CN104582737A - 用于调节apoa1和abca1表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的方面提供用于激活或增强APOA1或ABCA1的表达的单链寡核苷酸。另外的方面提供包含用于激活或增强APOA1或ABCA1的表达的单链寡核苷酸的组合物和试剂盒。还提供了用于使用这些单链寡核苷酸调节APOA1或ABCA1的表达的方法。本发明的另外的方面提供了选择用于激活或增强APOA1或ABCA1的表达的候选寡核苷酸的方法。

Description

用于调节APOA1和ABCA1表达的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年3月14日提交的名称为“用于调节APOA1和ABCA1表达的组合物和方法(COMPOSITIONSAND METHODS FOR MODULATING APOA1AND ABCA1EXPRESSION)”的美国临时申请号61/785,778以及2012年5月16日提交的名称为“用于调节APOA1和ABCA1表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING APOA1AND ABCA1EXPRESSION)”的美国临时申请号61/647,949的权益，每个申请通过引用以其全文结合在此。
发明领域
本发明涉及基于寡核苷酸的组合物，以及使用基于寡核苷酸的组合物用于治疗疾病的方法。
发明背景
血液中脂质的累积可导致多种病症和疾病，例如血脂异常和动脉粥样硬化。动脉粥样硬化特别是工业化社会中死亡的主要原因，使预防和治疗成为高的公共卫生关注点。低密度脂蛋白(LDL)是血流中脂肪分子例如胆固醇的主要的转运体，其将脂肪分子递送到细胞。高密度脂蛋白(HDL)是脂肪分子的另一个转运体，其将脂质例如胆固醇从细胞移动到肝脏。高水平的LDL与健康问题例如血脂异常与动脉粥样硬化相关，而HDL针对动脉粥样硬化是保护性的并且涉及在胆固醇平衡的保持中。
血脂异常通常说明了当异常量的脂质存在于血液中时的病症。高血脂症，占血脂异常的大多数，是指血液中异常高的量的脂质。高血脂症常与内分泌疾病例如糖尿病、甲状腺功能减退、代谢综合征和库欣综合征相关。血脂异常中的常见脂质的实例包括甘油三酯像胆固醇和脂肪。血液中异常量的脂质或脂蛋白可导致动脉粥样硬化、心脏病和中风。
动脉粥样硬化疾病，例如冠状动脉疾病(CAD)和心肌梗死(MI)，涉及由血液中脂肪(最常见地胆固醇)的累积引起的动脉壁的增厚。这种增厚被认为是小动脉壁的慢性炎症的结果，归因于LDL在这些血管壁中的累积。一旦在血管壁内，LDL分子就会变得被氧化，导致细胞损伤和免疫细胞像巨噬细胞的募集以吸收该氧化的LDL。一旦巨噬细胞内化氧化的LDL，它们变得被胆固醇饱和并被称为泡沫细胞。然后平滑肌细胞被募集并形成纤维状区域。这些过程最终导致斑块动脉的形成并可导致心脏病发作和中风。HDL能够将胆固醇从泡沫细胞转运到肝脏，辅助抑制炎症和斑块形成。
APOA1(载脂蛋白A-I)是血液中高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白组分。HDL通过与胆固醇流出调节蛋白ABCA1(ATP结合盒转运体A1)相互作用从细胞获得胆固醇。APOA1和ABCA1的相互作用对于胆固醇平衡和通过转运胆固醇针对疾病像动脉粥样硬化来保护免受动脉粥样硬化病变是重要的。动脉粥样硬化的小鼠模型已经证明，ApoA1减少动脉粥样硬化病变中的体内游离胆固醇的累积。
发明内容
在此披露的本发明的多个方面提供有用于上调细胞内APOA1和/或ABCA1的方法和组合物。在一些实施例中，提供单链寡核苷酸，其靶向APOA1基因或ABCA1基因(例如，人APOA1、人ABCA1)的PRC2相关区并且因此引起该基因的上调。在一些实施例中，提供单链寡核苷酸，这些单链寡核苷酸靶向编码APOA1或ABCA1的基因的PRC2相关区。在一些实施例中，这些单链寡核苷酸通过缓解或阻止PRC2介导的对APOA1或ABCA1的阻抑来激活或增强APOA1或ABCA1的表达。
在此披露的本发明的一些方面提供用于上调APOA1、ABCA1、或两者以治疗和/或预防血脂异常的方法和组合物。在此披露的本发明的其他方面提供用于上调APOA1、ABCA1、或两者以治疗和/或预防动脉粥样硬化的方法和组合物。
本发明的另外的方面提供用于选择用于激活或增强APOA1和/或ABCA1的表达的寡核苷酸的方法。在一些实施例中，提供用于选择一组寡核苷酸的方法，该组寡核苷酸中富集于用于激活或增强APOA1和/或ABCA1的表达的候选物(例如，与寡核苷酸随机选择相比较)中。因此，这些方法可以用于建立其中富集了激活或增强APOA1和/或ABCA1的表达的寡核苷酸的多组临床候选物。这类库可以被利用来例如鉴别用于开发治疗APOA1和/或ABCA1的治疗剂的先导寡核苷酸。另外，在一些实施例中，提供寡核苷酸化学性质，其可用于控制用于激活APOA1和/或ABCA1的表达的单链寡核苷酸的药物代谢动力学、生物分布、生物可利用性和/或功效。
根据本发明的一些方面，提供单链寡核苷酸，这些单链寡核苷酸具有与APOA1基因或ABCA1基因的PRC2相关区(例如，该区的至少8个连续核苷酸)(例如，如SEQ ID NO：1、2、5或6中给出的核苷酸序列的PRC2相关区)互补的区。在一些实施例中，寡核苷酸具有以下特征中的至少一个：a)为5’X-Y-Z的序列，其中X为任何核苷酸并且其中X位于寡核苷酸的5’端，Y为非为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列；b)不包括三个或更多个连续鸟苷核苷酸的序列；c)与每个核苷酸序列具有阈值水平以下的序列一致性的序列，这些核苷酸长度等于第二核苷酸序列、在脱靶基因的5’端上游的50千碱基与该脱靶基因的3’端下游的50千碱基之间；d)与编码RNA的PRC2相关区互补的序列，该RNA形成包括至少两个单链环的二级结构；以及e)具有60％以上G-C含量的序列。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少两种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少三种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少四种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的每一种。在某些实施例中，该寡核苷酸具有序列5’X-Y-Z，其中该寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸。
根据本发明的一些方面，提供具有序列X-Y-Z的单链寡核苷酸，其中X为任何核苷酸，Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列，其中该单链寡核苷酸与APOA1基因或ABCA1基因的PRC2相关区(例如，如SEQ ID NO：1、2、5或6中给出的核苷酸序列的PRC2相关区)互补。在本发明的一些方面中，提供具有序列5’-X-Y-Z的单链寡核苷酸，其中X为任何核苷酸，Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列，其中该单链寡核苷酸与APOA1基因或ABCA1基因的PRC2相关区(例如，如SEQ ID NO：1、2、5或6中给出的核苷酸序列的PRC2相关区)的至少8个连续核苷酸互补。在一些实施例中，Y为选自表1的序列。在一些实施例中，该PRC2相关区为SEQ ID NO：9至194中任一个中列出的序列。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO：195至187501中任一个中给出的核苷酸序列，或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO：195至187501中任一个中给出的核苷酸序列，其中所提供的核苷酸序列的5’端是该寡核苷酸的5’端。在一些实施例中，该互补区(例如，至少8个连续核苷酸)还存在于如SEQ ID NO：3、4、7或8中给出的核苷酸序列中。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO：195至187501中任一个中给出的核苷酸序列。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO：195至187501中任一个中给出的核苷酸序列中至少8个核苷酸的片段。
在一些实施例中，该PRC2相关区为SEQ ID NO：9至150中任一个中列出的序列。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO：195至120357中任一个中给出的核苷酸序列，或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO：195至120357中任一个中给出的核苷酸序列，其中在SEQ ID NO：195至120357中任一项中提供的核苷酸序列的5’端是该寡核苷酸的5’端。在一些实施例中，该至少8个连续核苷酸还存在于如SEQ ID NO：3或7中给出的核苷酸序列中。
在一些实施例中，该PRC2相关区为SEQ ID NO：151至194中任一个中列出的序列。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO：119697至187501中任一个中给出的核苷酸序列，或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO：119697至187501中任一个中给出的核苷酸序列，其中在SEQ ID NO：119697至187501中任一项中提供的核苷酸序列的5’端是该寡核苷酸的5’端。在一些实施例中，该至少8个连续核苷酸存在于如SEQ ID NO：4或8中给出的核苷酸序列中。
在一些实施例中，单链寡核苷酸包括如表4中给出的核苷酸序列。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如表4中给出的核苷酸序列中至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中，单链寡核苷酸由如表4中给出的核苷酸序列组成。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸不包括三个或更多个连续鸟苷核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸不包括四个或更多个连续鸟苷核苷酸。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸的长度高达50个核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸，并且该PRC2相关区的互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或鸟苷核苷酸。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸与APOA1基因或ABCA1基因的PRC2相关区、例如SEQ ID NO：1、2、5或6中给出的核苷酸序列的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补，其中该单链寡核苷酸的核苷酸序列包括选自下组的核苷酸序列中的一个或多个，该组由以下各项组成
(a)(X)Xxxxxx，(X)xXxxxx，(X)xxXxxx，(X)xxxXxx，(X)xxxxXx和(X)xxxxxX，
(b)(X)XXxxxx，(X)XxXxxx，(X)XxxXxx，(X)XxxxXx，(X)XxxxxX，(X)xXXxxx，(X)xXxXxx，(X)xXxxXx，(X)xXxxxX，(X)xxXXxx，(X)xxXxXx，(X)xxXxxX，(X)xxxXXx，(X)xxxXxX和(X)xxxxXX，
(c)(X)XXXxxx，(X)xXXXxx，(X)xxXXXx，(X)xxxXXX，(X)XXxXxx，(X)XXxxXx，(X)XXxxxX，(X)xXXxXx，(X)xXXxxX，(X)xxXXxX，(X)XxXXxx，(X)XxxXXx(X)XxxxXX，(X)xXxXXx，(X)xXxxXX，(X)xxXxXX，(X)xXxXxX和(X)XxXxXx，
(d)(X)xxXXX，(X)xXxXXX，(X)xXXxXX，(X)xXXXxX，(X)xXXXXx，(X)XxxXXXX，(X)XxXxXX，(X)XxXXxX，(X)XxXXx，(X)XXxxXX，(X)XXxXxX，(X)XXxXXx，(X)XXXxxX，(X)XXXxXx，和(X)XXXXxx，
(e)(X)xXXXXX，(X)XxXXXX，(X)XXxXXX，(X)XXXxXX，(X)XXXXxX和(X)XXXXXx，以及
(f)XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX以及XXXXXXx，其中“X”表示核苷酸类似物，(X)表示任选的核苷酸类似物，并且“x”表示DNA或RNA核苷酸单位。
在一些实施例中，该寡核苷酸的至少一个核苷酸为核苷酸类似物。在一些实施例中，与不具有至少一个核苷酸类似物的寡核苷酸相比较，该至少一个核苷酸类似物导致该寡核苷酸的的Tm在1℃至5℃的范围内的升高。
在一些实施例中，该寡核苷酸的至少一个核苷酸包括2’O-甲基。在一些实施例中，该寡核苷酸的每个核苷酸包括2’O-甲基。在一些实施例中，该寡核苷酸包括至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。在一些实施例中，该桥连核苷酸为LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰的核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的每个核苷酸为LNA核苷酸。
在一些实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-氟-脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及ENA核苷酸类似物。在一些实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及LNA核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包括交替的LNA核苷酸和2’-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的5’核苷酸为LNA核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包括通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个LNA核苷酸侧接的脱氧核糖核苷酸。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个核苷酸之间的修饰的核苷酸间键(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键或其他键)。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括所有核苷酸之间的修饰的核苷酸间键(例如，硫代磷酸酯核苷酸间键或其他键)。
在一些实施例中，该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’羟基。在一些实施例中，该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’硫代磷酸酯。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有生物素部分或缀合至其5’或3’核苷酸的其他部分。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有胆固醇、维生素A、叶酸、σ受体配体、适体、肽、如CPP、疏水性分子如脂质、ASGPR或动态多聚缀合物以及其在5’或3’端处的变体。
根据本发明的一些方面，提供包含在此披露的任何寡核苷酸以及载体的组合物。在一些实施例中，提供在缓冲溶液中包含任何寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，将寡核苷酸缀合至载体。在一些实施例中，载体为肽。在一些实施例中，载体为类固醇。根据本发明的一些方面，提供包含在此披露的任何寡核苷酸以及药学上可接受的载体的药物组合物。
根据本发明的其他方面，提供包括容纳在此披露的任何组合物的容器的试剂盒。
根据本发明的一些方面，提供提高细胞内APOA1或ABCA1的表达的方法。在一些实施例中，这些方法包括将在此披露的单链寡核苷酸中的任一种或多种递送至细胞。在一些实施例中，将该单链寡核苷酸递送至细胞导致APOA1或ABCA1的表达水平大于(例如，至少50％大于)不包括该单链寡核苷酸的对照细胞中的APOA1或ABCA1的表达水平。
根据本发明的一些方面，提供提高受试者体内APOA1或ABCA1的水平的方法。根据本发明的一些方面，提供治疗受试者体内与APOA1或ABCA1的降低的水平相关联的病症(例如，血脂异常、动脉粥样硬化)的方法。在一些实施例中，这些方法包括向该受试者给予在此披露的单链寡核苷酸中的任一种或多种。
表格简述
表1：非为人miRNA的种子序列的六聚物。
表2：为实验室测试制备的寡核苷酸。RQ(第3列)和RQ SE(第4列)显示了寡核苷酸相对于对照孔(通常为单独的载体)的活性以及针对实验的三次重复(triplicate replicates)的标准误差。已示出[寡核苷酸]在体外实验中以纳摩尔计并且在体内实验中以微克/千克体重计。表4中示出了每个寡核苷酸(包括任何修饰的核苷酸)的序列。
表3：寡核苷酸修饰列表。
表4：为显示核苷酸修饰的测试制备的格式化寡核苷酸序列。表格示出修饰的核苷酸序列，其中lnaX表示具有3’硫代磷酸酯键的LNA核苷酸，omeX为2’-O-甲基核苷酸，dX为脱氧核苷酸。核苷酸码末端处的s指示该核苷酸具有3’硫代磷酸酯键。序列末端处的“-Sup”标记以下事实：3’末端的3’键上缺少磷酸酯或硫代磷酸酯。针对表2中所测试的寡核苷酸，格式化序列列示出了包括修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
表5：细胞系
本发明的某些实施方案的详细说明
在此提供的本发明的方面涉及发现多梳阻抑复合物2(PRC2)-相互作用RNA。多梳阻抑复合物2(PRC2)为组蛋白甲基转移酶以及使基因组区通过组蛋白H3的甲基化沉默中涉及的已知的表观遗传调控剂(epigenetic regulator)。在其他功能中，PRC2与长的非编码RNA(lncRNA)如RepA、Xist以及Tsix相互作用以便催化组蛋白H3-赖氨酸27的三甲基化。PRC2含有四个亚单位：Eed、Suz12、RbAp48以及Ezh2。本发明的方面涉及单链寡核苷酸可以诱导或增强APOA1或ABCA1的表达的认识，这些单链寡核苷酸结合至在基因组区内表达的RNA(例如，lncRNA)的PRC2相关区，该基因组区涵盖或功能性接近APOA1或ABCA1基因。在一些实施例中，认为这个上调源于PRC2介导的APOA1或ABCA1的阻抑的抑制作用。
如在此所使用，术语“PRC2相关区”是指包括或编码与PRC2的组分直接或间接相互作用的核苷酸序列的核酸的区域。PRC2相关区可以存在于与PRC2相互作用的RNA(例如，长的非编码RNA(lncRNA))中。PRC2相关区可以存在于编码与PRC2相互作用的RNA的DNA中。在一些情况下，该PRC2相关区等效地称为PRC2相互作用区。
在一些实施例中，PRC2相关区为响应于对表达RNA的细胞的原位紫外线辐射而交联至PRC2的组分的RNA的区域，或编码所述RNA区域的基因组DNA的区域。在一些实施例中，PRC2相关区为与靶向PRC2的组分的抗体一起免疫沉淀的RNA的区域，或编码所述RNA区域的基因组DNA的区域。在一些实施例中，PRC2相关区为与特异性结合至SUZ12、EED、EZH2或RBBP4(如上所述为PRC2的组分)的抗体一起免疫沉淀的RNA的区域，或编码所述RNA区域的基因组DNA的区域。
在一些实施例中，PRC2相关区为在采用靶向PRC2的组分的抗体的RNA免疫沉淀测定中被保护免于核酸酶(例如，RNase)破坏的RNA的区域，或编码所述受保护的RNA区域的基因组DNA的区域。在一些实施例中，PRC2相关区为在采用靶向SUZ12、EED、EZH2或RBBP4的抗体的RNA免疫沉淀测定中被保护免于核酸酶(例如，RNase)破坏的RNA的区域，或编码所述受保护的RNA区域的基因组DNA的区域。
在一些实施例中，PRC2相关区为RNA的区域，其中在采用靶向PRC2的组分的抗体的RNA免疫沉淀测定的产物的测序反应中出现相对高频率的序列读取，或编码所述RNA区域的基因组DNA的区域。在一些实施例中，PRC2相关区为RNA的区域，其中在采用特异性结合至SUZ12、EED、EZH2或RBBP4的抗体的RNA免疫沉淀测定的产物的测序反应中出现相对高频率的序列读取，或编码所述受保护的RNA区域的基因组DNA的区域。在这类实施例中，该PRC2相关区可以称为“峰”。
在一些实施例中，PRC2相关区包括与PRC2复合物相互作用的、具有40至60个核苷酸的序列。在一些实施例中，PRC2相关区包括编码与PRC2相互作用的RNA的、具有40至60个核苷酸的序列。在一些实施例中，PRC2相关区包括长度高达5kb、包括与PRC2相互作用的序列(例如，具有40至60个核苷酸)的序列。在一些实施例中，PRC2相关区包括长度高达5kb的序列，其中编码具有已知与PRC2相互作用的序列(例如，具有40至60个核苷酸)的RNA。在一些实施例中，PRC2相关区包括长度约4kb、包括与PRC2相互作用的序列(例如，具有40至60个核苷酸)的序列。在一些实施例中，PRC2相关区包括长度约4kb的序列，其中编码包括已知与PRC2相互作用的序列(例如，具有40至60个核苷酸)的RNA。在一些实施例中，PRC2相关区具有如SEQ ID NO：9至194中任一个中给出的序列。
在一些实施例中，提供单链寡核苷酸，其特异性结合至涵盖或接近APOA1或ABCA1基因的基因组区内的PRC2相关区或与其互补。在一些实施例中，提供单链寡核苷酸，其特异性结合至具有如SEQ ID NO：9至194中任一个中给出的序列的PRC2相关区或与其互补。在一些实施例中，提供单链寡核苷酸，其特异性结合至PRC2相关区或与其互补，该PRC2相关区具有如SEQ ID NO：9至194中任一个中给出的序列，该序列连同来自这些SEQ ID所定位的相应基因组区(例如，在人基因组中)的2kb、高达5kb或高达10kb侧接序列相结合。在一些实施例中，单链寡核苷酸具有如SEQ ID NO：195至187501中任一个中给出的序列。在一些实施例中，单链寡核苷酸具有如表4中给出的序列。
无意受限于本发明的理论，这些寡核苷酸能够通过防止将PRC2募集至特定染色体基因座来干扰PRC2的结合和功能。例如，设计成特异性结合PRC2相关区lncRNA的单链寡核苷酸的单一给药通过结合染色质不仅可以稳定地替换lncRNA，而且可以替换结合至lncRNA的PRC2。在替换之后，PRC2的完整补体在高达24小时之内未恢复。另外，lncRNA能够以顺式方式募集PRC2，从而阻抑转录lncRNA的特定染色体基因座处或附近的基因表达。
在一些实施例中，提供调节基因表达的方法，这些方法可以在体外、离体或体内执行。应理解，整个说明书中对化合物的用途的任何提及涵盖所述化合物在制备用于治疗与APOA1或ABCA1的降低的水平或活性相关联的病症(例如，血脂异常、动脉粥样硬化)的药物组合物或药剂的中的用途。因此，作为一个非限制性实例，本发明的这个方面包括这类单链寡核苷酸在制备用于治疗疾病的药剂中的用途，其中该治疗包括上调APOA1或ABCA1的表达。
在本发明的另外的方面，提供用于选择用于激活APOA1或ABCA1的表达的候选寡核苷酸的方法。这些方法通常包括选择包括与PRC2相关区互补的核苷酸序列(例如，如SEQ ID NO：9至194中任一个中给出的核苷酸序列)的单链寡核苷酸作为候选寡核苷酸。在一些实施例中，可以选择富集了激活APOA1或ABCA1的表达的寡核苷酸(例如，与随机寡核苷酸选择相比较)的多组寡核苷酸。
用于调节APOA1或ABCA1的表达的单链寡核苷酸
在本发明的一个方面，提供用于调节细胞内APOA1或ABCA1的表达的、与PRC2相关区互补的单链寡核苷酸。在一些实施例中，上调或提高APOA1或ABCA1的表达。在一些实施例中，与这些PRC2相关区互补的单链寡核苷酸抑制PRC2与长的RNA转录物的相互作用，以使得上调或提高基因表达。在一些实施例中，与这些PRC2相关区互补的单链寡核苷酸抑制PRC2与长的RNA转录物的相互作用，从而导致组蛋白H3的减少的甲基化以及减少的基因失活，这样使得上调或提高基因表达。在一些实施例中，这种相互作用可能因防止或减少结合至PRC2的长的RNA的结构的变化而被破坏或抑制。可以使用在此披露用于选择用于激活APOA1或ABCA1的表达的候选寡核苷酸的任何方法来选择寡核苷酸。
该单链寡核苷酸可以包括与SEQ ID NO：9-194中任一个中给出的核苷酸序列的PRC2相关区互补的互补区。该单链寡核苷酸的互补区可以与PRC2相关区的至少6、例如至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或更多个连续核苷酸互补。
PRC2相关区可以定位至染色体中在APOA1或ABCA1基因的5’端上游50千碱基与APOA1或ABCA1基因的3’端下游50千碱基之间的位置。PRC2相关区可以定位至染色体中在APOA1或ABCA1基因的5’端上游25千碱基与APOA1或ABCA1基因的3’端下游25千碱基之间的位置。PRC2相关区可以定位至染色体中在APOA1或ABCA1基因的5’端上游12千碱基与APOA1或ABCA1基因的3’端下游12千碱基之间的位置。PRC2相关区可以定位至染色体中在APOA1或ABCA1基因的5’端上游5千碱基与APOA1或ABCA1基因的3’端下游12千碱基之间的位置。
所选择的PRC2相关区相对于APOA1或ABCA1基因的基因组位置可以变化。例如，PRC2相关区可以位于APOA1或ABCA1基因的5’端上游。PRC2相关区可以位于APOA1或ABCA1基因的3’端下游。PRC2相关区可以位于APOA1或ABCA1基因的内含子内。PRC2相关区可以位于APOA1或ABCA1基因的外显子内。PRC2相关区可以横跨APOA1或ABCA1基因的内含子-外显子接点、5’-UTR-外显子接点或3’-UTR-外显子接点。
该单链寡核苷酸可以包括具有式X-Y-Z的序列，其中X为任何核苷酸，Y为非为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为具有变化的长度的核苷酸序列。在一些实施例中，X为寡核苷酸的5’核苷酸。在一些实施例中，当X锚定在寡核苷酸的5’端时，寡核苷酸不具有在5’连接至X的任何核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施例中，其他化合物如肽类或固醇类在这个实施例中可以连接在5’端上，只要它们不为核苷酸或核苷酸类似物即可。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有序列5’X-Y-Z并且长度为8至50个核苷酸。预测具有这些序列特征的寡核苷酸以便避免miRNA路径。因此，在一些实施例中，具有这些序列特征的寡核苷酸不可能具有在细胞内起到miRNA分子作用的不期望的结果。Y序列可以为表1中给出的长度为6个核苷酸的核苷酸序列。
该单链寡核苷酸可以具有不合有尿苷核苷酸伸展段(例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个连续鸟苷核苷酸)的序列。在一些实施例中，与不具有鸟苷核苷酸伸展段的寡核苷酸相比较，具有鸟苷核苷酸伸展段的寡核苷酸具有提高的非特异性结合和/或脱靶效应。
该单链寡核苷酸可以具有与具有相等长度的每个核苷酸序列具有小于阈值水平的序列一致性的序列，这些核苷酸定位至涵盖或接近脱靶基因的基因组位置。例如，寡核苷酸可以被设计来确保其不具有定位至涵盖或接近除APOA1或ABCA1之外的所有已知基因(例如，所有已知蛋白编码基因)的基因组位置的序列。在类似的实施例中，寡核苷酸可以被设计来确保其不具有定位至任何其他已知的PRC2相关区、尤其是与任何其他已知基因(例如，任何其他已知的蛋白编码基因)在功能上相关的PRC2相关区的序列。在任一种情况下，该寡核苷酸有望具有降低的具有脱靶效应的可能性。阈值水平的序列一致性可以为50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列一致性。
该单链寡核苷酸可以具有与编码RNA的PRC2相关区互补的序列，RNA形成包括至少两个单链环的二级结构。已发现，在一些实施例中，与编码形成包括一个或多个单链环(例如，至少两个单链环)的二级结构的RNA的PRC2相关区互补的寡核苷酸具有活性(例如，能够激活或增强靶基因的表达)的可能性大于随机选择的寡核苷酸。在一些情况下，该二级结构可以包括该至少两个单链环之间的双链茎。因此，该寡核苷酸与该PRC2相关区之间的互补区可以位于编码至少一个环的至少一部分的该PRC2相关区的位置。在一些情况下，该寡核苷酸与该PRC2相关区之间的互补区可以位于编码至少两个环的至少一部分的该PRC2相关区的位置。在一些情况下，该寡核苷酸与该PRC2相关区之间的互补区可以位于编码双链茎的至少一部分的该PRC2相关区的位置。在一些实施例中，(例如，lncRNA的)PRC2相关区被鉴别(例如，使用RIP-Seq方法或来自其的信息)。在一些实施例中，含有该PRC2相关区的预测的二级结构RNA(例如，lncRNA)使用RNA二级结构预测算法例如RNAfold、mfold来确定。在一些实施例中，寡核苷酸被设计来靶向形成包括一个或多个单链环(例如，至少两个单链环)结构的二级结构的RNA的区域，该一个或多个单链环结构可以包括该至少两个单链环之间的双链茎。
该单链寡核苷酸可以具有G-C含量大于30％，G-C含量大于40％，G-C含量大于50％，G-C含量大于60％，G-C含量大于70％或G-C含量大于80％的序列。该单链寡核苷酸可以具有G-C含量高达100％，G-C含量高达95％，G-C含量高达90％或G-C含量高达80％的序列。在其中寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸的一些实施例中，该PRC2相关区的互补序列中除1、2、3、4或5个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或鸟苷核苷酸。在一些实施例中，与该单链寡核苷酸互补的该PRC2相关区的序列包括至多3个选自腺嘌呤和尿嘧啶的核苷酸。
该单链寡核苷酸可以与不同物种(例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、猴子等)的染色体在涵盖或接近所述物种的APOA1或ABCA1的同源物的位置处互补。该单链寡核苷酸可以与涵盖或接近该APOA1或ABCA1基因的人基因组区互补并且还可以与涵盖或接近小鼠的APOA1或ABCA1的同源物的小鼠基因组区互补。例如，该单链寡核苷酸可以与如SEQ IDNO：1、2、5或6中给出的、为涵盖或接近该APOA1或ABCA1基因的人基因组区的序列互补，并且还可以与如SEQ ID NO：3或4中给出的、为涵盖或接近小鼠的APOA1或ABCA1基因的同源物的小鼠基因组区的序列互补。可以在多种物种(例如，人和小鼠)中体内或体外测试具有这些特征的寡核苷酸的功效。这种方法还有助于通过选择疾病存在的适当动物的物种来开发用于治疗人疾病的临床候选物。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸的互补区与PRC2相关区的至少8至15、8至30、8至40、或10至50、或5至50、或5至40个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续核苷酸互补。在一些实施例中，该互补区与PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补。在一些实施例中，该单链寡核苷酸的序列是基于结合至PRC2的RNA序列，或其一部分，所述部分具有从5至40个连续碱基对，或约8至40个碱基，或约5至15，或约5至30，或约5至40个碱基，或约5至50个碱基的长度。
如本领域中所使用的术语互补是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸的某一位置处的核苷酸能够与PRC2相关区的相同位置处的核苷酸氢键合，那么该单链核苷酸和PRC2相关区被认为彼此在那个位置处互补。该单链核苷酸和PRC2相关区在每个分子中足量的相应位置被可以通过它们的碱基彼此氢键合的核苷酸占据时彼此互补。因此，“互补”为以下这样的术语：用于指示足够程度的互补性或精确配对，以使得在该单链核苷酸与PRC2相关区之间发生稳定且特异性的结合。例如，如果单链核苷酸的位置处的碱基能够与PRC2相关区的相应位置处的碱基氢键合，那么这些碱基被认为彼此在那个位置处互补。100％互补性是不需要的。
该单链寡核苷酸可以与PRC2相关区的连续核苷酸至少80％(任选地，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的一个)互补。在一些实施例中，与PRC2相关区的连续核苷酸的部分相比较，该单链寡核苷酸可以含有1、2或3个碱基错配。在一些实施例中，该单链寡核苷酸在15个碱基上可以具有至多3个错配，或在10个碱基上具有至多2个错配。
本领域中应理解，互补核苷酸序列不必与其可特异性杂交的靶标的核苷酸100％互补。在一些实施例中，出于本披露的目的，互补核酸序列在该序列与靶分子(例如，lncRNA)的结合干扰靶标(例如，lncRNA)的正常功能以致损失活性(例如，抑制PRC2相关阻抑作用，从而导致基因表达上调)时是可特异性杂交的，并且在以下条件下存在足够程度的互补性来避免该序列与非靶序列的非特异性结合：其中非特异性结合的避免是希望的，例如，在体内测定或治疗性治疗情况下以及体外测定情况下的生理条件下，在测定在适合的严格条件下进行时的条件下。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。在优选的实施例中，该寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
在一些实施例中，该PRC2相关区出现在与基因序列(有义)相同的DNA链上。在一些实施例中，该PRC2相关区出现在与基因序列(反义)相反的DNA链上。与PRC2相关区互补的寡核苷酸可以结合有义或反义序列。碱基配对可以包括标准的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对和非沃森-克里克碱基配对(例如，摇摆碱基配对(Wobble base pairing)和胡斯坦碱基配对(Hoogsteen base pairing))两者。应理解，对于互补碱基配对，腺苷型碱基(A)与胸苷型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)互补，胞嘧啶型碱基(C)与鸟苷型碱基(G)互补，并且通用碱基如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚可以杂交至任何A、C、U或T并且被认为与它们互补。肌苷(I)在本领域中也被认为是一种通用碱基并且被认为与任何A、C、U或T互补。
在一些实施例中，在此提供的序列、包括序列表中提供的序列中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸(或其修饰的核苷酸)或尿苷(U)核苷酸(或其修饰的核苷酸)可以用适于与腺苷核苷酸碱基配对(例如，经由沃森-克里克碱基配对)的任何其他核苷酸来置换。在一些实施例中，在此提供的序列、包括序列表中提供的序列中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸(或其修饰的核苷酸)或尿苷(U)核苷酸(或其修饰的核苷酸)可以用不同的嘧啶核苷酸来适当地置换或反之亦然。在一些实施例中，在此提供的序列、包括序列表中提供的序列中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸(或其修饰的核苷酸)可以用尿苷(U)核苷酸(或其修饰的核苷酸)来适当地置换或反之亦然。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸的GC含量优选地在约30％至60％之间。三个或更多个G或C的连续延伸段在一些实施例中可能不是优选的。因此，在一些实施例中，该寡核苷酸不包括三个或更多个鸟苷核苷酸的伸展段。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸特异性结合至在基因组(例如，人基因组)中编码作为单一的连续转录物(例如，非剪接RNA)的RNA或与其互补。在一些实施例中，该单链寡核苷酸特异性结合至在基因组(例如，人基因组)中编码的RNA或与其互补，其中基因组中在该RNA的编码区的5’端与该RNA的编码区的3’端之间的距离小于1kb，小于2kb，小于3kb，小于4kb，小于5kb，小于7kb，小于8kb，小于9kb，小于10kb或小于20kb。
应理解，可以排除在此提供的任何寡核苷酸。在一些实施例中，单链寡核苷酸不与SEQ ID NO：187522互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸不与SEQ ID NO：187523互补。
在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：80的核苷酸36至3115或3159至4038内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：83的核苷酸1至160或197至4056内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：84的核苷酸1至4008或4045至4046内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：91的核苷酸1至76或114至4045内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：92的核苷酸1至743或781至4045内的一个序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：93的核苷酸1至253或295至2316或2354至4046内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：94的核苷酸1至413或455至2476或2514至4047内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：95的核苷酸1至1421或1463至3484或3522至4024内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：96的核苷酸1至2821或2863至4042内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：97的核苷酸1至3646或3688至4023内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：183的核苷酸1至67或111至3141或3198至3428或3519至4050内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：184的核苷酸1至1199或1256至1486或1577至4044内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：191的核苷酸1至419或494至2471或2508至4074内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：192的核苷酸1至787或824至4058内的序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：193的核苷酸1至3029或3067至4041内的一个序列互补。在一些实施例中，单链寡核苷酸与SEQ ID NO：194的核苷酸1至2546或2584至4040内的序列互补。
在一些实施例中，已发现，在此披露的单链寡核苷酸可以将与基因对应的mRNA的表达提高至少约50％(即，正常值150％或1.5倍)或约2倍至约5倍。在一些实施例中，考虑了表达可以提高至少约15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍，或任何前述数字之间的任何范围。还发现，提高的mRNA表达已被示出与提高的蛋白表达相关。
在此描述的寡核苷酸的一些或任何实施例或用于设计或合成它们的方法中，这些寡核苷酸将上调基因表达并且可以特异性结合至或特异性杂交至转录自与蛋白编码参考基因相同的链的PRC2结合RNA或与其互补。该寡核苷酸可以结合至PRC2结合RNA的区，该区起源于参考基因(refGene)的蛋白编码有义链的内含子、外显子、内含子外显子接点、5′UTR、3′UTR、翻译起始区或翻译终止区或与它们重叠。
在此描述的寡核苷酸的一些或任何实施例或用于设计或合成它们的方法中，这些寡核苷酸将上调基因表达并且可以特异性结合至或特异性杂交至转录自蛋白编码参考基因的相反链(反义链)的PRC2结合RNA或与其互补。该寡核苷酸可以结合至PRC2结合RNA的区，该区起源于一个参考基因的蛋白编码反义链的内含子、外显子、内含子外显子接点、5′UTR、3′UTR、翻译起始区或翻译终止区或与它们重叠。
可以修饰在此描述的寡核苷酸，寡核苷酸例如包括修饰的糖部分、修饰的核苷间键、修饰的核苷酸和/或其组合。此外，这些寡核苷酸可以展现出以下特性中的一种或多种：不诱导靶RNA的实质性裂解或降解；不引起靶RNA的基本完全的裂解或降解；不激活RNA酶H路径；不激活RISC：不募集任何Argonaute家族蛋白；不被Dicer裂解；不介导替代的剪接；没有免疫刺激性；具有核酸酶抗性；与未修饰的寡核苷酸相比较，具有提高的细胞吸收；对细胞或哺乳动物无毒；可以具有改进的内体排出(endosomal exit)；干扰lncRNA与PRC2、优选地Ezh2亚单位，但任选地Suz12、Eed、RbAp46/48亚单位或辅助因子如Jarid2的相互作用；减少组蛋白H3赖氨酸27甲基化和/或上调基因表达。
设计来与RNA相互作用以调节基因表达的寡核苷酸为与设计来结合DNA靶标(例如，与转录RNA的潜在的基因组DNA序列互补)的那些相异的碱基序列的子集。
在此披露的任何寡核苷酸可以通过接头例如可裂解接头来连接至在此披露的一个或多个其他寡核苷酸。
用于选择用于激活APOA1或ABCA1的表达的候选寡核苷酸的方法
在此提供了用于选择用于激活或增强APOA1或ABCA1的表达的候选寡核苷酸的方法。目标选择方法通常可以包括用于选择具有在此披露的任何结构和功能特征的单链寡核苷酸的步骤。典型地，这些方法包括旨在鉴别寡核苷酸的一个或多个步骤，这些寡核苷酸靶向与APOA1或ABCA1功能相关的PRC2相关区，例如，lncRNA的PRC2相关区，该lncRNA通过促进(例如，以顺式调控方式)将PRC2募集至APOA1或ABCA1基因来调控APOA1或ABCA1的表达。这类寡核苷酸有望成为用于激活APOA1或ABCA1的表达的候选物，因为它们具有与核酸(例如，lncRNA)的PRC2相关区杂交的能力。在一些实施例中，这种杂交事件被理解成是破坏PRC2与该核酸(例如，lncRNA)的相互作用，并且因此破坏了PRC2以及其相关共阻抑物(例如，染色质重建因子)至APOA1或ABCA1基因座的募集。
选择候选寡核苷酸的方法可以包括选择定位至涵盖或接近APOA1或ABCA1基因的染色体位置(例如，具有如SEQ ID NO：9-194中任一个中给出的序列的染色体位置)的PRC2相关区(例如，如SEQ ID NO：9至194中任一个中给出的核苷酸序列)。该PRC2相关区可以定位至染色体的包括APOA1或ABCA1基因的有义链的链，在这种情况下，候选寡核苷酸与APOA1或ABCA1基因的有义链互补(即，对于该APOA1或ABCA1基因反义)。可替代地，该PRC2相关区可以定位至第一染色体的包括该APOA1或ABCA1基因的反义链的链，在这种情况下，寡核苷酸与该APOA1或ABCA1基因的反义链(模板链)互补(即，对于该APOA1或ABCA1基因有义)。
用于选择富集了激活APOA1或ABCA1的表达的寡核苷酸的一组候选寡核苷酸的方法可以包括选择定位至涵盖或接近该APOA1或ABCA1基因的染色体位置的一个或多个PRC2相关区，并且选择一组寡核苷酸，其中该组中的每个寡核苷酸包括与该一个或多个PRC2相关区互补的核苷酸序列。如在此所使用，短语“富集了激活...的表达的寡核苷酸的一组寡核苷酸”是指与具有与富集组相同的物理化学特性(例如，相同的GC含量、Tm、长度等)的随机选择的寡核苷酸相比较，激活靶基因(例如，APOA1或ABCA1)的表达的寡核苷酸的数量更大的一组寡核苷酸。
在单链寡核苷酸的设计和/或合成包括与通过这类序列信息描述的核酸或PRC2相关区互补的一个序列的设计和/或合成时，技术人员能够容易地例如通过对形成本领域中公知的常识的一部分的沃森-克里克碱基配对规则的理解来确定互补序列。
在一些实施例中，单链寡核苷酸的设计和/或合成包括通过本领域技术人员已知的技术来从起始材料制备寡核苷酸，其中该合成可以是基于PRC2相关区的序列或其一部分。
单链寡核苷酸的设计和/或合成的方法包括以下一个或多个步骤：
鉴别和/或选择PRC2相关区；
设计具有希望程度的与PRC2相关区或其一部分的序列一致性或互补性的核酸序列；
将单链寡核苷酸合成为所希望的序列；
纯化该合成的单链寡核苷酸；并且
任选地将该合成的单链寡核苷酸与至少一种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂混合以形成药物组合物或药剂。
如此设计和/或合成的单链寡核苷酸可以在如在此所描述调节基因表达的方法中使用。
优选地，本发明的单链寡核苷酸为化学合成的。用于实践本发明的寡核苷酸可以通过众所周知的化学合成技术来体内合成。
本发明的寡核苷酸可以如通过结合修饰例如核苷酸修饰来稳定化而免于溶核降解。例如，本发明的核酸序列包括核苷酸序列的5′或3′端处的硫代磷酸酯的至少第一、第二或第三核苷酸间键。作为另一个实例，该核酸序列可以包括2′-修饰的核苷酸，例如，2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基(2′-O-MOE)、2′-O-氨基丙基(2′-O-AP)、2′-O-二甲基氨基乙基(2′-O-DMAOE)、2′-O-二甲基氨基丙基(2′-O-DMAP)、2′-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2′-O-DMAEOE)或2′-O--N-甲基乙酰胺基(2′-O-NMA)。作为另一个实例，该核酸序列可以包括至少一个2′-O-甲基-修饰的核苷酸，并且在一些实施例中，所有核苷酸包括2′-O-甲基修饰。在一些实施例中，核酸为“锁定的”，即，包括其中核糖环通过连接2’-O原子和4’-C原子的亚甲基桥“锁定的”核酸类似物。
应理解，在此描述的单链寡核苷酸的任何修饰的化学性质或形式可以彼此组合，并且一个、两个、三个、四个、五个或更多个不同类型的修饰可以被包括在同一分子中。
在一些实施例中，该方法可以进一步包括以下步骤：扩增该合成的单链寡核苷酸，和/或纯化单链寡核苷酸(或扩增的单链寡核苷酸)和/或对如此获得的单链寡核苷酸测序。
因此，制备单链寡核苷酸的方法可以为用于制备治疗疾病中使用的药物组合物或药剂的方法，任选地，其中该治疗包括调节与PRC2相关区相关联的基因的表达。
在上文所述方法中，PRC2相关区可以是或已通过包括鉴别结合至PRC2的RNA的方法来鉴别或获得。
这类方法可以包括以下步骤：提供含有核糖核酸的样品，将该样品与特异性结合至PRC2或其亚单位的试剂接触，允许在该试剂与该样品中的蛋白之间形成复合物，分配这些复合物，合成与这些复合物中存在的核酸互补的核酸。
在该单链寡核苷酸是基于PRC2相关区或这种序列的一部分时，该单链寡核苷酸可能是基于与那个序列有关的信息，例如，书面形式或电子形式可获得的序列信息，这些信息可以包括公开可获得的科学出版物或序列数据库中含有的序列信息。
核苷酸类似物
在一些实施例中，该寡核苷酸可以包括至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸和/或至少一个桥连核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸可以包括桥连核苷酸如锁定核酸(LNA)核苷酸、约束的乙基(cEt)核苷酸或亚乙基桥连核酸(ENA)核苷酸。这类核酸的实例在此披露并且在本领域中是已知的。在一些实施例中，该寡核苷酸包括以下美国专利或专利申请公开中的一个中披露的核苷酸类似物：US 7,399,845、US7,741,457、US 8,022,193、US 7,569,686、US 7,335,765、US 7,314,923、US 7,335,765以及US 7,816,333、US 20110009471，每个专利申请的全部内容出于所有目的通过引用结合在此。该寡核苷酸可以具有一个或多个2’O-甲基核苷酸。该寡核苷酸可以完全由2’O-甲基核苷酸组成。
该单链寡核苷酸经常具有一个或多个核苷酸类似物。例如，与不具有至少一个核苷酸类似物的寡核苷酸相比较，该单链寡核苷酸可以具有导致该寡核苷酸的Tm在1℃、2℃、3℃、4℃或5℃范围内的升高的至少一种核苷酸类似物。与不具有核苷酸类似物的寡核苷酸相比较，该单链寡核苷酸可以具有导致该寡核苷酸的Tm在2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或更大的范围内的总升高的多种核苷酸类似物。
该寡核苷酸可以具有的长度为多达50个核苷酸，其中该寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30、2至40、2至45个或更多个核苷酸为核苷酸类似物。该寡核苷酸可以具有的长度为8至30个核苷酸，其中该寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30个核苷酸为核苷酸类似物。
该寡核苷酸可以具有的长度为8至15个核苷酸，其中该寡核苷酸的2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、2至11、2至12、2至13、2至14个核苷酸为核苷酸类似物。任选地，这些寡核苷酸可以具有每个核苷酸，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰的核苷酸。
该寡核苷酸可以完全由桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)组成。该寡核苷酸可以包括交替的脱氧核糖核苷酸与2’-氟-脱氧核糖核苷酸。该寡核苷酸可以包括交替的脱氧核糖核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。该寡核苷酸可以包括交替的脱氧核糖核苷酸与ENA核苷酸类似物。该寡核苷酸可以包括交替的脱氧核糖核苷酸与LNA核苷酸。该寡核苷酸可以包括交替的LNA核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。该寡核苷酸可以具有为桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸，cEt核苷酸，ENA核苷酸)的5’核苷酸。该寡核苷酸可以具有为脱氧核糖核苷酸的5’核苷酸。
该寡核苷酸可以包括通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)侧接的脱氧核糖核苷酸。该寡核苷酸可以包括通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的1、2、3、4、5、6、7、8或更多个桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)侧接的脱氧核糖核苷酸。该寡核苷酸的3’位置可以具有3’羟基。该寡核苷酸的3’位置可以具有3’硫代磷酸酯。
该寡核苷酸可以用标签缀合。例如，该寡核苷酸可以用生物素部分、胆固醇、维生素A、叶酸、σ受体配体、适体、肽、如CPP、疏水性分子如脂质、ASGPR或动态多聚缀合物以及其变体在5’或3’端处缀合。
优选地，该单链寡核苷酸包括一个或多个修饰，包括：修饰的糖部分、和/或修饰的核苷间键、和/或修饰的核苷酸和/或其组合。给定寡核苷酸的所有位置不必是均匀修饰的，并且事实上在此描述的一个以上修饰可以结合在单个寡核苷酸中或甚至是寡核苷酸的单个核苷内。
在一些实施例中，这些单链寡核苷酸为含有各自由至少一个核苷酸构成的两个或更多个化学相异区域的嵌合寡核苷酸。这些寡核苷酸典型地含有具有修饰的核苷酸的至少一个区域，这些修饰的核苷酸赋予一个或多个有益特性(例如像，提高的核酸酶抗性、提高的细胞吸收、对靶标的提高的结合亲和力)；以及为能够裂解RNA：DNA或RNA：RNA杂合体的酶的底物的区域。本发明的嵌合的单链寡核苷酸可以形成为具有两个或更多个寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或如上所述的寡核苷酸模拟物的复合结构。这类化合物在本领域中还被称为杂合体或缺口体(gapmer)。传授这类杂合结构的制备的代表性美国专利包括但不限于US专利号5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356以及5,700,922，每个专利通过引用结合在此。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括在糖的2′位置处修饰的至少一个核苷酸，最优选地为2′-O-烷基、2′-O-烷基-O-烷基或2′-氟修饰的核苷酸。在其他优选的实施例中，RNA修饰包括嘧啶的核糖、RNA的3′端处的无碱基残基或倒置碱基上的2′-氟、2′-氨基以及2′O-甲基修饰。这类修饰按照常规结合到寡核苷酸中并且这些寡核苷酸已显示针对给定靶标具有比2′-脱氧寡核苷酸更高的Tm(即，更高的靶标结合亲和力)。
多个核苷酸和核苷修饰已显示使得结合它们的寡核苷酸对核酸酶消化比天然寡聚脱氧核苷酸具有更大的抗性；这些修饰的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整存留更长的时间。修饰的寡核苷酸的具体的实例包括以下那些，它们包括修饰的主链，例如，硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。最优选的是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的那些，尤其是CH2-NH-O-CH2、CH、～N(CH3)～O～CH2(已知为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链，CH2--O--N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2以及O-N(CH3)-CH2-CH2主链，其中天然的磷酸二酯主链表示为O-P--O-CH)；酰胺主链(参见De Mesmaeker等人，化学研究述评(Ace.Chem.Res.)1995，28：366-374)；吗啉代主链结构(参见萨默顿(Summerton)和韦勒(Weller)，美国专利号5,034,506)；肽核酸(PNA)主链(其中寡核苷酸的磷酸二酯主链由聚酰胺主链置换，核苷酸直接或间接地结合至该聚酰胺主链的氮杂氮原子，参见尼尔森(Nielsen)等人，科学(Science)1991，254，1497)。含磷的键包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯以及手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯，以及具有正常3′-5′键的硼烷磷酸酯、这些硼烷磷酸酯的2′-5′连接类似物，以及其中相邻对的核苷单位以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′来连接的、具有反向极性的那些，参见美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361以及5,625,050。
基于吗啉代的低聚化合物在达万·A·布万其(Dwaine A.Braasch)和大卫·R·科里(David R.Corey)，生物化学(Biochemistry)，2002，41(14)，4503-4510)；发生学(Genesis)，第30卷，第3期，2001；希斯曼(Heasman)，发育生物学期刊(J.，Dev.Biol.)，2002，243，209-214；纳维斯(Nasevicius)等人，自然-遗传学(Nat.Genet.)，2000，26，216-220；拉切拉(Lacerra)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，2000，97，9591-9596；以及1991年7月23日颁予的美国专利号5,034,506中进行描述。在一些实施例中，基于吗啉代的低聚化合物为二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)(例如，如在艾弗森(Iverson)，分子治疗学新见(Curr.Opin.Mol.Ther.)，3：235-238，2001以及王(Wang)等人，基因医学杂志(J.Gene Med.)，12：354-364，2010中进行描述；这些参考文献的披露内容通过引用以其全部内容结合在此)。
王等人，美国化学学会期刊(J.Am.Chem.Soc.)，2000，122，8595-8602中描述了环己烯基核酸寡核苷酸模拟物。
其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子以及烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些主链包括具有吗啉代键(部分地由核苷的糖部分形成)的那些主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜以及砜主链；甲酰乙酰基以及硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基以及硫代甲酰乙酰基主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基以及亚甲基肼基主链；磺酸酯以及磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合N、O、S以及CH2组成部分的其他主链，参见美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，每个专利通过引用结合在此。
还已知包括基于阿糖核苷酸(arabinonucleotide)或修饰的阿糖核苷酸残基或由它们构建的寡核苷酸的修饰的寡核苷酸。阿糖核苷为核糖核苷的立体异构体，不同之处仅在于糖环的2′位置处的构型。在一些实施例中，2′-阿糖修饰为2′-F阿糖。在一些实施例中，修饰的寡核苷酸为2’-氟-D-阿糖核酸(FANA)(如例如在洛恩(Lon)等人，生物化学，41：3457-3467，2002和Min等人，生物有机化学与医药化学通讯，12：2651-2654，2002中所描述；这些参考文献的披露内容通过引用以其全部内容结合在此)。类似的修饰还可以在糖的其他位置处、尤其是3′末端核苷上糖的3′位置或在2′-5′连接的寡核苷酸以及5′末端核苷酸的5′位置上进行。
PCT公开号WO 99/67378披露了经由缔合至互补信使RNA而用于基因表达的提高的序列特异性抑制的阿糖核酸(ANA)低聚物以及其类似物。
其他优选的修饰包括亚乙基桥连的核酸(ENA)(例如，国际专利公开号WO 2005/042777，森田(Morita)等人，核酸研究(Nucleic Acid Res.)，增刊1：241-242，2001；苏罗诺(Surono)等人，人类基因治疗(Hum.GeneTher.)，15：749-757，2004；小泉(Koizumi)，分子治疗学新见，8：144-149，2006以及堀江(Horie)等人，核酸研讨会丛刊(Nucleic Acids Symp.Ser)(Oxf)，49：171-172，2005；这些参考文献的披露内容通过引用以其全部内容结合在此)。优选的ENA包括但不限于2′-O，4′-C-亚乙基-桥连的核酸。
LNA的实例在WO/2008/043753中进行描述并且包括具有以下通式的化合物。
其中X和Y独立地选自基团-O-、
-S-、-N(H)-、N(R)-、-CH2-或-CH-(如果是双键的一部分)，
-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2-或-CH2-CH-(如果是双键的一部分)，
-CH＝CH-，其中R选自氢和C1-4-烷基；Z和Z＊独立地选自核苷间键、末端基团或保护基团；B构成天然或非天然的核苷酸碱基部分；并且在任一取向上都可以找到不对称的基团。
优选地，在此描述的寡核苷酸中所使用的LNA包括至少一个根据以下任一式的LNA单位
其中Y为-O-、-S-、-NH-或N(RH)；Z和Z＊独立地选自核苷间键、末端基团或保护基团；B构成天然或非天然的核苷酸碱基部分，并且RH选自氢和C1-4-烷基。
在一些实施例中，在此描述的寡核苷酸中所使用的锁定核酸(LNA)根据PCT/DK 2006/000512的方案2中所示的任一式包括至少一个锁定核酸(LNA)单位。
在一些实施例中，本发明的低聚物中所使用的LNA包括选自-0-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-0-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-0-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-0-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-的核苷间键，其中RH选自氢和C1-4-烷基。
方案2中示出了特别优选的LNA单位：
方案2
术语“硫代-LNA”包括锁定核苷酸，其中以上通式中X或Y中的至少一个选自S或-CH2-S-。硫代-LNA可以为β-D和α-L-构型两者。
术语“氨基-LNA”包括锁定核苷酸，其中以上通式中X或Y中的至少一个选自-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-以及-CH2-N(R)-，其中R选自氢和C1-4-烷基。氨基-LNA可以为β-D和α-L-构型两者。
术语“氧基-LNA”包括锁定核苷酸，其中以上通式中X或Y中的至少一个表示-O-或-CH2-O-。氧基-LNA可以为β-D和α-L-构型两者。
术语“ena-LNA”包括一个锁定核苷酸，其中以上通式中的Y为-CH2-O-(其中-CH2-O-的氧原子相对于碱基B附接至2′位置上)。
在此描述了LNA的另外的细节。
还可以包括一个或多个取代的糖部分，例如，在2′位置上的以下各项中的一个：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n为从1至约10；C1至C10低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA裂解基团；报告子基团；插入子；用于提高寡核苷酸的药物代谢动力学特性的基团；或用于提高寡核苷酸的药效学特性的基团以及具有类似特性的其他取代基。优选的修饰包括2′-甲氧基乙氧基[2′-0-CH2CH2OCH3，又称为′-O-(2-甲氧基乙基)](马丁(Martin)等人，瑞士化学学报(HeIv.Chim.Acta)，1995，78，486)。其他优选的修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-丙氧基(2′-OCH2CH2CH3)以及2′-氟(2′-F)。类似的修饰还可以在该寡核苷酸的其他位置处、尤其是3′末端核苷酸上糖的3′位置以及5′末端核苷酸的5′位置上进行。寡核苷酸还可以具有糖模拟物如环丁基来代替戊呋喃糖基。
单链寡核苷酸还可以另外或可替代地包括核碱基(本领域中经常简单地称为“碱基”)修饰或取代。如在此所使用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括在天然核酸中仅偶尔或短暂地发现的核碱基，例如，次黄嘌呤，6-甲基腺嘌呤，5-Me嘧啶，尤其是5-甲基胞嘧啶(又称为5-甲基-2′脱氧胞嘧啶并且在本领域中经常称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC以及龙胆二糖基(gentobiosyl)HMC、异胞嘧啶、假异胞嘧啶以及合成核碱基，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤以及2，6-二氨基嘌呤或其他二氨基嘌呤。参见，例如，科恩伯格(Kornberg)，“DNA复制(DNAReplication)”，W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman&Co.)，旧金山(SanFrancisco)，1980，第75至77页；以及格贝耶胡·冈加(Gebeyehu，G.)等人，核酸研究，15：4513(1987))。还可以包括本领域中已知的“通用”碱基例如肌苷。已显示5-Me-C取代可将核酸双链体稳定性提高0.6℃至1.2℃。(赛格维(Sanghvi)在克鲁克(Crooke)和勒布勒(Lebleu)编著的反义研究与应用(Antisense Research and Applications)，CRC出版社(CRC Press)，博卡拉顿(Boca Raton)，1993，第276至278页)并且可以用作碱基取代。
给定寡核苷酸的所有位置不必是均匀修饰的，并且事实上在此描述的一个以上修饰可以结合在单个寡核苷酸中或甚至是寡核苷酸的单个核苷内。
在一些实施例中，核苷酸单位的糖和核苷间键(即，主链)都被新基团置换。保持碱基单位以便与适当的核酸靶化合物杂交。已显示具有优异的杂交特性的寡核苷酸模拟物的这样一种低聚化合物称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含酰胺的主链例如氨基乙基甘氨酸主链置换。核碱基被保持并且直接或间接地结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子。传授PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331以及5,719,262，每个专利通过引用结合在此。PNA化合物的另外的传授可以见尼尔森等人，科学，1991，254，1497-1500。
单链寡核苷酸还可以包括一个或多个核碱基(本领域中经常简单地称为“碱基”)修饰或取代。如在此所使用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成以及天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶，6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-卤基、8-氨基、8-氢硫基、8-硫烷基、8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基尤其5-溴、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤、以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱杂氮腺嘌呤。
另外，核碱基包括在美国专利号3,687,808中披露的那些核碱基、在“聚合物科学与工程简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of PolymerScience and Engineering)”，第858至859页，克洛舍维奇(Kroschwitz)编著，约翰威利出版公司(John Wiley&Sons)，1990年中披露的那些核碱基、在英利奇(Englisch)等人，应用化学(Angewandte Chemie)，国际版，1991，30，第613页中披露的那些核碱基、以及在赛格维，第15章，反义研究与应用，第289至302页，克鲁克和勒布勒编著，CRC出版社，1993中披露的那些核碱基。这些核碱基中的某一些尤其适用于增加本发明的低聚化合物的结合亲和力。这些核碱基包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6以及O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代可将核酸双链体稳定性提高0.6℃至1.2℃(赛格维等人编著，“反义研究与应用”，CRC出版社，博卡拉顿，1993，第276至278页)并且是目前优选的碱基取代，在与2′-O-甲氧基乙基糖修饰相结合时甚至更特别如此。修饰的核碱基在美国专利号3,687,808以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692以及5,681,941中进行描述，每个专利通过引用结合在此。
在一些实施例中，单链寡核苷酸化学连接至增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的一种或多种部分或缀合物。例如，类型相同或不同的一种或多种单链寡核苷酸可以彼此缀合；或单链寡核苷酸可以缀合至对细胞类型或组织类型具有增强的特异性的靶向部分。这类部分包括但不限于脂质部分如胆固醇部分(勒辛格(Letsinger)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1989，86，6553-6556)；胆酸(马诺哈兰(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学通讯，1994，4，1053-1060)；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(马诺哈兰等人，纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，1992，660，306-309；马诺哈兰等人，生物有机化学与医药化学通讯，1993，3，2765-2770)；硫代胆固醇(奥伯豪泽尔(Oberhauser)等人，核酸研究，1992，20，533-538)；脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(卡巴诺夫(Kabanov)等人，欧洲生物化学学会联盟简讯，1990，259，327-330；斯伍那区克(Svinarchuk)等人，法国生物化学杂志(Biochimie)，1993，75，49-54)；磷脂，例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-邻-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(马诺哈兰等人，四面体快报(Tetrahedron Lett.)，1995，36，3651-3654；谢伊(Shea)等人，核酸研究，1990，18，3777-3783)；聚胺或聚乙二醇链(马诺哈兰等人，核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)，1995，14，969-973)或金刚烷乙酸(马诺哈兰等人，四面体快报，1995，36，3651-3654)；棕榈基部分(米谢拉(Mishra)等人，生物化学与生物物理学学报，1995，1264，229-237)或十八烷基胺或己基氨基-羰基-t羟胆固醇部分(克鲁克等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，1996，277，923-937)。还参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941，每个专利通过引用结合在此。
这些部分或缀合物可以包括共价结合至官能团如伯或仲羟基的缀合基团。本发明的缀合基团包括插入子、报告子分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强低聚物的药效学特性的基团以及增强低聚物的药物代谢动力学特性的基团。典型的缀合基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素以及染料。在本发明的背景中增强药效学特性的基团包括提高吸收、增强对降解的抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的背景中增强药物代谢动力学特性的基团包括提高对本发明的化合物的吸收、分布、代谢或分泌的基团。代表性缀合基团在1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US 92/09196以及美国专利号6,287,860中披露，这些专利通过引用结合在此。缀合部分包括但不限于脂质部分(如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-邻-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈基部分，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。参见，例如，美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941。
在一些实施例中，单链寡核苷酸修饰包括该寡核苷酸的5’或3’端的修饰。在一些实施例中，该寡核苷酸的3’端包括羟基或硫代磷酸酯。应认识到，另外的分子(例如，生物素部分或荧光体)可以缀合至该单链寡核苷酸的5’或3’端。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括缀合至5’核苷酸的生物素部分。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括锁定核酸(LNA)、ENA修饰的核苷酸、2’-O-甲基核苷酸或2’-氟-脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸与2’-氟-脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸与ENA修饰的核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸与锁定核酸核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括交替的锁定核酸核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。
在一些实施例中，该寡核苷酸的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的5’核苷酸为锁定核酸核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包括通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少锁定核酸核苷酸侧接的脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’羟基或3’硫代磷酸酯。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括至少两个核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括所有核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
应认识到，该单链寡核苷酸可以具有如在此所描述的修饰的任何组合。
该寡核苷酸可以包括具有以下修饰模式中的一种或多种的核苷酸序列。
(a)(X)Xxxxxx，(X)xXxxxx，(X)xxXxxx，(X)xxxXxx，(X)xxxxXx和(X)xxxxxX，
(b)(X)XXxxxx，(X)XxXxxx，(X)XxxXxx，(X)XxxxXx，(X)XxxxxX，(X)xXXxxx，(X)xXxXxx，(X)xXxxXx，(X)xXxxxX，(X)xxXXxx，(X)xxXxXx，(X)xxXxxX，(X)xxxXXx，(X)xxxXxX和(X)xxxxXX，
(c)(X)XXXxxx，(X)xXXXxx，(X)xxXXXx，(X)xxxXXX，(X)XXxXxx，(X)XXxxXx，(X)XXxxxX，(X)xXXxXx，(X)xXXxxX，(X)xxXXxX，(X)XxXXxx，(X)XxxXXx(X)XxxxXX，(X)xXxXXx，(X)xXxxXX，(X)xxXxXX，(X)xXxXxX和(X)XxXxXx，
(d)(X)xxXXX，(X)xXxXXX，(X)xXXxXX，(X)xXXXxX，(X)xXXXXx，(X)XxxXXXX，(X)XxXxXX，(X)XxXXxX，(X)XxXXx，(X)XXxxXX，(X)XXxXxX，(X)XXxXXx，(X)XXXxxX，(X)XXXxXx，和(X)XXXXxx，
(e)(X)xXXXXX，(X)XxXXXX，(X)XXxXXX，(X)XXXxXX，(X)XXXXxX和(X)XXXXXx，以及
(f)XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX以及XXXXXXx，其中“X”表示核苷酸类似物，(X)表示任选的核苷酸类似物，并且“x”表示DNA或RNA核苷酸单位。以上所列模式各自可以单独或结合任何其他披露的修饰模式在寡核苷酸内出现一次或多次。
用于调节基因表达的方法
在一个方面，本发明出于研究目的(例如，研究细胞内基因的功能)涉及用于调节细胞(例如，APOA1或ABCA1水平降低的细胞)内基因表达的方法。在另一个方面，本发明涉及用于调节细胞(例如，APOA1或ABCA1水平降低的细胞)内基因表达以用于基因或表观遗传治疗的方法。这些细胞可以为体外的、离体的或体内的(例如，因APOA1或ABCA1的表达或活性降低而患有疾病的受试者体内)。在一些实施例中，用于调节细胞内基因表达的方法包括递送如在此所描述的一种单链寡核苷酸。在一些实施例中，向细胞递送该单链寡核苷酸导致基因表达的水平比尚未递送该单链寡核苷酸的对照细胞内的基因表达的水平大至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或以上。在某些实施例中，向细胞递送该单链寡核苷酸导致基因表达的水平比尚未递送该单链寡核苷酸的对照细胞内的基因表达的水平大至少50％。
在本发明的另一个方面，方法包括向受试者(例如，人)给予包含如在此所描述提高该受试者体内蛋白水平的单链寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，该蛋白水平的提高为比给药之前该受试者体内的蛋白的量高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或以上。
作为另一个实例，为了提高细胞内APOA1或ABCA1的表达，这些方法包括向该细胞引入单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸与定位至涵盖或接近APOA1或ABCA1基因的基因组位置(例如，长的非编码RNA)的PRC2相关区充分互补。
本发明的另一方面提供治疗与受试者体内APOA1或ABCA1的降低的表达水平相关联的病症(例如，血脂异常、动脉粥样硬化)的方法，该方法包括给予如在此所描述的单链寡核苷酸。
受试者可以包括非人哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、山羊、牛或马。在优选的实施例中，受试者为人。单链寡核苷酸已用作治疗动物(包括人)的疾病病况的治疗部分。单链寡核苷酸可以为有用的治疗模态，这些治疗模态可以被配置成在用于治疗细胞、组织以及动物特别是人的治疗方案中有用。
对于治疗法，怀疑患有血脂异常或动脉粥样硬化的动物优选为人通过给予根据本发明的单链寡核苷酸来治疗。例如，在一个非限制性实施例中，这些方法包括向需要治疗的动物给予治疗有效量的如在此所描述的单链寡核苷酸的步骤。
配制、递送以及给药
在此描述的寡核苷酸可以被配制用于向受试者给药以用于治疗与APOA1或ABCA1水平降低相关联的病症(例如，血脂异常、动脉粥样硬化)。应理解，配制品、组合物和方法可以用在此披露的任何寡核苷酸来实践。
这些配制品可以方便地按单位剂型形式呈现并且可以通过制药领域中熟知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以便产生单一剂型的活性成分(例如，本发明的寡核苷酸或化合物)的量将根据所治疗的宿主、具体给药模式例如皮内或吸入而变化。可以与载体材料组合以便产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果例如肿瘤阻抑的化合物的量。
本发明的药物配制品可以根据本领域已知用于制造药物的任何方法来制备。这类配制品可以含有甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂。配制品可以与适于制造的无毒的药学上可接受的赋形剂混合。配制品可以包含一种或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲液、赋形剂等并且可以提供成这类形式如液体、粉末、乳液、冻干粉末、喷雾、乳膏、洗剂、受控释放配制品、片剂、丸剂、凝胶、贴片上、植入物内等。
配制的单链寡核苷酸组合物可以呈现各种状态。在一些实例中，该组合物为至少部分结晶(均匀地结晶)和/或无水的(例如，小于80％、50％、30％、20％或10％水)。在另一个实例中，该单链寡核苷酸处于水相，例如处于包括水的溶液中。该水相或结晶组合物可以例如结合到递送媒介物例如脂质体(特别是针对水相)或颗粒(例如，对结晶组合物而言微粒可能是适当的)中。一般而言，该单链寡核苷酸组合物以与目标给药方法相容的方式配制。
在一些实施例中，该组合物通过以下方法中的至少一种来制备：喷雾干燥、冻干、真空干燥、蒸发、流化床干燥或这些技术的组合；或与脂质一起超声处理、冷冻干燥、冷凝以及其他自组装技术。
单链寡核苷酸制剂可以与另一种试剂组合配制或给予(一起或分开)，另一种试剂例如另一种治疗剂或稳定单链寡核苷酸的试剂，例如与单链寡核苷酸复合的蛋白质。其他试剂包括螯合剂，例如，EDTA(例如，以去除二价阳离子如Mg2+)，盐，RNA酶抑制剂(例如，宽特异性RNA酶抑制剂如RNAsin)等。
在一个实施例中，该单链寡核苷酸制剂包括另一种单链寡核苷酸，例如，调节第二基因的表达的第二单链寡核苷酸或调节第一基因的表达的第二单链寡核苷酸。其他制剂可以包括至少3个、5个、十个、二十个、五十个或一百个或更多个不同的单链寡核苷酸种类。这类单链寡核苷酸相对于类似数量的不同基因可以介导基因表达。在一个实施例中，该单链寡核苷酸制剂包括至少一种第二治疗剂(例如，除寡核苷酸之外的试剂)。
递送途径
包括单链寡核苷酸的组合物可以通过各种途径递送至受试者。示例性途径包括：静脉内、皮内、局部、经直肠、肠胃外、肛门内、阴道内、鼻内、经肺、经眼。术语“治疗有效量”为在有待治疗的受试者体内提供所希望水平的APOA1或ABCA1表达以便给出期望的生理反应所需的组合物中存在的寡核苷酸的量。术语“生理学有效量”为递送至受试者以便给出所希望的缓解性或治愈性效果的量。术语“药学上可接受的载体”意指可以向受试者给予而不对该受试者产生显著的不良的毒理学作用的载体。
本发明的单链寡核苷酸分子可以结合到适于给药的药物组合物中。这类组合物典型地包括一种或多种单链寡核苷酸种类以及药学上可接受的载体。如在此所使用，词语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何以及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。对于药物活性物质使用此类介质与试剂在本领域内是熟知的。除了任何常规的与活性成分不相容的介质或试剂之外，将涵盖此类介质和试剂在组合物中的使用。辅助活性化合物也可以结合到组合物中。
本发明的药物组合物能够以多种方式给予，这取决于希望是局部治疗还是系统治疗以及有待治疗的区域。给药可以为局部的(包括眼部给药、阴道给药、直肠给药、鼻内给药、经皮给药)、口服或肠胃外的。肠胃外给药包括静脉滴注、皮下注射、腹膜内注射或肌内注射、或鞘内给药或心室内给药。
给药途径和部位可以被选择来增强靶向作用。例如，为了靶向肌细胞，肌内注射到相关肌肉内将是合理的选择。可以通过给予呈气溶胶形式的单链寡核苷酸来靶向肺细胞。血管内皮细胞可以通过对气囊导管涂布单链寡核苷酸并机械地引入寡核苷酸来靶向。
局部给药是指通过使该配制品直接接触受试者的表面来向该受试者递送。局部递送的最常见形式为递送至皮肤，但在此披露的组合物也可以直接涂覆至身体的其他表面，例如，涂覆至眼睛、粘膜，体腔的表面或内表面。如上所述，最常见的局部递送为递送至皮肤。该术语涵盖若干给药途径，包括但不限于局部给药和经皮。这些给药模式典型地包括穿透皮肤的可渗透性屏障并且有效递送至靶组织或组织层。局部给药可以用作穿透表皮和真皮并最终实现组合物的系统递送的一种手段。局部给药还可以用作向受试者的表皮或真皮，或其特定组织层或底层组织选择性递送寡核苷酸的手段。
用于局部给药的配制品可以包括经皮贴片、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴液、栓剂、喷雾、液体以及粉末。常规的药物载体、水性基质、粉末基质或油性基质、增稠剂等可能是需要的或希望的。涂布的避孕套、手套等也可能是有用的。
皮内递送为用于脂溶性治疗剂的给药的有用途径。真皮比表皮更易渗透，并且因此吸收更为迅速地通过擦伤、烧伤或剥离后的皮肤。炎症和增加流向皮肤的血流的其他生理病症也增强经皮吸收。经由这种途径的吸收可以通过使用油性媒介物(涂擦)或通过使用一种或多种渗透增强剂来增强。经由经皮途径递送在此披露的组合物的其他有效方式包括皮肤的水合作用以及受控释放局部贴片的使用。经皮途径提供递送在此披露的组合物以用于系统和/或局部治疗的一种潜在有效的手段。此外，离子电渗疗法(在电场影响下，通过生物膜传递离子溶质)、超声透入疗法或超声导入疗法(使用超声波来增强整个生物膜特别是皮肤和角膜上的各种治疗剂的吸收)以及媒介物特征相对于给药部位处剂量位置和保持时间的优化可能是用于增强局部涂覆的组合物在整个皮肤和粘膜部位上的传送的有用方法。
经口和经鼻膜两者提供优于其他给药途径的优点。例如，通过这些膜给予的寡核苷酸可以具有快速起效的作用，提供治疗性血浆水平，避免肝脏的首过代谢作用，并且避免寡核苷酸在有害胃肠(GI)环境中的暴露。另外的优点包括易于进入膜部位以使得寡核苷酸可以容易地涂覆、局部化和去除。
在口服递送中，组合物可以靶向口腔的表面，例如，舌下黏膜，舌下黏膜包括舌部的腹面的膜和口腔底部或构成颊部的内层的颊粘膜。舌下黏膜为相对可渗透的，从而给出对许多试剂的快速吸收和可接受的生物可利用性。另外，舌下黏膜为方便的、可接受的以及易于接近的。
单链寡核苷酸的药物组合物还可以通过将如上所述的混合的胶束药物配制品以及推进剂从计量的剂量喷雾分配器喷入到(而非吸入到)腔中来向人类的颊腔给药。在一个实施例中，在将药物配制品和推进剂喷入到颊腔中之前，首先振荡该分配器。
用于口服给药的组合物包括粉末或颗粒、水性悬浮液或溶液、糖浆、浆料、乳液、酏剂或非水性介质、片剂、胶囊、锭剂或含片。在片剂的情况下，可以使用的载体包括乳糖、柠檬酸钠以及磷酸盐。各种崩解剂(如淀粉)和润滑剂(如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠以及滑石)普遍用于片剂中。对于胶囊形式的口服给药，可用稀释剂为乳糖和高分子量聚乙二醇。当需要用于口服使用的水性悬浮液时，可以将核酸组合物与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，可以添加某些甜味剂和/或调味剂。
肠胃外给药包括静脉滴注、皮下注射、腹膜内注射或肌内注射、鞘内给药或心室内给药。在一些实施例中，肠胃外给药包括直接给药至疾病部位(例如，注射到肿瘤中)。
用于肠胃外给药的配制品可以包括也可以含有缓冲液、稀释剂以及其他适合的添加剂的无菌水溶液。可以通过例如附接至贮药库(reservoir)的心室内导管来帮助心室内注射。对于静脉内使用，应控制溶质的总浓度以便使制剂等渗。
可以向眼部组织给予在此描述的任何单链寡核苷酸。例如，可以将组合物涂覆至眼睛或邻近组织的表面，例如，眼睑内部。对于眼部给药，可以通过本领域已知的眼部递送系统如涂药器或滴眼瓶来递送软膏或滴眼液。这类组合物可以包括粘液模拟物质(mucomimetics)如透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素或聚(乙烯醇)，防腐剂如山梨酸、EDTA或苄基氯化铬以及常用量的稀释剂和/或载体。还可以向眼睛的内部给予该单链寡核苷酸，并且可以通过针或可以将该单链寡核苷酸引至选定区域或结构的其他递送装置来引入该单链寡核苷酸。
肺部递送组合物可以由患者吸入分散剂来递送，这样使得该分散剂内的该组合物(优选地为单链寡核苷酸)可以抵达该组合物可以容易地通过肺泡段而直接吸收进入血液循环的肺部。肺部递送可以有效用于系统递送和局部递送两者以用于治疗肺部疾病。
可以通过不同的方法来实现肺部递送，包括使用基于气雾化、气溶胶化、胶束以及干粉的配制品。可以用液体气雾器、基于气溶胶的吸入器以及干粉分配装置来实现递送。计量剂量装置是优选的。使用雾化器或吸入器的一个益处在于污染的可能性被最小化，因为装置是独立的。干粉分配装置例如递送可以容易地配制成干粉的试剂。单链寡核苷酸组合物可以独自或结合适合的粉末载体稳定地存储为冻干或喷雾干燥的粉末。组合物的吸入递送可以通过给药计时元件来介导，该给药计时元件可以包括计时器、剂量计数器、测时装置或时间指示器，在它们结合到装置中时在气溶胶药剂的给药过程中实现剂量追踪、依从性监测和/或触发剂量给患者。
术语“粉末”意指由细微分散的固体颗粒组成的组合物，这些固体颗粒是自由流动的，并且能够容易地分散在吸入装置中，并且随后由受试者吸入，以使得颗粒抵达肺部以便允许穿透到肺泡中。因此，粉末被称为“可呼吸的”。优选地，平均粒度小于约10μm的直径，优选地具有相对均匀的球形分布。更优选地，直径小于约7.5μm并且最优选地小于约5.0μm。通常，粒度分布为在约0.1μm与约5μm的直径之间，特别是约0.3μm至约5μm。
术语“干燥”意指组合物按水的重量计(w％)具有低于约10％，通常低于约5w％并且优选地低于约3w％的含水量。干燥组合物可以使得颗粒能够容易地分散在吸入装置中以便形成气溶胶。
可用作载体的药物赋形剂的类型包括稳定剂如人血清白蛋白(HSA)、增量剂如糖类、氨基酸以及多肽；pH调节剂或缓冲液；盐如氯化钠；等。这些载体可以为结晶形式或无定形形式或者可以为两者的混合物。
适合的pH调节剂或缓冲液包括由有机酸和碱制备的有机盐，如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等；柠檬酸钠是优选的。胶束单链寡核苷酸配制品的肺部给药可以通过具有推进剂的计量剂量喷雾装置来实现，这些推进剂如四氟乙烷、七氟乙烷、二甲基氟丙烷、四氟丙烷、丁烷、异丁烷、二甲基醚以及其他非CFC和CFC推进剂。
示例性装置包括引入到脉管系统中的装置，例如，插入到血管组织的内腔中的装置，或装置自身形成脉管结构一部分的装置，包括支架、导管、心脏瓣膜以及其他血管装置。这些装置例如导管或支架可以放置在肺部、心脏或腿部的脉管结构中。
其他装置包括非血管装置，例如，植入到腹膜中，或器官或腺组织中的装置，例如人造器官。该装置可以释放除单链寡核苷酸之外的治疗物质，例如，装置可以释放胰岛素。
在一个实施例中，包括单链寡核苷酸的组合物的单位剂量或测量剂量通过植入装置来分配。该装置可以包括监控受试者体内参数的传感器。例如，该装置可以包括泵以及例如任选地相关联的电子器件。
组织例如细胞或器官可以离体用单链寡核苷酸治疗，并且之后给予或植入到受试者体内。该组织可以为自体组织、异体组织或异种组织。例如，可以治疗组织来减少移植物对抗宿主病。在其他实施例中，该组织为异体的并且治疗该组织来治疗特征在于所述组织中的不想要的基因表达的失调。例如，可以治疗组织例如造血干细胞(例如，骨髓造血干细胞)来抑制不想要的细胞增殖。引入无论是自体的还是移植的治疗组织都可以与其他疗法结合。在一些实施方案中，单链寡核苷酸处理的细胞例如通过半渗透多孔屏障与其他细胞分离开来，该半渗透多孔屏障防止细胞离开移植体，但使得来自身体的分子能够到达细胞并且使得由细胞产生的分子进入身体。在一个实施例中，该多孔屏障由藻酸盐形成。
在一个实施例中，避孕装置涂布有或含有单链寡核苷酸。示例性装置包括避孕套、子宫帽、IUD(植入式子宫装置)、海绵体、阴道用套以及节育装置。
剂量
在一个方面，本发明的特征为向受试者(例如，人受试者)给予单链寡核苷酸(例如，作为化合物或作为组合物的组分)的方法。在一个实施例中，该单位剂量在约10mg与25mg/kg体重之间。在一个实施例中，该单位剂量在约1mg与100mg/kg体重之间。在一个实施例中，该单位剂量在约0.1mg与500mg/kg体重之间。在一些实施例中，该单位剂量超过0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、25、50或100mg/kg体重。
所定义的量可以为有效用于治疗或预防疾病或失调例如与APOA1或ABCA1相关联的疾病或失调的量。单位剂量例如可以通过注射(例如，静脉内或肌内)、吸入剂量或局部涂覆来给予。
在一些实施例中，每天给予该单位剂量。在一些实施例中，小于每天一次的频率，例如小于每2、4、8或30天一次的频率给予该单位剂量。在另一个实施例中，该单位剂量不按频率给予(例如，非规律的频率)。例如，可以单次给予该剂量单位。在一些实施例中，该单位剂量一天可以给予一次以上，例如，一个小时、两个小时、四个小时、八个小时、十二个小时等给予一次。
在一个实施例中，向受试者给予单链寡核苷酸的初始剂量以及一个或多个维持剂量。一个或多个维持剂量通常低于该初始剂量，例如，比该初始剂量小一半。维持方案可以包括用在从每天0.0001至100mg/kg体重范围内，例如每天100、10、1、0.1、0.01、0.001或0.0001mg/kg体重的一个或多个剂量治疗受试者。每1、5、10或30天可以给予不超过一次的维持剂量。另外，治疗方案可以持续一段时间，该治疗方案将根据具体疾病的性质、严重程度以及患者的总体情况来变化。在一些实施例中，每天可以递送不超过一次的剂量，例如，每24、36、48小时或更多小时不超过一次，例如，每5或8天不超过一次。在治疗之后，可以监控患者的病症变化以及疾病病况的症状的缓解。寡核苷酸的剂量可以在患者对当前剂量水平未作出显著响应的情况下增加，或者剂量可以在观察到疾病病况的症状的缓解的情况下，在疾病病况消除的情况下或在观察到不希望的副作用的情况下减小。
在特定情况下根据需要或认为适当时，有效剂量能够以单次剂量或两次或更多次剂量给予。如果希望促进重复或频繁的输注，可建议植入递送装置，例如，泵、半永久性支架(例如，静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或贮药库。
在一些实施例中，该寡核苷酸药物组合物包括多个单链寡核苷酸种类。在另一个实施例中，单链寡核苷酸种类相对于天然存在的靶序列(例如，PRC2相关区)具有与另一个种类不重叠并且不邻近的序列。在另一个实施例中，多个单链寡核苷酸种类对不同的PRC2相关区具有特异性。在另一个实施例中，该单链寡核苷酸是等位基因特异性的。在一些情况下，用单链寡核苷酸结合其他治疗模态来治疗患者。
在成功治疗之后，可能希望使该患者经受维持治疗以便防止疾病病况的复发，其中以从0.0001mg至100mg/kg体重的范围内的维持剂量给予本发明的化合物。
该单链寡核苷酸组合物的浓度为足以在人体内有效治疗或预防失调或调控生理病症的量。所给予的单链寡核苷酸的浓度或量将取决于针对试剂和给药方法例如经鼻、经颊、经肺确定的参数。例如，鼻用配制品可能倾向于要求一些成分的浓度较低以便避免对鼻腔通道的刺激或烧伤。有时希望将口服配制品稀释多达10至100倍以便提供适合的鼻用配制品。
某些因素可能会影响有效治疗受试者所需的剂量，包括但不限于疾病或失调的严重程度、先前治疗、受试者的总体健康和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，使用治疗有效量的单链寡核苷酸对受试者治疗可以包括单一治疗、或优选地可以包括一系列治疗。还将认识到，用于治疗的单链寡核苷酸的有效剂量可以在具体治疗的过程中增大或减小。例如，可以在给予单链寡核苷酸组合物之后监控该受试者。基于来自监控的信息，可以给予另外的量的该单链寡核苷酸组合物。
给药取决于有待治疗的疾病病症的严重程度和响应性，其中治疗过程持续从数天至数月，直到实现治愈或者实现疾病病况减轻。最佳给药计划可以从对患者体内的APOA1或ABCA1表达水平的测量来计算。普通技术人员可以容易地测定最佳剂量、给药方法以及重复率。最佳剂量可以根据单独化合物的相对效力来变化，并且通常可以基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50来估算。在一些实施例中，动物模型包括表达人APOA1或ABCA1的转基因动物。在另一个实施例中，用于测试的组合物包括至少在内部区域中与序列互补的单链寡核苷酸，该序列在动物模型中的APOA1或ABCA1与人体中的APOA1或ABCA1之间保守。
在一个实施例中，单链寡核苷酸组合物的给药为肠胃外的，例如，静脉内(例如，作为推注或作为可扩散的输注)、皮内、腹膜内、肌内、鞘内、心室内、颅内、皮下、经粘膜、经颊、舌下、经内窥镜、经直肠、口服、阴道内、局部、经肺、鼻内、经尿道或经眼。可以通过受试者或通过另一个人例如卫生保健提供者来提供给药。该组合物能够以测量剂量或递送计量剂量的分配器提供。下文更详细地论述了选择的递送模式。
试剂盒
在本发明的某些方面，提供试剂盒，其包括容纳包含单链寡核苷酸的组合物的容器。在一些实施例中，该组合物为包含单链寡核苷酸和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施例中，该药物组合物的单独组分可以提供在一个容器中。可替代地，可能希望将该药物组合物的组分分开提供在两个或更多个容器中，例如，一个容器用于单链寡核苷酸，并且至少另一个用于载体化合物。该试剂盒可以封装在多个不同的构型如单个盒子内的一个或多个容器中。不同的组分可以例如根据试剂盒所提供的说明书来组合。组分可以根据在此描述例如用于制备和给予药物组合物的方法来组合。该试剂盒还可以包括递送装置。
通过以下实例来进一步说明本发明，这些实例绝不应解释为进一步的限制。在本发明通篇引用的所有参考(包括文献参考、颁予的专利、公开专利申请以及共同待决专利申请)的全部内容清楚地通过引用结合在此。
实例
以下实例将进一步描述本发明，这些实例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
材料与方法：
实时PCR
使用Promega SV 96总RNA分离系统或Trizol，省略DNA酶步骤来从细胞收获RNA。将从细胞收获的RNA归一化以使得相等的RNA输入至每个逆转录反应中。使用Superscript II试剂盒进行逆转录酶反应，并且使用icycler SYBR绿化学法(伯乐(Biorad))对cDNA样品进行实时PCR。通过如上所概述的定量PCR确定APOA1的mRNA表达的基线水平。通过如上所概述的定量PCR确定ABCA1的mRNA表达的基线水平。还确定组成性表达的不同管家基因的mRNA的基线水平。出于比较目的选择具有与靶基因近似相同的基线表达水平的“对照”管家基因。
细胞培养
使用本领域中已知的条件(参见，例如，细胞生物学实验指南(CurrentProtocols in Cell Biology))培养人肝细胞Hep3B、人肝细胞HepG2细胞、小鼠肝细胞瘤Hepa1-6细胞以及人肾脏近端小管上皮细胞(RPTEC)。表5中提供了在此描述的实验中所使用的细胞系的细节。
表5.细胞系
寡核苷酸设计
在PRC2-相互作用区内设计寡核苷酸以便上调APOA1。表4中示出了每个寡核苷酸的序列和结构。表3提供了用于所测试和说明的某些寡核苷酸的核苷酸类似物、修饰以及核苷酸内键的描述。SEQ ID NO：187502至187521是靶向APOA1的缺口体(gapmer)对照寡核苷酸。
用寡核苷酸进行细胞的体外转染
在PRC2-相互作用区内设计寡核苷酸以便上调APOA1。以25,000细胞/500uL的密度将细胞接种到24孔板中的每个孔中，并且用脂质转染胺和单链寡核苷酸进行转染。对照细胞只含有脂质转染胺。在转染48小时后，在-80℃下，存储约200uL细胞培养物上清液以用于ELISA。在转染48小时后，从细胞收获RNA，并且如上所概述的执行定量PCR。通过每个寡核苷酸诱导的靶mRNA表达的百分比是通过将在寡核苷酸存在下的mRNA水平相对于在对照(脂质转染胺单独)存在下的mRNA水平归一化来确定。将这与“对照”管家基因的mRNA表达的提高并行比较。
在PRC2-相互作用区内设计寡核苷酸以便上调ABCA1。以25,000细胞/500uL的密度将细胞接种到24孔板中的每个孔中，并且用脂质转染胺和单链寡核苷酸进行转染。对照细胞只含有脂质转染胺。在转染48小时后，在-80℃下，存储约200uL细胞培养物上清液以用于ELISA。在转染48小时后，从细胞收获RNA，并且如上所概述的执行定量PCR。通过每个寡核苷酸诱导的靶mRNA表达的百分比是通过将在寡核苷酸存在下的mRNA水平相对于在对照(脂质转染胺单独)存在下的mRNA水平归一化来确定。将这与“对照”管家基因的mRNA表达的提高并行比较。
体外递送单链寡核苷酸
寡核苷酸被设计为用于上调ABCA1表达的候选物。这些单链寡核苷酸被设计成与如SEQ ID NO：5或6中给出的序列内的PRC2相互作用区互补。至少重复两次测试这些寡核苷酸。简单地说，用如上所述的每个寡核苷酸对细胞进行体外转染。通过qRT-PCR评价处理之后细胞内的ABCA1表达。鉴别上调ABCA1表达的寡核苷酸。
结果：
体外递送单链寡核苷酸上调APOA1
寡核苷酸被设计为用于上调APOA1表达的候选物。总共70个单链寡核苷酸被设计成与如SEQ ID NO：1或2中给出的序列内的PRC2相互作用区互补。至少重复两次测试寡核苷酸。表4中给出了寡核苷酸的序列和结构特征。简单地说，用如上所述的寡核苷酸对细胞进行体外转染。通过qRT-PCR评价处理之后细胞内的APOA1表达。鉴别上调APOA1表达的寡核苷酸。表2中概括了另外的细节。
表
表1：非为人miRNA的种子序列的六聚物
AAAAAA，AAAAAG，AAAACA，AAAAGA，AAAAGC，AAAAGG，AAAAUA，AAACAA，AAACAC，AAACAG，AAACAU，AAACCC，AAACCU，AAACGA，AAACGC，AAACGU，AAACUA，AAACUC，AAACUU，AAAGAU，AAAGCC，AAAGGA，AAAGGG，AAAGUC，AAAUAC，AAAUAU，AAAUCG，AAAUCU，AAAUGC，AAAUGU，AAAUUA，AAAUUG，AACAAC，AACAAG，AACAAU，AACACA，AACACG，AACAGA，AACAGC，AACAGG，AACAUC，AACAUG，AACCAA，AACCAC，AACCAG，AACCAU，AACCCC，AACCCG，AACCGA，AACCGC，AACCGG，AACCUA，AACCUU，AACGAA，AACGAC，AACGAG，AACGAU，AACGCU，AACGGG，AACGGU，AACGUA，AACGUC，AACGUG，AACGUU，AACUAU，AACUCA，AACUCC，AACUCG，AACUGA，AACUGC，AACUGU，AACUUA，AACUUC，AACUUG，AACUUU，AAGAAA，AAGAAG，AAGAAU，AAGACG，AAGAGA，AAGAGC，AAGAGG，AAGAGU，AAGAUU，AAGCAA，AAGCAC，AAGCAG，AAGCAU，AAGCCA，AAGCCC，AAGCCG，AAGCCU，AAGCGA，AAGCGG，AAGCGU，AAGCUA，AAGGAA，AAGGAC，AAGGCU，AAGGGC，AAGGGU，AAGGUU，AAGUAA，AAGUAC，AAGUAU，AAGUCC，AAGUCG，AAGUGA，AAGUGG，AAGUUA，AAGUUU，AAUAAA，AAUAAC，AAUAAG，AAUAAU，AAUACA，AAUACC，AAUACG，AAUAGA，AAUAGC，AAUAGG，AAUAGU，AAUAUC，AAUAUU，AAUCAA，AAUCAU，AAUCCA，AAUCCC，AAUCCG，AAUCGA，AAUCGC，AAUCGU，AAUCUA，AAUCUG，AAUCUU，AAUGAA，AAUGAC，AAUGAG，AAUGAU，AAUGCG，AAUGCU，AAUGGA，AAUGGU，AAUGUA，AAUGUC，AAUGUG，AAUUAA，AAUUAC，AAUUAG，AAUUCC，AAUUCG，AAUUGA，AAUUGG，AAUUGU，AAUUUC，AAUUUG，ACAAAA，ACAAAC，ACAAAG，ACAAAU，ACAACC，ACAACG，ACAACU，ACAAGA，ACAAGC，ACAAGU，ACAAUC，ACAAUG，ACAAUU，ACACAG，ACACCA，ACACCC，ACACCG，ACACCU，ACACGA，ACACGC，ACACGU，ACACUC，ACACUG，ACACUU，ACAGAA，ACAGAC，ACAGCC，ACAGCG，ACAGCU，ACAGGG，ACAGUC，ACAGUG，ACAGUU，ACAUAA，ACAUAC，ACAUCC，ACAUCG，ACAUCU，ACAUGA，ACAUGC，ACAUGU，ACAUUG，ACAUUU，ACCAAA，ACCAAC，ACCAAG，ACCAAU，ACCACC，ACCACG，ACCAGA，ACCAGU，ACCAUA，ACCAUG，ACCAUU，ACCCAA，ACCCAC，ACCCCA，ACCCCG，ACCCGA，ACCCGC，ACCCUA，ACCCUC，ACCCUU，ACCGAA，ACCGAC，ACCGAU，ACCGCA，ACCGCC，ACCGCG，ACCGCU，ACCGGA，ACCGGC，ACCGGU，ACCGUA，ACCGUC，ACCGUG，ACCGUU，ACCUAA，ACCUAC，ACCUAG，ACCUAU，ACCUCA，ACCUCC，ACCUCG，ACCUCU，ACCUGA，ACCUGC，ACCUGU，ACCUUA，ACCUUC，ACCUUU，ACGAAA，ACGAAC，ACGAAG，ACGAAU，ACGACA，ACGACC，ACGACG，ACGACU，ACGAGA，ACGAGC，ACGAGG，ACGAGU，ACGAUA，ACGAUC，ACGAUG，ACGAUU，ACGCAA，ACGCAG，ACGCAU，ACGCCC，ACGCCG，ACGCCU，ACGCGA，ACGCGG，ACGCGU，ACGCUA，ACGCUG，ACGCUU，ACGGAA，ACGGAC，ACGGAG，ACGGAU，ACGGCC，ACGGCG，ACGGCU，ACGGGC，ACGGGG，ACGGGU，ACGGUA，ACGGUC，ACGGUG，ACGGUU，ACGUAA，ACGUAC，ACGUAU，ACGUCC，ACGUCG，ACGUCU，ACGUGA，ACGUGC，ACGUGG，ACGUGU，ACGUUA，ACGUUC，ACGUUG，ACGUUU，ACUAAA，ACUAAG，ACUAAU，ACUACA，ACUACC，ACUACG，ACUACU，ACUAGG，ACUAUC，ACUAUG，ACUAUU，ACUCAU，ACUCCC，ACUCCG，ACUCCU，ACUCGA，ACUCGC，ACUCGG，ACUCUC，ACUCUU，ACUGAG，ACUGAU，ACUGCC，ACUGCG，ACUGCU，ACUGGG，ACUGGU，ACUGUC，ACUUAA，ACUUAC，ACUUAU，ACUUCA，ACUUCC，ACUUCG，ACUUCU，ACUUGA，ACUUGC，ACUUGU，ACUUUA，ACUUUC，ACUUUG，AGAAAA，AGAAAC，AGAAAG，AGAACC，AGAACG，AGAACU，AGAAGC，AGAAGU，AGAAUA，AGAAUC，AGAAUG，AGAAUU，AGACAA，AGACAC，AGACAU，AGACCA，AGACCC，AGACCG，AGACCU，AGACGA，AGACGC，AGACGU，AGACUA，AGACUC，AGACUU，AGAGAC，AGAGAG，AGAGAU，AGAGCC，AGAGCG，AGAGCU，AGAGGC，AGAGGG，AGAGGU，AGAGUA，AGAGUU，AGAUAC，AGAUAG，AGAUAU，AGAUCC，AGAUCG，AGAUCU，AGAUGA，AGAUGC，AGAUGG，AGAUUA，AGAUUC，AGAUUG，AGAUUU，AGCAAC，AGCACA，AGCACG，AGCACU，AGCAGA，AGCAUA，AGCAUC，AGCAUG，AGCCAA，AGCCAU，AGCCCA，AGCCGA，AGCCGC，AGCCGG，AGCCGU，AGCCUA，AGCCUC，AGCGAA，AGCGAG，AGCGAU，AGCGCA，AGCGCC，AGCGCG，AGCGCU，AGCGGA，AGCGGC，AGCGGU，AGCGUA，AGCGUC，AGCGUG，AGCGUU，AGCUAA，AGCUAC，AGCUAG，AGCUAU，AGCUCA，AGCUCC，AGCUCG，AGCUCU，AGCUGA，AGCUGG，AGCUGU，AGCUUC，AGCUUU，AGGAAU，AGGACC，AGGACG，AGGAGA，AGGAGU，AGGAUA，AGGCAA，AGGCAU，AGGCCG，AGGCGA，AGGCGC，AGGCGG，AGGCUA，AGGCUC，AGGCUU，AGGGAC，AGGGAU，AGGGGA，AGGGGU，AGGGUA，AGGGUG，AGGUAA，AGGUAC，AGGUCA，AGGUCC，AGGUCU，AGGUGA，AGGUGC，AGGUGG，AGGUGU，AGGUUC，AGGUUG，AGUAAA，AGUAAG，AGUAAU，AGUACA，AGUACG，AGUAGC，AGUAGG，AGUAUA，AGUAUC，AGUAUG，AGUAUU，AGUCAA，AGUCAC，AGUCAG，AGUCAU，AGUCCA，AGUCCG，AGUCCU，AGUCGA，AGUCGC，AGUCGG，AGUCGU，AGUCUA，AGUCUC，AGUCUG，AGUCUU，AGUGAA，AGUGAC，AGUGCG，AGUGGG，AGUGUC，AGUUAA，AGUUAC，AGUUAG，AGUUCC，AGUUCG，AGUUGA，AGUUGC，AGUUGU，AGUUUA，AGUUUC，AGUUUG，AGUUUU，AUAAAC，AUAAAU，AUAACA，AUAACC，AUAACG，AUAACU，AUAAGA，AUAAGC，AUAAGG，AUAAGU，AUAAUC，AUAAUG，AUAAUU，AUACAC，AUACAG，AUACAU，AUACCA，AUACCC，AUACCG，AUACGA，AUACGC，AUACGG，AUACGU，AUACUA，AUACUC，AUACUG，AUACUU，AUAGAA，AUAGAC，AUAGAU，AUAGCA，AUAGCG，AUAGCU，AUAGGA，AUAGGU，AUAGUA，AUAGUC，AUAGUG，AUAGUU，AUAUAC，AUAUAG，AUAUCC，AUAUCG，AUAUCU，AUAUGA，AUAUGC，AUAUGG，AUAUGU，AUAUUC，AUAUUG，AUAUUU，AUCAAA，AUCAAC，AUCAAG，AUCAAU，AUCACA，AUCACC，AUCACG，AUCAGC，AUCAGG，AUCCAA，AUCCAU，AUCCCC，AUCCCG，AUCCGA，AUCCGC，AUCCGG，AUCCUA，AUCCUC，AUCCUG，AUCGAA，AUCGAC，AUCGAG，AUCGAU，AUCGCA，AUCGCC，AUCGCG，AUCGCU，AUCGGC，AUCGGG，AUCGGU，AUCGUC，AUCGUG，AUCGUU，AUCUAA，AUCUAC，AUCUAG，AUCUAU，AUCUCC，AUCUCG，AUCUGU，AUCUUG，AUCUUU，AUGAAA，AUGAAC，AUGAAG，AUGAAU，AUGACC，AUGACU，AUGAGG，AUGAGU，AUGAUA，AUGAUC，AUGAUU，AUGCAA，AUGCAG，AUGCCA，AUGCCC，AUGCCG，AUGCGA，AUGCGG，AUGCGU，AUGCUC，AUGCUU，AUGGAC，AUGGCC，AUGGGA，AUGGGC，AUGGGU，AUGGUC，AUGGUG，AUGUAC，AUGUAU，AUGUCA，AUGUCC，AUGUCG，AUGUGU，AUGUUA，AUGUUC，AUUAAA，AUUAAC，AUUAAG，AUUAAU，AUUACA，AUUACC，AUUACG，AUUACU，AUUAGA，AUUAGC，AUUAGG，AUUAGU，AUUAUA，AUUAUC，AUUAUG，AUUCAC，AUUCCA，AUUCCG，AUUCCU，AUUCGA，AUUCGC，AUUCGG，AUUCGU，AUUCUA，AUUCUC，AUUCUU，AUUGAA，AUUGAC，AUUGAU，AUUGCC，AUUGCG，AUUGCU，AUUGGA，AUUGGC，AUUGGG，AUUGGU，AUUGUA，AUUGUC，AUUGUG，AUUGUU，AUUUAA，AUUUAG，AUUUAU，AUUUCC，AUUUCG，AUUUCU，AUUUGA，AUUUGC，AUUUGU，AUUUUA，AUUUUC，AUUUUG，AUUUUU，CAAAAG，CAAACA，CAAACC，CAAACG，CAAACU，CAAAGA，CAAAGG，CAAAUA，CAAAUU，CAACAC，CAACAU，CAACCA，CAACCC，CAACCG，CAACGA，CAACGC，CAACGG，CAACGU，CAACUA，CAACUC，CA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表2：为测试制备的寡核苷酸序列
表3：寡核苷酸修饰列表。
表4：用于实验室测试的显示核苷酸修饰的制备的格式化寡核苷酸序列。
序列表简要说明
单链寡核苷酸(靶基因的反义链)
SeqID范围：195-120357
SeqID，没有G延伸：
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单链寡核苷酸(靶基因的有义链)
SeqID范围：119697-187501
SeqID，没有G延伸：
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，184287-184288，184290-184292，184299-184301，184304-184305，184311，184313-184315，184318，184321-184324，184326-184328，184330-184331，184333-184334，184336-184337，184339-184343，184345-184347，184350，184352-184355，184357，184363，184365-184369，184373，184376-184378，184380-184382，184386，184388-184391，184394-184401，184403-184404，184406-184408，184411-184415，184420，184422，184425-184431，184433-184436，184442，184447-184448，184450-184452，184454-184455，184457-184458，184461-184473，184475-184476，184478，184480-184481，184487，184489-184494，184499-184500，184502-184505，184507，184509，184511，184513-184514，184517-184522，184524-184526，184532-184534，184536，184539-184542，184545，184548，184552，184555，184558，184565-184566，184568，184570，184572-184573，184576-184579，184581，184589-184591，184594，184608，184610，184612，184615-184616，184621，184623-184624，184633-184634，184636，184639，184641-184642，184653，184655-184656，184658，184661-184663，184665，184669，184671，184674-184675，184677-184682，184684-184687，184689-184692，184695-184698，184702-184705，184707-184711，184713-184716，184719，184722-184724，184726-184730，184732-184733，184735，184737-184739，184743，184745，184751，184755-184756，184766-184772，184774-184775，184778-184779，184782-184784，184787，184789-184790，184792-184795，184798，184803，184805，184807-184810，184812-184814，184816-184817，184823，184826-184827，184829，184831-184835，184838，184843-184844，184847，184851-184855，184857，184860-184870，184872，184875-184876，184878-184885，184889，184893-184896，184899，184901-184903，184905，184908，184910，184914-184919，184921-184922，184924-184927，184929，184935，184937-184938，184942-184943，184948-184949，184951-184952，184955，184957-184958，184967-184969，184974-184977，184979-184981，184983-184988，184996，185001-185006，185008，185014-185015，185017，185020-185021，185023，185028-185032，185034-185035，185039，185042-185043，185051，185053-185058，185061-185063，185068-185069，185072-185074，185076，185080，185082-185085，185087-185088，185090-185093，185096-185101，185104，185107-185109，185111，185115，185117-185119，185123，185126，185128-185132，185135-185140，185144-185148，185150-185151，185154，185157，185162-185164，185166，185173，185176-185179，185182，185190，185192-185193，185197，185201，185204-185205，185208-185209，185215-185217，185220-185221，185223，185233，185237，185241，185243，185245-185248，185250-185251，185255-185257，185261，185263-185266，185269-185270，185272，185276，185278，185282，185284，185287，185290-185294，185296-185297，185299，185301-185302，185305-185310，185312-185316，185318-185329，185334-185339，185342-185344，185352-185353，185357-185358，185360-185361，185363-185367，185373，185375，185377，185384，185386，185389，185397，185399-185402，185406，185410，185412-185414，185416，185418-185419，185423，185425-185426，185428-185430，185433-185444，185449-185450，185453-185454，185457-185462，185464，185467-185473，185476-185477，185479-185480，185482-185484，185486，185490，185492-185494，185501，185506-185507，185510，185513-185518，185520，185526，185528-185533，185535-185536，185538-185540，185542，185552，185554，185556，185558-185559，185562-185563，185570，185575-185576，185578-185582，185586，185589，185591，185593-185594，185599-185604，185607，185609-185614，185617，185619-185621，185623-185626，185629-185633，185635-185636，185641，185645-185648，185650-185651，185653，185655-185660，185662，185664-185666，185673，185675，185683-185685，185687-185688，185694，185697，185700，185703，185711-185712，185715-185716，185719，185721-185722，185725，185728-185734，185736-185737，185739-185743，185745-185747，185749，185751-185752，185754，185756，185761，185764-185766，185769-185772，185774，185784，185794，185797，185799，185802，185808，185810-185812，185814-185815，185817，185819，185821-185825，185827-185828，185831-185834，185836-185839，185841，185848，185850-185863，185865，185868-185869，185871-185874，185876-185877，185882，185884-185885，185889-185891，185894-185896，185900-185901，185906，185910，185912，185914-185916，185918，185920-185923，185926，185929，185932-185934，185939，185942，185944，185953-185957，185960，185963，185965-185968，185970-185972，185974，185978-185987，185989-185994，185999-186000，186004，186006-186008，186010-186011，186016-186024，186026，186028-186032，186038-186039，186041-186042，186044-186045，186047-186048，186050-186059，186061-186062，186064，186066-186067，186071-186075，186077，186083，186085-186086，186088-186091，186096-186100，186103，186112-186113，186117-186119，186121，186123-186125，186131-186133，186138-186140，186143，186147，186150，186154，186156-186158，186160-186165，186168-186169，186171-186174，186182，186184-186185，186189-186192，186194，186202-186204，186212，186214，186218-186222，186224-186225，186229，186231-186232，186235，186237，186239，186242-186245，186251，186253，186255-186256，186258，186260-186261，186263，186266-186267，186269-186274，186276-186283，186285-186286，186290-186291，186294，186296-186305，186315-186318，186323，186325，186327-186328，186332-186336，186343-186345，186347，186351，186354，186358-186359，186362，186368，186371-186372，186374-186375，186378，186381-186382，186385，186392-186394，186401，186404-186405，186408，186413-186415，186420-186423，186425-186426，186429-186430，186433-186434，186436，186439，1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前述书面说明书被认为足以使本领域的技术人员能够实践本发明。本发明不限于所提供的实例的范围，因为实例意图作为本发明的一个方面的单一说明，并且其他功能上等效的实施例也属于本发明的范围。根据前述说明，除了那些在此显示并且描述的内容之外的本发明的不同修改对于本领域的技术人员将变得很清楚，并且属于随附权利要求书的范围。本发明的每个实施例不必涵盖本发明的优点和目的。

Claims (39)

1.一种具有序列5’-X-Y-Z的单链寡核苷酸，其中X为任何核苷酸，Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列，其中该单链寡核苷酸与APOA1基因或ABCA1基因的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补。
2.如权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸不包含三个或更多个连续鸟苷核苷酸。
3.如权利要求1或2中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸不包含四个或更多个连续鸟苷核苷酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
5.如权利要求1至3中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸，并且该PRC2相关区的该互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或鸟苷核苷酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的至少一个核苷酸为核苷酸类似物。
7.如权利要求6所述的单链寡核苷酸，其中与不具有该至少一个核苷酸类似物的寡核苷酸相比较，该至少一个核苷酸类似物导致该寡核苷酸的Tm在1℃至5℃的范围内的升高。
8.如权利要求1至7中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的至少一个核苷酸包含2’O-甲基。
9.如权利要求1至8中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的每个核苷酸包含2’O-甲基。
10.如权利要求1至8中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
11.如权利要求10所述的单链寡核苷酸，其中该桥连核苷酸为LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰的核苷酸。
12.如权利要求1至6中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的每个核苷酸为LNA核苷酸。
13.如权利要求1至6中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-氟-脱氧核糖核苷酸。
14.如权利要求1至6中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸。
15.如权利要求1至6中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及ENA核苷酸类似物。
16.如权利要求1至6中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及LNA核苷酸。
17.如权利要求13至16中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
18.如权利要求1至7中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括交替的LNA核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸。
19.如权利要求18所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的5’核苷酸为LNA核苷酸。
20.如权利要求1至8中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个LNA核苷酸侧接的这些脱氧核糖核苷酸。
21.如权利要求1至20中任一项所述的单链寡核苷酸，进一步包含至少两个核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
22.如权利要求21所述的单链寡核苷酸，进一步包含所有核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
23.如权利要求1至22中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’羟基。
24.如权利要求1至22中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’硫代磷酸酯。
25.如权利要求1至24中任一项所述的单链寡核苷酸，进一步包含缀合至该5’核苷酸的生物素部分。
26.一种单链寡核苷酸，包含与APOA1基因或ABCA1基因的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的互补区，其中该寡核苷酸具有以下各项中的至少一个：
a)为5’X-Y-Z的序列，其中X为任何核苷酸并且其中X锚定在该寡核苷酸的5’端上，Y为非为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列；
b)不包含三个或更多个连续鸟苷核苷酸的序列；
c)与该第二核苷酸序列具有相等长度的核苷酸的每个序列具有阈值水平以下的序列一致性的序列，这些核苷酸处在脱靶基因的5’端上游的50千碱基与该脱靶基因的3’端下游的50千碱基之间；
d)与编码RNA的PRC2相关区互补的序列，该RNA形成包含至少两个单链环的二级结构；和/或
e)具有60％以上G-C含量的序列。
27.如权利要求26所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有该序列5’X-Y-Z并且其中该寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸。
28.一种包含如权利要求1至27中任一项所述的单链寡核苷酸以及载体的组合物。
29.一种在缓冲溶液中的包含如权利要求1至27中任一项所述的单链寡核苷酸的组合物。
30.如权利要求28所述的组合物，其中该寡核苷酸缀合至该载体。
31.如权利要求30所述的组合物，其中该载体为肽。
32.如权利要求30所述的组合物，其中该载体为类固醇。
33.一种包含如权利要求28至32中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。
34.一种包括容纳如权利要求28至33中任一项所述的组合物的容器的试剂盒。
35.一种提高细胞内APOA1基因或ABCA1基因的表达的方法，该方法包括将如权利要求1至25中任一项所述的单链寡核苷酸递送到该细胞中。
36.如权利要求35所述的方法，其中将该单链寡核苷酸递送到该细胞中导致APOA1基因或ABCA1基因的表达水平比不包含该单链寡核苷酸的对照细胞中的APOA1基因或ABCA1基因的表达水平大至少50％。
37.一种提高受试者体内APOA1基因或ABCA1基因的水平的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求1至27中任一项所述的单链寡核苷酸。
38.一种治疗与受试者体内APOA1基因或ABCA1基因的降低的水平相关联的病症的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求A1至A36中任一项所述的单链寡核苷酸。
39.如权利要求38所述的方法，其中该病症为血脂异常或动脉粥样硬化。
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