JPH11511014A - 免疫刺激応答が低減した遺伝子発現の調節法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、病原体媒介の疾病や他の医療状態の処置に使用されているある種のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの免疫刺激作用を抑制する方法を提供するものである。本発明の方法により、そのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにおける少なくとも１つの化学構造を修飾して免疫刺激応答を減じたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを製造し、これを処置すべき疾病または状態にある哺乳動物に投与することにより、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの免疫刺激作用は抑制される。本発明方法により哺乳動物の免疫応答もモニターされる。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫刺激応答が低減した遺伝子発現の調節法 本発明は、アンチセンス製剤の分野、さらに詳しくは、そのようなアンチセン ス製剤によって治療された個体に誘発される免疫刺激応答を低減する方法に関す る。 発明の背景 アンチセンスオリゴヌクレオチド技術は、病原菌感染、がんおよび遺伝病とい ったような多くの疾患に対して刺激的な新しい治療を提供する。該分野は、過去 １０年間に非常に大きく発展しており、現在も多数の臨床的試みが進行中であり 、また提案されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソン・クリッ ク型またはフークシュタイン型塩基対により標的核酸に結合することによって作 用する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生物のゲノム内のいずれの単一の 遺伝子をも標的化し、阻害するように設計することができる。たとえば、配列番 号１および配列番号５のオリゴヌクレオチドは、１型ＨＩＶの複製を阻害する、 １型ＨＩＶのgagおよびrev領域に相補的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドであり、配列番号８のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヒトp５３ がん遺伝子に結合する。アンチセンスを用いるアプローチは、現在のところ、疾 患という状況において特異的遺伝子の発現を正確かつ有効に調節することに対し て広く効力を有する唯一の公知の方策である。 しかし、ホスホロチオエート結合含有アンチセンスオリゴヌクレオチドのなか には、インビトロおよびインビボの両方において、Ｂ細胞増殖および／または抗 体応答を引き起こす免疫刺激応答を呈するものもある。この免疫刺激応答は、す べてのホスホロチオエート結合含有アンチセンスオリゴヌクレオチドに特徴的な ものではない。たとえば、配列番号８のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド は免疫刺激効果を誘発しないことがわかっている。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの免疫刺激効果は、オリゴヌクレオチ ド内の特定の配列によるものであり、該オリゴヌクレオチドがそれぞれの標的遺 伝子に関してアンチセンス、センスまたはスクランブルであるかどうかには拘わ りがないと考えられる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオーチドには、細胞増 殖のみを誘発するものもあり、免疫刺激効果をまったく呈さないものもある。マ ックルンタイヤ(Mclntyre)らの(1993)Antisense Res．Dev.,3:309-322には、あ るオリゴヌクレオチドが、無胸腺ヌードマウスにおいて著しい巨脾症を引き起こ しうることが開示されている。メッシーナ(Messina)らの(1993)Cell Immunol.,1 47:148-157；およびピセツキーらの(1994)Life Sciences,54:101-107には、ＤＮ Ａならびに構造的に関連する合成オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが リンパ球を刺激することが開示されているが、この刺激のメカニズムはまだ完全 には解明されていない。Ｂ細胞は、通常、表面免疫グロブリンに抗原が結合する ことによって休止状態から活性化される。マウスでは、活性化もまた、インター ロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、γ−インターフェ ロンといったような生理的モジュレーター、およびリポ多糖（ＬＰＳ）、コンカ ナバリンＡ（conＡ）ならびにポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）といった ような非生理的マイトジェンによって調節することができる。 オリゴヌクレオチドのある配列モチーフまたは構造は、マウス細胞の刺激を引 き起こすにあたり重要な役割を演じる。クラモト(Kuramonoto)らの(1992)Jpn．J ．Cancer Res.,83:1128-1131には、５'−ＣＧ−３'モチーフを含む特定のパリン ドローム配列の存在が、ナチュラルキラー細胞の活性化およびインターフェロン の産生の誘発において、オリゴヌクレオチドにおける決定的な決定要素であるこ とが開示されている。クリーグ(Krieg)らの(1995)Nature,374:546-549には、最 適なＢ細胞の活性化には、非メチル化ＣpＧジヌクレオチドが２つの５'−プリン と２つの３'−ピリミジンによって隣接されているＤＮＡモチーフが必要である ことが開示されている。 疾患および遺伝病に対する特別の治療法の必要性が依然として存在し、標的遺 伝子の発現レベルを調節しうるアンチセンス治療薬の使用において高レベルの特 異性が提供されるゆえに、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによって誘発 される免疫刺激応答を低減する必要がある。 発明の要約 本発明者らは、たとえば、オリゴヌクレオチドに非ホスホロチオエート結合を 導入すること、オリゴヌクレオチドにおけるインターヌクレオチド結合による置 換率を変更すること、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの糖質骨格上のリ ボヌクレオチドを幾つかのデオキシリボヌクレオチドに置換すること、およびホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドから免疫原性ヌクレオチドを除去すること によってオリゴヌクレオチド内の配列または構造を変更することによって、ホス ホロチオエートオリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方法を見出した。 本発明にしたがって、これらのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド内の配列 または構造の変更は、“免疫刺激応答を低減する修飾”と定義される。 ひとつの態様において、本発明は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの 少なくともひとつの化学構造を修飾して免疫刺激応答を低減したホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドを製造し；免疫刺激応答を低減したホスホロチオエート オリゴヌクレオチドを含有する治療用製剤を哺乳動物に投与し；次いで、該哺乳 動物の免疫応答をモニターするステップを特徴とする、ホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドに対する哺乳動物の免疫刺激応答を低減する方法を提供する。 図面の簡単な説明 本発明の種々の特徴は、添付した図面および以下の記載を参照することによっ て、より完全に理解することができる。 図１は、インビトロでのマウス脾臓細胞増殖における、種々のホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドの効果を示す。 図２は、マウス脾臓細胞増殖における、異なる方法で修飾された１型ＨＩＶの gagオリゴヌクレオチドの効果を示す。 図３は、マウス脾臓細胞増殖における、異なる方法で修飾された１型ＨＩＶの revオリゴヌクレオチドの効果を示す。 図４Ａは、マウス脾臓細胞によるＩｇＧの産生における、異なる方法で修飾さ れた１型ＨＩＶのgagオリゴヌクレオチドの効果を示す。 図４Ｂは、マウス脾臓細胞によるＩｇＭの産生における、異なる方法で修飾さ れた１型ＨＩＶのgagオリゴヌクレオチドの効果を示す。 図５Ａは、マウスのＩｇＧの産生における、異なる方法で修飾された１型ＨＩ Ｖのrevオリゴヌクレオチドの効果を示す。 図５Ｂは、マウスのＩｇＭの産生における、異なる方法で修飾された１型ＨＩ Ｖのrevオリゴヌクレオチドの効果を示す。好ましい態様の詳細な説明 本明細書において言及する特許および科学文献は、当業者に利用できる知見を 確立するものである。本明細書中に引用する発行された米国特許および許された 出願は、参照のため本明細書中に引用する。 本発明の方法に従い、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにより引き起こ される免疫刺激応答は、該オリゴヌクレオチドの配列または構造中に免疫刺激応 答を低減する修飾を導入することにより修飾される。本発明の方法の第一の段階 において、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド中の少なくとも一つの化学構 造を修飾して免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを生成す る。本発明の第二の第二において、免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴ ヌクレオチドを含有する治療剤を哺乳動物に投与する。本発明の方法の第三の段 階において、哺乳動物の免疫応答をモニターする。 本発明によれば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは標的遺伝子の領域 に相補的であり、該標的遺伝子の発現を調節するのに用いる。ホスホロチオエー トオリゴヌクレオチドは非修飾形では免疫刺激応答を引き起こす。当業者であれ ば、下記実施例２〜５に示す方法を用い、あるいは他の公知の方法を用いてホス ホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激応答を引き起こすか否かを決定す ることができる。たとえば、上記マッキンタイヤら、上記メッシーナら、上記ピ セツキーら、上記クラモトらまたは上記クリーグらの方法のいずれかを用いてホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激応答を引き起こすか否かを決定 することができる。さらに、たとえば上記クラモトらまたは上記クリーグらによ って同定された免疫刺激配列はホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの配列を 調べることにより同定できる。 免疫刺激応答を引き起こすホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであればい かなるものでも本発明の方法に従って修飾することができる。 本明細書において「ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド」は、約５から約 ５０まで、好ましくは約１５から約３０までのデオキシリボヌクレオシドおよび ／またはリボヌクレオシドモノマーが少なくとも一つ、好ましくは一を越える５ '→３'ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により連結された化学的に 合成されたポリマーを含む。 オリゴヌクレオチドの標的遺伝子発現調節活性が保持される限り、ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドの配列または構造中にあらゆる免疫刺激応答低減修 飾を本発明の方法に従って導入することができる。本発明の目的のためには、遺 伝子調節活性は、標的遺伝子内のＤＮＡ配列に対するホスホロチオエートオリゴ ヌクレオチドの相補性により、標的遺伝子から翻訳されたＲＮＡ配列に対するホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドの相補性により生じる。「相補性」なる語 は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは免疫刺激応答低減ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドが、たとえばワトソン−クリック塩基対形成により （オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸との相互作用）またはフーグスチン塩基対形 成により（オリゴヌクレオチドと二本鎖核酸との相互作用）または他の何らかの 手段により生理条件下で標的核酸配列に結合することを意味し、ＲＮＡに結合す るオリゴヌクレオチドの場合にはシュードノット（pseudoknot）形成を引き起こ すことを含む。生理条件下でのワトソン−クリックまたはフーグスチン塩基対形 成による結合は、実際問題として核酸配列の機能に対する干渉を観察することに より測定される。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと対応する免疫原性低 減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとが標的核酸に対して同じ親和性で結 合することは必要ではない。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの遺伝子調節活性は、免疫刺激応答低 減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが該オリゴヌクレオチドによりターゲ ティングされる遺伝子の活性をいかなる程度であれ変化させることができるとき に本発明に従って保持される。好ましくは、免疫刺激応答低減ホスホロチオエー トオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子がその定常状態疾患発現レベルの約１０〜 ９０％のレベルで発現されるときに該標的遺伝子の活性を調節することができる 。さらに好ましくは、免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド は、標的遺伝子がその定常状態疾患発現レベルの約５０％未満のレベルで発現さ れるときに該標的遺伝子の活性を調節することができる。最も好ましくは、免疫 刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子が検出しう るほどに発現されないときに該標的遺伝子の活性を調節することができる。標的 遺伝子の定常状態疾患発現レベルの測定は、公知の方法を用い、たとえば感染し た（affected）哺乳動物または感染した哺乳動物からの細胞もしくは流体中で標 的遺伝子によりコードされたタンパク質の量を測定することにより行うことがで きる。標的遺伝子が哺乳動物に感染した病原生物のゲノム上に存在する場合には 、標的遺伝子の定常状態疾患発現レベルは該感染哺乳動物により保持された病原 生物の量を測定することにより、または該哺乳動物内の病原生物の量と相関関係 を有する感染哺乳動物の兆候を測定することにより決定することができる。 本発明の方法によれば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを修飾して、 修飾した３'末端構造を有する免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌク レオチド、修飾した５'末端構造を有する免疫刺激応答低減ホスホロチオエート オリゴヌクレオチド、または修飾した３'末端構造および５'末端構造の両者を有 する免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを生成することが できる。本発明の方法によれば、修飾した３'末端構造は、オリゴヌクレオチド の３'末端の６つの残基内の少なくとも一つのホスホロチオエートヌクレオチド 残基の化学修飾を含む。化学修飾はホスホロチオエートヌクレオチド残基上のい かなる部位であってもよい。同様に、修飾した５'末端構造は、オリゴヌクレオ チドの５'末端の６つの残基内の少なくとも一つのホスホロチオエートヌクレオ チド残基の化学修飾を含む。化学修飾はホスホロチオエートヌクレオチド残基上 のいかなる部位であってもよい。 本発明の範囲内の免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは 、技術分野で認識された方法により調製することができる。たとえば、ホスホル アミダイト、Ｈ−ホスホネート化学、またはメチルホスホルアミダイト化学など の 技術分野で認識された方法（たとえば、グッドチャイルド（Ｇoodchild）（１９ ９０）Ｂioconjugate Ｃhem.２：１６５〜１８７；ウールマン（Ｕhlmann）ら（ １９９０）Ｃhem.Ｒev.９０：５４３〜５８４；カルサーズ（Ｃaruthers）ら（ １９８７）Ｍeth.Ｅnzymol.１５４：２８７〜３１３；米国特許第５,１４９,７ ９８号を参照）を用いてヌクレオチドを共有結合させることができ、これらは手 動または自動合成機により行うことができる（アグラワルら（１９９２）Ｔrend s Ｂiotechnol.１０：１５２〜１５８）において概説されている）。 本発明の方法に用いる免疫刺激応答低減ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチ ドはまた、標的核酸へハイブリダイズする能力を損なうことなく多くの仕方で修 飾することができる。たとえば、一つのヌクレオチドの５'末端と他のヌクレオ チドの３'末端との間のホスホジエステルインターヌクレオチド結合以外の結合 をオリゴヌクレオチドが含んでいてよく、その際、５'ヌクレオチドリン酸はホ スホロチオエートなどのいくつかの数の化学基で置換されている。ホスホロチオ エート結合を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト（たとえば、ア グラワルら（１９８８）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）８５：７０７９〜 ７０８３を参照）やＨ−ホスホネート（たとえば、フレーラー（Ｆroehler）（ １９８６）Ｔetrahedron Ｌett.２７：５５７５″５５７８を参照）化学などの 当該技術分野でよく知られた方法を用いて調製することができる。バーゴット（ Ｂergot）らにより記載された合成方法（Ｊ.Ｃhromatog.（１９９２）５５９： ３５〜４２）を用いることもできる。他の免疫刺激応答低減修飾化学基の例とし ては、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエ ート、ホスホルアミデート、２'−Ｏ−メチル、カルバメート、アセトアミデー ト、カルボキシメチルエステル、カーボネート、およびリン酸トリエステルが挙 げられる。免疫刺激応答低減修飾インターヌクレオチド結合を有するオリゴヌク レオチドは、公知の方法に従って調製することができる（たとえば、上記グッド チャイルド（１９９０）；上記アグラワルら（１９８８）；上記ウールマンら； および上記アグラワルら（１９９２））。 他の免疫刺激応答低減修飾としては、たとえばコレステリルや２つのアミノ基 の間に種々の数の炭素残基を有するジアミン化合物のインターヌクレオシドリン 酸結合での該分子への付加、および開裂させ、または反対鎖または結合酵素もし くはゲノムに結合する他のタンパク質に架橋させる末端リボース、デオキシリボ ースおよびリン酸修飾が挙げられる。本発明の範囲に包含されるそのような免疫 刺激応答低減修飾オリゴヌクレオチドの例としては、リボースの代わりのアラビ ノースなどの修飾塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチド、または３ '位および５'位の一方または両方でヒドロキシルまたはリン酸基以外の化学基（ その３'位または５'位にて）結合した糖を有する３',５'−置換オリゴヌクレオ チドが挙げられる。他のそのような修飾は、その３'末端および／または５'末端 にてヌクレアーゼ耐性を付与する嵩ばった置換基を有するかまたはヌクレオチド 当たり一つまたは両方の非架橋性酸素に置換基を有するキャッピングされたオリ ゴヌクレオチドを生成し、これら修飾はすべて本発明による免疫刺激応答低減ホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドを生成することができる。そのような修飾 はオリゴヌクレオチドのいずれかまたは両方の末端でインターヌクレオシド結合 のいずれかまたはすべてでなされてよい（上記アグラワルら（１９９２）におい て概説されている）。 免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、本発明の病原感 染の治療法、癌などの遺伝子成分を有する疾患の治療法、遺伝された状態の治療 法などに用いる。免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、 本発明に従って生理学的および／または薬理学的に許容しうる担体と組み合わせ て治療製剤の一部として用いる。担体の特性は投与経路に依存するであろう。そ のような製剤は、免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよ び担体に加えて、希釈剤、充填剤、塩類、緩衝液、安定化剤、可溶化剤、および 当該技術分野でよく知られた他の物質を含んでいてよい。本発明の治療製剤はま た、免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの活性を促進する ある種の他の活性因子および／または薬剤を含んでいてよい。たとえば、それぞ れ病原ゲノムの異なる領域または過剰発現される標的遺伝子の異なる領域に向け られた免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの組み合わせを 本発明に従って治療製剤中に用いることができる。免疫刺激応答低減ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドは、本発明による治療製剤中で他の合成オリゴヌク レオチドと組み合わせることができる。治療製剤はまた、感染した哺乳動物の疾 患または状態の治療のための他の化学療法剤をさらに含んでいてよい。そのよう な付加的な因子および／または薬剤は、本発明の方法に従って治療製剤中に含め ることにより、免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとの相 乗作用を生み出したり、または免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌク レオチドにより引き起こされる副作用を最小にすることができる。逆に、感染し た哺乳動物の疾患または状態を治療するために用いる特定の因子および／または 薬剤の製剤中に免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含め ることにより、該因子の副作用を最小にすることができる。 本発明の方法において用いる治療製剤は、他の薬理学的に許容しうる担体に加 えて本発明の免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを脂質な どの両親媒性薬剤とともに配合したリポソームの形態であってよく、該脂質など の両親媒性薬剤は水溶液中にミセル、不溶性の単層、液晶、またはラメラ層とし て凝集形態で存在する。リポソーム製剤のために適した脂質としては、これらに 限られるものではないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾ レシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。かかるリポソーム製 剤の調製は、たとえば、米国特許第４,２３５,８７１号；米国特許第４,５０１, ７２８号；米国特許第４,８３７,０２８号；および米国特許第４,７３７,３２３ 号に開示されているように、当業者の範囲内である。本発明の方法に用いる治療 製剤はまた、オリゴヌクレオチドの細胞中への送達を促進するリポフェクチンや シクロデキストリン［ザオ（Ｚhao）ら（１９９５）Ａntisense Ｒes.Ｄev.（印 刷中）］または遅放性ポリマーなどの他の脂質担体をさらに含んでいてよい。 本明細書において「治療学的有効量」とは、意味のある患者の利益、すなわち 治療しようとする急性または慢性の疾患または状態に付随する兆候の低減を示す に充分な治療製剤または方法の各活性成分の合計量を意味する。単独で投与した 個々の活性成分についていう場合は、この語は該成分のみをさす。組み合わせた ものについていう場合は、この語は、活性成分を組み合わせて、順番に、または 一度に投与したかにかかわらず、治療学的効果となる活性成分の合計量をいう。 本発明の方法を行うに際しては、１またはそれ以上の本発明の免疫刺激応答低 減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの治療学的有効量を、治療しようとす る疾患または状態を患う患者に投与する。本発明の免疫刺激応答低減ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドは、本発明の方法に従い、単独か、または治療しよ うとする疾患または状態の他の公知の治療剤と組み合わせて投与することができ る。１またはそれ以上の他の療法剤とともに投与する場合には、本発明の免疫刺 激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは他の治療剤と同時かまたは 順番に投与することができる。順番に投与する場合には、担当医師は他の治療剤 と組み合わせて本発明の免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドを投与する適当な順番を決定するであろう。 所定の病原ゲノムまたは標的遺伝子内の保存された異なる部位をターゲティン グする異なる免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの混合物 を用いることがしばしば望ましい。そのような免疫刺激応答低減ホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドの混合物は、単一の治療製剤中に少なくとも一つ、好ま しくは２またはそれ以上の免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオ チドを含む治療製剤の形態（すなわち、少なくとも２つの免疫刺激応答低減ホス ホロチオエートオリゴヌクレオチドの物理的混合物からなる組成物）であってよ い。これら免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、同じか または異なる配列を有していてよい。少なくとも一つ、好ましくは２またはそれ 以上の免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、別々の治療 製剤の形態にて単一の治療エピソードとして同時にまたは順番に投与する。 本発明の方法による免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド の投与は、経口摂取、吸入、または経皮、皮下、筋肉内、もしくは静脈内注射な どの種々の通常の経路で行うことができる。 本発明の免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの治療学的 有効量を経口投与する場合には、免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドは、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤またはエリキシル剤の形態であろ う。錠剤の形態で投与する場合には、本発明の治療製剤はさらにゼラチンなどの 固形担体やアジュバントを含有していてよい。錠剤、カプセル剤および散剤は、 約５〜９５％の免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含み 、好ましくは約２５〜９０％の免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌク レオチドを含む。液体の形態で投与する場合には、液体担体、たとえば、水、石 油エーテル、動物または植物由来の油、たとえばピーナッツ油、鉱油、ダイズ油 、ゴマ油、または免疫刺激応答低減ホスホロチオエート油を加えることができる 。液体形態の治療製剤はさらに、生理食塩水、デキストロースその他の糖溶液、 またはグリコール、たとえばエチレングリコール、プロピレングリコールまたは ポリエチレングリコールを含んでいてよい。液体形態で投与する場合には、治療 製剤は約０.５〜９０重量％の免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌク レオチド、好ましくは約１〜５０重量％の免疫刺激応答低減ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドを含む。 本発明の方法に用いる免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドの治療学的有効量を静脈内、経皮または皮下注射により投与する場合には、免 疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは発熱物質不含の非経口 的に許容しうる水溶液の形態にあるであろう。ｐＨ、等張性、安定性などに妥当 な注意を払ったそのような非経口的に許容しうる溶液の調製は当該技術の範囲内 である。静脈内、経皮または皮下注射のための好ましい治療製剤は、免疫刺激応 答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに加えて等張ビヒクル、たとえば 塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロー スおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液、または当該技術分野で知 られた他のビヒクルを含有していなければならない。本発明の方法に用いる治療 製剤はまた、安定化剤、保存剤、緩衝液、酸化防止剤、または当業者に知られた 他の添加剤を含んでいてよい。 本発明の方法に用いる治療製剤中の免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドの量は、治療しようとする状態の性質および重篤度、患者が以前 に受けた治療の性質、および患者の特異体質的応答に依存するであろう。最終的 には担当医師が、個々の患者を治療するに必要な免疫刺激応答低減ホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドの量および処置の期間を決定するであろう。最初は担 当医師は低投与量の免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを 投与し、患者の応答を観察するであろう。最適の治療効果が患者で得られるまで 投与する免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの投与量を大 きくしていき、その時点で投与量をそれ以上は増加させない。 下記実施例は本発明を製造および実施する好ましい態様を説明するものである が、同様の結果を得るために別の方法を用いることができるので本発明の範囲を 制限するものではない。 実施例１ オリゴヌクレオチドの調製 配列番号：１、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：８、配列番号：９お よび配列番号：１０のオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートをβ−シ アノエチルホスホルアミダイト法を用いて１０μＭスケールで自動化ＤＮＡ合成 機（モデル８７００、バイオサーチ（Ｂiosearch）、ベッドフォード(Ｂedford) 、マサチューセッツ）を用いて合成した。ホスホロチオエート結合を製造するた めに、中間リン酸結合の酸化を３Ｈ、１,２−ベンゾジチオール−３Ｈ−オン− １,１−ジオキシドを用いて各々カップリングの後に得た（ボーケージ(Ｂeaucag e)、プロトコールズ・フォー・オリゴヌクレオチズ・アンド・アナログズ：シン セシス・アンド・プロパティーズ（Ｐrotocols for Ｏligonuceotides and Ａna logs：Ｓynthesis and Ｐroperties）、アグラワル（編）、ヒューマナ・プレス （Ｈumana Ｐress）、トトワ（Ｔotowa）、ニュージャージー、３３−６２頁、 １９９３）。ホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合を、ホスホジエス テル結合を製造し、各々のカップリングを標準ヨウ素試薬を用いて行った後得た 中間リン酸結合の酸化という点を除いて上記と同様のプロトコールを用いて合成 した（例えば、プロトコールズ・フォー・オリゴヌクレオチズ・アンド・アナロ グズ：シンセイシス・アンド・プロパティーズ、アグラワル（編）、ヒューマナ ・プレス、トトワ、ニュージャージー、１９９３参照）。配列番号：１のオリゴ ヌクレオチドはＨＩＶのｇａｇ領域に相補的であるホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドである。配列番号：４のオリゴヌクレオチドの１〜２５残基は、配列 番号：１のｇａｇ領域の同じ位置に相補的であり、ついで配列番号：４の２２〜 ３３残基は該オリゴヌクレオチドの３'−末端でステムループを形成する。配列 番号：５のオリゴヌクレオチドは、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方で脾臓 市あぼうの増殖を刺激すると知られているＨＩＶ−1のｒｅｖ領域に相補的なホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドである（ブランダ（Ｂranda）ら、(１９９ ３)、Ｂiochem．Ｐharmacol．４５：２０３７−２０４３）。配列番号：８のオ リゴヌクレオチドは、細胞増殖に全く効果を及ぼさないと知られるヒトｐ５３に 相補的 なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。配列番号：９はおよび配列番 号：１０はインターフェロンの産生およびナチュラルキラー細胞活性を誘発する と知られる回文的な配列を含む６マーおよび１０マー除いてホスホロチオエート オリゴヌクレオチドである（クラモト（Ｋuramoto）ら、上記）。 配列番号：２および配列番号：６のキメラオリゴヌクレオチドの合成は上記と 同様の手段を用いて１０μＭのスケールで行った。メチルホスホネート結合を含 むキメラオリゴヌクレオチドの部分をヌクレオシドメチルホスホルアミダイト（ グレン・リサーチ（Ｇlen Ｒesearch）、スターリング（Ｓterling）、バージニ ア）を用いて収集した後、テトラヒドロフラン／２,６−ルチジン／水、７５： ２５：０.２５中の０.１Ｍのヨウ素で酸化した。ホスホロチオエート結合を含む キメラオリゴヌクレオチドを上記の該オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオ エートのためと同様の方法を用いて収集した。キメラオリゴヌクレオチドの脱保 護は２段階で行った。第１に、ＣＰＧ−結合したキメラオリゴヌクレオチドを室 温で１時間濃縮アンモニウムヒドロキシドで処理し、上清を除去し、ついで蒸発 させて白みがかった黄色の残渣を得た。ついでその乾燥した残渣をエチレンジア ミン：エタノール（１：１１、ｖ／ｖ）の混合物で６時間処理し、ついで減圧下 で再度乾燥させた。配列番号：２および配列番号：６のキメラオリゴヌクレオチ ドはそれぞれ配列番号：１および配列番号：５の配列ど同じ配列および長さを有 し、キメラオリゴヌクレオチドの各末端で４つのメチルホスホネート結合の置換 を有する。 配列番号：３および配列番号：７のハイブリッドオリゴヌクレオチドを上記と 同様の機器を用いて１０μＭのスケールで合成した。２'−Ｏ−メチルリボヌク レオチドを有する部分は２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドβ−シアノエチルホ スホルアミダイトを用いて合成し、ついで３Ｈ、１,２−ベンゾジチオール−３ Ｈ−オン−１,１−ジオキシド（ボーケージ、上記）で酸化した。ホスホロチオ エート結合を含む部分をオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートのため の上記方法と同様の方法によって合成した。配列番号：１と配列および長さとも 一致する配列番号：３のハイブリッドオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレ オチドの各末端で４つの２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド置換を有する。同様 に、配列番号：５の配列および長さとも一致するハイブリッドオリゴヌクレオチ ドは、そのオリゴヌクレオチドの各末端で４つの２'−Ｏ−メチルリボヌクレオ チド置換を有する。 すべてのオリゴヌクレオチドの脱保護（キメラオリゴヌクレオチドを除く）お よび精製は、パドマプリヤ（Ｐadmapriya）ら（１９９４）Ａntisense Ｒes．Ｄ ev．４：１８５−１９９中で記載される方法によって行った。そのオリゴヌクレ オチドの純度を７Ｍ尿素を含む２０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動上で確 認し、そのオリゴヌクレオチドには必要とされる長さの９０％より多くが含まれ ていた。 実施例２ 脾臓細胞増殖アッセイ イン・ビトロ研究：脾臓をオスＣＤ１マウス（４−５週齢、２０−２２ｇ、チ ャールズ・リバー（Ｃharles Ｒiver）、ウィルミントン（Ｗilmington）マサチ ューセッツ）から摘出した。単一の細胞懸濁液をガラススライドのつや消しされ た一端で静かに細かくすることによって調製した。ついで、細胞をＲＰＭＩ完全 培地［１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０μＭ ２−メルカプトエタノール（ ２−ＭＥ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン 、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補ったＲＰＭＩ］中で培養した。その血清をホスホ ロチオエート、キメラおよびハイブリッドオリゴヌクレオチドでの実験には５６ ℃で３０分間、およびホスホジエステル部分を含むオリゴヌクレオチドでの実験 では６５℃で３０分間オリゴヌクレオチドの分解を最少にするために加熱した。 ついでその細胞を９６−ウェル皿に最終濃度１００μｌで１０⁶細胞／ｍｌの密 度でプレーティングした。３つのマイトジェンを細胞増殖のためにコントロール として使用した：コンカナバリンＡ（Ｃoncanavaline Ａ（Ｃon Ａ））、Ｔ細胞 特異的マイトジェン；ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）、Ｔリンパ球細胞 およびＢリンパ球細胞の両方に特異的であるマイトジェン；およびＢリンパ球細 胞に特異的であウリポポリサッカリド（ＬＰＳ）である。 オリゴヌクレオチドまたはマイトジェンは１０μｌのＴＥバッファー（１０m Ｍ Ｔris−ＨＣl、ｐＨ７.５、１mＭ ＥＤＴＡ）中のため細胞に加えた。ついで 市あぼうは３７℃にセットして培養した。４４時間後、１μＣi ³Ｈ−チミジン （アマシャム（Ａmersham）、アーリントン・ハイツ(Ａrlington Ｈeights)、イ リノイ）を２０μｌのＲＰＭＩ培地中での培養物に加え、その細胞をさらに４時 間パルス標識した。ついでその細胞を自動細胞回収機（スカットロン(Ｓkatron) 、スターリン、バージニア）によって回収し、ついでそのフィルターはシンチレ ーションカンウンターによって計算される。 図１は配列番号：のｒｅｖホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび配列 番号：９および配列番号：１０のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む パリンドロームはマウス脾臓細胞の増殖を非常に刺激したことを示している。配 列番号：１のｇａｇホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはまた、僅かな程度 、リンパ球の刺激を誘発する。配列番号：８のｐ５３ホスホロチオエートオリゴ ヌクレオチドは実験した濃度のいずれでも全く有意に細胞が増殖するのを誘発し なかった。 図２は、配列番号：２のキメラｇａｇホスホロチオエートオリゴヌクレオチド および配列番号：３のハイブリッドｇａｇホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドが実験した濃度のいずれでも有意な細胞増殖を誘発しなかったことを示す。逆 に、配列番号：４のステムループｇａｇホスホロチオエートオリゴヌクレオチド は配列番号：１のオリゴヌクレオチドと類似の細胞増殖レベルを誘発する。同様 に図３は配列番号：６のキメラｒｅｖホスホロチオエートオリゴヌクレオチドお よび配列番号：７のハブリッドｒｅｖホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが 配列番号：５のｒｅｖホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比較して有意に 細胞増殖が減少していることを示したことを示す。 ホスホジエステル結合の異なる数はまた、配列番号：１のｇａｇホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドの多様な位置に導入されており、およびそのような修 飾は配列番号：１のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比較して細胞増殖 が有意に減少させた。配列番号：１のｇａｇホスホロチオエートオリゴヌクレオ チドはまた、５'−末端または３'−末端のいずれかから切断され、マウス脾臓細 胞のイン・ビトロ増殖のためにアッセイされた。ホスホロチオエートオリゴヌク レオチドの長さが５'−末端から減少した場合、細胞刺激は長さ依存性であった ：短いオリゴヌクレオチドは、少量の刺激を産生した。驚くべきことに、オリゴ ヌクレオチドの長さは３'−末端から減少した場合、オリゴヌクレオチド全体の 長さは配列番号：１の２５マーｇａｇホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと して細胞増殖のほとんど同様のレベルを示し、このことは、そのオリゴヌクレオ チドによるマウス脾臓細胞の刺激は長さ依存性ではなく、むしろ配列または構造 依存性であることを示唆している。 実施例３ Ｔ細胞の枯渇 脾臓をＣＤ１マウスから摘出し、単一細胞懸濁液を調製し、ついで１ｍｌの容 量中に１０⁷細胞／ｍｌの密度でＲＰＭＩ完全培地中で再懸濁した。細胞をＴ細 胞特異的な、ラット抗−マウスＴhy １.２（１：１００）（ギブコ（Ｇibco Ｂ ＲＬ）、ゲイザーズバーグ、メリーランド）モノクローナル抗体で４℃で３０分 間インキュベートした。ついでその細胞を洗浄し、ＲＰＭｉ培地中で再懸濁し、 Ｌow−Ｔox−Ｍ ウサギ補体（１：１００９（セダーレーン（Ｃederlane）、オ ンタイロン、カナダ）で３７℃で３０分間インキュベートした。破壊されたＴ細 胞を除去するため、リンパ球細胞Ｍ（セダーレーン、オンタリオ、カナダ）を通 して完全に洗浄し、ついでＲＰＭＩ完全培地中で再懸濁し、ついで細胞増殖実験 を上記のようにして行った。 配列番号：１のｇａｇホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＴ細胞の不在 下および存在下の両方において細胞増殖を誘発し、このことは、観察された刺激 がＴ細胞から独立であることを示唆している。 実施例４ 抗体産生アッセイ イン・ビトロ実験：マウス脾臓細胞（１０⁶細胞／ｍｌ）を１ｍｌの培養液中 で９日間オリゴヌクレオチドを加えてか、または培地単独にて培養した。ついで 細胞培養上清を回収し、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いてＩｇＧおよびＩｇ Ｍレベルに関してアッセイした。簡単には、ＥＬＩＳＡ皿（９６ウエル）を０. ０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ９.６）を補ったリン酸バッファー中で４℃で一 夜希釈したヤギ抗−マウス ＩgＧまたはＩgＭ（５μｇ／ｍｌ）でコートし、Ｐ ＢＳ−Ｔバッファー（０.０５％Ｔween ２０および０.２５％ＢＳＡを補ったリ ン酸緩衝食塩水）で３回洗浄し、ついで細胞培養上清で３７℃で２時間インキュ ベートした。標準マウスＩgＧおよびＩgＭ（１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ−Ｔで希釈 して０から８００ｎｇ／ｍｌの標準曲線を得た。次いでそのプレートをＰＢＳ− Ｔバッファーで３回洗浄し、ついでＰＢＳ−Ｔバッファーで１：１０００に希釈 したアリカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗−マウスＩｇＧでイン キュベートしさらに２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔバッファーで３回洗 浄した後、ジエタノールアミン（７５μｌ）中のホスファターゼ基質（ｐ−ニト ロフェニルホスフェート１ｍｇ／ｍｌ）を室温で１時間維持したプレートに加え た。その比色反応を０.５Ｍの水酸化ナトリウムの２５μｌを添加することによ り停止させた。吸光度（２０５ｎｍ）をリーダー、セレス９００ＨＤＩ（Ｃeres ９００ ＨＤＩ）（バイオ・テク・インストルメンツ、インク（Ｂio-Ｔek Ｉns truments，Ｉnc.）を用いて測定した。ＩｇＧおよびＩｇＭレベルを標準曲線に 基づき計算した。実験は４回行った 図４Ａおよび４Ｂは抗体の産生が配列番号：１のｇａｇホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドによって誘発され、配列番号：４のステムループｇａｇホスホ ロチオエートオリゴヌクレオチドが用量依存方的に誘発されることを示している 。図４Ａおよび４Ｂは、また、配列番号：２のキメラｇａｇホスホロチオエート オリゴヌクレオチドおよび配列番号：３のハイブリッドｇａｇホスホロチオエー トオリゴヌクレオチドによって抗体産生の刺激が有意に低下したことを示してい る。 イン・ビボ実験：オスＣＤ１マウス(４−５週齢、チャールズ・リバー、ウィ ルミントン、マサチューセッツ)を本実験に使用した。その動物を市販の食餌を 与え、任意に水を与え、マサチューセッツメディカルセンター大学(Ｕniversity of Ｍassachusetts Ｍedical Ｃenter)（マサチューセッツ、ウースター）の動 物施設に飼育した。その動物に０.２５ｍｌのＰＢＳ中１ｍｇのオリゴヌクレオ チドを腹腔内注射した。各オリゴヌクレオチドに３匹の動物を使用した。マウス は４８時間後、屠殺され、脾臓を摘出し、単一細胞懸濁細胞培養駅を調製し、１ ０⁶細胞／ｍｌの密度で培養を開始した。培養後、２４時間で、上清を回収し、 上記のとおりにＩｇＧおよびＩｇＭに関してアッセイした。実験は３回行った。 配列番号：１のｇａｇホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび配列番号 ：４のステムループ状または自己ハイブリダイズしたｇａｇホスホロチオエート オリゴヌクレオチドはビヒクル（ＰＢＳ）単独で注射されたマウスに比較して脾 臓の大きさにおいて約１５％誘発し、一方、配列番号：５のｒｅｖホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドで処理した動物の脾臓腹約２倍の大きさ（１００％の 増加）となった。逆に、配列番号：２および配列番号：６のキメラホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドおよび配列番号：３および配列番号：７のハイブリッ ドホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは脾臓の重量において全く有意な増加 を誘発しなかった。脾臓細胞が免疫グロブリン産生に関して測定される場合、配 列番号：５（図５Ａおよび５Ｂ）のｒｅｖホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドを注射したマウスからのＩｇＧおよびＩｇＭの両方の産生において有意な増加 が見られた。配列番号：６のキメラｒｅｖホスホロチオエートオリゴヌクレオチ ドおよび配列番号：７のハイブリッドｒｅｖホスホロチオエートオリゴヌクレオ チドは、配列番号：５のｒｅｖホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで観察さ れた抗体誘発効果を有意に最少限とした。 実施例５ 細胞サイクル分析 細胞サイクルを分析するために、細胞を４時間培養し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝 液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％ナトリウムアジドを加え たハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）：１倍）で洗浄した。細胞を７０％冷アル コールで固定し、次いで、氷上に３０分間置いた。固定後、細胞を２００μｌの ＰＢＳに再懸濁し、５０μｌのＲＮアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ、ＤＮアーゼフリー ）で３７℃にて３０分間処理した。フローサイトメトリー分析を行う前にヨウ化 プ ロピジウム（５０ｎｇ／ｍｌ）を細胞に加えた。１０,０００個の可視細胞のフ ローサイトメトリーデータをエピックス（Epics）ＸＬフローサイトメーター（ クールター、ハイアレー、フロリダ）によりヒストグラムとして得、生存してい る細胞を前散乱対側方散乱によってゲートオンし、重なりを排除した後、該デー タをエピックスＸＬ、バージョン１.５ソフトウェアおよびマルチサイクルソフ トウェア（フェニックス・フロー・システムズ、サンディエゴ、カリフォルニア ）で分析した。実験は３回行った。 細胞サイクル分析の結果を以下の表１および表２に示す。表中の結果は、細胞 ％±４回実験の標準偏差で示している。 細胞サイクルの実験から、ヨウ化プロピジウムにより脾臓細胞を染色固定した 後、配列番号１のgagホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび配列番号４ の幹ループgagホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで処置したマウスからの Ｓ／Ｇ２相中の細胞パーセントが、非処置マウスと比べて約１３％増加したこと が示される。配列番号５のrevホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、細胞 サイクルのＳ／Ｇ２相における細胞パーセントにおいて、ビヒクル単独処置のも のと比べて約３０％の増加を誘発した。配列番号２および配列番号６のキメラホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび配列番号３および配列番号７のハイ ブリッドホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、インビトロでの知見を確認 するように、細胞サイクルにおいて有意な増加を示さなかった。 当業者は本明細書に記載の発明を特定の態様に対する多くの等価物を認識する か、ごく普通の実験方法を用いるだけで確認することができるであろう。そのよ うな等価物も以下の特許請求の範囲に包含されるように意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ザオ，キヤン アメリカ合衆国01604マサチューセッツ州 ウースター、フランク・ストリート67番 アパートメント160

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ．ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド中の少なくとも１つ化学構造を 修飾して免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを製造し： ｂ．免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む治療製剤を 投与し；ついで ｃ．該哺乳動物の免疫応答をモニターする ことを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに対する哺乳動物の免疫刺激 応答を低減させる方法。 ２．該免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが修飾した３' −末端構造を有する請求項１に記載の方法。 ３．該修飾した３'−末端構造が、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのホ スホロチオエートインターヌクレオチド結合のための少なくとも１つのメチルホ スホネートインターヌクレオチド結合の置換を含む請求項２に記載の方法。 ４．該修飾した３'−末端構造が少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドの ための少なくとも１つのリボヌクレオチドの置換を含む請求項２に記載の方法。 ５．該修飾した３'−末端構造が、免疫刺激応答を誘発する配列を中断させるた めの少なくとも１つのインターヌクレオチド結合の置換を含む請求項２に記載の 方法。 ６．該免疫刺激応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが修飾した５' −末端構造を有する請求項１に記載の方法。 ７．該修飾した５'−末端構造が該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのホス ホロチオエートインターヌクレオチド結合のための少なくとも１つのメチルホス ホネートインターヌクレオチド結合の置換を含む請求項６に記載の方法。 ８．該修飾した５'−末端構造が少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドの ための少なくとも１つのリボヌクレオチドの置換を含む請求項６に記載の方法。 ９．該修飾した５'−末端構造が、免疫刺激応答を誘発するヌクレオチド配列を 中断させるための他の異なるヌクレオチドのたの少なくとも１つのヌクレオチド の置換を含む請求項６に記載の方法。 １０．該免疫応答低減ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、修飾した３' −末端構造および修飾した５'−末端構造を有する請求項１に記載の方法。 １１．該修飾した３'−末端構造が該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのホ スホロチオエートインターヌクレオチド結合のための少なくとも１つのメチルホ スホネートインターヌクレオチド結合の置換を含む請求項１０に記載の方法。 １２．該修飾した３'−末端構造が少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド のための少なくとも１つのリボヌクレオチドの置換を含む請求項１０に記載の方 法。 １３．該修飾した３'−末端構造が、免疫刺激応答を誘発するヌクレオチド配列 を中断させるための他の異なるヌクレオチドのための少なくとも１つのヌクレオ チドの置換を含む請求項１０に記載の方法。 １４．該修飾した５'−末端構造が、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合のための少なくとも１つのメチル ホスホネートインターヌクレオチド結合の置換を含む請求項１０に記載の方法。 １５．該修飾した５'−末端構造が少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド のための少なくとも１つのリボヌクレオチドの置換を含む請求項１０に記載の方 法。 １６．該修飾した５'−末端構造が、免疫刺激応答を誘発するヌクレオチド配列 を中断させるための他の異なるヌクレオチドのための少なくとも１つのヌクレオ チドの置換を含む請求項１０に記載の方法。 １７．該修飾した３'−末端構造が、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合のための少なくとも１つのメチル ホスホネートインターヌクレオチド結合の置換を含み、および該修飾した５'− 末端構造が、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのホスホロチオエートイン ターヌクレオチド結合のための少なくとも１つのメチルホスホネートインターヌ クレオチド結合の置換を含む請求項１０に記載の方法。 １８．該修飾した３'−末端構造が、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチ ドのための少なくとも１つのリボヌクレオチドの置換を含み、および該修飾した ５'−末端構造が少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドのための少なくと も１つのリボヌクレオチドの置換を含む請求項１０に記載の方法。 １９．該修飾した３'−末端構造が、免疫刺激応答を誘発するヌクレオチド配列 を中断させるための１つのヌクレオチドの置換を含み、および、該修飾した５' −末端構造が免疫刺激応答を誘発するヌクレオチド配列を中断させるための１つ のヌクレオチドの置換を含む方法。