JP2013531981A - 選択的オリゴヌクレオチド修飾の方法 - Google Patents

選択的オリゴヌクレオチド修飾の方法 Download PDF

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Abstract

少なくとも１つのポリマー、好ましくはポリアルキレンオキシドと化合物との少なくとも一方又は両方を、ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端と共有結合してネイティブライゲーション部位を形成し、オリゴヌクレオチドの５’末端のみがネイティブライゲーションによるポリマーまたは化合物の結合によって修飾される場合、ポリマーおよび／または化合物はタンパク質でもペプチドでもない、修飾オリゴヌクレオチドを生成する方法である。本発明はさらに、本発明の方法によって得ることができる修飾オリゴヌクレオチド、ならびに腫瘍、転移の形成、免疫疾患もしくは障害、心血管病もしくは障害、および／またはウイルス性疾患もしくは障害を予防および／または処理するための医薬品を調製するためのそのような修飾オリゴヌクレオチドの使用に関する。

Description

本発明は、オリゴヌクレオチド、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択的に修飾する方法であって、ポリマー、具体的にはポリアルキレンオキシドおよび／または化合物を、オリゴヌクレオチドの３’および／または５’末端と共有結合させ；当該５’または３’末端は、ネイティブライゲーションによって修飾してネイティブライゲーション部位が形成され；任意でさらなるポリマーおよび／または化合物を、好ましくはオリゴヌクレオチドコンジュゲートのネイティブライゲーション部位のシステイン残基と連結する方法に関する。
非免疫原性かつ水溶性のポリマーは、生体材料、生命工学および医学において幅広く使用されている（非特許文献１）。薬物送達の領域では、ポリマー誘導体が、たとえば免疫原性（非特許文献２）、タンパク質分解、腎臓クリアランスを減少させるため、および溶解度を増強させるために、タンパク質との共有結合において幅広く使用されている。たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、溶解度を増強させる、毒性を低下させるおよび体内分布を変更させるためにほぼ疎水性の薬物と付着させる、幅広く使用されているポリマーである。ポリエチレングリコールなどのポリマーを薬物と連結させることのさらなる目的は、分子量を大きくし、薬物の体内半減期を長くすることである。さらに、ポリマーは、細胞取り込みを増強させるおよび／またはオリゴヌクレオチドを標的に向けるために、医薬組成物中の担体として適切である、または薬物と共有結合させる。したがって、活性剤と結合したポリマーは細胞または生体システムにおいて活性剤の浸透および保持を向上させ、たとえば、治療の成功を増やすために薬剤を腫瘍、腫瘍組織、または転移に特異的に向ける（ターゲッティングする）ことを可能にする。
特許文献１には、オリゴヌクレオチドがポリマー、好ましくはポリエチレングリコールと連結されたオリゴヌクレオチドコンジュゲートが記載されている。これらのコンジュゲートはオリゴヌクレオチド合成に基づいて生成され、固体支持体上のオリゴヌクレオチドの３’→５’合成および５’→３’合成は、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートさせるポリマーの種類および／または分子の大きさによって変わる。
非特許文献３では、無保護のポリペプチドおよび／またはタンパク質をそれぞれカップリングさせて大きなポリペプチドまたはタンパク質を構築する方法として、ネイティブライゲーションを初めて報告している。後に、ネイティブライゲーションは、ペプチドとオリゴヌクレオチドとのカップリングにより、たとえば、ペプチドがオリゴヌクレオチドの５’末端に連結されたペプチド−オリゴヌクレオチド・ハイブリッドが得られるように適合された（非特許文献４及び５）。
国際公開第２００８／０７７９６５号
Zhao, 1997 Chirila, 2001 Dawson et al.（Science, 1994） Stetsenko DA et al. 2000 Pierce TL et al. 2005
本発明の目的は、ネイティブライゲーションを使用してオリゴヌクレオチドの５’末端と結合させる場合はペプチドでもタンパク質でもないことが好ましいポリマーを用いた、幅広い範囲のオリゴヌクレオチドの複数の特異的修飾、および任意で化合物を用いたオリゴヌクレオチドのさらなる修飾を可能とする方法であって、ポリマーおよび／または化合物を、オリゴヌクレオチドの３’および／もしくは５’末端ならびに／またはネイティブライゲーション部位のシステイン残基と結合させて本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを形成する方法を提供することである。この方法は、本発明の具体的にはネイティブライゲーションの緩和な反応条件のために非常に効率的であり、不要な副産物が非常に少ないことを特徴としており、本方法によって調製された生成物は臨床的投与に容易に使用することができる。さらに、本方法は、オリゴヌクレオチドの様々な位置に様々なポリマーおよび／または化合物を有する高い多様性のコンジュゲートのためのプラットフォームを提供する。
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の方法によるオリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供することである。
さらに、本発明の目的は、疾患を予防および／または処置する医薬品を調製するために本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用することであり、コンジュゲートのオリゴヌクレオチドが、疾患に関与する因子とハイブリダイズまたは相互作用する。
本発明は、オリゴヌクレオチド、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを高度に選択的に修飾する方法であって、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端をネイティブライゲーションによって修飾する方法に関する。オリゴヌクレオチドは、３’末端および／もしくは５’末端ならびに／またはネイティブライゲーション部位のシステイン残基でさらに修飾される。オリゴヌクレオチドの修飾は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの５’、３’末端および／またはシステイン残基のチオール官能基、すなわちネイティブライゲーション部位での、ポリマーおよび／または化合物とオリゴヌクレオチドとの結合に基づく。一実施形態では、５’および３’末端はネイティブライゲーションによって修飾され、５’もしくは３’末端が最初に修飾されるか、または両末端が並行して修飾される。ネイティブライゲーションによるオリゴヌクレオチドの５’および３’末端修飾の場合は、２つもの追加のネイティブライゲーション部位が作製され、これは１つまたは２つの追加のポリマーおよび／または化合物との組合せを可能にする。
好ましい実施形態では、ポリアルキレンオキシド、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーを、５’または３’末端で、ネイティブライゲーションによってネイティブライゲーション部位のシステイン残基と連結させる。この第１のステップにより、オリゴヌクレオチドおよびポリマーを含むコンジュゲートが得られる。次のステップでは、小分子、抗体、抗原、酵素や抗体、抗原もしくは酵素の一部、任意のペプチド、たとえば、内部移行ペプチド、アプタマー、発色団、マーカー、好ましくはＦＩＴＣなどの蛍光マーカー、ビオチン、ホルモン、シグナルペプチド、脂質、脂肪酸、糖、アミノ酸、受容体、受容体の一部、または受容体もしくは結合分子の任意のリガンド、あるいはポリマー、たとえばポリアルキレンオキシドなどの化合物を、ネイティブライゲーション部位、好ましくはコンジュゲートのシステイン残基と連結させる。あるいは、ポリマーまたは化合物はコンジュゲートの３’または５’末端と連結させる。さらなる代替実施形態では、ポリマーおよび／または化合物はネイティブライゲーション部位ならびにオリゴヌクレオチドの３’または５’末端と連結させる。化合物および／またはポリマーは、オリゴヌクレオチドと永久結合されるか、または、好ましくは修飾オリゴヌクレオチド、すなわちコンジュゲートが標的に達成してコンジュゲートが標的と結合する場合にオリゴヌクレオチドから離脱する。好ましい実施形態では、タンパク質およびペプチドは、それぞれ、オリゴヌクレオチドを標的まで導き、好ましくはさらなる修飾（ポリマーおよび／または化合物）を含む標的およびオリゴヌクレオチドと結合し、ペプチドまたはタンパク質から分離される。
たとえば、ネイティブライゲーションによるオリゴヌクレオチドの５’または３’末端の修飾とＮＨＳ−エステルなどのリンカーを使用した遊離３’または５’末端の修飾との組合せは、対称的または非対称的に修飾されたオリゴヌクレオチド、たとえばポリアルキル化オリゴヌクレオチド、好ましくはペグ化オリゴヌクレオチドを生成するための、驚くほど単純かつ信頼性のある方法を提供する。この方法のさらなる利点は、システイン残基での追加の官能基の形成であり、これは、たとえば、さらなるポリマー、小分子、抗体、抗原、酵素、抗体もしくは酵素の一部、任意のペプチド、たとえば、内部移行ペプチド、アプタマー（核酸、タンパク質、もしくはペプチドに基づく）、スピーゲルマー、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、発色団、マーカー、好ましくはＦＩＴＣなどの蛍光マーカー、ビオチン、ホルモン、シグナルペプチド、脂質、脂肪酸、糖、アミノ酸、受容体、受容体の一部、または受容体もしくは結合分子の任意のリガンド、あるいはグルタチオンを用いた、修飾オリゴヌクレオチドのさらなる修飾を可能にする。
代替実施形態では、ネイティブライゲーションによって５’または３’末端で修飾したオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの遊離３’もしくは５’末端、またはネイティブライゲーション部位、好ましくはネイティブライゲーション部位のシステイン残基で、チオール−セファロース等の固体支持体と一時的または恒久的に連結させる。本実施形態は、５’および／もしくは３’末端ならびに／またはネイティブライゲーション部位、ならびに／または支持体と連結していない任意の部位での、オリゴヌクレオチドのさらなる修飾を可能にする。あるいは、修飾オリゴヌクレオチドと固体支持体との連結は、キットなどの試験システムのベースとなり、および／または修飾オリゴヌクレオチドの精製を可能にする。固体支持体の一例は磁気ビーズであり、これは、たとえば磁気によるネイティブライゲーション産物の容易な単離を可能にする。
オリゴヌクレオチドと結合したポリマーおよび化合物は、それぞれ、たとえば化学構造、分子量（大きさ）、および反応性が同じまたは異なる。したがって、本発明の方法は、幅広い範囲の様々な特徴を有する高い多様性の様々なオリゴヌクレオチドコンジュゲートをもたらし、オリゴヌクレオチドを任意の要件に特異的に適応させることを可能にする。したがって、本発明は、オリゴヌクレオチド、具体的にはアンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾するためのプラットフォーム技術を表す。
例示的な遺伝子ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＰＧＥ−ｒｅｃ．、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０、ｃ−ｅｒｂｂ２（Ｈｅｒ−２）、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、およびＭＩＡのオリゴヌクレオチド配列の例を表す図である。 ネイティブライゲーションの一般的反応スキームを示し、Ｘはポリマーおよび／または化合物であり、Ｙはリンカーを含む修飾オリゴヌクレオチドである図であり、ＲＳ−は脱離基である。 ５’Ｃｙｓ−オリゴ−合成を提示する図である。ステップ１：オリゴヌクレオチドの３’末端にアミノリンカーおよび５’末端にシステイン修飾因子（ＯＭＲ）を有するオリゴヌクレオチドの合成、ステップ２：ＤＭＦ中に好ましくは２０％のピペリジンによる、システイン修飾因子からのＦｍｏｃ保護基の切断、ステップ３：支持体からのオリゴヌクレオチドの除去およびアンモニアによる永久保護基の切断を示す図である。 ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドとカップリングさせるポリマーおよび／または化合物のチオエステル修飾を示す図である。 ネイティブライゲーションによるシステイン修飾オリゴヌクレオチドの５’末端のコンジュゲーションを提示する図である。 たとえばジピリジルジスルフィドによる、システイン残基のチオール官能基（ネイティブライゲーション部位）のそれぞれ保護および活性化を示し、Ｒはポリマーおよび／または化合物である図である。 たとえばＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）リンカーによる、５’末端がコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの３’末端のコンジュゲーションを実証し、Ｒ’およびＲ’’はポリマーおよび／または化合物である図である。 たとえばシステイン修飾した固体支持体を使用した、３’−システインオリゴヌクレオチド合成の例を提示する図である。 非修飾オリゴヌクレオチドと比較した、Ｓ１エンドヌクレアーゼに対する修飾オリゴヌクレオチドの増加する安定性を実証し、図９ａは非修飾オリゴヌクレオチドに言及し、図９ｂはｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００（オリゴヌクレオチドの５’末端にｍＰＥＧ４００およびオリゴヌクレオチドの３’末端にｍＰＥＧ１０００）に言及し、図９ｃはｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００（オリゴヌクレオチドの５’末端にｍＰＥＧ１０００およびオリゴヌクレオチドの３’末端にｍＰＥＧ４００）に言及する図である。試料は、０時間、１時間、２４時間、４８時間、７２時間、および１４４時間のＳ１エンドヌクレアーゼを用いたインキュベーション時に採取した図である。 非修飾オリゴヌクレオチドと比較した、５’−エキソヌクレアーゼに対する修飾オリゴヌクレオチドの増加した安定性を提示し、図１０ａは非修飾オリゴヌクレオチドに言及し、図１０ｂはｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００（オリゴヌクレオチドの５’末端にｍＰＥＧ４００およびオリゴヌクレオチドの３’末端にｍＰＥＧ１０００）に言及し、図１０ｃはｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００（オリゴヌクレオチドの５’末端にｍＰＥＧ１０００およびオリゴヌクレオチドの３’末端にｍＰＥＧ４００）に言及する図である。試料は、０時間、１時間、２４時間、４８時間、７２時間、および１４４時間の５’−エキソヌクレアーゼを用いたインキュベーション時に採取した図である。 非修飾オリゴヌクレオチドと比較した、３’−エキソヌクレアーゼに対する修飾オリゴヌクレオチドの増加した安定性を示し、図１１ａは非修飾オリゴヌクレオチドに言及し、図１１ｂはｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００（オリゴヌクレオチドの５’末端にｍＰＥＧ４００およびオリゴヌクレオチドの３’末端にｍＰＥＧ１０００）に言及し、図１１ｃはｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００（オリゴヌクレオチドの５’末端にｍＰＥＧ１０００およびオリゴヌクレオチドの３’末端にｍＰＥＧ４００）に言及する図である。試料は、０時間、１時間、２４時間、４８時間、７２時間、および１４４時間の３’−エキソヌクレアーゼを用いたインキュベーション時に採取した図である。 本発明によるネイティブライゲーションによって５’末端で修飾された５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドのネイティブライゲーション部位でのペプチドとの模式的カップリングを提示する図である。オリゴヌクレオチドの活性化されたチオール残基は、ジスルフィド結合を形成し、ピリジンチオン（ｐｙｒｉｄｉｎｔｈｉｏｎ）を排除することによって、ペプチドのＣ末端の遊離チオール残基と反応する図である。 図１２に提示した原理に基づいた、配列番号２４６１の３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドとペネトラチンとの反応の結果を示す図である（実施例１４を参照）。図１３ａでは、生成物の試料を１９％のＰＡＧＥゲル上に載せ、これを銀染色した。Ｍは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）−２ヌクレオチド、ＡＳＯ−１ヌクレオチド、すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチドマイナス１個または２個の核酸、ＡＳＯ、ｍＰＥＧ４００−ＡＳＯ−ｍＰＥＧ４００、ｍＰＥＧ１０００−ＡＳＯ−ｍＰＥＧ１０００を含むマーカーであり、レーン１はペネトラチンを用いない３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン２は０．５×過剰量のペネトラチンを用いた３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン３は１×過剰量のペネトラチンを用いた３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン４は２×過剰量のペネトラチンを用いた３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン５は４×過剰量のペネトラチンを用いた３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン６は８×過剰量のペネトラチンを用いた３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン７は１６×過剰量のペネトラチンを用いた３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示す。ペネトラチンの過剰量に応じて、ペネトラチンと連結したＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドの量が増加する。図１３ｂは、図１３ａに従って、レーン１）によるペネトラチンを用いない３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチド（Ａ）、ならびにレーン４）による、ネイティブライゲーション部位と連結した２×の過剰量のペネトラチンを用いたもの（Ｂ）およびレーン６）による８×を用いたもの（Ｃ）のクロマトグラムを示す図である。図１３ｃはクロマトグラムの曲線をより詳細に示し、線Ａは３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを表し、線Ｂは、３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを表し、２×過剰量のペネトラチンを修飾オリゴヌクレオチドに加えた場合にペネトラチンが修飾オリゴヌクレオチドと連結され、線Ｃは、３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを表し、８×過剰量のペネトラチンを修飾オリゴヌクレオチドに加えた場合にペネトラチンが修飾オリゴヌクレオチドと連結される図である。 図１２に提示した原理に基づいた、配列番号２０３０の５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドとペネトラチンとの反応の結果を示す図である（実施例１４を参照）。図１４ａでは、生成物の試料を１９％のＰＡＧＥゲル上に載せ、これを銀染色した。Ｍは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）−２ヌクレオチド、ＡＳＯ−１ヌクレオチド、ＡＳＯ、ｍＰＥＧ４００−ＡＳＯ−ｍＰＥＧ４００、ｍＰＥＧ１０００−ＡＳＯ−ｍＰＥＧ１０００を含むマーカーであり、レーン１はペネトラチンを用いない５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン２は０．５×過剰量のペネトラチンを用いた５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン３は１×過剰量のペネトラチンを用いた５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン４は２×過剰量のペネトラチンを用いた５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン５は４×過剰量のペネトラチンを用いた５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン６は８×過剰量のペネトラチンを用いた５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示す。ペネトラチンの過剰量に応じて、ペネトラチンと連結したＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドの量が増加する。図１４ｂは、図１４ａに従って、レーン１）によるペネトラチンを用いない５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチド（Ａ）、ならびにレーン２）による、ネイティブライゲーション部位と連結した０．５×過剰量のペネトラチンを用いたもの（Ｂ）、レーン４）による２×を用いたもの（Ｃ）、およびレーン６）による８×を用いたもの（Ｄ）のクロマトグラムを示す図である。図１４ｃはクロマトグラムの曲線をより詳細に示し、線Ａは５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを表し、線Ｂは、５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを表し、０．５×過剰量のペネトラチンを修飾オリゴヌクレオチドに加えた場合にペネトラチンが修飾オリゴヌクレオチドと連結され、線Ｃは、５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを表し、２×過剰量のペネトラチンを修飾オリゴヌクレオチドに加えた場合にペネトラチンが修飾オリゴヌクレオチドと連結され、線Ｄは、５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを表し、８×過剰量のペネトラチンを修飾オリゴヌクレオチドに加えた場合にペネトラチンが修飾オリゴヌクレオチドと連結される図である。 接近可能なネイティブライゲーション部位を有さない配列番号２０３０の５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドの実験の結果を提示する図である。したがって、ペネトラチンをオリゴヌクレオチドに加えたとしても、図１２に提示した原理に基づいて連結は検出可能でなく（実施例１４を参照）、ネイティブライゲーション部位が遮断されている。生成物の試料を１９％のＰＡＧＥゲル上に載せ、これを銀染色した。Ｍは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）−２ヌクレオチド、ＡＳＯ−１ヌクレオチド、ＡＳＯ、ｍＰＥＧ４００−ＡＳＯ−ｍＰＥＧ４００、ｍＰＥＧ１０００−ＡＳＯ−ｍＰＥＧ１００を含むマーカーであり、レーン１はペネトラチンを用いない５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン２は０．５×過剰量のペネトラチンを用いた５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン３は１×過剰量のペネトラチンを用いた５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン４は２×過剰量のペネトラチンを用いた５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン５は４×過剰量のペネトラチンを用いた５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示す図である。ネイティブライゲーション部位が遮断されている場合は、ペネトラチンの過剰量にかかわらず、ペネトラチンとの連結は観察されない。 図１２に提示した原理に基づいた、５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドとＲＧＤＣペプチドとの反応の結果を提示する図である（実施例１５を参照）。図１６Ａでは、生成物の試料を１９％のＰＡＧＥゲル上に載せ、これを銀染色した。Ｍは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）−２ヌクレオチド、ＡＳＯ−１ヌクレオチド、ＡＳＯ、ｍＰＥＧ４００−ＡＳＯ−ｍＰＥＧ４００、ｍＰＥＧ１０００−ＡＳＯ−ｍＰＥＧ１００を含むマーカーであり、レーン１は５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示し、レーン２は５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドのネイティブライゲーション部位と連結した０．５×過剰量のＲＧＤＣペプチドの反応生成物を示し、レーン３は５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドのネイティブライゲーション部位と連結した２×過剰量のＲＧＤＣペプチドの反応生成物を示し、レーン４は８×過剰量、レーン５は１６×過剰量である。図１６Ｂは、図１６Ａに従って、レーン１）によるＲＧＤＣを用いない５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチド（Ａ）ならびにレーン３）による、ネイティブライゲーション部位と連結した２×過剰量のＲＧＤＣを用いたもの（Ｂ）およびレーン４）による８×を用いたもの（Ｃ）のクロマトグラムを示す図である。図１６Ｃはクロマトグラムの曲線をより詳細に示し、線Ａは５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを表し、線Ｂは５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを表し、２×過剰量のＲＧＤＣを修飾オリゴヌクレオチドに加えた場合にＲＧＤＣが修飾オリゴヌクレオチドと連結され、線Ｃは５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを表し、８×過剰量のＲＧＤＣを修飾オリゴヌクレオチドに加えた場合にＲＧＤＣが修飾オリゴヌクレオチドと連結される図である。 図１４に従った、神経膠腫細胞に対する、ＡＰ１２００９が５’末端でネイティブライゲーションによって修飾されている５’／３’末端ＰＥＧ修飾ＡＰ１２００９（誘導体＃２６）の効果と、ＡＰ１２００９が５’末端でネイティブライゲーションによって修飾されており、ＲＧＤＣがネイティブライゲーション部位に連結している、５’／３’末端をＰＥＧおよびＲＧＤＣで修飾したＡＰ１２００９（誘導体＃２８）の効果との比較を提示する図である（実施例１６を参照）。図１７Ａは神経膠腫細胞の増殖の効果を示す図であり、図１７Ｂは、ＴＧＦ−β２の発現に対する効果、すなわち、ＡＰ１２００９およびそのネイティブライゲーションによって修飾された形態の阻害効果を示す図である。黒色のカラムはＡＰ１２００９を示し、薄い灰色のカラムはｍＰＥＧ４００−ＡＰ１２００９−ｍＰＥＧ１０００（誘導体＃２６）を示し、濃い灰色のカラムは、ネイティブライゲーション部位でＲＧＤＣと連結された５’／３’末端ＰＥＧ修飾ＡＰ１２００９、すなわちｍＰＥＧ４００−（ＲＧＤＣ−Ｓ）−Ｃｙｓ−ＡＰ１２００９−ｍＰＥＧ１０００（誘導体＃２８）を示す図である。誘導体＃２８は、非修飾ＡＰ１２００９および誘導体＃２６と比較して、神経膠腫細胞においてＴＧＦ−ベータ２の発現を抑制するために最も効率的な形態である。本実験中で使用したＡＰ１２００９、誘導体＃２６、および＃２８の濃度は、０μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２．５μＭ、５μＭ、または１０μＭであった。 不可逆的結合の例として、システインを含む５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドとヨードアセトアミド−フルオレセインとの反応の結果を示す図である。図１５では、遊離体および生成物を１９％のＰＡＧＥゲル上に載せ、これを銀染色した。Ｍは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）−２ヌクレオチド、ＡＳＯ−１ヌクレオチド、ＡＳＯ、ｍＰＥＧ４００−ＡＳＯ−ｍＰＥＧ４００、ｍＰＥＧ１０００−ＡＳＯ−ｍＰＥＧ１００を含むマーカーであり、レーン１は、フルオレセインを有さない５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチド（遊離体）を示し、レーン２は、修飾オリゴヌクレオチドのネイティブライゲーション部位と連結されたフルオレセインを有する５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを示す図である。
本発明は、ネイティブライゲーションによるオリゴヌクレオチド５’末端の特異性の高い修飾に基づく、広範囲のオリゴヌクレオチドコンジュゲートのプラットフォームを提供する方法に関する。好ましくは、オリゴヌクレオチド５’末端をネイティブライゲーションによるポリマーおよび／または化合物の結合によって修飾する。システイン残基のチオール官能基はネイティブライゲーション部位と呼ばれる。ネイティブライゲーション後に残るシステイン残基は、ポリマーおよび／または化合物の結合によって任意で修飾される。同様に、オリゴヌクレオチドの３’末端もポリマーおよび／または化合物の結合によって任意で修飾され、オリゴヌクレオチド３’末端は、１）第１のステップにおいて、２）オリゴヌクレオチド５’末端の修飾後の第２のステップにおいて、または３）オリゴヌクレオチドおよびコンジュゲートのそれぞれ５’末端およびネイティブライゲーション部位の修飾後の第３のステップにおいて、修飾される。ネイティブライゲーション部位（好ましくはポリマーおよび／または化合物とオリゴヌクレオチドとのコンジュゲートのシステイン残基である）は、オリゴヌクレオチド３’末端の修飾前または修飾後のさらなるポリマーおよび／または化合物の結合によって修飾される。
あるいは、オリゴヌクレオチド３’末端は、ネイティブライゲーションによってポリマーおよび／または化合物で修飾され、任意で更に、オリゴヌクレオチド５’末端、および／またはネイティブライゲーション部位のシステイン残基は、ポリマーおよび／または化合物との結合によって修飾される。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの様々な位置を修飾する順序は、オリゴヌクレオチドコンジュゲートの特徴に影響を与えない。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドを修飾するステップの順序は、特定のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを達成するために重要である。好ましくは、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端は、遊離３’もしくは５’末端を修飾する前、またはネイティブライゲーション部位を修飾する前の第１のステップにおいて、ネイティブライゲーションによって修飾される。
別の実施形態では、両末端、すなわち、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端は、一方の末端の後に他方の末端が、または両末端が並行して、ネイティブライゲーションによって修飾される。オリゴヌクレオチドの一方の末端を他方の後にネイティブライゲーションによって修飾する場合、第１の末端をネイティブライゲーションによって修飾する際に第２の末端を保護しなければならない。好ましい保護基は直交保護基である。
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドおよび／またはネイティブライゲーション部位の５’末端および／または３’末端、具体的にはシステイン残基、またはオリゴヌクレオチドの任意の他の残基は、ポリマーおよび／または化合物の結合の前にリンカーを結合させることによって修飾する。リンカーは高い多様性の様々な化学結合をもたらし、オリゴヌクレオチドのそれぞれの位置、好ましくはオリゴヌクレオチドの５’、３’末端および／またはネイティブライゲーション部位でのポリマーおよび／または化合物の可逆的または不可逆的結合を可能にする。
あるいは、固体支持体を修飾オリゴヌクレオチドに、好ましくはオリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端および／またはネイティブライゲーション部位で結合させる。固体支持体と修飾オリゴヌクレオチドとの結合は、たとえば、他の全ての方法でも達成可能でない高度に精製された修飾オリゴヌクレオチド等を得るためのキットまたは精製システムのベースとなる。
固体支持体とは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートが任意でリンカーを介して連結している、不溶性・不活性・官能性であり、好ましくはポリマー性の材料であり、たとえば、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの過剰量の試薬、可溶性反応副産物、または溶媒から容易な分離（濾過、遠心分離などによる）を可能にする。固体支持体の例は、磁気ビーズ、または制御孔ガラスなどのオリゴヌクレオチド合成に使用される支持体、またはチオール含有コンジュゲート（たとえばチオール活性化セファロース）をそれぞれ単離および分離するためのチオール活性化セファロースである。
本方法によれば、無数の修飾体、たとえば明細書中に明示したあらゆる様々な修飾体の構築が可能となるため、たとえば抗体による薬物ターゲッティングと、ポリアルキレンオキシドなどのポリマーによるオリゴヌクレオチドの半減期延長とを組み合わせるなどの特定の要求に合わせてオリゴヌクレオチドを（任意で高い純度で）修飾するための有利なプラットフォームを提供する。本方法では、任意の所望の用途および機能のそれぞれに合わせて、好ましくは保護基を使用しないで、高度に特異的に修飾されたオリゴヌクレオチドが生成される。
本発明の方法は、有利には、本明細書に記載したポリマーおよび／または化合物の分子量の種類または大きさのそれぞれによって制限されない。
少なくとも１つのポリマー、たとえばデンプンは、直鎖状または分枝状のどちらかであり、ポリマーは、１つまたは複数、たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の分岐点を含む。用語「分枝状」は、リンカー、たとえばＬｙｓコアによって組み合わされて「偽分枝状」ポリマーを形成する、ポリアルキレンオキシド、具体的にはＰＥＧなどのポリマーをさらに含む。この場合、ポリマーは複数ポリマー複合体の単量体を表す。
本発明によるポリマーは、単量体および／または単量体の集団である巨大分子からなる任意のクラスの天然および／または合成の物質であり、ポリマーは、任意選択で天然および／または合成の単量体を含む。単量体はすべて同じであるまたは同じ構造を有する必要はなく、ホモまたはコポリマーを形成する。ポリマーは、非分枝状もしくは分枝状の単量体の長い鎖、および／または二もしくは三次元の架橋結合された単量体のネットワークからなる。その主鎖は柔軟または強固である。多くの重要な天然材料は、たとえば、多糖、ポリペプチド、タンパク質、リグニン、ゴム、または核酸を含めた有機ポリマーである。ポリマーは、好ましくは、本発明におけるオリゴヌクレオチドの大きさおよび分子量を増加させる、ならびに／またはオリゴヌクレオチドを標的まで導く。本出願におけるポリマーは、ポリアルキレンオキシド、より好ましくはポリエチレングリコール、たとえば、アルファ−、オメガ−ジヒドロキシルポリエチレングリコール、生分解性ラクトン系ポリマー、たとえば、ポリアクリル酸、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシアノアクリレート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ、ＰＥＴＧ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＥ）、ポリテトラメチレングリコール（ＰＴＧ）、またはポリウレタン、およびその混合物などの、生体適合性材料を含む。混合物とは、同じ化合物内での異なるポリマーの使用、およびブロックコポリマーをいう。ブロックコポリマーとは、ポリマーの少なくとも１つのセクションが別のポリマーの単量体から構築されているポリマーである。本発明の好ましいポリマーは、ＰＥＧなどのポリアルキレンオキシド、およびポリエチレンイミド（ＰＥＩ）、またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）であり、ＨＥＳは、好ましくは、チオール官能基によってネイティブライゲーション部位のシステイン残基と結合する。そのような材料の選択は、ポリマーの安定性および毒性などのいくつかの要因に依存する。
本発明の化合物は、小分子；抗体、たとえばＭＵＪ５９１；糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＤ５２、ＣＤ２５、ＶＥＧＦ、表皮成長因子、ＣＤ３３、ＣＤ２０、または炭酸脱水酵素と結合する抗体；抗原、たとえば前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の外部ドメイン；酵素、抗体または酵素の一部；任意のペプチド、たとえば、内部移行ペプチド、ペネトラチンなどの細胞浸透ペプチド（実施例１４を参照）、ＴＡＴ（トランス活性化因子もしくは転写）、トランスポータン（たとえばＴＰ１０）、Ｒ９ペプチド、ＭＰＧペプチド、ＫＡＬＡペプチド、ｐＨ（低）挿入ペプチド、ＬＨＲＨなどのホルモンペプチド、ボンベシン、ソマトスタチン、またはＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）、具体的には直鎖状もしくは環状ＲＧＤ（実施例１５を参照）などのターゲッティングペプチド；アプタマー（核酸、タンパク質、またはペプチドに基づく）、スピーゲルマー、ｓｉＲＮＡ、たとえばコレステロール修飾したｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ヒト血清アルブミン担体、腫瘍抗原、たとえば、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＨＩＦアルファなどの腫瘍ワクチン、または免疫刺激剤；ＴＭＺ、ＢＣＮＵ、ＤＴＩＣ、５−フルオロウラシル（ＦＵ）、ゲムシタビン、タキソール（パクリタキセル）、イリノテカ、オキサリプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、フォリン酸などの細胞毒素；発色団、マーカー、たとえば、ＦＩＴＣ、フルオレセインなどの蛍光マーカー（実施例１７を参照）、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドまたはフルオレスカミン、ビオチン；造影剤、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、またはシュウ酸エステルなどの化学発光性剤、ルシフェリン、ルシフェラーゼまたはエクオリンなどの生物発光剤、ホルモン、シグナルペプチド、脂質、脂肪酸、たとえば共役リノール酸、糖、アミノ酸、受容体、受容体の一部、または受容体の任意のリガンド、たとえばＣＸＣＲ４ケモカイン受容体もしくは結合分子の拮抗剤、あるいは、グルタチオントランスフェラーゼによって、たとえば血液脳関門を通過するコンジュゲートの送達を増強させるグルタチオンなどの、機能的特徴を有する任意の物質である。
ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）ペプチドはたとえば直鎖状または環状であり、ＲＧＤ、たとえば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＯＨ、もしくはＨ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＯＨからなる、またはＲＧＤを含む。
本発明の化合物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドのターゲッティングおよび／または検出を対象とする。有利には、化合物、具体的にはマーカーおよび発色団は、好ましくはネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドと、またはネイティブライゲーション部位としっかりと結合しており、これは、とりわけ、非結合のマーカー、発色団などが原因の偽陽性結果の危険性を低下させる。
好ましい実施形態では、ネイティブライゲーション部位によってオリゴヌクレオチドと連結されているポリマーおよび／または化合物は、追加の立体的に利用可能なシステイン残基を、好ましくはポリマーおよび／または化合物の潜在的なさらなる結合のために、たとえば、ポリマーおよび／または化合物の末端または内部、たとえばペプチドなどのＮ末端、Ｃ末端またはポリマーもしくは化合物内等に含む。
本発明のコンジュゲートは、ポリマーおよび／または化合物をオリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端および／またはネイティブライゲーション部位（複数可）に含むオリゴヌクレオチド、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドの５’末端（図５）もしくは３’末端（図８）または両末端は、ネイティブライゲーションによって修飾されている。オリゴヌクレオチドの修飾とは、ポリマーおよび／または化合物とオリゴヌクレオチド、好ましくはオリゴヌクレオチドおよび／またはネイティブライゲーション部位の５’末端および／または３’末端との結合を意味し、ポリマーおよび／または化合物は、ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’および／もしくは３’末端と結合している、またはリンカーを用いてもしくは用いずに５’もしくは３’末端のうちの一方と結合している。
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの遊離末端はオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端のそれぞれであり、これは任意選択でリンカーと結合しており、ポリマーおよび／または化合物を含まない。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの遊離末端は、リンカーを用いてまたは用いずにポリマーおよび／または化合物と結合させるために適している。
少なくとも１つのポリマーおよび／または少なくとも１つの化合物とオリゴヌクレオチドとの直接結合は、コンジュゲート、すなわち、ポリマー−オリゴヌクレオチド、化合物−オリゴヌクレオチド、または混合化合物−ポリマー−オリゴヌクレオチドのコンジュゲートをもたらす。さらなるポリマーおよび／または化合物が、任意選択で、オリゴヌクレオチドおよびコンジュゲートのそれぞれに、オリゴヌクレオチドの任意の位置、たとえば、リン酸基、糖部分、および／またはオリゴヌクレオチドの塩基、好ましくはオリゴヌクレオチドの５’、３’末端および／もしくはネイティブライゲーション部位で直接、あるいは既にオリゴヌクレオチドおよびコンジュゲートのそれぞれと結合したポリマーまたは化合物によって間接的に結合している。オリゴヌクレオチドの５’末端のみがネイティブライゲーションによってポリマーまたは化合物で修飾される場合は、ポリマーまたは化合物は、好ましくはペプチドでもタンパク質でもない。
さらなる実施形態では、１つまたは複数のポリマーおよび／または化合物は、リンカーを用いてまたは用いずに、オリゴヌクレオチドならびに／または既にオリゴヌクレオチドと結合したポリマーおよび／もしくは化合物と結合させる。用語「リンカー」は、任意の種類のリンカー、好ましくは架橋結合剤を含み、オリゴヌクレオチドならびに少なくとも１つのポリマーおよび／または化合物などの、少なくとも２つの分子と結合することができる任意の化学物質をいう。リンカーには、ゼロ長のリンカー、ホモ二官能性架橋結合剤、ヘテロ二官能性架橋結合剤などが含まれる。様々なリンカーが本発明のコンジュゲート中でそれぞれ使用可能かつ組み合わせ可能である。さらに、リンカーは、修飾されているまたは修飾させる２つ以上のオリゴヌクレオチドを連結させる。リンカーに応じて、ポリマーおよび／または化合物とオリゴヌクレオチドとの結合は、可逆的、たとえばジスルフィド結合によるもの、または不可逆的、たとえばチオエーテル結合によるものである。
ポリマーおよび／または化合物、好ましくはペプチドをネイティブライゲーション部位に連結させるリンカーの例は、ペンタフルオロフェニルＳ−ベンジル−チオスクシネート（たとえばｌｉｎｋ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＯＰｅＣ（登録商標）コンジュゲーション試薬）などのペプチド修飾試薬（ＰＭＲ）である。
本発明のさらなるリンカーは、たとえば、ロマント（Ｌｏｍａｎｔ）試薬ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオネート）ＤＳＰ、３’３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（ＤＴＳＳＰ）、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）（ＢＳ）、酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）、酒石酸ジスルホスクシンイミジル（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、グルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ピメルイミド酸ジメチル（ＤＭＰ）、スベルイミノ酸ジメチル（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、たとえば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンまたは１，３−ジフルオロ−４，６−ジニトロベンゼン、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ−トルイジン、３，３’−ジメチルベンジジン、ベンジジン、α、α’−ｐ−ジアミノジフェニル、ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）などのホモ二官能性リンカーである。
反応の特異性を増加させる、ヘテロ二官能性リンカーを用いた連結が好ましい。ヘテロ二官能性リンカーの例は、アミン反応性およびスルフヒドリルの架橋結合剤、たとえば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ−ｓＰＤＰ）、水溶性長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ−ＬＣ−ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ｓＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢｓ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ｓＭＰＢ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢｓ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢｓ）、スクシンイミジル６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル６−［６−（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノエート（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル６−（（（（４−ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性およびスルフヒドリル反応性の架橋結合剤、たとえば、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド−８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、アミン反応性および光反応性の架橋結合剤、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨｓ−ＡｓＡ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（スルホ−ＮＨｓ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−（４−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＮＨｓ−ＬＣ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨｓＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ−ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯｓ）、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ−スクシンイミジル−４（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオネート（スルホ−ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−アジドフェニル）ブチレート（スルホ−ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマイン−３−アセテート（スルホ−ｓＡＭＣＡ）、ｐ−ニトロフェニルジアゾピルベート（ｐＮＰＤＰ）、ｐ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ−ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応性および光反応性の架橋結合剤、たとえば、１−（ｐ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン−４−マレイミド、カルボニル反応性および光反応性の架橋結合剤、たとえばｐ−アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボキシレート反応性および光反応性の架橋結合剤、たとえば４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、ならびにアルギニン反応性および光反応性の架橋結合剤、たとえばｐ−アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）である。さらなる詳細にはHermanson（1996）を参照されたい。
任意でリンカーが含まれるオリゴヌクレオチド、ポリマーおよび／または化合物は互いに共有結合しており、ポリマーおよび／または化合物は、好ましくはオリゴヌクレオチドの５’末端および／もしくは３’末端ならびに／またはネイティブライゲーション部位と結合している。任意選択で、オリゴヌクレオチド、ポリマーおよび／または化合物は、分子間力、イオン相互作用、たとえばワトソン−クリック塩基対合などの非共有結合を形成し、ポリマーおよび／または化合物は、同様に好ましくはオリゴヌクレオチドの５’末端および／もしくは３’末端ならびに／またはネイティブライゲーション部位と結合している。
本発明に従って修飾されたオリゴヌクレオチドの大きさは、少なくとも５個のヌクレオチド、好ましくは５〜７０個のヌクレオチド、より好ましくは１０〜６０個のヌクレオチド、さらにより好ましくは１０〜４０個のヌクレオチドを含む、またはそれからなり、１２〜２５個のヌクレオチドがさらに好ましく、１２〜２０個のヌクレオチドが最も好ましい。具体的には、オリゴヌクレオチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチドを含む、またはそれからなる。オリゴヌクレオチドは、任意の様式で、好ましくは化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、もしくはその組合せによって作製するか、または天然源から単離する。
好ましくは、本発明におけるオリゴヌクレオチドは、たとえば追加の官能基、たとえばアミノ基を、たとえばオリゴヌクレオチドの一末端または両末端に有するオリゴヌクレオチド誘導体を含めた、任意の種類のオリゴヌクレオチドを含む。これらの基は、たとえばポリマーおよび／または化合物との反応のベースとなり、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドなどのコンジュゲートがもたらす。
さらに、オリゴヌクレオチドは、塩基、糖、およびリン酸部分からなるヌクレオチド構成単位を含む。オリゴヌクレオチドには、類似の機能を有する天然に存在しないオリゴヌクレオチド構成単位を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチド、塩基、糖または主鎖におけるこれらのヌクレオチドの修飾体、ならびに少なくとも１つのヌクレオチドの代わりのスペーサーも、ヌクレオチド構成単位と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの修飾体は、たとえば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、または糖の２’−修飾（たとえば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシ−エチルオリゴヌクレオチド、もしくは２’−デオキシ−２’−フルオロオリゴヌクレオチド）である。
オリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも５個のヌクレオチド構成単位、好ましくは５〜１２０個のヌクレオチド構成単位、より好ましくは８〜３０個のヌクレオチド構成単位、さらにより好ましくは１０〜２８個のヌクレオチド構成単位、さらにより好ましくは１２〜２６個のヌクレオチド構成単位、最も好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６個のヌクレオチド構成単位を含む。
用語「ヌクレオチド構成単位」は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有的ヌクレオシド間（主鎖）連結からなるヌクレオチド（これらのそれぞれは部分とも呼ばれる）、ならびに、同様に機能する、たとえば選択された標的の同じｍＲＮＡとハイブリダイズする、天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、塩基は同様の分子によって修飾または置換されている。同様の塩基は、ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションも支持することができる、または少なくともハイブリダイゼーションに負の様式で影響を与えない分子である。一部の実施形態では、少なくとも１つの塩基部分がスペーサーで置換される。
他の実施形態では、ヌクレオチド構成単位の糖部分は、別の基、構造、または部分によって修飾または置換される。糖の例は、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはこれらの糖の安定化された修飾体である。一部の実施形態では、スペーサーが糖を置換する。
他の実施形態では、２つのヌクレオチド構成単位間の連結とも呼ばれるヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルではなく、別の基、構造、または部分である。少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド構成単位を有するそのようなオリゴヌクレオチドは、増強された細胞取り込み、核酸標的に対する増強された親和性、ヌクレアーゼの存在下における増加した安定性および／または増強された治療有効性などの望ましい特性が理由で、しばしばネイティブ形態よりも好ましい。
修飾ヌクレオチド構成単位を有するオリゴヌクレオチドは、たとえば、以下に示すペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびモルホリノをさらに含む。
ＰＮＡはＤＮＡおよびＲＮＡに化学的に類似であり、一般に人工合成される。ＰＮＡの主鎖は、たとえば、ペプチド結合によって連結された反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からなる。様々なプリン塩基およびピリミジン塩基は、好ましくは、メチレンカルボニル結合によって主鎖に連結されている。
ＬＮＡは修飾されたＲＮＡであり、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２位および４位の炭素を連結する追加のブリッジで修飾されている。ブリッジはリボースを３’末端コンホメーションに「ロック」し、これはＡ型のＤＮＡまたはＲＮＡに見つかることが多い。ＬＮＡはオリゴヌクレオチド中でＤＮＡまたはＲＮＡ塩基と組合せ可能である。
モルホリノオリゴヌクレオチドとは、他の分子が特定の配列を有する核酸に接近することを遮断するために使用されるアンチセンス技術である。モルホリノは、ＲＮＡまたはＤＮＡの塩基対合表面の小さな（約２５個の塩基）領域をブロックする。
本発明において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはその模倣体のオリゴマーをいい、ヌクレオチド構成単位ポリマーとも呼ばれる。用語、オリゴヌクレオチドは一本鎖および二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡを含む。二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡの場合、鎖は平滑末端である、またはオーバーハング末端を有しており、一方の鎖が他方の鎖の一方の末端もしくは他方の鎖の両末端にオーバーハングを有する、または、一方の鎖が一方の側にオーバーハングを有し、他方の鎖が他方の側にオーバーハングを有する。
用語「オリゴヌクレオチド」は、アプタマーおよび／またはスピーゲルマーをさらに含む。アプタマーとは、少なくとも５または８個のヌクレオチド、好ましくは１０〜１００個のヌクレオチド、より好ましくは２５〜７５個のヌクレオチド、さらにより好ましくは３０〜７０個のヌクレオチド、最も好ましくは４０〜６０個のヌクレオチドを含み、古典的なワトソン−クリック塩基対合以外の相互作用を介して分子に対する特異的結合親和性を有する、核酸分子である。アプタマーは、好ましくはナノモーラーからピコモーラーの範囲の親和性で、小分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織および生物などの様々な分子標的と結合するように、反復回数のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択、または等価にはＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化）によって操作する。アプタマーは、たとえば、完全に試験管中で操作され、化学合成によって容易に生成され、望ましい貯蔵特性を保有し、治療的応用において免疫原性をわずかのみ誘発するまたは誘発しない。さらに、アプタマーはリボザイムと組合せ可能であり、その標的分子の存在下で自己開裂する。
スピーゲルマーはアプタマーに基づいて開発される。これらはＬ型を有するヌクレオチドからなり、ヌクレアーゼに対する高い耐性をもたらす。したがって、スピーゲルマーは、アプタマーのすべての多様性特徴、および好ましくは低いナノモーラーからピコモーラーの範囲のその結合特徴を有するが、酵素分解を妨げる構造を保有する。アプタマーおよびスピーゲルマーは、受容体またはそのリガンドなどの細胞外および細胞内の分子の両方、転写因子、または脂質含有分子と結合する。
さらに、用語「オリゴヌクレオチド」は、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。ＲＮＡｉとは、ＲＮＡに導かれた遺伝子発現の調整の機構であり、二本鎖リボ核酸が、好ましくは相補的ヌクレオチド配列を用いて遺伝子の発現を阻害する。ＲＮＡｉ経路は酵素ダイサーによって開始され、これは二本鎖ＲＮＡを短い二本鎖断片、好ましくは１５〜３５塩基対、より好ましくは２０〜３０塩基対、最も好ましくは２０〜２５塩基対のものへと切断する。「導く鎖」である、それぞれの断片の２本の鎖のうちの一方がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内に取り込まれ、相補的配列と塩基対合する。ＲＮＡｉの最も十分に研究された効果は転写後の遺伝子サイレンシングであり、これは、たとえばＲＩＳＣ複合体の触媒構成成分であるアルゴノートによって、導く鎖がｍＲＮＡと塩基対合し、ｍＲＮＡの分解を誘導する際に起こる。短い断片は低分子干渉またはサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られており、これは好ましくは抑制する遺伝子に完全に相補的である。ＲＮＡｉ経路におけるその役割に加えて、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ関連経路において、たとえば抗ウイルス機構として、またはゲノムのクロマチン構造の形成においても作用する。ｓｉＲＮＡと同様に、１５〜３０個のヌクレオチド、好ましくは２０〜３０個のヌクレオチド、最も好ましくは２１〜２３個のヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子であるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、好ましくは遺伝子発現を調整する。ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写されるが、タンパク質へと翻訳されない遺伝子によってコードされている（非コードＲＮＡ）。その代わりに、ｍｉＲＮＡは、プレ−ｍｉＲＮＡとして知られる一次転写物から、好ましくはプレ−ｍｉＲＮＡなどの短いステム−ループ構造へ、最終的には機能的ｍｉＲＮＡへとプロセッシングされる。遺伝子サイレンシングに関与していることが好ましいさらなる種類のＲＮＡは、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。ｓｈＲＮＡとは、好ましくはＲＮＡｉによって遺伝子発現をサイレンシングするために適している、密なヘアピンターンを作るＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、細胞内に導入されたベクターを使用し、ｓｈＲＮＡが発現されることを確実にするためにプロモーター、好ましくはＵ６プロモーターを利用する。ベクターは好ましくは娘細胞に伝えられ、遺伝子サイレンシングが受け継がれることを可能にする。細胞機構は、好ましくはｓｈＲＮＡのヘアピン構造を好ましくはｓｉＲＮＡへと切断し、その後、これはＲＩＳＣと結合して上述の機構を開始させる。
さらに、用語「オリゴヌクレオチド」はＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。ＣｐＧモチーフは、細菌ＤＮＡを模倣することによって、好ましくはトール様受容体媒介性の免疫応答を誘導する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、好ましくは樹状細胞およびＢ−リンパ球などの免疫細胞を活性化し、ＮＦ−кＢを刺激する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは一般的に標的配列に特異的な手法ではない。
さらに、用語「オリゴヌクレオチド」は、「囮」としても知られる囮オリゴヌクレオチドを含み、これは好ましくは、たとえば、遺伝子発現を操作するための特定の転写因子のコンセンサス結合配列を保有する二本鎖オリゴヌクレオチドである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、細胞中で生理的および／もしくは生化学的効果に負の影響を与える分子のｍＲＮＡとハイブリダイズするか、または分子の受容体のｍＲＮＡとハイブリダイズする。好ましい実施形態では、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、Ｈｅｒ−２、ＭＩＡ、その受容体、および／もしくはプロスタグランジンＥ２受容体のｍＲＮＡとハイブリダイズするか、またはアプタマーもしくはスピーゲルマーの形態の標的とそれぞれ結合および相互作用する。オリゴヌクレオチドのさらなる好ましい実施形態は配列表に与えられているか、または本明細書中に参照により援用されるＷＯ９４／２５５８８号、ＷＯ９５／１７５０７号、ＷＯ９５／０２０５１号、ＷＯ９８／３３９０４号、ＷＯ９９／６３９７５号、ＷＯ０１／６８１４６号、ＷＯ０１／６８１２２号、ＷＯ０３／０６４４５号、ＷＯ２００５／０１４８１２号、ＷＯ２００５／０５９１３３号、ＷＯ２００５／０８４７１２号に公開されているオリゴヌクレオチドである。
少なくとも１つのポリマーおよび／または本発明の少なくとも１つの化合物と連結している好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４３５（図１を参照）または実施例１０のうちの少なくとも１つを含む、またはそれからなる。
特に好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号２０３０、２０３１、２０３２、２０５７および／または２０６６からなる、またはそれを含む。配列番号２０３０（ＣＧＧＣＡＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＧＴＡ）および／または配列番号２０５７（ＣＴＧＡＴＧＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡ）を含む、またはそれからなるオリゴヌクレオチドが最も好ましい。
好ましい実施形態では、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、細胞増殖性および／または分化性の疾患または障害、骨代謝、免疫、造血、心血管、肝臓、腎臓、筋肉、血液学、ウイルス、疼痛、神経学および／または代謝性の疾患または障害に関連する疾患または障害、具体的には望ましくないＴＧＦ−ベータシグナル伝達に関連する障害または疾患のうちの１つまたは複数を制御、処置および／または予防するための、新規の改良された治療剤である。用語「がん、癌、または新生物」には、様々な器官系の悪性腫瘍、たとえば、脳、眼、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸管系、および尿生殖路を冒すものが含まれる。
本発明の修飾オリゴヌクレオチド、またはそのような修飾オリゴヌクレオチドを含む、もしくはそれからなる医薬組成物で制御可能、予防可能および／または処置可能な疾患または障害、具体的には悪性または良性の腫瘍または転移および形成には、それだけには限定されないが、固形腫瘍；白血病、急性もしくは慢性の骨髄性もしくはリンパ芽球性白血病などの血液由来腫瘍；腫瘍転移、良性腫瘍、たとえば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、前悪性腫瘍、関節リウマチ、乾癬、星細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、ユーイング腫瘍、髄芽腫、神経膠腫、血管芽腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫（血管肉腫、軟骨肉腫、内皮肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮肉腫、リンパ管肉腫、黒色腫、髄膜腫、筋肉腫、乏突起神経膠腫、骨原性肉腫、骨肉腫が含まれる）、精上皮腫、トラコーマ、ウィルムス腫瘍が含まれるか、または、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳がん、気管支原性癌、腎臓癌、子宮頸がん、絨毛癌、嚢胞腺癌、胚性癌腫、上皮癌、食道がん、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜がん、胆嚢がん、胃がん、頭部がん、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部がん、非小細胞気管支原性／肺癌、卵巣がん、膵癌、乳頭癌、乳頭腺癌、前立腺がん、小腸癌、前立腺癌、直腸がん、腎細胞癌、皮膚がん、小細胞気管支原性／肺癌、扁平細胞癌、皮脂腺癌、精巣癌、子宮がん、肝臓転移、肺転移、脳転移、リンパ腫転移の群から選択される。
また、本発明の修飾オリゴヌクレオチドならびに１つまたは複数のそのような修飾オリゴヌクレオチドを含む、またはそれからなる医薬組成物は、自己の免疫の疾患または障害、たとえば、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎が含まれる）などの様々な免疫障害；多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性ループスエリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎、湿疹性皮膚炎が含まれる）；乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい病反転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性昜出血性脳症、特発性両側性進行性感音性聴覚損失、再生不良性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活性肝炎、スティーブンス−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性硬変、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症、移植片対宿主病、移植症例、ならびにアトピー性アレルギーなどのアレルギーを制御、予防および／または処置するためにも適切である。さらに、修飾オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈攣縮、鬱血性心不全、冠動脈疾患、弁膜症、不整脈、および心筋症などの心血管の疾患または障害；またはウイルス性の疾患または障害、たとえば、Ａ型肝炎（ＨＶＡ）、Ｂ型肝炎（ＨＶＢ）、Ｃ型肝炎（ＨＶＣ）、もしくは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ＨＩＶ、ＦＩＶ、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、エプスタイン−バー−ウイルスおよび天然痘ウイルスによって引き起こされるもの、または肝細胞がんなどのウイルス関連がんを制御、予防および／または処置するために適切である。
本発明の修飾オリゴヌクレオチドならびに１つまたは複数のそのようなオリゴヌクレオチドを含む、またはそれからなる医薬組成物は、それだけには限定されないが、あらゆる病因の糸球体腎炎（ＧＮ）、たとえば、メサンギウム増殖性ＧＮ、免疫ＧＮ、半月体性ＧＮなどの、腎臓障害や（過剰な）線維症および／または硬化症；糖尿病性腎症、間質性腎線維症および高血圧を含めた間質性腎線維症のすべての原因、移植レシピエントのシクロスポリン処置を含めた薬物曝露の合併症から生じる腎線維症、ＨＩＶ関連腎症、または移植腎症；（過剰の）瘢痕および（進行性）硬化症に関連する肝臓病、たとえば、あらゆる病因による硬変、胆樹の障害、および肝機能不全；成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、または煙、化学薬品、アレルゲン、または自己免疫疾患などの感染性もしくは毒性の薬剤が原因の肺線維症などの、間接的なガス交換または空気を効率的に肺の内外に移動させる能力の損失を伴う肺線維症；任意の病因学の線維増殖性硝子体網膜症または眼球手術、たとえば、緑内障の処置、網膜復位、白内障摘出、もしくは任意の種類のドレナージ手順に関連する線維症などの、線維増殖状態に関連する眼の疾患または障害；たとえば外傷または外科創傷から生じる創傷治癒中に起こる真皮の過剰または肥大性の瘢痕形成を含めた、たとえば望ましくないＴＧＦ−ベータシグナル伝達に関連している線維性の疾患または障害を制御、予防および／または処置するためにさらに適切である。本発明の修飾オリゴヌクレオチドおよび組成物のそれぞれは、特定の疾患または障害、好ましくはＴＧＦ−β１、−β２、または−β３などのＴＧＦ−βに関連する遺伝子を標的とするように具体的に設計されている。
本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、それだけには限定されないが、電気穿孔、表皮、皮膚への圧痕、動脈内、関節内、頭蓋内、くも膜下腔内、大脳内、真皮内、病変内、筋肉内、鼻腔内、眼球内、腹膜内、前立腺内、肺内、脊髄内、気管内、腫瘍内、静脈内、膀胱内の身体の空腔内への配置、経鼻吸入、経口、肺吸入（たとえば、噴霧器によるものを含めた、粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくはガス注入によるもの）、皮下、真皮下、経皮、または局所（経膣および直腸の送達を含めた眼および粘膜が含まれる）を含めた、様々な経路によって投与可能である。局所投与は、皮膚、眼および耳の投与をさらに含む。
一実施形態では、サイトカインおよび／または化学療法剤を、本発明の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドコンジュゲートと同時投与する。サイトカインおよび／または化学療法剤は、オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドと結合した１つもしくは複数の化合物、たとえば、小分子；抗体、たとえばＭＵＪ５９１；糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＤ５２、ＣＤ２５、ＶＥＧＦ、表皮成長因子、ＣＤ３３、ＣＤ２０、もしくは炭酸脱水酵素と結合する抗体；抗原、たとえば前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の外部ドメイン；酵素、抗体もしくは酵素の一部；任意のペプチド、たとえば、内部移行ペプチド、ペネトラチンなどの細胞浸透ペプチド、ＴＡＴ（トランス活性化因子もしくは転写）、トランスポータン（たとえばＴＰ１０）、Ｒ９ペプチド、ＭＰＧペプチド、ＫＡＬＡペプチド、ｐＨ（低）挿入ペプチド、ＬＨＲＨなどのホルモンペプチド、ボンベシン、ソマトスタチン、もしくはＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）などのターゲッティングペプチド；アプタマー（核酸、タンパク質、もしくはペプチドに基づく）、スピーゲルマー、ｓｉＲＮＡ、たとえばコレステロール修飾したｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ヒト血清アルブミン担体、腫瘍抗原、たとえば、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＨＩＦアルファなどの腫瘍ワクチン、または免疫刺激剤；ＴＭＺ、ＢＣＮＵ、ＤＴＩＣ、５−フルオロウラシル（ＦＵ）、ゲムシタビン、タキソール（パクリタキセル）、イリノテカ、オキサリプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、フォリン酸などの細胞毒素；発色団、マーカーたとえば、ＦＩＴＣなどの蛍光マーカー、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドまたはフルオレスカミン、ビオチン；造影剤、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、またはシュウ酸エステルなどの化学発光性剤、ルシフェリン、ルシフェラーゼまたはエクオリンなどの生物発光剤、ホルモン、シグナルペプチド、脂質、脂肪酸、たとえば共役リノール酸、糖、アミノ酸、受容体、受容体の一部、または受容体の任意のリガンド、たとえばＣＸＣＲ４ケモカイン受容体もしくは結合分子の拮抗剤、あるいは、グルタチオントランスフェラーゼによって、たとえば血液脳関門を横切るコンジュゲートの送達を増強させるグルタチオンの効果を増加させる。本発明の化合物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドのターゲッティングおよび／または検出を対象とする。好ましいサイトカインは、たとえば、α−、β−もしくはγ−インターフェロン（ＩＦＮ）などのインターフェロン、ＩＬ−１α、−１β、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１６、−１７、−１８、−２２、−２３、もしくは３１などのインターロイキン（ＩＬ）、またはＣＳＦ１、−２（ＧＭ−ＣＳＦやサルグラモスチム）、もしくは−３（Ｇ−ＣＳＦやフィルグラスチム）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ））、あるいはその組合せである。好ましい化学療法剤は、たとえば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、および抗腫瘍剤、具体的にはテモゾロマイド、ゲムシタビン、アバスチン、またはその組合せである。
好ましい実施形態では、ポリアルキレンオキシド、たとえばＰＥＧなどのポリマーがネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端と結合して、好ましくはシステイン残基を含むネイティブライゲーション部位をもたらし、これは、さらなるポリマーおよび／もしくは化合物とネイティブライゲーション部位との相互作用を回避するために保護されているか、ＰＥＧなどのポリマー、あるいは小分子、抗体、抗原、酵素、抗体もしくは酵素の一部、任意のペプチド、たとえば、内部移行ペプチド、アプタマー（核酸、タンパク質、もしくはペプチドに基づく）、スピーゲルマー、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、発色団、ビオチン、ホルモン、シグナルペプチド、脂質、脂肪酸、糖、アミノ酸、受容体、受容体の一部、または受容体もしくは結合分子の任意のリガンドなどの化合物に、任意で可逆的または不可逆的リンカーによって結合している。
好ましくは、ヒドロキシ保護基は、たとえば、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンジルヒドリル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピバロエート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、９−フルオレニルメチルカルボネート、メシレートおよびトシレートである。
アミノ保護基は、たとえば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシエチル（ＭＭＴ）、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）；ホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル、およびニトロフェニルアセチルなどのアミド保護基；２−ニトロベンゼンスルホニルなどのスルホンアミド保護基、またはフタルイミドおよびジチアスクシノイルなどのイミンおよび環状イミド保護基である。
カルボニル保護基は、たとえば、アセタール、ケタール、アシラール、またはジチアンである。カルボン酸保護基は、たとえば、メチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、またはシリルエステルである。
チオール保護試薬は、たとえば、エチルヨードアセテート；チオエーテル、またはジピリジルジスルフィドをもたらす不可逆的キャップ試薬；ジスルフィド、ベンジル−Ｓまたはｔｅｒｔ．ブチル−Ｓをもたらす可逆的保護基などである。
また、ヒドロキシ保護基、カルボニル保護基、カルボン酸保護基、チオール保護基またはアミノ保護基などの保護基の均等物も、コンジュゲートまたは化合物およびその生成方法に包含される。
さらなる好ましい実施形態では、ネイティブライゲーションに基づく本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、５’および／または３’末端にポリアルキレンオキシド、たとえばＰＥＧを含み、任意で、ＰＥＧなどのポリマーならびに／またはペネトラチンおよび／もしくはＲＧＤペプチドなどの化合物をネイティブライゲーション部位において含み、両末端のＰＥＧなどのポリアルキレンオキシドは、同一の大きさまたは異なる大きさである。
ポリマー、たとえばポリアルキレンオキシド、具体的にはＰＥＧは、多分散または単分散の材料として入手可能である。多分散材料は、様々な分子量が分散した分布を有し、平均重量（重量平均）サイズおよび分散度によって特徴づけられている。単分散ＰＥＧは１つの大きさの分子を含む。本発明のポリアルキレンオキシド、好ましくはＰＥＧは、多分散または単分散であり、示した分子量はポリアルキレンオキシド、たとえばＰＥＧ分子の分子量の平均を表す。ポリマー、具体的にはＰＥＧについて示した分子量はしばしば概数である。あるいは、ポリマー、具体的にはＰＥＧは、ポリマーが含む単量体の数に従って示し、たとえば、ＰＥＧ４は４個の単量体を含み、分子量は２００である。
たとえばオリゴヌクレオチドの５’末端と連結しているポリマー、たとえばＰＥＧなどのポリアルキレンオキシドの分子量は、２００（たとえばＰＥＧ４）、３００、４００（たとえばＰＥＧ８）、５００、６００、７００、８００、９００、１０００（たとえばＰＥＧ２４）、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００もしくは４７５０、５０００、１００００、２００００、５００００または１０００００Ｄａであり、オリゴヌクレオチドの３’末端と連結しているポリアルキレンオキシドの分子量は、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００もしくは４７５０、５０００、１００００、２００００、５００００または１０００００Ｄａであるか、あるいはオリゴヌクレオチドの３’末端と連結しているポリマー、たとえばＰＥＧなどのポリアルキレンオキシドの分子量は、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００もしくは４７５０、５０００、１００００、２００００、５００００または１０００００Ｄａであり、オリゴヌクレオチドの５’末端と連結しているポリマー、たとえばＰＥＧなどのポリアルキレンオキシドの分子量は、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００もしくは４７５０、５０００、１００００、２００００、５００００または１０００００Ｄａであるか、あるいはオリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端と連結しているポリマー、たとえばＰＥＧなどのポリアルキレンオキシドの分子量は、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００もしくは４７５０、５０００、１００００、２００００、５００００または１０００００Ｄａであり、ネイティブライゲーション部位と連結しているポリマー、たとえばＰＥＧなどのポリアルキレンオキシドの分子量は、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００もしくは４７５０、５０００、１００００、２００００、５００００または１０００００Ｄａであるか、あるいはネイティブライゲーション部位と連結しているポリマー、たとえばＰＥＧなどのポリアルキレンオキシドの分子量は、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００もしくは４７５０、５０００、１００００、２００００、５００００または１０００００Ｄａであり、オリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端と連結しているポリマー、たとえばＰＥＧなどのポリアルキレンオキシドの分子量は、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００もしくは４７５０、５０００、１００００、２００００、５００００または１０００００Ｄａである。本発明のポリマー、具体的にはＰＥＧは、好ましくは単分散ポリマーおよびＰＥＧのそれぞれである。
さらなる好ましい実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ポリマー、たとえばＰＥＧなどのポリアルキレンオキシドと、化合物、たとえば抗体と、ペネトラチンまたはＲＧＤペプチドなどの内部移行ペプチドとを含む。抗体は修飾オリゴヌクレオチドを標的まで導き、ＰＥＧは、たとえば５’−および／もしくは３’−エキソヌクレアーゼならびに／またはエンドヌクレアーゼによる修飾オリゴヌクレオチドの分解のそれぞれを回避し、とりわけ低下させる。標的に達成した後、抗体および／またはＰＥＧは、好ましくはジスルフィド結合などの可逆的リンカーによって修飾オリゴヌクレオチドから分離され、内部移行ペプチドがオリゴヌクレオチドの標的細胞内への進入を促進する。あるいは、修飾オリゴヌクレオチドは、たとえば、オリゴヌクレオチドの５’末端または５’および３’末端にＰＥＧなどのポリマーを含み、オリゴヌクレオチドの３’末端またはネイティブライゲーション部位に抗体などの化合物を含む。標的に達成した後、修飾オリゴヌクレオチドは標的細胞の表面と相互作用する。
さらなる代替方法では、オリゴヌクレオチドは、ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドと連結しているその５’および３’末端にポリマー、たとえばＰＥＧを含み、その結果、オリゴヌクレオチドの５’および３末端に２つのネイティブライゲーション部位をもたらす。たとえばターゲッティングのための抗体などの化合物、およびペネトラチンなどの内部移行ペプチドは、ネイティブライゲーション部位の１つとは独立して連結される。標的に達成した後、抗体をオリゴヌクレオチドおよび／または化合物から除去し、たとえばＰＥＧを除去し、ペネトラチンがオリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みを改善させる。
別の実施形態では、５’末端にポリマーおよび／または化合物を含む修飾オリゴヌクレオチドの３’末端および／またはネイティブライゲーション部位に固相を連結させる。そのような組合せは、たとえば、細胞または細胞因子を検出するための修飾オリゴヌクレオチドを使用した試験キットのベースとなる。
以下の実施例は、本発明の主題をこれらの実施例に限定せずに本発明をさらに例示する。
本発明を、以下の実施例を参照してさらに記載し、本発明は実施例に限定されない。以下の実施例中で使用したオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号２０３０、２０３１、２０３２、２０５７、２０６６、および２４６１、具体的には配列番号２０３０であった。
［実施例１］
５’−システイン修飾オリゴヌクレオチド−チオホスフェートの合成（図３）
二重カップリングサイクルを含む改変合成プロトコルに従った、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーによる、アミノ基担持支持体上での２μｍｏｌスケール（カートリッジ１個あたり正味重量２μｍｏｌの支持体官能基）でのホスホロチオエート主鎖含有オリゴヌクレオチドの合成。単一のカップリングステップを含む最終ステップでは、０．１Ｍのアセトニトリルに溶かしたＯＭＲ（オリゴヌクレオチド修飾試薬、たとえばＬｉｎｋ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｌａｎａｒｋｓｈｉｒｅ、スコットランド）などのシステイン修飾因子をオリゴヌクレオチドの５’末端と連結させ、ＯＭＲはＦｍｏｃおよび第三級ブチル−Ｓ−（ｔＢｕ−Ｓ）保護基で保護した。オリゴヌクレオチドの合成が完了した後、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に２０％のピペリジンを使用してＦｍｏｃ保護基をＯＭＲから除去する。その後、オリゴヌクレオチドを純粋なＤＭＦによって洗浄することによってピペリジンを除去する、ＤＭＦは最終的にはアセトニトリルによって除去する。支持体をカートリッジから取り出し、３７℃で乾燥させ、その後、アンモニアによって終夜、好ましくは濃アンモニアによって、５５℃で、オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断する。
最終産物をＨＰＬＣによって精製し、溶出液を収集し、超遠心または限外濾過によって溶出液の体積を減らし、定量し、好ましくはｓｐｅｅｄｖａｃ中で乾燥させ、−２０℃で保管する。生成物が何であるかは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって制御する。
［実施例２］
ＰＭＲで修飾したＰＥＧ構成成分の生成（図４）
チオエステルで修飾したＰＥＧの出発物質は、たとえば一般的なアミノ官能化されたＰＥＧおよびＰＭＲ（ペプチド修飾試薬（ペンタフルオロフェニル−Ｓ−ベンジル−チオスクシネート）、たとえばＬｉｎｋ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｌａｎａｒｋｓｈｉｒｅ、スコットランド）である。１００μｍｏｌのＭＷ４００のメトキシ−ＰＥＧ−ＮＨ２（ｍＰＥＧ４００−ＮＨ２）、すなわち４００μｌのＤＭＦ中に２５０ｍＭの溶液を、１．５×過剰量のＰＭＲ、すなわち１００μｌのＤＭＦ中に１５０μｍｏｌ（５８ｍｇ）と混合し、３０μｍｏｌ（４．６ｍｇ）のＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）の５００μｌの溶液に加える。組成物を３０分間、３７℃でインキュベーションする。反応は分析用ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して制御し、ｍＰＥＧ４００−ＰＭＲは鋭いピークを形成し、また、ｍＰＥＧ４００−ＰＭＲの単離をＲＰ−ＨＰＬＣで行った。単離したＰＥＧ４００−ＰＭＲを乾燥させ、限外濾過および／または超遠心分離し、−２０℃で保管する。
［実施例３］
ネイティブライゲーションによる、５’をＯＭＲで修飾したオリゴヌクレオチドの５’末端の修飾（図５）
オリゴヌクレオチドの５’末端の修飾は、ＰＥＧ−ＰＭＲ構成成分、たとえばｍＰＥＧ４００−ＰＭＲ構成成分のチオエステル（実施例２を参照）と、ＯＭＲ修飾オリゴヌクレオチドのシステイン残基（実施例１を参照）との反応に基づく。第１のステップでは、中間体チオエステル結合が形成され、次いで分子内アシル再編成が起こり、その結果、アミド結合、すなわちネイティブライゲーションがもたらされる。
ネイティブライゲーション用の反応緩衝液は、１ｎｍｏｌ／μｌのオリゴヌクレオチド濃度および１０ｎｍｏｌ／μｌのｍＰＥＧ４００−ＰＭＲ濃度には、１００ｍＭのトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、５０ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）ｐＨ７．５、および２５ｍＭのメルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）を含む。
第１のステップでは、システインを含む５’−ＯＭＲ修飾したオリゴヌクレオチドをＴＣＥＰによって化学還元させて、第三級ブチル−Ｓ（ｔＢｕ−Ｓ）保護基を、５’−ＯＭＲ修飾したオリゴヌクレオチドのシステイン残基から除去する。混合物を１時間、３７℃でインキュベーションし、反応はＲＰ−ＨＰＬＣを使用して制御する。
並行して、第２の独立したステップでは、ｍＰＥＧ４００−ＰＭＲなどのＰＥＧ−ＰＭＲ−化合物／ポリマーを、ＭＰＡＡによって、ｍＰＥＧ−ＰＭＲと相互作用させ、チオエステルのベンジル−Ｓ（Ｂｎ−Ｓ）基を交換することによって活性化させる。この混合物を同様に１時間、３７℃でインキュベーションし、反応はＲＰ−ＨＰＬＣを使用して制御する。
ステップ１の還元されたオリゴヌクレオチドおよびステップ２の活性化されたＰＥＧ−ＰＭＲ−化合物／ポリマーの組合せ、ならびに３７℃でのインキュベーションは、アミド結合を含む反応の最終産物を生じるネイティブライゲーションをもたらす。反応時間は２４〜２００時間である。
［実施例４］
ジピリジルジスルフィドによるチオール残基の保護（図６）
ネイティブライゲーションの直接生成物である、ＰＥＧ−ＰＭＲ−オリゴヌクレオチド中間体生成物のシステイン残基のチオール官能基（実施例３を参照）は、１０００×モーラー過剰量のジピリジルジスルフィド（メタノールに溶かした１Ｍのジチオピリジン（ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎ）、Ｐｙ２Ｓ２）を実施例３の反応緩衝液に加えることによって保護する。混合物を３７℃で約２０時間インキュベーションする。あるいは、ＤＴＮＢまたはエルマン試薬（ｒｅａｇｅｎ）を使用した。生じた生成物、たとえば、ｍＰＥＧ４００−ＰＭＲ、システイン残基に保護基を有するシステインを含む５’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドを、限外濾過およびＲＰ−ＨＰＬＣによって単離する。最終産物を乾燥させ、−２０℃で保管する。
［実施例５］
ネイティブライゲーションで修飾したオリゴヌクレオチドの３’末端の修飾（図７）
ピリジル−ジスルフィド保護システインを含む、５’末端をネイティブライゲーションで修飾したオリゴヌクレオチドの３’末端の修飾（実施例４を参照）は、３’末端アミノ官能基と、たとえばｍＰＥＧ２０００−ＮＨＳなどのＰＥＧ−ＮＨＳとの反応に基づく。反応緩衝液は、１ｍＭのオリゴヌクレオチド濃度には０．３ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５である。約１０倍の３×過剰量のｍＰＥＧ−ＮＨＳを５’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドに加え、３７℃で１０分間インキュベーションする。反応はＲＰ−ＨＰＬＣによって制御し、最終産物をＲＰ−ＨＰＬＣ、ＩＥ−ＦＰＬＣ、または限外濾過によって単離し、次いでこれをたとえばｓｐｅｅｄｖａｃ中で乾燥させ、−２０℃で保管する。
［実施例６］
エンドヌクレアーゼ、５’−エキソヌクレアーゼ、および３’−エキソヌクレアーゼのそれぞれに対する非修飾オリゴヌクレオチドの安定性
１８個のヌクレオチドおよびリン酸またはチオリン酸主鎖を含む非修飾オリゴヌクレオチドを、７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７中のＳ１エンドヌクレアーゼ（０．００５Ｕ／μｌ、すなわちオリゴヌクレオチド１ｎｍｏｌあたり０．０５Ｕ）と共に３７℃でインキュベーションした。
非修飾オリゴヌクレオチドの第２の試料を、０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ６．５中の５’−エキソヌクレアーゼ（たとえばホスホジエステラーゼＩＩ（ＰＤＥ ＩＩ））（０．０１８Ｕ／μｌ、すなわちオリゴヌクレオチド１ｎｍｏｌあたり０．１８Ｕ）と共にインキュベーションし、非修飾オリゴヌクレオチドの第３の群を、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１４ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．８中の３’−エキソヌクレアーゼ（たとえばホスホジエステラーゼＩ（ＰＤＥ Ｉ））（０．０００１Ｕ／μｌ、すなわちオリゴヌクレオチド１ｎｍｏｌあたり０．００１Ｕ）と共にインキュベーションした。
結果を以下に示す。ｔ＝０でのオリゴヌクレオチドの量を１００％に設定した。３つすべての試料のオリゴヌクレオチドの分解は、実験の開始時（ｔ＝０）、１時間、２４時間、４８時間、および１４４時間後にＲＰ−ＨＰＬＣによって直接試験した。表１はエンドヌクレアーゼの結果を示し、表２は５’−エキソヌクレアーゼの結果を示し、表３は３’−エキソヌクレアーゼの結果を示す。
［実施例７］
エンドヌクレアーゼに対する修飾オリゴヌクレオチドの安定性
チオリン酸主鎖を含む修飾オリゴヌクレオチドを、ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端のｍＰＥＧ４００と結合させ、オリゴヌクレオチドの３’−アミノ官能基とカップリングしたＮＨＳエステルによって３’末端でｍＰＥＧ２０００（ｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ２０００）と結合させ、７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７中のＳ１エンドヌクレアーゼ（０．００５Ｕ／μｌ、すなわちオリゴヌクレオチド１ｎｍｏｌあたり０．０５Ｕ）と共に３７℃でインキュベーションした。オリゴヌクレオチドの分解は、実験の開始時（ｔ＝０）、１時間、２４時間、４８時間、および１４４時間後にＲＰ−ＨＰＬＣによって直接試験した。表４はこれらの実験の結果を示す。
修飾オリゴヌクレオチドは表１の非修飾オリゴヌクレオチドよりも高い安定性を示す。
［実施例８］
ＰＡＧＥ上でのエンドヌクレアーゼに対する修飾オリゴヌクレオチドの安定性の試験（図９ａ〜ｃ）
非修飾オリゴヌクレオチドおよびチオリン酸主鎖を含む修飾オリゴヌクレオチドを、７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７中のＳ１エンドヌクレアーゼ（０．００５Ｕ／μｌ、すなわちオリゴヌクレオチド１ｎｍｏｌあたり０．０５Ｕ）と共に３７℃でインキュベーションした。修飾オリゴヌクレオチドを、ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端のｍＰＥＧ４００と結合させ、ＮＨＳエステルによって３’末端でｍＰＥＧ１０００と結合させたか（ｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００）、または、ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端のｍＰＥＧ１０００と結合させ、ＮＨＳエステルによって３’末端でｍＰＥＧ１０００と結合させた（ｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００）。オリゴヌクレオチドの分解は、実験の開始時（ｔ＝０）、１時間、２４時間、４８時間、７２時間、および１４４時間後にＰＡＧＥによって直接試験した。１μｌ（０．０１ｎｍｏｌ）のそれぞれの試料を５μｌのホルムアミドと混合し、試料を、６．３ｇの尿素、７．５ｍｌのアクリルアミド／ビスアクリルアミド １９：１（４０％）、１．５ｍｌのＴＢＥ緩衝液（１０×）、１．５ｍｌの水、９０μｌのアンモニウムパースルフェート（ＡＰＳ）および７μｌのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチエチルジアミン（ＴＥＭＥＤ）を含む、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によるポリアクリルアミドゲルで分離した。ゲルの電流時間は５ｍＡで約２．５時間であった。ゲル上の重量マーカーは、大きい順で、０．０１ｎｍｏｌのｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００、ｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００、非修飾オリゴヌクレオチド、非修飾オリゴヌクレオチド（ｎ−１）、および非修飾オリゴヌクレオチド（ｎ−２）を含む。
図９ａは非修飾オリゴヌクレオチドの結果を示し、図９ｂはｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００の結果を示し、図９ｃはｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００の結果を示し、これはＳ１エンドヌクレアーゼインキュベーションに対するｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００およびｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００の増加した安定性を実証している。
［実施例９］
５’−エキソヌクレアーゼ（ＰＤＥ ＩＩ）に対する修飾オリゴヌクレオチドの安定性
チオリン酸主鎖を含む修飾オリゴヌクレオチドを、ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端のｍＰＥＧ４００と結合させ、ＮＨＳエステルと３’−官能基との反応によってオリゴヌクレオチドの３’末端でＰＥＧ１０００と結合させ（ｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００）、０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ６．５中の５’−エキソヌクレアーゼ（０．０１８Ｕ／μｌ、すなわちオリゴヌクレオチド１ｎｍｏｌあたり０．１８Ｕ）と共に３７℃でインキュベーションした。オリゴヌクレオチドの分解は、実験の開始時（ｔ＝０）、１時間、２４時間、４８時間、および１４４時間後に直接試験した。表５にこれらの実験の結果を示す。
修飾オリゴヌクレオチドは表２の非修飾オリゴヌクレオチドよりも高い安定性を示す。
［実施例１０］
ＰＡＧＥ上での５’−エキソヌクレアーゼ（ＰＤＥ ＩＩ）に対する修飾オリゴヌクレオチドの安定性の試験（図１０ａ〜ｃ）
非修飾オリゴヌクレオチドおよびチオリン酸主鎖を含む修飾オリゴヌクレオチドを、０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ６．５中の５’−エキソヌクレアーゼ（０．０１８Ｕ／μｌ、すなわちオリゴヌクレオチド１ｎｍｏｌあたり０．１８Ｕ）と共に３７℃でインキュベーションした。修飾オリゴヌクレオチドを、ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端のｍＰＥＧ４００と結合させ、ＮＨＳエステルによって３’末端でｍＰＥＧ１０００と結合させたか（ｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００）、またはネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端のｍＰＥＧ１０００と結合させ、ＮＨＳエステルによって３’末端でｍＰＥＧ１０００と結合させた（ｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００）。オリゴヌクレオチドの分解は、実験の開始時（ｔ＝０）、１時間、２４時間、４８時間、７２時間、および１４４時間後にＲＰ−ＨＰＬＣによって直接試験した。試料は実施例８に従ってＰＡＧＥ上で試験した。
図１０ａは非修飾オリゴヌクレオチドの結果を示し、図１０ｂはｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００の結果を示し、図１０ｃはｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００の結果を示し、これは５’−エキソヌクレアーゼインキュベーションに対するｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００およびｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００の増加した安定性を実証している。
［実施例１１］
３’−エキソヌクレアーゼ（ＰＤＥ Ｉ）に対する修飾オリゴヌクレオチドの安定性
チオリン酸主鎖を含む修飾オリゴヌクレオチドを、ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端のｍＰＥＧ４００と結合させ、ＮＨＳエステルによってオリゴヌクレオチドの３’末端のｍＰＥＧ１０００と結合させ（ｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００）、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１４ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．８中の３’−エキソヌクレアーゼ（０．０００１Ｕ／μｌ、すなわちオリゴヌクレオチド１ｎｍｏｌあたり０．００１Ｕ）と共に３７℃でインキュベーションした。オリゴヌクレオチドの分解は、実験の開始時（ｔ＝０）、１時間、２４時間、４８時間、および１４４時間後にＲＰ−ＨＰＬＣによって直接試験した。表６はこれらの実験の結果を示す。
修飾オリゴヌクレオチドは表３の非修飾オリゴヌクレオチドよりも高い安定性を示す。
［実施例１２］
ＰＡＧＥ上での３’−エキソヌクレアーゼ（ＰＤＥ Ｉ）に対する修飾オリゴヌクレオチドの安定性の試験（図１１ａ〜ｃ）
非修飾オリゴヌクレオチドおよびチオリン酸主鎖を含む修飾オリゴヌクレオチドを、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ、１４ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．８中の３’−エキソヌクレアーゼ（０．０００１Ｕ／μｌ、すなわちオリゴヌクレオチド１ｎｍｏｌあたり０．００１Ｕ）と共に３７℃でインキュベーションした。修飾オリゴヌクレオチドを、ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端のｍＰＥＧ４００と結合させ、ＮＨＳエステルによって３’末端でｍＰＥＧ１０００と結合させたか（ｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００）、またはネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端のｍＰＥＧ１０００と結合させ、ＮＨＳエステルによって３’末端でｍＰＥＧ１０００と結合させた（ｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００）。オリゴヌクレオチドの分解は、実験の開始時（ｔ＝０）、１時間、２４時間、４８時間、７２時間、および１４４時間後にＰＡＧＥによって直接試験した。試料は実施例８に従ってＰＡＧＥ上で試験した。図１１ａは非修飾オリゴヌクレオチドの結果を示し、図１１ｂはｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００の結果を示し、図１１ｃはｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００の結果を示し、これは３’−エキソヌクレアーゼインキュベーションに対するｍＰＥＧ４００−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００およびｍＰＥＧ１０００−オリゴ−ｍＰＥＧ４００の増加した安定性を実証している。
［実施例１３］
オリゴヌクレオチド
本実施例のＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２およびＴＧＦ−ベータ３オリゴヌクレオチド、具体的にはアンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明に記載の所望しない新生物、転移の形成、線維症またはＨＩＶなどのウイルス性の疾患または障害の制御、予防、および／または処置に適切な、本発明の方法によるポリマーおよび／または化合物と結合させる。
ＴＧＦ−ベータ１、−２および−３アンチセンスオリゴヌクレオチド：
gtgccatcaatacctgcaaa(配列番号1)、catcagttacatcgaaggag(配列番号2)、tcttgggacacgcagcaagg(配列番号3)、gaaatcaatgtaaagtggac(配列番号4)、catgaactggtccatatcga(配列番号5)、gaggttctaaatcttgggac(配列番号6)、gcactctggcttttgggttc(配列番号7)、tagctcaatccgttgttcag(配列番号8)、ccctagatccctcttgaaat(配列番号9)、accaaggctctcttatgttt(配列番号10)、tcgagtgtgctgcaggtaga(配列番号11)、tgaacagcatcagttacatc(配列番号12)、gctgggttggagatgttaaa(配列番号13)、agaggttctaaatcttggga(配列番号14)、cgccggttggtctgttgtga(配列番号15)、ctgctttcaccaaattggaa(配列番号16)、aagtatagatcaaggagagt(配列番号17)、tgctcaggatctgcccgcgg(配列番号18)、gtgctgttgtagatggaaat(配列番号19)、agggcggcatgtctattttg(配列番号20)、taagcttattttaaatccca(配列番号21)、tagctgcatttgcaagactt(配列番号22)、tctgttgtgactcaagtctg(配列番号23)、aagcaataggccgcatccaa(配列番号24)、tcaatgtaaagtggacgtag(配列番号25)、attttagctgcatttgcaag(配列番号26)、tgtagatggaaatcacctcc(配列番号27)、ttaacactgatgaaccaagg(配列番号28)、attgtaccctttgggttcgt(配列番号29)、agatccctcttgaaatcaat(配列番号30)、tgtaaagtggacgtaggcag(配列番号31)、ccattcgccttctgctcttg(配列番号32)、tgttaaatctttggacttga(配列番号33)、gaagggcggcatgtctattt(配列番号34)、gaccctgctgtgctgagtgt(配列番号35)、gaactagtaccgccttttca(配列番号36)、cgatcctcttgcgcatgaac(配列番号37)、ccggccaaaagggaagagat(配列番号38)、aaagagacgagtggctatta(配列番号39)、aagtggaaatattaatacgg(配列番号40)、agatcaaggagagttgtttg(配列番号41)、agttgtttttaaaagtcaga(配列番号42)、tgtaacaactgggcagacag(配列番号43)、ggtgttgtaacaactgggca(配列番号44)、tacccacagagcacctggga(配列番号45)、gggatggcatcaaggtaccc(配列番号46)、tcgtcatcatcattatcatc(配列番号47)、aagggtgcctattgcatagc(配列番号48)、ctcactgttaactctaagag(配列番号49)、gcaaagtatttggtctccac(配列番号50)、caagttccttaagccatcca(配列番号51)、ttatcttaatgcagactttc(配列番号52)、cttacaagaagcttccttag(配列番号53)、actggtgagcttcagcttgc(配列番号54)、acttgagaatctgatatagc(配列番号55)、aggttcctgtctttatggtg(配列番号56)、gtgtatccatttccacccta(配列番号57)、cagcacagaagttggcattg(配列番号58)、gcaaggagaagcagatgctt(配列番号59)、agcaaggagaagcagatgct(配列番号60)、ttttccaagaattttagctg(配列番号61)、ttcttgttacaagcatcatc(配列番号62)、ttaaagaaggagcggttcgg(配列番号63)、ctgggctgaaatttatatat(配列番号64)、gggcagacagctaggagttt(配列番号65)、gtgtactcaccaaggtaccc(配列番号66)、cccagcactttgggaggccg(配列番号67)、ggctcacgcctgtaatccca(配列番号68)、tgaccgtgaactcactattt(配列番号69)、atagtggtgatggctataca(配列番号70)、ttttggttacctgcaaatct(配列番号71)、gaacactcaccctgctgtgc(配列番号72)、gaatggctctttaaacccta(配列番号73)、gaagaaatggagttcagtgt(配列番号74)、tttctcctggaagggagagg(配列番号75)、aaatgcaacgcgttcccaac(配列番号76)、aatacgaaacttttgcaaag(配列番号77)、actagtaattctcagagcgg(配列番号78)、aagaaactagtaattctcag(配列番号79)、agtgcatgtttttaaaagga(配列番号80)、cagtagtgcatgtttttaaa(配列番号81)、ctcagcacacagtagtgcat(配列番号82)、agatgcaggagcaaaaaggt(配列番号83)、caggtagacagactgagcgc(配列番号84)、gcctcgatcctcttgcgcat(配列番号85)、gcggatggcctcgatcctct(配列番号86)、ctcaggatctgcccgcggat(配列番号87)、gctccggatagtcttccggg(配列番号88)、agatggaaatcacctccggg(配列番号89)、gttgtagatggaaatcacct(配列番号90)、ctggtactgttgtagatgga(配列番号91)、aggcggctgccctccggctt(配列番号92)、aacctccttggcgtagtact(配列番号93)、attttataaacctccttggc(配列番号94)、cggcatgtcgattttataaa(配列番号95)、cgggatggcattttcggagg(配列番号96)、gtagggtctgtagaaagtgg(配列番号97)、tgaagtagggtctgtagaaa(配列番号98)、attctgaagtagggtctgta(配列番号99)、aagcggacgattctgaagta(配列番号100)、cccaggttcctgtctttgtg(配列番号101)、ggcagtgtaaacttatttta(配列番号102)、ccatcaatacctgcaaatct(配列番号103)、aggtgccatcaatacctgca(配列番号104)、agttttctgatcaccactgg(配列番号105)、ttatagttttctgatcacca(配列番号106)、cctagtggactttatagttt(配列番号107)、acattagcaggagatgtggg(配列番号108)、agggcaacaacattagcagg(配列番号109)、actccagtctgtaggagggc(配列番号110)、tcctgcacatttctaaagca(配列番号111)、cagcaattatcctgcacatt(配列番号112)、atgtaaagagggcgaaggca(配列番号113)、ctcttaaaatcaatgtaaag(配列番号114)、ccaagatccctcttaaaatc(配列番号115)、cctttgggttcatggatcca(配列番号116)、gcattgtaccctttgggttc(配列番号117)、gcacagaagttagcattgta(配列番号118)、ctgaggactttggtgtgttg(配列番号119)、tcctgggacacacagcaagg(配列番号120)、tttagctgcatttacaagac(配列番号121)、caaggactttagctgcattt(配列番号122)、gtcattgtcaccgtgatttt(配列番号123)、ccagttttaacaaacagaac(配列番号124)、agatgccagttttaacaaac(配列番号125)、gttcattatatagtaacaca(配列番号126)、atgaaaggttcattatatag(配列番号127)、ttccaagggtaatgaaaggt(配列番号128)、cttaagccatccatgagttt(配列番号129)、cctggcttatttgagttcaa(配列番号130)、ttagtcctataacaactcac(配列番号131)、gcaaagaaccatttacaatt(配列番号132)、cttgcttaaactggcaaaga(配列番号133)、acatgtaaagtagttactgt(配列番号134)、acacattacatgtaaagtag(配列番号135)、taagatctacacattacatg(配列番号136)、attcaaaggtactggccagc(配列番号137)、tttgtagtgcaagtcaaaat(配列番号138)、catgtcattaaatggacaat(配列番号139)、cctacatttgtgcgaacttc(配列番号140)、ttccccctttgaaaaactca(配列番号141)、tttttaatcagcctgcaaag(配列番号142)、actgggcagacagtttcgga(配列番号143)、taacaactgggcagacagtt(配列番号144)、tgttgtaacaactgggcaga(配列番号145)、cacagagcacctgggactgt(配列番号146)、gtacccacagagcacctggg(配列番号147)、tcaaggtacccacagagcac(配列番号148)、tggcatcaaggtacccacag(配列番号149)、ggcgggatggcatcaaggta(配列番号150)、tttgcaggtattgatggcac(配列番号151)、ctccttcgatgtaactgatg(配列番号152)、ccttgctgcgtgtcccaaga(配列番号153)、tcgatatggaccagttcatg(配列番号154)、gtcccaagatttagaacctc(配列番号155)、gaacccaaaagccagagtgc(配列番号156)、atttcaagagggatctaggg(配列番号157)、aaacataagagagccttggt(配列番号158)、tctacctgcagcacactcga(配列番号159)、tcacaacagaccaaccggcg(配列番号160)、ttccaatttggtgaaagcag(配列番号161)、actctccttgatctatactt(配列番号162)、ccgcgggcagatcctgagca(配列番号163)、caaaatagacatgccgccct(配列番号164)、tgggatttaaaataagctta(配列番号165)、cagacttgagtcacaacaga(配列番号166)、ttggatgcggcctattgctt(配列番号167)、ctacgtccactttacattga(配列番号168)、ggaggtgatttccatctaca(配列番号169)、ccttggttcatcagtgttaa(配列番号170)、acgaaccc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gacggtagccgaagc(配列番号1933)、ggccagacggtagc(配列番号1934)、gtgtagggccagacggta(配列番号1935)、ccgaagccatttttcagg(配列番号1936)、ccccgaagccatttttc(配列番号1937)、ggttgatgtcgtcc(配列番号1938)、
gcttgagacactcgc(配列番号1939)、ccggacccgtccat(配列番号1940)、gcttgctttactgc(配列番号1941)、ggttgctctgagac(配列番号1942)、gccacagtcatgcc(配列番号1943)、cgggcatgctggcg(配列番号1944)、gtgaagttcaggatgatc(配列番号1945)、ccagtgcctcatgg(配列番号1946)、cagtgttctccatgg(配列番号1947)、ctgtaccagaccgag(配列番号1948)、gcatactgtttcagc(配列番号1949)、gccatcagctccttg(配列番号1950)、ccacaccatagatgg(配列番号1951)、gctggagcagtttcc(配列番号1952)、ctcgcttctgctgc(配列番号1953)、accgtggcaaagcg(配列番号1954)、aggtgacaccgtgg(配列番号1955)、gacttgattccttcag(配列番号1956)、ggatttgacttgattcc(配列番号1957)、gctgctgttcatgg(配列番号1958)、ccgtttctttcagtagg(配列番号1959)、cttgaagtaggagc(配列番号1960)、cgctcctacatggc(配列番号1961)、gatgaggtacaggcc(配列番号1962)、gtagatgaggtacag(配列番号1963)、gagtagatgaggtac(配列番号1964)、cctgggagtagatg(配列番号1965)、ggacctgggagtag(配列番号1966)、acatgggtggaggg(配列番号1967)、gtgctcatggtgtc(配列番号1968)、ctttcagtgctcatg(配列番号1969)、tgctttcagtgctca(配列番号1970)、gatgatctgactgcc(配列番号1971)、gttcgagaagatgatc(配列番号1972)、gggttcgagaagatg(配列番号1973)、ggtttgctacaacatg(配列番号1974)、cagcttgagggtttg(配列番号1975)、tgcccctcagcttg(配列番号1976)、gacacacactatctc(配列番号1977)、gcagccatctttattc(配列番号1978)、gttcagcagccatc(配列番号1979)、tggttcagcagcca(配列番号1980)、ctactggttcagcagc(配列番号1981)、tctactggttcagc(配列番号1982)、gccacaaagttgatgc(配列番号1983)、cattgccacaaagttg(配列番号1984)、gagaacttggtcattc(配列番号1985)、ggtcaatgaagagaac(配列番号1986)、cgatttccttggtc(配列番号1987)、ccgatttccttggtc(配列番号1988)、caaatagaggccgatttc(配列番号1989)、caaatagaggccga(配列番号1990)、cctctaggctggct(配列番号1991)、catacctctaggctg(配列番号1992)、agccatacctctag(配列番号1993)、cagccatacctctag(配列番号1994)、cacagagatagttacag(配列番号1995)、gtcttcgttttgaacag(配列番号1996)、ctagtcttcgttttgaac(配列番号1997)、tagctagtcttcgttttg(配列番号1998)、gagccactgcgcc(配列番号1999)、cgtgagccactgcg(配列番号2000)、cgtaacgatcactgg(配列番号2001)、gcactcgtaacgatc(配列番号2002)、ggagcactcgtaac(配列番号2003)、catcatcctgaggt(配列番号2004)、cagtatcatcatcctg(配列番号2005)、ctcagtatcatcatcc(配列番号2006)、ctaaaagtatgtgccatc(配列番号2007)、cacatcgcctctct(配列番号2008)、gcttcacagtcacatcgc(配列番号2009)、ggaaggcttcacagtc(配列番号2010)、cctgtgacttgagaattg(配列番号2011)、ggaagacctgtgac(配列番号2012)、ctctgctccacatatttg(配列番号2013)、caacgaagatctctg(配列番号2014)、caacaccaacgaag(配列番号2015)、ggtcttctgtttgc(配列番号2016)、cgatgaagtggtaggaag(配列番号2017)、ggttgcatggaagc(配列番号2018)、ggtcacaaacttgcc(配列番号2019)、ctgatttggtccactag(配列番号2020)、catgttagcactgttc(配列番号2021)、ggtcttgatgtactcc(配列番号2022)、ccacctaaagagagatc(配列番号2023)、cttgtactgcaccatc(配列番号2024)、gccagttaagaagatg(配列番号2025)、gagatcatgatccatgg(配列番号2026)、gtagtgtcccaatagtg(配列番号2027)、cttcctcatcattccc(配列番号2028)、cacaagcttttcgac(配列番号2029)、
［実施例１４］
５’および３’末端ＰＥＧ修飾コンジュゲートと第３の構成成分ペネトラチンとの組合せ
開始生成物は、５’末端がネイティブライゲーションによって修飾されたピリジル活性化５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドであり、これはｍＰＥＧ４００−ＮＨ−Ｃｙｓ（ＳＰｙ）−オリゴ−ＮＨ−ｍＰＥＧ１０００として記載されている。ペネトラチンと連結させたオリゴヌクレオチドは、図１および実施例１３の配列、好ましくは配列番号２０３０、２０３１、２０３２、２０５７、２０６６、および２４６１からなる群から選択される。ペネトラチンはＨ２Ｎ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＣ−ＣＯＯＨの配列を有しており、ペネトラチンとｍＰＥＧ４００−ＮＨ−Ｃｙｓ（ＳＰｙ）−オリゴ−ＮＨ−ｍＰＥＧ１０００のネイティブライゲーション部位との間の連結を改善させるために、Ｃ末端のシステインを追加で付加した。
２０ｎｍｏｌのｍＰＥＧ４００−ＮＨ−Ｃｙｓ（ＳＰｙ）−オリゴ−ＮＨ−ｍＰＥＧ１０００をホルムアミドに溶かして０．０５ｎｍｏｌ／μｌ（０．０５ｍＭ）の最終オリゴヌクレオチド濃度にし、これを１ｎｍｏｌのペネトラチンに加えた。ｍＰＥＧ４００−ＮＨ−Ｃｙｓ（ＳＰｙ）−オリゴ−ＮＨ−ｍＰＥＧ１０００およびペネトラチンの混合物を３７℃で３０分間インキュベーションし、その後、陰イオン交換カラムおよび逆相ＨＰＬＣによって精製した。結果を図１３Ａ〜Ｃに示し、配列番号２４６１のオリゴヌクレオチドが選択された。
同じ上述の条件を使用して、配列番号２０３０のＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドをネイティブライゲーション部位によってペネトラチンと連結させた。配列番号２０３０は、配列番号２４６１と同様、ペネトラチンと非常に効率的な組合せを示す。配列番号２０３０の結果を図１３Ａ〜Ｃおよび１４Ａ〜Ｃに示す。
最終産物ｍＰＥＧ４００−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｐｅｎ）−オリゴ−ＮＨ−ｍＰＥＧ１０００は、２，６ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）およびクエン酸水素二アンモニウムのマトリックスを有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおいて確認された。
［実施例１５］
５’および３’末端ＰＥＧ修飾コンジュゲートとＲＧＤＣペプチドとの組合せ
開始生成物は、５’末端がネイティブライゲーションによって修飾されたピリジル活性化５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドであり、これはｍＰＥＧ４００−Ｃｙｓ（ＳＰｙ）−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００として記載されている。ＲＧＤＣと連結させたオリゴヌクレオチドは、図１および実施例１３の配列、好ましくは配列番号２０３０、２０３１、２０３２、２０５７、２０６６、および２４６１からなる群から選択される。
活性化されたＲＧＤＣペプチドは、追加のＣ末端システインを含み、Ｈ２Ｎ−ＲＧＤＣ−ＣＯＯＨの配列を有していた。
５０ｎｍｏｌのｍＰＥＧ４００−Ｃｙｓ（ＳＰｙ）−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００を０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液、ｐＨ７．５に溶かして０．０５ｎｍｏｌ／μｌ（０．０５ｍＭ）の最終オリゴヌクレオチド濃度にした。ＲＧＤＣペプチド水溶液（１０ｎｍｏｌ／μｌ）を０．５×、２×、８×、および１６×過剰量で修飾オリゴヌクレオチドに加えた。ｍＰＥＧ４００−Ｃｙｓ（ＳＰｙ）−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００およびＲＧＤＣペプチドの混合物を３７℃で１時間インキュベーションし、その後、逆相ＨＰＬＣによって精製した。結果を配列番号２０３０のオリゴヌクレオチドについて図１６Ａ〜Ｃに示す。
最終産物ｍＰＥＧ４００−Ｃｙｓ（Ｓ−ＣＤＧＲ）−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００は、２，６ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）およびクエン酸水素二アンモニウムのマトリックスを有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおいて確認された。
［実施例１６］
膠芽細胞腫細胞に対するＰＥＧおよびＲＧＤ修飾オリゴヌクレオチドの効果
市販のヒト膠芽細胞腫細胞系Ａ−１７２（受託番号ＣＲＬ−１６２０）はＧｉａｒｄによって１９７３年に膠芽細胞腫を有する５３歳の男性から確立された。Ａ−１７２細胞はＣｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＬＳ）から入手した。これらの接着細胞は単層で成長させた。
Ａ−１７２膠芽細胞腫細胞（７０００個の細胞／ウェル、それぞれの条件について３個のウェル）を４８ウェルの組織培養プレート中の成長培地（１０％のウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地）に播種し、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気下、相対湿度＞９０％で培養した。
細胞播種の６時間後、上清を除去し、成長培地（未処理の細胞）あるいは０μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２．５μＭ、５μＭ、または１０μＭのＡＰ１２００９または誘導体＃２６もしくは＃２８を添加した成長培地からなる処理溶液によって置き換えた。誘導体＃２６は、ネイティブライゲーションによって５’／３’末端がＰＥＧ修飾されたＡＰ１２００９、すなわちｍＰＥＧ４００−ＡＰ１２００９−ｍＰＥＧ１０００であり、誘導体＃２８は、ネイティブライゲーション部位でＲＧＤと連結された５’／３’末端ＰＥＧ修飾ＡＰ１２００９、すなわちｍＰＥＧ４００−Ｃｙｓ（Ｓ−ＣＤＧＲ）−ＡＰ１２００９−ｍＰＥＧ１０００である。
処理溶液の交換は１回目の処理の２日および４日後に繰り返した。７日目に上清を収集し、遠心分離（３００×ｇ、５分間、周囲温度）によって細胞成分を取り除き、直ちに−２０℃で凍結した。細胞数は、たとえばＣｙＱｕａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ細胞増殖アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）を使用して、製造者の指示書に従って決定した。
分泌されたＴＧＦ−ベータ２は、たとえばＱｕａｎｔｉｋｉｎｅａヒトＴＧＦ−β２−ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造者の指示書に従って測定した。
図１７Ａに示されるように、誘導体＃２６（薄い灰色のカラム）は、ＴＧＦ−ベータ２発現の抑制において、１および２．５μＭでＡＰ１２００９（黒色のカラム）よりも有効である。誘導体＃２８（濃い灰色のカラム）は、ＴＧＦ−ベータ２発現の抑制において、特により低い濃度範囲、たとえば０．５μＭで誘導体＃２６よりもさらに有効である。図１７Ｂに示されるように、０〜１０μＭの濃度範囲では、ＡＰ１２００９、誘導体＃２６、または誘導体＃２８は、これらの細胞の増殖にほぼ影響を与えない。増殖およびＴＧＦ−ベータの抑制の比較は、増殖とは独立した特異的なＴＧＦ−ベータ抑制を示す。
［実施例１７］
５’および３’末端ＰＥＧ修飾コンジュゲートとフルオレセインとの組合せ
開始生成物は、５’末端がネイティブライゲーションによって修飾された５’／３’末端ＰＥＧ修飾オリゴヌクレオチドであり、これはｍＰＥＧ４００−Ｃｙｓ（ＳＰｙ）−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００として記載されている。ＲＧＤＣと連結させたオリゴヌクレオチドは、図１および実施例１３の配列、好ましくは配列番号２０３０、２０３１、２０３２、２０５７、２０６６および２４６１からなる群から選択される。
４３ｎｍｏｌのｍＰＥＧ４００−Ｃｙｓ（ＳＰｙ）−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００を５０ｍＭのトリス／１５０ｍＭのＮａＣｌ／５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．５に溶かし、０．２５ｎｍｏｌ／μｌのオリゴヌクレオチド濃度をもたらした。５０ｍＭのトリス／１５０ｍＭのＮａＣｌ／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５中の１２９ｎｍｏｌのフルオレセイン−ヨードアセテートを修飾オリゴヌクレオチドに加え、３０分間、室温でインキュベーションした。その後、試料を逆相ＨＰＬＣによって精製した。結果を配列番号２０３０のオリゴヌクレオチドについて図１９に示す。
最終産物ｍＰＥＧ４００−Ｃｙｓ（Ｓ−フルオレセイン）−オリゴ−ｍＰＥＧ１０００は、２，６ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）およびクエン酸水素二アンモニウムのマトリックスを有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおいて確認された。

Claims (15)

  1. 少なくとも１つのポリマー、好ましくはポリアルキレンオキシドと化合物との少なくとも一方または両方を、ネイティブライゲーションによってオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端と共有結合させてネイティブライゲーション部位を形成することを含み、
    前記オリゴヌクレオチドの５’末端のみがネイティブライゲーションによる前記ポリマーまたは化合物の結合によって修飾される場合、前記ポリマーおよび／または化合物はタンパク質でもペプチドでもない、修飾オリゴヌクレオチドを生成する方法。
  2. さらなるポリマーおよび／または化合物を、５’末端をネイティブライゲーションで修飾した前記オリゴヌクレオチドの前記ネイティブライゲーション部位および／または３’末端と結合させるか、あるいは、３’末端をネイティブライゲーションで修飾した前記オリゴヌクレオチドの前記ネイティブライゲーション部位および／または５’末端と結合させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端をネイティブライゲーションによってポリマーおよび／もしくは化合物と結合させる第１のステップと、
    前記オリゴヌクレオチドの遊離３’末端もしくは遊離５’末端をポリマーおよび／もしくは化合物と結合させる第２のステップと、
    前記ネイティブライゲーション部位を任意でポリマーおよび／もしくは化合物と結合させる第３のステップとを含むか；
    前記オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端をネイティブライゲーションによってポリマーおよび／もしくは化合物と結合させる第１のステップと、
    前記ネイティブライゲーション部位をポリマーおよび／もしくは化合物と結合させる第２のステップと、
    前記オリゴヌクレオチドの遊離３’末端もしくは遊離５’末端を任意でポリマーおよび／もしくは化合物と結合させる第３のステップとを含むか；または、
    前記オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端をポリマーおよび／もしくは化合物と結合させる第１のステップと、
    前記オリゴヌクレオチドの遊離５’末端もしくは遊離３’末端をネイティブライゲーションによってポリマーおよび／もしくは化合物と結合させる第２のステップと、
    前記ライゲーション部位を任意でポリマーおよび／もしくは化合物と結合させる第３のステップとを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｅｒｂｂ２（Ｈｅｒ−２）もしくはＭＩＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、かつ／または、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｅｒｂｂ２（Ｈｅｒ−２）もしくはＭＩＡの受容体のうちの１つもしくは複数とハイブリダイズする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ポリマーは、ポリエチレングリコール、好ましくは、ＰＥＧ−４００、ＰＥＧ−１０００、ＰＥＧ−２０００、ＰＥＧ−５０００、またはＰＥＧ１００００である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記化合物は、小分子、抗体、抗原、酵素、抗体もしくは酵素の一部、任意のペプチド、たとえば、内部移行ペプチド、アプタマー、スピーゲルマー、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、発色団、マーカー、ビオチン、ホルモン、シグナルペプチド、脂質、脂肪酸、糖、アミノ酸、受容体、受容体の一部、または受容体もしくは結合分子の任意のリガンドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ポリマーおよび／または化合物は、リンカーを用いてまたは用いずに前記オリゴヌクレオチドと結合される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記リンカーは可逆的または不可逆的リンカーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 修飾された前記オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの５’および／もしくは３’末端ならびに／または前記ライゲーション部位によって固体支持体と結合される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. オリゴヌクレオチドの５’および／もしくは３’末端ならびに／またはライゲーション部位においてポリマーおよび／または化合物を含み、
    前記オリゴヌクレオチドの５’末端のみがネイティブライゲーションによる前記ポリマーまたは化合物の結合によって修飾される場合、前記ポリマーおよび／または化合物はタンパク質でもペプチドでもない、ネイティブライゲーションによって修飾されたオリゴヌクレオチド。
  11. 腫瘍、転移の形成、免疫疾患もしくは障害、心血管病もしくは障害、および／またはウイルス性疾患もしくは障害の予防および／または処理に使用するための、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
  12. 前記腫瘍が、固形腫瘍、血液由来腫瘍、白血病、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性、肉芽腫、乾癬、星細胞腫、聴神経腫、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、神経膠腫、血管芽腫、ホジキンリンパ腫、髄芽腫、白血病、中皮腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、非ホジキンリンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫、精上皮腫、トラコーマ、ウィルムス腫瘍、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳がん、気管支原性癌、腎臓癌、子宮頸がん、絨毛癌、嚢胞腺癌、胚性癌腫、上皮癌、食道がん、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜がん、胆嚢がん、胃がん、頭部がん、肝癌、肺癌、髄様癌、頸部がん、非小細胞気管支原性／肺癌、卵巣がん、膵癌、乳頭癌、乳頭腺癌、前立腺がん、小腸癌、前立腺癌、直腸がん、腎細胞癌、皮膚がん、小細胞気管支原性／肺癌、扁平細胞癌、皮脂腺癌、精巣癌、および子宮がんからなる群から選択され、かつ／あるいは、
    前記免疫疾患または障害が、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）；多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性ループスエリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎、湿疹性皮膚炎を含む）；乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚ループスエリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい病反転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性昜出血性脳症、特発性両側性進行性感音性聴覚損失、再生不良性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活性肝炎、スティーブンス−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、移植片対宿主病、移植症例、およびアトピー性アレルギーなどのアレルギーからなる群から選択され、かつ／あるいは、
    前記心血管病または障害が、高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈攣縮、鬱血性心不全、冠動脈疾患、弁膜症、不整脈、および心筋症からなる群から選択され、かつ／あるいは、
    前記ウイルス性疾患または障害が、Ａ型肝炎（ＨＶＡ）、Ｂ型肝炎（ＨＶＢ）、Ｃ型肝炎（ＨＶＣ）、もしくは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ＨＩＶ、ＦＩＶ、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、エプスタイン−バー−ウイルスおよび天然痘ウイルスによって引き起こされるもの、またはウイルス関連がんからなる群から選択される、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
  13. 請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドを投与することによる、腫瘍、転移の形成、免疫疾患もしくは障害、心血管病もしくは障害、および／またはウイルス性疾患もしくは障害を予防および／または処理する方法。
  14. 請求項１０に記載の修飾オリゴヌクレオチドと、任意で薬学的に許容される担体とを含み、
    前記オリゴヌクレオチドの５’末端のみがネイティブライゲーションによるポリマーまたは化合物の結合によって修飾される場合、前記ポリマーおよび／または化合物はタンパク質でもペプチドでもない、医薬組成物。
  15. サイトカインおよび／または化学療法剤をさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
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