TWI750712B

TWI750712B - 一種新化合物及其用途

Info

Publication number: TWI750712B
Application number: TW109121611A
Authority: TW
Inventors: 盧雪琴; 穆卓; 王聖軍; 杜豔春
Original assignee: 大陸商廈門甘寶利生物醫藥有限公司
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2021-12-21
Also published as: JP7383308B2; AU2020305793A1; AU2020305793B2; CN110846320B; JP2022540363A; EP3992291A4; US20230374513A1; CN110846320A; US20230110095A1; CN110218728A; EP3992291A1; KR20220035398A; US11840691B2; WO2020259497A1; TW202043474A

Abstract

本發明涉及一種新的化合物及其對HBV基因表達抑制的應用。該化合物結構中含有抑制HBV基因表達的干擾核酸、轉接點及其末端修飾鏈。通過末端修飾鏈，可以在這種siRNA的反義股3’端引入兩個或三個的N-乙醯基半乳糖胺，在正義股5’端相應引入兩個或一個N-乙醯基半乳糖胺，引入的N-乙醯基半乳糖胺總數量為四。通過體內外藥效實驗證明，這種新的化合物可以持續高效的抑制HBV基因表達。

Description

一種新化合物及其用途

本發明涉及一種新的化合物及其對HBV基因表達抑制的應用。該化合物結構中含有抑制HBV基因表達的干擾核酸、轉接點及其末端修飾鏈。通過末端修飾鏈，可以在這種siRNA的反義股3’端引入兩個到三個的N-乙醯基半乳糖胺，在正義股5’端相應引入兩個到一個N-乙醯基半乳糖胺，引入的N-乙醯基半乳糖胺的總數量為四個。通過HepG 2細胞和基因轉殖小鼠的藥效實驗證明，這種新的化合物可以持續使HBV的HBsAg、HBeAg和HBV DNA的表達得到抑制。

RNAi

RNAi(RNA干擾)於1998年，由安德魯．法厄(Andrew Z.Fire)等在秀麗隱杆線蟲中進行反義RNA抑制實驗時發現，並將這一過程稱為RNAi。這一發現被《Science》雜誌評為2001年的十大科學進展之一，並名列2002年十大科學進展之首。自此以後，以RNAi為作用機理的siRNA作為潛在的基因治療藥物得到人們廣泛的關注，2006年，安德魯．法厄與克雷格．梅洛(Craig C.Mello)由於在RNAi機制研究中的貢獻獲得諾貝爾生理或醫學獎。RNAi是在許多生物中，包括動物、植物和真菌，都可由雙股RNA(dsRNA)觸發的，在RNAi過程中，一種稱為“Dicer”的核酸內切酶將長鏈dsRNA切割或“切丁”成21~25個核苷酸長的小片段。這些小片段，被稱為小干擾RNA(siRNA)，其中的導引股(Guide strand)被載入到Argonaute蛋白(AGO2)上。AGO2載入發生在RISC-loading複合物中，這是一個三元複合物，由Argonaute蛋白、Dicer和dsRNA結合蛋白(簡稱為TRBP)組成。在裝載過程中，隨從股(Passenger strand)被AGO2裂解並排出。然後，AGO2使用反義股與包含完全互補序列的mRNA結合，然後催化這些mRNA的切割，致使mRNA分裂喪失轉譯模板的作用，進而阻止相關蛋白質的合成。切割後，被切割的mRNA被釋放，載入著反義股的RISC-loading複合物被循環用於另一輪的切割。

據統計，在人體內的疾病相關蛋白中，大約超過80%的蛋白質不能被目前常規的小分子藥物以及生物大分子製劑所標靶，屬於不可成藥蛋白。旨在通過基因的表達、沉默等功能治療疾病的基因治療被業界認為是繼化學小分子藥物、生物大分子藥物之後的第三代治療藥物，這種療法在基因水平上實現對疾病的治療，不受不可成藥蛋白的制約。作為基因治療中RNAi技術最主流的類型，RNAi技術是從mRNA的水平對疾病進行治療，相比化學小分子藥物及生物大分子藥物在蛋白質水平的治療具有更高的效率。利用RNAi技術，可以根據特定基因序列，設計出特異性高、抑制效果好的siRNA的正義股和反義股序列，通過固相合成這些單股序列，然後正義股與反義股在特定的退火緩衝液中按照鹼基配對原則配對成siRNA，最後通過載體系統輸送到體內相應靶點，降解目標mRNA，破壞目標mRNA作為轉譯模板的功能，從而阻止相關蛋白的合成。

siRNA的傳遞系統

siRNA在血液和組織中不穩定，容易被核酸酶降解，為了提高siRNA的穩定性，可以通過對siRNA骨架修飾，但這些化學修飾只提供有限的免受核酸酶降解的保護作用並且可能最終影響siRNA的活性。因此，還需要相應的傳遞系統來保障siRNA安全高效的穿過細胞膜。由於siRNA分子量較大，且帶有大量負電荷，而且具有高水溶解性，所以自身無法順利穿越細胞膜到達細胞內。

脂質體基本結構是由親水核和磷脂雙分子層構成，具備類似生物膜的磷脂雙分子層，擁有很高的生物相容性，所以脂質體一度成為最受歡迎、應用最廣泛的siRNA載體。脂質體介導的siRNA傳遞主要將siRNA包裹到脂質體內，保護siRNA不被核酸酶降解，提高siRNA的通過細胞膜障礙的效率，從而促進細胞的吸收。例如陰離子脂質體、pH敏感性脂質體、免疫脂質體、膜融合脂質體(fusogenic liposome)和陽離子脂質等等，儘管取得了一定的進展，但脂質體本身容易引發炎症反應，給藥前必須使用多種抗組織胺和激素類如西替利嗪和地塞米松類等藥物，以減少可能發生的急性炎症反應，因此在實際臨床應用中並不適合所有治療領域，尤其像慢性B型肝炎這一類治療週期長的疾病，長期使用可能產生的蓄積毒性是潛在的安全隱患。

去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)

肝臟中去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)，是肝細胞特異性表達的受體，是一種高效的內吞型受體。由於體內生理情況下各種糖蛋白在酶或酸水解唾液酸後，暴露出的次末端是半乳糖殘基，所以ASGPR特異性結合的糖為半乳糖基，故又稱半乳糖特異性受體。半乳糖、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺等單糖和多糖分子對ASGPR有高親和性。ASGPR主要生理功能是介導血液中去唾液酸糖蛋白、脂蛋白等物質的清除，且與病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等肝臟疾病的發生發展有著密切聯繫。ASGPR這一特性的發現，對肝源性疾病的診斷及治療起著重要作用(Ashwell G、Harford J，Carbohydrate specific Receptors of the Liver，Ann Rev Biochem 1982 51：531-554)。結構中含有半乳糖或半乳糖胺及其衍生物的肝源性疾病治療藥物可以特異性地與ASGPR親和，從而具有主動肝靶向性，不需要其它的載體系統來輸送。

本發明涉及一種新的化合物及其對HBV基因表達抑制的應用。該化合物結構中含有抑制HBV基因表達的干擾核酸、轉接點及其末端修飾鏈。末端修飾鏈與干擾核酸之間通過轉接點連接。通過末端修飾鏈，可以在這種siRNA的反義股3’端引入兩個或三個的N-乙醯基半乳糖胺，在正義股5’端相應引入兩個或一個N-乙醯基半乳糖胺，總數四個N-乙醯基半乳糖胺，是一種全新的引入方式，通過體內外藥效實驗證明，這種新的化合物可以持續使HBV的HBsAg、HBeAg和HBV DNA的表達得到高效抑制。

本發明一個方面，提供了一種結構中包含有抑制HBV基因表達的干擾核酸、轉接點及其末端修飾鏈的化合物，所述末端修飾鏈由連接鏈D、連接子B、支鏈L和肝靶向特異性配體X組成，所述末端修飾鏈與所述干擾核酸之間通過轉接點R1/R2連接，其結構為通式(I)所示：

其中：n為1時，m為3；n為2時，m也為2；R₁為-NH(CH₂)_xCH₂-，其中x可以是3-10的整數；R₂為-NHCH₂CH(OH)CH₂(OH)-，或其它同時帶有伯醇和仲醇或單獨的伯醇的含氮的結構，這種結構可以是一條直鏈或直鏈帶有支鏈，也可以是環狀結構。在一些優選實施方案中，R₂可以是帶有伯醇和仲醇的吡咯環或哌啶環，具體選自以下結構：

所述肝靶向特異性配體X選自半乳糖、半乳糖胺和N-乙醯半乳糖胺；所述支鏈L是C3-C18的直鏈，該直鏈中含有羰基、醯胺基、磷醯基、氧原子或這些基團的組合；所述連接子B選自以下結構式：

其中，A₁是C、O、S或NH；r1為1-15的正整數，r2為0-5的整數；A₂是C、O、S、胺基、羰基、醯胺基、磷醯基或硫代磷醯基；所述連接鏈D含有C5-C20，其含有胺基、羰基、醯胺基、氧原子、硫原子、硫代磷醯基、磷醯基、環狀結構或這些基團的組合。

在上述技術方案中，所述干擾核酸包括但不限於siRNA、miRNA或Agomir，優選為siRNA，進一步優選為抗B型肝炎病毒的siRNA。

所述的siRNA用於HBV RNAi的19 mer的序列設計是依照HBV cDNA靶序列(GenBank Accession # AF100309.1)設計的。這些靶點序列包括19 mer de1核心區域和以這些核心區域為主的擴展或位移的相應的DNA序列。其目的是通過基本的靶位點找到最佳有效序列，而這些序列可以部分或者全部與靶點位置相適應，能夠應用於治療慢性B型肝炎。

靶點的19 mer核苷酸序列包括兩股，正義股(S)和反義股(AS)。其中正義股的第19個核苷酸(5′→3′)可以和反義股的第1個核苷酸(5′→3′)按照華生-克里克(Watson-Crick)原則形成鹼基對。按照此原則，正義股(5′→3′)的1-19個鹼基可以和反義股(5′→3′)的19-1個鹼基與其相對應的鹼基配對形成雙股。在雙股中末端位置可以容許一到三個不配對的鹼基存在。在本發明中可以根據實際應用，篩選出HBV siRNA基本序列。按照基本序列進行3’或5’端位移，篩選出更為有效和特異性的序列。按照siRNA結構的研究結果，正義股或反義股3'端的單股突出部分的最優選擇是TT、UU、AU或者UA，得到變化序列。任一條正義股可以用來和反義股形成雙股，兩條股必須保持一個連續的至少16、17、18、19、20、21、22或23個鹼基配對。有些所列出來的序列可能和靶點有1、2或3個不同，在正義股的3′端的最後一個鹼基可以是U、A或T。在反義股的3′端的最後一個位置可以是U、A或T。按照上述原則，本發明篩選出以下候選序列：

為了siRNA在組織中的穩定性，siRNA的每個單體在沒有影響活性甚至增強活性的情況下，進行修飾。在正義股和反義股中可以容許有1個、2個或3個不完全配對的鹼基存在。其中的核苷酸可以帶有不同的修飾基團，可以整條股或者部分修飾。其中的每一條股中可以有一個、多個甚至全部帶有硫代的鹼基。

本發明所述的化合物中，修飾後的正義股和反義股選自下列序列：

其中：mG、mA、mC和mU為2’-甲氧基(2’-OMe)修飾的核苷酸；fG、fA、fC和fU為2’-氟修飾的核苷酸；s為硫代磷酸核苷間鍵，其餘的核苷酸單體通過磷酸二酯鍵連接。詳述如下：G=鳥糞嘌呤、A=腺嘌呤、U=尿嘧啶、C=胞嘧啶、dT或T=2’-去氧胸腺嘧啶；Gs=3’-硫代鳥糞嘌呤、As=3’-硫代腺嘌呤、Us=3’-硫代尿嘧啶、Cs=3’-硫代胞嘧啶、dTs或Ts=2’-去氧-3’-硫代胸腺嘧啶；mG=2’-O-甲基鳥糞嘌呤、mA=2’-O-甲基腺嘌呤、mU=2’-O-甲基尿嘧啶、mC=2’-O-甲基胞嘧啶； mGs=2’-O-甲基-3’-硫代鳥糞嘌呤、mAs=2’-O-甲基-3’-硫代腺嘌呤、mUs=2’-O-甲基-3’-硫代尿嘧啶、mCs=2’-O-甲基-3’-硫代胞嘧啶；fG=2’-氟鳥糞嘌呤、fA=2’-氟腺嘌呤、fU=2’-氟尿嘧啶、fC=2’-氟胞嘧啶；fGs=2’-氟-3’-硫代鳥糞嘌呤、fAs=2’-氟-3’-硫代腺嘌呤、fUs=2’-氟-3’-硫代尿嘧啶、fCs=2’-氟-3’-硫代胞嘧啶。

進一步優選地，在一些優選實施例方案中，在所述化合物中，修飾後的正義股和反義股選自下列序列：

所述末端修飾鏈是由連接鏈D、連接子B、含有位阻穩定結構的支鏈L和肝靶向特異性配體X組成，該末端修飾鏈的通式(II)為：

當n=1時，結構通式(II)為：

當n或m=2時，結構通式(II)為

當m=3時，結構通式(II)為：

所述肝靶向特異性配體X可以是一種或多種多糖、多糖衍生物或單糖和單糖衍生物。

優選地，所述肝靶向特異性配體X的通式(III)為：

其中，R₁、R₂和R₃分別為氫或羥基保護基。

進一步優選地，所述肝靶向特異性配體X選自半乳糖、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺或以下結構中的一種或多種：

其中，R₁選自OH、NHCOH或NHCOCH₃中的一種或兩種。

所述含有位阻穩定結構的支鏈L是C3-C18的直鏈，該直鏈中含有一個或多個羰基、醯胺基、磷醯基、氧原子或這些基團的組合，可以選自如下結構中的一種或多種：

其中，r1是1-12的正整數，r2為0-20的整數，Z為H或CH₃。

所述連接子B選自以下結構式：

其中，A₁是C、O、S或NH：r1為1-15的正整數，r2為0-5的整數；A₂是C、O、S、NH、羰基、醯胺基、磷醯基或硫代磷醯基。

優選地，所述連接子B選自以下結構式：

其中，r1、r3、r4、r5分別為1-15的正整數；r6為1-20的正整數，r7為2-6的正整數，r8為1-3的正整數。

進一步優選地，所述連接子B選自以下結構：

所述連接鏈D含有C5-C20，可以含有胺基、羰基、醯胺基、氧原子、硫原子、硫代磷醯基、磷醯基、環狀結構或這些基團的組合。

優選地，所述連接鏈D選自以下結構中的一種：

其中，每個n為1-20的正整數，且每個n為相同或不同的正整數。p為1-6的正整數；s為2-13的正整數；R₁和R₂為相同或者不同的取代基團，其結構式為以下結構中的一種：-H、-CH₃、-CH-(CH₃)、-CH-CH(CH₃)、-CH(CH₃)-CH-CH₃、-CH₂-C₆H₅、-C₈NH₆、-CH₂-C₆H₄-OH、-CH-COOH、-CH-CONH、-(CH)-COOH、-(CH)-NH、-(CH)-CONH、-(CH)-S-CH、-CH-OH、-CH(CH)-OH、-CH-SH、-CH₂-C₃H₃N₂、-(CH₂)₃NHC(NH)NH₂。

進一步優選地，所述連接鏈D選自以下結構中的一種：

所述的化合物，正義股5’端的修飾鏈帶有一個N-乙醯半乳糖胺或兩個N-乙醯半乳糖胺，選自以下結構中的一種：

在一些優選實施例中，所述的化合物的正義股5’端的修飾鏈選自下表的結構式：

所述的作合物的反義股3’端的修飾鏈帶有兩個或三個N-乙醯半乳糖胺，修飾鏈中的

選自以下結構中的一種：

在一些優選實施例中，所述的化合物反義股3’端的修飾鏈優選選自下表的結構式：

在一些優選實施例中，所述的化合物中正義股5’端末端修飾鏈與反義股3’末端修飾鏈組合優先為下表所示結構中的一種：

在一些優選實施例中，本發明所述的化合物包含正義股5’端和反義股3’端接入修飾鏈如下表所示：

在一些優選實施例中，本發明所述的化合物的結構如下表所示：

本發明的另一方面提供了本發明所述的化合物在製備用於治療肝臟相關疾病的藥物中的應用，其中，所述肝臟相關疾病包括急、慢性肝炎、肝癌、遺傳性肝源性疾病、肝硬化、脂肪肝、糖尿病。

本發明的又一方面提供了本發明所述的化合物在製備用於治療HBV感染的相關疾病的藥物中的應用，其中，所述HBV感染包括慢性B型肝炎病毒感染、急性B型肝炎病毒感染。

其中，所述肝靶向特異性配體X是針對肝臟中去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)特異性的，所述HBV感染的相關疾病為慢性B型肝炎，所述化合物可以持續使HBV的HBsAg、HBeAg和HBV DNA的表達得到抑制。

本發明的再一方面提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含本發明所述的化合物和藥學上可接受的輔料，優選劑型為皮下注射劑。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

(1)與脂質體介導的siRNA傳遞相比：脂質體介導的siRNA傳遞主要是脂質體將siRNA包裹到脂質體內，保護siRNA不被核酸酶降解，提高siRNA的通過細胞膜障礙的效率，從而促進細胞的吸收。脂質體例如陰離子脂質體、pH敏感性脂質體、免疫脂質體、膜融合脂質體(fusogenic liposome)和陽離子脂質等等，儘管取得了一定的進展，但脂質體本身容易引發炎症反應，給藥前必須使用多種抗組胺和激素類如西替利嗪和地塞米松類等藥物，以減少可能發生的急性炎症反應，因此在實際臨床應用中並不適合所有治療領域，尤其像慢性B型肝炎這一類治療週期長的疾病，長期使用產生的蓄積毒性可能是潛在的安全隱患。

(2)全新的N-乙醯半乳糖胺引入方式：

與帶有三個N-半乳糖胺結構的siRNA在抑制HBV的HBsAg效果進行比較：目前處於I/II期的治療慢性B型肝炎的siRNA藥物有ARO-HBV和ALN-HBV02。ARO-HBV是在siARNA的正義股的5’末端，通過連接鏈引入三個N-乙醯半乳糖胺；ALN-HBV02是在siRNA正義股的3’末端，通過連接鏈引入三個N-乙醯半乳糖胺。上述藥物引入半乳糖胺的部位都在正義股上，而且引入的都是三個N-乙醯半乳糖胺。本發明提供的化合物中，是siRNA正義股5’末端和反義股的3’末端同時引入數量不同的或相同的N-乙醯半乳糖胺，目前未見有在正義股5’末端和反義股的3’末端同時引入的報導，尤其是反義股的3’引入三個N-乙醯半乳糖胺，是一種全新的引入方式，通過實施例證實，該引入方式使siRNA具有高效抑制HBV基因的效果。

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖說明：圖1為5’YICd-01-c4的高解析度質譜圖；圖2為5’YICc-01-c7的高解析度質譜圖；圖3為5’ERCd-01-c7的高解析度質譜圖；圖4為5’ERCc-01-c4的高解析度質譜圖；圖5為3’SANCd-01-c6的高解析度質譜圖；圖6為對HepG2.215細胞中HBsAg的抑制效果柱狀圖；圖7為對HepG2.215細胞中HBeAg的抑制效果柱狀圖；圖8為對HepG2.215細胞中HBVDNA的抑制效果柱狀圖；圖9為對基因轉殖小鼠模型HBV基因的抑制效果柱狀圖；圖10為化合物01體內抑制HBV HBsAg效果圖。

以下實施例說明了本發明公開的一些實施方案，但並不局限於這些。此外，在提供具體實施方案時，發明人預期了那些具體實施方案的應用。例如具有具體同類或類似化學結構的化合物，用於不同的肝源性疾病的治療。

說明：

DMF的中文名稱是N,N-二甲基甲醯胺；HBTU的中文名稱為O-苯并三氮唑-四甲基脈六氟磷酸酯；DIPEA(DIEA)的中文名稱為N,N-二異丙基乙胺；DCM的中文名稱為二氯甲烷；DMAP的中文名稱為4-二甲胺基吡啶；DMT-CL的中文名稱為4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷；THF的中文名稱為四氫呋喃；TBTU的中文名稱為O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸；DBU的中文名稱為1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯；HOBt的中文名稱為1-羥基苯并三唑；DCC的中文名稱為二環己基碳二亞胺；Pd-C的中文名稱為鈀碳催化劑；

的中文名稱為固相載體，如樹脂(Resin)。

實施例一、化合物01的合成

1.Kys-01的合成

1.1.5’YICd-01結構的化合物：5'YICd-01-PFP的合成

1.1.1.5'YICd-01-c1的合成

量取2-羥基乙胺5.0g(81.9mmol)加入二甲基亞碸50mL，氫氧化鈉溶液5mL(濃度1g/mL)，滴加丙烯酸叔丁酯12mL(81.9mmol)1小時加完，室溫反應24h，加石油醚100mL，飽和食鹽水洗2次，有機層乾燥。過柱得無色油狀物7.5g。

1.1.2.5'YICd-01-c2的合成

稱取5'YICd-01-c1 7.5g(39.7mmol)，加DCM50mL，碳酸鈉溶液(25%)23mL，室溫滴加氯甲酸苄酯7.7g(45.0mmol)，室溫反應過夜，飽和食鹽水洗滌2次，無水硫酸鈉乾燥，蒸乾溶劑，過層析柱(乙酸乙酯：石油醚=15%-30%)得油狀物11.3g。

1.1.3.5'YICd-01-c3的合成

取5'YICd-01-c2 11.3g(35.0mmol)加甲酸20mL，室溫反應過夜，減壓蒸乾溶劑，得5'YICd-01-c3 9.2g。

1.1.4.5'YICd-01-c4的合成

將化合物5'YICd-01-c3 1.0g(3.73mmol)和dlSANC-c4 2.0g(4.48mmol)加到DMF30mL中，然後加入HOBt 0.38g和HBTU 2.30g，然後緩慢加入DIEA 1.0mL。再加入水20mL，DCM40mL萃取。飽和食鹽水100mL洗。用無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾，用矽膠柱層析純化(洗脫液：1-15%甲醇in DCM)。得白色泡狀固體2.2g，其高解析度質譜圖如圖1所示。

1.1.5.5'YICd-01-c5的合成

5'YICd-01-c4 2.2g(3.2mmol)用甲醇30mL溶解，加入10% Pd-C 1.0g(濕式Degussa型E101 NE/W)。然後常壓下加氫，反應過夜。反應液用矽藻土過濾，濾液減壓蒸乾，得白色泡狀物1.70g。

1.1.6.5'YICd-01-c6的合成

取戊二酸單苄酯0.80g(3.60mmol)，用DMF 2mL溶解，然後加入TBTU 1.28g，和DIEA 2.0mL，攪拌反應5分鐘，加5'YICd-01-c5 1.70g(3.0mmol)，室溫攪拌反應過夜。減壓蒸乾反應液，加DCM 50mL，水50mL，攪拌5分鐘。分層，有機層用無水硫酸鈉乾燥。過層析柱(洗脫劑：DCM：甲醇=1%-10%)，減壓蒸乾溶劑，得白色產品2.1g。

1.1.7.5'YICd-01-c7的合成

100mL單口瓶中投5'YICd-01-c6 2.1g(2.7mmol)，加鈀碳0.2g，水泵抽真空，補氫氣，重複三次，氫氣加壓反應過夜，第二日，TLC反應完全。鋪矽藻土過濾鈀碳，減壓蒸乾濾液，得產品1.8g。

1.1.8.5'YICd-01-PFP的合成

100mL單口瓶中投5'YICd-01-c7 1.8g(2.66mmol)，加DCM20mL，滴加三氟甲磺酸五氟苯酯1.1g(4.0mmol)，室溫反應1小時，加水40mL洗滌，加飽和亞硫酸氫鈉10mL洗滌，有機層用無水硫酸鈉乾燥，有機層減壓蒸乾得產品2.3g。

1.2.固相合成C6NH-S-01

mG為起始單體，C6NH亞磷醯胺單體為終端單體，通過固相亞磷醯胺法偶聯引入不同的亞磷醯胺單體。固相亞磷醯胺法基本步驟包括：1)脫保護：脫掉固相載體上氧原子上的保護基(DMT)；2)偶聯：加上第一個核苷酸單體，通過3’至5’方向發生偶聯反應；3)氧化：將所得的核苷亞磷酸酯氧化成更穩定的核苷磷酸酯(即三價磷氧化成五價磷)；4)封閉：將沒有反應的前一步核苷酸單體5’-OH加帽封死，使其不再進一步參與反應；重複上述步驟，直至完成所需的序列。合成後，用甲胺乙醇溶液和氨水來裂解固相載體上連接化合物與初始核苷間的酯鍵，並將寡聚核苷酸上的各個鹼基與磷酸上的保護基氰乙基(P)、苯甲醯基(mA、fA)、乙醯基(mC、fC)、異丁醯基 (mG、fG)和4-甲氧基三苯甲基(C6NH)脫掉。經HPLC分離純化後，過濾除菌，凍乾。

1.3.液相合成Kys-01

1.3.1.Kys-01-c1的合成

稱取純化凍乾後的化合物C6NH-S-01(12.5mg)加入硼酸鈉緩衝液(650μL，0.06mol/L)完全溶解，稱取5'YICd-01-PFP(10.3mg)溶解於二甲基亞碸(100μL)，將溶液加入化合物C6NH-S-01中，混合均勻後加入N-甲基嗎啡啉(5μL)，在室溫下超音波震盪3h，HPLC檢測反應完全後使用C18柱進行純化。

1.3.2.Kys-01的合成

取純化後的化合物Kys-01-c1(32mL,5mg)加入25%水合肼(16mL)，混合均勻後室溫下超音波震盪10min，HPLC檢測反應完全使用C18柱進行純化，凍乾後得到白色凍乾粉化合物Kys-01(2mg)。

2.Kyas-01的合成

2.1.3’SANCd-01結構的化合物：3’SANCd-01樹脂的合成

2.1.1.3’SANCd-01-c1的合成

稱量3-胺基-丙二醇(9.114g,0.100mol)，溶於THF中(50mL)，冷卻，滴加三氟乙酸乙酯(15.62g,0.110mol)，室溫反應1h，反應液旋蒸，得3’SANCd-01-c1粗品(18.871g)。

2.1.2.3’SANCd-01-c2的合成

3’SANCd-01-c1(5.480g，0.030mol)溶於吡啶中(30mL)，冷卻，分批加入DMT-CL(10.423g,0.031mol)，避光反應過夜，旋蒸除去吡啶。殘留物溶於CH₂Cl₂(50mL)，飽和食鹽水(50mL)洗滌，有機相無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸，過柱。得產品3’SANCd-01-c2(10.805g)。

2.1.3.3’SANCd-01-c3的合成

3’SANCd-01-c2(10.805g,0.022mol)溶於甲醇(60mL)和THF(30mL)，冷卻，滴加KOH(5.69g)的水溶液(24mL)，室溫反應2h，旋蒸除去甲醇和THF。殘留物加水(50mL)，EtOAc萃取(30mL*3)，飽和食鹽水(50mL)洗滌，有機相無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸。用含1%三乙胺洗脫液過柱，得產品3’SANCd-01-c3(8.286g)。

2.1.4.3’SANCd-01-c4的合成

3’SANCd-01-c3(2.890g，0.007mol)溶於CH₂Cl₂(20mL)，冷卻，滴加DCC(1.680g)的CH₂Cl₂溶液(10mL)，攪拌20分鐘後再加入辛二酸單甲酯(1.522g)的CH₂Cl₂溶液(10mL)，室溫反應過夜，5%NaHCO₃(20mL)淬滅，CH₂Cl₂萃取(20mL*2)，飽和食鹽水(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸，用含1%三乙胺的洗脫液過柱，得產品3’SANCd-01-c4(3.193g)。

2.1.5.3’SANCd-01-c5的合成

3’SANCd-01-c4(2.193g，0.004mol)溶於THF(10mL)中，冷卻，滴加LiOH(0.645g)的水溶液(4.5g)，反應2h後TLC顯示無原料。反應液旋蒸除去溶劑，用飽和氯化銨中和殘留物，CH₂Cl₂萃取(20mL*2)，飽和食鹽水(10mL)洗滌。無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸，用含1%三乙胺的洗脫液過柱，得產品3’SANCd-01-c5(1.979g)。

2.1.6.3’SANCd-01-c6的合成

3’SANCd-01-c5(0.389g，0.004mol)，溶於DMF(2mL)，冷卻，加DIPEA(0.15mL)，TBTU(0.183g)，攪拌10分鐘，再加入dlSANC-c12(0.756g,0.0005mol)的DMF(2mL)溶液，室溫反應過夜。水(20mL)淬滅， CH₂Cl₂萃取(20mL*2)，飽和食鹽水(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸，用含5%三乙胺的洗脫液過柱，得產品3’SANCd-01-c6(0.803g)，其高解析度質譜圖如圖5所示。

2.1.7.3’SANCd-01-c7的合成

向反應瓶內依次加入3’SANCd-01-c6(2.15g，0.001mol)和22mL的DCM，室溫攪拌溶解，再依次加入DBU(0.156g)和丁二酸酐(0.3g，0.003mmol)，室溫攪拌反應，TLC分析，反應合格濃縮掉DCM，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和食鹽水洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到3’SANCd-01-c7為2.03g。

2.1.8.3’SANCd-01樹脂的合成

向反應瓶內依次加入3’SANCd-01-c7(1.13g，0.0005mmol)和12mL的DMF，室溫攪拌溶解，再依次加入HBTU(0.11g)、DIPEA(0.104g)和GE樹脂(1.80g)，35℃搖床搖動24h，將物料轉移到合成管中，過濾，在氮氣鼓泡下樹脂用DMF沖洗4次，然後加入CAP A+CAP B在氮氣鼓泡下進行封端反應半小時，取少量樹脂進行kaiser test至測試液呈現黃色，封端完畢，濾餅分別用甲醇、DCM和甲醇進行沖洗；真空拉乾；得3’SANCd-01樹脂為2.48g，取代度150μmol/g。

2.2.固相合成Kyas-01

通過固相亞磷醯胺法偶聯引入不同的亞磷醯胺單體，mU為起始單體，mU為終端單體。固相亞磷醯胺法基本步驟包括：1)脫保護：脫掉3’SANCd-01樹脂上氧原子上的保護基(DMT)；2)偶聯：加上第一個核苷酸單體，通過3’至5’方向發生偶聯反應；3)氧化：將所得的核苷亞磷酸酯氧化成更穩定的核苷磷酸酯(即三價磷氧化成五價磷)；4)封閉：將沒有反應的前一步核苷酸單體5’-OH加帽封死，使其不再進一步參與反應；重複上述步驟，直至完成所需的序列。合成後，用甲胺乙醇溶液和氨水來裂解固相載體上連接化合物與初始核苷間的酯鍵，並將寡聚核苷酸上的各個鹼基與磷酸上的保護基氰乙基(P)、苯甲醯基(mA、fA)、乙醯基(mC、fC)和異丁醯基(mG、fG)脫掉。經HPLC分離純化後，過濾除菌，凍乾得Kyas-01。

3.化合物01合成

精確測定Kys-01與Kyas-01溶液的濃度，按等莫耳濃度進行混合後，加入該體積1/20體積的1M PBS溶液再次混勻，將混合體系加熱至95℃，持續5min，然後自然降溫3h至40℃或者室溫時，進行HPLC檢測，若單股殘餘<5%即可認為反應完成。

實施例二、化合物02的合成

1.Kys-02的合成

1.1.5’YICc-01結構的化合物：5'YICc-01-PFP的合成

1.1.1.5’YICc-01-c1的合成

取SANC-c8 7.0g(40.0mmol)，5’YICd-01-c3 9.2g(34.4mmol)，加DMF 25mL溶解，加TBTU 9.0g，降溫至10℃，加DIEA 2ml，室溫反應過夜。加水30mL，二氯甲烷50mL，有機層用飽和食鹽水洗三次。有機層乾燥，減壓蒸乾。過層析柱(洗脫劑：二氯甲烷：甲醇=1%-10%)，得黃色黏稠固體10.0g。

1.1.2.5’YICc-01-c2的合成

取5’YICc-01-c1 10.0g，加15ml濃鹽酸，室溫反應過夜。減壓蒸乾，得7.3g。

1.1.3.5’YICc-01-c3的合成

將化合物5’YICc-01-c2 7.3g(22.6mmol)和SANC-c4 12.1g(27.1mmol)加到DMF60mL中，然後加入HOBt 3.8g和HBTU 12.4g，然後緩慢加入DIEA 5.0ml。反應液室溫下攪拌反應過夜。然後加入水50mL，二氯甲烷100mL萃取。飽和食鹽水100mL洗。用無水Na₂SO₄乾燥，減壓蒸乾，用矽膠柱層析純化(洗脫液：3-15% MeOH in DCM)。得白色泡狀固體8.3g。

1.1.4.5’YICc-01-c7的合成

合成步驟同實施例一1.1.5，其高解析度質譜圖如圖2所示。

1.1.5.5’YICc-01-c8的合成

合成步驟同實施例一1.1.6。

1.1.6.5’YICc-01-c9的合成

合成步驟同實施例一1.1.7。

1.1.7.5’YICc-01-PFP的合成

合成步驟同實施例一1.1.8。

1.2.固相合成C6NH-S-02

mG為起始單體，C6NH亞磷醯胺單體為終端單體，通過固相亞磷醯胺法偶聯引入不同的亞磷醯胺單體。合成步驟同實施例一1.2固相合成。

1.3.液相合成得Kys-02

1.3.1.Kys-02-c1的合成

合成步驟同實施例一1.3.1。

1.3.2.Kys-02的合成

合成步驟同實施例一1.3.2。

2.Kyas-02的合成

2.1.3’SANCc-01結構的化合物：3’SANCc-01樹脂的合成

3’SANCc-01樹脂的合成路線和工藝步驟除3’SANCc-01-c6的合成，其它與3’SANCd-01樹脂一致。

2.1.1.3’SANCc-01-c1的合成

3’SANCd-01-c5(0.295g)，溶於DMF(2mL)，冷卻，加DIPEA(0.14mL)，TBTU(0.177g)，攪拌10分鐘，再加入SANC-c12(0.756g)的DMF(2mL)溶液，室溫反應過夜。水(50mL)淬滅，CH₂Cl₂萃取(20mL*2)，飽和食鹽水(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸，用含5%三乙胺的洗脫液過柱，得產品3’SANCc-01-c6(0.815g)。

2.2.固相合成Kyas-02

mU為起始單體，mU為終端單體，通過固相亞磷醯胺法偶聯引入不同的亞磷醯胺單體。合成步驟同實施例一2.2固相合成Kyas-01。

3.化合物02的合成

精確測定Kys-02與Kyas-02溶液的濃度，合成步驟同實施例一3.化合物01的合成。

實施例三、化合物03的合成

1.Kys-03的合成

1.1.5’ERCd-01結構的化合物：5’ERCd-01-PFP的合成

1.1.1.5’ERCd-01-c1的合成

量取2-胺基-1,3-丙二醇5.0g(54.9mmol)加入DMSO 50mL，氫氧化鈉溶液5mL(濃度1g/mL)，降溫到0℃，滴加丙烯酸叔丁酯20mL(137.8mol)2小時加完，室溫反應48h，加石油醚100mL，飽和食鹽水洗2次，有機層乾燥。過層析柱(洗脫液：乙酸乙酯：石油醚=25%-75%)，上柱加0.05%的三乙胺，得無色油狀物6.2g。

1.1.2.5’ERCd-01-c2的合成

稱取5’ERCd-01-c1 6.2g(17.9mmol)，加二氯甲烷50mL，碳酸鈉溶液(25%)23mL，室溫滴加氯甲酸苄酯8.2mL(57.4mmol)，2小時滴加完，室溫反應過夜，飽和食鹽水洗滌3次，無水硫酸鈉乾燥，蒸乾溶劑，過層析柱(乙酸乙酯：石油醚=5%-30%)得油狀物4.0g。

1.1.3.5’ERCd-01-c3的合成

取5’ERCd-01-c2 4.0g(8.3mmol)加甲酸12mL，室溫反應過夜，減壓蒸乾溶劑，得5’ERCd-01-c3 2.8g。

1.1.4.5’ERCd-01-c4的合成

將化合物5’ERCd-01-c3 1.11g(3.0mmol)和dlSANC-c4 3.6g(8.04mmol)加到DMF60mL中，然後加入HOBt 2.24g和HBTU 3.36g，然後緩慢加入DIEA 4.16mL。反應液室溫下攪拌反應3小時。然後加入水，水層用二氯甲烷萃取2 x 10mL。合併有機層，然後依次用飽和NaHCO₃ 80mL，水(2 x 60 mL)，飽和食鹽水(60mL)洗。用無水Na₂SO₄乾燥，減壓蒸乾，用矽膠柱層析純化(洗脫液：3-15% MeOH in DCM)。得淡黃色固3.24g。

1.1.5.5’ERCd-01-c5的合成

5’ERCd-01-c4 3.24g(2.6mmol)用甲醇60mL溶解，加入10% Pd-C 0.3g，濕式Degussa型E101 NE/W)，乙酸2.0mL。然後常壓下加氫，反應過夜。反應液用矽藻土過濾，濾液減壓蒸乾，得油狀物2.9g。

1.1.6.5’ERCd-01-c6的合成

取戊二酸單苄酯0.21g(0.001mol)，用DMF 2mL溶解，然後加入TBTU 0.36g和DIEA 0.4mL，攪拌反應5分鐘，加5’ERCd-01-c5 0.50g(溶於10ml DMF中)，室溫攪拌反應過夜。減壓蒸乾反應液，蒸乾後，加二氯甲烷40mL，水20mL，攪拌5分鐘。分層，有機層用無水硫酸鈉乾燥。過層析柱，(洗脫劑：二氯甲烷：甲醇=1%-10%)，減壓蒸乾溶劑，得白色產品0.51g。

1.1.7.5’ERCd-01-c7的合成

100mL單口瓶中投5’ERCd-01-c6 0.51g(0.42mmol)，加鈀碳127mg，水泵抽真空，補氫氣，重複三次，氫氣加壓反應過夜，第二日，TLC反應完全。鋪矽藻土過濾鈀碳，減壓蒸乾濾液，得產品0.40g，其高解析度質譜圖如圖3所示。

1.1.8.5’ERCd-01-PFP的合成

50mL單口瓶中投5’ERCd-01-c7 0.40g(0.33mmol)，加二氯甲烷10mL，滴加三氟甲磺酸五氟苯酯0.19g(0.6mmol)，10分鐘滴完，室溫反應2小時，加水10mL洗滌兩次，加飽和亞硫酸氫鈉5mL洗滌一次，有機層用無水硫酸鈉乾燥10分鐘，有機層減壓蒸乾得產品0.5g。

1.2.固相合成C6NH-S-03

1.3.液相合成Kys-03

1.3.1.Kys-03-c1的合成

合成步驟同實施例一1.3.1。

1.3.2.Kys-03的合成

合成步驟同實施例一1.3.2。

2.Kyas-03的合成

2.1.3’ERCd-01結構的化合物：3’ERCd-01樹脂的合成

2.1.1.3’ERCd-01-c1的合成

向反應瓶內依次加入3’SANCd-01-c5(0.824g，0.0015mol)和10mL的DMF，室溫攪拌溶解，再依次加入TBTU(0.563g)和DIPEA(0.517g)，室溫攪拌溶解，最後加入dlERC-c12(1.09g，0.001mol)室溫攪拌反應過夜，TLC分析，反應合格濃縮掉DMF，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到類白色泡狀固體1.3g。

2.1.2.3’ERCd-01-c2的合成

合成步驟同實施例一2.1.7。

2.1.3.3’ERCd-01樹脂的合成

合成步驟同實施例一2.1.8。

2.2.固相合成Kyas-03

mA為起始單體，T為終端單體，通過固相亞磷醯胺法偶聯引入不同的亞磷醯胺單體。合成步驟同實施例一2.2固相合成Kyas-01。

3.化合物03的合成

精確測定Kys-03與Kyas-03溶液的濃度，合成步驟同實施例一3.化合物01的合成。

實施例四、化合物04的合成

1.Kys-04的合成

1.1.5’ERCc-01結構的化合物：5’ERCc-01-PFP的合成

1.1.1.5’ERCc-01-c1的合成

取N-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺5.0g(28.7mmol)，5’ERCd-01-c3 2.8g(7.6mmol)，加DMF 25mL溶解，加TBTU 9.0g，加DIEA 2mL，室溫反應過夜。加水30mL，DCM50mL，有機層用飽和食鹽水洗滌，減壓蒸乾。過層析柱，用石油醚裝柱，用1L石油醚沖洗柱子(洗脫劑：DCM：甲醇=5%-10%)，得黃色黏稠固體2.9g。

1.1.2.5’ERCc-01-c2的合成

取5’ERCc-01-c1 2.9g，加9mL濃鹽酸，室溫反應過夜。減壓蒸乾，得2.7g。

1.1.3.5’ERCc-01-c3的合成

將化合物5’ERCc-01-c2 1.56g(2.44mmol)和Sanc-c4 3.6g(8.04mmol)加到DMF60mL中，然後加入HOBt 2.24g和HBTU 3.36g，然後緩慢加入DIEA 4.16mL。反應液室溫下攪拌反應1小時。然後加入水，水層用DCM萃取2x10mL。合併有機層，然後依次用飽和碳酸氫鈉80mL,、水40mL、飽和食鹽水60mL洗。用無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾，用矽膠柱層析純化(洗脫液：3-15%甲醇in DCM)，得淡黃色固2.36g。

1.1.4.5’ERCc-01-c4的合成

5’ERCc-01-c3 2.36g(1.2mmol)用甲醇120mL溶解，加入10% Pd-C 1.0g，濕式Degussa型E101 NE/W)。然後常壓下加氫，反應過夜。反應液用矽藻土過濾，濾液減壓蒸乾，得油狀物1.8g，其高解析度質譜圖如圖4所示。

1.1.5.5’ERCc-01-c5的合成

取戊二酸單苄酯0.21g(0.001mol)，用DMF 2mL溶解，然後加入TBTU 0.36g，和DIEA 0.4mL，攪拌反應5分鐘，加5’ERCc-01-c4 1.09g，室溫攪拌反應過夜。減壓蒸乾反應液，蒸乾後，加DCM40mL，水20mL，攪拌5分鐘。分層，有機層用無水硫酸鈉乾燥。過層析柱(洗脫劑：DCM：甲醇=1%-10%)，減壓蒸乾溶劑，得白色產品0.85g。

1.1.6.5’ERCc-01-c6的合成

100mL單口瓶中投5’ERCc-01-c5 0.85g(0.43mmol)，加鈀碳127mg，水泵抽真空，補氫氣，重複三次，氫氣加壓反應過夜，第二日，TLC反應完全。鋪矽藻土過濾鈀碳，減壓蒸乾濾液，得產品0.76g。

1.1.7.5’ERCc-01-PFP的合成

50mL單口瓶中投5’ERCc-01-c6 0.76g(0.40mmol)，加DCM10mL，滴加三氟甲磺酸五氟苯酯0.19g(0.6mmol)，室溫反應1小時，加水10mL洗滌，加飽和亞硫酸氫鈉5mL洗滌，有機層用無水硫酸鈉乾燥10分鐘，有機層減壓蒸乾得產品0.8g。

1.2.固相合成C6NH-S-04

mA為起始單體，C6NH亞磷醯胺單體為終端單體，通過固相亞磷醯胺法偶聯引入不同的亞磷醯胺單體。合成步驟同實施例一1.2固相合成。

1.3.液相合成Kys-04

1.3.1.Kys-04-c1的合成

合成步驟同實施例一1.3.1。

1.3.2.Kys-04的合成

合成步驟同實施例一1.3.2。

2.Kyas-04的合成

2.1.3’ERCc-01結構的化合物：3’ERCc-01樹脂的合成

2.1.1.3’ERCc-01-c1的合成

向反應瓶內依次加入3’SANCd-01-c5(0.824g，0.0015mol)和10mL的DMF，室溫攪拌溶解，再依次加入TBTU(0.563g)和DIPEA(0.517g)，室溫攪拌溶解，最後加入ERC-c12(1.21g，0.001mol)室溫攪拌反應過夜，TLC分析，反應合格濃縮掉DMF，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到白色泡狀固體1.4g。

2.1.2.3’ERCc-01-c2的合成

合成步驟同實施例一2.1.7。

2.1.3.3’ERCc-01樹脂的合成

合成步驟同實施例一2.1.8。

2.2.固相合成Kyas-04

mG為起始單體，mU為終端單體，通過固相亞磷醯胺法偶聯引入不同的亞磷醯胺單體。合成步驟同實施例一2.2固相合成Kyas-01。

3.化合物04的合成

精確測定Kys-04與Kyas-04溶液的濃度，合成步驟同實施例一3.化合物01的合成。

實施例五、化合物09的合成

1.Kyas-09的合成

1.1.3’qfSANCd-01結構的化合物：3’qfSANCd-01樹脂的合成

1.1.1.3’qfSANCd-01-c1的合成

向反應瓶內依次加入羥脯胺醇鹽酸鹽(1.53g，0.01mol)和15mL的DMF，室溫攪拌溶解，再依次加入辛二酸單甲酯(1.98g，0.0105mol)、HBTU(4.55g)和DIPEA(3.88g)，室溫攪拌反應過夜，TLC分析，反應合格濃縮掉DMF，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到黃色黏稠液體2.38g。

1.1.2.3’qfSANCd-01-c2的合成

向反應瓶內依次加入3’qfSANCd-01-c1(2.87g 0.01mol)和30ml吡啶，室溫攪拌溶解，再依次加入DMAP(0.61g)和DMT-CL(4.06g 0.012mol)，室溫攪拌反應過夜，TLC分析，反應合格濃縮掉吡啶，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到黃色黏稠液體4.13g(產率70%)。

1.1.3.3’qfSANCd-01-c3的合成

向反應瓶內依次加入3’qfSANCd-01-c2(5.89g，0.01mol)和60mL溶劑(THF/水/甲醇=1：1：4)，室溫攪拌溶解，再加入LiOH(1.26g)，室溫攪拌反應2h，TLC分析，反應合格濃縮掉溶劑，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到黃色黏稠液體4.5g。

1.1.4.3’qfSANCd-01-c4的合成

向反應瓶內依次加入3’qfSANCd-01-c3(0.863g，1.5mmol)和10mL的DMF，室溫攪拌溶解，再依次加入TBTU(0.963g)和DIPEA(0.517g)，室溫攪拌溶解，最後加入dlSANC-c12(1.62g，1mmol)室溫攪拌反應過夜，TLC分析，反應合格濃縮掉DMF，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到黃色黏稠液體1.743g。

1.1.5.3’qfSANCd-01-c5的合成

向反應瓶內依次加入3’qfSANCd-01-c4(2.18g，0.001mol)和10mL的DCM，室溫攪拌溶解，再依次加入DBU(0.256g)和丁二酸酐(0.3g，0.003mmol)，室溫攪拌反應，TLC分析，反應合格濃縮掉DCM，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到3’qfSANCd-01-c5為2.05g。

1.1.6.3’qfSANCd-01-c6的合成

向反應瓶內依次加入3’qfSANCd-01-c5(1.14g，0.0005mmol)和12mL的DMF，室溫攪拌溶解，再依次加入HBTU(0.19g)、DIPEA(0.194g)和GE樹脂(1.83g)，35℃搖床搖動4h，將物料轉移到合成管中，過濾，在氮氣鼓泡下樹脂用DMF沖洗4次，然後加入CAP A+CAP B在氮氣鼓泡下進行封端反應半小時，取少量樹脂進行kaiser test至測試液呈現黃色，封端完畢，濾餅分別用甲醇、DCM進行沖洗；真空拉乾；得3’qfSANCd-01為2.5g，取代度140μmol/g。

1.2.固相合成Kyas-09

2.化合物09的合成

精確測定Kys-01與Kyas-09溶液的濃度，合成步驟同實施例一3.化合物01的合成。

實施例六、化合物10的合成

1.Kys-10的合成

1.1.固相合成C9NH-S-01

mU為起始單體，C9NH亞磷醯胺單體為終端單體，通過固相亞磷醯胺法偶聯引入不同的亞磷醯胺單體。合成步驟同實施例一1.2固相合成C6NH-S-01。

1.2.液相合成Kys-10

1.2.1.Kys-10-c1的合成

合成步驟同實施例一1.3.3。

1.2.2.Kys-01的合成

合成步驟同實施例一1.3.4。

2.Kyas-10的合成

2.1.3’pdSANCd-01結構的化合物：3’pdSANCd-01樹脂的合成

2.1.1.3’pdSANCd-01-c1的合成

向反應瓶內依次加入4,4-哌啶二基二甲醇(1.59g，0.01mol)和20mL的DMF，室溫攪拌溶解，再依次加入辛二酸單甲酯(1.98g， 0.0105mol)、HBTU(4.55g)和DIPEA(3.88g)，室溫攪拌反應過夜，TLC分析，反應合格濃縮掉DMF，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到黃色黏稠液體2.65g。

2.1.2.3’pdSANCd-01-c2的合成

向反應瓶內依次加入3’pdSANCd-01-c1(3.29g，0.01mol)和33mL吡啶，室溫攪拌溶解，再依次加入DMAP(0.61g)和DMT-CL(4.06g，0.012mol)，室溫攪拌反應過夜，TLC分析，反應合格濃縮掉吡啶，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到黃色黏稠液體4.74g。

2.1.3.3’pdSANCd-01-c3的合成

向反應瓶內依次加入3’pdSANCd-01-c2(3.16g，5mmol)和32mL溶劑(THF/水/甲醇=1：1：4)，室溫攪拌溶解，再加入LiOH(0.63g)，室溫攪拌反應2h，TLC分析，反應合格濃縮掉溶劑，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到黃色黏稠液體2.78g。

2.1.4.3’pdSANCd-01-c4的合成

向反應瓶內依次加入3’pdSANCd-01-c3(0.93g，1.5mmol)和10mL的DMF，室溫攪拌溶解，再依次加入TBTU(0.963g)和DIPEA (0.517g)，室溫攪拌溶解，最後加入dlSANC-c12(0.562g，1mmol)室溫攪拌反應過夜，TLC分析，反應合格濃縮掉DMF，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到黃色黏稠液體1.688g。

2.1.5.3’pdSANCd-01-c5的合成

向反應瓶內依次加入3’pdSANCd-01-c4(2.22g，0.001mol)和22mL的DCM，室溫攪拌溶解，再依次加入DBU(0.256g)和丁二酸酐(0.3g，0.003mmol)，室溫攪拌反應，TLC分析，反應合格濃縮掉DCM，加水，用DCM萃取，有機相再用飽和氯化鈉水溶液洗滌，有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾、濃縮，最後過矽膠柱進行純化，得到3’pdSANCd-01-c5為2.11g。

2.1.6.3’pdSANCd-01的合成

向反應瓶內依次加入3’pdSANCd-01-c5(1.16g，0.0005mmol)和12mL的DMF，室溫攪拌溶解，再依次加入HBTU(0.19g)、DIPEA(0.194g)和GE樹脂(1.85g)，35℃搖床搖動4h，將物料轉移到合成管中，過濾，在氮氣鼓泡下樹脂用DMF沖洗4次，然後加入CAP A+CAP B在氮氣鼓泡下進行封端反應半小時，取少量樹脂進行kaiser test至測試液呈現黃色，封端完畢，濾餅分別用甲醇、DCM進行沖洗；真空乾燥；得3’pdSANCd-01為2.6g，取代度145μmol/g。

2.固相合成Kyas-10

通過固相亞磷醯胺法偶聯引入不同的亞磷醯胺單體，mU為起始單體，mU為終端單體。合成步驟同實施例一2.2固相合成Kyas-01。

3.化合物10的合成

精確測定Kys-10與Kyas-10溶液的濃度，合成步驟同實施例一3.化合物01的合成。

實施例七、化合物05~化合物08以及化合物11~化合物18參照化合物01~化合物04的合成。

實施例八、HepG2.215細胞實驗觀察化合物對HBV基因的體外抑制效果

1.實驗分組

空白對照組：加入含2% FBS的DMEM培養基培養72h。

測試樣品組：分別加入濃度為5nM、0.5nM或0.05nM的測試樣品稀釋液，每個濃度3個重複孔，37℃ 5%CO₂培養箱中培養72h。

2.實驗材料

HepG2.2.15細胞

3.實驗試劑

4.實驗儀器

5.測試樣品：

6.試驗過程

HepG2.2.15細胞在96孔細胞培養盤中培養，每三天更換一次新鮮培養基，第6天加入上述所配不同濃度含藥培養液，繼續培養到第9天。收集上清液，檢測試劑盒檢測細胞上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA的含量。並與對照不給藥組進行OD值對比，按照比值確定有效性。

7.實驗結果

7.1對HepG2.2.15細胞中HBsAg的抑制效果：見圖6

7.2 對HepG2.2.15細胞上清中HBeAg的抑制效果：見圖7

7.3 對HepG2.2.15細胞上清中HBV DNA的抑制效果：見圖8

實施例九、新化合物對基因轉殖小鼠模型HBV基因的抑制效果觀察

1.實驗方案

取適齡的雄性HBV基因轉殖小鼠(要求HBsAg表達顯著)用於實驗評估，挑出90隻體重處於25g左右的小鼠，隨機分成18組，每組5隻，在Day0分別通過皮下注射給藥：3mg/kg；給藥體積為100-200μL。用藥前，做小鼠血HBsAg測定，儘量保持各組的HBsAg的平均水平一致。

2.測試樣品與試劑

3.試劑盒

4.實驗儀器

5.實驗結果

抑制效果見圖9。

實施例十、化合物01對基因轉殖小鼠模型HBV的HBsAg表達的抑制效果的持續性研究

1.實驗方案

取適齡的雄性HBV基因轉殖小鼠(要求HBsAg表達顯著)用於實驗評估，挑出10隻體重處於25g左右的小鼠，隨機分成2組，每組5隻，分別為對照組和給藥組，在Day0分別通過皮下注射給藥3mg/kg；給藥體積為100-200μL。用藥前，採血測定HBsAg，儘量保持各組的HBsAg的水平一致。通過小鼠眼眶靜脈叢採集全血，採血時間點為給藥前(day 0)、給藥後-第1週、第2週、第3週、第4週、第5週和第6週，檢測HBsAg，觀察化合物01對HBV基因表達抑制的持續性。

具體給藥資訊如下表所示：

2.樣品與試劑

3.試劑盒

4.實驗儀器

5.試驗結果

結果表明，化合物01在第1週即達到最佳抑制效果99.08%，第2週至第3週趨勢有所下降，但仍呈現高的抑制率90%左右，第4到第6週呈下降趨勢，但依然維持抑制效果在75%左右。化合物01對HBV HBsAg表達有持續的抑制效果，可穩定抑制表達在6週左右。化合物01體內抑制HBV HBsAg效果圖見圖10。

<110> 大陸商廈門甘寶利生物醫藥有限公司(KYLONOVA(XIAMEN)BIOPHARMA CO.,LTD.)

<120> 一種新化合物及其用途

<140> TW109121611

<141> 2020-06-24

<150> CN 201910576037.1

<151> 2019-06-28

<150> CN 201911281389.0

<151> 2019-12-13

<160> 42

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV siRNA的正義股

<400> 1

<210> 2

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> HBV siRNA的反義股

<400> 2

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<212> RNA

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<223> HBV siRNA的正義股

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<223> HBV siRNA的正義股

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<223> HBV siRNA的正義股

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Claims

一種化合物，其結構中包含有干擾核酸、轉接點及末端修飾鏈，所述末端修飾鏈由連接鏈D、連接子B、支鏈L和肝靶向特異性配體X組成，所述末端修飾鏈與所述干擾核酸之間通過轉接點R₁和R₂連接，所述結構為通式(I)所示：
其中：所述干擾核酸為抑制B型肝炎病毒(HBV)基因表達的干擾核酸，其為抗B型肝炎病毒的siRNA，且所述化合物選自化合物01~化合物18，並如下所示：

所述帶末端修飾鏈的siRNA_01至帶末端修飾鏈的siRNA_16如下所示：

其中，mG、mA、mC和mU為2’-甲氧基(2’-OMe)修飾的核苷酸；fG、fA、fC和fU為2’-氟修飾的核苷酸；s為硫代磷酸核苷間鍵，其餘的核苷酸單體通過磷酸二酯鍵連接；Gs=3’-硫代鳥糞嘌呤、As=3’-硫代腺嘌呤、Us=3’-硫代尿嘧啶、Cs=3’-硫代胞嘧啶、dTs或Ts=2’-去氧-3’-硫代胸腺嘧啶核苷酸，其中，所述末端修飾鏈組合01至末端修飾鏈組合16如下所示：
一種如請求項1所述之化合物在製備用於治療HBV感染的相關疾病的藥物中的用途，其中，所述HBV感染為慢性B型肝炎病毒感染或急性B型肝炎病毒感染。
如請求項2所述之用途，其中，所述肝靶向特異性配體X是針對肝臟中去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)特異性的，所述HBV感染的相關疾病為慢性B型肝炎，所述化合物持續抑制HBV的B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA的表達。
一種藥物組合物，該藥物組合物包含請求項1所述之化合物和藥學上可接受的輔料。
如請求項4所述之藥物組合物，其中，所述藥物組合物的劑型為皮下注射劑。