JP3231779B2 - ｒａｆ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節 - Google Patents

ｒａｆ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節

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Description

【発明の詳細な説明】
技術分野 本発明は、異常細胞増殖および腫瘍形成への関与が示
唆されてきた天然に存在する細胞性遺伝子であるraf遺
伝子の発現を調節するための組成物および方法に関す
る。本発明はまた、細胞の過増殖を阻害するための方法
にも関している；これらの方法は診断的にまたは治療的
に使用しうる。さらに、本発明はraf遺伝子の発現に付
随する病状の処置にも関する。 発明の背景 直接的にまたは間接的に細胞の増殖および分化を制御
する細胞性遺伝子の変化は、癌の主原因と考えられてい
る。raf遺伝子ファミリーはＡ−、Ｂ−およびＣ−raf
（raf−１とも呼ばれる）と称される三つの高度に保存
された遺伝子を含む。raf遺伝子は細胞増殖を制御する
信号伝達過程において重要な制御的役割を果たしている
と考えられているプロテインキナーゼをコードしてい
る。すべての肺癌細胞株の60％はｃ−raf mRNAおよび
蛋白質を通常ではない高レベルで発現していることが報
告されているため、ｃ−raf蛋白質の発現は異常な細胞
増殖に何らかの役割を果たしていると考えられている。
Rapp et al.,The Oncogene Handbook,E.P.Reddy,A.
M Skalka and T.Curran,eds.,Elsevier Science P
ublishers,New York,1988,pp.213−253。 オリゴヌクレオチドは動物およびヒトの疾患状態処置
において治療用として用いられてきた。例えば、この分
野の研究者は現在、ウイルス性、真菌性および代謝疾患
に示唆される遺伝子の発現を調節しうるアンチセンス、
トリプレックスおよび他のオリゴヌクレオチド組成物を
同定している。 例えば、1992年８月４日に発行された米国特許第5,13
5,917号はヒトインターロイキン−１レセプター発現を
阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供してい
る。Gawirtzらの名前で1992年３月24日に発行された米
国特許第5,098,890号はｃ−myb癌遺伝子と相補的なアン
チセンスオリゴヌクレオチドおよびある種の癌状態のア
ンチセンスオリゴヌクレオチド治療に関している。1992
年２月11日に発行された米国特許第5,087,617号はアン
チセンスオリゴヌクレオチドによる癌患者の処置法を提
供している。1992年11月24日に発行された米国特許第5,
166,195号はHIVのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供して
いる。1991年４月２日に発行された米国特許第5,044,81
0号は単純ヘルペスウイルスVmw65 mRNAにハイブリダイ
ズして複製を阻害しうるオリゴマーを提供している。19
93年３月16日に発行された米国特許第5,194,428号はイ
ンフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性を有する
アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供している。1989
年２月21日に発行された米国特許第4,806,463号はアン
チセンスオリゴヌクレオチドおよびHTLV−III複製の阻
害にそれらを用いる方法を提供している。1994年２月15
日に発行された米国特許第5,286,717号（Cohen et a
l.）は癌遺伝子に相補的な混合結合オリゴヌクレオチド
ホスホロチオエートに関している。米国特許第5,276,01
9号および第5,264,423号（Cohen et al.）は細胞にお
ける外来性核酸の複製阻害に使用されるホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチド類似体に関している。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは安全にヒトへ投与され、ウイ
ルスおよび細胞性遺伝子産物の両方を標的とするいくつ
かのアンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤の臨床応用が
現在進行中である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チド、ISIS2922はAIDS患者のサイトメガロウイルス網膜
炎に対して有効であることが示されている。BioWorld
Today、1994年４月29日、p3。従って、オリゴヌクレオ
チドは有用な治療手段であり、細胞および動物（特にヒ
ト）の処置のための処置養生法で有用であろうことは確
立されている。 遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害は
raf遺伝子の役割の理解において有用な道具であること
が証明されている。ヒトｃ−rafの最初の６つのコドン
に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用い
て、インターロイキン−２（IL−２）に対するＴ細胞の
マイトジェン応答にｃ−rafを必要とすることが示され
た。オリゴヌクレオチドで処理した細胞はほとんど全部
のｃ−raf蛋白質の消失およびIL−２に対する増殖応答
の実質的な減少を示した。Riedel et al.,Eur.J.Immu
nol.1993,23,3146−3150。Rappらはプロモーターの下流
にアンチセンス配向したraf遺伝子を含む発現ベクタ
ー、および細胞でアンチセンスraf遺伝子または突然変
異したraf遺伝子を発現させることによるraf発現阻害の
方法を開示している。WO出願93/04170。マウスｃ−raf
のコドン１−６に相補的なアンチセンスオリゴデオキシ
リボヌクレオチドを用いてラッオ肝癌細胞株H4II Eにお
けるDNA合成のインシュリン刺激を回避した。Tornkvist
et al.,J.Biol.Chem,1994,269,13919−13921。WO出
願93/06248号は、ｃ−raf遺伝子領域を増幅し、および
突然変異の証拠についてそれを分析することを特徴とす
る、癌を発生する危険性が大きい固体の同定法および癌
にかかった患者の予後および適当な処置を決定するため
の方法を開示している。 Dennerらはraf遺伝子にハイブリダイズするアンチセ
ンスポリヌクレオチド、およびそれらを使用する方法を
開示している。WO94/15645。ヒトおよびラットraf配列
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが開示されて
いる。 Inversenらはras−活性化癌細胞を殺すことができるr
afに相補的なヘテロ型アンチセンスオリゴヌクレオチド
およびraf−活性化癌細胞を殺す方法を開示している。
多数のオリゴヌクレオチド配列が開示されているが、そ
のどれも実際にはアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
ではない。 raf遺伝子発現を阻害するための改良された組成物お
よび方法が長く待ち望まれている。 発明の概要 本発明はヒトrafをコードしている核酸を標的とし、
かつraf発現を阻害しうるオリゴヌクレオチドを提供す
る。本発明はまたヒトrafをコードしている核酸を標的
とするキメラオリゴヌクレオチドも提供する。本発明の
オリゴヌクレオチドは診断および治療の両方に有用であ
ると考えられ、本発明の方法において特に有用であると
考えられる。 本発明はまた、ヒトrafの発現、特にrafの異常発現を
阻害する方法を含む。これらの方法は、raf発現および
過増殖が連携しているため、治療および診断の両方に有
用であると考えられる。これらの方法はまた、例えば種
々の細胞機能および生理学的過程および状態におけるra
f発現の役割を検出および決定するための、およびraf発
現に付随する状態を診断するための道具としても有用で
ある。 本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドを用いる
細胞の過増殖を阻害する方法も提供する。これらの方法
は、例えば、rafに付随する細胞過増殖の診断に有用で
あると考えられる。異常な増殖的状態の処置法もまた提
供される。これらの方法は本発明のオリゴヌクレオチド
を使用している。これらの方法は、治療的におよび臨床
的研究および診断の道具としても有用であると考えられ
る。 図面の簡単な説明 図１はヌードマウスにおけるA549肺腫瘍異種移植片の
増殖に対するISIS5132（図1A）およびスクランブル化対
照オリゴヌクレオチドISIS10353（図1B）の効果を示し
ている折れ線グラフである。ISIS5132はすべての用量で
（0.006mg/kg;0.06mg/kg;0.6mg/kg;および6.0mg/kg）用
量応答的に腫瘍サイズを減少させた。スクランブル化ra
fオリゴヌクレオチド、ISIS10353はどの用量でも効果を
示さなかった（図1B）。 発明の詳細な説明 悪性腫瘍は、癌細胞の特性である増殖制御の消失を引
き起こす一種の段階的進行性変化を経て発育する。即
ち、連続的非制御増殖、周りの組織を侵襲する能力およ
び異なる器官部位へ転移する能力。注意深く制御された
インビトロでの研究から、正常および新生物性細胞の増
殖を特徴付ける因子を定義する手がかりが得られ、細胞
増殖および分化を制御する特定の蛋白質の同定が導かれ
た。raf遺伝子はＡ−、Ｂ−およびｃ−rafと名付けられ
た関連する蛋白質をコードしている遺伝子ファミリーの
一員である。raf遺伝子は高度に保存されたセリン−ト
レオニン−特異的プロテインキナーゼをコードしてい
る。これらの酵素は異なるように発現される；最も十分
に特徴付けられているｃ−rafは試験されたすべての器
官およびすべての細胞株で発現されている。Ａ−および
Ｂ−rafは各々尿性器および脳組織で発現されている。
ｃ−rafプロテインキナーゼ活性および細胞内分布はリ
ン酸化を通してマイトジェンにより制御される。上皮増
殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因
子、インシュリン、顆粒球−マクロファージコロニー刺
激因子、インターロイキン−２、インターロイキン−３
およびエリトロポイチエンを含む種々の増殖因子は、ｃ
−rafのリン酸化を誘導することが示されている。従っ
て、ｃ−rafは多数の増殖因子をそれらの正味の効果
（細胞増殖）と結合させ、正常細胞信号伝達経路におい
て基本的な役割を果たしていると考えられている。 ある種の異常増殖状態はraf発現に付随すると考えら
れており、従ってraf発現の阻害に応答すると考えられ
ている。raf蛋白質発現の異常な高レベルはまた形質転
換および異常な細胞増殖にも関係することが示唆されて
いる。これらの異常な増殖状態はraf発現の阻害に応答
的であると考えられている。異常な増殖状態の例は、
癌、腫瘍、過生、肺線維症、脈管形成、乾癬、アテロー
ム、および血管形成術後の狭窄または再狭窄のような血
管内の平滑筋増殖のような過増殖障害である。rafがそ
の一部となっている細胞信号伝達経路もまた、例えば、
組織移植片拒否反応、エンドトキシンショックおよび糸
球体腎炎のようなＴ細胞増殖（Ｔ細胞活性化および増
殖）により特徴付けられる炎症障害と関係することが示
唆されている。 raf遺伝子発現の除去または減少が異常な細胞増殖を
停止または逆転させることが観察された。このことはra
f発現のレベルが異常に高くはない場合においても観察
された。raf遺伝子の発現を調節しうる物質の組成物を
提供することが非常に待望されている。細胞、組織およ
び動物におけるraf遺伝子の検出法を提供することが非
常に待望されている。また、異常なraf遺伝子発現に付
随する異常な増殖状態の診断および治療の方法を提供す
ることも待望されている。さらに、raf遺伝子の検出お
よび研究のためのキットおよび試薬も待望されている。
ここで“異常な"raf遺伝子発現とは、raf蛋白質の発現
のレベルが異常に高いこと、または異常な増殖状況また
は状態におけるraf発現のレベルとして定義される。 本発明はrafをコードしている核酸を標的とするオリ
ゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドおよびそ
れがハイブリダイズするその相補的核酸標的間のこの関
係は通常“アンチセンス”と称されている。本発明の文
脈において、選択された核酸標的へのオリゴヌクレオチ
ドの“標的化”は多段階過程である。この過程は通常、
その機能が調節されるべき核酸配列を同定することから
始まる。それは例えば、その発現が特定の疾病状態に付
随する細胞性遺伝子（または遺伝子から作られるmRNA）
または感染作因からの外来性核酸であろう。本発明にお
いて、標的はrafをコードしている核酸である；別の表
現では、raf遺伝子またはraf遺伝子から発現されるmRNA
である。標的化過程にはまた、所望の効果（遺伝子発現
の調節）が得られるように、オリゴヌクレオチドとの相
互作用を起こす核酸配列内の一つまたは複数の部位の決
定が含まれる。一つまたは複数の部位が同定されたら、
標的に十分相補的な（即ち、十分な特異性で十分よくハ
イブリダイズし、所望の調節が得られる）オリゴヌクレ
オチドが選択される。 本発明の文脈において、“調節”とは阻害または刺激
を意味している。raf遺伝子発現の阻害は現在のところ
調節の好適な形である。この調節は例えば、本出願の実
施例に教示されるように、mRNA発現のノーザンブロット
アッセイまたは蛋白質発現のウェスタンブロットアッセ
イのような本分野では日常的な方法により測定しうる。
本出願の実施例に教示されるように、細胞増殖または腫
瘍細胞増殖に対する効果も測定可能である。本発明の文
脈において、“ハイブリダイゼーション”とは、通常相
対する核酸鎖または核酸鎖の二つの領域の相補的塩基間
の水素結合（ワトソン−クリック塩基対形成としても知
られている）を意味している。グアニンおよびシトシン
は相補的塩基の例であり、それらの間で三つの水素結合
が形成されることが知られている。アデニンおよびチミ
ンは相補的塩基の例であり、それらの間で二つの水素結
合が形成される。“特異的にハイブリダイズ可能”およ
び“相補的”とは、DNAまたはRNA標的とオリゴヌクレオ
チドとの間で安定かつ特異的な結合が起こるように十分
な程度の相補性を示すのに使用される術語である。特異
的にハイブリダイズ可能であるには、オリゴヌクレオチ
ドはその標的核酸配列と100％相補的である必要はない
ことを理解されたい。標的へのオリゴヌクレオチドの結
合が標的分子の正常な機能を妨害して有用性の消失を起
こす場合、および特異的結合が望まれる条件下、即ち、
インビボアッセイまたは治療的処置の場合には生理的条
件下、またはインビトロアッセイの場合にはアッセイが
実施される条件下で、非標的配列へのオリゴヌクレオチ
ドの非特異的結合を避けるために十分な程度の相補性が
ある場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイ
ズ可能である。 本発明の好適な実施態様において、ｃ−rafおよびＡ
−rafをコードしているmRNAを標的とするオリゴヌクレ
オチドが提供される。本発明に従うと、mRNAは三文字遺
伝コードを用いて蛋白質をコードするための情報を運ぶ
コード領域のみを含むだけでなく、５′−非翻訳領域、
３′−非選択領域、５′キャップ領域、イントロン領域
およびイントロン／エクソンまたはスプライス連結リボ
ヌクレオチドとして知られているような領域を形成する
付随するリボヌクレオチドを含むことを当業者は理解す
るであろう。従って、これらの付随するリボヌクレオチ
ド並びにコードリボヌクレオチドの全部または一部を標
的とするオリゴヌクレオチドを本発明に従って処方する
ことができる。好適な態様において、オリゴヌクレオチ
ドはヒトｃ−raf mRNAの翻訳開始部位（AUGコドン）ま
たは５′−または３′−非翻訳領域の配列を標的とす
る。妨害されるべきメッセンジャーRNAの機能には、蛋
白質翻訳の部位へのRNAのトランスロケーション、RNAか
らの実際の蛋白質の翻訳、RNAのスプライシングまたは
成熟およびおそらくはRNAにより行われているであろう
独立した酵素活性のような生存のためのすべての機能が
含まれる。RNA機能のそのような妨害の全体的な効果はr
af蛋白質発現の妨害を起こすことである。 本発明はraf遺伝子発現調節のためのオリゴヌクレオ
チドを提供する。そのようなオリゴヌクレオチドはraf
をコードしている核酸を標的とする。ｃ−rafおよびＡ
−rafの調整のためのオリゴヌクレオチドおよび方法が
現在のところ好適である；しかしながら、rafの他の型
の発現を調節するための組成物および方法もまた有用性
を有していると考えられ、本発明に包含されている。前
に定義したように、“調節”とは阻害または刺激を意味
している。raf遺伝子の阻害は現在のところ調節の好適
な形である。 本発明の文脈において、述語“オリゴヌクレオチド”
とは天然に存在する塩基、糖および糖間（主鎖）結合か
らなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのオリ
ゴマーまたはポリマーを意味している。述語“オリゴヌ
クレオチド”はまた、同様に機能する天然に存在しない
モノマー、またはそれらの一部からなるオリゴマーも含
まれる。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチド
は、例えば、促進された細胞取り込みおよびヌクレアー
ゼ存在下での増加た安定性のため天然型よりもしばしば
好適である。 本発明のある種の好適なオリゴヌクレオチドはキメラ
オリゴヌクレオチドである。本発明の文脈において“キ
メラオリゴヌクレオチド”または“キメラ”とは、各々
少なくとも一つのヌクレオチドから作り上げられた二つ
またはそれ以上の化学的に異なった領域を含むオリゴヌ
クレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型
的には、一つまたはそれ以上の有利な性質（例えば、ヌ
クレアーゼ耐性の増加、細胞内への取り込みの増加、RN
A標的に対する結合親和性の増加）を与える少なくとも
一つの修飾されたヌクレオチド領域およびRNaseH切断の
ための基質である領域を含む。一つの好適な態様におい
て、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増
加させるために修飾された少なくとも一つの領域および
通常はRNaseHのための基質として働く領域を含む。その
標的（この場合、rafをコードしている核酸）に対する
オリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオチドと
標的が解離する温度であるオリゴヌクレオチド／標的対
のTmを測定することによりルーチン的に決定される；解
離は分光学的に検出される。Tmが高いほど標的に対する
オリゴヌクレオチドの親和性は強い。より好適な態様で
は、raf mRNA結合親和性を増加させるために修飾され
たオリゴヌクレオチドの領域は、糖の２′位が修飾され
た少なくとも一つのヌクレオチド（最も好適であるのは
２′−Ｏ−アルキルまたは２′−フルオロ修飾ヌクレオ
チド）を含む。そのような修飾はオリゴヌクレオチド内
へルーチン的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチ
ドは与えられた標的に対し、２′−デオキシオリゴヌク
レオチドより高いTm（即ちより強い標的結合親和性）を
有していることが示された。そのような増加した親和性
の効果はraf遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオ
チド阻害を非常に増強することである。RNaseHはRNA:DN
AデュープレックスのRNA鎖を切断する細胞性エンドヌク
レアーゼである；従ってこの酵素の活性化はRNA標的の
切断を生じ、アンチセンス阻害の効率を非常に促進しう
る。RNA標的の切断はゲル電気泳動によりルーチン的に
示すことができる。別の好適な態様において、ヌクレア
ーゼ耐性を増強しうるためにキメラオリゴヌクレオチド
も修飾される。細胞は核酸を分解しうる種々のエキソ−
およびエンド−ヌクレアーゼを含む。多数のヌクレオチ
ドおよびヌクレオシド修飾が、これらを取り込んだオリ
ゴヌクレオチドを天然のオリゴヌクレオチドよりヌクレ
アーゼ消化に対してより耐性とすることが示されてい
る。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを細胞抽
出物または単離ヌクレアーゼ溶液とともにインキュベー
トし、通常はゲル電位泳動により、時間に関して残存す
る無傷のオリゴヌクレオチドの程度を測定することによ
りルーチン的に測定される。ヌクレアーゼ耐性を増強す
るように修飾されているオリゴヌクレオチドは非修飾オ
リゴヌクレオチドより長く無傷のままで残る。ヌクレア
ーゼ耐性を増強または与えるための種々のオリゴヌクレ
オチド修飾が示されている。現在のところ、少なくとも
一つのホスホロチオエート修飾を含むオリゴヌクレオチ
ドがより好適である。いくつかの場合、標的結合親和性
を増強させるオリゴヌクレオチド修飾はまた、独立して
ヌクレアーゼ耐性を増強しうる。 本発明において意図されるいくつかの好適なオリゴヌ
クレオチドの特定の例においては、ホスホロチオエー
ト、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖ア
ルキルまたはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ
芳香環またはヘテロ環式糖間（“主鎖”）結合が含まれ
ているであろう。最も好適なものはホスホロチオエート
およびCH2−NH−Ｏ−CH2、CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−CH
2（メチレン（メチルイミノ）またはMMI主鎖として知ら
れている）、CH2−Ｏ−Ｎ（CH3）−CH2、CH2−Ｎ（C
H3）−Ｎ（CH3）−CH2およびＯ−Ｎ（CH3）−CH2−CH2
主鎖（ここでホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−CH2であ
る）を含むものである。モルホリノ主鎖構造を有するオ
リゴヌクレオチドもまた好適である。Summerton,J.E.お
よびWeller,D.D.,米国特許第5,034,506号。別の好適な
態様においては、蛋白質−核酸またはペプチド−核酸
（PNA）主鎖のようにオリゴヌクレオチドのホスホジエ
ステル主鎖がポリアミド主鎖に置き換えられてもよく、
塩基はポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接または間接
的に結合されている。P.E.Nielsen,M.Egholm,R.H.Berg,
O.Buchardt,Science 1991,254,1497。他の好適なオリ
ゴヌクレオチドは下記の基の一つを２′位に含むアルキ
ルおよびハロゲン−置換糖部分を含んでいてもよい:O
H、SH、SCH3、Ｆ、OCN、OCH3OCH3、OCH3O（CH2）nCH3、
Ｏ（CH2）nNH2またはＯ（CH2）nCH3（式中ｎは１から約
10である）;C1からC10低級アルキル、置換低級アルキ
ル、アルカリールもしくはアラルキル;Cl;Br;CN;CF3;OC
F3;O−、Ｓ−，もしくはＮ−アルキル;O−,S−，もしく
はＮ−アルケニル;SOCH3;SO2CH3;ONO2;NO2;N3;NH2;ヘテ
ロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノ
アルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル;RNA
切断基；コレステリル基；コンジュゲート；レポーター
基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬動力
学的特性を改良する基；オリゴヌクレオチドの薬力学的
特性を改良する基および同様な特性を有する他の基。オ
リゴヌクレオチドはペントフラノシル基の代わりにシク
ロブチルのような糖模倣物を有していてもよい。他の好
適な態様では少なくとも一つの修飾塩基型またはイノシ
ンのような“万能塩基”を含んでいるであろう。 本発明に従ったオリゴヌクレオチドは好適には約８か
ら約50ヌクレオチドの長さである。本発明の文脈におい
ては８から50モノマーを有する上記のような天然に存在
しないオリゴマーを含むことを理解されたい。 本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドはよく
知られた固相合成技術により都合よくルーチン的に作製
することができる。そのような合成の装置はApplied B
iosystemsを含むいくつかの会社から売り出されてい
る。そのような合成のために他の手段を用いてもよい；
オリゴヌクレオチドの実際の合成はルーチン的に仕事を
する人の手腕の範囲内である。ホスホロチオエートおよ
びアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを
製造するために同様の技術を使用することもよく知られ
ている。また、蛍光標識、ビオチニル化またはコレステ
ロール修飾オリゴヌクレオチドのような他の修飾オリゴ
ヌクレオチドを合成するために、同様の技術およびビオ
チン、フルオレセイン、アクリジンまたはソラーレン修
飾アミダイトおよび／または制御細成ガラス（CPG）（G
len Research,Sterling VA）のような市販品として入
手可能な修飾アミダイトおよびCPG産物の使用もよく知
られている。 ｃ−raf mRNAの一部を標的とするある種のオリゴヌ
クレオチドがraf発現の阻害および細胞過増殖の妨害に
特に有用であることが見いだされた。アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを用いるｃ−raf発現の阻害のための方
法も同様に細胞過増殖の妨害に有用である。本発明の方
法においては、組織または細胞をオリゴヌクレオチドと
接触させる。本発明の文脈において、組織または細胞を
一つまたは複数のオリゴヌクレオチドと“接触”させる
とは、インビトロまたはエクスビボで細胞懸濁液または
組織試料へオリゴヌクレオチドを加えるか（通常は液体
担体中で）、または動物内の細胞または組織にオリゴヌ
クレオチドを投与することを意味している。 治療のため、細胞の過増殖を阻害する方法および異常
な増殖性状態を処置する方法が提供される。治療組成物
の処方および続いての投与は本分野の技術範囲であると
考えられる。一般に、治療のためには、本発明に従った
オリゴヌクレオチドを、医薬として許容可能な担体中、
特定の疾患の性質、その重態度および患者の全体の状態
に依存して変化するであろう用量および期間、そのよう
な治療が必要と思われる患者に投与する。本発明の医薬
組成物は、局所または全身処置が望まれるか、または処
置される領域に依存して多くの方法で投与されるであろ
う。局所（目、膣、直腸、鼻孔内を含む）、経口または
例えば、静脈内滴注、静脈注射または皮下、腹腔内もし
くは筋肉内注射による非経口で投与されるであろう。 局所投与のための処方には、軟膏、ローション、クリ
ーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、水剤および散
剤が含まれるであろう。通常の医薬担体、水性、粉末ま
たは油性基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望まし
いであろう。被覆コンドーム、グローブなどもまた有用
である。 経口投与のための組成物には散剤または顆粒剤、懸濁
剤または水または非水媒質溶液剤、カプセル剤、サッシ
ェ剤または錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、
乳化剤、分散補助剤または結合剤も望ましいであろう。 非経口投与のための処方には無菌水溶液が含まれ、そ
れには緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加物を含んで
いてもよい。 そのような医薬担体に加えて、オリゴヌクレオチドの
取り込みを容易にするためにカチオン性液体が処方に含
まれていてもよい。取り込みを容易にするそのような組
成物の一つはリポフェクチン（BRL,Bethesda MD）であ
る。 投与用量は処置されるべき状態の重度および応答度に
依存し、処置進行は治療が達成されるかまたは疾患状態
の軽減が達成されるまで数日から数カ月続く。至適投与
計画は体内の薬剤蓄積の測定から計算しうる。当業者は
容易に至適投与量、投与法および繰り返し頻度を決定し
うる。至適投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的
有効性に依存して変化するであろうが、一般的にはイン
ビトロおよびインビボの動物実験からのEC50に基づいて
計算しうる。例えば、化合物の分子量（オリゴヌクレオ
チド配列および化学構造から導かれる）およびIC50のよ
うな有効量（実験的に求められる）が与えられると、mg
/kgの投与量がルーチン的に計算される。 本発明はまた、癌、乾癬または血管狭窄またはアテロ
ームのような過増殖性疾患を有すると疑われる患者から
の組織または他の試料の異常増殖状態の診断にも適して
いる。細胞増殖を阻害する本発明のオリゴヌクレオチド
の能力は、そのような状態を診断するために用いられ
る。多くのアッセイが本発明を用いて計画できるが、そ
のようなアッセイは一般にそのような阻害を検出および
通常は定量化しうるように選択された条件下で組織試料
を本発明のオリゴヌクレオチドと接触させることを含ん
でいるであろう。同様に、本発明は有効な処置計画が設
計しうるように、他の病因を有する腫瘍からraf付随性
腫瘍を区別するために使用しうる。 本発明のオリゴヌクレオチドはまた研究目的にも使用
されるであろう。従って、オリゴヌクレオチドにより示
される特異的ハイブリダイゼーションはアッセイ、精
製、細胞生成物の調製および当業者により認められるで
あろう他の方法論で使用されるであろう。 本発明のオリゴヌクレオチドはまたraf発現の検出お
よび診断に有用である。例えば、ポリヌクレオチドキナ
ーゼによる５′末端の32P標識により放射性標識オリゴ
ヌクレオチドを製造しうる。Sambrook et al.,Molecu
la Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press,1989,第２巻,p10.59。次に、
放射性標識オリゴヌクレオチドをraf発現が疑われる組
織または細胞試料と接触させ、試料を洗浄して非結合オ
リゴヌクレオチドを除去する。試料に残存している放射
活性は結合されたオリゴヌクレオチドを示しており（そ
れはrafの存在を示している）、シンチレーションカウ
ンターまたは他の通常の手段により定量しうる。放射性
標識オリゴを用いて組織のオートラジオグラフィーを実
施し、研究、診断または治療の目的でraf発現の局在
化、分布または量を決定することができる。そのような
研究においては、組織切片を放射性標識オリゴヌクレオ
チドで処理し、上記のように洗浄し、次にルーチンオー
トラジオグラフィー法に従って写真乳化剤へ暴露する。
現像すると乳化剤はrafを発現している範囲に銀粒子の
イメージを与える。銀粒子の定量によりraf発現を検出
することができる。 raf発現の蛍光検出のための類似のアッセイは、放射
性標識の代わりにフルオレセインまたは他の蛍光性標識
とコンジュゲートさせた本発明のオリゴヌクレオチドを
用いて開発することができる。そのようなコンジュゲー
トは、蛍光標識アミダイトまたはCPG（例えば、Glen R
esearch、Sterling VAから入手可能なフルオレセイン
標識アミダイトおよびCPG。Glen Research、Sterling
VAの1993年のDNA研究用製品カタログp.21を参照され
たい）を使用した固相合成の間にルーチン的に製造され
る。 各々のこれらのアッセイの様式は本分野では既知であ
る。当業者は本発明の技術に従って容易にこれらの既知
のアッセイをraf発現の検出に適用でき、raf発現を検出
する新規かつ有用な手段が提供される。 ｃ−raf発現のオリゴヌクレオチド阻害 表１に示したオリゴヌクレオチドはGenbank ｃ−raf
配列HUMR AFR（Genbankリストx03484）を用いて設計
し、合成し、ノーザンブロットアッセイを用いてT24膀
胱癌細胞でのｃ−raf発現の阻害について試験した。す
べてホスホロチオエート主鎖を有するオリゴデオキシヌ
クレオチドである。 100nMまたは200nMの濃度でのオリゴヌクレオチドの第
一回目のスリーニングにおいて、オリゴヌクレオチド50
74、5075、5132、8034、7826、7827および7828はｃ−ra
f mRNAの少なくとも50％の阻害を示し、それ故これら
のオリゴヌクレオチドが好適である。オリゴヌクレオチ
ド5132および7826（配列ID番号:8および配列ID番号:1
7）は約90％を超える阻害を示し、より好適である。別
のアッセイにおいて、オリゴヌクレオチド6721,7848,78
47および8094はｃ−rafレベルを50％以上減少させた。
これらのオリゴヌクレオチドもまた好適である。これら
の内、7847（配列ID番号:22）はｃ−raf mRNAの約90％
を超える阻害を示し、より好適である。 rafに対するISIS5132の特異性 raf mRNAに対するISIS5132の特異性は、このオリゴ
ヌクレオチドをT24細胞においてHa−rasならびにｃ−ra
f mRNAを阻害する能力について試験するノーザンブロ
ットアッセイにより示された。Ha−rasは形質転換およ
び腫瘍発生への関与が示唆されている細胞性癌遺伝子で
ある。ISIS5132はHa−ras mRNAレベルに影響を与える
ことなくｃ−raf mRNAをほとんど完全になくすことが
示された。 ２′−修飾オリゴヌクレオチド こららのオリゴヌクレオチドのあるものは、ホスホジ
エステル（Ｐ＝Ｏ）またはホスホロチオエート（Ｐ＝
Ｓ）主鎖で合成され、また一様に２′−Ｏ−メチル、
２′−Ｏ−プロピルまたは２′−フルオロ基で糖の２′
位が置換されていた。オリゴヌクレオチドは表２に示さ
れている。 一様な２′−Ｏ−メチル修飾およびホスホロチオエー
ト主鎖を有する表２のオリゴヌクレオチドを、ウェスタ
ンブロットアッセイにより決定されるT24細胞における
ｃ−raf蛋白質発現の阻害能力について試験した。オリ
ゴヌクレオチド8033,7834および7835が最も大きな阻害
を示し、好適である。これらの内、8033および7834がよ
り好適である。 キメラオリゴヌクレオチド 配列ID番号:8を有するキメラオリゴヌクレオチドをを
合成した。これらのオリゴヌクレオチドは２′−Ｏ−メ
チル修飾ヌクレオチドの二つの領域により隣接される6,
8または10デオキシヌクレオチドの中心“ギャップ”領
域を有していた。主鎖は一様にホスホロチオエートであ
った。ノーザンブロット分析において、これらのオリゴ
ヌクレオチドの三つすべて（ISIS6720,6−デオキシギャ
ップ;ISIS6717,8−デオキシギャップ;ISIS6729,10−デ
オキシギャップ）がT24細胞におけるｃ−raf mRNA発現
の70％を超える阻害を示した。これらのオリゴヌクレオ
チドは好適である。８−デオキシギャップ化合物（671
7）は90％を超える阻害を示し、より好適である。 ２′−Ｏ−メチル修飾の一つまたはそれ以上の領域お
よび一様なホスホロチオエート主鎖を有する追加のキメ
ラオリゴヌクレオチドを合成した。これらは表３に示さ
れている。すべてホスホロチオエートであり；ボールド
体領域は２′−Ｏ−メチル修飾領域を示している。 ノーザンブロット分析によりそれらがｃ−raf mRNA
を阻害する能力を試験し、ISIS7848、7849、7851、785
6、7855、7854、7847および7853が70％より大きな阻害
を示し、好適である。これらの内、7851、7855、7847、
および7853が90％を超える阻害を示し、より好適であ
る。 種々の２′修飾を有する追加のキメラオリゴヌクレオ
チドを合成し、試験した。これらは表４に示されてい
る。すべてのホスホロチオエートであり；ボールド体領
域は２′−修飾領域を示している。 これらの内、オリゴヌクレオチド6720、6717、6729、
9720および9058が好適である。オリゴヌクレオチド671
7、6729、9720および9058がより好適である。 ２′−Ｏ−プロピル糖修飾およびキメラＰ＝O/P＝Ｓ
主鎖を有する二つのキメラオリゴヌクレオチドも合成し
た。これらは表５に示されており、そこでイタリック体
領域は２′が修飾されかつホスホジエステル主鎖を有す
る領域を示している。 癌細胞増殖の阻害 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドISIS5132がT2
4膀胱癌細胞増殖を阻害することが示された。細胞をリ
ポフェクチン（オリゴヌクレオチド取り込みを増加させ
るカチオン性脂質）とともに種々の濃度のオリゴヌクレ
オチドで処理した。表６に示したように細胞増殖の用量
依存性阻害が示され、ここで“なし”は非処理対照（オ
リゴヌクレオチドなし）を示し、“対照”は陰性対照オ
リゴヌクレオチドで処理したことを示している。結果は
非処理対照と比較したパーセント阻害として示されてい
る。 表６ ISIS5132によるT24細胞増殖阻害 オリゴ濃度 なし 対照 5132 50 nM ０ ＋９％ 23％ 100nM ０ ＋４％ 24％ 250nM ０ 10％ 74％ 500nM ０ 18％ 82％ T24ヒト膀胱癌腫瘍に対するISIS5132の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトT24膀胱癌腫移植片を
確立させ、ISIS5132および関連しない対照ホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドを25mg/kgの用量で週に３回
腹腔内に投与することにより処理した。この予備的研究
において、ISIS5132は11日後対照と比較して35％腫瘍増
殖を阻害した。オリゴヌクレオチド処理腫瘍は研究期間
を通して対照腫瘍より小さかった。 MDA−MB231乳癌腫瘍に対するISIS5132の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトMDA−MB231乳癌腫移植
片を確立させ、ISIS5132および関連しない対照ホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチドを0.6mg/kgまたは6.0mg/
kgの用量で１日１回静脈内に投与することにより処理し
た。ISIS5132は27日後（研究の終了日）対照と比較して
約80％腫瘍増殖を阻害した。 ISIS5132はまた、ヌードマウス中のMDA−MB231移植片
に対し腹腔内に投与しても有効であった。オリゴヌクレ
オチドは１日１回0.6mg/kgまたは6.0mg/kgで投与した。
27日後（研究の終了日）、腫瘍体積は対照と比較して57
％（0.6mg/kg）または64％（6.0mg/kg）阻害された。 MDA−MB231腫瘍におけるｃ−raf RNAレベルに対するIS
IS5132の効果 RNAをMDA−MB231腫瘍移植片から単離し、ノーザンブ
ロットを実施してraf RNAレベルに対するオリゴヌクレ
オチドの効果を評価した。ISIS5132は27日後に、静脈内
投与の場合は67％および腹腔内投与の場合は39％、raf
RNAレベルを減少させた（いずれも6mg/kg）。 Colo205ヒト結腸癌腫瘍に対するISIS5132の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトColo205結腸癌腫移植
片を確立させ、ISIS5132および関連しない対照ホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチドを、6.0mg/kgの用量で１
日１回静脈内に投与することにより処理した。この研究
において、ISIS5132は25日後に対照と比較して40％以上
腫瘍増殖を阻害した。 A549ヒト肺腺癌腫瘍に対するISIS5132の効果 皮下ヒトA549肺腺癌異種移植片をオスBalb/cヌードマ
ウスで確立させ、0.006から6.0mg/kgの範囲の用量での
静脈内注射による毎日の投与によりISIS5132および対照
オリゴヌクレオチドで処理した。図1Aに示されるよう
に、ISIS5132はすべての用量で用量応答的に腫瘍サイズ
を減少させた。スクランブル化rafオリゴヌクレオチドI
SIS10353はどの用量でも効果はなかった（図1B）。 A549腫瘍細胞におけるｃ−raf RNAレベルに対するISIS
5132の効果 A549腫瘍移植片からRNAを単離し、ノーザンブロット
を実施してraf RNAレベルに対するオリゴヌクレオチド
の効果を評価した。ISIS5132はraf RNAレベルを段々と
減少させ、それはオリゴ処理から８時間後に始まった。
実験を13日目で終了させた時、RNAレベルはまだ減少し
つつあり、対照の約15％のレベルに達していた。 A549肺移植片腫瘍に対するISIS6717、２′−Ｏ−メチル
ギャップ形成オリゴヌクレオチドの効果 表４に示したISIS6717、２′−Ｏ−メチルギャップ形
成オリゴヌクレオチドがA549腫瘍移植片増殖を阻害する
能力をISIS5132と比較した。0.006、0.06、0.6および6.
0mg/kgの用量での静脈内投与では、二つのオリゴヌクレ
オチドの腫瘍増殖に対する効果は実質的に区別できなか
った。従って、ISIS6717は本発明の好適な態様である。 Ａ−rafを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド Ａ−raf mRNAの一部を標的とし、Ａ−raf発現を阻害
するある種のオリゴヌクレオチドは細胞過増殖の阻害に
有用であると考えられる。そのようなアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを用いるＡ−raf発現阻害のための方法
も同様に細胞過増殖の阻害に有用であると考えられる。 表７に示したホスホロチオエート デオキシオリゴヌ
クレオチドをGenbank Ａ−raf配列HUMARAFIR（Genbank
リストx0479 ０）を利用して設計し合成した。 オリゴヌクレオチドISIS9061、ISIS9069およびISIS1022
8を、A549、T24およびNHDF細胞中のＡ−raf mRNAレベ
ルに対するそれらの効果についてノーザンブロット分析
により評価した。三つのオリゴヌクレオチドはすべて三
つ細胞型のすべてにおいて用量依存的様式でＡ−rafRNA
レベルを減少させ、すべての細胞型において500nMの用
量で50％を超える阻害を示した。最大阻害（88％）はT2
4細胞においてISIS9061および9069で達成された。これ
ら三つのオリゴヌクレオチド（ISIS9061、9069および10
228）は好適であり、ISIS9061および9069がより好適で
あった。 ラットおよびマウスｃ−rafを標的とするオリゴヌクレ
オチドの同定 rafキナーゼにより媒介されると考えられている多く
の状態は，ヒトにおける研究を実施することができな
い。例えば、組織移植片拒否反応はraf発現を妨害する
ことにより改善されるように見える状態である；しか
し、明らかにこのことはヒト移植患者ではなく動物で評
価されねばならない。別のそのような例は再狭窄であ
る。しかしながら、これらの状態はここで使用したラッ
トおよびマウスモデルのような動物モデルでは試験可能
である。 ラットおよびマウス細胞でｃ−raf発現を阻害するた
めのオリゴヌクレオチド配列が同定された。ラットおよ
びマウスｃ−raf遺伝子は高度に相同的な領域を有して
いる；ヒトｃ−rafを標的とするオリゴヌクレオチドの
評価から得られた情報を用いてラットおよびマウス両方
のｃ−rafm RNA配列を標的とする一連のオリゴヌクレオ
チドを設計し、合成した。これらのオリゴヌクレオチド
をノーザンブロット分析を用いてマウスbEND細胞および
ラットＡ−10細胞での活性についてスクリーニングし
た。オリゴヌクレオチド（すべてホスホロチオエート）
は表８に示されている： オリゴヌクレオチドISIS11061および107070は400nMの用
量でマウスbEND細胞でのｃ−raf RNAレベルを90％を超
えて阻害することが見いだされた。これら二つのオリゴ
ヌクレオチドは200nMの濃度でラットＡ−10細胞のraf
RNAレベルを実質的に完全に阻害した。ISIS10707のIC50
は、マウスbEND細胞で170nMであり、ラットＡ−10細胞
で85nMであることが見いだされた。ISIS11061のIC50
は、マウスbEND細胞で85nMであり、ラットＡ−10細胞で
30nMであると決定された。 マウスにおける内在性ｃ−raf RNA発現に対するISIS11
061の効果 マウスに３日間毎日ISIS11061（50mg/kg）または対照
オリゴヌクレオチドまたは対照塩溶液を腹腔内に注射し
た。動物を殺し、器官をノーザンブロット分析によりｃ
−raf mRNA発現について分析した。ISIS11061は肝臓の
ｃ−raf mRNAを約70％減少させることが観察された。
対照オリゴヌクレオチドはｃ−raf発現には何の影響も
与えなかった。ISIS11061の効果はｃ−rafに特異的であ
った;A−rafおよびG3PDH RNAレベルはオリゴヌクレオ
チド処理により影響を受けなかった。 ｃ−rafに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはマ
ウス心臓同種移植モデルにおいて生存を延長させる 同種移植拒否反応を防止するｃ−rafアンチセンスオ
リゴヌクレオチドISIS11061の治療的効果を決定するた
め、マウス血管新生化異所性心臓移植モデルにおける活
性についてこのオリゴヌクレオチドを試験した。本質的
にはIsobe etal.,Circulation 1991,84,1246−1255に
より記載されているように、一次血管新生化移植片とし
てC57BI10マウスからの心臓をC3Hマウスの腹部腔内へ移
植した。オリゴヌクレオチドを７日間アルゼットポンプ
を通して連続的に静脈内投与した。非処理マウスの平均
同種移植片生存時間は7.83±0.75日であった（７、７、
８、８、８、９日）。20mg/kgまたは40mg/kgのISIS1106
1で７日間処理したマウスの同種移植片はすべて少なく
とも11日生存していた（20mg/kgでは11、11、12日、お
よび40mg/kgでは＞11、＞11、＞11日）。 ラットで行われた試験的研究では、Lewisラットから
の心臓をACIラットの腹部腔内へ移植した。ラットにア
ルゼットポンプを通して20mg/kgのISIS11061を７日間投
与した。非処理ラットの平均同種移植片生存時間は8.86
±0.69日であった（８、８、９、９、９、９、10日）。
オリゴヌクレオチド処理ラットの平均同種移植片生存時
間は15.3±1.15日であった（14、16、16日）。 平滑筋細胞増殖に対するｃ−rafを標的とするアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの効果 平滑筋細胞増殖は、例えば血管形成術後のアテローム
および再狭窄のような血管狭窄の原因である。Ａ−10ラ
ット平滑筋細胞の増殖に対するISIS11061の効果を決定
するために実験を行った。培養細胞をISIS11061（リポ
フェクチンを加えて）を添加して、または添加せずに増
殖させ、ウシ胎児血清で刺激後24時間および48時間に細
胞増殖を測定した。ISIS11061（500nM）は用量応答的に
血清刺激細胞増殖を阻害することが観察され、24時間お
よび48時間後の最大阻害は各々46％および75％であっ
た。この化合物について200nMのIC50値が得られた。非
相関対照オリゴヌクレオチドは500nMの用量まで影響を
与えなかった。 ラットにおける再狭窄に対するｃ−rafを標的とするア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの効果 血管形成術再狭窄のラット頚動脈障害モデルは開発さ
れており、ｃ−myc癌遺伝子を標的とするアンチセンス
オリゴヌクレオチドの再狭窄に対する効果を評価するた
めに使用されてきた。Bennett et al.,J.Cli.Invest.
1994,93,820−828。このモデルを用いて再狭窄に対する
ラットｃ−rafを標的とするアンチセンスオリゴヌクレ
オチド（特にISIS11061）の効果を評価することができ
る。バルーンカテーテルによる頚動脈損傷に続いて、オ
リゴヌクレオチドを静脈内注射、アルゼットポンプを通
した連続的静脈内投与またはBennettらにより記載され
ているようなプルロニックゲルマトリックスでの頚動脈
への直接投与により投与する。回復後、ラットを殺し、
頚動脈を顕微鏡により試験して、ルミナール断面積に対
する処理の効果を決定する。 本発明は以下の実施例によりさらに例示されるが、そ
れらは例示のためだけであり、本発明を特定の態様に制
限することを意図しているものではない。 実施例 実施例１ オリゴヌクレオチドの合成および特性付け 非修飾DNAオリゴヌクレオチドはヨウ素による酸化を
行う標準ホスホロアミダイト化学を用いて自動化DNA合
成機（Applied Biosystems モデル380B）で合成し
た。β−シアノエチルジイソプロピル ホスホロアミダ
イトはApplied Biosystems（Foster City,CA）から購
入した。ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドにつ
いては、標準酸化ボトルをホスファイト結合の段階的チ
オ化のために0.2M Ｈ−1,2−ベンゾチオール−３−オ
ン 1,1−ジオキシドのアセトニトリル溶液で置き換え
た。チオ化サイクル待ち時間は68秒に増加し、続いてキ
ャッピング工程を行った。２′−Ｏ−メチル ホスホロ
チオエート オリゴヌクレオチドは２′−Ｏ−メチル
β−シアノエチルジイソプロピル−ホスホロアミダイト
（Chemgenes,Needham MA）および非修飾オリゴヌクレ
オチドのための標準サイクル（ただし、テトラゾールお
よび塩基のパルス運搬後の待ち時間を360秒に延長し
た）を用いて合成した。合成の開始に使用した３′−塩
基は２′−デオキシリボヌクレオチドであった。２′−
Ｏ−プロピルオリゴヌクレオチドはこの工程をわずかに
変更して製造した。 ２′−フルオロ ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドは５′−ジメトキシトリチル−３′−ホスホロアミ
ダイトを用いて合成し、1990年１月11日に出願された米
国特許出願第463,358号および1990号８月13日に出願さ
れた第566,977号（これらは本出願と同一の譲渡人に譲
渡されており、ここに引例として包含されている）に開
示されているように製造した。２′−フルオロ オリゴ
ヌクレオチドはホスホロアミダイト化学を用い、および
標準DNA合成プロトコールをわずかに変更して製造され
た：脱保護は室温でメタノール性アンモニアを用いて達
成された。 制御細孔ガラスカラム（Applied Biosystems）から
切断し、濃水酸化アンモニウム中55℃で18時間脱保護し
た後、オリゴヌクレオチドを2.5容量のエタノールで0.5
M NaClから二度沈澱させて精製した。分析ゲル電気泳
動は20％アクリルアミド、8M尿素、45mMトリス−ホウ酸
緩衝液、pH7.0で実施した。オリゴデオキシヌクレオチ
ドおよびそれらのホスホロチオエート類似体は80％を超
える完全長物質であることが電気泳動から判断された。 実施例２ ｃ−raf mRNA発現阻害のノーザンブロット
分析 ヒト膀胱癌細胞株T24はAmerican Type Culture Co
llection（Rockville MD）から得た。細胞は10％熱不
活性化ウシ胎児血清および各々50U/mlのペニシリンおよ
びストレプトマイシンを補給したＬ−グルタミンを含む
マッコイ5A培地（Gibco BRL,Gaithersburg MD）で増
殖させた。細胞は100mmプレートに播種した。それらが7
0％コンフルエントに達したとき、オリゴヌクレオチド
で処理した。プレートを10mlの前もって温めたPBSおよ
び2.5μｌのDOTMAを含む5mlのOpti−MEM還元血清培地で
洗浄した。リポフェクチンを含むオリゴヌクレオチドを
所望の濃度まで添加した。処理して４時間後、培地をマ
ッコイ培地に置き換えた。オリゴヌクレオチド処理後24
から72時間後に細胞を集め、標準CsCl精製法を用いてRN
Aを単離した。Kingston,R.E.,Current Protocols in
Molecular Biology,（F.M.Ausbel,R.Brent,R.E.King
ston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidman and K.Strah
l,eds）,John Wiley andSons,NY。全RNAはCsClクッシ
ョン上での細胞溶解物の遠心分離により単離した。RNA
試料は1.2％アガロース−ホルムアルデヒド ゲルを通
して電気泳動し,12−14時間以上かけてキャピラリー核
酸によりハイブリダイゼーション膜に移した。RNAはStr
atalinker（Stratagene,La Jolla,CA）内でUV光へ暴露
することにより膜と架橋させ、ランダム−プライム化32
P−標識ｃ−raf cDNAプローブ（ATCCから得られた）ま
たは対照としてG3PDHプローブとハイブリダイズさせ
た。RNAはPhosphorimager（Molecular Dynamics,Sunny
vale,CA）を用いて定量した。 実施例３ T24細胞におけるｃ−rafキナーゼ蛋白質の特
異的阻害 T24細胞をＴ＝０およびＴ＝24時間目にオリゴヌクレ
オチド（200nM）およびリポフェクチンで処理した。蛋
白質抽出物をＴ＝48時間に調製し、アクリルアミドで電
気泳動し、ｃ−raf（UBI,Lake Placid,NY）またはＡ−
raf（Transduction Laboratories、Knoxville,TN）に
対するポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット
により分析した。放射性標識第二抗体を使用し、raf蛋
白質はPhosphorimager（Molecular Dynamics,Sunnyval
e,CA）を用いて定量した。 実施例４ 細胞増殖のアンチセンス阻害 第０日にT24細胞を種々の濃度のオリゴヌクレオチド
およびリポフェクチンで２時間処理した（50nMオリゴヌ
クレオチドおよび２μg/mlリポフェクチン;100nMオリゴ
ヌクレオチドおよび２μg/mlリポフェクチン;250nMオリ
ゴヌクレオチドおよび６μg/mlリポフェクチンまたは50
0nMオリゴヌクレオチドおよび10μg/mlリポフェクリ
ン）。第１日に細胞を所望のオリゴヌクレオチド濃度で
２時間、２回目の処理を行った。第２日に細胞を計数し
た。 実施例５ ヌードマウスにおけるT24ヒト膀胱癌腫瘍異
種移植片に対するISIS5132の効果 5x106のT24細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下に移
植した。オリゴヌクレオチド（塩溶液に懸濁したISIS51
32および非相関対照ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チド）を腫瘍細胞接種４日後から週に３回投与した。塩
溶液のみの対照もまた実施した。オリゴヌクレオチドは
腹腔内注射により与えた。オリゴヌクレオチド用量は25
mg/kgであった。処理から11、15および18日目に腫瘍サ
イズを測定し、腫瘍体積を計算した。 実施例６ ヌードマウスにおけるMDA−MB231ヒト乳癌腫
瘍異種移植片に対するISIS5132の効果 5x106のMDA−MB231細胞をヌードマウスの右内側腿の
皮下に移植した。オリゴヌクレオチド（塩溶液に懸濁し
たISIS5132および非相関対照ホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチド）を腫瘍細胞接種10日後から毎日１回投与
した。塩溶液のみの対照もまた実施された。オリゴヌク
レオチドは0.6mg/kgまたは6.0mg/kgの用量で静脈内注射
により与えた。腫瘍細胞接種の10、13、16、20、23およ
び27日後に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算した。 腹腔内オリゴヌクレオチド投与においては、オリゴヌ
クレオチドを腫瘍細胞接種10日後から毎日１回投与し
た。塩溶液のみの対照もまた実施された。オリゴヌクレ
オチドは0.6mg/kgまたは6.0mg/kgの用量で腹腔内注射に
より与えた。腫瘍細胞接種の10、13、16、20、23および
27日後に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算した。 実施例７ ヌードマウスにおけるColo205ヒト結腸癌腫
瘍異種移植片に対するISIS5132の効果 5x106のColo205細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下
に移植した。オリゴヌクレオチド（塩溶液に懸濁したIS
IS5132および非相関対照ホスホロチオエートオリゴヌク
レオチド）を腫瘍細胞接種５日後から毎日１回投写し
た。塩溶液のみの対照もまた実施された。オリゴヌクレ
オチドは静脈内注射により与えた。オリゴヌクレオチド
用量は6mg/kgであった。腫瘍細胞接種の５、８、11、1
4、18、22および25日後に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体
積を計算した。 実施例８ ヌードマウスにおける異種移植片を用いたra
f付随腫瘍のための診断アッセイ 本アッセイを用いて、raf発現により生じる腫瘍を診
断し他の腫瘍と区別する。腫瘍のバイオプシ試料を使用
して（例えば、コラゲナーゼまたはトリプシンまたは他
の常法により）、腫瘍の塊を解離させた。5x106の腫瘍
細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下に移植した。塩溶
液に懸濁したアンチセンスオリゴヌクレオチド（例え
ば、ISIS5132）を腫瘍細胞接種４日後から週に３回一つ
またはそれ以上のマウスに投与した。対照マウスには塩
溶液のみを投与した。オリゴヌクレオチド用量は25mg/k
gであった。処理の11日後に腫瘍サイズを測定し、腫瘍
体積を計算した。オリゴヌクレオチド処理マウスの腫瘍
体積を対照マウスのものと比較した。処理マウスraf付
随腫瘍の体積は対照マウスより測定可能なほど小さかっ
た。raf発現以外の原因で生じる腫瘍はrafを標的とする
オリゴヌクレオチドに応答しないと予測され、したがっ
てオリゴヌクレオチド処理および対照マウスの腫瘍容量
は等しい。 実施例９ raf発現の検出 オリゴヌクレオチドを合成後、ポリヌクレオチドキナ
ーゼで５′末端を32Pで放射性標識した。Sambrook et
al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Col
d Spring Harbor Laboratory Press,1989,第２巻,p
g.11.31−11.32。放射性標識オリゴヌクレオチドを特異
的ハイブリダイゼーションを起こすことができる条件
下、腫瘍バイオプシ試料または乾癬が疑われる皮膚試料
のようなraf発現が疑われる組織または細胞試料と接触
させ、試料を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去
した。試料に残存する放射活性は結合オリゴヌクレオチ
ドを示し、シンチレーションカウンターまたは他の通常
手段を用いて定量した。 本発明の放射標識オリゴヌクレオチドはまたオートラ
ジオグラフィーでも使用される。組織切片を放射性標識
オリゴヌクレオチドで処理し、上記のように洗浄した
後、標準オートラジオグラフィー法に従って写真用感光
乳剤を暴露した。乳剤を現像するとrafを発現している
領域の銀粒子のイメージが得られた。raf発現の程度は
銀粒子を定量することにより決定された。 raf発現の蛍光検出のための類似のアッセイは、フル
オレセインまたは他の蛍光標識で標識された本発明のオ
リゴヌクレオチドを使用した。標識化DNAオリゴヌクレ
オチドはヨウ素による酸化を行う標準ホスホロアミダイ
ト化学を用いて自動化DNA合成機（Applied Biosystems
モデル380B）で合成した。β−シアノエチルジイソプ
ロピル ホスホロアミダイトはApplied Biosystems（F
oster City,CA）から購入した。フルオレセイン−標識
アミダイトはGlen Research（Sterling VA）から購入
された。オリゴヌクレオチドおよび生物試料のインキュ
ベーションは放射性標識オリゴヌクレオチドで記載した
ように実施したが、raf発現を示す蛍光を検出するため
にはシンチレーションカウンターの代わりに蛍光光度計
または蛍光顕微鏡を使用した。 実施例10:A549異種移植片 5x106のA549細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下に
移植した。塩溶液に懸濁したオリゴヌクレオチド（ISIS
5132およびスクランブルraf対照ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチド、ISIS10353）を、0.006から6.0mg/kg
の範囲の容量で毎日１回静脈内に注射することにより投
与した。生じた腫瘍は９、12、17および21日後に測定
し、腫瘍容量を計算した。 実施例11:内因性ｃ−raf発現に対するオリゴヌクレオチ
ドの効果 マウスを第１、２および３日に50mg/kgのオリゴヌク
レオチド用量で腹腔内注射することにより処理した。第
４日に動物を殺し、ノーザンブロット分析によるｃ−ra
f mRNAアッセイのために器官を除去した。４群の動物
を用いた:1）オリゴヌクレオチド処理なし（塩溶液）;
2）陰性対照オリゴヌクレオチドISIS1082（単純ヘルペ
スウイルスを標的とする）;3）陰性対照オリゴヌクレオ
チド4189（マウス蛋白質キナーゼＣ−αを標的とす
る）;4）げっし類ｃ−rafを標的とするISIS11061。 実施例12:心臓同種移植片モデル 本質的にIsobe etal.,Circulation 1991,84,1246−
1255により記載されているように、一次血管新生化移植
片として心臓をラットまたはマウス（ドナーとは異なる
種）の腹部腔内へ移植した。オリゴヌクレオチドは７日
間アルゼットポンプを通して連続的に静脈内投与した。
心臓同種移植片の生存は腹部腔の第二の心拍の存在を聞
くことによりモニターした。 実施例13:ラットＡ−10平滑筋細胞を用いる増殖アッセ
イ A10細胞を10％ウシ胎児血清を加えたダルベッコ改良
イーグル培地（DMEM）を含む96−ウェルプレートに入
れ、24時間放置して付着させた。更に24時間0.2％ウシ
胎児血清を加えたダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）
で細胞を静止させた。静止の最後の４時間の間に細胞を
無血清培地に溶解したISIS11061＋リポフェクチン（Gib
co−BRL,Bethesda MD）で処理した。次に、培地を除い
て新鮮な培地に交換し、細胞を10％ウシ胎児血清で刺激
した。次にプレートをインキュベーター内に置き、血清
刺激の24および48時間後にMTSのホルマザンへの変換に
より細胞増殖を評価した（Promega 細胞増殖キッ
ト）。対照オリゴヌクレオチドISIS1082（単純ヘルペス
ウイルスを標的とする非相関オリゴヌクレオチド）もま
た試験した。 実施例14:ラット頚動脈再狭窄モデル このモデルはBennett et al.,J.Clin.Invest.1994,
93,820−828により記載されている。ラット頚動脈のバ
ルンカテーテル拡張により動脈内膜過形成を誘導した。
ラットを麻酔し、20mlの塩溶液で膨張させるバルン塞栓
切除術カテーテルを通過させることにより総頚動脈損傷
を誘導した。オリゴヌクレオチドはプルロニックゲル溶
液として動脈壁の外膜表面に適用した。オリゴヌクレオ
チドは４℃で0.25％プルロニックゲル溶液（F127、BASF
Corp.）に所望の用量で溶解した。100μｌのゲル溶液
を損傷直後の総頚動脈の末端３分の１に適用した。対照
ラットは対照オリゴヌクレオチドを含むまたはオリゴヌ
クレオチドを含まないゲルで同様に処理した。首の傷を
縫合し、動物を回復させた。14日後にラットを殺してし
ゃ血し、そのままパラホルムアルデヒドおよびグルタル
アルデヒドで潅流して頚動脈を固定し、切り出して顕微
鏡用に調製した。動脈の断面積を計算した。 プルロニックゲル投与法と別の方法では、ラットをオ
リゴヌクレオチドの静脈注射または連続的静脈内注入
（アルゼットポンプを通して）により処理する。
【配列表】
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ボッグズ，ラッセル・ティー アメリカ合衆国カリフォルニア州92007, カーディフ−バイ−ザ−シー，オックス フォード・アベニュー 2317 (56)参考文献 米国特許4740463（ＵＳ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，23, 3146−3150（1993) Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，15 （２），595−609（1987) Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，14 （２），1009−1015（1986) Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，90（４），548 −550，558，571−573（1990) Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ ｃａｔｉｏｎｓ”，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ 1993 ｂｙ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ, ｐ．13−16 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90

Claims (34)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトｃ−rafをコードするmRNAを標的と
    し、かつraf発現を阻害しうる、配列番号８、12、17、2
    0、21、22、23、24、25、26または27を有する、20から5
    0ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】少なくとも１つのホスホロチオエート結合
    を有する、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】オリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニッ
    トの少なくとも１つが糖部分の２′位で修飾されてい
    る、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】前記糖部分の２′位における修飾が２′−
    Ｏ−アルキルまたは２′−フルオロ修飾である、請求項
    ３記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項５】配列番号８を有するオリゴヌクレオチド。
  6. 【請求項６】少なくとも１つの２′−Ｏ−メチル修飾を
    含む、請求項５記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 【請求項７】ヒトｃ−rafをコードするmRNAを標的と
    し、標的親和性を増強するように修飾されている少なく
    とも１つのヌクレオチドを有する第１の領域およびRNAs
    eHの基質である第２の領域を含む、配列番号８、12、1
    7、20、21、22、23、24、25、26または27を有する、20
    から50ヌクレオチド長さのキメラオリゴヌクレオチドで
    あって、raf発現を阻害することができることを特徴と
    するキメラオリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項８】標的親和性を増強するように修飾されてい
    るヌクレオチドが糖部分の２′位で修飾されている、請
    求項７記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 【請求項９】糖部分の２′位における修飾が２′−Ｏ−
    アルキルまたは２′−フルオロ修飾である、請求項８記
    載のオリゴヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】RNAseHの基質である領域が少なくとも１
    つの２′−デオキシヌクレオチドを含む、請求項７記載
    のオリゴヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】少なくとも１つのホスホロチオエート結
    合を有する、請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】配列番号８、21、24、25、26または27を
    含む、請求項11記載のオリゴヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】標的親和性を増強するように修飾されて
    いる少なくとも１つのヌクレオチドを有する第１の領域
    およびRNAseHの基質である第２の領域を含む、配列番号
    ８を有するキメラオリゴヌクレオチドであって、rafの
    発現を阻害しうることを特徴とするキメラオリゴヌクレ
    オチド。
  14. 【請求項１４】インビトロまたはヒトを除く動物におい
    てヒトrafの発現を阻害する方法であって、ヒトrafを発
    現する組織または細胞を、請求項１−13のいずれかに記
    載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。
  15. 【請求項１５】前記ヒトrafの発現が異常な発現であ
    る、請求項14記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記オリゴヌクレオチドがキメラオリゴ
    ヌクレオチドである、請求項14記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記キメラオリゴヌクレオチドが配列番
    号８、21、24、25、26または27を含む、請求項16記載の
    方法。
  18. 【請求項１８】前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１
    つのホスホロチオエート結合を有する、請求項14記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】インビトロまたはヒトを除く動物におい
    てヒトrafの発現を阻害する方法であって、ヒトrafを発
    現する組織または細胞を配列番号８を有するオリゴヌク
    レオチドと接触させることを含む方法。
  20. 【請求項２０】インビトロまたはヒトを除く動物におい
    て細胞の過増殖を阻害する方法であって、過増加細胞を
    請求項１−13のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドと
    接触させることを含む方法。
  21. 【請求項２１】前記オリゴヌクレオチドがキメラオリゴ
    ヌクレオチドである、請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記キメラオリゴヌクレオチドが配列番
    号８、21、24、25、26または27を含む、請求項21記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１
    つのホスホロチオエート結合を有する、請求項20記載の
    方法。
  24. 【請求項２４】インビトロまたはヒトを除く動物におい
    て細胞の過増殖を阻害する方法であって、過増殖細胞を
    配列番号８を有するオリゴヌクレオチドと接触させるこ
    とを含む方法。
  25. 【請求項２５】ヒトを除く動物において異常な増殖性状
    態を処置する方法であって、異常な増殖性状態を有する
    と疑われる患者または前記患者の細胞、組織もしくは体
    液を、請求項１−13のいずれかに記載のオリゴヌクレオ
    チドと接触させることを含む方法。
  26. 【請求項２６】状態が過増殖性疾患である、請求項25記
    載の方法。
  27. 【請求項２７】過増殖性疾患が癌、再狭窄、乾癬または
    Ｔ−細胞の活性化および成長により特徴づけられる疾患
    である、請求項26記載の方法。
  28. 【請求項２８】前記オリゴヌクレオチドがキメラオリゴ
    ヌクレオチドである、請求項25記載の方法。
  29. 【請求項２９】前記キメラオリゴヌクレオチドが配列番
    号８、21、24、25、26または27を含む、請求項28記載の
    方法。
  30. 【請求項３０】前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１
    つのホスホロチオエート結合を有する、請求項25記載の
    方法。
  31. 【請求項３１】ヒトを除く動物において異常な増殖性状
    態を処置する方法であって、異常な増殖性状態を有する
    と疑われる患者、または前記患者の細胞、組織もしくは
    体液を、配列番号８を有するオリゴヌクレオチドと接触
    させることを含む方法。
  32. 【請求項３２】ヒトrafの発現を阻害するための医薬組
    成物であって、請求項１−13のいずれかに記載のオリゴ
    ヌクレオチドを含む組成物。
  33. 【請求項３３】細胞の過増殖を阻害するための医薬組成
    物であって、請求項１−13のいずれかに記載のオリゴヌ
    クレオチドを含む組成物。
  34. 【請求項３４】異常な増殖性状態を処置するための医薬
    組成物であって、請求項１−13のいずれかに記載のオリ
    ゴヌクレオチドを含む組成物。
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