CN114585633A - 寡核苷酸缀合物组合物和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及包含至少一个GalNAc单体的GalNAc部分。本公开还涉及包含GalNAc部分和寡核苷酸例如saRNA或siRNA的GalNAc‑寡核苷酸缀合物，用于调节靶基因的表达。还提供了使用GalNAc‑寡核苷酸缀合物的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月19日提交的美国临时申请第62/888,748号和2020年8月11日提交的美国临时申请第63/064,114号的优先权，每一个的内容均通过引用整体并入本文。
序列列表的引用
本申请书与电子格式的序列表一起提交。提交的序列表文件名为2058-1026USPCT_SL.txt，创建于2020年8月17日，大小为44351字节。序列表的电子格式的信息的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及包含至少一个GalNAc单体的GalNAc部分(GalNAc moieties)。本公开还涉及包含GalNAc部分和寡核苷酸例如小激活RNA(saRNAs)或小抑制RNA(siRNAs)的GalNAc寡核苷酸缀合物。
发明背景
CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα、C/EBPα、C/EBPA或CEBPA)是从人类到啮齿类动物保守的亮氨酸拉链蛋白。这种核转录因子富含于肝细胞、骨髓单核细胞、脂肪细胞以及其他类型的乳腺上皮细胞[LekstRom-Himes等人,J.Bio.Chem,vol.273,28545-28548(1998)]。它由N末端部分中的两个反式激活结构域、介导与其他C/EBP家族成员的二聚化的亮氨酸拉链区和C末端部分中的DNA结合结构域组成。C/EBP转录因子家族的结合位点存在于许多基因的启动子区域，这些基因参与维持正常肝细胞功能和对损伤的反应。C/EBPα对参与免疫和炎症反应、发育、细胞增殖、抗细胞凋亡和几种代谢通路的几种肝特异性基因的转录具有多效性作用[DaRlington等人,CuRRent Opinion of Genetic Development,vol.5(5),565-570(1995)]。它对于维持肝细胞的分化状态至关重要。它激活白蛋白转录并协调编码参与尿素生产的多种鸟氨酸循环酶的基因表达，因此在正常肝功能中发挥重要作用。
出于治疗目的，需要用saRNA靶向调节CEBPA。
附图简要说明
上述和其他目的、特征和优点将从以下对附图中所例示的本发明特定实施方案的描述中变得显而易见，附图中类似的指示字符在不同视图中指代相同的部分。附图不一定按比例绘制，重点在于说明本发明的各个实施方案的原理。
图1显示在500nM时原代大鼠肝细胞中被动递送saRNA后的CEBPA mRNA水平。
图2显示在500nM时原代大鼠肝细胞中被动递送saRNA后的白蛋白mRNA水平。
图3显示在1μM时原代大鼠肝细胞中被动递送saRNA后的CEBPA mRNA水平。
图4显示在1μM时原代大鼠肝细胞中被动递送saRNA后的白蛋白mRNA水平。
图5显示正常小鼠在第1天和第3天以40mg/Kg注射并在第5天处死后的CEBPAmRNA的水平。CEBPA相对于PBS归一化，B2M作为管家基因。从冷冻肝样本中提取RNA，用qPCR测量mRNA水平。
图6显示正常小鼠在第1天和第3天以40mg/Kg注射并在第5天处死后的CEBPAmRNA的水平。CEBPA相对于PBS归一化，B2M作为管家基因。从冷冻肝样本中提取RNA，用qPCR测量mRNA水平。
图7显示正常小鼠在第1天和第3天以40mg/Kg注射并在第5天处死后的白蛋白mRNA的水平。白蛋白相对于PBS归一化，B2M作为管家基因。从冷冻肝样本中提取RNA，用qPCR测量mRNA水平。
图8显示正常小鼠在第1天和第3天皮下注射GalNAc-saRNA缀合物30mg/kg并在第5天处死后的肝脏中的CEBPAmRNA的水平。
图9显示CEBPa-saRNA-GalNAc缀合物L80(XD-14369K1缀合到GalNac簇G7)和L81(XD-14369K1缀合到GalNac簇G8)的体外剂量反应。
图10显示转染C5-siRNA-GalNAc缀合物后的C5 mRNA水平。
发明概述
本发明提供了用于设计、制备、制造、配制和/或使用短(或小)激活RNA(saRNA)(无论是否修饰)的组合物、方法和试剂盒，该saRNA调节靶基因的表达和/或功能以用于治疗目的，包括诊断和预后。术语“修饰的”或(视情况而定)“修饰”是指对核苷酸的任何一个或多个组分(糖、碱基或主链)的结构修饰和/或化学修饰。在碱基的情况下，可以修饰任何标准核酸碱基：A、G、U或C核糖核酸碱基。本发明的saRNAs中的核苷酸可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。
本发明的一个方面提供了一种合成的分离的小激活RNA(saRNA)，其上调靶基因的表达，其中saRNA包含对包含saRNA的多核苷酸的碱基、糖或主链中的至少一者的至少一个修饰。
本发明的另一方面提供了一种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)单体，其包含选自以下的结构：
(M1’)，
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基，
其中R4为合适的保护基团或C1-6直链或支链烷基，
其中R5和R6各自独立地为C1-6直链或支链烷基，并且
其中R7为合适的保护基团；
(M2’)，
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基；
其中R4为保护基团或C1-6直链或支链烷基，
其中R5和R6各自独立地为C1-6直链或支链烷基；并且
其中R7为合适的保护基团；
(M4’，其是固体支持物上的单体)，
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基，
其中R7为合适的保护基团；并且
其中连接体1为可切割的连接体(cleavable linker)；
和
(M5’，其是固体支持物上的单体)，
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基，
其中R7为合适的保护基团；并且
其中连接体1为可切割的连接体。
本发明的另一方面是包含至少一个GalNAc单体的GalNAc部分，其中GalNAc单体选自：
(M1)，其中R8为-H或C1-6直链或支链烷基；
(M2)，其中R8为-H或C1-6直链或支链烷基，且其中X为O或S；
(M3)，其中X为O或S；
(M4)；
(M5)；
和
(M6)。
本发明的另一方面提供了一种缀合物(conjugate)，其包含通过连接体连接到碳水化合物部分(例如N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)部分)的寡核苷酸。在本申请的上下文中，术语“部分(moiety)”是指整个化合物或缀合物中的一个单元或组分。例如，缀合物可以具有GalNAc部分、连接体部分和saRNA部分。GalNAc部分可以同时包含一个或多个GalNAc单体。术语“GalNAc簇”或“GalNAc多聚体”是指两个或多个GalNAc单体在一起。因此，在一些情况下(即，在同时存在两个或多个分子的情况下)，术语“GalNAc部分”、“GalNAc簇”和“GalNAc多聚体”可同义。寡核苷酸可以是反义寡核苷酸(ASO)、小激活RNA(saRNA)、小抑制RNA(siRNAs)、微小RNA(miRNA)、修饰的mRNA、自扩增RNA、环状RNA、适体RNA、核酶、质粒和免疫刺激性核酸。寡核苷酸可以是单链的或双链的。寡核苷酸可包括天然存在的核苷酸、合成的核苷酸和/或修饰的核苷酸。在本发明的上下文中，术语“小激活RNA”、“短激活RNA”或“saRNA”是指上调特定基因的表达或对该特定基因的表达具有积极作用的单链或双链RNA。该基因是saRNA的靶基因。上下文中的术语“小干扰RNA”、“小抑制RNA”或“siRNA”是指参与RNA干扰(RNAi)途径并干扰或抑制特定基因的表达的双链RNA。该基因是siRNA的靶基因。
本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其包含修饰的saRNA或包含连接有碳水化合物部分(例如，GalNAc部分)的saRNA的缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
本发明的另一方面提供了一种向细胞递送saRNA的方法，包括施用包含连接有碳水化合物部分(例如，GalNAc部分)的saRNA的缀合物。
本发明的另一方面提供了一种上调靶基因的表达的方法，包括施用修饰的saRNA或包含连接有碳水化合物部分(例如，GalNAc部分)的saRNA的缀合物。
本发明的另一方面提供了治疗或预防疾病的方法，包括施用修饰的saRNA或包含连接有碳水化合物部分(例如，GalNAc部分)的saRNA的缀合物，其中saRNA上调靶基因的表达，并且其中靶基因与疾病相关。
本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其包含修饰的siRNA或包含连接有碳水化合物部分(例如，GalNAc部分)的siRNA的缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。siRNA可下调靶基因的表达，例如但不限于补体C5(C5)或转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)。
本发明的另一方面提供了一种向细胞递送siRNA的方法，包括施用包含连接有碳水化合物部分(例如，GalNAc部分)的siRNA的缀合物。
本发明的另一方面提供了一种下调靶基因的表达的方法，包括施用修饰的siRNA或包含连接有碳水化合物部分(例如，GalNAc部分)的siRNA的缀合物。
本发明的另一方面提供了治疗或预防疾病的方法，包括施用修饰的siRNA或包含连接有碳水化合物部分(例如，GalNAc部分)的siRNA的缀合物，其中siRNA下调靶基因的表达，并且其中靶基因与疾病相关。
下面的描述中阐述了本发明的各个实施方案的细节。本发明的其他特征、目的和优点将从说明书和附图以及权利要求中显而易见。
发明详述
本发明提供了用于调节靶基因的表达和/或功能以用于治疗目的的组合物、方法和试剂盒。这些组合物、方法和试剂盒包含至少一种上调靶基因的表达的saRNA，其中所述saRNA包含至少一个化学修饰。
I.saRNA的设计与合成
在本发明的上下文中，术语“小激活RNA”、“短激活RNA”或“saRNA”是指上调特定基因的表达或对该特定基因的表达具有积极作用的单链或双链RNA。saRNA可以是14至30个核苷酸的单链。saRNA也可以是双链，每条链包含14至30个核苷酸。这种基因被称为saRNA的靶基因。如本文所用，靶基因是包含编码链和模板链的双链DNA。例如，上调CEBPA基因的表达的saRNA称为“CEBPAsaRNA”，且CEBPA基因是CEBPAsaRNA的靶基因。靶基因可以是任何感兴趣的基因。在一些实施方案中，靶基因在模板链上具有启动子区。
基因或mRNA的“上调”或“激活”是指基因或mRNA的表达水平的增加，或由mRNA编码的多肽(一种或多种)水平或其活性的增加。本发明的saRNA可对靶基因的表达具有直接上调作用。
本发明的saRNA可对从靶基因的模板链转录的RNA转录物(一种或多种)和/或由靶基因或mRNA编码的多肽(一种或多种)具有间接上调作用。下文中，从靶基因转录的RNA转录物称为靶转录物。靶转录物可以是靶基因的mRNA。靶转录物可以存在于线粒体中。本发明的saRNA可对生物过程或活动具有下游作用。在这样的实施方案中，靶向第一转录物的saRNA可以对第二非靶转录物具有作用(上调或下调)。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可在增殖细胞中显示功效。如本文关于细胞所使用的，“增殖”是指快速生长和/或繁殖的细胞。
靶基因的靶反义RNA转录物
在一个实施方案中，本发明的saRNAs被设计为与靶基因的靶反义RNA转录物互补，并且其可通过下调靶反义RNA转录物来发挥其对靶基因的表达和/或功能的影响。靶反义RNA转录物是由靶基因的编码链转录而来的，并且可以存在于细胞核中。
术语“互补”在上下文中是指能够在严谨条件下与靶反义RNA转录物杂交。
术语“反义”在本发明上下文中用于描述靶反义RNA转录物时是指该序列与基因编码链上的序列互补。
应该理解，DNA的胸苷在RNA中被尿苷替换，并且这种差异不会改变对术语“反义”或“互补性”的理解。
靶反义RNA转录物可以由编码链上在对应于靶基因转录起始位点(TSS)的位置上游高达100、80、60、40、20或10kb与对应于靶基因转录终止位点的位置下游高达100、80、60、40、20或10kb之间的基因座转录。
在一个实施方案中，靶反义RNA转录物由编码链上位于靶基因转录起始位点+/-1kb以内的基因座转录。
在另一实施方案中，靶反义RNA转录物由编码链上位于靶基因转录起始位点+/-500nt、+/-250nt、+/-100nt、+/-10nt、+/-5nt或+/-1nt以内的基因座转录。
在另一实施方案中，靶反义RNA转录物由编码链上位于靶基因转录起始位点+/-2000个核苷酸的基因座转录。
在另一实施方案中，编码链上的所述基因座在与靶基因转录起始位点对应的位置的上游或下游不超过1000个核苷酸处。
在另一实施方案中，编码链上的基因座在与靶基因转录起始位点对应的位置的上游或下游不超过500个核苷酸处。
如本文所用，术语“转录起始位点”(TSS)是指与转录起始位置相对应或标记转录起始位置的基因模板链上的核苷酸。TSS可位于基因模板链上的启动子区内。
如本文所用，术语“转录终止位点”是指基因模板链上的一个区域，其可以是一个或多个核苷酸区域，具有至少一个特征，例如但不限于编码靶转录物的至少一个终止密码子的区域、编码靶转录物3’UTR之前的序列的区域、RNA聚合酶释放基因的区域、编码剪接位点的区域或剪接位点之前的区域以及模板链上靶转录物的转录终止的区域。
在本发明的靶反义RNA转录物的上下文中，短语“由特定基因座转录”是指靶反义RNA转录物的转录从特定基因座开始。
靶反义RNA转录物与靶基因的基因组序列的编码链互补，且本文中对“基因组序列”的任何提及都是对“基因组序列的编码链”的简称。
基因的“编码链”与产生的mRNA具有相同的碱基序列，除了mRNA中的T被U替换之外。因此，基因的“模板链”与产生的mRNA是互补的和反平行的。
因此，靶反义RNA转录物可包含与位于在靶基因转录起始位点上游100、80、60、40、20或10kb与靶基因转录终止位点下游100、80、60、40、20或10kb之间的基因组序列互补的序列。
在一个实施方案中，靶反义RNA转录物包含与位于靶基因转录起始位点上游1kb和靶基因转录终止位点下游1kb之间的基因组序列互补的序列。
在另一实施方案中，靶反义RNA转录物包含与位于靶基因转录起始位点上游500、250、100、10、5或1个核苷酸与靶基因转录终止位点下游的末尾500、250、100、10、5或1个核苷酸之间的基因组序列互补的序列。
靶反义RNA转录物可包含与包含靶基因编码区的基因组序列互补的序列。靶反义RNA转录物可包含与模板链上的靶基因启动子区对齐的基因组序列互补的序列。基因可具有多个启动子区，在这种情况下，靶反义RNA转录物可与一个、两个或多个启动子区对齐。注释基因基因座(annotated gene loci)的在线数据库可用于鉴别基因的启动子区。当在一对核苷酸序列的上下文中使用术语“对齐(align，alignment)”时，是指该对核苷酸序列彼此互补或彼此具有序列同一性。
靶反义RNA转录物和靶基因的启动子区之间的对齐区域可以是部分的，且长度可以与单个核苷酸一样短，尽管其长度可为至少15或至少20个核苷酸，或者长度可为至少25个核苷酸，或者长度可为至少30、35、40、45或50个核苷酸，或长度可为至少55、60、65、70或75个核苷酸，或长度可为至少100个核苷酸。以下每一个具体安排的目的都是为了落入术语“对齐”的范围内：
a)靶反义RNA转录物和靶基因的启动子区在长度上相同，并且它们对齐(即，它们在其整个长度上对齐)。
b)靶反义RNA转录物比靶基因的启动子区短，并且在其整个长度上与靶基因的启动子区对齐(即，它在其整个长度上与靶基因的启动子区内的序列对齐)。
c)靶反义RNA转录物比靶基因的启动子区长，并且靶基因的启动子区与其完全对齐(即，靶基因的启动子区在其整个长度上与靶反义RNA转录物内的序列对齐)。
d)靶反义RNA转录物和靶基因的启动子区具有相同或不同的长度，并且对齐区域短于靶反义RNA转录物的长度和靶基因的启动子区的长度。
上述“对齐”的定义经必要修改后适用于其他重叠的描述，例如，整个说明书中的对齐的序列。显然，如果靶反义RNA转录物被描述为与靶基因的除启动子区外的区域对齐，则靶反义RNA转录物的序列与所述区域内的序列对齐，而不是与靶基因的启动子区内的序列对齐。
在一个实施方案中，靶反义RNA转录物的长度为至少1kb，或至少2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如，20、25、30、35或40kb。
在一个实施方案中，靶反义RNA转录物包含沿其全长与靶基因的编码链上的序列至少75％、或至少85％、或至少90％、或至少95％互补的序列。
本发明提供了靶向靶反义RNA转录物的saRNA，并可有效且特异地下调此类靶反义RNA转录物。这可以通过与靶反义RNA转录物内的区域具有高度互补性的saRNA来实现。所述saRNA与待靶向的靶反义RNA转录物内的区域的错配将不大于5个、或不大于4个或3个、或不大于2个、或不大于1个、或没有错配。
由于靶反义RNA转录物与靶基因的模板链的区域具有序列同一性，因此靶反义RNA转录物将与靶基因的模板链内的区域部分地相同，从而允许参考基因的模板链或靶反义RNA转录物。saRNA与靶反义RNA转录物杂交或结合的位置(因此在模板链上的相同位置)称为“靶序列(targeted sequence)”或“靶位点(target site)”。
saRNA的引导链或反义链(无论是单链还是双链)可与靶基因的模板链上的靶序列的反向互补物至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一(identical)。换句话说，saRNA的引导链或反义链可与靶序列至少80％、90％、95％、98％、99％或100％互补。因此，saRNA的引导链或反义链的反向互补物与靶序列具有高度的序列同一性。靶序列可与saRNA和/或saRNA的反向互补物具有相同的长度，即相同数量的核苷酸。
在一些实施方案中，靶序列包含至少14个且少于30个核苷酸。
在一些实施方案中，靶序列具有17、18、19、20、21、22或23个核苷酸。
在一些实施方案中，靶序列的位置位于模板链的启动子区内。
在一些实施方案中，靶序列位于模板链的TSS(转录起始位点)核心以内。如本文所用，“TSS核心”或“TSS核心序列”是指TSS(转录起始位点)上游2000个核苷酸和下游2000个核苷酸之间的区域。因此，TSS核心包含4001个核苷酸，TSS位于TSS核心序列自5’末端的2001位。
在一些实施方案中，靶序列位于TSS上游1000个核苷酸和下游1000个核苷酸之间。
在一些实施方案中，靶序列位于TSS上游500个核苷酸和下游500个核苷酸之间。
在一些实施方案中，靶序列位于TSS上游250个核苷酸和下游250个核苷酸之间。
在一些实施方案中，靶序列位于TSS上游100个核苷酸和下游100个核苷酸之间。
在一些实施方案中，靶序列位于TSS上游10个核苷酸和下游10个核苷酸之间。
在一些实施方案中，靶序列位于TSS上游5个核苷酸和下游5个核苷酸之间。
在一些实施方案中，靶序列位于TSS上游1个核苷酸和下游1个核苷酸之间。
在一些实施方案中，靶序列位于TSS核心中的TSS的上游。靶序列可以是TSS上游小于2000、小于1000、小于500、小于250、小于100、小于10或小于5个核苷酸。
在一些实施方案中，靶序列位于TSS核心中的TSS的下游。靶序列可以是TSS下游小于2000、小于1000、小于500、小于250、小于100、小于10或小于5个核苷酸。
在一些实施方案中，靶序列位于围绕TSS核心的TSS的+/-50个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列基本上与TSS核心的TSS重叠。在一些实施方案中，靶序列重叠开始或结束于TSS核心的TSS。在一些实施方案中，靶序列在上游或下游方向上与TSS核心的TSS重叠1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个核苷酸。
靶序列在模板链上的的位置由靶序列的5’末端的位置定义。靶序列的5’末端可以位于TSS核心的任何位置，并且靶序列可以开始于选自TSS核心的位置1到位置4001的任何位置。作为本文的参考，当靶序列的5’最末端是从TSS核心的位置1到位置2000时，靶序列被认为在TSS的上游，当靶序列的5’最末端是从位置2002到4001时，靶序列被认为在TSS的下游。当靶序列的5’最末端是核苷酸2001时，靶序列被认为是TSS中心序列，既不在TSS的上游也不在TSS的下游。
作为进一步参考，例如，当靶序列的5’末端是TSS核心的1600位，即，它是TSS核心的第1600位核苷酸时，靶序列起始于TSS核心的1600位，并被认为在TSS的上游。
在一些实施方案中，TSS核心是如WO2016170348的表1和表2中所述的用于靶基因的序列，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，TSS核心是诸如但不限于WO2016170348的SEQ ID NO:1-4047、315236-318726、584785-589061、913310-917531、1241080-1245401、1559932-1564372和1879189-1889207的序列，其内容通过引用整体并入本文。
在一个非限制性实例中，靶基因为CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα、C/EBPα、C/EBPA或CEBPA)。本申请中提供了CEBPA-saRNA用以上调CEBPA表达。CEBPA是无内含子的基因，长度为2591个核苷酸，带有一个TSS。CEBPATSS核心序列如表1所示。
表1.CEBPAmRNA和TSS核心序列
在一个实施方案中，本发明的saRNA可具有形成双链体的两条链，一条链为引导链。saRNA双链体也称为双链saRNA。如本文所用，双链saRNA或saRNA双链体是一种saRNA，其包含多于一条且优选两条链，其中的链间杂交可形成双链结构的区域。双链saRNA的两条链被称为反义链或引导链，和有义链或过客链。
saRNA双链体的反义链可与saRNA的引导链、反义链saRNA或反义saRNA互换使用，并且与靶反义RNA转录物内的区域具有高度互补性。反义链与靶反义RNA转录物或靶序列内的区域的错配可以不大于5个、或不大于4个或3个、或不大于2个、或不大于1个、或没有错配。因此，反义链与模板链上的靶序列具有高度互补性。saRNA双链体的有义链与有义链saRNA或有义saRNA互换使用，并且与模板链上的靶序列具有高度的序列同一性。在一些实施方案中，靶序列位于模板链的启动子区内。在一些实施方案中，靶序列位于模板链的TSS核心内。
saRNA双链体的反义链和/或有义链相对于靶序列的位置通过参考TSS核心序列来定义。例如，当靶序列位于TSS下游时，反义saRNA和有义saRNA起始于TSS的下游。在另一实例中，当靶序列起始于TSS核心的位置200时，反义saRNA和有义saRNA起始于TSS的上游。
本发明上下文中的“链”是指核苷酸的连续序列，包括非天然存在或修饰的核苷酸。两条或多条链可以是单独的分子，或者各自均形成单独分子的一部分，或者它们可以共价连接，例如通过诸如聚乙二醇连接体的间隔物。saRNA的至少一条链可包含与靶反义RNA互补的区域。这种链称为saRNA双链体的反义链或引导链。包含与saRNA的反义链互补的区域的saRNA的第二链称为有义链或过客链。
saRNA双链体还可以由至少部分地自互补形成发夹结构(包括双链体区)的单个分子形成。在这种情况下，术语“链”是指saRNA的一个区域，该区域与saRNA的另一内部区域互补。saRNA的引导链与靶反义RNA转录物内的序列的错配不大于5个、或不大于4个或3个、或不大于2个、或不大于1个、或没有错配。
在一些实施方案中，saRNA的过客链可包含至少一个与引导链上的对应核苷酸不互补的核苷酸，称为与引导链的错配。与引导链的错配可促进引导链的优先加载(preferential loading)(Wu等人，PLoS ONE,vol.6(12):e28580(2011)，其内容通过引用整体并入本文)。在一个实施方案中，所述与引导链的至少一个错配可位于过客链的3’末端。在一个实施方案中，过客链的3’末端可包含与引导链的1-5个错配。在一个实施方案中，过客链的3’末端可包含与引导链的2-3个错配。在一个实施方案中，过客链的3’末端可包含与引导链的6-10个错配。
在一个实施方案中，saRNA双链体可在增殖细胞中显示功效。
saRNA双链体可与靶反义RNA转录物的区域具有类似siRNA(siRNA-like)的互补性；也就是说，saRNA双链体中自引导链5’末端的核苷酸2-6与靶反义RNA转录物的区域之间具有100％的互补性。此外，saRNA的其他核苷酸可与靶反义RNA转录物的区域具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性。例如，从saRNA的核苷酸7(从5’末端开始计数)到3’末端可与靶反义RNA转录物的区域具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性。
上下文中的术语“小干扰RNA”或“siRNA”是指双链RNA，通常为20-25个核苷酸长，参与RNA干扰(RNAi)通路，且干扰或抑制特定基因的表达。所述基因是siRNA的靶基因。例如，干扰A3GALT2基因的表达的siRNA被称为“A3GALT2-siRNA”，A3GALT2基因是靶基因。siRNA通常约21个核苷酸长，在两条链的每一端各有3’悬突(例如，2个核苷酸)。
siRNA通过结合并促进靶基因的一个或多个RNA转录物在特定序列上的切割来抑制靶基因表达。通常，在RNAi中，RNA转录物是mRNA，因此mRNA的切割导致基因表达的下调。在本发明中，不愿束缚于任何理论，一个可能的机制是本发明的saRNA可以通过结合到靶反义RNA转录物来调节靶基因表达。靶反义RNA转录物可以被切割，或者可以不被切割。
双链saRNA可包含一个或多个单链的核苷酸悬突。在双链saRNA和siRNA的上下文中，术语“悬突”或“尾”是指至少一个从saRNA或siRNA的双链体结构突出来的未配对的核苷酸。例如，当saRNA的一条链的3’-末端延伸超出另一条链的5’-末端时，或者反之亦然，则存在核苷酸悬突。saRNA可包含至少一个核苷酸的悬突；或者，悬突可包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸悬突可包含包括脱氧核苷酸/核苷在内的核苷酸/核苷类似物，或由其组成。悬突(一个或多个)可位于有义链、反义链或其任何组合上。此外，悬突的核苷酸(一个或多个)可存在于saRNA的反义链或有义链的5’末端、3’末端或两端上。在两个寡核苷酸设计为在杂交后形成一个或多个单链悬突时，则在确定互补性方面，此类悬突不应被视为错配。例如，包含一个长度为19个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸的saRNA，其中较长的寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的19个核苷酸的序列，就本文所述目的而言，仍可称为“完全互补”。悬突核苷酸可以是天然或非天然核苷酸。悬突可以是如本文所定义的修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，双链saRNA的反义链在3’末端和/或5’末端具有1-10个核苷酸的悬突。在一个实施方案中，双链saRNA的反义链在其3’末端具有1-4个核苷酸的悬突，或在其3’末端具有1-2个核苷酸的悬突。在一个实施方案中，双链saRNA的有义链在3’末端和/或5’末端具有1-10个核苷酸的悬突。在一个实施方案中，双链saRNA的有义链在其3’末端具有1-4个核苷酸的悬突，或在其3’末端具有1-2个核苷酸的悬突。在一个实施方案中，双链saRNA的有义链和反义链均具有3’悬突。3’悬突可包含一个或多个尿嘧啶，例如序列UU或UUU。在一个实施方案中，用硫代磷酸核苷替换悬突中的一个或多个核苷酸，其中核苷间连接为硫代磷酸。在一个实施方案中，悬突包含一个或多个脱氧核糖核苷，例如序列dTdT或dTdTdT。在一个实施方案中，悬突包含序列dT*dT，其中“*”是硫代磷酸核苷间连接(有时称为“s”)。在一个实施方案中，悬突包含至少一个2’-Ome修饰的U(称为u)。在一个实施方案中，悬突包含u*u(也称为usu)。在一个实施方案中，悬突包含uu。在一个实施方案中，悬突包含反向核苷酸或核苷，其连接有具有反向连接(3’-3’或5’-5’键)的链。例如，悬突可以包含反向dT或反向无碱基核苷。反向无碱基核苷没有碱基部分。
本领域技术人员理解，通过参考靶反义RNA转录物或靶序列来定义本发明的saRNA是方便的，而不管saRNA调节靶基因表达的机制如何。然而，本发明的saRNA也可以替代地通过参考靶基因来定义。靶反义RNA转录物与靶基因的编码链上的基因组区域互补，且本发明的saRNA又与靶反义RNA转录物的区域互补，因此，本发明的saRNA可定义为与靶基因的编码链上的区域具有序列同一性。本文通过参考靶反义RNA转录物所讨论的关于本发明saRNA的定义的所有特征经必要修改后适用于通过参考靶基因对本发明的saRNA的定义，因此关于靶反义RNA转录物互补性的任何讨论都应理解为包括靶基因的基因组序列的同一性。因此，本发明的saRNA可与靶基因上的基因组序列具有高百分比同一性，例如至少80％、90％、95％、98％或99％或100％。基因组序列可以是靶基因转录起始位点上游或下游高达2000、1000、500、250或100个核苷酸。它可与靶基因的启动子区对齐。因此，saRNA可与和靶基因的启动子区对齐的序列具有序列同一性。
在一个实施方案中，设计本发明的saRNA不需要确定靶反义RNA转录物的存在。换句话说，saRNA的设计不需要鉴别靶反义RNA转录物。例如，TSS核心的核苷酸序列，即在靶基因转录起始位点上游2000个核苷酸到靶基因转录起始位点下游2000个核苷酸的区域中的序列，可通过靶基因的编码链的基因组序列、通过测序或通过在数据库中搜索获得。可以选择TSS核心内从模板链上TSS核心的位置1到位置4001的任何位置开始的靶序列，然后可以用于设计saRNA序列。如上所述，saRNA与靶序列的反向互补物具有高度的序列同一性。
然后确定在整个基因组中saRNA序列脱靶命中数、0个错配(0mm)命中数和1个错配(1mm)命中数。术语“脱靶命中数”是指整个基因组中与靶基因的模板链上的saRNA的靶序列相同的其他位点的数量。术语“0mm命中数”是指已知蛋白质编码转录物的数量而非saRNA的靶转录物的数量，saRNA可以以0错配与其的互补物杂交或结合。换句话说，“0mm命中数”计数的是已知蛋白质编码转录物的数量，而不是包含与saRNA序列完全相同的区域的saRNA的靶转录物的数量。术语“1mm命中数”是已知蛋白质编码转录物的数量而非指saRNA的靶转录物的数量，saRNA可以以1个错配与其的互补物杂交或结合。换句话说，“1mm命中数”计数的是已知蛋白质编码转录物的数量，而不是saRNA的靶转录物(包含与saRNA序列相同的区域且仅1个错配)的数量。在一个实施方案中，仅选择没有脱靶命中、没有0mm命中和没有1mm命中的saRNA序列。对于本申请中公开的那些saRNA序列，均不具有脱靶命中、0mm命中和1mm命中。
2011年6月23日提交的US 2013/0164846(其内容通过引用整体并入本文)中公开的方法(saRNA算法)也可用于设计saRNA。saRNA的设计也在CoRey等人的美国专利号8,324,181和美国专利号7,709,566、Li等人的公开号2010/0210707和Voutila等人,Mol TheRNucleic Acids,vol.1,e35(2012)中公开，其各自的内容通过引用整体并入本文。
“确定……存在”是指搜索靶基因基因座周围的EST和/或反义RNA转录物数据库，以确定合适的靶反义RNA转录物，或使用RT PCR或任何其他已知技术确认细胞中靶反义RNA转录物的物理存在。
在一些实施方案中，本发明的saRNA可以是单链的或双链的。双链分子包含第一链和第二链。如果是双链，则双链体的每条链的长度可为至少14或至少18，例如19、20、21或22个核苷酸。双链体可以在至少12个、或至少15个、或至少17个、或至少19个核苷酸的长度上杂交。每条链的长度可以正好是19个核苷酸。优选地，saRNA的长度小于30个核苷酸，因为超过该长度的寡核苷酸双链体可具有增加诱导干扰素反应的风险。在一个实施方案中，saRNA的长度为19至25个核苷酸。形成saRNA双链体的链可以具有相等或不等的长度。
在一个实施方案中，本发明的SARNA包含至少14个核苷酸且少于30个核苷酸的序列，其与靶序列具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的互补性。在一个实施方案中，与靶序列具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％互补性的序列的长度为至少15、16、17、18或19个核苷酸，或18至22或19至21，或恰好为19个核苷酸。
本发明的saRNA可包含与靶反义RNA转录物不互补的短3’或5’序列。在一个实施方案中，这种序列位于链的3’末端。该序列的长度可为1-5个核苷酸，或者2个或3个核苷酸。该序列可包含尿嘧啶，因此它可以是2或3个尿嘧啶的3’延伸段。所述序列可包含一个或多个脱氧核糖核苷，例如dT。在一个实施方案中，用硫代磷酸核苷替换所述序列中的一个或多个核苷酸，其中核苷间连接为硫代磷酸。作为非限制性实例，所述序列包含序列dT*dT，其中*为硫代磷酸核苷间连接。这种非互补序列可以称为“尾”。如果存在3’尾，链可以更长，例如19个核苷酸加上3’尾(其可以是UU或UUU)。在确定saRNA和靶反义RNA转录物之间的互补性方面，这种3’尾不应被视为错配。
因此，本发明的saRNA可由以下组成：(i)与靶反义RNA转录物的区域具有至少80％互补性的序列；和(ii)1-5个核苷酸的3’尾，其可以包含尿嘧啶残基或由尿嘧啶残基组成。因此，saRNA通常在其整个长度上与靶反义RNA转录物的区域具有互补性，3’尾(如果存在)除外。本申请中公开的任何saRNA序列都可任选地包含这样的3’尾。因此，在saRNA表和序列表中公开的任何saRNA序列都可任选地包含这样的3’尾。本发明的saRNA可进一步包含DiceR或DRosha底物序列。
本发明的saRNA可包含侧翼序列。侧翼序列可插入在本发明的saRNA的3’末端或5’末端中。在一个实施方案中，侧翼序列是miRNA序列，使得saRNA具有miRNA构型，并可以用DRosha和DiceR处理。在非限制性实例中，本发明的saRNA具有两条链，并且被克隆到微小RNA前体中，例如，miR-30主链侧翼序列。
本发明的saRNA可包含限制性内切酶底物或识别序列。限制性内切酶识别序列可以位于本发明的saRNA的3’末端或5’末端。限制性内切酶的非限制性实例包括NotI和AscI。
在一个实施方案中，本发明的saRNA由稳定地碱基配对在一起的两条链组成。在一些实施方案中，过客链可包含至少一个与引导链上的对应核苷酸不互补的核苷酸，称为与引导链的错配。在一个实施方案中，所述与引导链的至少一个错配可位于过客链的3’末端。在一个实施方案中，过客链的3’末端可包含与引导链的1-5个错配。在一个实施方案中，过客链的3’末端可包含与引导链的2-3个错配。在一个实施方案中，过客链的3’末端可包含与引导链的6-10个错配。
在一些实施方案中，双链saRNA可在每条链的3’末端包含一些未配对的核苷酸，形成3’悬突。形成每条链的3’悬突的未配对核苷酸的数量范围可以是1至5个核苷酸，或1至3个核苷酸，或2个核苷酸。3’悬突可以形成在上述3’尾上，因此3’尾可以是双链saRNA的3’悬突。
因此，本发明的saRNA可以是单链的，并且由以下组成：(i)与靶反义RNA转录物的区域具有至少80％互补性的序列；和(ii)1-5个核苷酸的3’尾，其可以包含尿嘧啶残基。本发明的saRNA可在其整个长度上与靶反义RNA转录物的区域具有互补性，3’尾(如果存在)除外。如上所述，除了“与靶反义RNA转录物互补”，本发明的saRNA也可定义为与靶基因的编码链具有“同一性”。本发明的saRNA可以是双链的，并且由第一链和第二链组成，该第一链包含(i)与靶反义RNA转录物的区域具有至少80％互补性的第一序列和(ii)1-5个核苷酸的3’悬突；该第二链包含(i)与第一序列形成双链体的第二序列和(ii)1-5个核苷酸的3’悬突。
如本文所述，靶基因的基因组序列可用于设计靶基因的saRNA。靶反义RNA转录物的序列可根据用以设计靶基因的saRNA的靶基因的序列确定。然而，不需要确定这样的靶反义RNA转录物的存在。
本发明的一个方面提供了调节靶基因的表达的saRNA。还提供了调节靶转录物的水平的saRNA。在一些实施方案中，靶转录物是编码转录物，例如mRNA。本发明的另一方面提供了调节由编码靶转录物所编码的蛋白质水平的saRNA。在一个实施方案中，与在没有本发明的saRNA的情况下靶基因的表达相比，在存在本发明的saRNA的情况下，靶基因的表达增加了至少20％、30％、40％或至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％。在其他实施方案中，与在没有本发明的saRNA的情况下靶基因的表达相比，在存在本发明的saRNA的情况下，靶基因的表达增加了至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，或增加了至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，或增加了至少60、70、80、90、100倍。靶基因的表达的调节可通过编码靶基因的mRNA水平的变化来反映或确定。
本发明的saRNA可以通过任何合适的方法产生，例如使用本领域普通技术人员所熟知的标准分子生物学技术通过合成或在细胞中表达而产生。例如，本发明的saRNA可以使用本领域已知的方法进行化学合成或重组生产。
本发明的SARNA可以是单链的，并且包含14-30个核苷酸。单链saRNA的序列可与序列具有至少60％、70％、80％或90％的同一性，所述序列例如但不限于WO2016170348的SEQID NO:4048-315235、318727-584784、589062-913309、917532-1241079、1245402-1559931、1564373-1879188和1889208-2585259，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，单链saRNA包含序列，所述序列例如但不限于WO2016170348的SEQ ID NO:4048-315235、318727-584784、589062-913309、917532-1241079、1245402-1559931、1564373-1879188和1889208-2585259，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，saRNA为单链saRNA，其包含反义序列，例如但不限于本申请开头引用的序列表中所述的任何反义序列。
在一个实施方案中，saRNA为单链saRNA，其包含反义序列，例如但不限于本申请开头引用的序列表中所述的任何有义序列。
本发明的单链saRNA可以是修饰的或未修饰的。
在一个实施方案中，单链saRNA可具有3’尾。
在一个实施方案中，saRNA可以是双链的。这两条链形成双链体，也称为saRNA双链体，且每条链包含14-30个核苷酸。双链saRNA的第一链可与序列具有至少60％、70％、80％或90％的同一性，所述序列例如但不限于WO2016170348的SEQ ID NO:4048-315235、318727-584784、589062-913309、917532-1241079、1245402-1559931、1564373-1879188和1889208-2585259，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，双链saRNA的第一链包含序列，所述序列例如但不限于SEQ ID NO:4048-315235、318727-584784、589062-913309、917532-1241079、1245402-1559931、1564373-1879188和1889208-2585259。双链saRNA的第二链可与序列具有至少60％、70％、80％或90％的同一性，所述序列例如但不限于WO2016170348的SEQ ID NO:4048-315235、318727-584784、589062-913309、917532-1241079、1245402-1559931、1564373-1879188和1889208-2585259，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，双链saRNA的第二链包括序列，所述序列例如但不限于WO2016170348的SEQ ID NO:4048-315235、318727-584784、589062-913309、917532-1241079、1245402-1559931、1564373-1879188和1889208-2585259，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，双链saRNA可在每条链上具有3’悬突。
在一个实施方案中，本发明的saRNA为saRNA双链体。saRNA双链体可以是一对有义和反义序列，例如但不限于本申请开头引用的序列表中描述的任何有义序列和相应反义序列。本发明的saRNA可以是本申请开头引用的序列表中描述的一对有义序列和反义序列。
本发明的双链saRNA可以是修饰的或未修饰的。
双功能寡核苷酸
双功能或双重功能寡核苷酸，例如saRNA可被设计为上调第一基因的表达，且下调至少一个第二基因的表达。双重功能寡核苷酸的一条链激活第一基因的表达，另一条链抑制第二基因的表达。每一条链还可包含DiceR底物序列。
saRNA的化学修饰
在本文，在saRNA中，术语“修饰”或“修饰的”(视情况而定)是指针对A、G、U或C核糖核苷酸的结构和/或化学修饰。本发明的saRNAs中的核苷酸可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。本发明的saRNA可包括任何有用的修饰，例如对糖、核碱基或核苷间连接(例如，对磷酸连接/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)的修饰。嘧啶核碱基的一个或多个原子可以被任选取代的氨基、任选取代的硫醇基、任选取代的烷基(例如，甲基或乙基)或卤素(例如，氯或氟)替换或取代。在某些实施方案中，修饰(例如，一个或多个修饰)存在于糖和核苷间连接中的每一个中。本发明的修饰可以是将核糖核酸(RNA)修饰为脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂合物。在非限制性实例中，U的2’-OH被2’–OMe取代。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可包含本文所述的至少一个修饰。
在另一实施方案中，saRNA为saRNA双链体，并且所述有义链和反义序列可独立地包含至少一个修饰。作为非限制性实例，有义序列可以包含修饰，反义链可以是未修饰的。作为另一个非限制性实例，反义序列可以包含修饰，有义链可以是未修饰的。作为又一非限制性实例，有义序列可包含多于一个修饰，反义链可包含一个修饰。作为非限制性实例，反义序列可包含多于一个修饰，有义链可包含一个修饰。
本发明的saRNA可包含对糖、核碱基和/或核苷间连接的修饰的组合。这些组合可包含本文描述或2012年10月3日提交的国际申请公开WO2013/052523中描述的任何一个或多个修饰，特别是式(Ia)-(Ia-5)、(Ib)-(If)、(IIa)-(IIp)、(IIb-1)、(IIb-2)、(IIc-1)-(IIc-2)、(IIn-1)、(IIn-2)、(IVa)-(IVl)和(IXa)-(IXR))，其内容通过引用整体并入本文。
本发明的saRNA可沿分子的整个长度被或不被均匀修饰。例如，本发明的saRNA中，一个或多个或所有类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一个或多个或全部)可以被或可以不被均匀修饰。在一些实施方案中，对本发明的saRNA中的所有核苷酸X进行修饰，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任何一个，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任何一个。
在saRNA的不同位置可以存在不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间连接(例如，主链结构)。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他修饰(一个或多个)可位于saRNA的任何位置(一个或多个)，使得saRNA的功能不会显著降低。本发明的saRNA可包含约1％至约100％的修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一个或多个类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一种或多种)或任何中间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。
在一些实施方案中，本发明的saRNA可修饰为环状核酸。本发明的saRNA的末端可通过化学试剂或酶连接，产生无自由端的环状saRNA。环状saRNA预期比其线性对应物更稳定，并且对RNase R核酸外切酶的消化有抵抗力。环状saRNA还可包含关于A、G、U或C核糖核苷酸的其他结构和/或化学修饰。
本发明的saRNA可用2013年10月10日公开的PCT公开WO2013/151666的第136至247页中公开的寡核苷酸或多核苷酸的任意修饰进行修饰，其内容通过引用整体并入本文。
本发明的saRNA可包括修饰的组合。saRNA可包括每条链至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个修饰。
在一些实施方案中，saRNA为至少50％修饰，例如，至少50％的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，saRNA为至少75％修饰，例如，至少75％的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，saRNA的两条链可在整个长度上进行修饰(100％修饰)。应当理解，由于核苷酸(糖、碱基和磷酸部分，例如连接体(linker))可各自被修饰，因此对核苷酸或核苷的任何部分的任何修饰都将构成修饰。
在一些实施方案中，saRNA仅在核苷酸的一个组分中为至少10％修饰，这种组分选自核酸碱基、糖或核苷之间的连接。例如，saRNA的修饰可以是针对所述saRNA的核酸碱基、糖或连接(linkage)的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％进行的。
在一些实施方案中，saRNA包含至少一个糖修饰。糖修饰的非限制性实例可包括以下：
在一些实施方案中，saRNA的核苷酸的糖的2’位置(RNA中的OH或DNA中的H)中的至少一个被-OMe取代，称为2’-OMe。
在一些实施方案中，saRNA的核苷酸的糖的2’位置(RNA中的OH或DNA中的H)中的至少一个被-F取代，称为2’-F。
在一些实施方案中，saRNA包含核苷酸之间的至少一个硫代磷酸酯连接或甲基膦酸酯连接。
在一些实施方案中，saRNA包含3’和/或5’加帽(capping)或悬突。在一些实施方案中，本发明的saRNA可包含至少一个反向脱氧核糖核苷悬突(例如，dT)。反向悬突，例如dT，可以位于过客(有义)链的5’端或3’端。在一些实施方案中，本发明的saRNA可包含过客链上的反向无碱基修饰。至少一个反向无碱基修饰可以位于过客链的5’末端、3’末端或两者。反向无碱基修饰可以促进引导(反义)链的优先加载。
在一些实施方案中，saRNA包含至少一个5’-(E)-乙烯基膦酸(5’-E-VP)修饰。
在一些实施方案中，saRNA包含至少一个乙二醇核酸(GNA)，其为无环核酸类似物，作为修饰。
在一些实施方案中，saRNA包含至少2个具有相同糖修饰的连续核苷酸的至少一个基序。在一个实例中，这种基序可包含2或3个连续核苷酸。在一些实施方案中，基序的连续核苷酸包含2’-F修饰。在一些实施方案中，基序的连续核苷酸包含2’-OMe修饰。
在一些实施方案中，当saRNA为双链时，saRNA的过客链和引导链各自包含具有相同糖修饰的连续核苷酸的至少一个基序。
在一些实施方案中，saRNA的过客链和引导链各自包含具有相同糖修饰的连续核苷酸的至少两个基序。在一些实施方案中，给定链上的所述至少两个基序独立地具有不同的糖修饰。例如，过客链或引导链可具有2’-OMe修饰的至少一个基序和2’-F修饰的至少一个基序。在一些实施方案中，给定链上的所述至少两个基序被至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)核苷酸分隔。在一些实施方案中，给定链上的所述至少两个基序是连接的。在一些实施方案中，过客链上的至少一个基序及其引导链上的互补基序具有不同的糖修饰。例如，过客链上的基序的核苷酸具有2’-F修饰，引导链上的基序的核苷酸具有2’-OMe修饰，其中这两个基序彼此互补。在另一实例中，过客链上的基序的核苷酸具有2’-OMe修饰，引导链上的基序的核苷酸具有2’-F修饰，其中这两个基序彼此互补。
在一些实施方案中，基序的修饰不同于基序两侧紧邻核苷酸的修饰。
在一些实施方案中，saRNA包含交替(alternating)糖修饰的至少一个基序。在一个实例中，交替糖修饰的基序包含2至30个核苷酸。在一些实施方案中，基序包含交替的2’-F和2’-OMe修饰。
在一些实施方案中，当saRNA为双链时，过客链和引导链各自包含交替糖修饰的至少一个基序。在一些实施方案中，过客链上的至少一个核苷酸及其在引导链上的互补核苷酸具有不同的糖修饰。例如，过客链上的碱基对的一个核苷酸具有2’-F修饰，引导链上的碱基对的另一个核苷酸具有2’-OMe修饰。在另一实例中，过客链上的碱基对的一个核苷酸具有2’-OMe修饰，引导链上的碱基对的另一个核苷酸具有2’-F修饰。
在一些实施方案中，saRNA为双链，并具有以下通式：
过客(有义或SS)：5’悬突1–NT1–(XXX-NT2)n–悬突2 3’，
引导(反义或AS)：3’悬突3–NT1’–(YYY-NT2’)n–悬突4 5’，(I)
其中：
每条链的长度为14-30个核苷酸，
悬突1、悬突2、悬突3和悬突4中的每一个独立地表示包含0-5个核苷酸的寡核苷酸序列，
NT1和NT1’表示包含0-20个核苷酸的寡核苷酸序列，且其中NT1与NT1’互补，
XXX-NT2和YYY-NT2’中的每一个独立地表示连续核苷酸的基序，其中前3个连续核苷酸具有相同的化学修饰，随后是包含0-20个核苷酸的寡核苷酸序列，并且其中XXX与YYY互补，NT2与NT2’互补，
NT1、NT2、NT1’和NT2’中的每一个都包含至少一个化学修饰，以及
n为1至5的数字。
具有式(I)的saRNA的引导链包含与位于靶基因的模板链上的TSS核心中的靶序列的反向互补物至少80％同一的序列。换言之，具有式(I)的saRNA的引导链包含与位于靶基因的模板链上的TSS核心中的靶序列至少80％互补的序列。“靶序列”和“TSS核心”如上定义。
XXX和YYY中的3个连续核苷酸不需要相同。它们只需要具有相同的化学修饰。
在一些情况下，每条链包含14-17个核苷酸、17-25个核苷酸、17-23个核苷酸、23-27个核苷酸、19-21个核苷酸、21-23个核苷酸或27-30个核苷酸。
在一些情况下，每条链包含至少一个糖修饰。
在一些情况下，过客链上的至少一个核苷酸及其在引导链上的互补核苷酸具有不同的糖修饰。
在一些情况下，NT1、NT2、NT1’和NT2’具有交替修饰，例如交替的2’-OMe和2’-F修饰。
在一些情况下，XXX的3个连续核苷酸具有2’-OMe修饰，YYY的3个连续核苷酸具有2’-F修饰。
在一些情况下，XXX的3个连续核苷酸具有2’-F修饰，YYY的3个连续核苷酸具有2’-OMe修饰。
在一些情况下，XXX或YYY的修饰不同于XXX或YYY两侧紧邻核苷酸的修饰。
在一些情况下，YYY基序可起始于反义链自5’末端的第8、9、10、11、12或13位。
在一些情况下，XXX基序可起始于有义链自3’末端的第8、9、10、11、12或13位。
在一些情况下，悬突1、悬突2、悬突3和/或悬突4包含uu。
在一些情况下，悬突1、悬突2和/或悬突3包含反向dT。
在一些情况下，悬突1、悬突2和/或悬突3包含反向无碱基核苷。
在一些情况下，saRNA包含核苷酸之间的至少一个硫代磷酸酯连接(
在序列中称为s)或甲基膦酸酯连接。硫代磷酸酯连接或甲基膦酸酯连接可以位于一条链的3’末端，例如，有义链或反义链。例如，反义链的3’末端的悬突可以是：usu。
在一些情况下，saRNA的过客链在其3’末端或5’末端包含连接体，这使得部分(moiety)能够连接至过客链的3’末端或5’末端。悬突1或悬突2可包含连接体。连接体可以是任何合适的连接体，例如NH2-(CH2)6--(在序列中称为NH2C6)。连接体和过客链之间可以存在硫代磷酸连接。
在一些实施方案中，与未修饰的版本相比，修饰的saRNA具有改进的稳定性。修饰的saRNA的血清半衰期(serum half-life)可以比未修饰的版本长约至少约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时、60小时、66小时、72小时、78小时、84小时、90小时或96小时。在一些实施方案中，修饰的saRNA具有至少48小时、60小时、72小时、84小时或96小时的半衰期。
在一些实施方案中，saRNA上调CEBPA。具有至少一个修饰的CEBPA-saRNA序列的非限制性实例包括表2中的saRNA。母体序列没有修饰。
表2.修饰的CEBPA-saRNA序列
Nf＝核苷酸N(N可为A、U、C或G)具有2’-氟(2’-F)修饰
小写＝核苷酸具有2’-O-甲基(2’-OMe)修饰
s：硫代磷酸酯连接
invdT：反向脱氧T(dT)
Invabasic：反向无碱基核苷酸
任何修饰的saRNA上的(NH2C6)连接体都可替换为另一合适的连接体。
在一个实施方案中，CEBPA-saRNA包含式(I)。CEBPA-saRNA的反义链与CEBPATSS核心上的区域的反向互补物至少80％同一。具有通式(I)的CEBPA-saRNA的非限制性实例包括S6(XD-06414,SEQ ID No.14和15)。
saRNA缀合物(conjugate)及组合(combination)
缀合可导致增加的稳定性和/或半衰期，并且在将本发明的saRNA靶向于细胞、组织或生物体中的特定位点时可特别有用。本发明的saRNA可设计为缀合于其他多核苷酸、染料、插入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、替沙林、Sapphyrin)、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、烷基化剂、磷酸盐/酯(phosphate)、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、多氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶、蛋白质(例如，糖蛋白)或肽(例如，对共配体具有特异亲和力的分子)或抗体(例如与特定的细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞结合的抗体)、激素和激素受体、非肽物种(例如脂质)、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子或药物。2012年12月14日提交的国际公开WO 2013/090648中公开了核酸分子的合适缀合物，其内容通过引用整体并入本文。
根据本发明，本发明的saRNA可与以下一种或多种一起施用或者进一步包含以下一种或多种：RNAi试剂、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、RNA增强子、增强子衍生的RNA或增强子驱动的RNA(eRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA结合位点、反义RNA、核酶、催化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体或载体等，以实现不同的功能。所述的一种或多种RNAi干扰剂、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA结合位点、反义RNA、核酶、催化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体或载体可包含至少一个修饰或取代。
在一些实施方案中，修饰选自核酸在糖位置的化学取代、在磷酸位置的化学取代和在碱位置的化学取代。在其他实施方案中，化学修饰选自掺入修饰的核苷酸；3’加帽；与高分子量的非免疫原性化合物缀合；与亲脂性化合物缀合；以及将硫代磷酸酯掺入磷酸酯主链。在一个实施方案中，高分子量的非免疫原性化合物为聚亚烷基二醇或聚乙二醇(PEG)。
在一个实施方案中，包含至少一个修饰的saRNA可在增殖细胞中显示功效。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可连接至转基因，从而其可从RNA聚合酶II启动子共同表达。在非限制性实例中，本发明的saRNA连接有绿色荧光蛋白基因(GFP)。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可连接有DNA或RNA适体，从而产生saRNA-适体缀合物。适体是具有高选择性、亲和力和稳定性的寡核苷酸或肽。它们呈现特定且稳定的三维形状，从而提供与靶分子高度特异的紧密结合。适体可以是通过重复数轮的体外选择或等效的SELEX(通过指数富集的配体系统进化)而工程化从而结合各种分子靶(例如小分子、蛋白质、核酸，甚至细胞、组织和生物体)的核酸种类。核酸适体通过除经典沃森-克里克碱基配对以外的相互作用对分子具有特异的结合亲和力。核酸适体，如噬菌体展示产生的肽或单克隆抗体(MAB)，能够特异性结合到选定的靶标，并通过结合而阻断其靶标的能力，由此起作用。在一些情况下，适体也可以是肽适体。对于任何特定的分子靶标，可以通过核酸组合文库鉴别核酸适体，例如通过SELEX。可使用酵母双杂交系统鉴别肽适体。因此，本领域技术人员能够设计合适的适体，用于将本发明的saRNA或细胞递送至靶细胞，例如肝细胞。DNA适体、RNA适体和肽适体都包括在内。优选使用肝脏特异性适体将本发明的saRNA施用至肝脏。
如本文所用，典型的核酸适体大小为约10-15kDa(20-45个核苷酸)，以至少纳摩尔亲和力与其靶标结合，并辨别密切相关的靶标。核酸适体可以是核糖核酸、脱氧核糖核酸或混合的核糖核酸和脱氧核糖核酸。适体可以是单链的核糖核酸、脱氧核糖核酸或混合的核糖核酸和脱氧核糖核酸。适体可包含至少一个化学修饰。
适体的合适核苷酸长度范围为约15至约100个核苷酸(nt)，并且在多个其他实施方案中，长度为15-30nt、20-25nt、30-100nt、30-60nt、25-70nt、25-60nt、40-60nt、25-40nt、30-40nt，22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40nt中的任一个，或40-70nt。然而，该序列可以设计为具有足够的灵活性，使得其能够适应适体与本文所述距离处的两个靶的相互作用。适体可进一步修饰以提供对核酸酶和其他酶活性的保护。适体序列可以通过本领域已知的任何合适的方法进行修饰。
saRNA-适体缀合物可使用用于连接两个部分的任何已知方法形成，例如直接化学键形成、通过连接体(例如链霉亲和素)连接等。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可连接至抗体。产生针对靶细胞表面受体的抗体的方法是众所周知的。本发明的saRNA可通过已知方法(例如使用RNA载体蛋白)连接此类抗体。由此产生的复合物随后可施用给受试者，并通过受体介导的内吞作用被靶细胞摄取。
在一个实施方案中，本发明的saRNA可缀合有脂质部分，例如胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86:6553-6556)，胆酸(Manoharan等人,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4:1053-1060)，硫醚，例如beryl-5-tritylthiol(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306-309；Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.,1992,20:533-538)，脂肪链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J,1991,10:1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259:327-330；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75:49-54)，磷脂，例如双十六烷基-rac-甘油或三乙基-铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H膦酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18:3777-3783)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654)，棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229-237)，或十八烷基胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(hexylamino-carbonyloxycholesterol moiety)(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923-937)，其各自的内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本发明的saRNA与配体缀合。在一个非限制性实例中，配体可以是在ManohaRan等人的US 20130184328中公开的任何配体，其内容通过引用整体并入本文。缀合物的通式是配体-[连接体]任选的-[系链]任选的-寡核苷酸试剂。寡核苷酸试剂可包含具有由Manoharan等人的US20130184328公开的式(I)的亚单元，其内容通过引用整体并入本文。在另一个非限制性实例中，配体可以是在Akinc等人的US 20130317081中公开的任何配体，其内容通过引用整体并入本文，例如式II-XXVI的脂质、蛋白质、激素或碳水化合物配体。配体可与saRNA偶联(couple)，利用Akinc中公开的式XXXI-XXXV中的二价或三价支化连接体。
教导此类核酸/脂质缀合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，其各自的内容通过引用整体并入本文。
本发明的saRNA可与已知在所考虑的特定方法中具有效果的其他活性成分组合提供。所述其他活性成分可与本发明的saRNA同时、单独或顺序施用。在一个实施方案中，本发明的saRNA与调节不同靶基因的saRNA一起施用。非限制性实例包含调节白蛋白、胰岛素或HNF4A基因的saRNA。调节任何基因都可以使用单个saRNA或两个或多个不同saRNA的组合来实现。可与本发明的saRNA一起施用的saRNA的非限制性实例包括2012年6月20日提交的国际公开WO 2012/175958中公开的saRNA调节白蛋白或HNF4A、2011年10月10日提交的国际公开WO 2012/046084和WO 2012/046085中公开的调节胰岛素的saRNA、2006年11月13日提交的美国专利号7,709,456和2010年4月23日提交的美国专利公开US 2010/0273863中公开的调节人孕激素受体、人主穹窿蛋白(human major vault protein，hMVP)、E-钙粘蛋白基因、p53基因或PTEN基因的saRNA、2006年4月11日提交的国际公开WO 2006/113246中公开的靶向p21基因的saRNA、2011年11月12日提交的WO2012/065143中公开的上调WO 2012/065143的表8中的基因表达或增加肿瘤抑制因子的表达的任何核酸、2013年5月16日提交的WO2013/173635的表4中激活靶基因的任何寡核苷酸、2013年5月16日提交的WO2013/173637的表4中激活靶基因的任何寡核苷酸、与选自2013年5月16日提交的WO2013/173652的SEQID NO:1-1212中的序列互补的任何寡核苷酸、2013年5月16日提交的WO2013173647中公开的调节APOA1和ABCA1基因表达的任何寡核苷酸、2013年5月16日提交的WO2013173638中公开的调节SMN家族基因表达的任何寡核苷酸、2013年5月16日提交的WO2013173605中公开的调节PTEN基因表达的任何寡核苷酸、2013年5月16日提交的WO2013173608中公开的调节MECP2基因表达的任何寡核苷酸、2013年5月16日提交的WO2013173598中公开的调节ATP2A2基因表达的任何寡核苷酸、2013年5月16日提交的WO2013173645中公开的调节UTRN基因表达的任何寡核苷酸、2006年12月28日提交的美国专利号8,288,354中公开的调节CD97、TS-α、C/EBPδ、CDC23、PINK1、HIF1α、Gnbp3g、肾上腺髓质素AM1受体(AdrenomedullinAM1receptor)、3-酮酸CoA转移酶(3-oxoacid CoAtransferase)、组织蛋白酶W或BACE1的表达的任何核酸分子、2011年11月17日提交的US 2013/0245099中公开的具有式(I)的antagoNAT、2010年4月30日提交的美国专利号8,318,690中公开的上调血红蛋白(HBF/HBG)多核苷酸表达的任何antagoNAT、2009年10月2日提交的美国专利号8,153,696(CURNA)中公开的增加载脂蛋白(ApoA1)多核苷酸的表达的任何反义寡核苷酸，其各自的内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，saRNA与碳水化合物配体缀合，如ManohaRan等人(AlnylamPhaRmaceuticals)的美国专利号8106022和8828956中公开的任何碳水化合物配体，其各自的内容通过引用整体并入本文。例如，碳水化合物配体可以是单糖、二糖、三糖、四糖、低聚糖或多糖。缀合有这些碳水化合物的RNA试剂可以靶向肝实质细胞。在一个实施方案中，saRNA缀合有多于一个碳水化合物配体，优选两个或三个。在一个实施方案中，saRNA缀合有一个或多个半乳糖部分。在另一实施方案中，saRNA缀合至少一个(例如，两个或三个或更多个)乳糖分子(乳糖是偶联半乳糖的葡萄糖)。在另一实施方案中，saRNA与至少一个(例如，两个或三个或更多个)N-乙酰-半乳糖胺(GalNAc)、N-Ac-葡萄糖胺(GluNAc)或甘露糖(例如，甘露糖-6-磷酸)缀合。在一个实施方案中，saRNA与至少一个甘露糖配体缀合，并且缀合的saRNA靶向巨噬细胞。
GalNAc-核苷酸(GalNAc-saRNA/GalNAc-siRNA)缀合物
在一些实施方案中，saRNA共价连接有碳水化合物部分，其中该部分包含至少一个(例如，两个或三个或更多)N-乙酰-半乳糖胺(GalNAc)或其衍生物，以形成GalNAc-saRNA缀合物。GalNAc是半乳糖的氨基糖衍生物，包含结构
GalNAc是携带核酸构建体进入肝细胞的有效部分。已经表明，三元GalNAc的分立式结构(discrete structure)对于有效递送用于基因沉默的单链和双链寡核苷酸是最佳的。GalNAc-核苷酸缀合物可在不使用任何转染剂的情况下递送到表达脱唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor)的细胞。核苷酸可以是saRNA的一部分，该GalNAc-核苷酸缀合物被称为GalNAc-saRNA缀合物。核苷酸也可以是抑制基因表达的小抑制RNA(也称为小干扰RNA或siRNA)的一部分，该GalNAc-核苷酸缀合物称为GalNAc-siRNA缀合物。
在一些实施方案中，本公开提供了一种GalNAc-saRNA缀合物，其包含连接有GalNAc部分的小激活RNA(saRNA)，其中saRNA包含至少一个修饰，这种修饰可任选地独立于连接的GalNAc。saRNA可包含每条链至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个修饰。
在一些实施方案中，缀合物的saRNA为至少50％修饰，即，至少50％的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，saRNA为至少75％修饰，即，至少75％的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，saRNA的两条链可在整个长度上进行修饰(100％修饰)。应当理解，由于核苷酸(糖、碱基和磷酸部分，例如连接体)可各自被修饰，因此对核苷酸或核苷的任何部分的任何修饰均构成修饰。
在一些实施方案中，saRNA仅在核苷酸的一个组分中为至少10％修饰，这种组分选自核酸碱基、糖或核苷之间的连接。例如，saRNA的修饰可以是针对所述saRNA的核酸碱基、糖或连接的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％进行的。
在一些实施方案中，缀合物的saRNA包含至少一个糖修饰。在一些实施方案中，saRNA的核苷酸的糖的2’位置(RNA中的OH或DNA中的H)中的至少一个被-OMe取代，称为2’-OMe。在一些实施方案中，saRNA的核苷酸的糖的2’位置(RNA中的OH或DNA中的H)中的至少一个被-F取代，称为2’-F。
在一些实施方案中，缀合物的saRNA包含3’和/或5’加帽或悬突。在一些实施方案中，本发明的saRNA可包含至少一个反向脱氧核糖核苷悬突。反向悬突，例如dT，可以位于过客(有义)链的5’端或3’端。在一些实施方案中，本发明的saRNA可包含过客链上的反向无碱基修饰。所述至少一个反向无碱基修饰可以位于过客链的5’末端、3’末端或两者。反向无碱基修饰可促进引导链的优先加载。
在一些实施方案中，saRNA包含至少2个具有相同糖修饰的连续核苷酸的至少一个基序。在一个实例中，这种基序可包含2或3个连续核苷酸。在一些实施方案中，基序的连续核苷酸包含2’-F修饰。在一些实施方案中，基序的连续核苷酸包含2’-OMe修饰。
在一些实施方案中，当saRNA为双链时，saRNA的过客链和引导链各自包含具有相同糖修饰的连续核苷酸的至少一个基序。
在一些实施方案中，saRNA的过客链和引导链各自包含具有相同糖修饰的连续核苷酸的至少两个基序。在一些实施方案中，给定链上的所述至少两个基序独立地具有不同的糖修饰。例如，过客链或引导链可具有2’-OMe修饰的至少一个基序和2’-F修饰的至少一个基序。在一些实施方案中，给定链上的所述至少两个基序被至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)核苷酸分隔。在一些实施方案中，给定链上的所述至少两个基序是连接的。在一些实施方案中，过客链上的至少一个基序及其引导链上的互补基序具有不同的糖修饰。例如，过客链上的基序的核苷酸具有2’-F修饰，引导链上的基序的核苷酸具有2’-OMe修饰，其中这两个基序相互互补。在另一实例中，过客链上的基序的核苷酸具有2’-OMe修饰，引导链上的基序的核苷酸具有2’-F修饰，其中这两个基序相互互补。
在一些实施方案中，基序的修饰不同于基序两侧紧邻核苷酸的修饰。
在一些实施方案中，saRNA包含交替糖修饰的至少一个基序。在一个实例中，交替糖修饰的基序包含2至30个核苷酸。在一些实施方案中，基序包含交替的2’-F和2’-OMe修饰。
在一些实施方案中，当saRNA为双链时，过客链和引导链各自包含交替糖修饰的至少一个基序。在一些实施方案中，过客链上的所述至少一个核苷酸及其在引导链上的互补核苷酸具有不同的糖修饰。例如，过客链上的碱基对的一个核苷酸具有2’-F修饰，引导链上的碱基对的另一个核苷酸具有2’-OMe修饰。在另一实例中，过客链上的碱基对的一个核苷酸具有2’-OMe修饰，引导链上的碱基对的另一个核苷酸具有2’-F修饰。
在一些实施方案中，saRNA包含核苷酸之间的至少一个硫代磷酸酯连接或甲基膦酸酯连接。
在一些实施方案中，缀合物的saRNA包含本文所述的式(I)的通式。
在一些实施方案中，本公开提供了一种GalNAc-siRNA缀合物，其包含连接GalNAc部分的小抑制RNA(siRNA)。
在一些实施方案中，GalNAc部分连接核糖的2′-或3′-位置，或连接saRNA或siRNA的核苷酸的核酸碱基。GalNAc部分和核苷酸之间可以存在磷酸二酯或硫代磷酸酯连接。
在一些实施方案中，GalNAc部分通过连接体连接至saRNA或siRNA的核苷酸。连接体可以连接至saRNA或siRNA的核苷酸的任何适当位置。连接体可以共价或非共价结合到GalNAc部分。
在一些情况下，连接体连接至saRNA或siRNA链的末端。在一些实施方案中，连接体连接至有义链的5’末端。在一些实施方案中，连接体连接至有义链的3’末端。
在一些情况下，连接体连接至saRNA或siRNA的链的内部核苷酸。在一些情况下，连接体连接至saRNA或siRNA的有义链的内部核苷酸。在一些情况下，连接体连接至saRNA或siRNA的反义链的内部核苷酸。
Manoharan等人，Chemical Biology,vol.10(5):1181,(2015)或Manoharan等人，ChemBioChem,vol.16(6):903,(2015)中公开的任何连接方法(其各自的内容通过引用整体并入本文)可用于将GalNAc部分连接至saRNA。
在一些情况下，GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物的连接体是直接的键(direct bond)或原子，如氧或硫，单元，如–NH-、-C(O)-、-C(O)NH-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NH-，或原子的链，如但不限于烷基、烯基、炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中每个基团都可以是取代的或未取代的。
在一些情况下，连接体是可切割的连接体。可切割的连接体可在特定pH、由特定酶或在特定氧化还原环境下被切割。举例来说，可切割的连接体可包含酯键、酸不稳定性键、二硫键或磷酸键。
在一些情况下，连接体是不可切割的连接体。
在一些情况下，连接体包含胺基，例如-NH-(CH2)6-或NH2-(CH2)6-(称为NH2C6、C6NH2或C6)。对于在末端包含羧酸的GalNAc簇，羧酸与连接体上的胺反应，且GalNAc簇直接连接至saRNA-C6NH-或siRNA-C6NH。
在一些情况下，连接体包含羧酸基团，例如-O-CO-(CH2)n-CO-NH-(CH2)6-，n＝2、3、4、5或6。对于在末端包含胺的GalNAc簇，胺与连接体上的羧酸反应，且GalNAc簇直接连接至saRNA-(CH2)6-NH-CO-(CH2)n-CO-或siRNA-(CH2)6-NH-CO-(CH2)n-CO-。
在一些情况下，连接体和有义链之间存在硫代磷酸酯连接。
在一些情况下，GalNAc部分可以是三触角的GalNAc簇。PRakash等人，Journal ofMedicinal Chemistry,vol.59:2718-2733(2016)中公开的任何GalNAc簇，其内容通过引用整体并入本文，例如基于Tris的GalNAc簇、基于三酸的GalNAc簇、基于Lys-Lys的GalNAc簇、基于Lys-Gly的GalNAc簇、基于Trebler的簇、基于羟脯氨醇的簇(Prakash等人的图2中)可根据本公开使用。GalNAc簇可具有以下结构：
n＝1、2、3、4、5或6。
当使用连接体将有义链的3’或5’末端连接至GalNAc部分时，GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物包含如下结构：
例如
例如，GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物可具有以下结构：
例如
其中X为O或S。
在一些实施方案中，GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物包含选自M1、M1’、M2、M2’、M3、M3’、M4、M4’、M5、M5’、M6、M6’或其衍生物的至少一个GalNAc单体。GalNAc-saRNA缀合物可包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个GalNAc单体，这些单体选自M1、M1’、M2、M2’、M3、M3’、M4、M4’、M5、M5’、M6、M6’或其衍生物。
在一个实施方案中，GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物包含选自M1、M1’或其衍生物的至少一个GalNAc单体。
(M1’)，
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基。在一些实施方案中，R1、R2和R3中的至少一个为-CH3。在一些实施方案中，R1、R2和R3均为-CH3。
其中R4为合适的保护基团或C1-6直链或支链烷基，其包括但不限于甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、异丁基和其他烷基基团。在一些实施方案中，R4为-CH3或CH2CH3。在一些实施方案中，R4为-CH2CH2CN。
其中R5、R6各自独立地为C1-6直链或支链烷基，其包括但不限于甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、异丁基和类似烷基基团。在一些实施方案中，R5和R6均为2-丙基。
并且
其中R7为合适的保护基团。在一些实施方案中，保护基团为4,4’-二甲氧基三苯甲基(dimethoxytrityl)。
(M1，代表完全脱保护的寡核苷酸中的M1’)，
其中R8为-H或C1-6直链或支链烷基，其包括但不限于甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、异丁基和类似烷基基团；并且其中X为O或S。在一些实施方案中，R8为-CH3或-CH2CH3。
在另一个实施方案中，GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物包含选自M2、M2’或其衍生物的至少一个GalNAc单体。
(M2’)，
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基基团。在一些实施方案中，R1、R2和R3中的至少一个为-CH3。在一些实施方案中，R1、R2和R3均为-CH3。
其中R4为保护基团或C1-6直链或支链烷基，其包括但不限于甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、异丁基和类似的烷基基团。在一些实施方案中，R4为-CH3或CH2CH3。在一些实施方案中，R4为-CH2CH2CN。
其中R5、R6各自独立地为C1-6直链或支链烷基，其包括但不限于甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、异丁基和其他烷基基团。在一些实施方案中，R5和R6均为2-丙基。
并且
其中R7为合适的保护基团。在一些实施方案中，保护基团为4,4’-二甲氧基三苯甲基。
(M2，代表完全脱保护的寡核苷酸中的M2’)，
其中R8为-H或C1-6直链或支链烷基，其包括但不限于甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、异丁基和类似烷基基团；并且其中X为O或S。在一些实施方案中，R8为-CH3或-CH2CH3。
在一个实施方案中，GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物包含选自M3、M3’或其衍生物的至少一个GalNAc单体。
(M3’)
(M3，代表完全脱保护的寡核苷酸中的M3’)，
其中X为O或S。
在一个实施方案中，GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物包含选自M4、M4’或其衍生物的至少一个GalNAc单体，
(M4’，其为固体支持物上的单体)
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基。在一些实施方案中，R1、R2和R3中的至少一个为-CH3。在一些实施方案中，R1、R2和R3均为-CH3。其中R7为保护基团。
在一些实施方案中，保护基团为4,4’-二甲氧基三苯甲基，
并且
其中，连接体1是可切割的连接体。在一些实施方案中，连接体1为琥珀酰基。
(M4，代表完全脱保护的寡核苷酸中的M4’)
在一个实施方案中，GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物包含选自M5、M5’或其衍生物的至少一个GalNAc单体。
(M5’，其为固体支持物上的单体)
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基基团。在一些实施方案中，R1、R2和R3中的至少一个为-CH3。在一些实施方案中，R1、R2和R3均为-CH3。其中R7为合适的保护基团。
在一些实施方案中，保护基团为4,4’-二甲氧基三苯甲基，
并且
其中，连接体1是可切割的连接体。在一些实施方案中，连接体1为琥珀酰基。
(M5，代表完全脱保护的寡核苷酸中的M5’)
在一个实施方案中，GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物包含选自M6、M6’或其衍生物的至少一个GalNAc单体。
(M6’，其为固体支持物上的单体)
(M6，代表完全脱保护的寡核苷酸中的M6’)
GalNAc单体用于构建GalNAc部分，其在与saRNA缀合时可实现将saRNA递送至靶器官，如肝脏。GalNAc部分包含至少一个GalNAc单体。在一些实施方案中，GalNAc部分可以是包含至少两个GalNAc单体的GalNAc簇(或多聚体)。在一些实施方案中，GalNAc簇可以是包含2个GalNAc单体的GalNAc二聚体簇。在一些实施方案中，GalNAc簇可以是包含3个GalNAc单体的三触角的GalNAc簇。GalNAc单体构建模块与通过亚磷酰胺方法进行的标准寡核苷酸合成相容。单体可用于提供官能化的支持物或在寡核苷酸合成期间在线添加。GalNAc单体可在寡核苷酸的5’处在线连接，以形成GalNAc缀合物。如本文所用，“在线(in-line)”是指合成过程中寡核苷酸延伸的自动化过程。GalNAc单体可单独或与其他GalNAc单体组合添加在寡核苷酸的任何位置。它们可以在没有任何连接体的情况下顺序添加，或者被核苷酸或其他连接体分隔。
在一些实施方案中，GalNAc部分包含至少一个GalNAc单体和至少一个间隔体(spacer)(在一些情况下也可称为连接体)，其中GalNAc单体通过键(例如磷酸酯键或硫代磷酸酯键)连接至间隔体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含至少两个GalNAc单体(例如，2个单体、3个单体、4个单体、5个单体或6个单体)和任选地至少一个间隔物，其中单体彼此连接或通过键(例如磷酸酯键或硫代磷酸酯键)连接至间隔体。间隔体可以是不可切割的连接体，例如但不限于六乙二醇(HEG)、C12、无碱基呋喃、三乙二醇(TEG)、C3或其衍生物(例如，具有合适的保护基团)：
1)HEG间隔体(HEG)，如完全脱保护的寡核苷酸中所示
2)C12间隔体(C12)，如完全脱保护的寡核苷酸中所示：
3)无碱基间隔体(ab)，如完全脱保护的寡核苷酸中所示：
4)TEG间隔体(TEG)，如完全脱保护的寡核苷酸中所示：
5)C3间隔体(C3)，如完全脱保护的寡核苷酸中所示：
GalNAc部分可通过包括以下步骤的方法制备：
1)提供选自M1’、M2’、M3’、M4’、M5’和M6’的至少一个GalNAc单体；和
2)从步骤1)的GalNAc单体(一个或多个)合成GalNAc部分，任选地添加至少一个间隔体并任选地去除保护基团。
在一些实施方案中，GalNAc部分包含至少一个M1单体(例如，正好一个、正好两个或正好三个M1单体)和至少一个间隔体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含：至少一个M1单体；以及至少一个M2或M3单体(例如三个M3单体)，或一个M4、M5或M6单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含：至少一个M1单体；至少一个间隔体；以及至少一个M2或M3单体(例如三个M3单体)，或一个M4、M5或M6单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含至少一个M1单体(例如，正好一个、正好两个或正好三个M1单体)而没有任何间隔体。
在一些实施方案中，GalNAc部分包含至少一个M2单体(例如，正好一个、正好两个或正好三个M2单体)和至少一个间隔体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含：至少一个M2单体；以及至少一个M1或M3单体(例如三个M3单体)，或一个M4、M5或M6单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含：至少一个M2单体；至少一个间隔体；以及至少一个M1或M3单体(例如三个M3单体)，或一个M4、M5或M6单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含至少一个M2单体(例如，正好一个、正好两个或正好三个M2单体)而没有任何间隔体。
在一些实施方案中，GalNAc部分包含至少一个M3单体和至少一个间隔体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含：至少一个M3单体；以及至少一个M1或M2单体，或一个M4、M5或M6单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含：至少一个M3单体；至少一个间隔体；以及至少一个M1或M2单体，或一个M4、M5或M6单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含三个M3单体和至少一个间隔体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含三个M3单体而没有任何间隔体。在一些实施方案中，GalNAc部分排除仅由一个M3单体组成的GalNAc部分。
在一些实施方案中，GalNAc部分不包含多于一个M4单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含一个M4单体。在一些实施方案中，GalNAc部分不包含任何M4单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含一个M4单体；以及至少一个M1、M2或M3单体，或一个M5或M6单体。
在一些实施方案中，GalNAc部分不包含多于一个M5单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含一个M5单体。在一些实施方案中，GalNAc部分不包含任何M5单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含一个M5单体；以及至少一个M1、M2或M3单体，或一个M4或M6单体。
在一些实施方案中，GalNAc部分不包含多于一个M6单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含一个M6单体。在一些实施方案中，GalNAc部分不包含任何M6单体。在一些实施方案中，GalNAc部分包含：一个M6单体；以及至少一个M1、M2或M3单体(例如三个M3单体)，或一个M4或M5单体。在一些实施方案中，GalNAc部分排除包含一个M6单体和两个M3单体的GalNAc部分。
在一些实施方案中，GalNAc部分可以是具有以下结构的三触角(triantennary)GalNAc簇：
(Ga)或表3中的任何结构。这些GalNAc部分也被称为GalNAc簇。
表3.GalNAc部分结构
(G1)；
(G2)；
(G3)；
(G4)；
(G5)；
(G6)；
(G7)；
(G8)；
(G9)；
(G10)；
(G11)；
(G12)；
(G13)；
(G14)；
(G15)；
(G16)；
(G17)；
(G18)；
(G19)；
(G20)；
(G21)；
(G22)；
(G23)；或
(G24)。
GalNAc部分可通过带或不带可切割的连接体的键(例如磷酸二酯键或硫代磷酸酯键)连接寡核苷酸序列(例如，双链saRNA的有义链)，以形成缀合物。GalNAc部分可连接至寡核苷酸序列的5’端O或3’端O。在一些实施方案中，可切割的连接体是具有以下结构的C6ssC6连接体：
(完全脱保护的寡核苷酸中的C6ssC6)，其中X为O或S。
在一些实施方案中，可切割的连接体是具有以下结构的dT连接体：
其在完全脱保护的寡核苷酸内。
GalNAc-saRNA缀合物可通过包括以下步骤的方法制备：
1)提供选自M1’、M2’、M3’、M4’、M5’和M6’的至少一个GalNAc单体；任选地添加至少一个间隔体；
2)提供至少一个saRNA(如表2中的任何saRNA)；任选地添加至少一个连接体；
以及
3)由步骤1)中的GalNAc单体(一个或多个)和步骤2)中的saRNA(一个或多个)合成GalNAc-saRNA缀合物，任选地去除保护基团。
在一些实施方案中，GalNAc部分连接至双链saRNA(saRNA双链体)的有义链的5’末端，以形成缀合物，其中saRNA为CEBPA-saRNA。在一些实施方案中，GalNAc部分连接至双链saRNA的有义链的3’末端，以形成缀合物，其中saRNA为CEBPA-saRNA。saRNA可以是表2中的任何saRNA。在一个实施方案中，saRNA具有以下序列：
XD-14369K1双链体：
反义链：5’-GfsAfscCfaGfuGfaCfaauGfaCfcGfcsUfsu-3’(SEQ ID NO:25)
有义链：5’-GfscsGfgUfcAfUfUfgUfcAfcUfgGfuCf-3’(SEQ ID NO:24)
或
XD-06414双链体：
反义链：5’-gAfcCfaGfuGfaCfaauGfaCfcGfcsusu-3’(SEQ ID NO:15)
有义链：5’-sGfcGfgUfcAfUfUfgUfcAfcUfgGfuCfuu(invdT)-3’(SEQ ID NO:14)
(Nf＝核苷酸N(N可为A、U、C或G)具有2’-氟(2’-F)修饰；
小写＝核苷酸具有2’-O-甲基(2’-OMe)修饰；
s：硫代磷酸酯连接；和
invdT：反向脱氧T(dT))
GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物的非限制性实例包括表4中的大类(genus)和小类(species)缀合物。应当了解，saRNA或siRNA的有义链与saRNA或siRNA的反义链形成双链体。
表4.GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物结构
在一些实施方案中，GalNAc部分连接至XD-06414双链体的有义链的5’末端，以形成缀合物。缀合物的非限制性实例包括表5中的任何缀合物。缀合物L1至L19各自包含可切割的连接体。缀合物L40至L58不包含任何可切割的连接体。
表5.包含GalNAc簇和XD-06414双链体的缀合物
*尽管本公开中的反义链的序列(如表5中的SEQ ID No.15)是以5’-3’方向呈现的，但可以理解的是，反义链在3’-5’方向上与有义链杂交。
表6.包含GalNAc簇和XD-14369K1双链体的缀合物
*尽管本公开中的反义链的序列(如表6中的SEQ ID No.25)是以5’-3’方向呈现的，但可以理解的是，反义链在3’-5’方向上与有义链杂交。
在一些实施方案中，GalNAc-核苷酸缀合物(例如，GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物)具有以下任一结构：
(L＝任选的连接体，如用于缀合物L1至L19的C6ssC6或用于L66至L71的dT；对于缀合物L40至L58、L60-65和L72-75，L不存在；
Po＝磷酸二酯键；
Ps＝硫代磷酸酯键；和
Nuc＝核苷酸或寡核苷酸，例如双链saRNA(例如，XD-06414))或双链siRNA的有义链
1)C6-GalNAc(涵盖了2018年9月7日提交的PCT/EP2018/074211的实施例2中公开的GalNAc-saRNA缀合物)：
2)GalNAc-Clv(涵盖了2018年9月7日提交的PCT/EP2018/074211中公开的GalNAc-saRNA缀合物)：
3)CJ1(涵盖了表5中的L1和L40)：
4)CJ2(涵盖了表5中的L2和L41)：
5)CJ3(涵盖了表5中的L3和L42)：
6)CJ4(涵盖了表5中的L4和L43)：
7)CJ5(涵盖了表5中的L5和L44)：
8)CJ6(涵盖了表5中的L6和L45)：
9)CJ7(涵盖了表5中的L14和L53以及表6中的L80)：
10)CJ8(涵盖了表5中的L15和L54)：
11)CJ9(涵盖了表5中的L16和L55以及表6中的L81)：
12)CJ10(涵盖了表5中的L17和L56)：
13)CJ11(涵盖了表5中的L18和L57)：
14)CJ12(涵盖了表5中的L19和L58)：
15)CJ13(涵盖了表6中的L60和L66)：
16)CJ14(涵盖了表6中的L61和L67)：
17)CJ15(涵盖了表6中的L62和L68)：
18)CJ16(涵盖了表6中的L63和L69)：
19)CJ17(涵盖了表6中的L64和L70)：
20)CJ18(涵盖了表6中的L65和L71)：
21)CJ19(涵盖了表6中的L72和L73)：
22)CJ20(涵盖了表6中的L73)：
23)CJ21(涵盖了表6中的L74)：
24)CJ22(涵盖了表6中的L75)：
25)CJ23(涵盖了表6中的L76和L77)：
26)CJ24(涵盖了表6中的L78)：
27)CJ25(涵盖了表6中的L79)：
在一些情况下，GalNAc-saRNA缀合物上调CEBPA的表达，其中saRNA为CEBPA-saRNA。例如，CEBPA-saRNA可以是表2中的任何saRNA，例如XD-06414(SEQ ID No.14和15)。
在一些实施方案中，将GalNAc-saRNA缀合物或GalNAc-siRNA缀合物递送至受试者的肝细胞。肝细胞可以是肝脏癌细胞。
GalNAc-saRNA缀合物可通过本领域已知的任何合适方法合成。例如，GalNAc-saRNA缀合物可根据Prakash等人，Journal of Medicinal Chemistry,vol.59:2718-2733(2016)的实验部分中所述的方法合成，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，GalNAc部分与siRNA缀合，以形成GalNAc-siRNA缀合物(conjugate)。
在一些情况下，GalNAc-siRNA缀合物下调靶基因的表达。
在一些实施方案中，将GalNAc-siRNA缀合物递送至受试者的肝细胞。肝细胞可以是肝脏癌细胞。
GalNAc-siRNA缀合物可通过本领域已知的任何合适方法合成。例如，GalNAc-siRNA缀合物可根据Prakash等人，Journal of Medicinal Chemistry,vol.59:2718-2733(2016)的实验部分中所述的方法合成，其内容通过引用整体并入本文。
II.药物组合物
本发明的一个方面提供了药物组合物，其包含上调靶基因的小激活RNA(saRNA)和至少一种药学上可接受的载体。
制剂、递送、施用和剂量
药物制剂还可包含药学上可接受的赋形剂，如本文所用，该赋形剂包括但不限于适合期望的特定剂型的任何及所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体溶媒、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等。本领域已知用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术(参见Remington：The Science and PRactice ofPhaRmacy,21st Edition,A.R.GennaRo,Lippincott,Williams&Wilkins,BaltimoRe,MD,2006；其内容通过引用整体并入本文)。常规赋形剂介质的使用都可考虑在本发明范围内，除非任何常规赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容，例如产生任何不良生物效应或在其他方面以有害方式与药物组合物的任何其他组分(一种或多种)相互作用。
在一些实施方案中，向人、人患者或受试者施用组合物。就本公开的目的而言，短语“活性成分”通常指如本文所述待递送的saRNA。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合于施用于人的药物组合物，但本领域技术人员将理解此类组合物通常适于施用于任何其他动物，例如，非人动物，例如非人哺乳动物。为使组合物适合于对各种动物施用而对适合施用于人的药物组合物的修饰是众所周知的，并且普通熟练的兽医药理学家可以通过仅仅是普通的实验(如果有的话)设计和/或进行这种修饰。考虑施用药物组合物的受试者包含但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包含商业相关哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包含商业相关鸟类，如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
在一个实施方案中，可在增殖细胞中测定本文所述的配制的saRNA的功效。
本文所述的药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知或随后开发的任何方法制备。通常，此类制备方法包含使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合的步骤，然后，如有必要和/或需要，将产品分割、成型和/或包装成期望的单一剂量或多剂量单位。
本发明的药物组合物可以作为一个单一单位剂量(a single unit dose)和/或多个单一单位剂量(a plurality of single unit doses)大量制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是药物组合物的包含预定量的活性成分的离散量。活性成分的量通常等于将给受试者施用的活性成分的剂量和/或这种剂量的方便分数，诸如例如，这种剂量的一半或三分之一。
本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、大小和/或状况而变化，并进一步取决于施用该组合物的途径。举例来说，该组合物可包含0.1％至100％，例如，.5至50％、1-30％、5-80％、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，本文所述的制剂可包含至少一种saRNA。作为非限制性实例，制剂可包含具有不同序列的1、2、3、4或5种saRNA。在一个实施方案中，制剂包含至少三种具有不同序列的saRNA。在一个实施方案中，制剂包含至少五种具有不同序列的saRNA。
本发明的saRNA可使用一种或多种赋形剂配制，以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，从saRNA的储库制剂中)；(4)改变生物分布(例如，将saRNA靶向特定组织或细胞类型)；(5)增加编码的蛋白质的体内翻译；和/或(6)改变编码的蛋白质的体内释放谱图。
除了传统赋形剂，例如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体溶媒、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂外，本发明的赋形剂还可包含但不限于类脂、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质体复合物(lipoplex)、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、转染saRNA的细胞(例如，用于移植到受试者中)、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物及其组合。因此，本发明的制剂可包含一种或多种赋形剂，每种赋形剂的量在一起提高了saRNA的稳定性和/或提高了saRNA的细胞转染。此外，本发明的saRNA可使用自组装核酸纳米颗粒配制。2012年12月14日提交的国际公开WO 2013/090648中公开了可用于本发明saRNA的制剂的针对核酸的药学上可接受的载体、赋形剂和递送剂，其内容通过引用整体并入本文。
递送
考虑到药物递送科学的可以进展，本公开涵盖了通过任何适当途径为任何治疗、预防、药物、诊断或成像递送saRNA。递送可以是裸的或者经配制的。
本发明的saRNA可被递送至裸细胞。如本文所用，“裸”是指递送的saRNA不含促进转染的试剂。例如，递送给细胞的saRNA可以不包含修饰。裸saRNA可使用本领域已知且本文所述的施用途径递送至细胞。
本发明的saRNA可使用本文所述的方法配制。制剂可以含有修饰的和/或未修饰的saRNA。制剂可进一步包含但不限于细胞渗透剂、药学上可接受的载体、递送剂、生物溶蚀性聚合物(bioerodible polymer)或生物相容性聚合物、溶剂和缓释递送库。配制的saRNA可使用本领域已知且本文所述的施用途径递送至细胞。
在一些实施方案中，本发明的saRNA通过非封装技术递送，例如包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)基团或其衍生物的试剂，或包含多于一个通过二价或三价分支连接体连接的GalNAc基团或其衍生物的簇。
组合物也可配制成以本领域中的几种方式中的任何一种直接递送到器官或组织，包括但不限于直接浸泡或沐浴，通过导管，通过凝胶、粉末、软膏、乳膏、凝胶、乳液和/或滴剂，通过使用基底物，例如用该组合物涂覆或浸渍的织物或生物可降解材料。本发明的saRNA也可克隆到逆转录病毒复制载体(RRV)中并转导到细胞中。
施用
本发明的saRNA可通过产生治疗有效结果的任何途径施用。这些途径包括但不限于肠内、胃肠、硬膜外、经口、经皮、硬膜外(epidural、peridural)、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮(施加到皮肤上)、真皮内(进入皮肤本身)、皮下(在皮肤下)，经鼻施用(通过鼻)、静脉内(进入静脉)、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、腹膜内(输注或注射进入腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼睛)、海绵窦内注射(进入阴茎根部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(扩散穿过完整皮肤以便全身性分布)、经粘膜(扩散穿过粘膜)、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠、滴眼液(滴到结膜上)或滴耳液。在具体实施方案中，组合物可以允许它们穿过血脑屏障、血管屏障或其他上皮屏障的方式施用。2012年12月14日提交的国际公开WO 2013/090648中公开的施用途径(其内容通过引用整体并入本文)可用于施用本发明的saRNA。
剂型
本文所述的药物组合物可以配制成本文所述的剂型，例如局部(topical)、鼻内、气管内或可注射用(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、心内、腹腔内、皮下)。2012年12月14日提交的国际公开WO 2013/090648中所述的液体剂型、可注射制剂、肺用形式和固态剂型(其内容通过引用整体并入本文)可用作本发明的saRNA的剂型。
III.使用方法
本发明的一个方面提供了在不没有任何转染剂的情况下通过GalNAc-saRNA缀合物将saRNA递送到细胞中的方法。细胞表达脱唾液酸糖蛋白受体。在一些实施方案中，利用本发明的GalNAc-saRNA缀合物实现saRNA靶向递送到细胞中。在一些情况下，细胞是肝细胞。在一些情况下，细胞是肝脏癌细胞。
本发明的另一方面提供了使用本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的方法以及包含saRNA或GalNAc-saRNA缀合物和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物调节其靶基因的表达。在一个实施方案中，提供了一种在体外和/或在体内调节靶基因表达的方法，所述方法包括施用本发明的saRNA。在一个实施方案中，与在没有本发明的saRNA的情况下的靶基因的表达相比，在存在本发明的saRNA的情况下，靶基因的表达增加至少5％、10％、20％、30％、40％或至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％。在进一步的实施方案中，与在没有本发明的saRNA的情况下的靶基因的表达相比，在存在本发明的saRNA的情况下，靶基因的表达增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，或增加至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，或增加至少60、70、80、90、100倍。
在一个实施方案中，在增殖细胞中显示了本文所述的saRNA的基因表达的增加。
在一个实施方案中，本文所述的saRNA可用作CRISPR(成簇的规则间隔的回文重复序列)系统例如CRISPR/Cas9系统中的间隔子。包含本文所述的saRNA的CRISPR系统可用于切割和编辑靶基因。
在一个实施方案中，在增殖细胞中显示本文所述的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物处理的基因表达的增加。
过度增生性病症
在本发明的一个实施方案中，本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物用于减少过度增殖性细胞的细胞增殖。过度增殖性细胞的实例包括癌性细胞，例如癌(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、淋巴瘤和胚细胞瘤(blastoma)。这种癌性细胞可以是良性的或者恶性的。过度增殖性细胞可以由自身免疫性疾病引起，如类风湿性关节炎、炎性肠病或牛皮癣。过度增殖性细胞也可以在免疫系统过度敏感的接触致敏原的患者内部产生。这种涉及免疫系统过度敏感的疾病包括但不限于哮喘、过敏性鼻炎、湿疹和过敏性反应，如变应性过敏。在一个实施方案中，抑制了肿瘤细胞形成和/或生长。在优选的实施方案中，抑制了实体肿瘤细胞增殖。在另一优选的实施方案中，防止了肿瘤细胞的转移。在另一优选的实例中，抑制了未分化的肿瘤细胞增殖。
抑制细胞增殖或减少增殖意味着增殖减少或完全停止。因此，“减少增殖”是“抑制增殖”的一个实施方案。与用本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物治疗前细胞的增殖相比，或与同等的未治疗的细胞的增殖相比，在存在本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下，细胞增殖减少至少20％、30％或40％，或优选至少45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％，甚至更优选至少80％、90％或95％。在过度增殖性细胞中的细胞增殖被抑制的实施方案中，所述“等同的”细胞也是过度增殖性细胞。在优选的实施方案中，将增殖降低至与等同的健康(非过度增殖性)细胞的增殖率相当的比率。或者，观察到，“抑制细胞增殖”的一个优选实施方案是抑制过度增殖或调节细胞增殖以达到正常、健康的增殖水平。
在一个非限制性实例中，本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物用于减少白血病和淋巴瘤细胞的增殖。优选地，所述细胞包括Jurkat细胞(急性T细胞淋巴瘤细胞系)、K562细胞(红细胞白血病细胞系)、U373细胞(胶质母细胞瘤细胞系)和32Dp210细胞(髓样白血病细胞系)。
在另一个非限制性实例中，本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物用于减少卵巢癌细胞、肝脏癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、大鼠肝脏癌细胞和胰岛素瘤细胞的增殖。优选地，所述细胞包括PEO1和PEO4(卵巢癌细胞系)、HepG2(肝细胞癌细胞系)、Panc1(人胰腺癌细胞系)、MCF7(人乳腺癌细胞系)、DU145(人转移性前列腺癌细胞系)、大鼠肝癌细胞和MIN6(大鼠胰岛素瘤细胞系)。
在一个实施方案中，本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物用于治疗过度增殖性病症。肿瘤和癌症是一种特别受关注的过度增殖性病症，并且包括所有类型的肿瘤和癌症，例如实体瘤和血液癌症。癌症的实例包括但不限于宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、胆囊癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞癌、胃肠癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病和慢性髓细胞白血病)、脑癌(如星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤)、神经母细胞瘤、肉瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、肛管癌、膀胱癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、Wilm’s肿瘤、Ewing肉瘤、黑素瘤和其他皮肤癌。肝脏癌症可包括但不限于胆管癌、肝胚细胞瘤、血管肉瘤(haemangiosarcoma)或肝细胞癌(HCC)。HCC尤其令人关注。
原发性肝癌是全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大常见原因。HCC代表了绝大多数原发性肝癌[El-SeRag等人,Gastroenterology,vol.132(7),2557-2576(2007)，其全部内容在此公开]。HCC受几个因素的相互作用的影响，包括癌细胞生物学、免疫系统和不同病因(病毒性、毒性和遗传性)。大多数HCC患者在肝硬化背景下发展为恶性肿瘤。目前大多数患者在晚期确诊，因此大多数HCC患者的5年生存率仍然很低。手术切除、局部区域消融和肝移植是目前唯一有可能治愈HCC的治疗选择。然而，基于对个体肝功能和肿瘤负担的评估，只有大约5-15％的患者符合手术治疗的条件。本发明利用saRNA或GalNAc-saRNA缀合物来调节靶基因的表达并治疗肝硬化和HCC。
本发明的方法可将肿瘤体积减少至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％。优选地，抑制一个或多个新肿瘤的形成，例如，根据本发明治疗的受试者形成更少和/或更小的肿瘤。更少的肿瘤意味着在一段时间内比等同受试者形成更少数量的肿瘤。例如，与等同对照(未治疗)受试者相比，形成的肿瘤少至少1、2、3、4或5个。较小肿瘤是指肿瘤在重量和/或体积上比等同受试者的肿瘤小至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％。本发明的方法将肿瘤负担减少至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％。
设定的时间段可以是任何合适的时间段，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个月或年。
在一个非限制性实例中，提供了治疗未分化的肿瘤的方法，包括将细胞、组织、器官或受试者与本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物接触。与分化的肿瘤相比，未分化的肿瘤通常预后较差。由于肿瘤的分化程度对预后有影响，因此假设使用分化生物制剂可能是有益的抗增殖药物。可使用saRNA或GalNAc-saRNA缀合物治疗的未分化的肿瘤包括未分化的小细胞肺癌、未分化的胰腺腺癌、未分化的人胰腺癌、未分化的人转移性前列腺癌和未分化的人乳腺癌。
在一个实施方案中，本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物用于调节癌基因和肿瘤抑制基因。优选地，可以下调癌基因的表达。与在没有本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下的表达相比，在存在本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下，癌基因的表达降低至少20、30、40％，更优选至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％。在另一优选实施方案中，与在不存在本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下的表达相比，在存在本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下，癌基因的表达减少至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，更优选减少至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，甚至更优选减少至少60、70、80、90、100倍。优选地，可以抑制肿瘤抑制基因的表达。与在没有本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下的表达相比，在存在本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下，肿瘤抑制基因的表达增加至少20、30、40％，更优选至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％，甚至更优选至少100％。在另一优选实施方案中，与在不存在本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下的表达相比，在存在本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下，肿瘤抑制基因的表达增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，更优选增加至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，甚至更优选增加至少60、70、80、90、100倍。
在一个实施方案中，本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物在肝细胞癌治疗中用于调节微小RNA(miRNA或miR)。微小RNA是调节基因表达的小的非编码RNA。它们与重要的生理功能有关，并且它们可以参与癌变的每一个步骤。它们通常具有21个核苷酸，通过与所述mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)结合来阻断mRNA翻译或诱导mRNA降解，从而在转录后水平上调节基因表达。
在肿瘤中，miRNA表达的调节影响着肿瘤的发展。与其他癌症一样，在HCC中，miRNA作为癌基因或肿瘤抑制基因发挥作用，影响细胞生长和增殖、细胞代谢和分化、凋亡、血管生成、转移和最终预后。[Lin等人,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,vol.375,315-320(2008)；Kutay等人,J.Cell.Biochem.,vol.99,671-678(2006)；Meng等人,Gastroenterology,vol.133(2),647-658(2007)，其各自的内容通过引用整体并入本文]。本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物调节靶基因的表达和/或功能，并且还调节HCC细胞中的miRNA水平。可由本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物调节的miRNA的非限制性实例包括hsa-let-7a-5p、hsa-miR-133b、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-184、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-134、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7c、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-206、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-1、hsa-miR-150-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-128、hsa-miR-215、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-203a、hsa-miR-30c-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-181d、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-210、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-372、hsa-miR-149-5p和hsa-miR-32-5p。
在一个非限制性实例中，miRNA为致癌性miRNA，且与在没有saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下相比，在存在本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下，其被下调至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、2.5和3倍。在另一非限制性实例中，miRNA是肿瘤抑制miRNA，与在不存在saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下相比，在存在本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的情况下，其被上调至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1倍，更优选上调至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，更优选上调至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，甚至更优选上调至少60、70、80、90、100倍。
IV.试剂盒和装置
试剂盒
本发明提供了用于方便和/或有效地实施本发明的方法的各种试剂盒。通常，试剂盒将包含足够量和/或数目的组分，以允许用户对受试者(一个或多个)进行多次治疗和/或进行多次实验。
在一个实施方案中，本发明提供了用于体外或体内调节基因表达的试剂盒，其包含本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物或本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物、调节其他基因的saRNA、siRNA、miRNA或其他寡核苷酸分子的组合。
该试剂盒还可包括包装和说明书和/或用于形成制剂组合物的递送剂。该递送剂可包含盐水、缓冲溶液、类脂质、树状大分子或本文公开的任何递送剂。
在本文表1中描述了基因的非限制性实例。
在一个实施方案中，包含本文所述的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的试剂盒可与增殖细胞一起使用以显示功效。
在一个非限制性实例中，缓冲溶液可包括氯化钠、氯化钙、磷酸盐和/或EDTA。在另一个非限制性实例中，缓冲溶液可包括但不限于盐水、含2mM钙的盐水、5％蔗糖、含2mM钙的5％蔗糖、5％甘露醇、含2mM钙的5％甘露醇、林格氏乳酸盐、氯化钠、含2mM钙的氯化钠和甘露糖(参见美国公开号20120258046；其内容通过引用整体并入本文)。在又一非限制性实例中，缓冲溶液可沉淀或可将其冻干。可以改变每种组分的量以实现一致的、可再现的更高浓度的盐水或简单的缓冲剂制剂。还可以改变组分以增加缓冲溶液中的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物在一段时间内和/或在各种条件下的稳定性。
装置
本发明提供了可掺入本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物的装置。这些装置包含稳定的制剂，可用于立即递送给有此需要的受试者，如人患者。
装置的非限制性实例包括泵、导管、针、透皮贴片、加压嗅用递送装置、离子导入装置、多层微流体装置。根据单次、多次或分割给药方案，所述装置可用于递送本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物。所述装置可用于递送本发明的saRNA或GalNAc-saRNA缀合物，跨生物组织递送、皮内、皮下或肌肉内递送。2012年12月14日提交的国际公开WO 2013/090648中公开了适用于递送寡核苷酸的装置的更多实例，其内容通过引用整体并入本文。
定义
为方便起见，下文提供说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语和短语的含义。如果本说明书的其他部分中的术语用法与本节中提供的其定义之间存在明显差异，应以本节中的定义为准。
约：如本文所用，术语“约”是指所述值的+/-10％。
组合施用：如本文所用，术语“组合施用”或“联合施用”是指同时或在一定间隔内向受试者施用两种或更多种药剂，使得每种药剂对患者的作用可以重叠。在一些实施方案中，它们彼此在约60、30、15、10、5或1分钟内施用。在一些实施方案中，药剂的施用间隔足够近，使得实现组合(例如，协同)效应。
氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”是指所有天然存在的L-α-氨基酸。氨基酸以一个字母或三个字母命名进行标识，如下：天冬氨酸(Asp:D)、异亮氨酸(Ile:I)、苏氨酸(ThR:T)、亮氨酸(Leu:L)、丝氨酸(SeR:S)、酪氨酸(TyR:Y)、谷氨酸(Glu:E)、苯丙氨酸(Phe:F)、脯氨酸(PRo:P)、组氨酸(His:H)、甘氨酸(Gly:G)、赖氨酸(Lys:K)、丙氨酸(Ala:A)，精氨酸(ARg:R)、半胱氨酸(Cys:C)、色氨酸(TRp:W)、缬氨酸(Val:V)、谷氨酰胺(Gln:Q)、蛋氨酸(Met:M)、天冬酰胺(Asn:N)，其中氨基酸首先列出，然后分别附带三个字母和一个字母的代码。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物王国的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和蠕虫。在一些实施方案中，动物是转基因动物、基因工程动物或克隆动物。
近似：如本文所用，术语“近似”或“约”，如应用于一个或多个关注的值，是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，术语“近似”或“约”是指在任一方向上(大于或小于)落入所示参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的数值范围，除非另有规定或上下文中另有说明(除非该数字超过可能数值的100％)。
结合：如本文所用，术语“结合(associated)”、“缀合(conjugated)”、“连接(linked)”、“附接(attached)”和“栓系(tethered)”，当针对两个或更多个部分使用时，表示这些部分直接或通过用作连接剂的一个或多个附加部分彼此物理结合或连接，以形成足够稳定的结构，以使这些部分在使用该结构的条件下(例如生理条件)保持物理上结合。“结合”不需要严格通过直接共价化学键合作用。它还可以表明离子键合作用或氢键合作用或基于杂交的连接性足够稳定，使得“结合的”实体保持物理上结合。
双功能或双功能的：如本文所用，术语“双功能”和“双功能的”是指能够或维持至少两种功能的任何物质、分子或部分。这些功能可以影响相同的结果或不同的结果。产生该功能的结构可以相同或不同。例如，本发明的双功能saRNA可包含细胞毒性肽(第一功能)，而包含saRNA的那些核苷就其本身而言就具有细胞毒性(第二功能)。
生物相容性：如本文所用，术语“生物相容性”是指与活的细胞、组织、器官或系统相容，几乎不会造成损伤、毒性或免疫系统排斥风险。
生物可降解的：如本文所用，术语“生物可降解的”是指能够通过生物体的作用分解为无害产物。
生物活性的：如本文所用，短语“生物活性的”是指在生物系统和/或生物体中具有活性的任何物质的特征。例如，当将一种物质施用给一个生物体时会对该生物体产生生物学作用，则认为该物质具有生物活性。在特定实施方案中，即便是本发明的saRNA的一部分也具有生物活性或模拟一种被认为具有生物相关性的活性时，则该saRNA可被认为具有生物活性。
癌症：如本文所用，术语“癌症”在个体中是指存在具有致癌细胞的典型特征的细胞，例如不受控制的增殖、永生、转移潜能、快速的生长和增殖率以及某些特征性形态特征。通常，癌细胞是肿瘤的形式，但这种细胞可以单独存在于个体内，或者可以作为独立细胞(如白血病细胞)在血流中循环。
细胞生长：如本文所用，术语“细胞生长”主要与细胞数量的增长相关，所述增长借助细胞复制速率大于细胞死亡速率(例如凋亡或坏死)时的细胞复制(即增殖)发生，从而导致细胞群体的大小增加，虽然在某些情况下这种生长的小部分可能是由于单个细胞的细胞尺寸或胞质体积增加所致。因此，抑制细胞生长的物质可以通过抑制增殖或刺激细胞死亡或同时发挥这两种作用而做到这点，从而改变两个相反过程之间的平衡。
细胞类型：如本文所用，术语“细胞类型”是指来自给定来源(例如，组织、器官)的细胞或处于给定分化状态的细胞，或与给定病理学或遗传构成相关的细胞。
染色体：如本文所用，术语“染色体”是指在细胞中发现的DNA和蛋白质的组织化结构。
互补的：如本文所用，与核酸相关的术语“互补”是指核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对，例如，双链DNA分子的两条链之间或寡核苷酸探针与靶之间的杂交或碱基配对是互补的。
状况：如本文所用，术语“状况”指任何细胞、器官、器官系统或生物体的状态。状况可以反映一种疾病状态，或者仅反映实体的生理表现或情况。状况可以被表征为表型状况例如疾病的宏观表现，或基因型状况例如与该状况相关的潜在基因或蛋白质表达谱。状况可以是良性的或者恶性的。
控释：如本文所用，术语“控释”是指符合特定释放模式以实现治疗结果的药物组合物或化合物释放特征。
抑制细胞的(cytostatic)：如本文所用，“抑制细胞的”是指抑制、减少、遏制细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人类细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合的生长、分裂或增殖。
细胞毒性：如本文所用，“细胞毒性”是指杀死细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人类细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合或对其造成有害、有毒或致死效果。
递送：如本文所用，“递送”是指递送化合物、物质、实体、部分、载货或酬载的行为或方式。
递送剂：如本文所用，“递送剂”是指至少部分地促进将本发明的saRNA在体内递送至靶细胞的任何物质。
失稳的：如本文所用，术语“失稳的(destable)”、“失稳(destabilize)”或“失稳区域”是指与相同区域或分子的起始、野生型或天然形式相比更不稳定的区域或分子。
可检测标签：如本文所用，“可检测标签”是指一种或多种标志物、信号或部分，其附着、掺入或与另一实体结合，该另一实体通过本领域已知的方法(包括射线照相、荧光、化学发光、酶活性、吸光度等)容易检测。可检测标签包括放射性同位素、荧光团、生色团、酶、染料、金属离子、配体如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素和半抗原、量子点等。可检测标签可位于本文公开的寡核苷酸中的任何位置。它们可以位于核苷酸内或位于5’或3’端。
封装：如本文所用，术语“封装”是指围绕、包围或包裹。
工程化：如本文所用，当本发明的实施方案被设计为具有不同于起始、野生型或天然分子的特征或性质(无论是结构的还是化学的)时，本发明的实施方案为“工程化的”。
等同受试者：如本文所用，“等同受试者”可以是例如具有类似年龄、性别和健康(例如肝脏健康或癌症分期)的受试者，或者在本发明的治疗之前的同一受试者。等同受试者是“未治疗”的，因为他没有接受本发明的saRNA治疗。然而，他可以接受常规抗癌治疗，条件是接受本发明的saRNA治疗的受试者接受相同或等同的常规抗癌治疗。
外泌体：如本文所用，“外泌体”是由哺乳动物细胞分泌的囊泡。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下一个或多个事件：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’末端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；以及(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
特征：如本文所用，“特征”是指特征、特性或不同要素。
制剂：如本文所用，“制剂”包含至少一种本发明的saRNA和递送剂。
片段：如本文所用，“片段”指的是一部分。例如，蛋白质片段可包含通过消化从培养的细胞分离的全长蛋白质而获得的多肽。寡核苷酸片段可包含核苷酸或核苷酸区域。
有功能的(功能性)：如本文所用，“有功能的(功能性)”生物分子是指在所处形式其表现出作为其特征的特性和/或活性的生物分子。
基因：如本文所用，术语“基因”是指包含用于产生多肽或前体所需的控制序列和最常见的编码序列的核酸序列。然而，基因可以不翻译，而是编码调节性或结构性RNA分子。
基因可完整地或部分地来自本领域已知的任何来源，包括植物、真菌、动物、细菌基因组或附加体、真核DNA、核DNA或质粒DNA、cDNA、病毒DNA或化学合成的DNA。基因可在编码区或未翻译区中包含一个或多个修饰，所述修饰可影响表达产物的生物活性或化学结构、表达速率或表达控制方式。此类修饰包括但不限于，一个或多个核苷酸的突变、插入、删除和替换。基因可以构成不间断的编码序列，或者它可包括一个或多个由适当剪接点界定的内含子。
基因表达：如本文所用，术语“基因表达”是指核酸序列发生成功转录并在大多数情况下翻译以产生蛋白质或肽的过程。为清楚起见，当提及测定“基因表达”时，应理解为可以指测定核酸转录产物(例如RNA或mRNA)，或翻译的氨基酸产物(例如多肽或肽)。测定RNA、mRNA、多肽和肽的数量或水平的方法在本领域是众所周知的。
基因组：术语“基因组”旨在包括生物体的完整DNA互补物，包括核DNA成分、染色体或染色体外DNA以及细胞质域(例如，线粒体DNA)。
同源性：如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间的整体相关性，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一或相似，则认为聚合物分子彼此“同源”。术语“同源”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。根据本发明，如果两个多核苷酸序列编码的多肽就至少约20个氨基酸的至少一个片段而言至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％同一，则认为这两个多核苷酸序列是同源的。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列的特征在于编码至少4-5个唯一指定氨基酸的片段的能力。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列，同源性由编码至少4-5个唯一指定氨基酸序列的片段的能力决定。根据本发明，如果两个蛋白质序列就至少一个至少约20个氨基酸的片段而言至少约50％、60％、70％、80％或90％同一，则认为这两个蛋白质序列是同源的。
术语“过度增殖性细胞”可指增殖速率异常高于等同的健康细胞(可称为“对照”)的增殖速率的任何细胞。“等同的健康”细胞是细胞的正常、健康对应物。因此，它是执行与对照细胞相同的功能(一种或多种)的同一类型的细胞，例如来自相同器官的细胞。例如，过度增殖性肝细胞的增殖应参考健康肝细胞进行评估，而过度增殖性前列腺细胞的增殖应参考健康前列腺细胞进行评估。
“异常高”的增殖速率意味着与等同健康(非过度增殖性)细胞的增殖速率相比，过度增殖性细胞的增殖速率增加至少20％、30％、40％，或至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％。“异常高”的增殖速率也可指与等同健康细胞的增殖速率相比增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，或至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，或至少60、70、80、90、100倍。
过度增殖性疾病：如本文所用，“过度增殖性疾病”可以是涉及上文所定义的过度增殖性细胞的任何疾病。过度增殖性疾病的实例包括肿瘤性病症，如癌症、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、胃过度增殖性疾病如炎性肠病、皮肤病症包括银屑病、Reiter综合征、毛发红糠疹以及角质化病症的过度增殖性变体。
技术人员完全了解如何识别过度增殖性细胞。可以通过诸如X光、MRI或CT扫描，识别动物体内是否存在过度增殖性细胞。还可以在体外培养样品，通过使用细胞增殖测定法(例如MTT、XTT、MTS或WST-1测定法)，来鉴定过度增殖性细胞或测定细胞的增殖。体外细胞增殖也可以用流式细胞术测定。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间的整体相关性，例如寡核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体相关性。例如，可以通过以下方式计算两个多核苷酸序列的同一性百分数：两个序列为了最佳比较目的对齐(例如，为了最佳对齐，可以在第一和第二核酸序列中的一个或两个中引入空位，并且为了比较目的可以忽略不相同的序列)。在某些实施方案中，出于比较目的对齐的序列的长度为参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置与第二序列中的相应位置被相同的核苷酸占据时，则分子在该位置是同一的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数，考虑为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数量和每个空位的长度。两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。例如，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用诸如以下描述的那些方法测定：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversity Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.编辑,Humana Press,New Jersey,1994；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.编辑,M Stockton Press,NewYork,1991，其各自均通过引用并入本文。例如，可以使用已被纳入ALIGN程序(版本2.0)的Meyers和Miller(CABIOS,1989,4:11-17)的算法确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比，该算法使用PAM120加权余数表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。或者，可以使用NWSgapdna.CMP矩阵，使用GCG软件包中的GAP程序确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。通常用于确定序列间的同一性百分比的方法包括但不限于Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)中公开的那些方法，其通过引用并入本文。确定同一性的技术被编入公开可用的计算机程序中。用于确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包，Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research,12(1),387(1984)),BLASTP,BLASTN和FASTA Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215,403(1990))。
抑制基因的表达：如本文所用，短语“抑制基因的表达”是指导致基因的表达产物量减少。表达产物可以是从基因转录的RNA(例如，mRNA)或从基因转录的mRNA翻译的多肽。通常，mRNA水平的降低导致从其翻译的多肽水平的降低。表达水平可以使用测量mRNA或蛋白质的标准技术来确定。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中发生的事件，例如试管或反应容器中、细胞培养中、皮氏培养皿中等，而不是在生物体内(例如动物、植物或微生物)发生。
体内：如本文所用，术语“体内”指生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是指已从与其相关联的至少一些组分(无论是在自然界中还是在实验性环境中)分离的物质或实体。相对于与其相关联的物质，分离的物质可具有不同的纯度水平。分离的物质和/或实体可以与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多起初同它们相关联的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的物质的纯度大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则该物质为“纯的”。
基本上分离的：“基本上分离的”是指化合物基本上与形成或检测到它的环境分离。部分地分离可包括例如，富含本公开的化合物的组合物。基本上分离可包括含有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％(按重量计)的本发明的化合物或其盐的组合物。分离化合物及其盐的方法是本领域的常规方法。
标签：术语“标签”是指一种物质或化合物，其被掺入物体中使得该物质、化合物或物体可以被检测到。
连接体：如本文所用，连接体是指一组原子，例如10-1,000个原子，并且可由诸如但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺的原子或基团组成。连接体可在第一端连接至核酸碱基或糖部分上的修饰的核苷或核苷酸，并在第二端连接至酬载，例如可检测物质或治疗剂。连接体可以具有足够的长度，从而不干扰掺入核酸序列中。如本文所述，连接体可用于任何有用目的，例如形成saRNA缀合物，以及施用酬载。
可掺入连接体和/或间隔体的化学基团的实例包括但不限于烷基、烯基、炔基、酰胺基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，其各自都可任选地被取代，如本文所述。间隔体的实例包括但不限于不饱和烷烃、聚乙二醇(例如，乙二醇或丙二醇单体单元，例如，二乙二醇、二丙二醇、三乙二醇、三丙二醇、四乙二醇或四乙二醇)和葡聚糖聚合物及其衍生物。连接体的实例包括但不限于，在连接体内具有可切割部分的那些，例如二硫键(-S-S-)或偶氮键(-N＝N-)，其可使用还原剂或光解来切割。选择性可裂解键的非限制性实例包括可通过例如使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其他还原剂来切割的二硫键。
转移：如本文所用，术语“转移”是指癌症从作为原发性肿瘤首先出现的地方扩散到身体内远处位置的过程。转移也指原发性肿瘤扩散导致的癌症。例如，乳腺癌患者的淋巴系统、肝脏、骨骼或肺部可以出现转移。
修饰的：如本文所用，“修饰的”指本发明分子的改变的状态或结构。分子可以通过多种方式进行修饰，包括化学修饰、结构修饰和功能修饰。在一个实施方案中，通过引入非天然核苷和/或核苷酸来修饰本发明的saRNA。
天然存在的：如本文所用，“天然存在的”是指在自然界中在没有人工帮助的情况下存在。
核酸：如本文所用，术语“核酸”是指由一个或多个核苷酸，即核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或两者组成的分子。该术语包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的单体和聚合物，在聚合物的情况下，核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸通过5’至3’连接结合在一起。核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸聚合物可以是单链的或双链的。然而，连接可以包括本领域已知的任何连接，包括例如包含5’到3’连接的核酸。核苷酸可以是天然存在的，或者可以是合成产生的类似物，其能够与天然存在的碱基对形成碱基配对关系。能够形成碱基配对关系的非天然存在的碱基的实例包括但不限于，氮杂和脱氮杂嘧啶类似物、氮杂和脱氮杂嘌呤类似物以及其他杂环碱基类似物，其中嘧啶环的一个或多个碳原子和氮原子已被杂原子例如氧、硫、硒、磷等取代。
患者：如本文所述，“患者”是指可以寻求或需要治疗、需要治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或由经过培训的专业人员针对特定疾病或状况进行护理的受试者。
肽：如本文所用，“肽”长度小于或等于50个氨基酸，例如长度为约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。
药学上可接受的：短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理医学判断的范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的赋形剂：如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述化合物以外并且具有对患者基本无毒且无炎性特征的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的溶媒)。赋形剂可包括例如抗粘附剂、抗氧化剂、粘结剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(色料)、软化剂、乳化剂、填料(稀释剂)、成膜剂或包衣、风味剂、香味剂、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷墨、吸收剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二碱式)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、蛋氨酸、甲基纤维素、尼泊金甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预糊化淀粉、尼泊金丙酯、视黄醇棕榈酸酯、紫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羧甲基淀粉钠(sodium starchglycolate)、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
药学上可接受的盐：本公开还包括本文所述的化合物的药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式(例如，通过使游离碱基与适当的有机酸反应)来修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱式盐或有机盐等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢钠、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖醛酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括由例如无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，优选非水介质，诸如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表在Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahland C.G.Wermuth(编辑),Wiley-VCH,2008和Berge等人,Journal of PharmaceuticalScience,66,1-19(1977)中找到，其各自的内容通过引用整体并入本文。
药学上可接受的溶剂化物：如本文所用，术语“药学上可接受的溶剂化物”是指其中合适的溶剂分子掺入晶格中的本发明的化合物。在施用的剂量下，合适的溶剂是生理学上可耐受的。例如，溶剂化物可通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀来制备。合适的溶剂的实例为乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N’-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苄醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂化物被称为“水合物”。
药理学作用：如本文所用，“药理学作用”是生物体或系统中在生物体或系统接触或暴露于外源剂后出现的可测量的生物学现象。药理学作用可以产生治疗有效的结果，如治疗、改善一种或多种症状、诊断、预防和延迟疾病、病症、状况或感染的发生。这种生物现象的测量可以是定量的、定性的或相对于另一种生物现象的。定量测量可为统计上显着的。定性测量可以按程度或种类进行，并且可为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的不同。它们可观察为存在或不存在，更好或更坏，更大或更小。当提到药理学作用时，外源物质是相对于生物体或系统为全部或部分外来的制剂。例如，对野生型生物分子的修饰，无论是结构上的还是化学上的，都会产生外源物质。同样，将野生型分子掺入在生物体或系统中未天然发现的化合物、分子或物质或与之组合，也会产生外源物质。
本发明的saRNA包含外源物质。药理学作用的实例包括但不限于细胞计数的改变，例如嗜中性粒细胞、网织红细胞、粒细胞、红细胞(erythRocytes、red blood cells)、巨核细胞、血小板、单核细胞、结缔组织巨噬细胞、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞、树突状细胞、小胶质细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤性T细胞、B细胞、自然杀伤细胞或网织红细胞的增加或减少。药理学作用还包括血液化学、pH、血红蛋白、血细胞比容的改变，酶(例如但不限于肝酶AST和ALT)水平的改变，脂质谱、电解质、代谢标志物、激素或其他标志物或本领域技术人员已知的谱图的改变。
物理化学：如本文所用，“物理化学”是指物理和/或化学性质，或与之相关。
预防：如本文所用，术语“预防”是指部分或完全延迟感染、疾病、病症和/或状况的发生；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或状况的一种或多种症状、特征或临床表现的发生；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或状况的一种或多种症状、特征或表现的发生；部分或完全延迟感染、特定疾病、病症和/或状况的进展；和/或降低与感染、疾病、病症和/或状况相关的病变风险。
前药：本公开还包括本文所述的化合物的前药。如本文所用，“前药”指任何物质、分子或实体，其处于据预测该物质、分子或实体在发生化学或物理变化后充当治疗剂的形式。前药可通过共价键合或以某种方式多价螯合，并在施用于哺乳动物受试者之前、之时或之后释放或转化为活性药物部分。前药可通过修饰化合物中存在的官能团来制备，该修饰可在常规操作中或在体内切割为母体化合物的方式。前药包含这样的化合物，其中羟基、氨基、巯基或羧基与施用至哺乳动物受试者时遭受切割以分别形成游离羟基、氨基、巯基或羧基的任何基团结合。前药的制备和使用在T.Higuchi和V.Stella,“Pro-drugs as NovelDelivery Systems,”Vol.14 of the A.C.S.Symposium Series,and in BioreversibleCarriers in Drug Design,ed.Edward B.Roche,American Pharmaceutical Associationand Pergamon Press,1987中讨论，两者的全部内容通过引用结合在此。
预后：如本文所用，术语“预后”是指特定生物事件将在未来发生或极有可以发生的陈述或声明。
进展：如本文所用，术语“进展”或“癌症进展”是指疾病或状况的进展或恶化，或朝向疾病或状况的进展或恶化。
增殖：如本文所用，术语“增殖”是指生长、扩展或增加，或导致快速生长、扩展或增加。“增殖性”是指具有增殖的能力。“抗增殖性”是指具有与增殖特性相反或相对的特性。
蛋白质：“蛋白质”是指通过肽键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。如本文所用，术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。然而，通常蛋白质为至少50个氨基酸长。在一些情况下，编码的蛋白质小于约50个氨基酸。在这种情况下，多肽被称为肽。如果蛋白质是短肽，它将为至少约10个氨基酸残基长。蛋白质可以是天然存在的、重组的或合成的，或者这些的任何组合。蛋白质还可包含天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质可以是单分子，或者可以是多分子复合物。术语蛋白质也可适用于氨基酸聚合物，其中的一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物。
蛋白质表达：术语“蛋白质表达”是指核酸序列经过翻译以表达可检测水平的氨基酸序列或蛋白质的过程。
纯化的：如本文所用，“纯化”是指基本上纯的或不含不需要的组分、材料污损、混合物或杂质。
消退:如本文所用，术语“消退”或“消退程度”是指癌症进展的逆转，无论是表型上还是基因型上。减缓或阻止癌症进展可以被认为是消退。
样品：如本文所用，术语“样品”或“生物样品”是指其组织、细胞或组成部分的子集(例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐血、尿液、阴道液和精液)。样品还可包括从完整生物体或其组织、细胞或组成部分的子集制备的匀浆、裂解物或提取物，或其级分或部分，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤的外部分、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、乳、血细胞、肿瘤、器官。样品还涉及培养基，例如营养肉汤或凝胶，其可以包含细胞组分，例如蛋白质或核酸分子。
信号序列：如本文所用，短语“信号序列”是指可指导蛋白质的运输或定位的序列。
单一单位剂量：如本文所用，“单一单位剂量”是以一剂/一个时间/单一途径/单一接触点施用的任何治疗剂量，即单一施用事件。
相似性：如本文所用，术语“相似性”是指聚合物分子之间的整体相关性，例如多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体相关性。聚合物分子彼此之间的相似性百分比的计算可以与同一性百分比的计算相同的方式进行，除了相似性百分比的计算考虑保守替换之外，这是本领域理解的。
分割剂量：如本文所用，“分割剂量”是将单个单位剂量或总每日剂量分成两个或更多个剂量。
稳定的：如本文所用，“稳定的”是指一种化合物，其足够稳健以能够从反应混合物中分离到有用的纯度，并且在一个实施方案中，能够配制成有效的治疗剂。
稳定化：如本文所用，术语“稳定化的”、“稳定化”、“稳定化区域”是指使得稳定或变得稳定。
受试者：如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指可施用本发明的组合物的任何生物体，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类动物和人类)和/或植物。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指显示所关注的特征或特性的完全或接近完全程度或度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)达到完全和/或很少推进到完全或很少实现或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来涵盖许多生物学和化学现象中固有的潜在的完整性缺失。
基本上相等：如本文所用，在其涉及剂量之间的倍数差异(time difference)时，该术语表示正/负2％。
基本上同时：如本文所用并且在涉及多个剂量时，该术语是指在2秒内。
患有：“患有”疾病、病症和/或状况的个体被诊断患有或表现出疾病、病症和/或状况的一种或多种症状。
易患：“易患”疾病、病症和/或状况的个体未被诊断为和/或可能未表现出疾病、病症和/或状况的症状，但有发展疾病或其症状的倾向。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或状况(例如，癌症)的个体可具有以下一种或多种特征：(1)与疾病、病症和/或状况发展相关的基因突变；(2)与疾病、病症和/或状况发展相关的遗传多态性；(3)与疾病、病症和/或状况相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性的增加和/或降低；(4)与疾病、病症和/或状况发展相关的习惯和/或生活方式；(5)疾病、病症和/或状况的家族史；和(6)暴露于和/或感染与疾病、病症和/或状况发展相关的微生物。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或状况的个体将发展为该疾病、病症和/或状况。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或状况的个体将不会发展为该疾病、病症和/或状况。
缓释：如本文所用，术语“缓释”是指在特定时间段内符合释放速率的药物组合物或化合物释放特征。
合成的：术语“合成的”是指人工生产、制备和/或制造的。本发明的多核苷酸或多肽或其他分子的合成可以是化学的或酶促的。
靶细胞：如本文所用，“靶细胞”是指任何一种或多种感兴趣的细胞。这些细胞可以在体外、体内、原位或生物体的组织或器官中发现。在一个实施方案中，生物体可以是动物、哺乳动物或人类，并且在一个实施方案中，大多数为患者。
治疗剂：术语“治疗剂”是指当向受试者施用时，具有治疗、诊断和/或预防效果和/或引发期望的生物和/或药理学效果的任何物质。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”是指当向患有或易患感染、疾病、病症和/或状况的受试者施用时足以治疗、改善感染、疾病、病症和/或状况的症状，诊断、预防和/或延迟其发生的待递送的药剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量。
治疗有效的结果：如本文所用，术语“治疗有效的结果”是指在患有或易患感染、疾病、病症和/或状况的受试者中足以治疗、改善感染、疾病、病症和/或状况的症状，诊断、预防和/或延迟其发生的结果。
总每日剂量：如本文所用，“总每日剂量”是指在24小时时间段内给予或开具的量。其可作为单一单位剂量施用。
转录因子：如本文所用，术语“转录因子”是指例如通过激活或抑制转录来调节DNA转录为RNA的DNA结合蛋白。一些转录因子单独实现转录的调节，而另一些转录因子与其他蛋白质协同作用。一些转录因子在一定条件下既能激活又能抑制转录。通常，转录因子结合与靶基因调节区中的特定共有序列高度相似的特定靶序列或序列。转录因子可以单独或与其他分子复合调节靶基因的转录。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指特定感染、疾病、病症和/或状况的一种或多种症状或特征的部分或完全缓解、减轻、改善、解除、延迟发病、抑制进展、降低严重程度和/或降低发生率。例如，“治疗”癌症可以指抑制肿瘤的生存、生长和/或扩散。可以对未表现出疾病、病症和/或状况迹象的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或状况早期迹象的受试者施用治疗，以用于降低与疾病、病症和/或状况相关的病理发展风险的目的。
例如，当应用于癌症时，“治疗方法”或其等同物是指旨在减少、消除或预防个体中癌细胞数量，或缓解癌症症状的程序或行动过程。“治疗”癌症或其他增殖性病症的方法并不一定意指事实上将彻底地消除癌细胞或其他疾病，事实上将减少细胞或疾病的数目，或将减轻癌症或其他疾病的症状。通常，治疗癌症的方法将甚至在成功可能性低的情况下进行，但考虑到个体的病史和估计的预期生存期，它仍然被认为是一种总体上有益的行动。
肿瘤生长：如本文所用，除非另有说明，否则术语“肿瘤生长”或“肿瘤转移生长”通常用于肿瘤学，其中该术语主要与肿瘤或肿瘤转移的质量或体积增加有关，主要是由于肿瘤细胞生长所致。
肿瘤负荷：如本文所用，术语“肿瘤负荷”是指受试者携带的直径超过3mm的所有肿瘤结节的总肿瘤体积。
肿瘤体积：如本文所用，术语“肿瘤体积”是指肿瘤的大小。以mm3为单位的肿瘤体积通过以下公式计算：体积＝(宽度)2x长度/2。
未修饰的：如本文所用，“未修饰的”是指以任何方式改变之前的任何物质、化合物或分子。未修饰的可以但并不总是指生物分子的野生型或天然形式。分子可经历一系列修饰，其中每个修饰的分子可作为后续修饰的“未修饰的”起始分子。
等同物和范围
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。本发明的范围不旨在限于上述描述，而是如所附权利要求中所阐述的。
在权利要求中，诸如“a”、“an”和“the”的冠词可以表示一个或多于一个，除非另有说明或从上下文中明显看出。除非另有说明或从上下文中明显看出，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、使用于或以其他方式与给定的产品或过程相关，则在该组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或说明书视为满足。本发明包括其中该组中的一个成员恰好存在于、用于给定产品或过程或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。本发明包括其中多于一个或所有的组成员存在于、用于给定产品或过程或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。
还应注意，术语“包括”旨在是开放的并且允许包括额外的元素或步骤。
在给出范围的情况下，包括端点。此外，应当理解，除非根据上下文和本领域普通技术人员的理解另有说明或以其他方式明显看出，否则表示为范围的值可以在本发明的不同实施方案中采取所述范围内的任何特定值或子范围，到范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。
此外，应当理解，属于现有技术的本发明的任何特定实施方案可以明确地从任何一项或多项权利要求中排除。由于这样的实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，因此即使在本文中没有明确阐述排除，它们也可以被排除。本发明的组合物的任何特定实施方案(例如，任何核酸或由其编码的蛋白质；任何生产方法；任何使用方法等)可出于任何原因从任何一项或多项权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在相关。
所有援引的来源，例如本文援引的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和论文，均通过引用并入本申请，即使在引用中未明确说明。在援引的来源的陈述与本申请存在冲突的情况下，以本申请中的陈述为准。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
实施例1.GalNAc单体的合成
(3aS,5R,6R,7R,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-甲基-3a,6,7,7a-四氢-5H-吡喃并[3,2-d]噁唑-6,7-二基二乙酸酯2((3aS,5R,6R,7R,7aR)-5-(acetoxymethyl)-2-methyl-3a,6,7,7a-tetrahydro-5H-pyrano[3,2-d]oxazole-6,7-diyl diacetate 2)
在室温下向搅拌的GalNAc(50g,129mmol)在二氯甲烷(580mL)中的悬浮液中加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯(47mL,316mmol,2.46当量)，并将反应混合物加热至回流。反应搅拌24小时，然后冷却至0℃。反应用三乙胺淬灭，用饱和NaHCO3水溶液洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空浓缩，得到2，为棕色胶状物粗品，直接用于下一步。
(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(烯丙基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯3((2R,3R,4R,5R,6R)-5-acetamido-2-(acetoxymethyl)-6-(allyloxy)tetrahydro-2H-pyran-3,4-diyl diacetate 3)
将2(42g,128mmol)在二氯甲烷(1000mL)中的溶液在室温下在活化的
分子筛(160g)上搅拌，并加入烯丙醇(9.6mL,141mmol,1.1当量)。将反应混合物搅拌30分钟，然后加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯(20.5mL,138mmol,1.0当量)。将反应混合物再搅拌3小时15分钟，然后通过硅藻土过滤并用饱和NaHCO3水溶液洗涤。混合物经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。粗产物由乙酸乙酯/乙醚然后乙酸乙酯重结晶，用乙酸乙酯(x4)和乙醚(x2)洗涤，并在高真空下干燥，根据GalNAc得到3，为棕色固体，产率35％。
2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙酸4(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxy-6-(acetoxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)acetic acid 4)
在室温下向搅拌的3(19.2g,49.6mmol)在1:1二氯甲烷/乙腈(192mL)中的溶液中加入高碘酸钠(40.3g,189mmol,3.8当量)和水(45mL)。将混合物冷却至5℃，并一次性加入氯化钌(1.03g,4.96mmol,0.1当量)。将反应温热至室温并搅拌16小时。真空除去有机溶剂，并用二氯甲烷(x9)萃取水相。合并有机相，经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。粗产物从乙酸乙酯中重结晶，用乙酸乙酯(x2)洗涤，然后用乙醚(x2)洗涤，并在高真空下干燥，得到4，为灰白色固体，产率为70％。
(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-((6-(((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四氢呋喃-2-基)氧基)己基)氨基)-2-氧代乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯6((2R,3R,4R,5R,6R)-5-acetamido-2-(acetoxymethyl)-6-(2-((6-(((2R,4S,5R)-5-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-4-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)oxy)hexyl)amino)-2-oxoethoxy)tetrahydro-2H-pyran-3,4-diyl diacetate 6)
在室温下向搅拌的4(4.65g,11.5mmol)和5(6.15g,11.5mmol)在四氢呋喃(100mL)中的悬浮液中加入羟基苯并三唑(1.86g,13.8mmol,1.2当量)，然后加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(2.65g,13.8mmol,1.2当量)，并将反应混合物搅拌16小时。将混合物真空浓缩，溶解在乙酸乙酯中，用10:3的水/盐水洗涤，用乙酸乙酯反萃取，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。油状物粗品通过快速柱层析(硅胶、二氯甲烷/丙酮梯度)纯化，得到6，为黄色固体，产率为68％。
(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-((6-(((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-氰基乙氧基)(二异丙氨基)膦基)氧基)四氢呋喃-2-基)氧基)己基)氨基)-2-氧代乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯((2R,3R,4R,5R,6R)-5-acetamido-2-(acetoxymethyl)-6-(2-((6-(((2R,4S,5R)-5-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)-4-(((2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphaneyl)oxy)tetrahydrofuran-2-yl)oxy)hexyl)amino)-2-oxoethoxy)tetrahydro-2H-pyran-3,4-diyl diacetate)M1’(其中R1＝R2＝R3＝Ac且R4＝OCH2CH2CN，R5＝R6＝2-丙基)。
将6(6.88g,7.38mmol)与二氯甲烷(x3)共沸，然后溶解在二氯甲烷(70mL)中，并在室温下搅拌。向混合物中加入2-氰基乙氧基-双(N,N-二异丙基氨基)磷化氢(2.45g,8.12mmol,1.1当量)的二氯甲烷溶液，然后加入二异丙基铵盐四氮唑(0.63g,3.69mmol,0.5当量)，并将混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物用水洗涤，然后用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。油状物粗物用戊烷(x5)沉淀，然后通过快速柱层析(硅胶、乙酸乙酯)纯化，得到黄色胶状物，将其溶解在乙腈中，过滤并真空浓缩，得到7，为黄色固体，产率为63％。
三乙基铵4-(((2R,3S,5R)-5-((6-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙酰氨基)己基)氧基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基)氧基)-4-氧代丁酸酯8(Triethylammonium4-(((2R,3S,5R)-5-((6-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxy-6-(acetoxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)acetamido)hexyl)oxy)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)tetrahydrofuran-3-yl)oxy)-4-oxobutanoate 8)
在室温下向搅拌的6(2g,2.17mmol)在二氯甲烷(6mL)中的悬浮液中加入丁二酸酐(0.54g,5.42mmol,2.5当量)和三乙胺(0.76mL,5.42mmol,2.5当量)，并将混合物在室温下搅拌16小时。混合物用二氯甲烷稀释，并用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用盐水洗涤。合并水相，用二氯甲烷反萃取，经NaSO4干燥，过滤并真空浓缩。粗物质通过快速柱层析(硅胶、二氯甲烷/甲醇梯度)纯化，得到8，产率为29％。
β-dR-GalNAc-琥珀酰基-LCAA-CPG
M4’(其中R1＝R2＝R3＝Ac,L1＝琥珀酰基，且支持物为
LCAA-CPG)
向搅拌的8(2.38g,2.11mmol)在2％三乙胺/二氯甲烷(8mL)中的悬浮液中加入2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3,-四甲基四氟硼酸铵(1.02g,3.18mmol,1.5当量)，并将混合物在室温下搅拌15分钟。将反应混合物加入到预洗过的氨基SynBaseTM LCAACPG 1000/100(49g)中，并通过用氮气流鼓泡2小时进行混合。过滤CPG，用二氯甲烷(x3)洗涤，然后将其悬浮在二甲基氨基吡啶(0.25g)和乙酸酐(3.8mL)在吡啶(150mL)中的溶液中。将混合物静置30分钟，偶尔轻轻搅拌，然后过滤，用甲醇(x3)、二氯甲烷(x3)和乙醚(x3)洗涤，并风干，得到自由流动的白色固体。
实施例2.saRNA-GalNAc缀合物的合成
单体GalNAc构建模块与通过亚磷酰胺方法(the phosphoramidite methods)合成的标准寡核苷酸相容。在合成过程中使用亚磷酰胺和官能化的固体支持物。GalNAc亚磷酰胺单独或与其他GalNAc单体组合添加到寡核苷酸的任何位置。它们在没有任何间隔体或连接体的情况下顺序添加，或通过核苷酸、间隔体或连接体分隔开。GalNAc固体支持物用于在寡核苷酸的3’-末端掺入GalNAc修饰。
saRNA-GalNAc缀合物使用用于此类修饰的寡核苷酸的典型寡核苷酸合成、脱保护、纯化和退火方法制备。
实施例3.CEBPA-saRNA-GalNAc缀合物的体外和体内研究
合成表5中的24种GalNAc-CEBPA-saRNA缀合物，并通过被动转染先前描述的涵盖在本文所述的C6-GalNAc结构中的完全修饰的GalNAc-C6-CEBPAsaRNA缀合物，在原代肝细胞内体外测试活性(2018年9月7日提交的PCT/EP2018/074211的实施例2)。通过在原代大鼠肝细胞中以500nM(图1和图2)和1μM(图3和图4)被动转染，所有新设计都产生了与GalNAc-C6-CEBPA相当或更好的CEBPA和白蛋白mRNA的上调。
L1：
L2：
L3：
L4：
L5：
L6：
L14：
L15：
L16：
L17：
L18：
L19：
L40：
L41：
L42：
L43：
L44：
L45：
L53：
L54：
L55：
L56：
L57：
L58：
在体外实验之后，将最有前景的化合物用在正常小鼠体内。
在第1天和第3天以30mg/Kg静脉(IV)注射缀合物L1、L2、L3、L4、L5、L16、L40、L41、L42、L43和L55，并在第5天收获肝脏以观察CEBPA mRNA上调(图5)。只有L55在肝脏中表现出CEBPA上调，而GalNAc-C6-CEBPA缀合物在这种给药方式下没有表现出任何上调。出乎意料的是，L1显示CEBPAmRNA的下调。
随后按照与先前实验相同的方案静脉注射L14、L53和L54(图6和图7)。原始GalNAc-C6-CEBPA缀合物显示CEBPA mRNA的显著上调，L53显示CEBPA和白蛋白mRNA均显著上调。在本实验中，L53比GalNAc-C6-CEBPA更有效。
最后，在第1天和第3天以30mg/kg在正常小鼠中皮下(SC)注射L6、L18、L19、L56、L57和L58，并在第5天收获肝脏。在这些条件下，测试的缀合物均未显示上调。
在进一步的研究中，再次合成L1、L2、L3、L16、L40、L41、L42和L55，并皮下注射(SC)。在第1天和第3天在正常小鼠中以30mg/kg通过SC注射GalNAc saRNA缀合物，并在第5天收获肝脏。如图8所示，L55通过SC施用也显示出比原始GalNAc-C6-CEBPA缀合物显著更好的CEBPA mRNA的上调。
在另一项研究中，CEBPa-saRNA-GalNAc缀合物L80(缀合到GalNac簇G7的XD-14369K1)和L81(缀合到GalNac簇G8的XD-14369K1)以高达1000nM的不同剂量施用于细胞。测定CEBPAmRNA水平。图9显示了L80和L81的体外剂量反应。
实施例4.C5-siRNA-GalNAc缀合物的体外研究
在这项体外研究中，靶向补体C5基因的siRNA(C5-siRNA)缀合到GalNAc簇。将C5-siRNA用被动转染递送至细胞，随后测量C5 mRNA水平。siRNA的序列是：
Nf＝核苷酸N(N可为A、U、C或G)具有2’-氟(2’-F)修饰
小写＝核苷酸具有2’-O-甲基(2’-OMe)修饰
s：硫代磷酸酯键
本研究中测试的C5-siRNA-GalNAc缀合物包括：
1.C5-siRNA-C6-GalNAc(图10中的GalNAc-C6-siC5)，具有以下结构：
2.C5-siRNA-G7(图10中的GalNAc-53-siC5)，具有以下结构：
3.C5-siRNA-G9(图10中的GalNAc-55-siC5)，具有以下结构：
GalNAc-C6-siC5、GalNAc-53-siC5、GalNAc-55-siC5和对照(GalNAc-C6-FLUC、GalNAc-53-FLUC和GalNAc-55-FLUC)以0.3125nm至20nm的剂量施用到原代大鼠肝细胞。然后通过qPCR检测细胞中C5 mRNA的水平。如图10所示，与GalNAc簇G7缀合的C5-siRNA(GalNAc-53-siC5)、与GalNAc簇G9缀合的C5-siRNA(GalNAc-55-siC5)和GalNAc-C6-siC5都降低了C5 mRNA水平。
其他实施方案
应当理解，虽然已经结合本公开的详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围定义。其他方面、优点和修饰在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 米纳治疗有限公司（MINA THERAPEUTICS LIMITED）
LGC基因组学有限公司（LGC GENOMICS LTD.）
C·M·麦肯（MCKEEN, CATHERINE M.）
L·米切尔（MITCHELL, LEE）
<120> 寡核苷酸缀合物组合物和使用方法
<130> 226 317
<150> US 63/064,114
<151> 2020-08-11
<150> US 62/888,748
<151> 2019-08-19
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4001
<212> DNA
<213> 人
<400> 1
tccctctccc accaggggta tacatcctca gagctgaccc acgacctagc tttctggtgt 60
gactcggggt gggggctccc actggtcacc tggtgacccc catcgcagtg agttccgccc 120
caaggggaag cccagcctat agcaggctgg ggtggggtgt gtgcggaggg aggtgggaga 180
ggcgtggaac tagagaccct ccaccttcat gtagaactag gggaacaacc ttaggttcca 240
agccccaagt ccctatgttt ccaccccttt ctaaggacag gcgtggagga gcggctgggg 300
ctggcgggct tgtcgggatc tcagctccct gagccctcct cctgccacgg gcctgctccc 360
ctccttctct catgggggtc tgctgtagcc tcgggaagga ggcaggaaac ctccaaataa 420
aatgacaagg cacgatttgc tccccctact cagtaggcat tggagcggtg agtttgcatt 480
tccaaggcac aaggttatcc taaatactag agttgccggg ctcccagctc agccccaaga 540
attctcccct cctcgcaggg agaagccacc gcctggcccc ctcatcttag acgcaccaag 600
tccggcgcag aggaagggag gggacacgcg gagcaggcca ggctttcagg aggcaccgga 660
atctcctagt cctggctcgc acggctcggg caagcctcga gatccggcga ccccaaacca 720
ctccctgggt ccccgccgga ggctggccca gggcggtccc acagccgcgc gcctcacgcg 780
cagttgccca tggccttgac caaggagctc tctggcagct ggcggaagat gccccgcagc 840
gtgtccagtt cgcggctcag ctgttccacc cgcttgcgca ggcggtcatt gtcactggtc 900
agctccagca ccttctgctg cgtctccacg ttgcgctgct tggccttgtc gcggctcttg 960
cgcaccgcga tgttgttgcg ctcgcgccgc acccggtact cgttgctgtt cttgtccacc 1020
gacttcttgg ccttgcccgc gccgctgccg ccactcgcgc ggaggtcggg gtgcgcggcg 1080
cccagcccct tgagcgcgct gccagggccc ggcaggccgg cggcaccgag cgcgggcgcg 1140
gggtgcgggc tgggcacggg cgtgggcggc ggcgtggggt gaccgggctg caggtgcatg 1200
gtggtctggc cgcagtgcgc gatctggaac tgcaggtgcg gggcggccag gtgcgcgggc 1260
ggcgggtgcg ggtgcgggtg cgagggcggc ggcggcggcg gcggctggta agggaagagg 1320
ccggccagcg ccagctgctt ggcttcatcc tcctcgcggg gctcctgctt gatcaccagc 1380
ggccgcagcg ccggcgcccc gacgcgctcg tacaggggct ccagcctgcc gtccaggtag 1440
ccggcggccg cgcagccgta gccgggcggg ggcccgtgcg ctcccccggg catgacggcg 1500
ccgccggggc ccgcgggcgc gcccgggtag tcaaagtcgc cgccgccgcc gccgcccgtg 1560
gggcccacgg ccgccttggc cttctcctgc tgccggctgt gctggaacag gtcggccagg 1620
aactcgtcgt tgaaggcggc cgggtcgatg taggcgctga tgtcgatgga cgtctcgtgc 1680
tcgcagatgc cgcccagcgg ctccggggcg gcaggtgggg cgggaggctg cgcggggccc 1740
gcgccccggg gaaagccgaa ggcggcgctg ctgggcgcgt gcggggggct ctgcaggtgg 1800
ctgctcatcg ggggccgcgg ctccgcctcg tagaagtcgg ccgactccat gggggagtta 1860
gagttctccc ggcatggcga gcctcggcgg cctccagcct gcgcggggcg tcgccgccgc 1920
ccacccggag accctgctcg cccgcgcccg cgcacctccg ggtcgcgaat ggcccggccc 1980
gcgccggccc agcttttata cccggcaggc cgcgtcgccc cctagagtcc gaggcggcct 2040
ctgtccccgg gctgcggcgg cgcggcgcct gctgggtcct agcgcgcggc cggcatgggg 2100
cggcgaacca gcgcggcaca gcgccgcgct ccccaggcag gccgcggcgc aacgcccacc 2160
gcctccagcg cgcccagcag agccgcggcg ctcgctccaa gctccgcccc cggcccggcc 2220
gtcgcccccg cgcccacgtg gtcggtagcg ggggccccct cctcctgcct gccctaggcg 2280
cccgtatcca gccacggccg ggagcccagg agtatcccga ggctgcacgg ggtaggggtg 2340
gggggcggag ggcgagtctt ggtcttgagc tgctggggcg cggattctct ttcaaagcca 2400
gaaccaggcc tgtcccggac ccgcgtcccg gggaggctgc agcgcagagc agcggggctg 2460
gggccggtgg ggggccgttt gggacgcgcg gagaggtcct gagcgcggtg gctctgcgtc 2520
tcctagctct gatctccagg ctacccctgt gattccgcgc agaggtacct ctcggaggac 2580
gccggggtcc catgggcggc gccgcgcagg gcgctaggac cccgcgggga gcggaggcgg 2640
cctcggcccg ggagcctgga ggacctggcc ggtcgatccg cccgggctgg aaaactttct 2700
ttataattac ttctccaggt cggagcgcgc ggcttgctag gcgcgcgggg ccggcgctgt 2760
tacccggcgt ggagtcgccg attttttttc ctgcgggacc gcggggcccc ccagactagc 2820
ggagctggac gccggggcga gcacggggag gggcgcaccg agggaggaga caaacttaac 2880
tctggggccg ggattccgag gcgggggccg cagccctcga ggcccgaagc caccgcttcc 2940
tcccccgcct ccccattcag gtgggcgcca acggcgggag cgagggtgtc caggccgccg 3000
ggctgccagg tccgagcacg cacagggaga actctgccca gtggttcgcc gggcgctgta 3060
gtccccggga tcctagggac cgaggcggcc aggccctggg gccccttgag tgcggcagct 3120
aatgctctca ccgcggcggg ggaaggagct tgccaccgag acccccagcc acgtgcgtcc 3180
ctcgcattct ttaccggggc cggggtggcg gctacggacc gtcagctggg cccagatgga 3240
gtcttgggag ccctcaagtg tctcctgtcc ttgcccgcgc cgcccctcgc cactggcgct 3300
gaggcctgac gccgcctgcg tcccggctag aggcgcgctt gcctacaggt gagggaagac 3360
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gagggggcac agctaaaaac accgctggag agccccgagc ttccacgacg atcgcagtaa 3480
agaagcagtt tcatctgggc aacgcacact gcgctttaat caagttccta ttcaacatag 3540
tcccagtgat taatagccca actgcttcgt tttcggtcca gagctcataa acaagatatt 3600
tttagcttga cgcttttgga cgggagggag taaaaaccag atacgttaaa taaatatccc 3660
gatgtgagcc ggagagctgc ttgctgagcc aaatgcagga cccattcata tagcattcac 3720
ctgtggaggg agacctggac ggaaatcaaa aagcaccaag agcgatttgc gtttttttct 3780
gcggtgctaa aactaatggc ttttcctacc taggaacaaa gaaacgccac tgtacatgca 3840
cggttcccgg cctgtggagt tgtgggagga aggcgatgtc tggccttttt tgcacagctg 3900
ctgttgcctg cccagagatc gggaactctg ccccgtagga ctggaagaaa cctcagtaat 3960
gggaataaga ctttgtccaa tagggggctg atgaatgtgt g 4001
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 2
gcggucauug ucacuggucu u 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 3
gaccagugac aaugaccgcu u 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 5' NH2-(C6H12)-连接体
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> 反向核苷酸
<400> 4
gcggucauug ucacuggucu ut 22
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸酯连接
<400> 5
gaccagugac aaugaccgcu u 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 合并的DNA/RNA分子的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 5' NH2-(C6H12)-连接体
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (11)..(11)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> 反向核苷酸
<400> 6
gcggucauug ucacuggucu ut 22
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (11)..(11)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
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<220>
<221> 修饰的碱基
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<223> 2'-氟核苷酸
<400> 24
gcggucauug ucacugguc 19
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连接
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (11)..(13)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> 硫代磷酸酯连接
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸酯连接
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<400> 25
gaccagugac aaugaccgcu u 21
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 26
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 27
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 27
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连接
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(11)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 2'-氟核苷酸
<400> 28
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 29
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
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<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
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<220>
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<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
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<220>
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<220>
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<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (11)..(13)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 2'-氟核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(23)
<223> 2'-O-甲基核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(22)
<223> 硫代磷酸酯连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> 硫代磷酸酯连接
<400> 29
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
Claims (43)
1.N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)单体，其包含选自以下的结构：
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基，
其中R4为合适的保护基团或C1-6直链或支链烷基，
其中R5和R6各自独立地为C1-6直链或支链烷基，并且
其中R7为合适的保护基团；
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基；
其中R4为保护基团或C1-6直链或支链烷基，
其中R5和R6各自独立地为C1-6直链或支链烷基；并且
其中R7为合适的保护基团；
(M4’，其是固体支持物上的单体)，
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基，
其中R7为合适的保护基团；并且
其中连接体1为可切割的连接体；
和
(M5’，其是固体支持物上的单体)，
其中R1、R2和R3可以相同或不同，并且其中R1、R2和R3独立地选自烷基、芳基和烯基，
其中R7为合适的保护基团；并且
其中连接体1为可切割的连接体。
2.GalNAc部分，其包含至少一个GalNAc单体，其中所述GalNAc单体选自：
其中R8为-H或C1-6直链或支链烷基；
其中R8为-H或C1-6直链或支链烷基，且其中X为O或S；
其中X为O或S；
其中所述GalNAc部分不包含多于一个M4、M5或M6单体，且
其中所述GalNAc部分不是由仅一个M3单体、仅一个M6单体或一个M6单体和两个M3单体组成的GalNAc部分。
3.根据权利要求2所述的GalNAc部分，其中所述GalNAc部分包含间隔体，所述间隔体包含HEG、C12、ab、TEG或C3的结构。
4.根据权利要求2所述的GalNAc部分，其中所述GalNAc部分包含两个或三个GalNAc单体。
5.根据权利要求2所述的GalNAc部分，其中所述GalNAc部分包含三个M1、M2或M3单体。
6.根据权利要求5所述的GalNAc部分，其中所述GalNAc部分包含三个M1单体。
7.根据权利要求2所述的GalNAc部分，其中所述GalNAc簇包含以下结构：
8.GalNAc部分，其通过包括以下步骤的方法制备：
1)提供至少一个GalNAc单体，其选自权利要求1中的任一单体、
(M6’，其为固体支持物上的单体)；以及
2)从步骤1)的GalNAc单体合成GalNAc部分；任选地添加至少一个间隔体和任选地去除所述保护基团。
9.一种缀合物，其包含寡核苷酸和权利要求2-8中任一项所述的GalNAc部分，其中所述寡核苷酸调节靶基因的表达，并且其中所述寡核苷酸和所述GalNAc部分通过键或可切割的连接体连接。
10.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述寡核苷酸和所述GalNAc部分通过可切割的连接体连接。
11.根据权利要求10所述的缀合物，其中所述连接体为C6ssC6或dT。
12.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述寡核苷酸和所述GalNAc部分通过键连接，其中所述键为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键。
13.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述缀合物包括CJ1、CJ2、CJ3、CJ4、CJ5、CJ6、CJ7、CJ8、CJ9、CJ10、CJ11、CJ12、CJ13、CJ14、CJ15、CJ16、CJ17、CJ18、CJ19、CJ20、CJ21、CJ22、CJ23、CJ24或CJ25的结构。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的缀合物，其中所述寡核苷酸为合成的分离的小激活RNA(saRNA)。
15.根据权利要求14所述的缀合物，其中所述靶基因为CEBPA。
16.根据权利要求14所述的缀合物，其中saRNA为双链saRNA。
17.根据权利要求16所述的缀合物，其中所述GalNAc簇连接至所述有义链的5’或3’末端。
18.根据权利要求16所述的缀合物，其中所述双链saRNA选自XD-03302、S1(XD-06409)、S2(XD-06410)、S3(XD-06411)、S4(XD-06412)、S5(XD-06413)、S6(XD-06414)、S7(XD-06415)、S8、XD-07139、XD-03934和XD-14369K1。
19.根据权利要求16所述的缀合物，其中所述saRNA为XD-06414，其具有包含SEQ IDNO:15的反义链和包含SEQ ID NO:14的有义链。
20.根据权利要求19所述的缀合物，其中所述缀合物选自：
L1：
L2：
L3：
L4：
L5：
L6：
L14：
L15：
L16：
L17：
L18：
L19：
L40：
L41：
L42：
L43：
L44：
L45：
L53：
L54：
L55：
L56：
L57：
和
L58：
21.根据权利要求19所述的缀合物，其中所述缀合物为L53。
22.根据权利要求19所述的缀合物，其中所述缀合物为L55。
23.根据权利要求9-13中任一项所述的缀合物，其中所述寡核苷酸是合成的分离的小抑制RNA(siRNA)。
24.根据权利要求23所述的缀合物，其中siRNA为双链siRNA。
25.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述GalNAc簇连接至所述有义链的5’或3’末端。
26.一种缀合物，其通过包括以下步骤的方法制备：
1)提供至少一个GalNAc单体，其选自M1’、M2’、M3’、M4’、M5’和M6’；任选地添加至少一个间隔体；
2)提供至少一个寡核苷酸；任选地添加至少一个连接体；
以及
3)从步骤1)中的GalNAc单体(一个或多个)和步骤2)中的寡核苷酸(一个或多个)合成所述缀合物，任选去除保护基团。
27.根据权利要求26所述的缀合物，其中所述寡核苷酸为saRNA。
28.根据权利要求27所述的缀合物，其中所述saRNA选自XD-03302、S1(XD-06409)、S2(XD-06410)、S3(XD-06411)、S4(XD-06412)、S5(XD-06413)、S6(XD-06414)、S7(XD-06415)、S8、XD-07139、XD-03934和XD-14369K1。
29.根据权利要求26所述的缀合物，其中所述寡核苷酸为siRNA。
30.一种药物组合物，其包含权利要求9-29中任一项所述的缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述缀合物包含saRNA。
32.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述缀合物包含siRNA。
33.向细胞递送寡核苷酸的方法，其包括向细胞施用权利要求9-29中任一项所述的缀合物，其中不使用转染剂。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述寡核苷酸包含saRNA。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述寡核苷酸包含siRNA。
36.在有需要的患者中调节靶基因的表达的方法，包括施用权利要求9-29中任一项所述的缀合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述缀合物包含saRNA。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述靶基因的表达增加。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述靶基因为CEBPA。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述患者中的白蛋白的表达增加。
41.根据权利要求36所述的方法，其中所述缀合物包含siRNA。
42.根据权利要求36所述的方法，其中所述靶基因的表达降低。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述靶基因为C5。
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