JPH11511002A

JPH11511002A - Ｃａｐｌ特異的オリゴヌクレオチドおよび転移性癌を抑制する方法

Info

Publication number: JPH11511002A
Application number: JP8525157A
Authority: JP
Inventors: フォスタッド，オイステイン; ホーヴィグ，エイヴィンド; エンイェブラーテン，オラフ; マエランスモ，グンヒルド; アグラワル，サドヒル; ヴォン・ホフ，エリック
Original assignee: ハイブリドン・インコーポレイテッド; ザ・ノーウェジアン・ラジウム・ホスピタル・リサーチ・ファウンデーション
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-02-16
Publication date: 1999-09-28
Also published as: US5789248A; EP0804585A1; US5872007A; NO973769L; AU4984696A; US5877308A; WO1996025499A1; NO973769D0; CA2213233A1

Abstract

(57)【要約】ＣＡＰＬ核酸に相補的なヌクレオチド配列を有する合成オリゴヌクレオチド（リボザイムを含む）を開示する。ＣＡＰＬ特異的オリゴヌクレオチドを用いたＣＡＰＬ遺伝子の発現を抑制する方法および転移性癌を抑制する方法もまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＡＰＬ特異的オリゴヌクレオチドおよび転移性癌を抑制する方法発明の技術分野本発明は癌治療に関する。特に、本発明は転移性癌を制御および治療するための合成オリゴヌクレオチドの使用に関する。発明の背景腫瘍の進行は腫瘍細胞集団内で選択的な増殖特性を有する変異細胞が発生する場合に起こると考えられている（フォウルズ（Ｆoulds）（１９７５）Ｎeoplast ic Ｄev.、第２巻、アカデミック・プレス（Ａcademic Ｐress）、ロンドン）。腫瘍の進行の最終段階の１つは転移性の表現型の出現である（ニコルソン（Ｎic olson（１９８４））Ｃancer Ｍetast.Ｒev．３：２４−４２）。転移の間に、該腫瘍細胞は血管に侵入し、循環する宿主の免疫防御に対して生き残り、ついで血管外遊出（extravasate）し、着床し、ついで第１次腫瘍の位置から遠く離れた部位で増殖する（ニコルソン(Ｎicolson)（１９８２）Ｂiochim．Ｂiophys．Ａcta ６９５：１１３−１７６；およびニコルソン（１９８７）Ｃancer Ｒes．４７：１４７３−１４８７）。腫瘍細胞の近隣組織への侵入および他の器官に着床するこの能力は癌関連死の主要な原因である。転移という語には癌死へと最も頻繁に導く臨床的な問題となる多数の表現型の特徴を含む。該細胞はその接着性を喪失し、組織化された組織内の限られた位置にとどまり、近隣部位へと移動し、血管からの侵入および遊出（egress）の両方の能力を増大させ、本来のではない位置または環境で増殖することができる。増殖パターンにおけるこれらの変化は転移性のプロセスを促進する能力を有する生化学的変化の蓄積を伴う。転移性癌は体の多数の異なる領域に（骨が最も頻繁におこる部位の１つである）侵入する。例えば、癌腫および時には肉腫からでさえの転移は骨格に広がることが知られている。骨格の転移は無症状であるかまたは第１次腫瘍と同様のメカニズムによる症状、すなわち、痛み、腫張、変形、骨髄中の造血幹細胞組織への侵入、脊髄または神経根の圧縮および病理学上の骨折などを生み出す。さらに、急速に溶解する骨格転移は過カルシウム血症となることができる。転移の痛みが多く、しばしばこのような衰弱させる効果のため一層よい治療および改良された方法が至急に必要である。これまでのところ、転移のカスケードに関する本質的なメカニズムは殆ど知られていない。いくつかの場合においてある腫瘍細胞の増大した転移能は癌遺伝子の増大した発現のためであり、癌遺伝子は通常は細胞の多様な機能（分化、増殖、細胞運動およびコミュニケーションを含む）のコントロールを担う（カーンズ（Ｃairns）（１９８１）Ｎature ２８９：３５３−５７；バーガー（Ｂerger）ら（１９８８）Ｃancer Ｒes．４８：１２３８−１２４３；およびクライン（Ｋ lein）ら（１９８５）Ｎature ３1５：１９０−１９５）。近年、このプロセスに関連するとされるいくつかの遺伝子が同定された。例えば、Ｃa²⁺結合タンパク質のＳ１００ファミリーのいくつかのメンバーは悪質新生物の進行、腫瘍発生および転移能の異なる側面と関連する（エブラリズ（Ｅbr alidze）ら（１９８９）Ｇenes ＆Ｄev．３：１０８６−１０９２；リー（Ｌee ）ら（１９９２）Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．８９：２５０４−２５０８））。このファミリーは組織特異的および細胞特異的なやり方で発現する１３のヒトのメンバーからなる。これらのタンパク質は事実上すべての第１次および転移性の黒色腫などの多様なヒトの腫瘍において見られ、腫瘍の組織病理発生の同定のためのマーカーとして使用される（例えば、リーら（１９９２）Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．（ＵＳＡ）８９：２５０４−２５０８）。Ｓ１００タンパク質の正常な細胞の機能は必須のシグナルトランスダクション経路への関連、細胞の発生および分化の制御および細胞骨格構成への関与などを含む幾つかは示唆されているものの明らかにされていない（クリグマン（Ｋligman）ら（１９８８）Ｔre nds．Ｂiol．Ｓci．１３：４３７−４４３）。ある特定のヒトＳ１００タンパク質を染色体１（Ｉq２１−２２）に局在化されたＣＡＰＬ遺伝子と少なくとも５つの他の構造的に関連した遺伝子によってコードされると見出された（エングルカンプ（Ｅnglekamp）ら（１９９２）Ｂioch em．３１：１０２５８−１０２６４；エンゲルカンプ（Ｅngelkamp）ら（１９９３）Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．（ＵＳＡ）９０：６５４７−６５５１）。そのマウスの対応物mts１は転移性のマウス乳癌に発現する（エブラリズら（１９８９）Ｇenes Ｄev．３：１０８６−１０９３）。これらの遺伝子、すなわちＳ１００ファミリーの小（１０ｋＤ）Ｃa²⁺結合タンパク質をコードする遺伝子は特に、Ｃa²⁺結合ドメインをコードする領域において高程度のホモロジーを共有する（モンクリフ（Ｍoncrief）（１９９０）Ｊ．Ｍol．Ｅvol．３０：５２２− ５６２）。どの癌が転移性となるかのメカニズムならびにＳ１００関連遺伝子の機能および転移性癌の進行におけるタンパク質の機能は未だ解明されていない。これらの基礎にあるプロセスの一層の理解は該疾患の進行に関与する遺伝子の発現を抑制する方法を含み、確かに必要とされている転移性癌の一層効果的な治療および制御方法を提供する。発明の概要本発明は転移性癌を治療および制御する方法および組成物を提供する。これらの組成物および方法はＣＡＰＬがたいていの骨肉腫組織および確立された骨肉腫細胞株において他の腫瘍の型において観察されるレベルに比較して高いレベルで発現するという現在の発見に基づいて開発された。ＣＡＰＬ転写物に特異的なリボザイムは、トランスフェクションされるヒト転移性癌細胞株におけるＣＡＰＬ発現を減少させ、増殖の速度を減少させ、ついでその形態を変えることもまた見出された。さらに、このリボザイムは該リボザイムでトランスフェクションしたヒト骨肉腫細胞で注入した哺乳動物モデルにおいて骨転移の進行を効果的に減少させる。これらの発見を用いて本発明がなされ、本発明は第一の態様においてＣＡＰＬ核酸に相補的であるヌクレオチド配列を有する合成オリゴヌクレオチドを含む。本発明の目的のため、「合成オリゴヌクレオチド」とは６またはそれ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が少なくとも１つの５'→３'のインターヌクレオチド結合を介して互いに結合している化学的に合成されたポリマーを含む意味である。この結合はアンチセンス技術において公知である任意の結合を含んでよい。このような分子は３'末端および５'末端を有する。「核酸に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」なる語は、生理学的条件下で例えばワトソン−クリックの塩基対形成（オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸間の相互作用）またはフーグスティーンの塩基対形成（オリゴヌクレオチドと二本鎖核酸間の相互作用）またはオリゴヌクレオチドがＲＮＡに結合し、偽の結合（pseudoknott）を形成する場合を含む他の任意の手段によって核酸に結合する６〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列を含むよう意図されている。生理学的条件下のこのような結合（ワトソン−クリックの塩基対形成による）は核酸配列の機能との干渉を観察することによって実際の物質として測定される。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドはトリヌクレオチドＧＵＣ（配列番号：２）を含む。他の態様において、特許請求されているオリゴヌクレオチドはエクソン２または転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳終結部位またはスプライシング部位を含むＣＡＰＬ転写物に相補的なヌクレオチド配列を有する。好ましい態様において、このヌクレオチド配列はヌクレオチド１３２を含むエクソン２の少なくとも一部を含むＣＡＰＬ転写物に相補的である。特定の態様において、本発明は配列番号：９または１０を有する合成オリゴヌクレオチドを含み、ＣＡＰＬ特異的リボザイムが結合する（および「ＧＵＸ」配列を含んでよい）ＣＡＰＬ核酸領域、配列番号：３または４を有するオリゴヌクレオチド（３ 'スプライシング部位に相補的である）、配列番号：５または６を有するオリゴヌクレオチド（５'スプイライシング部位に相補的である）または配列番号：７または８を有するオリゴヌクレオチド（翻訳開始部位に相補的である）に相補的である。修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも１つの「非ホスホジエステル−インターヌクレオチド結合、すなわち１つのヌクレオチドの５'末端と５'リン酸ヌクレオチド任意の数の化学基で置換されているが他のヌクレオチドの３' 末端の間のホスホジエステル結合の他の結合によって結合されているものをも含む。好ましい合成結合には、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルアミダイト、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデートおよびカルボキシメチルエステルが含まれる。これらの結合のうちの任意のものがまた、多様な化学基、例えばアミノアルキルホスフェートなどで置換されていてもよい。本発明の１つの好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドはオスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート結合を介して結合する。本発明のいくつかの態様において、該オリゴヌクレオチドは修飾される。本明細書で使用する「修飾されたオリゴヌクレオチド」とは修飾された核酸、塩基および／または天然にみられない糖を含む。例えば、３',５'−置換オリゴヌクレオチドは、３'位および５'位の両方の位置にて、ヒドロキシル基以外の化学基（３'位）およびリン酸基以外の化学基（５'位）に結合した糖を有するオリゴヌクレオチドである。本発明の目的のため、「２'−置換されたオリゴヌクレオチド」なる語はその２'位でヒドロキシル基以外の化学基に接着した糖を有するオリゴヌクレオチドをいう。リボース分子の２'−ＯＨは１−６炭素原子、２−６炭素原子（例えば、２'−Ｏ−アリル、２'−Ｏ−アリール、２'−Ｏ−アルキル（２'−Ｏ−メチルなど）、２'−ハロまたは２'−アミノであるが２'−Ｈは含まない）アリールまたは置換されたアリールまたはアリルを含む−Ｏ−低級アルキルで置換されることができる。ここでアリル、アリールまたはアルキル基は置換されていなくてもよいし、例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルバルコキシルまたはアミノ基で置換されていてもよい。修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、ジアミン、コレステリルまたは他の脂質親和基またはキャッピング化された種などの付加置換されたものであってもよい。さらに、酸化されていないかまたは、該分子中のヌクレオチド当たり１つの非架橋酸素原子における置換を有する部分的に酸化されたオリゴヌクレオチドもまたは修飾されたオリゴヌクレオチドとみなされる。また、３'および／または５'末端でのヌクレアーゼ耐性を付与するかさばった置換体および／または修飾されたオリゴヌクレオチドはヒトの介在なしにはイン・ビボでは見られない他の構造上の多様な修飾もまた本明細書中では修飾されたとみなされている。本発明の他の態様において該ＣＡＰＬ特異的合成オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含む。最も好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは約１５から３０ヌクレオチドの長さを有する。本発明の他の態様においてＣＡＰＬ遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。この方法において、ＣＡＰＬ核酸はＣＡＰＬ核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチドと結合する。本発明のさらに別の態様において、骨肉腫などの転移性癌を治療するまたは抑制する方法を提供する。この方法において、ＣＡＰＬ核酸に相補的である合成オリゴヌクレオチドの治療上の量を癌を罹患している被験体に投与する。１つの態様において、少なくとも２つの異なる合成オリゴヌクレオチドを同時に投与する。そのそれぞれはＣＡＰＬ核酸に相補的なヌクレオチド配列を有するが、該オリゴヌクレオチドの核酸配列は異なっているものである。本発明の方法はまた、コントロール動物および転移性癌を罹患している動物においてのＣＡＰＬ遺伝子の機能を試験する。現在、遺伝子機能はマウスなどの「ノックアウト」動物を作製する困難な仕事によってしか試験できない。この仕事は困難で、時間を消費するものであり、「ノックアウト」が致死表現型を生み出すので動物の発生に不可欠な遺伝子では行うことができない。本発明はこのモデルの欠点を克服するものである。本発明の少なくとも１つのＣＡＰＬ特異的合成オリゴヌクレオチドおよび製薬学的および生理学的に許容し得る担体を含む治療製剤をも提供する。図面の簡単な説明本発明の前記および他の目的、本発明の種々の特徴ならびに本発明自体は下記の説明を添付の図面とともに読めばより完全に理解されるであるろう。図１Ａは、ヒトＣＡＰＬ遺伝子のゲノム配列の模式図であり、下段の文字はｍＲＡＮ中においてスプライシングされる遺伝子の領域を示し、「ｎ」は決定されていない塩基を表わす。図１Ｂは、本発明の有用なオリゴヌクレオチドが標的化される領域を含むスプライシングされていないＣＡＰＬＲＮＡの図を表している。図２Ａは、保存されたハンマーヘッド配列および認識配列およびＧＵＣ開裂部位を有する相補的なＣＡＰＬｍＲＮＡ（ｎｔ．９８−１１８）および対応する遺伝子を有するＣＡＰＬイリボザイムの構造を模式的に表わす。図２Ｂは、ＣＡＰＬ特異的リボザイムをクローニングする方法およびリボザイム特異的ＲＮＡおよび標的特異的ＲＮＡを合成する方法の図である。図３は、イン・ビトロのＣＡＰＬ抑制リボザイム活性を示す変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムであり、レーン１は³²Ｐ−ＣＴＰ標識したＣＡＰＬ特異的ＲＮＡ、レーン２は未標識のリボザイムと混合した³²Ｐ−ＣＴＰ標識したＣＡＰＬ特異的ＲＮＡ、レーン３は未標識のリボザイムと混合した³²Ｐ−ＣＴＰ標識したＣＡＰＬ特異的ＲＮＡ（ＭgＣl₂は無添加）およびレーン４は³²Ｐ −ＣＴＰ標識したリボザイム特異的ＲＮＡである。図４は、ＣＡＰＬ特異的リボザイムをＯＨＳへトランスファーしたクローンＩＩ−１１ａ、ＩＩ−１１ｂ、ＩＩＩ−２およびＩＩＩ−１４をトランスフェクションしていない親のＯＨＳ細胞および「ベクターのみ」トランスフェクションした細胞であるｐＨβ−１の両方に比較して特徴付けした図である。すべての細胞クローンの形態学的写真、ノーザンンブロット分析（ハイブリダイゼーションにはＣＡＰＬｃＤＮＡ、ＣＡＰＬリボザイムおよび１８ＳｒＲＮＡとともに）、サザンブロット分析（ＣＡＰＬリボザイムを使用し、ｐＩＩβＡＰｒ−１−ネオベクターまたはハイブリダイゼーションのためのＲＴ−ＰＣＲ分析による挿入の検出）およびウェスタンブロット分析（ＣＡＰＬに対するモノクローナル抗体で染色する）を示す。図５は、本発明のＣＡＰＬ特異的なオリゴヌクレオチドで処理したヒト骨肉腫細胞中のＣＡＰＬｍＲＮＡの発現の抑制を示すグラフである。図６Ａは、コントロールオリゴヌクレオチドまたはＣＡＰＬ特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：９）で処理した後のイン・ビトロでのヒト黒色腫細胞中でのＣＡＰＬ発現の抑制を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。図６Ｂは、コントロールオリゴヌクレオチドまたはＣＡＰＬ特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：９）で処理した後のイン・ビトロでのヒト肉腫細胞中でのＣＡＰＬ発現の抑制を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。好ましい態様の詳細な説明本明細書中に言及する特許および科学的文献は当業者に利用できる知見を確立するものである。本明細書中に引用する発行された米国特許および許された出願は参照のため引用する。本発明は、転移性癌の治療に有用な、ＣＡＰＬ核酸に特異的な合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチド法は、ＣＡＰＬ発現の抑制に対する、それゆえ転移性癌の治療または予防に対する新たなアプローチを提供する（一般にアグラワル（Ａgrawal）（１９９２）Ｔrends in Ｂiotech.１０：１５２；ワグナー（Ｗagner）（１９９４）Ｎature３７２：３３３〜３３５；およびスタイン（Ｓ tein）ら（１９９３）Ｓcience２６１：１００４〜１０１２を参照）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的な核酸配列（センス鎖）に結合することによりＲＮＡのスプライシングおよび翻訳を抑制することができる。このようにしてアンチセンスオリゴヌクレオチドはタンパク質の発現を抑制することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまたゲノムＤＮＡに結合して三本鎖を形成し、転写を抑制することも示されている。さらに１７マーの塩基配列は統計的にヒトゲノム中に１度しか現れず、それゆえ、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて特異的配列の極めて正確なターゲティングが可能である。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＣＡＰＬ遺伝子発現を抑制し、ヒトＣＡＰＬ核酸配列の一部に向けられたものであればいかなるものも包含する。ヒトＣＡＰＬ核酸配列は知られており（エンゲルカンプ（Ｅngelkamp）ら（１９９３）Ｐro c.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）９０：６５４７〜６５５１ジーンバンク（Ｇen Ｂank）、ＡＣ.Ｎo.２１８９５０）、図１Ａに模式的に示してあり、配列番号：１に示してある。これら標的領域としては、公知のエクソンのいずれかの部分、ならびにスプライシング部位（エクソン−イントロン境界）、リボソーム結合部位、転写開始部位、翻訳開始部位、または翻訳停止部位が挙げられるが、これらに限られるものではない。ヒトＣＡＰＬに特異的な幾つかの代表的だが限定されないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を下記表１に列挙する。本明細書の開示に従い、当業者であればＣＡＰＬ発現を抑制する他のアンチセンス核酸配列を最小限の実験により同定することができるであろう。たとえば、ＣＡＰＬに対して特異的にターゲティングした他の配列は、ＲＮアーゼＨ開裂アッセイ（フランク（Ｆrank）ら（１９９３）Ｐroc.Ｉnt.Ｃonf.Ｎucleic Ａcid Ｍed.Ａpplns.１：４.１４（アブストラクト））やヒトＣＡＰＬｃＤＮＡを転写しアッセイに用いたランダム（たとえば、２０マー）ライブラリーを用いて選択することができる。このＲＮアーゼＨ分析法は、ＣＡＰＬｍＲＮＡ内のアンチセンス結合を最も受けやすい領域を示す。本発明の合成オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせからなり、一つのヌクレオチドの５'末端と他のヌクレオチドの３'末端とが共有結合により連結されている。これらオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも６ヌクレオチドであるが、好ましくは１２〜５０ヌクレオチドの長さであり、１５〜３０ヌクレオチドが最も一般的である。これらＲＮＡ−、ＤＮＡ−、およびＲＮＡ／ＤＮＡ−含有オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミデートまたはＨ−ホスホネート化学などの当該技術分野で認められた方法（手動または自動合成機により行うことができる）（たとえば、ウールマン（Ｕhlmann）ら（Ｃhem.Ｒev.（１９９０）９０：５３４〜５８３を参照）により調製することができる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ＣＡＰＬ核酸へハイブリダイズする能力を損なうことなく多くの方法で修飾してよい。たとえば、オリゴヌクレオチドは、一つのヌクレオチドの５'末端と他のヌクレオチドの３'末端との間にホスホジエステル以外のインターヌクレオチド結合を含んでいてよく、その際、５'ヌクレオチドリン酸は幾つかの化学基で置換されている。そのような化学基の例としては、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カーボネート、およびリン酸トリエステルが挙げられる。これら結合を有するオリゴヌクレオチドは、公知の方法（Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalogs、Ｍeth.Ｍol.Ｂiol. 、Ｖol.２０（アグラワル編）ヒューマナ・プレス、トトワ、ニュージャージー（１９９３）およびウールマンら（１９９０）Ｃhem.Ｒev.９０：５４３〜５８３に概説されている）に従って調製できる。他の修飾としてはオリゴヌクレオチド分子の内部または末端に存在するものが挙げられ、インターヌクレオシドリン酸結合への分子、たとえばコレステリルやジアミン化合物（アミノ基と末端リボース、デオキシリボースとの間に種々の炭素数の残基を有する）の付加、および開裂もしくは反対鎖や付随する酵素へ架橋するリン酸修飾を含む。そのような修飾オリゴヌクレオチドの例としては、２' −Ｏ−アルキル化リボース、リボースの代わりのアラビノースなどの修飾された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチド、またはその３'位および５' 位の両方にてヒドロキシル基以外の化学基（その３'位にて）およびリン酸基以外の化学基（その５'位にて）に結合した糖を有する３',５'−置換オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の修飾したオリゴヌクレオチドは、その３'および／または５'末端にてヌクレアーゼ耐性を付与する嵩ばった置換基でキャッピングされているか、またはヌクレオチド当たり一つの非架橋性酸素原子に置換を有する。そのような修飾はインターヌクレオシド結合の幾つかまたはすべてにおいてなされてよく、オリゴヌクレオチドのいずれかまたは両方の末端で、および／または該分子の内部でなされてよい。これら修飾されたオリゴヌクレオチドの調製は当該技術分野でよく知られている（アグラワルら（１９９２）Ｔrends Ｂiotechnol.１０：１５２〜１５８に概説されている）。たとえば、ホスホルアミデート、Ｈ−ホスホネート化学、またはメチルホスホルアミデート化学（たとえば、ウールマンら（１９９０）Ｃhem. Ｒev.９０：５４３〜５８４；アグラワルら（１９８７）Ｔetrahedron Ｌett.２８：（３１）：３５３９〜３５４２；カルサーズ（Ｃaruthers）ら（１９８７）Ｍeth.Ｅnzymol.１５４：２８７〜３１３；米国特許第５,１４９,７９８号を参照）などの技術分野で認められた方法を用いてヌクレオチドを共有結合により連結することができる。オリゴマー性のホスホロチオエートアナログは、メトキシホスホルアミダイト（たとえば、アグラワルら（１９８８）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci.（ＵＳＡ）８５：７０７９〜７０８３を参照）やＨ−ホスホネート（たとえば、フレーラー（Ｆroehler）（１９８６）Ｔetrahedron Ｌett.２７：５５７５〜５５７８を参照）化学などの当該技術分野でよく知られた方法を用いて調製することができる。バーゴット（Ｂergot）らによって記載された方法（Ｊ.Ｃhr omatog.（１９９２）５５９：３５〜４２）を用いることもできる。ハンマーヘッドリボザイムと呼ばれる特別の形態の合成オリゴヌクレオチドを用いてＣＡＰＬ遺伝子の発現を抑制することもできる。リボザイムは、基質にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての機能、およびそれがハイブリダイズしたＲＮＡ分子、たとえばｍＲＮＡ、ＲＮＡ含有基質、およびリボザイムそれ自体の特定のホスホジエステル結合において開裂する能力を有する触媒分子としての機能の両機能を有するＲＮＡ分子である。リボザイムはホスホルアミデートまたはＨ−ホスホネート化学などの技術分野で認められた方法により調製することができ、該方法は米国特許第５,１４９,７８９号に記載された標準Ｈ−ホスホネート化学を用い、または標準ホスホルアミダイト化学（たとえば、ボーケージ（Ｂeaucage）（Ｍeth.Ｍol.Ｂiol.（１９９３）２０：３３〜６１）；ダマー（Ｄamha）ら（Ｐrotocols for Ｏligonucleot ides and Ａnalogs：Ｓynthesis and Ｐroperties（アグラワル編）（１９９３）ヒューマナ・プレス、トトワ、ニュージャージー、８１〜１１４頁）；またはウールマンら（Ｃhem.Ｒev.（１９９０）９０：５３４〜５８３を参照）を用いて手動または自動合成機により行うことができる。リボザイムのフランキング領域および他の領域はまた、基質ＲＮＡにハイブリダイズするリボザイムアナログの能力を損なうことなく、ヌクレアーゼ消化に対して保護するために幾つかの仕方で修飾できる。これら修飾は本質的に上記合成オリゴヌクレオチドについて記載したものと同じである。別のやり方として、代表的なＣＡＰＬ特異的リボザイムＤＮＡは、それぞれＳ al ＩおよびＨind III制限部位を含む２つの部分的に重複するオリゴヌクレオチドプライマーから合成することができる。これらプライマーを、ＰＣＲ増幅を行う前にアニールさせて半二本鎖を形成させる。つぎに、制限部位でフランキングされた４８ｂｐのリボザイムＤＮＡからなるＰＣＲ産物をｐＨβＡＰｒ−１ｎｅｏなどの発現ベクター中にクローニングし、ついで該ベクターをＯＨＳなどの哺乳動物細胞中にトランスフェクションし、発現させることができる。コドン１４のＧＵＣトリヌクレオチドの後でＣＡＰＬｍＲＮＡ転写物を特異的に開裂すべく開発した代表的なハンマーヘッドリボザイムの構造を図２Ａに示す。該リボザイムのイン・ビトロ活性を、イン・ビトロ転写したリボザイムおよび³²Ｐ標識ＣＡＰＬを混合することにより調べた。最適の開裂条件は、基質とリボザイムとのモル比が約１：１で、１０ｍＭＭｇＣｌ₂とともに３７℃で１時間インキュベートするものであることがわかった。開裂生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、該リボザイムは１３２塩基の標的ＲＮＡをそれぞれ９１塩基および４１塩基の生成物に開裂したことが示された（図３）。ＣＡＰＬが転移性癌の発生において役割を果たしていることは、ヒト転移性癌細胞株を用いたイン・ビトロおよび骨肉腫の２つの哺乳動物モデルを用いたイン・ビボの両方において示された。イン・ビトロ系は、哺乳動物発現ベクターｐＨβＡＰｒ−１ｎｅｏでトランスフェクションした転移性ヒト骨肉腫細胞株ＯＨＳ（フォスタッド（Ｆodstad）（１９８６）Ｉnt.Ｊ.Ｃancer３８：３３〜４０）から調製した。このベクターは構成的なヒトβ−アクチンプロモーターの制御下にあり（図２Ｂ）、ＣＡＰＬ核酸に特異的なリボザイムをコードするＤＮＡを含んでいる。リボザイムでトランスフェクションしたＯＨＳ細胞におけるＣＡＰＬｍＲＮＡ発現の抑制を調べて、リボザイム構築物の特異性を決定した。該リボザイムを哺乳動物発現ベクターｐＨβＡＰｒ−１ｎｅｏ（構成的なヒトβ−アクチンプロモーターの制御下にある；図２Ｂ）中にクローニングした。ベクター単独およびクローニングしたリボザイム構築物の両者を転移性ヒト骨肉腫細胞株ＯＨＳ（フォスタッドら（１９８６）Ｉnt.Ｊ.Ｃancer３８：３３〜４０）中にトランスフェクションした。個々のジェネチシン耐性コロニーを拾い、４５のクローンを増殖させ、ＣＡＰＬをコードするｍＲＮＡおよびリボザイムをコードするｍＲＮＡの両者についてノーザンブロット上で転写レベルでスクリーニングした。リボザイムの存在は４０のクローンにおいて認められ、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザーンブロット分析によっても確認された。リボザイム活性は、親ＯＨＳ細胞およびベクター単独をトランスフェクションしたＯＨＳ細胞のレベルに比べてＣＡＰＬｍＲＮＡの量が７５％かまたはそれ未満である場合にクローン中に存在すると考えられた。ＣＡＰＬ転写レベルの著しい低下が１７の試験クローンにおいて観察され、そのすべてが中位から高度のリボザイム発現を伴っていた。さらに、抗ＣＡＰＬ抗体を用いて調製したウエスタンブロットから、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両者でのＣＡＰＬの低減の間の密接な相関関係が明らかとなった（図４）。活性なＣＡＰＬリボザイムの生物学的作用をスクリーニングするため、ＣＡＰＬのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで有意に低減した３つのクローンをさらに特徴付けるために選択した。親のＯＨＳ細胞およびベクターをトランスフェクションしたＯＨＳ細胞に加えて、ＣＡＰＬレベルの低減が観察されなかった一つのリボザイム発現クローン（クローンIII−２）をコントロールとして含めた。形態学的な作用に加えて、インビトロでの増殖特性、およびヌードマウスおよびラットにおけるインビボでの腫瘍形成性および転移能を評価した。ＣＡＰＬ発現が低減したＯＨＳ形質転換体の培養液は、単層で培養したときに親のＯＨＳ細胞と比べて異なる形態を示した。親の細胞が丸い細胞形状を示したのに対して形質転換細胞は一層平べったく、一層速やかに拡張して表面を覆う傾向があった。形質転換した単層細胞は親の細胞株に比べて、増殖速度も、軟寒天コロニー形成実験における播種効率も共にそれほど変化しなかった。細胞の接着特性および凝集体として増殖する能力を測定するため、クローンを三次元の凝集体（スフェロイド）として培養した。ＣＡＰＬ発現の低減した細胞からのスフェロイドは、コントロールのスフェロイドと比較したときに一層ゆっくりと増殖し、互いに接着する傾向が小さく、ＣＡＰＬタンパク質がある種の細胞−細胞接着特性に影響を及ぼすことを示唆していた。さらに、ＣＡＰＬ特異的なリボザイムの有意量を発現し、それと同時にＣＡＰＬのＲＮＡおよびタンパク質のレベルが低減しているクローンでは、ラットにおいて転移頻度が劇的に低くなることが観察された。詳しくは、通常レベルのＣＡＰＬＲＮＡおよびタンパク質を発現する細胞では９０％の転移が観察されたのに対し、ＣＡＰＬＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルが低減した細胞では２２％の転移が観察された。このことは、ＣＡＰＬ遺伝子の発現が転移性の表現型を付与するのに預かっており、該遺伝子の発現を特異的に低減させることにより腫瘍細胞の転移能を低減させ得ることを示している。ヒト骨肉腫（ＫＰＤＸ）および黒色腫（ＴＨＸ）細胞株でのＣＡＰＬｍＲＮＡおよびタンパク質の抑制もまた、５'スプライス部位に向けられたＣＡＰＬ特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：５）、開始コドンに向けられたＣＡＰＬ特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：２２）、ＡＴＧの前のスプライシング部位の３'末端に向けられたＣＡＰＬ特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：２３）、およびリボザイム部位に向けられたＣＡＰＬ特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：９）で処理した後に示された。これら結果を図６Ａおよび６Ｂおよび表２に示す。ヒト転移性癌モデルがヌードマウスにおいて（例えばニョニクセン（Ｋjoniks en）ら（１９９４）Ｃancer Ｒes．５４：１７１５−１７１９参照）およびヌードラットにおいて（例えばウェーターマン（Ｗeterman）らＣancer Ｒes．５２：１２９１−１２９６参照）ヒト癌細胞の直接注射によって確立された。これらおよび類似のモデルを使用して、ＣＡＰＬ遺伝子の発現と転移性癌の進行との間の相関を決定する。特に、ＣＡＰＬ特異的リボザイムでトランスフェクションされたヒト骨肉腫細胞から調製されたクローンをヌードマウスに皮下移植することによって試験した。重要なことに、親細胞株とリボザイムトランスフォーマントの間に腫瘍取り込み（tumor intake）時間の遅延または増殖速度における明確な相違は観察されなかった。これらの結果はイン・ビボでの発生の特徴と一致し、そのことは増殖能力それ自体がリボザイム活性に影響されないことを示唆している。心内腫瘍細胞注入で処理した免疫欠損ラットの転移性の表現型を抑圧する合成オリゴヌクレオチドの能力（ニョニクセンら（１９９４）Ｃancer Ｒes．５４：１７１５−１７１９；ニョニクセンら（１９９０）Ｊ．Ｎat．Ｃancer Ｉnst．８２（５）３月）をもまた研究した。このヌードラットモデル系において、親細胞および減少させたＣＡＰＬ発現を有するＯＨＳクローンの転移性の可能性を比較した。親ＯＨＳ細胞を注入した動物において３７ラットのうちの３３（８９％）が骨転移を発生し、一方、ＩＩ−１１、ＩＩ−１１ＢおよびIII−１４の細胞クローンを発現するリボザイムを注入した場合はそれぞれ１５のうちの２(１３％)、１６のうちの４（２５％）および１５のうちの４（２７％）ラットが転移性の疾患を発生した。ベクターでトランスフェクションしたコントロール細胞では骨髄の転移が全部で１４のうちの１１（７８％）ラットにおいて発生した。ＣＡＰＬ発現においてリボザイム誘発減少を有するクローンとコントロール細胞の間の顕著な違いは、リボザイム発現細胞で注入したラットにおける転移の発生の遅延によってさらに証明される。従って、平均的な発生した転移の症状が現れる前までの遅延時間はすべてのリボザイムトランスフェクションしたクローンに関して５０日以上であるのに比較して、ＯＨＳ細胞でトランスフェクションした場合２８日のみで、「ベクターのみ」でトランスフェクションした細胞では２９日であった。重要なことに、全てのリボザイム発現細胞クローンはＯＨＳ（図４）に比較してＣＡＰＬｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおいて顕著な減少を示す。対して、ＣＡＰＬｍＲＮＡまたはタンパク質レベルにおいて減少が見られないリボザイムでトランスフェクションしたクローンIII−２は親のＯＨＳ細胞の転移可能性を保持する。これらのデータはＣＡＰＬ発現および骨肉腫細胞の転移能力との間の密接な関係の証拠をさらに強力にする。別の態様において、ＯＨＳ細胞および多様なクローンを注入したヌードラットの骨髄における腫瘍細胞を抗ヒト抗体でコートされた免疫磁気（immunomagnetic ）ビーズによって単離し、ついでＲＴ−ＰＣＲによってＣＡＰＬおよびリボザイムコードｍＲＮＡの両方の発現を分析する。リボザイム特異的ＰＣＲ産物を観察し（図３）、設計されたリボザイムが実際に活性であり部位特異的であることを示す。結論として、ＣＡＰＬ特異的オリゴヌクレオチドによるＣＡＰＬ遺伝子発現の調節は、ヒト骨肉腫細胞株ＯＨＳの転移性表現型を取り消す。これはただ１つの遺伝子産物がイン・ビボアッセイによりヒト腫瘍細胞の転移性の動きにおける総変化を引き起こすことができることの最初の証明である。治療製剤の形態における本発明の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは骨肉腫、乳癌などの転移性癌の治療または抑制に有用である。それらは生理学的におよび／または製薬学的に許容し得る担体と組み合わせた場合に医薬組成物の一部として使用されてよい。該担体の特徴は投与経路に依存する。そのような組成物は合成オリゴヌクレオチドおよび担体に加えて希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤および当該技術分野においてよく知られた他の物質を含んでよい。本発明の医薬組成物はまた、他の活性因子および／またはＣＡＰＬ発現の抑制を増強する薬剤を含んでいてよい。例えば、合成オリゴヌクレオチドの組合せ（その各々はＣＡＰＬｍＲＮＡの異なる領域にむかう）は本発明の医薬組成物において使用されてよい。本発明の医薬組成物はさらに他の化学療法剤を含んでいてよい。そのような別の因子および／または薬剤は本発明の合成オリゴヌクレオチドと相乗効果を生み出すため、または本発明の合成オリゴヌクレオチドによって引き起こされる副作用を最少限度にとどめるために医薬組成物に含まれてよい。逆に、本発明の合成オリゴヌクレオチドは特定の抗ＣＡＰＬまたは抗転移性癌因子の製剤および／または抗ＣＡＰＬ因子および／または薬剤の副作用を最少限度にするための薬剤に含まれていてよい。本発明の医薬組成物は本発明の合成オリゴヌクレオチドが他の製薬学的に許容し得る担体に加えてミセルとしての集合形態で存在する脂質、不溶性の単層、液体結晶または水溶液中にあるラメラ層などの両親媒性薬剤と組み合わされてリポソームの形態であってよい。リポソーム製剤に適した脂質は制限ではないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが含まれる。そのようなリポソーム製剤の調製は当業者のレベルの範囲にあり、例えば米国特許第４,２３５,８７１号；米国特許第４,５０１,７２８号；米国特許第４,８３７,０２８号；および米国特許第４,７３７,３２３号に開示されている。本発明の医薬組成物はさらにシクロデキストリンおよび細胞へのオリゴヌクレオチドの運搬を増強するようなものまたは徐放性ポリマーなどの化合物をも含む。本明細書で使用する「治療上有効な量」とは、患者の意味ある利益、すなわち転移性腫瘍における低減を示すのに十分である医薬組成物または方法の各活性成分の総量である。個々の活性成分について、単独で投与する場合には、該語はその活性成分単独をいう。組み合わせて用いる場合には、該語は組み合わせて連続でまたは同時に投与されるかどうかにかかわらず治療上の効果を生む活性成分の組み合わせた量をいう。本発明の治療法および使用方法を実施することにおいて、治療上有効な量の本発明の１つまたはそれ以上の合成オリゴヌクレオチドを転移性または前転移性（ premetastatic）癌を罹患した被験体に投与する。本発明の合成オリゴヌクレオチドを単独でかまたは転移性癌の他の公知の治療剤と組み合わせて本発明の方法に従って投与する。１つまたはそれ以上の他の治療剤と共に投与する（co-admin isterd）場合、本発明の合成オリゴヌクレオチドを他の治療剤と同時かまたは連続して投与してよい。連続して投与する場合、担当医が本発明の合成オリゴヌクレオチドを他の治療剤と組み合わせて投与する適切な順序を決定するであろう。医薬組成物中で使用される本発明の合成オリゴヌクレオチドの投与または本発明の方法を実施することは眼内、経口摂取、吸入または皮膚、皮下、筋肉内または静脈内注射などの従来の多様な方法で行うことができる。本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療上有効な量を経口投与する場合、該合成オリゴヌクレオチドは錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシル剤の形態であろう。錠剤の形態で投与する場合には、本発明の医薬組成物はさらにゼラチンまたはアジュバントなどの固相担体を含む。該錠剤、カプセルおよび粉末は約５％−９５％の合成オリゴヌクレオチドを含み、好ましくは約２５％−９０％の合成オリゴヌクレオチドを含む。液体状で投与される場合、水、ワセリン、動物性油脂または落花生油、ミネラルオイル、大豆油、ゴマ油または合成油などの植物起源の油脂などの液相担体が添加される。該医薬組成物の液体の形態はさらに生理学的食塩水、デキストロースまたは他のサッカリド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールを含む。液体状で投与される場合、該医薬組成物は該合成オリゴヌクレオチドの約０.５−９０重量％および好ましくは合成オリゴヌクレオチドの約１−５０重量％である。本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療上有効な量を静脈内、皮膚または皮下注射によって投与する場合、該合成オリゴヌクレオチドは無発熱物質の、非経口的に許容し得る水溶液の形態であろう。そのような非経口的に許容し得る溶液の調製は、ｐＨ、等浸透圧性、安定性などのために当業者の範囲内にある。静脈内、皮膚または皮下注射のための好ましい医薬組成物は該合成オリゴヌクレオチドに加えて、塩化ナトリウム溶液、リンガー液、デキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム溶液、乳酸加リンガー液または公知の他のビヒクルなどの等張性ビヒクルを含むべきである。本発明の医薬組成物はまた、安定剤、保存剤、バッファー、抗酸化剤または他の当業者に公知の添加剤を含んでもよい。本発明の医薬組成物中の合成オリゴヌクレオチドの量は、治療される性質および重篤度および該特許が受ける前の治療の本質に依存するであろう。最終的に、担当医が個々の患者を治療するための合成オリゴヌクレオチドの量を決定する。最初に、担当医は低用量の該合成オリゴヌクレオチドを投与し、ついで患者の応答を観察する。該患者にとって最適な治療効果を得るまで合成オリゴヌクレオチドの高用量が投与され、その時点でそれ以上は用量は増加しない。本発明の方法を実施するのに使用される多様な医薬組成物は体重１kg当たり約１.０ng〜２.５ mgの合成オリゴヌクレオチドを含むべきである。本発明の医薬組成物を使用した静脈内治療の時間は多様であり、治療される疾患の重篤度および個々の患者の潜在的な特異体質的応答に依存する。該合成オリゴヌクレオチドの各々の適用の時間は持続的な静脈内投与で１２時間から２４時間の範囲にわたる。最終的に担当医は本発明の医薬組成物を用いた静脈内治療の適当な時間を決定するであろう。以下の実施例は、本発明の好ましい製造および実施態様を示すものであるが、本発明の範囲を制限しようと意図するものではない。なぜなら他の方法を用いても、同様の結果を得ることができるからである。実施例１．ＣＡＰＬオリゴヌクレオチドの配列決定ＣＡＰＬ発現のアンチセンス抑制のための最適な配列を決定するために、ＣＡＰＬｍＲＮＡのＲＮアーゼＨ分析をフランク（Ｆrank）ら（Ｐroc．Ｉnt．Ｃo nf．Ｎucleic Ａcid Ｍed．Ａpplns.（１９９３）１：４．１４（要約））により記載されるように行う。簡単には、ＣＡＰＬｍＲＮＡをランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーおよびＲＮアーゼＨの限られた量とともにインキュベートし、ついでＲＮアーゼＨ感受性部位を同定するためにゲル電気泳動によるｍＲＮＡの分析を行う。少なくとも５つの２０マーのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを各ＲＮアーゼＨ部位を標的として合成する：１つは直接その部位をスパンし、４つは３塩基の５'および３'の最初のオリゴヌクレオチドによって動く。この分析によって見出された代表的なオリゴヌクレオチドは配列番号：３−１０である。２．オリゴヌクレオチドの調製修飾していない（ＰＯ）および修飾した（ＰＳ）オリゴヌクレオチドを自動化合成機（ミリポア（Ｍillipore）８７００、ミリポア・コープ（Ｍillipore Ｃo rp.）、ベッドフォード（Ｂedford）、マサチューセッツ）でホスホルアミデート化学（アグラワルら（１９８９）Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．（ＵＳＡ）８６：７７９０−７７９４；マックブライド（ＭcＢride）ら（１９８３）Ｔetrah edron Ｌett.２４：２４５参照）を用いて合成する。本合成で使用する酸化剤はリン酸ジエステル結合のためにはヨウ素の標準溶液、ホスホロチオエート結合の形成のためにはアセトニトリル１００ml中の１ｇ溶液として³Ｈ−１,２−ベンゾチオール−３−オン−１,１−ジオキシドである。メチルホスホネートをボーケージ（Ｂeaucage）（「オリゴヌクレオチド・シンセシス（Ｏligonucleotide Ｓ ynthesis）：ホスホルアミダイト・アプローチ（Ｐhosphoramidite Ａpproach）」プロトコールズ・フォー・オリゴヌクレオチズ・アンド・アナログズ、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｐrotocols for Ｏligonucleotides a nd Ａnalogs，Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology）（１９９４）２０：３３−６２中）の方法に従って調製する。オリゴヌクレオチドの濃度を各配列に存在するヌクレオチドのモル吸光係数を考慮に入れて２６０nmでの吸光度によって決定する（オースベル（Ａusubel）ら（編）（１９８７）Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍo lecular Ｂiology（ウィリー（Ｗiley）、ニューヨーク）。３．リボザイム、プローブおよび抗体の調製リボザイム特異的なプローブを提供するため、上記に記載したリボザイムをクローニングするのに使用するプライマー（配列番号：１１および１２）をキナーゼ化（kinased）、アニーリングおよびライゲーションする。続いてそのライゲーション混合液を³²Ｐ−ｄＣＴＰでメランズモ（Ｍaelandsmo）ら（Ｂritish Ｊ．Ｃancer（１９９５）印刷中）に記載されるようにして標識する。ヒト１８ＳリボソームＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブおよび２８７から３０５までのヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドプローブをノーザンブロットのキャリブレーションに使用する。ウェスタンブロットの分析にはヒトＣＡＰＬに対する直接のモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ培養物からの上清を使用する。ＣＡＰＬ−ｒｉｂ−１およびＣＡＰＬ−ｒｉｂ−２のオリゴヌクレオチド（それぞれ配列番号：１１および１２を有する）をそのＣＡＰＬリボザィム（ＳatＩおよびＨind IIIのフランキング部位を有する）のクローニングのために構築する。Ｔ７−ｒｉｂ−１およびｒｉｂ−２のオリゴヌクレオチドプライマー（それぞれ配列番号：１３および１４を有する）をＣＡＰＬ特異的リボサイム（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する）の合成のために構築する。Ｔ７−ＣＡＰＬ−ｅｘ−１およびＣＡＰＬ−ｅｘ−２のオリゴヌクレオチドプライマー（それぞれ配列番号：１５および１６を有する）をＣＡＰＬ基質（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する）の合成のために構築する。ｐＨｂ−１およびｐＨｂ−２のＰＣＲプライマー（それぞれ配列番号：１７および１８を有する）をトランスフェクションした細胞内でのＣＡＰＬリボザイム発現を検出するために構築する。そのリボザイムの保存された触媒的な配列に相補的であるＣＡＰＬ特異的なプローブ（配列番号：１９を有する）もまた構築する。ＣＡＰＬ−ｅｘ −１およびＣＡＰＬ−ｅｘ−２のＰＣＲプライマー（それぞれ配列番号：２０および２１を有する）をＣＡＰＬｍＲＮＡを検出するために構築する。これらのプライマーおよびプローブを逆転写酵素を使用した標準的な方法により調製する（ウェーターマンら（１９９２）Ｃancer Ｒes.５２：１２９１−１２９６参照）。ハンマーヘッドリボザイムをカシャーニ−サベット（Ｋashani−Ｓabet）ら（Ａntisense Ｒes．Ｄev.（１９９２）２：３−１５）によって記載されたプロトコールに従って構築する。ＣＡＰＬｍＲＮＡ中のコドン１４のＧＵＣトリヌクレオチドをリボザイム開裂部位として選択する（図２Ａ）。ハンマーヘッドリボザイムの触媒コアをコードする２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１１および１２）を混合し、半二本鎖（hemiduplex）を形成させる。さらに、そのプライマーはＣＡＰＬｍＲＮＡ中の開裂部位の各側の１１または９ヌクレオチドに相補的であり、Ｓal ＩおよびＨind IIIの制限フランキング部位（プライマー配列番号：７および８）を有する。ＰＣＲ増幅は哺乳動物の発現ベクターｐＨβＡｐｒ−１ネオ（ｐＨβ）にライゲーションされる５２ｂｐのリボザイムＤＮＡとなる（ガニング（Ｇunning）ら（１９８７）Ｐroc. Ｎatl．Ａcad．Ｓci．８４：４８３１−４８３５）。インサートの配列および方向をシークエナーゼ・キット（Ｓequenase kit）、バージョン２.０（Ｕ.Ｓ.バイオケミカル・コープ（Ｕ.Ｓ.Ｂiochemical Ｃorp.）、クリーブランド（Ｃlea veland）、オハイオ）を用いてシークエンシングによって確認する。４．合成ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡのイン・ビトロ転写リボザイムおよび標的ＲＮＡの両者のイン・ビトロでの転写のための鋳型をＰＣＲによって産生する。そのＰＣＲ産物をリボザイムインサートを有するｐＨβ Ａｐｒ−１ネオベクターからまたはＯＨＳ細胞から単離した総ＲＮＡから配列番号：９および１０のプライマーを用いて増幅する。ついで０.５μgのＰＣＲ産物（ＤＮＡ鋳型）と２０ｕＴ７−ＲＮＡポリメラーゼを混合することによってサンブルック（Ｓambrook）ら（モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル(Ｍolecular Ｃloning，a Ｌaboratory Ｍanual)（第２版）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌ aboratory Ｐress）、（１９８９）ニューヨーク、５.５８頁および１７.１１− １７.１６頁）によって記載されるようにイン・ビトロ転写を行う。転写物の放射性標識のため６０μＣi³²−ＣＴＰ（８００Ｃi mmol^-1，アマシャム（Ａmersham）、英国）を添加する。その鋳型をＤＮアーゼ消化した後、その混合物を１回フェノール抽出し、ＮＥＮＳＯＲＢ２０カートリッジ（デュ・ポン（Ｄu Ｐont）、ＮＥＮプロダクツ（ＮＥＮＰroducts）、ハートフォードシアー（Ｈartfordshire）、英国）上で製造者の手引きに従って精製する。５．イン・ビトロリボザイム開裂反応開裂反応をカシャーニ−サベットら（Ａntisense Ｒes.and Ｄev.）による記載のようにイン・ビトロで転写した³²Ｐ−標識ＣＡＰＬ基質とＣＡＰＬ特異的リボザイムの等モル量の割合での混合によって行う。その開裂反応を１０mＭのＭg Ｃl₂を添加して開始する。３７℃で１時間インキュベーションした後、その開裂反応産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析する。６．イン・ビトロ研究Ａ．細胞ＯＨＳ細胞株を多数の骨格転移を有する患者から得た骨腫瘍生検から確立し、ついでフォスタッド（Ｆodstad）ら（Ｉnt．Ｊ．Ｃancer（１９８６）３８：３３−４０）によって記載されるように１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地中で単層培養物として増殖させる。腫瘍細胞の成長曲線を構築しついでその細胞が２倍になる時間を曲線の指数部位から測定した。軟寒天中の培養を行い（トバイト（Ｔveit）（１９８１）Ｉnt．Ｊ．Ｃancer（１９８６）２８：３２２９−３３４）、ついで播種効率（ＰＥ）を播種した細胞の生存数びパーセンテージ中の形成されたコロニーの数として定義する。回転楕円体（spheroid）の形成および発生をフォスタッドら（１９８６）上記、によって得る。その回転楕円体の直径を光学マイクロメーターにより弱く３回計測し、ついで相対的な容積を算出する（ワイブ（Ｗibe）（１９８４）Ｉnt．Ｊ．Ｃancer３４：２１−２６）。そのＫＰＤＸ細胞株を第一次骨肉腫を有する患者から確立し、ついで１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ増殖培地中で単層培養物として増殖させる。そのＫＰＤＸ細胞株はＣＡＰＬｍＲＮＡおよびタンパク質の高発現を示し、それぞれノーザンブロットおよびイムノブロット技術を用いて分析する。そのＴＨＸ細胞株をメラニン欠乏性の黒色腫細胞の転移性沈着物（deposit）を有するリンパ節を有する患者から単離する。その細胞株を１０％ウシ胎児血清を補ったＲＰＭＩ中で単層として維持する。その細胞株をＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質電気泳動、ブロッティングおよび免疫染色を用いて可視化してＣＡＰＬタンパク質の低から中程度の発現を示す。Ｂ．オリゴヌクレオチドの活性配列番号：３、５、７および９を有する０.５、２、５および１０μＭ合成オリゴヌクレオチドをＯＨＳ細胞中でのアンチセンス活性を評価するために使用する。特に２×１０⁵細胞を小培養フラスコ（２５cm²）中に播種しついで指示された量のオリゴヌクレオチドを翌日加える。これを２.５または５μg／mlのリポフェクチン（ギブコ（Ｇibco）／ＢＲＬ／ライフテクノロジーズ（ＬifeＴechnolo gies）、デンマーク）の存在下および不在下で行う。リポフェクチンを使用する時、その細胞を無血清培地中で４時間処理し、後に培地を１０％にするように十分な血清を加える。２０時間後、その細胞の培地を変えてさらに新鮮なオリゴヌクレオチドを加える。ついでその細胞をリポフェクチンを受けない細胞同様の様式で処理する。播種３日後にその細胞を培地を変えてさらに新鮮なオリゴヌクレオチドを加える。その細胞をコントロール（非アンチセンス）に関連したｍＲＮＡレベルについて播種後６日目で標準的手法により分析する（例えば、サンブルックら（１９８９）モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク参照）。幾つかの代表的な結果を図５に示し、それはＣＡＰＬ特異的オリゴヌクレオチドの単独または組み合わせてのＣＡＰＬｍＲＮＡの転写を抑制する能力を証明するものである。そのＣＡＰＬタンパク質を標準的な手法に従ってＣＡＰＬモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットにより類似した培養物中で決定する。オリゴヌクレオチド（配列番号：５）（スプライシング部位）、配列番号：２２（開始コドンを含む）、配列番号：２３（ＡＴＧの前のスプライシング部位の３'端）および配列番号：９（リボザイム部位））の活性を１２日間のインキュベーション期間、１μＭおよび５μＭの濃度を用いてＫＰＤＸおよびＴＨＸ細胞株中で試験する。これらの実験ではその濃度でリポフェクチンまたはＤＯＴＡＰトランスフェクション剤（ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannheim ）ＧmＢh、ドイツ）を製造者の推薦する手続きによって使用する。細胞を個々の３cmの直径の細胞培養皿中で総用量３mlの１０％ウシ胎児血清を補ったＲＰＭＩにおいて低い密度（２×１０³細胞／皿）で播種する。翌日そのオリゴヌクレオチドを含む懸濁液を５分間沸騰させ、ウシ胎児血清を含まないＲＰＭＩで希釈し、ついでＤＯＴＡＰトランスフェクション剤を含むＲＰＭＩの等用量で混合した。ついでその混合物を室温で１０分間インキュベートして後に皿の培養培地（１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ）を加える。その培養培地を４日および８日後に新しくし、ついで新しいアンチセンスオリゴヌクレオチドを上記のように加える。ついでその細胞を回収しＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質電気泳動、イモビロンメンブレン（Ｉmmobilon membrane）（ミリポアＡＢ／エネバックベイエン（Ｅneb akkveien）、ノールウェー）にブロッティングしついで標準的な免疫染色プロトコールにてクリアジェブスカ（Ｋriajevska）ら（Ｊ．Ｂiolog．Ｃhem．（１９９４）２６９：１９６７９−１９６８２）のプロトコールの変形に従って産生する）ＣＡＰＬ特異的モノクローナル抗体を用いてＣＡＰＬ発現を分析する。処理した細胞中のＣＡＰＬタンパク質発現をコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：９を無秩序にしたもの）で処理した細胞と比較する。その結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。Ｃ．リボザイムの活性４×１０⁵ＯＨＳ細胞を５mlのダルベッコ改変イーグル培地（Ｄulbecco's mod ified Ｅagle's medium）に再懸濁し、ついで２５cm²培養フラスコ中で撒く。その細胞を一夜増殖させ、チェン（Ｃhen）ら（Ｍol．Ｃell．Ｂiol．（１９８７）７：２７４５−２７５２）によって記載されたリン酸カルシウム沈澱法に従って、そのプラスミドを含む５μgまたは１０μgのリボザイムでトランスフェクションさせた。そのプラスミドｐＨβＡｐｒ−１ネオを有しリボザイム配列を有さないトランスフェクションをネガティブコントロールとして機能させる。組み込んだプラスミドを有するトランスフェクションさせた細胞を、６−８週間４００ μg／mlのゼラチン（Ｇ４１８ジスルフェート、ギブコ）を含むＲＰＭＩ増殖培地中で選択する。個々のＧ４１８耐性コロニーを拾い、増殖させ、ついで以下に記載するようにＰＣＲおよびノーザンブロット分析によってＣＡＰＬおよびリボザイムの両方の発現をスクリーニングする。数週間か後、細胞にＧ４１８を加えてネオマイシン遺伝子の存在を試験する。７．イン・ビボアッセイ先天性胸腺欠損Ｂalb／Ｃ rnu／rnuマウスおよびＲowett Ｈan：rnu／rnuラットをこの研究で使用する。単一のＯＨＳ細胞懸濁液をサブコンフルエント（subc onfluent）単層培養物から得る。１×１０⁶細胞をニョニクセン（Ｋjonniksen）（Ｊ．Ｎatl．Ｃancer Ｉnst．）（１９９０）８２：４０８− ４１２）により記載されたようにヌードマウスの脇腹に皮下注射（ｓ．ｃ.）するかまたは免疫欠損ラットの左心室（l.v.）に心臓内注射する。腫瘍を増殖させるｓ.ｃ.の容量を式０.５^*長さ^*幅２（フォスタッド（１９８０）Ｂr．Ｊ．Ｃan cer、４１（補遺、ＩＶ）：１４６−１４９）に従って計算する。ｌ.ｖ.注射の後、動物を毎日検査して脊髄中の転移疾患を表わす麻痺または歩行障害の最初の兆候が見られた時点で殺害する。８．ノーザンブロット分析総細胞ＲＮＡを、サンブルックらモレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（第二版）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９）ニューヨーク、７.５、７.１９−７.２２頁）に記載される塩化チオシアネート−セシウムグアニジン法に従って調製する。５μgの総ＲＮＡのサンプルを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル電気泳動によって分離し、ついでハイボンドＮ＋メンブレン（Ｈybond-Ｎ＋ membrane）（アマシャム（Ａmersham）、アーリントン・ハイツ（Ａrlington Ｈeights）、イリノイ）に製造者の手引き書に従ってブロットする。２時間焼いた後、続いて紫外線架橋を行い、そのフィルターを³²Ｐ−標識したＣＡＰＬまたはＣＡＰＬ特異的リボザイムをコードするＤＮＡプローブでメランズモ（Ｂritish Ｊ．Ｃancer（１９９５）印刷中）の記載のようにハイブリダイズさせる。多数回のハイブリダイゼーションのため、結合したプローブをフィルターを９５−１００℃で０.１×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳで５分間インキュベートすることにより除去する。各レーンにローデイングするＲＮＡの不均衡な量を正すため、そのフィルターをヒト１８ＳｒＲＮＡに特異的なキナーゼ標識したオリゴヌクレオチドプローブ（１９マー）で再度ハイブリダイゼーションする。特異的なｍＲＮＡのレベルをコンピュートデンシトメーター（モレキュラー・ダイナミクス（Ｍolecular Ｄynamics）、サニーベル（Ｓunneyvale）、カリフォルニア）注のオートラジオグラムのスキャン後に１８ＳｒＲＮＡの量に相対的に調整する。別法として、ＲＴ−ＰＣＲをトランスフェクションした細胞注のＣＡＰＬまたはリボザイム特異的ＲＮＡをスクリーニングするために使用する。異なる細胞クローンから単離した総ＲＮＡ（２００ng）を５u ＭＭＬＶ−逆転写酵素（スーパースクリプト（Ｓuperscript）II、ギブコ／ＢＲＬ／ライフテクノロジーズ、デンマーク）によって逆転写し、ついで配列番号：１３および1４を有するプライマーおよび配列番号：１６および１７を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う。増幅およびＰＡＧＥ上での分離の後、そのリボザイム特異的なＰＣＲ産物をハイボンドＮ＋メンブレン（アマシャム、アーリントン・ハイツ、イリノイ）にブロッティングし、ついでハンマーヘッド配列をコードするキナーゼ標識したオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイゼーションする（サンブルックら（１９８９）モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（第二版）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク、５. ６８−５.７２頁）。９．サザンブロット分析ゲノムＤＮＡを標準的な方法により単離する（例えば、サンブルックら（１９８９）モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（第二版）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク、６３頁）。ＤＮＡのアリコート（８μg）をＨind IIIで消化し、０.８％アガロスゲル上で分離し、ハイボンドＮ＋メンブレン（アマシャム、アーリントン・ハイツ、イリノイ）に製造者の手引書に従ってアルカリブロッテイングによりトランスファーする。そのメンブレンを調製し、前記のようにハイブリダイゼーションしついで洗浄する。多数回のハイブリダイゼーションのため、結合したプローブをフィルターを室温で１００mＭ水酸化ナトリウムおよび１mＭＥＤＴＡ中で１５分間インキュベートすることにより除去する。１０．ウェスタンブロットその細胞からのタンパク質リゼイトを標準的な方法に従って（例えば、サンブルックら（１９８９）モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（第二版）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク１８.６２−１８.６３頁参照）作製し、ついで１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、サンブルックら（１９８９）モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（第二版）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク１８.４７−１８.４８頁参照）によって分離する。イモビロン−Ｐ（Ｉmmobilon-Ｐ）メンブレン（ミリポア・コーポレーション、ベッドフォード、マサチューセッツ）に製造者の手引書に従ってトランスファーした後、そのメンブレンを５％乾燥ミルクおよび５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳによってブロッキングする。続いて、そのメンブレンをＣＡＰＬに対して直接のモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ培養培地上清でインキュベートし、ついで洗浄し、ついで１：２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗マウス抗体（ダコ（Ｄako）、グロストラップ（Ｇlostrup）、デンマーク）を含むブロッキング溶液でインキュベートする。免疫応答タンパク質をＥＣＬウェスタンブロット検出系（アマシャム、英国）を用いて可視化する。均等物当業者は上記の特定の物質および方法に均等な多くのものについて認識するか、または常套手段、実験を用いるだけで確認することができるであろう。このような均等物も本発明の範囲に包含され、以下の特許請求の範囲でカバーされるとみなされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ホーヴィグ，エイヴィンドノールウェー、エン−0851オスロ、ソーグンスヴェイエン31番 (72)発明者エンイェブラーテン，オラフノールウェー、エン−1470ローレンスコグ、ハネボリィヴェイエン43アー番 (72)発明者マエランスモ，グンヒルドノールウェー、エン−0475オスロ、ヨハン・セルメルス・ガーテ８番 (72)発明者アグラワル，サドヒルアメリカ合衆国01545マサチューセッツ州シュルーズベリー、ランプライター・ドライブ61番 (72)発明者ヴォン・ホフ，エリックアメリカ合衆国02181マサチューセッツ州ウェルズリー、レッドウィング・ロード 33番

Claims

【特許請求の範囲】１．ＣＡＰＬ遺伝子発現を抑制することができ、ＣＡＰＬ核酸に相補的であるヌクレオチド配列を有する合成オリゴヌクレオチド。２．配列番号：２（ＧＵＣ）を有するトリヌクレオチドを含むＣＡＰＬ核酸に相補的なヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。３．エクソン２の少なくとも一部を含むＣＡＰＬ転写物に相補的であるヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。４．ＣＡＰＬ核酸のリボザイム結合部位に相補的であるヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。５．配列番号：９を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。６．配列番号：１０を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。７．ＣＡＰＬ核酸の３'スプライシング部位に相補的なヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。８．配列番号：３、４または２３を有する請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。９．ＣＡＰＬ核酸の５'スプライシング部位に相補的なヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。１０．配列番号：５または６を有する請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。１１．ＣＡＰＬ核酸の翻訳開始部位に相補的であるヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。１２．配列番号：７、８または２２を有する請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。１３．ＣＡＰＬ核酸の翻訳終結部位に相補的であるヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。１４．ＣＡＰＬ核酸の転写開始部位に相補的であるヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。１５．修飾されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。１６．少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。１７．少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。１８．少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドをさらに含む請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。１９．約１２−５０ヌクレオチドの長さを有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。２０．ＣＡＰＬ核酸をＣＡＰＬ核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、ＣＡＰＬ遺伝子の発現を抑制する方法。２１．癌を罹患している被験体にＣＡＰＬ核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチドの治療上有効な量を投与する工程を含む、転移性癌を抑制する方法。２２．該被験体が骨肉腫を罹患している請求項２１に記載の方法。２３．ＣＡＰＬ核酸に相補的であるヌクレオチド配列を有する第２の合成オリゴヌクレオチドを同時に投与することをさらに含み、該第２のオリゴヌクレオチドの核酸配列は該第１のオリゴヌクレオチドの核酸配列と異なっている請求項２１に記載の方法。２４．請求項１に記載のオリゴヌクレオチドおよび製薬学的および生理学的に許容し得る担体を含む治療製剤。