PT850300E

PT850300E - Metodo de modulacao da expressao de genes com resposta imunoestimulante reduzida

Info

Publication number: PT850300E
Application number: PT96923709T
Authority: PT
Inventors: Qiuyan Zhao; Sudhir Agrawal; Jamal Temsamani
Original assignee: Hybridon Inc
Priority date: 1995-08-04
Filing date: 1996-07-09
Publication date: 2000-04-28
Also published as: DE69604686T2; CA2229171C; ES2141516T3; ATE185597T1; US5968909A; WO1997006253A1; CA2229171A1; JPH11511014A; DE69604686D1; EP0850300B1; AU6455996A; GR3032357T3; EP0850300A1

Description

¢. 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ

DESCRICÃO "Método de modulação da expressão de genes com resposta imunoestimulante reduzida" A presente invenção refere-se ao campo de fármacos anti-sentido e mais especificamente a métodos para a redução da resposta imunoestimulante que pode ser induzida em indivíduos tratados com estes fármacos anti-sentido.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A tecnologia dos oligonucleótidos anti-sentido representa uma excitante nova terapia para muitas doenças, incluindo infecções patogénicas, cancro e condições hereditárias. O campo progrediu extremamente ao longo da última década e correntemente estão em progresso ou propostos numerosos ensaios clínicos. Os oligonucleótidos anti-sentido actuam ligando-se a um ácido nucleico alvo por emparelhamento de bases de Hoogsteen ou de Watson-Crick. Os oligonucleótidos anti-sentido podem ser concebidos de modo a terem como alvo e a inibirem qualquer gene individual no interior do genoma de um organismo. Por exemplo, os oligonucleótidos de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:5 são oligonucleótido-fosforotioatos complementares às regiões gag e rev de HIV-1 que inibem a replicação do HIV-1, e o oligonucleótido-fosforotioato de SEQ ID NO:8 liga-se ao oncogene humano p53. A abordagem anti-sentido é correntemente a única estratégia conhecida que tem um amplo potencial para uma modulação precisa e eficaz da expressão de genes específicos numa situação de doença.

Contudo, alguns oligonucleótidos anti-sentido contendo ligações fosforotioato exibem uma resposta imunoestimulante, provocando a proliferação de células B e/ou uma resposta de anticorpos tanto in vitro como in vivo. Esta resposta imunoestimulante não é característica de todos os oligonucleótidos anti-sentido contendo ligações fosforotioato. Por exemplo, sabe-se que o oligonucleótido-fosforotioato de SEQ ID NO:8 não induz um efeito imunoestimulante.

Os efeitos imunoestimulantes dos oligonucleótido-fosforotioatos parecem ser dependentes de sequências particulares dentro do oligonucleótido mas V j» , 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ $ 2

permanecem independentes do facto de o oligonucleótido ser anti-sentido, com sentido ou aleatório relativamente ao gene alvo respectivo. Alguns oligonucleótido-fosforotioatos induzem apenas proliferação celular e outros oligonucleótido-fosforotioatos não produzem qualquer efeito imunoestimulante. Mclntyre et al. (1993) Antisense Res. Dev. 3:309-322 descrevem que certos oligonucleótidos podem causar esplenomegalia pronunciada em ratinhos nus atímicos. Messina et al., (1993) Cell Immunol. 147:148-157; e Pisetsky et al. (1994) Life Sciences 54:101-107 descrevem que o ADN, bem como oligonucleótidos e polinucleótidos sintéticos estruturalmente relacionados estimulam linfócitos, mas o mecanismo desta estimulação não é ainda completamente compreendido. As células B são usualmente activadas a partir do estado de repouso por ligação de antigénios à superfície da imunoglobulina. Nos ratinhos a activação pode também ser modulada por mediadores fisiológicos tais como interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), γ-interferão e mitogénios não fisiológicos, tais como lipopolissacárido (LPS), Concanavalina A (Con A), e mitogénio de erva-do-cancro (PWM).

Determinadas estruturas e motivos de sequências de oligonucleótidos podem desempenhar papéis importantes no processo que causa estimulação de células de murídeo. Kuramoto et al. (1992) Jpn. J. Câncer Res. 83:1128-1131 descrevem que a presença de sequências palindrómicas particulares incluindo o ou os motivos 5'-CG-3' é um determinante crítico nos oligonucleótidos relativamente a indução de activação de células assassinas naturais e produção de interferão. Krieg et al. (1995) Nature 374:546-549 descrevem que a activação óptima de células B requer um motivo de ADN em que um dinucleótido CpG não metilado esteja flanqueado por duas purinas em 5' e duas pirimidinas em 3'.

Devido à continuada necessidade de tratamentos específicos para doenças e condições hereditárias, e ao elevado nível de especificidade proporcionado pela utilização de fármacos anti-sentido capazes de modular os níveis de expressão de genes alvo, existe a necessidade de reduzir a resposta imunoestimulante induzida por certos oligonucleótido-fosforotioatos. 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores identificaram um método para a redução dos efeitos imunoestimulantes de certos oligonucleótido-fosforotioatos através da alteração de sequências ou estruturas nesses oligonucleótidos, por exemplo, introduzindo ligações que não de fosforotioato no oligonucleótido, alterando o grau de substituição com ligações internucleótidos de fosforotioato no oligonucleótido, substituindo alguns dos desoxirribonucleótidos por ribonucleótidos no esqueleto de açúcares do oligonucleótido-fosforotioato e removendo nucleótidos imunogénicos do oligonucleótido-fosforotioato. De acordo com a invenção, estas alterações de sequências ou estruturas no interior do oligonucleótido-fosforotioato são definidas como "modificações redutoras da resposta imunoestimulante".

Numa concretização, a invenção proporciona um método para a redução de uma resposta imunoestimulante de um mamífero a um oligonucleótido-fosforotioato que compreende os passos de modificação de pelo menos uma estrutura química no oligonucleótido-fosforotioato para produzir um oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante; administração ao mamífero de uma formulação terapêutica contendo o oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante; e monitorização da resposta imunitária do mamífero.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os vários aspectos da invenção podem ser mais bem compreendidos a partir da descrição que se segue, quando lida em conjunto com os desenhos anexos. A figura 1 mostra o efeito de vários oligonucleótido-fosforotioatos sobre a proliferação de esplenócitos de murídeo in v/tro. A figura 2 mostra o efeito de diferentes oligonucleótidos gag de HIV-1 modificados sobre a proliferação de esplenócitos de murídeo. A figura 3 mostra o efeito de diferentes oligonucleótidos rev de HIV-1 modificados sobre a proliferação de esplenócitos de murídeo. 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 4

A figura 4Α mostra ο efeito dos diferentes oligonucleótidos gag de HIV-1 modificados sobre a produção de IgG por esplenócitos de murídeo. A figura 4B mostra o efeito dos diferentes oligonucleótidos gag de HIV-1 modificados sobre a produção de IgM por esplenócitos de murídeo. A figura 5A mostra o efeito dos diferentes oligonucleótidos rev de HIV-1 modificados sobre a produção de IgG em ratinhos. A figura 5B mostra o efeito dos diferentes oligonucleótidos rev de HIV-1 modificados sobre a produção de IgM em ratinhos.

DESCRICÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

As patentes e a literatura específica aqui referidas estabelecem o conhecimento que está disponível aos peritos na arte. A patente dos E.U. concedida e os pedidos aceites aqui citados são incorporados por referência.

De acordo com o método da invenção, uma resposta imunoestimulante induzida por um oligonucleótido-fosforotioato é modificada através da introdução de uma modificação redutora da resposta imunoestimulante na sequência ou na estrutura do oligonucleótido. No primeiro passo do método da invenção, é modificada pelo menos uma estrutura química no oligonucleótido-fosforotioato de forma a produzir um oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante. No segundo passo do método da invenção, é administrada ao mamífero uma formulação terapêutica contendo o oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante. No terceiro passo do método da invenção monitoriza-se a resposta imunitária do mamífero.

De acordo com a invenção, o oligonucleótido-fosforotioato é complementar à região do gene alvo e é utilizado para modular a expressão do gene alvo. Na forma não modificada, o oligonucleótido-fosforotioato induz uma resposta imunoestimulante. Os peritos na arte podem determinar se um oligonucleótido-fosforotioato induz uma resposta imunoestimulante num mamífero utilizando métodos tais como os apresentados nos exemplos 2 a 5

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ que se seguem, ou utilizando outros métodos conhecidos. Por exemplo, quaisquer dos métodos apresentados em Mclntyre, et a!., supra, Messina et a!., supra, Pisetsky et af., supra, Kuramoto et a!., supra ou Krieg et aL, supra, podem ser utilizados para determinar se um oligonucleótido-fosforotioato induz uma resposta imunoestimulante. Em adição, as sequências imunoestimulantes, por exemplo, as sequências identificadas em Kuramoto, et aL, supra, ou em Krieg et aL, supra, podem ser identificadas por inspecção da sequência do oligonucleótido-fosforotioato.

Qualquer oligonucleótido-fosforotioato que induz uma resposta imunoestimulante pode ser modificado de acordo com o método da invenção. Tal como aqui utilizado, um "oligonucleótido-fosforotioato" inclui polímeros sintetizados quimicamente de cerca de cinco a cerca de 50, preferivelmente de cerca de 15a cerca de 30 . monómeros desoxirribonucleotídicos e/ou ribonucleotídicos ligados mutuamente ou ligados por pelo menos uma, e preferivelmente mais do que uma, ligação internucleótidos de fosforotioato 5' para 3', tal como estes termos são entendidos na arte.

Pode ser introduzida qualquer modificação redutora da resposta imunoestimulante na sequência ou na estrutura do oligonucleótido-fosforotioato de acordo com o método da invenção, desde que seja mantida a actividade do oligonucleótido de modulação da expressão do gene alvo. Para os fins da invenção, a actividade de modulação de genes ocorre em virtude da complementaridade do oligonucleótido-fosforotioato relativamente a uma sequência de ADN dentro do gene alvo ou em virtude da complementaridade do oligonucleótido-fosforotioato relativamente a uma sequência de ARN transcrita a partir do gene alvo. Com o termo "complementaridade" pretende-se significar que o oligonucleótido-fosforotioato e o oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante se ligam à sequência de ácido nucleico alvo sob condições fisiológicas, e.g., por emparelhamento de bases de Watson-Crick (interacção entre o oligonucleótido e o ácido nucleico em cadeia simples) ou por emparelhamento de bases de Hoogsteen (interacção entre o oligonucleótido e o ácido nucleico em cadeia dupla) ou por qualquer outro meio, incluindo, no caso de um oligonucleótido que se liga a ARN, causando formação pseudo-nós. A ligação por emparelhamento de bases de Watson-Crick e de Hoogsteen sob condições fisiológicas é medida na prática observando a interferência com a 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 6

função da sequência de ácido nucleico. Não é necessário que o oligonucleótido-fosforotioato e o correspondente oligonucleótido-fosforotioato redutor de imunogenicidade se liguem ao ácido nucleico alvo com a mesma afinidade. A actividade de modulação de genes do oligonucleótido-fosforotioato é mantida de acordo com a invenção quando o oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante é capaz de alterar em qualquer grau a actividade do gene alvo do oligonucleótido-fosforotioato. De preferência, um oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante é capaz de modular a actividade de um gene alvo quando o gene alvo é expresso a um nível de cerca de 10-90% do seu nível de expressão em estado estacionário de doença. Mais preferivelmente, um oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante é capaz de modular a actividade de um gene alvo quando o gene alvo é expresso a um nível inferior a cerca de 50% do seu nível de expressão em estado estacionário de doença. Ainda mais preferivelmente, um oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante é capaz de modular a actividade de um gene alvo quando o gene alvo não é expresso de forma detectável. O nível de expressão em estado estacionário de doença de um gene alvo pode ser determinado utilizando métodos conhecidos, por exemplo, medindo a quantidade da proteína codificada pelo gene alvo no mamífero afectado ou numa célula ou num fluido derivados do mamífero afectado. Quando o gene alvo está presente no genoma de um organismo patogénico que infecta o mamífero, o nível de expressão em estado estacionário de doença de um gene alvo pode ser determinado medindo a quantidade do organismo patogénico alojado pelo mamífero infectado ou medindo um sintoma do mamífero infectado que se correlacione com a quantidade do organismo patogénico no mamífero.

De acordo com o método da invenção, o oligonucleótido-fosforotioato pode ser modificado de forma a produzir um oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante contendo uma estrutura modificada no terminal 3', um oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante contendo uma estrutura modificada no terminal 5' ou um oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante contendo tanto uma estrutura modificada no terminal 3' como uma estrutura modificada

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ no terminal 5'. De acordo com o método da invenção, uma estrutura modificada no terminal 3' compreende uma modificação química de pelo menos um resíduo nucleótido-fosforotioato dos seis resíduos do terminal 3' do oligonucleótido. A modificação química pode ocorrer em qualquer local no resíduo nucleótido-fosforotioato. De modo semelhante, uma estrutura modificada no terminal 5' compreende uma modificação química de pelo menos um resíduo nucleótido-fosforotioato dos seis resíduos do terminal 5' do oligonucleótido. A modificação química pode ocorrer em qualquer local no resíduo nucleótido-fosforotioato.

Os oligonucleótido-fosforotioato redutores da resposta imunoestimulante no âmbito da presente invenção podem ser preparados por métodos reconhecidos na arte. Por exemplo, os nucleótidos podem ser ligados covalentemente utilizando técnicas reconhecidas na arte tais como a química do fosforamidito, do H-fosfonato, ou a química do metilfosforamidito (veja-se e.g., Goodchild (1990) Bioconjugate Chem. 2:165-187; Uhlmann et al. (1990) Chem. Rev. 90:543-584; Caruthers et al. (1987) Meth. Enzymol. 154:287-313; Patente dos E.U.A. 5 149 798) que podem ser realizadas manualmente ou através de um sintetizador automático, e depois processados (revisão em Agrawal et al. (1992) Trends Biotechnol. 10:152-158).

Os oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante utilizados no método da invenção podem também ser modificados de várias maneiras sem comprometer a sua capacidade para hibridar com o ácido nucleico alvo. Por exemplo, os oligonucleótidos podem conter outras ligações internucleótidos que não ligações fosfodiéster entre a extremidade 5' de um nucleótido e a extremidade 3' de outro nucleótido em que o nucleótido-fosfato em 5' tenha sido substituído com qualquer número de grupos químicos, tais como um fosforotioato. Os oligonucleótidos com ligações fosforotioato podem ser preparados utilizando métodos bem conhecidos no campo tais como a química do fosforamidito (veja-se, e.g., Agrawal et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85:7079-7083) ou do H-fosfonato (veja-se, e.g., Froehler (1986) Tetrahedron Lett. 27:5575-5578). Podem também utilizar-se os métodos sintéticos descritos em Bergot et al. (J. Chromatog. (1992) 559:35-42). Os exemplos de outros grupos químicos modificados redutores da resposta imunoestimulante incluem alquilfosfonatos, fosforoditioatos,

alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, 2'-0-metilos; carbamatos, acetamidato, ésteres de carboximetilo, carbonatos e triésteres de fosfato. Os oligonucleótidos com ligações internucleótidos modificadas redutoras da resposta imunoestimulante podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos (veja-se e.g., Goodchild (1990) supra; Agrawal et al. (1988) supra; Uhlmann et a!., supra; e Agrawal et ai (1992) supra).

Outras modificações redutoras da resposta imunoestimulante incluem aquelas que incluem adições à molécula nas ligações internucleótidos de fosfato, tais como compostos de colesterilo ou diamina com vários números de resíduos de carbono entre os dois grupos amino, e modificações de ribose, desoxirribose e de fosfato terminal, que clivam, ou formam ligações cruzadas com as cadeias opostas ou com enzimas associadas ou outras proteínas que se ligam ao genoma alvo. Os exemplos de tais modificações redutoras da resposta imunoestimulante dentro do âmbito da presente invenção incluem oligonucleótidos possuindo uma base e/ou açúcar modificados tal como arabinose em vez de ribose, ou um oligonucleótido substituído em 3',5' possuindo um açúcar que, numa ou em ambas as posições 3' e 5', está ligado a um grupo químico que não um grupo hidroxilo ou fosfato (na sua posição 3' ou 5'). Outra destas modificações produz oligonucleótidos com extremidades tapadas possuindo um substituinte volumoso que confere resistência à nuclease na(s) sua(s) extremidade(s) 3' e/ou 5', ou possuindo uma substituição num ou em ambos os oxigénios que não formam pontes por nucleótido, sendo todas as modificações capazes de produzir oligonucleótido-fosforotioato redutores da resposta imunoestimulante de acordo com a presente invenção. Estas modificações podem ser em algumas ou em todas as ligações internucleótidos numa ou em ambas as extremidades do oligonucleótido. (revisão em Agrawal et al. (1 992) supra)).

Os oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante são utilizados no método de acordo com a invenção para o tratamento de infecções patogénicas, para o tratamento de doenças possuindo uma componente genética tais como cancro, para o tratamento de uma condição hereditária, e semelhantes. Os oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante são utilizados de acordo com a invenção como parte de uma formulação terapêutica, em combinação com um transportador & 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 9

fisiológica e/ou farmaceuticamente aceitável. As características do transportador dependerão da via de administração. Uma formulação deste tipo pode conter, em adição ao oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante e ao transportador, diluentes, cargas, sais, tampões, estabilizantes, solubilizantes, e outros materiais bem conhecidos na arte. A formulação terapêutica de acordo com a invenção pode também conter outros factores e/ou agentes activos que aumentem a actividade dos oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante. Por exemplo, podem-se utilizar combinações de oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante, cada um dos quais dirigido a uma região diferente do genoma de um patogénio ou a uma região diferente de um gene alvo super-expresso, numa formulação terapêutica de acordo com a invenção. Os oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante podem ser combinados com outros olígonucleótidos sintéticos numa formulação terapêutica de acordo com a invenção. A formulação terapêutica pode ainda conter outras drogas quimioterapêuticas para o tratamento da doença ou condição do mamífero afectado. Estes factores e/ou agentes adicionais podem ser incluídos na formulação terapêutica de acordo com o método da invenção de modo a produzir um efeito sinergético com o oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante, ou de modo a minimizar efeitos secundários causados pelo oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante. De modo inverso, os oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante podem ser incluídos em formulações de um factor e/ou agente particular utilizado para tratar a doença ou condição do mamífero afectado, para minimizar efeitos secundários do factor e/ou agente.

A formulação terapêutica utilizada no método de acordo com a invenção pode ser na forma de um lipossoma em que os oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante de acordo com a invenção são combinados, em adição a outros transportadores farmaceuticamente aceitáveis, com agentes anfipáticos tais como lípidos que existem na forma de agregados tais como micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos ou camadas lamelares que estão em solução aquosa. Os lípidos adequados para a formulação lipossómica incluem, sem limitação, monoglicéridos, diglicéridos, sulfatidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares e semelhantes. A

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 10 preparação destas formulações lipossómicas está ao nível dos peritos na arte, tal como descrito, por exemplo, na Patente dos E.U.A. No. 4 235 871; na Patente dos E.U.A. No. 4 501 728; na Patente dos E.U.A. No. 4 837 028; e na Patente dos E.U.A. No. 4 737 323. A formulação terapêutica utilizada no método de acordo com a invenção pode ainda incluir outros transportadores lipídicos, tais como lipofectamina ou ciclodextrinas (Zhao et al. (1995) Antisense Res. Dev. (no prelo)) e semelhantes, que aumentam a entrega de oligonucleótidos nas células, ou tais como polímeros de libertação lenta.

Tal como - aqui utilizada, a expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade total de cada componente activo da formulação terapêutica ou do método, que é suficiente para apresentar um benefício significativo para o paciente, i.e., uma redução dos sintomas associados à doença ou condição aguda ou crónica que está a ser tratada. Quando aplicada a um ingrediente activo individual, administrado sozinho, a expressão refere-se a esse ingrediente sozinho. Quando aplicada a uma combinação, o termo refere-se a quantidades combinadas dos ingredientes activos que resultam no efeito terapêutico, quer administrados em combinação, em série ou simultaneamente.

Na prática do método da presente invenção, administra-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante de acordo com a invenção a um sujeito afectado com a doença ou condições a tratar. O oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante de acordo com a invenção pode ser administrado de acordo com o método da invenção sozinho ou em combinação com outras terapias conhecidas para a doença ou condição a tratar. Quando co-administrado com uma ou mais outras terapias, o oligonúcleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante da invenção pode ser administrado simultaneamente com o(s) outro(s) tratamento(s) ou sequencialmente. Se administrado sequencialmente, o médico assistente decidirá qual a sequência apropriada de administração do oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante da invenção em combinação com a outra terapia.

Pode ser por vezes desejável utilizar uma mistura de diferentes oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 11

possuindo como alvos diferentes locais conservados no interior de um dado genoma de um patogénio ou gene alvo. Uma mistura deste tipo de oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante pode ser na forma de uma composição terapêutica compreendendo pelo menos um, e preferivelmente, dois ou mais oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante numa única formulação terapêutica [i.e., uma composição compreendendo uma mistura física de pelo menos dois oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante). Estes oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante podem ter a mesma sequência ou sequências diferentes. Pelo menos um, preferivelmente dois ou mais oligonucleótido-fosforotioatos redutores da resposta imunoestimulante, podem ser administrados simultânea ou sequencialmente na forma de um único episódio de tratamento na forma de formulações terapêuticas separadas. A administração do oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante de acordo com o método da invenção pode ser realizada de várias maneiras convencionais, tais como ingestão oral, inalação ou injecção cutânea, subcutânea, intramuscular ou intravenosa.

Quando é administrada oralmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante de acordo com a invenção, o oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante estará na forma de um comprimido, uma cápsula, um pó, uma solução ou um elixir. Quando administrada na forma de comprimido, a formulação terapêutica da invenção pode conter adicionalmente um transportador sólido tal como uma gelatina ou um adjuvante. O comprimido, cápsula e pó contêm de cerca de 5 a 95% de oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante e preferivelmente de cerca de 25 a 90% de oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante. Quando administrado na forma líquida, pode ser adicionado um transportador líquido tal como água, petróleo, óleos de origem animal ou vegetal tais como óleo de amendoim, óleo mineral, óleo de soja, óleo de sésamo ou óleos de fosforotioato redutores da resposta imunoestimulante. A forma líquida da formulação terapêutica pode conter adicionalmente solução salina fisiológica, dextrose ou outro sacárido em solução, ou glicóis tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou 12 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ polietilenoglicol. Quando administrada na forma líquida, a formulação terapêutica contém de cerca de 0,5 a 90% em peso do oligonucléótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante e preferivelmente de cerca de 1 a 50% de oligonucléótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante.

Quando se administra uma quantidade terapeuticamente eficaz de oligonucléótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante utilizado no método de acordo com a invenção por injecção intravenosa, cutânea ou subcutânea, o oligonucléótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante estará na forma de uma solução aquosa isenta de pirogénios, parentericamente aceitável. A preparação destas soluções parentericamente aceitáveis, com as devidas considerações relativamente a pH, isotonicidade, estabilidade e semelhantes, faz parte da perícia na arte. Uma formulação terapêutica preferida para injecção intravenosa, cutânea ou subcutânea deverá conter, em adição ao oligonucléótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante, um veículo isotónico tal como cloreto de sódio para injecção, solução de Ringer para injecção, dextrose para injecção, dextrose e cloreto de sódio para injecção, solução de Ringer lactada para injecção, ou outro veículo conhecido na arte. A formulação terapêutica utilizada no método de acordo com a presente invenção pode também conter estabilizantes, conservantes, tampões, antioxidantes ou outros aditivos conhecidos dos peritos na arte. A quantidade de oligonucléótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante na formulação terapêutica utilizada no método da presente invenção e a duração do tratamento dependerão da natureza e da gravidade da condição a tratar, da natureza de tratamentos anteriores a que o paciente tenha sido submetido e das respostas idiossincráticas do paciente. Por último, o médico assistente decidirá qual a quantidade de oligonucléótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante se deverá utilizar para tratar cada paciente individual e qual a duração do tratamento. Inicialmente, o médico assistente administrará doses baixas do oligonucléótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante e observará a resposta do paciente. Podem ser administradas doses crescentes do oligonucléótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante até se obter o efeito terapêutico óptimo para o paciente e nesse ponto deixa-se de aumentar a dosagem. 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 13

Os exemplos que se seguem ilustram os modos preferidos de realizar e por em prática a presente invenção, mas não se pretende que limitem o âmbito da invenção uma vez que podem ser utilizados métodos alternativos para obter resultados semelhantes. EXEMPLO 1

PREPARAÇÃO DE OLIGONUCLEÓTIDOS

Os oligodesoxinucleótido-fosforotioatos de SEQIDNO:1, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10 foram sintetizados utilizando um sintetizador automático de ADN (Modelo 8700, Biosearch, Bedford, MA) utilizando a abordagem do fosforamidito de β-cianoetilo à escala de 10 μΜ. Para gerar as ligações fosforotioato, realizou-se a oxidação da ligação fosfato intermediária obtida após cada acoplamento utilizando 3H, 1,2-benzoditiol-3H-ona-1,1-dióxido (Beaucage em Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. S.Agrawal (ed.) Humana Press, Totowa, NJ, p. 33-62, 1993). Sintetizaram-se oligodesoxinucleótidos contendo ligações fosfodiéster e fosforotioato utilizando o mesmo protocolo que anteriormente, excepto para gerar ligações fosfodiéster, realizou-se a oxidação da ligação fosfito intermediária obtida após cada acoplamento com reagente de iodo Standard (veja-se e.g., Protocols for Oligonuc/eotides and Analogs: Synthesis and Properties. S.Agrawal (ed.) Humana Press, Totowa, NJ, 1993). O oligonucleótido de SEQ ID NO:1 é um oligonucleótido-fosforotioato complementar à região gag de HIV. Os resíduos 1 a 25 do oligonucleótido de SEQ ID NO:4 são complementares à mesma porção da região gag que a SEQ ID NO:1 e os resíduos 22 a 33 de SEQ ID N0:4 formam uma dobra na extremidade 3' do oligonucleótido. O oligonucleótido SEQ ID NO:5 é um oligonucleótido-fosforotioato complementar à região rev de HIV-1 que se sabe que estimula a proliferação de esplenócitos tanto in vitro como in vivo (Branda et ai (1993) Biochem. PharmacoL 45:2037-2043). O oligonucleótido de SEQ ID N0:8 é um oligonucleótido-fosforotioato complementar a p53 humano que sabe não ter efeito sobre a proliferação celular (Branda, et aL, supra). Os oligonucleótidos de SEQ ID NO:9 e SEQIDN0:10 são oligonucleótido-fosforotioatos 6-mero e 10-mero contendo sequências palindrómicas que se sabe que induzem a produção de interferão e a actividade

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 14 de células assassinas naturais (Kuramoto, et al., supra). A síntese dos oligonucleótidos quiméricos de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:6 foi realizada numa escala de 10μΜ utilizando o mesmo instrumento que anteriormente. Os segmentos de oligonucleótidos quiméricos contendo ligações metilfosfonato são montados utilizando nucleósido-metilfosfonamiditos (Glen Research, Sterling, VA) seguidos por oxidação com iodo 0,1 M em tetra-hidrofurano/2,6-Lutidina/água, 75:25:0,25). O segmento de oligonucleótido quimérico contendo a ligação fosforotioato foi montado utilizando o mesmo procedimento que se descreveu anteriormente para o oligodesoxinucleótido-fosforotioato. A desprotecção do oligonucleótido quimérico foi realizada em dois passos. Primeiro, tratou-se o oligonucleótido quimérico ligado a CPG com hidróxido de amónio concentrado durante 1 hora à temperatura ambiente, removeu-se o sobrenadante e evaporou-se para obter um resíduo amarelo pálido. Tratou-se então o resíduo seco com uma mistura de etilenodiamina:etanol (1:1 I, v/v) durante 6 horas e secou-se novamente sob pressão reduzida. Os oligonucleótidos quiméricos de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:6 têm as mesmas sequências e comprimentos que SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:5, respectivamente, com substituições de quatro ligações metilfosfonato em cada extremidade do oligonucleótido quimérico.

Os oligonucleótidos híbridos de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:7 foram sintetizados numa escala de 10μΜ utilizando o mesmo instrumento que anteriormente. O segmento contendo 2'-0-metilribonucleótido foi sintetizado utilizando β-cianoetilfosforamidito de 2'-0-metilribonucleósido seguido de oxidação com 3H, 1,2-benzoditiol-3H-ona-1,1-dióxido (Beaucage, supra). O segmento contendo ligações fosforotioato foram sintetizados pelo mesmo procedimento que se descreveu anteriormente para o oligodesoxinucleótido-fosforotioato. O oligonucleótido híbrido de SEQ ID NO:3 corresponde à sequência e ao comprimento de SEQIDNO:1, com quatro substituições com 2'-0-metilribonucleótidos em cada extremidade do oligonucleótido. De modo semelhante, o oligonucleótido híbrido de SEQ ID NO:7 corresponde à sequência e ao comprimento de SEQ ID NO:5, com quatro substituições com 2'-0-metilribonucleótidos em cada extremidade do oligonucleótido. 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 15

A desprotecção (excepto para os oligonucleótido quiméricos) e a purificação de todos os oligonucleótidos foram realizadas pelo procedimento descrito em Padmapriya et af. (1994) Antisense Res. Dev., 4:185-199. A pureza dos oligonucleótidos foi verificada por electroforese em gel de poliacrilamida a 20% contendo ureia 7 M e continha mais de 90% do comprimento necessário. EXEMPLO 2

ENSAIOS À PROLIFERAÇÃO DE ESPLENÓCITOS

Estudos in vitro\ Removeu-se o baço a um ratinho CD1 macho (4-5 semanas, 20-22 g, Charles River, Wilmington, MA). Prepararam-se suspensões de células individuais por moagem suave com extremidades foscas de lâminas de vidro. Fez-se então a cultura das células em meio RPMI completo [meio RPMI suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 10%, 2-mercaptoetanol (2-ME) 50 μΜ, penicilina 100U/ml, estreptomicina 100pg/ml, L-glutamina 2mM], Aqueceu-se o soro durante 30 minutos a 56°C para os estudos com oligonucleótido-fosforotioatos, oligonucleótidos quiméricos e híbridos, e a 65°C para os estudos com oligonucleótidos contendo segmentos fosfodiéster para minimizar a degradação dos oligonucleótidos. Plaquearam-se então as células em placas de 96 poços a uma densidade de 106 células/ml num volume final de 100 μΙ. Utilizaram-se três mitogénios (10pg/ml) como controlos para a proliferação celular: Concanavalina A (Con A), um mitogénio específico para células T; mitogénio de erva-do-cancro (PWM), um mitogénio específico tanto para linfócitos T como para linfócitos B; e lipopolissacárido (LPS) que é específico para linfócitos B.

Os oligonucleótidos ou os mitogénios foram adicionados às células em 10 μΙ de tampão TE (tris-HCI 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM). Estabeleceu-se então a cultura das células a 37°C. Após 44 horas, adicionou-se 3H-timidina 1 pCi (Amersham, Arlington Heights, IL) à cultura em 20 μΙ de meio RPMI e marcaram-se as células por pulsos durante mais 4 horas. Recolheram-se então as células através de um aparelho de colheita automático (Skatron, Sterling, VA) e contaram-se os filtros através de um contador de cintilação. A figura 1 mostra que o oligonucleótido-fosforotioato rev de SEQ ID NO:5

e o palindroma que contém os oligonucleótido-fosforotioatos de SEQ ID NO:9 e SEQIDNO:10 estimulam grandemente a proliferação de esplenócitos de murídeo. O oligonucleótido-fosforotioato gag de SEQ ID NO:1 também induziu estimulação de proliferação de linfócitos em menor grau. 0 oligonucleótido-fosforotioato p53 de SEQ ID N0:8 não induziu qualquer proliferação celular significativa em nenhuma das concentrações estudadas. A figura 2 mostra que o oligonucleótido-fosforotioato gag quimérico de SEQ ID NO:2 e o oligonucleótido-fosforotioato gag híbrido de SEQ ID N0:3 não induziram significativa proliferação celular em nenhuma das concentrações estudadas. Em contraste, o oligonucleótido-fosforotioato gag com a dobra de SEQ ID NO:4 induziu um nível de proliferação celular semelhante ao do oligonucleótido de SEQ ID N0:1. De modo semelhante, a figura 3 mostra que o oligonucleótido-fosforotioato rev quimérico de SEQ ID N0:6 e o oligonucleótido-fosforotioato rev híbrido de SEQ ID NO:7 apresentaram proliferação celular significativamente reduzida quando comparada com a do oligonucleótido-fosforotioato rev de SEQ ID N0:5.

Introduziram-se também diferentes números de ligações fosfodiéster em várias posições do oligonucleótido-fosforotioato gag de SEQIDN0:1, e estas modificações diminuíram significativamente a proliferação celular em comparação com a do oligonucleótido-fosforotioato de SEQIDNO:1. 0 oligonucleótido-fosforotioato gag de SEQ ID NO:1 foi também truncado na extremidade 5' ou na extremidade 3', e ensaiado quanto à proliferação in vitro de esplenócitos de murídeo. Quando o comprimento do oligonucleótido-fosforotioato foi reduzido a partir da extremidade 5', a estimulação celular era dependente do comprimento: oligonucleótidos mais curtos produziram menor estimulação. Surpreendentemente, quando o comprimento do oligonucleótido foi reduzido a partir da extremidade 3', todos os comprimentos do oligonucleótido apresentaram níveis de proliferação celular aproximadamente semelhantes aos do oligonucleótido-fosforotioato gag 25-mero de SEQIDN0:1, indicando que a estimulação de esplenócitos de murídeo por este oligonucleótido não depende do comprimento mas sim da sequência ou da estrutura. 17

R4 RRR

EP 0 850 300/ PT EXEMPLO 3

DEPLEÇÃO DE CÉLULAS T

Removeu-se o baço de um ratinho CD1 e preparam-se suspensões de células individuais e ressuspenderam-se em meio RPMI completo a uma densidade de 107 células/ml num volume de 1 ml. Incubaram-se as células com um anticorpo monoclonal específico para células T, Thy 1.2 de rato anti-ratinho (1:100) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) a 4°C durante 30 minutos. Lavaram-se então as células, ressuspenderam-se em meio RPMI e incubaram-se com complemento de coelho Low-Tox-M (1:100) (Cedarlane, Ontario, Canadá) a 37°C durante 30 minutos. Após passagem por linfócitos M (Cedarlane, Ontario, Canadá) para remover células T destruídas, lavaram-se as células cuidadosamente, ressuspenderam-se em meio RPMI completo e realizaram-se estudos de proliferação celular conforme anteriormente se descreveu. O oligonucleótido-fosforotioato gag de SEQIDNO:1 induziu proliferação celular tanto na ausência como na presença de células T, indicando que a estimulação observada é independente das células T. EXEMPLO 4

ENSAIOS DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

Estudos in vitro·. Fez-se uma cultura de esplenócitos de murídeo (106 células/ml) com oligonucleótidos ou apenas meio durante 9 dias em culturas de 1 ml. Recolheram-se então os sobrenadantes da cultura de células e ensaiaram-se quanto aos níveis de IgG e IgM utilizando um ensaio ELISA Standard. Resumidamente, revestiram-se placas de ELISA (96 poços) com IgG ou IgM de cabra anti-ratinho (5 μg/ml) diluídas em solução salina tamponada com fosfato suplementada com azida de sódio a 0,05% (pH 9,6) durante a noite a 4°C, lavou-se 3 vezes com tampão PBS-T (solução salina tamponada com fosfato suplementada com Tween 20 a 0,05% e BSA a 0,25%) e íncubou-se com sobrenadantes da cultura das células a 37°C durante 2 horas. Diluiu-se um padrão de IgG e IgM de ratinho (1 mg/ml) com tampão PBS-T para proporcionar uma curva padrão entre 0 e 800 ng/ml. Lavaram-se então as placas 3 vezes com tampão PBS-T e incubaram-se com IgG de cabra anti-ratinho conjugada com fosfatase alcalina 1:1000 com tampão PBS-T e

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ incubou-se a 37°C durante 2 horas. Após 3 lavagens com tampão PBS-T, adicionou-se à placas substrato de fosfatase (p-nitrofenilfosfato, 1 mg/ml) em dietanolamina (75 μΙ) que se mantiveram durante 1 hora à temperatura ambiente. Parou-se a reacção colorimétrica por adição de 25 μΙ de hidróxido de sódio 0,5 M. Mediu-se a densidade óptica (405 nm) utilizando o leitor Ceres 900 HDI (Bio-Tek Instruments, Inc.). Calcularam-se os níveis de IgG e IgM com base na curva padrão. As experiências foram realizadas em quadruplicado.

As figuras 4A e 4B mostram que foi induzida produção de anticorpos pelo oligonucleótido-fosforotioato gag de SEQID NO:1 e pelo oligonucleótido--fosforotioato gag com a dobra de SEQ ID NO:4, de um modo dependente da dose. As figuras 4A e 4B mostram também que a estimulação da produção de anticorpos pelo oligonucleótido-fosforotioato gag quimérico de SEQ ID NO:2 e pelo oligonucleótido-fosforotioato gag híbrido de SEQ ID NO:3 foi significativamente inferior.

Estudos in vivo\ Utilizaram-se neste estudo ratinhos CD1 macho (4-5 semanas, 20-22 g, Charles River, Wilmington, MA). Os animais foram alimentados com uma dieta comercial e água ad !ib. e foram mantidos nas instalações para animais de University of Massachussets Medicai Center (Worcester, MA). Injectaram-se nos animais, intraperitonealmente, 1 mg de oligonucleótido em 0,25 ml de PBS. Utilizaram-se três animais para cada oligonucleótido. Sacrificaram-se os ratinhos 48 horas mais tarde e removeram-se os baços e estabeleceram-se culturas celulares em suspensões de células individuais a uma densidade de 106 células/ml. Após 24 horas de cultura, recolheram-se os sobrenadantes e ensaiaram-se quanto a IgG e IgM, conforme anteriormente descrito. As experiências foram realizadas em triplicado. O oligonucleótido-fosforotioato gag de SEQ ID NO:1 e o oligonucleótido-fosforotioato gag auto-hibridado ou com a dobra de SEQ ID N0:4 induziram um aumento de cerca de 15% no tamanho do baço em comparação com ratinhos injectados apenas com veículo (PBS), enquanto que os baços dos animais tratados com oligonucleótido-fosforotioato rev de SEQ ID NO:5 tinham aproximadamente o dobro do tamanho (aumento de 100%). Em contraste, os oligonucleótido-fosforotioatos quiméricos de

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ SEQ ID Ν0:2 e SEQ ID Ν0:6 e os oligonucleótido-fosforotioato híbridos de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:7 não induziram qualquer aumento significativo no tamanho do baço. Quando as células do baço foram medidas quanto à produção de imunoglobulinas houve um aumento significativo na produção tanto de IgG como de IgM nos ratinhos injectados com o oligonucleótido-fosforotioato rev de SEQ ID NO:5 (figuras 5A e 5B). O oligonucleótido-fosforotioato rev quimérico de SEQ ID NO:6 e o oligonucleótido-fosforotioato rev híbrido de SEQ ID NO:7 minimizaram significativamente o efeito de indução de anticorpos observado com o oligonucleótido-fosforotioato rev de SEQ ID NO:5. EXEMPLO 5

ANÁLISE DO CICLO CELULAR

Para a análise do ciclo celular, cultivaram-se as células durante 4 horas e depois lavaram-se com tampão FACS (1 x Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) suplementada com albumina de soro bovino (BSA) a 1 % e azida de sódio a 0,1%). Fixaram-se as células com álcool frio a 70% e depois colocaram-se em gelo durante 30 minutos. Após fixação, ressuspenderam-se as células com 200 μΙ de PBS e trataram-se com 50 μΙ de ARNase (10mg/ml, isenta de ADNase) a 37°C durante 30 minutos. Adicionou-se iodeto de propídio (50 pg/ml) às células antes da análise por citometria de fluxo. Os dados da citometria de fluxo de 10 000 células viáveis foram obtidos na forma de um histograma num citómetro de fluxo Epics XL (Coulter, Hialeah, FL) e analisaram-se os dados através de um sofware Epics XL, versão 1.5, e sofware de múltiplos ciclos (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA) após aprisionamento em células vivas por difusão frontal versus difusão lateral e excluindo dubletos. As experiências foram realizadas em triplicado

Os resultados da análise do ciclo celular estão apresentados nas tabelas 1 e 2, nas quais os resultados são apresentados na forma de % de células ± desvio padrão de uma experiência em quadruplicado. 20 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ TABELA 1 AMOSTRA % DE CÉLULAS EM G1 % DE CÉLULAS EM S/G2 PBS 88,3 ± 0,25 11,7 ±0,20 SEQ ID NO:1 (gag) 86,9 ± 0,39 13,1 ± 0,38 SEQ ID NO:2 (gag quimérico) 88,4 ± 0,71 11,3 ± 0,29 SEQ ID N0:3 (gag híbrido) 88,3 ± 0,21 11,8 ±0,21 SEQ ID NO:3 (gag com a dobra) 87,7 ± 2,59 12,7 ± 1,96 TABELA 2 AMOSTRA % DE CÉLULAS EM G1 % DE CÉLULAS EM S/G2 PBS 85,4 ±0,36 14,6 ± 0,32 SEQ ID NO:1 (rev) 81,3 ± 0,49 18,7 ±0,45 SEQ ID NO:2 (rev quimérico) 85,9 ± 1,90 14,1 ± 1,90 SEQ ID NO:3 (rev híbrido) 85,7 ± 0,46 14,3 ±0,46

Os estudos de ciclos celulares mostraram que após a coloração das células do baço fixadas com iodeto de propídio, a percentagem de células nas fases S/G2 de ratinhos tratados com o oligonucleótido-fosforotioato gag de SEQIDNO:1, e com o oligonucleótido-fosforotioato gag com a dobra de SEQ ID N0:4, aumentou em cerca de 13%, em comparação com ratinhos não tratados. O oligonucleótido-fosforotioato rev de SEQ ID NO:5 induziu um aumento de aproximadamente 30% na percentagem de células em fases S/G2 do ciclo celular, em comparação com o veículo sozinho. Os oligonucleótido-fosforotioatos quiméricos de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:6 e os oligonucleótido-fosforotioato híbridos de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:7 não apresentaram aumentos significativos das células nos ciclos, confirmando os resultados observados in v/tro.

Os peritos na arte reconhecerão, ou poderão determinar, utilizando apenas experiências de rotina, numerosos equivalentes das substâncias e procedimentos específicos aqui descritos. Estes equivalentes são considerados 21 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ dentro do âmbito da invenção e estão cobertos pelas reivindicações que se seguem. (Segue Listagem de Sequências) 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Hybridon, Inc. (iil TÍTULO DA INVENÇÃO: Método de modulação da expressão de genes com resposta imunoestimulante reduzida (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 10 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: Ann-Louise Kerner, Ph.D., Lappin & Kusmer LLP (B) RUA: 200 State Street (C) CIDADE: Boston

(D) ESTADO: MA (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02109 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com PC da IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO:Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: McDaniels, Patrícia A. (B) NÚMERO DE REGISTO: 33 194

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/CERTIFICADO: HYZ-043PCT (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 617-330-1300 (B) TELEFAX: 617-330-1311

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: / desc = "ácido desoxirribonucleico ligado por fosforotioato"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM (vi) FONTE DE ORIGEM: (A) ORGANISMO: Gene gag do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...25 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação fosforotioato" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "ácido desoxirribonucleico quimérico ligado por metilfosfonato/fosforotioato"

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 24

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM (vi) FONTE DE ORIGEM: (A) ORGANISMO: Gene gag do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação metilfosfonato" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: miscfeature (B) LOCALIZAÇÃO: 6...20 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação fosforotioato" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc feature (B) LOCALIZAÇÃO: 21...25 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação metilfosfonato" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "ácido ribonucleico/desoxirribonucleico híbrido ligado por fosforotioato"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 25

(vi) FONTE DE ORIGEM: (A) ORGANISMO: Gene gag do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: 25

CUCUCGCACC CATCTCTCTC CUUCU (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: ambas (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "ácido desoxirribonucleico com dobra ligado por fosforotioato"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM (vi) FONTE DE ORIGEM: (A) ORGANISMO: Gene gag do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: stemjoop (B) LOCALIZAÇÃO: 22...33 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...33 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação fosforotioato" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:4: CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCTGGAGA GAG 33

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "ácido desoxirribonucleico ligado por fosforotioato"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM (vi) FONTE DE ORIGEM: (A) ORGANISMO: Gene rev do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: miscfeature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...27 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação fosforotioato" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: TCGTCGCTGT CTCCGCTTCT TCTTGCC 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "ácido desoxirribonucleico quimérico ligado por metilfosfonato/fosforotioato"

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 27 (iv) ANTI-SENTIDO: SIM (vi) FONTE DE ORIGEM: (A) ORGANISMO: Gene rev do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: miscfeature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação metilfosfonato" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc feature (B) LOCALIZAÇÃO: 6...22 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação fosforotioato" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc feature (B) LOCALIZAÇÃO: 23...27 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação metilfosfonato" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6: 27

TCGTCGCTGT CTCCGCTTCT TCTTGCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "ácido ribonucleico/desoxirribonucleico híbrido ligado por fosforotioato"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 28

(vi) FONTE DE ORIGEM: (A) ORGANISMO: Gene rev do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: miscfeature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...27 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação fosforotioato" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: 27

UCGUCGCTGT CTCCGCTTCT TCTUGCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "ácido desoxirribonucleico ligado por fosforotioato"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM (vi) FONTE DE ORIGEM: (A) ORGANISMO: p53 humano (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...20 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação fosforotioato" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: 20

CCCTGCTCCC CCCTGGCTCC

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "ácido desoxirribonucleico ligado por fosforotioato"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação fosforotioato" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: CGCGCG 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "ácido desoxirribonucleico ligado por fosforotioato"

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM 30 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (Β) LOCALIZAÇÃO: 1...10 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /produto = "ligação fosforotioato" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10: GACGATCGTC 10

Lisboa,

M EQOO

Por HYBRIDON, INC.

da mmk mmu Ag. Of. Pr. Ind. Ruo dos Flores, 74 - 4.° 1200 LISBOA

Claims

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método de produção de um oligonucleótido-fosforotioato possuindo uma resposta imunoestimulante reduzida num mamífero, o qual compreende: a. a modificação de pelo menos uma estrutura química no oligonucleótido-fosforotioato de modo a produzir um oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante possui uma estrutura modificada no terminal 3'.
3. Método de acordo com a reivindicação 2 em que a estrutura modificada no terminal 3' compreende uma substituição de pelo menos uma ligação internucleótidos fosforotioato do oligonucleótido por pelo menos uma ligação internucleótidos metilfosfonato.
4. Método de acordo com a reivindicação 2 em que a estrutura modificada no terminal 3' compreende uma substituição de pelo menos um desoxirribonucleótido por pelo menos um ribonucleótido.
5. Método de acordo com a reivindicação 2 em que a estrutura modificada no terminal 3' compreende uma substituição de pelo menos uma ligação internucleótidos de modo a quebrar a sequência que induz uma resposta imunoestimulante.
6. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante possui uma estrutura modificada no terminal 5'. i,
7. Método de acordo com a reivindicação 6 em que a estrutura modificada no terminal 5' compreende uma substituição de pelo menos uma ligação internucleótidos fosforotioato do oligonucleótido por pelo menos uma ligação internucleótidos metilfosfonato.
8. Método de acordo com a reivindicação 6 em que a estrutura I I

84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 2/3 modificada no terminal 5' compreende uma substituição de pelo menos um desoxirribonucleótido por pelo menos um ribonucleótido.
9. Método de acordo com a reivindicação 6 em que a estrutura modificada no terminal 5' compreende uma substituição de pelo menos um nucleótido por um outro nucleótido diferente de modo a quebrar a sequência de nucleótidos que induz uma resposta imunoestimulante.
10. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante possui uma estrutura modificada no terminal 3' e uma estrutura modificada no terminal 5'.
11. Método de acordo com a reivindicação 10 em que a estrutura modificada no terminal 3' compreende uma substituição de pelo menos uma ligação internucleótidos fosforotioato do oligonucleótido por pelo menos uma ligação internucleótidos metilfosfonato.
12. Método de acordo com a reivindicação 10 em que a estrutura modificada na terminal 3' compreende uma substituição de pelo menos um desoxirribonucleótido por pelo menos um ribonucleótido.
13. Método de acordo com a reivindicação 10 em que a estrutura modificada no terminal 3' compreende uma substituição de pelo menos um nucleótido por um outro nucleótido diferente de modo a quebrar a sequência de nucleótidos que induz uma resposta imunoestimulante.
14. Método de acordo com a reivindicação 10 em que a estrutura modificada no terminal 5' compreende uma substituição de pelo menos uma ligação internucleótidos fosforotioato do oligonucleótido por pelo menos uma ligação internucleótidos metilfosfonato.
15. Método de acordo com a reivindicação 10 em que a estrutura modificada na terminal 5' compreende uma substituição de pelo menos um desoxirribonucleótido por pelo menos um ribonucleótido.
16. Método de acordo com a reivindicação 10 em que a estrutura 84 553 ΕΡ Ο 850 300/ ΡΤ 3/3 modificada no terminal 5' compreende uma substituição de pelo menos um nucleótido por um outro nucleótido diferente de modo a quebrar a sequência de nucleótidos que induz uma resposta imunoestimulante.
17. Método de acordo com a reivindicação 10 em que a estrutura modificada no terminal 3' compreende uma substituição de pelo menos uma ligação internucleótidos fosforotioato do oligonucleótido por pelo menos uma ligação internucleótidos metilfosfonato e a estrutura modificada no terminal 5' compreende uma substituição de pelo menos uma ligação internucleótidos fosforotioato do oligonucleótido por pelo menos uma ligação internucleótidos metilfosfonato.
18. Método de acordo com a reivindicação 10 em que a estrutura modificada no terminal 3' compreende uma substituição de pelo menos um desoxirribonucleótido por pelo menos um ribonucleótido, e a estrutura modificada no terminal 5' compreende uma substituição de pelo menos um desoxirribonucleótido por pelo menos um ribonucleótido.
19. Método de acordo com a reivindicação 10 em que a estrutura modificada no terminal 3' compreende uma substituição de pelo menos um nucleótido de modo a quebrar a sequência de nucleótidos que induz uma resposta imunoestimulante, e a estrutura modificada no terminal 5' compreende uma substituição de pelo menos um nucleótido de modo a quebrar a sequência de nucleótidos que induz uma resposta imunoestimulante.
20. Composição farmacêutica compreendendo um oligonucleótido-fosforotioato redutor da resposta imunoestimulante possuindo uma estrutura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19. Lisboa, II JAN. 2000 Por HYBRIDON, INC. - O AGENTE OFICIAL -