值。* p 值 ≤ 0.05；** p 值 ≤0.01；*** p 值 ≤ 0.001；ns 不顯著；† 定量下限。
媒劑 抗 HBV ASO TLR7 QW 抗 HBV ASO 1.5 mg/kg +
1.5 mg/kg TLR7 QW
平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 組合的 p 值
vs. 抗 HBV ASO vs. TLR7
D0 7.66 ± 0.39 7.69 ± 0.15 7.68 ± 0.2 7.78 ± 0.23 n/a n/a
D7 7.38 ± 0.6 4.92 ± 0.19 7.15 ± 0.67 4.94 ± 0.23 ns ***
D14 7.24 ± 0.68 4.30† ± 0 7.14 ± 0.47 4.30† ± 0 ns ***
D21 7.12 ± 0.43 5.3† ± 0 6.65 ± 0.75 5.3† ± 0 ns ***
D28 7.44 ± 0.48 4.30† ± 0 6.1 ± 1.25 4.30† ± 0 ns ***
D35 7.4 ± 0.44 4.30† ± 0 6.61 ± 0.98 4.30† ± 0 ns ***
D42 7.34 ± 0.46 4.30† ± 0 6.4 ± 0.84 4.5 ± 0.55 ns ***
D49 7.4 ± 0.44 4.30† ± 0 6.27 ± 0.89 4.30† ± 0 ns ***
D56 7.4 ± 0.44 4.30† ± 0 6.74 ± 0.64 4.30† ± 0 ns ***
D63 7.5 ± 0.41 4.61 ± 0.7 6.72 ± 0.7 4.30† ± 0 ns ***
D70 7.41 ± 0.45 5 ± 1.02 6.8 ± 0.64 4.30† ± 0 ** ***
D77 7.25 ± 0.59 5.92 ± 0.98 6.95 ± 0.53 4.44 ± 0.41 *** ***
D84 7.2 ± 0.55 6.47 ± 0.69 6.87 ± 0.49 4.68 ± 0.7 *** ***
D91 7.13 ± 0.4 6.75 ± 0.51 6.59 ± 0.52 5.31 ± 0.75 *** ***
D98 7.1 ± 0.21 6.89 ± 0.59 6.7 ± 0.4 5.88 ± 0.77 ** ***
D105 7.35 ± 0.33 7.16 ± 0.5 6.93 ± 0.43 6.31 ± 0.97 ** **
D111 7.69 ± 0.27 7.23 ± 0.55 7.07 ± 0.45 6.77 ± 0.55 * *
表 17：在以下治療後，AAV/HBV 小鼠血清中的 HBV-DNA 水準：食鹽水（媒液）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）每週以 7.5 mg/kg 的劑量給藥；CMP ID NO: VI (TLR7) 每隔一天 (QOD) 投予 100 mg/kg；或兩者的組合。與抗 HBV ASO 1.5 mg/kg 和 TLR7 QOD 相比，計算出該組合的 p 值； * p 值 ≤ 0.05； ** p 值 ≤0.01； *** p 值 ≤ 0.001；ns 不顯著； † 定量下限。
媒劑 抗 HBV ASO TLR7 QOD 抗 HBV ASO 7.5 mg/kg +
7.5 mg/kg TLR7 QOD
平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 組合的 p 值
vs. 抗 HBV ASO vs. TLR7
D0 7.66 ± 0.39 7.67 ± 0.29 7.69 ± 0.19 7.62 ± 0.29 n/a n/a
D7 7.38 ± 0.60 4.80 ± 0.00 5.74 ± 0.62 4.80 ± 0.00 ns ***
D14 7.24 ± 0.68 4.30† ± 0.00 5.73 ± 1.20 4.30† ± 0.00 ns ***
D21 7.12 ± 0.43 5.30† ± 0.00 5.55 ± 0.32 5.30† ± 0.00 ns ***
D28 7.44 ± 0.48 4.30† ± 0.00 5.23 ± 1.02 4.30† ± 0.00 ns ***
D35 7.40 ± 0.44 4.30† ± 0.00 4.69 ± 0.71 4.30† ± 0.00 ns *
D42 7.34 ± 0.46 4.30† ± 0.00 4.72 ± 0.76 4.30† ± 0.00 ns *
D49 7.40 ± 0.44 4.30† ± 0.00 4.50 ± 0.55 4.30† ± 0.00 ns ns
D56 7.40 ± 0.44 4.30† ± 0.00 4.59 ± 0.65 4.30† ± 0.00 ns ns
D63 7.50 ± 0.41 4.30† ± 0.00 5.30 ± 1.21 4.30† ± 0.00 ns ***
D70 7.41 ± 0.45 4.30† ± 0.00 5.95 ± 1.17 4.30† ± 0.00 ns ***
D77 7.25 ± 0.59 4.72 ± 0.60 6.01 ± 1.17 4.30† ± 0.00 ns ***
D84 7.20 ± 0.55 5.74 ± 0.17 6.26 ± 1.08 4.30† ± 0.00 *** ***
D91 7.13 ± 0.40 5.97 ± 0.33 5.81 ± 1.09 4.70 ± 0.67 *** ***
D98 7.10 ± 0.21 6.13 ± 0.26 6.02 ± 1.17 5.32 ± 0.93 ** ***
D105 7.35 ± 0.33 6.52 ± 0.44 6.23 ± 1.29 5.89 ± 0.88 ** **
D111 7.69 ± 0.27 7.00 ± 0.26 6.77 ± 0.64 6.33 ± 0.65 *** ***
表 18：在以下治療後，AAV/HBV 小鼠血清中的 HBV-DNA 水準：食鹽水（媒液）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）每週以 7.5 mg/kg 的劑量給藥；CMP ID NO: VI (TLR7) 每週 (QW) 投予 100 mg/kg；或兩者的組合。與抗 HBV ASO 1.5 mg/kg 和 TLR7 QW 相比，計算出該組合的 p 值； * p 值 ≤ 0.05； ** p 值 ≤0.01； *** p 值 ≤ 0.001；ns 不顯著； † 定量下限。
媒劑 抗 HBV ASO TLR7 QW 抗 HBV ASO 7.5 mg/kg +
7.5 mg/kg TLR7 QW
平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 組合的 p 值
vs. 抗 HBV ASO vs. TLR7
D0 7.66 ± 0.39 7.67 ± 0.29 7.68 ± 0.20 7.67 ± 0.38 n/a n/a
D7 7.38 ± 0.60 4.80 ± 0.00 7.15 ± 0.67 4.98 ± 0.28 ns ***
D14 7.24 ± 0.68 4.30† ± 0.00 7.14 ± 0.47 4.30† ± 0.00 ns ***
D21 7.12 ± 0.43 5.30† ± 0.00 6.65 ± 0.75 5.30† ± 0.00 ns ***
D28 7.44 ± 0.48 4.30† ± 0.00 6.10 ± 1.25 4.30† ± 0.00 ns ***
D35 7.40 ± 0.44 4.30† ± 0.00 6.61 ± 0.98 4.30† ± 0.00 ns ***
D42 7.34 ± 0.46 4.30† ± 0.00 6.40 ± 0.84 4.30† ± 0.00 ns ***
D49 7.40 ± 0.44 4.30† ± 0.00 6.27 ± 0.89 4.30† ± 0.00 ns ***
D56 7.40 ± 0.44 4.30† ± 0.00 6.74 ± 0.64 4.30† ± 0.00 ns ***
D63 7.50 ± 0.41 4.30† ± 0.00 6.72 ± 0.70 4.30† ± 0.00 ns ***
D70 7.41 ± 0.45 4.30† ± 0.00 6.80 ± 0.64 4.30† ± 0.00 ns ***
D77 7.25 ± 0.59 4.72 ± 0.60 6.95 ± 0.53 4.46 ± 0.44 ns ***
D84 7.20 ± 0.55 5.74 ± 0.17 6.87 ± 0.49 4.55 ± 0.69 *** ***
D91 7.13 ± 0.40 5.97 ± 0.33 6.59 ± 0.52 4.87 ± 0.85 *** ***
D98 7.10 ± 0.21 6.13 ± 0.26 6.70 ± 0.40 5.17 ± 1.06 *** ***
D105 7.35 ± 0.33 6.52 ± 0.44 6.93 ± 0.43 6.07 ± 0.99 * ***
D111 7.69 ± 0.27 7.00 ± 0.26 7.07 ± 0.45 6.51 ± 0.69 * **
表 15 至 18 和圖 9A 至 D 顯示對於 CMP ID NO: 15_1 和 CMP ID NO: VI 的所示投予之組合，在研究期間病毒標誌物 HBV-DNA 的變化。對於 CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）單一療法，在 1.5 mg/kg 和 7.5 mg/kg 兩者均觀察到 HBV-DNA 迅速減少至測定之較低的量化水準 (LLOQ) 以下（圖 9A 和 C），以及含有任何濃度之抗 HBV ASO 的任何組合（圖 9A 至 D，實線）。相反，當僅用 TLR7 促效劑（CM ID NO: VI）治療時，每隔一天（QOD）給藥一次，HBV-DNA 的減少僅達到 LLOQ（圖 9A 和 C）。在 QW 給藥時（圖 9B 和 D），TLR7 促效劑單一療法最多減少約 1.5-log。
給藥結束後，所有治療組的 HBV-DNA 水準部分反彈，在 1.5 mg/kg 劑量的單一療法中，抗 HBV ASO 的絕對反彈最大（圖 9A 和 B）。該組中的 HBV DNA 血漿水準恢復到對照組的 ½log 以內。同樣地，在追蹤期間，無論是 QOD 還是 QW 給藥的單一療法，經 TLR7 促效劑治療之動物的反彈均恢復至對照組的 1 log 以內。這種反彈雖然與抗 HBV ASO 的幅度不同，但在治療結束後比抗 HBV ASO 治療組的反彈更快。
與每種單一化合物的治療相比，用抗 HBV ASO 和 TLR7 促效劑組合治療之組的反彈（通過 HBV DNA 測量）始終被延遲。值得注意的是，高劑量抗 HBV-ASO 之反彈的延遲發生和動力學在與頻繁和不頻繁之 TLR7 促效劑給藥的組合之間相似，反彈分別在第 91 和 84 天開始。有趣的是，在最低的組合劑量下（圖 8B），反彈似乎始於第 84 天，這比具有高 TLR7 促效劑劑量的低抗 HBV ASO 的反彈（圖 8A）晚，其在第 77 天觀察到反彈。因為，與用 TLR7 促效劑單一治療觀察到的相比，降低 3 倍劑量不會對觀察到反彈的時間產生負面影響，所以當將抗 HBV ASO 和 TLR7 促效劑組合使用時，其增加 TLR7 的治療範圍。
表 19 至 22 顯示用不同劑量治療後 AAV/HBV 小鼠血清中的 HBsAg 水準。該數據也表示在圖 10A 至 10D 中。
表 19：在以下治療後，AAV/HBV 小鼠血清中的 HBsAg 水準：食鹽水（媒液）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）每週以 1.5 mg/kg 的劑量給藥；CMP ID NO: VI (TLR7) 每隔一天 (QOD) 投予 100 mg/kg；或兩者的組合。與 a) 抗 HBV ASO 1.5 mg/kg 和 b) TLR7 QOD 相比，計算出該組合的 p 值。* p 值 ≤ 0.05； ** p 值 ≤0.01； *** p 值 ≤ 0.001；ns 不顯著。
媒劑 抗 HBV ASO TLR7 QOD 抗 HBV ASO 1.5 mg/kg +
1.5 mg/kg TLR7 QOD
平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 組合的 p 值
vs. 抗 HBV ASO vs. TLR7
D0 4.29 ± 0.36 4.34 ± 0.26 4.14 ± 0.37 4.27 ± 0.4 n/a n/a
D7 4.05 ± 0.61 2.6 ± 0.45 3.68 ± 1.03 2.53 ± 0.9 ns ***
D14 3.6 ± 0.91 2.53 ± 0.34 3.11 ± 1.35 1.87 ± 0.63 * ***
D21 3.38 ± 0.99 2.14 ± 0.35 2.62 ± 1.41 1.56 ± 0.52 * ***
D28 3.46 ± 1.18 2.12 ± 0.82 2.21 ± 1.28 1.33 ± 0.51 ** **
D35 3.59 ± 1.05 1.84 ± 0.46 1.78 ± 1.18 1.33 ± 0.49 ns ns
D42 3.55 ± 1.18 1.66 ± 0.51 1.57 ± 0.97 1.18 ± 0.42 ns ns
D49 3.54 ± 1.08 1.78 ± 0.43 1.63 ± 0.86 0.97 ± 0.58 ** *
D56 3.45 ± 0.99 1.62 ± 0.43 1.56 ± 0.77 1.27 ± 0.41 ns ns
D63 3.45 ± 0.96 1.97 ± 0.88 1.61 ± 0.96 1.14 ± 0.66 ** ns
D70 3.39 ± 1.12 2.87 ± 1.14 1.9 ± 1.23 1.53 ± 0.97 ** ns
D77 3.15 ± 1.17 3.2 ± 1.03 1.91 ± 1.18 1.77 ± 1.09 ** ns
D84 3.33 ± 1 3.58 ± 1.03 2.25 ± 1.16 2.18 ± 1.22 ** ns
D91 3.65 ± 1 3.89 ± 1.12 2.05 ± 1.35 2.35 ± 1.46 *** ns
D98 3.69 ± 0.84 3.87 ± 1.07 2.36 ± 1.26 2.7 ± 1.32 ** ns
D105 3.69 ± 0.85 3.96 ± 1.11 2.41 ± 1.18 2.68 ± 1.19 ** ns
D111 3.89 ± 0.84 4.07 ± 1.1 2.69 ± 1.38 2.99 ± 1.33 * ns
表 20：在以下治療後，AAV/HBV 小鼠血清中的 HBsAg 水準：食鹽水（媒液）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）每週以 1.5 mg/kg 的劑量給藥；CMP ID NO: VI (TLR7) 每週 (QW) 投予 100 mg/kg；或兩者的組合。與 a) 抗 HBV ASO 1.5 mg/kg 和 b) TLR7 QW 相比，計算出該組合的 p 值。* p 值 ≤ 0.05； ** p 值 ≤0.01； *** p 值 ≤ 0.001；ns 不顯著。
媒劑 抗 HBV ASO TLR7 QW 抗 HBV ASO 1.5 mg/kg +
1.5 mg/kg TLR7 QW
平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 組合的 p 值
vs. 抗 HBV ASO vs. TLR7
D0 4.29 ± 0.36 4.34 ± 0.26 4.07 ± 0.44 4.35 ± 0.14 n/a n/a
D7 4.05 ± 0.61 2.6 ± 0.45 3.72 ± 0.85 2.8 ± 0.39 ns ***
D14 3.6 ± 0.91 2.53 ± 0.34 3.52 ± 0.96 2.3 ± 0.49 ns ***
D21 3.38 ± 0.99 2.14 ± 0.35 3.07 ± 1.22 1.89 ± 0.53 ns ***
D28 3.46 ± 1.18 2.12 ± 0.82 2.65 ± 1.37 1.38 ± 0.52 * ***
D35 3.59 ± 1.05 1.84 ± 0.46 2.49 ± 1.29 1.48 ± 0.36 ns ***
D42 3.55 ± 1.18 1.66 ± 0.51 2.28 ± 1.28 1.28 ± 0.41 ns ***
D49 3.54 ± 1.08 1.78 ± 0.43 1.9 ± 1.07 1.12 ± 0.45 * **
D56 3.45 ± 0.99 1.62 ± 0.43 2.13 ± 1 1.26 ± 0.35 ns **
D63 3.45 ± 0.96 1.97 ± 0.88 2.43 ± 1.14 1.26 ± 0.64 * ***
D70 3.39 ± 1.12 2.87 ± 1.14 2.48 ± 1.23 1.15 ± 0.36 *** ***
D77 3.15 ± 1.17 3.2 ± 1.03 2.41 ± 1.16 1.28 ± 0.36 *** ***
D84 3.33 ± 1 3.58 ± 1.03 2.66 ± 1.15 1.34 ± 0.47 *** ***
D91 3.65 ± 1 3.89 ± 1.12 2.66 ± 1.44 1.55 ± 0.96 *** ***
D98 3.69 ± 0.84 3.87 ± 1.07 2.83 ± 1.16 2.2 ± 0.91 *** *
D105 3.69 ± 0.85 3.96 ± 1.11 2.81 ± 1.1 2.25 ± 0.9 *** *
D111 3.89 ± 0.84 4.07 ± 1.1 3.1 ± 1.12 2.51 ± 0.99 *** *
表 21：在以下治療後，AAV/HBV 小鼠血清中的 HBsAg 水準：食鹽水（媒液）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）每週以 7.5 mg/kg 的劑量給藥；CMP ID NO: VI (TLR7) 每隔一天 (QOD) 投予 100 mg/kg；或兩者的組合。與 a) 抗 HBV ASO 7.5mg/kg 和 b) TLR7 QOD 相比，計算出該組合的 p 值。* p 值 ≤ 0.05； ** p 值 ≤0.01； *** p 值 ≤ 0.001；ns 不顯著。
媒劑 抗 HBV ASO TLR7 QOD 抗 HBV ASO 7.5 mg/kg +
7.5 mg/kg TLR7 QOD
平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 組合的 p 值
vs. 抗 HBV ASO vs. TLR7
D0 4.29 ± 0.36 4.30 ± 0.30 4.14 ± 0.37 4.20 ± 0.31 n/a n/a
D7 4.05 ± 0.61 1.71 ± 0.24 3.68 ± 1.03 1.48 ± 0.45 ns ***
D14 3.60 ± 0.91 1.83 ± 0.21 3.11 ± 1.35 1.31 ± 0.34 ns ***
D21 3.38 ± 0.99 1.43 ± 0.17 2.62 ± 1.41 1.19 ± 0.31 ns ***
D28 3.46 ± 1.18 1.30 ± 0.19 2.21 ± 1.28 1.07 ± 0.36 ns ***
D35 3.59 ± 1.05 1.36 ± 0.26 1.78 ± 1.18 0.79 ± 0.35 * ***
D42 3.55 ± 1.18 1.30 ± 0.16 1.57 ± 0.97 0.90 ± 0.32 ns *
D49 3.54 ± 1.08 1.56 ± 0.16 1.63 ± 0.86 1.05 ± 0.27 ns *
D56 3.45 ± 0.99 1.32 ± 0.24 1.56 ± 0.77 1.08 ± 0.27 ns ns
D63 3.45 ± 0.96 1.33 ± 0.47 1.61 ± 0.96 0.92 ± 0.28 ns **
D70 3.39 ± 1.12 2.18 ± 0.91 1.90 ± 1.23 1.07 ± 0.24 ** **
D77 3.15 ± 1.17 2.70 ± 0.85 1.91 ± 1.18 1.08 ± 0.20 *** **
D84 3.33 ± 1.00 3.17 ± 0.60 2.25 ± 1.16 1.18 ± 0.24 *** ***
D91 3.65 ± 1.00 3.82 ± 0.38 2.05 ± 1.35 1.38 ± 0.85 *** *
D98 3.69 ± 0.84 3.64 ± 0.81 2.36 ± 1.26 2.26 ± 0.92 *** ns
D105 3.69 ± 0.85 3.61 ± 0.97 2.41 ± 1.18 2.39 ± 0.93 ** ns
D111 3.89 ± 0.84 3.40 ± 1.49 2.69 ± 1.38 2.55 ± 1.06 * ns
表 22：在以下治療後，AAV/HBV 小鼠血清中的 HBsAg 水準：食鹽水（媒液）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）每週以 7.5 mg/kg 的劑量給藥；CMP ID NO: VI (TLR7) 每週 (QW) 投予 100 mg/kg；或兩者的組合。與 a) 抗 HBV ASO 7.5mg/kg 和 b) TLR7 促效劑 QW 相比，計算出該組合的 p 值。* p 值 ≤ 0.05； ** p 值 ≤0.01； *** p 值 ≤ 0.001；ns 不顯著。
媒劑 抗 HBV ASO TLR7 QW 抗 HBV ASO 7.5 mg/kg +
7.5 mg/kg TLR7 QW
平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 平均值 ± SD 組合的 p 值
vs. 抗 HBV ASO vs. TLR7
D0 4.29 ± 0.36 4.30 ± 0.30 4.07 ± 0.44 4.07 ± 0.41 n/a n/a
D7 4.05 ± 0.61 1.71 ± 0.24 3.72 ± 0.85 1.52 ± 0.37 ns ***
D14 3.60 ± 0.91 1.83 ± 0.21 3.52 ± 0.96 1.45 ± 0.30 ns ***
D21 3.38 ± 0.99 1.43 ± 0.17 3.07 ± 1.22 1.27 ± 0.31 ns ***
D28 3.46 ± 1.18 1.30 ± 0.19 2.65 ± 1.37 1.09 ± 0.36 ns ***
D35 3.59 ± 1.05 1.36 ± 0.26 2.49 ± 1.29 1.30 ± 0.42 ns ***
D42 3.55 ± 1.18 1.30 ± 0.16 2.28 ± 1.28 1.12 ± 0.39 ns ***
D49 3.54 ± 1.08 1.56 ± 0.16 1.90 ± 1.07 0.82 ± 0.47 * ***
D56 3.45 ± 0.99 1.32 ± 0.24 2.13 ± 1.00 1.10 ± 0.29 ns ***
D63 3.45 ± 0.96 1.33 ± 0.47 2.43 ± 1.14 1.09 ± 0.50 ns ***
D70 3.39 ± 1.12 2.18 ± 0.91 2.48 ± 1.23 1.12 ± 0.59 * ***
D77 3.15 ± 1.17 2.70 ± 0.85 2.41 ± 1.16 1.14 ± 0.81 *** ***
D84 3.33 ± 1.00 3.17 ± 0.60 2.66 ± 1.15 1.47 ± 1.05 *** ***
D91 3.65 ± 1.00 3.82 ± 0.38 2.66 ± 1.44 1.52 ± 1.47 *** ***
D98 3.69 ± 0.84 3.64 ± 0.81 2.83 ± 1.16 1.83 ± 1.39 *** **
D105 3.69 ± 0.85 3.61 ± 0.97 2.81 ± 1.10 2.08 ± 1.30 *** *
D111 3.89 ± 0.84 3.40 ± 1.49 3.10 ± 1.12 2.25 ± 1.24 ** **
還測量了 HBeAg 水準，但是在單一治療和組合治療之間未觀察到市場差異。
表 19 至 22 和圖 10A 至 10D 顯示對 HBsAg 的效果通常與對 HBV-DNA 的效果相似。與 HBV DNA 不同，用 1.5 mg/kg 抗 HBV ASO (CMP ID NO: 15) 治療無法將 HBsAg 抑制到檢測極限以下水準（圖 10A 和 10B），TLR7 促效劑 (CMP ID NO: VI) 以任何劑量給藥也無法做到（圖 10A 至 10D）。另一方面，與單一治療相比，抗 HBV ASO 和 TLR7 促效劑的組合能夠在所有劑量下將 HBsAg 減少至檢測極限以下，並延遲反彈。如同 HBV DNA，觀察到最低限度的 TLR7 促效劑治療範圍增加也與 HBsAg 減少有關，而對於 HBsAg 來說這一點更為顯著，因為最低劑量的組合（圖 10B），無論是減少 HBsAg 還是延遲反彈，都與最高劑量的組合（圖 10C）基本上一樣有效，這表明抗 HBV ASO 的治療範圍也可能有所增加。
研究結論
研究中的數據顯示，在慢性 HBV 感染的體內模型中，抗 HBV ASO 和 TLR7 促效劑的組合具有益處。從 HBV DNA 和 HBsAg 的角度測量，這些好處最明顯地可以看作是治療結束後反彈的延遲。沒有跡象表明該組合改變了這些化合物的風險狀況，並且在臨床環境中每種活性成分的較低劑量可以達到與較高劑量組合相同的抗病毒效果。對於組合的治療範圍中，這種正向增加對患者來說是有明顯的好處。
C 部分：比較 RNAi 和反義寡核苷酸的效果
實例 C1
這項研究的目的是評估 AAV-HBV 小鼠模型中某些化合物的體內藥理作用和功效。
測試的化合物：負調控 siRNA（DCR-AUD1，不靶向 HBV 基因組的 siRNA）；HBV(s)-219 （抗 HBV siRNA）；CMP ID NO: 15_1（抗 HBV ASO）。
攜帶 B 型肝炎病毒 (HBV) 基因組的重組腺相關病毒 (AAV) rAAV8-1.3HBV ayw（批號：2019032703）購自北京五加和分子醫學研究所有限公司，並在使用前儲存於 -70°C。
取得了一百一十五 (115) 隻雄性 C57BL/6 小鼠。在給藥前第 0 天，將所有動物透過尾靜脈注射 1×1011 之 AAV-HBV 的載體基因組以進行模型誘導。在給藥前第 24 天，根據基線血清病毒標誌物和體重，選擇 80 隻合格的 HBV 感染小鼠。
將 80 隻選擇的小鼠隨機分為 4 組進行化合物治療。在第 0 天以 5 mL/kg 的劑量皮下注射無菌水、DCR-AUD1、DCR-S219 (9 mg/kg) 和 CMP ID NO: 15_1 (6.6 mg/kg)。劑量體積為 2 mL。
在第 0 至 21天期間每週測量一次體重。在研究期間，研究組之間未觀察到體重增長的顯著差異。
在第 0 至 21天期間每週兩次收集全血以製備血清（每隻小鼠 15 μL）。在第 21 天，對小鼠實施安樂死。除了用於病毒標記測定的血清樣本外，還製備了額外的血清樣本（每隻小鼠 120 μL）並儲存在 -70°C 下。收集整個肝臟，切成兩半，速凍並保存在 -70°C。其餘的劑量配方以及期終血清和組織樣本分別於 2019 年 11 月 16 日和 20 日處置。
HBsAg 的基線血清水準由 ARCHITECT i2000（美國伊利諾伊州萊克布拉夫湖的雅培實驗室）和輔助試劑測定。基線血清 HBV DNA 水準藉由使用 ABI7500（美國加利福尼亞州福斯特城的 Applied Biosystems 公司美國加利福尼亞州福斯特城的 Applied Biosystems 公司）和檢測套組（中國湖南長沙的聖湘生物科技股份有限公司）進行測量。
結果顯示於圖 30。抗 HBV ASO (HBV-LNA) 使 HBsAg 水準迅速下降，並一直維持到大約 10 天，此後 HBsAg 水準反彈。靶向 HBV 的 siRNA 化合物 (DCR-S219) 最初減少 HBsAg 水準的速度稍慢，但減少速率仍然非常快。此外，在實驗的 21 天中，使用 siRNA 化合物可保持令人印象深刻的減少水準，沒有反彈的跡象。對於 siRNA 化合物，甚至可以從圖 30 中看到更多好處，因為莫耳劑量比 LNA 化合物低得多，從而獲得了優異的結果。圖 30 顯示了用 9 mg/kg siRNA 和 6.6 mg/kg LNA 給藥的小鼠的結果，然而，由於這些化合物之間的分子量差異，siRNA 的莫耳劑量僅為 LNA 的 0.3 倍左右（DCR-S219 的 Mw 為 22262 Da，而 CMP ID NO: 15_1 的 Mw 為 6638 Da）。因此，本發明之 siRNA 的莫耳劑量遠低於反義寡核苷酸的莫耳劑量，其可以獲得優異的結果。
例如，如實例 B 和圖 9 所示，將數據與抗 HBV ASO 和 TLR7 促效劑的數據結合時，其顯示出 TLR7 促效劑與 RNAi 寡核苷酸（例如靶向 HBV 的 siRNA ）結合的益處。
如圖 10A 所示，單獨的 TLR7 促效劑可減少 HBsAg，但最初的 HBsAg 減少速度較慢（第 42 天觀察到的最低 HBsAg）。因此，使用 RNAi 寡核苷酸（例如靶向 HBV 的 siRNA）與 TLR7 促效劑存在協同作用，因為實例 C /圖 30 中靶向 HBV 的 siRNA 實現了快速有效的 HBsAg 減弱，即在 10 天內。此外，如圖 30 所示，靶向 HBV 的 siRNA 提供了非常有效的長期減弱作用，優於抗 HBV ASO。
根據本文所揭露之數據，可以確定包含 1) RNAi 寡核苷酸（例如靶向 HBV 的 siRNA）和 2) TLR7 促效劑之組合的效果將是快速誘導的、長時間有效的 HBsAg 減弱、在很長一段時間顯示出出有效的抗病毒控制。因此，包含 RNAi 寡核苷酸和 TLR7 促效劑的組合是本發明最優選的組合。
在本文揭露實例的 A、B 和 C 部分的試驗結果之前，無法預期到這樣有益的效果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
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Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
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Figure 12_A0101_SEQ_0023
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Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029

Claims (159)

  1. 一種醫藥組合，其包含以下項或由以下項組成：治療性寡核苷酸、及式 (I) 或式 (II) 之 TLR7 促效劑：
    Figure 03_image157
    其中，X 為 CH2 或 S； 針對式 (I)，R1 為 -OH 或 -H 且 R2 為 1-羥丙基或羥甲基， 針對式 (II)，R1 為 -OH 或 -H 或乙醯氧基且 R2 為 1-乙醯氧基丙基或 1-羥丙基或 1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基， 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  2. 如請求項 1 之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸為 RNAi 寡核苷酸。
  3. 如請求項 2 之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為靶向 HBV 之寡核苷酸 (RNAi ID NO: 1 )。
  4. 如請求項 2 或 3 之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為靶向 HBsAg mRNA 之寡核苷酸 (RNAi ID NO: 2 )。
  5. 如請求項 2 至 4 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為減少 HBsAg mRNA 表現之寡核苷酸 (RNAi ID NO: 3 )。
  6. 如請求項 2 至 5 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為包含長度為 19 至 30 個核苷酸的反義股之寡核苷酸，其中，該反義股包含與如 ACAANAAUCCUCACAAUA (SEQ ID NO: 33) 中所示之 HBsAg mRNA 序列互補之區域 (RNAi ID NO: 4 )。
  7. 如請求項 2 至 5 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為用於減少 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) mRNA 表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含長度為 19 至 30 個核苷酸的反義股，其中，該反義股包含與如 ACAANAAUCCUCACAAUA (SEQ ID NO: 33) 中所示之 HBsAg mRNA 序列互補之區域 (RNAi ID NO: 5 )。
  8. 如請求項 6 或 7 之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸進一步包含長度為 19 至 50 個核苷酸的有義股，其中，該有義股與該反義股形成雙股螺旋區域。
  9. 如請求項 8 之醫藥組合，其中，該有義股包含與如 UUNUUGUGAGGAUUN (SEQ ID NO: 34) 中所示之序列互補之區域。
  10. 如請求項 8 或 9 之醫藥組合，其中，該有義股包含與如 5′-UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC (SEQ ID NO: 35) 中所示之序列互補之區域。
  11. 如請求項 9 之醫藥組合，其中，該反義股包含如 UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG (SEQ ID NO: 36) 中所示之序列。
  12. 如請求項 9 之醫藥組合，其中，該反義股由如 UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG  (SEQ ID NO: 37) 中所示之序列組成。
  13. 如請求項 9 之醫藥組合，其中，該反義股由如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG  (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列組成。
  14. 如請求項 8 至 12 中任一項之醫藥組合，其中，該有義股包含如 ACAANAAUCCUCACAAUAA (SEQ ID NO: 39) 中所示之序列。
  15. 如請求項 8 至 14 中任一項之醫藥組合，其中，該有義股包含如 GACAANAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 40) 中所示之序列。
  16. 如請求項 8 至 14 中任一項之醫藥組合，其中，該有義股由如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC  (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列組成。
  17. 如請求項 8 至 14 中任一項之醫藥組合，其中，該有義股由如 GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC  (SEQ ID NO: 42) 中所示之序列組成。
  18. 如請求項 2 至 5 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為用於減少 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) mRNA 表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中，該有義股包含如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，其中，該反義股包含如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO: 38) 中所示之序列， 其中，該反義股及該有義股之各者包含一個或多個經 2′-氟及 2′-O-甲基修飾之核苷酸及至少一個硫代磷酸酯鍵聯，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳包含磷酸酯類似物，並且其中，該有義股經結合至一個或多個 N-乙醯半乳胺糖 (GalNAc) 部分。
  19. 如請求項 2 至 5 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為用於減少 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) mRNA 表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中： 該有義股包含如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2′-氟修飾之核苷酸；在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸；及至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股經結合至一個或多個 N-乙醯半乳胺糖 (GalNAc) 部分；並且 該反義股包含如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列，且其包含在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 的經 2′-氟修飾之核苷酸；在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸；及至少三個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳包含磷酸酯類似物。
  20. 如請求項 19 之醫藥組合，其中，該有義股包含介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。
  21. 如請求項 19 或 20 之醫藥組合，其中，該反義股包含介於核苷酸 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21、及 21 與 22 之間的五個硫代磷酸酯鍵聯。
  22. 如請求項 19 至 21 中任一項之醫藥組合，其中，該反義股的 5’-核苷酸具有下列結構：
    Figure 03_image159
    。
  23. 如請求項 19 至 22 中任一項之醫藥組合，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸中之一個或多個經結合至單價 GalNAc 部分。
  24. 如請求項 23 之醫藥組合，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸中之各者經結合至單價 GalNAc 部分。
  25. 如請求項 24 之醫藥組合，其中，該 –GAAA– 模體包含下列結構：
    Figure 03_image161
    ， 其中： L 代表鍵結、點擊化學控點或長度為 1 至 20 個 (包括1 個及 20 個) 連續共價鍵結原子的連接子，其選自由以下各項所組成之群組：取代和未取代之伸烷基 (alkylene)、取代和未取代之伸烯基 (alkenylene)、取代和未取代之伸炔基 (alkynylene)、取代和未取代之伸雜烷基 (heteroalkylene)、取代和未取代之伸雜烯基 (heteroalkenylene)、取代和未取代之伸雜炔基 (heteroalkynylene)、及其組合；並且 X 為 O、S或 N。
  26. 如請求項 25 之醫藥組合，其中，L 為縮醛連接子。
  27. 如請求項 25 或 26 之醫藥組合，其中，X 為 O。
  28. 如請求項 20 之醫藥組合，其中，該 –GAAA– 序列包含下列結構：
    Figure 03_image163
    。
  29. 如請求項 8 之醫藥組合，其中，該有義股在其 3′ 端包含如下所示之主幹-環圈：S1 -L-S2 ，其中，S1 與 S2 互補，並且其中，L 形成長度達至 6 個核苷酸的介於 S1 與 S2 之間之環圈。
  30. 如請求項 29 之醫藥組合，其中，L 為四鹼基環圈。
  31. 如請求項 29 或 30 之醫藥組合，其中，L 形成長度為 4 個核苷酸的介於 S1 與 S2 之間之環圈。
  32. 如請求項 29 至 31 中任一項之醫藥組合，其中，L 包含 GAAA 所示之序列。
  33. 如請求項 29 至 32 中任一項之醫藥組合，其中，該主幹-環圈的 L 之達至 4 個核苷酸各自結合至單獨的 GalNAc。
  34. 如請求項 6 至 16 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。
  35. 如請求項 34 之醫藥組合，其中，該經修飾之核苷酸包含 2′-修飾。
  36. 如請求項 35 之醫藥組合，其中，該 2′-修飾為選自以下項之修飾：2′-胺基乙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基及 2′-去氧-2′-氟-β-d-阿糖核酸。
  37. 如請求項 6 至 16 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸之所有核苷酸為經修飾之核苷酸。
  38. 如請求項 6 至 16 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯。
  39. 如請求項 38 之醫藥組合，其中，該至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。
  40. 如請求項 6 至 16 中任一項之醫藥組合，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳包含磷酸酯類似物。
  41. 如請求項 6 至 16 中任一項之醫藥組合，其中，該寡核苷酸的至少一個核苷酸經結合至靶向配體。
  42. 如請求項 41 之醫藥組合，其中，該靶向配體為 N-乙醯半乳胺糖 (GalNAc) 部分。
  43. 如請求項 2 至 5 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為用於減少 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) mRNA 表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中： 該有義股由如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列組成，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之硫代磷酸酯鍵聯，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸之各者經結合至單價 GalNac 部分；並且 該反義股由如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列組成，且其包含在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 的經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間、介於在位置 2 與 3 的核苷酸之間、介於在位置 3 與 4 的核苷酸之間、介於在位置 20 與 21 的核苷酸之間、及介於在位置 21 與 22 的核苷酸之間之硫代磷酸酯鍵聯， 其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳包含甲氧基膦酸酯 (MOP) (RNAi ID NO: 6 )。
  44. 如請求項 2 至 5 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為用於減少 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) mRNA 表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中： 該有義股包含如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2’-氟修飾之核苷酸；在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸；及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸之各者經結合至單價 GalNAc 部分，其中，該 –GAAA– 序列包含下列結構：
    Figure 03_image165
    ；並且 該反義股包含如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列，且其包含在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 的經 2′-氟修飾之核苷酸；在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸；及介於核苷酸 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21、及 21 與 22 之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳具有下列結構：
    Figure 03_image167
    (RNAi ID NO: 7 )。
  45. 如請求項 2 至 5 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸具有如圖 29A 中所繪示之結構 (RNAi ID NO: 8 )。
  46. 如請求項 2 至 5 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為寡核苷酸 HBV(s)-219 (RNAi ID NO: 9 )。
  47. 如請求項 1 之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸為長度為 13 至 22 個核苷酸的經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸，其具有至少 12 個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與來自 SEQ ID NO: 1 的位置 1530 至 1602 之連續序列為 100% 互補。
  48. 如請求項 47 之醫藥組合，其中，該連續核苷酸序列與選自由以下各項所組成之群組之標靶序列為 100% 互補：SEQ ID NO: 1 的位置 1530 至 1598；1530 至 1543；1530 至 1544；1531至 1543；1551 至 1565；1551 至 1566；1577 至 1589；1577 至 1591；1577 至 1592；1578 至 1590；1578 至 1592；1583 至 1598；1584 至 1598；1585 至 1598 及 1583 至 1602。
  49. 如請求項 47 或 48 之醫藥組合，其中，該連續核苷酸序列的長度為介於 12 至 16 個核苷酸之間。
  50. 如請求項 47 至 49 中任一項之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列選自由以下各項所組成之群組： gcgtaaagagagg (SEQ ID NO: 2)； gcgtaaagagaggt (SEQ ID NO: 3)； cgcgtaaagagaggt (SEQ ID NO 4)； agaaggcacagacgg (SEQ ID NO 5)； gagaaggcacagacgg (SEQ ID NO 6)； agcgaagtgcacacgg (SEQ ID NO 7)； gaagtgcacacgg (SEQ ID NO 8)； gcgaagtgcacacgg (SEQ ID NO 9)； agcgaagtgcacacg (SEQ ID NO: 10)； cgaagtgcacacg (SEQ ID NO 11)； aggtgaagcgaagtgc (SEQ ID NO: 12) aggtgaagcgaagtg (SEQ ID NO: 13)； aggtgaagcgaagt (SEQ ID NO 14) 及 gcagaggtgaagcgaagtgc (SEQ ID NO: 29)，或其醫藥上可接受之鹽。
  51. 如請求項 47 至 50 中任一項之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列為式 5’-F-G-F’-3’ 之缺口體，其中，區域 F 及 F’ 獨立地由 2 至 5 個經 2’ 糖修飾之核苷酸組成，且界定該區域 F 及 F’ 的 5’及 3’端，且 G 為介於 6 與 10 個之間的能夠招募核糖核酸酶 H 的 DNA 核苷之區域。
  52. 如請求項 51 之醫藥組合，其中，該 2’ 糖修飾核苷獨立地選自由以下各項所組成之群組：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、2’-氟-ANA 及 LNA 核苷。
  53. 如請求項 51 或 52 之醫藥組合，其中，該一個或多個 2’ 糖修飾核苷為 MOE 核苷。
  54. 如請求項 51 或 52 之醫藥組合，其中，該一個或多個 2’ 糖修飾核苷為 LNA 核苷。
  55. 如請求項 54 之醫藥組合，其中，該經修飾之 LNA 核苷選自氧-LNA、胺基-LNA、硫代-LNA、cET 及 ENA。
  56. 如請求項 54 或 55 之醫藥組合，其中，該經修飾之 LNA 核苷為氧-LNA，其具有下列 2’-4’ 橋 –O-CH2 -。
  57. 如請求項 56 之醫藥組合，其中，該氧-LNA 為 β-D-氧-LNA。
  58. 如請求項 54 或 55 之醫藥組合，其中，該經修飾之 LNA 核苷為 cET，其具有下列 2’-4’ 橋 –O-CH(CH3 )-。
  59. 如請求項 58 之醫藥組合，其中，該 cET 為 (S)cET，即 6’(S)甲基-β-D-氧-LNA。
  60. 如請求項 54 或 55 之醫藥組合，其中，該 LNA 為 ENA，其具有下列 2’ – 4’ 橋 –O-CH2 -CH2 -。
  61. 如請求項 47 至 60 中任一項之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列選自由以下各項所組成之群組： GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO: 2)； GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO: 2)； GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO: 3)； CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 4)； AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 5)； GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 6)； AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 7)； GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO: 8)； GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO: 8)； GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 9)； AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO: 10)； CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO: 11)； AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO: 12)； AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO: 13) AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO: 13)； AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO: 14) 及 GCAGAGgtgaagcgaAGTGC (SEQ ID NO: 29) 其中，大寫字母表示 LNA 或 MOE 核苷且小寫字母表示 DNA 核苷。
  62. 如請求項 47 至 61 中任一項之醫藥組合，其中，該連續核苷酸序列內的至少 50% 之該核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  63. 如請求項 47 至 62 中任一項之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸的該連續核苷酸序列內的所有該核苷間鍵聯均為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  64. 如請求項 47 至 63 中任一項之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸之 GalNAc 結合物為二價、三價或四價 GalNAc 簇。
  65. 如請求項 64 之醫藥組合，其中，該 GalNAc 結合物選自圖 1B、1D 或 1J。
  66. 如請求項 47 至 65 中任一項之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸之該 GalNAc 結合物及該連續核苷酸序列是藉由包含兩、三、四或五個經磷酸二酯連接的 DNA 核苷之 PO 連接子共價連接的。
  67. 如請求項 66 之醫藥組合，其中，該 PO 連接子為該反義寡核苷酸的一部分且由胞嘧啶及腺嘌呤 (CA) 之二核苷酸序列加上至少兩個磷酸二酯鍵聯組成，該等磷酸二酯鍵聯一個介於 C 與 A 之間且一個接至 GalNAc 簇。
  68. 如請求項 47 至 67 中任一項之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸長度為 12 至 18 個核苷酸。
  69. 如請求項 47 至 68 中任一項之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸選自由以下各項所組成之群組： 5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsG -3' SEQ ID NO: 15 5'-GN2-C6o co ao G sm C sG stsasasasgsasgsA sG sG -3' SEQ ID NO: 15 5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs tsasasasgsasgsasGsGsT -3' SEQ ID NO: 16 5'-GN2-C6o co ao mCsGsmCs gstsasasasgsasgsasGsGsT -3' SEQ ID NO: 17 5'-GN2-C6o co ao AsGsAs asgsgscsascsasgsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 18 5'-GN2-C6o co ao GsAsGs asasgsgscsascsasgsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 19 5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 20 5'- GN2-C6o co ao GsAsAs gstsgscsascsasmcsGsG -3' SEQ ID NO: 21 5’-GN2-C6o co ao GsAsA sgstsgscsascsasm CsGsG -3’ SEQ ID NO: 21 5'-GN2-C6o co ao GsmCsGs asasgstsgscsascsasmCsGsG -3' SEQ ID NO: 22 5'-GN2-C6o co ao AsGsmCs gsasasgstsgscsascsAsmCsG -3' SEQ ID NO: 23 5'-GN2-C6o co ao mCsGsAs asgstsgscsascsasmCsG -3' SEQ ID NO: 24 5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasgsTsGsmC -3' SEQ ID NO: 25 5’-GN2-C6o co ao A sG sgstsgsasasgsmcsgsasA sG sT sG -3' SEQ ID NO: 26 5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasasGsTsG -3' SEQ ID NO: 26 及 5'-GN2-C6o co ao AsGsGs tsgsasasgsmcsgsasAsGsT -3' SEQ ID NO: 27
    其中，大寫粗體字母表示 β-D-氧-LNA 單元；小寫字母表示 DNA 單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標 m 表示含有 5-甲基胞嘧啶鹼基的 DNA 或 β-D-氧-LNA 單元；GN2-C6 表示帶有 C6 連接子的 GalNAc2 結合物，或其醫藥上可接受之鹽。
  70. 如請求項 47 至 69 中任一項之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸為 5'-Fig1J-o G sC sA sG sA sgsgstsgsasasgscsgsasA sG sT sG sC -3’ (圖 2)，其中，劃有底線的大寫字母表示 MOE 單元；小寫字母表示 DNA 單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯。
  71. 如請求項 1 至 70 中任一項之醫藥組合，其中，該 TLR7 促效劑具有式 (III)：
    Figure 03_image169
    其中，R1 為 –OH 或乙醯氧基且 R2 為 1-乙醯氧基丙基或 1-羥丙基或 1-羥甲基 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  72. 如請求項 1 至 70 中任一項之醫藥組合，其中，該 TLR7 促效劑具有式 (IV)：
    Figure 03_image171
    其中，R1 為乙醯氧基（環丙基）甲基或乙醯氧基（丙炔-1-基）甲基。
  73. 如請求項 1 至 70 中任一項之醫藥組合，其中，該 TLR7 促效劑具有式 (V)：
    Figure 03_image173
    其中，R1 為 -OH 且 R2 為 1-羥丙基或羥甲基 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  74. 如請求項0 至 73 中任一項之醫藥組合，其中，該 TLR7 促效劑選自由以下各項所組成之群組： [(1S )-1-[(2S ,4R ,5R )-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d ]嘧啶-3-基)-4-羥基-四氫呋喃-2-基]丙基] 乙酸酯 (CMP ID NO: VI)； 5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮 (CMP ID NO: VII)； 5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮 (CMP ID NO: VIII)； 5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮 (CMP ID NO: IX)； 5-胺基-3-(2'-O-乙醯基-3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮 (CMP ID NO: X)； 5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮 (CMP ID NO: XI)； [(S )-[(2S ,5R )-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d ]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]-環丙基-甲基] 乙酸酯 (CMP ID NO: XII) 及 (1S)-1-[(2S,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]丁-2-炔基] 乙酸酯 (CMP ID NO: XIII)； 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  75. 如請求項 2 至 46 及 71 至 74 中任一項之醫藥組合，其中，包含 RNAi 寡核苷酸及 TLR7 促效劑之該組合選自由以下組合所組成之群組： RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: VI；RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: VI； RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: VII；RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: VII； RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: VIII；RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: VIII； RNAi ID NO: 1 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 2 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 3 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 4 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 5 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 6 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 7 及 CMP ID NO: XIII；RNAi ID NO: 8 及 CMP ID NO: XIII，或 RNAi ID NO: 9 及 CMP ID NO: XIII； 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  76. 如請求項 2 至 46 及 71 至 74 中任一項之醫藥組合，其中，該 RNAi 寡核苷酸為 RNAi ID NO: 7： 包含與反義股形成雙股螺旋區域的有義股之寡核苷酸，其中： 該有義股包含如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸中之各者經結合至單價 GalNac 部分，其中，該 –GAAA– 序列包含下列結構：
    Figure 03_image175
    ；並且 該反義股包含如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列，且其包含在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 的經 2′-氟修飾之核苷酸，在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸，及介於核苷酸 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21及 21 與 22 之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳具有下列結構：
    Figure 03_image177
    ； 且該 TLR7 促效劑為 CMP ID NO: VI：
    Figure 03_image179
    或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  77. 如請求項 47 至 74 中任一項之醫藥組合，其中，包含經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸及 TLR7 促效劑之該組合選自由以下組合所組成之群組：CMP ID NO: 15_ 1 及 VI；CMP ID NO: 15_ 2 及 VI；CMP ID NO: 16_ 1 及 VI；CMP ID NO: 20_ 1 及 VI；CMP ID NO: 23_ 1 及 VI；CMP ID NO: 26_ 1 及 VI；CMP ID NO: 29_ 1 及 VI；CMP ID NO: 15_ 1 及 VII；CMP ID NO: 15_ 2 及 VII；CMP ID NO: 16_ 1 及 VII；CMP ID NO: 20_ 1 及 VII；CMP ID NO: 23_ 1 及 VII；CMP ID NO: 26_ 1 及 VII；CMP ID NO: 29_ 1 及 VII；CMP ID NO: 15_ 1 及 VIII；CMP ID NO: 15_ 2 及 VIII；CMP ID NO: 16_ 1 及 VIII；CMP ID NO: 20_ 1 及 VIII；CMP ID NO: 23_ 1 及 VII；CMP ID NO: 26_ 1 及 VIII；CMP ID NO: 29_ 1 及 VIII；CMP ID NO: 15_ 1 及 XIII；CMP ID NO: 15_ 2 及 XIII；CMP ID NO: 16_ 1 及 XIII；CMP ID NO: 20_ 1 及 XIII；CMP ID NO: 23_ 1 及 XIII；CMP ID NO: 26_ 1 及 XIII；及 CMP ID NO: 29_ 1 及 XIII，或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  78. 如請求項 47 至 74 中任一項之醫藥組合，其中，該經 GalNAc 結合之反義寡核苷酸為如圖 5 中所示之 CMP ID NO: 15_1 且該 TLR7 促效劑為 CMP ID NO: VI：
    Figure 03_image181
    或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  79. 如請求項 1 至 78 中任一項之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是以醫藥上可接受之鹽來調製的。
  80. 如請求項 79 之醫藥組合，其中，該醫藥上可接受之鹽為金屬陽離子，較佳的是其中，該醫藥上可接受之鹽為 Na+ 或 K+ 。
  81. 如請求項 1 至 80 中任一項之醫藥組合，其中，如請求項 1 至 80 中任一項之治療性寡核苷酸及 TLR7 促效劑是以醫藥上可接受之載體來調製的。
  82. 如請求項 81 之醫藥組合，其中，該醫藥上可接受之載體為水。
  83. 如請求項 1 至 82 中任一項之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是調製於磷酸鹽緩衝液中的。
  84. 如請求項 1 至 83 中任一項之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是調製用於皮下注射的，且該 TLR7 促效劑是調製用於口服投予的。
  85. 如請求項 1 至 83 中任一項之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是調製用於靜脈內注射的，且該 TLR7 促效劑是調製用於口服投予的。
  86. 如請求項 2 至 46、75、76、及 79 至 83 中任一項之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸為調製用於皮下注射之 siRNA 且該 TLR7 促效劑是調製用於口服投予的。
  87. 如請求項 1 至 86 中任一項之醫藥組合，其中，該醫藥組合包含 RNAi 寡核苷酸及 TLR7 促效劑，其中，該醫藥組合進一步包含 CpAM (核心蛋白別構調節劑)。
  88. 如請求項 87 之醫藥組合，其中，該 CpAM 具有根據下面所示的化合物 (CpAM1) 之式：
    Figure 03_image183
    化合物 (CpAM1) 其中 R1 為氫、鹵素或 C1-6 烷基； R2 為氫或鹵素； R3 為氫或鹵素； R4 為 C1-6 烷基； R5 為氫、羥C1-6 烷基、胺基羰基、C1-6 烷氧基羰基或羧基； R6 為氫、C1-6 烷氧基羰基或羧基-Cm H2m -， X 為羰基或磺醯基； Y 為 -CH2 -、-O- 或 -N(R7 )-， 其中，R7 為氫、C1-6 烷基、鹵C1-6 烷基、C3-7 環烷基-Cm H2m -、C1-6 烷氧基羰基-Cm H2m -、-Ct H2t -COOH、-鹵C1-6 烷基-COOH、-(C1-6 烷氧基)C1-6 烷基-COOH、-C1-6 烷基-O-C1-6 烷基-COOH、-C3-7 環烷基-Cm H2m -COOH、-Cm H2m -C3-7 環烷基-COOH、羥-Ct H2t -、羧基螺[3.3]庚基或羧基苯基-Cm H2m -、羧基吡啶基-Cm H2m -； W 為 -CH2 -、-C(C1-6 烷基)2 -、-O- 或羰基； n 為 0 或 1； m 為 0 至 7； t 為 1 至 7； 或其醫藥上可接受之鹽、或鏡像異構物或非鏡像異構物。
  89. 如請求項 87 或 88 之醫藥組合，其中，該 CpAM 為化合物 (CpAM2)
    Figure 03_image185
    化合物 (CpAM2) 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  90. 一種醫藥組合，其包含 RNAi 寡核苷酸、TLR7 促效劑及 CpAM，其中，該 RNAi 寡核苷酸為 RNAi ID NO: 7： 包含與反義股形成雙股螺旋區域的有義股之寡核苷酸，其中： 該有義股包含如 GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 41) 中所示之序列，且其包含在位置 3、8 至 10、12、13 及 17 的經 2’-氟修飾之核苷酸，在位置 1、2、4 至 7、11、14 至 16、18 至 26 及 31 至 36 的經 2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置 1 與 2 的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上 –GAAA– 序列的核苷酸中之各者經結合至單價 GalNac 部分，其中，該 –GAAA– 序列包含下列結構：
    Figure 03_image187
    ；並且 該反義股包含如 UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG (SEQ ID NO: 38) 中所示之序列，且其包含在位置 2、3、5、7、8、10、12、14、16 及 19 的經 2′-氟修飾之核苷酸，在位置 1、4、6、9、11、13、15、17、18 及 20 至 22 的經 2′-O-甲基修飾之核苷酸，及介於核苷酸 1 與 2、2 與 3、3 與 4、20 與 21及 21 與 22 之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的 5′-核苷酸的糖的 4′-碳具有下列結構：
    Figure 03_image189
    ； 其中，該 TLR7 促效劑為 CMP ID NO: VI：
    Figure 03_image191
    或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物； 並且其中，該 CpAM 為化合物 (CpAM2)：
    Figure 03_image193
    化合物 (CpAM2)， 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  91. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 90 中任一項之醫藥組合。
  92. 一種部件套組，其包含如請求項 1 至 90 中任一項之治療性寡核苷酸和具有有關投予 TLR7 促效劑以治療 B 型肝炎病毒感染之說明的包裝插頁。
  93. 如請求項 92 之部件套組，其中，於該包裝插頁中所述之該 TLR7 促效劑為如請求項 1 至 90 中任一項之 TLR7 促效劑。
  94. 如請求項 92 或 93 之部件套組，其中，該套組包含如請求項 1 至 90 中任一項之治療性寡核苷酸及如請求項 1 至 90 中任一項之 TLR7 促效劑。
  95. 如請求項 92 至 94 中任一項之部件套組，其中，該治療性寡核苷酸是調製用於皮下注射的，且該 TLR7 促效劑是調製用於口服投予的。
  96. 如請求項 92 至 95 中任一項之部件套組，其中，該包裝插頁說明慢性 B 型肝炎病毒感染之治療。
  97. 如請求項 1 至 96 中任一項之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸為經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式。
  98. 一種如請求項 1 至 97 中任一項之醫藥組合、組成物或套組用於治療 B 型肝炎病毒感染之用途。
  99. 如請求項 98 之用途，其中，待治療的該 B 型肝炎病毒感染為慢性 B 型肝炎病毒感染。
  100. 如請求項 98 或 99 之用途，其中，該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑是以醫藥有效量投予的。
  101. 如請求項 98 至 100 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該 TLR7 促效劑是每隔一天投予的。
  102. 如請求項 98 至 101 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予 1 至 4 mg/kg 的劑量給藥的，且該 TLR7 促效劑是以每次投予 150 至 170 mg 的劑量給藥的。
  103. 如請求項 98 至 102 中任一項之用途，其中，投予該治療性寡核苷酸達 48 週，且投予 84 劑的 TLR7 促效劑。
  104. 如請求項 98 至 103 中任一項之用途，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑之投予。
  105. 如請求項 98 至 104 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該 TLR7 促效劑為用於口服投予之劑型。
  106. 如請求項 98 至 105 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為 100 至 150 mg/ml，且該 TLR7 促效劑之劑量為 150 至 170 mg。
  107. 如請求項 98 至 106 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼 HBV mRNA 轉錄本的非表面抗原的 RNAi 寡核苷酸治療的情況下投予的。
  108. 如請求項 98 至 107 中任一項之用途，其中，該個體未被投予選擇性靶向 HBxAg mRNA 轉錄本的 RNAi 寡核苷酸。
  109. 如請求項 98 至 108 中任一項之用途，其進一步包含將有效量之恩替卡韋 (Entecavir) 投予該個體。
  110. 如請求項 98 至 109 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。
  111. 如請求項 1 至 97 中任一項之醫藥組合、組成物或套組，其用於醫藥中。
  112. 如請求項 1 至 97 中任一項之醫藥組合、組成物或套組，其用於治療 B 型肝炎病毒感染。
  113. 如請求項 111 或 112 所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，待治療的該 B 型肝炎病毒感染為慢性 B 型肝炎病毒感染。
  114. 如請求項 111 至 113 中任一項所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑是以醫藥有效量投予的。
  115. 如請求項 111 至 114 中任一項所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該 TLR7 促效劑是每隔一天投予的。
  116. 如請求項 111 至 115 中任一項所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予 1 至 4 mg/kg 的劑量給藥的，且該 TLR7 促效劑是以每次投予 150 至 170 mg 的劑量給藥的。
  117. 如請求項 111 至 116 中任一項所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，投予該治療性寡核苷酸達 48 週，且投予 84 劑的 TLR7 促效劑。
  118. 如請求項 111 至 117 中任一項所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑之投予。
  119. 如請求項 111 至 118 中任一項所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該 TLR7 促效劑為用於口服投予之劑型。
  120. 如請求項 107 至 115 中任一項所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為 100 至 150 mg/ml，且該 TLR7 促效劑之劑量為 150 至 170 mg。
  121. 如請求項 111 至 120 中任一項所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼 HBV mRNA 轉錄本的非表面抗原的 RNAi 寡核苷酸治療的情況下投予的。
  122. 如請求項 111 至 121 中任一項所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該個體未被投予選擇性靶向 HBxAg mRNA 轉錄本的 RNAi 寡核苷酸。
  123. 如請求項 111 至 122 中任一項所使用之醫藥組合、組成物或套組，其進一步包含將有效量之恩替卡韋投予該個體。
  124. 如請求項 111 至 123 中任一項所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。
  125. 一種治療性寡核苷酸在製造用於治療 B 型肝炎病毒感染的第一藥物中之用途，其中，該第一藥物為如請求項 1 至 97 中任一項之治療性寡核苷酸，並且其中，該第一藥物是併以第二藥物來投予的，其中，該第二藥物為如請求項 1 至 97 中任一項之 TLR7 促效劑。
  126. 一種如請求項 1 至 97 中任一項之醫藥組合、組成物或套組在製造藥物中之用途。
  127. 一種如請求項 1 至 97 中任一項之醫藥組合、組成物或套組在製造用於治療 B 型肝炎病毒感染之藥物中之用途。
  128. 如請求項 125 至 127 中任一項之用途，其中，待治療的該 B 型肝炎病毒感染為慢性 B 型肝炎病毒感染。
  129. 如請求項 125 至 128 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑是以醫藥有效量投予的。
  130. 如請求項 125 至 129 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該 TLR7 促效劑是每隔一天投予的。
  131. 如請求項 125 至 130 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予 1 至 4 mg/kg 的劑量給藥的，且該 TLR7 促效劑是以每次投予 150 至 170 mg 的劑量給藥的。
  132. 如請求項 125 至 131 中任一項之用途，其中，投予該治療性寡核苷酸達 48 週，且投予 84 劑的 TLR7 促效劑。
  133. 如請求項 125 至 132 中任一項之用途，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑之投予。
  134. 如請求項 125 至 133 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該 TLR7 促效劑為用於口服投予之劑型。
  135. 如請求項 125 至 134 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為 100 至 150 mg/ml，且該 TLR7 促效劑之劑量為 150 至 170 mg。
  136. 如請求項 125 至 135 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼 HBV mRNA 轉錄本的非表面抗原的 RNAi 寡核苷酸治療的情況下投予的。
  137. 如請求項 125 至 136 中任一項之用途，其中，該個體未被投予選擇性靶向 HBxAg mRNA 轉錄本的 RNAi 寡核苷酸。
  138. 如請求項 125 至 137 中任一項之用途，其進一步包含將有效量之恩替卡韋投予該個體。
  139. 如請求項 125 至138 中任一項之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。
  140. 一種用於治療 B 型肝炎病毒感染之方法，該方法包含將治療有效量之如請求項1至 97 中任一項之治療性寡核苷酸併以治療有效量之如請求項1至 91 或 94 至 97 中任一項之 TLR7 促效劑投予受 B 型肝炎病毒感染之個體。
  141. 一種用於治療 B 型肝炎病毒感染之方法，該方法包含將治療有效量之如請求項 1至 97 中任一項之醫藥組合、組成物或套組投予受 B 型肝炎病毒感染之個體。
  142. 如請求項 140 或 141 之方法，其中，待治療的該 B 型肝炎病毒感染為慢性 B 型肝炎病毒感染。
  143. 如請求項 140 至 142 中任一項之方法，其中，該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑是以醫藥有效量投予的。
  144. 如請求項 140 至 143 中任一項之方法，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該 TLR7 促效劑是每隔一天投予的。
  145. 如請求項 140 至 144 中任一項之方法，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予 1 至 4 mg/kg 的劑量給藥的，且該 TLR7 促效劑是以每次投予 150 至 170 mg 的劑量給藥的。
  146. 如請求項 140 至 145 中任一項之方法，其中，投予該治療性寡核苷酸達 48 週，且投予 84 劑的 TLR7 促效劑。
  147. 如請求項 140 至 146 中任一項之方法，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及該 TLR7 促效劑之投予。
  148. 如請求項 140 至 147 中任一項之方法，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該 TLR7 促效劑為用於口服投予之劑型。
  149. 如請求項 140 至 148 中任一項之方法，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為 100 至 150 mg/ml，且該 TLR7 促效劑之劑量為 150 至 170 mg。
  150. 如請求項 140 至 149 中任一項之方法，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼 HBV mRNA 轉錄本的非表面抗原的 RNAi 寡核苷酸治療的情況下投予的。
  151. 如請求項 140 至 150 中任一項之方法，其中，該個體未被投予選擇性靶向 HBxAg mRNA 轉錄本的 RNAi 寡核苷酸。
  152. 如請求項 140 至 151 中任一項之方法，其進一步包含將有效量之恩替卡韋投予該個體。
  153. 如請求項 140 至 152 中任一項之方法，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。
  154. 一種減少 B 型肝炎病毒表面抗原在細胞中的表現之方法，該方法包含將如請求項 1 至 91 中任一項之醫藥組合或組成物遞輸至該細胞。
  155. 如請求項 154 之方法，其中，該細胞為肝細胞。
  156. 如請求項 154 或 155 之方法，其中，該細胞是在體內。
  157. 如請求項 154 或 155 之方法，其中，該細胞是在體外。
  158. 如請求項 154 至 157 中任一項之方法，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在該細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。
  159. 一種實質上如本文中所述並參照附圖之醫藥組合、組成物、套組、用途或方法。
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