JP7383308B2 - 新規化合物及びその適用 - Google Patents

新規化合物及びその適用 Download PDF

Info

Publication number
JP7383308B2
JP7383308B2 JP2021577836A JP2021577836A JP7383308B2 JP 7383308 B2 JP7383308 B2 JP 7383308B2 JP 2021577836 A JP2021577836 A JP 2021577836A JP 2021577836 A JP2021577836 A JP 2021577836A JP 7383308 B2 JP7383308 B2 JP 7383308B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
synthesis
added
liver
strand seq
sirna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021577836A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022540363A (ja
Inventor
シュエチン ルー
チュオ ムー
シェンジュン ワン
ヤンチュン ドゥ
Original Assignee
キロノヴァ （シアメン） バイオファーマ カンパニー リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by キロノヴァ （シアメン） バイオファーマ カンパニー リミテッド filed Critical キロノヴァ （シアメン） バイオファーマ カンパニー リミテッド
Publication of JP2022540363A publication Critical patent/JP2022540363A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7383308B2 publication Critical patent/JP7383308B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

本発明は、新規化合物及びＨＢＶ遺伝子発現抑制におけるその適用に関する。該化合物の構造中にＨＢＶ遺伝子発現を抑制する干渉核酸、トランジションポイント及びその末端修飾鎖が含まれている。末端修飾鎖によって、このようなｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖３’末端に２つ又は３つのＮ－アセチルガラクトサミンを導入し、これに対応してセンス鎖５’末端に２つ又は１つのＮ－アセチルガラクトサミンを導入することができ、導入されたＮ－アセチルガラクトサミンの総数は４つである。ＨｅｐＧ ２細胞とトランスジェニックマウスの薬効実験により、このような新規化合物はＨＢＶのＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡの発現を持続的に抑制可能なことが証明されている。
ＲＮＡｉ
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）は１９９８年にアンドリュー・ファイア（Ａｎｄｒｅｗ Ｚ．Ｆｉｒｅ）らがカエノラブディティス・エレガンスでアンチセンスＲＮＡ抑制の実験を行った時に発見され、この過程をＲＮＡｉと呼んだ。この発見は『Ｓｃｉｅｎｃｅ』誌により２００１年の１０大科学業績の一つに選定され、そして２００２年の１０大科学業績のトップとなった。それ以降、ＲＮＡｉを作用機序とするｓｉＲＮＡは潜在的な遺伝子治療薬として広く注目されてきて、２００６年、アンドリュー・ファイアとクレイグ・メロー（Ｃｒａｉｇ Ｃ．Ｍｅｌｌｏ）はＲＮＡｉ機序研究における貢献によりノーベル生理・医学賞を受賞した。ＲＮＡｉは動物、植物や真菌を含め多くの生物において二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によってトリガーすることができ、ＲＮＡｉ過程において、「Ｄｉｃｅｒ」と呼ばれるエンドヌクレアーゼは長鎖ｄｓＲＮＡを２１～２５ヌクレオチド長の小断片に切断又は「細断」する。これらの小断片は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれ、そのアンチセンス鎖（Ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）がＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（ＡＧＯ２）にローディングされている。ＡＧＯ２ローディングはＲＩＳＣ－ｌｏａｄｉｎｇ複合体で発生し、このＲＩＳＣ－ｌｏａｄｉｎｇ複合体は３元複合体であり、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質、Ｄｉｃｅｒ、及びｄｓＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰと略称する）からなっている。ローディング中にＡＧＯ２によってセンス鎖（Ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）が切断されて排出される。その後、ＡＧＯ２はアンチセンス鎖を用いて、完全に相補的な配列を含むｍＲＮＡと結合し、その後、これらのｍＲＮＡの切断を触媒したところ、ｍＲＮＡが分裂して翻訳テンプレートの作用を失い、さらに関連タンパク質の合成が阻止される。切断後、切断されたｍＲＮＡは放出され、アンチセンス鎖をローディングしたＲＩＳＣ－ｌｏａｄｉｎｇ複合体は、別のラウンドの切断にリサイクルされる。
統計によると、人体内の疾患関連タンパク質のうち、約８０％以上のタンパク質は現在一般的な小分子薬及び生体高分子製剤によって標的とされることができず、薬ができないタンパク質である。遺伝子の発現、沈黙などの機能によって疾患を治療することを目的とした遺伝子治療は、業界では、化学小分子薬、生体高分子薬に次ぐ第３世代の治療薬とされている。この治療法では、遺伝子レベルで疾患を治療し、薬ができないタンパク質による制約を受けない。遺伝子治療にいてＲＮＡｉ技術の最も主流のタイプとして、ＲＮＡｉ技術はｍＲＮＡのレベルで疾患を治療するものであり、タンパク質レベルで治療する化学小分子薬及び生体高分子薬よりも高い効率がある。ＲＮＡｉ技術によれば、特定の遺伝子配列に基づいて、特異性が高く、抑制効果が良いｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖配列を設計し、これらの一本鎖配列を固相合成した後、特定のアニーリング緩衝液中で塩基対合のルールに従ってセンス鎖とアンチセンス鎖を対合してｓｉＲＮＡとし、最後に、ベクター系を介して生体内の対応する標的に送達し、標的ｍＲＮＡを分解し、標的ｍＲＮＡの翻訳テンプレートとしての機能を破壊し、関連タンパク質の合成を阻止する。
ｓｉＲＮＡの送達系
ｓｉＲＮＡは血液や組織で不安定であり、ヌクレアーゼによって分解されやすく、ｓｉＲＮＡの安定性を高めるためには、ｓｉＲＮＡ骨格を修飾してもよいが、これらの化学修飾はヌクレアーゼ分解から限定的な保護作用を提供するだけであり、最終的にｓｉＲＮＡの活性に影響を与える恐れがある。そのため、ｓｉＲＮＡが安全かつ効率的に細胞膜を通過することを確保するために、対応する伝達系が必要とされる。ｓｉＲＮＡは分子質量が大きく、大量の負電荷を持ち、さらに水溶解性が高いため、そのもの自体が順調に細胞膜を通過して細胞内に到達することができない。
リポソームの基本構造は親水核とリン脂質との二分子層から構成され、生物膜のようなリン脂質二分子層を備え、高い生体適合性を持っているため、最も人気があり、最も広く応用されているｓｉＲＮＡベクターとなっている。リポソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達とは、主としてｓｉＲＮＡを脂質体内に封じ込み、ヌクレアーゼによる分解からｓｉＲＮＡを保護し、ｓｉＲＮＡの細胞膜障害への通過効率を高め、細胞の吸収を促進する。例えば陰イオンリポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、免疫リポソーム、膜融合リポソーム（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）や陽イオンリポソームなどは、ある程度の進展を遂げているにも係わらず、リポソーム自体は、炎症反応を起こしやすく、投与前に、発生可能な急性炎症反応を減少するようにセチリジンやデキサメタゾンなどの抗ヒスタミンやホルモン類を多く使用しなければならない。このため、実際の臨床応用において治療領域のすべてに適するわけではなく、特に慢性Ｂ型肝炎のような治療周期の長い疾患では、長期の使用により発生可能な蓄積毒性は潜在的な安全上のリスクである。
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）
肝臓中のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）は肝細胞により特異的に発現される受容体であり、高効率なエンドサイトーシス型受容体である。生体内の生理状況下で各種糖タンパク質は酵素や酸でシアル酸を加水分解された後、露出したペナルティメートがガラクトース残基であるため、ＡＳＧＰＲが特異的に結合する糖はガラクトシル基であり、それでガラクトース特異的受容体とも呼ばれる。ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンなどの単糖や多糖分子はＡＳＧＰＲに対して高い親和性を有する。ＡＳＧＰＲの主な生理学的機能は血液中のアシアロ糖タンパク質、リポタンパク質などの物質の除去を媒介することであり、ウイルス性肝炎、肝硬変、肝臓癌などの肝疾患の発症や進行と密接な関係がある。このようなＡＳＧＰＲの特性の発見によって、肝疾患の診断や治療に重要な役割が果たされている（Ａｓｈｗｅｌｌ Ｇ，Ｈａｒｆｏｒｄ Ｊ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８２ ５１：５３１－５５４）。ガラクトース又はガラクトサミン及びそれらの誘導体を構造中に含む肝疾患治療薬は、ＡＳＧＰＲに特異的に親和性を有し、それにより肝を能動的に標的とする特性を有し、その送達に他のベクター系を必要としない。
本発明は、新規化合物及びＨＢＶ遺伝子発現抑制におけるその適用に関する。該化合物の構造中にＨＢＶ遺伝子発現を抑制する干渉核酸、トランジションポイント及びその末端修飾鎖が含まれている。末端修飾鎖と干渉核酸とは、トランジションポイントを介して連結されている。末端修飾鎖によって、このようなｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖３’末端に２つ又は３つのＮ－アセチルガラクトサミンを導入し、これに対応してセンス鎖５’末端に２つ又は１つのＮ－アセチルガラクトサミンを導入することができ、合計４つのＮ－アセチルガラクトサミンは革新的な導入手段であり、インビボ及びインビトロの薬効実験によれば、この新規化合物によってＨＢＶのＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、及びＨＢＶ ＤＮＡの発現を持続的かつ効率よく抑制可能なことが証明された。
本発明の一態様は、ＨＢＶ遺伝子発現を抑制する干渉核酸、トランジションポイント及びその末端修飾鎖を構造中に含む化合物を提供し、前記末端修飾鎖は、連結鎖Ｄと、リンカーＢと、分岐鎖Ｌと、肝臓を標的とする特異的配位子Ｘとから構成され、前記末端修飾鎖と前記干渉核酸はトランジションポイントＲ１／Ｒ２を介して連結され、その構造は一般式（Ｉ）に示され、
Figure 0007383308000001
 （Ｉ）
式中、
ｎが１である場合、ｍは３であり、ｎが２である場合、ｍも２であり、
Ｒ１は－ＮＨ（ＣＨ２）ｘＣＨ２－であり、ここでｘは３～１０の整数であり、
Ｒ２は－ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）－、又は一級アルコールと二級アルコールの両方又は単独の一級アルコールを持つ他の窒素含有構造であり、この構造は１本の直鎖又は直鎖に分岐鎖を有するものであってもよいし、環状構造であってもよい。いくつかの好ましい実施態様では、Ｒ２は一級アルコールと二級アルコールを持つピロール環又はピペリジン環であってもよく、具体的には、以下の構造から選ばれ、
Figure 0007383308000002
 前記肝臓を標的とする特異的配位子Ｘはガラクトース、ガラクトサミン、及びＮ－アセチルガラクトサミンから選ばれ、
前記分岐鎖ＬはＣ３～Ｃ１８の直鎖であり、該直鎖にはカルボニル、アミド、ホスホリル、酸素原子又はこれらの基の組み合わせが含まれ、
前記リンカーＢは以下の構造式から選ばれ、
Figure 0007383308000003
 式中、Ａ１はＣ、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、ｒ１は１～１５の正の整数であり、ｒ２は０～５の整数であり、Ａ２はＣ、Ｏ、Ｓ、アミノ、カルボニル、アミド、ホスホリル又はチオホスホリルであり、
前記連結鎖ＤはＣ５～Ｃ２０を含有し、アミノ、カルボニル、アミド、酸素原子、硫黄原子、チオホスホリル、ホスホリル、環状構造又はこれらの基の組み合わせを含有する。
上記した技術案では、前記干渉核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はＡｇｏｍｉｒを含むが、これらに限定されず、好ましくはｓｉＲＮＡ、さらに好ましくは抗Ｂ型肝炎ウイルスｓｉＲＮＡである。
前記ｓｉＲＮＡをＨＢＶ ＲＮＡｉの１９ ｍｅｒに用いる配列設計については、ＨＢＶ ｃＤＮＡ標的配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＦ１００３０９．１）に従って設計されたものである。これらの標的配列は、１９ ｍｅｒ ｄｅ１コア領域と、これらのコア領域を中心として拡張又はシフトした対応するＤＮＡ配列とを含む。その目的としては、基本的な標的部位を介して最適な有効配列を見出すことであり、これらの配列は部分的又は全体的に標的部位に適合してもよく、慢性Ｂ型肝炎の治療に適用することができる。
標的の１９ｍｅｒヌクレオチド配列は、センス鎖（Ｓ）及びアンチセンス鎖（ＡＳ）の２つの鎖を含む。このうちセンス鎖の１９番目のヌクレオチド（５’→３’）はアンチセンス鎖の１番目のヌクレオチド（５’→３’）とワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）のルールに従って塩基対を形成することができる。このルールに従えば、センス鎖（５’→３’）の１～１９塩基とアンチセンス鎖（５’→３’）の１９～１塩基はそれらに対応する塩基と対合して二本鎖を形成することができる。二本鎖では末端位置に１～３個の不対塩基の存在が許容される。本発明では、実際の使用に応じてＨＢＶ ｓｉＲＮＡの基本配列をスクリーニングすることができる。基本配列に基づいて３’又は５’末端のシフトを行い、より有効で特異的な配列をスクリーニングする。ｓｉＲＮＡ構造の研究結果によると、センス鎖又はアンチセンス鎖３’末端の一本鎖の突出部分の最適選択はＴＴ、ＵＵ、ＡＵやＵＡであり、このように変化配列が得られる。いずれかのセンス鎖はアンチセンス鎖と二本鎖を形成することに使用することができ、２本の鎖は少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３個の塩基の連続した対を維持しなければならない。挙げられたこれらの配列は標的と１、２、又は３つの異なるものもあり、センス鎖の３’末端の最後の塩基はＵ、ＡやＴであってもよい。アンチセンス鎖の３’末端の最後の位置は、Ｕ、ＡやＴであってもよい。上記のルールに従って、本発明は、以下の候補配列をスクリーニングする。
Figure 0007383308000004
Figure 0007383308000005
組織におけるｓｉＲＮＡの安定性のために、ｓｉＲＮＡの各モノマーは、活性に影響を与えることなく、あるいは活性を増強することさえなく修飾されている。センス鎖とアンチセンス鎖には不完全に対合した塩基が１つ、２つや３つ存在することが許容される。その中のヌクレオチドは、異なる修飾基を有していてもよく、鎖全体又は部分的に修飾されていてもよい。その中の各鎖には、１つ、複数、さらには全てがチオを持つ塩基を含んでいてもよい。
本発明の前記化合物において、修飾されたセンス鎖及びアンチセンス鎖は以下の配列から選ばれる。
Figure 0007383308000006
Figure 0007383308000007
ここで、
ｍＧ、ｍＡ、ｍＣ及びｍＵは２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）で修飾されたヌクレオチドであり、ｆＧ、ｆＡ、ｆＣ及びｆＵは２’－フッ素で修飾されたヌクレオチドであり、ｓはホスホロチオ酸ヌクレオシド間結合であり、残りのヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合を介して連結されている。詳細は以下のとおりである。
Ｇ＝グアニル酸、Ａ＝アデノシン、Ｕ＝ウリジン酸、Ｃ＝シチジン、ｄＴ又はＴ＝２’－デオキシチミジン；
Ｇｓ＝３’－チオグアニル酸、Ａｓ＝３’－チオアデノシン、Ｕｓ＝３’－チオウリジン酸、Ｃｓ＝３’－チオシチジン、ｄＴｓ又はＴｓ＝２’－デオキシ－３’－チオチミジン；
ｍＧ＝２’－Ｏ－メチルグアニル酸、ｍＡ＝２’－Ｏ－メチルアデノシン、ｍＵ＝２’－Ｏ－メチルウリジン酸、ｍＣ＝２’－Ｏ－メチルシチジン；
ｍＧｓ＝２’－Ｏ－メチル－３’－チオグアニル酸、ｍＡｓ＝２’－Ｏ－メチル－３’－チオアデノシン、ｍＵｓ＝２’－Ｏ－メチル－３’－チオウリジン酸、ｍＣｓ＝２’－Ｏ－メチル－３’－チオシチジン；
ｆＧ＝２’－フルオログアニル酸、ｆＡ＝２’－フルオロアデノシン、ｆＵ＝２’－フルオロウリジン酸、ｆＣ＝２’－フルオロシチジン；
ｆＧｓ＝２’－フルオロ－３’－チオグアニル酸、ｆＡｓ＝２’－フルオロ－３’－チオアデノシン、ｆＵｓ＝２’－フルオロ－３’－チオウリジン酸、ｆＣｓ＝２’－フルオロ－３’－チオシチジン。
さらに好ましくは、いくつの好ましい実施例の態様では、前記化合物において、修飾されたセンス鎖及びアンチセンス鎖は以下の配列から選ばれる。
Figure 0007383308000008
前記末端修飾鎖は、連結鎖Ｄと、リンカーＢと、立体障害安定構造を含有する分岐鎖Ｌと、肝臓を標的とする特異的配位子Ｘとから構成され、該末端修飾鎖の一般式（ＩＩ）は以下のとおりである。
Figure 0007383308000009
ｎ＝１の場合、構造一般式（ＩＩ）は以下のとおりである。
Figure 0007383308000010
ｎ又はｍ＝２の場合、構造一般式（ＩＩ）は以下のとおりである。
Figure 0007383308000011
ｍ＝３の場合、構造一般式（ＩＩ）は以下のとおりである。
Figure 0007383308000012
前記肝臓を標的とする特異的配位子Ｘは、多糖、多糖誘導体又は単糖及び単糖誘導体の１種又は複数種であってもよい。
好ましくは、前記肝臓を標的とする特異的配位子Ｘの一般式（ＩＩＩ）は以下のとおりである。
Figure 0007383308000013
 （ＩＩＩ）
式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ水素又はヒドロキシ保護基である。
さらに好ましくは、前記肝臓を標的とする特異的配位子Ｘは、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン又は以下の構造から選ばれる１種又は複数種である。
Figure 0007383308000014
 式中、Ｒ１はＯＨ、ＮＨＣＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３から選ばれる１種又は２種である。
前記立体障害安定構造を含有する分岐鎖ＬはＣ３～Ｃ１８の直鎖であり、該直鎖には１つ又は複数のカルボニル、アミド、ホスホリル、酸素原子又はこれらの基の組み合わせが含まれ、以下のような構造から選ばれる１種又は複数種としてもよい。
Figure 0007383308000015
 式中、ｒ１は１～１２の正の整数であり、ｒ２は０～２０の整数であり、ＺはＨ又はＣＨ３である。
前記リンカーＢは以下の構造式から選ばれる。
Figure 0007383308000016
 式中、Ａ１はＣ、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、ｒ１は１～１５の正の整数であり、ｒ２は０～５の整数であり、Ａ２はＣ、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、カルボニル、アミド、ホスホリル又はチオホスホリルである。
好ましくは、前記リンカーＢは以下の構造式から選ばれる。
Figure 0007383308000017
Figure 0007383308000018
Figure 0007383308000019
Figure 0007383308000020
Figure 0007383308000021
 式中、ｒ１、ｒ３、ｒ４、ｒ５はそれぞれ１～１５の正の整数であり、ｒ６は１～２０の正の整数であり、ｒ７は２～６の正の整数であり、ｒ８は１～３の正の整数である。
さらに好ましくは、前記リンカーＢは以下の構造から選ばれる。
Figure 0007383308000022
Figure 0007383308000023
Figure 0007383308000024
前記連結鎖ＤはＣ５～Ｃ２０を含有し、アミノ、カルボニル、アミド、酸素原子、硫黄原子、チオホスホリル、ホスホリル、環状構造又はこれらの基の組み合わせを含有してもよい。
好ましくは、前記連結鎖Ｄは以下の構造から選ばれる１種である。
Figure 0007383308000025
Figure 0007383308000026
Figure 0007383308000027
Figure 0007383308000028
Figure 0007383308000029
Figure 0007383308000030
Figure 0007383308000031
 式中、各ｎは１～２０の正の整数であり、且つ各ｎは同じ又は異なる正の整数である。ｐは１～６の正の整数であり、ｓは２～１３の正の整数であり、Ｒ１とＲ２は同じ又は異なる置換基であり、その構造式は以下の構造のうちの１種である：－Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ－（ＣＨ３）２、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５、－Ｃ８ＮＨ６、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－ＣＨ２－ＣＯＯＨ、－ＣＨ２－ＣＯＮＨ２、－（ＣＨ２）２－ＣＯＯＨ、－（ＣＨ２）４－ＮＨ２、－（ＣＨ２）２－ＣＯＮＨ２、－（ＣＨ２）－Ｓ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＯＨ、－ＣＨ（ＣＨ３）－ＯＨ、－ＣＨ２－ＳＨ、－ＣＨ２－Ｃ３Ｈ３Ｎ２、－（ＣＨ２）３ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２。
さらに好ましくは、前記連結鎖Ｄは以下の構造から選ばれる１種である。
Figure 0007383308000032
Figure 0007383308000033
Figure 0007383308000034
Figure 0007383308000035
Figure 0007383308000036
Figure 0007383308000037
Figure 0007383308000038
Figure 0007383308000039
Figure 0007383308000040
前記化合物では、センス鎖５’末端の修飾鎖は１つのＮ－アセチルガラクトサミン又は２つのＮ－アセチルガラクトサミンを持っており、以下の構造から選ばれる１種である。
Figure 0007383308000041
Figure 0007383308000042
Figure 0007383308000043
Figure 0007383308000044
Figure 0007383308000045
Figure 0007383308000046
Figure 0007383308000047
Figure 0007383308000048
Figure 0007383308000049
Figure 0007383308000050
いくつかの好ましい実施例では、前記化合物のセンス鎖５’末端の修飾鎖は下表の構造式から選ばれる。
Figure 0007383308000051
Figure 0007383308000052
前記化合物のアンチセンス鎖３’末端の修飾鎖は２つ又は３つのＮ－アセチルガラクトサミンを持っており、修飾鎖中の
Figure 0007383308000053
 は以下の構造から選ばれる１種である。
Figure 0007383308000054
Figure 0007383308000055
Figure 0007383308000056
Figure 0007383308000057
Figure 0007383308000058
Figure 0007383308000059
Figure 0007383308000060
Figure 0007383308000061
Figure 0007383308000062
Figure 0007383308000063
いくつかの好ましい実施例では、前記化合物のアンチセンス鎖３’末端の修飾鎖は好ましくは下表の構造式から選ばれる。
Figure 0007383308000064
Figure 0007383308000065
Figure 0007383308000066
いくつかの好ましい実施例では、前記化合物において、センス鎖５’末端の末端修飾鎖とアンチセンス鎖３’末端の修飾鎖との組み合わせは、好ましく下表に示される構造のうちの１種である。
Figure 0007383308000067
Figure 0007383308000068
Figure 0007383308000069
Figure 0007383308000070
いくつかの好ましい実施例では、本発明の前記化合物に含まれるセンス鎖５’末端及びアンチセンス鎖３’末端の連結修飾鎖は下表に示される。
Figure 0007383308000071
Figure 0007383308000072
いくつかの好ましい実施例では、本発明の前記化合物の構造は下表に示される。
Figure 0007383308000073
Figure 0007383308000074
本発明の別の態様では、前記肝関連疾患は、急性・慢性肝炎、肝臓癌、遺伝性肝疾患、肝硬変、脂肪肝、糖尿病を含む、肝関連疾患を治療する医薬品の製造における本発明の前記化合物の適用を提供する。
本発明のさらに別の態様では、前記ＨＢＶ感染は、慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染、急性Ｂ型肝炎ウイルス感染を含む、ＨＢＶ感染関連疾患を治療する医薬品の製造における本発明の前記化合物の適用を提供する。
前記肝臓を標的とする特異的配位子Ｘは、肝臓中のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対して特異的なものであり、前記ＨＢＶ感染関連疾患は慢性Ｂ型肝炎であり、前記化合物はＨＢＶのＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡの発現を持続的に抑制することができる。
本発明のさらなる態様では、本発明の前記化合物と薬学的に許容される補助材料とを含み、好ましい剤形は、皮下注射剤である、医薬組成物を提供する。
従来技術と比較して、本発明の有益な効果は次の通りである。
（１）リポソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達と比較して：リポソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達は、主にリポソームがｓｉＲＮＡをリポソーム内に封じ込み、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼによる分解から保護し、ｓｉＲＮＡの細胞膜障害への通過効率を高め、細胞の吸収を促進する。、例えばアニオン性リポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、免疫リポソーム、膜融合リポソーム（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）及びカチオン性リポソーム等のリポソームは、ある程度の進展を遂げているにも係わらず、リポソーム自体は、炎症反応を起こしやすく、投与前に、発生可能な急性炎症反応を減少するようにセチリジンやデキサメタゾンなどの抗ヒスタミンやホルモン類を多く使用しなければならない。このため、実際の臨床応用において治療領域のすべてに適するわけではなく、特に慢性Ｂ型肝炎のような治療周期の長い疾患では、長期の使用による蓄積毒性は潜在的な安全上の潜在的な危険である恐れがある。
（２）革新的なＮ－アセチルガラクトサミン導入方法：
３つのＮ－ガラクトサミン構造を有するｓｉＲＮＡのＨＢｓＡｇ阻害効果と較べて、現在Ｉ／ＩＩ期にある慢性Ｂ型肝炎治療用ｓｉＲＮＡ薬としては、ＡＲＯ－ＨＢＶとＡＬＮ－ＨＢＶ０２がある。ＡＲＯ－ＨＢＶはｓｉＡＲＮＡのセンス鎖の５’末端に連結鎖を介して３個のＮ－アセチルガラクトサミンを導入し、ＡＬＮ－ＨＢＶ０２はｓｉＲＮＡセンス鎖の３’末端に連結鎖を介して３個のＮ－アセチルガラクトサミンを導入したが、これらの薬剤では、ガラクトサミンが導入された部位がいずれもセンス鎖にあり、そして３個のＮ－アセチルガラクトサミンが導入された。本発明から提供される化合物では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端に異なる数又は同じ数のＮ－アセチルガラクトサミンが同時に導入された。現在、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端に同時に導入されたという報道が見られず、特にアンチセンス鎖の３’に３つのＮ－アセチルガラクトサミンを導入するのは革新的な導入態様である。実施例によれば、この導入態様によってｓｉＲＮＡがＨＢＶ遺伝子を効率良く抑制するという効果を奏することが確認された。
本発明の目的、技術案及び有益な効果をより明らかにするために、本発明は以下のような図面の簡単な説明を提供する。
５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ４の高分解能質量スペクトルである。 ５’ＹＩＣｃ－０１－ｃ７の高分解能質量スペクトルである。 ５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ７の高分解能質量スペクトルである。 ５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ４の高分解能質量スペクトルである。 ３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ６の高分解能質量スペクトルである。 ＨｅｐＧ２．２１５細胞中のＨＢｓＡｇに対する抑制効果の棒グラフである。 ＨｅｐＧ２．２１５細胞中のＨＢｅＡｇに対する抑制効果の棒グラフである。 ＨｅｐＧ２．２１５細胞中のＨＢＶＤＮＡに対する抑制効果の棒グラフである。 トランスジェニックマウスモデルのＨＢＶ遺伝子に対する抑制効果の棒グラフである。 ＧＢＬ－０４０１によるＨＢＶ ＨＢｓＡｇのインビボ抑制の効果図である。
以下の実施例は、本発明で開示されたいくつかの実施形態を説明するが、これらに限定されるものではない。また、発明者は、具体的な実施形態を提供する際に、それらの具体的な実施形態の適用を予測した。例えば、特定の同種又は類似の化学構造を有する化合物は、異なる肝疾患の治療に用いられる。
説明：
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；
ＨＢＴＵ：Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；
ＤＩＰＥＡ（ＤＩＥＡ）：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；
ＤＣＭ：ジクロロメタン；
ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン；
ＤＭＴ－ＣＬ：４，４’－ジメトキシトリフェニルメチルクロリド；
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；
ＴＢＴＵ：Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；
ＤＢＵ：１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン；
ＨＯＢｔ：１－ヒドロキシベンゾトリアゾール；
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド；
Ｐｄ－Ｃ：パラジウム炭素触媒；
Figure 0007383308000075
 ：固相担体、例えば樹脂（Ｒｅｓｉｎ）。
実施例１、ＧＢＬ－０４０１の合成
１、Ｋｙｓ－０１の合成
１．１．５’ＹＩＣｄ－０１構造の化合物：５’ＹＩＣｄ－０１－ＰＦＰの合成
１．１．１．５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ１ の合成
Figure 0007383308000076
 ２－ヒドロキシエチルアミン５．０ｇ（８１．９ｍｍｏｌ）を秤量してジメチルスルホキシド５０ｍＬ、水酸化ナトリウム溶液５ｍＬ（濃度１ｇ／ｍＬ）を加え、アクリル酸ｔ－ブチル１２ｍＬ（８１．９ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下し、室温で２４ｈ反応させ、石油エーテル１００ｍＬ、飽和食塩水を加えて２回洗浄し、有機層を乾燥させた。残留物をカラムに通して無色油状物７．５ｇを得た。
１．１．２．５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ２の合成
Figure 0007383308000077
 ５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ１ ７．５ｇ（３９．７ｍｍｏｌ）を秤量してＤＣＭ ５０ｍＬ、炭酸ナトリウム溶液（２５％）２３ｍＬを加え、室温でクロロギ酸ベンジル７．７ｇ（４５．０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で一晩反応させ、飽和食塩水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を蒸発除去し、残留物をクロマトグラフィーカラム（酢酸エチル：石油エーテル＝１５％～３０％）に通して油状物１１．３ｇを得た。
１．１．３．５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ３の合成
Figure 0007383308000078
 ５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ２ １１．３ｇ（３５．０ｍｍｏｌ）にギ酸２０ｍＬを加え、室温で一晩反応させ、溶剤を減圧して蒸発除去し、５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ３ ９．２ｇを得た。
１．１．４．５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ４の合成
Figure 0007383308000079
 化合物５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ３ １．０ｇ（３．７３ｍｍｏｌ）及びｄｌＳＡＮＣ－ｃ４ ２．０ｇ（４．４８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ３０ ｍＬに加えた後、ＨＯＢｔ ０．３８ｇ及びＨＢＴＵ ２．３０ｇを加え、そして、ＤＩＥＡ １．０ｍＬを緩やかに加えた。さらに水２０ｍＬ、ＤＣＭ ４０ｍＬを加えて抽出した。飽和食塩水１００ｍＬで洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤減圧して蒸発除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：１～１５％ メタノール ｉｎ ＤＣＭ）により精製した。白色泡状固体２．２ｇを得て、その高分解能質量スペクトルを図１に示す。
１．１．５．５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ５の合成
Figure 0007383308000080
 ５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ４ ２．２ｇ（３．２ｍｍｏｌ）をメタノール３０ ｍＬに溶解し、１０％ Ｐｄ－Ｃ １．０ｇ（湿式ＤｅｇｕｓｓａタイプＥ１０１ ＮＥ／Ｗ）を加えた。そして、常圧下で水素を加えて、一晩反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ液を減圧して蒸発除去し、白色泡状物１．７０ｇを得た。
１．１．６．５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ６の合成
Figure 0007383308000081
 グルタル酸モノベンジル０．８０ｇ（３．６０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ２ｍＬに溶解した後、ＴＢＴＵ１．２８ｇ及びＤＩＥＡ ２．０ｍＬを加え、５分間撹拌しながら反応させ、５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ５ １．７０ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を加えて、室温で一晩撹拌しながら反応させた。反応液を減圧して蒸発除去し、ＤＣＭ ５０ｍＬ、水５０ｍＬを加えて、５分間撹拌した。層を分離して有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。クロマトグラフィーカラム（溶離剤：ＤＣＭ：メタノール＝１％～１０％）に通して、溶剤を減圧して蒸発除去し、白色製品２．１ｇを得た。
１．１．７．５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ７の合成
Figure 0007383308000082
 １００ｍＬシングルネックフラスコに５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ６ ２．１ｇ（２．７ｍｍｏｌ）を投入し、パラジウム炭素０．２ｇを加えて、水ポンプで真空吸引し、水素ガスを補充することを３回繰り返し、水素ガスを加圧して一晩反応させ、翌日、ＴＬＣにより完全に反応させた。珪藻土を敷いてパラジウム炭素をろ別し、ろ液から溶剤を減圧して蒸発除去し、製品１．８ｇを得た。
１．１．８．５’ＹＩＣｄ－０１－ＰＦＰの合成
Figure 0007383308000083
 １００ｍＬシングルネックフラスコに５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ７ １．８ｇ（２．６６ｍｍｏｌ）を投入し、ＤＣＭ ２０ｍＬを加え、トリフルオロメタンスルホン酸ペンタフルオロフェニル１．１ｇ（４．０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間反応させ、水４０ｍＬを加えて洗浄し、飽和亜硫酸水素ナトリウム１０ｍＬを加えて洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、有機層から溶剤減圧して蒸発除去し、製品２．３ｇを得た。
１．２．Ｃ６ＮＨ－Ｓ－０１の固相合成
ｍＧを出発モノマー、Ｃ６ＮＨホスホルアミダイトモノマーを末端モノマーとして、固相ホスホルアミダイト法によるカップリングによって異なるホスホルアミダイトモノマーを導入した。固相ホスホルアミダイト法の基本的なステップは以下を含む。１）脱保護：固相担体における酸素原子上の保護基（ＤＭＴ）を除去する。２）カップリング：１番目のヌクレオチドモノマーを追加し、３’から５’への方向でカップリング反応を起こす。３）酸化：得られたヌクレオシドホスファイトを酸化して、より安定的なヌクレオシドホスフェート（即ち３価リンが酸化されて５価リンとなる）とする。４）ブロック：前のステップの未反応ヌクレオチドモノマー５’－ＯＨにキャップをつけてブロックし、さらに反応に関与しないようにする。所望の配列が得られるまで上記ステップを繰り返す。合成後、メチルアミンエタノール溶液及びアンモニア水を用いて固相担体において化合物と最初のヌクレオシドとを連結するエステル結合を開裂させ、オリゴヌクレオチド上の各塩基とリン酸上の保護基であるシアノエチル（Ｐ）、ベンゾイル（ｍＡ、ｆＡ）、アセチル（ｍＣ、ｆＣ）、イソブチリル（ｍＧ、ｆＧ）及び４－メトキシトリチル（Ｃ６ＮＨ）とを除去した。ＨＰＬＣにより分離して精製した後、生成物をろ過して殺菌し、凍結乾燥させた。
１．３．Ｋｙｓ－０１の液相合成
１．３．１．Ｋｙｓ－０１－ｃ１の合成
Figure 0007383308000084
 精製・凍結乾燥後の化合物Ｃ６ＮＨ－Ｓ－０１（１２．５ｍｇ）を秤量してホウ酸ナトリウム緩衝液（６５０μＬ、０．０６ｍｏｌ／Ｌ）を加えて完全に溶解し、５’ＹＩＣｄ－０１－ＰＦＰ（１０．３ｍｇ）を秤量してジメチルスルホキシド（１００μＬ）に溶解し、溶液を化合物Ｃ６ＮＨ－Ｓ－０１に加え、均一に混合した後、Ｎ－メチルモルホリン（５μＬ）を加え、室温で３ｈ超音波処理し、ＨＰＬＣ検出によれば完全に反応した後、Ｃ１８柱を使用して精製した。
１．３．２．Ｋｙｓ－０１の合成
Figure 0007383308000085
 精製後の化合物Ｋｙｓ－０１－ｃ１（３２ｍＬ，５ｍｇ）に２５％ヒドラジン水和物（１６ｍＬ）を加え、均一に混合した後、室温で１０ｍｉｎ超音波処理し、ＨＰＬＣ検出によれば完全に反応し、Ｃ１８柱を使用して精製し、凍結乾燥させた後、白色の凍結乾燥粉末化合物Ｋｙｓ－０１（２ｍｇ）を得た。
２、Ｋｙａｓ－０１の合成
２．１．３’ＳＡＮＣｄ－０１構造の化合物：３’ＳＡＮＣｄ－０１樹脂の合成
２．１．１．３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ１の合成
Figure 0007383308000086
 ３－アミノプロピレングリコール（９．１１４ｇ，０．１００ｍｏｌ）を秤量してＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（１５．６２ｇ，０．１１０ｍｏｌ）を滴下して室温で１ｈ反応させ、反応液をロータリーエバポレーターにより減圧蒸留し、３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ１粗品（１８．８７１ｇ）を得た。
２．１．２．３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ２の合成
Figure 0007383308000087
 ３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ１（５．４８０ｇ、０．０３０ｍｏｌ）をピリジン（３０ｍＬ）に溶解し、冷却し、ＤＭＴ－ＣＬ（１０．４２３ｇ，０．０３１ｍｏｌ）を間欠的に加え、遮光下一晩反応させ、ロータリーエバポレーターによる減圧蒸留でピリジンを除去した。残留物をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解し、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して、ロータリーエバポレーターにより減圧蒸留し、残留物をカラムに通した。製品３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ２（１０．８０５ｇ）を得た。
２．１．３．３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ３の合成
Figure 0007383308000088
 ３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ２（１０．８０５ｇ，０．０２２ｍｏｌ）をメタノール（６０ｍＬ）とＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、冷却し、ＫＯＨ（５．６９ｇ）の水溶液（２４ｍＬ）を滴下し、室温で２ｈ反応させ、ロータリーエバポレーターによる減圧蒸留でメタノール及びＴＨＦを除去した。残留物に水（５０ｍＬ）、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ＊３）を加えて抽出し、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ロータリーエバポレーターにより減圧蒸留した。残留物を１％トリエチルアミン含有溶離液の入ったカラムに通して、製品３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ３（８．２８６ｇ）を得た。
２．１．４．３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ４の合成
Figure 0007383308000089
 ３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ３（２．８９０ｇ，０．００７ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解し、冷却し、ＤＣＣ（１．６８０ｇ）的ＣＨ２Ｃｌ２溶液（１０ｍＬ）を滴下し、２０分間撹拌後、スベリン酸モノメチル（１．５２２ｇ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（１０ｍＬ）をさらに加え、室温で一晩反応させ、５％ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）でクエンチングし、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ＊２）で抽出した。有機相を飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して、ロータリーエバポレーターにより減圧蒸留し、残留物を１％トリエチルアミン含有溶離液の入ったカラムに通して、製品３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ４（３．１９３ｇ）を得た。
２．１．５．３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５の合成
Figure 0007383308000090
 ３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ４（２．１９３ｇ、０．００４ｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、冷却し、ＬｉＯＨ（０．６４５ｇ）の水溶液（４．５ｇ）を滴下し、２ｈ反応後、ＴＬＣにより原料がなくなることを示した。反応液をロータリーエバポレーターにより減圧蒸留して溶剤を除去し、飽和塩化アンモニウムで残留物を中和し、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ＊２）で抽出した。有機相を飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過してロータリーエバポレーターにより減圧蒸留した。残留物を１％トリエチルアミン含有溶離液の入ったカラムに通して、製品３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５（１．９７９ｇ）を得た。
２．１．６．３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ６の合成
Figure 0007383308000091
 ３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５（０．３８９ｇ、０．００４ｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、冷却し、ＤＩＰＥＡ（０．１５ｍＬ）、ＴＢＴＵ（０．１８３ｇ）を加えて１０分間撹拌し、そして、ｄｌＳＡＮＣ－ｃ１２（０．７５６ｇ，０．０００５ｍｏｌ）の ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を加え、室温で一晩反応させた。水（２０ｍＬ）でクエンチングし、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ＊２）で抽出した。有機相を飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して、ロータリーエバポレーターにより減圧蒸留した。残留物を５％トリエチルアミン含有溶離液の入ったカラムに通して、製品３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ６（０．８０３ｇ）を得て、その高分解能質量スペクトルを図５に示す。
２．１．７．３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ７の合成
Figure 0007383308000092
 反応フラスコに３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ６（２．１５ｇ、０．００１ｍｏｌ）及び２２ｍＬのＤＣＭを順に加え、室温で撹拌して溶解し、そして、ＤＢＵ（０．１５６ｇ）及び無水コハク酸（０．３ｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を順に加え、室温で撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮してＤＣＭを除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出した。有機相をさらに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ７を２．０３ｇ得た。
２．１．８．３’ＳＡＮＣｄ－０１樹脂の合成
Figure 0007383308000093
 反応フラスコに３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ７（１．１３ｇ，０．０００５ｍｍｏｌ）及び１２ｍＬのＤＭＦを順に加え、室温で撹拌して溶解し、そして、ＨＢＴＵ（０．１１ｇ）、ＤＩＰＥＡ（０．１０４ｇ）及びＧＥ樹脂（１．８０ｇ）を順に加え、３５℃シェーカーで２４ｈ振とうし、材料を合成管に移して、ろ過し、窒素をバブリングしながら樹脂をＤＭＦで４回リンスした後、ＣＡＰ Ａ＋ＣＡＰ Ｂを加え、窒素をバブリングしながらエンドキャッピング反応を半時間行い、少量の樹脂を取って試験液が黄色を示すまでｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔを行い、エンドキャッピングが終了すると、それぞれメタノール、ＤＣＭ及びメタノールでろ過ケーキをリンスし、真空乾燥させ、３’ＳＡＮＣｄ－０１樹脂を２．４８ｇ得た。その置換度は１５０μｍｏｌ／ｇであった。
２．２．Ｋｙａｓ－０１の固相合成
固相ホスホルアミダイト法によるカップリングによって異なるホスホルアミダイトモノマーを導入し、ｍＵを出発モノマー、ｍＵを末端モノマーとした。固相ホスホルアミダイト法の基本的なステップは以下を含む。１）脱保護：３’ＳＡＮＣｄ－０１樹脂における酸素原子上の保護基（ＤＭＴ）を除去する。２）カップリング：１番目のヌクレオチドモノマーを追加し、３’から５’への方向でカップリング反応を起こす。３）酸化：得られたヌクレオシドホスファイトを酸化して、より安定的なヌクレオシドホスフェート（即ち、即ち３価リンが酸化されて５価リンとなる）とする。４）ブロック：前のステップの未反応ヌクレオチドモノマー５’－ＯＨにキャップをつけてブロックし、さらに反応に関与しないようにする。所望の配列が得られるまで上記ステップを繰り返す。合成後、メチルアミンエタノール溶液及びアンモニア水を用いて固相担体において化合物と最初のヌクレオシドとを連結するエステル結合を開裂し、オリゴヌクレオチド上の各塩基とリン酸上の保護基であるシアノエチル（Ｐ）、ベンゾイル（ｍＡ、ｆＡ）、アセチル（ｍＣ、ｆＣ）、及びイソブチリル（ｍＧ、ｆＧ）を除去した。ＨＰＬＣにより分離して精製した後、生成物をろ過して殺菌し、凍結乾燥させ、Ｋｙａｓ－０１を得た。
３、ＧＢＬ－０４０１合成
Ｋｙｓ－０１及びＫｙａｓ－０１溶液の濃度を精確に測定し、等モル濃度で混合した後、該体積に対して１／２０体積の１ Ｍ ＰＢＳ溶液を加えて再び均一に混合し、混合系を９５℃に加熱して５ｍｉｎ継続させた後、３ｈかけて４０℃又は室温に自然降温すると、ＨＰＬＣ検出を行った。残留一本鎖＜５％であれば、反応が完了したとしてもよい。
実施例２、ＧＢＬ－０４０２の合成
１、Ｋｙｓ－０２の合成
１．１．５’ＹＩＣｃ－０１構造の化合物：５’ＹＩＣｃ－０１－ＰＦＰの合成
１．１．１．５’ＹＩＣｃ－０１－ｃ１の合成
Figure 0007383308000094
 ＳＡＮＣ－ｃ８ ７．０ｇ（４０．０ｍｍｏｌ）、５’ＹＩＣｄ－０１－ｃ３ ９．２ｇ（３４．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ２５ｍＬに加えて溶解し、ＴＢＴＵ ９．０ｇを加えて１０℃に降温し、ＤＩＥＡ ２ｍｌを加えて室温で一晩反応させた。水３０ｍＬ、ジクロロメタン５０ｍＬを加え、有機層を飽和食塩水で３回洗浄した。有機層を乾燥させて、溶剤を減圧して蒸発除去した。残留物をクロマトグラフィーカラム（溶離剤：ジクロロメタン：メタノール＝１％～１０％）に通して、黄色の粘稠固体１０．０ｇを得た。
１．１．２．５’ＹＩＣｃ－０１－ｃ２の合成
Figure 0007383308000095
 ５’ＹＩＣｃ－０１－ｃ１ １０．０ｇを取り、濃塩酸１５ｍｌを加え、室温で一晩反応させた。溶剤を減圧して蒸発除去し、７．３ｇを得た。
１．１．３．５’ＹＩＣｃ－０１－ｃ３の合成
Figure 0007383308000096
 化合物５’ＹＩＣｃ－０１－ｃ２ ７．３ｇ（２２．６ｍｍｏｌ）及びＳＡＮＣ－ｃ４ １２．１ｇ（２７．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ６０ｍＬに加え、ＨＯＢｔ ３．８ｇ及びＨＢＴＵ １２．４ｇを加えた後、ＤＩＥＡ ５．０ｍｌを緩やかに加えた。反応液を室温下で一晩撹拌しながら反応させた。そして、水５０ ｍＬを加えて、反応溶液をジクロロメタン１００ｍＬで抽出した。有機相を飽和食塩水１００ｍＬで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶剤を減圧して蒸発除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：３～１５％ ＭｅＯＨ ｉｎ ＤＣＭ）により精製し、白色泡状固体８．３ｇを得た。
１．１．４．５’ＹＩＣｃ－０１－ｃ７の合成
合成ステップは実施例１の１．１．５と同様であり、その高分解能質量スペクトルを図２に示す。
１．１．５．５’ＹＩＣｃ－０１－ｃ８の合成
合成ステップは実施例１の１．１．６と同様であった。
１．１．６．５’ＹＩＣｃ－０１－ｃ９の合成
合成ステップは実施例１の１．１．７と同様であった。
１．１．７．５’ＹＩＣｃ－０１－ＰＦＰの合成
合成ステップは実施例１の１．１．８と同様であった。
１．２．Ｃ６ＮＨ－Ｓ－０２の固相合成
ｍＧを出発モノマー、Ｃ６ＮＨホスホルアミダイトモノマーを末端モノマーとして、固相ホスホルアミダイト法によるカップリングによって異なるホスホルアミダイトモノマーを導入した。合成ステップは実施例１の１．２固相合成と同様であった。
１．３．Ｋｙｓ－０２の液相合成
１．３．１．Ｋｙｓ－０２－ｃ１の合成
Figure 0007383308000097
 合成ステップは実施例１の１．３．１と同様であった。
１．３．２．Ｋｙｓ－０２の合成
Figure 0007383308000098
 合成ステップは実施例１の１．３．２と同様であった。
２、Ｋｙａｓ－０２の合成
２．１．３’ＳＡＮＣｃ－０１構造の化合物：３’ＳＡＮＣｃ－０１樹脂の合成
３’ＳＡＮＣｃ－０１樹脂の合成経路及びプロセスのステップとしては、３’ＳＡＮＣｃ－０１－ｃ６の合成以外、残りは３’ＳＡＮＣｄ－０１樹脂と一致した。
２．１．１．３’ＳＡＮＣｃ－０１－ｃ１の合成
Figure 0007383308000099
 ３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５（０．２９５ｇ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解して冷却し、ＤＩＰＥＡ（０．１４ｍＬ）、ＴＢＴＵ（０．１７７ｇ）を加えて１０分間撹拌し、ＳＡＮＣ－ｃ１２（０．７５６ｇ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液をさらに加え、室温で一晩反応させた。水（５０ｍＬ）でクエンチングし、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ＊２）で抽出した。有機相を飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して、ロータリーエバポレーターにより減圧蒸留した。残留物を５％トリエチルアミン含有溶離液の入ったカラムに通して、製品３’ＳＡＮＣｃ－０１－ｃ６（０．８１５ｇ）を得た。
２．２．Ｋｙａｓ－０２の固相合成
ｍＵを出発モノマー、ｍＵを末端モノマーとして、固相ホスホルアミダイト法によるカップリングによって異なるホスホルアミダイトモノマーを導入した。合成ステップは実施例１の２．２Ｋｙａｓ－０１の固相合成と同様であった。
３、ＧＢＬ－０４０２の合成
Ｋｙｓ－０２及びＫｙａｓ－０２溶液の濃度を精確に測定し、合成ステップは実施例１の３、ＧＢＬ－０４０１の合成と同様であった。
実施例３、ＧＢＬ－０４０３の合成
１、Ｋｙｓ－０３の合成
１．１．５’ＥＲＣｄ－０１構造の化合物：５’ＥＲＣｄ－０１－ＰＦＰの合成
１．１．１．５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ１の合成
Figure 0007383308000100
 ２－アミノ－１，３－プロピレングリコール５．０ｇ（５４．９ｍｍｏｌ）を秤量して、ＤＭＳＯ ５０ｍＬ、水酸化ナトリウム溶液５ｍＬ（濃度１ｇ／ｍＬ）を加え、０℃に降温し、アクリル酸ｔ－ブチル２０ｍＬ（１３７．８ｍｏｌ）を２時間かけて滴下し、室温で４８ｈ反応させ、混合物に石油エーテル１００ｍＬを加えた。有機相を飽和食塩水で２回洗浄し、乾燥させ、クロマトグラフィーカラム（溶離液：酢酸エチル：石油エーテル＝２５％～７５％）に通し、カラムにローディングして０．０５％トリエチルアミンを加え、無色油状物６．２ｇを得た。
１．１．２．５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ２の合成
Figure 0007383308000101
 ５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ１ ６．２ｇ（１７．９ｍｍｏｌ）を秤量して、ジクロロメタン５０ｍＬ、炭酸ナトリウム溶液（２５％）２３ｍＬを加え、室温でクロロギ酸ベンジル８．２ｍＬ（５７．４ｍｍｏｌ）を２時間かけて滴下し、室温で一晩反応させた。混合物を飽和食塩水で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を蒸発除去した。残留物をクロマトグラフィーカラム（酢酸エチル：石油エーテル＝５％～３０％）に通して、油状物４．０ｇを得た。
１．１．３．５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ３の合成
Figure 0007383308000102
 ５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ２ ４．０ｇ（８．３ｍｍｏｌ）にギ酸１２ｍＬを加え、室温で一晩反応させ、溶剤を減圧して蒸発除去し、５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ３ ２．８ｇを得た。
１．１．４．５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ４の合成
Figure 0007383308000103
 化合物５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ３ １．１１ｇ（３．０ｍｍｏｌ）及びｄｌＳＡＮＣ－ｃ４ ３．６ｇ（８．０４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ６０ｍＬに加え、ＨＯＢｔ ２．２４ｇ及びＨＢＴＵ ３．３６ｇを加えた後、ＤＩＥＡ ４．１６ｍＬを緩やかに加えた。反応液を室温で撹拌しながら３時間反応させた。そして、水を加え、水層をジクロロメタン２×１０ｍＬで抽出した。有機層を併せた後、飽和ＮａＨＣＯ３ ８０ｍＬ、水（２×６０ｍＬ）、飽和食塩水（６０ｍＬ）で順に洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶剤を減圧して蒸発除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：３－１５％ ＭｅＯＨ ｉｎ ＤＣＭ）で精製し、淡黄色固体３．２４ｇを得た。
１．１．５．５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ５の合成
Figure 0007383308000104
 ５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ４ ３．２４ｇ（２．６ｍｍｏｌ）をメタノール６０ｍＬに溶解し、１０％ Ｐｄ－Ｃ ０．３ｇ、湿式ＤｅｇｕｓｓａタイプＥ１０１ ＮＥ／Ｗ）、酢酸２．０ｍＬを加えた。そして、常圧下で水素を加えて、一晩反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ液を減圧して蒸発除去し、油状物２．９ｇを得た。
１．１．６．５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ６の合成
Figure 0007383308000105
 グルタル酸モノベンジル０．２１ｇ（０．００１ｍｏｌ）を取り、ＤＭＦ ２ｍＬに溶解した後、ＴＢＴＵ ０．３６ｇ及びＤＩＥＡ ０．４ｍＬを加え、５分間撹拌しながら反応させ、５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ５ ０．５０ｇ（ＤＭＦ １０ｍｌに溶解）を加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。反応液を減圧して蒸発除去し、その後、ジクロロメタン４０ｍＬ、水２０ｍＬを加えて、５分間撹拌した。層を分離して有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、クロマトグラフィーカラム、（溶離剤：ジクロロメタン：メタノール＝１％～１０％）に通し、溶剤を減圧して蒸発除去し、白色製品０．５１ｇを得た。
１．１．７．５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ７の合成
Figure 0007383308000106
 １００ｍＬシングルネックフラスコに５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ６ ０．５１ｇ（０．４２ｍｍｏｌ）を投入し、パラジウム炭素１２７ｍｇを加えて、水ポンプで真空吸引し、水素ガスを補充することを３回繰り返し、水素ガスを加圧して一晩反応させ、翌日、ＴＬＣにより反応を完了した。珪藻土を敷いてパラジウム炭素をろ別し、ろ液から溶剤を減圧して蒸発除去し、製品０．４０ｇを得て、その高分解能質量スペクトルを図３に示す。
１．１．８．５’ＥＲＣｄ－０１－ＰＦＰの合成
Figure 0007383308000107
 ５０ｍＬシングルネックフラスコに５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ７ ０．４０ｇ（０．３３ｍｍｏｌ）を投入し、ジクロロメタン１０ｍＬを加え、トリフルオロメタンスルホン酸ペンタフルオロフェニル０．１９ｇ（０．６ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下し、室温で２時間反応させ、水１０ｍＬを加えて２回洗浄し、飽和亜硫酸水素ナトリウム５ｍＬを加えて１回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで１０分間乾燥させ、有機層から溶剤を減圧して蒸発除去し、製品０．５ｇを得た。
１．２．Ｃ６ＮＨ－Ｓ－０３の固相合成
ｍＧを出発モノマー、Ｃ６ＮＨホスホルアミダイトモノマーを末端モノマーとして、固相ホスホルアミダイト法によるカップリングによって異なるホスホルアミダイトモノマーを導入した。合成ステップは実施例１の１．２固相合成と同様であった。
１．３．Ｋｙｓ－０３の液相合成
１．３．１．Ｋｙｓ－０３－ｃ１の合成
Figure 0007383308000108
 合成ステップは実施例１の１．３．１と同様であった。
１．３．２．Ｋｙｓ－０３の合成
Figure 0007383308000109
 合成ステップは実施例１の１．３．２と同様であった。
２、Ｋｙａｓ－０３の合成
２．１．３’ ＥＲＣｄ－０１構造の化合物：３’ ＥＲＣｄ－０１樹脂の合成
２．１．１．３’ ＥＲＣｄ－０１－ｃ１の合成
Figure 0007383308000110
 反応フラスコに３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５（０．８２４ｇ、０．００１５ｍｏｌ）及び１０ｍＬのＤＭＦを順に加え、室温で撹拌して溶解し、さらに、ＴＢＴＵ（０．５６３ｇ）及びＤＩＰＥＡ（０．５１７ｇ）を順に加え、室温で撹拌して溶解し、最後に、ｄｌＥＲＣ－ｃ１２（１．０９ｇ、０．００１ｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮してＤＭＦを除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出した。有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、白色泡状固体１．３ｇを得た。
２．１．２．３’ＥＲＣｄ－０１－ｃ２の合成
Figure 0007383308000111
 合成ステップは実施例１の２．１．７と同様であった。
２．１．３．３’ＥＲＣｄ－０１樹脂の合成
Figure 0007383308000112
 合成ステップは実施例１の２．１．８と同様であった。
２．２．Ｋｙａｓ－０３の固相合成
ｍＡを出発モノマー、Ｔを末端モノマーとして、固相ホスホルアミダイト法によるカップリングによって異なるホスホルアミダイトモノマーを導入した。合成ステップは実施例１の２．２ Ｋｙａｓ－０１の固相合成と同様であった。
３、ＧＢＬ－０４０３の合成
Ｋｙｓ－０３及びＫｙａｓ－０３溶液の濃度を精確に測定し、合成ステップは実施例１の３、ＧＢＬ－０４０１の合成と同様であった。
実施例４、ＧＢＬ－０４０４の合成
１、Ｋｙｓ－０４の合成
１．１．５’ＥＲＣｃ－０１構造の化合物：５’ＥＲＣｃ－０１－ＰＦＰの合成
１．１．１．５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ１ の合成
Figure 0007383308000113
 Ｎ－ｔ－トブトキシカルボニル－１，３－プロピルジアミン５．０ｇ（２８．７ｍｍｏｌ）、５’ＥＲＣｄ－０１－ｃ３ ２．８ｇ（７．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ２５ｍＬに加えて溶解し、ＴＢＴＵ ９．０ｇ、ＤＩＥＡ ２ｍＬを加え、室温で一晩反応させた。水３０ｍＬ、ＤＣＭ ５０ｍＬを加え、有機層を飽和食塩水で洗浄し、溶剤を減圧して蒸発除去した。残留物をクロマトグラフィーカラムに通して、石油エーテルをカラムに充填し、１Ｌ石油エーテルでカラム（溶離剤：ＤＣＭ：メタノール＝５％～１０％）をリンスし、黄色粘稠固体２．９ｇを得た。
１．１．２．５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ２の合成
Figure 0007383308000114
 ５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ１ ２．９ｇに濃塩酸９ｍＬを加え、室温で一晩反応させた。溶剤を減圧して蒸発除去し、２．７ｇを得た。
１．１．３．５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ３の合成
Figure 0007383308000115
 化合物５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ２ １．５６ｇ（２．４４ｍｍｏｌ）及びＳａｎｃ－ｃ４ ３．６ｇ（８．０４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ６０ｍＬに加え、ＨＯＢｔ ２．２４ｇ及びＨＢＴＵ ３．３６ｇを加えた後、ＤＩＥＡ ４．１６ｍＬを緩やかに加えた。反応液を室温で撹拌しながら１時間反応させた。そして、水を加え、水層をＤＣＭ ２×１０ｍＬで抽出した。有機層を併せて、飽和重炭酸ナトリウム８０ｍＬ、水４０ｍＬ、飽和食塩水６０ｍＬを用いて順に洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧して蒸発除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：３－１５％ メタノール ｉｎ ＤＣＭ）で精製し、淡黄色固体２．３６ｇを得た。
１．１．４．５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ４の合成
Figure 0007383308000116
 ５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ３ ２．３６ｇ（１．２ｍｍｏｌ）をメタノール１２０ｍＬに溶解し、１０％ Ｐｄ－Ｃ １．０ｇ、湿式ＤｅｇｕｓｓａタイプＥ１０１ ＮＥ／Ｗ）を加えた。そして、常圧下で水素を加えて、一晩反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ液を減圧して蒸発除去し、油状物１．８ｇを得て、その高分解能質量スペクトルを図４に示す。
１．１．５．５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ５ の合成
Figure 0007383308000117
 グルタル酸モノベンジル０．２１ｇ（０．００１ｍｏｌ）をＤＭＦ ２ｍＬに溶解した後、ＴＢＴＵ ０．３６ｇ及びＤＩＥＡ ０．４ｍＬを加え、５分間撹拌しながら反応させ、５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ４ １．０９ｇを加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。反応液を減圧して蒸発除去し、その後、ＤＣＭ ４０ｍＬ、水２０ｍＬを加え、５分間撹拌した。層を分離して有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、クロマトグラフィーカラム（溶離剤：ＤＣＭ：メタノール＝１％～１０％）を通して、溶剤を減圧して蒸発除去し、白色製品０．８５ｇを得た。
１．１．６．５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ６の合成
Figure 0007383308000118
 １００ｍＬシングルネックフラスコに５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ５ ０．８５ｇ（０．４３ｍｍｏｌ）を投入し、パラジウム炭素１２７ｍｇを加えて、水ポンプで真空吸引し、水素ガスを補充することを３回繰り返し、水素ガスを加圧して一晩反応させ、翌日、ＴＬＣにより反応を完了した。珪藻土を敷いてパラジウム炭素をろ別し、ろ液を減圧して蒸発除去し、製品０．７６ｇを得た。
１．１．７．５’ＥＲＣｃ－０１－ＰＦＰの合成
Figure 0007383308000119
 ５０ｍＬシングルネックフラスコに５’ＥＲＣｃ－０１－ｃ６ ０．７６ｇ（０．４０ｍｍｏｌ）を投入し、ＤＣＭ １０ｍＬを加え、トリフルオロメタンスルホン酸ペンタフルオロフェニル０．１９ｇ（０．６ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間反応させ、水１０ｍＬを加えて洗浄し、飽和亜硫酸水素ナトリウム５ｍＬを加えて洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで１０分間乾燥させ、有機層から溶剤を減圧して蒸発除去し、製品０．８ｇを得た。
１．２．Ｃ６ＮＨ－Ｓ－０４の固相合成
ｍＡを出発モノマー、Ｃ６ＮＨホスホルアミダイトモノマーを末端モノマーとして、固相ホスホルアミダイト法によるカップリングによって異なるホスホルアミダイトモノマーを導入した。合成ステップは実施例１の１．２固相合成と同様であった。
１．３．Ｋｙｓ－０４の液相合成
１．３．１．Ｋｙｓ－０４－ｃ１の合成
Figure 0007383308000120
 合成ステップは実施例１の１．３．１と同様であった。
１．３．２．Ｋｙｓ－０４の合成
Figure 0007383308000121
 合成ステップは実施例１の１．３．２と同様であった。
２、Ｋｙａｓ－０４の合成
２．１．３’ ＥＲＣｃ－０１構造の化合物：３’ ＥＲＣｃ－０１樹脂の合成
２．１．１．３’ ＥＲＣｃ－０１－ｃ１の合成
Figure 0007383308000122
 反応フラスコに３’ＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５（０．８２４ｇ、０．００１５ｍｏｌ）及び１０ｍＬのＤＭＦを順に加え、室温で撹拌して溶解し、ＴＢＴＵ（０．５６３ｇ）及びＤＩＰＥＡ（０．５１７ｇ）を順に加え、室温で撹拌して溶解し、最後に、ＥＲＣ－ｃ１２（１．２１ｇ、０．００１ｍｏｌ）を加えて室温で一晩撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮してＤＭＦを除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮し、最後にシリカゲルカラムに通して精製し、白色泡状固体１．４ｇを得た。
２．１．２．３’ＥＲＣｃ－０１－ｃ２の合成
Figure 0007383308000123
 合成ステップは実施例１の２．１．７と同様であった。
２．１．３．３’ＥＲＣｃ－０１樹脂の合成
Figure 0007383308000124
 合成ステップは実施例１の２．１．８と同様であった。
２．２．Ｋｙａｓ－０４の固相合成
ｍＧを出発モノマー、ｍＵを末端モノマーとして、固相ホスホルアミダイト法によるカップリングによって異なるホスホルアミダイトモノマーを導入した。合成ステップは実施例１の２．２ Ｋｙａｓ－０１固相合成と同様であった。
３、ＧＢＬ－０４０４の合成
Ｋｙｓ－０４及びＫｙａｓ－０４溶液の濃度を精確に測定し、合成ステップは実施例１の３、ＧＢＬ－０４０１の合成と同様であった。
実施例５、ＧＢＬ－０４０９の合成
１、Ｋｙａｓ－０９の合成
１．１． ３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１構造の化合物：３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１樹脂の合成
１．１．１．３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ１の合成
Figure 0007383308000125
 反応フラスコにヒドロキシプロリノール塩酸塩（１．５３ｇ、０．０１ｍｏｌ）及び１５ｍＬのＤＭＦを順に加え、室温で撹拌して溶解し、そして、スベリン酸モノメチル（１．９８ｇ、０．０１０５ｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４．５５ｇ）及びＤＩＰＥＡ（３．８８ｇ）を順に加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮してＤＭＦにより除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、黄色粘稠液体２．３８ｇを得た。
１．１．２．３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ２の合成
Figure 0007383308000126
 反応フラスコに３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ１（２．８７ｇ、０．０１ｍｏｌ）及びピリジン３０ｍｌを順に加え、室温で撹拌して溶解し、ＤＭＡＰ（０．６１ｇ）及びＤＭＴ－ＣＬ（４．０６ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を順に加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮してピリジンを除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、黄色粘稠液体４．１３ｇ（収率７０％）を得た。
１．１．３．３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ３の合成
Figure 0007383308000127
 反応フラスコに３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ２（５．８９ｇ、０．０１ｍｏｌ）及び溶剤（ＴＨＦ／水／メタノール＝１：１：４）６０ｍＬを順に加え、室温で撹拌して溶解し、ＬｉＯＨ（１．２６ｇ）を加え、室温で２ｈ撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮して溶剤を除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、黄色粘稠液体４．５ｇを得た。
１．１．４．３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ４の合成
Figure 0007383308000128
 反応フラスコに３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ３（０．８６３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）及び１０ｍＬのＤＭＦを順に加え、室温で撹拌して溶解し、ＴＢＴＵ（０．９６３ｇ）及びＤＩＰＥＡ（０．５１７ｇ）を順に加え、室温で撹拌して溶解し、最後に、ｄｌＳＡＮＣ－ｃ１２（１．６２ｇ １ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮してＤＭＦを除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、黄色粘稠液体１．７４３ｇを得た。
１．１．５．３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５の合成
Figure 0007383308000129
 反応フラスコに３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ４（２．１８ｇ、０．００１ｍｏｌ）及び１０ｍＬのＤＣＭを順に加え、室温で撹拌して溶解し、ＤＢＵ（０．２５６ｇ）及び無水コハク酸（０．３ｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を順に加え、室温で撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮してＤＣＭを除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５を２．０５ｇ得た。
１．１．６．３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ６の合成
Figure 0007383308000130
 反応フラスコに３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５（１．１４ｇ、０．０００５ｍｍｏｌ）及び１２ｍＬのＤＭＦを順に加え、室温で撹拌して溶解し、ＨＢＴＵ（０．１９ｇ）、ＤＩＰＥＡ（０．１９４ｇ）及びＧＥ樹脂（１．８３ｇ）を順に加え、３５℃シェーカーで４ｈ振とうし、材料を合成管に移して、ろ過し、窒素をバブリングしながら樹脂をＤＭＦで４回リンスした後、ＣＡＰ Ａ＋ＣＡＰ Ｂを加えて窒素をバブリングしながらエンドキャッピング反応を半時間行い、少量の樹脂を取り、試験液が黄色を示すまでｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔを行った。エンドキャッピングが終了すると、それぞれメタノール、ＤＣＭでろ過ケーキをリンスし、真空乾燥させ、３’ｑｆＳＡＮＣｄ－０１を２．５ｇ得た。その置換度は１４０μｍｏｌ／ｇであった。
１．２．Ｋｙａｓ－０９の固相合成
ｍＵを出発モノマー、ｍＵを末端モノマーとして、固相ホスホルアミダイト法によるカップリングによって異なるホスホルアミダイトモノマーを導入した。合成ステップは実施例１の２．２ Ｋｙａｓ－０１固相合成と同様であった。
２、ＧＢＬ－０４０９の合成
Ｋｙｓ－０１及びＫｙａｓ－０９溶液の濃度を精確に測定し、合成ステップは実施例１の３、ＧＢＬ－０４０１の合成と同様であった。
実施例６、ＧＢＬ－０４１０の合成
１、Ｋｙｓ－１０の合成
１．１．Ｃ９ＮＨ－Ｓ－０１の固相合成
ｍＵを出発モノマー、Ｃ９ＮＨホスホルアミダイトモノマーを末端モノマーとして、固相ホスホルアミダイト法によるカップリングによって異なるホスホルアミダイトモノマーを導入した。合成ステップは実施例１の１．２Ｃ６ＮＨ－Ｓ－０１の固相合成と同様であった。
１．２．Ｋｙｓ－１０の液相合成
１．２．１．Ｋｙｓ－１０－ｃ１の合成
Figure 0007383308000131
 合成ステップは実施例１の１．３．３と同様であった。
１．２．２．Ｋｙｓ－０１の合成
Figure 0007383308000132
 合成ステップは実施例１の１．３．４と同様であった。
２、Ｋｙａｓ－１０の合成
２．１．３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１構造の化合物：３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１樹脂の合成
２．１．１．３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１－ｃ１の合成
Figure 0007383308000133
 反応フラスコに４，４－ピペリジンジイルジメタノール（１．５９ｇ、０．０１ｍｏｌ）及び２０ｍＬのＤＭＦを順に加え、室温で撹拌して溶解し、スベリン酸モノメチル（１．９８ｇ、０．０１０５ｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４．５５ｇ）及びＤＩＰＥＡ（３．８８ｇ）を順に加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮してＤＭＦを除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、黄色粘稠液体２．６５ｇを得た。
２．１．２．３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１－ｃ２の合成
Figure 0007383308000134
 反応フラスコに３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１－ｃ１（３．２９ｇ、０．０１ｍｏｌ）及びピリジン３３ｍＬを順に加え、室温で撹拌して溶解し、ＤＭＡＰ（０．６１ｇ）及びＤＭＴ－ＣＬ（４．０６ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を順に加え、室温で一晩撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮してピリジンを除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、黄色粘稠液体４．７４ｇを得た。
２．１．３．３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１－ｃ３の合成
Figure 0007383308000135
 反応フラスコに３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１－ｃ２（３．１６ｇ、５ｍｍｏｌ）及び溶剤（ＴＨＦ／水／メタノール＝１：１：４）３２ｍＬを順に加え、室温で撹拌して溶解し、ＬｉＯＨ（０．６３ｇ）を加え、室温で２ｈ撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮して溶剤を除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、黄色粘稠液体２．７８ｇを得た。
２．１．４．３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１－ｃ４の合成
Figure 0007383308000136
 反応フラスコに３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１－ｃ３（０．９３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）及び１０ｍＬのＤＭＦを順に加え、室温で撹拌して溶解し、ＴＢＴＵ（０．９６３ｇ）及びＤＩＰＥＡ（０．５１７ｇ）を順に加え、室温で撹拌して溶解し、最後に、ｄｌＳＡＮＣ－ｃ１２（０．５６２ｇ、１ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮してＤＭＦを除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、黄色粘稠液体１．６８８ｇを得た。
２．１．５．３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５の合成
Figure 0007383308000137
 反応フラスコに３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１－ｃ４（２．２２ｇ、０．００１ｍｏｌ）及び２２ｍＬのＤＣＭを順に加え、室温で撹拌して溶解し、ＤＢＵ（０．２５６ｇ）及び無水コハク酸（０．３ｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を順に加え、室温で撹拌しながら反応させた。ＴＬＣにより分析したところ、反応が完了すると、反応混合物を濃縮してＤＣＭを除去し、水を加えて、ＤＣＭで抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。最後に残留物をシリカゲルカラムに通して精製し、３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５を２．１１ｇ得た。
２．１．６．３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１の合成
Figure 0007383308000138
 反応フラスコに３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１－ｃ５（１．１６ｇ、０．０００５ｍｍｏｌ）及び１２ｍＬのＤＭＦを順に加え、室温で撹拌して溶解し、ＨＢＴＵ（０．１９ｇ）、ＤＩＰＥＡ（０．１９４ｇ）及びＧＥ樹脂（１．８５ｇ）を順に加え、３５℃シェーカーで４ｈ振とうし、材料を合成管に移して、ろ過し、窒素をバブリングしながら樹脂をＤＭＦで４回リンスした後、ＣＡＰ Ａ＋ＣＡＰ Ｂを加えて窒素をバブリングしながらエンドキャッピング反応を半時間行い、少量の樹脂を取り、試験液が黄色を示すまでｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔを行った。エンドキャッピングが終了すると、それぞれメタノール、ＤＣＭでろ過ケーキをリンスし、真空乾燥させ、３’ｐｄＳＡＮＣｄ－０１を２．６ｇ得た。その置換度は１４５μｍｏｌ／ｇであった。
２、Ｋｙａｓ－１０の固相合成
固相ホスホルアミダイト法によるカップリングによって異なるホスホルアミダイトモノマーを導入し、ｍＵを出発モノマー、ｍＵを末端モノマーとした。合成ステップは実施例１の２．２ Ｋｙａｓ－０１の固相合成と同様であった。
３、ＧＢＬ－０４１０の合成
Ｋｙｓ－１０及びＫｙａｓ－１０溶液の濃度を正確に測定し、合成ステップは実施例１の３、ＧＢＬ－０４０１の合成と同様であった。
実施例７、ＧＢＬ０４０５～ＧＢＬ０４０８及びＧＢＬ０４１１～ＧＢＬ０４１８はＧＢＬ－０４０１～ＧＢＬ０４０４の合成を参照する。
実施例８、ＨｅｐＧ２．２１５細胞実験による化合物のＨＢＶ遺伝子に対するインビトロ抑制効果の考察
１．実験の群分け
空白対照群：２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を加えて７２ｈインキュベートした。
試験品群：それぞれ濃度５ｎＭ、０．５ｎＭ又は０．０５ｎＭの試験品希釈液を加え、濃度ごとに重複ウエルを３つとし、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで７２ｈ培養した。
２、実験材料
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞
３、実験試薬
Figure 0007383308000139
 ４、実験機器
Figure 0007383308000140
 ５、試験品：
Figure 0007383308000141
 ６、試験過程
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞は９６ウェル細胞培養プレートで培養し、３日ごとに新鮮な培地に交換し、６日目に上述で調製した各濃度の薬物含有培養液を加え、９日目まで培養を続けた。上清液を収集し、測定キットで細胞上清中のＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡの含有量を測定した。また、対照非投与群とＯＤ値を比較し、比の値に基づいて有効性を確定した。
７．実験結果
７．１ ＨｅｐＧ２．２．１５細胞中のＨＢｓＡｇに対する抑制効果：図６参照
７．２ ＨｅｐＧ２．２．１５細胞上清中のＨＢｅＡｇに対する抑制効果：図７参照
７．３ ＨｅｐＧ２．２．１５細胞上清中のＨＢＶ ＤＮＡに対する抑制効果：図８参照
実施例９、トランスジェニックマウスモデルＨＢＶ遺伝子に対する新規化合物の抑制効果の考察
１．実験案
適齢のＨＢＶトランスジェニック雄マウス（ＨＢｓＡｇ発現が顕著であることを要求する）を実験評価に用い、体重が２５ｇ前後のマウスを９０匹選び、１８群に無作為に分け、各群を５匹とし、Ｄａｙ０でそれぞれ皮下注射により３ｍｇ／ｋｇ投与し、投与体積は１００～２００μＬであった。投薬前にマウス血ＨＢｓＡｇを測定し、各群のＨＢｓＡｇの平均レベルをできるだけ一致させた。
２．試験品及び試薬
Figure 0007383308000142
 ３．キット
Figure 0007383308000143
 ４．実験機器
Figure 0007383308000144
 ５．実験結果
抑制効果を図９に示す。
実施例１０、トランスジェニックマウスモデルＨＢＶのＨＢｓＡｇ発現に対するＧＢＬ－０４０１の抑制効果の持続性の研究
１．実験案
適齢のＨＢＶトランスジェニック雄マウス（ＨＢｓＡｇ発現が顕著であることを要求する）を実験評価に用い、体重が２５ｇ前後のマウスを１０匹選び、２群に無作為に分け、各群を５匹とし、それぞれ対照群と投与群とし、Ｄａｙ０でそれぞれ皮下注射により３ｍｇ／ｋｇ投与し、投与体積は１００～２００μＬであった。投薬前に採血してＨＢｓＡｇを測定し、各群のＨＢｓＡｇレベルをできるだけ一致させた。マウス眼窩静脈叢から全血を、投与前（ｄａｙ ０）、投与後－１週目、２週目、３週目、４週目、５週目、６週目の時点で採取し、ＨＢｓＡｇを検出し、ＨＢＶ遺伝子発現に対するＧＢＬ－０４０１の抑制の持続性を考察した。
具体的な投与情報は下表のように示されている。
Figure 0007383308000145
 （二）試料及び試薬
Figure 0007383308000146
 ３．キット
Figure 0007383308000147
 ４．実験機器
Figure 0007383308000148
 ５．試験結果
結果から、ＧＢＬ－０４０１は１週目に最適な抑制効果である９９．０８％を達成し、２週目から３週目までは低下傾向にあったが、９０％前後の高い抑制率を示し、４週目から６週目までは低下傾向にあったが、７５％前後の抑制効果を維持した。ＧＢＬ－０４０１はＨＢＶ ＨＢｓＡｇ発現に対して持続的な抑制効果があり、６週間程度発現を安定的に抑制することができた。ＨＢＶ ＨＢｓＡｇに対するＧＢＬ－０４０１のインビボ抑制効果を図１０に示す。

Claims (9)

  1. ＨＢＶ遺伝子発現を抑制する干渉核酸、トランジションポイント及びその末端修飾鎖を構造中に含む化合物であって、
    前記末端修飾鎖は、連結鎖Ｄと、リンカーＢと、分岐鎖Ｌと、肝臓を標的とする特異的配位子Ｘとから構成され、前記末端修飾鎖と前記干渉核酸はトランジションポイントＲ１／Ｒ２を介して連結され、その構造は一般式（Ｉ）に示され、
    Figure 0007383308000149
     （Ｉ）
    式中、
    ｎが１である場合、ｍは３であり、又は、ｎが２である場合、ｍは２であり、
    Ｒ１は－ＮＨ（ＣＨ２）ｘＣＨ２－であり、ここでｘは３～１０の整数であり、
    Ｒ２は－ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）－、又は一級アルコールと二級アルコールを持つピロール環又はピペリジン環であり、
    前記肝臓を標的とする特異的配位子ＸはＮ－アセチルガラクトサミンであり、
    前記分岐鎖ＬはＣ３～Ｃ１８の直鎖であり、該直鎖にはカルボニル、アミド、ホスホリル、酸素原子又はこれらの基の組み合わせが含まれ、
    前記リンカーＢは以下の構造式から選ばれ、
    Figure 0007383308000150
     式中、Ａ１はＣ、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、ｒ１は１～１５の正の整数であり、ｒ２は０～５の整数であり、Ａ２はＣ、Ｏ、Ｓ、アミノ、カルボニル、アミド、又はホスホリルであり、
    前記連結鎖ＤはＣ５～Ｃ２０を含有し、アミノ、カルボニル、アミド、酸素原子、硫黄原子、ホスホリル、又はこれらの基の組み合わせを含有し、
    前記干渉核酸は抗Ｂ型肝炎ウイルスｓｉＲＮＡである、化合物。
  2. 前記抗Ｂ型肝炎ウイルスｓｉＲＮＡのセンス鎖５’末端の末端修飾鎖と前記抗Ｂ型肝炎ウイルスｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖３’末端の末端修飾鎖との組み合わせは下記から選ばれる、請求項１に記載の化合物。


    Figure 0007383308000151
    Figure 0007383308000152

    Figure 0007383308000153

    Figure 0007383308000154
  3. 前記ｓｉＲＮＡの配列は以下から選ばれる、請求項１に記載の化合物。
    １） センス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１とアンチセンス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２との組み合わせ配列
    ２） センス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５とアンチセンス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６との組み合わせ配列
    ３） センス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７とアンチセンス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８との組み合わせ配列
    ４） センス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９とアンチセンス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０との組み合わせ配列
    ５） センス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３とアンチセンス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４との組み合わせ配列
    ６） センス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７とアンチセンス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８との組み合わせ配列
    ７） センス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７とアンチセンス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８との組み合わせ配列
    ８） センス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１とアンチセンス鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２との組み合わせ配列。

  4. 下記のＧＢＬ－０４０１～ＧＢＬ－０４１８から選ばれる、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
    Figure 0007383308000155

    Figure 0007383308000156
     また、前記修飾鎖を持つｓｉＲＮＡコードは以下示す通りである。


    Figure 0007383308000157

    Figure 0007383308000158

    Figure 0007383308000159
     ここで、ｍＧ、ｍＡ、ｍＣ及びｍＵは２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）で修飾されたヌクレオチドであり、ｆＧ、ｆＡ、ｆＣ及びｆＵは２’－フッ素で修飾されたヌクレオチドであり、ｓはホスホロチオ酸ヌクレオシド間結合であり、残りのヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合を介して連結されていて、Ｇｓ＝３’－チオグアニル酸、Ａｓ＝３’－チオアデノシン、Ｕｓ＝３’－チオウリジン酸、Ｃｓ＝３’－チオシチジン、ｄＴｓ又はＴｓ＝２’－デオキシ－３’－チオチミジンであり、
    前記末端修飾鎖の組み合わせのコードは以下の通りである。


    Figure 0007383308000160

    Figure 0007383308000161
    Figure 0007383308000162

    Figure 0007383308000163
  5. 肝関連疾患は、急性・慢性肝炎、肝臓癌、遺伝性肝疾患、肝硬変、脂肪肝、又は糖尿病である、肝関連疾患を治療する医薬品の製造における請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物の適用。
  6. 前記ＨＢＶ遺伝子発現の抑制によって治療されるＨＢＶ感染は、慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染、急性Ｂ型肝炎ウイルス感染を含む、ＨＢＶ感染関連疾患を治療する医薬品の製造における請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物の適用。
  7. 前記肝臓を標的とする特異的配位子Ｘは、肝臓中のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対して特異的なものであり、前記ＨＢＶ感染関連疾患は慢性Ｂ型肝炎であり、前記化合物は、ＨＢＶのＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡの発現を持続的に抑制することが可能である、ことを特徴とする請求項６に記載の適用。
  8. 請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物と薬学的に許容される補助材料とを含む、医薬組成物。
  9. 前記医薬組成物の剤形は、皮下注射剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
JP2021577836A 2019-06-28 2020-06-23 新規化合物及びその適用 Active JP7383308B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910576037.1 2019-06-28
CN201910576037.1A CN110218728A (zh) 2019-06-28 2019-06-28 一种新化合物及其应用
CN201911281389.0A CN110846320B (zh) 2019-06-28 2019-12-13 一种新化合物及其应用
CN201911281389.0 2019-12-13
PCT/CN2020/097732 WO2020259497A1 (zh) 2019-06-28 2020-06-23 一种新化合物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022540363A JP2022540363A (ja) 2022-09-15
JP7383308B2 true JP7383308B2 (ja) 2023-11-20

Family

ID=67815175

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021577836A Active JP7383308B2 (ja) 2019-06-28 2020-06-23 新規化合物及びその適用

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20230374513A1 (ja)
EP (1) EP3992291A4 (ja)
JP (1) JP7383308B2 (ja)
KR (1) KR20220035398A (ja)
CN (2) CN110218728A (ja)
AU (1) AU2020305793B2 (ja)
TW (1) TWI750712B (ja)
WO (1) WO2020259497A1 (ja)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110218728A (zh) * 2019-06-28 2019-09-10 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种新化合物及其应用
CN111514307A (zh) * 2020-04-30 2020-08-11 杭州勇诚睿生物科技有限公司 一种新型肝靶向药物载体
WO2022155814A1 (en) * 2021-01-20 2022-07-28 Argorna Pharmaceuticals Ltd Ligand compounds, conjugates, and applications thereof
CN114853828A (zh) * 2021-01-20 2022-08-05 阿格纳生物制药有限公司 化合物、缀合物及其用途
CN114940991B (zh) * 2021-04-13 2023-02-03 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的rna抑制剂及其应用
CN113234725B (zh) * 2021-05-28 2022-02-18 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种抑制pcsk9基因表达的rna抑制剂及其应用
CN113862268A (zh) * 2021-10-20 2021-12-31 厦门甘宝利生物医药有限公司 Agt抑制剂及其用途
CN114703184A (zh) * 2022-03-11 2022-07-05 厦门甘宝利生物医药有限公司 Lpa抑制剂及其用途
WO2024061157A1 (en) * 2022-09-19 2024-03-28 Kylonova (Xiamen) Biopharma Co., Ltd. Carbohydrate-oligonucleotide conjugates, pharmaceutical compositions, and therapeutic applications

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014527401A (ja) 2011-06-30 2014-10-16 アローヘッド リサーチ コーポレイション Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子発現を阻害するための組成物および方法
JP2017538679A (ja) 2014-11-10 2017-12-28 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
CN109331185A (zh) 2017-12-01 2019-02-15 厦门甘宝利生物医药有限公司 含有肝靶向特异性配体和甲状腺素受体激动剂的药物
JP2018520685A5 (ja) 2016-07-17 2019-03-28

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009082607A2 (en) * 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
MX2012009178A (es) 2010-02-24 2012-11-30 Arrowhead Res Corp Composiciones para liberacion dirigida de arnsi.
BR122020024388B1 (pt) * 2010-12-29 2021-09-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotídeo e composição farmacêutica
WO2015188194A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced intestinal absorption of conjugated oligomeric compounds
US20170137821A1 (en) * 2015-07-17 2017-05-18 Arcturus Therapeutics, Inc. Molecules and agents for treating hepatitis b virus
CN108136206B (zh) * 2015-07-17 2021-10-15 阿克丘勒斯治疗公司 抗乙型肝炎病毒的组合物和药剂及其用途
CA2991639A1 (en) * 2015-08-07 2017-02-16 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Rnai therapy for hepatitis b virus infection
JOP20170161A1 (ar) * 2016-08-04 2019-01-30 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل RNAi للعدوى بفيروس التهاب الكبد ب
WO2018185253A1 (en) * 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Ligand modified double-stranded nucleic acids
EP3888685A4 (en) 2018-11-30 2022-11-09 Kylonova (Xiamen) Biopharma Co., Ltd. PHARMACEUTICALS CONTAINING LIVER TARGETING SPECIFIC LIGANDS AND THYROID HORMONE RECEPTOR AGONISTS
CN110218728A (zh) * 2019-06-28 2019-09-10 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种新化合物及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014527401A (ja) 2011-06-30 2014-10-16 アローヘッド リサーチ コーポレイション Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子発現を阻害するための組成物および方法
JP2017538679A (ja) 2014-11-10 2017-12-28 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
JP2018520685A5 (ja) 2016-07-17 2019-03-28
CN109331185A (zh) 2017-12-01 2019-02-15 厦门甘宝利生物医药有限公司 含有肝靶向特异性配体和甲状腺素受体激动剂的药物

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022540363A (ja) 2022-09-15
US20230110095A1 (en) 2023-04-13
CN110846320A (zh) 2020-02-28
AU2020305793B2 (en) 2024-04-18
WO2020259497A1 (zh) 2020-12-30
AU2020305793A1 (en) 2022-02-17
US11840691B2 (en) 2023-12-12
EP3992291A1 (en) 2022-05-04
TWI750712B (zh) 2021-12-21
TW202043474A (zh) 2020-12-01
CN110846320B (zh) 2020-10-30
EP3992291A4 (en) 2023-08-02
CN110218728A (zh) 2019-09-10
US20230374513A1 (en) 2023-11-23
KR20220035398A (ko) 2022-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7383308B2 (ja) 新規化合物及びその適用
JP7224319B2 (ja) キラルデザイン
AU2016334232B2 (en) Oligonucleotide compositions and methods thereof
JP2023145620A (ja) オリゴヌクレオチド組成物及びその使用方法
TW201908483A (zh) 寡核苷酸組合物及其使用方法
WO2018223081A1 (en) Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
WO2017192664A1 (en) Oligonucleotide compositions and methods thereof
JP2019511491A (ja) 治療化合物用の標的化リガンド
EP3862024A1 (en) Sirna conjugate, preparation method therefor and use thereof
WO2023066236A1 (zh) Agt抑制剂及其用途
WO2024088190A1 (zh) 一种抑制lpa基因表达的rna抑制剂及其应用
TW202227135A (zh) 用於遞送治療劑之脂質結合物
WO2024002046A1 (en) Oligonucleotide delivery enhancing compounds, pharmaceutical compositions and methods using the same
AU2022349576A1 (en) Multivalent ligand clusters with diamine scaffold for targeted delivery of therapeutic agents
RU2797833C1 (ru) Композиции олигонуклеотидов и способы с ними
TW202412845A (zh) 用於遞送治療劑至cns組織之脂質結合物
CN117466959A (zh) 一种肝靶向化合物、缀合物及应用
CN116854754A (zh) 一种含有核糖环或其衍生结构的GalNAc化合物及其寡核苷酸缀合物
CN116474107A (zh) 一种缀合物及其中间体化合物和用途
WO2024023252A2 (en) Nucleic acid compounds
WO2023245061A2 (en) Lipid conjugates for the delivery of therapeutic agents to cns tissue
TW202239962A (zh) 一種抑制b型肝炎病毒基因表達的rna抑制劑及其應用

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220221

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230404

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230704

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230822

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20231024

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231031

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7383308

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150