JPH08506724A

JPH08506724A - 白血病治療のための化合物および方法

Info

Publication number: JPH08506724A
Application number: JP6514181A
Authority: JP
Inventors: パチュク，キャサリン・ジェイ; コニー，レスリー・アール; オークス，フレッド・ティー
Original assignee: アポロン・インコーポレーテッド
Priority date: 1992-12-04
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 1996-07-23
Also published as: EP0674707A1; CA2150903A1; WO1994013793A1; US6080851A; EP0674707A4

Abstract

(57)【要約】触媒配列、二つの脚部、脚部に相補的な基質ｍＲＮＡの部分と非接続であることのできる位置にある基質ｍＲＮＡと相補的な少なくとも一つのアンカー配列をもつリボザイムが提供された。ある望ましい実施態様では、Ｌ６ｍＲＮＡまたはＬ６およびＫ２８の両ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイムが提供された。Ｌ６およびＫ２８の転座ならびにその結果のＬ６ｍＲＮＡを持つ慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の治療方法が提供された。さらに、Ｋ２８およびＬ６の両ｍＲＮＡに特異的な成分からなる組み合わせ治療が提供された。また、Ｋ２８および／またはＬ６ｍＲＮＡとの組み合わせでｃ−ｍｙｃを発現するその様な患者のための組み合わせ治療を提供する。例えば、治療方法には、この様なｍＲＮＡへ直接リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することが含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】白血病治療のための化合物および方法発明の分野本発明は、リボザイムの脚部に相補的な基質ｍＲＮＡ領域と隣接していなくて良い基質ｍＲＮＡ領域にリボザイムを繋ぎとめる能力のあるアンカー配列を持つリボザイムを提供する。本発明のある望ましい実施態様は、ある種のＣＭＬおよびＡＬＬ患者の造血細胞によって発現するＬ６融合ｍＲＮＡまたはＬ６およびＫ２８の両ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイムを含む。また、本発朋は、オリゴヌクレオチド治療薬を用いる白血病の治療方法を供給する。発明の背景薬剤としてリボザイムを用いる可能性については、非常な期待が寄せられている。リボザイムの薬剤生成物を研究開発するにあたっての重要な必要条件は、目的とする細胞内ＲＮＡへのリボザイムの特異的標的としての能力である。この事は、第二のＲＮＡ分子と相同であるキメラＲＮＡ分子に作用するリボザイムをデザインする場合に、特に第二のＲＮＡの切断が宿主に不利益であれば、とりわけ難しい。標的ＲＮＡ分子が、リボザイムの切断部位またはその近くでのリボザイムの相互作用を妨害する形に折り畳まれている場合も、同等に難しいであろう。我々は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に関連する異常なｍＲＮＡに特異的なリボザイムをデザインする試みの中で、これらの問題の両方に遭遇した。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）は、白血病の二種類の異なる型を代表している。ＣＭＬは、患者のおおよそ９５％がフィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）染色体と呼ばれる細胞発生マーカーに関連する慢性骨髄増殖性疾患である（Ｎｏｗｅｌｌ，Ｐ．Ｃ．およびＨｕｎｇｅｒｆｏｒｄ，Ｄ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６０，１３２，１４９７）。フィラデルフィア染色体は、染色体９および２２の間の相互転座に起因する染色体異常である（Ｍｅｒｃｏｌａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９３３，２２１，６６３）。染色体２２の切断点はブレークポイントクラスター領域（ｂｃｒ）と呼ばれる６Ｋｂの領域に集塊している（Ｇｒｏｆｆｅｎ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ，１９８４，３６，９３−９９）が、これに対して、染色体９では、切断点はｃ−ａｂｌエクソン２の上流９０Ｋｂの領域のいたるところに散乱している（Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８３，３０６，２３９−２４２）。結果として得られた融合転写物は、約８．５Ｋｂの長さであり、ｂｃｒ配列を上流に、ａｂｌ配列を下流に含んでいる。細胞遺伝子aｂｌは、保存性の高い遺伝子であり、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）白血病ウイルスのウイルス形質転換遺伝子（ｖ−ａｂｌ）の先祖の代表的なものである。ｖ−ａｂｌはアベルソン白血病ウイルスに広範囲の型の造血細胞を形質転換する能力を与える。形質転換は、ウイルスゲノムにコードされたチロシンキーゼによって仲介され、ウイルスｇａｇポリペプチドにそのＮ末端を付着させたｖ−ａｂｌポリペプチドからなる。ヒトａｂｌ遺伝子は、染色体９にマッピングされ、チロシンキナーゼ活性を持つ１４５Ｋｂのタンパク質を発現する。ａｂｌの誤制御はヒトのＣＭＬと密接に関係する（Ｓｈｔｉｖｅｌｍａｎら、Ｃｅｌｌ，１９８６，４７，２７７−２８４）。フィラデルフィア染色体に関連する様々な９：２２転座は２種類の型：Ｋ２８転座およびＬ６転座：に細別することができる。Ｋ２８ｍＲＮＡでは、ａｂｌエキソン２がｂｃｒエキソン３に連結している。Ｌ６ｍＲＮＡでは、ａｂｌエキソン２がｂｃｒエキソン２に連結している。Ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡがＣＭＬの急性転化に関する。第３の型の９：２２転座もまた同定された。この型の転座に特異的な染色体９の切断点はＬ６切断点の５’末端に位置している。しかしながら、この異常な染色体の存在は、ＣＭＬではなく急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の確立に関連している（Ｓｅｌｌｅｒｉら、Ｂｌｏｏｄ，１９９０，７５，１１４６−１１５３）。さらに、Ｋ２８およびＬ６のｍＲＮＡも幾人かのＡＬＬ患者に関係していた。Ｋ２８ｍＲＮＡの役割およびＣＭＬの確立がさらに強調された（Ｓｈｔｉｖｅｌｍａｎ，Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ，１９８６，４７，２７７−２８４；Ｋｕｂｏｎｉｓｈｉ，Ｉ．およびＭｉｙｏＳｈｉ，Ｉ、Ｉｎｔ．Ｊ．ＣｅｌｌＣｌｏｎｉｎｇ，１９８３，１，１０５−１１７；Ｓｈｔａｌｒｉｄ，Ｍ．Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ，１９８８，７２，４８５−４９０；Ｍｉｌｌｓ，Ｋ．Ｉ．ら、Ｂｌｏｏｄ，１９８８，７２，１２３７−１２４１）。Ｋ２８転座では、染色体２２の切断点がｂｃｒエキソン３と４の間に位置している（Ｓｈｔｉｖｅｌｍａｎ，Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ，１９８６，４７，２７７−２８４）。この領域が転写されると、二者択一的にスプライシングされて二種の別個のｍＲＮＡ（Ｓｈｔｉｖｅｌｍａｎ，Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ，１９８６，４７，２７７−２８４）：ｍＲＮＡＫ２８およびｍＲＮＡＬ６：を生ずることの出来るｍＲＮＡが生ずる。ｍＲＮＡＫ２８では、ｂｃｒエキソン３がａｂｌエキソン２に融合しているが、ｍＲＮＡＬ６では、ｂｃｒエキソン２がａｂｌエキソン２に融合している。重要なことは、生じるｍＲＮＡが病気の進行中に変化しうることである。Ｌ６転座では、染色体の切断点はｂｃｒエキソン２および３の間にある（Ｓｈｔｉｖｅｌｍａｎ，Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ，１９８６，４７，２７７− ２８４）。この領域が転写されると、一種類のみのｍＲＮＡ，ｍＲＮＡＬ６，が得られる。Ｋ２８およびＬ６のｍＲＮＡは、ＣＭＬ細胞に独特であり、ＣＭＬの確立に鍵の役割を演ずると信じられている異常なチロシンキナーゼ活性を持つタンパク質をコードする（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，８４，６５５８−６５６２）。今までのところ、骨髄移植がＣＭＬ治療の最も効果的な方法である。それでもなお、より感度の高い技術を用いると、幾人かの患者では放射線照射および／または化学療法の後に骨髄移植を受けても、残存白血病細胞が生き残る場合もあることが証明された。研究者たちは、より感度の高いＰＣＲアッセイを用いた研究で、骨髄移植後の患者にｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡが残存することを検出した（Ｓｎｙｄｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９１，５１，１０３３ −１０４０）。ＣＭＬおよびＡＬＬの治療で白血病に関係するｍＲＮＡおよびそれらのタンパク質生成物の程度を減少させる必要性が残されている。これらのｍＲＮＡには、Ｋ２８及びＬ６ｍＲＮＡならびにｃ−ｍｙｃｍＲＮＡのようなｂｃｒ−ａｂｌ転写物が含まれる。リボゾームは魅力的な代替法を提供する。特に、リボゾームの切断部位がキメラ接合部の２または３ヌクレオチド以内、すなわち接合部付近に位置する場合は、特に、ＣＭＬで発生するようなキメラＲＮＡは、リボゾームの標的としての理想的候補になることができる。この場合、１）触媒領域の５’側のリボザイム配列が切断部位の３’側すぐに位置するキメラＲＮＡ配列に相補的であること、２）触媒領域の３’側のリボゾーム配列が切断部位の５’側すぐに位置するキメラ配列に相補的であること、を条件としてして指定する事によって、リボゾームはキメラ分子を特異的に標的とする事ができるが、非キメラ分子は標的としない。この様にして、おそらく、リボゾームの特異性が保たれ、リボゾームの非特異的な切断によって起こる可能性のある有害な結果を排除することができる。しかしながら、キメラｍＲＮＡの全てが接合サイトのすぐ近くにリボゾーム切断に便利なサイトを提示しているわけではない。ｂｃｒ−ａｂｌ接合部付近にある最も近い“ＮＵＸ”リボゾーム切断サイトは接合部から７、８および１９ヌクレオチド離れた位置にある（第１図ｂを参照のこと）ことが、Ｌ６ｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡ配列試験から明らかになった。文献記載の方法では、これらのどの部分もリボゾーム切断の標的にすることは不可能である、なぜなら、その様なリボゾームは正常なａｂｌｍＲＮＡまたは正常なｂｃｒｍＲＮＡをも切断すると思われるからである。さらに、コンピューター予想によるＬ６ｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡの二次構造から、これらの部位は従来のリボザイムには近付きがたいであろうことが示唆された。従って、我々は、Ｌ６ｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡに特異的なリボザイムをデザインする新たな研究を開始した。Ｒｅｄｄｙら、ＷＯ９２／０００８０、１９９２年１月９日公表、は、切断点またはその付近にあるＣＭＬのハイブリッドｂｃｒ−ａｂｌ“遺伝子”を切断する能力を持つリボザイムについて報告している。標的とすべき転座生成物は明細に記載されておらず、ただ一つの転座が起こっていることをそれとなく記載しているのみであった。しかしながら、配列の相補性から、ＲｅｄｄｙのリボザイムはＫ２８の転座を標的していると思われる。この転座は接合部の近くに従来のリボゾームによる切断に好都合なサイトを提示する。ハイブリッドｂｃｒ−ａｂｌに対するリボザイムの特異性を証明する試験は提供されていなかった。前述のように、Ｋ２８によって転写される特別なメッセージは病気の進行中に変化しうる。さらに、あるＣＭＬ患者はＬ６ｍＲＮＡを単独でまたはＫ２８ｍＲＮＡと共に発現している（Ｓｈｔｉｖｅｌｍａｎら、Ｃｅｌｌ，１９８６，４７，２７７−２８４）。未解決の問題が残されている、即ち、Ｌ６ｍＲＮＡである。おそらく、Ｌ６ｍＲＮＡは、単独でＫ２８ｍＲＮＡを標的とするようにデザインした治療によっては影響されないであろう。さらに、ｂｃｒ−ａｂｌ転写物と共にｃ−ｍｙｃｍＲＮＡを標的とする未解決の要求がある。本発明は、前述の転写物を特異的に標的とするＣＭＬ及びＡＬＬを治療するためのオリゴヌクレオチド治療薬ならびに方法を提供する。また、本発明は、Ｌ６ｍＲＮＡまたはＬ６及びＫ２８の両ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイムを提供する。また、本発明は、一般に、触媒認識配列が核形成サイト、標的となるキメラｍＲＮＡの接合部から離れて位置する、または触媒認識配列が二次構造によって容易に近付きがたい、標的ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボゾームの未解決の必要性を解決しようとするものである。本発明のリボゾームは、例えば、ＣＭＬ、ＡＬＬおよび濾胞性リンパ腫のような転座を含む病気の治療に有益である。発明の概要我々は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の確立に関係するｂｃｒ−ａｂｌ融合ｍＲＮＡをモデルとして用い、リボザイムを標的とする一般的な研究方法を開発した。この研究方法を用いて、我々は切断サイトから遠く離れたｂｃｒ−ａｂｌＲＮＡ基質上のサイトにリボザイムを核形成させることに成功した。一般的には、核形成サイトは切断サイトと非常に隣接しており、リボザイムの脚部が核形成を成し遂げることができる、即ち、基質と最初に接触して次に起こるハイブリダイゼーション、ツイスト形成および切断を容易にする。しかしながら、時には、切断サイトに非常に隣接した位置に核形成に有効なサイトがない場合がある。それ故、本発明のリボザイムは、基質ＲＮＡの非隣接の領域を、リボザイムの核形成およびリボザイムの切断のために別々に利用することができる。この研究方法によって、Ｌ６およびＫ２８のｂｃｒ−ａｂｌ融合ｍＲＮＡに特異的な一連のリボザイムが開発された。これらのリボザイムは、ｂｃｒ−ａｂｌ接合部付近にあるｂｃｒ配列に相補的なアンカー配列を通じて、Ｌ６ｂｃｒ−ａｂｌＲＮＡを標的にした。これらのリボザイムによる切断は、融合ｍＲＮＡのａｂｌ特異的配列内の下流側サイトで起こった。正常なａｂｌおよびｂｃｒの基質ＲＮＡは切断されなかった。本発明の研究方法によって、キメラＲＮＡに対するリボザイムの切断の特異性を増加させることが可能になった。さらに、この同じ手段によって、リボザイムは、基質ＲＮＡの二次構造によって他の方法では近付きにくいサイト、またはキメラＲＮＡの場合には接合部から離れたサイトを切断することができようになる。この発明は、ａｂｌエキソン２配列の接合部に融合したｂｃｒエキソン２配列を持つＬ６ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイムを提供する。これらのリボザイムは、ａｂｌエキソン２に相補的な少なくとも一つの領域、および、ａｂｌまたはｂｃｒ配列を切断する能力を持つ少なくとも一つの触媒配列をもつヌクレオチドまたはその誘導体からなる。さらに、リボザイムはｂｃｒエキソン２に相補的な少なくとも一つの領域からなる。加えて、基質ｍＲＮＡに相補的な少なくとも一つの領域から離れた位置を切断する能力を持つリボザイムを提供する。また、本発明は、リボザイムの脚部に相補的な基質ｍＲＮＡ領域と隣接していなくても良い基質ｍＲＮＡの領域に、リボザイムをつなぎとめるためのアンカー配列を持つリボザイムを提供する。ある好適な実施態様は、触媒認識配列がリボザイムのアンカーに相補的である標的ｍＲＮＡの領域から遠くに位置する標的ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイムを提供する。本発明のリボザイムは、例えば、ＣＭＬ、ＡＬＬおよび濾胞性リンパ腫のような転座を含む病気の治療に有効である。また、本発明のリボザイムは、例えば、ｍＲＮＡが触媒認識サイトの近くに基質へのリボザイムの結合を立体的に障害する原因となる領域を持っているような病気に関連するｍＲＮＡを切断するのに有効である。Ｌ６ｍＲＮＡまたはＬ６およびＫ２８の両ｍＲＮＡを発現するような慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）に罹った脊椎動物を治療するための方法を提供する。これらの方法は、リゾザイム、またはＬ６ｍＲＮＡもしくはＬ６およびＫ２８の両ｍＲＮＡの発現を減少させる能力を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドのような、少なくとも一つのオリゴヌクレオチド治療薬を投与することからなる。組み合わせ治療は、Ｌ６ｍＲＮＡおよびＫ２８の両ｍＲＮＡを標的とする場合に好適な実施態様である。例えば、両タイプのｍＲＮＡを発現している患者では、Ｌ６特異的リボザイムはＫ２８転写物に特異的なリボザイムと一緒に用いられる。組み合わせ治療は、病気の進行過程で同時または連続的のどちらかでＬ６およびＫ２８の両ＲＮＡを発現しているＫ２８転座をもつ患者にとって、特に重要である。この様な患者には、Ｌ６またはＫ２８ｍＲＮＡのどちらかに特異的な治療薬による治療は、リボザイムが両方を切断する能力をもつのでなければ、効果的でないであろう。意外にも、Ｌ６ｍＲＮＡを標的とする本発明のリボザイムは、Ｋ２８基質ＲＮＡをも切断するが、本来のａｂｌおよびｂｃｒを示す基質は切断しないことが発見された。Ｋ２８の転座はＬ６の転座に存在しない７５塩基対のエキソンを含むので、この発見には非常に驚かされた。本発明によるリボザイムは、特異性を犠牲にすることなく、核を形成し、Ｋ２８基質を切断することができる。発明者の知りうるところでは、これは二種の異常な転座生成物に特異性を持つ単一なリボザイムに関する最初の報告である。このように単一なリボザイムの投与によって組み合わせ治療を成し遂げることができる。さらに、組み合わせ治療は、Ｋ２８およびＬ６ｍＲＮＡの少なくとも一つに特異性を持つオリゴヌクレオチド治療薬に加えて、ｃ−ｍｙｃＲＮＡに特異的性を持つ（アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムのような）オリゴヌクレオチド治療薬を用いて、ｃ−ｍｙｃＲＮＡをも発現している様な患者にも提供される。図面の簡単な説明第１図は、Ｋ２８およびＬ６の転座を示している。第２図は、実施例１に記載した本発明のＬ６（１）リボザイムのある望ましい実施態様を示している。第３図は、実施例２に記載した本発明のＬ６（２）リボザイムのある望ましい実施態様を示している。第４図ａ−ｃは、リボザイムＬ６（１）₃₁、Ｌ６（１）₂₁、およびＬ６（１）₁₁ のそれぞれによるｂｃｒ−ａｂｌ基質の切断の時間経過を示している。第５図ａおよびｂは、リボザイムの特異性を示している。未変性のａｂｌおよびｂｃｒ基質は切断されなかった。第６図ａおよびｂは、基質ＲＮＡ内の予想される二次構造を示している。第７図ａ−ｃは、リボザイムＬ６（１）₁₁およびＬ６（１）₂₁の反応速度論を示している。発明の詳細な説明本発明の態様の一つは、リボザイムの脚部に相補的な基質であるｍＲＮＡの領域と隣接していなくてもよい基質ｍＲＮＡの領域にリボザイムを繋ぎとめるためのアンカー配列を持つリボザイムを提供することである。核形成領域から離れた位置に存在する配列を切断する能力を持つリボザイムが、本発明の実施態様として提供される。ある望ましい実施態様は、Ｌ６ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイムを含む。また、本発明は、脊椎動物の造血細胞がＬ６ｍＲＮＡを発現すると信じられている、ＣＭＬまたはＡＬＬに罹っている疑いのある脊椎動物の治療方法を供給する。治療方法は、Ｌ６ｍＲＮＡを標的とする少なくとも一つのオリゴヌクレオチド治療薬を脊椎動物に投与することからなる。また、他の方法では、Ｌ６およびＫ２８ｍＲＮＡの少なくとも一つと共にｃ−ｍｙｃを標的とする。本発明の実施態様の一つは、配列がＫ２８およびＬ６の両ｍＲＮＡに存在する、ａｂｌまたはｂｃｒの配列のいずれか一方および望ましくはａｂｌ内でＬ６ｍＲＮＡを切断するのに有効なリボザイムを含む。リボザイムは、自己切断能力または他のＲＮＡ分子を切断する能力を持つ触媒ＲＮＡである。この分野では、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｈｅａｄ）、ヘアピン、テトラヒメナＩ群イントロン、アクスヘッド（ａｘｈｅａｄ）、およびＲＮアーゼＰのような種々の異なる型のリボザイムが知られている（Ｓ．Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０，２５６−２６２）。ハンマーヘッドのリボザイムは４０ヌクレオチドより少ないコアにマッピングされた触媒部位を持つ。植物のウイロイドおよびサテライトＲＮＡの幾つかのリボザイムは、共通の二次構造およびある保存性ヌクレオチドを共有している。これらのリボザイムは、本来それら自身を基質として供するが、酵素ドメインは保存された切断部位と近接する配列との塩基対合を通して他のＲＮＡ基質を標的とすることができる。特別にデザインしたリボザイムのこの能力によって、この様なリボザイムを、配列に特異的なＲＮＡ切断に用いることができる（Ｇ．Ｐａｏｌｅｌｌａら、ＥＭＢＯ，１９９２，１９１３−１９１９）。それ故、ハンマーヘッド触媒配列のような様々な型のリボザイムから異なる触媒配列を用いること、およびここに開示した方法でそれらをデザインすることはこの分野の熟練者の範囲内であろう。また、リボザイムは切断反応の速度を高めるようにデザインされてもよい。例えば、ＧｏｏｄｃｈｉｌｄおよびＫｏｈｌｉ、ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９９１，２８４，３８６−３９１）では、２０から１２までの基質と塩基対合する能力を持つ相補的なヌクレオチドを減少させることを、教授している。さらに、強すぎる結合を妨害すると同時に、認識が多数の塩基に広がるように、ミスマッチを導入してもよい。速度論についての議論は、例えば、Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９１，８８，６９２１−６９２５を参照されたい。本発明のある望ましい実施態様は、切断反応の有効性を維持しながら、特異的にａｂｌ−ｂｃｒ融合転写物を標的にするための十分な相補性を含む。リボザイムが標的とするｍＲＮＡを切断する能力を持つか否かを決定するためのアッセイの例は以下の通りである。ｂｃｒ−ａｂｌ基質のようなＲＮＡ基質は、試験するリボザイムと共に適当な条件下でインキュベーションする。次いで、反応生成物を、例えばゲル電気泳動を用いて試験する。基質ｍＲＮＡの検出可能な切断は肯定的な結果を示し、リボザイムが標的ｍＲＮＡを切断する能力を持つことを示している。本発明の望ましい実施態様は、ａｂｌに相補的な少なくとも一つの領域、およびｂｃｒに相補的な一つの領域からなるリボザイムを提供する。さらに望ましい実施態様は、（アンカーのような）相補性領域および（脚部のような）第二の相補性領域との間に非相補性のスペーサー領域を含む。好適には、リボザイムの触媒モチーフはハンマーヘッドの触媒コア配列であり、より好適には、触媒配列は望ましい実施態様は、ａｂｌ配列に相補的な、約２から約３０のヌクレオチド、好適には約１５のヌクレオチド、を持つ二つの脚部を持つ。脚部の長さは同じである必要はない。また、望ましい実施態様は、ｂｃｒ配列に相補的である約２から約５００、好適には約１１、のヌクレオチドを含み、この配列はアンカーを意味する。本発明のリボザイムは、Ｌ６および／またはＫ２８ｍＲＮＡを切断する能力を持つ。さらに、望ましい実施態様は、ａｂｌに相補的な領域およびｂｃｒに相補的な領域のような相補的領域の間に、約１から約３，０００、好適には約１から約１，０００、より好適には約１から約１００、最も好適には約１３ヌクレオチドからなるを非相補的スペーサー領域を含む。ある望ましい実施態様は、ｂｃｒ−ａｂｌ接合部の３’側１９ヌクレオチドに位置するａｂｌ領域内のＧＵＡサイトでｂｃｒ−ａｂｌ融合ｍＲＮＡを切断する。これらは以下の議論においてＬ６（１）類のリボザイムとしてデザインされた。その他の望ましい実施態様は、ｂｃｒ −ａｂｌ接合部の３’側７ヌクレオチドに位置するａｂｌ領域内のＣＵＵサイトを標的とし、これらはＬ６（２）類と呼ばれる。本開示が与えられれば、当業者は、標的配列およびリボザイムで用いられる触媒コアモチーフの型に従って、種々の可能な切断サイトの配列を認識するであろう。リボザイムのＬ６（１）類は、ｂｃｒ−ａｂｌ接合部の３’側１９ヌクレオチド（ｎｔｓ）に位置するＧＵＡモチーフを切断するようにデザインした（第２図）。この様なリボザイムは、ＧＵＡトリプレットの両側に存在するａｂｌ配列に相補的な配列を含み、さらに、ａｂｌに相補的な配列に隣接していない、ｂｃｒエキソン２内の配列と相補的なアンカー配列を含んでいる。第２図およびそれに続く図は、説明の目的で切断直前の組み合わされた状態を単純化して表している。第６図ａおよび第６図ｂに示す二次構造の予想から明らかなように、接合部の３’側すぐの基質は相補的塩基対合を容易には作れない。基質となるＲＮＡの二次構造の予想は、ＲＮＡ折りたたみのためのＺｕｃｋｅｒおよびＳｔｅｉｇｌｅｒの演算規則を用いて行った。合成した基質分子のヌクレオチド配列を完全に分析したが、折り畳み構造の部分のみを図に示している。アンカー相補的サイトおよび基質切断サイトを示している。＃１および＃２はそれぞれＣＵＵおよびＧＵＡの二つのリボザイム切断サイトを示している。Ｌ６ｂｃｒ−ａｂｌ基質内のｂｃｒ−ａｂｌ接合部はＡＡＧ／ＡＡＧの間に縦線で示し、括弧内の数字は示した構造の最初および最後のヌクレオチドを示している。第６図ａは、正常なａｂｌ基質を示し；ヌクレオチド１−８７はａｂｌエキソン１ａおよび２に由来している。第６図ｂは、Ｌ６ｂｃｒ−ａｂｌ基質を示し；ヌクレオチド１−１４はＢｒｕｅｓｃｒｉｐｔのポリリンカー配列に由来し、ヌクレオチド１５−７２はｂｃｒエキソン２に由来し、ヌクレオチド７３−２３２はａｂｌエキソン２に由来する。アンカーは、ｂｃｒ配列を含むＲＮＡへのリボザイムのハイブリダイゼーションを助力するために挿入され、こうすることによってリボザイムが正常なａｂｌｍＲＮＡを切断しないようにした。また、アンカーは、切断サイト付近、二次構造内に埋没するであろう領域、にリボザイムを隔離するように働くであろう。様々な長さのアンカーを試験した。Ｌ６（１）リボザイムの望ましい実施態様は次のリボザイム：を含む。リボザイムのＬ６（２）類は、ｂｃｒ−ａｂｌ接合部の３’側７ヌクレオチドに位置するＣＵＵモチーフで切断されるようにデザインした。ｂｃｒエキソン２に相補的な領域は、好適には約２から約５００、より好適には約５から約１００、最も好適には約５ヌクレオチドである。触媒コア配列は、望ましくはハンマーヘッド触媒コアモチーフである。ある望ましい実施態様では、２つの脚部のそれぞれは、長さ約４から１５、好適には約７ヌクレオチドである。Ｌ６（２）リボザイムの望ましい実施態様は、以下のリボザイム：を含む。上述のリボザイムの中の相補的配列は変えることができ、それぞれ異なることができる。第一のリボザイム（配列番号：３）は触媒配列の３’側に位置する領域はａｂｌエキソン２に完全な相補性を維持しているが、上記の第二のリボザイムはａｂｌエキソン２配列との２つのミスマッチを含んでいる。ａｂｌエキソン２配列とのミスマッチを含むリボザイムとＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーションは、おそらく、ｂｃｒおよびａｂｌ両方の相補的配列に依存するであろう。ａｂｌ配列との望ましいミスマッチの数は、特異性を保持しながら切断効率を大きくするような数である。文献に記載されたハンマーヘッドリボザイムの大多数は、標的配列に相補的な配列であり且つ触媒サイトに側面を接する“脚部”、によって脇を固めたハンマーヘッド配列からなる。相補性はリイボザイムを所望の切断サイトに導くのに役立ち、それ故、一般的にリボザイムの切断が特異的に起こる原因となる。しかしながら、その様なリボザイムのデザインにおいて、触媒サイトの直ぐ側面に立つ標的配列領域が最初の結合、即ち、リボザイム機能に重大な核形成、のために開放（ｏｐｅｎ）されている。本発明は、例えば、染色体切断点がいろいろな位置に起こる可能性のあるＣＭＬ、ＡＬＬ、および濾胞性リンパ腫に於けるように、相補性のある“開放”（ｏｐｅｎ）領域から離れて存在する配列を切断する能力を持つリボザイムを提供する。これらのリボザイムは、ハイブリダイゼーションを安定化するために切断サイトの一方の側に十分な相補性を持ち、切断サイトのもう一方の側にも同様に十分な相補性を持つ。相補性を持つこれらの領域は、リボザイムの相補的ヌクレオチド配列と相補的ヌクレオチド配列の間に位置する基質配列と実質的にハイブリダイゼーションしないヌクレオチド、またはポリエチレングリコールのような他の分子、からなるスペーサーに付けることができる。“実質的にハイブリダイゼーションしない”と言う句は、切断反応効率を妨害するほどにはハイブリダイゼーションしない長さであれば、スペーサー配列内に幾らかの相補性が存在しても良いことを意味している。この非対合ヌクレオチドの領域は、互いに離れた位置にある脚部とアンカーの相補的領域の間にリンカーとして供される。こうすることによって、これらのリボザイムは、相補的領域の一つから離れた位置を切断できるようになるであろう。ある望ましい実施態様では、切断サイトから離れた位置にあるより長い相補性領域がリボザイムを繋ぎとめるために供される。リボザイムによる切断の特異性および速度は、標的に相補的な任意の一つの領域内に存在する塩基対の範囲を変えることによって修飾しても良い。 “脚部”と言う言葉は、切断サイトと隣接した基質ｍＲＮＡ内の相補的領域と結合する能力を持つ相補的領域を示す。望ましい実施態様では、脚部の相補的領域は、リボザイムの触媒配列と隣接している。“結合する能力を持つ”という句は、脚部が基質内の標的領域を検出できるように結合する能力を持つ限り、標的ｍＲＮＡと正確にはマッチしないヌクレオチドを持つリボザイムも含むことと理解される。この様に、相補性領域は、領域が標的とする地域と結合する能力を残している限り、ミスマッチを含んでいてもよい。一般的に、リボザイムの脚部は核形成のために機能し、それによって、基質との塩基対は、切断サイトに隣接した位置に触媒ドメインを正確に配置する（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３４，５８５−５９１）。 “アンカー”という言葉は、基質ｍＲＮＡと相補的な領域を包括しており、（リボザイム内にスペーサーを持たない場合には）脚部の一つと隣接してもよく、（リボザイム内にスペーサーを持つ場合には）脚部の一つと隣接していなくてもよい。アンカーは、脚部に相補的な基質ｍＲＮＡ領域と隣接していない基質ｍＲＮＡの一つの領域と結合する能力を持つこと、二次構造によって脚部の効果的な核形成が妨げられる場合に核を形成すること、および／または、標的配列がキメラＲＮＡの接合部から離れた領域にある場合に脚部の特異性の向上を助けること、を特徴とする。基質上の非隣接地域の長さは、１ヌクレオチドと同じ位短くても良いが、好適には少なくとも約３ヌクレオチドである。リボザイムがアンカー配列をもつことによってもたらされる有利点には、例えば、基質ｍＲＮＡの触媒認識配列が基質融合ｍＲＮＡの接合部から離れた位置にあるような、異常な融合ｍＲＮＡを切断する能力が含まれる。融合ＲＮＡは、一つの染色体遺伝子がもう一つの染色体遺伝子と並列の位置に置かれた二つの染色体間の転座を伴う。転写によって、転座はこのように融合ｍＲＮＡになる。触媒認識サイトが接合部に近い場合、切断点の両側のすぐの位置にそれぞれのＲＮＡ種に相補的な脚部を持つリボザイムを使用すれば、融合ＲＮＡを標的として用いることができ、多分、主に存在する二種の在来のＲＮＡを切断しないであろう。当然ながら、触媒認識サイトが接合部からさらに遠くに離れるにつれて、リボザイムが本来のＲＮＡも切断するであろう可能性は増加する。第１図から明らかなように、Ｌ６融合生成物上のすべての切断サイトは接合部から７ヌクレオチド以上離れている。本発明のリボザイムは、触媒認識サイトが接合部から離れている場合に、基質ＲＮＡに対する特異性をより大きくすることができる。また、二次構造のような、リボザイムによる切断を阻害する、触媒サイト付近の障害を克服する機構を提供する。その様なリボザイムを調整するための一般的な方法をここに開示する。リボザイムを作成する方法の第一段階は、例えば、ハンマーヘッド触媒コアを用いる場合、基質ｍＲＮＡ内のＸＵＸサイト（Ｘは４種のヌクレオチドの内の任意の一つである）を同定することである。第二段階は、リボザイムの脚部を作ることである。既知の遺伝子配列を用いて、リボザイムの脚部が基質ｍＲＮＡ内のＸＵＸサイトのどちら側にも相補的であるように、リボザイムをデザインすることができる。好適には、リボザイムは、融合ｍＲＮＡ内に存在する配列に一致する正常なｍＲＮＡを実質的に切断しないように、デザインされるであろう。第三段階は、アンカー配列の考案を伴う。アンカーは触媒標的認識サイトを持つ一つのＲＮＡ種よりむしろ異なるＲＮＡ種間の領域に相補的にして、アンカー配列が触媒認識配列から遠い位置にある融合ｍＲＮＡ内の領域を標的とするようにすることができる。スペーサー領域は所望によりリボザイムに含まれて良い。二次構造による阻害が存在する時には、アンカーは、そのような構造の５’、３’側の基質ＲＮＡ上、および／またはこの構造内、の領域に相補的であるようにデザインすることができる。アンカーによって、触媒サイトが転座接合部から遠く離れている場合でさえ、転座に関わるｍＲＮＡ領域のようなアンカーと相補的な配列を、リボザイムが認識し結合できるようになる。リボザイムの大きさが、転座と触媒サイトとの間の領域にわたる基質ｍＲＮＡの大きさと一致しない場合でさえ、基質ｍＲＮＡの任意の非相補性部分がループのような局部に限定された二次構造を形成することがあり、こうなることによって、リボザイムは連続しない配列と結合出来るようになる。リボザイムは、基質ｍＲＮＡの任意の部分を切断するようにデザインすることができること；標的領域は、転座接合部近くに位置する必要がないこと；が理解されるであろう。同様に、アンカー配列は、転座接合部を標的とする必要がない。実験結果から、Ｌ６リボザイムはＬ６およびＫ２８のメッセンジャーの両方を切断すること、およびこの切断は異常なメッセンジャーのみに特異的であることが示された。また、単一のリボザイムが同一のｍＲＮＡの融合を生ずる、多くの異なる転座に有効で有り得ることが理解されるであろう。リボザイムがアンカー配列を持つことによって得られる利点のもう一つの例として、基質ＲＮＡ内の触媒認識配列の近くに位置することによる、加えて二次構造による、立体障害を避ける能力が上げられる。立体障害を作り出すもう一つの状態の例として、基質ｍＲＮＡへのタンパク質の結合が含まれる。二次構造の存在は、例えば、ＰＣｇｅｎｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）のようなコンピュータープログラムを用いて、および／または化学的もしくは酵素的手段によって、決定することができる。リボザイムがスペーサーを持つことによって得られる利点としては、例えば、リボザイムに可動性を持たせ、それによってリボザイムが基質ｍＲＮＡと接触できるように空間を回転する能力が上げられる。また、スペーサーは、リボザイムが基質ｍＲＮＡと結合すること無く、基質ｍＲＮＡの長い距離を覆うようにする。スペーサー領域は、ヌクレオチドもしくはその誘導体、またはポリアルキレングリコールのような非ヌクレオチドスペーサー、並びにＬｅｖｅｎｓｏｎら、米国特許第４，９１４，２１０号（ここに参照として取り入れる）に記載の非ヌクレオチドスペーサーからなる。ある望ましい実施態様では、スペーサーはポリエチレングリコールからなる。他の望ましい実施態様では、スペーサー領域は１から約３０００のヌクレオチドまたはその誘導体を持つ。より望ましい実施態様は、少なくとも約１３のヌクレオチドを持つ。“化学的スペーサー領域”と言う句は、例えば、米国特許第４，９１４，２１０号に記載された化学品のような化学的スペーサーをもつスペーサー領域を意味する。特定の例として、ポリアルキレングリコール、より好適にはポリエチレングリコールが上げられる。当業者は、その様な化学薬品が１から１，０００のヌクレオチドの大きさと等価であるか否かを決定することができる。本発明を読むことによって、当業者は、複数のアンカー配列をもつリボザイムならびに複数スペーサーを持つリボザイム、およびアンカーとスペーサーの組み合わせを持つリボザイムを作り出しうることを理解するであろう。望ましい実施態様では、リボザイムは１から約１００の間、より好適には１から約１０の間、のアンカー配列をもつ。また、望ましい実施態様では、リボザイムは、約１から１００の間、より好適には１から約１０の間、のスペーサー領域を持つ。望ましい実施態様では、リボザイムのそれぞれの脚部は、約２から約１５のヌクレオチド、および好適には約７のヌクレオチドをもつ。アンカー配列は、好適には約２から約５００のヌクレオチド、より好適には約５から約１００のヌクレオチドを持つ。場合により存在するスペーサー領域は、好適には基質ｍＲＮＡの約１から３０００のヌクレオチド、より好適には約１から１０００のヌクレオチド、最も好適には約１０から約１００のヌクレオチドにわたる。本開示を読むことによって、当業者は、切断反応の効率および／または特異性を増加させるために、この様なリボザイムをデザインして修飾体を作ることができるであろう。この様な修飾には、例えば、ＣＭＬの場合に、ｂｃｒエキソン２に相補的な領域の大きさを増大させる事、および／またはａｂｌエキソン２の相補性量を減少させる事が含まれる。ある望ましい実施態様では、リボザイムは複数の触媒単位を含む。本開示によって、当業者は、Ｋ２８ｍＲＮＡおよび／またはＬ６ｍＲＮＡのような基質ｍＲＮＡを切断する能力を持つ複数の触媒単位を持つリボザイムを作る事ができる。その様なリボザイムは基質ｍＲＮＡと相補性を持つ領域に加えて、触媒単位の間にスペーサー領域を含むであろう。触媒単位はそれ自身、例えば、ａｂｌおよび／またはｂｃｒ配列を切断するであろう。アンカーを脚部の一つとつなぐスペーサー領域をもつリボザイムの例としては、実施例１のリボザイムＬ６（１）₃₁（配列番号：２）、ならびに実施例２のリボザイムＬ６（２）₀およびＬ６（２）₂（配列番号：４および５）が含まれる。望ましい実施態様は、配列番号：２の修飾物であり、より短いアンカー配列を持ち、基質ｍＲＮＡをより効率よく切断する、配列番号：１４および配列番号：１５のリボザイムを含む。転座によって生じた融合ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイムのもう一つの例は、配列番号：１３のリボザイムである。このリボザイムは、ＡＬＬに含まれる融合ｍＲＮＡを標的とし、ＡＬＬの治療に用いうるであろう。９；２２染色体の転座はＡＬＬと関連する。染色体９の切断点は、ａｂｌエキソン２の上流に位置する。この領域の転写物は、最初のｂｃｒエキソンがａｂｌエキソン２に隣接する融合ｍＲＮＡを生ずる。このリボザイムのアンカーはｂｃｒエキソン１に相補的であり、リボザイムの残りの部分は配列番号：２のスペーサー領域、脚部および触媒配列に該当する。本開示によって、当業者は、例えば、濾胞性リンパ腫および転座を含むその他の病気を標的とするリボザイムをも作り出すことができるであろう。また、リボザイムを２'-Ｏ−アルキル−および２'-Ｏ−アリル−リボヌクレオチド類似体を用いて修飾しうることも、理解されるであろう（Ｐａｏｌｅｌｌａら、ＥＭＢＯＪ．，１９９２，１１，１９１３−１９１９）。その様な修飾物は“誘導体”という言葉の中に含まれる。さらに、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを混合して用いてもよい（Ｐｅｒｒｅａｕｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，５６５−５６７）。さらに、既知の触媒配列を変えることもできる。例えば、ハンマーヘッドリボザイムのコア触媒領域の共通配列は、例えば、Ｒｕｆｆｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０，２９，１０６９５−１０７０２に従って、変化させても良い。また、脊椎動物の造血細胞はＬ６ｍＲＮＡを発現すると信じられているので、本発明は、ＣＭＬまたはＡＬＬを持つと予想される脊椎動物を治療する方法をも提供する。望ましい実施態様は、Ｌ６ｍＲＮＡ、またはＬ６およびＫ２８の両ｍＲＮＡの発現を減少させる能力を持つオリゴヌクエオチド治療薬を用いることを含む。“オリゴヌクレオチド治療薬”という言葉は、リボザイムおよびアンチセンスＲＮＡの両方を含む。ある望ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド治療薬は、Ｌ６ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイムからなる。その他の望ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド治療薬はＫ２８に結合する能力を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＬ６ｍＲＮＡを結合する能力を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる。さらなる望ましい実施態様は、Ｋ２８およびＬ６ｍＲＮＡに特異的なリボザイム並びにアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物を提供する。その他の望ましい実施態様では、“オリゴヌクレオチド治療薬 ”は、Ｌ６およびＫ２８の両方を切断する能力を持つリボザイムからなる。アンチセンスの技術は、特異的遺伝子の発現を妨害するために用いることができる価値ある道具を提供する。興味ある遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的な配列を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞の表現型も修飾しうる。少なくともＫ２８とＬ６接合部の一部分とハイブリダイゼーションするアンチセンスオゴヌクレオチドが、本発明の方法において、意図される。この様に、異常な転写に競合して結合する分子は、治療薬として期待される。任意の長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられてもよいが、１５塩基より短い配列は標的へのハイブリダイゼーションの特異性が小さいと思われ、酵素消化によってより簡単に破壊されるであろう。これゆえ、少なくとも１５のヌクレオチドを持つオリゴヌクレオチドが望ましい。他方、大きなオリゴヌクレオチドは標的細胞による取り込みが減少するために、発現を干渉する効果が少なくなるであろうことはこの技術分野では既知であるので、オリゴヌクレオチドの大きさは、それが標的細胞に入り込む能力によって制限される。発現の干渉とは、エクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）またはインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）のどちらかで、ｂｃｒ−ａｂｌ融合転写物によってコードされるタンパク質生成物の発現が検出可能なほど減少することを意味することが、理解されるであろう。ここで用いられる“オリゴヌクレオチド”という言葉は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含み、且つ、“ポリヌクレオチド”と呼ぶに十分な長さでありうる分子を含む。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドよりリボヌクレオチドによる酵素攻撃をより受けやすいために、望ましい。又、塩基、糖またはヌクレオチド間の結合は、この技術分野で既知の方法によって、化学的に修飾されて良いことも、理解されるであろう。修飾は、例えば、安定性および／または脂質溶解性を改良するために行われて良い。例えば、脂質溶解性および／またはヌクレアーゼ消化への耐性の強化は、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合のリン酸の酸素をメチル基または硫黄原子で置換する結果、得られることが知られている。特に、ホスホロチオ酸塩は、ヌクレオチド切断に対して安定であり、且つ脂質に溶解する。本発明のリボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の既知の化学的オリゴヌクテオチド合成法によって合成されて良い。例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、１９８４、“オリゴヌクレオチド合成（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）”（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ）を参照されたい。また、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの両方が、適当なベクターからの組換え体での発現を通して合成されても良い。本発明の望ましい実施態様は、組み合わせ治療で、Ｌ６ｍＲＮＡ単独またはＬ６ｍＲＮＡとＫ２８ｍＲＮＡの両方を標的とすることを含む。ＣＭＬまたはＡＬＬ治療の望ましい方法では、オリゴヌクレオチド治療薬は標的となるｍＲＮＡの発現を減少させるために使われる。“発現を減少させる能力”と言う句は、検出可能なほど発現が減少することを意味する。組み合わせ治療は、病気の経過中にＬ６およびＫ２８ｍＲＮＡの両方が同時にまたは連続的に発現する、Ｋ２８の転座を持つような患者にとって、特に重要である。Ｌ６またはＫ２８のｍＲＮＡのどちらかに特異的な治療薬での治療は、この様な患者にとって最も効果がないと思われる。望ましい方法は、Ｋ２８およびＬ６ｍＲＮＡの両方に特異的な成分を持つ組み合わせ治療からなる。治療方法には、例えば、Ｋ２８およびＬ６ｍＲＮＡを切断する能力のあるリボザイムの混合物が含まれる。その他の望ましい実施態様は、Ｋ２８およびＬ６の両ｍＲＮＡと結合する能力を持つ成分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＡＬＬおよびＣＭＬを治療する方法である。“結合（する）能力”と言う句は、電気泳動で移動度が変化すると言ったような、当業者に既知のアッセイで検出できる結合を示す。さらに望ましい実施態様は、Ｋ２８およびＬ６ｍＲＮＡに特異的なリボザイムならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物を提供する。又、これらによる治療は、例えば、化学療法および照射のような従来の治療と合わせて用いても良い。さらに望ましい実施態様は、Ｌ６およびＫ２８を切断する能力を持つ単一のリボザイムを提供する。さらに望ましい実施態様は、Ｋ２８および／またはＬ６ｍＲＮＡを標的とすることに加えて、ｃ−ｍｙｃ発現を支配する組み合わせ治療を含む。例えば、ＣＭＬに於けるｃ−ｍｙｃの潜在性の役割については、Ｓａｗｙｅｒｓら、Ｃｅｌｌ，１９９２，７０，９０１−９１０で議論されている。特に、ｍｙｃは、インビトロではｂｃｒ−ａｂｌの形質転換能力に影響を及ぼし、ｍｙｃは幾人かの患者でＣＭＬの急性転化と関連していた。それ故、本発明のある実施態様は、Ｋ２８および／もしくはＬ６ｍＲＮＡに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに／またはリボザイムに加えで、ｃ−ｍｙｃＲＮＡに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムのような治療薬を用いて、ｃ−ｍｙｃを発現しているその様な患者を組み合わせ治療することからなる。他の望ましい実施態様では、配列番号：１３のリボザイムはＡＬＬの治療に同様に使われても良い。このリボザイムの基質ｍＲＮＡは、配列番号：１２に提供されている。インビボで用いるために、アンチセンスオリゴヌクレオチド並びにリボザイムは、適当は液体ベヒクルまたは補助剤および最適な補助添加物または添加物のような、薬剤担体と結合させても良い。液体ベヒクルおよび補助剤は従来からのものであり、商品として入手できる。その例としては、蒸留水、生理食塩水、デキストロース水溶液などがあげられる。従来の担体を用いての投与に加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチド並びにリボザイムは様々な特殊なオリゴヌクレオチド配給技術をもちいて投与されても良い。例えば、オリゴヌクレオチドは、単層板（ｕｎｉｌａｍｅｌｌｅｒ）リポソームにカプセル化することに成功している。再構築したセンダイウイルス外皮を用いて、ＲＮＡおよびＤＮＡを細胞に配合することに成功している。Ａｒａｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ．，１９８６，８５９，８８−９４（ここに参照として取り入れる）。さらに、オリゴヌクレオチドは、葉酸塩レセプターが仲介するエンドサイトーシスの利己的利用によって細胞内に運ばれてもよい。ＬｅａｍｏｎおよびＬｏｗ，ＰΓｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９１，８８，５５７２−５５７６（ここに参照として取り入れる）。また、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドはベクターを仲介とした配達によって投与されても良いことが理解されるであろう。そのような配達システムは、本開示で示されたように、当業者の範囲内にある。遺伝子治療の望ましい方法は、例えば、治療用オリゴヌクレオチドをコードする遺伝子のレトロウイルスベクター内への取り込み、さらに遺伝子を発現している細胞の選択、を含む。レトロウイルスベクターを用いて、次に、エキソビボで患者の骨胞の幹細胞に伝達する。効率よく再移植するため、例えば、患者自身の骨髄は照射、化学療法または除去によって治療される。次いで、治療した骨髄を患者に移植する。ベクター仲介配達システムの例として、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、ＮｅｗＥｎｇ．Ｊｏｕｒ．Ｍｅｄ．，１９９０，５７０−５７８；Ｒｏｕｘら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８９，８６，９０７９−９０８３；ＤｅＭｏｎｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９０，８７，２９４１−２９４５；Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８９，８６，３５１９−３５２３およびＫａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．ａｎｄＤｅｖ．，１９９２，２，３ −１５を参照されたい。インビボで用いるために、アンチセンスオリゴヌクレオチド並びにリボザイムは、異常な転写物の発現を減少させるのに効果的な量を投与することができる。治療の形態は、患者の体力、年齢、体重、健康状態および性、投与経路、並びにその他の要因で、予防または治療を目的として行われるが、事実上の投与量の判定は患者の体格および体重を考慮して行われるであろう。また、エクスビボでのアンチセンスオリゴヌクレオチドならびにリボザイムは、白血球細胞を末梢血液から分離し、それをオリゴヌクレオチドで処理した後に、細胞を宿主の血液に戻す事によって投与することができる。エクスビボでの技術は、インターロイキン２活性化リンパ球をもつ癌患者の治療に用いられた。オリゴヌクレオチド治療は、正常な血液細胞の生存能力を維持した状態で、白血病細胞を殺すのに有効な量投与することができる。その様な投与量は、白血病の種類および範囲、用いる個々のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドに対する白血病の相対的感受性、並びに他の要因に依存して変化するであろう。本発明の治療は、従来の治療法との組み合わせであって良いことが、理解されるであろう。また、本発明の組み合わせ治療は、順々にまたは同時に投与されて良いことが理解されるであろう。投与量の決定は、個人に依存し、当業者によって決定することができる。材料および方法細菌の増殖および保持大腸菌ＨＢ１０１株（Ｂｏｙｅｒ，Ｈ．Ｗ．およびＤ．Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｌｏ．，１９６９，４１，４５９）およびＳＢ２２１株（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｄ．およびＭ．Ｉｎｏｕｙｅ，Ｃｅｌｌ，１９７９，１８，１１０９−１１１７）は、Ｌ培地（１０ｇ／ｌ−トリプトン、５ｇ／ｌ −酵母エキス、１０ｇ／ｌ−ＮａＣｌ）中、３７℃で増殖させた。長期間保存するために、細菌は７５％のＬ培地／２５％グリセロール中、−８０℃で保存した。プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地で増殖したＨＢ１０１内に保持した。鋳型ＤＮＡの構築各々のリボザイムの二つのＤＮＡの鋳型は、シアノエチルホスホロアミダイト合成（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．およびＭ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９８１，２２，１８５９−１８６２）を用いるＭｉｌｌｉｇｅｎＢｉｏＳｅａｒｃｈ８７５０ＤＮＡシンセサイザーで、ＥｃｏＲＩ末端を持つ二つの相補的オリゴデオキシヌクレオチドとして合成され、逆層の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。おおよそ３μ ｇのそれそれのオリゴヌクレオチドを、５０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む１ｘリンカーキナーゼ緩衝液（７０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．６、１ｍＭ−ＡＴＰ、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、１５ｍＭ−ＤＴＴ）中でリン酸化した。反応は３７℃で３０分間行った。相補的オリゴヌクレオチドは、反応混合物を化合させる事によってリン酸化した後、互いにアニーリングし、次の温度および時間：８５℃で５分間；６５℃で１５分間；３７℃で１５分間；室温で１５分間；および氷上で１５分間：で順々にインキュベーショした。アニーリングしたリン酸化オリゴヌクレオチドは、エタノール沈殿し、脱イオン水（ｄＨ₂Ｏ）に７５ｎｇ／μｌの濃度で再懸濁した。アニールした後、二本鎖オリゴヌクレオチドをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋のＥｃｏＲＩサイトに結合させた。結合したＤＮＡは、遺伝子パルス“ｇｅｎｅｐｕｌｓｅ”（ＢｉｏＲａｄ）を取扱い説明書に従って用いることによって、ＢＨ１０１細菌内にエレクトロポレート（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅ）した。一本鎖の突出部は、ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化によって生じた末端と相補的な末端である。基質ＤＮＡの構築およびクローニングＬ６ｂｃｒ−ａｂｌ基質ＲＮＡのためのＤＮＡ鋳型は、Ｌ６ｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡと同し方向性をも持つオリゴデオキシヌクレオチドとして合成した。このＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ｂｃｒ−ａｂｌ接合部５’側５７ヌクレオチドに位置する場所からｂｃｒ−ａｂｌ接合部３’側９７ヌクレオチドに位置する場所迄に位置付けされる配列からなる（Ｓｈｔｉｖｅｌｍａｎら、Ｃｅｌｌ，１９８６，４７，２７７−２８４；ＨｅｉｓｔｅｒＫａｍｐら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３１５，７５８−７６１）。二本鎖ＤＮＡは、次の配列：（ＥｃｏＲＩサイトを下線で示す）：を持つそれそれ５’および３’プライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって合成した。ＰＣＲ生成物はゲル精製し、ＥｃｏＲＩ消化し、その後、上記の方法でＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋にクローン化した。正常なｂｃｒ基質ＲＮＡのためのＤＮＡ鋳型は、ｂｃｒｍＲＮＡと同じ方向性を持つオリゴデオキシヌクレオチドとして合成した。二本鎖ＤＮＡは、次の配列：をもつ、それぞれ５’および３’プライマーを用いて、ＰＣＲによって合成した。得られたＰＣＲ生成物は、正常なｂｃｒｃＤＮＡの５５４から６７５の場所に位置付けられる（Ｌｏｚｚｉｏら、Ｂｌｏｏｄ，１９７５，４５，３２１−３３４）。Ｋ５６２細胞からの正常なａｂｌｍＲＮＡ領域（Ｌｏｚｚｉｏら）は、ＰＣＲ逆転写酵素によって増幅した（Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２２）である。えられたＰＣＲ生成物は正常なａｂｌｃＤＮＡの１５７から３４０（５）に位置付けられる。正常なｂｃｒおよびａｂｌのＰＣＲ生成物はゲル精製し、リン酸化し、その後、ｄＮＴＰｓおよびＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント存在下で、ブラントエンドにした。次いで、ＤＮＡをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした。Ｋ２８基質のための鋳型は、ＳｃｏｔｔＳｈｏｒｅ博士（ＴｅｍｐｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）に提供して頂いた。クローニングベクターの調製ＢｌｕｅｓｃｔｉｐｔＩＩＫＳ＋プラスミドＤＮＡは、製造者の推奨する条件を用い、ＨｉｎｃＩＩまたはＥｃｏＲＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）のどちらかで、完全に消化した。消化したＤＮＡは、フェノール：クロロホロムで２度抽出し、エタノール沈殿し、その後、供給者の推奨する条件に従って、子ウシの腸のホスファターゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅi ｍＢiｏｃｈｅｍiｃａｌｓ）で脱リン酸化した。リボザイムのクローニング１５０ｎｇと４５０ｎｇとの間のアニーリングしたオリゴヌクレオチドは、２００ｎｇのベクターＤＮＡおよび５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む１０μｌの１ｘ結合緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．６、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ−ＡＴＰ、１０ｍＭ−ＤＴＴ）中で、ＥｃｏＲＩ消化ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋と結合させた。１４℃で一晩インキュベーションした後、反応物は５μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．７、１ｍＭＥＤＴＡ）で希釈し、ただちに使うか、または−２０℃で保存した。２μｌの希釈した結合反応物は、取扱い説明書に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄの“遺伝子パルサー（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ）”を用いて、ＨＢ１０１またはＳＢ２２１内にエレクトロポレートした。形質転換した細菌は、すぐに１ｍｌのＳＯＣ培地（２％［ｗ／ｖ］バクト− トリプトン、０．５％［ｗ／ｖ］酵母エキス、１０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＳＯ₄−７Ｈ₂Ｏ、２０ｍＭグルコース）で希釈し、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、形質転換した細菌を、１００μｌ／ｍｌアンピシリンを含むＬ寒天プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベーションした。クローンの特徴個々の形質転換株を採取し、１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で増殖させた。プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶解の処方箋にしたがって、細菌培養液から収集した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）。さらに、ＤＮＡは、塩化リチウム沈殿、ＲＮアーゼＡ消化、ポリエチレングリコール沈殿、フェノールおよびクロロホルム抽出、およびその後エタノール沈殿させることによって、精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈｃ，Ｅ．Ｆ．および、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）。ＤＮＡは１μｇ／ｌから２μｇ／ｌの濃度でｄＨ₂Ｏに再懸濁した。プラスミドＤＮＡのアリコートは取扱い説明書にしたかって、ＰｓｔＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で二重消化した。生成物は、１．５％アガロース／ＴＢＥ（９０ｍＭトリス−ホウ酸、２ｍＭ−ＥＤＴＡ）ゲルを用いて７０ｍａｍｐｓで電気泳動した。配列分折適当は大きさのプラスミド挿入物は、シークエナーゼ（ＵｎｉｔｉｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、ならびにＭ１３^-20および逆プライマーの両方を用いて、確立された処方箋（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に従って、ＤＮＡ配列分析を行った。配列決定反応生成物は、７％ポリアクリルアミド／尿素ゲルで電気泳動した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ．Ｔ．編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）。Ｔ７およびＴ３の転写のための鋳型の調製プラスミドＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、またはＸｈｏＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）のいずれかで、取扱い説明書に従って、完全に消化した。消化したＤＮＡは、エタノール沈殿し、１μｌの新規に作成したプロテイナーゼＫ溶液（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を含む２００μｌの１ｘプロテイナーゼＫ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）に再懸濁した。反応物は、３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで、フェノール：クロロホルムで２回抽出した。ＤＮＡは、エタノール沈殿し、ＲＮアーゼを含まないＨ₂Ｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に５００ｎｇ／μｌの濃度になるように再懸濁した。インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）での転写基質およびリボザイムＲＮＡは、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、取扱い説明書に従って、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋から転写した。転写に次いで、ＤＮＡ鋳型は、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼ（ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を５μｇ／μｌまたは２単位／μｇのＤＮＡ鋳型に加え、３７℃で３０分間インキュベーションすることによって、反応物から除去した。ＲＮＡはエタノール沈殿によって濃縮し、次いで、プロテイナーゼＫ消化を行い、さらにＲＮアーゼをふくまないＨ₂Ｏに再懸濁した。リボザイム切断実験にトレーサーとして用いる基質ＲＮＡは、製造者の認める方法に従って、Ｔ７またはＴ３転写中に［α³²Ｐ］ＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で放射能標識した。リボザイムアッセイリボザイムおよび基質ＲＮＡの両方１０ｐＭを、１０ｍＭのバナジルリボヌクレオシド複合体または４０単位のＲＮアーゼ（Ｐｒｏｇｅｍａ）のどちらかを含む、１０μｌの１ｘリボザイム反応緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ₂）中でインキュベーションした。反応は、３７℃で１３− １５時間インキュベーションし、１０μｌのホルムアミド装填緩衝液（８０％ホルムアミド、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌキシレンシアノールＦＦ、１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）を加えることによって終止させた。サンプルは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で変性させる前に、９５℃で２分間変性させた。代わりに、リボザイムおよび基質ＲＮＡの両方１０ｐＭを、トレーサーとして５０，０００ｃｐｍの放射能標識した基質ＲＮＡ（比活性［５ｘ１０⁸ｃｐｍ／μｇ］）を含む１０μｌのリボザイム反応緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ₂）中でインキュベーションした。反応は、３７ ℃、最大で１０時間インキュベーションし、ドライアイス上で凍結させる事によって終止させた。サンプルは、５％ポリアクリルアミドゲルを用い、変性させてポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた（Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．，１９７０，ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ，ＳｔｕｄｅｎｔＥｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｏｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ．）。ゲルを乾燥させ、次に取扱い説明書に従って、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩａｇｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）で分析した。ゲルシフト分析５０ｐＭのリボザイムおよび１０ｐＭの基質を５０，０００ｃｐｍの放射能標識した基質ＲＮＡ（比活性［５ｘ１０⁸ｃｐｍ／μｇ］）を含む１０μｌのリボザイム反応緩衝液中、３７℃で２．５時間インキュベーションした。生成物は１ｘＴＢＮ緩衝液（９０ｍＭトリス−ホウ酸、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ₂）を用い、６％ポリアクリルアミドゲルで未変性のままゲル電気泳動によって分析した。ゲルを乾燥させ、次いで、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）で分折した。すべてのリボザイムは基質ｂｃｒ−ａｂｌの帯をシフトさせた。二種類のコンホメーションのｂｃｒ−ａｂｌが検出された。反応速度論分析リボザイム反応は上記の方法で行ったが、基質は過剰に用いた。リボザイム濃度は０．５μＭ一定に保った。用いた様々な基質のリボザイムに対する比率を以下に記載する。反応はいろいろな時間で終わらせ、生成物は変性させゲル電気泳動にかけた。ゲルを乾燥させ、次いで、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒで分析した。ＲＮＡのおりたたみリボザイムおよび基質ＲＮＡの二次構造は、ＰＣＧｅｎｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）およびＭａｃＤＮＡＳＩＳＰｒｏ（Ｈｉｔａｃｈｉ）で、ＺｕｃｋｅｒおよびＳｔｅｉｇｌｅｒのプログラムを用いて予想した。細胞Ｋ５６２（Ｂｌｏｏｄ，１９７５，４５，３２１−３３４）は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２４３）から得、１０％胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を追加した完全最小必須培地（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で培養した。実施例１Ｌ６（１）リボザイムおよびそれらの基質を下に示す；このリボザイムによって切断される基質の認識配列は太く示し、リボザイムのスペーサー配列は下線で示し、接合部は／で示し、触媒コアは括弧［］で示した。Ｌ６（１）₃₁を用いたインビトロでのＬ６基質の切断の結果、上記のように期待された切断生成物を生成した。基質の１５から４０％が、等モル量のリボザイムおよび基質を用いて切断された。基質残査はおおよそ２３０ｂｐの未切断物として移動した。リボザイムの比率を（鋳型をおおよそ３倍に）増加させた結果、得られた切断生成物の量がわずかに増加した。Ｋ２８基質の切断は検出されなかったので、このリボザイムは明らかにＬ６基質に特異的である。ハンマーヘッドリボザイムのＬ６（１）類は、第２図および配列を上記に示すように、ｂｃｒエキソン２の領戚の３１、２１、または１１の長さのヌクレオチドと相補的な、リボザイムの３´末端に位置するアンカーを含む。それらは１３のヌクレオチドからなるスペーサー配列を介して、リボザイムの５’側部分に連結した。このスペーサーは、ａｂｌまたはｂｃｒ配列のどちらとも相補性を持たない。リボザイムの５’末端近くに位置するハンマーヘッド触媒コアは、ａｂｌエキソン２と相補性のある１５ヌクレオチド配列に位置する。アンカー配列を欠くが、他の点ではアンカーを持つリボザイムと相同である、対照のリボザイムもまた、構築され試験された（配列番号：２３）。これらのリボザイムはｂｃｒ−ａｂｌ接合部の３’側１９ヌクレオチドに位置するＧＵＡトリプレットでＬ６ｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡを切断するようにデザインした。合成基質のこの位置の切断によって、（それそれ、７７または７３ヌクレオチドの基質および６６または１２ヌクレオチドのポリリンカーからなる）長さ１４３および８５のヌクレオチドである２つのフラグメントが生成される。それぞれのリボザイムは、予想される切断生成物にＬ６基質を切断することができ、それぞれのリボザイムによって切断される基質の量は、一般的に、アンカー配列の長さに逆比例する。第４図ａ−ｃに、それぞれＬ６（１）₃₁、Ｌ６（１）₂₁、およびＬ６（１）₁₁リボザイムの切断生成物の時間経過を示している。基質の帯は“Ｓ”で示し、生成物の帯は“Ｐ”で示している。しかしながら、２１ヌクレオチドのアンカーを含むリボザイムは早期の時点では１１ヌクレオチドアンカーのリボザイムより、高い活性を示した。また、アンカーを持たないリボザイムもＬ６基質を正しく切断した。切断はアンカーを持つものほど効率的ではなく、生成物の形成はより少なかった。リボザイムなしでは、切断生成物は検出されなかった。アンカー配列はＬ６基質の適正な切断を妨げなかった。しかしながら、生成物の遊離、切断反応の律速段階を示す速度反応論分折では、より長いアンカーを持つリボザイムによる触媒反応は遅かった。反応を基質過剰な条件下で行った場合には、イニシャルバースト速度は、１１ヌクレオチドのアンカーおよび２１ヌクレオチドのアンカーを持つリボザイムでは両方とも同じであった。測定された速度は、他のリボザイムて測定された速度より遅い（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９９０，８７，１６６８−１６７２；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，３１，１２０４２−１２０５４）。しかしながら、他のリボザイムで報告されている速度は小分子のオリゴリボヌクレオチド基質を用いた反応で定量されたのに対して、アンカーを持つリボザイムの速度は大分子の基質ＲＮＡを用いた反応で測定された。反応をリボザイム過剰条件下で打った場合、２１ヌクレオチドのアンカーを持つリボザイムは、１１ヌクレオチドのアンカーを持つリボザイムより活性であった。この様な条件下では、それぞれのリボザイムによる切断速度は、基質過剰で測定した反応速度より遅く、この事は、リボザイムが基質誘導のコンホメーンョン変化を受けるであろう事を示している（即ち、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９０，１８，１１０３−１１０８を参照の事）。しかしながら、治療上の目的から、リボザイムが基質過剰でより効率的であることは都合が良い。。２１ヌクレオチドのアンカーを持つリボザイムの生成物解離速度は、１１ヌクレオチドのアンカーを持つリボザイムのそれより遅いが、正味の結果では、１１ヌクレオチドのアンカーを持つリボザイムは反応時間をのばすとより有効である。リボザイムは、ｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡに特異的である。基質ＲＮＡの二次構造の予想は、ＲＮＡの折りたたみ構造に関するＺｕｃｋｅｒおよびＳｔｅｉｇｅｒのアルゴリズムを用いて行った。正常なａｂｌＲＮＡの二次構造の予想は、切断サイトと側面を接する配列がリボザイム結合を受け入れないかもしれないことを示唆している（第６図ａ）。このことは、インビトロで結合アッセイに用いることによって実験的に確認された。もし、基質の二次構造が最初に融解したならば、リボザイムは正常なａｂｌ基質を切断するであろうと予想された。それ故、基質を最初に変性させ、次いでリボザイム存在下で復元して、実験を行った。この様な条件下では、１５％から２０％の間の正常なａｂｌ基質が１１ヌクレオチドのアンカーを持つリボザイムによって切断された。この結果は、ゲル移動データと共に、正常なａｂｌ基質は多分リボザイムの核化をふさぐように折りたたまれているという解釈を指示する。それ故、正常なａｂｌＲＮＡはアンカーを持つリボザイムとの結合を受け入れないために、この様なリボザイムは正常なａｂｌＲＮＡを切断できないと考えられる。Ｌ６ｂｃｒ−ａｂｌ基質の二次構造の予想は、リボザイムの切断サイトと側面を接する配列もまたリボザイムとの結合を受け入れないが、リボザイムのアンカーと相補的な領域のほとんどがアンカーとのハイブリダイゼーションに有効であることを示唆している（第６図ｂ）。この様な予想はベクター誘導のポリリンカー配列を含む基質ＲＮＡについて行ったものであるが、未変性の基質ＲＮＡについての予想は、アンカー相補性のほとんどがこの分子にもなお存在することを示した。我々のモデルによれば、リボザイムアンカーの機能は、リボザイムを近付きやすい基質配列につなぎとめ、それによって基質切断サイト付近内に分子を隔離することにある。このことから、切断サイトおよび側面にある配列が二次構造の一時的転移のために利用できるようになるときは常に、リボザイムが基質を切断出来るようになる。この様な二次構造の変化は、実際に、さらなるリボザイムの相互作用によって育まれる、および／または安定化するであろう。我々は、キメラＲＮＡを用いて、リボザイムアンカーが切断サイトの周辺の二次構造を原因とする障害に打ち勝つために有効であることを証明したが、アンカーを用いると、リボザイムは任意のＲＮＡ分子のふさがれたサイトを標的にすることができる可能性を持つ。アンカーの最適な長さは、おそらくアンカー配列および二次構造に依存するであろう。アンカーを持たないリボザイムでは、有効でない切断が認められるように、何等かの形のアンカーが存在することが明らかに重要である。本実施例で試験したアンカーは、１３ヌクレオチドからなるスペーサーを介してリボザイムに付着させた。また、アンカーは化学的スペーサーを介して連結させることもできるし、または単純にリボザイムに直接結合させても良い。スペーサーの存在は、リボザイムが切断サイトから離れた位置につなぎとめられる場合に、立体化学的に重要であろう。予想に反して、Ｌ６（１）₁₁はＫ２８基質をも切断することが、試験の結果分かった。このことは、Ｌ６（１）₁₁をＫ２８基質と共にインキュベーションすることによって示された。反応生成物は、変性させ、５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロミドで染色した。この様に、Ｌ６（１）₁₁は未変性のａｂｌまたはｂｃｒを切断しないが、Ｌ６およびＫ２８の両方を切断した。病気の進行中のＫ２８転写物の変化の可能性を考慮すると、Ｌ６（１）₁₁は価値ある治療薬でありえた。実施例２Ｌ６（２）リボザイム［Ｌ６（２）_0-4］を第３図にしめす。それらの配列および基質を以下に示す；これらのリボザイムによって切断される基質の認識配列を太字で示し、リボザイムの誤対合（ミスマッチ）配列を下線で示し、接合部を／で示し、触媒コアを括弧（［］）で示している。インビトロでＬ６（２）₀を用いて基質を切断した結果、Ｌ６およびＫ２８の両基質が予想された切断サイトで完全に切断された。Ｌ６（２）₂は、たとえ効率が悪くても、Ｌ６基質を切断した。Ｋ２８基質の切断もまた非効率であるが認められた。基質に関してリボザイムの分子比率を増加させると切断反応の効率は上昇するが、非特異性が残る。Ｌ６（２）₃、およびＬ６（２）₄では、Ｋ２８またはＬ６基質のどちらの切断も検出されなかった。ハンマーヘッドリボザイムのＬ６（２）類は、ｂｃｒエキソン２に相補的な配列、ハンマーヘッド触媒コア、およびａｂｌエキソン２に相補的な二つの領域からなる。アンカーが相補的であるｂｃｒエキソン２の領域は、脚部の一つと相補的な基質ＲＮＡの領域と隣接している。ａｂｌに相補的な第一領域はリボザイムの５’末端の一番端に位置し、これに対してａｂｌに相補的な第二領域は触媒配列の３’側すぐの所に位置する。この領域の配列は一連のリボザイムのそれぞれで変化している。Ｌ６（２）₀リボザイムは、ａｂｌエキソン２に対する完全な相補性を維持しており、リボザイム、Ｌ６（２）₂、Ｌ６（２）₃およびＬ６（２）₄は、ａｂｌエキソン２配列に対して、それぞれ２、３、および４の誤対合を含んでいる。これらのリボザイムはｂｃｒ−ａｂｌ接合部の３’側７ヌクレオチドに位置するＣＵＵトリプレットを切断するようにデザインした。合成基質のこのサイトの切断の結果、（それぞれ、６５または８５のヌクレオチドの基質および６６または１２ヌクレオチドのポリリンカーからなる）１３１ヌクレオチドおよび９７ヌクレオチトの長さの二つのフラグメントが生じた。Ｌ６（２）₀およびＬ６（２）₂の両リボザイムは合成Ｌ６基質を切断し、期待される切断生成物を生じたが、Ｌ６（２）₀の方がより活性であった。期待に反して、両リボザイムは、Ｌ６基質を切断するのと同じぐらい効率的に、合成Ｋ２８基質をも正しく切断することができた。ＬＧ（２）₃およびＬ６（２）₄リボザイムは活性が検出されなかった。Ｌ６（２）₀リボザイムはＬ６（１）₃₁リボザイムより活性であるが、０．５から４時間の間の時間分析では、実施例１の２１ヌクレオチドおよび１１ヌクレオチドのアンカーを持つ両リボザイムより活性が低い。しかしながら、８時間では、Ｌ６（２）₀は２１ヌクレオチドのアンカーを持つリボザイムより基質を良く切断した。これらのリボザイムはｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡに特異的であったが、早い時点で分析されたＬ６（１）リボザイムの切断ほど活性ではなかった。Ｌ６（１）リボザイムはスペーサーおよびより長いアンカー配列を含んでいた。Ｌ６（２）リボザイムのより低い活性は、部分的には、ゲル移動アッセイによって示されたように基質との結合の減少による。これらのリボザイムは、Ｌ６ｂｃｒ−ａｂｌ基質の立体配座の一つとのみ有意に結合するように見えた。しかしながら、基質の大多数は、８時間後、ＬＧ（２）₀リボザイムによって切断され、このことは、基質の二次構造が定位状態でなく、リボザイムの結合を許すように他の立体配座に転じるであろうことを示唆している。このことは、立体配座の変化が標的サイトを別の方法では利用できないものを利用できるようにする時のために、切断コアを近くに保つという、アンカーを持つリボザイムの一つの利点を証明している。二次構造の予想は、Ｌ６（２）リボザイムによって認識される切断サイトおよび側面を接するａｂｌ配列がこれらのリボザイムに近付きにくいかもしれないことを示している（第６図ｂ）。しかしながら、リボザイムの３’末端に相補的なｂｃｒ領域ならびにａｂｌの一つのヌクレオチドは予想されるＲＮＡ立体配座において近付きやすいと思われる。この領域は、リボザイムが結合しない第二の立体配座の状態のＬ６基質ＲＮＡでは利用できないかもしれない。Ｌ６（２）₃およびＬ６（２）₄は現行の試験では活性を示さなかったが、ポリリンカー配列を除いて化学的に合成したならば、違った反応を示すかもしれない。また、Ｌ６（２）₀およびＬ６（２）₂リボザイムは、Ｌ６基質を切断するのと同しぐらい効果的に合成したＫ２８基質を切断することができた。本発明のリボザイムは、Ｌ６およびＫ２８の融合ｍＲＮＡの両方を特異的に切断することが報告された最初のものであり、従って、単独の治療薬として、Ｋ２８またはＬ６型のどちらかの転座に関連したＣＭＬ患者を治療するために用いることができる。実施例３−特異性および有効性ｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡに関するリボザイムの特異性は、合成した正常なａｂｌ基質（第５図ａ）または合成した正常なｂｃｒ基質（第５図ｂ）と共にリボザイムをインキュベーションすることによって試験した。それぞれ１０ｐＭのリボザイムおよび放射能標識した基質と放射能標識していない基質の混合物を３７℃ で６時間インキュベーションし、変性させて５％ポリアクリルアミドゲルでゲル電気泳動を行った。第５図ａ、第１−６列は、それぞれリボザイムＬ６（１）₃₁ Ｌ６（１）₂₁、Ｌ６（１）₁₁、Ｌ６（２）₀、Ｌ６（２）₂およびＬ６（２）₃ を示している。第７列はリボザイムを含んでいない。第５図ｂ、第１−５列は、第５図ａに記載の通りである。第６列はリボザイムを含んでいない。これらの反応のいずれでも切断生成物が検出されなかったことから、これらのリボザイムはすべてｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡに特異的であることが示唆された。アンカーを含まないＬ６（１）リボザイム（配列番号：２３）もまた正常なａｂｌ基質を切断しなかった。正常なｂｃｒ切断はこの分子が標的となる切断サイトを欠いているために予想されなかったが、この標的サイトは正常なａｂｌ基質にも存在する。リボザイムがこの分子を切断しないのは、リボザイムが正常なａｂｌ基質に結合できない事、、またはリボザイムがすでにそれに結合した分子を切断できない事、によるのかも知れない。これらの二つの可能性を識別するために、基質のゲル移動アッセイを行った。ゲル移動実験は、放射能標識したＬ６ｂｃｒ−ａｂｌ基質または放射能標識した正常なａｂｌ基質のどちらかと共に行った。アッセイ条件下では、Ｌ６ｂｃｒ−ａｂｌＲＮＡは、二種類の主な立体配座で存在する。これらの種類は両方ともＬ６（１）リボザイムによってシフトする。これに対して、Ｌ６（２）₀ およびＬ６（２）₂リボザイムは、ｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡの早く移動する種類をシフトすることができるだけであった。試験したリボザイムは、いずれも未変性のゲル上を一種類の立体配座として移動する、放射能標識したａｂｌ基質をシフトさせられなかった。この結果は、これらのリボザイムのｂｃｒ−ａｂｌ基質に対する特異性はこれらのリボザイムが正常なａｂｌ基質に結合することが出来ないことによることを示している。より早い反応速度を持つリボザイムを同定するために、反応速度分折を行った。２１ヌクレオチトおよび１１ヌクレオチドからなるアンカーを持つリボザイムは、特異性および早い時点で最も高い切断速度を示すため、さらなる分析を行うために最初に選んだ。また、この分析はリボザイム活性へのアンカーの長さの効果を決定することをも可能にする。すべての実験は基質過剰条件下で行った。切断速度は１１ヌクレオチドおよび２１ヌクレオチドのアンカーを持つリボザイムについて測定した。第７図ａは、Ｌ６（１）₁₁での試験結果を示し、［●］は基質：リボザイムの比率が２：１；［○］は５：１、［□］は１０：１である。第７図ｂはＬ６（１）₂₁での試験結果を示し、基質：リボザイムの比率は上記のＬ６（１）₁₁と同じである。第７図ｃは、基質：リボザイムの比率を５：１にした場合のＬ６（１）₁₁［□］およびＬ６（１）₂₁［●］の比較を示している。得られた結果の分析から、これらの反応はミカエリス−メンテンの反応速度論に従わないことが示唆された（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３４，５８５−５９１）。それ故、データは時間に対して生成物とリボザイムの濃度比をプロットすることによって偽の一次速度反応に適合させた。反応速度は、“Ｅｎｚｙｆｉｔｔｅｒ”プログラム（ＥｌｓｅｖｉｅｒＢｉｏｓｏｆｔ）を用いて、反応時間経過の直線回帰から求めた。両リボザイムは、早期時点では爆発的に生成物を形成し、次いで、ひどくゆっくりとした定常状態を示した。初期の爆発段階の勾配から、それぞれのリボザイムの触媒速度は０．０３／分であることが分かった。後期の時間点での勾配は、リボザイムからの生成物の解離速度を示している。与えられたリボザイムについて、同じような勾配が、様々なリボザイムと基質との比率でも見出だされた。しかしながら、試験した基質：リボザイムのすべての比率について、２１ヌクレオチドのアンカーを持つリボザイムは、１１ヌクレオチドのリボザイムより３−４倍ゆっくりした代謝回転と示すことが、二つの勾配の違いによって示された。実施例４：Ｋ２８−Ｌ６の組み合わせ治療細胞Ｋ５６２細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），１ｘ非必須アミノ酸（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および２ｍＭグルタミン（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に調製したα修飾ＭＥＭ培地（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に細胞密度１０⁵／ｍｌで植え継いだ。Ｋ２８アンチセンスオリゴヌクレオチドと同し塩基構成の１８マー（配列番号：チドはＳｙｎｔｈｅｃｅｌｌから購入した。Ｌ６融合のｍＲＮＡ接続部をつなぐセンスオリゴヌクレオチド、およびＬ６アンチセンス分子と同し塩基組成を持つホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、ＭｉｌｌｉｇｅｎＢｉｏＳｅａｒｃｈ８７５０ＤＮＡシンセサイザーを用い、シアノエチルホスホロアミダイト合成法（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９８１，２２，１８５９−１８６２）で合成した。Ｋ５６２細胞は、継代後４８時間、細胞が指数増殖期にあると定量された時点で、平板培養するために集菌した。細胞はペレット状にし、洗浄し、細胞濃度が１ｘ１０⁶／ｍｌになるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＢＲＬ−Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、９６穴のプレートに濃度が５ｘ１０⁴細胞／穴になるように塗布した。一つの穴につき、２μｇのリポフェクチン（ＢＲＬ）、および１０μｇの単一のオリゴヌクレオチドまたはそれぞれ１０μｇの二つのオリゴヌクレオチドのいずれかをＯｐｔｉ−Ｍｅｍ中に含む混合物１００μｌを加えた。未処理の対照細胞には１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭのみを加えた；細胞は３７℃４時間インキュベーションし、その時点で、一つの穴につき、５０μｌの熱で不活性化させた４０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を加えた。リポフェクション後２０時間で、おおよそ５μｇのオリゴヌクレオチドまたはそれぞれ５μｇづつの２つのオリゴヌクレオチド／２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを予定した穴に加えた。それぞれの時点で、２０μｌの１：３０に希釈した³Ｈ−チミジン（６．７ｃｉ／ｍＭ）を適切な穴のそれぞれに加えた。細胞を３７℃で１８時間インキュベーションし、次いで集菌し、取扱い説明書にしたがって、自動細胞収集器（ａｕｔｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｈａｒｂｅｓｔｅｒ）（Ｓｋａｔｒｏｎ）で溶菌した。ＤＮＡはＳｋａｔｒｏｎのフィルターマットで取集した。フィルターを乾燥し、３ｍｌのＥＣＯ−Ｓｃｉｎｔ（ＮａｔｉｏｎａｌＤｉａｇｏｎｏｓｔｉｃｓ）と共にシンチレーションバイアル内に置き、ＢｅｃｈｍａｎＬＳ９８００シンチレーションカウンターで計数した。細胞分裂におけるＫ２８またはＫ２８／Ｌ６組み合わせのアンチセンス処理効果を測定し、同じヌクレオチド含量のスクランブルオリゴヌクレオチドを用いて得た効果と比較した。Ｌ６特異的アンチセンスで処理したＫ５６２Ｍ胞による³ Ｈ−チミジンの取り込みの減少は、最初にアンチセンス処理をしてから４時間後に認められ（第一表、時間点１）、この傾向はすべての時間点で継続した。また、Ｋ２８およびＬ６アンチセンス化合物の混合物で処理した細胞による³Ｈチミジン取り込みの減少も、すべての時間点で認められた（第１表）。効果の大きさはそれぞれの時間点で変化し、最も大きい違いが認められたのは、時間点４であった。Ｌ６およびＫ２８オリゴヌクレオチドの組み合わせ処理の結果、スクランブル対照で認められた³Ｈ−チミジンの取り込みに比べて、１．６から３．９倍減少した（第１表）。Ｌ６オリゴヌクレオチドのみで処理した結果、³Ｈ−チミジンの取り込みはスクランブル対照で認められるそれに比較して３．１から４．８倍減少した（第１表）。Ｋ２８アンチセンスのみで処理した結果、対照の時間点２および３での取り込みに比べて、³Ｈ−チミジンの取り込みは僅かに減少したのみであった（第１表）。未処哩の対照サンプルと任意の処理サンプルについて得られた値の比較から、リポフェクション処理またはリポフェクションとオリゴヌクレオチドの組み合わせ処理のいずれかの結果として非特異的毒性が生じたことが示される。また、細胞形態学上へのアンチセンス処理効果についても試験した。時間点１および２で試験した場合には、未処理および処理した細胞は同じ様に見えた。しかしながら、細胞容量の大部分を占める大き液胞をもつ細胞が、時間３の時点で、Ｌ６アンチセンスのみ、およびＬ６／Ｋ２８の組み合わせで処理したサンプルに時間点３で現れた。液胞の出現した細胞の割合は、それぞれの場合、時間点４で最も多かった。液胞を持つ細胞の出現は、未処理のサンプル、Ｋ２８アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したサンプル、または任意のスクランブルオリゴヌクレオチドで処理したサンプルでは認められなかった。それ故、³Ｈ−チミジンの取り込みの減少と液胞の形態学の間には相関関係があった。この様な結果は、Ｌ６特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＬ６およびＫ２８特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせでＫ５６２細胞系を処理すると、Ｋ５６２細胞系の増殖速度が減少することを、示している。Ｋ２８特異的オリゴヌクレオチドでの処理は、Ｋ５６２細胞系の増殖速度を明らかには減少させないが、Ｓｚｃｚｙｌｉｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，５６２−５６５は、ホスホジエステル骨格をもつ同じ様なＫ２８特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した後、白血病コロニー形成の減少が認められたことを報告している。前述の実施例は、本発明を説明するためのものであって、どの様な場合にも制限するものではない。当業者は、添付の請求の範囲に示したような本発明の精神および範囲内にある修飾物を作成することができることを認識するであろう。配列表（2）配列情報 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者コニー，レスリー・アールアメリカ合衆国ペンシルバニア州19010, ローズモント，コネストガ・ロード 1000，エイ―201 (72)発明者オークス，フレッド・ティーアメリカ合衆国ペンシルバニア州19355, マルヴァーン，オーク・ヒル・サークル 24

Claims

【特許請求の範囲】１．触媒配列；触媒配列の両側に一つずつあり、実質的に基質ｍＲＮＡと相補的である２つの脚部；および基質ｍＲＮＡに相補的な少くとも一つのアンカー配列；からなる、基質ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイム。２．触媒配列；触媒配列の両側に一つずつあり、実質的に基質ｍＲＮＡと相補的である２つの脚部；および脚部に相補的な基質ｍＲＮＡの部分と隣接しない位置にある基質ｍＲＮＡに相補的な少くとも一つのアンカー配列；からなる、基質ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイム。３．アンカー配列と相補的である基質ｍＲＮＡの部分が脚部と相補的な基質ｍＲＮＡの部分から少なくとも約３ヌクレオチド離れた位置にある、請求項１記載のリボザイム。４．さらに、リボザイムのアンカーに相補的な地域と脚部に相補的な地域との間に位置するｍＲＮＡ基質配列と実質的にハイブリダイゼーションしない、脚部とアンカーとの間のスペーサー領域を含む、請求項１記載のリボザイム。５．スペーサー領域がヌクレオチドまたはその誘導体からなる、請求項３記載のリボザイム。６．スペーサー領域がポリアルキレングリコールからなる、請求項３記載のリボザイム。７．スペーサー領域が約１から約３０００ヌクレオチド、またはその誘導体からなる。請求項４記載のリボザイム。８．スペーサー領域が約１から約３０００ヌクレオチドと等価の大きさの化学的スペーサーからなる、請求項３記載のリボザイム。９．スペーサー領域が少なくとも約１３ヌクレオチド、またはその誘導体からなる、請求項６記載のリボザイム。１０．それぞれの脚部が少なくとも約４のヌクレオチドを持ち、アンカー領域が少なくとも約２のヌクレオチドを持つ、請求項１記載のリボザイム。１１．少なくとも一つのｂｃｒエキソン２に相補的な領域、少なくとも一つのａｂｌエキソン２に相補的な領域、および少なくとも一つのＬ６ｍＲＮＡを切断する能力を持つ触媒配列を持つ、ヌクレオチドまたはその誘導体からなる、ａｂｌエキソン２配列との接合部に融合したｂｃｒエキソン２を持つ、Ｌ６ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイム。１２．Ｋ２８ｍＲＮＡを切断する能力をもまた持つ、請求項１０記載のリボザイム。の誘導体からなる、請求項１１記載のリボザイム。１４．触媒配列がａｂｌエキソン２中の配列を切断する能力を持つ、請求項１０記載のリボザイム。１５．少なくとも２つのａｂｌエキソン２に相補的な領域を持ち、それらの少なくとも一つは触媒配列の５´側に位置し、少なくとも一つは触媒配列の３’側に位置する、請求項１０記載のリボザイム。誘導体からなる、請求項１０記載のリボザイム。１７．リボザイムがおよびその誘導体からなる群から選択した配列からなる、請求項１３記載のリボザイム。１８．ｂｃｒエキソン２に相補的な領域が約５から約３１のヌクレオチドまたはその誘導体からなる、請求項１３記載のリボザイム。１９．ａｂｌエキソン２に相補的な領域が約１０から約１５のヌクレオチドまたはその誘導体からなる、請求項１０記載のリボザイム。２０．さらに、アンカーと脚部との間の基質ｍＲＮＡ配列と実質的にハイブッリダイゼーションしないスペーサー領域を含む、請求項１０記載のリボザイム。２１．スペーサー領域が少なくとも約１３のヌクレオチドからなる、請求項２０記載のリボザイム。２２．切断がＣＵＵサイトで起こる、請求項１０記載のリボザイム。２３．切断がＧＵＡサイトで起こる、請求項１０記載のリボザイム。２４．脊椎動物にＬ６ｍＲＮＡの発現を減少させる能力を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチド治療薬を投与することからなる、Ｌ６ｍＲＮＡを発現する造血細胞をもっている疑いのある脊椎動物を治療する方法。２５．脊椎動物にＬ６およびＫ２８の両ｍＲＮＡの発現を減少させる能力を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチド治療薬を投与することからなる、Ｌ６ｍＲＮＡを発現する造血細胞をもっている疑いのある脊椎動物を治療する方法。２６．脊椎動物がＣＭＬまたはＡＬＬを持っている疑いのある、請求項２４または２５記載の方法。２７．オリゴヌクレオチド治療薬が請求項１記載のリボザイムからなる、請求項２４または２５記載の方法。２８．さらにＫ２８ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイムからなる、請求項２７記載の方法。２９．リボザイムが、およびその誘導体からなる群から選択された配列からなる、請求項２７記載の方法。３０．オリゴヌクレオチド治療薬がさらにＬ６ｍＲＮＡと結合する能力を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体からなる、請求項２６記載の方法。３１．オリゴヌクレオチド治療薬がさらにＫ２８ｍＲＮＡと結合する能力を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体からなる、請求項２６記載の方法。３２．さらに、エクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）でオリゴヌクレオチド治療薬を投与することからなる、請求項２４または２５記載の方法。３３．ｃ−ｍｙｃｍＲＮＡの発現を減少させる能力のあるオリゴヌクレオチド治療薬、並びにＫ２８ｍＲＮＡおよびＬ６ｍＲＮＡの少なくとも一つの発現を減少させる能力を持つオリゴヌクレオチド治療薬を脊椎動物に投与することからなる、ｃ−ｍｙｃならびにＬ６およびＫ２８ｍＲＮＡの少なくとも一つを発現する造血細胞を持っている疑いのある脊椎動物を治療する方法。３４．ａｂｌエキソン２配列と接合部で融合したｂｃｒエキソン２配列を持つ、Ｌ６ｍＲＮＡを切断する能力を持つリボザイム。