DE69604686T2 - Methode zur modulation der genexpression mit reduzierter immunstimulierender wirkung - Google Patents

Methode zur modulation der genexpression mit reduzierter immunstimulierender wirkung

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Antisense-Pharmazeutika, speziell auf Verfahren zur Verminderung der immunstimulierenden Reaktion, die in Patienten, die mit solchen Antisense-Pharmazeutika behandelt werden, induziert werden kann.
  • Die Antisense-Oligonukleotid-Technologie stellt eine aufregende neue Therapieform für viele Krankheiten dar, pathogene Infektionen, Krebs und Erbkrankheiten eingeschlossen. Während des letzten Jahrzehnts wurden auf diesem Gebiet enorme Fortschritte erzielt und gegenwärtig sind zahlreiche klinische Studien im Fortschritt oder geplant. Antisense Oligonukleotide agieren mittels Bindung an eine Ziel-Nukleinsäure durch Watson-Crick- oder Hoogstein-Basenpaarung. Antisense-Oligonukleotide können entworfen werden, um auf jedes einzelne Gen innerhalb des Genoms eines Organismus gerichtet zu sein und es zu hemmen. Die Oligonukleotide mit der SEQ ID NO: 1 und der SEQ ID NO: 5 z. B. sind Phosphorothioat-Oligonukleotide, die komplementär zu den gag und rev Regionen von HIV- 1 sind, die die Replikation von HIV-1 hemmen. Das Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 8 bindet an das p53 Onkogen. Der Antisense-Ansatz ist gegenwärtig die einzige bekannte Strategie, die ein breites Potential besitzt, die Expression spezifischer Gene in einer Krankheitssituation präzise und wirksam zu modulieren.
  • Einige Antisense-Oligonukleotide, die Phosphorothioatbindungen enthalten, weisen jedoch durch Auslösen von B-Zell-Proliferation und/oder einer Antikörper-Reaktion sowohl in vitro als auch in vivo eine immunstimulierende Reaktion auf. Diese immunstimulierende Reaktion ist nicht für alle Antisense-Oligonukleotide mit Phosphorothioatbindungen charakteristisch. Es ist z. B. bekannt, das das Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 8 keinen immunstimulierenden Effekt induziert.
  • Immunstimulierende Effekte von Phosphorothioat-Oligonukleotiden scheinen von bestimmten Sequenzen innerhalb des Oligonukleotids abhängig zu sein, sind aber unabhängig davon, ob das Oligonukleotid im Hinblick auf das jeweilige Zielgen in Antisense, Sense oder verdrehter Orientierung vorliegt. Einige Phosphorothioat- Oligonukleotide induzieren nur Zellproliferation und andere Phosphorothioat- Oligonukleotide erzeugen überhaupt keinen immunstimulierenden Effekt. McIntyre et al. (1993) Antisense Res. Dev. 3: 309-322 beschreiben, daß bestimmte Oligonukleotide in athymischen Nacktmäusen deutliche Splenomegalie verursachen können. Messina et. al. (1993) Cell Immunol. 147: 148-157; und Pisetsky et al. (1994) Life Sciences 54: 101-107 beschreiben, daß DNA und auch strukturell verwandte synthetische Oligonukleotide und Polynukleotide Lymphozyten stimulieren. Der Mechanismus für diese Stimulation ist noch nicht vollständig verstanden. B-Zellen werden üblicherweise durch Antigenbindung an Oberflächenimmunglobulin aus dem Ruhezustand aktiviert. Bei Mäusen kann die Aktivierung auch durch physiologische Vermittler, wie Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-4 (IL- 4), γ-Interferon und nicht-physiologische Mitogene, wie Lipopolysaccharid (LPS), Concanavalin A (Con A) und Kermesbeeren-Mitogen (PWM) moduliert werden.
  • Bestimmte Sequenzmotive oder Strukturen von Oligonukleotiden können wichtige Rollen beim Auslösen der Stimulation von Mauszellen spielen. Kuramoto et al. (1992) Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 beschreiben, daß die Gegenwart bestimmter palindromischer Sequenzen einschließlich 5'-CG-3'-Motive(n) in Oligonukleotiden eine kritische Determinante für die Induktion der Aktivierung von natürlichen Killerzellen und der Interferonproduktion ist. Krieg et al. (1995) Nature 374: 546-549 beschreiben, daß optimale B-Zell-Aktivierung ein DNA-Motiv erfordert, in dem ein ummethyliertes CpG-Dinukleotid von zwei 5'-Purinen und zwei 3'-Pyrimidinen flankiert ist.
  • Aufgrund des fortgesetzten Bedarfs an spezifischen Behandlungen für Krankheiten und Erbkrankheiten und des hohen Maßes an Spezifität, die durch die Verwendung von Antisense-Therapeutika, die zur Modulierung des Expressionsspiegels der angestrebten Gene fähig sind, besteht ein Bedarf zur Reduzierung der immunstimulierenden Reaktion, die durch bestimmte Phosphorothioat-Oligonukleotide induziert wird.
  • Die Erfinder haben ein Verfahren entdeckt, die immunstimulierenden Effekte bestimmter Phosphorothioat-Oligonukleotide durch Verändern von Sequenzen oder Strukturen innerhalb dieser Oligonukleotide zu reduzieren, z. B. durch Einbringen von nicht- Phosphorothioatbindungen in das Oligonukleotid, durch Verändern des Ausmaßes der Substitution mit Phosphorothioat-Internukleotid-Bindungen im Oligonukleotid, durch Austauschen einiger Desoxyribonukleotide im Zuckerrückgrat des Phosphorothioat- Oligonukleotids gegen Ribonukleotide, und durch Entfernen immunogener Nukleotide vom Phosphorothioat-Oligonukleotid. Gemäß der Erfindung werden diese Änderungen von Sequenzen oder Strukturen innerhalb des Phosphorothioat-Oligonukleotids als "immunstimulierende Reaktion vermindernde Modifikationen" definiert.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Reduzierung der immunstimulierenden Reaktion eines Säugers auf ein Phosphorothioat-Oligonukleotid zur Verfügung, welches die folgenden Schritte umfasst: Modifizieren wenigstens einer chemischen Struktur im Phosphorothioat-Oligonukleotid zur Herstellung eines immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotids; Verabreichen einer therapeutischen Zusammensetzung, die das immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid enthält, an einen Säuger; und Überwachen der Immunantwort des Säugers.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die erfindungsgemäßen Merkmaie können vollständiger aus der folgenden Beschreibung erfasst werden, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen gelesen werden.
  • Fig. 1 zeigt den Effekt verschiedener Phosphorothioat-Oligonukleotide auf die in vitro Proliferation von Maus-Splenozyten.
  • Fig. 2 zeigt den Effekt verschiedener modifizierter HIV-1 gag-Oligonukleotide auf die Proliferation von Maus-Splenozyten.
  • Fig. 3 zeigt den Effekt verschiedener modifizierter HIV-1 mv Oligonukleotide auf die Proliferation von Maus-Splenozyten.
  • Fig. 4A zeigt den Effekt der verschiedenen modifizierten HIV-1 gag-Oligonukleotide auf die IgG-Bildung durch Maus-Splenozyten.
  • Fig. 4B zeigt den Effekt der verschiedenen modifizierten HIV-1 gag-Oligonukleotide auf die IgM-Bildung durch Maus-Splenozyten.
  • Fig. 5A zeigt den Effekt der verschiedenen modifizierten HIV-1 rev-Oligonukleotide auf die IgG-Bildung in Mäusen.
  • Fig. 5B zeigt den Effekt der verschiedenen modifizierten HIV-1 rev Oligonukleotide auf die IgM-Bildung in Mäusen.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die Patente und die wissenschaftliche Literatur, auf die hier Bezug genommen wird, stellen für die Fachleute den Stand der Technik dar. Die veröffentlichten US-Patente und erteilten Anmeldungen, die hier zitiert werden, werden hiermit in den Umfang der Anmeldung aufgenommen.
  • Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine durch ein Phosphorothioat- Oligonukleotid induzierte immunstimulierende Reaktion durch Einbringen einer immunstimulierende Reaktion vermindernden Modifikation in die Sequenz oder Struktur des Oligonukleotids modifiziert. Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird wenigstens eine chemische Struktur im Phosphorothioat-Oligonukleotid modifiziert, um ein immunstimulierende Reaktion-verminderndes Phosphorothioat-Oligonukleotid herzustellen. Im zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine therapeutische Zusammensetzung, die das immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat- Oligonukleotid enthält, an einen Säuger verabreicht. Im dritten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Immunantwort des Säugers überwacht.
  • Gemäß der Erfindung ist das Phosphorothioat-Oligonukleotid komplementär zu der Region des angestrebten Gens und wird dazu verwendet, die Expression des Zielgens zu modulieren. In unmodifizierter Form induziert das Phosphorothioat-Oligonukleotid eine immunstimulierende Reaktion. Ob ein Phosphorothioat-Oligonukleotid in einem Säuger eine immunstimulierende Reaktion induziert, kann der Fachmann anhand der in den nachstehenden Beispielen 2-5 genannten Verfahren oder anhand anderer bekannter Verfahren bestimmen. Zum Nachweis, ob ein Phosphorothioat-Oligonukleotid eine immunstimulierende Reaktion induziert, kann z. B. eines der in McIntyre et al., supra, Messina et al., supra, Pisetsky et al., supra, Kuramoto et al., supra oder in Krieg et al., supra dargelegten Verfahren verwendet werden. Zusätzlich können immunstimulierende Sequenzen, z. B. die in Kuramoto et al., supra oder in Krieg et al., supra identifizierten Sequenzen durch Untersuchung der Sequenz des Phosphorothiat-Oligonukleotids identifiziert werden.
  • Jedes Phosphorothioat-Oligonukleotid, das eine immunstimulierende Reaktion induziert, kann gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren modifiziert werden. Der hier verwendete Begriff "Phosphorothioat-Oligonukleotid" schliesst chemisch synthetisierte Polymere von etwa 5 bis etwa 50, bevorzugt von etwa 15 bis etwa 30 Desoxyribonukleosiden und/oder Ribonukleosidmonomere ein, die miteinander verbunden sind oder durch wenigstens eine, bevorzugt mehr als eine 5'- an 3'-Phosphorothioat-Internukleotid-Bindung verknüpft sind.
  • Jede immunstimulierende Reaktion vermindernde Modifikation kann gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in die Sequenz oder Struktur des Phosphorothioat- Oligonukleotids eingebracht werden, solange die modulierende Aktivität des Oligonukleotid gegenüber der Expression des Zielgens erhalten bleibt. Zu Erfindungszwecken erfolgt die Gen-modulierende Aktivität gemäß der Komplementarität des Phosphorothioat- Oligonukleotids zu einer DNA-Sequenz innerhalb des Zielgens oder gemäß der Komplementarität des Phosphorothioat-Oligonukleotids zu einer RNA-Sequenz, die vom Zielgen transkribiert wird. Der Begriff "Komplementarität" bedeutet, daß das Phosphorothioat-Oligonukleotid und das immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid unter physiologischen Bedingungen an die Ziel- Nukleinsäuresequenz binden, z. B. durch Watson-Crick-Basenpaarung (Wechselwirkung zwischen Oligonukleotid und einzelsträngiger Nukleinsäure) oder durch Hoogstein-Basenpaarung (Wechselwirkung zwischen Oligonukleotid und doppelsträngiger Nukleinsäure) oder auf andere Weise. Dabei ist im Falle der Bindung von Oligonukleotid an RNA die Pseudoknoten-Bildung eingeschlossen. Die Bindung durch Watson-Crick oder Hoogsteen Basenpaarung unter physiologischen Bedingungen wird praktischerweise durch Beobachten der Interferenz mit der Funktion der Nukleinsäuresequenz gemessen. Es ist nicht notwendig, daß das Phosphorothioat-Oligonukleotid und das entsprechende Immunogenitäts-vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der gleichen Affinität an die Zielnukleinsäure binden.
  • Die Gen-modulierende Aktivität des Phosphorothioat-Oligonukleotids wird gemäß der Erfindung aufrechterhalten, wenn das immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid die Aktivität eines Gens, gegen das das Phosphorothioat- Oligonukleotid gerichtet ist, auf jedes Maß verändern kann. Bevorzugt kann ein immunstimulierende Reaktion-verminderndes Phosphorothioat-Oligonukleotid die Aktivität eines Zielgens modulieren, wenn das Zielgen in einer Höhe von 10-90% seiner "steady- state"-Expressionshöhe bei Krankheit exprimiert wird. Insbesondere kann ein immunstimulierende Reaktion-verminderndes Phosphorothioat-Oligonukleotid die Aktivität eines Zielgens modulieren, wenn das Zielgen in einer Höhe von weniger als 50% seiner "steady-state"-Expressionshöhe bei Krankheit exprimiert wird. Am besten kann ein immunstimulierende Reaktion-verminderndes Phosphorothioat-Oligonukleotid die Aktivität eines Zielgens modulieren, wenn das Zielgen nicht nachweisbar exprimiert wird. Die "steady-state"-Expressionshöhe eines Zielgens kann anhand bekannter Verfahren, z. B. durch Messen der Menge des Proteins, das durch das Zielgen kodiert wird, in einem betroffenen Säuger oder einer Zelle oder einer Körperflüssigkeit des betroffenen Säugers bestimmt werden. Wenn das Zielgen im Genom eines pathogenen Organismus, der den Säuger infiziert, anwesend ist, dann kann die "steady state"-Expressionshöhe eines Zielgens durch Messen der Menge des pathogenen Organismus, der vom infizierten Säuger abgegeben wird, oder durch Messen eines Symptoms des infizierten Säugers, der mit der Menge des pathogenen Organismus innerhalb des Säugers korreliert, bestimmt werden.
  • Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Phosphorothioat-Oligonukleotid modifiziert werden, um ein immunstimulierende Reaktion-verminderndes Phosphorothioat- Oligonukleotid herzustellen, das eine modifizierte 3'-terminale Struktur besitzt, ein immunstimulierende Reaktion-verminderndes Phosphorothioat-Oligonukleotid, das eine modifizierte 5'-terminale Struktur besitzt, oder ein immunstimulierende Reaktionverminderndes Phosphorothioat-Oligonukleotid, daß eine modifizierte 3'-terminale Struktur und eine modifizierte 5'-terminale Struktur besitzt. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren umfasst eine modifizierte 3'-terminale Struktur eine chemische Modifikation von wenigstens eines Phosphorothioat-Nukleotidrestes innerhalb von sechs Resten vom 3'- Terminus des Oligonukleotids. Die chemische Modifikation kann an irgendeiner Stelle des Phosphorothioat-Nukleotidrestes erfolgen. Ähnlicherweise umfasst eine modifizierte 5'- terminale Struktur eine chemische Modifikation wenigstens eines Phosphorothioat- Nukleotidrestes innerhalb von sechs Resten vom 5'-Terminus des Oligonukleotids. Die chemische Modifikation kann an irgendeiner Stelle des Phosphorothioat-Nukleotidrestes erfolgen.
  • Erfindungsgemäße immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat- Oligonukleotide können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Nukleotide können z. B. durch bekannte Verfahren wie Phosphoramidit, H-Phosphonat-Chemie oder Methylphosphoramidit-Chemie (siehe z. B. Goodchild (1990) Bioconjugate Chem. 2: 165- 187; Uhlmann et al. (1990) Chem. Rev. 90: 543-584; Caruthers et al. (1987) Meth. Enzymol. 154: 287-313; U. S. Patent 5149798) kovalent verbunden werden, die manuell oder durch einen automatisierten Synthesizer durchgeführt und dann prozessiert werden können (Übersicht in Agrawal et al. (1992) Trends Biofechnol. 10: 152-158).
  • Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten immunstimulierende Reaktionvermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotide können auch auf zahlreiche Arten modifiziert werden, ohne ihre Fähigkeit, an die Zielnukleinsäure zu hybridisieren, zu beeinflussen. Die Oligonukleotide können z. B. zwischen dem 5'-Ende eines Nukleotids und dem 3'-Ende eines anderen Nukleotids, in dem das 5'-Nukleotidphosphat durch eine beliebige Anzahl von chemischen Gruppen, wie Phosphorothioat, ersetzt wurde, andere Bindungen als Phosphodiester-Internukleotidbindungen enthalten. Oligonukleotide mit Phosphorothioatbindungen können anhand bekannter Verfahren wie Phosphoramidit (siehe z. B. Agrawal et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7079-7083)) oder H-Phosphonat- Chemie (siehe z. B. Froehler (1986) Tetrahedron Lett. 27: 5575-5578) hergestellt werden. Die in Bergot et al. (J. Chromatog. (1992) 559: 35-42) beschriebenen Synthese-Verfahren können ebenfalls verwendet werden. Beispiele anderer immunstimulierende Reaktion-vermindernder modifizierter chemischer Gruppen schliessen Alkylphosphonate, Phosphordithioate, Alkylphosphonothioate, Phosphoramidate, 2'-O-Methylgruppen, Carbamate, Acetamidate, Carboxymethylester, Carbonate und Phosphattriester ein. Oligonukleotide mit immunstimulierende Reaktion vermindernden modifizierten Internukleotidbindungen können anhand bekannter Methoden (siehe z. B. Goodchild (1990) supra; Agrawal et al. (1988) supra; Uhlmann et al., supra und Agrawal et al. (1992) supra) hergestellt werden.
  • Andere immunstimulierende Reaktion vermindernde Modifikationen schliessen solche mit ein, die Zusätze an das Molekül an den Internukleosid-Phosphatbindungen einschliessen, wie Cholesteryl- oder Diamin-Verbindungen mit variierenden Anzahlen von Kohlenstoffresten zwischen den beiden Aminogruppen und terminale Ribose-, Desoxyribose- und Phosphatmodifikationen, die gegenüberliegende Ketten oder assoziierte Enzyme oder andere Proteine, die an das Zielgenom binden, abspalten oder quervernetzen. Beispiele solcher erfindungsgemäßer immunstimulierende Reaktionvermindernder Modifikationen schliessen Oligonukleotide mit einer modifizierten Base ein, und/oder mit einem Zucker wie Arabinose anstatt Ribose, oder ein 3',5'-substituiertes Oligonukleotid mit einem Zucker, der an einer oder beiden 3' und 5-Positionen an eine andere chemische Gruppe als an eine Hydroxyl- oder Phosphat-Gruppe (an seiner 3' oder 5'-Position) gebunden ist. Andere derartige Modifikation produzieren "gecappte" Oligonukleotide, die an ihren 3' und/oder 5' Ende(n) einen sperrigen Substituenten besitzen, der Resistenz gegen Nukleasen verleiht, oder mit einer Substitution pro Nukleotid in einem oder beiden nicht-brückenbildenden Sauerstoffmolekülen. Alle diese Modifikationen können immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung herstellen. Solche Modifikationen können sich an einigen oder allen Internukleosid-Bindungen an einem oder beiden Enden des Oligonukleotids befinden (Übersicht in Agrawal et al. (1992) supra)).
  • Die immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotide werden im erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung von pathogenen Infektionen, von Krankheiten mit genetischer Komponente, wie Krebs, von einer Erbkrankheit und ähnlichem verwendet. Immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotide werden gemäß der Erfindung als Teil einer therapeutischen Zusammensetzung in Kombination mit einem physiologisch und/oder pharmazeutisch verträglichen Träger verwendet. Die Merkmale des Trägers hängen von dem Weg der Verabreichung ab. Solch eine Zusammensetzung kann, zusätzlich zum immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotid und Träger, Verdünner, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Lösungstoffe und andere bekannte Materialien enthalten. Die therapeutische Zusammensetzung der Erfindung kann auch andere aktive Faktoren und/oder Agenzien enthalten, die die Aktivität der immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotide steigern. Es können z. B. Kombinationen von immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotiden, von denen jedes gegen eine unterschiedliche Region des Genoms des Pathogens oder gegen eine unterschiedliche Region eines überexprimierten Zielgens gerichtet ist, in einer therapeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung verwendet werden. Immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotide können innerhalb einer therapeutischen Zusammensetzung mit anderen synthetischen Oligonukleotiden gemäß der Erfindung kombiniert werden. Die therapeutische Zusammensetzung kann außerdem andere chemotherapeutische Arzneistoffe zur Behandlung der Krankheit oder des Zustandes des betroffenen Säugers enthalten. Solche zusätzlichen Faktoren und/oder Agenzien können gemäß der Erfindung in die therapeutische Zusammensetzung eingeschlossen werden, um einen synergistischen Effekt mit dem immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat- Oligonukleotid herzustellen, oder um Nebenwirkungen, die durch das immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid hervorgerufen werden, zu minimieren. Umgekehrt können immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotide in Zusammensetzungen eines bestimmten Faktors und/oder Agens, daß verwendet wird, um die Krankheit oder den Zustand des betroffenen Säugers zu behandeln, eingeschlossen werden, um die Nebenwirkungen des Faktors und/oder des Agens zu minimieren.
  • Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete therapeutische Zusammensetzung kann in Liposom-Form vorliegen, in der die immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotide der Erfindung zusätzlich zu anderen pharmazeutisch verträglichen Trägern mit amphipathischen Agenzien wie Lipiden kombiniert sind, die in aggregierter Form als Mizellen, unlöslichen Einschichtstrukturen, Flüssigkristallen oder lamellaren Schichten, die in wässriger Lösung sind, vorliegen. Geeignete Lipide für Liposomen-Zusammensetzungen schliessen Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide, Saponin, Gallensäuren und ähnliche ein. Die Herstellung solcher Liposomen-Zusammensetzungen gehört für den Fachmann zum Stand der Technik, wie beschrieben, z. B. in U. S. Patent No. 4235871; U. S. Patent No. 4501728; U. S. Patent No. 4837028; und U. S. Patent No. 4737323. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete therapeutische Zusammensetzung kann weiter andere Lipidträger, wie Lipofektamin oder Cyclodextrine (Zhao et al. (1995) Antisense Res. Dev. (in Druck)) und ähnliches enthalten, die den Transport von Oligonukleotid in die Zellen erhöhen, oder Polymere mit verzögerter Freisetzung.
  • Der hier verwendete Begriff "therapeutisch wirksame Menge" bezeichnet die Gesamtmenge jedes aktiven Bestandteils der therapeutischen Zusammensetzung oder der Methode, die ausreicht, einen sinnvollen Nutzen am Patienten zu zeigen, d. h. eine Reduzierung der mit der behandelten akuten oder chronischen Krankheit assoziierten Symptome. Wenn angewandt auf einen individuellen aktiven Bestandteil, der alleine verabreicht wird, dann bezieht sich dieser Begriff auf diesen Bestandteil alleine. Wenn angewandt auf eine Kombination, dann bezieht sich der Begriff auf kombinierte Mengen von aktiven Bestandteilen, die bei Verabreichung in Kombination, aufeinanderfolgend oder gleichzeitig, zu einem therapeutischen Effekt führen.
  • Bei Ausübung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat- Oligonukleotide der Erfindung an einen Patienten verabreicht, der von der behandelten Krankheit oder des behandelten Zustandes betroffen ist. Das immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid der Erfindung kann gemäß des Verfahrens der Erfindung entweder alleine oder in Kombination mit anderen bekannten Therapien für die behandelte Krankheit oder den Zustand verabreicht werden. Bei gemeinsamer Verabreichung mit einer oder mehreren anderen Therapien kann das immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid der Erfindung entweder gleichzeitig mit der (den) anderen Therapie(n) verabreicht werden, oder aufeinanderfolgend. Bei aufeinanderfolgender Verabreichung wird der betreuende Arzt über die geeignete Abfolge des Verabreichens des immunstimulierende Reaktionvermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotids der Erfindung in Kombination mit der anderen Therapie entscheiden.
  • Zeitweise kann es erwünscht sein, ein Gemisch verschiedener immunstimulierende Reaktion-vermindernder Phosphorothioat-Oligonukleotide zu verwenden, um verschiedene konservierte Stellen innerhalb eines gegebenen Genoms eines Pathogens oder eines Zielgens anzustreben. Solch ein Gemisch immunstimulierende Reaktion-vermindernder Phosphorothioat-Oligonukleotide kann in der Form einer therapeutischen Zusammensetzung vorliegen, die wenigstens eines, und bevorzugt zwei oder mehr immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotide in einer einzigen therapeutischen Zusammensetzung (d. h., eine Zusammensetzung umfassend ein physikalisches Gemisch von wenigstens zwei immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotiden) umfasst. Diese immunstimulierende Reaktionvermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotide können identische oder unterschiedliche Sequenzen besitzen. Wenigstens eines, bevorzugt zwei oder mehrere immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotide können gleichzeitig oder aufeinanderfolgend als Einmal-Behandlung in Form von separaten therapeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden.
  • Die Verabreichung des immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat- Oligonukleotids gemäß des Verfahrens der Erfindung kann in einer Vielzahl von herkömmlichen Arten durchgeführt werden, wie durch orale Aufnahme, Inhalation, oder kutane, subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion.
  • Falls eine therapeutisch wirksame Menge an immunstimulierende Reaktion-verminderndem Phosphorothioat-Oligonukleotid der Erfindung oral verabreicht wird, dann liegt das immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid in Form einer Tablette, Kapsel, Pulver, Lösung oder Elixir vor. Bei Verabreichung in Tablettenform kann die therapeutische Zusammensetzung der Erfindung zusätzlich einen festen Träger wie Gelatine oder ein Adjuvans enthalten. Die Tablette, Kapsel und das Pulver enthalten etwa 5 bis 95% immunstimulierende Reaktion-verminderndes Phosphorothioat-Oligonukleotid und bevorzugt etwa 25 bis 90% immunstimulierende Reaktion-verminderndes Phosphorothioat- Oligonukleotid. Bei Verabreichung in flüssiger Form kann ein flüssiger Träger wie Wasser, Petroleum, pflanzliche oder tierische Öle wie Erdnussöl, Mineralöl, Sojabohnenöl, Sesamöl, oder immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Öle zugegeben werden. Die flüssige Form der therapeutischen Zusammensetzung kann weiter physiologische Kochsalzlösung, Dextrose oder andere Zuckerlösungen oder Glykole wie Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol enthalten. Bei Verabreichung in flüssiger Form enthält die therapeutische Zusammensetzung etwa 0,5 bis 90% an Gewicht des immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotids und bevorzugt etwa 1 bis 50% immunstimulierende Reaktion-verminderndes Phosphorothioat- Oligonukleotid.
  • Bei Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat- Oligonukleotids durch intravenöse, kutane oder subkutane Injektion, liegt das immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid in Form einer pyrogenfreien, parenteral verträglichen wässrigen Lösung vor. Die Zubereitung solcher parenteral verträglicher Lösungen unter ausreichender Beachtung von pH, Isotonizität, Stabilität und ähnlichem, liegt im Können der Fachleute. Eine bevorzugte therapeutische Zusammensetzung für intravenöse, kutane oder subkutane Injektion sollte, zusätzlich zum immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotid einen isotonischen Träger wie Natriumchlorid-Injektion, Ringer's Injektion, Dextrose Injektion, Dextrose und Natriumchlorid-Injektion, laktierte Ringer's Injektion oder andere bekannte Träger enthalten. Die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete therapeutische Zusammensetzung kann auch Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Puffer, Antioxidantien oder andere bekannte Additive enthalten.
  • Die Menge an immunstimulierende Reaktion-verminderndem Phosphorothioat- Oligonukleotid, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird und die Dauer der Behandlung hängen von der Art und des Schweregrades der behandelten Krankheit, von der Art der vorhergehenden Behandlung, der sich der Patient unterzogen hat und von den idiosynkratischen Reaktionen des Patienten ab. Der behandelnde Arzt wird schließlich über die Menge an immunstimulierende Reaktion-verminderndem Phosphorothioat- Oligonukleotid, mit der der Patient zu behandeln ist und über die Dauer der Behandlung entscheiden. Anfänglich wird der behandelnde Arzt niedrige Dosen des immunstimulierende Reaktion ermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotids verabreichen und die Reaktion des Patienten beobachten. Höhere Dosen des immunstimulierende Reaktionverminderndem Phosphorothioat-Oligonukleotids können verabreicht werden, bis der optimale therapeutische Nutzen für den Patient erreicht ist. An diesem Punkt wird die Dosis nicht weiter erhöht.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung. Sie sind jedoch nicht beschränkend aufzufassen, da zum Erreichen ähnlicher Ergebnisse auch alternative Verfahren angewandt werden können.
    • BEISPIEL 1 HERSTELLUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN
  • Die Oligodesoxynukleotide-Phosphorothioate mit der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 wurden mittels eines automatisierten DNA Synthesizers (Modell 8700, Biosearch, Bedford, MA) unter Verwendung des β- Cyanoethyl-Phosphoramidit-Ansatzes im 10 uM-Maßstab synthetisiert. Um die Phosphorothioat-Bindungen zu generieren, wurde die Oxidation der nach jeder Kopplung erhaltenen Intermediat-Phosphatbindung mit 3H, 1,2-Benzothiol-3H-on-1,1-dioxid durchgeführt (Beaucage in Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties._S. Agrawal (Hrsg.) Humana Press, Totowa, NJ., Seiten 33-62, 1993). Oligodesoxynukleotide mit Phosphodiester- und Phosphorothioat-Bindungen wurden nach vorstehend genanntem Protokoll synthetisiert, wobei die Oxidation der nach jeder Kopplung erhaltenen Intermediat-Phosphatbindung zum Generieren der Phosphodiester-Bindungen mit Standard-Iod-Reagenz durchgeführt wurde (siehe z. B. Protocols for Oligonucleotides and Analogs; Synthesis and Properties. S. Agrawal (Hrsg.) Humana Press, Totowa, NJ. 1993). Das Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 1 ist ein zur gag-Region von HIV komplementäres Phosphorothioat-Oligonukleotid. Die Reste 1 bis 25 des Oligonukleotids mit der SEQ ID NO: 4 sind komplementär zum identischen Teil der gag-Region wie SEQ ID NO: 1, und die Reste 22 bis 33 von SEQ ID NO: 4 bilden eine Haarnadelschleife am 3'-Ende des Oligonukleotids. Das Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 5 ist ein zur rev-Region von HIV-1 komplementäres Phosphorothioat-Oligonukleotid, von dem bekannt ist, daß es sowohl in vitro als auch in vivo (Branda et al (1993) Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043) die Proliferation von Milzzellen stimuliert. Das Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 8 ist ein zu humanem p53 komplementäres Phosphorothioat-Oligonukleotid, von dem bekannt ist, daß es keinen Effekt auf die Zellproliferation besitzt (Branda et al., supra). Die Oligonukleotide mit der SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 sind 6-mer und 10-mer Phosphorothioat- Oligonukleotide, die palindromische Sequenzen enthalten, von denen bekannt ist, daß sie die Interferonproduktion und die Aktivität der natürlichen Killerzellen induzieren (Kuramoto et al., supra).
  • Die Synthese der chimären Oligonukleotide mit der SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 6 wurde mit vorstehend genanntem Gerät im 10uM Maßstab durchgeführt. Segmente chimärer Oligonukleotide, die Methylphoshonat-Bindungen enthalten, wurden mit Nukleosid- Methylphosphonoamidit zusammengesetzt (Glen Research, Sterling, VA), gefolgt von Oxidation mit 0.1 M Iod in Tetrahydrofuran/2,6-Lutidine/Wasser im Verhältnis 75 : 25 : 0,25. Das Segment des chimären Oligonukleotids, das die Phosphorothioatbindung enthält, wurde anhand der vorstehend für das Oligodesoxynukleotid-Phosphorothioat beschriebenen Methode zusammengesetzt. Die Entschützung des chimären Oligonukleotids wurde in zwei Schritten durchgeführt. Zuerst wurde das CPG-gebundene chimäre Oligonukleotid mit konzentriertem Ammoniumhydroxid für 1 h bei Raumtemperatur behandelt, der Überstand entfernt und verdampft. Es wurde ein blaßgelber Rest erhalten. Der getrocknete Rest wurde dann mit einem Gemisch von Ethylendiamin : Ethanol (1 : 1 l, v/v) 6 Stunden behandelt und unter vermindertem Druck erneut getrocknet. Die chimären Oligonukleotide mit der SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 6 haben diesselben Sequenzen und Längen wie SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 5, mit Austauschen von 4 Methylphosphonatbindungen an jedem Ende des chimären Oligonukleotids.
  • Die Synthese der Hybrid-Oligonukleotide mit der SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 7 wurde mit vorstehend genanntem Gerät im 10uM Maßstab durchgeführt. Das Segment, das 2'-O- Methylribonukleotid enthält, wurde unter Verwendung von 2'-O-Methylribonukleosid-β- Cyanoethylphosphoramidit synthetisiert, gefolgt von Oxidation durch 3H, 1,2-Benzodithiol- 3H-on-1,1-dioxid (Beaucage, supra). Das Segment, das Phosphorothioatbindungen enthält, wurde nach derselben Methode, die vorstehend für Oligodesoxynukleotide beschrieben wurde, synthetisiert. Das Hybrid-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 3 entspricht der Sequenz und Länge von SEQ ID NO: 1, mit vier 2'-O-Methylribonukleotid-Austauschen an jedem Ende des Oligonukleotids. Ähnlicherweise entspricht das Hybrid-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 7 der Sequenz und der Länge von SEQ ID NO: 5, mit vier 2'-O- Methylribonukleotid-Austauschen an jedem Ende des Oligonukleotids.
  • Entschützung (außer bei chimären Oligonukleotiden) und Aufreinigung aller Oligonukleotide wurde nach dem in Padmapriya et al. (1994) Antisense Res. Dev. 4: 185-199 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Reinheit der Oligonukleotide wurde durch Elektrophorese auf 20%igem Polyacrylamidgel mit 7M Harnstoff überprüft und enthielt mehr als 90% der erforderlichen Länge.
    • BEISPIEL 2 PROLIFERATIONS-TESTS AN MILZZELLEN
  • In vitro-Untersuchungen: Aus einer männlichen CD1 Maus (4-5 Wochen, 20-22 g, Charles River, Wilmington, MA) wurde die Milz entnommen. Einzelzellsuspensionen wurden durch sanftes Zerkleinern mit geeisten Enden von Glasscheiben hergestellt. Die Zellen wurden dann in RPMI-Vollmedium [RPMI-Medium, ergänzt mit 10% foetalem Rinderserum (FBS), 50uM 2-Mercaptoethanol (2-ME), 100 U/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 2 mM L- Glutamin] kultiviert. Für Untersuchungen mit Phosphorothioat-, chimären und Hybrid- Oligonukleotiden wurde das Serum 30 Minuten bei 56ºC und für Untersuchungen mit Oligonukleotiden, die Phosphodiester-Segmente zur Minimierung des Abbaus von Oligonukleotiden enthalten, bei 65ºC erhitzt. Die Zellen wurden dann in einer Dichte von 10&sup6; Zellen/ml in einem Endvolumen von 100 ul in 96-Lochplatten plattiert. Zur Kontrolle der Zellproliferation wurden drei Mitogene (10 ug/ml) verwendet: Concanavalin A (Con A), ein für T-Zellen spezifisches Mitogen; Kermesbeere-Mitogen (PWM), ein für T- und B-Lymphozyten spezifisches Mitogen; und Lipopolysaccharid (LPS), das spezifisch für B-Lymphozyten ist.
  • Oligonukleotide oder Mitogene wurden in 10 ul TE Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) den Zellen zugegeben. Die Zellen wurden dann bei 37ºC kultiviert. Nach 44 Stunden wurde 1 uCl ³H-Thymidin (Amersham, Arlington Heights, IL) in 20 ul RPMI-Medium zur Kultur zugegeben und die Zellen für weitere 4 Stunden Puls-markiert. Die Zellen wurden mit einem automatischen Zellernter (Skatron, Sterling, VA) geerntet und die Filter mit einem Szintillationszähler gezählt.
  • Fig. 1 zeigt, daß das rev Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ NO: 5 und die Palindrom-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotide mit der SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 die Proliferation muriner Splenozyten stark stimulierten. Das gag Phosphorothioat- Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 1 induzierte zu einem geringeren Grad ebenfalls die Stimulation der Lymphozytenproliferation. Das p53 Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 8 induzierte bei keiner der untersuchten Konzentrationen eine signifikante Zellproliferation.
  • Fig. 2 zeigt, das das chimäre gag Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 2 und das Hybrid-gag Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 3 bei keiner der untersuchten Konzentrationen signifikante Zellproliferation induzierten. Im Gegensatz dazu, induzierte das Haarnadelschleifen-gag Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 4) einen ähnlichen Spiegel an Zellproliferation wie das Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 1. Ähnlicherweise zeigt Fig. 3, das das chimäre rev Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 6 und das Hybrid-rev Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 7, verglichen mit dem rev Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 5, signifikant reduzierte Zellproliferation zeigten.
  • Verschiedene Anzahlen von Phosphodiester-Bindungen wurden auch in verschiedene Positionen des gag Phosphorothioat-Oligonukleotids mit der SEQ ID NO: 1 eingebracht. Solche Modifikationen erniedrigten signifikant die Zellproliferation, verglichen mit dem Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 1. Das gag Phosphorothioat- Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 1 wurde auch entweder am 5'-Ende oder am 3'-Ende verkürzt und auf in vitro Proliferation von murinen Splenozyten getestet. Bei Längenverkürzung des Phosphorothioat-Oligonukleotid vom 5'-Ende war die Zellstimulation längenabhängig: kürzere Oligonukleotide führten zu geringerer Stimulation. Überraschenderweise zeigten bei Längenverkürzung des Oligonukleotids vom 3'-Ende alle Längen des Oligonukleotids ungefähr gleiche Spiegel an Zellproliferation wie das 25-mer gag Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 1. Dies zeigt an, daß die Stimulation von murinen Splenozyten durch dieses Oligonukleotid nicht längen-, sondern eher sequenz- oder strukturabhängig ist.
    • BEISPIEL 3 VERMINDERUNG VON T-ZELLEN
  • Aus einer CD1 Maus wurde eine Milz entnommen. Einzelzellsuspensionen wurden hergestellt und in RPMI-Vollmedium in einer Dichte von 10&sup7; Zellen/ml in einem Volumen von 1 ml resuspendiert. Zellen wurden mit einem für T-Zellen spezifischen monoklonalen Antikörper, Ratte-anti-Maus Thy 1.2 (1 : 100) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) bei 4ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen, in RPMI-Medium resuspendiert und mit Low-Tox-M-Kaninchen-Komplement (1 : 100) (Cedarlane, Ontario, Canada) bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Nach Passage durch Lymphocyte M (Cedarlane, Ontario, Canada) zur Entfernung zerstörter T-Zellen wurden die Zellen gründlich gewaschen, in RPMI- Vollmedium resuspendiert und Zellproliferationsstudien wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
  • Das gag Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 1 induzierte sowohl in An- als auch in Abwesenheit von T-Zellen Zellproliferation. Dies zeigt, das die beobachtete Stimulation unabhängig von T-Zellen ist.
    • BEISPIEL 4 ANTIKÖRPER-BILDUNGS-ASSAYS
  • In vitro-Untersuchungen: Murine Splenozyten (10&sup6; Zellen/ml) wurden mit Oligonukleotiden oder Medium 9 Tage lang in 1 ml-Kulturen kultiviert Zellkulturüberstände wurden dann gesammelt und mit einem Standard-ELISA-Assay auf IgG und IgM-Spiegel hin getestet. ELISA-Platten (96 Vertiefungen) wurden mit Ziege-anti-Maus IgG oder IgM (5 ug/ml), verdünnt in Phosphat-gepufferter Saline, ergänzt mit 0.05% Natriumazid (pH 9.6), über Nacht bei 4ºC beschichtet, dreimal mit PBS-T-Puffer (Phosphat-gepufferte Saline, ergänzt mit 0.05% Tween 20 und 0.25% BSA) gewaschen und bei 37ºC für 2 Stunden mit Zellkulturüberständen inkubiert. Ein Standard von Maus-IgG und IgM (1 mg/ml) wurde mit PBS-T-Puffer verdünnt, um eine Standardkurve zwischen 0 und 800 ng/ml bereitzustellen. Die Platten wurden dreimal mit PBS-T-Puffer gewaschen und mit einem Ziege-anti-Maus IgG, gekoppelt an Alkalische Phosphatase, verdünnt 1 : 1000 mit PBS-T-Puffer bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Nach drei Waschschritten mit PBS-T-Puffer wurde Phosphatase- Substrat (p-Nitrophenylphosphat 1 mg/ml) in Diethanolamin (75 ul) den Platten zugegeben, die für 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten wurden. Die Farbreaktion wurde durch Zugabe von 25 ul 0.5M Natriumhydroxid gestoppt. Die optische Dichte (405nm) wurde mit dem Lesegerät Ceres 900 HDI (Bio-Tek Instruments, Inc.) gemessen. IgG- und IgM-Spiegel wurden basierend auf der Standardkurve berechnet. Die Experimente wurden im Vierfach- Ansatz durchgeführt.
  • Fig. 4A und 4B zeigen, das die Antikörperbildung durch das gag Phosphorothioat- Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 1 und durch das Haarnadelschleifen-gag Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 4 in einer dosisabhängigen Weise induziert wurde. Fig. 4A und 4B zeigen, daß die Stimulierung der Antikörperbildung durch das chimäre gag Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 2 und das Hybrid-gag- Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 3 signifikant niedriger war.
  • In vivo-Studien: In dieser Studie wurden männliche CD1 Mäuse (4-5 Wochen, 20-22 g, Charles River, Wilmington, MA) verwendet. Die Tiere wurden mit der herkömmlichen Diät und Wasser ad libitum gefüttert und in der Tierhaltung der University of Massachusetts, Medical Center (Worcester, MA) gehalten. Die Tiere erhielten intraperitoneale Injektionen von 1 mg Oligonukleotid in 0,25 ml PBS. Für jedes Oligonukleotid wurden 3 Tiere verwendet. Mäuse wurden 48 Stunden später getötet, die Milz entfernt, Einzelzellkulturen präpariert und bei einer Dichte von 10&sup6; Zellen/ml in Kultur genommen. Nach 24 Stunden in Kultur, wurden die Überstände geerntet und wie vorstehend beschrieben auf IgG und IgM untersucht. Die Experimente wurden im Dreifach-Ansatz durchgeführt.
  • Das gag Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 1 und das Haarnadelschleifen- oder selbst-hybridisierende gag Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 4 induzierten einen etwa 15%igen Anstieg in der Milzgröße, verglichen mit Mäusen, denen nur der Träger (PBS) injiziert wurde, während die Milzen von Tieren, die mit dem rev Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 5 behandelt wurden, in der Größe verdoppelt waren (100% Anstieg). Im Gegensatz dazu induzierten die chimären Phosphorothioat-Oligonukleotide mit der SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 6 und die Hybrid- Phosphorothioat-Oligonukleotide mit der SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 7 keinen signifikanten Anstieg des Milzgewichtes. Bei Messung der Immunglobulinproduktion der Milzzellen zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Bildung von IgG und IgM bei Mäusen, denen das rev Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 5 (Fig. 5A und 5B) injiziert wurde. Das chimäre rev Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 6 und das Hybrid-rev Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 7 minimierten signifikant den Antikörper-Induktionseffekt, der mit dem rev Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 5 beobachtet wurde.
    • BEISPIEL 5 ZELLZYKLUS-ANALYSE
  • Zur Zellzyklusanalyse wurden die Zellen 4 Stunden kultiviert und dann mit FACS Puffer (1x Hanks's balancierte Salzlösung (BHSS), ergänzt mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA) und 0.1% Natriumazid) gewaschen. Die Zellen wurden mit 70%igem kaltem Alkohol fixiert und dann für 30 Minuten auf Eis gestellt. Nach der Fixierung wurden die Zellen in 200 ul PBS resuspendiert und mit 50 ul RNase (10 mg/ml, DNase-frei) bei 37ºC für 30 Minuten behandelt. Vor der Flußzytometrie-Analyse wurde den Zellen Propidium-Iodid (50 ug/ml) zugegeben. Die flußzytometrischen Daten von 10000 lebenden Zellen wurden in einem Histogramm auf einem Epics XL Fluß-Zytometer (Coulter, Hialeah, FL) erhalten. Die Daten wurden mittels Epics XL, Version 1.5 Software und Multicycle Software (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA) nach Beschränkung auf lebende Zellen durch Vorwärts-Streuung gegen Seiten-Streuung und Ausschluß von Dubletten analysiert. Die Experimente wurden im Dreifach-Ansatz durchgeführt.
  • Die Ergebnisse der Zellzyklus-Analyse sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt. Die Ergebnisse sind als Prozentanteil der Zellen ± der Standardabweichung eines Vierfach- Experimentes dargestellt. TABELLE 1 TABELLE 2
  • Die Zellzyklus-Analysen zeigen, das nach Färbung der fixierten Milzzellen mit Propidiumlodid, der Prozentsatz an Zellen in der S/G2 Phase von Mäusen, die mit dem gag Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 1 und mit dem Haarnadelschleifen-gag Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 4 behandelt wurden, verglichen mit unbehandelten Mäusen, um etwa 13% anstieg. Das rev Phosphorothioat-Oligonukleotid mit der SEQ ID NO: 5 induzierte, verglichen mit dem Träger alleine, einen etwa 30%igen Anstieg im Prozentsatz an Zellen in der S/G2-Phase des Zellzyklus. Die chimären Phosphorothioat-Oligonukleotide mit der SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 6 und die Hybrid- Phosphorothioat-Oligonukleotide mit der SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 7 zeigten keinen signifikanten Anstieg an zyklierenden Zellen. Dies bestätigt die in vitro beobachteten Ergebnisse.
  • Die Fachleute werden mit Routine-Versuchen zahlreiche Äquivalente zu den spezifischen Substanzen und Verfahren, die hier beschrieben sind, erkennen. Es wird angesehen, daß solche Äquivalente innerhalb des Umfangs dieser Erfindung liegen und durch die Ansprüche abgedeckt sind.
    • SEQUENZPROTOKOLL
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
  • (i) ANMELDER: Hybridon, Inc.
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Verfahren zur Modulierung von Genexpression mit verminderter immunstimulierender Reaktion
  • (iii) Anzahl der Sequenzen: 10
  • (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
  • (A) ADRESSAT: Ann-Louise Kerner, Ph. D., Lappin & Kusmer LLP
  • (B) STRASSE: 200 State Street
  • (C) STADT: Boston
  • (D) STATE: MA
  • (E) LAND: USA
  • (F) ZIP: 02109
  • (v) COMPUTER-LESBARE-FASSUNG:
  • (A) DATENTRÄGER: Diskette
  • (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30
  • (iv) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
  • (A) ANMELDENUMMER:
  • (B) ANMELDETAG:
  • (C) KLASSIFIKATION:
  • (viii) ANWALTSDATEN
  • (A) NAME: McDaniels, Patricia A.
  • (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 33,194
  • (C) AKTENZEICHEN: HYZ-043PCT
  • (ix) TELEKOMMUNIKATIQNSINFORMATION
  • (A) TELEFON: 617-330-1300
  • (B) TELEFAX: 617-330-1311
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1
  • (i) SEQUENZMERKMALE
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGTYP: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
  • (A) BESCHREIBUNG:/ = "Phosphorothioat-gebundene Desoxyribonukleinsäure"
  • (iv)ANTISENSE: ja
  • (vi) URSPRUNG:
  • (A) ORGANISMUS: Humaner Immundefizienzvirus Typ1 gag-Gen
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 1..25
  • (D) WEITERE INFORMATION:/Produkt = "Phosphorothiatbindung"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1
  • CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT 25
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2
  • (i) SEQUENZMERKMALE
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGTYP: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
  • (A) BESCHREIBUNG:/ = "chimäre Methylphosphonat-/Phosphorothioat gebundene Desoxyribonukleinsäure"
  • (iv) ANTISENSE: ja
  • (vi) URSPRUNG:
  • (A) ORGANISMUS: Humaner Immundefizienzvirus Typ1 gag-Gen
  • (ix) MERKMAL
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 1..5
  • (D) WEITERE INFORMATION:/Produkt = "Methylphosphonatbindung"
  • (ix) MERKMAL
  • (A) NAMEIMERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 6..20
  • (D) WEITERE INFORMATION:/Produkt = "Phosphorothioatbindung"
  • (ix) MERKMAL
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 21..25
  • (D) WEITERE INFORMATION: 1 Produkt = "Methylphosphonatbindung"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2
  • CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT 25
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3
  • (i) SEQUENZMERKMALE
  • (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGTYP: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
  • (A) BESCHREIBUNG:/ = "Hybrid-Phosphorothioat gebundene Ribonukleinsäure/Desoxyribonukleinsäure"
  • (iv) ANTISENSE: ja
  • (vi) URSPRUNG:
  • (A) ORGANISMUS: Humaner Immundefizienzvirus Typ1 gag-Gen
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3
  • CUCUCGCACC CATCTCTCTC CUUCU 25
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 4
  • (i) SEQUENZMERKMALE
  • (A) LÄNGE: 33 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGTYP: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: Doppelstrang
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
  • (A) BESCHREIBUNG:/ = "Haarnadelschleifen-Phosphorothioat gebundene Desoxyribonukleinsäure"
  • (iv) ANTISENSE: ja
  • (vi) URSPRUNG:
  • A) ORGANISMUS: Humaner Immundefizienzvirus Typ1 gag-Gen
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: Haarnadelschleife
  • (B) POSITION: 22..33
  • (ix) MERKMAL
  • (A) NAME: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 1..33
  • (D) WEITERE INFORMATION: I Produkt = "Phosphorothiatbindung"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4
  • CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCTGGAGA GAG 33
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 5
  • (i) SEQUENZMERKMALE
  • (A) LÄNGE: 27 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGTYP: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
  • (A) BESCHREIBUNG:/ = "Phosphorothioat-gebundene Desoxyribonukleinsäure"
  • (iv) ANTISENSE: ja
  • (vi) URSPRUNG:
  • (A) ORGANISMUS: Humaner Immundefizienzvirus Typ1 rev-Gen
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 1..27
  • (D) WEITERE INFORMATION: /Produkt = "Phosphorothiatbindung"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5
  • TCGTCGCTGT CTCCGCTTCT TCTTGCC 27
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6
  • (i) SEQUENZMERKMALE
  • (A) LÄNGE: 27 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGTYP: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
  • (A) BESCHREIBUNG:/ = "chimäre MethylphosphonatlPhosphorothioat-gebundene Desoxyribonukleinsäure"
  • (iv) ANTISENSE: ja
  • (vi) URSPRUNG:
  • (A) ORGANISMUS: Humaner Immundefizienzvirus Typ1 rev-Gen
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 1..5
  • (D) WEITERE INFORMATION:/Produkt = "Methylphosphonatbindung"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 6..22
  • (D) WEITERE INFORMATION: I Produkt = "Phosphorothiatbindung"
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 23..27
  • (D) WEITERE INFORMATION:/ Produkt = "Methylphosphonatbindung"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6
  • TCGTCGCTGT CTCCGCTTCT TCTTGCC 27
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 7
  • (i) SEQUENZMERKMALE
  • (A) LÄNGE: 27 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGTYP: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
  • (A) BESCHREIBUNG :/ = "Hybrid-Phosphorothioat-gebundene Ribonukleinsäure/Desoxyribonukleinsäure"
  • (iv) ANTISENSE: ja
  • (vi) URSPRUNG:
  • (A) ORGANISMUS: Humaner Immundefizienzvirus Typ1 rev-Gen
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 1..27
  • (D) WEITERE INFORMATION:/Produkt = "Phosphorothiatbindung"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7
  • UCGUCGCTGT CTCCGCTTCT TCTUGCC 27
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 8
  • (i) SEQUENZMERKMALE
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGTYP: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
  • (A) BESCHREIBUNG/ = "Phosphorothioat-gebundene Desoxyribonukleinsäure"
  • (iv) ANTISENSE: ja
  • (vi) URSPRUNG:
  • (A) ORGANISMUS: humanes p53
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 1..20
  • (D) WEITERE INFORMATION:/Produkt = "Phosphorothiatbindung"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8
  • CCCTGCTCCC CCCTGGCTCC 20
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 9
  • (i) SEQUENZMERKMALE
  • (A) LÄNGE: 6 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGTYP: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
  • (A) BESCHREIBUNG:/ = "Phosphorothioat-gebundene Desoxyribonukleinsäure"
  • (iv) ANTISENSE: ja
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 1.6
  • (D) WEITERE INFORMATION:/Produkt = "Phosphorothiatbindung"
  • (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9
  • CGCGCG 6
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 10
  • (i) SEQUENZMERKMALE
  • (A) LÄNGE: 10 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGTYP: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
  • (A) BESCHREIBUNG:/ "Phosphorothioat-gebundene Desoxyribonukleinsäure"
  • (iv) ANTISENSE: ja
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/MERKMALSSCHLÜSSEL: misc. MERKMAL
  • (B) POSITION: 1..10
  • (D) WEITERE INFORMATION: I Produkt = "Phosphorothiatbindung"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10
  • GACGATCGTC 10

Claims (20)

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines Phosphorothioat-Oligonukleotids mit einer verminderten immunstimulierenden Reaktion in einem Säuger, umfassend:
a. Modifizieren von wenigstens einer chemischen Struktur in dem Phosphorothioat-Oligonukleotid zur Herstellung eines eine immunstimulierende Reaktion vermindernden Phosphorothioat-Oligonukleotids.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das die immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid eine modifizierte 3'-terminale Struktur besitzt.
3. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die modifizierte 3'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einer Methylphosphonat-Internukleotidbindung gegen wenigstens eine Phosphorothioat-Internukleotidbindung des Oligonukleotids umfaßt.
4. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die modifizierte 3'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einem Ribonukleotid gegen wenigstens ein Desoxyribonukleotid umfaßt.
5. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die modifizierte 3'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einer Internukleotidbindung umfaßt zur Unterbrechung einer Sequenz, die eine immunstimulierende Reaktion hervorruft.
6. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das die immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid eine modifizierte 5'-terminale Struktur besitzt.
7. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die modifizierte 5'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einer Methylphosphonat-Internukleotidbindung gegen wenigstens eine Phosphorothioat-Internukleotidbindung des Oligonukleotids umfaßt.
8. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die modifizierte 5'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einem Ribonukleotid gegen wenigstens ein Desoxyribonukleotid umfaßt.
9. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die modifizierte 5'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einem Nukleotid gegen ein anderes verschiedenes Nukleotid umfaßt zur Unterbrechung einer Nukleotidsequenz, die eine immunstimulierende Reaktion hervorruft.
10. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das die immunstimulierende Reaktion vermindernde Phosphorothioat-Oligonukleotid eine modifizierte 3'-terminale Struktur und eine modifizierte 5'-terminale Struktur besitzt.
11. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die modifizierte 3'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einer Methylphosphonat-Internukleotidbindung gegen wenigstens eine Phosphorothioat-Internukleotidbindung des Oligonukleotids umfaßt.
12. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die modifizierte 3'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einem Ribonukleotid gegen wenigstens ein Desoxyribonukleotid umfaßt.
13. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die modifizierte 3'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einem Nukleotid gegen ein anderes verschiedenes Nukleotid umfaßt zur Unterbrechung einer Nukleotidsequenz, die eine immunstimulierende Reaktion hervorruft.
14. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die modifizierte 5'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einer Methylphosphonat-Internukleotidbindung gegen wenigstens eine Phosphorothioat-Internukleotidbindung des Oligonukleotids umfaßt.
15. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die modifizierte 5'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einem Ribonukleotid gegen wenigstens ein Desoxyribonukleotid umfaßt.
16. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die modifizierte 5'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einem Nukleotid gegen ein anderes verschiedenes Nukleotid umfaßt zur Unterbrechung einer Nukleotidsequenz, die eine immunstimulierende Reaktion hervorruft.
17. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die modifizierte 3'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einer Methylphosphonat-Internukleotidbindung gegen wenigstens eine Phosphorothioat-Internukleotidbindung des Oligonukleotids umfaßt und die modifizierte 5'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einer Methylphosphonat-Internukleotidbindung gegen wenigstens eine Phosphorothioat-Internukleotidbindung des Oligonukleotids umfaßt.
18. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die modifizierte 3'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einem Ribonukleotid gegen wenigstens ein Desoxyribonukleotid umfaßt und die modifizierte 5'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einem Ribonukleotid gegen wenigstens ein Desoxyribonukleotid umfaßt.
19. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die modifizierte 3'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einem Nukleotid umfaßt zur Unterbrechung einer Nukleotidsequenz, die eine immunstimulierende Reaktion hervorruft und die modifizierte 5'-terminale Struktur einen Austausch von wenigstens einem Nukleotid umfaßt zur Unterbrechung einer Nukleotidsequenz, die eine immunstimulierende Reaktion hervorruft.
20. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein die immunstimulierende Reaktion verminderndes Phosphorothioat-Oligonukleotid mit einer Struktur gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19.
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