JP2000506866A

JP2000506866A - アンギオテンシノゲンｍＲＮＡに標的化されたオリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JP2000506866A
Application number: JP9532856A
Authority: JP
Inventors: ウィールボ，ドナ; フィリップス，エム．イアン
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 2000-06-06
Also published as: AU2529697A; CA2248932A1; EP0906123A1; EP0906123A4; WO1997033623A1

Abstract

(57)【要約】ヒト被験体に投与されて、アンギオテンシノゲンの発現を阻害し、それによってアンギオテンシノゲン誘導性高血圧症を調節し得る、オリゴヌクレオチド、およびその組成物が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】アンギオテンシノゲンmRNAに標的化されたオリゴヌクレオチド発明の背景技術分野本発明は、ヒトにおける高血圧症を低減するために有用である組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、アンギオテンシノゲンmRNAに結合してアンギオテンシノゲンの発現、およびそれにより本態性高血圧症を阻害し得るオリゴヌクレオチド化合物に関する。背景技術アンギオテンシノゲン（AGT）は、主に肝臓により産生され、これは腎臓により産生されるタンパク質レニンの基質である。アンギオテンシノゲンへのレニンの作用により、デカペプチドアンギオテンシンＩの形成がもたらされる。アンギオテンシンＩは、それが脈管構造を通して循環するにつれてアンギオテンシン変換酵素（ACE）の作用を通してさらにオクタペプチドアンギオテンシンIIに変換される。アンギオテンシンIIは、強力な血管収縮剤であり、そして血圧および血容量ホメオスタシスのレギュレーターである。過作用のレニンアンギオテンシン系（RAS）は、ヒトにおける本態性高血圧症および米国において約４千万人の成人に影響を及ぼす関連した形態の高血圧症の発達および維持に関連がある。アンギオテンシノゲンの阻害を通して、アンギオテンシンIIの産生は阻害され得、その後、高血圧性の血圧が低減する。 AGTの遺伝的変異体が、高血圧症患者における上昇した血漿AGTレベル、および特定の集団における子癇前症またはアテローム性動脈硬化症への素因に関連している（Jeunmatre，X.ら，Cell 71(1):169-80，1992;Hixon，J.E.およびPowers， P.K.，Human Genet．96:110-112，1995）。RASは、いくつかの機構により阻害され得、これはACEインヒビター、レニンインヒビター、およびアンギオテンシンアンタゴニストを含むが、今までのところでは、AGTの特異的なインヒビターは存在しない。AGTの産生は、遺伝子転写の際に作用し、組織におけるmRNAの濃度に影響を与えるホルモンにより主に制御される。 AGTの調節においてホルモンが果たす最も重要な役割は、高レベルのレニンによるその迅速な消費の間、その合成および構成的分泌を維持することであり得る。肝臓のAGTは、ゲノムレベルで作用するホルモン（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、グルココルチコイド、および炎症性サイトカイン）により、適切な応答性エレメントおよびマルチホルモン応答部位（例えば、主要転写開始部位の上流のヌクレオチド−615〜−440のホルモン誘導性エンハンサー単位（HIEU））と相互作用するDNA結合タンパク質の活性化を通して、主に肝細胞における転写レベルで調節される（Peters,J.,前出，1995;Brashier，A.R.ら，Kidney Intern ational，46:1564-1566，1994）。多数の降圧剤が市販されているが、しかし、ほとんどは、一般的に、第２群の薬剤の作用を必要とする、重篤な副作用を有する。これは、疾患の性質と共に、患者のコンプライアンスが乏しい結果となる傾向がある。現在使用されている多くのレニンアンギオテンシン系インヒビターは、レニンインヒビター、アンギオテンシン変換酵素インヒビター、およびアンギオテンシンレセプターブロッカーを含む。これらの薬剤もまた特異性を欠き、好ましくない副作用を有し、頻繁な投薬レジメを必要とし、そしてアンギオテンシンIIの形成を完全には防がない。別のアプローチが、高血圧症を低減するために提案されている。多くの研究者は、レニン−アンギオテンシン系成分の阻害のためのアンチセンス配列を開発している。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの生物学的系においてタンパク質合成を首尾良く阻害するために使用されている（Yakubov，L.ら，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 86:6454-6458，1989;Wahlstedt，D.ら，Science 259:528-531，199 3;Wahlstedt，D.ら，Nature 363:260-263，1993;Wielbo，D.ら，Hypertension 2 5:314-319，1995）。遺伝子調節のこのパラダイムは、多くの潜在的な治療的適用を有し、そして現在、抗ガン剤、抗不安剤、抗ウイルス剤、および駆虫剤としての適用のために開発されている。タンパク質合成のアンチセンス調節または減衰は、公知の分子配列を有する任意の候補遺伝子に適用され得る。アンチセンス分子は、候補遺伝子の標的領域に相補的であるように合成される、短いストランド（通常、12〜18塩基長）のDNAまたはRNAである。アンチセンス分子はその相補的領域に結合し、そして多くの機構を通して遺伝子発現を阻害または減衰する（Helene，C.C.およびToulme，J.J.,Biochemica et Biophysica Ac ta 1049:99-125，1990）。これらの分子の機能、代謝、および構造の理解が前進することにより、増強されたヌクレアーゼ耐性、ならびに増加した特異性、選択性、および効力を有するアンチセンス分子の開発が導かれている（Crooke，S.T.,FASEB J．7:533-539，1 993）。ホスホロチオエートASODNは、改変されたホスホジエステルオリゴヌクレオチドであり、ここで、ヌクレオチド間結合の非架橋酸素原子の１つが、硫黄により置換されている。完全にチオエート化されたアンチセンス分子は、ヌクレアーゼにさらに耐性であるが、しかしまた一般に１μmより大きな用量においていくつかの非配列特異的効果を示す（Wagner，R.W.，Nature 372:333-335，1994）。ホスホロチオエート化はまた、RNase Hの活性を刺激する。この酵素は、DNA-m RNA二重鎖を基質として認識し、そして二重鎖のmRNA部分を切断し、DNAアンチセンス分子を他のmRNA鎖へと自由に結合させて触媒型の効果を促進する（Helene， C.C.およびToulme,J.J.,前出，1990;Boiziau，C.ら，Biochemical Society Tran sactions 20:764-767，1992）。本発明者らは、アンチセンス技術の概念を心血管機能および高血圧症へ情報を提供するための生物学的道具として利用した。SakaiおよびMengは、アンギオテンシンII １型（AT1）レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドが、AngIIへのdipsogenic応答を阻害することを実証し（Sakai,R.R.ら，J．Neurochem．62:2 053-2056，1994;Meng，H.ら，Regulatory Peptides 54:543-551，1994）、そしてMorishitaおよび共同研究者は、増殖細胞核抗原に標的化したアンチセンスを首尾良く用いて、バルーンカテーテル血管形成術の後の新動脈内膜形成を阻害した（Morishita，R.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90(18):8474-8，1993）。 Gyurkoは、AT1レセプターに標的化したASODNの中枢投与の後の血圧減少を示し得た（Gyurko，R.ら，Regulatory Peptides 49:165-174，1993）。そして同様の効果はWielboが中枢性のAGTを標的化した場合に観察された（Wielbo，D.ら，前出，1995）。最近、Tomitaは、末梢AGTを標的化する３つの連続したアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を用いてSHＲにおける血圧を低減し得、そしてAGT mR NAにおける減少を示した（Tomita，N.ら，Hypertension 24(3):65，397，1994;T omita，N.ら，Hypertension 26:131-136，1995）。Wielboらはまた、18マーのOD N配列がカプセル化されたリポソームを用いてラットモデルにおける高血圧性の血圧を減少させたが、mRNAにおいては変化は観察されなかった（Wielbo，D.ら， Hypertension 28:147-151，1996）。 N．Tomitaら，26 Hypertension 131-136(1995)は、初期mRNAのエキソン／イントロン連結部に標的化したアンチセンス分子の投与により、高血圧症のラットモデルにおいて血圧が一時的に減少することを実証した。これらのアンチセンス分子は、肝臓の取り込みを促進するためのウイルス抗原を組込むリポソームの送達機構を介して肝門静脈に直接投与された。この研究グループは、末梢のアンギオテンシノゲンおよびアンギオテンシノゲンmRNAにおけるその後の減少を伴う、血圧における減少を実証した。注射の投与速度または数に関する情報は全くないことに留意されたい。しかし、用量依存性研究が、15μMol／Ｌまでを用いて行われ、AGTにおける有意な減少が得られた。このデータは、おそらく、このような高容量でのコントロールオリゴにより観察された非特異的効果による比として示された。 Tomitaらの方法の欠点の１つは、肝門静脈を通してリポソームを与えるために侵襲的な外科的手段が必要とされることである。アンチセンス分子を直接肝臓に（Tomitaにより使用された容量で）注射することの別の欠点は、肝臓組織を損傷する危険性である。また、ウイルス抗原改変が、肝臓の取り込みを容易にするために行われなければならない。残念ながら、当該分野では、先の問題を避けるアプローチは開発されていない。従って、有毒な副作用が無くそして少用量で効力がある有効なASODN高血圧症処置組成物、および侵襲性の外科的投与技術を必要としない方法に対する必要性が存在する。発明の開示本発明は、AGT発現が、以下の式Ｉのオリゴヌクレオチド化合物の投与によってヒトにおいて阻害され得るという知見に帰する：ここで：各Ｘは、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＣ₁ _〜4アルキルであり；各Ｂは、独立して、ヒトアンギオテンシノゲンをコードするセンスmRNA鎖にオリゴヌクレオチドが結合し得、それによってその翻訳を阻害するように選択される、アデニン、グアニン、シトシン、またはチミンであり；各Ｒは、独立して、ＨまたはＣ₁ _〜4アルキルまたはＰ(O)(O)置換アクリジンであり；各Ｙは、独立して、ＨまたはOHであり；そしてｎは８〜23である。式Ｉのオリゴヌクレオチド化合物はまた、それの薬学的に受容可能な塩または水和物であり得る。好ましくは、Ｂは、オリゴヌクレオチドが、ヒトアンギオテンシノゲンのセンスmRNA鎖に対してアンチセンスであるように選択される。より好ましくは、Ｂは、オリゴヌクレオチドが、AUG開始コドンを含むmRNA塩基領域に結合し得るように選択される。本発明の別の局面は、薬学的キャリアおよび上記種のオリゴヌクレオチドを含有する、アンギオテンシノゲンの発現を阻害するために有用な薬学的組成物を提供する。薬学的キャリアは、リポソーム、ウイルスベクター、またはタンパク質結合体処方物であり得る。本発明の別の局面はヒトにおける高血圧症を処置するための方法を提供する。この方法は、上記種のオリゴヌクレオチドまたは組成物の有効量を被験体に投与する工程を含む。本発明の目的は、それゆえ：（a）毒性の副作用を回避し；（b）侵襲性の外科的手順を回避し；（c）少用量で効果的であり；そして（d）アンギオテンシノゲンmRNAを特異的に標的化する、上記種の化合物、組成物および方法を提供することを含む。本発明のこれらおよびさらに他の目的および利点は、以下の記載から明らかである。図面の簡単な説明図１は、本発明の１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、アンギオテンシノゲンの発現割合を示す棒グラフであり；図2aおよび2bは、それぞれ、非カプセル化アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリポソームカプセル化オリゴヌクレオチドの注射１時間後のラット肝臓組織の顕微鏡写真であり；図３は、リポソームカプセル化アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロール組成物で自然発症性高血圧症ラットを処置した後の平均動脈圧における変化を示す棒グラフであり；図４は、自然発症性高血圧症ラットをリポソームカプセル化アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロール組成物で処置した後のそれらの血漿アンギオテンシンIIのレベルを示す棒グラフであり；図５は、自然発症性高血圧症ラットをリポソームカプセル化アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロール組成物で処置した後のそれらの血漿アンギオテンシノゲンのレベルを示す棒グラフであり；図６は、ウイルスベクター送達系を用いた比較データを示すグラフであり；図7aは、AGTおよびコントロール遺伝子カテプシンＤに関するノーザンブロットハイブリダイゼーションを示し；図7bは、未処置コントロール細胞におけるアンギオテンシノゲン発現と比較した処置後のAGT mRNA発現の相対強度を示す棒グラフであり；図８は、アンギオテンシノゲン産生へのカチオン性リポソーム結合ASODNの効果を示す棒グラフであり；図9aは、AGTおよびコントロール遺伝子カテプシンＤに関するノーザンブロットハイブリダイゼーションを示し；図9bは、コントロール処置サンプルと比較したAGT mRNAの相対的な発現を示す棒グラフであり；そして図10は、ASODNのカチオン性リポソーム送達後のアンギオテンシノゲンタンパク質における用量依存性減少を示す棒グラフである。発明を実施するための最良の形態アンギオテンシノゲン（AGT）をコードする天然のDNAセグメント、および全てのそのような哺乳動物DNA鎖は、以下の２つの鎖を有する：水素結合により一緒に保持されたセンス鎖およびアンチセンス鎖。DNAのチミジンがウリジンによって置換されている以外は、AGTをコードするメッセンジャーRNAは、センスDNA鎖と同じヌクレオチド配列を有する。従って、合成アンチセンスヌクレオチド配列は、AGTをコードするDNAおよびRNAと結合するはずである。本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、ヒトAGTをコードするメッセンジャーR NAに結合し、それによりこのタンパク質の発現を阻害する。好ましい本発明の化合物は、Fukamizuら、265 J. Biol. Chem. 7576-7582(1990)の図２に示されるようなヒトAGTをコードするセンスDNA配列に対してアンチセンスである。特に好ましいオリゴヌクレオチド化合物は、オリゴヌクレオチドの塩基配列が5'-CTCGCTT CCGCATACCCT-3'（配列番号１）であるように式ＩのＢが選択されているオリゴヌクレオチド化合物である。本明細書および請求の範囲において、文字Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、およびＵはそれぞれ、ヌクレオシドがアデノシン（Ade）、グアノシン（Gua）、シチジン（Cyt）、チミジン（Thy）、およびウリジン（Ura）であるヌクレオチドを示す。本明細書および請求の範囲において用いられる場合、AGT DNAまたはmRNAセンス鎖に対してアンチセンスである化合物は、センス鎖に相補的なヌクレオシド配列を有する化合物である。表１は、４つの可能なセンス鎖ヌクレオシドおよびアンチセンス化合物中に存在するそれらの相補物を示す本発明が、アンギオテンシノゲンをコードするセンスmRNA鎖に結合し得るオリゴヌクレオチド化合物を広く包含することが、当業者により理解される。従って、本発明は、厳密にはアンチセンスではない化合物を包含する：化合物は、そのような化合物が発現を阻害するに十分なアンギオテンシノゲンmRNAに対する結合親和性を有するという条件で、いくつかの非相補的塩基を有し得る。式Ｉの化合物はまた、ヌクレオチド中のいくつかまたは全てのリン酸塩が、ホスホロチオエート（Ｘ＝Ｓ）またはメチルホスホネート（Ｘ＝CH₃）または他のC_1-4 アルキルホスホネートにより置換されているという点で、天然のDNAとは異なり得る。式Ｉの化合物は、必要に応じて、センス分子の遊離水酸基の一方または両方をC_1-4アルコキシ基（Ｒ＝C_1-4アルコキシ）で置換することにより、天然の DNAからさらに差別化され得る。本明細書中で用いられる場合、C_1-4アルキルは、１〜４個の炭素原子を有する分岐または非分岐炭化水素を意味する。式Ｉの化合物はまた、3'および／または5'末端において、置換アクリジン誘導体によって置換され得る。本明細書中で用いられる場合、「置換アクリジン」は、 DNAのようなヌクレオチド鎖にインターカレートし得る任意のアクリジン誘導体を意味する。好ましい置換アクリジンは、2-メトキシ-6-クロロ-9-ペンチルアミノアクリジン、N-(6-クロロ-2-メトキシアクリジニル)-O-メトキシジイソプロピルアミノホスフィニル-3-アミノプロパノール、およびN-(6-クロロ-2-メトキシアクリジニル)-O-メトキシジイソプロピルアミノホスフィニル-5-アミノペンタノールである。他の適切なアクリジン誘導体は、当業者に容易に明らかとなる。さらに、本明細書中で用いられる場合、「P(O)(O)-置換アクリジン」は、適切なアクリジンに共有結合されたリン酸塩を意味する。式Ｉの化合物はまた、それらのヌクレオチド配列中に挿入されたリボザイム配列を含み得る。リボザイム配列は、それらがAUC、UUC、GUA、GUU、GUC、または好ましくは、CUCによりすぐに先行されるように、式Ｉの化合物中に挿入される。リボザイム配列は、挿入され得、そしてメッセンジャーRNAの自己切断を引き起こす、任意の配列である。配列CUG AUG AGU CCG UGA CGA Aが好ましい。他のそのような配列は、HaseloffおよびGerlach，334 Nature 585-591(1988)により記載されるように調製され得る。式Ｉの化合物は、約10〜25ヌクレオチドを有する。本明細書中で用いられる場合、用語「ヌクレオチド」はリン酸部分がホスホロチオエートまたはアルキルホスホネートにより置換されているヌクレオチドを包含し、そしてヌクレオチドは置換アクリジンにより置換され得る。好ましい式Ｉの化合物は、13〜22ヌクレオチドを有する。16〜20ヌクレオチドを有する化合物がより好ましい。18ヌクレオチドを有する化合物が最も好ましい。10より少ないヌクレオチドを有する化合物はより所望されない。なぜなら、それらは一般に、特異性がより低いからである。そして25より多いヌクレオチドを有する化合物はより所望されない。なぜなら、それらの物理的な大きさおよび電荷が親油性細胞膜の通過を減じるからである。従って、それらは、細胞にあまり入りそうにない。ヒトAGT mRNAに対してアンチセンスである式Ｉの化合物が好ましいが、そのような化合物が発現を阻害するに十分なヒトAGT mRNAに対する結合親和性を有するという条件で、式Ｉは、mRNAセンス鎖のセグメント中の各ヌクレオチドに対する相補性を欠くヌクレオチド化合物を包含する。実施例１および５の手順は、本発明の特定のオリゴヌクレオチドがアンギオテンシノゲン発現を阻害するに有効であるかどうかをスクリーニングするために有用である。ＲがＨである式Ｉの化合物が好ましい。しかし、得られる化合物がAGTの発現を阻害するに十分なAGT mRNAセンス鎖に対する結合親和性を保持するという条件で、ＲはC_1-4のアルキルであり得る。少なくとも１つのＸがＳである式Ｉの化合物は、以下の公開された手順により調製される:W.J．Stecら、106 J. Am. Chem. Soc. 6077-6079(1984)；S.P．Adam sら、105 J. Am. Chem. Soc. 661(1983)；M.H．Caruthersら、4 Genetic Engine ering 1，Settlow，J．Hollander．A.編；Plenum Press:New York(1982)； M.S．Broidoら、119 Biochem. Biophys. Res. Commun. 663(1984)。これらの公開された手順において記載される反応スキームは、固相支持体上で実施される。反応スキームはホスホルアミダイトの1H-テトラゾール触媒カップリングを含んでホスフェート中間体を生じ、これは2,6-ルチジン中の硫黄と反応されてホスフェート化合物を生じる。オリゴヌクレオチド化合物は、ホスフェート化合物をチオフェノキシド（１：２：２チオフェノール／トリエチルアミン／テトラ-ヒドロフラン、室温、１時間）で処理することにより調製される。一連の反応は、所望の長さのオリゴヌクレオチド化合物が調製されるまで反復される（式Ｉ）。式Ｉの化合物は、水酸化アンモニウムで室温で１時間処理することにより支持体から切断され、次いで約50℃において一晩加熱することによりさらに脱保護されて、式Ｉの化合物を生じる。少なくとも１つのＸが酸素である式Ｉの化合物は、 I₂-H₂Oを2,6-ルチジン中の硫黄に置換することにより調製される。少なくとも１つのＸがCH₃または他のC_1-4アルキルである式Ｉの化合物は、以下の公開された手順により調製される：K.L．AgarwalおよびF．Riftina、6 Nucl .Acids Res. 3009-3023(1979)。一連の反応は固相支持体上で実施される。反応手順は、メチルホスホノジトリアゾリドをリン酸化試薬として使用する5'-保護ヌクレオシドの3'-ヒドロキシル基のリン酸化、続くメチルホスホネートのベンゼンスルホニル触媒カップリングを含んで、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドを生じる。メチルホスホノジトリアゾリドは、等モル量のメチルホスホノ- ジクロリデート、トリエチルアミン、およびトリアゾールからインサイチュで調製される。ベンゼンスルホニルテトラゾールはまた、ピリジン、ベンゼンスルホン酸、およびトリエチルアミンからインサイチュで調製された。この一連の反応、続く支持体からの切断および脱保護の反復は、式Ｉの化合物を生じる。ＲがC_1-4アルキルである式Ｉの化合物は、DMT-保護化合物をC_1-4アルキルエーテルで置換することにより調製される。ＲがP(O)(O)-置換アクリジンである式Ｉの化合物はまた、以下の公開された手順により調製される：U．AsselineおよびN.T．Thuong、30(19)Tet. Letters 252 1-2524(1989)C.A．Steinら、72 Gene 333-341(1988)。これらの公開された手順は、ヌクレオシドホスホルアミダイト保有アクリジン誘導体の合成を含み、これは次いで、支持体に付着された2,2'-ジチオジエタノールと反応される。次いで、鎖伸長は、上記のように、自動化固相DNA合成機上で実施される。これらの公開された手順はまた、置換9-(3-ヒドロキシプロピル)アミノアクリジンをN-エチルジイソプロピルアミン、続いて塩化N,N-ジイソプロピルメチルホスホンアミドと反応させることによるヌクレオシドホスホルアミダイト保有アクリジン誘導体の合成を含む。自動化DNA合成機を使用して、ＲがP(O)(O)-置換アクリジンである式Ｉの化合物が、アセトニトリル中のアクリジニルホスホルアミダイトを使用する合成の追加の回により調製される。式Ｉの化合物は、適切な薬学的投薬形態（例えば、カプセル剤、錠剤、または注射可能な調製物）中に組み込まれ得る。固体または液体の薬学的キャリアが使用され得る。固体キャリアとして、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸が挙げられる。液体のキャリアとして、シロップ剤、ピーナッツオイル、オリーブオイル、生理食塩水、および水が挙げられる。リポソーム、ウイルスベクター、およびタンパク質結合体調製物もまた、キャリアとして使用され得る。同様に、キャリアまたは希釈剤は、例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートのような任意の持続放出物質を単独で、またはワックスとともに含み得る。固体キャリアの量は広範に変化し得るが、好ましくは、投薬単位あたり約25mg〜約1gである。液体のキャリアが使用される場合、調製物は、シロップ剤、エリキシル剤、エマルジョン、軟ゼラチンカプセル剤、アンプルのような滅菌の注射可能な液体、または水溶性もしくは非水溶性液体懸濁物の形態である。液体のキャリアが使用される場合、生理食塩水溶液またはリン酸緩衝化生理食塩水溶液が最も頻繁に使用される。薬学的調製物は、薬学的化学者の従来技術（混合すること、必要であれば、錠剤の形態に顆状化および圧縮すること、または所望の経口用または全身用産物を得るために、適切なように、混合すること、濾過すること、および成分を溶解することを含む）に従って生成される。本発明の式Ｉの化合物の用量（上記のような薬学的投薬単位中）は、1ng/kg〜 500mg/kg（好ましくは1mg/kg未満）の活性化合物の範囲から選択される、意図した効果を生じる非毒性の量である。選択された用量が、AGTの発現の阻害を必要とするヒト患者に、１日に１〜６回またはそれ以上で、経口、経直腸的に、注射または連続的な注入によって投与される。経口処方物は、一般に、胃での分解の影響を克服するためにいくらか多い投薬を必要とする。静脈内または動脈内投与が、一般に最少用量を必要とする。なぜなら、薬物が全身的な循環に直接置かれるからである。従って、用量は、投与の実際の経路に依存する。末梢投与は、本発明者らは、経口または中枢投与（脳への）を除く任意の他の送達経路を意図する。本発明のオリゴヌクレオチド化合物の、動脈（頚動脈）、静脈（ラットの尾静脈、またはヒトの腕の静脈）、あるいは腹膜内（哺乳動物において）を介する末梢投与は、Tomitaら（前出）におけるように、肝静脈または動脈への注射のために腹腔を外科的に切開することを伴わずに肝臓への送達を可能にする。以下の実施例は、式（Ｉ）の化合物およびそれらの調製を示す。この実施例は、先に定義され、そして以下で請求される本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明は、アンギオテンシノゲンタンパク質の産生を妨げるアンギオテンシノゲンmRNAの領域に結合するオリゴヌクレオチド化合物に関する。これは、高血圧の発症および維持に関与する。リポソームのような薬学的キャリアにアンチセンス分子をカプセル化することによって、体内のアンギオテンシノゲン産生の主要な部位である肝臓への、直接的なアンチセンス分子の送達を標的化する方法において使用され得る組成物を得ることが可能である。肝臓の標的化はまた、アンチセンス分子をウイルスベクターおよびタンパク質結合体でパッケージングすることによって達成され得る。本発明の化合物および組成物は独特である。なぜなら、アンギオテンシノゲンの作用を特異的に阻害する試薬が市販されていないからである。さらに、アンチセンス分子の化学的性質に帰因して、その作用は高く特異的であり、従来の抗高血圧剤よりも潜在的に少ない副作用を伴う、少用量の投与を可能にする。本発明のリポソームカプセル化オリゴヌクレオチド化合物は、自然発症性高血圧症のラットのアンギオテンシノゲンmRNAを阻害するためには、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを使用することが示された。ラットmRNAの配列が、Oh kuboら、80 PNAS USA 2196-2200（1983）の図３に開示される。本発明の１つのバージョンは、ラットアンギオテンシノゲンmRNAの-5〜+13塩基の領域に相補的に合成された18塩基のオリゴマーであり、これは、翻訳開始コドンAUGを含む。このオリゴマーは、以下の塩基配列から構成される：5'-CCGTGGGAGTCATCACGG-3' （配列番号２）。ホスホロチオエート化骨格の改変は、ヌクレアーゼ耐性を付与するために、各塩基上に含まれ得る。本発明の組成物は、好ましくは、薬学的送達系にカプセル化されたアンギオテンシノゲンmRNAに結合し得る新規のDNA配列を含み、これは、アンギオテンシノゲン産生の主要な部位である肝臓に直接送達されたASODNを生じる。アンチセンスオリゴヌクレオチドのウイルス抗原改変体は必要ではない。リポソーム（80％ホスファチジルコリン、20％コレステロール）は、脂質膜の乾燥および再水和のためのロータリーエバポレーター装置を使用して調製される。リポソームは、アンチセンス分子の捕捉を促進する複数回の凍結解凍サイクルに供され、次いでそれらのサイズを小さくするために押し出し形成機（0.1μmのフィルター）を通過させられる。次いで、力学的な光散乱によってサイズが決定され得る。リポソームカプセル化された生物学的に活性な化合物を生成する種々の方法のさらなる詳細については、米国特許第4,311,712号；同第4,370,349号；号；同第4,963,362号；同第5,264,221号；同第5,417,978号；および同第5,422,1 20号を参照のこと。末梢送達を容易にすることと同様に、リポソームカプセル化は、アンチセンス分子の細胞性取り込みを容易にし、増大した送達効率を生じる。これは、血流にアンチセンス組成物を末梢的に投与すること、および予め試験した時に生理学的応答が生じなかった用量で生理学的応答を得ることを可能にする（Gyurkoら、およびWielboら、前出を参照のこと）。一旦アンチセンス分子が細胞内に侵入すると、これは、アンギオテンシノゲンmRNAの標的領域に結合してmRNA/DNA二本鎖を形成する。この二本鎖の形成は、リボソーマルサブユニットのアセンブリおよび続くタンパク質メッセージの読み取りを妨げるように作用し、それにより、アンギオテンシノゲン産生を阻害する。アンチセンス分子のホスホロチオエート化形態はヌクレアーゼ耐性を増強されており、そして二本鎖部分のmRNAを切断する酵素であるRNase Hの作用をさらに刺激し、続いて、アンチセンス分子を遊離させて別の標的mRNAに結合させる。本発明者らは、高血圧の動物モデルにおいて、高血圧が、アンギオテンシノゲンを標的化するリポソームカプセル化アンチセンスDNAフラグメントを含む組成物の、単回の動脈内用量を用いて低減され得ることを示した。生理学的応答を誘発し得ることと同様に、本発明者らはまた、血圧の低下時の末梢中でのアンギオテンシンIIの続く減少を示す生化学的データを生成し得た。本発明者らの以前の研究は、高血圧の動物の脳へのアンチセンス分子の単回用量がまた、７日目まで血圧を低下させることもまた示した。本発明者らは以前に、自然発症性高血圧症のラットの脳に直接投与された、アンギオテンシノゲンmRNAを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの50μg の単回用量が、延長した時間にわたって高血圧の有意な、そして十分な低減を生じることを示した。以下の図面は、高血圧のラットの肝臓中のアンギオテンシノゲンを標的化するリポソームカプセル化アンチセンス分子の生理学的効果を示す。使用され得る別の送達系はウイルスベクターである。図６は、神経腫-神経膠種脳腫瘍細胞株における１型アンギオテンシンIIレセプターの発現におけるウイルスベクターアンチセンス送達系の効果を示す。この研究において、アンチセンス（完全長のタンパク質配列）が１型アンギオテンシンIIレセプターのmRNAを標的化した。細胞は、以下のウイルスベクターの取り込みを増強させるために有用な試薬であるトランスフェクタム（transfectam）のいずれかで処理された：空のmockプラスミドウイルスベクター；paAT、アンチセンス配列を含むアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター；およびpaAT＋Ad、アンチセンスならびにアンチセンスmRNAの発現を駆動するAAVのp40プロモーターを増強するアデノ随伴ウイルスのためのヘルパーウイルスを含むアデノ随伴ウイルスベクター。実質的に減少したレセプター結合は、paAT＋Ad処理した細胞において観察された。このことは、mR NA発現がpaAT＋Ad処理で減少されたことを示す。本発明で用いられ得る別の送達系は、タンパク質結合体オリゴヌクレオチド組成物である。この技術は、肝臓特異的アシアロ糖タンパク質レセプターにより認識されるDNA−タンパク質複合体の構築に基づく。ホスホロチオエート化アンチセンスとのポリ(1-リジン)-アシアロオロソムコイド（ASoR）タンパク質結合体との結合は、肝臓における細胞内取り込みを容易にし得る。結合体は、遺伝子の細胞中への送達のためのレセプター媒介細胞内機構を用いる。特異的レセプターリガンド（例えば、DNAタンパク質複合体を形成する、ポリリジンに対するアシアロオロソムコイドまたはトランスフェリン）を共有結合することにより、細胞特異的表面レセプターを標的化することおよびアンチセンスDNAを細胞に貫通させることが可能になっている。Bunnellら、18 Somatic Cell Molec. Gen. 559- 569(1992)を参照のこと。実施例１図１は、標的アンチセンス分子（配列番号２）の選択された標的であるラットタンパク質アンギオテンシノゲンに対する特異性を示す。これらの実験では、標的タンパク質の転写および翻訳を、アンギオテンシノゲンに対する相補的DNA（c DNA）を用いてインビトロで実施した。インビトロ反応を、アンチセンス分子およびスクランブル化もしくはセンスコントロールオリゴヌクレオチド分子の存在下または非存在下で実施した。これらのインビトロ反応は、本発明のオリゴヌクレオチドがヒトアンギオテンシノゲンの発現を阻害する能力を評価するために用いられ得る。データは、コントロール反応と比較したアンギオテンシノゲンの発現％として示す。用量応答研究を、30μＭオリゴヌクレオチド〜0.3μＭオリゴヌクレオチドの範囲を包含するようにして実施した。より高いアンチセンス用量（３〜30μ Ｍ）では、アンギオテンシノゲンの発現は、コントロールの約５〜10％に減少した。しかし、アンギオテンシノゲン発現の非特異的減衰はスクランブル化およびセンスオリゴヌクレオチドで観察され、これは、文献において最近記載された現象である。この点において、Tomita（前出）では、15μMol/Lの用量で見られる応答の程度は、この現象に最も起因するようであるとしている。より低いオリゴヌクレオチド用量（0.3〜１μＭ）では、アンチセンスの存在下で行われた反応は、アンギオテンシノゲン産生の顕著な減衰を示し（45％）、スクランブル化オリゴヌクレオチドでの非特異的減衰は見られなかった。このことにより、低用量で、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、インビトロでのアンギオテンシノゲンの翻訳を顕著かつ特異的に減衰することが示唆される。実施例２図２ａおよび２ｂは、50μｇの(a)非カプセル化蛍光標識アンチセンス（配列番号２）または(b)リポソームカプセル化蛍光標識アンチセンス（配列番号２）の頸動脈への直接注入の１時間後のラット肝組織の２つの共焦点顕微鏡写真を示す。顕微鏡写真(a)は、肝組織内に蛍光シグナルの分布がほとんどまたは全くなかったことを示す。顕微鏡写真(b)は、組織全体に強度にかつ均等に分布された蛍光シグナルが存在することを示す。これにより、リポソームカプセル化は、標的器官へのアンチセンスの送達を容易にすることが示される。リポソームカプセル化mRNA（肝臓アンギオテンシノゲンmRNAに対して標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド）を含む動脈内末梢投与組成物への生理的応答を実証するために、雄の自然発症性高血圧症ラット（250〜275ｇ）の群を、頸動脈を介してカテーテル挿入し、そして24時間放置して手術から回復させた。次いで、基底平均動脈圧（MAP）を、留置動脈カテーテルに連結した直接血圧変換器を介して測定した。単回50μg用量のリポソームカプセル化(25mg脂質)アンチセンスオリゴヌクレオチド（AS/L）またはリポソームカプセル化スクランブル化オリゴヌクレオチド（Scr/L）または空リポソーム（25mg脂質）（Lipo）、あるいは50μg非カプセル化アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASDON）を含む組成物を頸動脈を介して投与した。24時間後、平均動脈圧を測定して血圧変化を決定した。実施例３本実施例は、自然発症性高血圧症ラットにおけるリポソームカプセル化ASDON （配列番号２）の平均動脈圧（MAP）に対する効果を実証する。ラット群において、基底MAPを樹立した。次いで、50μgのリポソームカプセル化(25mg脂質)ASDO N（AS/L）；リポソームカプセル化Scr0DN（Scr/L）；空リポソーム（25mg）（Li po）；または50μg非カプセル化ASDONを動脈内投与した。図３は、各処理24時間後に観察された血圧変化を示す。平均動脈圧はリポソームカプセル化アンチセンス組成物で処置した群において有意に減少した（-24.66mmHg±2.43）。しかし、 Scr/L（1.34mmHg±3.98）；Lipo（-5.34mmHg±3.71）；またはASDON（-6.02mmHg ±8.68）処置群においては、有意な血圧変化は観察されなかった。結果を平均± SEM，ｐ＜0.013、ｎ＝６／群として表す。本データは、リポソームカプセル化アンチセンス(AS/L)を含む末梢投与組成物は、高血圧症のSHRモデル（ヒトにおいて生じることの推定となる）における高血圧症血圧を減少させるという概念を支持する。生化学的変化を決定するために、動物群（ｎ＝３／群）を処置の24時間後に屠殺し、そして血漿アンギオテンシンIIレベルを放射免疫アッセイにより測定した。図４は、投与24時間後の血漿アンギオテンシンIIレベルに対するリポソームカプセル化アンチセンス（AS/L）処置の効果を示す。実施例４本実施例は、アンギオテンシンIIに対するリポソームカプセル化ASDON（配列番号2）の効果を実証する。動物群（ｎ＝３／群）を処置の24時間後に屠殺した。血漿アンギオテンシンIIレベルを放射免疫アッセイにより測定した。図４に示すように、アンギオテンシンIIは、以下のコントロールに比較してリポソームカプセル化ASDON（AS/L）処置ラット（30.3±11.4pg/mL、ｎ＝５）において有意に低かった：リポソームカプセル化ScrODN（Scr/L）（103.1±33.2pg/mL、ｎ＝３）；空リポソーム（Lipo）（233.5±71.1pg/mL、ｎ＝３）；および非カプセル化AS DON（201.4±88.5pg/mL、ｎ＝３）、p<0.05。本データにより、アンチセンス効果は、提唱された作用機構を介して媒介されることが示唆され、アンギオテンシノゲン産生の減衰は血漿アンギオテンシンIIの引き続く減少を伴う。実施例５本実施例は、リポソームカプセル化ASODN（配列番号２）の血漿AGTに対する効果を実証する。動物を処置の24時間後に屠殺し、そして血漿AGTレベルを放射免疫アッセイにより測定した。図５に示すように、AGTは、以下のコントロールに比較してリポソームカプセル化ASDON（AS/L）処置ラット（58.5±3.71pg/mL、ｎ＝５）において有意に低かった：リポソームカプセル化ScrODN（Scr/L）（79.0 ±8.72pg/mL、ｎ＝３）；空リポソーム（Lipo）（85±5.72pg/mL、ｎ＝３）；および非カプセル化ASDON（77.8±3.25pg/mL、ｎ＝３）、p<0.05。リポソームは、水性相がリン脂質分子の膜中に封入される薬物小胞である。これは、脂質が水性媒体中に分散された場合自然に形成する。これらの小胞は、ナノメートルからミクロンまでのサイズ範囲であり、そして水性区画中および膜内の両方で大量の物質を捕獲するように構築され得る。標的化された薬物送達の進歩は今や、薬物分子の保護を改善するリポソームカプセル化、持続放出、およびより効率的な細胞取り込みを可能にする。ホスファチジルコリンリポソームは、オリゴヌクレオチドの効率的なキャリアであることが示され、細胞取り込みの効率を増大させ、そしてまた、培養培地におけるオリゴヌクレオチドの安定性を増大させる。カチオンリポソームは、静電相互作用を介したリポソーム表面における負に帯電されたオリゴヌクレオチドの複合体化に起因して、細胞取り込みにおいて特に効率的であることが示されている（Ahktar，S.およびJuliano，R．L.，Trends i n Cell Biology 2:139-144，1992）。この研究において、本発明者らは、AGT分泌Hepatoma細胞株を使用して、カチオンリポソームに結合された単独の18マーAG Tアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その送達および細胞取り込みを増強し、それにより、低用量で、かつ用量依存様式でアンギオテンシノゲン産生を阻害するという仮説を試験した。以前の研究では、本発明者らは、高用量の裸のASODN でインビトロおよびインビボでの標的タンパク質産生を首尾良く減少したが、本発明者らは、標的mRNAにおいては減少を観察しなかった。従って、タンパク質阻害の機構および特異性に関して疑問が残る。材料および方法（実施例６〜９）アンチセンス合成： Ohkuboにより確立されたAGT配列を用いて（Ohkubo，Hら、Proc．Natl．Acad.S ci．USA80:2196-200，1983）、18マーASDON鎖を、アンギオテンシノゲンmRNAの- 5〜+13塩基配列、5-CCGTGGGAGTCATCACGG-3'（配列番号２）に対して合成した。この領域は、AUG翻訳開始コドンを含む。コントロールのスクランブル化ODN（Sc rODN）は、ASODN鎖と同じ塩基組成であるが、無作為な順序である。これらのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート化により修飾されている。ODNは、DNA Synthesis Laboratory，University of Floridaにおいて合成した。全てのオリゴヌクレオチド配列を、関連タンパク質との相同性について、National Center for Biotechnology Information BLASTネットワークサーバーおよびGenebankデータプログラムを介して調べた。リポソーム合成：ジメチルジアクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DPOE）（2:5、w/w）（Avanti Polar Lipids In c.，Alabaster，Alabama）からなるカチオン性リポソームを30mLのクロロホルムに溶解し、そして溶媒を減圧下で55℃で加熱することにより蒸発させた。脂質を１mLの滅菌脱イオン水中に再懸濁し、そして溶液がほぼ清澄になるまで氷上で超音波処理することによりリポソームを調製した。次いで、ASODNまたはScrODNを添加して１μMの濃度を得た。ODS/カチオン性脂質の-/+変化率は0.18であった。これは正味の正電荷をODN-リポソーム結合体に与えて細胞膜とODN-リポソーム結合体との間の融合を可能にする。用量応答研究のために、５つの異なるオリゴヌクレオチド濃度を異なる濃度のDDABで調製して、ODS/カチオン性脂質複合体を同じ-/+電荷比で作製した。細胞培養： H-4-II E、肝ガン、Reuber H35ラット細胞をATCCより購入した（Rockville，M aryland）。細胞を、単層培養で、10％ウシ胎児血清、10％仔ウシ血清を補充した12mLのイーグル最小必須培地（EMEM）中で増殖させ、そして95％空気−５％CO₂ で37℃にてインキュベートした。培養物に毎日栄養補給し、そしてコンフルエントである場合、1.0mLの0.25％トリプシン-EDTAを使用して、1:6の比で継代した。細胞を10cmのペトリ皿上で実験まで増殖させた。次いで、培養物をEMEMで洗浄して血清補充培地をすべて除去し、次いで変化する濃度のオリゴヌクレオチドまたはリポソーム複合体化オリゴヌクレオチドおよびコントロール処理物で処理した。アンギオテンシノゲンアッセイ：培養培地の500μlのアリコートを乾燥するまで蒸発させた。乾燥サンプルを、 Serniaの直接ラジオイムノアッセイ法（Sernia，C.,ら、Neuroendocrinology 55 :308-316，1992）によりアンギオテンシノゲンについてアッセイした。AGTサンプル含有量を、サンプルの培地と同一の細胞培養培地で希釈した純粋なラットAG Tの標準曲線から算出した。アッセイ感度は0.3ng/チューブであり、そしてアッセイ間およびアッセイ内の可変度はそれぞれ14％および９％であった。ノーザンブロット：ノーザンブロット分析をChomczynskiおよびSacchiの方法（Chomczynski，P.およびSacchi，N.、Anal．Biochem．162:156-9，1987）により行い、そして濃度測定方法により定量した。細胞をメルカプトエタノールを使用して溶解し、次いで RNAをグアニジウムチオシアネートでの処理、続くフェノール-クロロホルム抽出により抽出した。RNAを20℃のイソプロパノールにより沈澱させた。遠心分離後、 RNAの量を分光学的に算出した。RNAの20μgのアリコートを、アガロースホルムアルデヒドゲル上で、25Ｖで16時間、電気泳動した。mRNAの十分な分離をRNAラダーおよびエチジウムブロミド染色を使用して観察した。RNAを、ノーザンブロットによりナイロンメンブレンに移した後、４時間で56℃、１×デンハルトSSPE 溶液（５×SSPE、0.1％SDSおよび50％ホルムアミド）でプレハイブリダイゼーションした。溶液はまた、250mg/mLの変性サケ精子DNAを含んだ。ハイブリダイゼーションを、特定のmRNA配列に対する標識リボプローブを用いて同じ条件下で行った。洗浄工程後、メンブレンをＸ線フィルムに曝し、次いで現像した。メンブレンをカテプシンＤ mRNAについて再プローブすることにより標準化した。統計学的分析：統計学的分析を処理効果についてのANOVAにより行ない、そしてDuncanの多範囲試験を個々の比較のために使用した。個々の時点のラジオイムノアッセイデータをステューデントの独立Ｔ検定により分析した。Ｐ＜0.05が統計学的に有意であると考えられる。肝ガンH4細胞培養でのアンギオテンシノゲン産生およびアンギオテンシノゲンmR NAの発現におけるASODNのインビトロ効果の決定。 H4肝ガン細胞培養物をコンフルエンスになるまで増殖させ、次いでカチオン性リポソーム結合ASODNおよびScrODN（１μＭ）または１μＭの裸のASODNもしくはカチオン性脂質コントロール溶液で処理した。培養物を24時間インキュベートした。培地の上澄みを除去し、AGTアッセイのために100μlのアリコートを採取した後、細胞をペトリ皿から回収した。２つの処理プレートを合わせて十分な細胞にし、mRNAを抽出し、そしてノーザンブロットにより分析してAGT mRNAレベルを決定した。ノーザンブロットを濃度測定により定量した。培地のアリコートを凍結乾燥し、RIAによりAGTレベルについてアッセイした。６つの100mmプレートを、各サンプルのアッセイのために合わせた。肝ガンH4細胞培養におけるカチオン性リポソーム結合ASODNの用量応答の関係。 H4肝ガン細胞培養物をコンフルエンスになるまで増殖させ、次いで次の濃度のカチオン性リポソーム複合体化ASODNで処理した：０、0.01、0.05、0.1、0.5および1.0μＭ。コントロールグループは、-/+のASODN脂質比を維持するために必要な量内の漸増量のカチオン性脂質からなった。ODN／カチオン性脂質は0.18である。培養物を24時間インキュベートした。培地の上澄みを除去し、AGTアッセイのために100μlのアリコートを凍結乾燥し、そしてRIAによりAGTレベルについてアッセイした。培地の採取後に細胞をペトリ皿から回収し、２つの処理プレートを合わせて十分な細胞にし、mRNAを抽出し、そしてノーザンブロット分析により分析してAGT mRNAにおけるASODN用量効果を決定した。ノーザンブロットを濃度測定法により定量した。実施例６カチオン性リポソーム複合体化ASODNおよびコントロール処理物のmRNA発現における効果を決定するために、細胞培養物を、１μＭのカチオン性リポソーム複合体化ASODN、複合体化ScrODN、カチオン性リポソームおよび１μＭの裸のASODN で処理した。図７ａは、AGT(1.9Kb)およびコントロール遺伝子であるカテプシン (2.1Kb)についてのノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す。サンプル１〜５は以下の処理に対応した：１．裸のアンチセンス（ASODN）；２．空のカチオン性リポソームコントロール（CL）；３．カチオン性リポソーム複合体化ScrO DN（Scr/CL）；４．カチオン性リポソーム複合体化ASODN（AS/CL）および５．未処理コントロール（CTRL）。図７ｂは、未処理コントロール細胞のAGT発現と比較した、処理後のAGT mRNA発現の相対強度に対応する。発現はコントロールパーセントで表す。裸のASODN（ASODN）で処理した細胞は、70％に減少したAGT発現を有するようであった。複合体化していないリポソーム（CL）およびリポソーム複合体化ScrODN（Scr/CL）のコントロール処理は、基底レベルからわずかな変化（約90％の発現）を生じた。しかし、リポソーム複合体化ASODN（AS/CL）で処理した細胞は22％の発現を示すのみである。実施例７肝ガンH4細胞培養でのAGT産生におけるASODNの効果を決定するために、細胞培養物を前述のように処理し、そして培養培地をRIAを使用してAGTタンパク質レベルについて分析した。図８は、コントロールおよびASODN処理後に肝ガン細胞培養により産生されたAGTの量を示す。このグラフは、AGT産生におけるカチオン性リポソーム複合体化ASODNの効果を示す。細胞を、１μＭのASODNとともに、カチオン性リポソームおよび適切なコントロールの存在または非存在下でインキュベートした。未処理コントロール（CTRL）において、基底AGTレベルは52.0±2.46n g/mLであった。空のリポソーム（CL）およびリポソーム複合体化Scr0DN(Scr/CL) コントロールグループでは、AGT産生において、基底レベルからの有意な減少は存在しなかった（それぞれ、45.53±5.9ng/mL；47.03±6.9ng/mL；n=3）。裸のA SODNおよびカチオン性リポソーム複合体化ASODN（AS/CL）で処理した細胞は、基底レベルから有意に減少したAGTレベルを有した（それぞれ、30.2±3.Ong/mL，n =3,^*=P<0.05および5.61±0.95ng/mL；n=3，^**=P<0.01）。実施例８次いで、肝ガンH4細胞培養におけるカチオン性リポソーム複合体化ASODNの用量応答の関係について行なった。図９ａおよび９ｂは、送達メカニズムとしてカチオン性リポソームを使用したAGT mRNAの用量依存な減少を示す。図９ａは、AG Tおよびコントロール遺伝子であるカテプシンＤについてのノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す。サンプル１〜５は、カチオン性リポソームのみで処理した細胞の代表的なブロットを示す。各オリゴヌクレオチド濃度は、処理あたりのリポソームの濃度がオリゴヌクレオチド濃度のそれぞれの増加とともに比例して増加するように、複合体化していないリポソームの別のコントロールに付随した。サンプル６〜10は、0.01、0.05、0.1、0.5および1.0μＭのカチオン性リポソーム複合体化ASODNで処理した細胞に対応する。サンプル11は、未処理コントロール細胞におけるAGT mRNAの発現を示す。これは、ASODN処理試験後の減少の比較のためのAGTの基底発現として使用される。図９ｂは、コントロール処理サンプルと比較した、mRNAの相対的な発現を表す。コントロールカチオン性リポソームで処理した細胞の平均発現は92％であった。0.01および0.05μＭのASODN で処理した細胞は、約92％の発現を有した。これは、コントロールカチオン性リポソーム処理物と類似した。より高用量のASODN（0.1、0.5および１μＭ）では、発現は、用量依存様式で、コントロール発現の60％、56％および24％までそれぞれ減少した。各処理後のカテプシンＤ mRNAの発現においては変化は観察されなかった。実施例９図10は、ASODNのカチオン性リポソーム送達の後のAGTタンパク質における用量依存性減少を示す。さらに、各オリゴヌクレオチド濃度を、別のコントロールの複合体化していないリポソームに付随させた。１処置あたりのリポソーム濃度が増加するのに比例して、オリゴヌクレオチド濃度はそれぞれ増加した。AGTタンパク質の基底レベルは、未処置コントロールにおいて51.77±3.7ng/mLであった（ｎ＝３）。空のカチオン性リポソームを用いると、基底AGT産生に変化は観察されず、平均AGTレベルは各漸増用量について48.5ng/mLであった。・RNAレベルの減少と一致して、ASODNの低用量（0.01μMまたは0.05μM）では、AGTの有意な減少は観察されなかった。AGTタンパク質レベルはそれぞれ47.6±7.4および40.2 9±4.0ng/mLであったが、減少傾向は明らかであった。0.1、0.5、および0.1μM ASODNでは、タンパク質レベルは、用量依存性様式で基底レベルから有意に減少した。AGTタンパク質レベルは、26.86±5.3；23.27±6.1、および5.67±0.3ng/m L（１群あたりｎ＝３）；^★＝ｐ≦0.05および^★★＝ｐ≦0.01であった。実施例６〜９の議論広範囲の生物学的系においてアンチセンス技術を用いて首尾良い標的タンパク質の減衰が達成されているが、アンチセンス治療の開発はかつて予測されたほどスムーズではない。標的部位への分子の送達において、問題に遭遇している。AS ODN分子の細胞取り込みは特異的レセプター相互作用またはレセプター媒介性工ンドサイトーシスを通してであると考えられる（Morishita，R.ら，上記，1993; Loke，S.L．ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3474−3478，1989;Temsamani，J. ら，Antisense Research and Development 4:35-42，1994;Wickstrom，E.，Tren ds-Biotechnol.，10(8):281-7，1992）が、一般に、取り込み効率は、細胞に侵入するASODNで２％程度、そしてトランスフェクトされた細胞で１％程度と乏しい（Ahktar，S.およびJuliano，R．L.,前出，1992）。生存細胞により取り込まれる裸のオリゴヌクレオチドの量は、１〜10％の範囲であり、トランスフェクション率は、細胞のタイプにより変わり得る。リポソーム送達系は、アンチセンスが分解されるのを防ぐこと、およびアンチセンス分子を細胞の極近くに運んでそれにより取り込みプロセスを促進することにより、ASODNの細胞取り込みを促進し、そしてその効率を増加させることが示されている。特に、カチオン性リポソームは、取り込み効率を30％まで増加させることが示されている（Lappalaine n，K.ら，Biochimica et Biophysica Acta 1196:201-208，1994）。結果として、カチオン性リポソームの推測された増強送達および細胞トランスフェクションによって、本発明者らは、AGTタンパク質およびmRNAレベルが、結果的に減少すると推測した。上記のデータは、カチオン性リポソームが、アンギオテンシノゲンmRNAに標的化されたアンチセンス分子についての効率的な送達系であることを示唆する。本発明者らのデータは、１μMの用量で、リポソーム複合体化ASODNが、裸のASODN 単独よりも大いに、標的タンパク質およびmRNAを特異的に減少させることを示す。これらの観察は、リポソーム複合体化ScrODNまたはコントロールカチオン性脂質で標的タンパク質の有意な減少が観察されていないので、標的mRNAの特異的阻害に起因し得る。さらに、リポソーム複合体化ASODNの同一用量はまた、基底レベルからの標的mRNAの有意な減少をもたらした。このことは、オリゴヌクレオチド作用のモードが、RNase Hの刺激を通してであり得ることを示唆する。この酵素は、mRNA-DNA二本鎖を基質として認識し、その後に二重鎖のmRNA部分を分解する。これ故に、この特定のオリゴヌクレオチドが翻訳プロセスおよびAUG開始コドンでのリボソーム結合を阻害するように設計されたにもかかわらず、アンギオテンシノゲンmRNAの減少が観察された。興味深いことに、裸のASODN処理の後にmRNA発現が基底レベル未満（しかし有意ではない）であったにもかかわらず、本発明者らは、裸のDNAは、カチオン性リポソーム複合体化ASODNほど大いにではないが、AGTタンパク質レベルを有意には減少させることを観察した。この観察は、おそらく、カチオン性リポソームが、実質的な量のリポソーム／オリゴヌクレオチド表面結合をもたらす、負に荷電したオリゴヌクレオチドおよび脂質のカチオン性荷電による、オリゴヌクレオチド送達の増大をもたらすことによる。本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な細胞送達は、タンパク質減衰の有効性を得る際の重要なことがらであること、およびこのような送達はリポソーム送達系の使用を通して促進され得ることを結論した。カチオン性リポソームは、細胞培養におけるオリゴヌクレオチドの送達効率を、細胞内ASOD Nレベルが標的タンパク質および標的mRNAの両方の減衰を誘起する程度まで実質的に増加させるために利用され得る。この送達系は、ウイルスベクター送達または標的化細胞送達の必要性を伴ずに、活性についてのASODNの十分な細胞内レベルを可能にする、基本的ASODN特性の決定のための簡単なアプローチを提供する。実施例10 本研究において、約８週齢まで正常血圧である幼児SHラットに、単回用量（50 μgオリゴ）のリポソームカプセル化オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドの塩基配列は配列番号２による）を、尾静脈を通して週に１回４週間にわたって注射した。これは、離乳後に４週齢〜８週齢で行なった。８，12、および18週間目に、それらの血圧を、テイルカフ（tail cuff）方法を用いて間接的に測定した。８週齢では、リポソームアンチセンス処置ラットは、126.2mmHg±7.49の血圧を有した。これは、コントロール処置群より有意に低かった（Ｐ＜0.05）。この血圧の低下により、正常血圧の範囲内で血圧が維持されたが、コントロール群は、高血圧症の範囲の血圧を有した。最後のASODN−リポソーム処置の８週間後の12週齢目では、動物は、依然として、コントロール処置群と比較して低い血圧を有した。この低下した血圧はコントロール群よりも有意に低いわけではなく、そして依然として高血圧症の範囲にあるとはいえ、傾向は明らかであったし、そして有意性はおそらくサンプル数を増加することにより達成され得る。18週齢目では、全ての群のラットは、高血圧症の範囲の血圧を有した。従って、幼児ラットの重要な成長段階の間のリポソームカプセル化アンチセンスの投与は、一時的にだが有意に高血圧症の発達を減衰させ得る。この減衰の持続期間は、おそらく、ASODNの投薬頻度または量を増加させることにより延長され得る。この減衰化は、侵襲的手術の必要性なく、単純な静脈投与により達成され得る。本発明は特定の好ましい実施態様を参照して記載してきたが、他の改変が可能である。例えば、本発明は、アンギオテンシノゲンmRNAの特定のセグメントにおける各ヌクレオチドについて相補性を欠くオリゴヌクレオチド化合物を含む。ただし、このような化合物は、その発現を阻害するために、AGT mRNAに十分な結合親和性を有する。これに関して、実施例６〜９（上記）の材料および方法は、特定のオリゴヌクレオチドがアンギオテンシノゲン発現を阻害する際に有効であるかを決定するために有用である。明らかに、上記の方法は、ヒトアンギオテンシノゲンの阻害について特定の化合物を評価する際に改変される。例えば、ヒト細胞（例えば、ヒト胚細胞株またはヒト肝ガン細胞株）は、細胞培養に使用され得る。また、本発明は、オリゴヌクレオチド化合物の混合物を含むことが意図され、各化合物は、アンギオテンシノゲンmRNAに結合し得る。従って、請求の範囲の範囲は、本明細書中の好ましいバージョンの特定の例に制限されない。むしろ、請求の範囲は、本発明の完全な範囲を判断するために熟視するべきである。産業上の利用性本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドは、アンギオテンシノゲンの発現を阻害して、それによりアンギオテンシノゲン誘導性高血圧症を制御するために有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．アンギオテンシノゲンの発現を阻害するために有用な薬学的組成物であって、リポソーム処方物および以下の式：によって示されるオリゴヌクレオチドまたは薬学的に受容可能なその塩または水和物を含有し、ここで、各Ｘは、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＣ₁ _〜4アルキルであり；各Ｂは、独立して、存在する場合にヒトアンギオテンシノゲンをコードするセンスmRNA鎖に該オリゴヌクレオチドが結合し、それによってその翻訳を阻害するように選択される、アデニン、グアニン、シトシン、またはチミンであり；各Ｒは、独立して、ＨまたはＣ₁ _〜4アルキルまたはＰ(O)(O)置換アクリジンであり；各Ｙは、独立して、ＨまたはOHであり；そしてｎは８〜23である、薬学的組成物。２．前記オリゴヌクレオチドが、ヒトアンギオテンシノゲンをコードするセンス mRNA鎖に対してアンチセンスであるように、Ｂが選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。３．前記オリゴヌクレオチドが、AUG開始コドンを含むmRNA塩基領域に結合するように、Ｂが選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。４．前記オリゴヌクレオチドが、mRNA-5〜+13塩基領域と重複し、そしてAUG開始コドンを含む領域に結合するように、Ｂが選択される、請求項３に記載の薬学的組成物。５．前記オリゴヌクレオチドが、AUG開始コドンを含むmRNA-5〜+13塩基領域に結合するように、Ｂが選択される、請求項３に記載の薬学的組成物。６．前記オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１に従うように、Ｂが選択される、請求項５に記載の薬学的組成物。７．前記リポソーム処方物がカチオン性リポソーム処方物である、請求項１に記載の薬学的組成物。８．ヒトにおける高血圧症を処置するための方法であって：被験体に請求項１に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。９．ヒトにおける高血圧症を処置するための方法であって：被験体に請求項３に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。１０．ヒトにおける高血圧症を処置するための方法であって：被験体に請求項４に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。１１．ヒトにおける高血圧症を処置するための方法であって：被験体に請求項５に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。１２．ヒトにおける高血圧症を処置するための方法であって：被験体に請求項６に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。１３．ヒトにおける高血圧症を予防するための方法であって：被験体に請求項１に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。１４．ヒトにおける高血圧症を予防するための方法であって：被験体に請求項３に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。１５．ヒトにおける高血圧症を予防するための方法であって：被験体に請求項４に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。１６．ヒトにおける高血圧症を予防するための方法であって：被験体に請求項５に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。１７．ヒトにおける高血圧症を予防するための方法であって：被験体に請求項６に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。