CN110218728A - 一种新化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的化合物及其对肝源性疾病有关的mRNA干扰的应用。该化合物结构中含有siRNA和末端修饰链。通过末端修饰链，可以在这种siRNA正义链3’末端和反义链的5’末端引入数量不同的半乳糖胺，这样形成一个整体化合物结构。在这种siRNA末端引入的半乳糖胺总数量可以是三个或四个。通过体外细胞实验证明，相比引入三个半乳糖胺，在siRNA末端引入四个半乳糖胺的化合物与肝脏特有的去唾液酸糖蛋白受体具有更高的亲和性，其对HBV的HBsAg、HBeAg和DNA的抑制效果更好，因此在siRNA末端引入的半乳糖胺的总数量优选为四个。

Description

一种新化合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种新的化合物及其对肝源性疾病有关的mRNA干扰的应用。该化合物结构中含有siRNA和末端修饰链。通过末端修饰链，可以在这种siRNA正义链3’末端和反义链的5’末端引入数量不同的半乳糖胺，这样形成一个整体化合物结构。在这种siRNA末端引入的半乳糖胺总数量可以是三个或四个。通过体外细胞实验证明，相比引入三个半乳糖胺，在siRNA末端引入四个半乳糖胺的化合物与肝脏特有的去唾液酸糖蛋白受体具有更高的亲和性，其对HBV的HBsAg、HBeAg和DNA的抑制效果更好，因此在siRNA末端引入的半乳糖胺的总数量优选为四个。
背景技术
RNAi
RNAi(RNA干扰)于1998年，由安德鲁法厄(Andrew Z.Fire)等在秀丽隐杆线虫中进行反义RNA抑制实验时发现，并将这一过程称为RNAi。这一发现被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。自此以后，以RNAi为作用机理的siRNA作为潜在的基因治疗药物得到人们广泛的关注，2006年，安德鲁法厄与克雷格梅洛(Craig C.Mello)由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理医学奖。RNAi是在许多生物中，包括动物、植物和真菌，都可由双链RNA(dsRNA)触发的，在RNAi过程中，一种称为“Dicer”的酶将长链dsRNA切割或“切丁”成21～25个核苷酸长的小片段。这些小片段，被称为小干扰RNA(siRNA)，其与一种叫Argonaute蛋白结合后，siRNA被解开，其中的反义链根据碱基配对的规则可以与特定基因的mRNA靶序列结合。一旦结合，Argonaute蛋白就分裂mRNA，从而阻止其被用作翻译模板，进而阻止相关蛋白质的合成。
据统计，在人体内的疾病相关蛋白中，大约超过80％的蛋白质不能被目前常规的小分子药物以及生物大分子制剂所靶向，属于不可成药蛋白。旨在通过基因的表达、沉默等功能治疗疾病的基因治疗被业界认为是继化学小分子药物、生物大分子药物之后的第三代治疗药物，这种疗法在基因水平上实现对疾病的治疗，不受不可成药蛋白的制约。作为基因治疗中RNAi技术最主流的类型，RNAi技术是从mRNA的水平对疾病进行治疗，相比化学小分子药物及生物大分子药物在蛋白质水平的治疗具有更高的效率。利用RNAi技术，可以根据特定基因序列，设计出特异性高、抑制效果好的siRNA的正义链和反义链序列，通过固相合成这些单链序列，然后正义链与反义链在特定的退火缓冲液中按照碱基配对原则配对成siRNA，最后通过载体系统输送到体内相应靶点，降解目标mRNA，破坏目标mRNA作为翻译模板的功能，从而阻止相关蛋白的合成。
siRNA的递送系统
siRNA在血液和组织中不稳定，容易被核酸酶降解，为了提高siRNA的稳定性，可以通过对siRNA骨架和基团的修饰，但这些化学修饰只提供有限的免受核酸酶降解的保护作用并且可能最终影响siRNA的活性。因此，还需要相应的传递系统来保障siRNA安全高效的穿过细胞膜。由于siRNA分子质量较大，且带有大量负电荷，而且具有高水溶解性，所以自身无法顺利穿越细胞膜到达细胞内，脂质体基本结构是由亲水核和磷脂双分子层构成，具备类似生物膜的磷脂双分子层，拥有很高的生物相容性，所以脂质体一度成为最受欢迎，应用最广泛的siRNA载体。
脂质体介导的siRNA递送主要将脂质体将siRNA包裹到脂质体内，保护siRNA不被核酸酶降解，提高siRNA的通过细胞膜障碍的效率，从而促进细胞的吸收。例如阴离子脂质体、pH敏感性脂质体、免疫脂质体、膜融合脂质体(fusogenic liposome)和阳离子脂质等等，尽管取得了一定的进展，但脂质体本身容易引发炎症反应，给药前必须使用多种抗组胺和激素类如西利替嗪和地塞米松类等药物，以减少可能发生的急性炎症反应，因此在实际临床应用中并不适合所有治疗领域，尤其像慢性乙肝这一类治疗周期长的疾病，长期使用可能产生的积蓄毒性是潜在的安全隐患。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)
肝脏中去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，是肝细胞特异性表达的受体，是一种高效的内吞型受体。由于体内生理情况下各种糖蛋白在酶或酸水解唾液酸后，暴露出的次末端是半乳糖残基，所以ASGPR特异性结合的糖为半乳糖基，故又称半乳糖特异性受体。半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺等单糖和多糖分子对ASGPR有高亲和性。ASGPR主要生理功能是介导血液中去唾液酸糖蛋白、脂蛋白等物质的清除，且与病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏疾病的发生发展有着密切联系。ASGPR这一特性的发现，对肝源性疾病的诊断及治疗起着重要作用(AshwellG、HarfordJ，Carbohydrate specific Receptors of the Liver[J]，AnnRevBiochem 1982 51:531-554)。结构中含有半乳糖或半乳糖胺及其衍生物的肝源性疾病治疗药物可以特异性地与ASGPR亲和，从而具有主动肝靶向性，不需要其它的载体系统来输送。当前siRNA类药物在利用ASGPR的这一特性给药机制方面的研究已取得了突破性的进展，尤其在慢性乙型肝炎的新药研发方面，目前美国的两家专门从事siRNA类药物研发的公司Arrowhead和Alnylam分别开发的带有半乳糖胺结构的siRNA类药物ARO-HBV和ALN-HBV02都已处于I/II临床阶段。Arrowhead公司的ARO-HBV是siARNA的正义链的5’末端，通过连接链引入三个半乳糖胺；Alnylam公司的ALN-HBV02是在siRNA正义链的3’末端，通过连接链引入三个半乳糖胺。上述药物引入半乳糖胺的部位都在正义链上，而且引入的都是三个半乳糖胺。
发明内容
本发明涉及一种新的化合物及其对肝源性疾病有关的mRNA干扰的应用。该化合物结构中含有siRNA和末端修饰链。通过末端修饰链，可以在这种siRNA正义链3’末端和反义链的5’末端引入数量同的半乳糖胺，这样形成一个整体化合物结构。这种siRNA末端引入的半乳糖胺总数量可以是三个或四个。通过体外细胞实验证明，相比引入三个半乳糖胺，在siRNA末端引入四个半乳糖胺的化合物与肝脏特有的去唾液酸糖蛋白受体具有更高的亲和性，其对HBV的HBsAg、HBeAg和DNA的抑制效果更好，因此在siRNA末端引入的半乳糖胺的总数量优选为四个。
本发明所述的化合物是结构中含有siRNA和末端修饰链，其特征在于，其结构为通式(I)或(I’)所示：
其中，n和m分别为1-3的正整数，且n和m之和为3或4，优选为4；优选地，n为1，m为3或n为3，m为1；更优选地，n为1，m为3。
所述siRNA的正义链和反义链序列为：
正义链：CCGUGUGCACUUCGCUUCAUA
反义链：UGAAGCGAAGUGCACACGGUU
其中，核苷酸的核糖的2’位可以用甲氧基或氟原子取代；核苷酸之间部分可以通过3’-O→5’-O硫代磷酸酯基团连接，所述修饰使修饰后的siRNA在细胞内抵抗核酸酶降解的能力增强。
所述末端修饰链是由连接链D、接头B、含有位阻稳定结构的支链L和肝靶向特异性配体X组成，该末端修饰链的通式(II)为：
当n或m＝1时，结构通式(II)为：
当n或m＝2时，结构通式(II)为
当n或m＝3时，结构通式(II)为：
所述肝靶向特异性配体X可以是一种或多种多糖、多糖衍生物或单糖和单糖衍生物。
优选地，所述肝靶向特异性配体X的通式(III)为：
其中，R1、R2和R3分别为氢或羟基保护基。
进一步优选地，所述肝靶向特异性配体X选自以下结构中的一种或多种：
其中，R1选自OH和NHCOOH中的一种或两种。
所述含有位阻稳定结构的支链L选自如下结构中的一种或多种：
其中，n1是1-10的正整数，m为1-5的正整数，n2为0-20的整数，n3为1-12的正整数，Z为H或CH3。
所述接头B选自以下结构式：
其中，A1是C、O、S或NH；r1为1-15的正整数；A2选自C1-C10直链烷烃，或者带有氨基、羰基、酰胺基、磷酰根、硫代磷酰基、氧原子或硫原子的C1-C10直链烷烃或者环状化合物；r2为0-15的整数。
优选地，所述接头B选自以下结构式：
其中，r1、r3、r4、r5分别为1-15的正整数；r6为1-20的正整数，r7为2-6的正整数，r8为1-3的正整数。
进一步优选地，所述接头B选自以下结构：
所述连接链D选自带有羰基、酰胺基、氧原子、硫原子、硫代磷酰基、磷酰基或环状结构的烷烃。
优选地，所述连接链D选自以下结构中的一种：
其中，每个n为1-20的正整数，且每个n为相同或不同的正整数。
进一步优选地，所述连接链D选自以下结构中的一种：
优选地，所述通式(I)中的[B-(L-X)n或m]结构,可以依据n和m的数量不同，从以下含有与n或m个半乳糖胺数量的结构式中进行选择：
进一步优选地，所述通式(I)为Kylo-04-DS12、Kylo-04-DS13、Kylo-04-DS22、Kylo-04-DS21、Kylo-04-DS31所示结构中的一种：
本发明提供的上述化合物在制备用于治疗肝源性疾病的药物中的应用。
所述肝靶向特异性配体X是针对肝脏中去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异性的，所述肝源性疾病为慢性乙型肝炎。
本发明还提供了一种的药物组合物，其包含上述化合物和药学上可接受的辅料，其剂型可以优选为皮下注射剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)与脂质体介导的siRNA递送相比：脂质体介导的siRNA递送主要是脂质体将siRNA包裹到脂质体内，保护siRNA不被核酸酶降解，提高siRNA的通过细胞膜障碍的效率，从而促进细胞的吸收。脂质体例如阴离子脂质体、pH敏感性脂质体、免疫脂质体、膜融合脂质体(fusogenic liposome)和阳离子脂质等等，尽管取得了一定的进展，但脂质体本身容易引发炎症反应，给药前必须使用多种抗组胺和激素类如西利替嗪和地塞米松类等药物，以减少可能发生的急性炎症反应，因此在实际临床应用中并不适合所有治疗领域，尤其像慢性乙肝这一类治疗周期长的疾病，长期使用可能产生的积蓄毒性是潜在的安全隐患。
(2)与带有三个半乳糖胺结构的siRNA在抑制HBV的HBsAg效果进行比较：目前处于I/II期的治疗慢性乙型肝炎的siRNA药物有ARO-HBV和ALN-HBV02。ARO-HBV是在siARNA的正义链的5’末端，通过连接链引入三个半乳糖胺；ALN-HBV02是在siRNA正义链的3’末端，通过连接链引入三个半乳糖胺。上述药物引入半乳糖胺的部位都在正义链上，而且引入的都是三个半乳糖胺。本发明提供的化合物中的siRNA正义链3’末端和反义链的5’末端引入数量不同的半乳糖胺，这样形成一个整体化合物结构。在这种siRNA末端引入的半乳糖胺总数量可以是三个或四个。通过体外细胞实验证明，相比引入三个半乳糖胺，在siRNA末端引入四个半乳糖胺的化合物与肝脏特有的去唾液酸糖蛋白受体具有更高的亲和性，其对HBV的HBsAg、HBeAg和DNA的抑制效果更好，因此在siRNA末端引入的半乳糖胺的总数量优选为四个。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图说明：
图1为Kylo-04-DLyiC5的高分辨率质谱图；
图2为Kylo-04-DLsanC5的高分辨率质谱图；
图3为DLyic-c11的高分辨率质谱图；
图4为Erc-c12的高分辨率质谱图；
图5为DLSanc-c12的高分辨率质谱图；
图6为对HepG2.2.15细胞中HBsAg的抑制效果柱状图；
图7为对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制效果柱状图；
图8为对HepG2.2.15细胞中HBVDNA的抑制效果柱状图。
具体实施方式
1、合成用于修饰siRNA的正义链3’末端的带有1个、2个和3个半乳糖胺的修饰链化合物。
2、合成用于修饰siRNA的反义链5’末端的带有1个、2个和3个半乳糖胺的修饰链化合物。
3.3’末端被修饰的正义链合成
序号 引入的半乳糖胺个数 正义链代码
1 0 Kylo-04-S0
2 3 Kylo-04-S3
3 2 Kylo-04-S2
4 1 Kylo-04-S1
说明：
正义链代码最后一位的“0”、“1”、“2”、“3”指正义链3'端引入的半乳糖胺个数。分别表示引入的半乳糖胺0个、1个、2个、3个。连接链D中含有十二烷二酸。
siRNA中的正义链是以Kylo-04-DLyiC6、Kylo-04-erC6或Kylo-04-DLsanC6为起点单体通过固相亚磷酰胺法偶联所得的。固相亚磷酰胺法基本步骤包括：1)脱保护：脱掉Kylo-04-DLyiC6上氧原子上的保护基(DMT)；2)偶联：加上第一个核苷酸单体，通过3’至5’方向发生偶联反应；3)封闭：将没有反应的第二个核苷酸单体5’-OH加冒封死，使其不再进一步参与反应；4)氧化：将所得的核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯(即三价磷氧化成五价磷)；重复上述步骤，直至完成所需的序列。合成后，用二乙胺、乙腈溶液来裂解固相载体上连接化合物与初始核苷间的酯键，将合成好的寡聚核苷酸从固相载体进行氨解切割下来，并将寡聚核苷酸上的各个碱基与磷酸上的保护基氰乙基、苯甲酰基、乙酰基和异丁酰基脱掉。最后，溶解于二甲基亚砜的产物，加入三乙胺三氢氟酸盐溶液脱掉糖基2’的TBDMS基团。经HPLC分离纯化后，过滤除菌，冻干。
4.5’末端被修饰的反义链合成
序号 引入的半乳糖胺个数 反义链代码
1 0 Kylo-04-AS0
2 3 Kylo-04-AS3
3 2 Kylo-04-AS2
4 1 Kylo-04-AS1
说明：
反义链代码最后一位的“0”、“1”、“2”、“3”指反义链5'端引入的半乳糖胺个数。分别表示引入的半乳糖胺0个、1个、2个、3个。连接链D中含有戊二酸。
反义链是以U为起点单体，通过固相亚磷酰胺法合成，合成步骤与正义链的合成基本一样，然后分别通过与DLsanc-wuers-PFP、Erc-wuers-PFP或DLyic-wuers-PFP液相合成引入相应的半乳糖胺部分。
5.新化合物合成
拟合成的新化合物
说明：
新化合物代码最后两位数说明：前一位数字表示正义链的3’末端引入的半乳糖胺数，后一位数字表示反义链的5’末端引入的半乳糖胺数。
由正义链与反义链在退火缓冲溶液中按照碱基配对原则形成。基本步骤包括：将正义链和反义链分别复溶，混合，加入注射用水适量，投入适量TRIS缓冲溶液，使溶液混合均匀。水浴升温至92℃～95℃，加热3min～5min，使溶液受热均匀。自然冷却至室温，取样送检，测浓度，用灭菌注射水将溶液稀释至标准浓度。
6.通过HepG2.2.15细胞实验筛选出抑制HBV HBsAg、HBeAg和DNA的效果最好的化合物
HepG2.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养，每三天更换一次新鲜培养基，第6天加入上述所配不同浓度含药培养液，继续培养到第9天。收集上清液，用HBsAg诊断试剂盒(ELISA)检测HBsAg。并与对照不给药组进行OD值，对比，按照比值确定有效性。
实施例
以下实施例说明了本发明公开的一些实施方案，但并不局限于这些。此外，在提供具体实施方案时，发明人预期了那些具体实施方案的应用。例如具有同类或类似化学结构的化合物，用于不同的肝源性疾病的治疗。
说明：
DMF的中文名称是N,N-二甲基甲酰胺；
HBTU的中文名称为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯；
DIPEA(DIEA)的中文名称为N,N-二异丙基乙胺；
DCM的中文名称为二氯甲烷；
DMAP的中文名称为4-二甲氨基吡啶；
DMT-Cl的中文名称为4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷；
THF的中文名称为四氢呋喃；
TBTU的中文名称为O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸；
DBU的中文名称为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯；
HOBt的中文名称为1-羟基苯并三唑；
MTBE的中文名称为甲基叔丁基醚；
Pd-C的中文名称为钯碳催化剂；
的中文名称为固相载体，如树脂(Resin)；
实施例一、Kylo-04-DLyiC6的合成
1、Kylo-04-DLC1的合成
向反应瓶内依次加入二乙醇胺(2.0g 0.019mol)和10mL的DMF，室温搅拌溶解，再依次加入十二烷二酸单甲酯(4.89g 0.020mol)、HBTU(7.32g)和DIPEA(5.10g)，室温搅拌反应过夜，TLC分析，反应合格浓缩掉DMF，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到黄色粘稠液体5.24g(收率83.17％)。
2、Kylo-04-DLC2的合成
向反应瓶内依次加入Kylo-04-DLC1(3.31g 0.01mol)和5mL吡啶，室温搅拌溶解，再依次加入DMAP(0.21g)和DMT-CL(4.06g 0.01mol)，室温搅拌反应过夜，TLC分析，反应合格浓缩掉吡啶，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到黄色粘稠液体4.44g(收率70％)。
3、Kylo-04-DLC3的合成
向反应瓶内依次加入Kylo-04-DLC2(4.4g 0.007mol)和20mL溶剂(THF/水/甲醇＝1:1:4)，室温搅拌溶解，再加入氢氧化锂(0.5g)，室温搅拌反应2h，TLC分析，反应合格浓缩掉溶剂，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到黄色粘稠液体3.92g(收率90.3％)。
4、Kylo-04-DLyiC4的合成
向反应瓶内依次加入Kylo-04-DLC3(0.93g 0.0015mol)和10mL的DMF，室温搅拌溶解，再依次加入TBTU(0.501g)和DIPEA(0.517g)，室温搅拌溶解，最后加入短链一叉(0.562g0.001mol)室温搅拌反应过夜，TLC分析，反应合格浓缩掉DMF，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到黄色粘稠液体0.814g(收率70％)。
5、Kylo-04-DLyiC5的合成
向反应瓶内依次加入Kylo-04-DLyiC4(0.814g 0.7mmol)和10mL的DCM，室温搅拌溶解，再依次加入DBU(0.012g)和丁二酸酐(0.031g 0.31mmol)，室温搅拌反应，TLC分析，反应合格浓缩掉DCM，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到Kylo-04-DLyiC5为0.796g(收率90％)。
6、Kylo-04-DLyiC6的合成
向反应瓶内依次加入Kylo-04-DLyiC5(0.8g 0.633mmol)和30mL的DMF，室温搅拌溶解，再依次加入HBTU(0.24g)、DIPEA(0.245g)和GE树脂(1.28g)，将物料转移到合成管中，过滤，用DMF冲洗4次，然后加入CAP A+CAP B在氮气鼓泡下进行封端反应半小时，取少量树脂进行Kaiser test至测试液呈现黄色，封端完毕，滤饼分别用甲醇、DCM和甲醇进行冲洗；真空拉干；得Kylo-04-DLyiC6为2.0g，取代度140μmol/g。
实施例二、Kylo-04-erC6的合成
1、Kylo-04-erC4的合成
向反应瓶内依次加入Kylo-04-DLC3(0.465g 0.75mmol)和10mL的DMF，室温搅拌溶解，再依次加入TBTU(0.82g)和DIPEA(0.232g)，室温搅拌溶解，最后加入二叉(0.6g0.5mmol)室温搅拌反应过夜，TLC分析，反应合格浓缩掉DMF，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到黄色粘稠液体0.63g(收率70％)。
2、Kylo-04-erC5的合成
向反应瓶内依次加入Kylo-04-erC4(0.63g 0.348mmol)和10mL的DCM，室温搅拌溶解，再依次加入DBU(0.059g)和丁二酸酐(0.105g 1.044mmol)，室温搅拌反应，TLC分析，反应合格浓缩掉DCM，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到Kylo-04-DLyiC5为0.598g(收率90％)
3、Kylo-04-erC6的合成
向反应瓶内依次加入Kylo-04-erC5(0.6g 0.315mmol)和24mL的DMF，室温搅拌溶解，再依次加入HBTU(0.06g)、DIPEA(0.122g)和GE树脂(0.96g)，将物料转移到合成管中，过滤，DMF冲洗4次，然后加入CAP A+CAP B在氮气鼓泡下进行封端反应半小时，取少量树脂进行Kaiser test至测试液呈现黄色，封端完毕，滤饼分别用甲醇、DCM和甲醇进行冲洗；真空拉干；得Kylo-04-erC6为1.5g，取代度130μmol/g。
实施例三、Kylo-04-DLsanC6的合成
1、Kylo-04-DLsanC4的合成
向反应瓶内依次加入Kylo-04-DLC3(0.344g 0.555mmol)和10mL的DMF，室温搅拌溶解，再依次加入TBTU(0.256g)和DIPEA(0.131g)，室温搅拌溶解，最后加入短链三叉(0.6g0.37mmol)室温搅拌反应过夜，TLC分析，反应合格浓缩掉DMF，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到黄色粘稠液体0.576g(收率70％)。
2、Kylo-04-DLsanC5的合成
向反应瓶内依次加入Kylo-04-DLsanC4(0.6g 0.27mmol)和10mL的DCM，室温搅拌溶解，再依次加入DBU(0.180g)和丁二酸酐(1.081g)，室温搅拌反应，TLC分析，反应合格浓缩掉DCM，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到Kylo-04-DLyiC5为0.565g(收率90％)。
3、Kylo-04-DLsanC6合成
向反应瓶内依次加入Kylo-04-DLsanC5(0.6g 0.258mmol)和24mL的DMF，室温搅拌溶解，再依次加入HBTU(0.058g)、DIPEA(0.1g)和GE树脂(0.96g)，将物料转移到合成管中，过滤，用DMF冲洗4次，然后加入CAP A+CAP B在氮气鼓泡下进行封端反应半小时，取少量树脂进行kaiser test至测试液呈现黄色，封端完毕，滤饼分别用甲醇、DCM和甲醇进行冲洗；真空拉干；得Kylo-04-DLsanC6为1.5g，取代度120μmol/g。
实施例四、DLSanc-wuers-PFP的合成
1、Sanc-c2的合成
称取Sanc-c1 50.0g(128.5mmol)，用1,2-二氯乙烷100mL溶解，加15.0g 4A型分子筛。搅拌10分钟，滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯20.0mL，升温至50℃，保温反应过夜。TLC监测反应完全(DCM：甲醇＝10:1)，加DCM，加饱和碳酸氢钠至碱性，分层。干燥，减压蒸干。过层析柱得30.0g淡黄色油状物。
2、DLsanc-c3的合成
投Sanc-c2 30.0g(91.2mmol)，用1,2-二氯乙烷100mL溶解，加15.0g 4A型分子筛。搅拌10分钟，加入N-Cbz-6-氨基-1-己醇15g，滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯20.0mL，滴加完毕。TLC监测反应完全(DCM：甲醇＝10:1)，加DCM，加饱和碳酸氢钠至碱性，分层。干燥，减压蒸干。过层析柱得25.0g淡黄色油状物。
3、DLsanc-c4的合成
投DLSanc-c3 25.0g(43.1mmol)，用甲醇50mL溶解，加入10％钯炭1.0g(湿式Degussa型E101 NE/W)。然后常压下加氢，反应过夜。反应液用硅藻土过滤，滤液减压蒸干,得白色泡状物19.0g。
4、DLsanc-c11的合成
将化合物Sanc-c7 1.4g(2.97mmol)和DLsanc-c4 3.6g(8.07mmol)加到DMF40mL中，然后加入HOBt 2.24g和HBTU 3.36g，然后缓慢加入DIEA 4.16mL。然后加入水，DCM 50mL萃取。有机层用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，用硅胶柱层析纯化(洗脱液：1-10％甲醇inDCM)。得淡黄色固1.93g。
5、DLsanc-c12的合成
DLsanc-c11 1.93g(1.1mmol)用甲醇20mL溶解，加入10％钯炭1.0g(湿式Degussa型E101 NE/W)。然后常压下加氢，反应过夜。反应液用硅藻土过滤，滤液减压蒸干,得油状物1.75g。
6、DLsanc-wuers-C1的合成
取戊二酸单苄酯0.29g(1.3mmol)，用DMF 2mL溶解，然后加入TBTU 0.46g和DIEA0.4mL，搅拌反应5分钟，加DLsanc-c12 1.75g，室温搅拌反应过夜。减压蒸干反应液，加DCM20mL，水20mL，搅拌5分钟。分层，有机层用无水硫酸钠干燥。过层析柱(洗脱剂：DCM：甲醇＝1％-10％)，减压蒸干溶剂，得白色产品1.6g。
7、DLSanc-wuers的合成
100mL单口瓶中投DLsanc-wuers-C1 1.6g(0.88mmol),加钯炭100mg,水泵抽真空，补氢气，重复三次，氢气加压反应过夜，第二日，TLC反应完全。铺硅藻土过滤钯炭，减压蒸干滤液，得产品1.50g。
8、Sanc-wuers-PFP的合成
50mL单口瓶中投DLSanc-wuers 1.50g(0.86mmol),加DCM10mL,滴加三氟甲磺酸五氟苯酯0.36g(1.3mmol),室温反应1小时，加水30mL洗涤，加饱和亚硫酸氢钠10mL洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，有机层减压蒸干得产品1.7g.
实施例五、DLYic-wuers-PFP的合成
1、Yic-c5的合成
量取2-羟基乙胺5.0g(81.9mmol)加入二甲基亚砜50mL，氢氧化钠溶液5mL(浓度1g/mL),滴加丙烯酸叔丁酯12mL(81.9mmol)1小时加完，室温反应24h，加石油醚100mL，饱和食盐水洗2次，有机层干燥。过柱得无色油状物7.5g。
2、Yic-c6的合成
称取Yic-c5 7.5g(39.7mmol)，加DCM50mL,碳酸钠溶液(25％)23mL，室温滴加氯甲酸苄酯7.7g(45.0mmol),室温反应过夜，饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，过层析柱(乙酸乙酯：石油醚＝15％-30％)得油状物11.3g。
3、Yic-c7的合成
取Yic-c6 11.3g(35.0mmol)加甲酸20mL,室温反应过夜，减压蒸干溶剂，得Yic-c79.2g。
4、DLyic-c11的合成
将化合物Yic-c7 1.0g(3.73mmol)和DLsanc-c4 2.0g(4.48mmol)加到DMF30mL中，然后加入HOBt 0.38g和HBTU 2.30g，然后缓慢加入DIEA 1.0mL。再加入水20mL，DCM40mL萃取。饱和食盐水100mL洗。用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，用硅胶柱层析纯化(洗脱液：1-15％甲醇in DCM)。得白色泡状固体2.2g。
5、DLyic-c12的合成
DLyic-c11 2.2g(3.2mmol)用甲醇30mL溶解，加入10％钯碳1.0g(湿式Degussa型E101 NE/W)。然后常压下加氢，反应过夜。反应液用硅藻土过滤，滤液减压蒸干,得白色泡状物1.70g。
6、DLyic-wuers-C1的合成
取戊二酸单苄酯0.80g(3.60mmol)，用DMF 2mL溶解，然后加入TBTU1.28g,和DIEA2.0mL，搅拌反应5分钟，加DLyic-c12 1.70g(3.0mmol)，室温搅拌反应过夜。减压蒸干反应液，加DCM 50mL，水50mL，搅拌5分钟。分层，有机层用无水硫酸钠干燥。过层析柱(洗脱剂：DCM：甲醇＝1％-10％)，减压蒸干溶剂，得白色产品2.1g。
7、DLyic-wuers的合成
100mL单口瓶中投Yic-wuers-C1 2.1g(2.7mmol),加钯炭0.2g,水泵抽真空，补氢气，重复三次，氢气加压反应过夜，第二日，TLC反应完全。铺硅藻土过滤钯炭，减压蒸干滤液，得产品1.8g。
8、DLyic-wuers-PFP的合成
100mL单口瓶中投DLyic-wuers 1.8g(2.66mmol),加DCM20mL,滴加三氟甲磺酸五氟苯酯1.1g(4.0mmol),室温反应1小时，加水40mL洗涤，加饱和亚硫酸氢钠10mL洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，有机层减压蒸干得产品2.3g。
实施例六、Erc-wuers-PFP的合成
1、Erc-c5的合成
量取2-氨基-1,3-丙二醇5.0g(54.9mmol)加入二甲基亚砜25mL,氢氧化钠溶液5mL(浓度1g/mL)，滴加丙烯酸叔丁酯20mL(137.8mol)，室温反应8h，加石油醚50mL，饱和食盐水洗2次，有机层干燥。过层析柱(洗脱液：乙酸乙酯：石油醚＝15％-75％)，得无色油状物6.2g。
2、Erc-c6的合成
称取Erc-c5 6.2g(17.9mmol)，加DCM50mL,碳酸钠溶液(35％)16mL，室温滴加氯甲酸苄酯8.2mL(57.4mmol)，室温反应6h，饱和食盐水洗涤，蒸干溶剂，过层析柱(乙酸乙酯：石油醚＝5％-20％)得油状物4.0g。
3、Erc-c7的合成
取Erc-c6 4.0g(8.3mmol)加甲酸12mL,室温反应过夜，减压蒸干溶剂，得Erc-c72.8g。
4、Erc-c9的合成
取Erc-c8(N-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺)5.0g(28.7mmol)，Erc-c7 2.8g(7.6mmol)，加DMF 25mL溶解，加TBTU 9.0g，加DIEA 2mL，室温反应过夜。加水30mL，DCM50mL，有机层用饱和食盐水洗涤，减压蒸干。过层析柱，用石油醚装柱，用1L石油醚冲洗柱子(洗脱剂：DCM：甲醇＝5％-10％)，得黄色粘稠固体2.9g。
5、Erc-c10的合成
取Erc-c9 2.9g，加9mL浓盐酸，室温反应过夜。减压蒸干，得2.7g。
6、Erc-c11的合成
将化合物Erc-c10 1.56g(2.44mmol)和Sanc-c4 3.6g(8.04mmol)加到DMF60mL中，然后加入HOBt 2.24g和HBTU 3.36g，然后缓慢加入DIEA 4.16mL。反应液室温下搅拌反应1小时。然后加入水，水层用DCM萃取2x10mL。合并有机层，然后依次用饱和碳酸氢钠80mL,水40mL,饱和食盐水60mL洗。用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，用硅胶柱层析纯化(洗脱液：3-15％甲醇in DCM)，得淡黄色固2.36g。
7、Erc-c12的合成
Erc-c11 2.36g(1.2mmol)用甲醇120mL溶解，加入10％钯碳1.0g,湿式Degussa型E101 NE/W)。然后常压下加氢，反应过夜。反应液用硅藻土过滤，滤液减压蒸干,得油状物1.8g。
8、Erc-wuers-C1的合成
取戊二酸单苄酯0.21g(0.001mol)，用DMF 2mL溶解，然后加入TBTU 0.36g,和DIEA0.4mL，搅拌反应5分钟，加Erc-c12 1.09g，室温搅拌反应过夜。减压蒸干反应液，蒸干后，加DCM40mL，水20mL，搅拌5分钟。分层，有机层用无水硫酸钠干燥。过层析柱(洗脱剂：DCM：甲醇＝1％-10％)，减压蒸干溶剂，得白色产品0.85g。
9、Erc-wuers的合成
100mL单口瓶中投Erc-wuers-C1 0.85g(0.43mmol),加钯炭127mg,水泵抽真空，补氢气，重复三次，氢气加压反应过夜，第二日，TLC反应完全。铺硅藻土过滤钯炭，减压蒸干滤液，得产品0.76g。
10、Erc-wuers-PFP的合成
50mL单口瓶中投Erc-wuers 0.76g(0.40mmol)，加DCM10mL,滴加三氟甲磺酸五氟苯酯0.19g(0.6mmol),室温反应1小时，加水10mL洗涤，加饱和亚硫酸氢钠5mL洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥10分钟，有机层减压蒸干得产品0.8g.
实施例七、通过HepG2.2.15细胞实验，考察引入不同个数的半乳糖胺对HBVHBsAg、HBsAg和DNA的抑制效果。
试验过程
1.药液配制
样品用ddH2O，配置成100×母液，临用前用10％FBS DMEM细胞培养液将母液稀释成以下浓度：
2.抑制效果检测
HepG2.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养，每三天更换一次新鲜培养基，第6天加入上述所配不同浓度含药培养液，继续培养到第9天。收集上清液，检测试剂盒检测细胞上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA的含量。并与对照不给药组进行OD值对比，按照比值确定有效性。
3.实验结果
3.1对HepG2.2.15细胞中HBsAg的抑制效果：见附图6
3.2对HepG2.2.15细胞上清中HBeAg的抑制效果：见附图7
3.3对HepG2.2.15细胞上清中HBV DNA的抑制效果：见附图8
序列表
<110> 厦门甘宝利生物医药有限公司
<120> 一种新化合物及其应用
<130> 33
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ccgugugcac uucgcuucau a 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ugaagcgaag ugcacacggu u 21

Claims (16)

1.一种结构中含有siRNA和末端修饰链的化合物，其特征在于，其结构为通式(I)或(I’)所示：
其中，n和m分别为1-3的正整数，且n和m之和为3或4，优选为4；优选地，n为1，m为3或n为3，m为1；更优选地，n为1，m为3。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述siRNA的正义链和反义链序列为：
正义链：CCGUGUGCACUUCGCUUCAUA
反义链：UGAAGCGAAGUGCACACGGUU
其中，核苷酸的核糖的2’位可以用甲氧基或氟原子取代；核苷酸之间部分可以通过3’-O→5’-O硫代磷酸酯基团连接，所述修饰使修饰后的siRNA在细胞内抵抗核酸酶降解的能力增强。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述末端修饰链由连接链D、接头B、含有位阻稳定结构的支链L和肝靶向特异性配体X组成，该末端修饰链的通式(II)为：
4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述肝靶向特异性配体X选自多糖、多糖衍生物、单糖和单糖衍生物，该肝靶向特异性配体X的通式(III)为：
其中，R1、R2和R3分别为氢或羟基保护基。
5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述肝靶向特异性配体X选自以下结构中的一种或多种：
其中，R1选自OH和NHCOOH中的一种或两种。
6.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述含有位阻稳定结构的支链L选自如下结构中的一种或多种：
其中，n1是1-10的正整数，m为1-5的正整数，n2为0-20的整数，n3为1-12的正整数，Z为H或CH3。
7.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述接头B选自以下结构式：
其中，A1是C、O、S或NH；r1为1-15的正整数；A2选自C1-C10直链烷烃，或者带有氨基、羰基、酰胺基、磷酰根、硫代磷酰基、氧原子或硫原子的C1-C10直链烷烃或者环状化合物；r2为0-15的整数。
8.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述接头B选自以下结构式：
其中，r1、r3、r4、r5分别为1-15的正整数；r6为1-20的正整数，r7为2-6的正整数，r8为1-3的正整数。
9.根据权利要求1或8所述的化合物，其特征在于：所述接头B选自以下结构式：
10.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述连接链D选自带有羰基、酰胺基、氧原子、硫原子、硫代磷酰基、磷酰基或环状结构的烷烃，该连接链D选自以下结构中的一种：
其中，每个n为1-20的正整数，且每个n为相同或不同的正整数。
11.根据权利要求1或10所述的化合物，其特征在于：所述连接链D选自以下结构式中的一种：
12.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述结构通式(I)中的[B-(L-X)n或m]结构，根据n和m的数量不同，从以下含有与n或m个半乳糖胺数量的结构式中进行选择：
13.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述通式(I)为Kylo-04-DS12、Kylo-04-DS13、Kylo-04-DS22、Kylo-04-DS21、Kylo-04-DS31所示结构中的一种：
14.如权利要求1-13中任一项所述的化合物在制备用于治疗肝源性疾病的药物中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述肝靶向特异性配体X是针对肝脏中去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异性的，所述肝源性疾病为慢性乙型肝炎。
16.一种药物组合物，该药物组合物包含权利要求1-13中任一项所述的化合物和药学上可接受的辅料，优选剂型为皮下注射剂。
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