BR122020024388B1 - Oligonucleotídeo e composição farmacêutica - Google Patents

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Torsten Hoffmann
Kerstin Jahn-Hofmann
Eric A. Kitas
David L. Lewis
Peter Mohr
Hans Martin Mueller
Guenther Ott
Ingo Roehl
David B. Rozema
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Abstract

a presente invenção fornece o uso de compostos inovadores para fornecimento de ácidos nucleicos e conjugados desses compostos com ácidos nucleicos. critérios de projeto inovadores adicionais para sirna quimicamente estabilizado particularmente úteis quando ligados covalentemente aos mencionados compostos e coadministrados com um polímero de fornecimento para atingir knockdown de mrna in vivo são descritos no presente.

Description

[001] A presente invenção refere-se ao uso de conjugados de moléculas pequenas inovadores para o fornecimento de ácidos nucleicos, tais como siRNA. O fornecimento de ácidos nucleicos em uma célula viva é altamente restringido pelo complexo sistema de membranas da célula.
[002] Um meio que vem sendo utilizado para fornecer ácidos nucleicos in vivo é a ligação do ácido nucleico a uma molécula direcionadora pequena ou uma molécula hidrofóbica, tal como lipídio ou esterol. Embora tenha sido observado algum fornecimento e atividade com esses conjugados quando administrados a roedores, a dose necessária tem sido proibitivamente grande e frequentemente resulta em efeitos de toxicidade indesejados in vivo, altos custos e regime de tratamento impraticável quando traduzido para seres humanos. É fornecido no presente o uso de compostos de moléculas pequenas para o fornecimento de ácidos nucleicos, tais como siRNA. Quando os compostos de moléculas pequenas forem conjugados ao ácido nucleico, eles mediam o fornecimento bem sucedido do ácido nucleico para a célula. Descobriu-se surpreendentemente que doses significativamente menores do ácido nucleico são agora suficientes para fornecimento bem sucedido ao utilizar- se os compostos inovadores fornecidos no presente. Desta forma, o uso dos compostos fornece uma ferramenta poderosa para o fornecimento de ácidos nucleicos com toxicidade consideravelmente limitada in vivo.
[003] Em uma realização, a presente invenção refere-se ao uso de compostos de fórmula:
Figure img0001
para o fornecimento de ácidos nucleicos, em que: - Y é um grupo ligante selecionado a partir de -(CH2)3- or - C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-; - R1 é -(C1-C6) alquila, -(CH2)-naftila ou -(CH2)m-fenila, em que fenila é não substituído ou substituído por até quatro vezes com um substituinte selecionado independentemente a partir de: -NO2, -CN, halogênio, -O-(CH2)-fenila, -O-(C1-C6) alquila ou -C(O)-NH2; - R2 é hidrogênio; -(CH2)k-N-C(Ph)3, cujos anéis fenila são não substituídos ou independentemente substituídos com -O-(C1-C4) alquila; - (CH2)k -C(O)-NH2; -(CH2)k -fenila; -(C1-C6) alquila, que é não substituído ou substituído uma vez com -S-CH3; - R3 é -NH-fenila, cujo grupo fenila é adicionalmente substituído com um substituinte independentemente selecionado a partir de: - (CH2)-OH; ou -(CH2)-O-C(O)-O-(4-nitrofenila); - k é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; - m é 1, 2, 3 ou 4; - n é 0 ou 1; e - p é um número inteiro de 1 a 20.
[004] Em outra realização, é fornecido o uso dos compostos de fórmula (I) com a conformação específica exibida na fórmula (Ia):
Figure img0002
para o fornecimento de ácidos nucleicos, em que todos os substituintes R1, R2, R3 e Y, bem como as variáveis k, m, n e p, possuem o significado fornecido acima.
[005] Em ainda outra realização, a presente invenção refere-se ao uso de compostos de fórmula (I) ou (Ia) para fornecimento de ácidos nucleicos, em que Y é -(CH2)3-; e todos os grupos substituintes restantes possuem o significado fornecido acima.
[006] Em ainda outra realização, a presente invenção refere-se ao uso de compostos de fórmula (I) ou (Ia) para fornecimento de ácidos nucleicos, em que Y é -C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-; e todos os grupos substituintes possuem o significado fornecido acima.
[007] Em ainda outra realização, é fornecido o uso dos compostos de fórmulas (I) ou (Ia) para fornecimento de ácidos nucleicos, em que: - Y é -(CH2)3-; - R2 é -(CH2)k-N-C(Ph)3, cujos anéis fenila são não substituídos ou independentemente substituídos com -O-(C1-C4) alquila; e - R3 é -NH-fenila, cujo grupo fenila é adicionalmente substituído com -(CH2)-O-C(O)-O-(4-nitrofenila); - n é 0; e - R1 e k possuem os significados fornecidos acima.
[008] Em ainda outra realização, é fornecido o uso de compostos de fórmulas (I) ou (Ia) para fornecimento de ácidos nucleicos, em que: - Y é -C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-; - R2 é -(CH2)k-N-C(Ph)3, cujos anéis fenila são não substituídos ou independentemente substituídos com -O-(C1-C4) alquila; e - R3 é -NH-fenila, cujo grupo fenila é adicionalmente substituído com -(CH2)-O-C(O)-O-(4-nitrofenila); - n é 0; e - R1, k e p possuem os significados fornecidos acima.
[009] A expressão “(C1-C6) alquila”, da forma utilizada no presente, indica um hidrocarboneto linear ou ramificado saturado que contém de um a seis átomos de carbono. Os grupos C1-C6 alquila preferidos incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, 2-butila e similares.
[010] O termo “halogênio”, da forma utilizada no presente, indica flúor, cloro, bromo ou iodo, preferencialmente flúor e cloro.
[011] Os compostos para uso no fornecimento de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser geralmente obtidos utilizando métodos conhecidos dos técnicos comuns no assunto de química orgânica ou medicinal. De forma similar, compreende-se que a porção de colesterol pode ser substituída por outros compostos naturais ou quimicamente sintetizados da classe dos esteroides (tais como ácido colânico, ácido litocólico etc.) ou outras moléculas pequenas (tais como vitaminas) conhecidamente eficazes no fornecimento de ácido nucleico tal como tocoferol (Molecular Therapy, 2008, 16, 734).
[012] Para o fornecimento bem sucedido dos ácidos nucleicos, os compostos de fórmula (I) ou (Ia) são ligados covalentemente aos ácidos nucleicos. Preferencialmente, a ligação covalente é criada por meio da reação de um grupo funcional apropriado, tal como um grupo amina primário, no ácido nucleico com o grupo carbonila ativado na porção -O-C(O)-O- de R3 conforme definido acima. É fornecido no presente um conjugado que compreende os compostos de fórmula (I) ou (Ia) e um ácido nucleico.
[013] A expressão “ácido nucleico”, da forma utilizada no presente, designa qualquer forma de DNA, incluindo cDNA, ou RNA ou um de seus fragmentos, nucleotídeos, nucleosídeos, oligonucleotídeos (incluindo oligonucleotídeos sem sentido, LNA e siRNA), que causa efeito biológico quando administrado in vivo a animais, incluindo, mas sem limitações, pássaros e mamíferos, incluindo seres humanos. Os ácidos nucleicos preferidos utilizados no presente são siRNAs.
[014] O conjugado que compreende os compostos ligados covalentemente a um ácido nucleico exibe capacidade aprimorada de absorção por células em comparação com o dito ácido nucleico isoladamente. Após o fornecimento do conjugado para a célula e o tráfego para o lisossomo, o ácido nucleico correspondente é liberado por meio de divisão enzimática. Essa divisão preferencialmente tem lugar quando um motivo dipeptídico, que consiste preferencialmente da sequência de α ou β-(fenil)alanina e lisina presente nos compostos de fórmula (I) ou (Ia), é incorporado ao conjugado (vide o Esquema 1). De preferência superior, o conjugado contém o motivo dipeptídico e um espaçador tal como o espaçador carbamato de p- aminobenzila (Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855) que se fragmenta espontaneamente após a divisão da ligação de amida C-terminal do motivo dipeptídico conforme exemplificado para siRNAs no Esquema 2. Desta forma, os conjugados que compreendem compostos de fórmula (I) ou (Ia) também são denominados conjugados de colesterol que contêm dipeptídeo. A divisão enzimática do ácido nucleico dos conjugados de colesterol que contêm dipeptídeo de acordo com a presente invenção é catalisada por proteases inatas da célula. Um exemplo de uma protease inata capaz de dividir o motivo dipeptídico presente nos compostos de fórmula (I) ou (Ia) é Catepsina B. Catepsina B é uma protease de cisteína onipresente conhecida localizada nos lisossomos de células de mamíferos (Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855; J. Med. Chem. 2005, 48, 1344; Nat. Biotechnology 2003, 21, 778). Desta forma, o motivo dipeptídico descrito acima também é denominado motivo dipeptídico divisível por catepsina.
[015] A presente invenção também fornece, portanto, um método de fornecimento de ácido nucleico em células em que o dito ácido nucleico pode ser dividido em seguida do conjugado para desdobrar uma atividade terapêutica.
[016] Em uma realização adicional da presente invenção, é fornecido o uso de um conjugado dos compostos de fórmula (I) ou (Ia) ligado covalentemente a um siRNA para fornecimento intracelular.
[017] Conjugados de fórmula (I) ou (Ia) ligados covalentemente a um ácido nucleico são designados no presente fórmula (II) ou (IIa), respectivamente.
Figure img0003
divisão enzimática com substância biologicamente ativa ; ligada em R3
[018] Em realização adicional, portanto, a presente invenção fornece um composto de Fórmula:
Figure img0004
em que: Ra é -(CH2)k-NH2; e R1 e k possuem os significados fornecidos para a fórmula (I) acima.
[019] Em uma realização mais específica, a presente invenção
Figure img0005
Ra é -(CH2)k-NH2; e R1 e k possuem os significados fornecidos para a fórmula (I) acima.
[020] Em uma realização preferida, o ácido nucleico de fórmula (II) ou (IIa) é siRNA.
[021] Os compostos de fórmula (II) ou (IIa) podem possuir propriedades valiosas em terapia. Em uma realização adicional, portanto, são fornecidos os compostos de fórmula (II) ou (IIa) para uso como medicamentos.
[022] Outra realização da presente invenção é uma composição farmacêutica que compreende os conjugados dos compostos de fórmula (I) ou (Ia) ligados covalentemente a um ácido nucleico.
[023] Em ainda outra realização da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende os compostos de Fórmula (IIa) em conjunto com veículos farmaceuticamente aceitáveis.
[024] As realizações abaixo são exemplificadas para conjugados dos compostos de Fórmula (I) ou (Ia) covalentemente ligados a siRNA. Compreende-se que essas realizações também são aplicáveis para outros tipos de ácidos nucleicos conforme definido acima.
[025] A ligação covalente do siRNA aos compostos de fórmula (I) ou (Ia) é atingida por meio de reação de um grupo nucleofílico apropriado, ou seja, um grupo amina primário, no siRNA com o grupo -C(O)- ativado em R3 dos mencionados compostos de Fórmula (I) ou (Ia). A ativação daquele grupo - C(O)- é obtida por um p-nitrofenóxi carbonato conforme exibido no Esquema 2 abaixo.
Figure img0006
[026] O carbonato ativado de p-nitrofenila pode, por exemplo, reagir com o siRNA equipado com um nucleófilo apropriado tal como a amina primária de um ligante de hexilamino para gerar uma ligação de carbamato para produzir o conjugado de siRNA covalente. Após a absorção intracelular do siRNA e sua transferência para o lisossomo, os compostos de Fórmula (II) ou (IIa) em que a substância ativa biológica é siRNA são divididos pela atividade de protease que libera o siRNA por meio de reação de eliminação 1,6 conforme também exibido no Esquema 3. A porção de colesterol do conjugado dos compostos de Fórmula (II) ou (IIa) modifica as propriedades de PK de siRNA de tal forma que a administração sistêmica permita o silenciamento genético in vivo.
[027] Em uma realização, os compostos de Fórmula (II) ou (IIa) em que o ácido nucleico é siRNA são coadministrados com um polímero de fornecimento. Os polímeros de fornecimento fornecem um meio de rompimento de membranas celulares e mediação da liberação endossômica. Em outra realização, o dito polímero de fornecimento e o conjugado de siRNA de acordo com a presente invenção não são ligados covalentemente, são sintetizados separadamente e podem ser fornecidos em recipientes separados ou em um único recipiente. Os polímeros de fornecimento para oligonucleotídeos tais como siRNA são bem conhecidos na técnica.
[028] Rozema et al, na Patente Norte-Americana Publicada n° 20040162260, por exemplo, demonstraram um meio de regular de forma reversível a atividade de rompimento de membrana de uma poliamina ativa na membrana. Regulagem reversível forneceu um meio de limitação da atividade aos endossomas de células alvo, de forma a limitar a toxicidade. O seu método dependeu da reação de aminas sobre a poliamina com anidrido 2-propiônico-3-metilmaleico. Esta modificação converteu o policátion em um poliânion por meio de conversão de aminas primárias em grupos que contêm carboxila e inibiu de forma reversível a atividade de membrana da poliamina.
Figure img0007
[029] Para permitir o cofornecimento do ácido nucleico com o veículo de fornecimento, o ácido nucleico foi ligado covalentemente ao polímero de fornecimento. No Pedido de Patente Provisório Norte-Americano 61/307490, é descrita uma nova geração de polímeros de fornecimento. Nela, são fornecidos poliamina ativa na membrana que compreende um terpolímero anfifático formado por meio da polimerização aleatória de monômeros que contêm amina, monômeros hidrofóbicos inferiores e monômeros hidrofóbicos superiores. Essa nova geração de polímeros de fornecimento eliminou a necessidade de que polinucleotídeo e polímero sejam associados por meio de ligação covalente ou de interação entre cargas.
[030] Exemplos não limitadores de polímeros de fornecimento utilizados para coadministração com os conjugados de siRNA de acordo com a presente invenção são poliaminas ativas na membrana e póli(vinil)éter (PBAVE), policonjugados dinâmicos (DPC; Rozema et al, 2007) e DPCs aprimorados conforme descrito no Pedido de Patente Provisório Norte- Americano n° 61/307490.
[031] Em uma realização adicional, é fornecido um novo padrão de modificação química de siRNA para fornecimento in vivo funcional. Esse novo padrão de modificação química de siRNA é especialmente útil com veículos de fornecimento que exibem retenção endossomal/lisossomal relativamente forte.
[032] Descobriu-se que a estabilização de siRNA contra a degradação por nucleases localizadas endossomais/lisossomais tais como DNAse II aprimora muito o knockdown desejado. Essa estabilização pode afetar diretamente a quantidade de siRNA liberada para o citoplasma no qual está localizada a maquinaria de RNAi celular. Apenas a parte de siRNA disponível no citoplasma é capaz de acionar o efeito de RNAi.
[033] Além de baixas características farmacocinéticas, siRNAs são susceptíveis em nucleases no ambiente biológico quando administrados como tal na circulação sem um veículo de fornecimento protetor. Consequentemente, muitos siRNAs são rapidamente degradados, seja de forma extracelular no tecido e no fluxo sanguíneo ou após a absorção intracelular (tal como no endossomo).
[034] Uma nuclease bem conhecida localizada no compartimento endossomal/lisossomal é DNase II. Essa enzima é ativa sob pH abaixo de 6-6,5 com atividade máxima na faixa de pH de 4,5-5, refletindo condições presentes no ambiente acidificado do compartimento endossomal/lisossomal. Os processos de degradação de RNA a seguir induzidos por DNase II foram identificados in vitro e são descritos na presente invenção: a. Fitas de RNA que contêm pelo menos um nucleotídeo 2’- OH são degradadas rapidamente por meio de um intermediário de fósforo pentavalente cíclico, gerando fosfatos 2’-3’ cíclicos no produto de divisão 5’. A formação do intermediário pentavalente pode ser inibida por nucleotídeos que não contêm um grupo 2’-OH tal como nucleotídeos 2’-deóxi, 2’-O-metila (2’- OMe) ou 2’-deóxi-2’-fluoro(2’F); b. Além disso, RNA é degradado em um processo 5’- exonucleolítico independente da modificação 2’ dos nucleotídeos 5’-terminais. Este processo de degradação pode ser inibido por porções não de nucleotídeos 5’-terminais, tais como colesterol, ligante aminoalquila ou um fosforotioato na primeira ligação entre nucleotídeos; c. Um fosfato 5’ também protege e reduz a velocidade da cinética de divisão exonucleolítica, mas não pode bloquear completamente este processo. Isso se deve, mais provavelmente, à divisão do 5’-fosfato por fosfatases ou a uma atividade de fosfatase inerente da preparação de enzima DNase II utilizada no teste de estabilidade in vitro; e d. A melhor proteção foi atingida com oligonucleotídeos que não contêm nenhum nucleotídeo 2’-OH dentro da fita, começando com um nucleotídeo 2’-OMe na extremidade 5’ conectada por uma ligação de fosforotioato (PTO) ao segundo nucleotídeo. Outros nucleotídeos terminais que não contêm um grupo 2’-OH também protegem contra a degradação 5’-exo, mas, até menor ponto, em comparação com a modificação de 2’-OMe.
[035] Desta forma, os inventores da presente invenção descobriram que siRNAs podem ser estabilizados significativamente ao utilizar o projeto a seguir, em que um oligonucleotídeo é fornecido com uma fita antisense com o padrão de modificação: 5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’ e uma fita sense com o padrão de modificação 5’-(Z3)ns-3’, em que: - w é independentemente um 5’-fosfato, 5’-fosfotioato ou H; - Z1 é independentemente um nucleosídeo 2’-modificado; - Z2 é independentemente um 2’-deóxi nucleosídeo ou nucleosídeo 2’-fluoro modificado; e - Z3 é independentemente um nucleosídeo 2’-modificado; na é 8-23 e ns é 8-25.
[036] Em uma realização preferida, é fornecido um oligonucleotídeo com fita antisense com o padrão de modificação: 5’-(w)-(Z1)- (Z2)-(Z3) na -3’ e uma fita sense com o padrão de modificação 5’-(Z3)ns-3’, em que Z1 é um nucleosídeo 2’-fluoro modificado ou um nucleosídeo 2-deóxi e todos os substituintes restantes, bem como as variáveis na e ns, possuem o significado fornecido acima.
[037] Em uma realização preferida, é fornecido um oligonucleotídeo com fita antisense com o padrão de modificação: 5’-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3) na -3’ e uma fita sense com o padrão de modificação 5’- (Z3) ns -3’, em que Z3 é um nucleosídeo 2’-O-metil modificado ou um nucleosídeo 2’-fluoro modificado ou um nucleosídeo 2-deóxi e todos os substituintes restantes, bem como as variáveis na e ns, possuem o significado fornecido acima.
[038] Em uma realização preferida, é fornecido um oligonucleotídeo com fita antisense com o padrão de modificação: 5’-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3) na -3’ e uma fita sense com o padrão de modificação 5’-(Z3) ns -3’, em que Z1 é um nucleosídeo 2’-fluoro modificado ou um nucleosídeo 2’-deóxi e Z3 é um nucleosídeo 2’-O-metil modificado, um nucleosídeo 2’-fluoro modificado ou um nucleosídeo 2-deóxi e todos os substituintes restantes, bem como as variáveis na e ns, possuem o significado fornecido acima.
[039] Os nucleosídeos na sequência de ácidos nucleicos do oligonucleotídeo com o padrão de modificação inovador podem ser ligados por 5’-3’ fosfodiésteres ou 5’-3’ fosforotioatos.
[040] Da forma utilizada no presente, a fita “antisense” é a fita de siRNA que é complementar ao mRNA alvo e será ligado ao mRNA assim que o siRNA estiver desenrolado.
[041] A fita sense do dito siRNA que compreende o padrão de modificação inovador é complementar à fita sense.
[042] O dito siRNA que compreende o padrão de modificação inovador que se comprovou ser particularmente vantajoso quando ligado covalentemente a um polímero de fornecimento conforme exemplificado por Rozema et al (Dynamic PolyConjugates (DPC; Rozema et al, 2007)). A potência e a duração do efeito podem ser significativamente aprimorados empregando a estratégia de modificação de siRNA delineada na presente invenção.
[043] Em outra realização, o dito siRNA que compreende o padrão de modificação inovador é especialmente útil quando conjugado a moléculas pequenas que alteram as propriedades farmacocinéticas de siRNA tais como colesterol ou os compostos de Fórmula (I) e (Ia) fornecidos no presente. Em uma realização, é fornecido um conjugado de molécula pequena e um oligonucleotídeo em que o oligonucleotídeo possui o padrão de modificação a seguir: a fita antisense com o padrão de modificação: : 5’-(w)- (Z1)-(Z2)-(Z3) na -3’ e uma fita sense com o padrão de modificação 5’-(Z3) ns - 3’, em que os substituintes, bem como as variáveis na e ns, possuem o significado fornecido acima. Em uma realização, a mencionada molécula pequena é colesterol. Em outra realização, a mencionada molécula pequena é um composto de Fórmula (I) ou (Ia), que resulta em compostos de Fórmula (II) ou (IIa).
[044] Preferencialmente, os mencionados conjugados de siRNA são coadministrados com um polímero de fornecimento. Polímeros de fornecimento apropriados são descritos acima.
[045] Em uma realização, o dito siRNA que compreende o padrão de modificação inovador é especialmente útil quando conjugado a um ligante que conhecidamente se liga a um receptor específico que internaliza o conjugado em uma célula. Particularmente, o receptor de asialoglicoproteína (ASGPR) expresso sobre hepatócitos é um receptor bem conhecido que permite a liberação (endocitose e degradação lisossômica) de proteínas desialiladas de circulação. Demonstrou-se que N-acetil-D-galactosamina possui alta afinidade de ligação para o receptor, especialmente quando apresentado multivalente e quando os resíduos de galactose forem adequadamente espaçados (J. Biol. Chem., 2001, 276, 37577). A fim de utilizar esse receptor de alta capacidade para endocitose mediada por receptor do ácido nucleico, o ligante sintético exibido abaixo foi preparado para ligação covalente aos siRNAs que compreendem o padrão de modificação inovador. Como este tipo de endocitose gera degradação lisossomal do material internalizado, o siRNA deve ser preparado de tal forma que seja estável no lisossomo, o que agora é solucionado pelo padrão de modificação inovador indicado acima.
[046] De forma similar, compreende-se que o ligante direcionador exibido na Fórmula III conjugado a um ácido nucleico tal como siRNA conforme exibido na Fórmula IV pode ser substituído por outros compostos naturais ou quimicamente sintetizados (antagonistas ou agonistas) que exibem alta afinidade de ligação a receptores expressos da superfície celular. Exemplos incluem folato como ligante para o receptor de folato expresso sobre uma série de células cancerosas (Ann. N. Y. Acad. Sci., 2009, 1175, 32) ou moléculas de ligação de PSMA (Nature Biotech., 2006, 24, 1005; Mol. Pharm., 2009, 6, 780).
[047] O ligante para o ASGPR é ligado por meio de uma ligação de amida ao ácido nucleico. A formação de ligações de amida pode ser estabelecida com o auxílio de química de N-hidroxissuccinimida (NHS). O ligante empregado na reação de conjugação é exibido abaixo (Fórmula III). Para intearção com ASGPR, os grupos de O-acetato sobre os resíduos de açúcar necessitam ser removidos conforme exibido na Fórmula IV para siRNA.
Figure img0008
[048] Em uma realização da presente invenção, é fornecido um conjugado de um composto de Fórmula IV e um oligonucleotídeo, em que o oligonucleotídeo possui o padrão de modificação a seguir: a fita antisense com o padrão de modificação 5’-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3) na -3’ e uma fita sense com o padrão de modificação 5’- (Z3) ns -, em que os substituintes, bem como as variáveis na e ns, possuem o significado fornecido acima. O dito conjugado também é denominado conjugado de palmitoíla GalNAc. Preferencialmente, os mencionados conjugados de palmitoíla GalNAc são coadministrados com um polímero de fornecimento. Polímeros de fornecimento apropriados são descritos acima.
[049] Descobriu-se que, para esses padrões de modificação, ligações divisíveis de padrões de modificação provaram ser vantajosas em comparação com ligantes de moléculas pequenas ligados de forma estável. Possíveis ligantes divisíveis são um motivo dipeptídico conforme exemplificado no Esquema 1 ou um ligante de RNA divisível que compreende nucleotídeos que contêm 2’-OH. O ligante de RNA divisível é especialmente útil com relação aos siRNAs que possuem o padrão de modificação inovador (siRNA totalmente 2’-modificado) descrito acima.
[050] Em princípio, pode ser introduzido um local de divisão de nuclease por meio de sobreposições 3’ ou 5’ que contêm pelo menos um nucleotídeo 2’-OH na fita sense ou antisense. A substância de siRNA ativa final é gerada por meio de processamento de nuclease intracelular. Além disso, é possível o uso de locais de divisão definidos implementados por nucleotídeos 2’-OH dentro da região emparelhada base. Isso pode ser feito utilizando pelo menos um nucleotídeo 2’-OH complementar à fita oposta ou por meio de introdução de pelo menos um nucleotídeo 2’-OH não emparelhado ou um grampo de cabelo/bojo que contém pelo menos um nucleotídeo 2’-OH.
[051] Ao contrário de outras químicas de ligação divisíveis, o uso de locais de divisão definidos por meio da introdução de nucleotídeos 2’-OH gera uma abordagem de conjugação mais versátil. Introduzindo-se locais de divisão seletivos sobre uma ou as duas fitas do siRNA na extremidade 3’ e/ou 5’ ou dentro da estrutura duplex, é possível conjugação múltipla.
[052] Consequentemente, em uma realização, é fornecido um conjugado de uma molécula pequena e um oligonucleotídeo, em que: e. a molécula pequena compreende um ligante de nucleotídeo que compreende 1-10, preferencialmente 1-5, de preferência superior 1-3 nucleotídeos 2’OH; f. o oligonucleotídeo possui o padrão de modificação a seguir: a fita antisense com o padrão de modificação 5’-(w)- (Z1)- (Z2)- (Z3) na -3’ e uma fita sense com o padrão de modificação 5’-(Z3) ns -, em que os substituintes, bem como as variáveis na e ns, possuem o significado fornecido acima; e g. o oligonucleotídeo é ligado covalentemente por meio do ligante de nucleotídeo à molécula pequena.
[053] O ligante de nucleotídeo é dividido, por exemplo, no endossomo por nucleases intracelulares tais como DNAse II após a internalização do conjugado, de forma a liberar o siRNA.
[054] Preferencialmente, o dito conjugado é coadministrado com um polímero de fornecimento. Polímeros de fornecimento apropriados são descritos acima.
[055] Em outra realização da presente invenção, é fornecido o composto de fórmula (V). Este composto compreende uma porção de colesterol e um ligante de nucleotídeo que compreende 1-10, preferencialmente 1-5 e, de preferência superior, 1-3 nucleotídeos 2’OH.Este ligante de nucleotídeo é útil para ligar covalentemente um oligonucleotídeo tal como siRNA ao composto de Fórmula (V). Preferencialmente, o dito oligonucleotídeo possui o padrão de modificação inovador indicado acima. Desta forma, em outra realização, é fornecido um conjugado de um composto de Fórmula (V) e um oligonucleotídeo, em que o oligonucleotídeo é ligado covalentemente ao ligante de nucleotídeo do composto de Fórmula (V).
[056] O ligante de nucleotídeo é dividido por nucleases intracelulares tais como DNAse II após a internalização do conjugado de um composto de Fórmula (V) e um oligonucleotídeo no endossomo, de forma a liberar o siRNA.
Figure img0009
[057] Preferencialmente, o dito conjugado de um composto de Fórmula (V) e um oligonucleotídeo é coadministrado com um polímero de fornecimento. Polímeros de fornecimento apropriados são descritos acima.
[058] Em outra realização, o dito polímero de fornecimento e o conjugado de um composto de Fórmula (V) e um oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção não são ligados covalentemente, são sintetizados separadamente e podem ser fornecidos em recipientes separados ou em um único recipiente.
DEFINIÇÕES
[060] A expressão “molécula pequena”, da forma utilizada no presente, designa moléculas orgânicas ou inorgânicas, sintetizadas ou encontradas na natureza, que possuem geralmente peso molecular de menos de 10.000 gramas por mol, opcionalmente menos de 5000 gramas por mol e, opcionalmente, menos de 2000 gramas por mol.
[061] O termo “peptídeo”, da forma utilizada no presente, designa qualquer composto polimérico produzido produzido por meio de formação de ligações de amida entre um grupo alfacarboxila de um aminoácido D ou L e um grupo alfa-amino de outro aminoácido D ou L. O termo “proteína”, da forma utilizada no presente, designa polipeptídeos com sequência específica de mais de cerca de cinquenta resíduos.
[062] A expressão “motivo dipeptídico”, da forma utilizada no presente, designa qualquer motivo que compreende uma ligação de amida formada pelo grupo D ou L-alfa ou beta amino de um primeiro aminoácido com o grupo alfacarboxila de um segundo aminoácido D ou L.
[063] Da forma utilizada no presente, o termo “aminoácido” designa qualquer molécula que contenha grupos funcionais amina e carboxila. Desta forma, o termo “aminoácido” designa aminoácidos naturais, não naturais e sintéticos. Quaisquer aminoácidos naturais utilizados na presente invenção são indicados no presente por meio das suas abreviações comuns.
[064] O termo “ligante”, da forma utilizada no presente, designa uma porção que é capaz de ligação covalente ou química de outra forma de um ácido nucleico. O termo “ligante”, no contexto da presente invenção, é preferencialmente um composto de Fórmula (I) ou (Ia) ligado covalentemente a um ácido nucleico.
[065] A expressão “ácido nucleico”, da forma utilizada no presente, indica um oligômero ou polímero composto de nucleotídeos, tais como desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou compostos produzidos sinteticamente (tais como PNA, conforme descrito na Patente Norte-Americana n° 5.948.902 e referências ali citadas) que podem hibridizar-se com ácidos nucleicos de ocorrência natural de forma específica para sequências análoga à de dois ácidos nucleicos de ocorrência natural, por exemplo, que podem participar de interações de emparelhamento com base Watson-Crick. Ácidos nucleicos não de ocorrência natural são oligômeros ou polímeros que contêm sequências de nucleobases que não ocorrem na natureza ou substâncias que contêm equivalentes funcionais de nucleobases de ocorrência natural, açúcares ou ligações entre açúcares, tais como ácidos nucleicos de peptídeos (PNA), ácidos nucleicos de treose (TNA), ácidos nucleicos travados (LNA) ou ácidos nucleicos de glicerol (GNA). Essa expressão inclui oligômeros que contêm os nucleobases de ácidos nucleicos de ocorrência natural adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) e uracila (U), bem como oligômeros que contêm análogos de bases ou nucleobases modificadas. Ácidos nucleicos podem ser derivados de uma série de fontes naturais tais como RNAs e DNAs eucarióticos, bacterianos e virais. Outros ácidos nucleicos podem ser derivados de fontes sintéticas e incluem qualquer um dentre os diversos oligonucleotídeos que estão sendo fabricados para uso como reagentes de pesquisa, agentes de diagnóstico ou agentes terapêuticos potenciais e definidos. A expressão inclui oligômeros que compreendem um ácido nucleico de fita simples ou um ácido nucleico de fita dupla.
[066] A expressão “2’-modificado”, da forma utilizada no presente, designa um β-D-ribonucleosideo ou β-D-ribonucleotideo composto de nucleobases de ocorrência natural que possui o grupo 2’-OH substituído com H, F, O-CH3 ou outros substituintes conhecidos na técnica.
[067] A expressão “nucleotídeo 2’-OH”, da forma utilizada no presente, designa um β-D-ribonucleotideo composto de nucleobases de ocorrência natural que possuem um grupo 2’-OH.
[068] O termo “5’-fosfato”, da forma utilizada no presente, designa a fórmula -O-P(=O)(OH)OH. Em outro aspecto, o fosfato é modificado de tal forma que um dos grupos O ou OH seja substituído com S e denominado no presente “5’-fosfotioato”.
[069] O termo “fosforotioato”, da forma utilizada no presente, designa uma ligação entre nucleotídeos na qual um dos oxigênios que não formam ponte é substituído por enxofre.
[070] A expressão “polímero de fornecimento”, da forma utilizada no presente, designa polímeros apropriados para o fornecimento funcional de um ácido nucleico. No contexto da presente invenção, o polímero de fornecimento é covalentemente ligado ou coadministrado com a substância biologicamente conjugada aos compostos descritos no presente e media a fuga endossomal após a internalização na célula e absorção no endossomo. O termo “polímero”, no presente contexto, indica qualquer composto que é composto de duas ou mais unidades monoméricas ligadas covalentemente entre si, em que as unidades monoméicas podem ser idênticas ou diferentes, de tal forma que o polímero possa ser um homopolímero ou heteropolímero. Os polímeros representativos incluem peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos e similares, em que os polímeros podem ser de ocorrência natural ou sintética. Exemplos não limitadores de polímeros de forrnecimento são analisados, por exemplo, em International Journal of Pharmaceutical Research and Development, outubro de 2010, Volume 2, Edição 8, artigo n° 2. Exemplos não limitadores de polímeros de fornecimento úteis para o fornecimento de ácidos nucleicos são descritos nos Pedidos EP 10165502.5 e 10191030.5, Patente PCT WO 2008/0022309 e Pedido Provisório Norte-Americano 61/307490 e referências mencionadas no presente, que são todos incluídos como referência.
[071] Da forma utilizada no presente, “composição farmacêutica” inclui os conjugados de acordo com a presente invenção, um veículo farmacêutico ou diluente e qualquer outro meio ou agente necessário para a formulação.
[072] Da forma utilizada no presente, “veículo farmacêutico” inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento da absorção, isotônicos e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. Preferencialmente, o veículo é apropriado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (tal como por meio de injeção ou infusão).
[073] Um conjugado de acordo com a presente invenção pode ser administrado por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica. Como apreciarão os técnicos no assunto, a via e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados. Para administrar um conjugado de acordo com a presente invenção por meio de certas vias de administração, pode ser necessário revestir ou coadministrar o conjugado com um material para evitar a sua desativação. O conjugado pode ser administrado a um paciente, por exemplo, em um veículo ou diluente apropriado. Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções de tampão salinas e aquosas. Veículos farmacêuticos incluem dispersões ou soluções aquosas estéreis e pós estéreis para preparação extemporânea de dispersões ou soluções injetáveis estéreis. O uso desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.
[074] As expressões “administração parenteral” e “administrado por via parenteral”, da forma utilizada no presente, indicam modos diferentes de administração enteral e tópica, normalmente por meio de injeção, e incluem, sem limitações, infusão e injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesterna.
[075] Esses veículos podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de micro-organismos pode ser garantida por meio de procedimentos de esterilização acima e da inclusão de diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, tais como paraben, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e similares nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser causada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
[076] Independentemente da via de administração selecionada, os conjugados de acordo com a presente invenção, que podem ser utilizados em forma hidratada apropriada, e/ou as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por meio de métodos convencionais conhecidos dos técnicos no assunto.
[077] Os níveis reais de dosagem dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem variar, de forma a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para atingir a reação terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração específico, sem toxicidade para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma série de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições específicas de acordo com a presente invenção empregadas, via de administração, tempo de administração, velocidade de excreção do composto específico sendo empregado, duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições específicas empregadas, idade, sexo, peso, condições, saúde geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado, bem como fatores similares bem conhecidos na técnica médica.
[078] A composição farmacêutica deve ser estéril e fluida até o ponto em que a composição possa ser fornecida por meio de seringa. Além de água, o veículo é preferencialmente uma solução salina tamponada isotônica.
[079] Pode-se manter a fluidez adequada utilizando, por exemplo, um revestimento tal como lecitina, por meio da manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e utilizando tensoativos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, poliálcoois tais como manitol ou sorbitol e cloreto de sódio na composição.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[080] A Figura 1 exibe a coadministração de conjugados de siRNA que compreendem os compostos de Fórmula (I) ou (Ia) e um polímero de fornecimento in vivo.
[081] A Figura 2 exibe a coadministração de conjugados de siRNA que compreendem os compostos de Fórmula (I) ou (Ia) e um polímero de fornecimento in vivo.
[082] A Figura 3 exibe a coadministração de conjugados de siRNA que compreendem os compostos de Fórmula (I) ou (Ia) e um polímero de fornecimento in vivo.
[083] A Figura 4 exibe a coadministração de conjugados de siRNA que compreendem os compostos de Fórmula (I) ou (Ia) e um polímero de fornecimento in vivo.
[084] A Figura 5a exibe silenciamento genético mediado por fita antisense com siRNAs totalmente 2’-modificados. Células COS7 foram cotransfectadas com siRNAs dirigidos por EGFP a 3 nM e psiCHECK2-AT. A atividade de knockdown dos siRNAs foi determinada por meio da medição da atividade de renilla em comparação com luciferase de vaga-lume da construção relatora. siRNAs foram classificados pela atividade de knockdown de siRNAs de referência não modificados (2-19-2).
[085] A Figura 5b exibe silenciamento genético mediado por fita sense com siRNAs totalmente 2’-modificados. Células COS7 foram cotransfectadas com siRNAs dirigidos por EGFP a 3 nM e psiCHECK2-ST. A atividade de knockdown dos siRNAs foi determinada por meio de medição da expressão de luciferase da construção relatora. siRNAs foram classificados pela atividade de knockdown de siRNAs de referência não modificados (2-192).
[086] A Figura 6a exibe a redução da atividade de FVII de soro em primatas não humanos mediante injeção intravenosa de diversos siRNAs 2’-modificados ligados covalentemente a um polímero de fornecimento.
[087] A Figura 6b exibe o desenvolvimento do tempo de protrombina em primatas não humanos mediante tratamento com siRNAs 2’- modificados conjugados covalentemente a um polímero de fornecimento. EXEMPLOS
[088] Os exemplos a seguir destinam-se a ser apenas exemplos de referência, a fim de ilustrar a síntese dos compostos para uso no fornecimento de ácidos nucleicos. Eles não se destinam a fazer parte da presente invenção. EXEMPLO 1
[089] Etapa 1: 3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5- dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca- hiydro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi]-propilamina.
Figure img0010
[090] A amina título foi preparada a partir do seu precursor de nitrila de acordo com protocolo da literatura (Lollo et al, WO 2001/070415).
[091] Etapa 2: ácido N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17- ((R)-1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi]-propil}-succinâmico.
Figure img0011
[092] Em um frasco de dois litros com fundo abaulado, 3- ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propan-1-amina (21,15 g, 47,7 mmol, Eq: 1,00) e base de Huenig (12,3 g, 16,6 ml, 95,3 mmol, Eq: 2,00) foram combinados com AcOEt (845 ml) para gerar uma solução incolor. Di- hidrofuran-2,5-diona (4,77 g, 47,7 mmol, Eq: 1,00) em THF (42 ml) foi adicionada e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por uma noite => suspensão branca. Todos os voláteis foram removidos por via intravenosa, o resíduo foi dissolvido em CH2Cl2, a camada orgânica foi lavada com NH4Cl e salmoura, seca sobre Na2SO4 e evaporada até secar. O produto bruto foi dissolvido em CH3CN/H2O e liofilizado para gerar 29,8 g do composto título na forma de pó fofo.
[093] MS (ISP): (M-H) 542,5.
[094] Etapa 3: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-((S)-1- (4-(hidroximetil)fenilamino)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)-1-oxo- hexan-2-ilamino)-3-(4-nitrofenil)-1-oxopropan-2-il)succinamida.
Figure img0012
[095] Em um frasco de 10 ml com fundo abaulado, o ácido 4- (3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propilamino)-4-oxobutanoico (106 mg, 184 μmol, Eq: 1,00), (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-nitrofenil)propanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamida (132 mg, 184 μmol, Eq: 1,00), HOAt (25,0 mg, 184 μmol, Eq: 1,00) e cloridrato de EDC (35,3 mg, 184 μmol, Eq: 1,00) foram misturados entre si em CH2Cl2 (1,8 ml) para gerar uma solução amarela. Adicionou-se base de Huenig (47,5 mg, 64,2 μl, 368 μmol, Eq: 2,0) e a reação foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. TLC indicou o consumo de material de partida. Todos os voláteis foram removidos por via intravenosa e o produto bruto foi purificado por meio de cromatografia de flash de SiO2/7% MeOH/0,1% NEt3 em CH2Cl2 para produzir 128 mg do composto título na forma de sólido amarelo claro.
[096] MS: massa esperada: 1240,7552, massa encontrada: 1240,7518.
[097] Etapa 4:
Figure img0013
[098] Em um frasco de 10 ml com fundo abaulado, a N1-(3- ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren- 3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(hidroximetil)fenilamino)-6-((4- metoxifenil)difenilmetilamino)-1-oxo-hexan-2-ilamino)-3-(4-nitrofenil)-1- oxopropan-2-il)succinamida (126 mg, 101 μmol, Eq: 1,00) e base de Huenig (39,3 g, 53,2 μl, 304 μmol, Eq: 3,00) foram combinados com CH2Cl2 (1,4 ml) e DMF (1,0 ml) para gerar uma suspensão amarela; adicionou-se carbonato de bis(4-nitrofenila) (46,3 mg, 152 μmol, Eq: 1,50) e permitiu-se o processamento da reação por uma noite. A mistura foi despejada sobre gelo picado, extraída por duas vezes com AcOEt, lavada com H2O, seca sobre Na2SO4 e evaporada até secar. Após trituração com cerca de 10 ml de dietil éter, 99 mg do produto título foram obtidos na forma de sólido esbranquiçado.
[099] MS: massa esperada: 1405,7614, massa encontrada: 1405,7518.
[0100] O bloco de construção de dipeptídeos necessário para a etapa 3 foi preparado conforme segue: - Etapa a: ácido (S)-2-[(S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)- 3-(4-nitrofenil)-propionilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}-hexanoico:
Figure img0014
[0101] Em um frasco de 25 ml com fundo abaulado, ácido (S)-2- amino-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)hexanoico (Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, 968 mg, 2,31 mmol, Eq: 1,00) foi dissolvido em CH2Cl2 (20 ml) para gerar uma solução amarela clara. Adicionou-se base de Huenig (897 mg, 1,21 ml, 6,94 mmol, Eq: 3,00) e trimetilclorossilano (528 mg, 621 μl, 4,86 mmol, Eq: 2,10) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada por quinze minutos.
[0102] Em um segundo frasco de 50 ml com fundo abaulado, ácido (S)-2-(((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-3-(4-nitrofenil)propanoico (1 g, 2,31 mmol, Eq: 1,00) foi dissolvido em DMF (20 ml) para gerar uma solução incolor.Adicionou-se base de Huenig (359 mg, 458 μl, 2,78 mmol, Eq: 1,20) e TPTU (125700-71-2) (687 mg, 2,31 mmol, Eq: 1,00) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada por vinte minutos. Adicionou-se a solução do primeiro frasco que contém a silil éster monossililamina correspondente e a reação foi agitada por mais três horas. A mistura foi despejada sobre gelo picado e NH4Cl, extraída por duas vezes com AcOEt, lavada com H2O e salmoura, seca sobre Na2SO4 e evaporada até secar. Cromatografia de flash SiO2/10% MeOH/0,1% NEt3 em CH2Cl2 gerou 1,38 g do composto título na forma de espuma amarronzada.
[0103] MS (ISP): (M+H) 833,5, (M+Na) 855,4.
[0104] Etapa b: 9H-fluoren-9-ilmetil éster de ácido [(S)-1-((S)-1- (4-hidroximetilfenilcarbamoil)-5-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}- pentilcarbamoil)-2-(4-nitrofenil)-etil]-carbâmico.
Figure img0015
[0105] Em um frasco de 250 ml em forma de pera, o ácido (S)-2-((S)-2-(((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-3-(4- nitrofenil)propanamido)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)hexanoico sintetizado acima (1,38 g, 1,66 mmol, Eq: 1,00), (4-aminofenil)metanol (204 mg, 1,66 mg, Eq: 1,00), HOAt (226 mg, 1,66 mmol, Eq: 1,00) e cloridrato de EDC (318 mg, 1,66 mmol, Eq: 1,00) foram dissolvidos em CH2Cl2 (16,6 ml) para gerar uma solução amarela. Adicionou-se base de Huenig (428 mg, 579 μl, 3,31 mmol, Eq: 2,00) e permitiu-se o processamento da reação por uma noite. A mistura foi despejada sobre gelo picado/NH4Cl (pH ~7), extraída por duas vezes com AcOEt, lavada com H2O, seca sobre Na2SO4 e evaporada até secar. O produto bruto foi triturado com dietil éter (1 x 50 ml); o sólido resultante foi retirado por meio de filtragem e seco para gerar 1,214 g do composto título na forma de sólido marrom claro.
[0106] MS (ISP): (M+H) 938,7.
[0107] Etapa c: (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-[(S)-2- amino-3-(4-nitrofenil)-propionilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}- hexanoico.
Figure img0016
[0108] Em um frasco de 50 ml com fundo abaulado, o 9H- fluoren-9-ilmetil éster de ácido [(S)-1-((S)-1-(4-hidroximetilfenilcarbamoil)-5- {[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}-pentilcarbamoil)-2-(4-nitrofenil)-etil]- carbâmico preparado acima (1,214 g, 1,29 mmol, Eq: 1,001) foi combinado com THF (19 ml) para gerar uma solução marrom. A 0°, adicionou-se dietilamina (1,77 g, 2,49 ml, 24,2 mmol, Eq: 18,70). A reação foi agitada à temperatura ambiente por três horas, quando MS indicou o desaparecimento do material de partida. Todos os voláteis foram evaporados i. V.; cromatografia de flash em andamento SiO2/0,1% NEt3 em CH2Cl2 => 10% MeOH/0,1% NEt3 em CH2Cl2, seguida por segunda cromatografia de flash SiO2/5% MeOH/0,1% NEt3 em CH2Cl2 gerou 502 mg do composto título na forma de espuma marrom clara.
[0109] MS: massa esperada: 715,337, massa encontrada: 715,3362. EXEMPLO 2
[0110] O-benzil-N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3- ilóxi]propil}amino)-4-oxobutanoil]-L-tirosil-N~6~-[(4- metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- lisinamida: quiral
Figure img0017
[0111] Preparado de forma análoga ao Exemplo 1, mas utilizando, na etapa 3, (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-[(S)-2-amino-3- (4-benziloxifenil)-propionilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}- hexanoico no lugar de (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-nitrofenil)propanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamida como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-2-(((9H- fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-3-(4-(benzilóxi)fenil)propanoico conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0112] MS: massa esperada: 1466,8182, massa encontrada: 1466,8136. EXEMPLO 3
[0113] N-[4-({3-[(3Beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-4-ciano-L-fenilalanil-N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-lisinamida:
Figure img0018
[0114] Preparado de forma análoga ao Exemplo 1, mas utilizando, na etapa 3, (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-[(S)-2- amino-3-(4-cianofenil)-propionilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]- amino}-hexanoico no lugar de (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-nitrofenil)- propanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-6-((4- metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamida como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-2-(((9H-fluoren-9- il)metóxi)carbonilamino)-3-(4-cianofenil)propanoico conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0115] MS: massa esperada: 1385,7716, massa encontrada: 1385,7696. EXEMPLO 4
[0116] 3,4-Dicloro-N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3- ilóxi]propil}amino)-4-oxobutanoil]-L-fenilalanil-N~6~-[(4- metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- lisinamida:
Figure img0019
[0117] Preparado de forma análoga ao Exemplo 1, mas utilizando, na etapa 3, (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-[(S)-2- amino-3-(3,4-diclorofenil)-propionilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]- amino}-hexanoico no lugar de (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-nitrofenil)- propanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-6-((4- metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamida como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-2-(((9H-fluoren-9- il)metóxi)carbonilamino)-3-(3,4-diclorofenil)propanoico conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0118] MS: massa esperada: 1428,6984, massa encontrada: 1428,695. EXEMPLO 5
[0119] 4-Cloro-N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3- ilóxi]propil}amino)-4-oxobutanoil]-L-fenilalanil-N~6~-[(4- metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- lisinamida:
Figure img0020
[0120] Preparado de forma análoga ao Exemplo 1, mas utilizando, na etapa 3, (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-clorofenil)propanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamida no lugar de (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-nitrofenil)-propanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-6-((4- metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamida como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-2-(((9H-fluoren-9-il)metóxi)- carbonilamino)-3-(4-clorofenil)propanoico conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0121] MS: massa esperada: 1394,7373, massa encontrada: 1394,7342. EXEMPLO 6
[0122] Carbonato de 4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-[(4-{[3- ({(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-[(2R)-6-metil-heptan-2-il]- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren- 3-il}óxi)propil]amino}-4-oxobutanoil)amino]-3-(naftalen-1-il)propanoil]amino}-6- {[(4-metoxifenil)(difenil)metil]amino}hexanoil]amino}benzil 4-nitrofenila (nome não preferido):
Figure img0021
[0123] Preparado de forma análoga ao Exemplo 1, masutilizando, na etapa 3, (4-hidroximetilfenil)-amida de amino-3-naftalen-1-ilpropionilamino)-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}- hexanoico no lugar de (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-nitrofenil)-propanamido)-N- (4-(hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamida como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-2- (((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-3-(naftalen-1-il)propanoico conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0124] MS: massa esperada: 1410,792, massa encontrada: 1410,7918. EXEMPLO 7
[0125] N-[4-({3-[(3Beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-4-fluoro-L-fenilalanil-N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4- ({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-lisinamida:
Figure img0022
[0126] Preparado de forma análoga ao Exemplo 1, mas utilizando, na etapa 3, (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido 3 (S)-2-[(S)-2- amino-3-(4-fluorofenil)-propionilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]- amino}-hexanoico no lugar de (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-nitrofenil)- propanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)- hexanamida como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-2-(((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-3-(4- fluorofenil)propanoico conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0127] MS: massa esperada: 1378,7669, massa encontrada: 1378,7609. EXEMPLO 8
[0128] N-[4-({3-[(3Beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-2-fluoro-L-fenilalanil-N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4- ({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-lisinamida:
Figure img0023
[0129] Preparado de forma análoga ao Exemplo 1, mas utilizando, na etapa 3, (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-[(S)-2- amino-3-(2-fluorofenil)-propionilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]- amino}-hexanoico no lugar de (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-nitrofenil)- propanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)- hexanamida como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-2-(((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-3-(2- fluorofenil)propanoico conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0130] MS: massa esperada: 1378,7669, massa encontrada: 1378,7689. EXEMPLO 9
[0131] N-[4-({3-[(3Beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-3-fluoro-L-fenilalanil-N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4- ({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-lisinamida:
Figure img0024
[0132] Preparado de forma análoga ao Exemplo 1, mas utilizando, na etapa 3, (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-[(S)-2- amino-3-(3-fluorofenil)-propionilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]- amino}-hexanoico no lugar de (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-nitrofenil)- propanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)- hexanamida como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-2-(((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-3-(3- fluorofenil)propanoico conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0133] MS: massa esperada: 1378,7669, massa encontrada: 1378,7659. EXEMPLO 10
[0134] Etapa 1: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-(4- fluorofenil)-4-((S)-1-(4-(hidroximetil)fenilamino)-6-((4- metoxifenil)difenilmetilamino)-1-oxo-hexan-2-ilamino)-4-oxobutan-2- il)succinamida.
Figure img0025
[0135] Em um frasco de 10 ml com fundo abaulado, o ácido 4-(3- ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren- 3-ilóxi)propilamino)-4-oxobutanoico (109 mg, 188 μmol, Eq: 1,00), (4- hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-[(S)-3-amino-4-(4-fluorofenil)- butirilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}-hexanoico (132 mg, 188 μmol, Eq: 1,00), HOAt (25,6 mg, 188 μmol, Eq: 1,00) e cloridrato de EDC (36,1 mg, 188 μmol, Eq: 1,00) foram misturados entre si em CH2Cl2 (2 ml) para gerar uma solução amarela. Adicionou-se base de Huenig (48,7 mg, 64,1 μl, 377 μmol, Eq: 2,00) e a reação foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. TLC indicou o consumo de material de partida. Todos os voláteis foram removidos i. V. e o produto bruto foi purificado por meio de cromatografia de flash de SiO2/5% MeOH/0,1% NEt3 em CH2Cl2 para gerar 197 mg do composto título na forma de sólido esbranquiçado.
[0136] MS: massa esperada: 1227,7763, massa encontrada: 1227,7714.
[0137] Etapa 2: carbonato de 4-((S)-2-((S)-3-(4-(3- ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren- 3-ilóxi)propilamino)-4-oxobutanamido)-4-(4-fluorofenil)butanamido)-6-((4- metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamido)-benzil 4-nitrofenila.
Figure img0026
[0138] Em um frasco de 10 ml com fundo abaulado a N1-(3- ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren- 3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-(4-fluorofenil)-4-((S)-1-(4-(hidroximetil)fenilamino)-6-((4- metoxifenil)difenilmetilamino)-1-oxo-hexan-2-ilamino)-4-oxobutan-2- il)succinamida (196 mg, 160 μmol, Eq: 1,00) e base de Huenig (61,9 mg, 81,4 μl, 479 μmol, Eq: 3,00) foram combinados com CH2Cl2 (1,6 ml) e DMF (0,8 ml) para gerar uma suspensão amarela; adicionou-se carbonato de bis(4- nitrofenila) (72,8 mg, 239 μmol, Eq: 1,50) e permitiu-se o processamento da reação à temperatura ambiente por uma noite. A mistura foi despejada sobre gelo picado/NH4Cl (pH ~6), extraída por duas vezes com AcOEt, lavada com H2O e salmoura, seca sobre Na2SO4 e evaporada até secar. Após trituração com AcOEt/heptano, foram obtidos 123 mg do composto título na forma de sólido amarelo claro.
[0139] MS: massa esperada: 1392,7825, massa encontrada: 1392,7819.
[0140] O bloco de construção dipeptídico necessário para a etapa 1 foi preparado conforme segue: Etapa a: ácido (S)-2-[(S)-3-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)- 4-(4-fluorofenil)-butirilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}-hexanoico.
Figure img0027
[0141] Em um frasco de 25 ml com fundo abaulado, ácido (S)-2- amino-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)hexanoico (Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, 1040 mg, 2,48 mmol, Eq: 1,00) foi dissolvido em CH2Cl2 (12,5 ml) para gerar uma solução amarela clara. Adicionou-se base de Huenig (961 mg, 1,27 ml, 7,44 mmol, Eq: 3,00) e trimetilclorossilano (566 mg, 621 μl, 5,21 mmol, Eq: 2,10) e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por vinte minutos.
[0142] Em um segundo frasco de 50 ml com fundo abaulado, ácido (S)-3-(((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-4-(4-fluorofenil)butanoico (1040 mg, 2,48 mmol, Eq: 1,00) foi dissolvido em DMF (12,5 ml) para gerar uma solução incolor. Adicionou-se base de Huenig (385 mg, 506 μl, 2,98 mmol, Eq: 1,20) e TPTU (125700-71-2) (737 mg, 2,48 mmol, Eq: 1,00) e a mistura de reação foi agitada por quinze minutos. Adicionou-se a solução do primeiro frasco que contém a silil éster monossililamina correspondente e a reação foi agitada por mais três horas à temperatura ambiente. A mistura foi despejada sobre gelo picado e NH4Cl, extraída por duas vezes com AcOEt, lavada com H2O, seca sobre Na2SO4 e evaporada até secar. Cromatografia de flash SiO2/5% MeOH/0,1% NEt3 em CH2Cl2 gerou 2,10 g do composto título na forma de espuma amarela.
[0143] MS (ISP): (M+H) 820,6.
[0144] Etapa b: 9H-fluoren-9-ilmetil éster de ácido {(S)-2-(4- fluorofenil)-1-[((S)-1-(4-hidroximetilfenilcarbamoil)-5-{[(4-metoxifenil)- difenilmetil]-amino}-pentilcarbamoil)-metil]-etil}-carbâmico.
Figure img0028
[0145] Em um frasco de 250 ml em forma de pera, o 9H-fluoren- 9-ilmetil éster de ácido {(S)-2-(4-fluorofenil)-1-[((S)-1-(4- hidroximetilfenilcarbamoil)-5-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}- pentilcarbamoil)-metil]-etil}-carbâmico (2,10 g, 2,56 mmol, Eq: 1,00), (4- aminofenil)metanol (315 mg, 2,55 mmol, Eq: 1,00), HOAt (349 mg, 2,56 mmol, Eq: 1,00) sintetizado acima e cloridrato de EDC (491 mg, 2,56 mmol, Eq: 1,00) foram dissolvidos em CH2Cl2 (12,5 ml). Adicionou-se base de Huenig (662 mg, 871 μl, 5,21 mmol, Eq: 2,00) e permitiu-se o processamento da reação por uma noite. A mistura foi despejada sobre gelo picado/NH4Cl (pH ~7), extraída por duas vezes com AcOEt, lavada com H2O e salmoura, seca sobre Na2SO4 e evaporada até secar. O produto bruto foi triturado com dietil éter (1 x 50 ml); o sólido resultante foi retirado por meio de filtragem e seco para gerar 0,796 g do composto título na forma de sólido marrom claro.
[0146] MS (ISP): (M+H) 925,6.
[0147] Etapa c: (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-[(S)-3- amino-4-(4-fluorofenil)-butirilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}- hexanoico.
Figure img0029
[0148] Em um frasco de 50 ml com fundo abaulado, o 9H- fluoren-9-ilmetil éster de ácido {(S)-2-(4-fluorofenil)-1-[((S)-1-(4- hidroximetilfenilcarbamoil)-5-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}- pentilcarbamoil)-metil]-etil}-carbâmico (793 mg, 857 μmol, Eq: 1,001) foi combinado com THF (12 ml) para gerar uma solução amarronzada. A 0°, adicionou-se dietilamina (1,13 g, 1,59 ml, 15,4 mmol, Eq: 18). A reação foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. A mistura foi despejada sobre gelo picado/NH4Cl (pH ~7), extraída por duas vezes com AcOEt, lavada com H2O e salmoura, seca sobre Na2SO4 e evaporada até secar. Cromatografia de flash de SiO2/10% MeOH/0,1% NEt3 em CH2Cl2 gerou 500 mg do composto título na forma de sólido esbranquiçado.
[0149] MS: massa esperada: 702,3581, massa encontrada: 702,3578. EXEMPLO 11
[0150] Carbonato de 4-((S)-2-((S)-3-(4-(3- ((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren- 3-ilóxi)propilamino)-4-oxobutanamido)-4-fenilbutanamido)-6-((4- metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamido)benzil 4-nitrofenila:
Figure img0030
[0151] Preparado de forma análoga ao Exemplo 10, mas utilizando, na etapa 1, (S)-2-((S)-3-amino-4-fenilbutanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamida no lugar de (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-[(S)-3-amino-4-(4-fluorofenil)- butirilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}-hexanoico como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-3- (((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-4-fenilbutanoico conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0152] MS: massa esperada: 1374,792, massa encontrada: 1374,7877. EXEMPLO 12
[0153] Carbonato de 4-({N~2~-[(3S)-4-(4-clorofenil)-3-{[4-({3- [(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4-oxobutanoil]amino}butanoil]- N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-L-lisil}amino)benzil 4-nitrofenila:
Figure img0031
[0154] Preparado de forma análoga ao Exemplo 10, mas utilizando, na etapa 1, (S)-2-((S)-3-amino-4-(4-clorofenil)butanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)-difenilmetilamino)hexanamida no lugar de (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-[(S)-3-amino-4-(4-fluorofenil)- butirilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}-hexanoico como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-3- (((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-4-(4-clorofenil)-butanoico conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0155] MS (ISP): (M+H) 1409,9. EXEMPLO 13
[0156] N-[4-({3-[(3Beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-O-metil-L-tirosil-N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-lisinamida:
Figure img0032
[0157] Preparado de forma análoga ao Exemplo 1, mas utilizando, na etapa 3, (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-metoxifenil)propanamido)-N- (4-(hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)-difenilmetilamino)hexanamida no lugar de (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-nitrofenil)-propanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamida como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-2- (((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-3-(4-metoxifenil)propanoico conforme descrito acima nas etapas a até c do Exemplo 1.
[0158] MS (ISP): (M+H) 1391,9. EXEMPLO 14
[0159] N-[4-({3-[(3Beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-D-fenilalanil-N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-D-lisinamida:
Figure img0033
[0160] Preparado de forma análoga ao Exemplo 1, mas utilizando, na etapa 3, (R)-2-((R)-2-amino-3-fenilpropanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)-hexanamida no lugar de (S)-2-((S)-2-amino-3-(4-nitrofenil)-propanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)- 6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamida como parceiro de acoplamento. Este bloco de construção foi sintetizado a partir de ácido (R)- 2-(((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonilamino)-6-amino-hexanoico e ácido (R)- 2-amino-6-((4-metoxifenil)-difenilmetilamino)hexanoico (vide Bioconjugate Chem. 2002, 13, 885-869) conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0161] MS: massa esperada: 1360,7763, massa encontrada: 1360,7774. EXEMPLO 15
[0162] Carbonato de 4-({N~2~-[(3S)-3-{[4-({3-[(3Beta)-colest- 5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4-oxobutanoil]amino}-4-(4-cianofenil)butanoil]- N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-L-lisil}amino)benzil 4-nitrofenila:
Figure img0034
[0163] Preparado de forma análoga ao Exemplo 10, mas utilizando, na etapa 1, (S)-2-((S)-3-amino-4-(4-cianofenil)butanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)hexanamida no lugar de (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-[(S)-3-amino-4-(4-fluorofenil)- butirilamino]-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}-hexanoico como parceiro de acoplamento. O acima foi preparado a partir de ácido (S)-3-(((9H-fluoren-9- il)metóxi)carbonilamino)-4-(4-cianofenil)butanoico conforme descrito acima nas etapas a até c.
[0164] MS: massa esperada: 1399,7872, massa encontrada: 1399,7857. EXEMPLO 16
[0165] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-fenilalanil-N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4-({[(4-
Figure img0035
[0166] Etapa1: (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-((S)-2-amino-3-fenilpropionilamino)-6- {[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}-hexanoico.
Figure img0036
[0167] O bloco de construção (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2-((S)-2-amino-3-fenilpropionilamino)-6-{[(4-metoxifenil)-difenilmetil]-amino}- hexanoico foi preparado de forma análoga ao procedimento descrito em Bioconjugate Chem., Vol. 13, N° 4, 2002, 855-869.
[0168] MS (ISP): (M+H) 671,5.
[0169] Etapa 2: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17- ((R)-6-metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro- 1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-((S)-1-(4- (hidroximetil)fenilamino)-6-((4-metoxifenil)difenilmetilamino)-1-oxo-hexan-2- ilamino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)succinamida:
Figure img0037
[0170] TPTU (125700-71-2) (233 mg, 784 μmol, Eq: 1,00) foi adicionado a uma solução de N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5- dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro- 1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi]-propil}-succinâmico (vide Exemplo 1, etapa 2) (426 mg, 0,784 mmol, Eq: 1,00) e base de Huenig (304 mg, 411 μl, 2,35 mmol, Eq: 3) em DMF (10 ml). Após três minutos, adicionou-se (4-hidroximetilfenil)- amida de ácido (S)-2-((S)-2-amino-3-fenilpropionilamino)-6-{[(4-metoxifenil)- difenilmetil]-amino}-hexanoico (etapa 1) e TLC em t = 1 h demonstrou o término da reação. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo restante foi absorvido em acetato de etila e extraído com solução meio saturada de NaHCO3 (1X), solução de hidrogênio ftalato de potássio a 0,05 M (2X), água (1X) e salmoura (1X). O extrato orgânico foi seco sobre MgSO4 e concentrada sob pressão reduzida. O material bruto foi purificado por meio de cromatografia de flash para obter o produto título (682 mg, 513 μmol) e um sólido marrom claro.
[0171] MS (ISP): (M+H) 1196,8.
[0172] Etapa 3: - Adicionou-se base de Hünig (465 mg, 629 μl, 3,6 mmol, Eq: 6) a uma solução do álcool anterior (718 mg, 600 μmol, Eq: 1,00) e carbonato de bis(4-nitrofenila) (548 mg, 1,8 mmol, Eq: 3) em THF (20 ml). A solução amarela foi agitada por uma noite à temperatura ambiente. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo restante foi triturado com dietil éter. O sólido foi coletado por meio de filtragem, lavado com éter e seco sob pressão reduzida para obter o composto título (800 mg, 529 μmol) na forma de sólido marrom claro.
[0173] MS (ISP): (M+H) 1361,9. EXEMPLO 17
[0174] Etapa 1: ácido (S)-2-[(S)-2-(9H-fluoren-9- ilmetoxicarbonilamino)-3-fenilpropionilamino]-hexanoico.
Figure img0038
[0175] L-Fmoc-Phe-OSu disponível comercialmente (0,969 g, 2,00 mmol, Eq: 1,00) foi suspenso em uma mistura 1:1 v/v de 1,2- dimetoxietano e água (17 ml) e tratado a 0 °C com L-norleucina (0,275 g, 2,10 mmol, Eq: 1,05) e NaHCO3 (0,185 g, 2,20 mmol, Eq: 1,10). O banho de resfriamento foi removido e a reação foi mantida em processamento à temperatura ambinte por quatorze horas. A mistura foi despejada sobre gelo picado/ácido cítrico (pH ~3), extraída por duas vezes com acetato de etila, lavada com H2O e salmoura, seca sobre Na2SO4 e evaporada até secar. Cromatografia de flash de SiO2/AcOEt gerou 0,870 mg do composto título na forma de sólido branco.
[0176] MS (ISP): (M+H) 501,2.
[0177] Etapa 2: 9H-fluoren-9-ilmetil éster de ácido {(S)-1-[(S)-1- (4-hidroximetilfenilcarbamoil)-pentilcarbamoil]-2-feniletil}-carbâmico.
Figure img0039
[0178] Em um frasco em forma de pera, o ácido (S)-2-[(S)-2-(9H- fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-3-fenilpropionilamino]-hexanoico sintetizado acima (10,72 g, 21 mmol, Eq: 1,00), (4-aminofenil)metanol (2,717 g, 22 mmol, Eq: 1,03) e 2-etóxi-1-etoxicarbonil-1,2-di-hidroquinolina (EEDQ) (7,994 g, 32 mmol, Eq: 1,50) foram dissolvidos em CH2Cl2 (320 ml) e agitados por uma noite sob balão de Ar. A mistura foi despejada sobre gelo picado/NH4Cl, extraída por duas vezes com AcOEt, lavada com H2O, seca sobre Na2SO4 e o volume foi reduzido para cerca de 300 ml. O precipitado foi retirado por meio de filtragem e seco para gerar 5,25 g do composto título na forma de sólido marrom claro.
[0179] MS (ISP): (M+H) 606,3.
[0180] Etapa 3: (4-hidroximetilfenil)-amida de ácido (S)-2((S)-2- amino-3-fenilpropionilamino)-hexan oico.
Figure img0040
[0181] Em um frasco com fundo abaulado, o 9H-fluoren-9- ilmetil éster de ácido {(S)-1-[(S)-1-(4- hidroximetilfenilcarbamoil)pentilcarbamoil]-2-feniletil}-carbâmico (4,738 g, 7,822 mmol, Eq: 1,0) foi dissolvido em CH2Cl2 (28 ml). A 0 °C, adicionou-se dietilamina (28 ml, 19,80 g, 271 mmol, Eq: 35) e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. Todos os voláteis foram evaporados i. V.; cromatografia de flash em andamento SiO2/CH2Cl2/10% MeOH, seguida por cristalização a partir de AcOEt, gerou 2,116 g do composto título na forma de cristais marrons claros.
[0182] MS (ISP): (M+H) 384,2.
[0183] Etapa 4: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17- ((R)-6-metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca- hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-((S)-1-(4- (hidroximetil)fenilamino)-1-oxo-hexan-2-ilamino)-1-oxo-3-fenilpropan-2- il)succinamida
Figure img0041
foi preparada de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 16.
[0184] MS (ISP): (M+H) 909,7, (M+Na) 931,8.
[0185] Etapa 5: N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4-oxobutanoil]-L- fenilalanil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-norleucinamida
Figure img0042
foi preparada de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 16. Massa esperada MS: 1073,6453, massa encontrada: 1073,642. EXEMPLO 18
[0186] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4-
Figure img0043
[0187] Etapa 1: - Adição de FMOC-álcool 4-aminobenzílico à resina de 2- clorotritila:
Figure img0044
[0188] Resina de cloreto de 2-clorotritila (Novabiochem 01-640114, 100-200 mesh), 1% DVB (18 g, 21,6 mmol, Eq: 1,00) foi engolida em DCM/DMF = 1/1 (300 ml) por dez minutos. A resina foi drenada e adicionou-se uma solução de FMOC-álcool 4-aminobenzílico (14,9 g, 43,2 mmol, Eq: 2) e piridina (6,83 g, 6,99 ml, 86,4 mmol, Eq: 4) em DCM/DMF = 1/1 (300 ml). A mistura foi agitada por uma noite. A resina foi drenada e tampada com uma solução de base de Hünig a 10% em metanol (300 ml). A resina foi lavada com DMF e DCM e seca por uma noite com HV para obter 21,7 g de resina.
[0189] A determinação da carga resultou em 0,4 mmol/g.
[0190] Etapa 2: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6- metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-(2-(4-(hidroximetil)fenilamino)-2-
Figure img0045
[0191] A resina da etapa 1 (1 g, 410 μmol, Eq: 1,00) foi previamente lavada com DMF (2X) e tratada com piperidina/DMF = 1/4 (10 ml) por cinco e dez minutos. A resina foi lavada alternadamente com DMF e IPA (3 x 10 ml). Uma solução de Fmoc-Gly-OH (488 mg, 1,64 mmol, Eq: 4), TPTU (487 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) e base de Huenig (636 mg, 859 μl, 4,92 mmol, Eq: 12) em DMF (10 ml) foi agitada por cinco minutos e agitada em seguida com a resina por uma hora. A resina foi lavada alternadamente com DMF e álcool isopropílico (3x).
[0192] Foram realizadas as divisões de Fmoc a seguir e os acoplamentos subsequentes de Fmoc-Ala-OH (511 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) e ácido N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3- ilóxi]-propil}-succinâmico (Exemplo 1, etapa 2) (892 mg, 1,64 mmol, Eq: 4). A resina de peptídeo seco foi agitada por cerca de 2 x 30 min em TFA 1%/DCM (2 x 20 ml). A mistura de reação foi filtrada e a resina foi lavada com DCM. Os filtrados foram reunidos e os solventes foram evaporados a vácuo. O material bruto foi triturado com dietil éter (2x). Após a purificação por meio de cromatografia de flash, o produto (84 mg, 97,3 μmol) foi obtido na forma de sólido branco.
[0193] MS massa esperada: 776,5452, massa encontrada 776,5455.
[0194] Etapa 3: - O álcool preparado acima N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)- 10,13-dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-(2-(4- (hidroximetil)fenilamino)-2-oxoetilamino)-1-oxopropan-2-il)succinamida (RO5545270) (70 mg, 90,1 μmol, Eq: 1,00) e carbonato de bis(4-nitrofenila) (137 mg, 450 μmol, Eq: 5) sob argônio à temperatura ambiente foram dissolvidos em DMF (4 ml) e tratados com base de Huenig (34,9 mg, 47,2 μl, 270 μmol, Eq: 3) e a mistura foi mantida em reação por uma noite. O solvente foi removido a vácuo. O sólido resultante foi triturado com dietil éter. O sólido foi coletado por meio de filtragem e lavado com dietil éter. O produto foi seco a vácuo para obter o composto título (84 mg, 80,2 μmol) na forma de sólido marrom claro.
[0195] MS massa esperada: 941,5514, massa encontrada 941,5518. EXEMPLO 19
[0196] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-leucyl-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- metioninamida:
Figure img0046
[0197] Etapa 1: - Adição de FMOC-álcool 4-aminobenzílico à resina de 2- clorotritila:
Figure img0047
foi realizada de forma análoga à etapa 1 do Exemplo 18.
[0198] Etapa 2: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6- metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-((S)-1-(4- (hidroximetil)fenilamino)-4-(metiltio)-1-oxobutan-2-ilamino)-4-metil-1-oxopentan- 2-il)succinamida
Figure img0048
foi preparada de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 18, utilizando Fmoc-Met-OH (609 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) e Fmoc-Leu-OH (580 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) na forma de aminoácidos.
[0199] O produto (208 mg, 210 μmol) foi obtido na forma de sólido amarelo claro.
[0200] MS (ISP): (M+H) 893,6183.
[0201] A etapa 3 foi preparada de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 18. Após a purificação sobre sílica gel, o composto título (161 mg, 137 μmol) foi obtido na forma de sólido marrom claro.
[0202] MS massa esperada: 1057,6174, massa encontrada 1057,6184. EXEMPLO 20
[0203] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-leucil-N~1~-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- aspartamida:
Figure img0049
[0204] Etapa 1: - Adição de FMOC-álcool 4-aminobenzílico à resina de 2-clorotritila:
Figure img0050
foi realizada de forma análoga à etapa 1 do Exemplo 18.
[0205] Etapa 2: (S)-2-((S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17- ((R)-6-metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro- 1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propilamino)-4-oxobutanamido)-4- metilpentanamido)-N1-(4-(hidroximetil)fenil)succinamida:
Figure img0051
foi preparada de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 18, utilizando Fmoc-Asn-OH (581 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) e Fmoc-Leu-OH (580 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) na forma de aminoácidos.
[0206] O produto (87 mg, 89,4 μmol) foi obtido na forma de sólido amarelo claro.
[0207] MS massa esperada: 875,6136, massa encontrada 875,6133.
[0208] Etapa 3: - O composto título foi preparado de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 18. Após a purificação sobre sílica gel, o composto título (87 mg, 89,4 μmol) foi obtido na forma de sólido marrom claro.
[0209] MS massa esperada: 1040,6198, massa encontrada 1040,6188. EXEMPLO 21
[0210] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-alanil-N~1~-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- aspartamida:
Figure img0052
[0211] Etapa 1: Adição de FMOC-álcool 4-aminobenzílico à resina de 2-clorotritila:
Figure img0053
foi realizada de forma análoga à etapa 1 do Exemplo 18.
[0212] Etapa 2: (S)-2-((S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17- ((R)-6-metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro- 1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propilamino)-4-oxobutanamido)propanamido)- N1-(4-(hidroximetil)fenil)succinamida:
Figure img0054
foi preparada de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 18, utilizando Fmoc-Asn-OH (581 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) e Fmoc-Ala-OH (511 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) na forma de aminoácidos.
[0213] O produto (140 mg, 159 μmol) foi obtido na forma de sólido amarelo claro.
[0214] MS (ISP): (M+H) 834,8, (M+Na) 856,7.
[0215] Etapa 3: - O composto título foi preparado de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 18. Após a purificação sobre sílica gel (169 mg, 152 μmol), ele foi obtido na forma de sólido marrom claro.
[0216] MS massa esperada: 998,5729, massa encontrada 998,5739. EXEMPLO 22
[0217] N~2~-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-asparaginil-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]glicinamida:
Figure img0055
[0218] Etapa 1: - Adição de FMOC-álcool 4-aminobenzílico à resina de 2- clorotritila:
Figure img0056
foi realizada de forma análoga à etapa 1 do Exemplo 18.
[0219] Etapa 2: (S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6- metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propilamino)-4-oxobutanamido)-N1-(2-(4- (hidroximetil)fenilamino)-2-oxoetil)succinamida:
Figure img0057
foi preparada de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 18, utilizando Fmoc-Gly-OH (488 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) e Fmoc-Asn-OH (581 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) na forma de aminoácidos.
[0220] O produto (140 mg, 162 μmol) foi obtido na forma de sólido branco.
[0221] MS massa esperada: 819,551, massa encontrada 819,5503.
[0222] Etapa 3: o composto título foi obtido de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 18 (176 mg, 161 μmol) na forma de sólido marrom claro.
[0223] MS massa esperada: 984,5572, massa encontrada 984,5489. EXEMPLO 23
[0224] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-fenilalanil-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]glicinamida:
Figure img0058
[0225] Etapa 1: - Adição de FMOC-álcool 4-aminobenzílico à resina de 2- clorotritila:
Figure img0059
foi realizada de forma análoga à etapa 1 do Exemplo 18.
[0226] Etapa 2: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6- metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-(2-(4-(hidroximetil)fenilamino)-2- oxoetilamino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)succinamida:
Figure img0060
foi preparada de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 18, utilizando Fmoc-Gly-OH (488 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) e Fmoc-Phe-OH (635 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) na forma de aminoácidos.
[0227] O produto (259 mg, 288 μmol) foi obtido na forma de sólido branco.
[0228] MS massa esperada: 852,5765, massa encontrada 852,5754.
[0229] Etapa 3: - O composto título foi obtido de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 18 (280 mg, 247 μmol) na forma de sólido marrom claro.
[0230] MS massa esperada: 1017,5827, massa encontrada 1017,5775. EXEMPLO 24
[0231] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-leucil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]glicinamida: O+ quiral
Figure img0061
[0232] Etapa 1: - Adição de FMOC-álcool 4-aminobenzílico à resina de 2- clorotritila:
Figure img0062
foi realizada de forma análoga à etapa 1 do Exemplo 18.
[0233] Etapa 2: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren- 3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-(2-(4-(hidroximetil)fenilamino)-2-oxoetilamino)-4-metil-1- oxopentan-2-il)succinamida:
Figure img0063
foi preparada de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 18, utilizando Fmoc-Gly-OH (488 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) e Fmoc-Leu-OH (580 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) na forma de aminoácidos.
[0234] O produto (240 mg, 278 μmol) foi obtido na forma de sólido amarelo claro.
[0235] MS massa esperada: 818,5921, massa encontrada 818,5921.
[0236] Etapa 3: - O composto título foi preparado de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 18. Após a purificação sobre sílica gel (194 mg, 177 μmol), ele foi obtido na forma de sólido amarelo claro.
[0237] MS massa esperada: 983,5983, massa encontrada 983,6004. EXEMPLO 25
[0238] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-leucil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- fenilalaninamida:
Figure img0064
[0239] Etapa 1: - Adição de FMOC-álcool 4-aminobenzílico à resina de 2- clorotritila:
Figure img0065
foi realizada de forma análoga à etapa 1 do Exemplo 18.
[0240] Etapa 2: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metil- heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(hidroximetil)fenilamino)-1- oxo-3-fenilpropan-2-ilamino)-4-metil-1-oxopentan-2-il)succinamida:
Figure img0066
foi preparada de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 18, utilizando Fmoc-Phe-OH (635 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) e Fmoc-Leu-OH (580 mg, 1,64 mmol, Eq: 4) na forma de aminoácidos.
[0241] O produto (153 mg, 151 μmol) foi obtido na forma de sólido amarelo claro.
[0242] Massa esperada MS: 908,6391, massa encontrada: 908,637.
[0243] Etapa 3: - O composto título foi preparado de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 18. Após a purificação sobre sílica gel (117 mg, 98 μmol), ele foi obtido na forma de sólido branco.
[0244] MS massa esperada: 1073,6453, massa encontrada 1073,646. Exemplo 26
[0245] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-fenilalanil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-Lfenilalaninamida:
Figure img0067
[0246] Etapa 1: - Adição de FMOC-álcool 4-aminobenzílico à resina de 2- clorotritila:
Figure img0068
[0247] Etapa 2: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6- metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-((S)-1-(4- (hidroximetil)fenilamino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-ilamino)-1-oxo-3-fenilpropan-2- il)succinamida:
Figure img0069
foi preparada de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 18, utilizando Fmoc-Phe-OH (635mg, 1,64mmol, Eq: 4) na forma de aminoácido.
[0248] O produto (240mg, 204μmol) foi obtido na forma de sólido amarelo claro.
[0249] MS massa esperada: 942,6234, massa encontrada 942,6218.
[0250] Etapa 3: - O composto título foi preparado de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 18. Após a purificação sobre sílica gel (190mg, 154μmol), ele foi obtido na forma de sólido branco.
[0251] MS massa esperada: 1107,6296, massa encontrada 1107,6287. EXEMPLO 27
[0252] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-leucil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-leucinamida:
Figure img0070
[0253] Etapa 1: - Adição de FMOC-álcool 4-aminobenzílico à resina de 2- clorotritila:
Figure img0071
foi realizada de forma análoga à etapa 1 do Exemplo 18.
[0254] Etapa 2: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metil- heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(hidroximetil)fenilamino)-4- metil-1-oxopentan-2-ilamino)-4-metil-1-oxopentan-2-il)succinamida:
Figure img0072
foi preparada de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 18, utilizando Fmoc-Leu-OH (1,59g, 4,5mmol, Eq: 3) na forma de aminoácido.
[0255] O produto (254mg, 284μmol) foi obtido na forma de sólido branco.
[0256] MS massa esperada: 874,6547, massa encontrada 874,6527.
[0257] Etapa 3: - O composto título foi preparado de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 18. Após a purificação sobre sílica gel, ele foi obtido na forma de sólido branco (178mg, 168μmol).
[0258] MS massa esperada: 1039,6609, massa encontrada 1039,6588. EXEMPLO 28
[0259] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-alanil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-
Figure img0073
[0260] Etapa 1: 9H-fluoren-9-ilmetil éster de ácido {(S)-1-[(S)-1-(4- hidroximetilfenilcarbamoil)-etilcarbamoil]-etil}-carbâmico:
Figure img0074
[0261] Uma solução de Fmoc-Ala-Ala-oH (1 g, 2,61 mmol, Eq: 1,00) e (4-aminofenil)metanol (483 mg, 3,92 mmol, Eq: 1,5) em THF (20 ml) foi tratada com EEDQ (970 mg, 3,92 mmol, Eq: 1,5). A solução foi agitada por uma noite à temperatura ambiente. A mistura foi diluída com 10% 2- propanol/acetato de etila (100 ml) e a solução foi lavada com KHSo4 5%/K2So4 10% (2x), água (1x) e salmoura (1x), seca sobre MgSo4 e evaporada a vácuo. o resíduo foi sonicado em dietil éter por vários minutos e o sólido foi coletado por meio de filtragem para obter o produto (1,27 g, 1,2 mmol) na forma de sólido marrom claro.
[0262] MS (ISP): (M+H) 488,3.
[0263] Etapa 2: (S)-2-amino-N-[(S)-1-(4-hidroximetilfenilcarbamoil)-etil]- propionamida.
Figure img0075
[0264] O composto foi preparado de forma análoga à etapa c do Exemplo 1 para obter o produto (245 mg, 877 μmol) na forma de sólido amarelo claro.
[0265] MS (ISP): (M+H) 266,3, (M+Na) 288,2 (2M+H) 531,3.
[0266] Etapa 3: N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6- metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propil)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-
Figure img0076
[0267] O composto foi preparado de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 16 (165 mg, 198 μmol) na forma de sólido marrom claro.
[0268] Massa esperada MS: 790,5608, massa encontrada: 790,5587.
[0269] Etapa 4: - O composto título foi preparado de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 18. Após a purificação sobre sílica gel, ele foi obtido na forma de sólido branco (99 mg, 98,4 μmol).
[0270] Massa esperada MS: 955,567, massa encontrada: 955,5651. EXEMPLO 29
[0271] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-isoleucil-N~1~-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- aspartamida:
Figure img0077
[0272] Etapa 1: Ácido (S)-2-[(2S,3S)-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-3- metilpentanoilamino]-succinâmico:
Figure img0078
[0273] Resina de cloreto de 2-clorotritila (5 g, 7,5 mmol, Eq: 1,00) foi engolida em DCM e tratada em seguida com uma solução de Fmoc- Asn(Trt)-OH (8,95 g, 15,0 mmol, Eq: 2) e base de Huenig (3,88 g, 5,1 ml, 30,0 mmol, Eq: 4) em DCM por uma noite. A resina foi lavada com DCM e tampada com uma solução de base de Huenig a 10% em metanol. Acoplamento de Fmoc-Ile-OH (5,3 g, 15,0 mmol, Eq: 2) com TPTU (4,46 g, 15,0 mmol, Eq: 2) e base de Huenig (3,88 g, 5,1 ml, 30,0 mmol, Eq: 4) de acordo com síntese de peptídeos em fase sólida padrão. O produto foi dividido da resina com um coquetel de TFA, água e tri-isopropilsilano (95/2,5/2,5 v/v/v) por duas horas à temperatura ambiente. A resina foi filtrada e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida em um volume pequeno. Após trituração com dietil éter, o produto foi filtrado e seco a vácuo para obter o produto (2,85 g, 5,79 mmol) na forma de sólido branco.
[0274] Massa esperada MS: 467,2056, massa encontrada: 467,2056.
[0275] Etapa 2: 9H-fluoren-9-ilmetil éster de ácido {(1S,2S)-1-[2-carbamoil-1-((S)- 4-hidroximetilfenilcarbamoil)-etilcarbamoil]-2-metilbutil}-carbâmico.
Figure img0079
[0276] O composto foi preparado de forma análoga à etapa 1 do Exemplo 28 (620 mg, 336 μmol) na forma de sólido amarelo claro.
[0277] Etapa 3: (S)-2-((2S,3S)-2-amino-3-metilpentanoilamino)-N*1*-(4- hidroximetilfenil)-succinamida:
Figure img0080
[0278] O composto foi preparado de forma análoga à etapa c do Exemplo 1 (100 mg, 228 μmol) na forma de sólido amarelo claro.
[0279] Etapa 4: (S)-2-((2S,3S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13- dimetil-17-((R)-6-metil-heptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilóxi)propilamino)-4- oxobutanamido)-3-metilpentanamido)-N1-(4-(hidroximetil)fenil)succinamida:
Figure img0081
[0280] O composto foi preparado de forma análoga à etapa 2 do Exemplo 16 (89 mg, 91.4 μmol) na forma de sólido amarelo claro.
[0281] Etapa 5: - O composto da etapa anterior reagiu no composto título de forma análoga à etapa 3 do Exemplo 18. Após a purificação sobre sílica gel (42 mg, 36.3 μmol), ele foi obtido na forma de sólido marrom claro.
[0282] Massa esperada MS: 1040,6198, massa encontrada: 1040,6177. EXEMPLO 30
[0283] N-[4-({3-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]propil}amino)-4- oxobutanoil]-L-fenilalanil-N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-D-lisinamida:
Figure img0082
[0284] O composto foi preparado de forma análoga à etapa 1 do Exemplo 16, a partir de Fmoc-D-Lys(Boc)-OH (158 mg, 116 μmol) na forma de sólido marrom claro.
[0285] MS (ISP): (M+H) 1362,8, (M+Na) 1383,8. EXEMPLO 31
[0286] N-{15-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]-4,15-dioxo-8,11-dioxa- 5,14-diazapentadecan-1-oil}-L-fenilalanil-N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-N-
Figure img0083
[0287] O composto título foi preparado de forma análoga ao Exemplo 16, utilizando um derivado de oligo-PEG de colesterol na etapa 2 da síntese.
[0288] MS (ISP): (M+H) 1479,8.
[0289] O intermediário PEG de colesterol ácido N-[2-(2-{2- [(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren- 3-iloxicarbonilamino]-etóxi}-etóxi)-etil]-succinâmico necessário para a etapa 2 foi preparado conforme segue: - Etapa a: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-dimetil-hexil)- 10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-il éster de ácido {2-[2-(2-aminoetóxi)-etóxi]-etil}- carbâmico:
Figure img0084
[0290] Uma solução de cloroformato de colesterila (1 g, 2,23 mmol) em 25 ml de diclorometano foi adicionada em gotas mediante agitação a uma solução de 2,2’-(etilenodióxi)bis-(etilamina) (495 mg, 3,34 mmol) em 75 ml de diclorometano. A reação foi agitada por uma noite à temperatura ambiente. A reação foi diluída com diclorometano e extraída com água. O extrato orgânico foi seco sobre di-hidrato de MgSO4 anidro, filtrado e evaporado. Após purificação sobre sílica gel modificada por amino (eluente: MeCl2 -> MeCl2/MeOH = 975:25 v/v), foi obtido o produto (615 mg) na forma de sólido branco ceroso.
[0291] MS (ISP): (M+H) 561,5.
[0292] Etapa b: Ácido N-[2-(2-{2- [(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-etóxi}-etóxi)-etil]-succinâmico:
Figure img0085
[0293] A amina da etapa A (480 mg, 0,856 mmol) e trietilamina (0,13 ml, 0,94 mmol) foram dissolvidas em 5 ml de diclorometano. Após a adição de anidrido succínico (90 mg, 0,9 mmol), a solução foi agitada por uma noite à temperatura ambiente. Verificação de TLC exibiu ainda algum material de partida. Adicionou-se mais anidrido succínico (20 mg, 0,2 mmol). Após agitação da reação por mais três horas à temperatura ambiente, ela foi diluída com diclorometano e lavada com uma mistura de 5% KHSO4 e 10% K2SO4. O extrato orgânico foi seco sobre di-hidrato de MgSO4 anidro, filtrado e evaporado a vácuo para obter o ácido desejado (490 mg, 0,667 mmol).
[0294] MS (ISP): (M+H) 661,5. EXEMPLO 32
[0295] N-{30-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]-4,30-dioxo- 8,11,14,17,20,23,26-heptaoxa-5,29-diazatriacontan-1-oil}-L-fenilalanil-N~6~-[(4- metoxifenil)(difenil)metil]-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-Llisinamida:
Figure img0086
[0296] O composto título foi preparado de forma análoga ao Exemplo 16, utilizando um derivado de PEG de colesterol na etapa 2 da síntese.
[0297] MS (ISP): (M+H) 1699,9.
[0298] O intermediário de PEG de colesterol necessário ácido 1- [(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]-1,27-dioxo-5,8,11,14,17,20,23-heptaoxa-2,26- diazatriacontan-30-oico da etapa 2 foi preparado conforme segue: - Etapa a: [25-({(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17- [(2R)-6-metil-heptan-2-il]-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradeca-hidro- 1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il}óxi)-25-oxo-3,6,9,12,15,18,21-heptaoxa-24- azapentacos-1-il]carbamato de terc-butila:
Figure img0087
[0299] Cloroformato de cloresterila (476 mg, 1,06 mmol) e trietilamina (155 μl, 1,113 mmol) foram dissolvidos em 5 ml de diclorometano. Em seguida, adicionou-se uma solução de alfa-amino-ômega-boc-amino- octa(etileno glicol) (497 mg, 1,06 mmol) dissolvida em 1 ml de diclorometano. A solução foi agitada por uma noite à temperatura ambiente, diluída com diclorometano e extraída com uma mistura aquosa de KHSO4 5%/K2SO4. O extrato orgânico foi seco sobre MgSO4 anidro, filtrado e evaporado a vácuo. Após purificação sobre sílica gel (eluente: MeCl2/MeOH = 975:25 -> 95:5 v/v), o produto (530 mg, 0,571 mmol) foi obtido na forma de óleo incolor.
[0300] MS (ISP): (M+NH4) 898,7.
[0301] Etapa b: ácido 1-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]-1,27-dioxo- 5,8,11,14,17,20,23-heptaoxa-2,26-diazatriacontan-30-oico:
Figure img0088
[0302] O derivado de Boc anterior (450 mg, 0,511 mmol) foi dissolvido em 4M de HCl em dioxano (10,2 ml, 40,9 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente por quarenta minutos. O solvente foi removido a vácuo e o sólido branco restante foi dissolvido em 5 ml de diclorometano e tratado com trietilamina (32 μl, 0,229 mmol) e anidrido succínico (11,5 mg, 0,114 mmol) por uma noite. Adicionou-se mais anidrido succínico (11 mg, 0,11 mmol, 0,2 equiv.) e, após sessenta minutos, a reação foi diluída com diclorometano e lavada com tampão de KHSO4 5%/K2SO4 10%. O extrato orgânico foi seco sobre MgSO4 anidro, filtrado e evaporado para gerar 390 mg do produto desejado.
[0303] MS (ISP): (M+H) 881,7. EXEMPLO 33
[0304] N-{66-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]-4,66-dioxo- 8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62-nonadecaoxa-5,65- diaza-hexa-hexacontan-1-oil}-L-fenilalanil-N~6~-[(4-metoxifenil)(difenil)metil]-N- [4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-lisinamida:
Figure img0089
[0305] O composto título foi preparado de forma análoga ao Exemplo 16, utilizando um derivado de PEG de colesterol na etapa 2 da síntese.
[0306] MS (ISP): (M+H) 2228,1.
[0307] O intermediário de PEG de colesterol necessário ácido 1- [(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]-1,63-dioxo- 5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59-nonadecaoxa-2,62- diaza-hexa-hexacontan-66-oico da etapa 2 foi preparado conforme segue: Etapa a: (59-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27, 30,33,36,39,42,45,48, 51,54,57 nonadecaoxanonapentacont-1-il)carbamato de (3beta)-colest-5-en-3-ila:
Figure img0090
[0308] Alfa,ômega-bis-amino 20 (etileno glicol) (538 mg, 0,6 mmol) e trietilamina (92 μl, 0,66 mmol) foram dissolvidos em 15 ml de diclorometano seco. Adicionou-se uma solução de cloroformato de colesterila (270 mg, 0,6 mmol) em 2 ml de diclorometano seco em gotas à temperatura ambiente. A solução foi agitada por uma noite e concentrada a vácuo em seguida até um pequeno volume e purificada diretamente sobre sílica gel (eluente: MeCl2/MeOH = 95:5 -> 9:4 -> 4:1 v/v) para obter o produto (350 mg, 0,254 mmol) na forma de sólido ceroso.
[0309] MS (ISP): (M+H) 1309,9.
[0310] Etapa b: ácido 1-[(3beta)-colest-5-en-3-ilóxi]-1,63-dioxo- 5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59-nonadecaoxa-2,62- diaza-hexa-hexacontan-66-oico:
Figure img0091
[0311] A amina da etapa a (329 mg, 0,251 mmol), anidrido succínico (26,4 mg, 0,264 mmol) e trietilamina (40 μl, 0,286 mmol) foram dissolvidos em 5 ml de diclorometano seco. Após a adição de mais trietilamina (40 μl, 0,286 mmol), a solução (pH > 8) foi agitada por uma noite à temperatura ambiente. A reação foi diluída com diclorometano e lavada por duas vezes com uma mistura aquosa de KHSO4 a 5%/K2SO4 a 10%. O extrato orgânico foi seco sobre MgSO4 anidro, filtrado e evaporado para obter o produto (260 mg, 0,175 mmol) na forma de sólido ceroso incolor.
[0312] MS (ISP): (M+NH4) 1408,9.
[0313] Os exemplos de trabalho a seguir ilustram a presente invenção: EXEMPLO 34
[0314] Procedimento geral de preparação de conjugados de RNA. MATERIAIS
[0315] Sulfóxido de dimetila (DMSO), N,N-di-isopropiletilamina (DIPEA) e solução de acetato de sódio (3 M, pH 5,2) foram adquiridos da Sigma Aldrich Chemie GmbH (Traufkirchen, Alemanha).
[0316] Acetato de trietilamônio (TEAA) (2,0 M, pH 7,0) e acetonitrila (ACN, qualidade de HPLC) para HPLC RP foram adquiridos da Biosolve (Valkenswaard, Holanda).
[0317] Etanol (EtOH, p. a.) foi adquirido da Merck (Darmstadt, Alemanha). Utilizou-se água purificada de um sistema Optilab HF (Membra Pure, Alemanha).
[0318] Coluna de 3 ml Resource RPC (10 x 0,64 cm; tamanho de partículas de 15 μm) foi adquirida da GE Healthcare (Freiburg, Alemanha).
[0319] Realizou-se purificação por HPLC utilizando um sistema ÃKTA Explorer 100 (GE Healthcare).
[0320] Síntese de RNA modificado por amino: - RNA equipado com um hexilaminoligante na extremidade 5’ da fita sense foi produzido por meio de química de fosforamidita sobre fase sólida em escala de 1215 μmol utilizando um ÃKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Alemanha) e vidro com poros controlados como suporte sólido (Prime Synthesis, Aston PA, Estados Unidos). RNA contendo 2’-O-metil nucleotídeos foi gerado empregando as fosforamiditas correspondentes, 2’-O-metil fosforamiditas e TFA-helixaminoligante amidita (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburgo, Alemanha). A divisão e a desproteção, bem como a purificação, foram atingidas por meio de métodos conhecidos na técnica (Wincott, F. et al, NAR 1995, 23, 14, 2677-84).
[0321] O RNA modificado por amino foi caracterizado por meio de HPLC de troca de ânions (pureza: 96,1%) e a identidade foi confirmada por meio de ESI-MS ([M+H]1+, calculado: 6937,4; [M+H]1+ medido: 6939,0.
[0322] Sequência: 5'-(NH2C6)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3’; u, c: 2’-O-metil nucleotídeos de nucleotídeos de RNA correspondentes, s: fosforotioato.
[0323] Procedimento geral de conjugação experimental: - Os compostos título dos Exemplos 1 a 33 foram acoplados por meio do RNA modificado por amino de acordo com o procedimento a seguir: - RNA equipado com um aminoligante C-6 na extremidade 5’ (16,5 mg, 1 equivalente) é dissolvido em 500 μl de DMSO e 150 μl de água. Adiciona-se o derivado carbonato de p-nitrofenila (10 equivalentes) dissolvido em 1 ml de DMSO, seguido por 8 μl de DIPEA. A mistura de reação é agitada a 35 °C no escuro e monitorada utilizando HPLC RP (RPC de Recursos 3 ml, tampão: A: 0,1 M de TEAA em água, B: 0,1 M de TEAA em 95% de ACN, gradiente: 3% B a 100% B em 20 CV). Quando a reação caminha para o término, o conjugado de RNA é precipitado utilizando acetato de sódio (3 M) em EtOH a -20 °C. Para exemplos que não possuem um grupo protetor de MMT no motivo de dipeptídeo, os conjugados correspondentes são purificados utilizando as condições descritas acima. Frações puras são reunidas e o material é precipitado utilizando acetato de sódio e EtOH para gerar o conjugado de RNA desejado; e - Conjugados de RNA que contêm um grupo protetor de MMT na sequência dipeptídica são adicionalmente processados de acordo com o procedimento fornecido abaixo.
[0324] Procedimento geral de divisão de MMT: A pelota conjugada de RNA bruto é dissolvida em 500 μl de água e 1,5 ml de tampão acetato de sódio (3 M, pH 5,2 ou 0,1 M, pH 4,0). A solução é agitada por dois dias a 30 °C. A mistura de reação é monitorada utilizando HPLC RP (RPC de Recursos 3 ml, tampão: A: 0,1 M de TEAA em água, B: 0,1 M de TEAA em 95% de ACN, gradiente: 3% B a 100% B em 20 CV). Após a divisão completa do grupo protetor de MMT, o conjugado de RNA é purificado diretamente utilizando as condições mencionadas logo acima. Frações puras são reunidas e o conjugado desejado é precipitado utilizando acetato de sódio e EtOH.
[0325] Como controle, foi sintetizado um conjugado de RNA que não contém o motivo de dipeptídeo. Com este propósito, colesterol foi ligado à extremidade 5’ por meio de um ligante descrito na literatura (Nature Biotech., 2007, 25, 1149). Este conjugado é denominado “não divisível”.
[0326] Todos os conjugados de RNA foram analisados por meio de HPLC RP para determinar a pureza e a identidade foi confirmada por meio de MS ESI (modo negativo). Resumidamente, realizou-se HPLC RP em um sistema Dionex Ultimate (Dionex, Idstein, Alemanha) equipado com uma coluna C18 XBridge (2,5 x 50 mm, tamanho de partículas de 2,5 μm, Waters, Eschborn, Alemanha) sob temperatura de coluna de 65 °C. Realizou-se eluição de gradiente utilizando 100 mM de hexafluoroisopropanol (HFIP) e 16 nM de trietilamina em metanol a 1% como eluente A e em metanol a 95% como eluente B (1% B a 18% B em trinta minutos). Realizou-se detecção de UV a 260 nm. Para análise espectrométrica de massa, um sistema MS ESI ThermoFinnigan LCQ DecaXP com fonte de micropulverização e detector de captura de íons foi acoplado online ao sistema de HPLC.
[0327] Exemplos de compostos específicos de Fórmula (IIa) são descritos na Tabela 1. Os compostos resultantes são denominados “conjugados de siRNA de colesterol que contêm dipeptídeo”, em que os conjugados de siRNA de colesterol que contêm dipeptídeos específicos são denominados a seguir “exemplo de composto título X-(NHC6)-(sequência de siRNA)” e “siRNA com composto título do Exemplo X”.
[0328] Preparação de siRNA: Sequência sem sentido: 5'-uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU-3' u, c: 2’-O-metil nucleotídeos de nucleotídeos de RNA correspondentes, s: fosforotioato.
[0329] Os conjugados de siRNA de colesterol que contêm dipeptídeos dirigidos contra o mRNA de polipoproteína B foram gerados por meio de mistura de uma solução equimolar de fitas complementares em tampão de combinação (20 mM de fosfato de sódio, pH 6,8; 100 mM de cloreto de sódio), aquecido em um banho de água a 80-85 °C por três minutos e resfriado à temperatura ambiente ao longo de um período de três a quatro horas. A formação de duplex foi confirmada por meio de eletroforese de gel nativa.
[0330] Todos os conjugados de siRNA de colesterol que contêm dipeptídeos preparados são relacionados na Tabela 2. TABELA 1 CONJUGADOS DE SIRNA DE COLESTEROL QUE CONTÊM DIPEPTÍDEOS (5’ -3’) E DADOS ANALÍTICOS
[0331] Chave: as letras minúsculas a, c, g, u são 2’-O-metil nucleotídeos; ligações de fosforotioato A são simbolizadas com um “s” minúsculo. (NHC6) é o ligante de amino-hexila incorporado na extremidade 5’ da fita sense.
Figure img0092
Figure img0093
TABELA 2 CONJUGADOS DE SIRNA DE COLESTEROL QUE CONTÊM DIPEPTIDEOS
[0332] A última linha (SEQ ID N° par 266/154) representa um conjugado de siRNA que não contém o motivo dipeptídico. Chave: as letras minúsculas a, c, g, u são 2’-O-metil nucleotídeos; ligações de fosforotioato são simbolizadas com um “s” minúsculo. (NHC6) é o ligante de amino-hexila incorporado na extremidade 5’ da fita sense.
Figure img0094
Figure img0095
EXEMPLO 35 EXPERIMENTOS IN VIVO
[0333] Coadministração de conjugados de siRNA de colesterol que contêm dipeptídeos e polímero de fornecimento in vivo: - Camundongos com seis a oito semanas de idade (linhagem C57BL/6 ou ICR, cerca de 18 a 20 g cada) foram obtidos de Harlan Sprague Dawley (Indianápolis IN). Os camundongos foram abrigados pelo menos dois dias antes da injeção. A alimentação foi realizada à vontade com Alimento para Roedores Harlan Teklad (Harlan, Madison WI); e - Camundongos (n = 3 por grupo) receberam injeção de uma mistura de 0,2 ml de solução de polímero de fornecimento e 0,2 ml de conjugados de siRNA de colesterol que contêm dipeptídeos. A dose injetada, a menos que indicado em contrário, foi de 15 mg/kg para o polímero de fornecimento e 0,1 mg/kg com relação aos conjugados de siRNA de colesterol que contêm dipeptídeos. As soluções foram injetadas por meio de infusão na veia da cauda. 48 horas após a injeção, os níveis de ApoB no soro foram medidos com relação a animais tratados com glicose isotônica de acordo com o procedimento abaixo.
[0334] Determinação dos níveis de ApoB em soro: - Camundongos foram mantidos em jejum por quatro horas antes da coleta de soro por meio de sangramento abaixo da mandíbula. Os níveis de proteína ApoB no soro foram determinados por meio de métodos ELISA de sanduíche padrão. Resumidamente, um anticorpo anti-ApoB de camundongo de cabra policlonal e um anticorpo anti-ApoB de camundongo de coelho (Biodesign International) foram utilizados, respectivamente, como anticorpos de captura e detecção. Um anticorpo anti-IgG de coelho de cabra conjugado a HRP (Sigma) foi aplicado em seguida para ligar o complexo de ApoB e anticorpo. A absorção de desenvolvimento colorimétrico de tetrametilbenzidina (TMB, Sigma) foi medida em seguida por meio de um leitor de microplacas Tecan Safire2 (Áustria, Europa) a 450 nm.
[0335] Na Figura 1, diversos conjugados de siRNA de colesterol contendo dipeptídeos foram marcados contra o mesmo siRNA conjugado a colesterol, mas que não possuem o motivo divisível elaborado anteriormente neste capítulo. O efeito deste conjugado de siRNA (SEQ ID N° par 266/154, “controle não divisível”) sobre os níveis de ApoB no soro foi definido em 1, a fim de avaliar a influência dos conjugados que contêm dipeptídeos com relação ao controle não divisível. A substituição do motivo Phe-Lys utilizado inicialmente (siRNA com composto título do Exemplo 16) pelos os D-aminoácidos correspondentes (siRNA com o composto título do Exemplo 14) ou apenas a substituição do Lys pelo enantiômero não natural (siRNA com o composto título do Exemplo 30) gerou redução de ApoB pronunciada ou equivalente ao siRNA controle não divisível. A substituição de Lys por Gly (siRNA com o composto título do Exemplo 23) ou de Phe por p-metoxifenilalanina (siRNA com o composto título do Exemplo 13) reduziu a potência em comparação com siRNA com o composto título do Exemplo 16. Demonstrou-se que outros motivos de dipeptídeos que contêm conjugados de siRNA são tão eficazes quanto o conjugado que contêm Phe-Lys original.
[0336] A Figura 2 resume conjugados de siRNA de colesterol que contêm dipeptídeos que foram tão eficazes ou apresentaram eficácia aprimorada em comparação com siRNA com o composto título do Exemplo 16 que consiste do motivo Phe-Lys. Todos esses conjugados foram significativamente mais ativos em comparação com o conjugado de siRNA de colesterol “não divisível” SEQ ID N° par 266/154. Os conjugados de siRNA de colesterol que contêm dipeptídeos com melhor desempenho apresentaram anel fenila modificado por flúor no motivo Phy-Lys (siRNA com o composto título do Exemplo 8, siRNA com o composto título do Exemplo 9) ou continham a fenilalanina substituída por betafenilalanina (siRNA com o composto título do Exemplo 11) ou um de seus derivados (siRNA com o composto título do Exemplo 10).
[0337] Como os conjugados de siRNA de colesterol que contêm dipeptídeos com motivos dipeptídicos que consistem de D-aminoácidos apresentam desempenho igual ao conjugado controle não divisível, é concebível que outras sequências de dipeptídeos realmente sejam divididas por uma atividade de protease in vivo. Considerando a ampla aceitação de diferentes aminoácidos e seus derivados, entretanto, é provável que mais de uma enzima esteja participando da reação de divisão conforme sugerido na literatura (Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855).
[0338] Conforme exibido na Figura 3, a incorporação de um motivo dipeptídico divisível por catepsina (neste caso, Phe-Lys, siRNA com o composto título do Exemplo 16) entre o siRNA e o colesterol ligante com moléculas pequenas amplia a potência do conjugado de siRNA em comparação com o conjugado de siRNA de colesterol linear (SEQ ID N° par 266/154). O espaçamento adicional entre o ligante de colesterol e o motivo dipeptídico por meio de ligantes com base em PEG reduz a potência proporcionalmente ao comprimento do ligante de PEG.
[0339] Na Figura 4, a dose de polímero foi mantida constante em 15 mg/kg. A dose de siRNA foi titulada e foi medido o efeito sobre o teor de ApoB no soro. Os conjugados de siRNA de colesterol que contêm dipeptídeos e contêm o motivo Phe-Lys (F-K) foram significativamente mais potentes em comparação com o conjugado de controle que não contém a sequência de dipeptídeos. EXEMPLO 36
[0340] Síntese de oligorribonucleotídeos 2’-modificados: - Oligorribonucleotídeos foram sintetizados de acordo com a tecnologia de fosforamidita sobre fase sólida. Dependendo da escala, foi utilizado um sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems) ou um oligopiloto AKTA 100 (GE Healthcare, Freiburg, Alemanha). Foram realizadas sínteses sobre um suporte sólido feito de vidro com poros controlados (CPG, 520 A, com carga de 75 μmol/g, obtido por meio da Prime Synthesis, Aston PA, Estados Unidos). Todas as fosforamiditas de RNA modificadas 2’, bem como reagentes ancilares, foram adquiridas da SAFC (Hamburgo, Alemanha). Especificamente, foram utilizads as fosforamiditas de 2’-O-metila a seguir: (5’-O-dimetoxitritil-N6- (benzoil)-2’-O-metiladenosina-3’-O-(2-cianoetil-N,N-di-isopropilamino) fosforamidita, 5’-O-dimetoxitritil-N4-(acetil)-2’-O-metilcitidina-3’-O-(2-cianoetil- N,N-di-isopropilamino) fosforamidita, (5’-O-dimetoxitritil-N2-(isobutiril)-2’-O- metilguanosina-3’-O-(2-cianoetil-N,N-di-isopropilamino) fosforamidita, e 5’-O- dimetoxitritil-2’-O-metiluridina-3’-O-(2-cianoetil-N,N-di-isopropilamino) fosforamidita. As 2’-deóxi-2’-fluorofosforamiditas conduziram os mesmos grupos protetores como amiditas de RNA 2’-O-metila. Todas as amiditas foram dissolvidas em acetonitrila anidra (100 mM) e foram adicionadas peneiras moleculares (3 A). Para gerar o 5’-fosfato, foi gerada a 2-[2-(4,4’- dimetoxitritilóxi)etilsulfonil]etil-(2-cianoetil)-(N,N-di-isopropil)-fosforamidita da Glen Research, Sterling, Virgínia, Estados Unidos). A fim de introduzir o ligante C-6 amino na extremidade 5’ dos oligômeros, foi empregada a 6- (trifluoroacetilamino)-hexil-(2-cianoetil)-(N,N-di-isopropil)-fosforamidita da Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, Wisconsin, Estados Unidos). As modificações 5’ foram introduzidas sem nenhuma modificação do ciclo de síntese. 5-Etil tiotetrazol (ETT, 500 mM em acetonitrila) foi utilizado como solução ativadora. Os tempos de acoplamento foram de seis minutos. A fim de introduzir ligações de fosforotioato, foi empregada uma solução de 50 mM de 3- ((dimetilaminometilideno)amino)-3H-1,2,4-ditiazolo-3-tiona (DDTT, obtido por meio da AM Chemicals, Oceanside CA, Estados Unidos) em acetonitrila anidra/piridina (1:1 v/v). EXEMPLO 37
[0341] Divisão e desproteção de oligômero ligado a suporte: - Após a finalização da síntese de fase sólida, o suporte sólido seco foi transferido para um tubo de 15 ml e tratado com amônia aquosa concentrada (Aldrich) por dezoito horas a 40°C. Após centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo e o CPG foi lavado com amônia aquosa. As soluções combinadas foram evaporadas e o resíduo sólido foi reconstituído em tampão A (vide abaixo). EXEMPLO 38
[0342] Purificação de oligorribonucleotídeos: - Oligômeros brutos foram purificados por meio de HPLC de troca aniônica utilizando uma coluna embalada com Fonte Q15 (GE Healthcare) e um sistema AKTA Explorer (GE Healthcare). O tampão A foi de 10 mM de perclorato de sódio, 20 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 7,4 (Fluka, Buchs, Suíça), continha 20% de acetonitrila e o tampão B foi idêntico ao tampão A com exceção de 500 mM de perclorato de sódio. Foi empregado um gradiente de 22% de B para 42% de B em 32 volumes de coluna (CV). Foram registrados traços de UV a 280 nm. Frações apropriadas foram reunidas e precipitadas com 3 M de NaOAc, pH = 5,2 e 70% de etanol. Por fim, a pelota foi lavada com 70% de etanol. EXEMPLO 39
[0343] Combinação de oligorribonucleotídeos para gerar siRNA: - Fitas complementares foram misturadas por meio da combinação de soluções de RNA equimolares. A mistura foi liofilizada e reconstituída com um volume apropriado de tampão de combinação (100 mM de NaCl, 20 mM de fosfato de sódio, pH 6,8) para atingir a concentração desejada. A presente solução foi colocada em um banho de água a 85°C que foi resfriado à temperatura ambiente em até três horas. EXEMPLO 40 ATIVIDADE IN VITRO DE SIRNAS ISENTOS DE RESÍDUOS DE 2’-OH:
[0344] A fim de pesquisar se siRNAs que não contêm nenhum resíduo de 2’-OH exibem atividade de knockdown in vitro potente, testamos um quadro de siRNAs dirigidos a mRNA de EGFP com químicas de modificação 2’ diferentes (SEQ ID pares 31/32 a 149/150 e vide a Tabela 3 para exemplos). Os siRNAs foram selecionados para determinar a atividade com e sem sentido com o Sistema de Teste de Luciferase Dual-Glo® (Promega) utilizando o vetor psiCHECK2 (Promega) em células COS7 (DSMZ, Braunschweig, Alemanha, cat. n° ACC-60). Para abordar a atividade de silenciamento conferida por fitas sense e antisense, clonamos cada sequência de local alvo 19mer correspondente como construção psiCHECK2 separada (psiCHECK2-AT para atividade sem sentido, psiCHECK2-ST para atividade com sentido) na região de clonagem múltipla localizada a 3’ do códon de parada de tradução da luciferase de Renilla sintética. Utilizando Lipofetamina 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemanha, cat. n° 11668-019), células COS7 foram cotransfectadas com construção de vetor e 3 nM do siRNA correspondente complementar ao local alvo clonado. Determinou-se silenciamento mediado por siRNA bem sucedido 24 hroas após a transfecção por meio da atividade da luciferase de renilla normalizada em níveis de luciferase de vaga-lume para levar em conta a eficiência de transfecção (vide a Figura 5a para a atividade sem sentido e a Figura 5b para a atividade com sentido). TABELA 3 EXEMPLOS DE SEQUÊNCIAS DE SIRNA E MODIFICAÇÕES QUÍMICAS UTILIZADAS PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE KNOCKDOWN IN VITRO DEPENDENTE DE MODIFICAÇÕES 2’
[0345] Duplicatas de referência e exemplos selecionados de variantes de modificação correspondentes utilizadas no presente estudo. Xf indica uma modificação 2’-fluoro do nucleotídeo X, letras minúsculas indicam uma modificação 2’-O-metila, letras sublinhadas indicam um nucleotídeo de DNA e todas as outras letras maiúsculas indicam ribonucleotídeos. A letra “p” indica um 5’-fosfato.
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[0346] Descobriu-se que os cinco siRNAs modificados mais potentes (> 60% de knockdown) foram projetados em um padrão de 2’- fluoro/2’-O-metilas (2’F/2’-OMe) alternado. Embora confira atividade sem sentido, essa química eliminou totalmente a atividade das fitas sense correspondentes, conforme exibido pela atividade de luciferase de renilla inexistente ou mínima para todas as variantes de 2’F/2’-OMe testadas.
[0347] Concluímos que esse padrão 2’F/2’-OMe está promovendo a atividade de fita antisense pretendida de siRNA, enquanto efeitos indesejados decorrentes da fita sense são totalmente suprimidos. EXEMPLO 41
[0348] Detecção de locais sensíveis a DNAse II por meio de teste in vitro: - Cromatografia de líquidos de alto desempenho (HPLC) de fase reversa (RP) com emparelhamento de íons (IP) acoplada a espectrometria de massa (MS) por ionização de eletropulverização (ESI) ou um método com base em HPLC de troca de ânions (AEX) foi estabelecida para testar a estabilidade in vitro de RNAs com fita simples e dupla selecionados.
[0349] Descrição do método: para análise da estabilidade, uma solução de 10 μM de RNA de fita simples ou fita dupla foi incubada a 37°C em 5 mM de solução tampão de acetato de sódio (pH 4,5) contendo 0,8 ou 8 unidades de DNase II (de baço bovino, Tipo V, Sigma Aldrich). A reação de incubação foi suspensa por meio da adição de uma solução de 100 mM de acetato de trietil amônio (TEAA), alterando o pH para 7 e desativando a enzima DNase II. A análise foi realizada por meio de LC/MS combinada com detecção de UV ou por meio de HPLC AEX com detecção de UV. Traços de detecção UV a 260 nm foram utilizados para análise quantitativa e dados de MS sesrviram para identificação do local de divisão na sequência de RNA: a. HPLC RP IP foi realizada empregando uma coluna Waters XBridge C18 (2,5 x 50 mm, tamanho de partícula de 2,5 μm) sob temperatura de coluna de 65 °C. Realizou-se eluição de gradiente utilizando 100 mM de hexafluoroisopropanol (HFIP) e 16 mM de trietilamina em metanol a 1% como eluente A e composição A em 95% de metanol como eluente B. Foi empregado um gradiente de 1% de B a 18% de B em trinta minutos; e b. HPLC AEX foi realizada sobre uma coluna Dionex DNA Pac200 (4 x 250 mm) a 50°C utilizando um tampão de 20 mM de fosfato contendo 10% de ACN sob pH = 11. O eluente B continha 1 M de NaBr em eluente A. Foi empregado um gradiente de 25% a 62% de B em 18 minutos. TABELA 4 DUPLEX E FITAS INTACTAS RESTANTES AVALIADAS PARA DETERMINAR A SUA ESTABILIDADE CONTRA DNASE II
[0350] Chave: as letras minúsculas a, c, g, u são 2’-O-metil nucleotídeos; as letras maiúsculas A, C, G, U seguidas por “f” indicam um 2’- fluoronucleotídeo. “p” minúsculo indica um 5’-fosfato. (invdT) representa uma deoxitimidina invertida (ligado 3’-3’). Ligações de fosforotioato são simbolizadas com um “s’ minúsculo. dT é deoxitimidina. (NHC6) é o ligante de amino-hexila incorporado na extremidade 5’ da fita sense.
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[0351] Conclusões: a. Fitas de RNA que contêm pelo menos um nucleotídeo 2’- OH (tais como as duas fitas de SEQ ID N° par 157/158) são degradados rapidamente por meio de um intermediário pentavalente cíclico, gerando fosfatos 2’-3’ cíclicos no produto de divisão 5’. A formação do intermediário pentavalente pode ser inibida utilizando nucleotídeos que não contêm um grupo 2’-OH tais como 2’-deóxi, 2’-OMe ou 2’-F; b. Além disso, RNA é degradado em um processo 5’- exonucleolítico que é independente da modificação 2’ dos nucleotídeos 5’- terminais. Este processo de degradação pode ser inibido utilizando porções não de nucleotídeos 5’-terminais, tais como um ligante amino C6 (por exemplo, SEQ ID N° 160 em SEQ ID N° par 160/159 ou SEQ ID N° 165 em SEQ ID N° par 165/166) ou um fosforotioato na primeira ligação internucleotídeos (tal como SEQ ID N° 160 em SEQ ID N° par 160/159); c. Grupo 5’-fosfato reduz a velocidade da cinética de divisão exonucleolítica, mas não pode bloquear completamente a degradação que começa nessa extremidade (tal como SEQ ID N° 160 em SEQ ID N° par 160/159). Isso se deve, mais provavelmente, à divisão do 5’-fosfato por fosfatases ou por uma atividade de fosfatase inerente da enzima DNase II; e d. A melhor proteção para fitas de RNA foi atingida com oligonucleotídeos que não contêm nucleotídeo 2’-OH, começando com um nucleotídeo 2’-OMe na extremidade 5’ conectada por uma ligação de fosforotioato ao segundo nucleotídeo (tal como SEQ ID N° 173 em SEQ ID N° par 173/174). Outros nucleotídeos não de 2’-OH terminais também protegem contra a degradação 5’-exo, mas, até menor ponto, em comparação com a modificação de 2’-OMe (vide Tabela 9). EXEMPLO 42 ATIVIDADE DE KNOCKDOWN IN VIVO DE SIRNAS ISENTOS DE RESÍDUOS DE 2’-OH:
[0352] Foram conduzidos experimentos in vivo com camundongos injetados com siRNAs dirigidos a Fator VII (FVII) (SEQ ID N° pares 179/166 e 180/168, vide Tabela 5) coadministrados com DPC-GalNac. TABELA 5A
[0353] Sequências de siRNAs para Experimento in Vivo Chave: as letras minúsculas a, c, g, u são 2’-O-metil nucleotídeos; as letras maiúsculas A, C, G, U seguidas por “f” indicam um 2’-fluoronucleotídeo. “p” minúsculo indica um 5’-fosfato. (invdT) representa uma deoxitimidina invertida (ligado 3’3’). Ligações de fosforotioato são simbolizadas com um “s’ minúsculo. dT é deoxitimidina. (NHC6) é o ligante de amino-hexila incorporado na extremidade 5’ da fita sense. GalNAc designa a estrutura de fórmula (IV).
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[0354] siRNA FVII com padrão 2’-OMe/2’-F alternado sobre fita sense e antisense foi gerado com um nucleotídeo 2’-OMe 5’-terminal sobre a fita antisense e uma fita 2’-F 5’-terminal sobre a fita sense. As duas fitas são protegidas por um inv(dT) na sobreposição 3’-terminal. A fita antisense continha um grupo 5’-fosfato para manter a atividade do siRNA. À extremidade 5’ da fita sense, um ligante de GalNAc-palmitoíla foi conjugado para permitir o direcionamento a hepatócitos pelo receptor de asialiloglicoproteína expresso sobre essas células. siRNA (2,5 mg/kg) foi coadministrado com polímero de fornecimento de PBAVE dirigido a GalNAc (15 mg/kg) em camundongos.
[0355] Medições de mRNA FVII foram realizadas a partir de homogeneizados do fígado utilizando o Kit de Teste de DNA ramificado QuantiGene 1.0 (bDNA) (Panomics, Fremont, Califórnia, Estados Unidos, Cat. n° QG0004).
[0356] Na necropsia, 1 a 2 g de tecido do fígado foram congelados em nitrogênio líquido. O tecido congelado foi pulverizado com pistão e almofariz sobre gelo seco. 15 a 25 mg de tecido foram transferidos para um tubo de reação de 1,5 ml resfriado, adicionou-se 1 ml de mistura de lise 1:3 previamente diluída em água MilliQ e 3,3 μl de proteinase K (50 μg/μl) e o tecido foi lisado por vários segundos de sonicação ultrassônica em 30%-50% de pó (HD2070, Bandelin, Berlim, Alemanha). Lisatos foram armazenados a - 80°C até análise. Para análise de mRNA, o lisato foi descongelado e digerido com Proteinase K por quinze minutos a 1000 rpm em um termomisturador a 65 °C (termomisturador Comfort, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). Os níveis de mRNA de FVII e GAPDH foram determinados utilizando reagentes do Kit de Teste de bDNA QuantiGene 1.0 de acordo com as recomendações do fabricante. A expressão de mRNA de FVII foi analisada utilizando 20 μl de lisato e um conjunto de sonda FVII de camundongo. A expressão de mRNA de GAPDH foi analisada utilizando 40 μl de lisato e demonstrou-se que conjuntos de sonda de Rattus norvegicus apresentam reação cruzada com camundongos (sequências de conjuntos de sonda, vide acima). Como leitura de teste, o sinal de quimioluminescência ao final do teste foi medido em um contador de luminescência Victor 2 Light (Perkin Elmer, Wiesbaden, Alemanha) na forma de unidades de luz relativas (RLU). O sinal de mRNA de FVII foi dividido pelo sinal de mRNA de GAPDH do mesmo lisato. Os valores são relatados como expressão de mRNA de FVII normalizada em GAPDH.
[0357] Os resultados demonstram knockdown de mRNA de FVII de 79% em 48 horas após a dosagem, depois da administração de SEQ ID N° par 179/166. Por outro lado, o nucleotídeo 2’-OH que contêm siRNA SEQ ID N° par 180/168 não exibiu knockdown significativo (< 25%), conforme exibido na Tabela 5.
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EXEMPLO 43 DISTRIBUIÇÃO EM TECIDOS DE SIRNAS QUE NÃO CONTÊM RESÍDUOS DE 2’-OH:
[0358] A concentração de siRNA nas amostras de tecido do fígado foi determinada utilizando um método de detecção de oligonucleotídeos patenteado conforme descrito em WO 2010043512. Resumidamente, a quantificação de siRNA é baseada na hibridização de uma sonda de PNA marcada de forma fluroescente (Atto-425) (Atto425-OO-GCAAAGGCGTGCCAACT, obtida por meio da Panagene Inc., Coreia) compelementar à fita antisense do duplex de siRNA, seguida por separação com base em HPLC AEX. A quantificação foi realizada por meio de detecção de fluorescência contra uma curva de calibragem externa que foi gerada a partir de uma série de diluição de dois siRNAs de FVII utilizados no experimento in vivo (vide Exemplo 42). Foram injetadas, para amostras de plasma, de 0,2 a 2 μl e, para tecido, parcelas de cerca de 1 mg no sistema de HPLC.
[0359] Análise de tecido do fígado do siRNA estabilizado que não contém nucleotídeo 2’-OH exibiu altas concentrações de fita antisense intacta no fígado na faixa de μg/g, mas cerca de 95% estavam presentes na forma inativa 5’-desfosforilada (vide a Tabela 6). O RNA resultante com um nucleotídeo 2’-OMe terminal não é propenso à refosforilação no citoplasma pela fosfoquinase hClp1 (vide abaixo). Por outro lado, a fita antisense do siRNA que contém 2’-OH foi completamente degradada no tecido dentro das primeiras seis horas após a dosagem.
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EXEMPLO 44
[0360] Atividade de knockdown in vitro de siRNAs com extremidades 5’ otimizadas: - Foi conduzida seleção in vitro adicional de siRNAs de FVII a fim de identificar siRNAs que podem ser (re)fosforilados de forma intracelular na extremidade 5’ sem sentido para resultar na substância competente para RNAi. Todos os siRNAs da presente seleção são exibidos na Tabela 7. O padrão de modificação 2’-OMe/2’-F alternado foi idêntico ao projeto de primeira geração (sem nenhum resíduo de 2’-OH) com exceção de várias modificações nos dois primeiros nucleotídeos na extremidade 5’ da fita antisense. Os dois nucleotídeos 5’-terminais da fita antisense foram gerados na forma de nucleotídeos modificados por 2’-F ou 2’-deóxi em várias combinações com e sem um 5’-fosfato ou 5’-fosfotioato adicional. Todos os siRNAs foram selecionados em reação de dosagem (24 nM a 0,00037 nM em diluições em quatro vezes) para atividade de knockdown após a transfecção de hepatócitos de camundongos primários (30.000 células por cavidade; formato de placas de 96 cavidades) utilizando Lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante. Dois siRNAs foram comparáveis e ativos para o duplex parental (SEQ ID N° par 182/168); siRNAs ativos comparáveis: SEQ ID N° pares 181/186 e 181/185) em termos de valores IC50, um com 2’-F 5’-terminal e um grupo fosfato e um com dois nucleotídeos 2’-deóxi 5’-terminais e um 5’-fosforotioato (vide Tabela 7 para valores IC50). Ambos são cerca de cinco a seis vezes mais ativos em comparação com o siRNA (SEQ ID N° par 181/166) utilizado no primeiro experimento com animais com o nucleotídeo 2’-OMe terminal. EXEMPLO 45
[0361] Fosforilação 5’ in vitro de siRNAs com terminais 5’ otimizados: - Todos os siRNAs sem 5’-fosfato nem 5’-fosforotioato listados na Tabela 7 foram testados para determinar fosforilação por hClp1 em um extrato celular HeLa S100.
[0362] A fosforilação 5’ foi analisada a partir de extratos de HeLa S100 conforme descrito por Weitzer e Martinez (S. Weitzer e J. Martinez, hClp1: A Novel Kinase Revitalizes RNA Metabolism, Cell Cycle 6 (17): 21332137, 2007). Diretamente após a incubação de 1 μM de siRNAs no extrato de HeLa S100 contendo 5 mM de ATP, a solução foi analisada por meio de HPLC RP IP ou HPLC AEX sob condições de desnaturação por meio da injeção de 5 μl de solução de amostra: a. HPLC RP IP foi realizada empregando uma coluna Waters XBridge C18 (2,5 x 50 mm, tamanho de partícula de 2,5 μm) sob temperatura de coluna de 65 °C. Realizou-se eluição de gradiente utilizando 100 mM de hexafluoroisopropanol (HFIP) e 16 mM de trietilamina em metanol a 1% como eluente A e composição A em 95% de metanol como eluente B. Foi empregado um gradiente de 1% de B a 18% de B em trinta minutos; e b. AEX-HPLC foi realizada sobre uma coluna Dionex DNA Pac200 (4 x 250 mm) a 50 °C utilizando um tampão de 20 mM de fosfato contendo 10% de ACN sob pH = 11. O eluente B continha 1 M de NaBr em eluente A. Foi empregado um gradiente de 25% a 62% de B em 18 minutos.
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[0363] A razão de fosforilação 5’ é calculada para cada fita de siRNA do traço de UV a 260 nm utilizando a equação a seguir (PA é a área de pico): % (5’-fosforilação) = 100 * PA [fita 5’-fosforilada] / (PA [fita 5’-fosforilada] + PA [fita parental])
[0364] Exibe-se na Tabela 8 que a fita antisense de um siRNA não pode ser 5’-fosforilada quando um nucleotídeo 2’-OMe estiver localizado no terminal 5’ (SEQ ID N° par 181/196 e SEQ ID N° par 181/195). Por outro lado, a fita antisense é susceptível a 5’-fosforilação, quando um nucleotídeo 2’- F, 2’-deóxi ou 2’-OH for incorporado no terminal 5’ (SEQ ID N° par 181/195, SEQ ID N° par 181/192, SEQ ID N° par 181/197, SEQ ID N° par 181/199 e SEQ ID N° par 182/168). Os dois siRNAs, que foram comparativamente ativos no teste in vitro como SEQ ID N° par 182/168 (SEQ ID N° par 181/186 e 181/185), são susceptíveis a 5’-fosforilação porque o grupo 5’-fosfato/5’-PTO introduzido sinteticamente é dividido in vivo, por exemplo, por fosfatases. TABELA 8 PERCENTUAL DE FITA 5’-FOSFORILADA APÓS QUATRO HORAS DE INCUBAÇÃO EM EXTRATO DE CÉLULAS HELA S100
[0365] Chave: as letras minúsculas a, c, g, u são 2’-O-metil nucleotídeos; as letras maiúsculas A, C, G, U seguidas por “f” indicam um 2’- fluoronucleotídeo.(invdT) representa uma deoxitimidina invertida (ligado 3’-3’). Ligações de fosforotioato são simbolizadas com um “s’ minúsculo. dT é deoxitimidina.
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EXEMPLO 46 ESTABILIDADE EM DNASE II IN VITRO DE SIRNAS COM EXTREMIDADES 5’ OTIMIZADAS:
[0366] Todas as fitas antisense foram selecionadas para determinar a estabilidade de DNAse II conforme descrito no Exemplo 41. As duas fitas antisense presentes nos siRNAs que foram comparáveis ativas para o duplex parental (SEQ ID N° 186 e SEQ ID N° par 185, um com 2’-F 5’-terminal e um grupo fosfato e uma com dois nucleotídeos 2’- deóxi 5’-terminais e um 5’-fosforotioato) são estáveis para a divisão II de DNAse II (>70% fita intacta após vinte horas de incubação). TABELA 9 ESTABILIDADE IN VITRO DE SIRNAS PARA DNASE II APÓS VINTE HORAS DE INCUBAÇÃO
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EXEMPLO 47 ATIVIDADE DE KNOCKDOWN IN VITRO DE SIRNAS COM EXTREMIDADES 5’ OTIMIZADAS:
[0367] A fim de avaliar se a melhoria in vitro por extremidades 5’ otimizadas é transferida para a situação in vivo, conduzimos experimentos com camundongos adicionais com conjugados de GalNAc-palmitoíla de siRNAs selecionados (vide a Tabela 10). siRNAs foram administrados sob condições idênticas às descritas para o primeiro experimento com camundongos (Exemplo 42, o presente pedido de patente). Para medição de níveis de FVII, amostras de plasma de camundongos foram preparadas por meio de coleta de sangue (nove volumes) por meio de sangramento abaixo da mandíbula em tubos de microcentrifugação contendo 0,109 mol/l de anticoagulante citrato de sódio (um volume) seguindo procedimentos padrão. A atividade de FVII em plasma foi medida com um método cromogênico utilizando um kit BIOPHEN VII (Hyphen BioMed/Aniara, Mason OH) seguindo recomendações do fabricante. A absorção de desenvolvimento colorimétrico foi medida utilizando um leitor de microplacas Tecan Safire2 a 405 nm.
[0368] Os siRNAs em investigação exibiram maior atividade in vivo, em total correlação com os resultados de seleção in vitro. A atividade de FVII em soro foi reduzida em mais de 80% para os dois siRNAs 48 horas após a dosagem, em comparação com 49% utilizando o projeto de siRNA de primeira geração (vide a Tabela 10). Este resultado salienta claramente a importância de um nucleotídeo 5’- trminal sobre a fita antisense que pode ser efetivamente fosforilada, caso fosfatases in vivo dividam o grupo 5’-fosfato ou 5’-fosfotioato gerado sinteticamente. Caso um nucleotídeo 2’-OMe 5’-terminal conforme utilizado no projeto inicial ou descrito na literatura como projeto de siRNA mais potente com base em comparação in vitro com siRNAs canônicos (Allerson et al, J. Med. Chem. 2005, 48, 901-904), a divisão do fosfato sintético in vivo geraria forte redução da potência do siRNA correspondente. TABELA 10 ATIVIDADE DE KNOCKDOWN IN VITRO DE SIRNAS COM EXTREMIDADES 5’ OTIMIZADAS
[0369] Chave: as letras minúsculas a, c, g, u são 2’-O-metil nucleotídeos; as letras maiúsculas A, C, G, U seguidas por “f” indicam um 2’- fluoronucleotídeo. “p” minúsculo indica um 5’-fosfato. (invdT) representa uma deoxitimidina invertida (ligado 3’-3’). Ligações de fosforotioato são simbolizadas com um “s’ minúsculo.(NHC6) é o ligante de amino-hexila incorporado na extremidade 5’ da fita sense.GalNAc designa a estrutura de fórmula (IV).
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EXEMPLO 48 ATIVIDADE DE KNOCKDOWN IN VITRO DE SIRNAS COM EXTREMIDADES 3’ OTIMIZADAS:
[0370] Para aumentar ainda mais a atividade dos siRNAs estáveis em DNAse II, foi realizado um estudo SAR da sobreposição 3’. Várias combinações de invdT, dTinvdT ou dTsdT sobre a sobreposição 3’ da fita sense ou antisense foram aplicadas a siRNAs dirigidos a EGFP e Aha1 (vide as Tabelas 11 e 12, respectivamente) e foram comparadas em pares para determinar a composição das duas extremidades 3’ nos siRNAs mais potentes. Todos os siRNAs foram selecionados em reação de dosagem (24 nM a 0,00037 nM em diluições em quatro vezes) para atividade de knockdown após a transfecção de hepatócitos de camundongos primários (30.000 células por cavidade; formato de placas de 96 cavidades) utilizando Lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante. TABELA 11 ATIVIDADE DE KNOCKDOWN IN VITRO DE SIRNAS DIRIGIDOS A EGFP COM EXTREMIDADES 3’ DIFERENTES
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TABELA 12 ATIVIDADE DE KNOCKDOWN IN VITRO DE SIRNAS DIRIGIDOS A AHA1 COM EXTREMIDADES 3’ DIFERENTES
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[0371] Concluímos que siRNAs com duas sobreposições de dTsdT de nucleotídeos sobre a fita antisense apresentaram resultados sempre melhores que uma única sobreposição de invdT na extremidade 3’ sem sentido (embora as fitas sense fossem as mesmas). Foi de benefício adicional a combinação com uma fita sense modificada com uma única sobreposição de invdT como sobreposição 3’. EXEMPLO 49 ATIVIDADE DE KNOCKDOWN IN VIVO DE SIRNAS EM PRIMATAS NÃO HUMANOS:
[0372] Preparação de DPCs e dosagem: - DPCs foram preparados por meio da ligação covalente de polímero “149 RAFT” ao Fator VII de coagulação direcionado a siRNA indicado (siF7) em razão 4:1 peso:peso (polímero:siRNA) por meio de uma ligação de dissulfeto e, em seguida, modificação do conjugado de polímero e siRNA com uma mistura 2:1 peso:peso de CDM-PEG:CDM-NAG em razão 7x peso:peso (CDM:polímero). Macacos Cynomolgous foram dosados com 1 mg/kg de DPC (peso de polímero) e 0,25 mg/kg do siRNA indicado. Um animal recebeu DPC contendo siF7 SEQ ID N° par 151/152, dois animais receberam DPC contendo siF7 SEQ ID N° par 253/254), n° 1 e n° 2) e dois animais receberam DPC contendo SEQ ID N° par 251/255, n° 1 e n° 2). Os valores F7 foram normalizados na média dos dois valores antes da dosagem. Animais que recebem DPCs contendo SEQ ID N° par 253/254 ou SEQ ID N° par 251/255 continham níveis maiores de knockdown de F7 e PT mais longo que o animal que recebe SEQ ID N° par 251/252.
[0373] Procedimento de injeção de DPC: - Para cada procedimento de injeção, os animais receberam injeção IM contendo uma combinação de cetamina (até 7 mg/kg) e dexmedetomidina (até 0,03 mg/kg) e foram removidos para uma sala de procedimentos. Na sala de procedimentos, os animais foram colocados sobre uma almofada de aquecimento com camisa de água e o local da injeção foi raspado e preparado com um antisséptico. Um cateter intravenoso (20 a 22 gauge) foi inserido em uma veia sistêmica (cefálica ou safenosa pequena) e a solução de DPC foi mantida em infusão (2 ml/kg) lentamente por um a dois minutos. Utilizou-se um oxímetro de pulso para monitorar os batimentos cardíacos e saturação de oxigênio durante e imediatamente após o procedimento de injeção. Cada procedimento de injeção levou cerca de vinte minutos para ser realizado. Após a injeção, o cateter foi removido e aplicou-se pressão suave ao local da venopunção. Os animais foram levados de volta para as suas gaiolas e receberam injeção IM da droga reversa atipamezol (antisedan) (0,10 a 0,15 mg/kg). Os animais foram monitorados até atingirem novamente a atividade normal.
[0374] Procedimento de coleta de sangue: - Amostras de sangue (1 a 5 ml) foram obtidas para medição da inibição genética (atividade F7, tempo de coagulação), químicas do sangue e marcadores de lesões no fígado (CBC, quadro de química, ALT, citoquinas, complemento). Para esses procedimentos de coleta de sangue, os animais receberam injeção IM contendo uma combinação de cetamina (até 7 mg/kg) e dexmedetomidina (até 0,03 mg/kg). Uma vez sedados, os animais foram movidos para uma mesa portátil de procedimentos e uma agulha de 22 gauge e seringa foram utilizadas para coletar sangue da veia femoral. Imediatamente após a coleta de sangue, aplicou-se pressão ao local da venopunção e o sangue foi dividido nos tubos de amostra apropriados para cada exame de sangue. Os animais receberam em seguida uma injeção IM da droga reversa atipamezol (antisedan) (0,10 a 0,15 mg/kg) e retornaram para a sua gaiola. Não mais de 20% do volume total de sangue foram retirados em qualquer período de trinta dias (volume de sangue estimado = 60 ml/kg). Cada procedimento de coleta de sangue levou cerca de dez minutos para ser realizado.
[0375] Medições da atividade de Fator VII (F7): - Amostras de sangue de primatas não humanos foram preparadas por meio de enchimento de tubos separadores de soro com sangue integral e permitindo-se a coagulação do sangue à temperatura ambiente por pelo menos vinte minutos. Após a coagulação, tubos de sangue foram centrifugados por três minutos a 9000 rpm, parcelados em tubos Eppendorf e armazenados a -20 °C até o teste. A atividade de F7 em plasma foi medida com um método cromogênico utilizando um kit BIOPHEN VII (Hyphen BioMed/Aniara, Mason OH) seguindo recomendações do fabricante. A absorção de desenvolvimento colorimétrico foi medida utilizando um leitor de microplacas Tecan Safire2 a 405 nm.
[0376] Testes de coagulação (tempo de protrombina, tempo de protrombina parcial e fibrinogênio): - Amostras de sangue de primatas não humanos foram preparadas por meio do enchimento completo de tubos de citrato de sódio (BD Vacutainer) com sangue integral e suave mistura para evitar a formação de coágulos. Os tubos foram transportados para um laboratório de testes clínicos em uma hora e foram realizados testes de coagulação em até quatro horas a partir do momento da coleta. TABELA 13 DSRNAS FVII UTILIZADOS PARA EXPERIMENTO DE NHP
[0377] Chave: as letras minúsculas a, c, g, u são 2’-O-metil nucleotídeos; as letras maiúsculas A, C, G, U seguidas por “f” indicam um 2’- fluoronucleotídeo. “p” minúsculo indica um 5’-fosfato. (invdT) representa uma deoxitimidina invertida (ligado 3’-3’). Ligações de fosforotioato são simbolizadas com um “s’ minúsculo. dT é deoxitimidina. NH2C6 é o ligante de amino-hexila incorporado na extremidade 5’ da fita sense.
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[0378] Alteração de uma única sobreposição (invdT)-3’ de nucleotídeo sobre as duas fitas para um projeto de siRNA assimétrico com sobreposição 3’-(invdT) sobre a fita sense e sobreposição dTsdT sobre a fita antisense, mas com padrão de modificação constante de outra forma, gera redução mais pronunciada de FVII em soro e duração significativamente prolongada desse efeito em primatas não humanos (vide a Figura 6a). Esta observação é sustentada por uma consequência biológica esperada, nomeadamente um efeito mais pronunciado sobre o tempo de protrombina correspondente à extensão da redução de Fator 7 (vide Figura 6b). EXEMPLO 50
[0379] Atividade de knockdown in vivo de siRNAs com ligantes de RNA divisíveis: - Na Tabela 14, a eficácia in vivo com base na inibição de proteína FVII em soro foi comparada utilizando colesterol ou o conjugado de siRNA de GalNAc-palmitoíla no mesmo contexto de sequência em camundongos. O experimento in vivo foi conduzido conforme descrito no Exemplo 42. A inibição de FVII foi fortemente reduzida para os siRNAs conjugados a colesterol que não continham nucleotídeo 2’-OH em comparação com os correspondentes conjugados a GalNAc-palmitoíla (SEQ ID N° par 179/166 x 179/190, SEQ ID N° par 257/264 x SEQ ID N° par 179/262, SEQ ID N° par 257/263 x SEQ ID N° par 179/163 e SEQ ID N° par 257/166 x SEQ ID N° par 179/166). Por outro lado, para siRNA que contém 2’-OH, o conjugado de colesterol gera inibição de FVII mais alta em comparação com o derivado de GalNAc-palmitoíla (SEQ ID N° par 180/168 x SEQ ID N° par 258/168).
[0380] Os ligantes de moléculas pequenas GalNAc-palmitoíla e colesterol utilizados no experimento in vivo descrito são conectados ao siRNA por meio de um ligante não divisível à extremidade 5’ da fita sense. Caso a fita sense exiba nucleotídeos 2’-OH, o ligante ainda é divisível por nucleases (tais como DNase II no compartimento endossomal ou lisossomal). A reação de divisão libera o siRNA livre que é liberado em seguida no citoplasma pela atividade perturbadora endossomal do polímero de fornecimento.
[0381] Para siRNAs que não contêm um nucleotídeo 2’-OH na fita sense, os ligantes são conectados de forma estável ao duplex, pois nenhum mecanismo enzimático (nuclease/protease/esterase etc.) ou químico aciona a divisão do ligante. siRNA conjugado a colesterol totalmente estável, portanto, pode ser capturado em membranas celualres devido à interação com a membrana do ligante de colesterol lipofílico. Mesmo altas concentrações do siRNA no tecido não são suficientes para a liberação efetiva do siRNA no citoplasma. Por outro lado, o siRNA conjugado a GalNAc-palmitoíla menos lipofílico pode ser liberado no citoplasma, devido à interação menos pronunciada com membranas celulares. Por esta razão, um conjugado de siRNA de GalNAc-palmitoíla não divisível estável é mais eficaz em comparação com um colesterol conjugado ao mesmo siRNA.
[0382] O desenvolvimento de construções de ligantes divisíveis ajudaria a superar a questão de captura na membrana de siRNA conjugado a colesterol de forma estável. O uso de química de ligantes de dissulfeto é descrito como possibilidade atraente de introdução de um local de divisão definido. A divisão é restrita, entretanto, à redução de organelas no interior da célula (PNAS, 2006, 103, 13872). Como se espera que a divisão seja lenta no compartimento endossomal/lisossomal, a maior parte do siRNA conjugado a dissulfeto e colesterol pode ainda ser capturada em membranas conforme descrito para os conjugados de colesterol não divisíveis.
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[0383] Além da química de ligante divisível de dissulfeto bem estabelecida, outra possibilidade é a geração de locais de divisão definidos utilizando nucleotídeos 2’-OH em certas posições. A introdução de nucleotídeos 2’-OH em posições seletivas é uma nova abordagem para atingir a divisão dos conjugados a partir de fitas de RNA. Os nucleotídeos 2’-OH podem ser implementados por meio da adição de sobreposições de fita simples com pelo menos um nucleotídeo 2’-OH na extremidade 3’ ou 5’ da fita de RNA ou utilizando nucleotídeos 2’-OH dentro da região duplex de um siRNA. A atividade enzimática de nucleases presentes no endossomo/lisossomo divide- se seletivamente nessas posições. Em um primeiro projeto, o colesterol foi conectado à fita sense por meio de uma sobreposição de fita simples contendo três nucleotídeos 2’-OH (AUC) no terminal 5’.
[0384] siRNAs conjugados a colesterol comparando diversas químicas de ligação divisíveis são exibidos na Tabela 15. Todos os siRNAs possuem contexto de sequências idêntico e apenas a química de ligantes foi alterada. Colesterol foi conectado à fita sense por meio de uma sobreposição de fita simples composta de três nucleotídeos 2’-OH (AUC) ao terminal 5’. Quando coadministrado com um polímero de fornecimento, esse siRNA (SEQ ID N° par 260/263) gera 77% de modulação para baixo de FVII em soro em camundongos, em comparação com apenas 60% ao utilizar o siRNA idêntico com um colesterol ligado de forma estável (SEQ ID N° par 257/263). O mesmo siRNA com um colesterol conjugado por meio de um ligante de acordo com a Fórmula Ia ao terminal 5’ da fita sense (SEQ ID N° par 261/263) gera 93% de redução da atividade de FVII em soro. Todos os resultados foram atingidos por meio de coadministração de 15 mg/kg de um polímero de fornecimento com 2,5 mg/kg do siRNA conjugado a colesterol em camundongos.
[0385] Estes resultados indicam que o uso de um ligante divisível aumenta a potência in vivo de siRNAs que não contêm nucleotídeo 2’-OH. O ligante divisível pode ser compreendido de nucleotídeos que contêm 2’-OH, um motivo de divisão de dipeptídeo ou uma química de ligante de dissulfeto. Todas as construções de ligantes divisíveis aumentam a potência in vivo em uma configuração de coadministração de siRNAs conjugados a colesterol com um polímero de fornecimento de liberação endossomal lenta. TABELA 15 COMPARAÇÃO IN VIVO DE DIVERSAS QUÍMICAS DE LIGANTES PARA SIRNAS CONJUGADOS A COLESTEROL
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EXEMPLO 51 ESTABILIDADE EM SORO IN VITRO DE SIRNAS COM LIGANTES DIVISÍVEIS:
[0386] A estabilidade do ligante divisível foi avaliada em um teste de estabilidade in vitro. As fitas sense conjugadas a colesterol foram incubadas em soro de camundongo a 90% a 37°C por diversos momentos. A reação de incubação foi suspensa por meio da adição de proteinase K em um tampão contendo dodecil sulfato de sódio (SDS). O tratamento degrada todas as proteínas e enzimas sem interferir com a integridade da fita de RNA. 25 μl desta solução foram injetados diretamente em um sistema HPLC AEX conectado a um detector de UV a 260 nm. HPLC AEX foi realizada sobre uma coluna Dionex DNA Pac200 (4x250mm) a 75 °C utilizando um tampão de 20 mM de Tris contendo 50% de ACN sob pH = 8. 800 mM de NaBr em eluente B servem de sal eluente. Foi empregado um gradiente de 25% a 62% de B em 18 minutos.
[0387] O RNA de fita simples que contém colesterol é eluído da coluna de HPLC na forma de pico amplo a 260 nm. Após a divisão do colesterol, são observados picos simétricos agudos em tempo de retenção inferior. A velocidade de divisão de colesterol foi determinada pela equação a seguir (PA = área de pico): % (RNA livre) = 100 * PA [RNA livre] / (PA [RNA livre] + PA [RNA conjugado a colesterol])
[0388] Demonstrou-se in vitro que a sobreposição de nucleotídeo 3nt (AUC) é dividida quantitativamente em menos de uma hora em soro de camundongo a 90%. A divisão ocorre a 3’ dos dois nucleotídeos de pirimidina na sobreposição, gerando dois metabólitos de divisão distintos (as áreas de pico de metabólitos foram resumidas para avaliação de dados). Por outro lado, o ligante que contém dipeptídeo de acordo com a Fórmula 1a, o dissulfeto e o colesterol ligado de forma estável são totalmente estáveis em soro de camundongo. EXEMPLO 52
[0389] Distribuição em tecido de siRNAs com ligantes divisíveis: - Estes resultados indicam que o uso de um ligante divisível aumenta a potência in vivo de siRNAs que não contêm nucleotídeo 2’-OH. O ligante divisível pode ser compreendido de nucleotídeos que contêm 2’-OH, um motivo de divisão de dipeptídeo ou uma química de ligante de dissulfeto. Todas as construções de ligantes divisíveis aumentam a potência in vivo em uma configuração de coadministração de siRNAs conjugados a colesterol com um polímero de fornecimento de liberação endossomal lenta.
[0390] Resumidamente, a quantificação de siRNA é baseada na hibridização de uma sonda de PNA marcada de forma fluroescente (Atto-425) (Atto425-OO-TGAGTTGGCACGCCTTT, obtida por meio da Panagene Inc., Coreia) complementar à fita sense do duplex de siRNA, seguida por separação com base em HPLC AEX. A quantificação foi realizada por meio de detecção de fluorescência contra uma curva de calibragem externa que foi gerada a partir de uma série de diluição de dois siRNAs de FVII utilizados no experimento in vivo (vide Exemplo 42). Foram injetados, para amostras de plasma, de 0,2 a 2 μl e, para tecido, parcelas de cerca de 1 mg no sistema de HPLC.
[0391] Na Tabela 16, são exibidos os resultados de análise de tecido do fígado. Ao analisar-se o teor de siRNA, descobriu-se que a fita sense que está presente no tecido do fígado é dividida quantitativamente de colesterol ao utilizar-se o motivo ligante de dipeptídeo ou a sobreposição 5’ 3 nt com a sequência ligante não modificada AUC. Por outro lado, apenas 15% do siRNA ligado por dissulfeto que está presente no fígado são divididos de colesterol nas primeiras 48 horas após a dosagem e nenhum colesterol ligado de forma estável é dividido do siRNA.
[0392] Ao comparar-se as quantidades absolutas de siRNA livre de colesterol em tecido do fígado, foram encontradas quantidades similares para o ligante de dissulfeto e para o ligante AUC de RNA, em boa correlação com a atividade em soro de FVII igual 48 horas após a dosagem. A atividade de FVII mais baixa atingida com o siRNA de colesterol ligado por dipeptídeos correlaciona-se totalmente com a quantidade absoluta mais alta do siRNA livre de colesterol dividido.
[0393] A quantidade total de conjugado de siRNA de colesterol equipado com um ligante (AUC) sobre a fita sense fornecida para o fígado é cerca de seis vezes mais baixa em comparação com o colesterol ligado a dissulfeto ou de forma estável e cerca de três vezes mais baixa em comparação com o siRNA de colesterol conjugado a dipeptídeo. A presença em tecido reduzida pode ser atribuída ao fato de que o ligante de AUC não é apenas um substrato para nucleases intracelulares, mas também para nucleases presentes na circulação, conforme exibido na incubação in vitro com soro de camundongo. Quando o ligante de colesterol for dividido do siRNA já em circulação, o siRNA resultante é propenso à liberação renal e é rapidamente excretado na urina sem fornecimento para o tecido. TABELA 16
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EXEMPLO 53
[0394] Atividade de knockdown in vivo de siRNAs com ligantes de RNA divisíveis: - O experimento in vivo foi conduzido conforme descrito no Exemplo 50 em camundongos utilizando conjugados de siRNA de colesterol.
[0395] No Exemplo 50, o colesterol foi conectado à fita sense por meio de uma sobreposição de fita simples contendo três nucleotídeos 2’-OH (AUC) no terminal 5’ (SEQ ID N° par 260/263), que exibiram baixa estabilidade em soro conforme descrito no Exemplo 51. Isso gera concentração em tecido claramente reduzida em comparação com químicas de ligantes estáveis em soro conforme descrito no Exemplo 52. Combinação de apenas um ou dois nucleotídeos 2’-OH selecionados em conjunto com nucleotídeos 2’-OMe no ligante geram estabilidade em soro mais alta, mas mantêm a sensibilidade contra nucleases presentes no endossomo/lisossomo. A atividade enzimática de nucleases presentes no endossomo/lisossomo divide-se seletivamente nas posições dos nucleotídeos 2’-OH.
[0396] siRNAs conjugados a colesterol comparando diversos motivos de ligantes de nucleotídeos divisíveis encontram-se resumidos na Tabela 17. Todos os siRNAs possuem contexto de sequências idêntico e apenas a química de ligantes foi alterada. Colesterol foi conectado ao terminal 5’ da fita sense por meio de sobreposição de fita simples composta de três ou quatro nucleotídeos com números variáveis de nucleotídeos 2’-OH e 2’-OMe. Quando coadministrados com um polímero de fornecimento, todos os siRNAs geram modulação para baixo de FVII em soro em camundongos. O siRNA (SEQ ID N° par 276/282) gera redução de 87% da atividade de FVII em soro em 48 horas e 95% em 168 horas após a dosagem. O siRNA (SEQ ID N° par 277/282) gera redução de 79% da atividade de FVII em soro em 48 horas e 97% em 168 horas após a dosagem. Todos os resultados foram atingidos por meio da coadministração de 15 mg/kg de um polímero de fornecimento com 2,5 mg/kg do siRNA conjugado a colesterol em camundongos.
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[0397] Estes resultados indicam que o uso de um ligante de nucleotídeo que é estável em soro e divisível em endossomo/lisossomo aumenta ainda mais a potência in vivo de siRNAs em comparação com siRNAs com um ligante instável em soro. Todas as construções de ligantes divisíveis aumentam a potência in vivo em uma configuração de coadministração de siRNAs conjugados a colesterol com um polímero de fornecimento de liberação endossomal lenta.
[0398] Nas tabelas a seguir, siRNAs utilizados nos exemplos são resumidos:
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Claims (3)

1. OLIGONUCLEOTÍDEO, caracterizado por consistir na SEQ ID NO: 173, compreendendo: uma fita antisense com o padrão de modificação 5’-(w)- (Z1)-(Z2)- (Z3)na-3’; e uma fita sense com o padrão de modificação 5’-(Z3)ns-3’, em que: w é independentemente um 5’-fosfato ou 5’-fosfotioato ou H; Z1 é independentemente um nucleotídeo 2’-fluoro modificado ou um nucleotídeo 2’-deóxi; Z2 é independentemente um nucleotídeo 2’-deóxi ou nucleotídeo 2’-fluoro modificado; Z3 é independentemente um nucleotídeo 2’-O-metil modificado ou um nucleotídeo 2’-fluoro modificado ou um nucleotídeo 2’-deóxi; na é 8-23 e ns é 8-25.
2. OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser ligado covalentemente a um polímero de fornecimento.
3. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um oligonucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou um conjugado, que compreende dito oligonucleotídeo e colesterol.
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