CN113862268A - Agt抑制剂及其用途 - Google Patents

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CN113862268A CN202111222428.7A CN202111222428A CN113862268A CN 113862268 A CN113862268 A CN 113862268A CN 202111222428 A CN202111222428 A CN 202111222428A CN 113862268 A CN113862268 A CN 113862268A
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Abstract

本申请涉及一种RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述RNAi剂的结构中含有载体结构和干扰核酸。本申请还涉及使用所述RNAi剂以抑制AGT基因表达的方法及预防与治疗AGT相关疾病的方法。

Description

AGT抑制剂及其用途
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种抑制AGT基因表达的RNAi剂及其应用。
背景技术
RNAi
RNAi(RNA干扰)于1998年，由安德鲁·法厄(Andrew Z.Fire)等在秀丽隐杆线虫中进行反 义RNA抑制实验时发现，并将这一过程称为RNAi。这一发现被《Science》杂志评为2001 年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。自此以后，以RNAi为作用机理 的siRNA作为潜在的基因治疗药物得到人们广泛的关注，2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅 洛(Craig C.Mello)由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理或医学奖。RNAi是在许多 生物中，包括动物、植物和真菌，都可由双链RNA(dsRNA)触发的，在RNAi过程中，一种 称为“Dicer”的核酸内切酶将长链dsRNA切割或“切丁”成21～25个核苷酸长的小片段。这些小 片段，被称为小干扰RNA(siRNA)，其中的反义链(Guide strand)被加载到Argonaute蛋白(AGO2) 上。AGO2加载发生在RISC-loading复合物中，这是一个三元复合物，由Argonaute蛋白、 Dicer和dsRNA结合蛋白(简称为TRBP)组成。在装载过程中，正义链(Passenger strand)链被 AGO2裂解并排出。然后，AGO2使用反义链与包含完全互补序列的mRNA结合，然后催化 这些mRNA的切割，致使mRNA分裂丧失翻译模板的作用，进而阻止相关蛋白质的合成。 切割后，被切割的mRNA被释放，加载着反义链的RISC-loading复合物被循环用于另一轮的 切割。
据统计，在人体内的疾病相关蛋白中，大约超过80％的蛋白质不能被目前常规的小分子 药物以及生物大分子制剂所靶向，属于不可成药蛋白。旨在通过基因的表达、沉默等功能治 疗疾病的基因治疗被业界认为是继化学小分子药物、生物大分子药物之后的第三代治疗药物， 这种疗法在基因水平上实现对疾病的治疗，不受不可成药蛋白的制约。作为基因治疗中RNAi 技术最主流的类型，RNAi技术是从mRNA的水平对疾病进行治疗，相比化学小分子药物及 生物大分子药物在蛋白质水平的治疗具有更高的效率。利用RNAi技术，可以根据特定基因 序列，设计出特异性高、抑制效果好的siRNA的正义链和反义链序列，通过固相合成这些单 链序列，然后正义链与反义链在特定的退火缓冲液中按照碱基配对原则配对成siRNA，最后 通过载体系统输送到体内相应靶点，降解目标mRNA，破坏目标mRNA作为翻译模板的功能， 从而阻止相关蛋白的合成。
siRNA的递送系统
siRNA在血液和组织中不稳定，容易被核酸酶降解，为了提高siRNA的稳定性，可以通过 对siRNA的正义链和/或反义链修饰，但这些化学修饰只提供有限的免受核酸酶降解的保护作 用并且可能最终影响siRNA的活性。因此，还需要相应的传递系统来保障siRNA安全高效的穿 过细胞膜。由于siRNA分子质量较大，且带有大量负电荷，而且具有高水溶解性，所以自身 无法顺利穿越细胞膜到达细胞内。
脂质体基本结构是由亲水核和磷脂双分子层构成，具备类似生物膜的磷脂双分子层，拥 有很高的生物相容性，所以脂质体一度成为最受欢迎、应用最广泛的siRNA载体。脂质体介 导的siRNA递送主要将siRNA包裹到脂质体内，保护siRNA不被核酸酶降解，提高siRNA 的通过细胞膜障碍的效率，从而促进细胞的吸收。例如阴离子脂质体、pH敏感性脂质体、免 疫脂质体、膜融合脂质体(fusogenic liposome)和阳离子脂质等等，尽管取得了一定的进展，但 脂质体本身容易引发炎症反应，给药前必须使用多种抗组胺和激素类如西利替嗪和地塞米松 类等药物，以减少可能发生的急性炎症反应，因此在实际临床应用中并不适合所有治疗领域， 尤其像慢性乙肝这一类治疗周期长的疾病，长期使用可能产生的积蓄毒性是潜在的安全隐患， 因此需要一种更安全有效的载体系统来递送siRNA。
肝脏中去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，是肝细胞特异性表达的受体，是一种高效的内吞 型受体。由于体内生理情况下各种糖蛋白在酶或酸水解唾液酸后，暴露出的次末端是半乳糖 残基，所以ASGPR特异性结合的糖为半乳糖基，故又称半乳糖特异性受体。半乳糖、半乳 糖胺、N-乙酰半乳糖胺等单糖和多糖分子都对ASGPR有高亲和性。ASGPR主要生理功能是 介导血液中去唾液酸糖蛋白、脂蛋白等物质的清除，且与病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏 疾病的发生发展有着密切联系。ASGPR这一特性的发现，对肝源性疾病的诊断及治疗起着重 要作用(Ashwell G、Harford J，Carbohydrate specific Receptors of the Liver，Ann Rev Biochem 1982 51:531-554)。结构中含有半乳糖或半乳糖胺及其衍生物的肝源性疾病治疗药物可以特异 性地与ASGPR亲和，从而具有主动肝靶向性，不需要其它的载体系统来输送。
血管紧张素原(AGT)与高血压
血压是指循环系统中血液对血管壁的压力。血压主要是由于动物心脏的跳动。在每次心 跳期间，血压在最大(收缩期)血压(SBP)和最小(舒张期)血压(DBP)之间变化。平均动脉压(MAP) 是心跳周期期间的平均动脉压。血压可以通过血压计(即血压测量计)测量。静息时的正常血 压在100-140mmHg收缩期和60-90mmHg舒张期的范围内，并且通常表示为收缩压(最高读数)/ 舒张压(最低读数)mmHg。
在未使用降压药物的情况下,收缩压(SBP)≥140mmHg和(或)舒张压(DBP)≥90mmHg，定 义为高血压。根据血压升高水平，将高血压分为1级、2级和3级。根据血压水平、心血管危险 因素、靶器官损害、临床并发症和糖尿病进行心血管风险分层,分为低危、中危、高危和很高 危4个层次。血压分类和定义如下：
Figure BDA0003313098240000031
根据病症起因，高血压还可分为原发性高血压以及继发性高血压。原发性高血压是多种 因素导致的高血压，或者是由不明原因导致的高血压，有遗传、地域或者是钠水潴留、交感 兴奋、RAS激活等各种各样的原因，所以原发性高血压只能够控制，不能够根治。继发性高 血压是指由某种疾病所导致血压增高，高血压是原发疾病的临床症状之一，占95％。一般继 发性高血压常见于肾性高血压、肾动脉狭窄，原发性醛固酮增多症、嗜铬细胞瘤、多发性大 动脉炎等等。
血压水平与心脑血管病发病和死亡风险之间存在密切的因果关系。有研究发现，基线血 压从115/75mmHg到185/115mmHg，平均随访12年,结果发现诊室SBP或DBP与脑卒中、冠 心病事件、心血管病死亡的风险呈连续、独立、直接的正相关关系。SBP每升高20mmHg或DBP每升高10mmHg，心、脑血管病发生的风险倍增，其中心力衰竭和脑卒中是与血压水平 关联最密切的两种并发症，同时也发现终末期肾病(ESRD)的发生率也明显增加。在重度高 血压，ESRD发生率是正常血压者的11倍以上,即使血压在正常高值水平也达1.9倍。因此高血压治疗的根本目标是通过降低血压，有效预防或延迟脑卒中、心肌梗死、心力衰竭、肾功能不全等并发症发生有效控制高血压的疾病进程，预防高血压急症、亚急症等重症高血压发生。
“肾素-血管紧张素-醛固酮系统”，英文缩写为RAAS或者RAS(肾素-血管紧张素系统) 是人体内对心血管功能有调节作用的系统，受交感神经系统领导，分泌产生的血管紧张素具 有收缩血管的作用。RAS途径的过度刺激或活动是高血压形成的原因之一。
血管紧张素原(AGT)，是serpin家族的成员，也被称为SERPINA8，由AGT基因编码，是 RAS所有血管紧张素肽的唯一前体。人AGT有485个氨基酸，其中包括一个33个氨基酸的信号 肽，主要在肝脏中产生，并且释放到体循环中，期间肾素将其转化为血管紧张素I。随后通过 血管紧张素转化酶(ACE)将血管紧张素I转化成血管紧张素II。血管紧张素Ⅰ能刺激肾上腺髓质 分泌肾上腺素，但直接收缩血管的作用不明显；血管紧张素Ⅱ能使全身小动脉收缩而升高血压， 此外，还可促进肾上腺皮质分泌醛固酮，醛固酮作用于肾小管，起保钠、保水、排钾作用， 从而引起血量增多，血压升高。作用机制如图10所示。
临床一线的降压药主要有五大类，通常使用的降压药分为五大类，一般用字母ABCD来 表示，A包括血管紧张素转换酶抑制剂ACEI(如普利类药物)和血管紧张素II拮抗剂ARB(如 沙坦类药物)、B是是指β1-受体拮抗剂(如洛尔类药物)、C是指二氢吡啶钙通道拮抗剂(如 地平类药物)、D是指利尿剂(如噻嗪类药物)。这五类降压药的作用机制不完全一样，根据 患者的不同年龄不同血压水平临床上对于血压的控制，首先采用一个药物，如果一个药物对 血压的控制效果欠佳，则联合使用两个，甚至三个降压药。如果三个降压药都无法将血压控 制到正常范围，则称之为难治型高血压。难治性高血压是高血压治疗中一个比较常见的临床 问题，也是治疗方面的棘手的问题。
当前临床常用的这五类药物都需要长期每天不间断的用药，有些患者的依从性差，其中 的副作用是导致依从性差的主要原因，ACEI类和ARB类都可引起干咳和水肿，严重可导致肾 功能不全；CB类药副作用可见为心跳加速、脸红、头疼、脚肿；B类还可导致乏力，对血糖、 血脂代谢影响；D类药可导致身体发软、抽筋，严重可导致痛风。
因此，本领域中存在不同于现有临床药物的新的作用机理的、副作用少的有更有效治疗 的需要。
发明内容
本申请提供了一种AGT RNAi剂，其通过特异性的干扰AGT基因的mRNA，破坏其作为翻译模板的功能，阻止血管紧张素原AGT蛋白的表达，从而可以预防和/或治疗与RAS途径相关的疾病，如高血压，包括“非顽固性高血压”和“顽固性高血压”。
本申请的RNAi剂可以由正义链和反义链通过碱基配对形成，正义链和反义链彼此之间 至少80％碱基互补，且部分或全部核苷酸糖基2’位可以是氟或甲氧基，末端可以至少有连续 3个核苷酸之间的磷酸酯被硫代。
本申请的RNAi剂的结构中还可以含有使所述RNAi剂具有肝靶向特异性的结构5’MVIP 和3'MVIP，其中5’MVIP可以偶联在所述RNAi剂正义链和/或反义链5’末端，3’MVIP可以 偶联在所述RNAi剂反义链和/或正义链3’末端，5’MVIP和3’MVIP都可以包含有(肝靶向特异性)靶向单元X、支链L、接头B和连接链D，5’MVIP还可以包含与所述RNAi剂正义 链或反义链5’末端连接的转接点R1，3’MVIP还可以包含与所述RNAi剂正义链或反义链3’ 末端连接的转接点R2，所述靶向单元X、支链L、接头B和连接链D在5’MVIP与3’MVIP 各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间可以相同，也可以不同。通过体内外药效实验证明， 这种RNAi剂直接降解AGT mRNA，持续高效地抑制AGT基因表达，可用于治疗或/和预防 AGT基因介导的疾病，如高血压。
一方面，本申请提供一种RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述RNAi剂的结构中含有 载体结构和干扰核酸，其结构如式IIIa、IIIb或IIIc所示：
Figure BDA0003313098240000051
Figure BDA0003313098240000061
其中，
所述干扰核酸靶向AGT基因，其包括反义链和正义链；
所述载体结构包括5’MVIP(5’MultiValent Import Platform)和/或3’MVIP(3’MultiValent Import Platform)；
所述5’MVIP由转接点R1、连接链D、接头B、支链L和肝靶向特异性配体X组成，所 述3’MVIP由转接点R2、连接链D、接头B、支链L和肝靶向特异性配体X组成，所述5’MVIP 通过转接点R1与正义链5’端或反义链5’端连接，所述3’MVIP通过转接点R2与正义链3’端 或反义链3’端连接，n和m各自独立地为0-4的任意整数。
在某些实施方式中，其中所述干扰核酸用于抑制AGT基因表达，
在某些实施方式中，其中所述干扰核酸包括siRNA或miRNA。
在某些实施方式中，其中所述且n+m＝2-6的整数，优选n+m＝2、3或4，更优选为4。
在某些实施方式中，所述5’MVIP选自表10中5’MVIP01至5’MVIP22中的任一个，和/或所述3’MVIP选自表11中3’MVIP01至3’MVIP27的任一个。
在某些实施方式中，其中所述正义链与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18中任意 一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列具有基本上同源性。
在某些实施方式中，所述反义链包含以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:25、 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35和SEQID NO:36中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
在某些实施方式中，其中所述正义链包含SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO: 44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中 任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列，且所述反义链包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71 和SEQ IDNO:72中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
在某些实施方式中，其中所述干扰核酸包括Kylo-09-DS01，Kylo-09-DS07，Kylo-09-DS08， Kylo-09-DS10，Kylo-09-DS11，Kylo-09-DS12，Kylo-09-DS17，Kylo-09-DS18，Kylo-09-DS37～ Kylo-09-DS54中任意任一种或多种。
在某些实施方式中，所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐包括表18中Kylo-09-DS122， Kylo-09-DS131至Kylo-09-DS147中的任一种或多种。
在某些实施方式中，所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐包括表19中Kylo-09-DS122， Kylo-09-DS131，Kylo-09-DS141，Kylo-09-DS142和Kylo-09-DS147中的任一种或多种。
另一方面，本申请提供了一种抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其 包含反义链，其中所述反义链包含至少12个与选自以下序列相应位置的核苷酸基本上互补的 连续核苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列：AGT mRNA NM_001382817.3中起始位置 为1854-1874、1907-1927、1895-1915、1352-1372、1903-1923、2019-2039、1853-1873和1818-1838 的至少连续12个核苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列或NM_001384479.1中起始位置 为1822-1842、1875-1895、1863-1883、1320-1340、1871-1891、1987-2007、1821-1841和1786-1806 的至少连续12个核苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
在某些实施方式中，所述RNAi剂包括单链或双链核酸分子。
在某些实施方式中，所述RNAi剂包括siRNA或miRNA。
在某些实施方式中，所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐还包含 正义链，其中所述反义链和正义链形成的互补区，所述互补区包括至少12个连续核苷酸。
在某些实施方式中，其中所述正义链和/或反义链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成修 饰的核苷酸。
在某些实施方式中，所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐还包含 配体，所述配体通过载体结构偶联于正义链和/或反义链。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含前述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，或 者前述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含前述的RNAi剂或其药学上可接受的 盐，或者前述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，以及任选地药学上可 接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。
另一方面，本申请提供了一种减少细胞或组织中AGT mRNA或蛋白质表达的方法，其 包括使细胞或组织与有效量的前述的RNAi剂或其药学上可接受的盐、前述的抑制AGT基因 表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，和/或前述的药物组合物接触。
另一方面，本申请提供了前述的RNAi剂或其药学上可接受的盐、前述的抑制AGT基因 表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药 物用于预防和/或治疗疾病或病症或者降低疾病或病症的风险。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需 要的受试者施用有效量的前述的RNAi剂或其药学上可接受的盐、前述的抑制AGT基因表达 的RNAi剂或其药学上可接受的盐，和/或前述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种药盒，其包含前述的RNAi剂或其药学上可接受的盐、前 述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，或前述的药物组合物。
本申请的AGT RNAi剂通过干扰AGT mRNA，破坏其作为翻译模板的功能，调整体循环 中AGT蛋白(RAS所有血管紧张素肽的唯一前体)的表达水平，从基因层面和从RAS系统的源头上进行血压的调控，供了一种全新的治疗模式来对抗各类高血压，包括抗原发性和继发 性的，也包括其中的顽固性高血压(TRH)，使那些抗顽固性高血压(TRH)或射血分数降低的慢 性心力衰竭患者有药可用。本申请的AGT RNAi剂还具有独特的长效性，存在一季度或半年 给药一次的可能，具有当前小分子高血压治疗药无可比拟的优势。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文 的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本 申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉 及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限 制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的 示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如 下：
图1A显示的是本申请实施例2中的RNAi干预后Hep 3B细胞中AGT mRNA水平；
图1B显示的是本申请实施例2中的RNAi干预后HepG 2细胞中AGT mRNA水平；
图2A-2D显示的是本申请实施例3中RNAi剂不同时段的稳定性检测的HPLC图；
图3显示的是本申请实施例4.1.1.5中合成的ERCd-01-c2的高分辨质谱图；
图4显示的是本申请实施例4.1.2.6中合成的3’MVIP17-c1的高分辨质谱图；
图5显示的是本申请实施例4.2.1.2中合成的5’MVIP09-ERCd-PFP-c2的高分辨质谱图；
图6显示的是本申请实施例6中的转基因小鼠给药后hAGT平均水平；
图7显示的是本申请实施例7中的转基因小鼠给药后血清中hAGT平均水平。
图8显示的是本申请实施例8中的食蟹猴给药后血清中AGT平均水平。
图9A-9E显示的是Kylo-09-DS122，Kylo-09-DS131，Kylo-09-DS141，Kylo-09-DS142 和Kylo-09-DS147的结构式。
图10显示的是血管紧张素原(AGT)的作用机制。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书 所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“血管紧张素原”可以与术语“AGT”交换使用，AGT mRNA序列的实例容易利用已公开的数据库取得，例如，GenBank、UniProt、OMIM和猕猴(Macaca)基因 组计划网站。术语“AGT”包括人类AGT，其mRNA序列可见于例如，GenBank NM_001382817.3或GenBank NM_001384479.1；食蟹猴AGT，其氨基酸与完整编码序列可见 于，例如，GenBank登录号GI：90075391(AB170313.1)；小鼠(Mus musculus)AGT，其氨基 酸与完整编码序列可见于例如，GenBank登录号GI：113461997(NM_007428.3)；及大鼠AGT (Rattus norvegicus)AGT，其氨基酸与完整编码序列可见于例如，GenBank登录号GI： 51036672(NM_134432)。本文所用术语“AGT”亦指AGT基因的天然存在的DNA序列变异， 如AGT基因中的单核苷酸多态性(SNP)。
在本申请中，术语“iRNA”、“RNAi剂”、“iRNA剂”、“RNA干扰剂”可交换使 用，通常指包含如本文术语所定义的RNA的药剂，且其可通过RNA诱导沉默复合物(RISC) 途径介导RNA转录物的靶向切割。iRNA经由称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序 列特异性降解。iRNA调控(例如，抑制)AGT基因在细胞(例如，受试者如哺乳动物受试者中 的细胞)中的表达。
在某些实施方式中，RNAi剂可为引入细胞或生物体中来抑制靶mRNA的单链 siRNA(ssRNAi)。单链RNAi剂结合RISC内切核酸酶Argonaute 2，其然后切割靶mRNA。单 链siRNA一般为15至30个核苷酸且经化学修饰。单链siRNA的设计和测试说明于美国专利 号8,101,348及Lima等人(2012)Cell 150：883-894中，其各自的完整内容以引用的方式并入 本文中。本文所述的任何反义核苷酸序列均可用作本文所述的或通过Lima等人(2012)Cell150： 883-894中说明的方法进行化学修饰的单链siRNA。
在某些实施方式中，本申请所使用的“iRNA”是双链RNA，且本文中称为“双链RNAi剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”指核糖核 酸分子的复合物，其具有包含两个反向平行且基本上互补的核酸链的双链体结构，称为具有 相对于靶RNA(即AGT基因)的“正义”和“反义”取向。在本申请的一些实施方式中，双链 RNA(dsRNA)通过转录后基因沉默机制(本文中称为RNA干扰或RNAi)触发靶RNA(例如， mRNA)的降解。
双链体结构可为容许所需的靶RNA通过RISC途径的特异性降解的任何长度，且可在约 19至36碱基对的长度范围内，例如，约19-30碱基对的长度，例如，约19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36碱基对的长度。上述范围与 长度中间的范围与长度也包括为本申请的部分。在某些实施方式中，本申请的iRNA剂为各 链包含15-23个核苷酸的dsRNA，其与靶RNA序列(例如，AGT基因)相互作用以指导靶RNA 的切割。在某些实施方式中，本申请的iRNA为24-30个核苷酸的dsRNA，其与靶RNA序列 (例如，AGT靶mRNA序列)相互作用以指导靶RNA的切割。
通常，dsRNA分子的各链的大多数核苷酸为核糖核苷酸，但如本文详细说明的，各链或 两条链也可包括一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或修饰的核苷酸。此外， 本说明书所用“iRNA”可包括具有化学修饰的核糖核苷酸；iRNA可在多个核苷酸处包括实 质修饰。本文所用术语“修饰的核苷酸”意指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷酸间连接 或修饰的核碱基，或其任何组合的核苷酸。因此，术语“修饰的核苷酸”涵盖对核苷酸间连 接、糖部分或核碱基的例如官能团或原子的置换、添加或移除。适用于本申请药剂的修饰包 括本文所公开或本领域已知的所有类型的修饰。
在本申请中，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并指任何长度的核苷酸(脱氧核 糖核苷酸或者核糖核苷酸或者其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可 以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST 或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、siRNA、miRNA、shRNA、RNAi试剂和引物。多核苷酸可以在一个或多 个碱基、糖和/或磷酸酯处以本申请所述或本领域已知的任何各种修饰或取代进行修饰或取代。 多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分阻断。多聚 核苷酸可以在聚合后修饰，例如通过与标记组分偶联。该术语可以是双链和单链分子。除非 另有说明或要求，否则本申请作为多核苷酸的任何实施方式包括双链形式和已知或据预测构 成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
在本申请中，术语“靶核酸”或“靶序列”通常指在AGT基因转录期间所形成mRNA 分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为主要转录产物的RNA加工产物的mRNA。序列的 靶部分应至少足够长以作为在AGT基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的该部分 位置处或附近iRNA指导的切割的底物。在一个实施方式中，该靶序列在AGT的蛋白质编码 区内。靶序列可为约19-36个核苷酸的长度，例如，优选约19-30个核苷酸的长度。上述范 围和长度中间的范围和长度也包括为本申请的部分。
在本申请中，术语“核苷酸序列”通常是指一连串或一定顺序的核碱基、核苷酸和/或核 苷，无论是经修饰还是未修饰，使用标准核苷酸命名和本申请所述的经修饰的核苷酸的符号 表用一连串字母描述。
在本申请中，术语“寡核苷酸”通常是指由多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸，或其相关的结构变体或合成类似物)通过磷酸二酯键(或其相关的结构变体或合成类似物) 连接组成的聚合物。因此，虽然术语“寡核苷酸”一般指其中核苷酸残基和它们之间的连接是 天然产生的核苷酸聚合物，但应理解，该术语的范围也包括各种类似物，包括但不限于：肽 核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核酸等。该分子的确切大 小可取决于具体应用。寡核苷酸一般长度较短，通常约有10-30个核苷酸残基，但该术语也 可指任何长度的分子，尽管术语“多核苷酸”或“核酸”一般用于较大的寡核苷酸。
在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个或多个未修饰的核糖核苷(RNA)和/或未修饰的脱 氧核糖核苷(DNA)和/或一个或多个修饰核苷。术语“修饰寡核苷酸”通常意指包含至少一个修 饰核苷和/或至少一个修饰的核苷间键联的寡核苷酸。
在本申请中，术语“修饰的核苷”通常意指与天然存在的RNA或DNA核苷相比包含至少 一个化学修饰的核苷。修饰的核苷包含修饰的糖部分和/或修饰的核碱基。
在本申请中，术语“核碱基”通常意指杂环嘧啶或嘌呤化合物，它是所有核酸的组分且 包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。核苷酸可包括经修饰的 核苷酸或核苷酸模拟物、无碱基位点(Ab或X)或替代物替代部分。如本申请所使用，“核碱 基序列”通常意指不依赖于任何糖、键联或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。术语“未修饰 的核碱基”或“天然存在的核碱基”通常意指RNA或DNA的天然存在的杂环核碱基：嘌呤 碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基C)和尿嘧啶 (U)。“修饰的核碱基”通常意指并非天然存在的核碱基的任何核碱基。
在本申请中，术语“糖部分”通常意指核苷的天然存在的糖部分或修饰的糖部分。术语 “天然存在的糖部分”通常意指如在天然存在的RNA中发现的呋喃核糖基或如在天然存在 的DNA中发现的脱氧呋喃核糖基。“修饰的糖部分”意指取代的糖部分或糖替代物。
在本申请中，术语“核苷间键联”通常意指寡核苷酸中相邻核苷之间的共价键联。“天 然存在的核苷间键联”意指3’至5’磷酸二酯键联。“修饰的核苷间键联”意指除了天然存在 的核苷间键联之外的任何核苷间键联。
在本申请中，术语“反义寡核苷酸”是指单链寡核苷酸分子，其具有与靶核酸(例如，目 标基因组序列，mRNA前体，或mRNA分子)的相应片段互补的核碱基序列。在某些实施方 案中，反义寡核苷酸的长度为12至30个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸是具有 与靶核酸(如AGT多核苷酸)序列互补的核苷酸序列的未经修饰或经修饰的核酸。
在本申请中，术语“反义链”通常是指RNAi剂(例如dsRNA)的包括与靶序列实质上互 补的区域的链。在本文中使用时，术语“互补性区域”通常指反义链上与本申请定义的序列(例 如靶序列)实质上互补的区域。当互补性区域与靶序列不完全互补时，错配可以在分子的内部 或末端区域。通常，最被容许的错配在末端区域，例如，在5’末端和/或3’末端的5、4、3或 2个核苷酸内。
在本申请中，术语“正义链”(S)通常是指RNAi剂的这样一条链，所述链包括与作为在 此定义的术语反义链的区域基本互补的区域。“正义”链有时被称为“有义”链，“过客”链或“反引导”链。借助它们的序列，反义链靶向所希望的mRNA，同时正义链靶向不同靶 标。因此，如果反义链被掺入RISC中，则正确的靶标被靶向。正义链的掺入可以导致脱靶 效应。这些脱靶效应可以通过在正义链上使用修饰或使用5’端帽加以限制。
在本申请中，术语“互补”当用于描述就第二核苷酸序列(如RNAi剂反义链)而言的第一 核苷酸序列(如RNAi剂正义链或AGT mRNA)时是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核 苷酸在一定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交(形成碱基对氢键)并形 成双链体或双螺旋结构的能力。互补序列包括沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pairs)或 非沃森-克里克碱基对，并且包括天然或经修饰的核苷酸或核苷酸模拟物，只要以上关于它们 的杂交能力而言的需求得以实现。“互补”不必需在每个核苷上均具有核碱基互补性。相反， 可以容忍一些错配。
在本申请中，术语“完全互补”通常意指第一多核苷酸的连续序列中的全部(100％)碱基 将与第二多核苷酸的连续序列中的相同数目的碱基杂交。连续序列可以包含第一或第二核苷 酸序列的全部或一部分。如本申请所用，“部分互补”通常意指在杂交的核碱基序列对中， 第一多核苷酸的连续序列中至少约70％的碱基将与第二多核苷酸的连续序列中相同数目的碱 基杂交。如本申请所用，“基本上互补”通常意指在杂交的核碱基序列对中，第一多核苷酸的 连续序列中至少约90％的碱基将与第二多核苷酸的连续序列中相同数目的碱基杂交。如本申 请所用的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以就在RNAi剂的正义链与反义 链之间或者在RNAi剂的反义链与AGT mRNA的序列之间的碱基匹配而言使用。序列同一性 或互补性不依赖于修饰。为了测定同一性或互补性的目的，例如，a和Af与U(或T)互补并 且与A同一。
在本申请中，术语“同源的”或“同源性”通常是指已经与参考核酸序列的相同核苷酸 匹配的主题核酸序列的核苷酸的数量，通常通过序列分析程序(例如，Karlin和Altschul,1990, PNAS 87:2264-2268；Karlin和Altschul,1993,PNAS 90:5873-5877)，或通过目视检查确定。如 本文所使用的，术语“完全同源性”或“完全同源的”一般是指在参考序列和主题核酸序列 之间的完全(100％)同源性或“同一性”。如本文所使用的，术语“基本上同源的”或“基本 上同源性”一般是指主题序列与参考序列中相同核苷酸位置的核苷酸共有至少50％(例如，至 少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％) 的同源的核苷酸。
在本申请中，术语“配体”通常是指能够共价地或以其它化学方式与生物活性物质(如 寡核苷酸)结合的任何化合物或分子。在某些实施方式中，配体能够与另一种化合物例如受 体直接或间接地相互作用，与配体相互作用的受体可以存在于细胞表面上，或可替代地可以 是细胞内和/或细胞间受体，配体与受体的相互作用可以导致生化反应，或可以仅仅是物理相 互作用或结合。
在本申请中，术语“诱导”、“抑制”、“加强”、“升高”、“增加”、“减少”、 “降低”等通常表示两个状态之间的定量差异。例如，“有效抑制AGT的活性或表达的量” 意指处理样品中AGT的活性或表达的水平将低于未处理样品中AGT活性或表达的水平。所 述术语例如适用于表达水平和活性水平。术语“减少”和“降低”可互换使用并且通常表示 小于原来的任何变化。“减少”和“降低”是相对的术语，需要在测量前和测量后间进行比 较。“减少”和“降低”包括完全耗竭。
在某些实施方式中，术语“降低”可以通过本领域已知标准方法(诸如本申请中描述的那 些)检测的，基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第一样品中的表达水平/量与相应基因、 基因产品例如蛋白质或生物标志物在第二样品中的表达水平/量相比约5％、10％、20％、25％、 30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或100％的总体降低。在某些 实施方式中，术语“降低”指第一样品中基因或生物标志物的表达水平/量的降低，其中该降低 是第二样品中相应基因或生物标志物的表达水平/量的至少约0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、 0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍、或0.01倍。在某些实施方式中，第一样品 是自受试者获得的样品，而第二样品是参照样品。
在本申请中，术语“表达”通常意指基因最终产生蛋白质的过程。表达包括但不限于转 录、转录后修饰(例如，剪接、聚腺苷酸化、添加5’-帽)以及翻译。
在本申请中，术语“药学上可接受的”通常是指不干扰活性成分生物学活性的有效性的 一种或多种无毒物质。这类制剂通常可含有盐、赋形剂、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和任 选的其它治疗剂。这类药学上可接受的制剂通常也可包含适合给予人的相容性固体或液体填 料、稀释剂或包囊材料。用于医药时，盐应该是药学上可接受的盐，但可方便地使用非药学 上可接受的盐来制备药学上可接受的盐，不能将它们排除在本申请范围以外。这类药理学和 药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、 马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、硼酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药学上可接受的盐也可 制备成碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐或钙盐。
在本申请中，术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”通常指包含包封药理活性分子(如核酸分 子，例如，iRNA或iRNA从其转录的质粒)的脂质层的囊泡。LNP描述于例如，中国专利号CN103189057B中，其完整内容以引用方式并入本文中。
在本申请中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，还通常包括预防疾 病的发作，减缓或逆转疾病的进展，预防或减缓与疾病相关的一种或多种症状的发作，减少 和/或减轻与疾病相关的一种或多种症状，降低疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度和/ 或持续时间和/或预防疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度的进一步增加，预防、减少或 逆转由疾病引起的任何生理损伤，以及通常对正在治疗的患者有益的任何药理学作用。本申 请的RNAi剂或药物组合物形成可行的治疗剂不需要实现完全治愈或根除疾病的任何症状或 表现。如在相关领域中所认识到的，用作治疗剂的药物可降低给定疾病状态的严重程度，但 不需要消除疾病的每种表现才能被认为是有用治疗剂。类似地，预防性施用的治疗构成可行 的预防剂不需要完全有效地预防病症的发作。简单地在受试者中减少疾病的影响(例如，通过 减少其症状的数量或严重程度，或通过提高另一种治疗的有效性，或通过产生另一种有益效 果)，或减少疾病发生或恶化的可能性就足够了。
在本申请中，术语“疾病”或“病症”可以互换使用，通常是指受试者与正常状态的任 意偏离，例如身体或某些器官的状态的任何变化，妨碍或扰乱了功能的履行，和/或在患病或 与其接触的人中引起症状例如不适、机能障碍、痛苦或甚至死亡。疾病或病症还可以称为失 调(distemper)、不适(ailing)、小病(ailment)、疾病(malady)、紊乱(disorder)、疾病(sickness)、 生病(illness)、身体不适(complaint)、inderdisposion或affectation。
在本申请中，术语“血管紧张素原相关疾病”或“AGT相关疾病”通常是指因肾素-血管 紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活导致或与其相关的疾病或障碍，或其症状或进展响应于RAAS 失活的疾病或障碍。术语“血管紧张素原相关疾病”包括因AGT表达降低而受益的疾病、障 碍或病症。这类疾病通常与高的血压相关。血管紧张素原相关疾病的非限制实例包括高血压， 例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为本态性高血压或特发性高血 压)、继发性高血压(也称为非本态性高血压)、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关高血 压(例如，先兆子痫、子痫和产后先兆子痫)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血 压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾高血压)、戈德布拉特氏高血压、眼高压、青 光眼、肺动脉高血压、门静脉高血压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压； 高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病变(包括外周血管疾病)、 糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化 症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、睡眠呼吸暂停、心力衰竭(例如，左心室收缩功能 障碍)、心肌梗塞、心绞痛、中风、肾疾病(例如，慢性肾脏病或糖尿病性肾病变，任选地在 妊娠的情况中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)和全身性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在某些实 施方式中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)或胎儿生长受限。在某些实施方式中，AGT 相关障碍也包括肥胖、肝脂肪变性/脂肪肝，例如，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及非酒精性 脂肪肝病(NAFLD)、葡萄糖耐受不良、2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)和代谢综合征。在 某些实施方式中，高血压包括与低的血浆肾素活性或血浆肾素浓度相关的高血压。
本申请中，术语“施用”通常是指通过任意引入或递送途径将本申请药物制剂引入受试 者的身体中。可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与所述药物接触的任 何方法。所述施用可以包括而不限于静脉内、动脉内、鼻内、腹内、肌内、皮下透皮或口服。 每日剂量可以划分成一个、两个或更多个合适形式的剂量以在某个时间段期间的一个、两个 或更多个时间施用。
在本申请中，术语“接触”通常是指两种两个或更多个不同类型的物质以任何顺序、任 何方式以及任何时长接触在一起。接触可以发生在体内(in vivo)、间接体内(exvivo)或体外(in vitro)。在某些实施方式中，可以是指使本申请的RNAi剂或组合物直接接触细胞或组织。在 另一些实施方式中，该术语是指使本申请的RNAi剂或组合物间接接触细胞或组织。例如， 本申请的方法包括其中受试者接触本申请的RNAi剂或组合物，然后RNAi剂或组合物通过 扩散或本领域已知的任何其他主动运输或被动运输过程(化合物通过该过程在体内循环)接触 细胞或组织的方法。
在本申请中，术语“有效量”或“有效剂量”通常是指足以实现或至少部分实现所需效 果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗 剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时 间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。药物的“预 防有效量”或“预防有效剂量”通常是指当单独或与另一种治疗剂组合给有疾病发展或疾病 复发的风险的受试者施用时抑制疾病的发展或复发的药物量。可以使用本领域技术人员已知 的多种方法对治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力进行评估，比如在 处于临床试验期间的人类受试者中、在动物模型系统中预测对人类的功效、或者通过在体外 测定中测定药剂的活性。在某些实施方式中，“有效量”是指产生预期药理学、治疗性或预防 性结果的RNAi剂的量。
在本申请中，术语“受试者”通常是指需要诊断、预后、改善、预防和/或治疗疾病的人 或非人动物(包括哺乳动物)，诸如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(家禽如鸡和鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。受试者包 括动物疾病模型。
在本申请中，术语“包括”、“包含”、“具有”、“可以”、“含有”及其变体通常 旨在是开放式过渡性短语、术语或词语，其不排除额外行为或结构的可能性。术语“由…… 组成”通常表示不能存在别的组分(或同样地，特征、整数、步骤、等)。除非上下文另有明 确规定，单数形式如英文的“a”，“an”，“the”，中文的“一个”、“一种”和“所述/ 该”一般包括所指代事物的复数形式。
在本申请中，术语“约”通常意指大约(approximately)、在......的附近(intheregionof)、粗 略地(roughly)、或左右(around)。当术语“约”当用于指涉数值范围时，截值或特定数值用于指 示所载明的数值可与该列举数值有多达10％的差异。因此，术语“约”可用于涵盖自特定值 ±10％或更少的变异、±5％或更少的变异、±1％或更少的变异、±0.5％或更少的变异、或±0.1％ 或更少的变异。
应理解，数字或一系列数字之前的术语“至少”包括与该术语“至少”相邻的数字，及 逻辑上包括在内的所有后续数字或整数，如从上下文中明确的。例如，核酸分子中的核苷酸 数目必需为整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子中的至少19个核苷酸”意指19、20或21 个核苷酸具有所指示的性质。当“至少”出现在一系列数字或范围之前时，应理解“至少”可修饰该系列或范围中每一个数字。
应理解本文中采用的“不超过”或“低于”指与该短语相邻且逻辑上较低的值或整数， 如从上下文逻辑而言，至零。例如，具有“不超过3个核苷酸”的突出端的双链体具有3、2、1 或0个核苷酸的突出端。当“不超过”出现在一系列数字或范围之前时，应理解，“不超过” 可修饰该系列或范围内每个数字。本文所采用范围同时包括上限与下限。
发明详述
RNAi剂
一方面，本申请提供抑制AGT基因表达的RNAi剂。
在某些的实施方式中，RNAi剂包括用于抑制在细胞中，如受试者(例如，哺乳动物，如 易于发生AGT相关障碍例如高血压的人)的细胞中，AGT基因的表达的单链寡核苷酸或双链 核糖核酸(dsRNA)分子。其中，该dsRNA包括反义链，其具有与在AGT基因的表达中所形成mRNA的至少一部分互补的互补区。该互补区为约12-30个核苷酸长度(例如，约30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13或12个核苷酸长度)。
dsRNA包括两个RNA链，其可在dsRNA使用的条件下互补并杂交形成双链体结构(互补区)。dsRNA的一条链(反义链)包括与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区。靶序列 可源自AGT基因表达期间形成mRNA的序列。另一条链(正义链)包括与反义链互补的区域， 使得在合适条件下组合时，两条链可杂交并形成双链体结构。通常，双链体结构的长度为12 至30个碱基对。类似地，与靶序列的互补区的长度为12至30个核苷酸。
在某些实施方式中，dsRNA为约19至约23个核苷酸长度，或约24至约30个核苷酸长度。通常，dsRNA的长度足以用作Dicer酶的底物。例如，本领域公知，长度大于约21-23 个核苷酸的dsRNA可用作Dicer的底物。本领域技术人员也了解，被靶向切割的RNA的区 域通常为较大RNA分子(通常mRNA分子)的部分。靶的“一部分”为mRNA靶的连续核苷 酸，其长度足以允许其为RNAi指导切割(即经由RISC途径的切割)的底物。
本领域技术人员也应理解，双链体区为dsRNA的主要功能部分，例如，约19至约30碱 基对的双链体区，例如，约19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、 19-21、19-20碱基对。因此在一个实施方式中，为了达到成为靶向所需RNA进行切割的功能 性双链体(例如，15-30碱基对)的程度，具有超过30碱基对的双链体区的RNA分子或RNA 分子的复合物为dsRNA。
在一个方面中，本申请的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其包含反义链，其中所述反 义链包含至少12个与选自以下序列相应位置的核苷酸基本上互补的连续核苷酸或与其相差 不超过3个核苷酸的序列：AGT mRNA NM_001382817.3中起始位置为1854-1874、1907-1927、 1895-1915、1352-1372、1903-1923、2019-2039、1853-1873和1818-1838的至少连续12个核 苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列或NM_001384479.1中起始位置为1822-1842、 1875-1895、1863-1883、1320-1340、1871-1891、1987-2007、1821-1841和1786-1806的至少 连续12个核苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
在某些实施方式中，其中所述反义链和正义链形成的双链体结构(互补区)，所述互补区 包括至少12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸。
在某些实施方式中，所述RNAi剂的正义链与表1中的靶序列具有基本上同源性。
表1 靶序列
Figure BDA0003313098240000181
Figure BDA0003313098240000191
其中，g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，t＝胸腺苷酸，c＝胞苷酸。
表2 反义链序列
SEQ ID NO. 单链代码 反义链序列5'→3'
19 AS1 uuuuguuucacaaacaagcun
20 AS2 uuuauuacuaacacaagggan
21 AS3 uauacuuuaauuuuaaaaccn
22 AS4 uacuuuaauuuuaaaacccan
23 AS5 uuguucaaaaaucacaagcan
24 AS6 uuaauuuuaaaacccaauuun
25 AS7 auacuuuaauuuuaaaacccn
26 AS8 uaaaacccaauuuuuguucun
27 AS9 uuuugcagcgacuagcaccan
28 AS10 ucaagcucaaaaaaaaugcun
29 AS11 uuuaauuuuaaaacccaauun
30 AS12 uucaaaaaucacaagcaucun
31 AS13 uaagcuguuggguagacucun
32 AS14 uucacaaacaagcuggucggn
33 AS15 uuguccuggaugucacuccan
34 AS16 uauuacagacacuacacggan
35 AS17 uuuguuucacaaacaagcugn
36 AS18 uuuuggaacaguagucccgcn
其中n为a或u或g或c，g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，u＝尿苷酸，c＝胞苷酸。
在一些筛选实施方案中，所述的RNAi剂的正义链和反义链选自表3中序列或与表3中 的各序列相差一个、两个或三个核苷酸。
表3 筛选RNAi剂序列
Figure BDA0003313098240000201
其中，g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，u＝尿苷酸，c＝胞苷酸。
应理解，虽然表3中的序列未说明为修饰或偶联的序列，但本申请的iRNA(例如，dsRNA) 的RNA可包含表3所示的任何一个序列、或经修饰的表4、5或6的序列、或偶联的表13、 14、16或17的序列。换言之，本申请涵盖如本文所述的未修饰的、未偶联的、修饰的或偶联的dsRNA。
在一些实施方案中，所述的RNAi剂可以通过脂质体-核酸纳米颗粒的方式加药到细胞系 中进行序列筛选。专利US9233971B2，US9080186B2，CN102985548B和CN103189057B有 关脂质化合物及脂质体-核酸纳米颗粒制备的方法全文引入本说明书。
在一些实施方案中，其中所述的脂质化合物中的两性脂质优选大环脂类化合物D1C1， T1C1，T1C6，T4C4，B2C1，B2C6，B2C7和M10C1。
本领域技术人员公知，具有约20至23碱基对，例如，21碱基对的双链体结构的dsRNA 已经被认为能特别有效地诱导RNA干扰(Elbashir等人，EMBO 2001，20：6877-6888)。然而， 其他人已发现更短或更长的RNA双链体结构也有效(Chu和Rana(2007)RNA14：1714-1719； Kim等人(2005)Nat Biotech 23：222-226)。可以合理地预期，由表1、2和3中一个序列在一 端或两端减去或增加几个核苷酸的双链体与所述dsRNA相比可以类似地有效。因此，具有源 自表1、2和3中一个序列的至少18、19、20、21或更多个连续核苷酸的序列且在抑制AGT 基因表达的能力方面与包含全序列的dsRNA的差异不超过约5、10、15、20、25或30％的 抑制的dsRNA均包括在本申请范围内。
此外，表1、2和3提供的RNA识别了在AGT转录物中易发生RISC介导的切割的位点。因此，本申请的进一步包含靶向这类位点之一内的iRNA。如果iRNA促进转录物在该特定位点内任何位置的切割，则如本文所用iRNA被称为靶向RNA转录物的该特定位点内，这种iRNA通常包括来自表1、2和3中提供的一个序列的至少约12、13、14、15、16、17、18 或19个连续核苷酸。
本申请所述dsRNA可进一步包括一个或多个单链核苷酸突出端，例如，1、2、3或4个核苷酸。具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA可以具有比其平端的对应物优异的抑制性质。核苷酸突出端可包含核苷酸/核苷类似物或其组成，包括脱氧核苷酸/核苷。该突出端可在正义 链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可存在于dsRNA的反义或正义链的5’- 端、3’-端或两端。该突出端可由一条链长于另一条链所造成，或由相同长度的两条链交错造 成。该突出端可与靶mRNA形成错配或其可与所靶向的基因序列互补或可为另一个序列。
dsRNA也可以只含有单一突出端，其可以增强RNAi剂的干扰活性，而不影响其整体稳 定性。例如，单链突出端可以位于正义链的3’-端，或可选地，在反义链的3’-端。RNAi剂还 可以具有平端，位于反义链的5’-端(或正义链的3’-端)，反之亦然。通常，RNAi剂的反义链 在3’-端具有核苷酸突出端，而5’-端是平端。尽管不希望受到理论的束缚，反义链的5’-端的 不对称平端和反义链的3’-端突出端有利于引导链载入RISC过程中。
在某些实施方式中，突出端存在于正义链、反义链或两条链的3’-端。在某些实施方式中， 此3’-突出端存在于反义链中。在某些实施方式中，此3’-突出端存在于正义链中。
在某些实施方式中，所述dsRNA是21个核苷酸长的双端平端体。
在某些实施方式中，所述dsRNA具有21个核苷酸长度，且正义链和反义链在3’端均具 有2个核苷酸的突出端。
修饰的RNAi剂
为了增强本申请所述的RNAi剂在体内的稳定性，在不影响其活性甚至增强其活性的情 况下，可以对上述RNAi剂的正义链和反义链进行修饰，其中的核苷酸可以有修饰基团，可 以整条链或者部分修饰。在某些实施方式中，其中所述正义链和/或反义链上的一个或多个核 苷酸被修饰以形成修饰的核苷酸。
在某些实施方式中，本申请的RNAi剂(例如，dsRNA)的RNA未修饰，且不包含例如，本领域已知及本文所述的化学修饰或偶联。在其他实施方式中，本申请的RNAi剂(例如，dsRNA)的RNA经化学修饰以加强稳定性或其他有利特性。本申请的其他实施方式中，本申请的RNAi剂的所有核苷酸或基本上所有核苷酸被修饰，即RNAi剂的链存在不超过5、4、3、 2或1个未修饰的核苷酸。
如本申请所述的核酸可采用本领域上公知的方法合成和/或修饰，如那些描述于“Current protocols in nucleic acid chemistry”，Beaucage，S.L.等人(编辑)，JohnWiley & Sons，Inc.，New York，NY，USA中的，其以引用方式并入本文中。修饰包括例如，末端修饰，例如，5’-端 修饰(磷酸化、偶联、反向连接)或3’-端修饰(偶联、DNA核苷酸、反向连接等)；碱基修饰， 例如，使用稳定化碱基、失稳碱基或用与扩异展的伴体库碱基配对的碱基替代、移除碱基(无 碱基核苷酸)或偶联碱基；糖修饰(例如，2’-位或4’-位)或糖的替代；或主链修饰，包括磷酸二 酯连接的修饰或替换。在本申请提供的RNAi剂中，所述RNAi剂的正义链和反义链均不需 要均匀修饰，可在其单个核苷酸中掺入一种或一种以上的修饰。
在某些实施方式中，其中所述修饰的核苷酸选自：脱氧核糖核苷酸、核苷酸模拟物、脱 碱基核苷酸、2’-修饰核苷酸、3’至3’连接(倒置)核苷酸、含非天然碱基的核苷酸、桥接核苷 酸、肽核酸(PNA)、解锁的核碱基类似物、锁定核苷酸、3’-O-甲氧基(2’核苷间连接)核苷酸、 2’-F-阿拉伯糖核苷酸、5’-Me/2’-氟带核苷酸、吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸、 含乙烯基膦酸酯的核苷酸和含环丙基膦酸酯的核苷酸。
在某些实施方式中，其中所述2’-修饰核苷酸包括：2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷 酸、2’-脱氧核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基核苷酸和/或2’-烷基核苷酸。
在某些实施方式中，其中所述反义链5’末端开始的第7、12、14位核苷酸糖基2’位至少 一个是氟。例如，其中所述反义链5’末端开始的第7、12、14位核苷酸糖基2’位均是氟。
在某些实施方式中，其中所述反义链除了5’末端开始的第7、12、14位核苷酸之外，其 余的核苷酸糖基的2’位至少一个是甲氧基。
在某些实施方式中，其中所述正义链5’末端开始的第5、7、8、9位核苷酸糖基2’位至 少一个是氟。例如，所述正义链5’末端开始的第5、7、8、9位核苷酸糖基2’位均是氟。
在某些实施方式中，其中所述正义链除了5’末端开始的第5、7、8、9位核苷酸之外，其 余的核苷酸糖基的2’位的至少一个是甲氧基。
例如，所述正义链或反义链的部分或全部核苷酸糖基2’位的-OH可以被取代，其中，所 述取代基团为氟或甲氧基，优选从正义链5’末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2’位是氟 和从反义链的5’末端开始的第7、12、14位核苷酸2’位是氟，其余的核苷酸2’位均是甲氧基。
例如，所述反义链5’末端开始的第7、12、14位核苷酸糖基2’位均是氟，其余的核苷酸 糖基的2’位均是甲氧基。
例如，所述正义链5’末端开始的第5、7、8、9位核苷酸糖基2’位均是氟，其余的核苷酸糖基的2’位均是甲氧基。
在某些实施方式中，其中所述正义链和/或反义链的核苷酸之间存在至少连续两个硫代磷 酸酯键。
在某些实施方式中，其中所述正义链末端和/或反义链末端的3个连续的核苷酸之间存在 至少连续两个硫代磷酸酯键。
例如，其中所述正义链和反义链的5’端和3’端的3个连续的核苷酸之间存在至少连续两 个硫代磷酸酯键。
又例如，从正义链5’末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2’位是氟和从反义链的5’末 端开始的第7、12、14位核苷酸2’位是氟，其余的核苷酸2’位均是甲氧基，且所述正义链和 反义链的5’端和3’端的3个连续的核苷酸之间存在至少连续两个硫代磷酸酯键。
在一些筛选实施方案中，所述的RNAi剂的正义链和反义链选自表4中序列或与表4中 的各序列相差一个、两个或三个核苷酸。
表4 筛选RNA抑制剂序列
Figure BDA0003313098240000231
Figure BDA0003313098240000241
其中，G＝2’-甲氧基鸟苷酸，A＝2’-甲氧基腺苷酸，U＝2’-甲氧基尿苷酸，C＝2’-甲氧基胞 苷酸；u＝尿苷酸，c＝胞苷酸。
在一些实施例方案中，在所述RNAi剂中的反义链选自下列表5中的序列。从反义链5’ 末端开始的第7、12、14位的核苷酸2’位是氟，其余的核苷酸2’位是甲氧基，且所述反义链 的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以硫代。
表5 反义链的修饰序列
Figure BDA0003313098240000242
Figure BDA0003313098240000251
Figure BDA0003313098240000261
其中，G＝2’-O-甲基鸟苷酸，A＝2’-O-甲基腺苷酸，U＝2’-O-甲基尿苷酸，C＝2’-O-甲基胞 苷酸；fG＝2’-氟鸟苷酸，fA＝2’-氟腺苷酸，fU＝2’-氟尿苷酸，fC＝2’-氟胞苷酸；Gs＝2'-O-甲基 -3’-硫代鸟苷酸、As＝2'-O-甲基-3'-硫代腺甘酸、Us＝2'-O-甲基-3'-硫代尿甘酸、Cs＝2'-O-甲基-3'- 硫代胞苷酸。
在一些实施例方案中，在所述RNAi剂中的正义链选自下列表6中的序列。从正义链5’ 末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2’位是氟，其余的核苷酸2’位是甲氧基，且所述反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以硫代。
表6 正义链修饰序列
Figure BDA0003313098240000262
Figure BDA0003313098240000271
Figure BDA0003313098240000281
在某些实施方案中，本申请所述的RNAi剂的正义链与表6中的各序列相差一个、两个 或三个核苷酸。
在某些实施方案中，所述RNAi剂中正义链与反义链的组合选自表7。
表7 RNAi剂
Figure BDA0003313098240000282
Figure BDA0003313098240000291
Figure BDA0003313098240000301
与载体偶联的RNAi剂
本申请RNAi剂的另方面涉及将干扰核酸与载体偶联的方式，以增强RNAi剂的稳定性、 活性、细胞分布或细胞摄取。
在某些实施方式中，通过在载体中引入靶组织受体的配体，以改变RNAi剂的分布、靶 向或稳定性。例如，与不存在配体的物种相比，专属性的配体可以提供针对所选靶(例如分子、 细胞或细胞类型、区室(例如细胞或器官区室、身体组织、器官或区域))的增强的亲和力。
配体可以包括天然存在的物质，如蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL) 或球蛋白)；碳水化合物(例如葡聚糖、茁霉多糖、壳多糖、壳聚糖、菊糖、环糊精、N-乙酰 葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合 物，例如合成的聚氨基酸。
配体也可以包括靶向基团，例如与指定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂， 例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、 凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白质A、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生 素B12、维生素A、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。在某些实施方式中，该配体为多 价半乳糖，例如，N-乙酰基-半乳糖胺。
本申请RNAi剂所包含的正义链和反义链可以通过固相合成的公知技术方便且常规地制 备。可另外地或替代地使用本领域中已知的用于这类合成的任何其他方法，如液相合成或发 酵。使用相似的技术来制备其他寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化衍生物)也是已知的。
在某些实施方式中，除了可商购以及寡核苷酸合成中常规使用的标准核苷亚磷酰胺单体 以及非标准核苷亚磷酰胺单体之外，本申请的寡核苷酸或连接的核苷酸可以通过自动合成仪 使用衍生自载体-核苷亚磷酰胺单体的亚磷酰胺法合成。
在某些实施方式中，本发明所述配体缀合的方式通过载体结构偶联于反义链的5’末端和/ 或3’末端，和/或正义链的5’末端和/或3’末端。
例如，所述载体结构可以偶联于正义链的5’末端和/或3’末端；或所述载体结构可以偶联 于反义链的5’末端且所述载体结构偶联于正义链的3’末端；或所述载体结构可以偶联于反义 链的3’末端，且所述配体偶联于正义链的5’末端；或所述载体结构偶联于正义链的5’末端和 3’末端。
在某些实施方式中，其中所述载体结构包括5’MVIP和3’MVIP，其中，所述5’MVIP偶联在所述正义链和/或反义链5’末端，所述3’MVIP偶联在所述反义链和/或正义链3’末端，所 述5’MVIP的结构如式I所示，所述3’MVIP结构如式II所示，
(X-L)n-B-D-R1-，
I
(X-L)m-B-D-R2-，
II
其中，
X为靶向特异性配体；
L为支链；
B为接头；
D为连接链；
R1和R2为转接点；
所述5’MVIP通过转接点R1与正义链5’端或反义链5’端连接，所述3’MVIP通过转接点 R2与正义链3’端或反义链3’端连接，n和m各自独立地为0-4的任意整数。
在某些实施方式中，其中所述X为组织的特异性靶向配体
在某些实施方式中，其中所述的X肝靶向特异性配体。
在某些实施方式中，其中所述R1或R2与所述正义链或反义链的连接通过磷酸酯或经修 饰的磷酸酯，优选地通过磷酸酯或硫代磷酸酯相连接。
在某些实施方式中，其中所述且n+m＝2-6的整数，优选n+m＝2、3或4，更优选为4。
在某些实施方式中，m或n可以为0，即不存在3’MVIP或5’MVIP。
在某些实施方案中，当n＝0(即不存在5’MVIP)时，所述3’MVIP的结构可以为：
Figure BDA0003313098240000321
在某些实施方案中，当n＝1时，所述3’MVIP的结构可以为：
Figure BDA0003313098240000322
在某些实施方案中，当n＝2时，所述3’MVIP的结构可以为：
Figure BDA0003313098240000331
在某些实施方案中，当n＝3时，所述3’MVIP的结构可以为：
Figure BDA0003313098240000332
在某些实施方案中，当n＝4时，所述3’MVIP的结构可以为：
Figure BDA0003313098240000341
在某些实施方案中，所述的n是指同时放在所述RNAi剂的正义链和反义链5’末端5'MVIP 中n之和，所述的m是指同时放在所述RNAi剂的正义链和反义链3’末端3'MVIP中m之和。
在某些实施方案中，所述R1和R2结构中带有-NH-、-S-和/或-O-，R1和R2通过结构中-NH-、 -S-或-O-分别与连接链D以及正义链和/或反义链5’末端和3’末端相连，R1和R2相同或不相 同。
在某些实施方案中，所述R1和R2是任选直链，或带有酰胺基、羧基或烷基类支链的直 链或者环状结构，所述环状结构包括饱和或不饱和的脂肪族碳环基，或者含有硫、氧或氮原 子的五元或六元杂环基或芳香烃基。
在某些实施方案中，所述R1和/或R2为-E1(CH2)xCH2E2-，其中x为3-12的任意整数，基 团E1和E2可以分别为-NH-、-S-或-O-。
在某些实施方案中，所述R1和/或R2为-E1(CH2)x1CH(OH)(CH2)x2E2-，其中x1或x2各自 独立地为3-10的任意整数，E1和E2可以分别为-NH-、-S-或-O-。
在某些实施方案中，所述R1为含有N、S或O的杂环或碳环结构：
Figure BDA0003313098240000351
在某些实施方式中，所述转接点R1为-NH(CH2)xCH2O-，其中x为3-12的任意整数，优选为4-6的任意整数，可以通过以下两种亚磷酰胺单体引入：
i.其中的一个-O-或-S-用于R1亚磷酰胺单体的合成，通过固相合成的方法接入RNAi剂 正义链或反义链的5’端。结构中-NH-、-S-或-O-用于与5'MVIP中的连接链D连接，从而在 RNAi剂正义链或反义链的5’端引入肝靶向特异性配体X。引入到RNAi剂正义链或反义链5’ 端的单体示例性结构如下：
Figure BDA0003313098240000352
在某些实施方案中，优选以下结构：
Figure BDA0003313098240000353
ii.R1结构中-NH-、-S-或-O-先与连接链D连接，另外一个-NH-、-S-或-O-用于5'MVIP 亚磷酰胺单体的合成中与亚磷酰胺成酯，正义链或反义链5’MVIP亚磷酰胺单体结构示例如 下：
Figure BDA0003313098240000354
在某些实施方案中，正义链或反义链5’MVIP亚磷酰胺单体优选以下结构：
Figure BDA0003313098240000361
当通式中n为1-4时，上述的单体中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的单体化合物，借助上述的单体化合物，肝靶向特异性配体X通过固相合成被引入到正义链或反义链5’末端。
在某些实施方案中，转接点R1为-NH(CH2)xCH2O-，其中x可以是3-12的整数，优选为4-6的整数。
在某些实施方案中，5'MVIP亚磷酰胺单体结构选自如下结构中：
Figure BDA0003313098240000362
Figure BDA0003313098240000371
Figure BDA0003313098240000381
在某些实施方式中，所述R2为含有N、S或O的杂环或碳环结构：
Figure BDA0003313098240000382
在某些实施方式，所述R2为-NH(CH2)x1CH(OH)(CH2)x2CH2O-，其中x1为1-4的任意整数，x2为0-4的任意整数。
本申请所述的R2是通过丁二酸酐与R2结构中-NH-、-S-或-O-成酯或酰胺的同时，又与空 白Solid Support中-NH-进行偶联，形成3'MVIP solid spport，再通过亚磷酰胺固相合成法，将 3’MVIP引入到正义链或反义链的3’末端。
在某些实施方案中，R2结构中的杂环为吡咯环或哌啶环，其通过环中的氮杂原子与 3'MVIP的连接链D连接，3'MVIP solid spport示例性结构如下：
Figure BDA0003313098240000383
当通式中m为1-4时，上述的单体中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的Solid Support。
在某些实施方案中，R2为-B4(CH2)x1CH(OH)(CH2)x2CH2B5-，其中x1为1-4的整数，x2为0-4的整数，B4和B5分别为-NH-、-S-或-O-。
Figure BDA0003313098240000391
当通式中m为1-4时，上述的单体中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的Solid Support。
在某些实施方案中，R2为-NHCH2CH(OH)CH2O-。引入3’MVIP solid spport示例性结构 如下：
Figure BDA0003313098240000392
当通式中m为1-4时，上述的单体中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的Solid Support。
在某些实施方案中，3’MVIP solid support结构如下：
Figure BDA0003313098240000393
Figure BDA0003313098240000401
Figure BDA0003313098240000411
在某些实施方式中，所述肝靶向特异性配体X选自用于增强肝细胞对RNAi剂的摄取的 结构，可以是脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、多胺及肽模拟结构。在本申请提供的RNAi剂中，引入所述RNAi剂正义链或反义链末端的肝靶向特异性配体X可以相同，也 可以不同，例如在特性上，有些可以是增强肝靶向性，有些可以是所述RNAi剂在体内药代 动力学的调节结构，有些可以是具有体内溶解活性的结构。在某些实施方案中，所述肝靶向特异性配体X选自以下结构中的一种或多种单糖及其衍生物。
在某些实施方式中，所述单糖选自以下结构中的一种或多种：甘露糖、半乳糖、D-阿拉 伯糖、葡萄糖、果糖、木糖、葡糖胺、核糖。所述单糖衍生物选自甘露糖衍生物、半乳糖衍 生物、葡萄糖衍生物、核糖衍生物以及其他衍生物。
在某些实施方式中，所述靶向单元X选自半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺及其衍生 物，其结构通式如下：
Figure BDA0003313098240000421
其中，W1为氢或羟基保护基，可以相同也可以不同；W为-OH、-NHCOOH或 -NHCO(CH2)qCH3，其中q为0-4的整数；W2为-NH-、O、S或C。
在某些实施方式中，所述靶向单元X为N-乙酰半乳糖胺及其衍生物。
在某些实施方式中，所述靶向单元X选自以下结构：
Figure BDA0003313098240000422
其中，W选自-OH、-NHCOOH或-NHCO(CH2)qCH3中的一种或两种，其中q为0-4的整 数。
在某些实施方案中，所述肝靶向特异性配体X在同一个5'MVIP或3'MVIP结构中可以相 同，也可以不同。
在某些实施方案中，5'MVIP与3'MVIP彼此之间的X可以相同，也可以不同。
在某些实施方式中，所述L是含有-NH-、-C(＝O)-、-O-、-S-、酰胺基、磷酰基、硫代磷 酰基、C4-C10脂肪族碳环基、苯基或者这些基团的组合的C4-C18直链。
在某些实施方式中，所述L还带有羟乙基或羧酸类的侧链。
在某些实施方式中，所述L为含酰胺基或六元脂肪族碳环基的C7-C18直链。
在某些实施方式中，所述L选自如下结构中的一种或多种：
Figure BDA0003313098240000431
其中，r1是1-12的任意整数，r2为0-20的任意整数，Z为H、烷基或酰胺基。
在某些实施方式中，所述B的结构与能引入的X的数量有关，所述B中含-NH-、C、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基，当n或m为1时，其为一条直链，当n或m为2、3或4 时，其分叉的次数分别为2、3或4。
在某些实施方式中，所述B选自以下结构：
Figure BDA0003313098240000441
其中，A1和A2各自独立地是C、O、S、-NH-、羰基、酰胺基、磷酰基或硫代磷酰基，r 为0-4的整数。
在某些实施方式中，所述B选自以下结构：
Figure BDA0003313098240000451
Figure BDA0003313098240000461
其中，r为0-4的任意整数。
在某些实施方式中，所述B选自以下结构：
Figure BDA0003313098240000471
Figure BDA0003313098240000481
Figure BDA0003313098240000491
在某些实施方式中，所述B选自以下结构：
Figure BDA0003313098240000492
在某些实施方式中，所述D是含有-NH-、C＝O、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基、芳香烃基、C4-C10脂肪族碳环基、含1-3个氮的五元或六元杂环基或者这些基团的组合的C3-C18直链。
在某些实施方式中，所述D还带有羟甲基、甲基叔丁基、甲基苯酚基、C5-C6脂肪环基的侧链。
在某些实施方式中，，所述D为含两个C＝O、六元脂肪族碳环基或苯基的C3-C10直链。
在某些实施方式中，所述D为含两个C＝O的C3-C10直链。
在某些实施方式中，所述D选自以下结构：
Figure BDA0003313098240000501
Figure BDA0003313098240000511
其中，每个p各自独立地为1-20的任意整数；s为2-13的整数；Z1和Z2为相同或者不同的取代基团。
在某些实施方式中，所述D选自以下结构：
Figure BDA0003313098240000512
Figure BDA0003313098240000521
Figure BDA0003313098240000531
在某些实施方式中，所述D选自以下结构：
Figure BDA0003313098240000532
在某些实施方式中，所述5’MVIP结构中的(X-L)n-B-D-和3’MVIP结构中的(X-L)m-B-D- 选自以下结构中的一种或多种：
Figure BDA0003313098240000541
Figure BDA0003313098240000551
Figure BDA0003313098240000561
Figure BDA0003313098240000571
Figure BDA0003313098240000581
Figure BDA0003313098240000591
Figure BDA0003313098240000601
Figure BDA0003313098240000611
Figure BDA0003313098240000621
Figure BDA0003313098240000631
Figure BDA0003313098240000641
Figure BDA0003313098240000651
在某些实施方式中，所述X、L、D、及B在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP 与3’MVIP之间相同或不同。
在某些实施方案中，所述5’MVIP结构中的(X-L)n-B-D-选自表8中所示的结构：
表8 5’MVIP的(X-L)n-B-D-结构
Figure BDA0003313098240000652
Figure BDA0003313098240000661
Figure BDA0003313098240000671
Figure BDA0003313098240000681
在某些实施方案中，5’MVIP也可以不存在，这时候m可以为2-4的整数。
在某些实施方案中，所述3’MVIP结构中的(X-L)m-B-D-选自表9中所示的结构：
表9 3’MVIP的(X-L)m-B-D-结构
Figure BDA0003313098240000691
Figure BDA0003313098240000701
Figure BDA0003313098240000711
Figure BDA0003313098240000721
在某些实施方案中，5’MVIP配体结构中的(X-L)n-B-D-与R1的组合如表10所示。
表10 5’MVIP中(X-L)n-B-D-与R1的组合
Figure BDA0003313098240000722
Figure BDA0003313098240000731
在某些实施方案中，3’MVIP可以不存在，这时候n可以是2-4。
在某些实施方案中，3’MVIP配体结构中的(X-L)m-B-D-与R2组合如表11所示。
表11 3’MVIP的(X-L)m-B-D-与R2组合
Figure BDA0003313098240000732
Figure BDA0003313098240000741
Figure BDA0003313098240000751
在某些实施方式中，所述5’MVIP选自表10中5’MVIP01至5’MVIP22中的任一个。
在某些实施方式中，所述5’MVIP选自：
Figure BDA0003313098240000752
在某些实施方式中，所述3’MVIP选自表11中3’MVIP01至3’MVIP27的任一个。
在某些实施方式中，所述3’MVIP选自：
Figure BDA0003313098240000753
Figure BDA0003313098240000761
在某些实施方案中，选择表12中不同5'MVIP和3'MVIP组合接入RNAi剂的正义链和或反义链的不同位置，包括末端及序列的中间位置，考察对AGT mRNA表达水平的影响。
表12 5'MVIP与3'MVIP的组合
Figure BDA0003313098240000762
Figure BDA0003313098240000771
例如，可以将表5中的反义链序列的3’末端与载体结构3'MVIP09偶联。示例性的，所 述RNAi剂中的反义链可以选自下列表13中的序列。
表13 与3’MVIP偶联的反义链
Figure BDA0003313098240000772
Figure BDA0003313098240000781
Figure BDA0003313098240000791
在某些实施方案中，本申请所述的RNAi剂的反义链与表13中的各序列相差一个、两个 或三个核苷酸。
例如，可以将表6中的正义链序列的5’末端与载体结构5'MVIP09偶联。示例性的，所 述RNAi剂中的正义链可以选自下列表14中的序列。
表14 与5’MVIP偶联的正义链
Figure BDA0003313098240000792
Figure BDA0003313098240000801
Figure BDA0003313098240000811
在某些实施方案中，本申请所述的RNAi剂的正义链与表14中的各序列相差一个、两个 或三个核苷酸。
AGT主要表达在肝脏，其表达仅限于人类和非灵长类动物。在一些体内实施方案中，猴 是临床前研究首选模型。在一些体内试验实施方案中，所述的RNAi剂选自表15中的序列。
表15 含5’MVIP09/3’MVIP09组合的RNAi剂
Figure BDA0003313098240000812
Figure BDA0003313098240000821
在某些实施方案中，本申请所述的RNAi剂的正义链和反义链与表15中的各序列相差一 个、两个或三个核苷酸。
在某些实施方案中，所述RNAi剂的反义链UsCsAAGCfUCAAAfAAfAAAUGCsUsG(SEQID NO:118)的5'末端和/或3'端与不同结构的5'MVIP和/或3'MVIP连接，所述反义链选自下表16：
表16 5'MVIP和/或3'MVIP偶联的反义链
Figure BDA0003313098240000822
Figure BDA0003313098240000831
Figure BDA0003313098240000841
在某些实施方案中，本申请所述的RNAi剂的反义链与表16中的各序列相差一个、两个 或三个核苷酸。
在某些实施方案中，所述RNAi剂的正义链GsCsAUfUUfUfUfUUUGAGCUUGAsAsG (SEQID NO:194)的5'末端和/或3'端与不同结构的5'MVIP和/或3'MVIP连接，所述正义 链选自下表17。
表17 5'MVIP和/或3'MVIP偶联的正义链
Figure BDA0003313098240000842
Figure BDA0003313098240000851
在某些实施方案中，本申请所述的RNAi剂的正义链与表17中的各序列相差一个、两个 或三个核苷酸。
在某些实施方案中，本申请所述的RNAi剂是由表17的正义链或与这些正义链相差一个、 两个或三个核苷酸的序列和表16中的反义链或与这些反义链一个、两个或三个核苷酸的序列 随机配对形成的。
在某些实施方案中，本申请所述的RNAi剂是由表16中反义链和表17中正义链配对退 火合成，见表18。这些RNAi剂中的n+m分别为2，3，4，5和6。5’MVIP和/或3’MVIP偶 联的位置包括反义链的5’末端和/或3’末端、正义链的5’末端和/或3’末端、反义链的5’末端 和正义链的3’末端、正义链的5’末端和3’末端。其中n+m＝2,3,4,5和6。
表18 含有5’MVIP和3’MVIP组合的RNAi剂
Figure BDA0003313098240000861
Figure BDA0003313098240000871
在某些实施方案中，本申请所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐优选以钠盐和三乙胺 盐或其它可药用盐的形式制备或合成。
在某些实施方案中，所述RNAi剂或其药学上可接受的盐更优选为其钠盐或三乙胺盐。
药物组合物
本申请也包括包含本申请的RNAi剂或其药学上可接受的盐的药物组合物。
在一个实施方式中，本文提供包含本文所述的RNAi剂和药学上可接受的药用辅料的药 物组合物。包含RNAi剂的药物组合物可用于预防和/或治疗AGT相关障碍，例如，高血压。 这类药物组合物依据递送模式配制。一个实例方案为配制用于以肠胃外递送全身性施用的组 合物，例如，皮下(SC)、肌内(IM)或静脉内(IV)递送。本申请的药物组合物可以足以抑制AGT 基因表达的剂量施用。
药学上可接受的“辅料”或“赋形剂”是用于递送一种或多种核酸至动物的药学上可接 受的溶剂、悬浮剂或任何其他药学上惰性的媒介物。赋形剂可为液体或固体，并考虑计划的 施用方式进行选择，以在与核酸及给定药物组合物中的其他组分组合时提供所需的体积、稠 度等。RNAi剂可以靶向特定组织(例如，肝细胞)的方式递送。
在某些实施方式中，所述的药物组合物，其还包含递送媒介物(如纳米颗粒、树状聚合物、 聚合物、脂质体或阳离子递送系统)，
在某些实施方式中，其中所述递送媒介物包括脂质体。
在某些实施方式中，其中所述递送媒介物包括纳米脂质，其能够与核酸分子形成脂质体- 核酸纳米颗粒。
在某些实施方式中，所述递送媒介物包括两性脂质化合物M10C1。
本申请的药物组合物包括(但不限于)溶液、乳液和包含脂质体的制剂。这些组合物可由 多种组分产生，包括(但不限于)预形成液体、自乳化固体和自乳化半固体。制剂包括靶向肝 脏的那些。可以单位剂型方便地存在的本申请药物制剂可依据制药业公知的常规技术制备。 这类技术包括将活性成分与药用辅料或赋形剂结合的步骤。
用途
另一方面，本申请提供一种减少细胞或组织中AGT mRNA或蛋白质表达的方法，其包 括使细胞或组织与有效量的前述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，和 /或前述的药物组合物接触。
适合使用本申请方法处理的细胞可为任何表达AGT基因的细胞，例如，肝脏细胞、脑细 胞、胆囊细胞、心脏细胞或肾脏细胞，但优选为肝脏细胞。适合用于本申请方法的细胞可为 哺乳动物细胞，当与表达AGT基因的细胞接触时，RNAi剂抑制AGT基因(例如，人类、灵长类、非灵长类或大鼠AGT基因)的表达至少约50％，例如可通过PCR或基于分支 DNA(bDNA)的方法，或由基于蛋白质的方法，如免疫荧光分析法，蛋白质印迹法或流式细胞 分析技术测定的。
在某些实施方式中，其中所述组织是肝脏组织。
在某些实施方式中，其中所述细胞和组织是离体的。
在某些实施方式中，其中所述细胞和组织在受试者体内。
本文所用术语“抑制”可与“减少”、“降低”、“沉默”、“下调”、“压制”及其他 类似术语交换使用，且包括任何抑制水平。AGT基因的表达可依据与AGT基因表达相关的 任何变量的水平或水平变化来评价，例如，AGT mRNA水平或AGT蛋白水平。这一水平可 在单个细胞中或细胞群中(包括例如，源自受试者的样品)中分析。可通过与AGT表达相关的 一种或多种变量与对照水平比较的绝对或相对水平的下降来评价抑制。对照水平可为本领域 上采用的任何类型的对照水平，例如，给药前基线水平或从未处理或接受对照(如例如，仅缓 冲剂对照或无活性剂对照)处理的类似受试者、细胞或样本测得的水平。
AGT基因表达的抑制可通过其中AGT基因被转录且已处理(例如，通过一个或多个细胞 与本申请的RNAi剂接触，或通过施用本申请的RNAi剂于其中存在该细胞的受试者)使得抑 制AGT基因表达的第一细胞或细胞群(这类细胞可例如存在于源自受试者的样品中)表达的 mRNA量与基本上与该第一细胞或细胞群相同但未如此处理的第二细胞或细胞群(未用RNAi 剂处理或未用靶向目的基因的RNAi剂处理的对照细胞)相比的降低来表现。在优选的实施方 式中，抑制通过实施例2提供的方法使用siRNA合适的浓度在高表达AGT的细胞系中评价， 并将被干预细胞中的mRNA水平表示为非干预对照细胞中mRNA水平的百分比。
在其他实施方式中，AGT基因表达的抑制可通过功能上与AGT基因表达相关的参数的 降低来评价，例如，受试者血液或血清中的AGT蛋白水平。AGT基因沉默可在任何表达AGT的细胞(内源性或来自表达构建体的外源性)中且通过本领域已知的任何分析法测定。
AGT蛋白质表达的抑制可由细胞或细胞群或受试者样品表达的AGT蛋白水平(例如，源 自受试者的血液样品中的蛋白质水平)的降低来表现。如上所述，对于mRNA抑制的评价， 处理细胞或细胞群的蛋白质表达水平的抑制可类似地表示为对照细胞或细胞群的蛋白质水平 的百分比，或受试者样品(例如，血液或其衍生的血清)中的蛋白质水平的变化。
可用于评价AGT基因抑制的对照组细胞、细胞群或受试者样品包括未与本申请RNAi 剂接触的细胞、细胞群或受试者样品。例如，对照细胞、细胞群或受试者样品可源自于用RNAi 剂治疗前的单个受试者(例如，人类或动物受试者)或适当匹配的群体对照。
细胞或细胞群表达的AGT mRNA水平可采用本领域已知用于评价mRNA表达的任何方 法测定。例如，qRT-PCR，评价基因表达的降低。可通过本领域中已知的任何方法，例如，ELISA，评价蛋白质产生的降低。在某些实施方式中，穿刺肝脏活检样品用作监测AGT基因或蛋白质表达降低的组织材料。其他实施方式中，血液样品用作监测AGT蛋白质表达降低的受试者样品。
另一方面，本申请提供前述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，或 前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病或病症或者降低疾 病或病症的风险。
在某些实施方式中，其中所述疾病或病症包括与AGT相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述疾病或病症选自：高血压病、高血压、临界性高血压、原 发性高血压、继发性高血压、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关高血压、糖尿病性高 血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血 压、低血浆肾素活性或血浆肾素浓度相关的高血压、眼高血压、青光眼、肺动脉高血压、门 静脉高血压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血 压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、中风、肾疾病、肾衰竭、系统性硬化症、宫内发育迟缓(IUGR)、胎儿生长受限、肥胖、肝脂肪变性/脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)；葡萄糖耐受不良、2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)和代谢综合征。
另一方面，本申请提供一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要 的受试者施用有效量的前述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，和/或 前述的药物组合物。
本申请的体内方法可包括对受试者施用包含RNAi剂的组合物，其中该RNAi剂包括与 接受施用RNAi剂的哺乳动物的AGT基因的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。组合物可采用本领域已知的任何方式施用，包括(但不限于)：经口、腹膜内或肠胃外途径，包括颅内(例如，脑室内、脑实质内和鞘内)、静脉内、肌内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、经鼻、直肠和局部(包括颊内及舌下)施用。在某些实施方式中，组合物通过静脉内输注或注射施用。在某些实施方式中，组合物通过皮下注射施用。在某些实施方式中，该组合物通过肌内注射施用。
本申请的RNAi剂还可作为“游离RNAi剂”施用。游离RNAi剂是在没有药物组合物的存 在下施用。裸RNAi剂可在合适缓冲液中。缓冲液可包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。在一个实施方式中，缓冲液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以调整包含RNAi剂的缓冲液的pH和渗透压，以便适合施用于受试者。
或者，本申请的RNAi剂可作为药物组合物施用，如脂质体制剂。
本申请的药物组合物可以足以抑制AGT基因表达的剂量施用。通常，本申请的RNAi剂的合适剂量在每天每千克接受者体重约0.001至约200.0mg的范围内，通常在每天每千克体重约1至50mg的范围内。通常，本申请的RNAi剂的合适剂量在约0.1mg/kg至约5.0mg/kg的范围内，例如约0.3mg/kg至约3.0mg/kg的范围内。
在一个实施方式中，该方法包括施用本文所述的组合物，使得降低靶AGT基因表达，如 每剂约1、2、3、4、5、6、1-6、1-3或3-6个月。在某些实施方式中，该组合物每3-6个月施用一次。
在某些实施方式中，在初始治疗方案后，以较少的频率施用治疗。重复剂量方案可包括 规律地施用治疗量的RNAi剂，如每月一次至一年一次。在某些实施方式中，RNAi剂约每月 一次至约每三个月一次施用，或约每三个月一次至约每六个月一次施用。
在初始治疗方案后，可以较低的频率施用治疗。可依据疾病严重性确定治疗持续时间。
在其他实施方式中，单一剂量的药物组合物可以为长效的，使得剂量以不超过1、2、3 或4个月的间隔施用。在本申请的一些实施方式中，本申请的药物组合物的单一剂量约每月 施用一次。在本申请的其他实施方式中，本申请药物组合物的单一剂量按季(即约每3个月) 施用。在本申请的其他实施方式中，本申请药物组合物的单一剂量每年施用2次(即约每6个 月一次)。
本领域技术人员应理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和施用时间，包括 (但不限于)：受试者中存在的突变、之前的治疗、受试者的一般健康或年龄和存在的其他疾 病。此外，按照需要以预防和/或治疗有效量的组合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列治 疗。
在某些实施方式中，其进一步包括测定来自所述受试者的样品中的AGT水平。
例如，其进一步包括测定来自所述受试者血液样品、血清样品或尿液样品中的AGT蛋白 质水平。
在某些实施方式中，其进一步包括对所述受试者施用用于治疗高血压的另外的治疗剂。
例如，其中该另外的治疗剂可以选自：利尿剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管 紧张素II受体拮抗剂、β-阻滞剂、血管扩张剂、钙通道阻滞剂、醛固酮拮抗剂、α2-激动剂、 肾素抑制剂、α-阻滞剂、外周作用肾上腺素能剂、选择性D1受体部分激动剂、非选择性α- 肾上腺素能拮抗剂、合成的甾体抗盐皮质激素剂、血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂(ARNi)、 沙库比曲/缬沙坦；或内皮素受体拮抗剂(ERA)、西他生坦、安贝生坦、阿曲生坦、BQ-123、 齐泊腾坦、波生坦、马昔腾坦和替唑生坦；上述任何治疗剂的组合；及配制成药剂组合的高 血压治疗剂。
在某些实施方式中，其中该另外的治疗剂包括血管紧张素II受体拮抗剂。
例如，其中该血管紧张素II受体拮抗剂可以选自：氯沙坦、缬沙坦、奥美沙坦、依普沙 坦和阿齐沙坦。
另一方面，本申请提供一种细胞其包含前述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上 可接受的盐。
另一方面，本申请提供一种药盒，其包含前述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学 上可接受的盐，或前所述的药物组合物。
具体地，本申请还公开了以下实施方式：
1.一种RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述RNAi剂的结构中含有载体 结构和干扰核酸，其结构如式IIIa、IIIb或IIIc所示：
Figure BDA0003313098240000921
Figure BDA0003313098240000931
其中，
所述干扰核酸靶向AGT基因，其包括反义链和正义链；
所述载体结构包括5’MVIP(5’MultiValent Import Platform)和3’MVIP(3’MultiValent Import Platform)；
所述5’MVIP由转接点R1、连接链D、接头B、支链L和肝靶向特异性配体X组成，所 述3’MVIP由转接点R2、连接链D、接头B、支链L和肝靶向特异性配体X组成，所述5’MVIP 通过转接点R1与正义链5’端或反义链5’端连接，所述3’MVIP通过转接点R2与正义链3’端 或反义链3’端连接，n和m各自独立地为0-4的任意整数。
2.根据实施方式1所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述干扰核酸包括siRNA或miRNA。
3.根据实施方式1-2中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述且n+m＝2-6的整数，优选n+m＝2、3或4，更优选为4。
4.根据实施方式1-3中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述R1为含有N、 S或O的杂环或碳环结构：
Figure BDA0003313098240000932
或者，所述R1为-NH(CH2)xCH2O-，其中x为3-12的任意整数，优选为4-6的任意整数。
5.根据实施方式1-4中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述R2为含有N、 S或O的杂环或碳环结构：
Figure BDA0003313098240000941
或者，所述R2为-NH(CH2)x1CH(OH)(CH2)x2CH2O-，其中x1为1-4的任意整数，x2为0-4的任意整数。
6.根据实施方式1-5中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述X选自用于 增强肝细胞对RNAi剂的摄取的结构。
7.根据实施方式1-6中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述X选自单糖 及其衍生物。
8.根据实施方式1-7中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述X为N-乙酰半乳糖胺及其衍生物。
9.根据实施方式1-8中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述X选自以下 结构：
Figure BDA0003313098240000942
其中，W选自-OH、-NHCOOH或-NHCO(CH2)qCH3中的一种或两种，其中q为0-4的整 数。
10.根据实施方式1-9中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述L选自如下 结构中的一种或多种：
Figure BDA0003313098240000951
其中，r1是1-12的任意整数，r2为0-20的任意整数，Z为H、烷基或酰胺基。
11.根据实施方式1-10中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述B选自以 下结构：
Figure BDA0003313098240000952
其中，A1和A2各自独立地是C、O、S、-NH-、羰基、酰胺基、磷酰基或硫代磷酰基，r 为0-4的整数。
12.根据实施方式1-11中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述D选自以 下结构：
Figure BDA0003313098240000961
Figure BDA0003313098240000971
其中，每个p各自独立地为1-20的任意整数；s为2-13的整数；Z1和Z2为相同或者不同的取代基团。
13.根据实施方式1-12中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述5’MVIP结 构中的(X-L)n-B-D-和3’MVIP结构中的(X-L)m-B-D-选自以下结构中的一种或多种：
Figure BDA0003313098240000981
Figure BDA0003313098240000991
Figure BDA0003313098240001001
Figure BDA0003313098240001011
Figure BDA0003313098240001021
Figure BDA0003313098240001031
Figure BDA0003313098240001041
Figure BDA0003313098240001051
Figure BDA0003313098240001061
Figure BDA0003313098240001071
Figure BDA0003313098240001081
Figure BDA0003313098240001091
Figure BDA0003313098240001101
14.根据实施方式1-13中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述X、L、D及B在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同。
15.根据实施方式1-14中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述5’MVIP选 自表10中5’MVIP01至5’MVIP22中的任一个。
16.根据实施方式1-15中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述3’MVIP选 自表11中3’MVIP01至3’MVIP27的任一个。
17.根据实施方式1-16中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中正义链 5’MVIP和反义链3’MVIP的组合为5’MVIP01/3’MVIP01、5’MVIP01/3’MVIP17或 5’MVIP09/3’MVIP09；或者正义链5’MVIP和正义链3’MVIP的组合为5’MVIP01/3’MVIP09 或5’MVIP09/3’MVIP01。
18.根据实施方式1-17中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述反义 链和正义链形成的互补区，所述互补区包括至少12个连续核苷酸，其中所述正义链包含AGT mRNA NM_001382817.3中起始位置为1854-1874、1907-1927、1895-1915、1352-1372、1903-1923、2019-2039、1853-1873和1818-1838的至少连续12个核苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列或NM_001384479.1中起始位置为1822-1842、1875-1895、1863-1883、1320-1340、1871-1891、1987-2007、1821-1841和1786-1806的至少连续12个核苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
19.根据实施方式1-18中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述正义 链和反义链之间至少有约80％的碱基互补。
20.根据实施方式1-19中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述正义 链和反义链各自独立地为15-30个核苷酸，优选17-25个核苷酸，更优选19-23个核苷酸。
21.根据实施方式1-20中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述正义 链与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列具有基本上同源性。
22.根据实施方式1-21中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述反义 链包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸 的序列。
23.根据实施方式1-22中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述正义 链包含SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸 的序列。
24.根据实施方式1-23中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述反义 链包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸 的序列。
25.根据实施方式1-24中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述正义 链和/或反义链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成修饰的核苷酸。
26.根据实施方式25所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的核苷酸选 自：脱氧核糖核苷酸、核苷酸模拟物、脱碱基核苷酸、2’-修饰核苷酸、3’至3’连接(倒置)核 苷酸、含非天然碱基的核苷酸、桥接核苷酸、肽核酸(PNA)、解锁的核碱基类似物、锁定核 苷酸、3’-O-甲氧基(2’核苷间连接)核苷酸、2’-氟-阿拉伯糖核苷酸、5’-甲基/2’-氟带核苷酸、 吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸、含乙烯基膦酸酯的核苷酸和含环丙基膦酸酯 的核苷酸。
27.根据实施方式1-26中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述正义 链和反义链的部分或全部核苷酸糖基2’位是氟或甲氧基。
28.根据实施方式1-27中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述正义 链末端和/或反义链末端的3个连续的核苷酸之间存在至少连续两个硫代磷酸酯键。
29.根据实施方式1-28中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述反义 链5’末端开始的第7、12、14位核苷酸糖基2’位是氟，反义链其余的核苷酸糖基的2’位是甲 氧基，且所述反义链末端的3个连续的核苷酸之间存在至少连续两个硫代磷酸酯键；所述正 义链5’末端开始的第5、7、8、9位核苷酸糖基2’位是氟，正义链其余的核苷酸糖基的2’位 是甲氧基；且所述正义链末端的3个连续的核苷酸之间存在至少连续两个硫代磷酸酯键。
30.根据实施方式1-29中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述反义 链包含SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、 SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126中任意一个或与其相差不超过3个核苷 酸的序列。
31.根据实施方式1-30中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述正义 链包含SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、 SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:201和SEQ ID NO:202中任意一个或与其相差不超过3个核苷 酸的序列。
32.根据实施方式1-31中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述干扰 核酸包括Kylo-09-DS01至Kylo-09-DS112中任意一个。
33.一种抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其包含反义链，其中所 述反义链包含至少12个与选自以下序列相应位置的核苷酸基本上互补的连续核苷酸或与其 相差不超过3个核苷酸的序列：AGT mRNA NM_001382817.3中起始位置为1854-1874、1907-1927、1895-1915、1352-1372、1903-1923、2019-2039、1853-1873和1818-1838的至少连续12个核苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列或NM_001384479.1中起始位置为1822-1842、1875-1895、1863-1883、1320-1340、1871-1891、1987-2007、1821-1841和1786-1806 的至少连续12个核苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
34.根据实施方式33所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中 所述反义链长度为15-30个核苷酸，优选17-25个核苷酸，更优选19-23个核苷酸。
35.根据实施方式33-34中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述反义链包含以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO: 26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36中 任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
36.根据实施方式33-35中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述RNAi剂包括单链或双链核酸分子。
37.根据实施方式33-36中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述RNAi剂包括siRNA或miRNA。
38.根据实施方式33-37中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其还包含正义链，其中所述反义链和正义链形成的互补区，所述互补区包括至少12 个连续核苷酸。
39.根据实施方式33-38中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述互补区包含12-25个连续核苷酸碱基对。
40.根据实施方式33-39中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述正义链和反义链之间至少有约80％的碱基互补。
41.根据实施方式33-40中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述正义链包含AGT mRNA NM_001382817.3中起始位置为1854-1874、1907-1927、1895-1915、1352-1372、1903-1923、2019-2039、1853-1873和1818-1838的至少连续12个核苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列或NM_001384479.1中起始位置为1822-1842、1875-1895、1863-1883、1320-1340、1871-1891、1987-2007、1821-1841和1786-1806 的至少连续12个核苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
42.根据实施方式33-41中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述正义链长度为15-30个核苷酸，优选17-25个核苷酸，更优选19-23个核苷 酸。
43.根据实施方式33-43中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述正义链与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18中任意一个或与其相差不 超过3个核苷酸的序列具有基本上同源性。
44.根据实施方式33-43中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述正义链与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18中任意一个或与其相差不 超过3个核苷酸的序列具有基本上同源性，且所述反义链包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
45.根据实施方式33-44中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述反义链包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72中任意一个或与其相 差不超过3个核苷酸的序列。
46.根据实施方式33-45中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述正义链包含SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任意一个或与其相 差不超过3个核苷酸的序列。
47.根据实施方式33-46中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述反义链包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72中任意一个或与其相 差不超过3个核苷酸的序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中 任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
48.根据实施方式33-47中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述正义链和/或反义链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成修饰的核苷酸。
49.根据实施方式48所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中 所述修饰的核苷酸选自：脱氧核糖核苷酸、核苷酸模拟物、脱碱基核苷酸、2’-修饰核苷酸、 3’至3’连接(倒置)核苷酸、含非天然碱基的核苷酸、桥接核苷酸、肽核酸(PNA)、解锁的核碱 基类似物、锁定核苷酸、3’-O-甲氧基(2’核苷间连接)核苷酸、2’-氟-阿拉伯糖核苷酸、5’-甲基 /2’-氟带核苷酸、吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸、含乙烯基膦酸酯的核苷酸和 含环丙基膦酸酯的核苷酸。
50.根据实施方式49所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中 所述2’-修饰核苷酸包括：2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-甲氧基 乙基核苷酸、2’-氨基核苷酸和/或2’-烷基核苷酸。
51.根据实施方式33-50中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述正义链和反义链的部分或全部核苷酸糖基2’位取代基团为氟或甲氧基。
52.根据实施方式33-51中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述正义链末端和/或反义链末端的3个连续的核苷酸之间存在至少连续两个硫 代磷酸酯键。
53.根据实施方式33-52中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述反义链5’末端开始的第7、12、14位核苷酸糖基2’位是氟，反义链其余的 核苷酸糖基的2’位是甲氧基，且所述反义链末端的3个连续的核苷酸之间存在至少连续两个 硫代磷酸酯键；所述正义链5’末端开始的第5、7、8、9位核苷酸糖基2’位是氟，正义链其 余的核苷酸糖基的2’位是甲氧基；且所述正义链末端的3个连续的核苷酸之间存在至少连续 两个硫代磷酸酯键。
54.根据实施方式33-53中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述反义链包含SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO: 118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
55.根据实施方式33-54中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述正义链包含SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ IDNO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:201和SEQ ID NO:202中任意一 个或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
56.根据实施方式33-55中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述干扰核酸包括Kylo-09-DS01，Kylo-09-DS07，Kylo-09-DS08，Kylo-09-DS10， Kylo-09-DS11，Kylo-09-DS12，Kylo-09-DS17，Kylo-09-DS18，Kylo-09-DS37～Kylo-09-DS54 中任意任一种或多种。
57.根据实施方式33-56中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，还包含配体，所述配体通过载体结构偶联于正义链和/或反义链。
58.根据实施方式33-57中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述配体包含靶向配体。
59.根据实施方式33-58中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述靶向配体通过载体结构偶联于反义链的5’末端和/或3’末端。
60.根据实施方式33-59中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述载体结构合于正义链的5’末端和/或3’末端。
61.根据实施方式57-60中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述载体结构包括5’MVIP和3’MVIP，其中，所述5’MVIP偶联在所述正义链和/或反义链5’末端，所述3’MVIP偶联在所述反义链和/或正义链3’末端，所述5’MVIP的结构如式I所示，所述3’MVIP结构如式II所示，
(X-L)n-B-D-R1-，
I
(X-L)m-B-D-R2-，
II
其中，
X为靶向特异性配体；
L为支链；
B为接头；
D为连接链；
R1和R2为转接点；
所述5’MVIP通过转接点R1与正义链5’端或反义链5’端连接，所述3’MVIP通过转接点 R2与正义链3’端或反义链3’端连接，n和m各自独立地为0-4的任意整数。
62.根据实施方式61所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中 所述且n+m＝2-6的整数，优选n+m＝2、3或4，更优选为4。
63.根据实施方式61-62中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，其中所述R1或R2与所述正义链或反义链通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯，优选地通 过磷酸酯或硫代磷酸酯相连接。
64.根据实施方式61-63中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述R1为含有N、S或O的杂环或碳环结构：
Figure BDA0003313098240001161
或者，所述R1为-NH(CH2)xCH2O-，其中x为3-12的任意整数，优选为4-6的任意整数。
65.根据实施方式61-64中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述R2为含有N、S或O的杂环或碳环结构：
Figure BDA0003313098240001171
或者，所述R2为-NH(CH2)x1CH(OH)(CH2)x2CH2O-，其中x1为1-4的任意整数，x2为0-4的任意整数。
66.根据实施方式61-65中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述X为靶向配体选自用于增强肝细胞对RNAi剂的摄取的结构。
67.根据实施方式61-66中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述X选自单糖及其衍生物。
68.根据实施方式61-67中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述X选自半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺及其衍生物。
69.根据实施方式61-68中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述X为N-乙酰半乳糖胺及其衍生物。
70.根据实施方式61-69中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述X选自以下结构：
Figure BDA0003313098240001172
其中，W选自-OH、-NHCOOH或-NHCO(CH2)qCH3中的一种或两种，其中q为0-4的整 数。
71.根据实施方式61-70中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述L选自如下结构中的一种或多种：
Figure BDA0003313098240001181
其中，r1是1-12的任意整数，r2为0-20的任意整数，Z为H、烷基或酰胺基。
72.根据实施方式61-71中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述B选自以下结构：
Figure BDA0003313098240001182
Figure BDA0003313098240001191
其中，A1和A2各自独立地是C、O、S、-NH-、羰基、酰胺基、磷酰基或硫代磷酰基，r 为0-4的整数。
73.根据实施方式61-72中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述D选自以下结构：
Figure BDA0003313098240001192
Figure BDA0003313098240001201
Figure BDA0003313098240001211
其中，每个p各自独立地为1-20的任意整数；s为2-13的整数；Z1和Z2为相同或者不同的取代基团。
74.根据实施方式61-73中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述5’MVIP结构中的(X-L)n-B-D-和3’MVIP结构中的(X-L)m-B-D-选自以下结构中 的一种或多种：
Figure BDA0003313098240001212
Figure BDA0003313098240001221
Figure BDA0003313098240001231
Figure BDA0003313098240001241
Figure BDA0003313098240001251
Figure BDA0003313098240001261
Figure BDA0003313098240001271
Figure BDA0003313098240001281
Figure BDA0003313098240001291
Figure BDA0003313098240001301
Figure BDA0003313098240001311
Figure BDA0003313098240001321
Figure BDA0003313098240001331
75.根据实施方式61-74中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述X、L、D、及B在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间 相同或不同。
76.根据实施方式61-75中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述5’MVIP选自表10中5’MVIP01至5’MVIP22中的任一个。
77.根据实施方式61-76中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述3’MVIP选自表11中3’MVIP01至3’MVIP27的任一个。
78.根据实施方式61-77中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述正义链5’MVIP和反义链3’MVIP的组合为5’MVIP01/3’MVIP01、 5’MVIP01/3’MVIP17或5’MVIP09/3’MVIP09；或者所述正义链5’MVIP和正义链3’MVIP的 组合为5’MVIP01/3’MVIP09或5’MVIP09/3’MVIP01。
79.根据实施方式33-78中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述反义链包括AS131、AS137、AS138、AS140、AS141、AS142、AS147和AS148 的任一种或多种。
80.根据实施方式33-79中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述正义链包括S131、S137、S138、S140、S141、S142、S147和S148中的任一种 或多种。
81.根据实施方式33-80中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述RNAi剂或其药学上可接受的盐为表15中Kylo-09-DS113、Kylo-09-DS119、Kylo-09-DS120、Kylo-09-DS122、Kylo-09-DS123、Kylo-09-DS124、Kylo-09-DS129和 Kylo-09-DS130中的任一种或多种。
82.根据实施方式33-81中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述反义链选自AS140、AS207～AS266中的任一种或多种。
83.根据实施方式33-82中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述正义链选自S140、S207～S264中的任一种或多种。
84.根据实施方式33-83中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，所述反义链选自AS140、AS207SEQ ID NO:413～AS266中的任一种或多种，且所述 正义链选自S140、S207～S264中的任一种或多种。
85.根据实施方式33-84中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接 受的盐，包括表18中Kylo-09-DS122，Kylo-09-DS131，Kylo-09-DS141，Kylo-09-DS142和Kylo-09-DS147中的任一种或多种。
86.细胞，其包含实施方式1-32中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，或者 实施方式33-85中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐。
87.药物组合物，其包含实施方式1-32中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐， 或者实施方式33-85中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐， 以及任选地药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。
88.根据权要求87所述的药物组合物，其还包含递送媒介物。
89.根据权要求88所述的药物组合物，其中所述递送媒介物包括脂质体。
90.根据权要求89所述的药物组合物，其中所述递送媒介物包括纳米脂质。
91.一种减少细胞或组织中AGT mRNA或蛋白质表达的方法，其包括使细胞或组织与有 效量的实施方式1-32中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐、实施方式33-85中任 一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，和/或实施方式87-90中任 一项所述的药物组合物接触。
92.根据实施方式91所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
93.根据实施方式91所述的方法，其中所述组织是肝脏组织。
94.根据实施方式91所述的方法，其中所述细胞和组织是离体的。
95.根据实施方式91所述的方法，其中所述细胞和组织在受试者体内。
96.实施方式1-32中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐、实施方式33-85中任 一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，或实施方式87-90中任一 项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病或病症或者降低 疾病或病症的风险。
97.根据实施方式96所述的用途，其中所述疾病或病症包括与AGT相关的疾病或病症。
98.根据实施方式96所述的用途，其中所述疾病或病症选自：高血压病、高血压、临界 性高血压、原发性高血压、继发性高血压、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关高血压、 糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布 拉特氏高血压、低血浆肾素活性或血浆肾素浓度相关的高血压、眼高血压、青光眼、肺动脉 高血压、门静脉高血压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心 脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、 心室纤维化、心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、中风、肾疾病、肾衰竭、系统性硬化症、宫内 发育迟缓(IUGR)、胎儿生长受限、肥胖、肝脂肪变性/脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)；葡萄糖耐受不良、2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)和代谢综 合征。
99.一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效 量的实施方式1-32中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐、实施方式33-85中任一 项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，和/或实施方式87-90中任一 项所述的药物组合物。
100.根据实施方式99所述的方法，其中所述施用包括经皮下方式、静脉内方式、口服、经直肠或腹膜内施加途径向受试者施用。
101.根据实施方式99所述的方法，其中所述的RNAi剂、抑制AGT基因表达的RNAi剂或药物组合物以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用于所述受试者。
102.根据实施方式99所述的方法，其进一步包括测定来自所述受试者的样品中的AGT水平。
103.根据实施方式99所述的方法，其中所述受试者样品中的AGT水平为血液样品、血清样品或尿液样品中的AGT蛋白质水平。
104.根据实施方式99所述的方法，其进一步包括对所述受试者施用用于治疗高血压 的另外的治疗剂。
105.根据实施方式104所述的方法，其中该另外的治疗剂选自：利尿剂、血管紧张素 转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、β-阻滞剂、血管扩张剂、钙通道阻滞剂、醛固酮拮抗剂、α2-激动剂、肾素抑制剂、α-阻滞剂、外周作用肾上腺素能剂、选择性D1受 体部分激动剂、非选择性α-肾上腺素能拮抗剂、合成的甾体抗盐皮质激素剂、血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂(ARNi)、沙库比曲/缬沙坦；或内皮素受体拮抗剂(ERA)、西他生坦、安贝生坦、阿曲生坦、BQ-123、齐泊腾坦、波生坦、马昔腾坦和替唑生坦；上述任何治疗剂的组合；及配制成药剂组合的高血压治疗剂。
106.根据实施方式104所述的方法，其中该另外的治疗剂包括血管紧张素II受体拮抗 剂。
107.根据实施方式106所述的方法，其中该血管紧张素II受体拮抗剂选自：氯沙坦、 缬沙坦、奥美沙坦、依普沙坦和阿齐沙坦。
108.药盒，其包含实施方式1-32中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐、实 施方式33-85中任一项所述的抑制AGT基因表达的RNAi剂或其药学上可接受的盐，或实施 方式87-90中任一项所述的药物组合物。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的RNAi剂、制备方法和 用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
说明：
DMSO的中文名称为二甲基亚砜；
DMF的中文名称为N,N-二甲基甲酰胺；
HOBt的中文名称为1-羟基苯并三氮唑；
HBTU的中文名称为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯；
DIPEA(DIEA)的中文名称为N,N-二异丙基乙胺；
DCM的中文名称为二氯甲烷；
DMAP的中文名称为4-二甲氨基吡啶；
DMT-CL的中文名称为4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷；
MEOH的中文名称为甲醇；
TBTU的中文名称为O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸；
Figure BDA0003313098240001361
的名称为固相载体，如大孔氨甲基树脂(Resin)。
实施例1 合成siRNA的固相亚磷酰胺法
根据标准的固相亚磷酰胺法合成表1中的正义链和表2中的反义链，正义链与对应的反 义链互补退火得到siRNA。
固相亚磷酰胺法基本步骤包括：
1)脱保护：脱掉起始单体Solid Support羟基保护基(DMTr)；
2)偶联：加上第一个亚磷酰胺单体，通过3’至5’方向发生偶联反应；
3)氧化：将所得的核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯(即三价磷氧化成五价磷)；
4)封闭：将前步骤失败核苷酸序列5’-OH加冒封死，使其不再进一步参与反应；重复上 述步骤，直至最后一个亚磷酰胺单体的接入；然后用甲胺水溶液和氨水裂解SolidSupport与 起始单体之间酯键，并将所得核苷酸序列上的各个碱基与磷酸上的保护基脱掉；经HPLC分 离纯化后，过滤除菌，冻干得到相应的正义链或反义链。
退火工艺描述：
将正义链和反义链冻干粉分别复溶、等摩尔混合，加入注射用水适量，投入适量的TRIS 缓冲溶液。轻晃约1～2min，使溶液混合均匀。将水浴锅升温至92℃～95℃。将上述反应液 置水浴锅中加热3min～5min,轻晃使溶液受热均匀。自然冷却至室温。得到无色或微黄色透 明液体，取样送检，测浓度。本申请所述的RNAi剂是通过固相亚磷酰胺法得到各自的正义 链和反义链，正义链与对应的反义链互补退火得到终产品。
实施例2 RNAi剂体外抑制AGT基因表达试验
取按实施例1所述的方法制备得到的RNAi剂(表3中的Kylo-09-DS01～Kylo-09-DS18)。 将RNAi剂水溶液和DOTMA的有机溶液混合形成不溶于水的沉淀，沉淀分离干燥后溶于氯 仿，进一步和其他脂质氯仿溶液混合，其他脂质包括M10C1和PEG600-胆固醇。混合物真空 离心蒸发干燥过夜，得到纳米脂质包裹的RNAi剂，其中DOTMA、M10C1和PEG600-胆固醇与RNAi剂的重量配比为1～1.6，1.5～2.5和2.5～3.5。
含10％胎牛血清的DMEM配制相应浓度的纳米脂质包裹的RNAi剂(表3中RNAi剂：Kylo-09-DS01～Kylo-09-DS18)样品溶液。以105细胞密度接种Hep3B细胞，10％胎牛血清DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养24h后，加不同浓度(10nM、1nM、0.1nM)的样品干 预，孵育72h后，收集细胞样品，往收集完毕的细胞样品中加入1ml Ezol裂解液，漩涡震荡 混匀。加入0.2ml三氯甲烷，剧烈摇动10s，室温放置1分钟。4℃，12,000xg离心15min。 将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中，并加入等体积的100％乙醇。吸取全部样品， 加入带有2ml收集管的mini-spin离心柱。8,000xg，室温离心15s，弃尽流穿液。将剩余的 样品转移至离心柱，重复上一步骤。往离心柱中加入700μl WB，轻盖盖子，8,000×g，室 温离心15秒，弃尽流穿液，重复上一步骤，用500μl WB洗涤离心柱两次。通过QRT-PCR 测定AGT mRNA水平。与未干预的Hep3B细胞上清对比，标定样品干预组的AGT mRNA 相对百分率。所得试验结果见下表19和图1A。
表19 RNAi干预后Hep3B细胞中AGT mRNA的水平
Figure BDA0003313098240001381
所得试验结果显示，由表1正义链和表2反义链退火形成表3中RNAi剂，在不同浓度下对Hep3B细胞中AGTmRNA表达水平都呈现出不同程度的抑制效果，其中Kylo-09-DS01，Kylo-09-DS07，Kylo-09-DS08，Kylo-09-DS10，Kylo-09-DS11，Kylo-09-DS12，Kylo-09-DS17和Kylo-09-DS18对Hep3B细胞中AGTmRNA表达水平的抑制呈现明显的剂量依耐性，其分 别对应的正义链序列为SEQ ID NO.37，43，44，46，47，48，53和54及对应的反义链序列 SEQ IDNO.55，61，62，64，65，66，71和72。
将筛选出来的Kylo-09-DS01，Kylo-09-DS07，Kylo-09-DS08，Kylo-09-DS10，Kylo-09-DS11， Kylo-09-DS12，Kylo-09-DS17和Kylo-09-DS18参照Hep 3B细胞实验操作，考察RNAi剂不 同浓度(10nM、0.1nM)对HepG 2细胞的干预效果，通过QRT-PCR测定AGT mRNA水平。 与未干预的HepG 2细胞上清对比，标定样品干预组的AGT mRNA相对百分率。所得试验结 果见下表20和图1B。
表20 RNAi干预后HepG 2细胞中AGT mRNA水平
Figure BDA0003313098240001391
实施例3 修饰的siRNA在血浆中稳定性研究
本实施例所涉及的RNAi剂选自表7，母链为实施例2优选出来的序列(正义链序列为 SEQ ID NO.37，43，44，46，47，48，53和54及对应的反义链序列SEQ ID NO.55，61，62，64，65，66，71和72)。从反义链5’末端开始的第7、12、14位的核苷酸2’位是氟和从其余 的核苷酸为2’位是甲氧基，且所述反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以 硫代，从正义链5’末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2’位是氟和从其余的核苷酸为2’位 是甲氧基，且所述反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以硫代。
本实施例目的是验证上述的修饰方式可以增强RNAi剂在人血清中的稳定性，试验结果 见表21和图2。
其中，图2显示的是RNAi Kylo-09-DS46与其母链Kylo-09-DS10不同时段的稳定性检测 的HPLC图。
表21 RNAi剂在人血清中不同时长，全长双链相对0h的峰面积比％。
Figure BDA0003313098240001401
上述试验结果显示，与各自未修饰的母链反义链5’末端开始的第7、12、14位的核苷酸 2’位是氟和从其余的核苷酸为2’位是甲氧基，且所述反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之 间的磷酸酯键可以硫代，从正义链5’末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2’位是氟和从其 余的核苷酸为2’位是甲氧基，且所述反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可 以硫代的修饰方式可以有效增强RNAi剂在人血清中稳定性，增强的效果存在序列的特异性， 不同的序列稳定性的增强效果不同。
实施例4 5’MVIP和3’MVIP化合物的合成
当本申请的RNAi剂的正义链或反义链的3'端偶联有载体结构3'MVIP时，3'MVIP的solid support作为固相合成的起始单体。当本申请的RNAi剂的正义链或反义链的5端偶联有载体 结构5'MVIP时，5’MVIP亚磷酰胺单体作为固相合成的最后一个单体。
当本申请的RNAi剂的正义链或反义链的3'端偶联有3'MVIP时，3'MVIP的solidsupport 作为固相合成的起始单体，3’MVIP的solid spport通式如下：
Figure BDA0003313098240001411
m为1-4时，通式中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的3’MVIP的SolidSupport。
例如，当m为1时，所得的Solid Support作为RNAi剂Kylo-09-DS142(结构式见图9D) 的正义链和Kylo-09-DS133反义链固相合成的起始单体；当m为2时，所得的SolidSupport 作为RNAi剂Kylo-09-DS141(结构式见9C)的正义链和Kylo-09-DS122的反义链的固相合成起 始单体；
当m为3时，所得的Solid Support作为RNAi剂Kylo-09-DS147的反义链固相合成起始 单体。
当本申请的RNAi剂的正义链或反义链的5'端有5’MVIP时，5’MVIP亚磷酰胺单体是作 为正义链或反义链固相合成的最后一个亚磷酰胺单体。5’MVIP亚磷酰胺单体通式如下：
Figure BDA0003313098240001412
n为1-4时，通式中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的5’MVIP亚磷酰胺单体。
例如，当n为1时，所得的5’MVIP亚磷酰胺单体作为RNAi剂Kylo-09-DS141、 Kylo-09-DS131(结构式加9B)以及Kylo-09-DS147(结构式见9E)的正义链固相合成的最后一 个单体；当n等于2时，所得的5’MVIP亚磷酰胺单体作为Kylo-09-DS122(结构式见9A)和 Kylo-09-DS142的正义链固相合成的最后一个单体。
当n等于3时，所得的带3个配体X的5’MVIP亚磷酰胺单体可作为正义链或反义链固相合成的最后一个单体。
本申请所述的这些RNAi剂的正义链和反义链在进行亚磷酰胺固相合成之前，需要先化 学合成相应的3’MVIP Solid Support和5’MVIP亚磷酰胺单体。
本实施示例性叙述了如下RNAi剂的3’MVIP Solid Support和5’MVIP亚磷酰胺单体化学 合成过程，叙述如下：
4.1 3’MVIP的Solid Support的合成
4.1.1 3'MVIP09的Solid Support的合成
Figure BDA0003313098240001421
合成过程描述：
4.1.1.1 ERC-01-c1的合成
Figure BDA0003313098240001422
称取2-氨基-1,3-丙二醇(5.0g，54.9mmol)加入DMSO 50mL，氢氧化钠溶液(1g/mL)5mL， 降温到0℃，滴加丙烯酸叔丁酯(20mL，137.8mol)2小时加完，室温反应48h，加石油醚(100mL)， 饱和食盐水洗2次，有机层干燥。过层析柱(洗脱液：乙酸乙酯:石油醚＝25％-75％)，上柱 加0.05％的三乙胺，得无色油状物6.2g。
4.1.1.2 ERC-01-c2的合成
Figure BDA0003313098240001423
称取ERC-01-c1(6.2g，17.9mmol)，加二氯甲烷50mL，碳酸钠溶液(25％)23mL，室温滴加氯甲酸苄酯(8.2mL，57.4mmol)，2小时滴加完，室温反应过夜，饱和食盐水洗涤3 次，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，过层析柱(乙酸乙酯:石油醚＝5％-30％)得油状物4.0g。
4.1.1.3 ERC-01-c3的合成
Figure BDA0003313098240001431
取ERC-01-c2(4.0g，8.3mmol)加甲酸12mL，室温反应过夜，减压蒸干溶剂，得产品2.8g。
4.1.1.4 ERCd-01-c1的合成
Figure BDA0003313098240001432
将化合物ERC-01-c3(1.11g，3.0mmol)和dlSANC-c4(3.6g，8.04mmol)加到DMF(60mL) 中，然后加入HOBt(2.24g)和HBTU(3.36g)，然后缓慢加入DIEA(4.16mL)。反应液室温下搅 拌反应3小时。然后加入水，水层用二氯甲烷萃取(2x10mL)。合并有机层，然后依次用饱和 碳酸氢钠(80mL)、水(2x60mL)、饱和食盐水(60mL)洗。用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，用 硅胶柱层析纯化(洗脱液：3-15％MeOH in DCM)。得淡黄色固3.24g。
4.1.1.5 ERCd-01-c2的合成
Figure BDA0003313098240001441
ERCd-01-c1(3.24g，2.6mmol)用甲醇(60mL)溶解，加入10％钯碳(0.3g)，乙酸(2.0mL)。 然后常压下加氢，反应过夜。反应液用硅藻土过滤，滤液减压蒸干，得油状物ERCd-01-c2 2.9g， 其高分辨质谱图见图3。
4.1.1.6 3’MVIP09-c1的合成
Figure BDA0003313098240001442
向反应瓶内依次加入SANCd-01-c0(0.824g，1.5mmol)和ERCd-01-c2(1.09g，1.0mmol)， 再加入10mL的DCM，搅拌溶解，再依次加入TBTU(0.963g)和DIPEA(0.517g)，反应过夜，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和食盐水洗涤，干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶 柱进行纯化，得产品1.3g。
4.1.1.7 3’MVIP09-c2的合成
Figure BDA0003313098240001451
向反应瓶内依次加入3’MVIP09-c1(1.62g，1μmol)和10mL的DCM，室温搅拌溶解，再依次加入DMAP(0.366g)和丁二酸酐(0.2g，3μmol)，室温搅拌反应，TLC分析，反应 合格浓缩掉DCM，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和食盐水洗涤，有机相经无水硫酸钠 干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到产品为1.55g。
4.1.1.8 3’MVIP09的Solid Support合成
Figure BDA0003313098240001452
向反应瓶内依次加入3’MVIP09-c2(0.86g，0.5μmol)和10mL DMF，溶解，再依次加入 HBTU(0.19g)、DIPEA(0.194g)和大孔氨甲基树脂(2.0g)，摇床24h，过滤，树脂用10％ 甲醇/DCM洗涤，再用25％醋酸/吡啶进行封端，取代度150μmol/g。
4.1.2 3'MVIP17的Solid Support的合成
Figure BDA0003313098240001461
4.1.2.1 SANC-01-c1的合成
Figure BDA0003313098240001462
合成步骤参照4.1.1.1.ERC-01-c1的合成。
4.1.2.2 SANC-01-c2的合成
Figure BDA0003313098240001463
合成步骤参照4.1.1.2.ERC-01-c2的合成。
4.1.2.3 SANC-01-c3的合成
Figure BDA0003313098240001464
合成步骤参照4.1.1.3.ERC-01-c3的合成。
4.1.2.4 SANCd-01-c1的合成
Figure BDA0003313098240001471
合成步骤参照4.1.1.4.ERCd-01-c1的合成。
4.1.2.5 SANCd-01-c2的合成
Figure BDA0003313098240001472
合成步骤参照4.1.1.5.ERCd-01-c2的合成。
4.1.2.6 3’MVIP17-c1的合成
Figure BDA0003313098240001481
合成步骤参照4.1.1.6.3’MVIP09-c1的合成，合成所得3’MVIP17-c1的高分辨质谱图见图 4。
4.1.2.7 3’MVIP17-c2的合成
Figure BDA0003313098240001491
合成步骤参照4.1.1.7.3’MVIP09-c2的合成。
4.1.2.8 3’MVIP17的Solid Support合成
Figure BDA0003313098240001492
合成步骤参照4.1.1.8 3’MVIP09的Solid Support合成。
4.1.3 3'MVIP01的Solid Support的合成：
Figure BDA0003313098240001501
合成过程描述：
4.1.3.1 3’MVIP01-c1的合成
Figure BDA0003313098240001502
合成步骤参照4.1.1.6.3’MVIP09-c1的合成。
4.1.3.2 3’MVIP01-c2的合成
Figure BDA0003313098240001503
合成步骤参照5.1.1.7.3’MVIP09-c2的合成。
4.1.3.3 3’MVIP01的Solid Support合成
Figure BDA0003313098240001511
合成步骤参照4.1.1.8.3’MVIP09的Solid Support合成。
4.2.5’MVIP亚磷酰胺单体的合成
4.2.1 当n为2时，所得的5’MVIP亚磷酰胺单体作为Kylo-09-DS122、Kylo-09-DS142正义 链固相合成的最后一个单体5’MVIP09亚磷酰胺单体的合成：
Figure BDA0003313098240001512
4.2.1.1 5’MVIP09-ERCd-PFP-c1的合成
Figure BDA0003313098240001513
称量ERCd-01-c2(2.18g，2.0mmol)溶于DMF(50mL)，加戊二酸单苄酯(0.53g，2.4mmol)、 DIPEA(0.78g)与TBTU(0.84g)，室温搅拌过夜，加水淬灭(50mL)，DCM(30mL*3)萃取，10％ 柠檬酸(50mL*3)、饱和碳酸氢钠50mL和吡啶100mL洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸， 过柱纯化得产品5’MVIP09-ERCd-PFP-c1(2.15g)。
4.2.1.2 5’MVIP09-ERCd-PFP-c2的合成
Figure BDA0003313098240001521
称量5’MVIP09-ERCd-PFP-c1(2.15g，1.66mmol)和10％钯碳(0.21g)，加甲醇(50mL)，室 温搅拌加氢过夜，反应结束后硅藻土过滤钯碳，旋蒸得5’MVIP09-ERCd-PFP-c2粗品(1.9g)， 其高分辨率质谱图如图5所示。
4.2.1.3 5’MVIP09-ERCd-PFP的合成
Figure BDA0003313098240001522
称量5’MVIP09-ERCd-PFP-c2粗品(1.9g，1.58mmol)溶于DCM(60mL)，加DIPEA(1.33g)， 冷却，加三氟乙酸五氟苯酚酯(2.21g，7.9mmol)，室温搅拌反应2h后旋蒸，再溶于DCM(60mL)， 饱和碳酸氢钠(30mL*3)、10％柠檬酸(30mL*1)、饱和食盐水(50mL*1)洗涤，无水硫酸钠干燥， 过滤，旋蒸得5’MVIP09-ERCd-PFP粗品(2.35g)，抽干后无纯化直接用于下一步反应。
4.2.1.4 5’MVIP09亚磷酰胺单体-c1的合成
Figure BDA0003313098240001523
5’MVIP09-ERCd-PFP粗品(2.35g，1.58mmol)溶于DCM(60mL)，加DIPEA(0.82g，6.32mmol)、6-氨基-1-己醇(0.37g，3.16mmol)，室温搅拌反应过夜。加10％柠檬酸(30mL)，DCM(30mL*3)萃取，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤、旋蒸，过柱纯化得产 品5’MVIP09单体-c1(1.73g)。
4.2.1.5 5’MVIP09亚磷酰胺单体
Figure BDA0003313098240001531
称量5’MVIP09亚磷酰胺单体-c1(1.3g、1.0mmol)溶于乙腈(30mL)，加入二异丙胺三 氮唑(0.22g)，冰浴下滴加双-(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(0.36g，1.2mmol)，室温反应4h，HPLC中控，反应合格后，浓缩过柱纯化得到产品5’MVIP09单体(1.2g)。
当n为1时，所得的5’MVIP亚磷酰胺单体作为Kylo-09-DS141、Kylo-09-DS131、Kylo-09-DS147的正义链固相合成的最后一个单体，代码为5'MVIP01：
Figure BDA0003313098240001532
5'MVIP01的亚磷酰胺单体称量YICd-01-c2(1.12g，2.0mmol)，剩余操作参照4.2.1.1.～ 4.2.1.5。
实施例5 5’MVIP09/3’MVIP 09偶联不同的siRNA的RNAi剂的合成
表13中反义链合成描述：用氩气吹扫试剂瓶至少2min。向试剂瓶中依次加入亚磷酰胺 单体和乙腈，拧紧瓶盖后，震荡直至目测固体全溶。然后加入3A分子筛，静置8h以上待用。 用氩气吹扫试剂瓶至少2min。向试剂瓶中依次加入氢化黄原素和干燥的吡啶，拧紧瓶盖后， 震荡直至目测固体全溶，暂存待用。确认在室温20～30oC环境条件下进行以下操作:称取 3’MVIP载体,加入到试剂瓶中，再加入乙腈，震荡混合均匀。将载体转移至合成柱内，并用 乙腈将试剂瓶中残余的载体淋洗转移至合成柱内。淋洗完毕后加乙腈充满合成柱，记录使用 乙腈的用量。按仪器操作安装固定合成柱。
将上述配制的单体溶液、CAP A、CAP B、氧化剂、硫代试剂、活化剂、脱帽剂以及乙腈， 连接至AKTA PILOT100对应的管路，确保管路插入试剂瓶底。
合成方法设置完毕后，仪器各项工作准备就绪，点击运行，开始合成。在线观察记录每 个detritylation峰面积。在合成过程中根据脱保护试剂实际使用量，进行补加操作。
合成结束后，氩气吹扫合成柱≥2h，按操作规程卸载合成柱。向合成柱内固相载体转移 至反应瓶，加入甲胺水溶液和氨水，将反应瓶放入摇床中，35℃，2-3小时。将溶液过滤至圆 底烧瓶中，再使用50％乙醇水溶液洗涤残留固相，再次过滤与之前滤液合并，将圆底烧瓶连 接旋转蒸发仪，设置水温50℃蒸至无馏出，向圆底烧瓶内加入乙醇，混匀，再次蒸至无馏出， 重复操作至瓶底出现白色粉末。将得到的白色粉末配制成溶液，使用反向层析柱进行纯化， 取样检测OD260、纯度。将纯化的反义链溶液分装于西林瓶中冻干备用，并将产品密封储存 于-20℃冰箱中。
表14中正义链的合成操作同反义链，其中装柱的载体为Universal载体。所得中间体加 DIPEA配制成溶液，加入5’MVIP亚磷酰胺单体，混匀，将反应瓶放入摇床中，35℃，2-3小时。
表15中RNAi剂的合成退火工艺描述：
取表13中反义链，取与表13中反义链碱基配对的表14中反正义链，1:1等摩尔混合在 反应瓶中，水浴95℃5分钟后，关闭水浴锅电源，使其自然降温至40℃以下。向双链溶液中 加入3M醋酸钠水溶液，混合均匀后，再加入适量体积的无水乙醇，混合均匀，将反应液放入-20℃冰箱内45min。冷冻高速离心机设置4℃预制冷，温度达到后，放入双链溶液，启动离心机。取出离心后的双链溶液，去除上清液，加入超纯水使固体完全溶解，取样检测OD260、 纯度。将纯化的双链溶液分装于西林瓶中冻干备用，并将产品密封储存于-20℃冰箱中。
实施例6 5’MVIP09/3’MVIP09偶联不同siRNA的RNAi剂活性研究
取适龄的雌性AGT转基因小鼠用于实验评估。供试品为表15中RNAi剂 Kylo-09-DS113～Kylo-09-DS130。在Day0分别通过皮下注射给药3mg/kg；给药体积为 100-200μL。在给药后第0，7，14，21，28和第35天取血，分离血清，-80℃储存。用Elisa 方法测定血清中hAGT水平，试验结果见表22和图6。
表22 转基因小鼠给药后血清中hAGT平均水平
Figure BDA0003313098240001541
Figure BDA0003313098240001551
结果显示5’MVIP09/3’MVIP09偶联的实施例2优选出来的序列(正义链序列为SEQID NO.37，43，44，46，47，48，53和54及对应的反义链序列SEQ ID NO.55，61，62，64， 65，66，71和72)所得到的RNAi剂Kylo-09-DS113，119，120，122，123，124，129和130 在体内活性仍旧是显著且持续性好。本实施例验证了5’MVIP09/3’MVIP09载体结构可以实现 siRNA的安全递送，且作用效果显著。
实施例7 不同结构5’MVIP和3’MVIP偶联同一种siRNA对RNAi剂的活性影响研究
按照实施例5所述的方法合成表16中的反义链和表17中的正义链，配对退火合成表18 中本实施例供试品RNAi剂Kylo-09-DS122，Kylo-09-DS147～160，Kylo-09-DS161和Kylo-09-171。取适龄的雌性人AGT转基因小鼠用于实验评估。在Day0分别通过皮下注射 给药：3mg/kg；给药体积为100-200μL。在给药后14取血，分离血清，用Elisa方法测定血 清中hAGT水平，试验结果见表23及图7。
表23 转基因小鼠血清中hAGT平均水平
Figure BDA0003313098240001561
上述试验结果显示，载体结构5’MVIP和/或3’MVIP偶联的位置包括反义链的5’末端和/ 或3’末端、正义链的5’末端和/或3’末端、反义链的5’末端和正义链的3’末端、正义链的5’ 末端和3’末端，各种载体结构与同一AGT siRNA进行不同位置偶联，所得的RNAi剂对转基 因小鼠hAGT水平抑制效果呈现出差异性，其中n和m分别为2的5’MVIP09，20，19和10偶联正义链的同时，3’MVIP09，10，15和12分别对应偶联在反义链上，退火配对所得RNAi 剂Kylo-09-DS122，151，152和153对转基因小鼠hAGT抑制效果都优于其它组合；n和m 不同，n+m等于4的RNAi剂Kylo-09-DS147，148，149和150的抑制效果其次。反义链5’ 末端偶联有载体结构所得到的RNAi剂中，5’MVIP21与3’MVIP18组合中得到的 Kylo-09-DS160抑制效果也达到67.3％。Kylo-09-DS161剂和Kylo-09-DS171虽然n+m分别为 5和6，但在抑制效果上并未显示出支化多的优势，推测与序列的特异性或引入的载体结构的 空间位阻有关。试验结果显示，选自表10中的5’MVIP和/或选自表11中3’MVIP组合成载 体结构所得的RNAi剂对转基因小鼠体内的hAGT表达水平都有一定的抑制效果。
实施例8 5'MVIP09/3'MVIP09组合形成的RNAi剂的在食蟹猴体内药效探索研究
本实施例的目的是研究不同结构5’MVIP和3’MVIP偶联同一种AGT siRNA所得RNAi在食蟹猴体内抑制活性的影响。按实施例6所述的方法制备相应的RNAi剂Kylo-09-DS131、Kylo-09-DS141、Kylo-09-DS142、Kylo-09-DS147或Kylo-09-DS122，选取18只3～5岁雄性洗脱猴适应性饲养结束后根据体重随机分为对照组(n＝3)以及给药组(n＝3)。给药剂量为3mg/kg，给药体积3ml/kg。分组给药当天定义为Day0，在首次给药后7天、14天、21天、 28天、35天、42天和49天采集血液，分离血浆后，用Elisa方法测定血清中AGT水平，试 验结果见表24和图8。
表24 食蟹猴血清中AGT平均水平
Figure BDA0003313098240001571
实验结果显示，正义链5’MVIP和反义链3’MVIP的组合为5’MVIP01/3’MVIP01、 5’MVIP01/3’MVIP17或5’MVIP09/3’MVIP09或正义链5’MVIP和正义链3’MVIP的组合 5’MVIP01/3’MVIP09或5’MVIP09/3’MVIP01的偶联方式都对食蟹猴体内AGT水平的抑制都 呈现了显著的效果且持续性好。
序列表
<110> 厦门甘宝利生物医药有限公司
<120> AGT抑制剂及其用途
<130> 0249-PA-004
<160> 260
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1
<400> 1
gcttgtttgt gaaacaaaaa a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S2
<400> 2
cccttgtgtt agtaataaac g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S3
<400> 3
gttttaaaat taaagtatac a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S4
<400> 4
gggttttaaa attaaagtat a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S5
<400> 5
gcttgtgatt tttgaacaat a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S6
<400> 6
aattgggttt taaaattaaa g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S7
<400> 7
ggttttaaaa ttaaagtata c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S8
<400> 8
gaacaaaaat tgggttttaa a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S9
<400> 9
ggtgctagtc gctgcaaaac t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S10
<400> 10
gcattttttt tgagcttgaa g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S11
<400> 11
attgggtttt aaaattaaag t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S12
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gatgcttgtg atttttgaac a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gagtctaccc aacagcttaa c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> S14
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cgaccagctt gtttgtgaaa c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 15
ggagtgacat ccaggacaac t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 16
ccgtgtagtg tctgtaatac c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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agcttgtttg tgaaacaaaa a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cgggactact gttccaaaaa g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<222> (21)..(21)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 19
uuuuguuuca caaacaagcu n 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
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<400> 20
uuuauuacua acacaaggga n 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
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<400> 21
uauacuuuaa uuuuaaaacc n 21
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<213> Artificial Sequence
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<221> n代表a、u、g或c
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 22
uacuuuaauu uuaaaaccca n 21
<210> 23
<211> 21
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 23
uuguucaaaa aucacaagca n 21
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 24
uuaauuuuaa aacccaauuu n 21
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 25
auacuuuaau uuuaaaaccc n 21
<210> 26
<211> 21
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 26
uaaaacccaa uuuuuguucu n 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
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<400> 27
uuuugcagcg acuagcacca n 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
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<400> 28
ucaagcucaa aaaaaaugcu n 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<221> n代表a、u、g或c
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 29
uuuaauuuua aaacccaauu n 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS12
<220>
<221> n代表a、u、g或c
<222> (21)..(21)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 30
uucaaaaauc acaagcaucu n 21
<210> 31
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<221> n代表a、u、g或c
<222> (21)..(21)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 31
uaagcuguug gguagacucu n 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> n代表a、u、g或c
<222> (21)..(21)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
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uucacaaaca agcuggucgg n 21
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<223> AS15
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<222> (21)..(21)
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<220>
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<222> (21)..(21)
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<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
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<222> (1)..(21)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
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<222> (1)..(21)
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<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> g代表2'-甲氧基鸟苷酸, a代表2'-甲氧基腺苷酸
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<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> g代表2'-甲氧基鸟苷酸，a代表2'-甲氧基腺苷酸
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<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> g代表2'-甲氧基鸟苷酸, a代表2'-甲氧基腺苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> c代表2'-甲氧基胞苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> c代表2'-甲氧基胞苷酸
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uuuauuacua acacaaggga g 21
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS39
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> a代表2'-甲氧基腺苷酸，c代表2'-甲氧基胞苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(21)
<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
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uauacuuuaa uuuuaaaacc c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS40
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> a代表2'-甲氧基腺苷酸，c代表2'-甲氧基胞苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(11)
<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
<400> 94
uacuuuaauu uuaaaaccca a 21
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS41
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> g代表2'-甲氧基鸟苷酸, a代表2'-甲氧基腺苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(21)
<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
<400> 95
uuguucaaaa aucacaagca u 21
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS42
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> a代表2'-甲氧基腺苷酸
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<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(21)
<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
<400> 96
uuaauuuuaa aacccaauuu u 21
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> a代表2'-甲氧基腺苷酸，c代表2'-甲氧基胞苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> u代表2'-甲氧基尿苷酸
<400> 97
auacuuuaau uuuaaaaccc a 21
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS44
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> g代表2'-甲氧基鸟苷酸, a代表2'-甲氧基腺苷酸
<220>
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<222> (6)..(7)
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ucuuguccac ccagaacuc 19
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gucauguucu uacauucaa 19
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<222> (1)..(20)
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<400> 181
aaccgaccag cuuguuugug 20
<210> 182
<211> 20
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<220>
<223> AS128
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 从5'末端开始的第7、12、14位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 182
uguucccuuu ucaaguugag 20
<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 从5'末端开始的第7、12、14位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 183
ucccuuuuca aguugagaac 20
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<222> (1)..(21)
<223> 从5'末端开始的第7、12、14位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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uauacucuca uuguggauga c 21
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<222> (1)..(21)
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<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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<222> (1)..(21)
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<222> (1)..(21)
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<222> (1)..(21)
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<222> (1)..(21)
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<222> (1)..(21)
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<213> Artificial Sequence
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<222> (1)..(21)
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<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 198
cgaccagcuu guuugugaaa c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
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<400> 200
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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agcuuguuug ugaaacaaaa a 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
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是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 202
cgggacuacu guuccaaaaa g 21
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 203
ggaugcuggc caacuucuu 19
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<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位
是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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<211> 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S75
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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<211> 19
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<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
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是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 206
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<211> 19
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<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
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<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
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<211> 19
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位
是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 211
agguggaggg ucucacuuu 19
<210> 212
<211> 19
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<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 212
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<221> misc_feature
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<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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<211> 19
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<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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cccucaacug gaugaagaa 19
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<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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ucaacuggau gaagaaacu 19
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<211> 19
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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accugcaaaa auugagcaa 19
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<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 219
cugcaaaaau ugagcaaug 19
<210> 220
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 220
ugcaaaaauu gagcaauga 19
<210> 221
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S91
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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gcaaaaauug agcaaugac 19
<210> 222
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 222
ggaugagaga gagcccaca 19
<210> 223
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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guuugcugug uaugaucaa 19
<210> 224
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
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uuugcugugu augaucaaa 19
<210> 225
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S95
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 225
cccccagucu cccaccuuu 19
<210> 226
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S96
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 226
cccaccuuuu cuucuaaug 19
<210> 227
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S97
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 227
ccaccuuuuc uucuaauga 19
<210> 228
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S98
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 228
caccuuuucu ucuaaugag 19
<210> 229
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S99
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 229
caaaaagaau uccaaccga 19
<210> 230
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S100
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 230
ccaaccgacc agcuuguuu 19
<210> 231
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S101
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 231
ccgaccagcu uguuuguga 19
<210> 232
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S102
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 232
cgaccagcuu guuugugaa 19
<210> 233
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S103
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 233
gaccagcuug uuugugaaa 19
<210> 234
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S104
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 234
gcuuguuugu gaaacaaaa 19
<210> 235
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S105
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 235
cuuguuugug aaacaaaaa 19
<210> 236
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S106
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 236
uuguuuguga aacaaaaaa 19
<210> 237
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S107
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 237
guuugugaaa caaaaaagu 19
<210> 238
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S108
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 238
uugugaaaca aaaaagugu 19
<210> 239
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S109
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位
是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 239
caaaaaagug uucccuuuu 19
<210> 240
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S110
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 240
uucccuuuuc aaguugaga 19
<210> 241
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S111
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 241
ccuuuucaag uugagaaca 19
<210> 242
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S112
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 242
ugagaacaaa aauuggguu 19
<210> 243
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S113
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 243
gaacaaaaau uggguuuua 19
<210> 244
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S114
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 244
caaaaauugg guuuuaaaa 19
<210> 245
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S115
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 245
uguauuuagu gucuugaau 19
<210> 246
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S116
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 246
uagugucuug aauguaaga 19
<210> 247
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S117
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 247
cuugaaugua agaacauga 19
<210> 248
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S118
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 248
uugaauguaa gaacaugac 19
<210> 249
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S119
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 249
cuuaguuuuu uccacagau 19
<210> 250
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S120
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 250
ccacagaugc uugugauuu 19
<210> 251
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S121
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 251
acagaugcuu gugauuuuu 19
<210> 252
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S122
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 252
acacaucgcu gauuuguccg 20
<210> 253
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S123
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 253
ucgguuggaa uucuuuuugg 20
<210> 254
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S124
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 254
ucacaaacaa gcuggucggu 20
<210> 255
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S125
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 255
uggaacagua gucccgcgcu 20
<210> 256
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S126
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 256
uuggaacagu agucccgcgc 20
<210> 257
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S127
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 257
cacaaacaag cuggucgguu 20
<210> 258
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S128
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 258
cucaacuuga aaagggaaca 20
<210> 259
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S129
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 259
guucucaacu ugaaaaggga 20
<210> 260
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S130
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 从5'末端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2'位是氟和从其余的核苷酸为2'位是甲氧基，且5'末端和3'末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键被硫代
<400> 260
gucauccaca augagaguac a 21

Claims (10)

1.一种RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述RNAi剂的结构中含有载体结构和干扰核酸，其结构如式IIIa、IIIb或IIIc所示：
Figure FDA0003313098230000011
其中，
所述干扰核酸靶向AGT基因，其包括反义链和正义链；
所述载体结构包括5’MVIP(5’MultiValent Import Platform)和/或3’MVIP(3’MultiValent Import Platform)；
所述5’MVIP由转接点R1、连接链D、接头B、支链L和肝靶向特异性配体X组成，所述3’MVIP由转接点R2、连接链D、接头B、支链L和肝靶向特异性配体X组成，所述5’MVIP通过转接点R1与正义链5’端或反义链5’端连接，所述3’MVIP通过转接点R2与正义链3’端或反义链3’端连接，n和m各自独立地为0-4的任意整数。
2.根据权利要求1所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述n+m＝2-6的整数，优选n+m＝2、3或4，更优选为4。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述5’MVIP选自表10中5’MVIP01至5’MVIP22中的任一个，和/或所述3’MVIP选自表11中3’MVIP01至3’MVIP27的任一个。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述正义链与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列具有基本上同源性。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，所述反义链包含以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述正义链包含SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列，且所述反义链包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72中任意一个或与其相差不超过3个核苷酸的序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其中所述干扰核酸包括Kylo-09-DS01，Kylo-09-DS07，Kylo-09-DS08，Kylo-09-DS10，Kylo-09-DS11，Kylo-09-DS12，Kylo-09-DS17，Kylo-09-DS18，Kylo-09-DS37～Kylo-09-DS54中任意任一种或多种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，其包括表18中Kylo-09-DS122，Kylo-09-DS131至Kylo-09-DS147中的任一种或多种。
9.药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，以及任选地药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。
10.权利要求1-8中任一项所述的RNAi剂或其药学上可接受的盐，或权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病或病症或者降低疾病或病症的风险。
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