JPH11512601A

JPH11512601A - 修飾プロテインキナーゼａ特異的オリゴヌクレオチドおよびその使用法

Info

Publication number: JPH11512601A
Application number: JP9512911A
Authority: JP
Inventors: アグラワル，サドヒル
Original assignee: Idera Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Idera Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-19
Publication date: 1999-11-02
Also published as: ATE203271T1; CA2232724A1; EP0846170A1; DE69613984T2; US5969117A; WO1997011171A1; DE69613984D1; AU7241296A; EP0846170B1

Abstract

(57)【要約】プロテインキナーゼＡサブユニットＲＩ_αをコードする核酸に相補的で該核酸の発現をダウンレギュレートしうる合成修飾オリゴヌクレオチドを開示する。該修飾オリゴヌクレオチドは約１５から約３０のヌクレオチドを有し、ハイブリッドオリゴヌクレオチド、インバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチド、またはインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドである。かかるオリゴヌクレオチドを含む治療組成物およびその使用方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】修飾プロテインキナーゼＡ特異的オリゴヌクレオチドおよびその使用法発明の技術分野本発明は、癌療法に関する。さらに詳しくは、本発明は、プロテインキナーゼＡＲＩ_αサブユニットをコードする核酸に相補的な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた癌細胞の増殖の抑制に関する。発明の背景有効な癌療法の開発は生医学的研究の主要な焦点である。特定の解剖学的部位に限られた腫瘍の患者を治療するために外科的方法が開発され使用されている。しかしながら、発表では腫瘍を有する患者のうち約２５％しか、腫瘍が真に限定され、外科的治療のみには委ねることができない［スラパック（Ｓlapak）ら、Ｈarrison's Ｐrinciples of Ｉnternal Ｍedicine（イッセルバッヒャー（Ｉss elbacher）ら編）マックグローヒル、ＮＹ（１９９４）ｐｐ．１８２６−１８５０］。放射線療法も外科的療法と同様に局部的な物理療法であり、癌治療におけるその有用性は腫瘍および該腫瘍に近接する正常組織の内在的な放射線感受性に大きく依存する。しかしながら、放射線療法には急性毒性と長期にわたる後遺症との両者を伴う。さらに、放射線療法は、変異原性、発癌性、および催奇形性を有することが知られている（スラパックら、上掲）。全身的な化学療法単独または外科的療法および／または放射線療法との併用が、現在のところ散在性の悪性腫瘍に利用できる主要な治療法である。しかしながら、酵素経路をブロックしたり細胞の表現型とは無関係にＤＮＡとランダムに相互作用する従来の化学療法剤は、新生物細胞を殺傷する特異性に欠ける。それゆえ、標準的な細胞毒性化学療法では、しばしば全身的な毒性が現れる。さらに最近では、トランスフォームした細胞での複製、転写または翻訳をブロックし、それと同時に細胞が耐性になる能力を打ち負かす治療剤の開発が化学療法への多くのアプローチの目標となっている。一つの戦略は、細胞での新生物表現型に付随する遺伝子の発現をダウンレギュレートすることである。単一の活性化遺伝子を停止させる技術として、遺伝子発現の抑制のためのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびそのアナログの使用がある［ザメクニック（Ｚamecnik）ら（１９７８）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci．（ＵＳＡ）７５：２８０〜２８４］。新生物細胞増殖に関与する遺伝子のみを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドは該遺伝子の発現のみを特異的に妨害し、その結果、癌細胞の増殖が阻止される。かかる遺伝子の発現を特異的に阻止したりダウンレギュレートしうることは、正常な増殖制御の分子的基礎の探求の強力な手段や治療的介入の機会を提供する［たとえば、チョーチュング（Ｃho−Ｃhung）（１９９３）Ｃurr.Ｏpin.Ｔhera.Ｐatents ３：１７３７〜１７５０を参照］。新生物細胞に対して増殖を有利とする遺伝子や癌に原因に関連する他の遺伝子を同定すること、およびその活性化の遺伝子的なメカニズムを解明することは、癌治療へのアンチセンスアプローチを可能とする。そのような一つの遺伝子は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）依存性のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のＲＩ_αサブユニットをコードする［クレブス（Ｋre bs）（１９７２）Ｃurr.Ｔopics Ｃell.Ｒegul.５：９９〜１３３］。プロテインキナーゼはｃＡＭＰにより結合されるが、このことは細胞増殖および分化の制御に役割を有すると考えられている［たとえば、チョーチュング（１９８０）Ｊ．Ｃyclic Ｎucleotide Ｒes．６：１６３〜１６７を参照］。ＰＫＡにはＩ型（ＰＫＡ−Ｉ）とII型（ＰＫＡ−II）との２つの型があり、両者は共通のＣサブユニットを共有するが、それぞれ異なるＲサブユニット、ＲＩおよびＲIIを含む［ビーブ（Ｂeebe）ら、Ｔhe Ｅnzymes：Ｃontrol by Ｐhosphorylation、１７（Ａ）：４３〜１１１（アカデミックプレス、ニューヨーク、１９８６）］。こ８）ＦＥＢＳＬett.２２９：３９１〜３９４；クレッグ（Ｃlegg）ら（１９８８）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．（ＵＳＡ）８５：３７０３〜３７０７］、生化学的特性が異なる［ビーブら、Ｔhe Ｅnzymes：Ｃontrol by Ｐhosphorylation、１７（Ａ）：４３〜１１１（アカデミックプレス、ニューヨーク、１９８６）；キャッド（Ｃadd）ら（１９９０）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６５：１９５０２〜１９５０６］。これらＲサブユニットの２つの一般的なイソ型はまた、細胞下での局在も異なり、ＲＩが細胞質全体に認められるのに対し、ＲＩは核、核小体、ゴルジ装置および微小管形成中心（microtuble−organizing center）に局在する［たとえば、ローマン（Ｌohmann）、Ａdvances in Ｃyclic Ｎucleotide and Ｐrot ein Ｐhosphorylation Ｒesearch、１８：６３〜１１７（ラベン（Ｒaven）、ニューヨーク、１９８４）；およびニッグ（Ｎigg）ら（１９８５）Ｃell ４１：１０３９〜１０５１を参照］。ＲＩ_α発現レベルの増加が、正常な対応細胞に比べてヒト癌細胞株および原発性腫瘍において、Ｋｉ−ｒａｓ癌遺伝子またはトランスフォーミング成長因子α でトランスフォームした後の細胞において、および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはホルボールエステルで細胞増殖を刺激した後に示されている［ローマン、Ａdvances in Ｃyclic Ｎucleotide and Ｐrotei n Ｐhosphorylation Ｒesearch、１８：６３〜１１７（ラベン、ニューヨーク、１９８４）；およびチョーチュング（１９９０）Ｃancer Ｒes.５０：７０９３〜７１００］。逆に、ＲＩ_αの発現レベルの低下が、広スペクトルのヒト癌細胞株において部位選択的なｃＡＭＰアナログにより誘発された増殖抑制と関連付けられている［チョーチュング（１９９０）Ｃancer Ｒes.５０：７０９３〜７１００］。ＲＩ／ＰＫＡ−ＩおよびＲII／ＰＫＡ−IIの発現は、個体発生および細胞分化の際に逆の相関関係を有することも決定されている［ローマン、Ａdvance s in Ｃyclic Ｎucleotide and Ｐrotein Ｐhosphorylation Ｒesearch、１８：６３〜１１７（ラベン、ニューヨーク、１９８４）；チョーチュング（１９９０）Ｃancer Ｒes.５０：７０９３〜７１００］。それゆえ、ＰＫＡのＲＩ_αサブユニットは、その構成的な発現が正常な個体発生プロセスを破壊し、その結果、悪性腫瘍などの病原性の派生物となる個体発生増殖誘発タンパク質であると仮定されている［ネステローバ（Ｎesterova）ら（１９９５）Ｎature Ｍedicine １：５２８〜５３３］。ＲＩ_α遺伝子に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドが調製されている。米国特許第５,２７１,９４１号には、ＲＩ_αの最初の１００個のＮ末端アミノ酸の領域に相補的なホスホジエステル結合アンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されており、これは白血病細胞でのＲＩ_α発現をインビトロで抑制する。さらに、ＲＩ_α遺伝子のＮ末端の８〜１３コドンに対応するアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドがヌードマウスにおいて腫瘍増殖をインビボで低減させることもわかっている［ネステローバら（１９９５）Ｎature Ｍed．１：５２８〜５３３］。残念なことに、ホスホジエステル結合（ＰＯ）オリゴヌクレオチドや幾つかのホスホロチオエート結合（ＰＳ）オリゴヌクレオチドの使用には問題が生じている。血清中のヌクレアーゼがＰＯオリゴヌクレオチドを容易に分解することが知られている。ホスホジエステルインターヌクレオチド結合をホスホロチオエートインターヌクレオチド結合で置換すると、細胞、細胞抽出液、血清、その他のヌクレアーゼ含有溶液中［たとえば、ベーコン（Ｂacon）ら（１９９０）Ｂiochem .Ｂiophys.Ｍeth.２０：２５９］およびインビボで［イバーセン（Ｉversen）（１９９３）Ａntisense Ｒesearch and Ａpplication（クルック（Ｃrooke）編）ＣＲＣプレス、４６１］オリゴヌクレオチドが安定化されることが示されている。しかしながら、幾つかのＰＳオリゴヌクレオチドは免疫刺激応答を示すことがわかっており、これはある場合には望ましくない。たとえば、ガルブレイス（Ｇ albraith）らは［Ａntisense Ｒes.＆Ｄev．（１９９４）４：２０１〜２０６］、幾つかのＰＳオリゴヌクレオチドによる補体活性化を開示している。ヘンリー（Ｈenry）らは［Ｐharm.Ｒes．（１９９４）１１：ＰＰＤＭ８０８２］、幾つかのＰＳオリゴヌクレオチドが血液凝固を強く妨害することを開示している。それゆえ、遺伝子発現抑制能は保持しながら従来のオリゴヌクレオチドに比べて副作用の減った、癌関連遺伝子に向けられた修飾オリゴヌクレオチドに対する必要性が存在する。発明の要約本発明は、遺伝子発現の研究およびアンチセンス療法に有用な修飾オリゴヌクレオチドに関する。本発明は、ＲＩ_α遺伝子の発現をダウンレギュレートしながら副作用が従来のオリゴヌクレオチドに比べて少ない修飾オリゴヌクレオチドを提供する。とりわけ、本発明は、従来のオリゴヌクレオチドに比べて低減した変異原性、低減した補体活性化および低減した抗トロンビン特性を示す修飾オリゴヌクレオチドを提供する。ＲＩ_α核酸の最初の１００個のヌクレオチドに向けられた、ホスホジエステルのみで結合したまたはホスホロチオエートのみで結合したオリゴヌクレオチドが細胞増殖を抑制することが知られている。幾つかのＰＳオリゴヌクレオチドがそれを投与した患者において免疫刺激応答を引き起こし、このことが幾つかの場合において望ましくないこともまた知られている。プロテインキナーゼＡＲＩ_α サブユニット遺伝子に相補的な修飾オリゴヌクレオチドがインビボで腫瘍の増殖を抑制すること、およびこれら修飾オリゴヌクレオチドが少なくともＰＯ−またはＰＳ−結合オリゴヌクレオチドに匹敵する抗ＰＫＡ活性を有するが副作用は少ないこともいまやわかった。これら知見をもとに本発明を完成したのであり、本発明は、その第一の側面において、プロテインキナーゼＡサブユニットＲＩ_α遺伝子発現を副作用を低減させて特異的にダウンレギュレートするための合成ハイブリッドオリゴヌクレオチド、インバーテッド（inverted）ハイブリッドオリゴヌクレオチド、およびインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドおよびそのその組成物を含む。かかる遺伝子発現の抑制は、細胞増殖および腫瘍増殖におけるプロテインキナーゼＡ関連遺伝子の生物学的機能および役割を決定するための変異分析に替わるものとして有用である。かかるＲＩ_α遺伝子発現の抑制はまた、該遺伝子の過剰発現や不適切な発現によって引き起こされる疾患や異常を治療するのにも用いることができる。本明細書において「合成オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも一つ、好ましくは１以上の５'→３'インターヌクレオチド結合により一緒に結合または連結した３から５０まで、好ましくは約１５から約３０まで、最も好ましくは１８のリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドモノマーからなる化学的に合成したポリマーを含む。本発明の目的のためには、「ゲノム領域または該ゲノム領域から転写されたＲＮＡ分子に相補的なオリゴヌクレオチド配列」なる語は、生理的条件下、たとえば、ワトソン−クリック型の塩基対形成（オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸との間の相互作用）により、またはフーグスチーン型の塩基対形成（オリゴヌクレオチドと二本鎖核酸との間の相互作用）により、またはオリゴヌクレオチドがＲＮＡへ結合してシュードノット（pseudoknot）形成を起こす場合を含む他の手段により、該核酸配列に結合するオリゴヌクレオチドを意味する。生理的条件下でのワトソン−クリック型またはフーグスチーン型の塩基対形成による結合は、実際には該核酸配列の機能の妨害を観察することにより測定する。本発明の該側面による一つの態様において、オリゴヌクレオチドは、それぞれ少なくとも４つのリボヌクレオチドを有する５'および３'リボヌクレオチド領域によりフランキングされた少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドの領域を含むコア領域ハイブリッドオリゴヌクレオチドである。配列表の配列番号：４に示す配列を有するハイブリッドオリゴヌクレオチドは一つの特定の態様である。幾つかの態様において、本発明の３'および５'フランキングリボヌクレオチドの各領域は、少なくとも４つの連続した２'−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含む。本発明の目的のためには、「２'−Ｏ−置換」とは、ペントース残基の２'位での１〜６の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基による、または２〜６炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基（その際、かかるアルキル、アリールまたはアリル基は置換されていなくてもよいし、または、たとえばハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルブアルコキシルまたはアミノ基で置換されていてもよい）による、またはヒドロキシ、アミノまたはハロ基による（しかしながら、２'−Ｈ基による置換は含まない）置換を意味する。幾つかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドの３'および５'フランキングリボヌクレオチドの各領域は、少なくとも一つの２'−Ｏ−アルキル置換リボヌクレオチドを含む。一つの好ましい態様において、２'−Ｏ−アルキル置換ヌクレオチドは２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。他の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドの３'および５'フランキングリボヌクレオチド領域は、少なくとも４つの２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む。好ましい態様において、ハイブリッドオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレォチドとはホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により連結されている。特別の態様において、このホスホロチオエート領域は、互いに５'→３'ホスホロチオエート結合により連結した約４から約１８のヌクレオシド、好ましくは約５から約１８のかかるホスホロチオエート結合したヌクレオシドを有する。ホスホロチオエート結合はＲ_PおよびＳ_Pの混合エナンシオマーであるか、またはＲ_PかＳ_Pのいずれかの形態で立体規則的または実質的に立体規則的であってよい（アイアー（Ｉyer）ら（１９９５）Ｔetrahedron Ａsymmetry ６：１０５１〜１０５４を参照）。本発明の該側面による他の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドからなる３'および５'デオキシリボヌクレオチド領域によりフランキングされた少なくとも４つのリボヌクレオチドからなる領域を含むインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドの構造は従来のハイブリッドオリゴヌクレオチドに比べて「逆（inverted）」である。幾つかの態様において、２'−Ｏ−置換ＲＮＡ領域は、互いに５'→３'インターヌクレオシド結合により連結された約４つから約１０の２'−Ｏ−置換ヌクレオシド、最も好ましくは約４つから約６つのかかる２'− Ｏ−置換ヌクレオシドを有する。幾つかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５つの連続したリボヌクレオチドを含むリボヌクレオチド領域を有する。一つの特に好ましい態様において、インバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドの全体のサイズは１８である。好ましい態様において、２' −Ｏ−置換リボヌクレオシドは、互いに５'→３'ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステルまたはホスホジエステル結合により連結している。ホスホロチオエート３'または５'フランキング領域は、互いに５'→３'ホスホロチオエート結合により連結した約１８のヌクレオシド、好ましくは約５から約１８のかかるホスホロチオエート結合ヌクレオシドを有する。好ましい態様において、ホスホロチオエート領域は少なくとも５つのホスホロチオエート結合ヌクレオシドを有するであろう。一つの特別の態様は、実質的に配列表の配列番号：６に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである。本発明の該側面の好ましい態様において、リボヌクレオチド領域は２'−Ｏ−アルキル置換リボヌクレオチドなどの２'−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含む。一つの特に好ましい態様は、そのリボヌクレオチド領域が少なくとも一つの２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含むハイブリッドオリゴヌクレオチドである。幾つかの態様において、インバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドがホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により連結されている。特別の態様において、デオキシリボヌクレオチドフランキング領域は、互いに５'→３'ホスホロチオエート結合により連結した約１８のヌクレオシド、好ましくは約５から約１８のかかるホスホロチオエート結合ヌクレオシドを有する。幾つかの態様において、本発明のハイブリッドオリゴヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチド３'および５'フランキング領域は、約５つのホスホロチオエート結合ヌクレオシドを有する。ホスホロチオエート結合はＲ_PおよびＳ_P の混合エナンシオマーであるか、またはＲ_PかＳ_Pのいずれかの形態で立体規則的または実質的に立体規則的であってよい（アイアーら（１９９５）Ｔetrahedron Ａsymmetry ６：１０５１〜１０５４を参照）。他の態様は、プロテインキナーゼＡサブユニットＲＩ_αの発現を副作用を低減させて抑制するための組成物であり、該組成物は本発明のインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドを含む。本発明の該側面によるさらに他の態様は、１またはそれ以上、好ましくは２つのオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの領域によってフランキングされた少なくとも４つのヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド非イオン性領域を含むインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドである。かかるキメラオリゴヌクレオチドは、従来のキメラオリゴヌクレオチドに比べて「逆」の構造を有する。一つの特別の態様において、本発明のインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドは、実質的に配列表の配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有する。好ましい態様において、オリゴヌクレオチド非イオン性領域は、互いに５'→３'非イオン結合により連結した約４から約１２のヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、非イオン性領域は、アルキルホスホネートおよび／またはホスホルアミデートおよび／またはホスホトリエステルインターヌクレオシド結合を含む。一つの特別の態様において、オリゴヌクレオチド非イオン性領域は６つのヌクレオチドを含む。幾つかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、それぞれ約６から約１０のホスホロチオエート結合ヌクレオシドを有するホスホロチオエート領域によりいずれかの側をフランキングされた、約６つから約８のメチルホスホネート結合したヌクレオシドを有する非イオン性領域を有する。好ましい態様において、フランキング領域はホスホロチオエートヌクレオチドである。幾つかの態様において、フランキング領域は、互いに５'→３'ホスホロチオエート結合により連結した約４つから約２４のヌクレオシドを有し、好ましくは約６つから約１６のかかるホスホロチオエート結合ヌクレオシドを有する。好ましい態様において、ホスホロチオエート領域は約５つから約１５のホスホロチオエート結合ヌクレオシドを有する。ホスホロチオエート結合は、混合Ｒ_pおよびＳ_pエナンシオマーであってよく、またはＲ_pかまたはＳ_pのいずれかの形態での立体規則的なまたは実質的に立体規則的なものであってよい［アイアーら、Ｔetrahedron Ａsymmetr y ６：１０５１〜１０５４（１９９５）を参照］。本発明の側側面の他の態様は、プロテインキナーゼＡサブユニットＲＩ_αの発現を副作用を低減させて抑制するための組成物であり、該組成物は本発明によるインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドを含む。本発明の他の側面は、癌細胞の増殖をインビトロで抑制する方法である。この方法において、本発明のオリゴヌクレオチドを該細胞に投与する。さらに他の側面は、薬理学的に許容しうる担体中に本発明のオリゴヌクレオチドを含む治療組成物である。罹患した患者の癌を低減した副作用で治療する方法は、本発明の他の側面である。この方法は、プロテインキナーゼＡサブユニットＲＩ_α遺伝子が過剰発現している患者に本発明の治療組成物を投与することを含む。当業者であれば、これら好ましい態様の要素を組み合わせうることを認識するであろうし、本発明者は実際、かかる組み合わせを想定している。たとえば、２ ' −Ｏ−置換リボヌクレオチド領域はまた、一つからすべての非イオン性インターヌクレオシド結合を含んでいてよい。別の態様として、非イオン性領域は一つからすべての２'−Ｏ−置換リボヌクレオチドを有していてよい。さらに、本発明によるオリゴヌクレオチドは、一つまたはそれ以上の２'−Ｏ−置換リボヌクレオチド領域と一つまたはそれ以上の非イオン性領域との組み合わせを含んでいてよく、そのいずれかまたは両者はホスホロチオエート領域によりフランキングされていてよい［関連する合成技術についてはＮucleosides ＆Ｎucleotides １４：１０３１〜１０３５（１９９５）を参照］。図面の簡単な説明本発明の上記および他の目的、本発明の種々の特徴、並びに本発明それ自体は、下記の記載を添付の図面とともに読んだときに一層完全に理解される。添付図面において、図１は、種々の対照と比較したときの本発明の修飾オリゴヌクレオチドのマウスにおける腫瘍サイズに対する効果を示すグラフ表示である。好ましい態様の詳細な説明本明細書中に引用する特許および科学的文献は当業者に利用できる知見を確立するものである。本明細書中に引用する発行された米国特許、許された出願および参考文献は参照のため本明細書中に引用される。ハイブリッドオリゴヌクレオチド、インバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチド、およびインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドは以下に記載する通りである。本発明は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のＲＩ_αサブユニットをコードするゲノム領域または該ゲノム領域から転写されたＲＮＡ分子に相補的なヌクレオチド配列を有する、かかる合成ハイブリッドオリゴヌクレオチド、インバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチド、およびインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドを提供する。これらオリゴヌクレオチドは、長さが約１５から約３０ヌクレオチド、好ましくは長さが約１５から約２５ヌクレオチドであるが、最も好ましくは約１８ヌクレオチドの長さである。この遺伝子の配列は知られている。それゆえ、本発明のオリゴヌクレオチドは該遺伝子のいずれかの領域に相補的ないかなるヌクレオチド配列を有していてもよい。本発明の１８ｍｅｒの３つの非限定的な例は、下記表１に配列番号：１、４および６として示す配列を有する。１８オリゴヌクレオチドを越えるオリゴヌクレオチドもまた本発明により想定される。これらオリゴヌクレオチドは、ＲＩ_α遺伝子発現をダウンレギュレートする能力を減じることなしに、たとえば配列番号：１、４または６の１８ｍｅｒの３'末端、または５'末端、または３'末端と５'末端の両方から延びる２５までの付加的なヌクレオチドを有する。別の態様として、本発明の他のオリゴヌクレオチドは、たとえば配列番号：１、４または６を有するオリゴヌクレオチドよりも少ないヌクレオチドを有していてもよい。かかる短くなったオリゴヌクレオチドは、少なくともＲＩ_α遺伝子の発現をダウンレギュレートする親オリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を保持しているか、またはより高い活性を有する。本発明のオリゴヌクレオチドは当該技術分野で認められた方法により調製できる。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは手動または自動合成機により調製でき、ついでホスホルアミダイト［アグラワル（Ａgrawal）ら（１９９２）Ｔrends Ｂiotechnol.１０：１５２〜１５８において概説、たとえばアグラワルら（１９８８）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．（ＵＳＡ）８５：７０７９〜７０８３を参照］またはＨ−ホスホネート［たとえば、フレーラー（Ｆroehler ）（１９８６）Ｔetrahedron Ｌett.２７：５５７５〜５５７８を参照］化学などの当該技術分野でよく知られた方法を用いて処理する。バーゴット（Ｂergot ）により記載された合成法［Ｊ.Ｃhromatog.（１９９２）５５９：３５〜４２］もまた用いることができる。他の化学基の例としては、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、２ '−Ｏ−メチル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カーボネート、およびリン酸トリエステルが挙げられる。これら結合を有するオリゴヌクレオチドは公知の方法に従って調製できる［たとえば、グッドチャイルド（Ｇoodchild）（１９９０）Ｂioconjugate Ｃhem.２：１６５〜１８７；アグラワルら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．（ＵＳＡ）（１９８８）８５：７０７９〜７０８３）；ウールマン（Ｕhlmann）ら（Ｃhem.Ｒev．（１９９０）９０：５３４〜５８３）；およびアグラワルら（Ｔrends Ｂiotechnol．（１９９２）１０：１５２〜１５８）を参照］。本発明の好ましいハイブリッドオリゴヌクレオチド、インバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチド、およびインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドは、ＲＩ_α遺伝子発現を特異的にダウンレギュレートする能力には実質的に影響を与えることのない他の修飾を有していてよい。これら修飾は、オリゴヌクレオチド分子の内部または末端の修飾を含み、コレステリルや２つのアミノ基の間に種々の数の炭素残基を有するジアミン化合物などのインターヌクレオシドリン酸結合での該分子への付加、および開裂するまたは反対鎖または関連酵素またはＲＩ_α核酸に結合する他のタンパク質に架橋する末端リボース、デオキシリボースおよびリン酸修飾を含む。そのような修飾オリゴヌクレオチドの例としては、修飾した塩基および／または糖、たとえばリボースの代わりのアラビノースなどを有するオリゴヌクレオチド、またはその３'位および５'位の一方または両方においてヒドロキシル基またはリン酸基以外の化学基（その３'位または５'位にて）に結合した糖を有する３',５'−置換オリゴヌクレオチドを含む。他の修飾オリゴヌクレオチドは、その３'および／または５'末端においてヌクレアーゼ耐性を付与する嵩ばった置換基でキャッピングされているか、またはヌクレオチド当たり一方または両方の非架橋性酸素に置換を有する。そのような修飾は、インターヌクレオシド結合の幾つかまたはすべてにおいて、並びにオリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両末端において、および／または該分子の内部にあってよい［アグラワルら（１９９２）Ｔrends Ｂiotechnol.１０：１５２〜１５８において概説］。本発明はまた、ＲＩ_α遺伝子の発現を特異的にダウンレギュレートしうる本発明による少なくとも一つのオリゴヌクレオチドおよび薬理学的に許容しうる担体または希釈剤を含む、望ましくない制御不能な細胞増殖または癌を治療するのに適した治療組成物をも提供する。本発明の治療組成物中に用いるオリゴヌクレオチドは、ＲＩ_αゲノム領域、遺伝子、またはそのＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的であるのが好ましい。本明細書において用いる「薬理学的または生理学的に許容しうる担体」としては、いずれかまたはすべての溶媒（ラクトースを含むがこれに限られるものではない）、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。かかる薬理学的に活性な物質のための媒体および薬剤の使用は当該技術分野でよく知られている。活性成分と両立しない通常の媒体または薬剤以外は、本発明の治療組成物に用いることが想定される。補助的な活性成分を該組成物中に配合することもできる。イン・ビトロまたはイン・ビボにて細胞の増殖を抑制するため、または本発明の方法によりヒトにおけるガンを治療するために適当な本発明のいくつかの好ましい治療組成物は、滅菌標準食塩水で本明細書に記載される治療上有効な量に再構築される配列番号：１−４および／または６および２０−７５ｍｇのラクトース、ＵＳＰを有する約２５−７５ｍｇの凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを含む。本発明はまた、ＲＩ_α遺伝子が不正確にまたは過剰発現している障害または疾患を罹患しているヒトを治療する方法を提供する。本方法を用いて治療することができる障害または疾患などは、以下に限るものではないが、ヒト結腸癌、乳癌、胃癌および神経芽細胞腫などである。本発明の方法において、本発明の治療上有効な量がヒトに投与される。本発明の治療方法は他の治療剤と共に投与されることができる。本明細書で使用する「治療上有効な量」とは、該医薬製剤の各活性成分または、有意義な主題または患者の利益、すなわち腫瘍の発達の低減または癌を引き起こすかまたは特徴付けるタンパク質の発現における低減などを示すに十分な方法の各活性成分の総量を意味する。個体に活性成分を単独で投与する場合、該語はその成分単独をいう。組み合わせて投与される場合、該語は、組み合わせて連続して投与するかまたは同時に投与するか治療効果を得る活性成分の組み合わせた量をいう。「治療上有効なやり方」とは、上記のように、患者の意味ある利益が最終的な結果となる医薬製剤の投与の経路、持続期間および頻度をいう。本発明のいくつかの態様において該医薬製剤は、注入、舌下、結腸、皮内、経口または丸剤により腸内、持続的、断続的または断続性の食事後の持続性を介して投与する。本発明の医薬組成物における合成オリゴヌクレオチドの治療上有効な量は治療されるべき病状の性質または重篤度および患者が罹患した疾患の前回の治療の性質によるであろう。最終的に、医師が個々の患者を治療する合成オリゴヌクレオチドの量を決定するであろう。最初に、医師が合成オリゴヌクレオチドの低用量を投与し、ついで患者の応答を観察する。最適の効果が得られるまで一層多くの量の合成オリゴヌクレオチドが患者に投与され、ついで、得られた時点で該用量はそれ以上増加させない。本発明の方において投与される医薬組成物用量は、１日当たり約０.１〜０.５mg／kg体重および好ましくは１日当たり０.１〜２.０mg ／kg体重を含むべきであると考えられている。全身投与される場合、該治療組成物は好ましくは、約０.０１μＭ〜１０μＭのオリゴヌクレオチドの血中レベルを達成するのに十分な用量で投与される。好ましくは、異常な遺伝子発現の部分でのオリゴヌクレオチドの濃度は、好ましくは、約０.０１μＭ〜１０μＭであるべきであり、最も好ましくは、約０.０５μＭ〜約５μＭであるべきである。しかしながら、局所投与に関しては、これより一層低濃度が有効であり、一層高濃度が寛容であり得る。各個体が単独の治療エピソードを落としてある場合、本発明の１またはそれ以上の治療組成物の治療上有効な量を同時または連続して投与するのが好ましいであろう。本発明の医薬組成物の投与または本発明の方法の実施は経口注入、腸内、結腸内、または皮中投与、吸入、舌下投与または皮膚、皮下、筋肉内、眼内、横隔膜内または静脈注入または治療製剤を投与するのに公知の他の投与経路などの従来の多様な方法において実施することができる。該組成物ガ、経口、舌下または任意の注入できない経路により投与される場合、治療製剤が好ましくは生理学的に許容し得る担体、例えば、不活性化希釈剤または該組成物が投与される吸収可能な可食担体などが含まれるであろう。化合物を血流に注入以外の経路によって導入するための製薬学的に許容し得る賦形剤を含む適当な製剤は、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒ emington's Ｐharmaceutical Ｓciences）（第１８版）（ゲナロ（Ｇenarro）編（１９９０）、マック・パブリッシング・コ（Ｍack Ｐublishing Ｃo.），イーストン（Ｅaston）、フィラデルフィア）。該オリゴヌクレオチドおよび他の成分は硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセルに封入され、錠剤に打錠され、または個体の食事に直接組み入れられることができる。該治療組成物は、賦形剤と共に組み込まれ、および摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ、ウエハースなどの形態において使用されることができる。該治療組成物が経口投与される場合、該組成物は他の食物形態オヨビ製薬学的に許容し得る香料増強剤（enhancer）と混合されることができる。該治療組成物が腸内に投与される場合、それらは固体、半固体、懸濁液または乳液形態にて導入されることができ、ついで任意の数のよく知られた製薬学的に許容し得る添加剤と化合していてよい。徐放性経口運搬系および／または経口投与量形態のための腸コーティングは米国特許第４,７０４,２９５号、４,５５６,５５２号、４,３０９,４０４号および４,３０９,４０６号などに記載されるように考慮されている。本発明の組成物の治療上有効な量が注入によって投与される場合、該合成オリゴヌクレオチドは、好ましくは無発熱素、非経口的に許容し得る水溶液の形態であろう。そのような非経口的に許容し得る溶液の調製（ｐＨ、等張性、安定性などに関する当然のことを含む）は、当業者の範囲内である。注入に関して好ましい医薬組成物は、合成オリゴヌクレオチドの他に、塩化ナトリウム注入液、リンガー液、デキストロース注入、デキストロースおよび塩化ナトリウム注入、酪酸化リンガー液または公知の他のビヒクルなどの等張性ビヒクルを含むべきである。本発明の医薬組成物はまた、安定化剤、保存剤、バッファー、抗酸化剤または当業者に公知の添加剤を含むことができる。注入可能な使用に適した製薬学的な形態は、滅菌水溶液または分散媒および滅菌注入液または分散媒の即時調製のための滅菌粉末を含む。すべての場合において該形態は滅菌状態である。該形態は製造および保存状態において安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されることができる。該担体は、溶剤または分散媒体であることができる。微生物の作用の妨害は多様な抗細菌または抗真菌剤によってもたらされることができる。注入可能な治療剤の吸収延長は、吸収を遅延させる組成物の使用によってもたらされることができる滅菌注入可能な溶液は、適当な溶剤、中に必要な量のオリゴヌクレオチドを組み込み、後に滅菌濾過することによって調製される。該製剤は、医師により丸剤にて持続的、または間欠的投与により、または持続および間欠的投与の組合せによって該患者の疾患の程度および／または段階によって決定されることができる。本発明の医薬組成物による持続期間は、オリゴヌクレオチドの独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ヒトの治療のための治療製剤などを調製する技術に内在する制限、治療されるべき疾患および各患者個体の潜在的な特異体質的応答などのための治療製剤に依存して変化するであろう。最終的に医師は本発明の医薬組成物を用いて静脈内療法の適当な持続期間に関して決定するであろう。本発明の組成物はイン・ビトロにおける癌または腫瘍細胞の増殖を抑制または低減するために有用である。本発明の合成オリゴヌクレオチドは相補的なゲノム領域またはＲＩ_αサブユニットをコードするものから転写されたＲＮＡ分子にオリゴヌクレオチドが結合することができるのに十分な量にて細胞に投与される。このようにして、ＰＫＡの発現は減少し、従って、細胞増殖は抑制または低減する。本発明の組成物はまた、ヒトにおける癌の治療または非制御細胞増殖のために有用である。この方法において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む治療製剤は、生理学的に許容し得る担体において提供される。ついで個体は、該オリゴヌクレオチドがＲＫＡＲＩ_αゲノム領域または感染細胞中から転写されたＲＮＡ分子に結合するのに十分である量において治療製剤で治療する。このようにして、オリゴヌクレオチドの結合はＲＩ_α発現およびそれゆえのＰＫＡ活性の抑制またはダウンレギュレーション（down-regulation）する。本発明の治療方法の実施または使用において、本発明の少なくとも１または一層多くの有効な治療量は癌を患う被験体に投与した。腫瘍の発達また大きさまたはＲＩ_α発現の減少は、該方法と医薬製剤が細胞増殖の抑制または減少および従って、ヒトにおける癌に対する能力のポジティブな指標であるとみなされている。本発明の少なくとも１つ医療組成物は本発明の方法により単独または他の１または一層他の多くの投与量で投与されている場合、該組成物は他の治療と連続して投与されるかまたは連続的に投与されることができる。連続で投与される場合、医師は本発明の組成物を治療法と組み合わせて適当な順にて投与することに関して決定する。以下の実施例は本発明の製造および実施の好ましい態様を説明するものであって、本発明の範囲を制限することを意図しているのではない。というのは、別法を類似の結果を得るために利用することができるからである。実施例１オリゴヌクレオチドの合成、脱保護および精製オリゴヌクレオチドホスホロチオエートは自動化ＤＮＡ合成器（モデル８７００、バイオサーチ、ベッドフォード、マサチューセッツ）を用いて、１０μＭスケールにてβ−シアノエチルホスホルアミデート方法を用いて合成した。ホスホロチオエート結合を産生するのに、中間リン酸結合は３Ｈ、１，２−ベンゾチオール−３Ｈ−オン−１,１−ジオキシド（ボーケージ（Ｂeaucage）、プロトコールズ・フォー・オリゴヌクレオチズアンド・アナログズ：シンセシスアンド・プロパティズ(Ｐrotocols for Ｏrigonucleotides and Ａnalogues；Ｓynthesis a nd Ｐroperties)、アグラワル（編）（１９９３）ヒューマン・プレス（Ｈumana Ｐress、トトワ（Ｔotowa）、ニュージャージー、３３−６２ページ）。類似の合成はホスホジエステル結合を産生するために行われるが、標準酸化は標準ヨウ素を用いて行われる。インバーテッドキメラオリゴヌクレオチドの合成は、同様のやり方で行うが、メチルホスホネート結合をメチルホスホノアミダイトヌクレオシドを用いて集めることは別であり（グレン・リサーチ・スターリング(Ｇlen Ｒesearch Ｓterling)、バージニア）、後に、テトラヒドロフラン／２,６−ルチジン／水（７５：２５：０.２５）中の０.１Ｍヨウ素を用いて酸化する（アグラワルおよびグッドチャイルド（１９８７）、Ｔet.Ｌett．２８：３５３９−３５４２参照）。ハイブリッドオリゴヌクレオチドおよびインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドは同様に合成されるが、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドが２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドホスホルミダイトを用いて集められ、後に、上記のホスホロチオエートまたはホスホルジエステル結合への酸化が続くことは別である。オリゴヌクレオチドの脱保護および精製を標準産物により実施する（パドマプリヤ（Ｐadmapriya）ら（１９９４）、Ａntisense Ｒes.＆Ｄev. ４：１８５−１９９参照）、メチルホスホネート含有領域を含むオリゴヌクレオチドを除く。それらのオリゴヌクレオチドに関して、該ＣＰＧ−結合オリゴヌクレオチドを濃アンモニウムヒドロキシドにて１時間室温処理し、その上清を除去しついで蒸発させて淡黄色の残渣を得て、ついでエチレンジアミン／エタノール（１：１ v/v）の混合物で６時間処理し、ついで再度減圧下で乾燥させる。実施例２イン・ビトロ補体活性実験オリゴヌクレオチド媒介補体の枯渇に関するインバーテッドハイブリッドまたはインバーテッドキメラ構造の適正な効果を決定するために以下の実験を行った。静脈血を、健常成人志願者から収集する。血清を市販の添加剤なしに血液ををバキュテイナー（vacutainer）（ベクトン・ディキンソン（Ｂecton Ｄickinson ）、第６４３０号、フランクリン・レイクス（Ｆrankilin Ｌakes）、ニュージャージー）に収集することによって溶血性補体アッセイのために調製する。血液を室温で３０分間凝血させ、１５分間氷上で冷却し、ついで４℃で遠心して分離血清を得る。収集した血清を同日のアッセイのために氷上に維持するかまたは別法として、−７０℃で保存する。バッファーまたはオリゴヌクレオチドサンプルを、ついで該血清でインキュベートする。試験したオリゴヌクレオチドは２５マーのオリゴヌクレオチドホスホジエステルまたはホスホロチオエート、２５マーのハイブリッドオリゴヌクレオチド、２５マーのインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチド、２５マーのキメラオリゴヌクレオチドおよび２５マーのインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドである。代表的なハイブリッドオリゴヌクレオチドは各、６−９のデオキシリボヌクレオチドのうちの２つの領域によりフランキングされている７〜１３の２−Ｏ−メチルリボヌクレオチドからなる。代表的な２５マーのインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドは各４つのリボヌクレオチドのうちの２つの領域によりフランキングされている１７のデオキシリボヌクレオチドからなる。代表的な２５マーのキメラオリゴヌクレオチドは６つのメチルホスホネートデオキシリボヌクレオチドおよび１９のホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドからなる。代表的なインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドは、２〜７つのメチルホスホネートデオキシリボヌクレオチドの領域によってフランキングされる１６〜１７のホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドから回されていること、または２〜１２オリゴヌクレオチドにわたる２つのホスホルチオエート領域によってフランキングされ、２〜６ヌクレオチド長にわたる３つのホスホロチオート領域によってフランキングされるものからなる。抗ヒツジ赤血球細胞抗体（溶血素、ディアメディックス（Ｄiamedeix）、マイアミ、フロリダ）で感作したヒツジ赤血球細胞（コロラド・シーラム・コ（Ｃol orado Ｓerum Ｃo.）の補体媒体溶菌のためのＣＨ５０アッセイ（カバト（Ｋaba t）およびメイヤー（Ｍayer）（編）、Ｅxperimental Ｉmmunochemistry２編、スプリングフィールド（Ｓpringfield）、イリノイ、ＤＣＣトーマス（Ｔhomas ）、１２５ページ）を、各試験血清の少なくとも５倍希釈を２回、同じ決定を用いて行い、ついで無細胞上清へのヘモグロビンの放出を５４１ｎｍの分光光度計を用いて測定した。実施例３マウス脾臓を用いてのイン・ビトロマイトジェン産生実験オリゴヌクレオチド媒介マイトジェン産生に関してインバーテッドハイブリッドまたはインバーテッドキメラ構造の適正な効果を決定するために、以下の実験を行った。雄性ＣＤ１マウス（４−５週齢、２０−２２ｇ；チャールズ・リバー（Ｃharles Ｒiver）、ウィルミントン（Ｗilmington）、マサチューセッツ）から脾臓を摘出した。単細胞懸濁液をガラススライドのつや消し末端で穏やかに細かく挽くことによって調製した。ついで細胞をＲＰＭＩ完全培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０μＭ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、１００Ｕ／mlペニシリン、１００μｇ／mlストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを補ったＲＰＭＩ培地）で培養した。オリゴヌクレオチドの分解を最少にするため、ＦＢＳを最初に３０分間６５℃（ホスホジエステル含有オリゴヌクレオチド）または５６℃（その他すべてのオリゴヌクレオチド）にまで加熱した。細胞を９６ウェル皿に１ウェル当たり１００,０００細胞（１００μｌ／ウェルの容量）でプレーティングした。１０μｌＴＥバッファー（１０ｍＭのＴris-ＨＣl 、ｐＨ７.５、１ｍＭノＥＤＴＡ）中の上記実施例２に記載の各オリゴヌクレオチドの１タイプを各ウェルに加えた。３７℃で４４時間培養後、１μＣｉのトリチウム化したチミジン(アマシャム（Ａmersham）、アーリントン・ハイツ（Ａrlingt on Ｈeights）、イリノイ)を４時間のパルス標識法の間２０μｌのＲＰＭＩ培地中に加えた。ついで該細胞を自動細胞回収機（スカトロン（Ｓkatron）、スターリン（Ｓterling）、バージニア）中で回収し、ついで該フィルターをシンチレーションカウンターを用いて評価した。マイトジェン産生に関するコントロール実験において、細胞を培地（ネガティブコントロール）かまたはコンカナバリンＡ（concanavalin Ａ）（ポジティブコントロール）をオリゴヌクレオチドの存在下で該細胞に加えることを除いては、同一に処理した。すべてのインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドより免疫原性は少ないことがわかった。２'−Ｏ−メチル領域中のホスホロジエステル結合を有するインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドはその領域中のホスホロチオエート結合を含むものより免疫原性がわずかに少ないようである。２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド領域が１３〜１１または９ヌクレオチドに削除する場合、マイトジェン産生における有意差は全く観察されなかった。インバーテッドキメラオリゴヌクレオチドはまた、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドより一般的にマイトジェン産生は少なかった。さらに、これらのオリゴヌクレオチドは伝統的なキメラオリゴヌクレオチドよりマイトジェン産生が少ないようであり、少なくとも伝統的なキメラオリゴヌクレオチドは、３'末端近辺のメチルホスホネート結合の多数を有する場合においては少ないようであった。５〜６、または７のオリゴヌクレオチドの中心のメチルホスホネート結合の増大する数がマイトジェン産生に有意な効果を及ぼさなかったようである。これらの結果は、オリゴヌクレオチドへのインバーテッドハイブリッドまたはインバーテッドキメラ構造の取込みがそのマイトジェン産生を減少させることができることを示唆している。実施例４ヒト血液を用いたイン・ビトロでのマイトジェン産生実験オリゴヌクレオチド誘発マイトジェン産生に関するインバーテッドハイブリッドまたはインバーテッドキメラ構造の相対的効果を決定するため、以下の実験を行った。静脈血を健常成人志願者から収集した。凝血時間アッセイのための血漿を血液をクエン酸ナトリウムとともにシリコン化したバキュテイナーに収集することによって調製し（ベクトン・ディキンソン、第３６７７０５号）、ついで４ ℃で２回遠心して血小板の乏しい血漿を調製した。血漿アリコートを氷上に維持し、上記実施例２に記載の多様な試験オリゴヌクレオチドにてスパイクし、ついですぐに試験するかまたはトライアイスで急速凍結して引き続き−２０℃出保存し、のち凝血アッセイする。活性化された部分的なトロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）をエラクトラ１０００Ｃ（Ｅlectra １０００Ｃ）（メディカルラボラトリーオートメーション、（Ｍedical Ｌaboratory Ａutomation）、マウント・バーノン（Ｍount Ｖernon）、ニューヨーク）上で製造者の推薦した方法によりアクチンＦＳＬ（バクスターデード（Ｂaxter Ｄade）、マイアミ、フロリダ）および分光光度計によって測定した凝血形成開始のためのカルシウムを用いて行った。ａＰＴＴの延長をオリゴヌクレオチドにより産生された凝血抑制副作用の指標としてとらえた。伝統的なホスホロチオエートオリゴヌクルエオチドは、試験したすべてのオリゴヌクレオチドのうちで、ａＰＴＴが最大の延長を産生した。伝統的なハイブリッドオリゴヌクレオチドは幾分ａＰＴＴの減少した延長を産生した。伝統的なホスホロチオエートまたは伝統的なハイブリッドオリゴヌクレオチドと比較して、試験したすべてのインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドはａＰＴＴの有意に減少した延長を産生した。２'−Ｏ−置換リボヌクレオチド領域中のホスホジエステル結合を有するインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドはこの副作用において最大の減少を有し、オリゴヌクレオチド濃度がせいぜい１００ μg／mlの濃度でさえ、ａＰＴＴの非常にわずかな延長を示す１３ヌクレオチドの２'−Ｏ−メチルＲＮＡホスホジエステル領域を有するオリゴヌクレオチドでのように減少した。伝統的なキメラオリゴヌクレオチドは、伝統的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが産生するよりａＰＴＴの延長が少ない。一般的に、インバーテッドキメラオリゴヌクレオチドはこの特徴を有している。少なくとも１つのインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドは９つのホスホロチオエート領域によってフランキングされる７つのヌクレオチドのメチルホスホネート領域を有しているが、これは本アッセイにおいて試験したオリゴヌクレオチドの最も高濃度を除いて、すべてにおいて伝統的なキメラオリゴヌクレオチドより一層よい結果を与えた。これらの結果は、インバーテッドハイブリッドおよびインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドが、イン・ビボで遺伝子発現を調製するために投与される場合に、凝血抑制の副作用を減少するという利点を提供することを示唆している。実施例５イン・ビボ補体活性実験実験の少なくとも７日前には、アカゲザル（４−９kg体重）を実験室の状態に馴化させる。実験の当日、各動物をケタミン−ＨＣｌ（１０ｍｇ／ｋｇ）およびジアゼパム（０．５ｍｇ／ｋｇ）で軽く鎮静させる。外科手術レベルの麻酔を誘発し、ついで実験の間ずっと持続的にケタミンを静脈内に滴下することにより維持した。上記実施例２に記載のオリゴヌクレオチドを通常の食塩水に溶かし、０ .４２ｍｇ／分の運搬速度でプログラム可能な注入ポンプを用いて、頭蓋静脈内カテーテルを介して静脈内で注入した。各オリゴヌクレオチド、０、０.５、１、２、５および１０mg／kgの用量を１０分かけての注入速度で２頭の動物各々に投与した。動物の血液サンプルを収集して１０分後にオリゴヌクレオチドを投与し、ついで注入開始後２、５、１０、２０、４０および６０分後ならびに２４時間後に収集した。血清は補体ＣＨ５０を決定するために使用し、ヒツジ赤血球手法（カバトおよびマイヤー、１９６１、上記）の従来の補体依存溶菌を用いて行った。最高の用量において、ホスホロチエートオリゴヌクレオチドは、注入開始５分以内に血清補体ＣＨ５０中において減少を引き起こす。インバーテッドハイブリッドおよびキメラオリゴヌクレオチドはこれらの条件下で血清補体ＣＨ５０において多大な減少または検出不可能な減少を示すと期待されている。実施例６イン・ビボマイトジェン産生実験ＣＤ１マウスに上記実施例２に記載のオリゴヌクレオチドの５０mg／kg体重の用量で腹腔内に注入する。４８時間後、該動物を安楽死させ、ついでその脾臓を摘出し、重量を測定する。インバーテッドハイブリッドまたはインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドは脾臓の重量において有意な増加が見られないことが期待されたが、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートで処理したものは脾臓重量においては控えめに増加を示すと期待されている。実施例７イン・ビボ凝血実験アカゲザルを実施例５のように処理する。採取した全血液サンプルから、凝血アッセイ用の血漿を調製し、ついで実施例４に記載のようにアッセイを行った。ａＰＴＴの延長はインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドおよびインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドの両者に関して、伝統的なオリゴヌクレオチドホスホロチオエートに比較して実質的に減少するであろう。実施例８ＲＮアーゼＨ活性実験相補的ＲＮＡ分子に結合した場合のインバーテッドオリゴヌクレオチドおよびインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼＨ活性化能力を決定するために、以下の実験を行った。前記実施例２で記載したオリゴヌクレオチドの各タイプを、最終体積１ｍｌのＲＮアーゼＨ緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１ＭＫＣｌ，２％グリセロール，０．１ｍＭＤＴＴ）を入れたキュベット中で、モル当量の相補的オリゴヌクレオチド（それぞれ濃度０．２２６μＭ）とともにインキュベートした。サンプルを９５ ℃に加熱し、次いで室温まで徐々に冷却し、アニーリングさせて二重体を形成した。アニーリングした二重体を３７℃で１０分間インキュベートし、次いで５ユニットのＲＮアーゼＨを加え、３時間にわたるデータ収集を開始した。データは、分光光度計（ＧＢＣ９２０，ＧＢＣＳcientific Ｅquipment，ビクトリア，オーストラリア）を用い、２５９ｎｍにて収集した。濃色シフトを利用してＲＮアーゼＨの分解を測定した。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、分解半減期が８.８秒の、ＲＮアーゼＨ媒介性ＲＮＡ分解の非常に良好な共基質であった。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、半減期がやや長く２２.４秒であった。オリゴヌクレオチドのそれぞれの末端に２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドセグメントを導入すると、ＲＮアーゼＨの活性はさらに低下した（半減期３２.７秒）。逆に、オリゴヌクレオチドの中間部に２'−Ｏ−メチルセグメントを導入すると（インバーテッドハイブリッド構造）、ＲＮアーゼＨ媒介性分解において常に改善された結果が得られた。１３の２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドホスホジエステルの領域の両サイドをホスホロチオエートＤＮＡで隣接させた場合、半減期７.９秒という最良のＲＮアーゼＨ活性が観察された。各オリゴヌクレオチドの３'末端にメチルホスホネート結合ヌクレオチドの大きなブロックを導入しても、たとえキメラ配置の場合でさえも、ＲＮアーゼＨ活性にはどのような悪影響もなかった。しかし、５'末端にメチルホスホネート結合ヌクレオチドを導入すると、特に３'末端にひとつのメチルホスホネートリンカーをもつキメラ配置の場合に、ＲＮアーゼＨ活性は良好になった（最良半減期８.１秒）。ホスホロチオエート領域によって隣接されたメチルホスホネートコア領域をもつすべてのインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドにおいて、良好なＲＮアーゼＨ活性が得られた（半減期９. ３〜１４.４秒）。これらの結果は、インバーテッドハイブリッドまたはインバーテッドキメラ構造をホスホロチオエート包含オリゴヌクレオチドに導入すると、有効なアンチセンス剤として非常に重要な属性である、ＲＮアーゼＨに対する共基質として作用するオリゴヌクレオチドの能力を幾らかあるいはすべて修復できることを示している。実施例９融解温度実験アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的分子の間に形成された二重体の安定性におけるインバーテッドハイブリッドまたはインバーテッドキメラ構造の影響を決定するために、以下の実験を行った。熱融解(Themal melting:Ｔｍ)データは、デュアル回転ラックに搭載された６個の１０ｍｍキュベットを備える分光光度計（ＧＢＣ９２０，ＧＢＣ Scientific Equipment，ビクトリア，オーストラリア）を用いて収集した。Ｔｍ実験において、温度は、ＧＢＣ製のソフトウェアをその使用説明書にしたがって用い、ペルティエ効果温度コントローラーを通じてコンピューター制御した。該ソフトウェアによって遂行される第１誘導法および中間点法の両方でデータを分析した。Ｔｍ実験は、１０ｍＭＰＩＥＰＥＳ，ｐＨ７. ０，１ｍＭＥＤＴＡ，１ＭＮａＣｌを含む緩衝液中で行った。熱を吸収するために、ペルティエ効果温度コントローラーに冷凍浴（ＶＷＲ１１６６，ＶＷＲ，ボストン，ＭＡ）を接続した。２６０ｎｍにおける吸光度を使用し、吸光係数を考慮してオリゴヌクレオチド鎖濃度を測定した。実施例１０ヒト腫瘍細胞を用いたインビボ実験ＬＳ−１７４Ｔヒト結腸癌細胞（１×１０⁶個の細胞，ＡＴＣＣ番号ＣＬ１８８，アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション，ロックビル，メリーランド）を、無胸腺ＳＣＩＤ雌性マウスの左脇腹に皮下接種した。細胞接種から約１週間後、腫瘍の大きさが８０〜１００ｍｇになったとき、表１に示すように、１ｍｇ／０.１ｍｌ／マウスの量のＲＩ_αアンチセンスハイブリッド（オリゴ１６４、配列番号４）、インバーテッドハイブリッド（オリゴ１６６、配列番号６）またはインバーテッドキメラ（オリゴ１９０、配列番号１）オリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチド（オリゴ１６９、配列番号７）；オリゴ１６８（配列番号５）；オリゴ１８８（配列番号３）または食塩水（０.１ｍｌ／マウス）を１回投与にてマウスの右脇腹に皮下注入した。腫瘍の最大径と最小径を毎日測定し、式：４／３πｒ³［ここでｒ＝(長さ＋幅)／４］から腫瘍の体積を算出した。各時点ごとに、コントロールおよびアンチセンス処置グループから２匹の実験動物を屠殺し、腫瘍を切除して秤量した。結果を図１に示す。配列番号６のインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチド１６６で処置した動物における腫瘍サイズが、驚くべきことに、注入後３日から、配列番号１のホスホチオエートオリゴヌクレオチド１６４のものよりも小さくなった。この効果が配列特異的であったこともまた図１に実証されている：コントロールオリゴヌクレオチド１６８（配列番号３）の腫瘍サイズを最小に維持する能力は、ハイブリッドおよびインバーテッドオリゴヌクレオチドと比較して少ししかない。もうひとつの実験では、５０〜１５０ｍｇの大きさのＬＳ−１７４Ｔヒト腫瘍を創製したＳＣＩＤマウスに、生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に２５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したハイブリッドオリゴヌクレオチドを経口投与した。これらのオリゴヌクレオチドは、配列番号４または９であり、４つの２'−Ｏ−メチル置換リボヌクレオチドをその３'および５'末端に有するものである。配列番号４のオリゴヌクレオチドは、タンパク質キナーゼＡをコードするｍＲＮＡの一部と相補的である。配列番号９のオリゴヌクレオチドはミスマッチコントロールである。断食した実験動物に食塩水またはこれらのオリゴヌクレオチドのいずれかを、動物の体重１ｋｇあたり１ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇの量にて栄養を介して投与した。他の動物には、配列番号４の抗ＰＫＡオリゴヌクレオチド１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。投与量は、処置前の体重に基づいており、０．０１ｍｌの位まで精密にした。投与後、それぞれの動物を代謝ケージに入れ、市販の飼料で給餌し、任意給水を行った。キャリパーで腫瘍の大きさを測定して腫瘍の成長をモニターした。処置前に腫瘍の２つの垂直直径を測定し、次いで処置後７日目にもう一度測定した。腫瘍重量は次のように算出した。腫瘍重量（ｍｇ）＝１／２×Ａ×Ｂ²×１００［ここで、Ａは長直径（ｃｍ）、およびＢは短直径（ｃｍ）である］食塩水コントロール処置腫瘍に対するパーセンテージとして算出した結果を下記表２に示す。処置後１日目から開始して投与したタンパク質キナーゼＡ特異的オリゴヌクレオチドは、それぞれの用量において腫瘍の成長を阻害したばかりでなく、腫瘍の大きさも縮小した。これらの結果は、哺乳動物においてヒト腫瘍の成長を阻害する本発明方法の能力を実証するものである。実施例１１ＲＩ_αサブユニットの光親和性標識および免疫沈降腫瘍を氷冷緩衝液１０（トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７.４，２０ｍＭ；ＮａＣｌ，１００ｍＭ；ＮＰ−４０，１％；デオキシコール酸ナトリウム，０．５％；ＭｇＣｌ₂，５ｍＭ；ペプスタチン，０．１ｍＭ；アンチペイン，０.１ｍＭ；キモスタチン，０.１ｍＭ；ロイペプチン，０.２ｍＭ；アプロチニン，０.４ｍｇ／ｍｌ；および大豆トリプシンインヒビター，０.５ｍｇ／ｍｌ；孔径０.４５μｍの膜を通して濾過したもの）中、テフロン／ガラスホモジナイザーでホモジナイズし、エッペンドルフマイクロ分離機にて４℃で５分間遠心分離する。腫瘍抽出物として上清を用いる。腫瘍中のＰＫＡＲＩ_αの量を、８−Ｎ₃−［³²Ｐ］ｃＡＭＰで光親和性標識し、次いでトートラ(Tortora)ら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:705-708）に記載のＲＩ_α抗体で免疫沈降することにより測定する。８−Ｎ₃−［³²Ｐ］ｃＡＭＰ（６０.０Ｃｉ／ｍ−ｍｏｌ）の光活性化配合物、および抗ＲＩ_αまたは抗ＲＩ_β抗結成およびタンパク質Ａセファロースを用いる免疫沈降、および可溶化抗原−抗体複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、先行文献の記載に準じる［トートラら（ 1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:705-708;エカンガー(Ekanger)ら(1985)J.Bio l.Chem.,260:3393-3401］。本発明のハイブリッド、インバーテッドハイブリッドおよびインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドで処置した腫瘍中のＲＩ_αの量は、ミスマッチ、直鎖ホスホロチオエートまたは直鎖ホスホジエステルオリゴヌクレオチドゴントロール、食塩水またあは他のコントロールで処置した腫瘍中の量と比較して減少するであろうと予測される。実施例１２ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼアッセイアンチセンス、コントロールアンチセンスまたは食塩水で処置した実験動物からの腫瘍抽出物（タンパク質１０ｍｇ）をＤＥＡＥセルロースカラム（１×１０ｃｍ）に通し、直線塩勾配にて分画する［ロルフ（Rohllf）ら(1993)J.Biol.Che m.,268:5774-5782］。ｃＡＭＰ５μＭの不在あるいは存在下にて、ＰＫＡ活性を測定する［ロルフ（Rohllf）ら(1993)J.Biol.Chem.,268:5774-5782］。先行文献に記載の方法にしたがってｃＡＭＰ結合活性を測定し、特異的結合として表わす［タグリアフェリ(Tagliafefrri)ら(1998)J.Biol.Chem.,263:409-416］。ダリベッコのリン酸緩衝食塩水で２回洗浄した後、細胞ペレット（２×１０⁶ 個の細胞）をトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７.５，２０ｍＭ；ＥＤＴＡナトリウム，０. １ｍＭ；ジチオスレイトール，０.１ｍＭ；ペプスタチン，０.１ｍＭ；アンチペイン，０.１ｍＭ；キモスタチン，０.１ｍＭ；ロイペプチン，０.２ｍＭ；アプロチニン，０.４ｍｇ／ｍｌ；および大豆トリプシンインヒビター，０.５ｍｇ／ｍｌに、Douceホモジナイザーを用いて１００ストロークで溶解する。５分間遠心分離した後（エッペンドルフ５４１２）、上清を０.７ｍｇタンパク質／ｍｌに調節し、迅速にアッセイする［アーラー(Uhler)ら(1987)J.Biol.Chem.,262: 15202-15207］。アッセイ（総体積４０μｌ）は、３００℃で１０分間、２００ μＭＡＴＰ、２.７×１０⁶ｃｐｍのγ［³²Ｐ］ＡＴＰ、２０ｍＭＭｇＣｌ、１００μＭのケンプチド（Kemptide）（SigmaＫ−１１２７）（ケンプ(Kemp)ら(19 77)J.Biol.Chem.,252:4888-4894）、４０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、±１００ μＭのタンパク質キナーゼインヒビター（SigmaＰ−３２９４）（チェン(Cheng) ら(1985)Biochem.J.,231:655-661）、±８μＭのｃＡＭＰおよび７μｇの細胞抽出液を含めて行う。インキュベーション混合物２０μｌをホスホセルロースフィルター（ワットマン、Ｐ８１）上にスポッティングし、リン酸で洗浄することによりケンプチドのリン酸化を測定した［ロスコスキ(Roskoski)(1983)Methods En zymol.,99:3-6］。Econofluor-２（ＮＥＮリサーチプロダクツのＮＥＦ−９６９）を用いる液体シンチレーションによって放射活性を測定する。本発明のハイブリッド、インバーテッドハイブリッドおよびインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドで処置した腫瘍の抽出液においてはＰＫＡおよびｃＡＭＰ結合活性が減少するであろうと予測される。等価物当業者であれば、慣例の実験方法を利用するだけで、本明細書中に記載した特定の物質および手順に対する多数の等価物を理解するかまたは確認することができるであろう。このような等価物もまた本発明の範囲に属するものとみなされ、後記の請求の範囲によって包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．プロテインキナーゼＡサブユニットＲＩａをコードする核酸に相補的で該核酸の発現をダウンレギュレートしうる合成修飾オリゴヌクレオチドであって、該修飾オリゴヌクレオチドは約１５から約３０のヌクレオチドを有し、ハイブリッドオリゴヌクレオチド、インバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチド、またはインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドであり、該ハイブリッドオリゴヌクレオチドは、それぞれ少なくとも４つのリボヌクレオチドを有する３'および５'フランキングリボヌクレオチド領域によりフランキングされた少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドからなる領域を含み、該インバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドからなる３'および５'フランキングデオキシリボヌクレオチド領域によりフランキングされた少なくとも４つのリボヌクレオチドからなる領域を含み、該インバーテッドキメラオリゴヌクレオチドは、２つのオリゴヌクレオチドホスホロチオエート領域によりフランキングされた少なくとも４つのヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド非イオン性領域を含む、合成修飾オリゴヌクレオチド。２．１８のヌクレオチドを有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。３．ハイブリッドオリゴヌクレオチドである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。４．実質的に配列番号：４に示すヌクレオチド配列を有する請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。５．各フランキングリボヌクレオチド領域が少なくとも４つの連続した２'−Ｏ −置換リボヌクレオチドを含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。６．各フランキングリボヌクレオチド領域が少なくとも一つの２'−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドを含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。７．各フランキングリボヌクレオチド領域が少なくとも一つの２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。８．各フランキングリボヌクレオチド領域が少なくとも４つの２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。９．リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとがホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により連結されている、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。１０．インバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。１１．実質的に配列番号：６に示すヌクレオチド配列を有する請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。１２．該リボヌクレオチド領域が少なくとも５つの連結したリボヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。１３．該デオキシリボヌクレオチドフランキング領域が６つの連結したリボヌクレオチドを含む、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。１４．該フランキングリボヌクレオチド領域が２'−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。１５．該２'−Ｏ−置換リボヌクレオチドが２'−Ｏ−アルキル置換リボヌクレオチドである、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。１６．各フランキングリボヌクレオチド領域が少なくとも一つの２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。１７．該ヌクレオチドがホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により連結されている、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。１８．低減した副作用でプロテインキナーゼＡの発現を抑制するための組成物であって、請求項１２に記載のインバーテッドハイブリッドオリゴヌクレオチドを含む組成物。１９．インバーテッドキメラオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。２０．実質的に配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有する請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。２１．該オリゴヌクレオチド非イオン性領域が約４つから約１２のヌクレオチドを含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。２２．該オリゴヌクレオチド非イオン性領域が６つのヌクレオチドを含む、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。２３．該オリゴヌクレオチド非イオン性領域がアルキルホスホネートヌクレオチドを含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。２４．該オリゴヌクレオチド非イオン性領域がメチルホスホネートヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。２５．該フランキング領域中のヌクレオチドが、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により連結された少なくとも６つの連結したヌクレオチドを含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。２６．低減した副作用でプロテインキナーゼＡＲＩ_αサブユニット遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、請求項１９に記載のインバーテッドキメラオリゴヌクレオチドを含む組成物。２７．請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを癌細胞に投与する工程を含む、癌細胞の増殖をインビトロで抑制する方法。２８．請求項３に記載のオリゴヌクレオチドを癌細胞に投与する工程を含む、癌細胞の増殖をインビトロで抑制する方法。２９．請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドを癌細胞に投与する工程を含む、癌細胞の増殖をインビトロで抑制する方法。３０．請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドを癌細胞に投与する工程を含む、癌細胞の増殖をインビトロで抑制する方法。３１．薬理学的に許容しうる担体中に請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む治療組成物。３２．薬理学的に許容しうる担体中に請求項３に記載のオリゴヌクレオチドを含む治療組成物。３３．薬理学的に許容しうる担体中に請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドを含む治療組成物。３４．薬理学的に許容しうる担体中に請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドを含む治療組成物。３５．罹患した患者に請求項３１に記載の治療組成物を投与する工程を含む、罹患した患者における癌の治療方法。３６．罹患した患者に請求項３２に記載の治療組成物を投与する工程を含む、罹患した患者における癌の治療方法。３７．罹患した患者に請求項３３に記載の治療組成物を投与する工程を含む、罹患した患者における癌を低減した副作用にて治療する方法。３８．罹患した患者に請求項３４に記載の治療組成物を投与する工程を含む、罹患した患者における癌を低減した副作用にて治療する方法。