JP2000506866A - アンギオテンシノゲンmRNAに標的化されたオリゴヌクレオチド - Google Patents
アンギオテンシノゲンmRNAに標的化されたオリゴヌクレオチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
ヒト被験体に投与されて、アンギオテンシノゲンの発現を阻害し、それによってアンギオテンシノゲン誘導性高血圧症を調節し得る、オリゴヌクレオチド、およびその組成物が開示される。
Description
【発明の詳細な説明】
アンギオテンシノゲンmRNAに標的化されたオリゴヌクレオチド
発明の背景 技術分野
本発明は、ヒトにおける高血圧症を低減するために有用である組成物および方
法に関する。より具体的には、本発明は、アンギオテンシノゲンmRNAに結合して
アンギオテンシノゲンの発現、およびそれにより本態性高血圧症を阻害し得るオ
リゴヌクレオチド化合物に関する。背景技術
アンギオテンシノゲン(AGT)は、主に肝臓により産生され、これは腎臓によ
り産生されるタンパク質レニンの基質である。アンギオテンシノゲンへのレニン
の作用により、デカペプチドアンギオテンシンIの形成がもたらされる。アンギ
オテンシンIは、それが脈管構造を通して循環するにつれてアンギオテンシン変
換酵素(ACE)の作用を通してさらにオクタペプチドアンギオテンシンIIに変換
される。アンギオテンシンIIは、強力な血管収縮剤であり、そして血圧および血
容量ホメオスタシスのレギュレーターである。過作用のレニンアンギオテンシン
系(RAS)は、ヒトにおける本態性高血圧症および米国において約4千万人の成
人に影響を及ぼす関連した形態の高血圧症の発達および維持に関連がある。アン
ギオテンシノゲンの阻害を通して、アンギオテンシンIIの産生は阻害され得、そ
の後、高血圧性の血圧が低減する。
AGTの遺伝的変異体が、高血圧症患者における上昇した血漿AGTレベル、および
特定の集団における子癇前症またはアテローム性動脈硬化症への素因に関連して
いる(Jeunmatre,X.ら,Cell 71(1):169-80,1992;Hixon,J.E.およびPowers,
P.K.,Human Genet.96:110-112,1995)。RASは、いくつかの機構により阻害さ
れ得、これはACEインヒビター、レニンインヒビター、およびアンギオテンシン
アンタゴニストを含むが、今までのところでは、AGTの特異的なインヒビター
は存在しない。AGTの産生は、遺伝子転写の際に作用し、組織におけるmRNAの濃
度に影響を与えるホルモンにより主に制御される。
AGTの調節においてホルモンが果たす最も重要な役割は、高レベルのレニンに
よるその迅速な消費の間、その合成および構成的分泌を維持することであり得る
。肝臓のAGTは、ゲノムレベルで作用するホルモン(例えば、ステロイド、甲状
腺ホルモン、グルココルチコイド、および炎症性サイトカイン)により、適切な
応答性エレメントおよびマルチホルモン応答部位(例えば、主要転写開始部位の
上流のヌクレオチド−615〜−440のホルモン誘導性エンハンサー単位(HIEU))
と相互作用するDNA結合タンパク質の活性化を通して、主に肝細胞における転写
レベルで調節される(Peters,J.,前出,1995;Brashier,A.R.ら,Kidney Intern
ational,46:1564-1566,1994)。
多数の降圧剤が市販されているが、しかし、ほとんどは、一般的に、第2群の
薬剤の作用を必要とする、重篤な副作用を有する。これは、疾患の性質と共に、
患者のコンプライアンスが乏しい結果となる傾向がある。現在使用されている多
くのレニンアンギオテンシン系インヒビターは、レニンインヒビター、アンギオ
テンシン変換酵素インヒビター、およびアンギオテンシンレセプターブロッカー
を含む。これらの薬剤もまた特異性を欠き、好ましくない副作用を有し、頻繁な
投薬レジメを必要とし、そしてアンギオテンシンIIの形成を完全には防がない。
別のアプローチが、高血圧症を低減するために提案されている。多くの研究者
は、レニン−アンギオテンシン系成分の阻害のためのアンチセンス配列を開発し
ている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの生物学的系においてタンパク質合
成を首尾良く阻害するために使用されている(Yakubov,L.ら,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 86:6454-6458,1989;Wahlstedt,D.ら,Science 259:528-531,199
3;Wahlstedt,D.ら,Nature 363:260-263,1993;Wielbo,D.ら,Hypertension 2
5:314-319,1995)。遺伝子調節のこのパラダイムは、多くの潜在的な治療的適
用を有し、そして現在、抗ガン剤、抗不安剤、抗ウイルス剤、および駆虫剤とし
ての適用のために開発されている。タンパク質合成のアンチセンス調節または減
衰は、公知の分子配列を有する任意の候補遺伝子に適用され得る。
アンチセンス分子は、候補遺伝子の標的領域に相補的であるように合成される
、短いストランド(通常、12〜18塩基長)のDNAまたはRNAである。アンチセンス
分子はその相補的領域に結合し、そして多くの機構を通して遺伝子発現を阻害ま
たは減衰する(Helene,C.C.およびToulme,J.J.,Biochemica et Biophysica Ac
ta 1049:99-125,1990)。
これらの分子の機能、代謝、および構造の理解が前進することにより、増強さ
れたヌクレアーゼ耐性、ならびに増加した特異性、選択性、および効力を有する
アンチセンス分子の開発が導かれている(Crooke,S.T.,FASEB J.7:533-539,1
993)。ホスホロチオエートASODNは、改変されたホスホジエステルオリゴヌクレ
オチドであり、ここで、ヌクレオチド間結合の非架橋酸素原子の1つが、硫黄に
より置換されている。完全にチオエート化されたアンチセンス分子は、ヌクレア
ーゼにさらに耐性であるが、しかしまた一般に1μmより大きな用量においてい
くつかの非配列特異的効果を示す(Wagner,R.W.,Nature 372:333-335,1994)
。
ホスホロチオエート化はまた、RNase Hの活性を刺激する。この酵素は、DNA-m
RNA二重鎖を基質として認識し、そして二重鎖のmRNA部分を切断し、DNAアンチセ
ンス分子を他のmRNA鎖へと自由に結合させて触媒型の効果を促進する(Helene,
C.C.およびToulme,J.J.,前出,1990;Boiziau,C.ら,Biochemical Society Tran
sactions 20:764-767,1992)。
本発明者らは、アンチセンス技術の概念を心血管機能および高血圧症へ情報を
提供するための生物学的道具として利用した。SakaiおよびMengは、アンギオテ
ンシンII 1型(AT1)レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドが、AngIIへ
のdipsogenic応答を阻害することを実証し(Sakai,R.R.ら,J.Neurochem.62:2
053-2056,1994;Meng,H.ら,Regulatory Peptides 54:543-551,1994)、そし
てMorishitaおよび共同研究者は、増殖細胞核抗原に標的化したアンチセンスを
首尾良く用いて、バルーンカテーテル血管形成術の後の新動脈内膜形成を阻害し
た(Morishita,R.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(18):8474-8,1993)。
Gyurkoは、AT1レセプターに標的化したASODNの中枢投与の後の血圧減少を示し
得た(Gyurko,R.ら,Regulatory Peptides 49:165-174,1993)。そして同様の
効果はWielboが中枢性のAGTを標的化した場合に観察された(Wielbo,D.ら,前
出,1995)。最近、Tomitaは、末梢AGTを標的化する3つの連続したアンチセン
スオリゴヌクレオチド配列を用いてSHRにおける血圧を低減し得、そしてAGT mR
NAにおける減少を示した(Tomita,N.ら,Hypertension 24(3):65,397,1994;T
omita,N.ら,Hypertension 26:131-136,1995)。Wielboらはまた、18マーのOD
N配列がカプセル化されたリポソームを用いてラットモデルにおける高血圧性の
血圧を減少させたが、mRNAにおいては変化は観察されなかった(Wielbo,D.ら,
Hypertension 28:147-151,1996)。
N.Tomitaら,26 Hypertension 131-136(1995)は、初期mRNAのエキソン/イン
トロン連結部に標的化したアンチセンス分子の投与により、高血圧症のラットモ
デルにおいて血圧が一時的に減少することを実証した。これらのアンチセンス分
子は、肝臓の取り込みを促進するためのウイルス抗原を組込むリポソームの送達
機構を介して肝門静脈に直接投与された。この研究グループは、末梢のアンギオ
テンシノゲンおよびアンギオテンシノゲンmRNAにおけるその後の減少を伴う、血
圧における減少を実証した。注射の投与速度または数に関する情報は全くないこ
とに留意されたい。しかし、用量依存性研究が、15μMol/Lまでを用いて行わ
れ、AGTにおける有意な減少が得られた。このデータは、おそらく、このような
高容量でのコントロールオリゴにより観察された非特異的効果による比として示
された。
Tomitaらの方法の欠点の1つは、肝門静脈を通してリポソームを与えるために
侵襲的な外科的手段が必要とされることである。アンチセンス分子を直接肝臓に
(Tomitaにより使用された容量で)注射することの別の欠点は、肝臓組織を損傷
する危険性である。また、ウイルス抗原改変が、肝臓の取り込みを容易にするた
めに行われなければならない。
残念ながら、当該分野では、先の問題を避けるアプローチは開発されていない
。従って、有毒な副作用が無くそして少用量で効力がある有効なASODN高血圧症
処置組成物、および侵襲性の外科的投与技術を必要としない方法に対する必要性
が存在する。発明の開示
本発明は、AGT発現が、以下の式Iのオリゴヌクレオチド化合物の投与によっ
てヒトにおいて阻害され得るという知見に帰する:
ここで:
各Xは、独立して、O、S、またはC1 〜4アルキルであり;各Bは、独立して
、ヒトアンギオテンシノゲンをコードするセンスmRNA鎖にオリゴヌクレオチドが
結合し得、それによってその翻訳を阻害するように選択される、アデニン、グア
ニン、シトシン、またはチミンであり;各Rは、独立して、HまたはC1 〜4アル
キルまたはP(O)(O)置換アクリジンであり;各Yは、独立して、HまたはOHであ
り;そしてnは8〜23である。式Iのオリゴヌクレオチド化合物はまた、それの
薬学的に受容可能な塩または水和物であり得る。好ましくは、Bは、オリゴヌク
レオチドが、ヒトアンギオテンシノゲンのセンスmRNA鎖に対してアンチセンスで
あるように選択される。より好ましくは、Bは、オリゴヌクレオチドが、AUG開
始コドンを含むmRNA塩基領域に結合し得るように選択される。
本発明の別の局面は、薬学的キャリアおよび上記種のオリゴヌクレオチドを含
有する、アンギオテンシノゲンの発現を阻害するために有用な薬学的組成物を提
供する。薬学的キャリアは、リポソーム、ウイルスベクター、またはタンパク質
結合体処方物であり得る。
本発明の別の局面はヒトにおける高血圧症を処置するための方法を提供する。
この方法は、上記種のオリゴヌクレオチドまたは組成物の有効量を被験体に投与
する工程を含む。
本発明の目的は、それゆえ:
(a)毒性の副作用を回避し;
(b)侵襲性の外科的手順を回避し;
(c)少用量で効果的であり;そして
(d)アンギオテンシノゲンmRNAを特異的に標的化する、
上記種の化合物、組成物および方法を提供することを含む。
本発明のこれらおよびさらに他の目的および利点は、以下の記載から明らかで
ある。
図面の簡単な説明
図1は、本発明の1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、アンギオ
テンシノゲンの発現割合を示す棒グラフであり;
図2aおよび2bは、それぞれ、非カプセル化アンチセンスオリゴヌクレオチドお
よびリポソームカプセル化オリゴヌクレオチドの注射1時間後のラット肝臓組織
の顕微鏡写真であり;
図3は、リポソームカプセル化アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコント
ロール組成物で自然発症性高血圧症ラットを処置した後の平均動脈圧における変
化を示す棒グラフであり;
図4は、自然発症性高血圧症ラットをリポソームカプセル化アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドおよびコントロール組成物で処置した後のそれらの血漿アンギオ
テンシンIIのレベルを示す棒グラフであり;
図5は、自然発症性高血圧症ラットをリポソームカプセル化アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドおよびコントロール組成物で処置した後のそれらの血漿アンギオ
テンシノゲンのレベルを示す棒グラフであり;
図6は、ウイルスベクター送達系を用いた比較データを示すグラフであり;
図7aは、AGTおよびコントロール遺伝子カテプシンDに関するノーザンブロッ
トハイブリダイゼーションを示し;
図7bは、未処置コントロール細胞におけるアンギオテンシノゲン発現と比較し
た処置後のAGT mRNA発現の相対強度を示す棒グラフであり;
図8は、アンギオテンシノゲン産生へのカチオン性リポソーム結合ASODNの効
果を示す棒グラフであり;
図9aは、AGTおよびコントロール遺伝子カテプシンDに関するノーザンブロッ
トハイブリダイゼーションを示し;
図9bは、コントロール処置サンプルと比較したAGT mRNAの相対的な発現を示す
棒グラフであり;そして
図10は、ASODNのカチオン性リポソーム送達後のアンギオテンシノゲンタンパ
ク質における用量依存性減少を示す棒グラフである。
発明を実施するための最良の形態
アンギオテンシノゲン(AGT)をコードする天然のDNAセグメント、および全て
のそのような哺乳動物DNA鎖は、以下の2つの鎖を有する:水素結合により一緒
に保持されたセンス鎖およびアンチセンス鎖。DNAのチミジンがウリジンによっ
て置換されている以外は、AGTをコードするメッセンジャーRNAは、センスDNA鎖
と同じヌクレオチド配列を有する。従って、合成アンチセンスヌクレオチド配列
は、AGTをコードするDNAおよびRNAと結合するはずである。
本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、ヒトAGTをコードするメッセンジャーR
NAに結合し、それによりこのタンパク質の発現を阻害する。好ましい本発明の化
合物は、Fukamizuら、265 J. Biol. Chem. 7576-7582(1990)の図2に示されるよ
うなヒトAGTをコードするセンスDNA配列に対してアンチセンスである。特に好ま
しいオリゴヌクレオチド化合物は、オリゴヌクレオチドの塩基配列が5'-CTCGCTT
CCGCATACCCT-3'(配列番号1)であるように式IのBが選択されているオリゴヌ
クレオチド化合物である。
本明細書および請求の範囲において、文字A、G、C、T、およびUはそれぞ
れ、ヌクレオシドがアデノシン(Ade)、グアノシン(Gua)、シチジン(Cyt)
、
チミジン(Thy)、およびウリジン(Ura)であるヌクレオチドを示す。本明細書
および請求の範囲において用いられる場合、AGT DNAまたはmRNAセンス鎖に対し
てアンチセンスである化合物は、センス鎖に相補的なヌクレオシド配列を有する
化合物である。表1は、4つの可能なセンス鎖ヌクレオシドおよびアンチセンス
化合物中に存在するそれらの相補物を示す
本発明が、アンギオテンシノゲンをコードするセンスmRNA鎖に結合し得るオリ
ゴヌクレオチド化合物を広く包含することが、当業者により理解される。従って
、本発明は、厳密にはアンチセンスではない化合物を包含する:化合物は、その
ような化合物が発現を阻害するに十分なアンギオテンシノゲンmRNAに対する結合
親和性を有するという条件で、いくつかの非相補的塩基を有し得る。
式Iの化合物はまた、ヌクレオチド中のいくつかまたは全てのリン酸塩が、ホ
スホロチオエート(X=S)またはメチルホスホネート(X=CH3)または他のC1-4
アルキルホスホネートにより置換されているという点で、天然のDNAとは異な
り得る。式Iの化合物は、必要に応じて、センス分子の遊離水酸基の一方または
両方をC1-4アルコキシ基(R=C1-4アルコキシ)で置換することにより、天然の
DNAからさらに差別化され得る。本明細書中で用いられる場合、C1-4アルキルは
、1〜4個の炭素原子を有する分岐または非分岐炭化水素を意味する。
式Iの化合物はまた、3'および/または5'末端において、置換アクリジン誘導
体によって置換され得る。本明細書中で用いられる場合、「置換アクリジン」は
、
DNAのようなヌクレオチド鎖にインターカレートし得る任意のアクリジン誘導体
を意味する。好ましい置換アクリジンは、2-メトキシ-6-クロロ-9-ペンチルアミ
ノアクリジン、N-(6-クロロ-2-メトキシアクリジニル)-O-メトキシジイソプロピ
ルアミノホスフィニル-3-アミノプロパノール、およびN-(6-クロロ-2-メトキシ
アクリジニル)-O-メトキシジイソプロピルアミノホスフィニル-5-アミノペンタ
ノールである。他の適切なアクリジン誘導体は、当業者に容易に明らかとなる。
さらに、本明細書中で用いられる場合、「P(O)(O)-置換アクリジン」は、適切な
アクリジンに共有結合されたリン酸塩を意味する。
式Iの化合物はまた、それらのヌクレオチド配列中に挿入されたリボザイム配
列を含み得る。リボザイム配列は、それらがAUC、UUC、GUA、GUU、GUC、または
好ましくは、CUCによりすぐに先行されるように、式Iの化合物中に挿入される
。リボザイム配列は、挿入され得、そしてメッセンジャーRNAの自己切断を引き
起こす、任意の配列である。配列CUG AUG AGU CCG UGA CGA Aが好ましい。他の
そのような配列は、HaseloffおよびGerlach,334 Nature 585-591(1988)により
記載されるように調製され得る。
式Iの化合物は、約10〜25ヌクレオチドを有する。本明細書中で用いられる場
合、用語「ヌクレオチド」はリン酸部分がホスホロチオエートまたはアルキルホ
スホネートにより置換されているヌクレオチドを包含し、そしてヌクレオチドは
置換アクリジンにより置換され得る。好ましい式Iの化合物は、13〜22ヌクレオ
チドを有する。16〜20ヌクレオチドを有する化合物がより好ましい。18ヌクレオ
チドを有する化合物が最も好ましい。10より少ないヌクレオチドを有する化合物
はより所望されない。なぜなら、それらは一般に、特異性がより低いからである
。そして25より多いヌクレオチドを有する化合物はより所望されない。なぜなら
、それらの物理的な大きさおよび電荷が親油性細胞膜の通過を減じるからである
。従って、それらは、細胞にあまり入りそうにない。
ヒトAGT mRNAに対してアンチセンスである式Iの化合物が好ましいが、そのよ
うな化合物が発現を阻害するに十分なヒトAGT mRNAに対する結合親和性を有する
という条件で、式Iは、mRNAセンス鎖のセグメント中の各ヌクレオチドに対する
相補性を欠くヌクレオチド化合物を包含する。実施例1および5の手順は、本発
明の特定のオリゴヌクレオチドがアンギオテンシノゲン発現を阻害するに有効で
あるかどうかをスクリーニングするために有用である。
RがHである式Iの化合物が好ましい。しかし、得られる化合物がAGTの発現
を阻害するに十分なAGT mRNAセンス鎖に対する結合親和性を保持するという条件
で、RはC1-4のアルキルであり得る。
少なくとも1つのXがSである式Iの化合物は、以下の公開された手順により
調製される:W.J.Stecら、106 J. Am. Chem. Soc. 6077-6079(1984);S.P.Adam
sら、105 J. Am. Chem. Soc. 661(1983);M.H.Caruthersら、4 Genetic Engine ering
1,Settlow,J.Hollander.A.編;Plenum Press:New York(1982);
M.S.Broidoら、119 Biochem. Biophys. Res. Commun. 663(1984)。これらの公
開された手順において記載される反応スキームは、固相支持体上で実施される。
反応スキームはホスホルアミダイトの1H-テトラゾール触媒カップリングを含
んでホスフェート中間体を生じ、これは2,6-ルチジン中の硫黄と反応されてホス
フェート化合物を生じる。オリゴヌクレオチド化合物は、ホスフェート化合物を
チオフェノキシド(1:2:2チオフェノール/トリエチルアミン/テトラ-ヒ
ドロフラン、室温、1時間)で処理することにより調製される。一連の反応は、
所望の長さのオリゴヌクレオチド化合物が調製されるまで反復される(式I)。
式Iの化合物は、水酸化アンモニウムで室温で1時間処理することにより支持体
から切断され、次いで約50℃において一晩加熱することによりさらに脱保護され
て、式Iの化合物を生じる。少なくとも1つのXが酸素である式Iの化合物は、
I2-H2Oを2,6-ルチジン中の硫黄に置換することにより調製される。
少なくとも1つのXがCH3または他のC1-4アルキルである式Iの化合物は、以
下の公開された手順により調製される:K.L.AgarwalおよびF.Riftina、6 Nucl .Acids Res. 3009-3023(1979)。一連の反応は固相支持体上で実施される。反応
手順は、メチルホスホノジトリアゾリドをリン酸化試薬として使用する5'-保護
ヌクレオシドの3'-ヒドロキシル基のリン酸化、続くメチルホスホネートのベン
ゼンスルホニル触媒カップリングを含んで、メチルホスホネートオリゴヌクレオ
チドを生じる。メチルホスホノジトリアゾリドは、等モル量のメチルホスホノ-
ジクロリデート、トリエチルアミン、およびトリアゾールからインサイチュで調
製される。ベンゼンスルホニルテトラゾールはまた、ピリジン、ベンゼンスルホ
ン酸、およびトリエチルアミンからインサイチュで調製された。この一連の反応
、続く支持体からの切断および脱保護の反復は、式Iの化合物を生じる。
RがC1-4アルキルである式Iの化合物は、DMT-保護化合物をC1-4アルキルエー
テルで置換することにより調製される。
RがP(O)(O)-置換アクリジンである式Iの化合物はまた、以下の公開された手
順により調製される:U.AsselineおよびN.T.Thuong、30(19)Tet. Letters 252
1-2524(1989)C.A.Steinら、72 Gene 333-341(1988)。これらの公開された手順
は、ヌクレオシドホスホルアミダイト保有アクリジン誘導体の合成を含み、これ
は次いで、支持体に付着された2,2'-ジチオジエタノールと反応される。次いで
、鎖伸長は、上記のように、自動化固相DNA合成機上で実施される。これらの公
開された手順はまた、置換9-(3-ヒドロキシプロピル)アミノアクリジンをN-エチ
ルジイソプロピルアミン、続いて塩化N,N-ジイソプロピルメチルホスホンアミド
と反応させることによるヌクレオシドホスホルアミダイト保有アクリジン誘導体
の合成を含む。自動化DNA合成機を使用して、RがP(O)(O)-置換アクリジンであ
る式Iの化合物が、アセトニトリル中のアクリジニルホスホルアミダイトを使用
する合成の追加の回により調製される。
式Iの化合物は、適切な薬学的投薬形態(例えば、カプセル剤、錠剤、または
注射可能な調製物)中に組み込まれ得る。固体または液体の薬学的キャリアが使
用され得る。固体キャリアとして、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水
和物、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステ
アリン酸マグネシウム、およびステアリン酸が挙げられる。液体のキャリアとし
て、シロップ剤、ピーナッツオイル、オリーブオイル、生理食塩水、および水が
挙げられる。リポソーム、ウイルスベクター、およびタンパク質結合体調製物も
また、キャリアとして使用され得る。同様に、キャリアまたは希釈剤は、例えば
、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートのような任意の
持続放出物質を単独で、またはワックスとともに含み得る。固体キャリアの量は
広範に変化し得るが、好ましくは、投薬単位あたり約25mg〜約1gである。液体の
キャリアが使用される場合、調製物は、シロップ剤、エリキシル剤、エマルジョ
ン、軟ゼラチンカプセル剤、アンプルのような滅菌の注射可能な液体、または水
溶性もしくは非水溶性液体懸濁物の形態である。液体のキャリアが使用される場
合、生理食塩水溶液またはリン酸緩衝化生理食塩水溶液が最も頻繁に使用される
。
薬学的調製物は、薬学的化学者の従来技術(混合すること、必要であれば、錠
剤の形態に顆状化および圧縮すること、または所望の経口用または全身用産物を
得るために、適切なように、混合すること、濾過すること、および成分を溶解す
ることを含む)に従って生成される。
本発明の式Iの化合物の用量(上記のような薬学的投薬単位中)は、1ng/kg〜
500mg/kg(好ましくは1mg/kg未満)の活性化合物の範囲から選択される、意図し
た効果を生じる非毒性の量である。選択された用量が、AGTの発現の阻害を必要
とするヒト患者に、1日に1〜6回またはそれ以上で、経口、経直腸的に、注射
または連続的な注入によって投与される。経口処方物は、一般に、胃での分解の
影響を克服するためにいくらか多い投薬を必要とする。静脈内または動脈内投与
が、一般に最少用量を必要とする。なぜなら、薬物が全身的な循環に直接置かれ
るからである。従って、用量は、投与の実際の経路に依存する。
末梢投与は、本発明者らは、経口または中枢投与(脳への)を除く任意の他の
送達経路を意図する。本発明のオリゴヌクレオチド化合物の、動脈(頚動脈)、
静脈(ラットの尾静脈、またはヒトの腕の静脈)、あるいは腹膜内(哺乳動物に
おいて)を介する末梢投与は、Tomitaら(前出)におけるように、肝静脈または
動脈への注射のために腹腔を外科的に切開することを伴わずに肝臓への送達を可
能にする。
以下の実施例は、式(I)の化合物およびそれらの調製を示す。この実施例は
、先に定義され、そして以下で請求される本発明の範囲を限定することを意図し
ない。
本発明は、アンギオテンシノゲンタンパク質の産生を妨げるアンギオテンシノ
ゲンmRNAの領域に結合するオリゴヌクレオチド化合物に関する。これは、高血圧
の発症および維持に関与する。リポソームのような薬学的キャリアにアンチセン
ス分子をカプセル化することによって、体内のアンギオテンシノゲン産生の主要
な部位である肝臓への、直接的なアンチセンス分子の送達を標的化する方法にお
いて使用され得る組成物を得ることが可能である。肝臓の標的化はまた、アンチ
センス分子をウイルスベクターおよびタンパク質結合体でパッケージングするこ
とによって達成され得る。
本発明の化合物および組成物は独特である。なぜなら、アンギオテンシノゲン
の作用を特異的に阻害する試薬が市販されていないからである。さらに、アンチ
センス分子の化学的性質に帰因して、その作用は高く特異的であり、従来の抗高
血圧剤よりも潜在的に少ない副作用を伴う、少用量の投与を可能にする。
本発明のリポソームカプセル化オリゴヌクレオチド化合物は、自然発症性高血
圧症のラットのアンギオテンシノゲンmRNAを阻害するためには、アンチセンスオ
リゴデオキシヌクレオチドを使用することが示された。ラットmRNAの配列が、Oh
kuboら、80 PNAS USA 2196-2200(1983)の図3に開示される。本発明の1つの
バージョンは、ラットアンギオテンシノゲンmRNAの-5〜+13塩基の領域に相補的
に合成された18塩基のオリゴマーであり、これは、翻訳開始コドンAUGを含む。
このオリゴマーは、以下の塩基配列から構成される:5'-CCGTGGGAGTCATCACGG-3'
(配列番号2)。ホスホロチオエート化骨格の改変は、ヌクレアーゼ耐性を付与
するために、各塩基上に含まれ得る。
本発明の組成物は、好ましくは、薬学的送達系にカプセル化されたアンギオテ
ンシノゲンmRNAに結合し得る新規のDNA配列を含み、これは、アンギオテンシノ
ゲン産生の主要な部位である肝臓に直接送達されたASODNを生じる。アンチセン
スオリゴヌクレオチドのウイルス抗原改変体は必要ではない。
リポソーム(80%ホスファチジルコリン、20%コレステロール)は、脂質膜の
乾燥および再水和のためのロータリーエバポレーター装置を使用して調製される
。リポソームは、アンチセンス分子の捕捉を促進する複数回の凍結解凍サイクル
に供され、次いでそれらのサイズを小さくするために押し出し形成機(0.1μmの
フィルター)を通過させられる。次いで、力学的な光散乱によってサイズが決定
され得る。リポソームカプセル化された生物学的に活性な化合物を生成する種々
の方法のさらなる詳細については、米国特許第4,311,712号;同第4,370,349号;
号;同第4,963,362号;同第5,264,221号;同第5,417,978号;および同第5,422,1
20号を参照のこと。
末梢送達を容易にすることと同様に、リポソームカプセル化は、アンチセンス
分子の細胞性取り込みを容易にし、増大した送達効率を生じる。これは、血流に
アンチセンス組成物を末梢的に投与すること、および予め試験した時に生理学的
応答が生じなかった用量で生理学的応答を得ることを可能にする(Gyurkoら、お
よびWielboら、前出を参照のこと)。一旦アンチセンス分子が細胞内に侵入する
と、これは、アンギオテンシノゲンmRNAの標的領域に結合してmRNA/DNA二本鎖を
形成する。この二本鎖の形成は、リボソーマルサブユニットのアセンブリおよび
続くタンパク質メッセージの読み取りを妨げるように作用し、それにより、アン
ギオテンシノゲン産生を阻害する。アンチセンス分子のホスホロチオエート化形
態はヌクレアーゼ耐性を増強されており、そして二本鎖部分のmRNAを切断する酵
素であるRNase Hの作用をさらに刺激し、続いて、アンチセンス分子を遊離させ
て別の標的mRNAに結合させる。
本発明者らは、高血圧の動物モデルにおいて、高血圧が、アンギオテンシノゲ
ンを標的化するリポソームカプセル化アンチセンスDNAフラグメントを含む組成
物の、単回の動脈内用量を用いて低減され得ることを示した。生理学的応答を誘
発し得ることと同様に、本発明者らはまた、血圧の低下時の末梢中でのアンギオ
テンシンIIの続く減少を示す生化学的データを生成し得た。本発明者らの以前の
研究は、高血圧の動物の脳へのアンチセンス分子の単回用量がまた、7日目まで
血圧を低下させることもまた示した。
本発明者らは以前に、自然発症性高血圧症のラットの脳に直接投与された、ア
ンギオテンシノゲンmRNAを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの50μg
の単回用量が、延長した時間にわたって高血圧の有意な、そして十分な低減を生
じることを示した。以下の図面は、高血圧のラットの肝臓中のアンギオテンシノ
ゲンを標的化するリポソームカプセル化アンチセンス分子の生理学的効果を示す
。
使用され得る別の送達系はウイルスベクターである。図6は、神経腫-神経膠
種脳腫瘍細胞株における1型アンギオテンシンIIレセプターの発現におけるウイ
ルスベクターアンチセンス送達系の効果を示す。この研究において、アンチセン
ス(完全長のタンパク質配列)が1型アンギオテンシンIIレセプターのmRNAを標
的化した。細胞は、以下のウイルスベクターの取り込みを増強させるために有用
な試薬であるトランスフェクタム(transfectam)のいずれかで処理された:空
のmockプラスミドウイルスベクター;paAT、アンチセンス配列を含むアデノ随伴
ウイルス(AAV)ベクター;およびpaAT+Ad、アンチセンスならびにアンチセン
スmRNAの発現を駆動するAAVのp40プロモーターを増強するアデノ随伴ウイルスの
ためのヘルパーウイルスを含むアデノ随伴ウイルスベクター。実質的に減少した
レセプター結合は、paAT+Ad処理した細胞において観察された。このことは、mR
NA発現がpaAT+Ad処理で減少されたことを示す。
本発明で用いられ得る別の送達系は、タンパク質結合体オリゴヌクレオチド組
成物である。この技術は、肝臓特異的アシアロ糖タンパク質レセプターにより認
識されるDNA−タンパク質複合体の構築に基づく。ホスホロチオエート化アンチ
センスとのポリ(1-リジン)-アシアロオロソムコイド(ASoR)タンパク質結合体
との結合は、肝臓における細胞内取り込みを容易にし得る。結合体は、遺伝子の
細胞中への送達のためのレセプター媒介細胞内機構を用いる。特異的レセプター
リガンド(例えば、DNAタンパク質複合体を形成する、ポリリジンに対するアシ
アロオロソムコイドまたはトランスフェリン)を共有結合することにより、細胞
特異的表面レセプターを標的化することおよびアンチセンスDNAを細胞に貫通さ
せることが可能になっている。Bunnellら、18 Somatic Cell Molec. Gen. 559-
569(1992)を参照のこと。実施例1
図1は、標的アンチセンス分子(配列番号2)の選択された標的であるラット
タンパク質アンギオテンシノゲンに対する特異性を示す。これらの実験では、標
的タンパク質の転写および翻訳を、アンギオテンシノゲンに対する相補的DNA(c
DNA)を用いてインビトロで実施した。インビトロ反応を、アンチセンス分子お
よびスクランブル化もしくはセンスコントロールオリゴヌクレオチド分子の存在
下または非存在下で実施した。これらのインビトロ反応は、本発明のオリゴヌク
レオチドがヒトアンギオテンシノゲンの発現を阻害する能力を評価するために用
いられ得る。
データは、コントロール反応と比較したアンギオテンシノゲンの発現%として
示す。用量応答研究を、30μMオリゴヌクレオチド〜0.3μMオリゴヌクレオチ
ドの範囲を包含するようにして実施した。より高いアンチセンス用量(3〜30μ
M)では、アンギオテンシノゲンの発現は、コントロールの約5〜10%に減少し
た。しかし、アンギオテンシノゲン発現の非特異的減衰はスクランブル化および
センスオリゴヌクレオチドで観察され、これは、文献において最近記載された現
象である。この点において、Tomita(前出)では、15μMol/Lの用量で見られる
応答の程度は、この現象に最も起因するようであるとしている。より低いオリゴ
ヌクレオチド用量(0.3〜1μM)では、アンチセンスの存在下で行われた反応
は、アンギオテンシノゲン産生の顕著な減衰を示し(45%)、スクランブル化オ
リゴヌクレオチドでの非特異的減衰は見られなかった。このことにより、低用量
で、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、インビトロでのアンギオテン
シノゲンの翻訳を顕著かつ特異的に減衰することが示唆される。実施例2
図2aおよび2bは、50μgの(a)非カプセル化蛍光標識アンチセンス(配列
番号2)または(b)リポソームカプセル化蛍光標識アンチセンス(配列番号2)
の頸動脈への直接注入の1時間後のラット肝組織の2つの共焦点顕微鏡写真を示
す。顕微鏡写真(a)は、肝組織内に蛍光シグナルの分布がほとんどまたは全くな
かったことを示す。顕微鏡写真(b)は、組織全体に強度にかつ均等に分布された
蛍光シグナルが存在することを示す。これにより、リポソームカプセル化は、標
的器官へのアンチセンスの送達を容易にすることが示される。
リポソームカプセル化mRNA(肝臓アンギオテンシノゲンmRNAに対して標的化さ
れたアンチセンスオリゴヌクレオチド)を含む動脈内末梢投与組成物への生理的
応答を実証するために、雄の自然発症性高血圧症ラット(250〜275g)の群を、
頸動脈を介してカテーテル挿入し、そして24時間放置して手術から回復させた。
次いで、基底平均動脈圧(MAP)を、留置動脈カテーテルに連結した直接血圧変
換器を介して測定した。単回50μg用量のリポソームカプセル化(25mg脂質)アン
チセンスオリゴヌクレオチド(AS/L)またはリポソームカプセル化スクランブル
化オリゴヌクレオチド(Scr/L)または空リポソーム(25mg脂質)(Lipo)、あ
るいは50μg非カプセル化アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASDON)を含む組成
物を頸動脈を介して投与した。24時間後、平均動脈圧を測定して血圧変化を決定
した。実施例3
本実施例は、自然発症性高血圧症ラットにおけるリポソームカプセル化ASDON
(配列番号2)の平均動脈圧(MAP)に対する効果を実証する。ラット群におい
て、基底MAPを樹立した。次いで、50μgのリポソームカプセル化(25mg脂質)ASDO
N(AS/L);リポソームカプセル化Scr0DN(Scr/L);空リポソーム(25mg)(Li
po);または50μg非カプセル化ASDONを動脈内投与した。図3は、各処理24時間
後に観察された血圧変化を示す。平均動脈圧はリポソームカプセル化アンチセン
ス組成物で処置した群において有意に減少した(-24.66mmHg±2.43)。しかし、
Scr/L(1.34mmHg±3.98);Lipo(-5.34mmHg±3.71);またはASDON(-6.02mmHg
±8.68)処置群においては、有意な血圧変化は観察されなかった。結果を平均±
SEM,p<0.013、n=6/群として表す。本データは、リポソームカプセル化ア
ンチセンス(AS/L)を含む末梢投与組成物は、高血圧症のSHRモデル(ヒトにおい
て生じることの推定となる)における高血圧症血圧を減少させるという概念を支
持する。
生化学的変化を決定するために、動物群(n=3/群)を処置の24時間後に屠
殺し、そして血漿アンギオテンシンIIレベルを放射免疫アッセイにより測定した
。図4は、投与24時間後の血漿アンギオテンシンIIレベルに対するリポソームカ
プセル化アンチセンス(AS/L)処置の効果を示す。実施例4
本実施例は、アンギオテンシンIIに対するリポソームカプセル化ASDON(配列
番号2)の効果を実証する。動物群(n=3/群)を処置の24時間後に屠殺した
。血漿アンギオテンシンIIレベルを放射免疫アッセイにより測定した。図4に示
すように、アンギオテンシンIIは、以下のコントロールに比較してリポソームカ
プセル化ASDON(AS/L)処置ラット(30.3±11.4pg/mL、n=5)において有意に
低
かった:リポソームカプセル化ScrODN(Scr/L)(103.1±33.2pg/mL、n=3)
;空リポソーム(Lipo)(233.5±71.1pg/mL、n=3);および非カプセル化AS
DON(201.4±88.5pg/mL、n=3)、p<0.05。本データにより、アンチセンス効
果は、提唱された作用機構を介して媒介されることが示唆され、アンギオテンシ
ノゲン産生の減衰は血漿アンギオテンシンIIの引き続く減少を伴う。実施例5
本実施例は、リポソームカプセル化ASODN(配列番号2)の血漿AGTに対する効
果を実証する。動物を処置の24時間後に屠殺し、そして血漿AGTレベルを放射免
疫アッセイにより測定した。図5に示すように、AGTは、以下のコントロールに
比較してリポソームカプセル化ASDON(AS/L)処置ラット(58.5±3.71pg/mL、n
=5)において有意に低かった:リポソームカプセル化ScrODN(Scr/L)(79.0
±8.72pg/mL、n=3);空リポソーム(Lipo)(85±5.72pg/mL、n=3);お
よび非カプセル化ASDON(77.8±3.25pg/mL、n=3)、p<0.05。
リポソームは、水性相がリン脂質分子の膜中に封入される薬物小胞である。こ
れは、脂質が水性媒体中に分散された場合自然に形成する。これらの小胞は、ナ
ノメートルからミクロンまでのサイズ範囲であり、そして水性区画中および膜内
の両方で大量の物質を捕獲するように構築され得る。標的化された薬物送達の進
歩は今や、薬物分子の保護を改善するリポソームカプセル化、持続放出、および
より効率的な細胞取り込みを可能にする。ホスファチジルコリンリポソームは、
オリゴヌクレオチドの効率的なキャリアであることが示され、細胞取り込みの効
率を増大させ、そしてまた、培養培地におけるオリゴヌクレオチドの安定性を増
大させる。
カチオンリポソームは、静電相互作用を介したリポソーム表面における負に帯
電されたオリゴヌクレオチドの複合体化に起因して、細胞取り込みにおいて特に
効率的であることが示されている(Ahktar,S.およびJuliano,R.L.,Trends i
n Cell Biology 2:139-144,1992)。この研究において、本発明者らは、AGT分
泌Hepatoma細胞株を使用して、カチオンリポソームに結合された単独の18マーAG
Tアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その送達および細胞取り込みを増強し、
それにより、低用量で、かつ用量依存様式でアンギオテンシノゲン産生を阻害す
るという仮説を試験した。以前の研究では、本発明者らは、高用量の裸のASODN
でインビトロおよびインビボでの標的タンパク質産生を首尾良く減少したが、本
発明者らは、標的mRNAにおいては減少を観察しなかった。従って、タンパク質阻
害の機構および特異性に関して疑問が残る。
材料および方法(実施例6〜9)
アンチセンス合成:
Ohkuboにより確立されたAGT配列を用いて(Ohkubo,Hら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA80:2196-200,1983)、18マーASDON鎖を、アンギオテンシノゲンmRNAの-
5〜+13塩基配列、5-CCGTGGGAGTCATCACGG-3'(配列番号2)に対して合成した。
この領域は、AUG翻訳開始コドンを含む。コントロールのスクランブル化ODN(Sc
rODN)は、ASODN鎖と同じ塩基組成であるが、無作為な順序である。これらのオ
リゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート化により修飾されている。ODNは、DNA
Synthesis Laboratory,University of Floridaにおいて合成した。全てのオリ
ゴヌクレオチド配列を、関連タンパク質との相同性について、National Center
for Biotechnology Information BLASTネットワークサーバーおよびGenebankデ
ータプログラムを介して調べた。
リポソーム合成:
ジメチルジアクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB)およびジオレオイルホ
スファチジルエタノールアミン(DPOE)(2:5、w/w)(Avanti Polar Lipids In
c.,Alabaster,Alabama)からなるカチオン性リポソームを30mLのクロロホルム
に溶解し、そして溶媒を減圧下で55℃で加熱することにより蒸発させた。脂質を
1mLの滅菌脱イオン水中に再懸濁し、そして溶液がほぼ清澄になるまで氷上で超
音波処理することによりリポソームを調製した。次いで、ASODNまたはScrODNを
添加して1μMの濃度を得た。ODS/カチオン性脂質の-/+変化率は0.18であった。
これは正味の正電荷をODN-リポソーム結合体に与えて細胞膜とODN-リポソーム結
合体との間の融合を可能にする。用量応答研究のために、5つの異なるオリゴヌ
クレオチド濃度を異なる濃度のDDABで調製して、ODS/カチオン性脂質複合体を同
じ-/+電荷比で作製した。
細胞培養:
H-4-II E、肝ガン、Reuber H35ラット細胞をATCCより購入した(Rockville,M
aryland)。細胞を、単層培養で、10%ウシ胎児血清、10%仔ウシ血清を補充し
た12mLのイーグル最小必須培地(EMEM)中で増殖させ、そして95%空気−5%CO2
で37℃にてインキュベートした。培養物に毎日栄養補給し、そしてコンフルエ
ントである場合、1.0mLの0.25%トリプシン-EDTAを使用して、1:6の比で継代し
た。細胞を10cmのペトリ皿上で実験まで増殖させた。次いで、培養物をEMEMで洗
浄して血清補充培地をすべて除去し、次いで変化する濃度のオリゴヌクレオチド
またはリポソーム複合体化オリゴヌクレオチドおよびコントロール処理物で処理
した。
アンギオテンシノゲンアッセイ:
培養培地の500μlのアリコートを乾燥するまで蒸発させた。乾燥サンプルを、
Serniaの直接ラジオイムノアッセイ法(Sernia,C.,ら、Neuroendocrinology 55
:308-316,1992)によりアンギオテンシノゲンについてアッセイした。AGTサン
プル含有量を、サンプルの培地と同一の細胞培養培地で希釈した純粋なラットAG
Tの標準曲線から算出した。アッセイ感度は0.3ng/チューブであり、そしてアッ
セイ間およびアッセイ内の可変度はそれぞれ14%および9%であった。
ノーザンブロット:
ノーザンブロット分析をChomczynskiおよびSacchiの方法(Chomczynski,P.お
よびSacchi,N.、Anal.Biochem.162:156-9,1987)により行い、そして濃度測
定方法により定量した。細胞をメルカプトエタノールを使用して溶解し、次いで
RNAをグアニジウムチオシアネートでの処理、続くフェノール-クロロホルム抽出
により抽出した。RNAを20℃のイソプロパノールにより沈澱させた。遠心分離後
、
RNAの量を分光学的に算出した。RNAの20μgのアリコートを、アガロースホルム
アルデヒドゲル上で、25Vで16時間、電気泳動した。mRNAの十分な分離をRNAラ
ダーおよびエチジウムブロミド染色を使用して観察した。RNAを、ノーザンブロ
ットによりナイロンメンブレンに移した後、4時間で56℃、1×デンハルトSSPE
溶液(5×SSPE、0.1%SDSおよび50%ホルムアミド)でプレハイブリダイゼーシ
ョンした。溶液はまた、250mg/mLの変性サケ精子DNAを含んだ。ハイブリダイゼ
ーションを、特定のmRNA配列に対する標識リボプローブを用いて同じ条件下で行
った。洗浄工程後、メンブレンをX線フィルムに曝し、次いで現像した。メンブ
レンをカテプシンD mRNAについて再プローブすることにより標準化した。
統計学的分析:
統計学的分析を処理効果についてのANOVAにより行ない、そしてDuncanの多範
囲試験を個々の比較のために使用した。個々の時点のラジオイムノアッセイデー
タをステューデントの独立T検定により分析した。P<0.05が統計学的に有意で
あると考えられる。
肝ガンH4細胞培養でのアンギオテンシノゲン産生およびアンギオテンシノゲンmR
NAの発現におけるASODNのインビトロ効果の決定。
H4肝ガン細胞培養物をコンフルエンスになるまで増殖させ、次いでカチオン性
リポソーム結合ASODNおよびScrODN(1μM)または1μMの裸のASODNもしくは
カチオン性脂質コントロール溶液で処理した。培養物を24時間インキュベートし
た。培地の上澄みを除去し、AGTアッセイのために100μlのアリコートを採取し
た後、細胞をペトリ皿から回収した。2つの処理プレートを合わせて十分な細胞
にし、mRNAを抽出し、そしてノーザンブロットにより分析してAGT mRNAレベルを
決定した。ノーザンブロットを濃度測定により定量した。培地のアリコートを凍
結乾燥し、RIAによりAGTレベルについてアッセイした。6つの100mmプレートを
、各サンプルのアッセイのために合わせた。
肝ガンH4細胞培養におけるカチオン性リポソーム結合ASODNの用量応答の関係。
H4肝ガン細胞培養物をコンフルエンスになるまで増殖させ、次いで次の濃度の
カチオン性リポソーム複合体化ASODNで処理した:0、0.01、0.05、0.1、0.5お
よび1.0μM。コントロールグループは、-/+のASODN脂質比を維持するために必
要な量内の漸増量のカチオン性脂質からなった。ODN/カチオン性脂質は0.18で
ある。培養物を24時間インキュベートした。培地の上澄みを除去し、AGTアッセ
イのために100μlのアリコートを凍結乾燥し、そしてRIAによりAGTレベルについ
てアッセイした。培地の採取後に細胞をペトリ皿から回収し、2つの処理プレー
トを合わせて十分な細胞にし、mRNAを抽出し、そしてノーザンブロット分析によ
り分析してAGT mRNAにおけるASODN用量効果を決定した。ノーザンブロットを濃
度測定法により定量した。実施例6
カチオン性リポソーム複合体化ASODNおよびコントロール処理物のmRNA発現に
おける効果を決定するために、細胞培養物を、1μMのカチオン性リポソーム複
合体化ASODN、複合体化ScrODN、カチオン性リポソームおよび1μMの裸のASODN
で処理した。図7aは、AGT(1.9Kb)およびコントロール遺伝子であるカテプシン
(2.1Kb)についてのノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す。サンプル1
〜5は以下の処理に対応した:1.裸のアンチセンス(ASODN);2.空のカチ
オン性リポソームコントロール(CL);3.カチオン性リポソーム複合体化ScrO
DN(Scr/CL);4.カチオン性リポソーム複合体化ASODN(AS/CL)および5.未
処理コントロール(CTRL)。図7bは、未処理コントロール細胞のAGT発現と比
較した、処理後のAGT mRNA発現の相対強度に対応する。発現はコントロールパー
セントで表す。裸のASODN(ASODN)で処理した細胞は、70%に減少したAGT発現
を有するようであった。複合体化していないリポソーム(CL)およびリポソーム
複合体化ScrODN(Scr/CL)のコントロール処理は、基底レベルからわずかな変化
(約90%の発現)を生じた。しかし、リポソーム複合体化ASODN(AS/CL)で処理
した細胞は22%の発現を示すのみである。実施例7
肝ガンH4細胞培養でのAGT産生におけるASODNの効果を決定するために、細胞培
養物を前述のように処理し、そして培養培地をRIAを使用してAGTタンパク質レベ
ルについて分析した。図8は、コントロールおよびASODN処理後に肝ガン細胞培
養により産生されたAGTの量を示す。このグラフは、AGT産生におけるカチオン性
リポソーム複合体化ASODNの効果を示す。細胞を、1μMのASODNとともに、カチ
オン性リポソームおよび適切なコントロールの存在または非存在下でインキュベ
ートした。未処理コントロール(CTRL)において、基底AGTレベルは52.0±2.46n
g/mLであった。空のリポソーム(CL)およびリポソーム複合体化Scr0DN(Scr/CL)
コントロールグループでは、AGT産生において、基底レベルからの有意な減少は
存在しなかった(それぞれ、45.53±5.9ng/mL;47.03±6.9ng/mL;n=3)。裸のA
SODNおよびカチオン性リポソーム複合体化ASODN(AS/CL)で処理した細胞は、基
底レベルから有意に減少したAGTレベルを有した(それぞれ、30.2±3.Ong/mL,n
=3,*=P<0.05および5.61±0.95ng/mL;n=3,**=P<0.01)。実施例8
次いで、肝ガンH4細胞培養におけるカチオン性リポソーム複合体化ASODNの用
量応答の関係について行なった。図9aおよび9bは、送達メカニズムとしてカ
チオン性リポソームを使用したAGT mRNAの用量依存な減少を示す。図9aは、AG
Tおよびコントロール遺伝子であるカテプシンDについてのノーザンハイブリダ
イゼーションの結果を示す。サンプル1〜5は、カチオン性リポソームのみで処
理した細胞の代表的なブロットを示す。各オリゴヌクレオチド濃度は、処理あた
りのリポソームの濃度がオリゴヌクレオチド濃度のそれぞれの増加とともに比例
して増加するように、複合体化していないリポソームの別のコントロールに付随
した。サンプル6〜10は、0.01、0.05、0.1、0.5および1.0μMのカチオン性リ
ポソーム複合体化ASODNで処理した細胞に対応する。サンプル11は、未処理コン
トロール細胞におけるAGT mRNAの発現を示す。これは、ASODN処理試験後の減少
の比較のためのAGTの基底発現として使用される。図9bは、コントロール処理
サンプルと比較した、mRNAの相対的な発現を表す。コントロールカチオン性リポ
ソームで処理した細胞の平均発現は92%であった。0.01および0.05μMのASODN
で処理し
た細胞は、約92%の発現を有した。これは、コントロールカチオン性リポソーム
処理物と類似した。より高用量のASODN(0.1、0.5および1μM)では、発現は
、用量依存様式で、コントロール発現の60%、56%および24%までそれぞれ減少
した。各処理後のカテプシンD mRNAの発現においては変化は観察されなかった
。実施例9
図10は、ASODNのカチオン性リポソーム送達の後のAGTタンパク質における用量
依存性減少を示す。さらに、各オリゴヌクレオチド濃度を、別のコントロールの
複合体化していないリポソームに付随させた。1処置あたりのリポソーム濃度が
増加するのに比例して、オリゴヌクレオチド濃度はそれぞれ増加した。AGTタン
パク質の基底レベルは、未処置コントロールにおいて51.77±3.7ng/mLであった
(n=3)。空のカチオン性リポソームを用いると、基底AGT産生に変化は観察
されず、平均AGTレベルは各漸増用量について48.5ng/mLであった。・RNAレベル
の減少と一致して、ASODNの低用量(0.01μMまたは0.05μM)では、AGTの有意な
減少は観察されなかった。AGTタンパク質レベルはそれぞれ47.6±7.4および40.2
9±4.0ng/mLであったが、減少傾向は明らかであった。0.1、0.5、および0.1μM
ASODNでは、タンパク質レベルは、用量依存性様式で基底レベルから有意に減少
した。AGTタンパク質レベルは、26.86±5.3;23.27±6.1、および5.67±0.3ng/m
L(1群あたりn=3);★=p≦0.05および★★=p≦0.01であった。実施例6〜9の議論
広範囲の生物学的系においてアンチセンス技術を用いて首尾良い標的タンパク
質の減衰が達成されているが、アンチセンス治療の開発はかつて予測されたほど
スムーズではない。標的部位への分子の送達において、問題に遭遇している。AS
ODN分子の細胞取り込みは特異的レセプター相互作用またはレセプター媒介性工
ンドサイトーシスを通してであると考えられる(Morishita,R.ら,上記,1993;
Loke,S.L.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3474−3478,1989;Temsamani,J.
ら,Antisense Research and Development 4:35-42,1994;Wickstrom,E.,Tren
ds-Biotechnol.,10(8):281-7,1992)が、一般に、取り込み効率は、細胞に
侵入するASODNで2%程度、そしてトランスフェクトされた細胞で1%程度と乏
しい(Ahktar,S.およびJuliano,R.L.,前出,1992)。生存細胞により取り込
まれる裸のオリゴヌクレオチドの量は、1〜10%の範囲であり、トランスフェク
ション率は、細胞のタイプにより変わり得る。リポソーム送達系は、アンチセン
スが分解されるのを防ぐこと、およびアンチセンス分子を細胞の極近くに運んで
それにより取り込みプロセスを促進することにより、ASODNの細胞取り込みを促
進し、そしてその効率を増加させることが示されている。特に、カチオン性リポ
ソームは、取り込み効率を30%まで増加させることが示されている(Lappalaine
n,K.ら,Biochimica et Biophysica Acta 1196:201-208,1994)。結果として
、カチオン性リポソームの推測された増強送達および細胞トランスフェクション
によって、本発明者らは、AGTタンパク質およびmRNAレベルが、結果的に減少す
ると推測した。
上記のデータは、カチオン性リポソームが、アンギオテンシノゲンmRNAに標的
化されたアンチセンス分子についての効率的な送達系であることを示唆する。本
発明者らのデータは、1μMの用量で、リポソーム複合体化ASODNが、裸のASODN
単独よりも大いに、標的タンパク質およびmRNAを特異的に減少させることを示す
。これらの観察は、リポソーム複合体化ScrODNまたはコントロールカチオン性脂
質で標的タンパク質の有意な減少が観察されていないので、標的mRNAの特異的阻
害に起因し得る。さらに、リポソーム複合体化ASODNの同一用量はまた、基底レ
ベルからの標的mRNAの有意な減少をもたらした。このことは、オリゴヌクレオチ
ド作用のモードが、RNase Hの刺激を通してであり得ることを示唆する。この酵
素は、mRNA-DNA二本鎖を基質として認識し、その後に二重鎖のmRNA部分を分解す
る。これ故に、この特定のオリゴヌクレオチドが翻訳プロセスおよびAUG開始コ
ドンでのリボソーム結合を阻害するように設計されたにもかかわらず、アンギオ
テンシノゲンmRNAの減少が観察された。
興味深いことに、裸のASODN処理の後にmRNA発現が基底レベル未満(しかし有
意ではない)であったにもかかわらず、本発明者らは、裸のDNAは、カチオン性
リポソーム複合体化ASODNほど大いにではないが、AGTタンパク質レベルを有意に
は減少させることを観察した。この観察は、おそらく、カチオン性リポソームが
、
実質的な量のリポソーム/オリゴヌクレオチド表面結合をもたらす、負に荷電し
たオリゴヌクレオチドおよび脂質のカチオン性荷電による、オリゴヌクレオチド
送達の増大をもたらすことによる。
本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な細胞送達は、タン
パク質減衰の有効性を得る際の重要なことがらであること、およびこのような送
達はリポソーム送達系の使用を通して促進され得ることを結論した。カチオン性
リポソームは、細胞培養におけるオリゴヌクレオチドの送達効率を、細胞内ASOD
Nレベルが標的タンパク質および標的mRNAの両方の減衰を誘起する程度まで実質
的に増加させるために利用され得る。この送達系は、ウイルスベクター送達また
は標的化細胞送達の必要性を伴ずに、活性についてのASODNの十分な細胞内レベ
ルを可能にする、基本的ASODN特性の決定のための簡単なアプローチを提供する
。実施例10
本研究において、約8週齢まで正常血圧である幼児SHラットに、単回用量(50
μgオリゴ)のリポソームカプセル化オリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド
の塩基配列は配列番号2による)を、尾静脈を通して週に1回4週間にわたって
注射した。これは、離乳後に4週齢〜8週齢で行なった。
8,12、および18週間目に、それらの血圧を、テイルカフ(tail cuff)方法
を用いて間接的に測定した。8週齢では、リポソームアンチセンス処置ラットは
、126.2mmHg±7.49の血圧を有した。これは、コントロール処置群より有意に低
かった(P<0.05)。この血圧の低下により、正常血圧の範囲内で血圧が維持さ
れたが、コントロール群は、高血圧症の範囲の血圧を有した。最後のASODN−リ
ポソーム処置の8週間後の12週齢目では、動物は、依然として、コントロール処
置群と比較して低い血圧を有した。この低下した血圧はコントロール群よりも有
意に低いわけではなく、そして依然として高血圧症の範囲にあるとはいえ、傾向
は明らかであったし、そして有意性はおそらくサンプル数を増加することにより
達成され得る。18週齢目では、全ての群のラットは、高血圧症の範囲の血圧を有
した。
従って、幼児ラットの重要な成長段階の間のリポソームカプセル化アンチセン
スの投与は、一時的にだが有意に高血圧症の発達を減衰させ得る。この減衰の持
続期間は、おそらく、ASODNの投薬頻度または量を増加させることにより延長さ
れ得る。この減衰化は、侵襲的手術の必要性なく、単純な静脈投与により達成さ
れ得る。
本発明は特定の好ましい実施態様を参照して記載してきたが、他の改変が可能
である。例えば、本発明は、アンギオテンシノゲンmRNAの特定のセグメントにお
ける各ヌクレオチドについて相補性を欠くオリゴヌクレオチド化合物を含む。た
だし、このような化合物は、その発現を阻害するために、AGT mRNAに十分な結合
親和性を有する。これに関して、実施例6〜9(上記)の材料および方法は、特
定のオリゴヌクレオチドがアンギオテンシノゲン発現を阻害する際に有効である
かを決定するために有用である。明らかに、上記の方法は、ヒトアンギオテンシ
ノゲンの阻害について特定の化合物を評価する際に改変される。例えば、ヒト細
胞(例えば、ヒト胚細胞株またはヒト肝ガン細胞株)は、細胞培養に使用され得
る。また、本発明は、オリゴヌクレオチド化合物の混合物を含むことが意図され
、各化合物は、アンギオテンシノゲンmRNAに結合し得る。
従って、請求の範囲の範囲は、本明細書中の好ましいバージョンの特定の例に
制限されない。むしろ、請求の範囲は、本発明の完全な範囲を判断するために熟
視するべきである。
産業上の利用性
本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドは、アンギオテンシノゲンの発現
を阻害して、それによりアンギオテンシノゲン誘導性高血圧症を制御するために
有用である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S
D,SZ,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ
,MD,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU
,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,
CN,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,G
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,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,
LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,N
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,SI,SK,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,
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Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.アンギオテンシノゲンの発現を阻害するために有用な薬学的組成物であって 、リポソーム処方物および以下の式: によって示されるオリゴヌクレオチドまたは薬学的に受容可能なその塩または 水和物を含有し、 ここで、 各Xは、独立して、O、S、またはC1 〜4アルキルであり; 各Bは、独立して、存在する場合にヒトアンギオテンシノゲンをコードするセ ンスmRNA鎖に該オリゴヌクレオチドが結合し、それによってその翻訳を阻害する ように選択される、アデニン、グアニン、シトシン、またはチミンであり; 各Rは、独立して、HまたはC1 〜4アルキルまたはP(O)(O)置換アクリジンで あり; 各Yは、独立して、HまたはOHであり;そして nは8〜23である、薬学的組成物。 2.前記オリゴヌクレオチドが、ヒトアンギオテンシノゲンをコードするセンス mRNA鎖に対してアンチセンスであるように、Bが選択される、請求項1に記載の 薬学的組成物。 3.前記オリゴヌクレオチドが、AUG開始コドンを含むmRNA塩基領域に結合する ように、Bが選択される、請求項1に記載の薬学的組成物。 4.前記オリゴヌクレオチドが、mRNA-5〜+13塩基領域と重複し、そしてAUG開始 コドンを含む領域に結合するように、Bが選択される、請求項3に記載の薬学的 組成物。 5.前記オリゴヌクレオチドが、AUG開始コドンを含むmRNA-5〜+13塩基領域に結 合するように、Bが選択される、請求項3に記載の薬学的組成物。 6.前記オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号1に従うように、Bが選択さ れる、請求項5に記載の薬学的組成物。 7.前記リポソーム処方物がカチオン性リポソーム処方物である、請求項1に記 載の薬学的組成物。 8.ヒトにおける高血圧症を処置するための方法であって: 被験体に請求項1に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、 方法。 9.ヒトにおける高血圧症を処置するための方法であって: 被験体に請求項3に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。 10.ヒトにおける高血圧症を処置するための方法であって: 被験体に請求項4に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。 11.ヒトにおける高血圧症を処置するための方法であって: 被験体に請求項5に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。 12.ヒトにおける高血圧症を処置するための方法であって: 被験体に請求項6に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。 13.ヒトにおける高血圧症を予防するための方法であって: 被験体に請求項1に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。 14.ヒトにおける高血圧症を予防するための方法であって: 被験体に請求項3に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。 15.ヒトにおける高血圧症を予防するための方法であって: 被験体に請求項4に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。 16.ヒトにおける高血圧症を予防するための方法であって: 被験体に請求項5に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。 17.ヒトにおける高血圧症を予防するための方法であって: 被験体に請求項6に記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
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