JPH08512300A

JPH08512300A - ニューロン損傷、変性及び細胞壊死の予防及び／又は治療、並びに腫瘍の治療を目的とするアンチセンス核酸を含む医薬用組成物

Info

Publication number: JPH08512300A
Application number: JP7503825A
Authority: JP
Inventors: シュリンゲンジーペン・ゲオルグ−エフ; シュリンゲンジーペン・レイマール; シュリンゲンジーペン・カール−ヘルマン; ブリッシュ・ウォルフガング
Original assignee: バイオグノスティック・ゲゼルシャフト・フュア・バイオモレキュラーレ・ダイアグノスティック・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1993-07-10
Filing date: 1994-07-06
Publication date: 1996-12-24
Also published as: WO1995002051A2; WO1995002051A3; US7326783B2; ATE258596T1; EP0708829B8; DE69433520T2; EP0708829B1; DE69433520D1; AU7345694A; US20020037866A1; EP0708829A1

Abstract

(57)【要約】 c-ｊｕｎ、c-ｆｏｓ又はｊｕｎ-Bの発現が原因として働くニューロン損傷、変性、細胞壊死及び／又は腫瘍を予防及び治療することができる化合物を有効量含む医薬用組成物であって、当該化合物がアンチセンス核酸又はその有効な誘導体であり、前記アンチセンス核酸がc-ｊｕｎ、c-ｆｏｓ又はｊｕｎ-BをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)及び／又はDNAの領域にハイブリダイズする医薬用組成物。

Description

【発明の詳細な説明】ニューロン損傷、変性及び細胞壊死の予防及び／又は治療、並びに腫瘍の治療を目的とするアンチセンス核酸を含む医薬用組成物本発明は、c-ｊｕｎ、c-ｆｏｓ又はｊｕｎ-Bの発現が原因として働くニューロン損傷、細胞壊死及び／又は腫瘍を予防及び治療することができる化合物、特に、c-ｊｕｎ、c-ｆｏｓ又はｊｕｎ-Bに対する遺伝子を含むメッセンジャーRNA(mR NA)及び／又はDNAの領域にハイブリダイズするアンチセンス核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド類を有効量含む医薬用組成物及び診断薬；腫瘍の治療並びに／又はc-ｊｕｎ、c-ｆｏｓ又はｊｕｎ-Bの発現が関与するニューロン損傷及び変性の予防及び／若しくは治療に用いられる医薬用組成物を製造するための上記化合物の使用に関する。シュリンゲンジーペンら（Schlingensiepen et al.）は、第82回米国癌研究学会（ヒューストン、USA、1991年）、米国癌研究学会会報、32巻、303頁、要約No .1799に、c-ｊｕｎ及びｊｕｎ-B遺伝子がv-ｊｕｎ遺伝子に対して高い配列相同性を共有することを報告している。それらは直接初期遺伝子群に属す。c-ｊｕｎはc-ｆｏｓと共にDNA結合因子AP-1を構成する。c-ｊｕｎ及びｊｕｎ-Bの発現は種々の細胞株においてホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを用いて阻害された。c-ｊｕｎ阻害は２種の乳癌細胞株、ラット褐色細胞腫細胞株PC-12 及びNH 3T3マウス線維芽細胞において3H-チミジンの取り込みを著しく減少させた。c-ｊｕｎ発現及びc-ｆｏｓ発現の阻害は同じ細胞株において非常に類似した効果を示した。ｊｕｎ-B発現の阻害は3H-チミジンの取り込みを10倍より多く強烈に増加させる。10-ｊｕｎはガン原遺伝子(proto-oncogene)の特徴を持つことを意味しているが、ｊｕｎ-Bはp53のものと同様の強い抗増殖作用を持つガン抑制遺伝子らしい。この結果は、ｊｕｎ-B及びc-ｊｕｎが細胞成長に対する作用においては機能的アンタゴニストであることを示唆している。この研究はそれぞれの遺伝子及び蛋白の機能を解明することを目的として行われた。この要旨からは治療に向けた考え方は何も示されていない。ザ・ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリー、分子細胞生物学キーストーン・シンポジウム（1993年）要約B 977でシュリンゲンジーペンら（Schli ngensiepen et al.）は哺乳動物で同定されているガン原遺伝子c-ｊｕｎの２個の相同物を報告している。この要約でｊｕｎ-Bは細胞分化において役割を演じるらしいと推測されている。ｊｕｎ-B遺伝子の機能上の疑問点を調べることを目的として、ラット海馬から取った一次ニューロン細胞培養でのニューロン分化PC-1 2腫瘍細胞におけるc-ｊｕｎ及びｊｕｎ-Bの発現を特異的に阻害するためにアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(S-ODN)が使用された。ウェスタン・ブロット分析から２μM S-ODNを用いた後のそれぞれのJun蛋白レベルに90%を超える特異的減少が明らかになった。ニューロン細胞培養では神経突起伸長がｊｕｎ-B発現阻害の後に強く阻害されたが、抗c-ｊｕｎ-S-ODNを用いた後には促進された。ニューロン分化PC-12腫瘍細胞では、より強烈な変化が観察された。この結果は、c-ｊｕｎは分化を阻害するようであるがｊｕｎ-Bは細胞分化における決定的な役割を演じていることを示唆している。この開示からも治療へ向けた考え方は与えられていない。第５回国際分化治療会議におけるバイオメディスン・アンド・ファーマコセラピー、要約38で、シュリンゲンジーペンら（Schlingensiepen et al.）はジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリーに発表した結果について再び報告している。デベロップメンタル・ジェネティクス、14巻、305-312頁、1993年で、シュリンゲンジーペンら（Schlingensiepen et al.）はｊｕｎ-B及び／又はc-ｊｕｎ転写因子の誘導について報告している。この誘導は細胞プログラムに変化をもたらす種々の刺激に対する直接初期反応の一部である。ｊｕｎ-B及び／又はc-ｊｕｎ転写の機能上の重要性を調べることを目的として、増殖細胞及びニューロン分化細胞における遺伝子の発現を阻害するためにアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドが使用された。細胞培養試験で、ｊｕｎ-B発現の阻害により形態学的分化が著しく抑えられることが見出された。逆に、c-ｊｕｎ蛋白合成の阻害により一次ニューロン及びPC-12腫瘍細胞の両方の形態学的分化が促進された。 EP-A-0 305 929は膜上に直接結合した結合オリゴヌクレオチド及びペプチドを伴う膜を扱っている。膜上に直接結合したオリゴヌクレオチドを合成する方法は膜アフィニティ支持体を作る手段を提供する。直接合成法用に改良された膜も提供されている。 WO 92/15680は遺伝子発現を選択的に阻害する方法及び組成物を扱っている。アンチセンスRNA技術を用いて遺伝子発現を選択的に阻害するための方法及び組成物が開示されている。アンチセンスRNA構築には、その発現が下方調節を目標とする遺伝子の明確なイントロン領域に対応するアンチセンスイントロンDNA を利用している。具体例として、ホモ接合体自発性K-ras変異を持つヒト肺癌細胞株(NCI-H460a)を、K-rasのゲノミックセグメントをアンチセンス配向に合成する組み換えプラスミドでトランスフェクトした。H-ras及びN-rasの発現に変化がなかった一方で、変異K-rasm RNAの翻訳は特異的に阻害された。変異ras p21 蛋白の発現がアンチセンスRNAにより下方調節された場合、３倍の成長阻害がH46 0a細胞に起きたが、細胞は生存能力を保っていた。nu/nuマウスにおけるH460a腫瘍の成長は、発現されたK-rasアンチセンスRNAにより実質的に減少された。ダン・マーコーラ(Dan Mercola)は“癌及びエイズのアンチセンス核酸治療の展望”（83-114頁、1991年）でアンチセンスｆｏｓRNA及び、程度は低いがアンチセンスｊｕｎRNAの利用を扱っている。このようなアンチセンスRNAは、細胞周期調節、分化などにおける遺伝子産物の役割を理解する上で役立ってきた。診断及び治療の手掛かりとなるこれらの話題や関連事項へのアンチセンスRNA及びオリゴヌクレオチドの応用における発展が考察されている。 S.ヴァン・デン・ベルグ（S.van den Berg）は“癌及びエイズのアンチセンス核酸治療の展望”（63-70頁、1991年）で染色体異常の発生を抑制するアンチセンスｆｏｓオリゴデオキシリボヌクレオチドを扱っている。飢餓状態にある細胞の血清処理による発現産物FOS核ガン蛋白の急速誘導がアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの機能的安定性を試験するために使用された。非修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドは約２時間を半減期としてその阻止作用を失ったが、チオエステルによる主鎖の修飾により半減期が約４時間に延長された。修飾されたオリゴデオキシリボヌクレオチドは、複雑な生理的事象：すなわち、ras やmosのようなガン遺伝子の過剰発現及び繊維芽細胞への紫外線照射に因る染色体異常の誘導におけるFOSの決定的な役割を解明するために使用された。 c-Fos、Jun-B及び／又はc-Jun転写因子の誘導は、細胞プログラムに変化をもたらす種々の刺激に対する直接初期反応の一部である。c-ｊｕｎ及びc-ｆｏｓはその発現が細胞増殖の誘導に必要なガン原遺伝子であるが、Jun-B転写因子の機能は依然として明らかでない。例えば低酸素又は低血糖に因るニューロン細胞損傷及び細胞壊死は、細胞プログラムに変化をもたらす種々の刺激に対する細胞の反応として起きるらしい。ニューロン損傷及び／又は細胞壊死を予防及び／又は治療するための医薬用組成物を提供することが本発明の目的である。驚くべきことに、c-ｆｏｓ及びc-ｊｕｎ遺伝子の発現は、例えば低酸素又は低血糖に因るニューロン細胞損傷及び細胞壊死において原因として働く。さらに驚くべきことに、Jun-B蛋白の発現が正常細胞及び腫瘍細胞の分化に必要であり、c-Jun蛋白発現の阻害によりそのような細胞の分化が促進される。その結果に基づいて、本発明はｊｕｎ-B発現の促進及び／又はc-ｊｕｎ発現の阻害による腫瘍治療のための医薬用組成物を提供する。 c-ｊｕｎ、c-ｆｏｓ又はｊｕｎ-Bに対する遺伝子を含むmRNA又はDNAの領域にハイブリダイズするアンチセンス核酸又はその有効な誘導体を含む医薬用組成物は上記の問題を解決することができる。このアンチセンス核酸はc-ｊｕｎ、ｊｕｎ -B又はc-ｆｏｓ mRNAの領域にハイブリダイズすることができる。このアンチセンス核酸の断片及びこれらの配列を含むアンチセンス核酸は、c-Jun及び／又はc-Fos及び／又はJun-B蛋白の生成が減少又は阻害される限り本発明に従って機能することは当業者に理解されるものである。本発明によれば、アンチセンス−オリゴヌクレオチド類は、固相に共有結合した最初のヌクレオチドに各ヌクレオチドが結合してヌクレオチド鎖が3'-5'方向に成長することによる亜リン酸３エステル化学を用いた固相合成によって得ることができ、この合成は以下の工程を含む： − 先のヌクレオチドの5'DMT保護基の開裂、 − 鎖を増殖させるための各ヌクレオチドの付加、 − 亜リン酸基の修飾、次いで未反応5'-水酸基の封鎖、及び − 固体支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂、 − それに続く合成生成物の処理。オリゴデオキシ−リボヌクレオチド類の化学構造を図１に示し、同様に、アンチセンスオリゴ−リボヌクレオチド類のそれぞれの構造を図２に示す。オリゴヌクレオチド鎖は、ヌクレオチド長鎖からの細部として理解されるべきものである。図１において、ＢはN9(A,G)又はN1(D,T)を介してデオキシリボースに結合しているアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)及びチミン(T)等の有機塩基を意味する。これらの塩基配列は対象遺伝子配列(mRNA-配列）の逆相補物である。使用する修飾により以下に示すものが得られる： 1. 全てのR¹が 1.1 R¹ = O 1.2 R¹ = S 1.3 R¹ = F 1.4 R¹ = CH₃ 1.5 R¹ = OEt で置換されたオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、 2. 一つのオリゴヌクレオチド；（式中、 B = 遺伝子配列に依存するデオキシ−リボヌクレオチドdA、dC、dG又はdT p = ヌクレオチド内リン酸エステル n = 6〜20塩基の長さのオリゴデオキシ−リボヌクレオチドの範囲）の中のヌクレオチド内リン酸エステルにおいて、R¹が 2.1 R^1a = S； R^1b = O 2.2 R^1a = CH₃； R^1b = O 2.3 R^1a = S； R^1b = CH₃ 2.4 R^1a = CH₃； R^1b = S に変わっているオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、 3. 一つのオリゴヌクレオチド；（式中、 B = 遺伝子配列に依存するデオキシ−リボヌクレオチドdA、dC、dG又はdT p = ヌクレオチド内リン酸エステル n = 4〜12ジヌクレオチドの長さのオリゴデオキシ−リボジヌクレオチドの範囲）の中のヌクレオチド内リン酸エステルにおいて、R¹が 3.1 R^1a = S； R^1b = O 3.2 R^1a = CH₃； R^1b = O 3.3 R^1a = S； R^1b = CH₃ に変わっているオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、 4. 共有結合して細胞の取り込みを促進する以下の化合物 4.1 コレステロール 4.2 ポリ(L)リジン 4.3 トランスフェリン 4.4 葉酸とR²において結合している化合物1.1〜1.5；2.1〜2.4； 3.1〜3.3のいずれか、 5. 共有結合して細胞の取り込みを促進する以下の化合物 5.1 コレステロール 5.2 ポリ(L)リジン 5.3 トランスフェリン 5.4 葉酸とR³において結合している化合物1.1〜1.5；2.1〜2.4；3.1〜3.3のいずれか。 RNA-オリゴヌクレオチド類の場合は（図２）、塩基(アデニン(A)、グアニン(G )、シトシン(C)、ウラシル(U))はN9(A,G)又はN1(C,U)を介してリボースに結合している。これらの塩基配列は対象遺伝子配列(mRNA-配列)の逆相補物である。オリゴヌクレオチド配列中に使用する修飾により、以下に示すものが得られる： 6. 全てのR¹が 6.1 R¹ = O 6.2 R¹ = S 6.3 R¹ = F 6.4 R¹ = CH₃ 6.5 R¹ = OEt で置換されたオリゴ−リボヌクレオチド類、 7. 一つのオリゴヌクレオチド；（式中、 B = 遺伝子配列に依存するリボヌクレオチドA、C、G又はT p = ヌクレオチド内リン酸エステル n = 4〜20塩基の長さのオリゴ−リボヌクレオチドの範囲）の中のヌクレオチド内リン酸エステルにおいて、R¹が 7.1 R^1a = S； R^1b = O 7.2 R^1a = CH₃； R^1b = O 7.3 R^1a = S； R^1b = CH₃ 7.4 R^1a = CH₃； R^1b = S に変わっているオリゴ−リボヌクレオチド類、 8. 一つのオリゴヌクレオチド；（式中、 B = 遺伝子配列に依存するリボヌクレオチドA、C、G又はT p = ヌクレオチド内リン酸エステル n = 4〜12ジヌクレオチドの長さのオリゴ−リボジヌクレオチドの範囲）の中のヌクレオチド内リン酸エステルにおいて、R¹が 8.1 R^1a = S； R^1b = O 8.2 R^1a = CH₃； R^1b = O 8.3 R^1a = S； R^1b = CH₃ に変わっているオリゴ−リボヌクレオチド類、 9. 共有結合して細胞の取り込みを促進する以下の化合物 9.1 コレステロール 9.2 ポリ(L)リジン 9.3 トランスフェリンとR²において結合している化合物6.1〜6.5；7.1〜7.4；8.1〜8.3のいずれか、 10．共有結合して細胞の取り込みを促進する以下の化合物 10.1 コレステロール 10.2 ポリ(L)リジン 10.3 トランスフェリンとR³において結合している化合物6.1〜6.5；7.1〜7.4；8.1〜8.3のいずれか、 11．全てのR⁴が 11.1 R⁴ = O 11.2 R⁴ = F 11.3 R⁴ = CH₃ で置換された化合物6.1〜6.5；7.1〜7.4；8.1〜8.3；9.1〜9.3；10.1〜10.3のいずれか。好ましい態様において、c-ｊｕｎアンチセンス核酸は配列表中SEQ ID NO.1〜 55及び174〜177に規定された配列を含む。好ましい態様において、ｊｕｎ-Bアンチセンス核酸は配列表中SEQ ID NO.56〜 97及び178、179に規定された配列を含む。好ましい態様において、c-ｆｏｓアンチセンス核酸は配列表中SEQ ID NO.98〜 173及び180〜185に規定された配列を含む。上記の独立のただ一つの配列が本発明のアンチセンス核酸又はオリゴヌクレオチド構造として機能することができる。しかしながら一本のヌクレオチド鎖が、直接共有結合しているか又は他のヌクレオチドと中間的に共有結合している２個以上の上記配列を含むこともできる。好ましくは、配列表中に掲げた配列を持つ個々のオリゴヌクレオチド類が挙げられる。配列を無作為対照配列として使用した。これらのオリゴ−ヌクレオチド類の好ましい態様において、それらはホスホロチオエート誘導体である。アンチセンス−オリゴヌクレオチド類を修飾することは、それらが応用された場合に自然に存在するヌクレオチド配列に確認されている程速く内因性の因子によって破壊されることがないために、有利である。しかしながら、開示されている配列を持つ自然に存在するヌクレオチドもまた本発明に使用しうることが当業者には理解される。特に好ましい態様において、上記修飾はホスホロチオエート修飾である。本発明のオリゴデオキシ−ヌクレオチドの合成を、以下により詳しく具体例として述べる。オリゴデオキシ−ヌクレオチド類は亜リン酸３エステル化学を用いて、保護されたヌクレオチドの段階的5'-付加により合成した。ヌクレオチドAは5'-ジメトキシ−トリチル−デオキシアデノシン（N-ベンゾイル）-N,N'-ジイソプロピル-2 -シアノエチルホスホルアミダイト(0.1M)として導入し；ヌクレオチドCは5'- ジメトキシトリチル−デオキシシチジン（N⁴-ベンゾイル）-N,N'-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホルアミダイトとして導入し；ヌクレオチドG は5'-ジメトキシトリチル−デオキシグアノシン（N⁸-イソブチリル）-N,N'-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホルアミダイトとして導入し、ヌクレオチドT は5'-ジメトキシトリチル−デオキシチミジン-N,N'-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホルアミダイトとして導入した。ヌクレオチド類は好ましくはアセトニトリル中に0.1M濃度に溶解して使用した。合成は、殆どの3'ヌクレオチドが長鎖アルキルアミンリンカーを介して共有結合する（平均担持30μmol/g固体支持体）、直径が約150μmに調節された細孔ガラス粒子（細孔直径500Å）上で行った。固体支持体は円筒状の合成カラムに充填し、試薬類は十分流出できるが固体合成支持体は保持するフィルターで両末端をキャップした。試薬類は、不活性ガスによる加圧を利用して合成カラムに供給し、回収した。ヌクレオチド類は3'→5' 方向に伸長するオリゴヌクレオチド鎖に付加した。各ヌクレオチドは以下の合成サイクルを一巡して結合した：先のヌクレオチドの5'DMT（ジメトキシトリチル）保護基をジクロロメタン中で3-クロロ酢酸を用いて開裂し、次いで無水アセトニトリルでカラムを洗浄した。そして同時に、配列に応じて、保護された誘導体の形態にある塩基の一つをアセトニトリル中のテトラゾールと共に添加した。反応後、反応混合液を回収して、亜リン酸を二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン中の硫黄（S₈）の混合物で酸化した。酸化反応の後、混合液を回収し、カラムをアセトニトリルで洗浄した。1-メチルイミダゾール及び無水酢酸／ルチジン／テトラヒドロフランを同時に添加して未反応の5'-水酸基を封鎖した。その後、反応カラムをアセトニトリルで洗浄し、次のサイクルを開始した。合成生成物の処理及び精製は以下のように行った。最後のヌクレオチドを付加した後に、デオキシヌクレオチドをアンモニア溶液中でインキュベートすることにより固体支持体から開裂した。環外塩基保護基はアンモニア中でさらにインキュベートすることにより除去した。その後アンモニアを減圧留去した。依然として5'DMT保護基を有する全長合成生成物を、シリカC₁₈ 固定相上で逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて短い破損不純物から分離した。生成物のピーク溶離液を回収し、減圧乾燥し、5'DMT保護基を酢酸中でインキュベートすることにより開裂し、その後酢酸を減圧留去した。合成生成物を脱イオン水中に溶解し、ジエチルエーテルで３回抽出した。その後、生成物を減圧乾燥した。再度HPLC-AXクロマトグラフィーを行い、生成物のピーク溶離液を過剰のトリスバッファーに対して透析し、同様に二度目の透折を脱イオン水に対して行った。最終生成物は凍結乾燥し、乾燥貯蔵した。本発明のアンチセンス核酸は、本発明の医薬用組成物又は薬剤の中間生成物である。この薬剤は、ニューロン細胞壊死の治療及び／又は予防、並びにc-ｊｕｎ及び／又はｊｕｎ-B又はc-ｆｏｓの発現が病原性に関連している腫瘍の治療に使用することができる。この医薬用組成物は上記有効な化合物（類）の他に、適当な担体試薬、溶媒及び薬剤を製造するために当技術分野において公知の他の成分を含んでもよい。好ましくは、これらの試薬は本発明の医薬用組成物の投与を容易にする。典型的には、この医薬用組成物は静脈内注入又は静脈内ボーラス注射として投与される。投与される活性成分の量は典型的には、１日当たり体重１kg について0.2‐50mg、とりわけ１‐12mgの範囲のオリゴヌクレオチドである。ニューロン細胞壊死に対する保護作用における、c-ｊｕｎ、ｊｕｎ-B及びc-ｆｏｓに特異的なアンチセンスオリゴ−ヌクレオチド類の効果が研究された。c-ｊｕｎと同様にc-ｆｏｓもニューロン細胞壊死の原因として働くことが示された。腫瘍細胞の分化及び増殖におけるこれらの遺伝子の役割も研究された。c-Ｊｕｎ蛋白合成の阻害により腫瘍細胞の分化が促進されることが示された。c-ｊｕｎ、ｊｕｎ-B及びc-ｆｏｓのmRNA類に相補的なホスホロチオエート修飾核酸と同様にアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド類もそれぞれの蛋白の発現を特異的に阻害することが示された。主に、この医薬用組成物における活性化合物として使用できる化合物は各遺伝子が発現されるかどうかを評価するための診断手段として用いることができる。典型的には、検査されるサンプルに放射性ラベルヌクレオチドが、当技術分野において周知のノーザン・ブロッティング法により又は生体内でそのままハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの度合いが各遺伝子の発現度についての測定値となる。図３ラットPC-12セルライセート(lysate)のウェスタン・ブロット分析。c-Ｆｏｓ蛋白発現における種々のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの作用。オリゴデオキシヌクレオチドとのインキュベーション時間は６時間であった。レーン１：無作為対照S-ODN；レーン２：抗c-ｆｏｓ S-ODN-180；レーン３：抗c-ｆｏｓ S-ODN-182。各レーンについて全量10μgの蛋白を使用した。図４ c-Jｕｎ及びＪｕｎ-B蛋白発現における種々のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの作用。Ａ：抗c-ｊｕｎ抗体をプローブに用いたNIH 3T3セルライセートのウェスタン・ブロット。Ｂ：抗ｊｕｎ-B抗体をプローブに用いたSK-BR3セルライセート。オリゴデオキシヌクレオチドとのインキュベーション時間は：レーン１〜３が６時間；レーン４〜６が24時間であった。レーン１及び４：無作為対照S-ODN；レーン２及び５：抗ｊｕｎ-B S-ODN-62；レーン３及び６：抗c-ｊｕｎ S-ODN-13 。各レーンについて全量10μgの蛋白を使用した。図５ c-Ｊｕｎ、Ｊｕｎ-B及びc-Ｆｏｓ蛋白発現における種々のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの作用。Ａ：c-ｊｕｎ（ラット特異的）アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド17 4、175、176、177とインキュベートしたラットPC-12セルライセートの酵素結合免疫吸着剤検定。Ｂ：c-ｊｕｎ（ヒト特異的）アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド１、７、13、17、20、23、26、31、31、39、45、51又は54とインキュベートしたヒト SK-Br-3セルライセートの酵素結合免疫吸着剤検定。Ｃ：ｊｕｎ-B（ラット特異的）アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド17 8又は179とインキュベートしたラットPC-12セルライセートの酵素結合免疫吸着剤検定。Ｄ：ｊｕｎ-B（ヒト特異的）アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド57、 62、64、69、80、85、89、92、95又は97とインキュベートしたヒトSK-Br-3セルライセートの酵素結合免疫吸着剤検定。Ｅ：c-ｆｏｓ（ラット特異的）アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド18 0、181、182、183、184又は185とインキュベートしたラットPC-12セルライセートの酵素結合免疫吸着剤検定。Ｆ：c-ｆｏｓ（ヒト特異的）アンチセンスオリゴヌクレオチド98、99、102 、103、108、116、121、130、139、144、152、158、165、170又は173とインキュベートしたヒトSK-Br-3セルライセートの酵素結合免疫吸着剤検定。ホスホロチオエート−オリゴデオキシヌクレオチド類は２μM濃度で使用した。対照細胞は、未処理で置く（白色棒）か又は２μMの無作為対照ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類で処理した（灰色棒）。図６低酸素処理後のラット小脳ニューロンの生存率。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類は１μM濃度で使用した。対照細胞には低酸素処理をしなかった（白色棒）。低酸素処理対照細胞は、オリゴヌクレオチドで処理しなかったもの（黒色棒、Ｃ）又は同じ濃度の無作為対照ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドで処理したもの（灰色棒）のいずれかであった。誤差を示す棒は１ SDに対応する。図７ NGF処理PC-12細胞におけるc-Ｊｕｎ蛋白合成の抑制後に見られる増殖抑止強化及びＪｕｎ-B蛋白合成の抑制後に見られる増殖抑止欠如。PC-12細胞数はNGF処理の８日後に計数した。各棒は４回の測定の平均値を表わす。灰色棒：２μMの無作為対照S-ODN；白色棒：２μMの抗c-ｊｕｎ S-ODN-174；黒色棒：２μMの抗ｊｕｎ -B S-ODN-179。誤差を示す棒は１SDに対応する。図８ c-ｊｕｎ又はｊｕｎ-B蛋白合成の阻害後のNGF処理PC-12細胞の形態的分化。Ａ：ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類で処理していない対照細胞。Ｂ：２μM抗ｊｕｎ-B S-ODN-179とインキュベートした細胞。Ｃ：２μM抗c-ｊｕｎ S-ODN-174とインキュベートした細胞。以下の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。実施例１細胞株及び増殖アッセイ NIH 3T3マウス線維芽細胞及びSK-Br-3ヒト乳癌細胞を100U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、5% FCSを添加したRPMI培地（ギブコ）中で培養した。PC-12ラット褐色細胞腫細胞は100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、5% FCSを添加したダルベッコの(Dulbecco's)改良イーグル培地（DMEM培地セロメド）中で培養した。実施例２ウェスタン・ブロット細胞をRPMI/ 2% FCS中で３日間、低血清条件下に置き、トリプシン処理してRP MI/ 5% FCS/ 2μM S-ODN中で５分間プレインキュベートした。３×10⁶細胞を260 ml培養フラスコ中に接種し、RPMI/5% FCS/2μM S-ODN中で指定時間培養し、トリプシン処理して、遠心して回収し、凍結により細胞分解した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ブロッティング及び化学ルミネセンス検出を標準的手法により行った。ブロットは、二次抗体としてヤギ抗ウサギIgG-アルカリホスファターゼ共役体（ベーリンガー・マンハイム）及び化学ルミネセンス検出用にCSPD（トロピクス）を使用して、ウサギ抗マウスc-ｊｕｎ抗体（オンコジーン・サイエンス）又はウサギ抗ヒトｊｕｎ-B抗体（オンコジーン・サイエンス）又はウサギ抗c-ｆｏｓ抗体（オンコジーン・サイエンス）をプローブに用いて検出した。実施例３酵素結合免疫吸着剤検定（ELISA）セルライセートをpH9.0の50mM炭酸塩バッファー中に希釈し、一晩かけてイムノンIIプレート（ダイナテク・ラボラトリーズ社）上に固定した。抗原溶液を除去し、200μl/ウェルのリン酸緩衝化食塩水(PBS)/1% BSA/0.02%アジドを加えて非特異的蛋白結合を阻止した。室温で２時間インキュベートした後、溶液を除去した。PBSで洗浄した後、プレートを３時間風乾した。c-ｊｕｎ、ｊｕｎ-B又はc-ｆｏｓに対する特異的抗体（オンコジーン、サンタクルス、バイオテクノロジー社）を50μl/ウェルずつ加え、阻止バッファーで希釈した。室温で１時間インキュベートした後、サンプルを除去し、続いてウェルをPBS/0.05% Tween20で４回洗浄した。その後、50μlの二次抗体−ホスファターゼ共役体を加え１時間後に除去した。ウェルをジエタノールアミンバッファー（10mMジエタノールアミン、0.5mM MgCl₂、pH9.5）で洗浄した。１錠のシグマ104ホスファターゼ基質を５mlのジエタノールアミンバッファーに溶解した。１ウェル当たり50μlの基質溶液を加えた。反応は50μlの0.1M EDTA（pH7.5）を加えて停止し、プレートを微量滴定プレートリーダーで読み取った。実施例４ニューロン生存率小脳を無菌条件下で８日齢ラットの脳から取り出し、リン酸緩衝化食塩水／グルコース中の0.1%トリプシン、0.1% DNase溶液中に移し、20℃で15分間処理した後、1.5%大豆トリプシン阻害剤（シグマ）で５分間処理した。細胞を、25mM KCl 、５U/mlペニシリン、５μg/mlゲンタマイシン及び30mMグルコースを添加したダルベッコの(Dulbecco's)改良イーグル培地及びハム(Ham's)のF-12培地の混合液（50%/50%、v/v；DMEM F-12、ギブコ）中で分離した。細胞を300xgで３分間遠心し、10%ウシ胎児血清（ギブコ）を添加した同じ培地中に再懸濁した。細胞(１ウェル当たり0.5ml)をポリL-リジン（10μg/ml、シグマ）でコートした３cmディッシュに１ｘ10⁵細胞／ウェルの密度で接種し、95% O₂/5% CO₂の加湿環境下のインキュベーターに移した。シトシンアラビノシド(40μM) を24時間後に加えてグリア細胞増殖を阻害した。接種後16日目に、細胞を95% N₂ /5% CO₂の加湿ガスを含む密封チャンバー棒中に置くことによって無酸素条件に1 6時間さらした。このチャンバーを37℃のインキュベーター中に移した。ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類は、無酸素条件を開始する８時間前に１μMの濃度で加えた。ニューロン細胞損傷は26時間後にトリパンブルー染料排除で染色（0.4%トリパンブルーと共に５分間インキュベート）することにより測定した。実施例５ NGF及び種々のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類で処理した後のPC-12細胞の増殖 PC-12細胞を100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、5% FCS/2μM S-ODNを添加したDMEM（セロメド）中に2,500細胞／ウェルの密度で接種した。２μM S-ODNは接種の６時間後に加えた。接種の24時間後から、細胞を10ng/mlの神経成長因子(NGF)の2.5 Sサブフラクション（ベーリンガー・マンハイム）と共に８日間インキュベートした。細胞数はトリパンブルー染料排除（0.4%トリパンブルーと共に５分間インキュベート）を用いて、ヌーバウア計数チャンバー中で細胞計数することにより測定した。実施例６ PC-12腫瘍細胞分化 PC-12細胞をポリL-リジン（10μg/ml、シグマ）でコートした96ウェルの微量滴定プレート中の100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、5% FCSを添加した100μl DMEM（セロメド）中に2,500細胞／ウェルの密度で接種した。S- ODNは接種の２時間後に２μMの濃度で加えた。接種の６時間後から、細胞を40ng /mlの神経成長因子(NGF)の2.5 Sサブフラクション（ベーリンガー・マンハイム）と共に11日間インキュベートした。

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Claims

【特許請求の範囲】１．c-ｊｕｎ、c-ｆｏｓ又はｊｕｎ-Bの発現が原因として働くニューロン損傷、変性、細胞壊死及び／又は腫瘍を予防及び治療することができる化合物を有効量含む医薬用組成物であって、当該化合物がアンチセンス核酸又はその有効な誘導体であり、前記アンチセンス核酸が遺伝子 c-ｊｕｎ、c-ｆｏｓ又はｊｕｎ-Bを含むメッセンジャーRNA(mRNA)及び／又はDNAの領域にハイブリダイズする医薬用組成物。２．c-ｊｕｎアンチセンス核酸又はヌクレオチドが配列表中SEQ ID NO.1〜55及び174〜177に規定された配列を含み、ｊｕｎ-Bアンチセンス核酸が配列表中SEQ ID NO.56〜97及び178〜179に規定された配列を含み、且つ c-ｆｏｓアンチセンス核酸が配列表中SEQ ID NO.98〜173及び180〜185に規定された配列を含み、上記の配列がいずれも、ただ一つのオリゴヌクレオチドを表わすか又は、核酸中で結合しているヌクレオチドの断片及び／又は直接共有結合しているか若しくは上記のヌクレオチド配列を隔てている他のヌクレオチドと結合している少なくとも一つの上記のヌクレオチド配列を含む核酸を表わす請求項１に記載の医薬用組成物。３．オリゴヌクレオチド類がホスホロチオエート誘導体のような修飾されたオリゴヌクレオチド類である請求項１及び／又は２に記載の医薬用組成物。４．請求項２及び／又は３に記載の医薬用組成物を製造するための中間生成物としての、請求項３及び４に記載の医薬用組成物のアンチセンスオリゴヌクレオチド類。５．固相に共有結合した最初のヌクレオチドに各ヌクレオチドが結合してヌクレオチド鎖が3'-5'方向に成長することによる亜リン酸３エステル化学を用いた固相合成によって得ることができ、この合成が以下の工程 − 先のヌクレオチドの5'DMT保護基の開裂、 − 鎖を増殖させるための各ヌクレオチドの付加、 − 亜リン酸基の修飾、次いで未反応5'-水酸基の封鎖、及び − 固体支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂、 − それに続く合成生成物の処理を含む、請求項２〜４のいずれかに記載のアンチセンス核酸又はアンチセンス− オリゴヌクレオチド類。６．腫瘍の治療並びに／又はc-ｊｕｎ、c-ｆｏｓ若しくはｊｕｎ-Bの発現が関与するニューロン損傷及び変性の予防及び治療に用いられる医薬用組成物を製造するための、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物の使用。７．請求項１〜５のいずれかに記載の有効量の医薬用組成物又は化合物を、c-ｊｕｎ、c-ｆｏｓ又はｊｕｎ-Bの発現が関与する疾患の患者に投与することにより腫瘍を治療し、並びに／又はニューロン損傷及び／若しくは変性を予防及び治療する方法。８．請求項１〜５に記載の化合物を含む診断薬。