JP2022545101A - オリゴヌクレオチドコンジュゲート組成物および使用方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドコンジュゲート組成物および使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含むＧａｌＮＡｃ部分に関する。本開示はまた、ターゲット遺伝子の発現を調節するのに有用な、ＧａｌＮＡｃ部分とオリゴヌクレオチド、たとえば、ｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含むＧａｌＮＡｃ－オリゴヌクレオチドコンジュゲートに関する。また、ＧａｌＮＡｃ－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用する方法も提供される。

Description

本開示は、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含むＧａｌＮＡｃ部分に関する。本開示はまた、ＧａｌＮＡｃ部分およびオリゴヌクレオチド、たとえば、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）または低分子阻害（ｓｉＲＮＡ）を含むＧａｌＮＡｃ－オリゴヌクレオチドコンジュゲートに関する。
ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰアルファ、Ｃ／ＥＢＰＡ、またはＣＥＢＰＡ）は、ヒトとげっ歯類の間にわたり保存されているロイシンジッパータンパク質である。この核転写因子は、肝細胞、骨髄単球、脂肪細胞ばかりでなく、他の型の乳腺上皮細胞においても豊富である（非特許文献１）。それは、Ｎ末端部分の２つのトランス活性化ドメインと、他のＣ／ＥＢＰファミリーメンバーとの二量体化を仲介するロイシンジッパー領域と、Ｃ末端部分のＤＮＡ結合ドメインから構成されている。Ｃ／ＥＢＰ転写因子ファミリーの結合部位は、正常な肝細胞機能の維持および傷害に対する反応に関与する数多くの遺伝子のプロモータ領域内に存在する。Ｃ／ＥＢＰαは、免疫および炎症反応、発生、細胞増殖、抗アポトーシス、およびいくつかの代謝経路に関与する、いくつかの肝臓特異的遺伝子の転写に多面的な影響を及ぼす（非特許文献２）。それは、肝細胞の分化状態を維持するために不可欠である。それは、アルブミンの転写を活性化し、尿素生成に関与する複数のオルニチンサイクル酵素をコードする遺伝子の発現を調整しており、したがって正常な肝機能に重要な役割を果たしている。
レクストロム－ヒメスら（Ｌｅｋｓｔｒｏｍ－Ｈｉｍｅｓ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ，ｖｏｌ．２７３，２８５４５－２８５４８（１９９８） ダーリントンら（Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．５（５），５６５－５７０（１９９５）
ｓａＲＮＡを用いた治療目的のためのＣＥＢＰＡのターゲティングされた調節に対するニーズがある。
本発明は、修飾されているかどうかにかかわらず、診断および予後を含む治療目的のためにターゲット遺伝子の発現および／または機能を調節する短い（または小さな）活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）の設計、調製、製造、製剤化および／または使用のための組成物、方法およびキットを提供する。「修飾された」または適切な場合には「修飾」という用語は、ヌクレオチドの任意の１つ以上の成分（糖、塩基または骨格）に関する構造的および／または化学的な修飾を指す。塩基の場合、標準的な核酸塩基：Ａ、Ｇ、ＵまたはＣのリボ核酸塩基のいずれかが修飾されうる。本発明のｓａＲＮＡ中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを含みうる。
本発明の１つの側面は、ターゲット遺伝子の発現をアップレギュレートする単離された合成低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）であって、前記ｓａＲＮＡが、前記ｓａＲＮＡを構成するポリヌクレオチドの塩基、糖、骨格のうちの少なくとも１つに対する少なくとも１つの修飾を含む、ｓａＲＮＡを提供する。
本発明の別の側面は、以下からなる群から選択される構造を含むＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）モノマーを提供する。
Figure 2022545101000002
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、アルキル、アリール、およびアルケニル基から独立して選択され、
Ｒ４は、適切な保護基またはＣ１～６の直鎖もしくは分岐のアルキル基であり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立してＣ１～６の直鎖または分岐のアルキル基であり、かつ
Ｒ７は、適切な保護基である；
Figure 2022545101000003
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、アルキル、アリール、およびアルケニル基から独立して選択され；
Ｒ４は、保護基またはＣ１～６の直鎖もしくは分岐のアルキル基であり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立してＣ１～６の直鎖または分岐のアルキルであり；かつ
Ｒ７は、適切な保護基である；
Figure 2022545101000004
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立して、アルキル基、アリール基、およびアルケニル基から選択され、
Ｒ７は、適切な保護基であり、かつ
リンカー１は切断可能なリンカーである；
および
Figure 2022545101000005
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、アルキル基、アリール基、およびアルケニル基からなる群から独立して選択され、
Ｒ７は、適切な保護基であり、かつ
リンカー１は切断可能なリンカーである。
本発明の別の側面は、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含むＧａｌＮＡｃ部分を提供し、ここで、前記ＧａｌＮＡｃモノマーは、
Figure 2022545101000006
ここで、Ｒ８は－ＨまたはＣ１～６の直鎖もしくは分岐のアルキル基である；
Figure 2022545101000007
ここで、Ｒ８は－ＨまたはＣ１～６の直鎖もしくは分岐のアルキル基であり、ＸはＯまたはＳである；
Figure 2022545101000008
ここで、ＸはＯまたはＳである；
Figure 2022545101000009
からなる群から選択される。
本発明の別の側面は、リンカーを介して炭水化物部分（Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分など）に接続されたオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを提供する。本出願の文脈において、「部分」という用語は、化合物またはコンジュゲート全体中の１つのユニットまたは成分を意味する。たとえば、コンジュゲートは、ＧａｌＮＡｃ部分、リンカー部分、およびｓａＲＮＡ部分を有し得る。ＧａｌＮＡｃ部分は、１つ以上のＧａｌＮＡｃモノマーを一緒に含み得る。「ＧａｌＮＡｃクラスター」または「ＧａｌＮＡｃマルチマー」という用語は、２つ以上のＧａｌＮＡｃモノマーが一緒になっていることを意味する。したがって、いくつかの状況では（すなわち、２つ以上の分子が一緒に存在する場合）、「ＧａｌＮＡｃ部分」、「ＧａｌＮＡｃクラスター」、および「ＧａｌＮＡｃマルチマー」という用語は同義語でありうる。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、低分子抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、修飾ｍＲＮＡ、自己増幅型ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、リボザイム、プラスミド、および免疫刺激性核酸であってもよい。オリゴヌクレオチドは、一本鎖でも二本鎖でもよい。オリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド、および／または修飾ヌクレオチドを含みうる。本発明の文脈における「低分子活性化ＲＮＡ」、「短鎖活性化ＲＮＡ」、または「ｓａＲＮＡ」という用語は、特定の遺伝子の発現をアップレギュレートするか、または正の効果を有する一本鎖または二本鎖ＲＮＡを意味する。前記遺伝子はｓａＲＮＡのターゲット遺伝子である。この文脈における「低分子干渉ＲＮＡ」、「低分子阻害ＲＮＡ」、または「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与し、特定の遺伝子の発現を妨害または阻害する二本鎖ＲＮＡを意味する。前記遺伝子はｓｉＲＮＡのターゲット遺伝子である。
本発明の別の側面は、修飾されたｓａＲＮＡまたは炭水化物部分（ＧａｌＮＡｃ部分など）に接続されたｓａＲＮＡを含むコンジュゲートと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
本発明の別の側面は、炭水化物部分（ＧａｌＮＡｃ部分など）に接続されたｓａＲＮＡを含むコンジュゲートを投与する工程を含む、ｓａＲＮＡを細胞に送達する方法を提供する。
本発明の別の側面は、修飾されたｓａＲＮＡまたは炭水化物部分（ＧａｌＮＡｃ部分など）に接続されたｓａＲＮＡを含むコンジュゲートを投与する工程を含む、ターゲット遺伝子の発現をアップレギュレートする方法を提供する。
本発明の別の側面は、修飾されたｓａＲＮＡまたは炭水化物部分（ＧａｌＮＡｃ部分など）に接続されたｓａＲＮＡを含むコンジュゲートを投与する工程を含む、疾患の治療または予防を提供し、ここで、前記ｓａＲＮＡはターゲット遺伝子の発現をアップレギュレートし、そして、前記ターゲット遺伝子は疾患と関連付けられている。
本発明の別の側面は、修飾されたｓｉＲＮＡまたは炭水化物部分（ＧａｌＮＡｃ部分など）に接続されたｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。ｓｉＲＮＡは、限定されるものではないが補体Ｃ５（Ｃ５）またはトランスサイレチン（ＴＴＲ）などのターゲット遺伝子の発現をダウンレギュレートしうる。
本発明の別の側面は、炭水化物部分（ＧａｌＮＡｃ部分など）に接続されたｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートを投与する工程を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に送達する方法を提供する。
本発明の別の側面は、修飾されたｓｉＲＮＡまたは炭水化物部分（ＧａｌＮＡｃ部分など）に接続されたｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートを投与する工程を含む、ターゲット遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を提供する。
本発明の別の側面は、修飾されたｓｉＲＮＡまたは炭水化物部分（ＧａｌＮＡｃ部分など）に接続されたｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートを投与する工程を含み、前記ｓｉＲＮＡはターゲット遺伝子の発現をダウンレギュレートし、そして、前記ターゲット遺伝子は疾患と関連付けられている、疾患の治療または予防を提供する。
本発明のさまざまな実施形態の詳細が以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
異なる図全体を通して同様の参照文字が同じ部分を指す添付の図面に示されているような、本発明の特定の実施形態の以下の説明から、前述および他の目的、特徴、および利点が明らかとなるであろう。図面は必ずしも原寸に比例しておらず、代わりに、本発明のさまざまな実施形態の原理を説明することに重点が置かれている。
初代ラット肝細胞における５００ｎＭでのｓａＲＮＡパッシブ送達後のＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡレベルを示す図。 初代ラット肝細胞における５００ｎＭでのｓａＲＮＡパッシブ送達後のアルブミン ｍＲＮＡレベルを示す図。 初代ラット肝細胞における１μＭでのｓａＲＮＡパッシブ送達後のＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡレベルを示す図。 初代ラット肝細胞における１μＭでのｓａＲＮＡパッシブ送達後のアルブミンｍＲＮＡレベルを示す図。 正常なマウスに４０ｍｇ／Ｋｇの注射を１日目と３日目に行い、５日目に屠殺した後のＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡレベルを示す図。ＣＥＢＰＡは、ハウスキーピングとしてＢ２Ｍを用いて、ＰＢＳに対して正規化されている。凍結肝臓サンプルからＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲでｍＲＮＡレベルを測定した。 正常なマウスに４０ｍｇ／Ｋｇの注射を１日目と３日目に行い、５日目に屠殺した後のＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡレベルを示す図。ＣＥＢＰＡは、ハウスキーピングとしてＢ２Ｍを用いて、ＰＢＳに対して正規化されている。凍結肝臓サンプルからＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲでｍＲＮＡレベルを測定した。 正常なマウスに４０ｍｇ／Ｋｇの注射を１日目と３日目に行い、５日目に屠殺した後のアルブミンｍＲＮＡレベルを示す図。アルブミンは、ハウスキーピングとしてＢ２Ｍを用いて、ＰＢＳに対して正規化されている。凍結肝臓サンプルからＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲでｍＲＮＡレベルを測定した。 正常なマウスにＧａｌＮＡｃ ｓａＲＮＡコンジュゲートを３０ｍｇ／ｋｇで１日目と３日目に皮下注射し、５日目に屠殺した後の肝臓におけるＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡレベルを示す図。 ＣＥＢＰａ－ｓａＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬ８０（ＧａｌＮａｃクラスターＧ７に対してコンジュゲートされたＸＤ－１４３６９Ｋ１）およびＬ８１（ＧａｌＮａｃクラスターＧ８に対してコンジュゲートされたＸＤ－１４３６９Ｋ１）のインビトロでの用量反応を示す図。 Ｃ５－ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートをトランスフェクションした後のＣ５ ｍＲＮＡレベルを示す図。
詳細な説明
本発明は、治療目的のためにターゲット遺伝子の発現および／または機能を調節するための組成物、方法、およびキットを提供する。これらの組成物、方法およびキットは、ターゲット遺伝子の発現をアップレギュレートする少なくとも１つのｓａＲＮＡを含み、ここで、前記ｓａＲＮＡは少なくとも１つの化学修飾を含む。
Ｉ．ｓａＲＮＡの設計と合成
本発明の文脈における「低分子活性化ＲＮＡ」、「短鎖活性化ＲＮＡ」、または「ｓａＲＮＡ」という用語は、特定の遺伝子の発現をアップレギュレートするか、または正の効果を有する一本鎖または二本鎖ＲＮＡを意味する。ｓａＲＮＡは、１４から３０ヌクレオチドの一本鎖でありうる。ｓａＲＮＡはまた、二本鎖であってもよく、各鎖は１４から３０ヌクレオチドを含みうる。前記遺伝子はｓａＲＮＡのターゲット遺伝子と呼ばれる。本明細書で使用されるターゲット遺伝子は、コード鎖とテンプレート鎖を含む二本鎖ＤＮＡである。たとえば、ＣＥＢＰＡ遺伝子の発現をアップレギュレートするｓａＲＮＡは「ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ」と呼ばれ、ＣＥＢＰＡ遺伝子がＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのターゲット遺伝子である。ターゲット遺伝子は、関心のある任意の遺伝子でありうる。いくつかの実施形態において、ターゲット遺伝子は、テンプレート鎖上にプロモータ領域を有する。
遺伝子またはｍＲＮＡの「アップレギュレーション」または「活性化」とは、遺伝子またはｍＲＮＡの発現レベル、またはｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドのレベルまたはその活性の増加を意味する。本発明のｓａＲＮＡは、ターゲット遺伝子の発現に対する直接的なアップレギュレーション効果を有していてもよい。
本発明のｓａＲＮＡは、ターゲット遺伝子のテンプレート鎖から転写されるＲＮＡ転写物および／またはターゲット遺伝子またはｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドに対する間接的なアップレギュレーション効果を有していてもよい。ターゲット遺伝子から転写されたＲＮＡ転写物は、その後、ターゲット転写物と呼ばれる。ターゲット転写物は、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡでありうる。ターゲット転写物はミトコンドリア中に存在していてもよい。本発明のｓａＲＮＡは、生物学的なプロセスまたは活性に対して下流効果を有しうる。このような実施形態において、第１の転写物をターゲティングするｓａＲＮＡは、第２の非ターゲット転写物に対する効果（アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれか）を有していてもよい。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、増殖細胞において有効性を示しうる。細胞に関して本明細書で用いられる場合、「増殖する」とは、急速に増殖および／または再生する細胞を意味する。
ターゲット遺伝子のターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ターゲット遺伝子のターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物に相補的になるように設計されており、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物をダウンレギュレートすることで、ターゲット遺伝子の発現および／または機能に対する効果を発揮しうる。ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、ターゲット遺伝子のコード鎖から転写され、細胞の核内に存在しうる。
この文脈において「相補的」という用語は、ストリンジェントな条件下でターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物とハイブリダイズすることができることを意味する。
本発明の文脈において、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物を説明するために使用される場合の「アンチセンス」という用語は、その配列が遺伝子のコード鎖上の配列に相補的であることを意味する。
ＤＮＡのチミジンはＲＮＡのウリジンに置き換えられること、およびこの差は「アンチセンス」または「相補性」という用語の解釈を変えるものではないことを理解すべきである。
ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、ターゲット遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）に対応する位置の１００、８０、６０、４０、２０、または１０ｋｂ上流までと、ターゲット遺伝子の転写停止部位に対応する位置の１００、８０、６０、４０、２０、または１０ｋｂ下流までとの間のコード鎖の遺伝子座から転写されてもよい。
一実施形態では、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、ターゲット遺伝子の転写開始部位から＋／－１ｋｂ以内に位置するコード鎖の遺伝子座から転写される。
別の実施形態では、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、ターゲット遺伝子の転写開始部位から＋／－５００ｎｔ、＋／－２５０ｎｔ、＋／－１００ｎｔ、＋／－１０ｎｔ、±５ｎｔまたは＋／－１ｎｔ以内に位置するコード鎖上の遺伝子座から転写される。
別の実施形態では、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、ターゲット遺伝子の転写開始部位の＋／－２０００ヌクレオチドに位置するコード鎖上の遺伝子座から転写される。
別の実施形態では、コード鎖上の遺伝子座は、ターゲット遺伝子の転写開始部位に対応する位置から上流または下流の１０００ヌクレオチド以下である。
別の実施形態では、コード鎖上の遺伝子座は、ターゲット遺伝子の転写開始部位に対応する位置から上流または下流の５００ヌクレオチド以下である。
本明細書で用いられる「転写開始部位」（ＴＳＳ）という用語は、転写の開始位置に対応するか、またはそれを示す遺伝子のテンプレート鎖上のヌクレオチドを意味する。ＴＳＳは、遺伝子のテンプレート鎖のプロモータ領域内に位置しうる。
本明細書で用いられる「転写停止部位」という用語は、遺伝子のテンプレート鎖上の１つ以上のヌクレオチドであり得る領域を意味し、少なくとも１つの特徴部、限定されるものではないが例として、ターゲット転写物の少なくとも１つの停止コドンをコードする領域、ターゲット転写物の３’ＵＴＲの直前の配列をコードする領域、ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を放出する領域、スプライス部位またはスプライス部位の前の部分をコードする領域、およびターゲット転写物の転写が終了するテンプレート鎖上の領域を有する。
本発明のターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物に関連する「特定の遺伝子座から転写される」という語句は、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の転写が特定の遺伝子座から開始されることを意味する。
ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、ターゲット遺伝子のゲノム配列のコード鎖に相補的であり、本明細書における「ゲノム配列」への参照はいずれも「ゲノム配列のコード鎖」に対する簡略表現である。
遺伝子の「コード鎖」は、ＴがｍＲＮＡのＵに置き換えられること以外、産生されるｍＲＮＡと同一の塩基配列を有する。したがって、遺伝子の「テンプレート鎖」は、産生されるｍＲＮＡに相補的かつ逆平行である。
したがって、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、ターゲット遺伝子の転写開始部位の１００、８０、６０、４０、２０、または１０ｋｂ上流と、ターゲット遺伝子の転写停止部位の１００、８０、６０、４０、２０、または１０ｋｂ下流との間に位置するゲノム配列に相補的な配列を含みうる。
一実施形態では、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、ターゲット遺伝子の転写開始部位の１ｋｂ上流とターゲット遺伝子の転写停止部位の１ｋｂ下流との間に位置するゲノム配列に相補的な配列を含む。
別の実施形態では、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、ターゲット遺伝子の転写開始部位の５００、２５０、１００、１０、５または１ヌクレオチド上流と、ターゲット遺伝子の転写停止部位の５００、２５０、１００、１０、５または１ヌクレオチド下流の終了部との間に位置するゲノム配列に相補的な配列を含む。
ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、ターゲット遺伝子のコード領域を含むゲノム配列に相補的な配列を含みうる。ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、テンプレート鎖のターゲット遺伝子のプロモータ領域にアライメントするゲノム配列に相補的な配列を含みうる。遺伝子は複数のプロモータ領域を有しうるが、その場合、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、１つ、２つ、またはそれ以上のプロモータ領域にアライメントしうる。遺伝子のプロモータ領域を同定するために、アノテートされた遺伝子座のオンラインデータベースを使用しうる。ヌクレオチド配列の対に関連して用いられるときの「アライン」および「アライメント」という用語は、ヌクレオチド配列の対が互いに相補的であるかまたは互いに配列同一性を有することを意味する。
ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物とターゲット遺伝子のプロモータ領域との間のアライメント領域は、部分的でありうると共に１ヌクレオチド長程度の短いものでありうるが、少なくとも１５もしくは少なくとも２０ヌクレオチド長、または少なくとも２５ヌクレオチド長、または少なくとも３０、３５、４０、４５、もしくは５０ヌクレオチド長、または少なくとも５５、６０、６５、７０、もしくは７５ヌクレオチド長、または少なくとも１００ヌクレオチド長でありうる。次の特定の各配置は、「アライメント」という用語の範囲内に含まれることが意図される：
ａ）ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物およびターゲット遺伝子のプロモータ領域が、同一の長さでアライメントする（すなわち、それらの全長にわたりアライメントする）。
ｂ）ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物が、ターゲット遺伝子のプロモータ領域よりも短く、その全長にわたりターゲット遺伝子のプロモータ領域にアライメントする（すなわち、それはその全長にわたりターゲット遺伝子のプロモータ領域内の配列にアライメントする）。
ｃ）ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物が、ターゲット遺伝子のプロモータ領域よりも長く、ターゲット遺伝子のプロモータ領域が、それにより完全にアライメントされる（すなわち、ターゲット遺伝子のプロモータ領域が、その全長にわたりターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物内の配列にアライメントされる）。
ｄ）ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物およびターゲット遺伝子のプロモータ領域が、同一の長さまたは異なる長さであり、アライメント領域は、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の長さおよびターゲット遺伝子のプロモータ領域の長さの両方よりも短い。
「アライン」および「アライメント」の以上の定義は、しかるべき変更を加えて、本明細書全体を通じて他の重複配列、たとえばアライメント配列の記述にも当てはまる。明らかなように、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物がプロモータ領域以外のターゲット遺伝子の領域にアライメントすると記述されている場合、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の配列は、ターゲット遺伝子のプロモータ領域内ではなく記載の領域内の配列にアライメントする。
一実施形態では、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、少なくとも１ｋｂまたは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ｋｂ、たとえば、２０、２５、３０、３５、もしくは４０ｋｂの長さである。
一実施形態では、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、その全長に沿ってターゲット遺伝子のコード鎖の配列に少なくとも７５％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％相補的な配列を含む。
本発明は、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物をターゲティングするｓａＲＮＡを提供し、かかるターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物を効果的かつ特異的にダウンレギュレートしうる。これは、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物内の領域との高度の相補性を有するｓａＲＮＡにより達成可能である。ｓａＲＮＡは、ターゲティングされるターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物内の領域とのミスマッチが５以下、または４もしくは３以下、または２以下または１以下であるかあるいはまったくないであろう。
ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、ターゲット遺伝子のテンプレート鎖の領域との配列同一性を有するため、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物はターゲット遺伝子のテンプレート鎖内の領域と部分的に同一となり、このことから遺伝子のテンプレート鎖またはターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物のいずれへの参照も可能になろう。ｓａＲＮＡがターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズまたは結合する位置（すなわちテンプレート鎖の同位置）は、「ターゲティングされる配列」または「ターゲット部位」と呼ばれる。
ｓａＲＮＡのガイド鎖またはアンチセンス鎖（一本鎖または二本鎖にかかわらず）は、ターゲット遺伝子のテンプレート鎖上のターゲティングされる配列の逆相補体と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一でありうる。言い換えれば、ｓａＲＮＡのガイドまたはアンチセンス鎖は、ターゲティングされる配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％相補的でありうる。したがって、ｓａＲＮＡのガイド鎖またはアンチセンス鎖の逆相補体は、ターゲティングされる配列と高度な配列同一性を有している。ターゲッティングされる配列は、ｓａＲＮＡおよび／またはｓａＲＮＡの逆相補体と同じ長さ、すなわち同じ数のヌクレオチドを有しうる。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、少なくとも１４かつ３０未満のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列の位置は、テンプレート鎖のプロモータ領域内にある。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、テンプレート鎖のＴＳＳ（転写開始部位）コア内に位置する。本明細書で使用される「ＴＳＳコア」または「ＴＳＳコア配列」は、ＴＳＳ（転写開始部位）の上流２０００ヌクレオチドと下流２０００ヌクレオチドとの間の領域を指す。したがって、ＴＳＳコアは４００１ヌクレオチドを含み、ＴＳＳはＴＳＳコア配列の５’末端から２００１位に位置する。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳの１０００ヌクレオチド上流と１０００ヌクレオチド下流との間に位置する。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳの５００ヌクレオチド上流と５００ヌクレオチド下流との間に位置する。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳの２５０ヌクレオチド上流と２５０ヌクレオチド下流との間に位置する。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳの１００ヌクレオチド上流と１００ヌクレオチド下流との間に位置する。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳの１０ヌクレオチド上流と１０ヌクレオチド下流との間に位置する。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳの５ヌクレオチド上流と５ヌクレオチド下流との間に位置する。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳの１ヌクレオチド上流と１ヌクレオチド下流との間に位置する。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳコアにおいてＴＳＳの上流に位置する。ターゲティングされる配列は、ＴＳＳの上流２０００ヌクレオチド未満、１０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、１０ヌクレオチド未満または５ヌクレオチド未満でありうる。
いくつかの実施形態では、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳの下流に位置する。ターゲティングされる配列は、ＴＳＳの下流２０００ヌクレオチド未満、１０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、１０ヌクレオチド未満または５ヌクレオチド未満でありうる。
いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳを取り囲む＋／－５０ヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳと実質的に重複する。いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列の重複は、ＴＳＳコアのＴＳＳで始まるか、または終了する。いくつかの実施形態において、ターゲティングされる配列は、上流または下流方向のいずれかにおいて、ＴＳＳコアのＴＳＳと１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９ヌクレオチド重複する。
テンプレート鎖上のターゲティングされる配列の位置は、ターゲティングされる配列の５’末端の位置によって定義される。ターゲティングされる配列の５’末端は、ＴＳＳコアの任意のポジションにあってもよく、ターゲティングされる配列は、ＴＳＳコアの１位から４００１位までから選択される任意のポジションから開始しうる。ここでの参考として、ターゲティングされる配列の５’最末端がＴＳＳコアの１位から２０００位までにある場合、ターゲティングされる配列はＴＳＳの上流であると見なされ、ターゲティングされる配列の５’最末端が２００２位から４００１位までにある場合、ターゲティングされる配列はＴＳＳの下流であると見なされる。ターゲティングされる配列の５’最末端がヌクレオチド２００１にある場合、ターゲティングされる配列はＴＳＳ中央の配列であると見なされ、ＴＳＳの上流でも下流でもない。
さらなる参考のために、たとえば、ターゲティングされる配列の５’末端がＴＳＳコアの１６００位にある場合、すなわち、それがＴＳＳコアの１６００番目のヌクレオチドである場合、ターゲティングされる配列はＴＳＳコアの１６００位から開始し、ＴＳＳの上流にあると見なされる。
いくつかの実施形態において、ＴＳＳコアは、国際公開第２０１６１７０３４８号の表１および２に記載されるようなターゲット遺伝子の配列であり、その内容の全体を本願明細書に援用する。
一実施形態では、ＴＳＳコアは、国際公開第２０１６１７０３４８号の配列番号１～４０４７、３１５２３６～３１８７２６、５８４７８５～５８９０６１、９１３３１０～９１７５３１、１２４１０８０～１２４５４０１、１５５９９３２～１５６４３７２および１８７９１８９～１８８９２０７などの配列であるが、これらに限定はされず、その内容の全体を本願明細書に援用する。
非限定的な一例では、ターゲット遺伝子は、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰアルファ、Ｃ／ＥＢＰＡまたはＣＥＢＰＡ）である。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡは、ＣＥＢＰＡの発現をアップレギュレートするために本出願において提供される。ＣＥＢＰＡは、単一のＴＳＳを有する２５９１ヌクレオチド長のイントロンのない遺伝子である。ＣＥＢＰＡのＴＳＳコア配列を表１に示す。
Figure 2022545101000010
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、二重鎖を形成する２つの鎖を有していてもよく、一方の鎖はガイド鎖でありうる。ｓａＲＮＡ二重鎖は二本鎖ｓａＲＮＡとも呼ばれる。本明細書で使用される二本鎖ｓａＲＮＡまたはｓａＲＮＡ二重鎖は、鎖間のハイブリダイゼーションが二重鎖構造の領域を形成できる１本より多い、好ましくは２本の鎖を含むｓａＲＮＡである。二本鎖ｓａＲＮＡの２本の鎖は、アンチセンス鎖もしくはガイド鎖、およびセンス鎖もしくはパッセンジャー鎖と呼ばれる。
ｓａＲＮＡのガイド鎖、アンチセンス鎖ｓａＲＮＡ、またはアンチセンスｓａＲＮＡと交換可能に使用される、ｓａＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖は、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物内の領域に対して高い相補性を有する。アンチセンス鎖は、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物またはターゲティングされる配列内の領域とのミスマッチが５個以下、または４個以下、または３個以下、または２個以下、または１個以下であるか、あるいはまったく有さなくてもよい。したがって、アンチセンス鎖は、テンプレート鎖上のターゲティングされる配列に対して高度に相補的である。センス鎖ｓａＲＮＡまたはセンスｓａＲＮＡと交換可能に使用されるｓａＲＮＡ二重鎖のセンス鎖は、テンプレート鎖上のターゲティングされる配列に対して高い配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ターゲティングされる配列は、テンプレート鎖のプロモータ領域内に位置する。いくつかの実施形態では、ターゲティングされる配列は、テンプレート鎖のＴＳＳコア内に位置する。
ターゲティングされる配列に対するｓａＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖および／またはセンス鎖の位置は、ＴＳＳコア配列を参照することによって定義される。たとえば、ターゲティングされる配列がＴＳＳの下流にある場合、アンチセンスｓａＲＮＡとセンスｓａＲＮＡはＴＳＳの下流から開始する。別の例では、ターゲティングされる配列がＴＳＳコアの２００位から開始する場合、アンチセンスｓａＲＮＡおよびセンスｓａＲＮＡはＴＳＳの上流から開始する。
本発明の文脈における「鎖」は、天然に存在しない、または修飾されたヌクレオチドを含む、ヌクレオチドの連続した配列を意味する。２つ以上の鎖は、別個の分子であっても、またはそれぞれがその一部を形成してもよく、またはそれらは、たとえば、ポリエチレングリコールリンカーなどのスペーサーによって共有結合されていてもよい。ｓａＲＮＡの少なくとも１つの鎖は、ターゲットアンチセンスＲＮＡに相補的な領域を含みうる。このような鎖は、ｓａＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖またはガイド鎖と呼ばれる。ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的な領域を含むｓａＲＮＡの第２鎖は、センス鎖またはパッセンジャー鎖と呼ばれる。
ｓａＲＮＡ二本鎖はまた、二本鎖領域を含むヘアピン構造を形成する少なくとも部分的に自己相補的な単一の分子からも形成されうる。そのような場合、「鎖」という用語は、ｓａＲＮＡの別の内部領域に相補的であるｓａＲＮＡの領域の１つを指す。ｓａＲＮＡのガイド鎖は、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物内の配列とのミスマッチが５以下、４以下、３以下、２以下、１以下であるか、またはまったくないであろう。
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡのパッセンジャー鎖は、ガイド鎖とのミスマッチと呼ばれる、ガイド鎖上の対応するヌクレオチドに相補的ではない少なくとも１つのヌクレオチドを含みうる。ガイド鎖とのミスマッチは、ガイド鎖の優先的なローディングを促進しうる（ウーら（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．），ＰＬｏＳ ＯＮＥ，ｖｏｌ．６（１２）：ｅ２８５８０（２０１１）、その内容の全体を本願明細書に援用する）。一実施形態では、ガイド鎖との少なくとも１つのミスマッチは、パッセンジャー鎖の３’末端にあってもよい。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端は、ガイド鎖との１～５のミスマッチを含みうる。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端は、ガイド鎖との２～３のミスマッチを含みうる。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端は、ガイド鎖との６～１０のミスマッチを含みうる。
一実施形態では、ｓａＲＮＡ二重鎖は、増殖細胞において有効性を示しうる。
ｓａＲＮＡ二重鎖は、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の領域に対してｓｉＲＮＡ様の相補性、つまり、ｓａＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’末端からのヌクレオチド２～６とターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の領域との間の１００％の相補性を有していてもよい。さらに、ｓａＲＮＡの他のヌクレオチドは、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の領域に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相補性を有していてもよい。たとえば、ｓａＲＮＡのヌクレオチド７（５’末端から数える）から３’末端までは、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の領域に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有し得る。
この文脈における「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与し、特定の遺伝子の発現を妨害または阻害する、典型的には２０～２５ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡを意味する。前記遺伝子はｓｉＲＮＡのターゲット遺伝子である。たとえば、Ａ３ＧＡＬＴ２遺伝子の発現を妨害するｓｉＲＮＡは「Ａ３ＧＡＬＴ２－ｓｉＲＮＡ」と呼ばれ、Ａ３ＧＡＬＴ２遺伝子がターゲット遺伝子である。ｓｉＲＮＡは通常約２１ヌクレオチドの長さであり、２本の鎖の両端に３’オーバーハング（たとえば２ヌクレオチド）を有する。
ｓｉＲＮＡは、特定の配列においてターゲット遺伝子の１つ以上のＲＮＡ転写物に結合し、その切断を促進することにより、ターゲット遺伝子の発現を阻害する。典型的には、ＲＮＡｉではＲＮＡ転写物はｍＲＮＡであるため、ｍＲＮＡの切断により遺伝子発現のダウンレギュレーションがもたらされる。本発明において、いかなる理論にも拘束されることを望まないが、可能なメカニズムの１つは、本発明のｓａＲＮＡが、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物に結合することによってターゲット遺伝子発現を調節しうるというものである。ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物は、切断されても、切断されなくてもよい。
二本鎖ｓａＲＮＡは、１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含みうる。二本鎖ｓａＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの文脈における「オーバーハング」または「テール」という用語は、ｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを指す。たとえば、ｓａＲＮＡの１つの鎖の３’末端が他の鎖の５’末端を越えて延在するかまたはその逆が成り立つ場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｓａＲＮＡは、少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハングを含みうると共に、代替的に、オーバーハングは、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、またはそれを超えるヌクレオチドを含みうる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含めてヌクレオチド／ヌクレオシドアナログを含みうるか、またはそれらからなりうる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそれらの任意の組合せに存在しうる。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または両末端に存在可能である。ハイブリダイゼーション時に１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように２つのオリゴヌクレオチドを設計する場合、かかるオーバーハングは相補性の決定に関してミスマッチと見なさないものとする。たとえば、１９ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと２１ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドとを含むｓａＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的な１９ヌクレオチドの配列を含む場合、本明細書に記載の目的では依然として「完全に相補的」と見なしうる。オーバーハングヌクレオチドは、天然または非天然ヌクレオチドでありうる。オーバーハングは、本明細書で定義される修飾ヌクレオチドでありうる。
一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖は、その３’末端に１～４ヌクレオチドのオーバーハング、またはその３’末端に１～２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡのセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡのセンス鎖は、その３’末端に１～４ヌクレオチドのオーバーハング、またはその３’末端に１～２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が３’オーバーハングを有する。３’オーバーハングは、１つ以上のウラシル、たとえば、配列ＵＵまたはＵＵＵを含みうる。一実施形態では、オーバーハング内の１つ以上のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられており、ここで、ヌクレオシド間結合はチオホスフェートである。一実施形態では、オーバーハングは、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、たとえば、配列ｄＴｄＴまたはｄＴｄＴｄＴを含む。一実施形態では、オーバーハングは、配列ｄＴ＊ｄＴを含み、ここで、「＊」はチオリン酸ヌクレオシド間結合（時として「ｓ」と呼ばれる）である。一実施形態では、オーバーハングは、少なくとも１つの２’－ＯＭｅ修飾Ｕ（ｕと呼ばれる）を含む。一実施形態では、オーバーハングは、ｕ＊ｕ（ｕｓｕとも呼ばれる）を含む。一実施形態では、オーバーハングは、ｕｕを含む。一実施形態では、オーバーハングは、逆結合（３’－３’または５’－５’結合）で鎖に接続されている逆位ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。たとえば、オーバーハングは、逆位のｄＴ、または逆位の脱塩基ヌクレオシドを含みうる。逆位脱塩基ヌクレオシドは塩基部分を持たない。
当業者は、ｓａＲＮＡがターゲット遺伝子発現を調節するメカニズムに関係なく、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物またはターゲティングされる配列を参照することによって本発明のｓａＲＮＡを定義することが便利であることを理解するであろう。しかしながら、本発明のｓａＲＮＡは、代替的にターゲット遺伝子を参照することによって定義されてもよい。ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物はターゲット遺伝子のコード鎖のゲノム領域に相補的であり、本発明のｓａＲＮＡは、次に、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の領域に対して相補的であるため、本発明のｓａＲＮＡは、ターゲット遺伝子のコード鎖の領域との配列同一性を有すると定義されうる。ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物を参照することによる本発明のｓａＲＮＡの定義に関して本明細書で論じられる特徴はすべて、しかるべき変更を加えて、ターゲット遺伝子を参照することによる本発明のｓａＲＮＡの定義にも当てはまるため、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物との相補性に関するいずれの考察もターゲット遺伝子のゲノム配列に対する同一性を含むと理解すべきである。したがって、本発明のｓａＲＮＡは、ターゲット遺伝子のゲノム配列との高いパーセントの同一性、たとえば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％または１００％の同一性を有しうる。ゲノム配列は、ターゲット遺伝子の転写開始部位の上流または下流の２０００、１０００、５００、２５０、または１００ヌクレオチドまででありうる。それはターゲット遺伝子のプロモータ領域にアライメントしうる。したがって、ｓａＲＮＡは、ターゲット遺伝子のプロモータ領域にアライメントする配列との配列同一性を有しうる。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡを設計するためにターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の存在を決定する必要はない。換言すれば、ｓａＲＮＡの設計はターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の同定を必要としない。たとえば、ＴＳＳコアのヌクレオチド配列、すなわち、ターゲット遺伝子の転写開始部位の上流の２０００ヌクレオチド領域の配列からターゲット遺伝子の転写開始部の下流の２０００ヌクレオチドまでは、ターゲット遺伝子のコード鎖のゲノム配列により、シーケンシングにより、またはデータベース検索により得られうる。テンプレート鎖のＴＳＳコアの１位～４００１位の任意の位置から開始するＴＳＳコア内のターゲティングされる配列を選択可能であり、次いで、ｓａＲＮＡ配列を設計するためにそれを使用可能である。以上で考察したように、ｓａＲＮＡは、ターゲティングされる配列の逆相補体との高度の配列同一性を有する。
次いで、全ゲノムのｓａＲＮＡ配列のオフターゲットヒット数、０ミスマッチ（０ｍｍ）ヒット数、および１ミスマッチ（１ｍｍ）ヒット数を決定する。「オフターゲットヒット数」という用語は、ターゲット遺伝子のテンプレート鎖上のｓａＲＮＡにターゲティングされる配列と同一の全ゲノム中の他の部位の数を意味する。「０ｍｍヒット数」という用語は、ｓａＲＮＡのターゲット転写物以外の公知のタンパク質コード転写物のうち、その相補体にｓａＲＮＡが０ミスマッチでハイブリダイズまたは結合しうるものの数を意味する。換言すれば、「０ｍｍヒット数」は、ｓａＲＮＡ配列と完全に同一の領域を含むｓａＲＮＡのターゲット転写物以外の公知のタンパク質コード転写物の数をカウントする。「１ｍｍヒット数」という用語は、ｓａＲＮＡのターゲット転写物以外の公知のタンパク質コード転写物のうち、その相補体にｓａＲＮＡが１ミスマッチでハイブリダイズまたは結合しうるものの数を意味する。換言すれば、「１ｍｍヒット数」は、１ミスマッチのみを有してｓａＲＮＡ配列と同一の領域を含むｓａＲＮＡのターゲット転写物以外の公知のタンパク質コード転写物の数をカウントする。一実施形態では、オフターゲットヒットなし、０ｍｍヒットなし、かつ１ｍｍヒットなしのｓａＲＮＡ配列のみを選択する。本出願に開示されるｓａＲＮＡ配列は、それぞれオフターゲットヒットなし、０ｍｍヒットなし、かつ１ｍｍヒットなしである。
２０１１年６月２３日に出願された米国特許出願公開第２０１３／０１６４８４６号明細書（ｓａＲＮＡアルゴリズム）（その内容の全体を本願明細書に援用する）に開示される方法は、ｓａＲＮＡを設計するためにも使用されうる。ｓａＲＮＡの設計は、コーリら（Ｃｏｒｅｙ ｅｔ ａｌ．）の米国特許第８，３２４，１８１号明細書および米国特許第７，７０９，５６６号明細書、リーら（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．）の米国特許出願公開第２０１０／０２１０７０７号明細書、ならびにボウティラら（Ｖｏｕｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．），Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ｖｏｌ．１，ｅ３５（２０１２）にも開示されており、それぞれの内容の全体を本願明細書に援用する。
「存在の決定」とは、ターゲット遺伝子の遺伝子座の周りのＥＳＴおよび／もしくはアンチセンスＲＮＡ転写物のデータベースを探索して好適なターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物を同定すること、またはＲＴ－ＰＣＲもしくは任意の他の公知の技術を用いて細胞内のターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の物理的存在を確認することのいずれかを意味する。
いくつかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、一本鎖または二本鎖でありうる。二本鎖分子は第１の鎖と第２の鎖とを含む。二本鎖の場合、二本鎖の各鎖は、少なくとも１４または少なくとも１８ヌクレオチド長、たとえば、１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド長でありうる。二本鎖は、少なくとも１２、または少なくとも１５、または少なくとも１７、または少なくとも１９ヌクレオチドの長さ全体にわたりハイブリダイズしうる。各鎖はちょうど１９ヌクレオチド長でありうる。この長さを超えるオリゴヌクレオチド二本鎖はインターフェロン反応を誘導するリスクを増加させうるため、好ましくはｓａＲＮＡの長さは３０ヌクレオチド未満である。一実施形態では、ｓａＲＮＡの長さは１９～２５ヌクレオチドである。ｓａＲＮＡ二本鎖を形成する鎖は等しい、または等しくない長さでありうる。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ターゲティングされる配列との少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する少なくとも１４ヌクレオチドかつ３０ヌクレオチド未満の配列を含む。一実施形態では、ターゲティングされる配列に対する少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、もしくは１９ヌクレオチド長または１８～２２または１９～２１またはちょうど１９ヌクレオチド長である。
本発明のｓａＲＮＡは、ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物に相補的でない短い３’または５’配列を含みうる。一実施形態では、かかる配列は鎖の３’末端にある。配列は、１～５ヌクレオチド長または２もしくは３ヌクレオチド長でありうる。配列はウラシルを含みうるため、２または３ウラシルの３’ストレッチでありうる。配列は、ｄＴなどのデオキシリボヌクレオシドを１つ以上含みうる。一実施形態では、配列内の１つ以上のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられており、ここで、ヌクレオシド間結合はチオホスフェートである。非限定的な例として、配列は、配列ｄＴ＊ｄＴを含み、ここで、＊はチオリン酸ヌクレオシド間結合である。この非相補的配列は「テール」と呼ばれうる。３’テールが存在する場合、鎖はより長くなってもよく、たとえば、１９ヌクレオチド＋ＵＵまたはＵＵＵでありうる３’テールであってもよい。かかる３’テールは、ｓａＲＮＡとターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物との間の相補性の決定に関してミスマッチと見なさないものとする。
したがって、本発明のｓａＲＮＡは、（ｉ）ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の領域との少なくとも８０％の相補性を有する配列と（ｉｉ）ウラシル残基を含みうるか、またはそれからなりうる１～５ヌクレオチドの３’テールとからなりうる。したがって、ｓａＲＮＡは、存在するのであれば３’テールを除いて、典型的にはその全長にわたりターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の領域との相補性を有するであろう。本出願に開示されるｓａＲＮＡ配列はいずれもかかる３’テールを任意選択的に含みうる。したがって、ｓａＲＮＡの表および配列リストに開示されるｓａＲＮＡ配列はいずれもかかる３’テールを任意選択的に含みうる。本発明のｓａＲＮＡは、ダイサーまたはドローシャの基質配列をさらに含みうる。
本発明のｓａＲＮＡはフランキング配列を含有しうる。フランキング配列は、本発明のｓａＲＮＡの３’末端または５’末端に挿入されうる。一実施形態では、フランキング配列は、ｓａＲＮＡにｍｉＲＮＡ構成を持たせるｍｉＲＮＡの配列であり、ドローシャおよびダイサーで処理しうる。非限定的な例では、本発明のｓａＲＮＡは２本の鎖を有し、マイクロＲＮＡ前駆体、たとえば、ｍｉＲ－３０骨格フランキング配列にクローニングされる。
本発明のｓａＲＮＡは、制限酵素の基質または認識配列を含みうる。制限酵素の認識配列は、本発明のｓａＲＮＡの３’末端または５’末端にあってもよい。制限酵素の非限定的な例は、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩを含む。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは安定に塩基対合されて一体化された２つの鎖からなる。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖とのミスマッチと呼ばれる、ガイド鎖上の対応するヌクレオチドに相補的ではない少なくとも１つのヌクレオチドを含みうる。一実施形態では、ガイド鎖との少なくとも１つのミスマッチは、パッセンジャー鎖の３’末端にあってもよい。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端は、ガイド鎖との１～５のミスマッチを含みうる。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端は、ガイド鎖との２～３のミスマッチを含みうる。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端は、ガイド鎖との６～１０のミスマッチを含みうる。
いくつかの実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡは、３’オーバーハングを形成する各鎖の３’末端にいくつかの非対合ヌクレオチドを含みうる。各鎖の３’オーバーハングを形成する非対合ヌクレオチドの数は、１～５ヌクレオチドもしくは１～３ヌクレオチドの範囲内または２ヌクレオチドでありうる。３’オーバーハングは上述した３’テールに形成しうるため、３’テールは二本鎖ｓａＲＮＡの３’オーバーハングでありうる。
したがって、本発明のｓａＲＮＡは一本鎖でありうると共に、（ｉ）ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の領域との少なくとも８０％の相補性を有する配列と（ｉｉ）ウラシル残基を含みうる１～５ヌクレオチドの３’テールとからなる。本発明のｓａＲＮＡは、存在するのであれば３’テールを除いて、その全長にわたりターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の領域との相補性を有しうる。上述したように、「ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物に相補的」である代わりに、本発明のｓａＲＮＡはまた、ターゲット遺伝子のコード鎖との「同一性」を有するものとして定義しうる。本発明のｓａＲＮＡは二本鎖でありうると共に、（ｉ）ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の領域との少なくとも８０％の相補性を有する第１の配列と（ｉｉ）１～５ヌクレオチドの３’オーバーハングとを含む第１の鎖と、（ｉ）第１の配列と二本鎖を形成する第２の配列と（ｉｉ）１～５ヌクレオチドの３’オーバーハングとを含む第２の鎖とからなる。
本明細書に記載されるように、ターゲット遺伝子のゲノム配列は、ターゲット遺伝子のｓａＲＮＡを設計するために使用されうる。ターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の配列は、ターゲット遺伝子のｓａＲＮＡを設計するためのターゲット遺伝子の配列から決定されうる。しかしながら、そのようなターゲットアンチセンスＲＮＡ転写物の存在を決定する必要はない。
本発明の１つの側面は、ターゲット遺伝子の発現を調節するｓａＲＮＡを提供する。ターゲット転写物のレベルを調節するｓａＲＮＡもまた提供される。いくつかの実施形態において、ターゲット転写物は、コード転写物、たとえば、ｍＲＮＡである。本発明の別の側面は、ターゲットコード転写物によってコードされるタンパク質のレベルを調節するｓａＲＮＡを提供する。一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡの非存在下におけるターゲット遺伝子の発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、ターゲット遺伝子の発現が、少なくとも２０、３０、４０％、または少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、もしくは少なくとも８０％増加する。さらなる実施形態では、本発明のｓａＲＮＡの非存在下におけるターゲット遺伝子の発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、ターゲット遺伝子の発現が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、または少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍増加する。ターゲット遺伝子の発現の調節は、ターゲット遺伝子をコードするｍＲＮＡレベルの変化によって反映または決定されうる。
本発明のｓａＲＮＡは、任意の適切な方法によって、たとえば、合成的に、または当業者に周知の標準的な分子生物学的技術を使用して細胞内で発現させることによって生成されうる。たとえば、本発明のｓａＲＮＡは、当技術分野で公知の方法を使用して、化学的に合成されるか、または組換え的に生成されうる。
本発明のｓａＲＮＡは一本鎖であってもよく、１４～３０ヌクレオチドを含む。一本鎖ｓａＲＮＡの配列は、限定されるものではないが、その内容の全体を本願明細書に援用する国際公開第２０１６１７０３４８号の配列番号４０４８～３１５２３５、３１８７２７～５８４７８４、５８９０６２～９１３３０９、９１７５３２～１２４１０７９、１２４５４０２～１５５９９３１、１５６４３７３～１８７９１８８、および１８８９２０８～２５８５２５９などの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の同一性を有していてもよい。
一実施形態では、一本鎖ｓａＲＮＡは、限定されるものではないが、その内容の全体を本願明細書に援用する国際公開第２０１６１７０３４８号の配列番号４０４８～３１５２３５、３１８７２７～５８４７８４、５８９０６２～９１３３０９、９１７５３２～１２４１０７９、１２４５４０２～１５５９９３１、１５６４３７３～１８７９１８８および１８８９２０８～２５８５２５９などの配列を含む。
一実施形態では、ｓａＲＮＡは、本出願の冒頭で参照された配列表に記載されているアンチセンス配列のいずれかなどであるが、それらに限定はされないアンチセンス配列を含む一本鎖ｓａＲＮＡである。
一実施形態では、ｓａＲＮＡは、本出願の冒頭で参照された配列表に記載されているセンス配列のいずれかなどであるが、それらに限定はされないアンチセンス配列を含む一本鎖ｓａＲＮＡである。
本発明の一本鎖ｓａＲＮＡは、修飾されていても、修飾されていなくてもよい。
一実施形態では、一本鎖ｓａＲＮＡは３’テールを有しうる。
一実施形態では、ｓａＲＮＡは、二本鎖でありうる。２本の鎖はｓａＲＮＡ二重鎖としても公知の二重鎖を形成し、各鎖は１４～３０ヌクレオチドを含む。二本鎖ｓａＲＮＡの第１の鎖は、限定されるものではないが、その内容の全体を本願明細書に援用する国際公開第２０１６１７０３４８号の配列番号４０４８～３１５２３５、３１８７２７～５８４７８４、５８９０６２～９１３３０９、９１７５３２～１２４１０７９、１２４５４０２～１５５９９３１、１５６４３７３～１８７９１８８、および１８８９２０８～２５８５２５９などの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の同一性を有していてもよい。一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡの第１鎖は、限定されるものではないが、配列番号４０４８～３１５２３５、３１８７２７～５８４７８４、５８９０６２～９１３３０９、９１７５３２～１２４１０７９、１２４５４０２～１５５９９３１、１５６４３７３～１８７９１８８および１８８９２０８～２５８５２５９などの配列を含む。二本鎖ｓａＲＮＡの第２の鎖は、限定されるものではないが、その内容の全体を本願明細書に援用する国際公開第２０１６１７０３４８号の配列番号４０４８～３１５２３５、３１８７２７～５８４７８４、５８９０６２～９１３３０９、９１７５３２～１２４１０７９、１２４５４０２～１５５９９３１、１５６４３７３～１８７９１８８、および１８８９２０８～２５８５２５９などの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の同一性を有していてもよい。一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡの第２の鎖は、限定されるものではないが、その内容の全体を本願明細書に援用する国際公開第２０１６１７０３４８号の配列番号４０４８～３１５２３５、３１８７２７～５８４７８４、５８９０６２～９１３３０９、９１７５３２～１２４１０７９、１２４５４０２～１５５９９３１、１５６４３７３～１８７９１８８および１８８９２０８～２５８５２５９などの配列を含む。一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡは、各鎖に３’オーバーハングを有していてもよい。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ｓａＲＮＡ二重鎖である。ｓａＲＮＡ二重鎖は、本出願の冒頭で参照された配列表に記載されているセンス配列および対応するアンチセンス配列のいずれかなどであるが、それらに限定されないセンス配列およびアンチセンス配列の対であってもよい。本発明のｓａＲＮＡは、本出願の冒頭で参照された配列表に記載されているセンス配列とアンチセンス配列の対でありうる。
本発明の二本鎖ｓａＲＮＡは、修飾されていても、修飾されていなくてもよい。
二機能オリゴヌクレオチド
二機能または二重機能性オリゴヌクレオチド、たとえば、ｓａＲＮＡは、第１の遺伝子の発現をアップレギュレートし、少なくとも１つの第２の遺伝子の発現をダウンレギュレートするように設計されてもよい。二重機能性オリゴヌクレオチドの一方の鎖は、第１の遺伝子の発現を活性化し、もう一方の鎖は、第２の遺伝子の発現を阻害する。各鎖は、ダイサー基質配列をさらに含んでいてもよい。
ｓａＲＮＡの化学修飾
本明細書では、ｓａＲＮＡにおいて「修飾」または必要に応じて「修飾された」という用語は、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣリボヌクレオチドに対する構造修飾および／または化学修飾を意味する。本発明のｓａＲＮＡ中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを含みうる。本発明のｓａＲＮＡは、任意の有用な修飾、たとえば、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合（たとえば、結合ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格）に対する修飾を含みうる。ピリミジン核酸塩基の１個以上の原子は、任意選択的に置換されたアミノ、任意選択的に置換されたチオール、任意選択的に置換されたアルキル（たとえば、メチルもしくはエチル）、またはハロ（たとえば、クロロもしくはフルオロ）により置き換えられうるか、または置換されうる。特定の実施形態では、修飾（たとえば、１つ以上の修飾）は糖およびヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。本発明にかかる修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはそれらのハイブリッドをもたらすリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾でありうる。非限定的な例では、Ｕの２’－ＯＨが２’－ＯＭｅで置換される。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、本明細書に記載の少なくとも１つの修飾を含みうる。
別の実施形態では、ｓａＲＮＡは、ｓａＲＮＡ二重鎖であり、センス鎖およびアンチセンス配列は、独立して、少なくとも１つの修飾を含みうる。非限定的な例として、センス配列は修飾を含んでいてもよく、アンチセンス鎖は修飾されていなくてもよい。別の非限定的な例として、アンチセンス配列は修飾を含んでいてもよく、センス鎖は修飾されていなくてもよい。さらに別の非限定的な例として、センス配列は２つ以上の修飾を含んでいてもよく、アンチセンス鎖は１つの修飾を含んでいてもよい。非限定的な例として、アンチセンス配列は２つ以上の修飾を含んでいてもよく、センス鎖は１つの修飾を含んでいてもよい。
本発明のｓａＲＮＡは、糖、核酸塩基、および／またはヌクレオシド間結合への修飾の組合せを含みうる。これらの組合せは、本明細書または２０１２年１０月３日に出願された国際公開第２０１３／０５２５２３号に記載のいずれか１つ以上の修飾、特に式（Ｉａ）～（Ｉａ－５）、（Ｉｂ）～（Ｉｆ）、（ＩＩａ）～（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ－１）、（ＩＩｂ－２）、（ＩＩｃ－１）～（ＩＩｃ－２）、（ＩＩｎ－１）、（ＩＩｎ－２）、（ＩＶａ）～（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）～（ＩＸｒ））（その内容の全体を本願明細書に援用する）を含みうる。
本発明のｓａＲＮＡは、分子の全長に沿って均一に修飾されていても、されていなくてもよい。たとえば、本発明のｓａＲＮＡでは１つ以上またはすべてのタイプのヌクレオチド（たとえば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくはすべて）を均一に修飾されていても、されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡのすべてのヌクレオチドＸが修飾されており、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、または組合せＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つでありうる。
さまざまな糖修飾、ヌクレオチド修飾、および／またはヌクレオシド間結合（たとえば、骨格構造）が、ｓａＲＮＡの種々の位置に存在しうる。ｓａＲＮＡの機能が実質的に低減されないようにｓａＲＮＡの任意の位置にヌクレオチドアナログまたは他の修飾を配置しうることは、当業者であれば分かるであろう。本発明のｓａＲＮＡは、修飾ヌクレオチドを約１％～約１００％（全ヌクレオチド分を基準にして、または１つ以上のタイプのヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのいずれか１つ以上を基準にして）または任意の介在パーセント（たとえば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、および９５％～１００％）で含有しうる。
いくつかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、環状核酸となるように修飾されうる。本発明のｓａＲＮＡの末端は、化学試薬または酵素によって連結されて、自由端を有さない環状ｓａＲＮＡを生成してもよい。環状ｓａＲＮＡは、線状の対応物よりも安定しており、ＲＮａｓｅ Ｒエキソヌクレアーゼによる消化に耐性があると予想される。環状ｓａＲＮＡは、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣリボヌクレオチドに関する他の構造的および／または化学的修飾をさらに含みうる。
本発明のｓａＲＮＡは、２０１３年１０月１０日に公開されたＰＣＴ国際公開第２０１３／１５１６６６号の１３６～２４７ページに開示されているオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの任意の修飾で修飾されていてもよく、その内容の全体を本願明細書に援用する。
本発明のｓａＲＮＡは、修飾の組合せを含みうる。ｓａＲＮＡは、各鎖について少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の修飾を含みうる。
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡは、少なくとも５０％修飾されており、たとえば、ヌクレオチドの少なくとも５０％が修飾されている。いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡは、少なくとも７５％修飾されており、たとえば、ヌクレオチドの少なくとも７５％が修飾されている。ある実施形態では、ｓａＲＮＡの両鎖は、全長にわたって修飾されていてもよい（１００％修飾）。ヌクレオチド（糖、塩基およびリン酸部分、たとえばリンカー）はそれぞれ修飾されうるので、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの任意の部分への任意の修飾が、修飾を構成することを理解されたい。
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡは、ヌクレオチドの１つの成分のみにおいて少なくとも１０％修飾され、かかる成分は、核酸塩基、糖、またはヌクレオシド間の結合から選択される。たとえば、ｓａＲＮＡの修飾は、当該ｓａＲＮＡの核酸塩基、糖、または結合の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％に対して行われうる。
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡは、少なくとも１つの糖修飾を含む。糖修飾の非限定的な例は、以下を含みうる：
Figure 2022545101000011
Figure 2022545101000012
いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡのヌクレオチドの糖の２’位（ＲＮＡではＯＨ、ＤＮＡではＨ）の少なくとも１つが－ＯＭｅで置換されており、２’－ＯＭｅと称される。
Figure 2022545101000013
いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡのヌクレオチドの糖の２’位（ＲＮＡではＯＨ、ＤＮＡではＨ）の少なくとも１つが－Ｆで置換されており、２’－Ｆと称される。
Figure 2022545101000014
いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡは、ヌクレオチド間に少なくとも１つのホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合を含む。
いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡは、３’および／または５’のキャッピングまたはオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、少なくとも１つの逆位デオキシリボヌクレオシドオーバーハング（たとえば、ｄＴ）を含んでいてもよい。逆位オーバーハング、たとえば、ｄＴは、パッセンジャー（センス）鎖の５’末端または３’末端にありうる。いくつかの実施形態において、本発明のｓａＲＮＡは、パッセンジャー鎖上に逆位脱塩基修飾を含んでいてもよい。少なくとも１つの逆位脱塩基修飾は、パッセンジャー鎖の５’末端、または３’末端、または両末端にあってもよい。逆位脱塩基修飾は、ガイド（アンチセンス）鎖の優先的なローディングを促しうる。
いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡは、少なくとも１つの５’－（Ｅ）－ビニルホスホン酸（５’－Ｅ－ＶＰ）修飾を含む。
Figure 2022545101000015
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡは、修飾として、非環式核酸アナログである少なくとも１つのグリコール核酸（ＧＮＡ）を含む。
Figure 2022545101000016
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡは、同じ糖修飾を有する少なくとも２つの連続するヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含む。一例では、そのようなモチーフは、２つまたは３つの連続したヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態において、モチーフの連続するヌクレオチドは、２’－Ｆ修飾を含む。いくつかの実施形態において、モチーフの連続するヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾を含む。
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡが二本鎖である場合、ｓａＲＮＡのパッセンジャー鎖およびガイド鎖はそれぞれ、同じ糖修飾を有する連続するヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含む。
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡのパッセンジャー鎖およびガイド鎖はそれぞれ、同じ糖修飾を有する連続するヌクレオチドの少なくとも２つのモチーフを含む。いくつかの実施形態において、所与の鎖上の少なくとも２つのモチーフは、独立して、異なる糖修飾を有する。たとえば、パッセンジャー鎖またはガイド鎖は、２’－ＯＭｅ修飾の少なくとも１つのモチーフおよび２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを有しうる。いくつかの実施形態では、所定の鎖上の少なくとも２つのモチーフは、少なくとも１つ（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０など）のヌクレオチドによって分離されている。いくつかの実施形態では、所与の鎖上の少なくとも２つのモチーフは、接続されている。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖上の少なくとも１つのモチーフおよびガイド鎖上のその相補的モチーフは、異なる糖修飾を有する。たとえば、パッセンジャー鎖上のモチーフのヌクレオチドは２’－Ｆ修飾を有し、ガイド鎖上のモチーフのヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾を有し、ここで２つのモチーフは互いに相補的である。別の例では、パッセンジャー鎖上のモチーフのヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾を有し、ガイド鎖上のモチーフのヌクレオチドは２’－Ｆ修飾を有し、ここで、２つのモチーフは互いに相補的である。
いくつかの実施形態では、モチーフの修飾は、モチーフの両側のすぐに隣接するヌクレオチドの修飾とは異なる。
いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡは、交互に糖が修飾された少なくとも１つのモチーフを含む。一例では、交互に糖が修飾されたモチーフは、２～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、モチーフは、２’－Ｆおよび２’－ＯＭｅ修飾を交互に含む。
いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡが二本鎖である場合、パッセンジャー鎖およびガイド鎖はそれぞれ、交互に糖が修飾された少なくとも１つのモチーフを含む。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖上の少なくとも１つのヌクレオチドおよびガイド鎖上のその相補的ヌクレオチドは、異なる糖修飾を有する。たとえば、パッセンジャー鎖上の塩基対の一方のヌクレオチドは２’－Ｆ修飾を有し、ガイド鎖上の塩基対のもう一方のヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾を有する。別の例では、パッセンジャー鎖の塩基対の一方のヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾を有し、ガイド鎖の塩基対のもう一方のヌクレオチドは２’－Ｆ修飾を有する。
いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡは二本鎖であり、以下の一般式を有する：
パッセンジャー（センスまたはＳＳ）：５’オーバーハング１－ＮＴ１－（ＸＸＸ－ＮＴ２）ｎ－オーバーハング２ ３’、
ガイド（アンチセンスまたはＡＳ）：３’オーバーハング３－ＮＴ１’－（ＹＹＹ－ＮＴ２’）ｎ－オーバーハング４ ５’、（Ｉ）
ここで、
各鎖の長さは１４～３０ヌクレオチドであり、
オーバーハング１、オーバーハング２、オーバーハング３およびオーバーハング４は、それぞれ独立して、０～５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
ＮＴ１およびＮＴ１’は、０～２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、ＮＴ１はＮＴ１’に相補的であり、
ＸＸＸ－ＮＴ２およびＹＹＹ－ＮＴ２’の各々は、独立して、連続するヌクレオチドのモチーフを表し、ここで、最初の３つの連続するヌクレオチドは、同じ化学修飾を有し、その後に０～２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列が続き、ここで、ＸＸＸはＹＹＹに相補的であり、ＮＴ２はＮＴ２’に相補的であり、
ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ１’、およびＮＴ２’のそれぞれは、少なくとも１つの化学修飾を含み、
ｎは１から５までの数字である。
式（Ｉ）を有するｓａＲＮＡのガイド鎖は、ターゲット遺伝子のテンプレート鎖上のＴＳＳコアに位置するターゲティングされる配列の逆相補体と少なくとも８０％同一である配列を含む。言い換えれば、式（Ｉ）を有するｓａＲＮＡのガイド鎖は、ターゲット遺伝子のテンプレート鎖上のＴＳＳコアに位置するターゲティングされる配列に少なくとも８０％相補的である配列を含む。「ターゲティングされる配列」と「ＴＳＳコア」は上記で定義されている。
ＸＸＸとＹＹＹにおける３つの連続したヌクレオチドは、同じである必要はない。それらは同じ化学修飾を有している必要があるだけである。
いくつかの場合、各鎖は、１４～１７ヌクレオチド、１７～２５ヌクレオチド、１７～２３ヌクレオチド、２３～２７ヌクレオチド、１９～２１ヌクレオチド、２１～２３ヌクレオチド、または２７～３０ヌクレオチドを含む。
いくつかの場合、各鎖は少なくとも１つの糖修飾を含む。
いくつかの場合、パッセンジャー鎖上の少なくとも１つのヌクレオチドおよびガイド鎖上のその相補的ヌクレオチドは、異なる糖修飾を有する。
いくつかの場合、ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ１’、およびＮＴ２’は、交互の２’－ＯＭｅおよび２’－Ｆ修飾のような、交互の修飾を有する。
いくつかの場合、ＸＸＸの連続する３つのヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾を有し、ＹＹＹの連続する３つのヌクレオチドは２’－Ｆ修飾を有する。
いくつかの場合、ＸＸＸの３つの連続したヌクレオチドは２’－Ｆ修飾を有し、ＹＹＹの３つの連続したヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾を有する。
いくつかの場合、ＸＸＸまたはＹＹＹの修飾は、ＸＸＸまたはＹＹＹの両側のすぐに隣接するヌクレオチドの修飾とは異なる。
いくつかの場合、ＹＹＹモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から８、９、１０、１１、１２、または１３番目の位置から開始しうる。
いくつかの場合、ＸＸＸモチーフは、センス鎖の３’末端から８、９、１０、１１、１２、または１３番目の位置から開始しうる。
いくつかの場合、オーバーハング１、オーバーハング２、オーバーハング３および／またはオーバーハング４はｕｕを含む。
いくつかの場合、オーバーハング１、オーバーハング２、および／またはオーバーハング３は、逆位ｄＴを含む。
いくつかの場合、オーバーハング１、オーバーハング２、および／またはオーバーハング３は、逆位脱塩基ヌクレオシドを含む。
いくつかの場合、ｓａＲＮＡは、ヌクレオチド間に少なくとも１つのホスホロチオエート結合（
Figure 2022545101000017
、配列中ではｓと呼ばれる）またはメチルホスホネート結合を含む。ホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合は、１本の鎖、たとえば、センス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端にありうる。たとえば、アンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングはｕｓｕであってもよい。
いくつかの場合、ｓａＲＮＡのパッセンジャー鎖はその３’末端または５’末端にリンカーを含み、これは、部分がパッセンジャー鎖の３’末端または５’末端に結合されることを可能とする。オーバーハング１またはオーバーハング２はリンカーを含みうる。リンカーは、ＮＨ２－（ＣＨ２）６－－（配列中ではＮＨ２Ｃ６と呼ばれる）などの任意の適切なリンカーでありうる。リンカーとパッセンジャー鎖の間にホスホロチオエート結合が存在してもよい。
いくつかの実施形態において、修飾されたｓａＲＮＡは、修飾されていないバージョンと比較して改善された安定性を有する。修飾ｓａＲＮＡの血清半減期は、修飾されていないバージョンよりも少なくとも約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、７８時間、８４時間、９０時間または９６時間長くなりうる。いくつかの実施形態において、修飾されたｓａＲＮＡは、少なくとも４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、または９６時間の半減期を有する。
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡは、ＣＥＢＰＡをアップレギュレートする。少なくとも１つの修飾を伴うＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ配列の非限定的な例は、表２のｓａＲＮＡを含む。親配列は修飾を有さない。
Figure 2022545101000018
任意の修飾ｓａＲＮＡ上の（ＮＨ２Ｃ６）リンカーは、別の適切なリンカーで置き換えられうる。
一実施形態では、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡは式（Ｉ）を含む。ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＣＥＢＰＡ ＴＳＳコア上の領域の逆相補体と少なくとも８０％同一である。一般式（Ｉ）を有するＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡの非限定的な例は、Ｓ６（ＸＤ－０６４１４、配列番号１４および１５）を含む。
ｓａＲＮＡコンジュゲートおよび組合せ
コンジュゲーションは、安定性および／または半減期の増加をもたらしうると共に、細胞、組織、または生物において本発明のｓａＲＮＡを特定の部位にターゲティングするのに特に有用でありうる。本発明のｓａＲＮＡは、他のポリヌクレオチド、色素、インターカレート剤（たとえば、アクリジン）、架橋剤（たとえば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（たとえば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（たとえば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（たとえば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（たとえば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（たとえば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、たとえば、糖タンパク質、またはペプチド、たとえば、共リガンドへの特異的親和性を有する分子、または抗体、たとえば、癌細胞、内皮細胞、骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモンレセプター、非ペプチド種、たとえば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、または薬物にコンジュゲートされるように設計可能である。核酸分子に好適なコンジュゲートは、２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第２０１３／０９０６４８号（その内容の全体を本願明細書に援用する）に開示されている。
本発明によれば、本発明のｓａＲＮＡは、さまざまな機能を達成するために、ＲＮＡｉ剤、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、エンハンサーＲＮＡ、エンハンサー由来ＲＮＡまたはエンハンサー駆動ＲＮＡ（ｅＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重螺旋形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどの１つ以上と共に投与しうるか、またはそれらをさらに含みうる。１つ以上のＲＮＡｉ剤、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重螺旋形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、またはベクターは、少なくとも１つの修飾または置換を含みうる。
いくつかの実施形態において、修飾は、糖位置での核酸の化学的置換、リン酸位置での化学的置換、および塩基位置での化学的置換から選択される。他の実施形態では、化学修飾は、修飾されたヌクレオチドの取込み、３’キャッピング、高分子量非免疫原性化合物へのコンジュゲーション、親油性化合物へのコンジュゲーション、およびホスフェート骨格へのホスホロチオエートの取込みから選択される。一実施形態では、高分子量非免疫原性化合物はポリアルキレングリコールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
一実施形態において、少なくとも１つの修飾を含むｓａＲＮＡは、増殖細胞において有効性を示しうる。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータから共発現できるようにトランスジーンに結合しうる。非限定的な例では、本発明のｓａＲＮＡは緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）に結合される。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーに結合することによりｓａＲＮＡ－アプタマーコンジュゲートを生成しうる。アプタマーは、高い選択性、親和性、および安定性を有するオリゴヌクレオチドまたはペプチドである。それは特異的かつ安定な三次元形状をとることによりターゲット分子へのきわめて特異的な緊密結合を提供する。アプタマーは、低分子、タンパク質、核酸などの種々の分子ターゲット、さらには細胞、組織、および生物に結合するように、インビトロ選択の繰返しラウンドまたは均等にＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）により工学操作された核酸種でありうる。核酸アプタマーは、典型的なワトソン・クリック塩基対合以外の相互作用により分子への特異的結合親和性を有する。核酸アプタマーは、ファージディスプレイまたはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により生成されたペプチドのように、選択されたターゲットに特異的に結合可能であり、かつ結合を介してそのターゲットの機能する能力をブロックする。いくつかの場合、アプタマーはまたペプチドアプタマーでありうる。いずれかの特異的分子ターゲットでは、核酸アプタマーは、たとえばＳＥＬＥＸにより核酸のコンビナトリアルライブラリーから同定可能である。ペプチドアプタマーは酵母ツーハイブリッド系を用いて同定されうる。したがって、当業者であれば、肝細胞などのターゲット細胞に本発明のｓａＲＮＡまたは細胞を送達するのに好適なアプタマーを設計可能である。ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、およびペプチドアプタマーが企図される。肝臓特異的アプタマーを用いて本発明のｓａＲＮＡを肝臓に投与することは好ましい。
本明細書で用いられる場合、典型的な核酸アプタマーは、約１０～１５ｋＤａのサイズ（２０～４５ヌクレオチド）であり、そのターゲットに少なくともナノモル親和性で結合し、かつ関連性の高いターゲットを識別する。核酸アプタマーは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはリボ核酸とデオキシリボ核酸との混合でありうる。アプタマーは、一本鎖のリボ核酸、デオキシリボ核酸、またはリボ核酸とデオキシリボ核酸との混合でありうる。アプタマーは、少なくとも１つの化学修飾を含みうる。
アプタマーに好適なヌクレオチド長は約１５～約１００ヌクレオチド（ｎｔ）の範囲内であり、種々の他の実施形態では、１５～３０ｎｔ、２０～２５ｎｔ、３０～１００ｎｔ、３０～６０ｎｔ、２５～７０ｎｔ、２５～６０ｎｔ、４０～６０ｎｔ、２５～４０ｎｔ、３０～４０ｎｔ、次の値、すなわち、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０ｎｔのいずれか、または４０～７０ｎｔの長さである。しかしながら、配列は、本明細書に記載の距離でアプタマーと２つのターゲットとの相互作用に適合できるように十分な柔軟性を有して設計可能である。アプタマーは、ヌクレアーゼ活性および他の酵素活性からの保護を提供するようにさらに修飾されうる。アプタマー配列は、当技術分野で公知の任意の好適な方法により修飾可能である。
ｓａＲＮＡ－アプタマーコンジュゲートは、２つの部分を結合するための任意の公知の方法、たとえば、直接化学結合形成、ストレプトアビジンなどのリンカーを介する結合などを用いて形成されうる。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは抗体に結合されていてもよい。ターゲット細胞表面レセプターに対する抗体を生成する方法は周知である。本発明のｓａＲＮＡ分子は、公知の方法を用いて、たとえば、ＲＮＡ担体タンパク質を用いて、かかる抗体に結合されうる。次いで、得られた複合体は、対象に投与してレセプター媒介エンドサイトーシスによりターゲット細胞に取り込みうる。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、脂質部分、たとえばコレステロール部分（レットシンガーら（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３－６５５６）、コール酸（マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、たとえばベリル－５－トリチルチオール（マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．），Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６－３０９；マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（オーバーハウザら（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３－５３８）、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（サイソン－ベーモアラスら（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．），ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１－１１１８；カバノフら（Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７－３３０；シバノルチュクら（Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９－５４）、リン脂質、たとえば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈホスホネート（マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４；シーアら（Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７－３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．），Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（ミシュラら（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（クルッケら（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３－９３７）（それらの各内容の全体を本願明細書に援用する）にコンジュゲートしうる。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、リガンドとコンジュゲートされる。非限定的な一例では、リガンドは、マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．）の米国特許出願公開第２０１３０１８４３２８号明細書に開示された任意のリガンドであってもよく、その内容の全体を本願明細書に援用する。コンジュゲートは、リガンド－［リンカー］任意選択－［テザー］任意選択－オリゴヌクレオチド剤の式を有する。オリゴヌクレオチド剤は、マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．）の米国特許出願公開第２０１３／０１８４３２８号明細書（その内容の全体を本願明細書に援用する）に開示される式（Ｉ）を有するサブユニットを含みうる。別の非限定的な例では、リガンドは、その内容全体を本願明細書に援用するアキンクら（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．）の米国特許出願公開第２０１３０３１７０８１号明細書に開示されている任意のリガンド、たとえば式ＩＩ～ＸＸＶＩの脂質、タンパク質、ホルモン、または炭水化物リガンドでありうる。リガンドは、アキンク（Ａｋｉｎｃ）に開示されている式ＸＸＸＩ～ＸＸＸＶの二価または三価の分岐リンカーを用いてｓａＲＮＡと結合させていてもよい。
かかる核酸／脂質コンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，８２８，９７９号明細書、同第４，９４８，８８２号明細書、同第５，２１８，１０５号明細書、同第５，５２５，４６５号明細書、同第５，５４１，３１３号明細書、同第５，５４５，７３０号明細書、同第５，５５２，５３８号明細書、同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書、同第５，５９１，５８４号明細書、同第５，１０９，１２４号明細書、同第５，１１８，８０２号明細書、同第５，１３８，０４５号明細書、同第５，４１４，０７７号明細書、同第５，４８６，６０３号明細書、同第５，５１２，４３９号明細書、同第５，５７８，７１８号明細書、同第５，６０８，０４６号明細書、同第４，５８７，０４４号明細書、同第４，６０５，７３５号明細書、同第４，６６７，０２５号明細書、同第４，７６２，７７９号明細書、同第４，７８９，７３７号明細書、同第４，８２４，９４１号明細書、同第４，８３５，２６３号明細書、同第４，８７６，３３５号明細書、同第４，９０４，５８２号明細書、同第４，９５８，０１３号明細書、同第５，０８２，８３０号明細書、同第５，１１２，９６３号明細書、同第５，２１４，１３６号明細書、同第５，０８２，８３０号明細書、同第５，１１２，９６３号明細書、同第５，２１４，１３６号明細書、同第５，２４５，０２２号明細書、同第５，２５４，４６９号明細書、同第５，２５８，５０６号明細書、同第５，２６２，５３６号明細書、同第５，２７２，２５０号明細書、同第５，２９２，８７３号明細書、同第５，３１７，０９８号明細書、同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書、同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書、同第５，５１０，４７５号明細書、同第５，５１２，６６７号明細書、同第５，５１４，７８５号明細書、同第５，５６５，５５２号明細書、同第５，５６７，８１０号明細書、同第５，５７４，１４２号明細書、同第５，５８５，４８１号明細書、同第５，５８７，３７１号明細書、同第５，５９５，７２６号明細書、同第５，５９７，６９６号明細書、同第５，５９９，９２３号明細書、同第５，５９９，９２８号明細書、および同第５，６８８，９４１号明細書（それらの各内容の全体を本願明細書に援用する）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明のｓａＲＮＡは、考慮されている特定の方法において効果を発揮することが公知である他の活性成分と組み合わせて提供されうる。他の活性成分は、本発明のｓａＲＮＡと同時に、別々に、または逐次的に投与されうる。一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、異なるターゲット遺伝子を調節するｓａＲＮＡと共に投与される。非限定的な例は、アルブミン、インスリン、またはＨＮＦ４Ａ遺伝子を調節するｓａＲＮＡを含む。任意の遺伝子の調節が、単一のｓａＲＮＡまたは２つ以上の異なるｓａＲＮＡの組合せを用いて達成されうる。本発明のｓａＲＮＡと共に投与可能なｓａＲＮＡの非限定的な例は、２０１２年６月２０日に出願された国際公開第２０１２／１７５９５８号に開示されているアルブミンまたはＨＮＦ４Ａを調節するｓａＲＮＡ、２０１１年１０月１０日に出願された国際公開第２０１２／０４６０８４号および国際公開第２０１２／０４６０８５号の両者に開示されているインスリンを調節するｓａＲＮＡ、２００６年１１月１３日に出願された米国特許第７，７０９，４５６号明細書および２０１０年４月２３日に出願された米国特許出願公開第２０１０／０２７３８６３号明細書に開示されているヒトプロゲステロン受容体、ヒト主要ヴォールトタンパク質（ｈＭＶＰ）、Ｅ－カドヘリン遺伝子、ｐ５３遺伝子、またはＰＴＥＮ遺伝子を調節するｓａＲＮＡ、２００６年４月１１日に出願された国際公開第２００６／１１３２４６号に開示されているｐ２１遺伝子、２０１１年１１月１２日に出願された国際公開第２０１２／０６５１４３号に開示されている国際公開第２０１２／０６５１４３号の表８の遺伝子の発現をアップレギュレートするか、または腫瘍抑制因子の発現を増加させる任意の核酸、２０１３年５月１６日に出願された国際公開第２０１３／１７３６３５号の表４中のターゲット遺伝子を活性化する任意のオリゴヌクレオチド、２０１３年５月１６日に出願された国際公開第２０１３／１７３６３７号の表４中のターゲット遺伝子を活性化する任意のオリゴヌクレオチド、２０１３年５月１６日に出願された国際公開第２０１３／１７３６５２号の配列番号１～１２１２の配列から選択される配列に相補的な任意のオリゴヌクレオチド、２０１３年５月１６日に出願された国際公開第２０１３３１７３６４７号に開示されているＡＰＯＡ１およびＡＢＣＡ１遺伝子の発現を調節する任意のオリゴヌクレオチド、２０１３年５月１６日に出願された国際公開第２０１３３１７３６３８号に開示されているＳＭＮファミリー遺伝子の発現を調節する任意のオリゴヌクレオチド、２０１３年５月１６日に出願された国際公開第２０１３１７３６０５号に開示されているＰＴＥＮ遺伝子の発現を調節する任意のオリゴヌクレオチド、２０１３年５月１６日に出願された国際公開第２０１３１７３６０８号に開示されているＭＥＣＰ２遺伝子の発現を調節する任意のオリゴヌクレオチド、２０１３年５月１６日に出願された国際公開第２０１３１７３５９８号に開示されているＡＴＰ２Ａ２遺伝子の発現を調節する任意のオリゴヌクレオチド、２０１３年５月１６日に出願された国際公開第２０１３１７３６４５号に開示されているＵＴＲＮ遺伝子の発現を調節する任意のオリゴヌクレオチド、２００６年１２月２８日に出願された米国特許第８，２８８，３５４号明細書に開示されているＣＤ９７、ＴＳ－α、Ｃ／ＥＢＰデルタ、ＣＤＣ２３、ＰＩＮＫ１、ＨＩＦ１α、Ｇｎｂｐ３ｇ、アドレノメジュリンＡＭ１受容体、３－オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、カテプシンＷまたはＢＡＣＥ１の発現を調節する任意の核酸分子、２０１１年１１月１７日に出願された米国特許出願公開第２０１３／０２４５０９９号明細書に開示されている式（Ｉ）を有するアンタゴＮＡＴ、２０１０年４月３０日に出願された米国特許第８，３１８，６９０号明細書に開示されているヘモグロビン（ＨＢＦ／ＨＢＧ）ポリヌクレオチドの発現をアップレギュレートする任意のアンタゴＮＡＴ、２００９年１０月２日に出願された米国特許第８，１５３，６９６号明細書（キュアナ社（ＣＵＲＮＡ））に開示されているアポリポタンパク質（ＡｐｏＡ１）ポリヌクレオチドの発現を増加させる任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドをターゲティングするｓａＲＮＡを含み、それぞれの内容の全体を本明細書に援用する。
一実施形態では、ｓａＲＮＡは、マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．）（アルナイラム・ファーマシューティカルズ（Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））による米国特許第８１０６０２２号明細書および同第８８２８９５６号明細書（それらの内容の全体を本願明細書に援用する）に開示される任意の炭水化物リガンドなどの炭水化物リガンドにコンジュゲートされる。たとえば、炭水化物リガンドは、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖でありうる。これらの炭水化物コンジュゲートされたＲＮＡ剤は、肝臓の実質細胞をターゲティングしうる。一実施形態では、ｓａＲＮＡは、２つ以上、好ましくは２つまたは３つの炭水化物リガンドにコンジュゲートされる。一実施形態では、ｓａＲＮＡは、１つ以上のガラクトース部分にコンジュゲートされる。他の実施形態では、ｓａＲＮＡは、少なくとも１つ（たとえば、２つまたは３つ以上）のラクトース分子にコンジュゲートされる（ラクトースはガラクトースに結合されたグルコースである）。他の実施形態では、ｓａＲＮＡは、少なくとも１つ（たとえば、２つまたは３つ以上）のＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－Ａｃ－グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、またはマンノース（たとえば、マンノース－６－ホスフェート）にコンジュゲートされる。一実施形態では、ｓａＲＮＡは、少なくとも１つのマンノースリガンドにコンジュゲートされ、コンジュゲートされたｓａＲＮＡはマクロファージをターゲティングする。
ＧａｌＮＡｃ－ヌクレオチド（ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡ／ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ）コンジュゲート
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡは炭水化物部分に共有結合され、この部分は、少なくとも１つ（たとえば、２つまたは３つ以上）のＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはその誘導体を含み、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを形成する。ＧａｌＮＡｃは、
Figure 2022545101000019
の構造を含むガラクトースのアミノ糖誘導体である。ＧａｌＮＡｃは、核酸コンストラクトを肝細胞に運ぶための効果的な部分である。三分岐ＧａｌＮＡｃの離散構造は、遺伝子サイレンシングのための一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドの効果的な送達に最適であることが示されている。ＧａｌＮＡｃ－ヌクレオチドコンジュゲートは、トランスフェクション剤を用いずにアシアロ糖タンパク質受容体を発現する細胞に送達されうる。ヌクレオチドはｓａＲＮＡの一部であってもよく、ＧａｌＮＡｃ－ヌクレオチドコンジュゲートはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートと呼ばれる。ヌクレオチドはまた、遺伝子の発現を阻害する低分子阻害ＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとしても公知である）の一部であってもよく、ＧａｌＮＡｃ－ヌクレオチドコンジュゲートはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートと称される。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＧａｌＮＡｃ部分に接続された低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を含むＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを提供し、ここで、ｓａＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含み、かかる修飾は任意選択的に接続されたＧａｌＮＡｃから独立していてもよい。ｓａＲＮＡは、各鎖について少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の修飾を含みうる。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートのｓａＲＮＡは、少なくとも５０％修飾されており、すなわち、ヌクレオチドの少なくとも５０％が修飾されている。いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡは、少なくとも７５％修飾されており、すなわち、ヌクレオチドの少なくとも７５％が修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡの両鎖は、全長にわたって修飾されていてもよい（１００％修飾）。ヌクレオチド（糖、塩基およびリン酸部分、たとえばリンカー）はそれぞれ修飾されうるので、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの任意の部分への任意の修飾が、修飾を構成することを理解されたい。
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡは、ヌクレオチドの１つの成分のみにおいて少なくとも１０％修飾され、かかる成分は、核酸塩基、糖、またはヌクレオシド間の結合から選択される。たとえば、ｓａＲＮＡの修飾は、当該ｓａＲＮＡの核酸塩基、糖、または結合の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％に対して行われうる。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートのｓａＲＮＡは、少なくとも１つの糖修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡのヌクレオチドの糖の２’位（ＲＮＡではＯＨ、ＤＮＡではＨ）の少なくとも１つが－ＯＭｅで置換されており、２’－ＯＭｅと称される。いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡのヌクレオチドの糖の２’位（ＲＮＡではＯＨ、ＤＮＡではＨ）の少なくとも１つが－Ｆで置換されており、２’－Ｆと称される。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートのｓａＲＮＡは、３’および／または５’のキャッピングまたはオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、少なくとも１つの逆位デオキシリボヌクレオシドオーバーハングを含んでいてもよい。逆位オーバーハング、たとえば、ｄＴは、パッセンジャー（センス）鎖の５’末端または３’末端にありうる。いくつかの実施形態において、本発明のｓａＲＮＡは、パッセンジャー鎖上に逆位脱塩基修飾を含んでいてもよい。少なくとも１つの逆位脱塩基修飾は、パッセンジャー鎖の５’末端、または３’末端、または両末端にあってもよい。逆位脱塩基修飾は、ガイド鎖の優先的なローディングを促しうる。
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡは、同じ糖修飾を有する少なくとも２つの連続するヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含む。一例では、そのようなモチーフは、２つまたは３つの連続したヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態において、モチーフの連続するヌクレオチドは、２’－Ｆ修飾を含む。いくつかの実施形態において、モチーフの連続するヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾を含む。
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡが二本鎖である場合、ｓａＲＮＡのパッセンジャー鎖およびガイド鎖はそれぞれ、同じ糖修飾を有する連続するヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含む。
いくつかの実施形態において、ｓａＲＮＡのパッセンジャー鎖およびガイド鎖はそれぞれ、同じ糖修飾を有する連続するヌクレオチドの少なくとも２つのモチーフを含む。いくつかの実施形態において、所与の鎖上の少なくとも２つのモチーフは、独立して、異なる糖修飾を有する。たとえば、パッセンジャー鎖またはガイド鎖は、２’－ＯＭｅ修飾の少なくとも１つのモチーフおよび２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを有しうる。いくつかの実施形態では、所定の鎖上の少なくとも２つのモチーフは、少なくとも１つ（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０など）のヌクレオチドによって分離される。いくつかの実施形態では、所与の鎖上の少なくとも２つのモチーフは、接続される。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖上の少なくとも１つのモチーフおよびガイド鎖上のその相補的モチーフは、異なる糖修飾を有する。たとえば、パッセンジャー鎖上のモチーフのヌクレオチドは２’－Ｆ修飾を有し、ガイド鎖上のモチーフのヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾を有し、ここで２つのモチーフは互いに相補的である。別の例では、パッセンジャー鎖上のモチーフのヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾を有し、ガイド鎖上のモチーフのヌクレオチドは２’－Ｆ修飾を有し、ここで、２つのモチーフは互いに相補的である。
いくつかの実施形態では、モチーフの修飾は、モチーフの両側のすぐに隣接するヌクレオチドの修飾とは異なる。
いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡは、交互に糖が修飾された少なくとも１つのモチーフを含んでいる。一例として、交互に糖が修飾されたモチーフは、２～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、モチーフは、２’－Ｆおよび２’－ＯＭｅ修飾を交互に含む。
いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡが二本鎖である場合、パッセンジャー鎖およびガイド鎖はそれぞれ、交互に糖が修飾された少なくとも１つのモチーフを含む。いくつかの実施形態において、パッセンジャー鎖上の少なくとも１つのヌクレオチドおよびガイド鎖上のその相補的ヌクレオチドは、異なる糖修飾を有する。たとえば、パッセンジャー鎖上の塩基対の一方のヌクレオチドは２’－Ｆ修飾を有し、ガイド鎖上の塩基対のもう一方のヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾を有する。別の例では、パッセンジャー鎖の塩基対の一方のヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾を有し、ガイド鎖の塩基対のもう一方のヌクレオチドは２’－Ｆ修飾を有する。
いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡは、ヌクレオチド間に少なくとも１つのホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合を含む。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートのｓａＲＮＡは、本明細書に記載される式（Ｉ）の一般式を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＧａｌＮＡｃ部分に接続された低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、リボ糖の２’または３’位、またはｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのヌクレオチドの核酸塩基に結合される。ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合は、ＧａｌＮＡｃ部分とヌクレオチドの間にありうる。
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、リンカーを介してｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのヌクレオチドに結合される。リンカーは、ｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのヌクレオチドの任意の適切な位置に結合されうる。リンカーは、ＧａｌＮＡｃ部分に共有結合または非共有結合で結合しうる。
いくつかの場合、リンカーはｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの鎖の末端に接続される。いくつかの場合、リンカーはセンス鎖の５’末端に接続される。いくつかの場合、リンカーはセンス鎖の３’末端に接続される。
Figure 2022545101000020
いくつかの場合、リンカーはｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの鎖の内部のヌクレオチドに接続される。いくつかの場合、リンカーはｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのセンス鎖の内部のヌクレオチドに接続される。いくつかの場合、リンカーはｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の内部のヌクレオチドに接続される。
Figure 2022545101000021
マノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．），Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０（５）：１１８１，（２０１５）またはマノハランら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，ｖｏｌ．１６（６）：９０３，（２０１５）に開示されている任意の結合方法（それぞれの内容の全体を本願明細書に援用する）が、ＧａｌＮＡｃ部分をｓａＲＮＡに結合させるために使用されうる。
いくつかの場合、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートのリンカーは、直接結合または酸素もしくは硫黄などの原子、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＳＯ２－、－ＳＯ２ＮＨ－などのユニット、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレアリールなどの原子の鎖であるが、これらに限定はされず、ここで、各基は置換されていても、置換されていなくてもよい。
いくつかの場合、リンカーは切断可能なリンカーである。切断可能なリンカーは、特定のｐＨで、特定の酵素によって、または特定のレドックス環境において切断されうる。切断可能なリンカーは、例として、エステル結合、酸分解性結合、ジスルフィド結合、またはリン酸結合を含みうる。
いくつかの場合、リンカーは切断可能でないリンカーである。
いくつかの場合、リンカーは、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－またはＮＨ２－（ＣＨ２）６－などのアミン基（ＮＨ２Ｃ６、Ｃ６ＮＨ２、またはＣ６と呼ばれる）を含む。末端にカルボン酸を含むＧａｌＮＡｃクラスターの場合、カルボン酸はリンカー上のアミンと反応し、ＧａｌＮＡｃクラスターがｓａＲＮＡ－Ｃ６ＮＨ－またはｓｉＲＮＡ－Ｃ６ＮＨに直接結合される。
いくつかの場合、リンカーは、－Ｏ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）６－、ｎ＝２、３、４、５または６などのカルボン酸基を含む。末端にアミンを含むＧａｌＮＡｃクラスターの場合、アミンがリンカー上のカルボン酸と反応し、ＧａｌＮＡｃクラスターがｓａＲＮＡ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－またはｓｉＲＮＡ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－に直接的に結合している。
いくつかの場合、リンカーとセンス鎖の間にホスホロチオエート結合が存在する。
いくつかの場合、ＧａｌＮＡｃ部分は三分岐ＧａｌＮＡｃクラスターでありうる。その内容の全体を本願明細書に援用するプラカッシュら（Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．５９：２７１８－２７３３（２０１６）の図２におけるトリスベースのＧａｌＮＡｃクラスター、三酸ベースのＧａｌＮＡｃクラスター、Ｌｙｓ－ＬｙｓベースのＧａｌＮＡｃクラスター、Ｌｙｓ－ＧｌｙベースのＧａｌＮＡｃクラスター、トレブラーベースのクラスター、ヒドロキシプロリノールベースのクラスターなど、プラカッシュら（Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．）に開示されている任意のＧａｌＮＡｃクラスターが、本開示に従って使用されうる。ＧａｌＮＡｃクラスターは、以下の構造を有していてもよい：
Figure 2022545101000022
、ｎ＝１、２、３、４、５、または６。
センス鎖の３’または５’末端をＧａｌＮＡｃ部位に接続するためにリンカーが使用される場合、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ＳｉＲＮＡコンジュゲートは、以下：
Figure 2022545101000023
の構造、たとえば
Figure 2022545101000024
の構造を含む。
たとえば、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、以下：
Figure 2022545101000025
の構造、たとえば、
Figure 2022545101000026
ここで、ＸはＯまたはＳである、
の構造を有していてもよい。
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、Ｍ１、Ｍ１’、Ｍ２、Ｍ２’、Ｍ３、Ｍ３’、Ｍ４、Ｍ４’、Ｍ５、Ｍ５’、Ｍ６、Ｍ６’、またはその誘導体から選択される少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含む。ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、Ｍ１、Ｍ１’、Ｍ２、Ｍ２’、Ｍ３、Ｍ３’、Ｍ４、Ｍ４’、Ｍ５、Ｍ５’、Ｍ６、Ｍ６’またはその誘導体から選択される１、２、３、４、５、６、７、８または９個のＧａｌＮＡｃモノマーを含んでいてもよい。
一実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、Ｍ１、Ｍ１’、またはその誘導体から選択される少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含む。
Figure 2022545101000027
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、アルキル、アリール、およびアルケニル基から独立して選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はすべて－ＣＨ３である。
ここで、Ｒ４は適切な保護基またはＣ１～６直鎖または分岐アルキルであり、メチル、エチル、ｎ－プロピル、２－プロピル、ｎ－ブチル、イソブチルおよび他のアルキル基を含むが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、Ｒ４は－ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮである。
ここで、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してＣ１～６直鎖または分岐アルキルであり、メチル、エチル、ｎ－プロピル、２－プロピル、ｎ－ブチル、イソブチルおよび同様のアルキル基を含むが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、Ｒ５およびＲ６はどちらも２－プロピルである。
そして、
ここで、Ｒ７は適切な保護基である。いくつかの実施形態では、保護基は４，４’－ジメトキシトリチルである。
Figure 2022545101000028
ここで、Ｒ８は－Ｈ、またはＣ１～６直鎖または分岐アルキルであり、メチル、エチル、ｎ－プロピル、２－プロピル、ｎ－ブチル、イソブチルおよび類似のアルキル基を含むが、これらに限定はされず；そして、ここで、ＸはＯまたはＳである。いくつかの実施形態では、Ｒ８は－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３である。
別の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、Ｍ２、Ｍ２’、またはその誘導体から選択される少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含む。
Figure 2022545101000029
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、アルキル、アリール、およびアルケニル基から独立して選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はすべて－ＣＨ３である。
ここで、Ｒ４は保護基またはＣ１～６直鎖もしくは分岐アルキルであり、メチル、エチル、ｎ－プロピル、２－プロピル、ｎ－ブチル、イソブチルおよび同様のアルキル基を含むが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、Ｒ４は－ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮである。
ここで、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立してＣ１～６直鎖または分岐アルキルであり、メチル、エチル、ｎ－プロピル、２－プロピル、ｎ－ブチル、イソブチルおよび他のアルキル基を含むが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、Ｒ５およびＲ６はどちらも２－プロピルである。
かつ、
ここで、Ｒ７は、適切な保護基である。いくつかの実施形態では、保護基は４，４’－ジメトキシトリチルである。
Figure 2022545101000030
ここで、Ｒ８は－Ｈ、またはＣ１～６直鎖または分岐アルキルであり、メチル、エチル、ｎ－プロピル、２－プロピル、ｎ－ブチル、イソブチルおよび類似のアルキル基を含むが、これらに限定はされず；そして、ここで、ＸはＯまたはＳである。いくつかの実施形態では、Ｒ８は－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３である。
一実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、Ｍ３、Ｍ３’、またはその誘導体から選択される少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含む。
Figure 2022545101000031
ここで、ＸはＯまたはＳである。
一実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、Ｍ４、Ｍ４’、またはその誘導体から選択される少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含む。
Figure 2022545101000032
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、アルキル、アリール、およびアルケニル基から独立して選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はすべて－ＣＨ３である。
ここで、Ｒ７は保護基である。いくつかの実施形態では、保護基は４，４’－ジメトキシトリチルである。
そして、
ここで、リンカー１は切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカー１はスクシニルである。
Figure 2022545101000033
一実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、Ｍ５、Ｍ５’、またはその誘導体から選択される少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含む。
Figure 2022545101000034
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、アルキル、アリール、およびアルケニル基から独立して選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はすべて－ＣＨ３である。
ここで、Ｒ７は、適切な保護基である。いくつかの実施形態では、保護基は４，４’－ジメトキシトリチルである。
そして、
ここで、リンカー１は切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカー１はスクシニルである。
Figure 2022545101000035
一実施形態では、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、Ｍ６、Ｍ６’、またはその誘導体から選択される少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含む。
Figure 2022545101000036
Figure 2022545101000037
ＧａｌＮＡｃモノマーは、ｓａＲＮＡにコンジュゲートされて、肝臓などのターゲティングされる器官へのｓａＲＮＡの送達を実現するＧａｌＮＡｃ部分を構築するために使用される。ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含む。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも２つのＧａｌＮＡｃモノマーを含むＧａｌＮＡｃクラスター（またはマルチマー）でありうる。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃクラスターは、２つのＧａｌＮＡｃモノマーを含むＧａｌＮＡｃダイマークラスターでありうる。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃクラスターは、３つのＧａｌＮＡｃモノマーを含む三分岐ＧａｌＮＡｃクラスターでありうる。ＧａｌＮＡｃモノマービルディングブロックは、ホスホロアミダイト法による標準的なオリゴヌクレオチド合成に適合する。モノマーは、官能基化された支持体を提供するために使用することができ、またはオリゴヌクレオチド合成中にインラインで添加することが可能である。ＧａｌＮＡｃモノマーは、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートを形成するように連結されたオリゴヌクレオチドの５’にインラインで結合されうる。本明細書で使用される場合、「インライン」は合成中のオリゴヌクレオチドの伸長の自動化されたプロセスを指す。ＧａｌＮＡｃモノマーは、オリゴヌクレオチドの任意の位置に単独で、または他のＧａｌＮＡｃモノマーと組み合わせて加えられうる。それらは、リンカーなしで順次加えられるか、またはヌクレオチドもしくは他のリンカーによって分離されうる。
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーおよび少なくとも１つのスペーサー（いくつかの状況ではリンカーとも呼ばれうる）を含み、ここで、ＧａｌＮＡｃモノマーは結合（リン酸結合またはホスホロチオエート結合など）を介してスペーサーに結合される。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも２つのＧａｌＮＡｃモノマー（２つのモノマー、３つのモノマー、４つのモノマー、５つのモノマー、または６つのモノマーなど）、および任意選択的に少なくとも１つのスペーサーを含み、ここで、モノマーは結合（リン酸結合またはホスホロチオ酸結合など）を介して互いに、またはスペーサーに結合される。スペーサーは、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、Ｃ１２、脱塩基フラン、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、Ｃ３、またはそれらの誘導体（たとえば、適切な保護基を有する）などであるが、これらに限定されない、切断可能でないリンカーでありうる：
１）．完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド内に示されるＨＥＧスペーサー（ＨＥＧ）
Figure 2022545101000038
、ここで、ＸはＯまたはＳである。本開示において、「ＨＥＧ」が使用される場合、ＸはＯである。「Ｓ－ＨＥＧ」が使用される場合、ＸはＳである。
２）．完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド内に示されるＣ１２スペーサー（Ｃ１２）：
Figure 2022545101000039
、ここで、ＸはＯまたはＳである。本開示において、「Ｃ１２」が使用される場合、ＸはＯである。「Ｓ－Ｃ１２」が使用される場合、ＸはＳである。
３）．完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド内に示される脱塩基スペーサー（ａｂ）：
Figure 2022545101000040
、ここで、ＸはＯまたはＳである。本開示において、「ａｂ」が使用される場合、ＸはＯである。「Ｓ－ａｂ」が使用される場合、ＸはＳである。
４）．完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド内に示されるＴＥＧスペーサー（ＴＥＧ）：
Figure 2022545101000041
、ここで、ＸはＯまたはＳである。本開示において、「ＴＥＧ」が使用される場合、ＸはＯである。「Ｓ－ＴＥＧ」が使用される場合、ＸはＳである。
５）．完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド内に示されるＣ３スペーサー（Ｃ３）：
Figure 2022545101000042
、ここで、ＸはＯまたはＳである。本開示において、「Ｃ３」が使用される場合、ＸはＯである。「Ｓ－Ｃ３」が使用される場合、ＸはＳである。
ＧａｌＮＡｃ部分は、以下の工程を含むプロセスによって調製可能である：
１）．Ｍ１’、Ｍ２’、Ｍ３’、Ｍ４’、Ｍ５’およびＭ６’からなる群から選択される少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを提供する工程；ならびに
２）．工程１）でＧａｌＮＡｃモノマー（単数または複数）からＧａｌＮＡｃ部分を合成する工程、任意選択的に少なくとも１つのスペーサーを追加する工程、および任意選択的に保護基を除去する工程。
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＭ１モノマー（正確に１つ、正確に２つ、または正確に３つのＭ１モノマーなど）および少なくとも１つのスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＭ１モノマー；少なくとも１つのＭ２またはＭ３モノマー（３つのＭ３モノマーなど）、または１つのＭ４、Ｍ５、もしくはＭ６モノマーを含む。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＭ１モノマー；少なくとも１つのスペーサー；および少なくとも１つのＭ２またはＭ３モノマー（３つのＭ３モノマーなど）、または１つのＭ４、Ｍ５、もしくはＭ６モノマーを含む。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＭ１モノマー（正確に１つ、正確に２つ、または正確に３つのＭ１モノマーなど）を含むが、スペーサーは有さない。
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＭ２モノマー（正確に１つ、正確に２つ、または正確に３つのＭ２モノマーなど）および少なくとも１つのスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＭ２モノマー；少なくとも１つのＭ１またはＭ３モノマー（３つのＭ３モノマーなど）、または１つのＭ４、Ｍ５、もしくはＭ６モノマーを含む。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＭ２モノマー；少なくとも１つのスペーサー；少なくとも１つのＭ１またはＭ３モノマー（３つのＭ３モノマーなど）、または１つのＭ４、Ｍ５、もしくはＭ６モノマーを含む。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＭ２モノマー（正確に１つ、正確に２つ、または正確に３つのＭ２モノマーなど）を含むが、スペーサーは有さない。
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＭ３モノマーおよび少なくとも１つのスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＭ３モノマー；および少なくとも１つのＭ１もしくはＭ２モノマー、または１つのＭ４、Ｍ５もしくはＭ６モノマーを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのＭ３モノマー；少なくとも１つのスペーサー；および少なくとも１つのＭ１もしくはＭ２モノマー、または１つのＭ４、Ｍ５もしくはＭ６モノマーを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、少なくとも１つのスペーサーを有する３つのＭ３モノマーを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、３つのＭ３モノマーを含むが、スペーサーを有さない。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、１つのＭ３モノマーのみからなるＧａｌＮＡｃ部分を除外する。
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、２つ以上のＭ４モノマーを含まない。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、１つのＭ４モノマーを含む。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、いかなるＭ４モノマーも含まない。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、１つのＭ４モノマー；および少なくとも１つのＭ１、Ｍ２、もしくはＭ３モノマー、または１つのＭ５もしくはＭ６モノマーを含む。
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、２つ以上のＭ５モノマーを含まない。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、１つのＭ５モノマーを含む。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、いかなるＭ５モノマーも含まない。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、１つのＭ５モノマー；および少なくとも１つのＭ１、Ｍ２、もしくはＭ３モノマー、または１つのＭ４もしくはＭ６モノマーを含む。
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、２つ以上のＭ６モノマーを含まない。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、１つのＭ６モノマーを含む。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、いかなるＭ６モノマーも含まない。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、１つのＭ６モノマー；少なくとも１つのＭ１、Ｍ２もしくはＭ３モノマー（３つのＭ３モノマーなど）、または１つのＭ４もしくはＭ５モノマーを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、１つのＭ６モノマーおよび２つのＭ３モノマーを含むＧａｌＮＡｃ部分を除外する。
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、以下の構造を有する三分岐ＧａｌＮＡｃクラスター：
Figure 2022545101000043
または表３のいずれかの構造でありうる。ここでＧａｌＮＡｃ部分はＧａｌＮＡｃクラスターとも呼ばれる。
Figure 2022545101000044
Figure 2022545101000045
Figure 2022545101000046
Figure 2022545101000047
Figure 2022545101000048
Figure 2022545101000049
Figure 2022545101000050
Figure 2022545101000051
Figure 2022545101000052
Figure 2022545101000053
Figure 2022545101000054
Figure 2022545101000055
Figure 2022545101000056
Figure 2022545101000057
Figure 2022545101000058
Figure 2022545101000059
Figure 2022545101000060
Figure 2022545101000061
Figure 2022545101000062
Figure 2022545101000063
Figure 2022545101000064
ＧａｌＮＡｃ部分は、切断可能なリンカーの有無にかかわらず、結合（ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合など）によってオリゴヌクレオチド配列（たとえば、二本鎖ｓａＲＮＡのセンス鎖）に結合して、コンジュゲートを形成しうる。ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチド配列の５’末端のＯまたは３’末端のＯに結合されうる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、以下の構造を有するＣ６ｓｓＣ６リンカーであり：
Figure 2022545101000065
（完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド内のＣ６ｓｓＣ６）、ここで、ＸはＯまたはＳである。
いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、以下の構造を有するｄＴリンカーであり：
Figure 2022545101000066
完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド内にある。
ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、以下の工程を含むプロセスによって調製可能である：
１）．Ｍ１’、Ｍ２’、Ｍ３’、Ｍ４’、Ｍ５’およびＭ６’からなる群から選択される少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを提供する工程；任意選択的に少なくとも１つのスペーサーを追加する工程；
２）．少なくとも１つのｓａＲＮＡ（表２の任意のｓａＲＮＡなど）を提供する工程；任意選択的に少なくとも１つのリンカーを加える工程；および
３）．工程１）のＧａｌＮＡｃモノマー（単数または複数）と工程２）のｓａＲＮＡからＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを合成する工程、任意選択的に保護基を除去する工程。
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、二本鎖ｓａＲＮＡ（ｓａＲＮＡ二重鎖）のセンス鎖の５’末端に結合して、コンジュゲートを形成し、ここで、ｓａＲＮＡはＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、二本鎖ｓａＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合して、コンジュゲートを形成し、ここで、ｓａＲＮＡはＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡである。ｓａＲＮＡは、表２の任意のｓａＲＮＡでありうる。一実施形態では、ｓａＲＮＡは、以下の配列を有する：
ＸＤ－１４３６９Ｋ１二重鎖：
アンチセンス：５’－ＧｆｓＡｆｓｃＣｆａＧｆｕＧｆａＣｆａａｕＧｆａＣｆｃＧｆｃｓＵｆｓｕ－３’（配列番号２５）
センス：５’－ＧｆｓｃｓＧｆｇＵｆｃＡｆＵｆＵｆｇＵｆｃＡｆｃＵｆｇＧｆｕＣｆ－３’（配列番号２４）
または
ＸＤ－０６４１４二重鎖：
アンチセンス：５’－ｇＡｆｃＣｆａＧｆｕＧｆａＣｆａａｕＧｆａＣｆｃＧｆｃｓｕｓｕ－３’（配列番号１５）
センス：５’－ｓＧｆｃＧｆｇＵｆｃＡｆＵｆＵｆｇＵｆｃＡｆｃＵｆｇＧｆｕＣｆｕｕ（ｉｎｖｄＴ）－３’（配列番号１４）
（Ｎｆ＝ヌクレオチドＮ（ＮはＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧでありうる）には２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾を有する；
小文字＝ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾を有する；
ｓ：ホスホロチオエート結合；ならびに
ｉｎｖｄＴ：逆位デオキシＴ（ｄＴ）。）
ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの非限定的な例は、表４の属および種のコンジュゲートを含む。ｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と二重鎖を形成することが理解される。
Figure 2022545101000067
いくつかの実施形態では、コンジュゲートを形成するために、ＧａｌＮＡｃ部分がＸＤ－０６４１４二重鎖のセンス鎖の５’末端に結合される。コンジュゲートの非限定的な例は、表５の任意のコンジュゲートを含む。コンジュゲートＬ１からＬ１９は、それぞれ切断可能なリンカーを含む。コンジュゲートＬ４０からＬ５８は、切断可能なリンカーを含まない。
Figure 2022545101000068
Figure 2022545101000069
Figure 2022545101000070
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ－ヌクレオチドコンジュゲート（ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートなど）は、以下のいずれかの構造：
（Ｌ＝コンジュゲートＬ１からＬ１９についてはＣ６ｓｓＣ６、Ｌ６６からＬ７１についてはｄＴなどの任意選択的なリンカー；コンジュゲートＬ４０からＬ５８、Ｌ６０から６５、およびＬ７２から７５についてはＬが存在しない）。
Ｐｏ＝ホスホジエステル結合；
Ｐｓ＝ホスホロチオエート結合；そして
Ｎｕｃ＝二本鎖ｓａＲＮＡ（たとえば、ＸＤ－０６４１４）または二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖などのヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド）
１）．Ｃ６－ＧａｌＮＡｃ（２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７４２１１の実施例２に開示されているＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを包含する）：
Figure 2022545101000071
２）．ＧａｌＮＡｃ－Ｃｌｖ（２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７４２１１に開示されているＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを包含する：
Figure 2022545101000072
３）．ＣＪ１（表５のＬ１およびＬ４０を包含する）：
Figure 2022545101000073
４）．ＣＪ２（表５のＬ２およびＬ４１を包含する）：
Figure 2022545101000074
５）．ＣＪ３（表５のＬ３およびＬ４２を包含する）：
Figure 2022545101000075
６）．ＣＪ４（表５のＬ４およびＬ４３を包含する）：
Figure 2022545101000076
７）．ＣＪ５（表５のＬ５およびＬ４４を包含する）：
Figure 2022545101000077
８）．ＣＪ６（表５のＬ６およびＬ４５を包含する）：
Figure 2022545101000078
９）．ＣＪ７（表５のＬ１４とＬ５３、表６のＬ８０を包含する）：
Figure 2022545101000079
１０）．ＣＪ８（表５のＬ１５およびＬ５４を包含する）：
Figure 2022545101000080
１１）．ＣＪ９（表５のＬ１６とＬ５５、表６のＬ８１を包含する）：
Figure 2022545101000081
１２）．ＣＪ１０（表５のＬ１７およびＬ５６を包含する）：
Figure 2022545101000082
１３）．ＣＪ１１（表５のＬ１８およびＬ５７を包含する）：
Figure 2022545101000083
１４）．ＣＪ１２（表５のＬ１９およびＬ５８を包含する）：
Figure 2022545101000084
１５）．ＣＪ１３（表６のＬ６０およびＬ６６を包含する）：
Figure 2022545101000085
１６）．ＣＪ１４（表６のＬ６１およびＬ６７を包含する）：
Figure 2022545101000086
１７）．ＣＪ１５（表６のＬ６２およびＬ６８を包含する）：
Figure 2022545101000087
１８）．ＣＪ１６（表６のＬ６３およびＬ６９を包含する）：
Figure 2022545101000088
１９）．ＣＪ１７（表６のＬ６４およびＬ７０を包含する）：
Figure 2022545101000089
２０）．ＣＪ１８（表６のＬ６５およびＬ７１を包含する）：
Figure 2022545101000090
２１）．ＣＪ１９（表６のＬ７２およびＬ７３を包含する）：
Figure 2022545101000091
２２）．ＣＪ２０（表６のＬ７３を包含する）：
Figure 2022545101000092
２３）．ＣＪ２１（表６のＬ７４を包含する）：
Figure 2022545101000093
２４）．ＣＪ２２（表６のＬ７５を包含する）：
Figure 2022545101000094
２５）．ＣＪ２３（表６のＬ７６およびＬ７７を包含する）：
Figure 2022545101000095
２６）．ＣＪ２４（表６のＬ７８を包含する）：
Figure 2022545101000096
２７）．ＣＪ２５（表６のＬ７９を包含する）：
Figure 2022545101000097
を有する。
いくつかの場合、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、ＣＥＢＰＡの発現をアップレギュレートし、ここで、ｓａＲＮＡはＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡである。たとえば、ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡは、ＸＤ－０６４１４（配列番号１４および１５）などの表２の任意のｓａＲＮＡでありうる。
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、対象の肝細胞に送達される。肝細胞は肝癌細胞でありうる。
ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって合成されうる。たとえば、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、プラカッシュら（Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．５９：２７１８－２７３３（２０１６）の実験セクションに記載されている方法に従って合成してもよく、その内容の全体を本願明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを形成するために、ｓｉＲＮＡにコンジュゲートされる。
いくつかの場合、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートはターゲティングされる遺伝子の発現をダウンレギュレートする。
いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、対象の肝細胞に送達される。肝細胞は肝癌細胞でありうる。
ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって合成されうる。たとえば、ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、プラカッシュら（Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．５９：２７１８－２７３３（２０１６）の実験セクションに記載されている方法に従って合成してもよく、その内容の全体を本願明細書に援用する。
ＩＩ．医薬組成物
本発明の１つの側面は、ターゲット遺伝子をアップレギュレートする低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
製剤、送達、投与、および用量
医薬製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤を追加的に含みうるが、この賦形剤は、本明細書で用いられる場合、所望の特定の剤形に適したあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤、または乳化剤、保存剤などを含むが、これらに限定されるものではない。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤および組成物を調製するための技術は当技術分野で公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、エー アール ジェンナーロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６（その全体を本願明細書に援用する）を参照されたい）。何らかの望ましくない生物学的作用、さもなければ医薬組成物のいずれか他の成分との有害な相互作用を生じることなどにより、任意の従来の賦形媒体が物質またはその誘導体に不適合性でありうる場合を除いて、従来の賦形媒体の使用は本開示の範囲内で企図されうる。
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的では、「活性成分」という語句は、本明細書に記載されるように送達されるｓａＲＮＡを一般に意味する。
本明細書に提供される医薬組成物の説明はヒトへの投与に好適な医薬組成物に主に向かっているが、かかる組成物が任意の他の動物、たとえば非ヒト動物、たとえば非ヒト哺乳動物への投与に一般に好適であることは、当業者であれば理解されよう。種々の動物への投与に好適な組成物にするためのヒトへの投与に好適な医薬組成物の修飾はよく理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者であれば、かりに実験を行うとしても通常の実験を行うだけで、かかる修飾の設計および／または実施が可能である。医薬組成物の投与が企図される対象としては、限定されるものではないが、ヒトおよび／もしくは他の霊長動物、哺乳動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラットなどの商業関連の哺乳動物を含む）、ならびに／またはトリ（家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウなどの商業関連のトリを含む）が挙げられる。
一実施形態では、本明細書に記載の製剤化ｓａＲＮＡの効力は増殖性の細胞において決定されうる。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学技術分野で公知であるまたは今後開発される任意の方法により調製されうる。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１種以上の他の副成分と一体化させる工程と、次いで、必要に応じておよび／または望ましい場合には分割、造形、および／または包装を行って所望の単回または複数回用量ユニットにする工程とを含む。
本発明にかかる医薬組成物は、単回ユニット用量として、および／または複数の単回ユニット用量として大量に調製、包装、および／または販売されうる。本明細書で使用される場合、「ユニット用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の投与量および／またはかかる投与量の便利な部分量、たとえばかかる投与量の１／２もしくは１／３に等しい。
本発明にかかる医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象のアイデンティティー、サイズ、および／または病態に依存して、さらには組成物の投与経路に依存して変化するであろう。例として、組成物は、０．１％～１００％、たとえば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含みうる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は少なくとも１種のｓａＲＮＡを含有しうる。非限定的な例として、製剤は、異なる配列を有する１、２、３、４、または５種のｓａＲＮＡを含有しうる。一実施形態では、製剤は、異なる配列を有する少なくとも３種のｓａＲＮＡを含有する。一実施形態では、製剤は、異なる配列を有する少なくとも５種のｓａＲＮＡを含有する。
本発明のｓａＲＮＡは、（１）安定性を向上させるために、（２）細胞トランスフェクションを向上させるために、（３）持続放出または遅延放出（たとえば、ｓａＲＮＡのデポ製剤から）を可能にするために、（４）生体内分布を変化させるために（たとえば、ｓａＲＮＡを特定の組織または細胞型にターゲティングするために）、（５）インビボでコードタンパク質の翻訳を増加させるために、および／または（６）インビボでコードタンパク質の放出プロファイルを変化させるために、１種以上の賦形剤を用いて製剤化可能である。
従来の賦形剤、たとえば、あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤または他の液体媒体、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤に加えて、本発明の賦形剤は、限定されるものではないがリピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア－シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ｓａＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（たとえば、対象への移植のために）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子ミミック、およびそれらの組合せを含みうる。したがって、本発明の製剤は、それぞれ一緒になってｓａＲＮＡの安定性の向上および／またはｓａＲＮＡによる細胞トランスフェクションの向上を行う量で１種以上の賦形剤を含みうる。さらに、本発明のｓａＲＮＡは、自己集合核酸ナノ粒子を用いて製剤化されうる。薬学的に許容可能な担体、賦形剤、および本発明のｓａＲＮＡを含む製剤で使用されうる核酸用の送達剤は、２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第２０１３／０９０６４８号（その内容の全体を本願明細書に援用する）に開示されている。
送達
本開示は、薬物送達の科学における将来の進歩を考慮し、任意の適切な経路による治療、予防、製薬、診断またはイメージングのいずれかのためのｓａＲＮＡの送達を包含する。送達は、ネイキッドでも、または製剤化されていてもよい。
本発明のｓａＲＮＡは、ネイキッドで細胞に送達されうる。本明細書で使用される場合、「ネイキッド（ｎａｋｅｄ）」とは、トランスフェクションを促進する薬剤を使わずにｓａＲＮＡを送達することを指す。たとえば、細胞に送達されるｓａＲＮＡは、修飾を含まないものでありうる。ネイキッドｓａＲＮＡは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている投与経路を使用して細胞に送達されうる。
本発明のｓａＲＮＡは、本明細書に記載の方法を用いて、製剤化されうる。製剤は、修飾および／または非修飾でありうるｓａＲＮＡを含有しうる。製剤は、限定されるものではないが、細胞透過剤、薬学的に許容可能な担体、送達剤、生侵食性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポをさらに含みうる。製剤化ｓａＲＮＡは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている投与経路を使用して細胞に送達されうる。
いくつかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）基またはその誘導体を含む薬剤、あるいは２価または３価の分岐リンカーを介して連結された２つ以上のＧａｌＮＡｃ基またはその誘導体を含むクラスターなどの非封入技術により送達される。
組成物はまた、直接浸漬（ｓｏａｋｉｎｇ）または浴（ｂａｔｈｉｎｇ）、カテーテルを介して、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／または滴下によって、組成物で被覆または含浸された布または生分解性材料などの基材を使用することによってなど、これらに限らないが、当技術分野におけるいくつかの方法のいずれかを用いて器官または組織に直接送達するために製剤化されうる。本発明のｓａＲＮＡはまた、レトロウイルス複製ベクター（ＲＲＶ）にクローニングされ、細胞に形質導入されてもよい。
投与
本発明のｓａＲＮＡは、治療上有効なアウトカムをもたらす任意の経路によって投与されうる。これらは、経腸、胃腸、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（硬膜の外）、大脳内（大脳の中）、脳室内（脳室の中）、皮膚上（皮膚への塗布）、皮内（皮膚自体の中）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻から）、静脈内（静脈の中）、動脈内（動脈の中）、筋肉内（筋肉の中）、心臓内（心臓の中）、骨内注入（骨髄の中）、くも膜下腔内（脊柱管内）、腹腔内、（腹膜への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内、（眼から）、海綿体内注射、（陰茎基部の中）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のための無傷の皮膚を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、ガス注入（経鼻吸入）、舌下、陰唇下、浣腸、点眼（結膜上）、または点耳を含むが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態において、組成物は、それらが血液脳関門、血管関門、または他の上皮関門を通過することを可能とする方法で投与されうる。その内容全体を本願明細書に援用する２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第２０１３／０９０６４８号に開示されている投与経路は、本発明のｓａＲＮＡを投与するために使用されうる。
剤形
本明細書に記載の医薬組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注射剤（たとえば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下）などの本明細書に記載の剤形に製剤化され得る。２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第２０１３／０９０６４８号に記載されている液体製剤、注射剤、肺剤、および固体製剤（その内容全体を本願明細書に援用する）が本発明のｓａＲＮＡの剤形として使用されうる。
ＩＩＩ．使用方法
本発明の１つの側面は、トランスフェクション剤なしで、ＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートによって細胞にｓａＲＮＡを送達する方法を提供する。細胞はアシアロ糖タンパク質受容体を発現する。いくつかの実施形態において、細胞へのｓａＲＮＡのターゲティングされた送達は、本発明のＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを用いて達成される。いくつかの場合、細胞は肝細胞である。いくつかの場合、細胞は肝臓癌細胞である。
本発明の別の側面は、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲート、ならびにｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を使用する方法を提供する。本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、そのターゲット遺伝子の発現を調節する。一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡを投与することを含む、インビトロおよび／またはインビボでのターゲット遺伝子の発現を調節する方法が提供される。一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡの非存在下におけるターゲット遺伝子の発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、ターゲット遺伝子の発現が、少なくとも５、１０、２０、３０、４０％、または少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、もしくは少なくとも８０％増加する。さらなる実施形態では、本発明のｓａＲＮＡの非存在下におけるターゲット遺伝子の発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、ターゲット遺伝子の発現が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、または少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍増加する。
一実施形態では、本明細書で説明されるｓａＲＮＡの遺伝子発現の増加は、増殖中の細胞において示される。
一実施形態では、本明細書に記載のｓａＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなどのＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート）システムにおけるスペーサーとして使用されうる。本明細書に記載のｓａＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムは、ターゲット遺伝子を切断および編集するために使用されうる。
一実施形態では、本明細書で説明されるｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲート処置の遺伝子発現の増加が、増殖細胞において示される。
過剰増殖障害
本発明の一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートが、過剰増殖性細胞の細胞増殖を低減するために使用される。過剰増殖性細胞の例は、癌腫、肉腫、リンパ腫、および芽細胞腫などの癌性細胞を含む。そのような癌性細胞は、良性または悪性でありうる。過剰増殖性細胞は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、または乾癬などの自己免疫状態に起因するものであってもよい。過剰増殖性細胞はまた、アレルゲンと接触した過敏性の免疫系を有する患者の中でも生じうる。過敏性の免疫系が関与するそのような状態は、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、およびアレルギー性アナフィラキシーなどのアレルギー反応を含むが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、腫瘍細胞の発生および／または増殖が阻害される。好ましい実施形態では、固形腫瘍細胞の増殖が阻害される。別の好ましい実施形態では、腫瘍細胞の転移が防がれる。別の好ましい例では、未分化の腫瘍細胞の増殖が阻害される。
細胞増殖の阻害または増殖の低減は、増殖が低減するか、または完全に停止することを意味する。したがって、「増殖の低減」は「増殖の阻害」の一実施形態である。本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートで処置する前の前記細胞の増殖と比較して、または均等な未処置の細胞の増殖と比較して、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの存在下では、細胞の増殖が少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％低減する。細胞増殖が過剰増殖性細胞において阻害される実施形態においては、「均等」な細胞もまた過剰増殖性細胞である。好ましい実施形態では、増殖が、均等で健康な（非過剰増殖性）細胞の増殖速度に匹敵する速度にまで低減する。別の見方をすれば、「細胞増殖を阻害する」ことの好ましい実施形態は、過剰増殖の阻害、または正常で健康的なレベルの増殖に達するように細胞増殖を調節することである。
非限定的な一例として、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、白血病およびリンパ腫細胞の増殖を低減するために使用される。好ましくは、細胞は、ジャーカット細胞（急性Ｔ細胞リンパ腫細胞株）、Ｋ５６２細胞（赤血球白血病細胞株）、Ｕ３７３細胞（神経膠芽腫細胞株）、３２Ｄｐ２１０細胞（骨髄性白血病細胞株）を含む。
別の非限定的な例では、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、卵巣癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、ラット肝臓癌細胞、およびインスリノーマ細胞の増殖を低減するために使用される。好ましくは、細胞は、ＰＥＯ１およびＰＥＯ４（卵巣癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌細胞株）、Ｐａｎｃ１（ヒト膵臓癌細胞株）、ＭＣＦ７（ヒト乳腺癌細胞株）、ＤＵ１４５（ヒト転移性前立腺癌細胞株）、ラット肝癌細胞、ＭＩＮ６（ラットインスリノーマ細胞株）を含む。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、過剰増殖性障害を治療するために使用される。腫瘍および癌は、特に関心のある過剰増殖性障害を表し、あらゆるタイプの腫瘍および癌、たとえば、固形腫瘍および血液癌が含まれる。癌の例は、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、腎臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、消化器癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、および慢性骨髄性白血病など）、脳腫瘍（たとえば、星状細胞腫、神経細胞腫、髄芽細胞腫）、神経芽腫、肉腫、大腸癌、直腸癌、胃癌、肛門癌、膀胱癌、子宮内膜癌、形質細胞腫、リンパ腫、網膜芽細胞腫、ウィルム腫瘍、ユーイング肉腫、メラノーマ、および他の皮膚癌を含むが、これらに限定されるものではない。肝癌は、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、または肝細胞癌（ＨＣＣ）を含むが、これらに限定されるものではない。ＨＣＣは特に関心が高いものである。
原発性肝癌は、世界で５番目に頻度の高い癌であり、癌関連の死亡の３番目に多い原因となっている。ＨＣＣは、原発性肝癌の大部分を占めている［エル－セラグら（Ｅｌ－Ｓｅｒａｇ ｅｔ ａｌ．），Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１３２（７），２５５７－２５７６（２００７）、その内容の全体を本願明細書に援用する］。ＨＣＣは、癌細胞生物学、免疫系、およびさまざまな病因（ウイルス性、毒性、および一般）を含むいくつかの因子の相互作用により影響される。ＨＣＣの患者の大多数は、肝硬変を背景に悪性腫瘍を発症する。現在、ほとんどの患者は、進行した段階で診断されるため、ＨＣＣ患者の大多数の５年生存率は依然として惨憺たるものとなっている。現在、外科的切除、局所領域切除および肝移植だけが、ＨＣＣを治癒する可能性のある治療選択肢である。しかしながら、個々の肝機能および腫瘍負荷の評価に基づくと、外科的介入の対象となるのは患者の約５～１５％のみである。本発明は、ターゲット遺伝子の発現を調節し、肝硬変およびＨＣＣを治療するために、ｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを利用する。
本発明の方法は、腫瘍体積を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％低減させうる。好ましくは、１つ以上の新たな腫瘍の発生が阻害され、たとえば、本発明に従って治療された対象は、より少ないおよび／またはより小さい腫瘍を発生する。腫瘍が少ないということは、彼が一定期間に均等な対象よりも少ない数の腫瘍を発症することを意味する。たとえば、彼は均等な対照（未治療）の対象よりも少なくとも１、２、３、４、または５個少ない腫瘍を発症する。腫瘍が小さいということは、腫瘍が均等な対象の腫瘍よりも重量および／または体積が少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％小さいことを意味する。本発明の方法は、腫瘍負荷を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％低減させる。
一定の期間は、任意の適切な期間、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ヶ月または数年でありうる。
非限定的な一例において、細胞、組織、器官または対象を本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートと接触させることを含む、未分化腫瘍を治療する方法が提供される。未分化腫瘍は一般に、分化したものと比較して予後が不良である。腫瘍における分化の程度は予後に関係することから、分化を促す生物製剤の使用は、有益な抗増殖薬となりうると仮定されている。ｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートで治療されうる未分化腫瘍は、未分化小細胞肺癌、未分化膵臓腺癌、未分化ヒト膵臓癌、未分化ヒト転移性前立腺癌、および未分化ヒト乳癌を含む。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を制御するために使用される。好ましくは、癌遺伝子の発現はダウンレギュレートされうる。癌遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの非存在下における発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの存在下では、少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％低減する。さらに好ましい実施形態では、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの非存在下における発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの存在下では、癌遺伝子の発現が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０分の１に、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０分の１に、さらにより好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００分の１に低減する。好ましくは、腫瘍抑制遺伝子の発現が阻害されうる。腫瘍抑制遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの非存在下における発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの存在下では、少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％、さらに好ましくは少なくとも１００％増加する。さらに好ましい実施形態では、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの非存在下における発現と比較して、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの存在下では、腫瘍抑制遺伝子の発現が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、さらにより好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍に増加する。
一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、肝細胞癌の治療において、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）を調節するために使用される。マイクロＲＮＡは、遺伝子発現を調節する小さな非コードＲＮＡである。それらは重要な生理学的機能に関与しており、発癌のあらゆる段階に関与しうる。典型的には、それらは２１ヌクレオチドを有し、前記ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）に結合することで、ｍＲＮＡ翻訳の遮断またはｍＲＮＡ分解の誘導を介して転写後レベルで遺伝子の発現を調節する。
腫瘍では、ｍｉＲＮＡ発現の調節が腫瘍の発達に影響を及ぼす。ＨＣＣでは、他の癌と同様に、ｍｉＲＮＡは癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子のいずれかとして機能し、細胞の成長および増殖、細胞の代謝および分化、アポトーシス、血管新生、転移、そして最終的には予後に影響を与える。［リンら（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，ｖｏｌ．３７５，３１５－３２０（２００８）；クタイら（Ｋｕｔａｙ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．９９，６７１－６７８（２００６）；メンら（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．），Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１３３（２），６４７－６５８（２００７）、それぞれの内容の全体を本願明細書に援用する］本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートは、ＨＣＣ細胞において、ターゲット遺伝子の発現および／または機能を調節し、また、ｍｉＲＮＡレベルも調節する。本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートによって制御されうるｍｉＲＮＡの非限定的な例は、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３２－５ｐを含む。
非限定的な一例では、ｍｉＲＮＡは発癌性ｍｉＲＮＡであり、ｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの非存在下と比較して、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの存在下では、少なくとも０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、１、１．５、２、２．５および３倍ダウンレギュレートされる。別の非限定的な例では、ｍｉＲＮＡは腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡであり、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの存在下では、ｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの非存在下と比較して、少なくとも０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、１倍、より好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、さらに好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍アップレギュレートされる。
ＩＶ．キットおよびデバイス
キット
本発明は、本発明の方法を便利におよび／または効果的に実施するためのさまざまなキットを提供する。典型的にはキットは、ユーザーが対象の複数の治療を行うこと、および／または複数の実験を行うことを可能にするのに十分な量および／または数の成分を含むであろう。
一実施形態では、本発明は、インビトロまたはインビボで遺伝子の発現を調節するためのキットであって、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲート、または本発明のｓａＲＮＡもしくはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲート、他の遺伝子を調節するｓａＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のオリゴヌクレチオド分子の組合せを含む、キットを提供する。
キットは、製剤組成物を形成するための包装および説明書および／または送達剤をさらに含みうる。送達剤は、生理食塩水、緩衝液、リピドイド、デンドリマー、または本明細書に開示される任意の送達剤を含みうる。
遺伝子の非限定的な例が、本明細書の表１に記載されている。
一実施形態において、本明細書に記載のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを含むキットは、有効性を示すために増殖性の細胞と共に使用されうる。
非限定的な一例において、バッファー溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩および／またはＥＤＴＡを含みうる。別の非限定的な例において、バッファー溶液は、生理食塩水、２ｍＭカルシウムを含む生理食塩水、５％スクロース、２ｍＭカルシウムを含む５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭカルシウムを含む５％マンニトール、リンゲル乳酸塩、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウムを含む塩化ナトリウム、およびマンノースを含みうるが、これらに限定されるものではない（その全体を本願明細書に援用する米国特許出願公開第２０１２０２５８０４６号明細書を参照）。さらに別の非限定的な例では、バッファー溶液は沈殿されるかまたは凍結乾燥されてもよい。各成分の量は、一貫性と再現性のある高濃度の生理食塩水またはシンプルなバッファーの製剤を可能にするために変更されてもよい。また、成分は、一定期間にわたる、および／またはさまざまな条件下におけるバッファー溶液中のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートの安定性を高めるために変更されてもよい。
デバイス
本発明は、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを組み込むことができるデバイスを提供する。これらのデバイスは、ヒト患者など、それを必要とする対象に直ちに送達するために利用可能な安定した製剤を含有する。
デバイスの非限定的な例は、ポンプ、カテーテル、針、経皮パッチ、加圧嗅覚送達デバイス、イオントフォレーシスデバイス、多層マイクロ流体デバイスを含む。デバイスは、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを単回、複数回、または分割投与レジメンに従って送達するために使用されうる。デバイスは、本発明のｓａＲＮＡまたはＧａｌＮＡｃ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを生物学的組織全域、皮内、皮下、または筋肉内に送達するために使用されうる。オリゴヌクレオチドを送達するのに好適なデバイスのより多くの例は、２０１２年１２月１４日に出願された国際公開第２０１３／０９０６４８号に開示されており、その内容の全体を本願明細書に援用する。
定義
便宜のため、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語および句の意味が以下に提供される。この明細書の他の部分における用語の使用とこのセクションで提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合は、このセクションにおける定義が優先するものとする。
約：本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、記載されている値の＋／－１０％を意味する。
組み合わせて投与される：本明細書で用いられる場合、「組み合わせて投与される」または「組合せ投与」という用語は、２つ以上の薬剤が、同時にまたは患者に対する各薬剤の効果が重複しうるような間隔で、対象に投与されることを意味する。いくつかの実施形態において、それらは互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。いくつかの実施形態において、薬剤の投与は、組合せ（たとえば、相乗的）効果が達成されるように、互いに十分に近い間隔で行われる。
アミノ酸：本明細書で用いられる場合、「アミノ酸」および「アミノ酸（複数）」という用語は、天然に存在するすべてのＬ－アルファ－アミノ酸を指す。アミノ酸は、次のような１文字または３文字の表記で識別され、ここでは、最初にアミノ酸が記載され、その後に３文字および１文字のコードがそれぞれ記載されている：アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、スレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、リジン（Ｌｙｓ：Ｋ）、アラニン（Ａｌａ：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ：Ｃ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）、メチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）。
動物：本明細書で用いられる場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は任意の発生段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は任意の発生段階における非ヒト動物を指す。特定の実施形態において、非ヒト動物は哺乳動物（たとえば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物は哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および線虫を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、動物はトランスジェニック動物、遺伝子工学操作動物、またはクローンである。
およそ：本明細書で用いられる場合、「およそ」または「約」という用語は、関心のある１つ以上の値に適用される場合、記載されている基準値に類似した値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、明記された参照値のいずれの方向にも（それよりも大きい方向にも小さい方向にも）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に入る値の範囲を意味する（ただし、そのような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
会合：本明細書で用いられる場合、「会合」、「コンジュゲート」、「結合」、「装着」、および「テザー連結」という用語は、２つ以上の部分に対して用いられる場合、直接にまたはリンク剤として機能する１つ以上の追加の部分を介して、互いに物理的に会合または接続されて、構造が用いられる条件下で、たとえば、生理学的条件下で、これらの部分が、物理的に会合された状態を維持するように、十分に安定な構造を形成することを意味する。「会合」は、厳密に直接の共有化学結合を介する必要はない。また、それは、イオン結合、水素結合、または「会合」要素が物理的会合を維持するように十分に安定なハイブリダイゼーションに基づく結合をも示唆しうる。
二機能または二機能性：本明細書で用いられる場合、「二機能」および「二機能性」という用語は、少なくとも２つの機能が可能であるまたはそれを維持する任意の物質、分子、または部分を意味する。機能は、同一のアウトカムまたは異なるアウトカムに影響しうる。機能を発揮する構造は、同一であっても異なっていてもよい。たとえば、本発明の二機能性ｓａＲＮＡは、細胞傷害性ペプチド（第１の機能）を含みうるが、その一方で、ｓａＲＮＡを構成するそれらのヌクレオシドが、それ自体で細胞傷害性である（第２の機能）。
生体適合性：本明細書で用いられる場合、「生体適合性」という用語は、生細胞、組織、傷害のリスクをほとんどまたはまったく示さない器官もしくは系、毒性、または免疫系による拒絶に適合しうることを意味する。
生分解性：本明細書で用いられる場合、「生分解性」という用語は、生物の作用により無害な産物に分解可能であることを意味する。
生物学的活性：本明細書で用いられる場合、「生物学的活性」という表現は、生体系および／または生物で活性を有する任意の物質の特性を意味する。たとえば、生物に投与されたとき、その生物に対して生物学的作用を有する物質は、生物学的に活性であると考えられる。特定の実施形態では、ｓａＲＮＡの一部であっても、生物学的に活性であれば、または生物学的に関連があると見なされる活性を模倣するのであれば、本発明のｓａＲＮＡは、生物学的に活性であると考えられうる。
癌：本明細書で用いられる場合、個体における「癌」という用語は、癌を引き起こす細胞に典型的な特性、たとえば、無制御な増殖、不死、転移能、速い成長および増殖の速度、ならびに特徴的なモルフォロジー特性を有する細胞の存在を意味する。多くの場合、癌細胞は、腫瘍の形態であろうが、そのような細胞は、個体内に単独で存在しうるか、または白血病細胞などの独立細胞として血流中を循環しうる。
細胞成長：本明細書で用いられる場合、「細胞成長」という用語は、細胞複製（すなわち増殖）により生じる細胞数の増大に主に関連付けられ、その速度は細胞死（たとえば、アポトーシスまたは壊死による）の速度よりも大きく、細胞集団のサイズの増加をもたらすが、特定の状況下では、その成長のごく一部は、個別細胞の細胞サイズまたは細胞質体積の増加にも起因する。したがって、細胞成長を阻害する作用剤は、増殖の阻害もしくは細胞死の促進のいずれかまたはその両方によりこれらの２つの対立するプロセスの平衡を変化させるように阻害を行いうる。
細胞型：本明細書で用いられる場合、「細胞型」という用語は、所与の起源（たとえば、組織、器官）の細胞、または所与の分化状態の細胞、または所与の病理もしくは遺伝子構成に関連付けられる細胞を意味する。
染色体：本明細書で用いられる場合、「染色体」という用語は、細胞に見いだされるＤＮＡおよびタンパク質の組織化構造を意味する。
相補的：本明細書で用いられる場合、核酸に関する「相補的」という用語は、ヌクレオチド間または核酸間のハイブリダイゼーションまたは塩基対合を意味し、たとえば、二本鎖ＤＮＡ分子の２つの鎖間またはオリゴヌクレオチドプローブとターゲットとの間などは相補的である。
病態：本明細書で用いられる場合、「病態」という用語は、任意の細胞、器官、器官系、または生物の状態を意味する。病態は、疾患状態または単にエンティティーの生理学的提示もしくは状況を反映しうる。病態は、疾患の巨視的提示などの表現型病態または病態に関連付けられる根底にある遺伝子もしくはタンパク質の発現プロファイルなどの遺伝子型病態として特徴付けられうる。病態は良性または悪性でありうる。
制御放出：本明細書で用いられる場合、「制御放出」という用語は、治療アウトカムをもたらす特定の放出パターンに適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを意味する。
細胞静止：本明細書で用いられる場合、「細胞静止」とは、細胞（たとえば、哺乳動物細胞（たとえば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、菌類、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組合せの成長、分裂、または増殖の阻害、低減、抑制を意味する。
細胞傷害性：本明細書で用いられる場合、「細胞傷害性」とは、細胞（たとえば、哺乳動物細胞（たとえば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、菌類、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組合せを死滅させることまたはそれらに有害作用、毒性作用、もしくは致命的作用を引き起こすことを意味する。
送達：本明細書で用いられる場合、「送達」とは、化合物、物質、要素、部分、カーゴ、またはペイロードを送達する行為または方式を意味する。
送達剤：本明細書で用いられる場合、「送達剤」とは、ターゲティングされる細胞への本発明のｓａＲＮＡのインビボ送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を意味する。
不安定化：本明細書で用いられる場合、「不安定」、「不安定化する」、または「不安定化領域」という用語は、同一の領域または分子の初期型、野生型、または天然型よりも安定でない領域または分子を意味する。
検出可能な標識：本明細書で用いられる場合、「検出可能な標識」とは、ラジオグラフィー、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などをはじめとする当技術分野で公知の方法により容易に検出される、他のエンティティーへの装着、組込み、または会合が行われる１つ以上のマーカー、シグナル、または部分を意味する。検出可能な標識としては、放射性同位体、発蛍光団、発色団、酵素、染料、金属イオン、リガンド（たとえば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびハプテン）、量子ドットなどが挙げられる。検出可能な標識は、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド中の任意のポジションに配置されうる。それらはヌクレオチド内にあるか、５’または３’末端に位置していてもよい。
カプセル化：本明細書で用いられる場合、「カプセル化」という用語は、密封、包囲、または収容を意味する。
工学操作：本明細書で用いられる場合、本発明の実施形態は、構造的か化学的かにかかわらず、出発点、野生型、または天然型の分子と異なる特徴または性質を有するように設計される場合、「工学操作」される。
均等な対象：本明細書で用いられる場合、「均等な対象」は、たとえば、類似の年齢、性別、および健康、たとえば、肝臓の健康もしくは癌の病期の対象、または本発明にかかる治療を行う前の同一の対象でありうる。均等な対象は、本発明にかかるｓａＲＮＡの治療を受けない点で「未治療」である。しかしながら、本発明のｓａＲＮＡで治療される対象が同一または均等な従来の抗癌治療を受けるのであれば、従来の抗癌治療を受けてもよい。
エキソソーム：本明細書で用いられる場合、「エキソソーム」とは哺乳動物細胞により分泌されるベシクルである。
発現：本明細書で用いられる場合、核酸配列の「発現」とは、次のイベント、すなわち、（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生（たとえば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（たとえば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）、（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳、ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾の１つ以上を意味する。
特徴：本明細書で用いられる場合、「特徴」とは、特性、性質、または識別エレメントを意味する。
製剤：本明細書で用いられる場合、「製剤」は、少なくとも１つの本発明のｓａＲＮＡと送達剤とを含む。
断片：「断片」とは、本明細書で用いられる場合、一部分を意味する。たとえば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することにより得られるポリペプチドを含みうる。オリゴヌクレオチドの断片は、ヌクレオチド、またはヌクレオチドの領域を含みうる。
機能性：本明細書で用いられる場合、「機能性」生物学的分子とは、特徴付けられる性質および／または活性を呈する形態の生物学的分子のことである。
遺伝子：本明細書で用いられる場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体の産生に必要な制御配列とほとんどの場合にコード配列とを含む核酸配列を意味する。しかしながら、遺伝子は翻訳されなくてもよく、その代わりに調節または構造ＲＮＡ分子をコードしうる。
遺伝子は、植物、菌類、動物、細菌ゲノムもしくはエピソーム、真核、核、もしくはプラスミドのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または化学合成ＤＮＡを含めて、全体または一部が当技術分野で公知の任意の起源に由来しうる。遺伝子は、発現産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現の速度、または発現制御の方式に影響を及ぼしうる１つ以上の修飾をコード領域または非翻訳領域のいずれかに含有しうる。そのような修飾としては、１つ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、および置換が挙げられるが、これらに限定されるものではない。遺伝子は非中断コード配列を構成しうるか、または適切なスプライス部位により結合された１つ以上のイントロンを含みうる。
遺伝子発現：本明細書で用いられる場合、「遺伝子発現」という用語は、核酸配列がうまく転写されて、ほとんどの場合、翻訳されてタンパク質またはペプチドを産生するプロセスを意味する。明確さを期して、「遺伝子発現」の測定が参照される場合、測定は転写の核酸産物、たとえばＲＮＡもしくはｍＲＮＡまたは翻訳のアミノ酸産物、たとえばポリペプチドもしくはペプチドの測定でありうることを意味すると理解すべきである。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、およびペプチドの量またはレベルを測定する方法は、当技術分野で周知である。
ゲノム：「ゲノム」という用語は、核ＤＮＡ成分、染色体または染色体外のＤＮＡ、さらには細胞質内ドメイン（たとえば、ミトコンドリアＤＮＡ）を含めて、生物の全ＤＮＡ相補体を含むことが意図される。
相同性：本明細書で用いられる場合、「相同性」という用語は、高分子間、たとえば、核酸分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を意味する。いくつかの実施形態では、高分子は、配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または類似である場合、互いに「相同」であると見なされる。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列）間の比較を意味する。本発明によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチに関して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、さらには９９％であれば、相同であると見なされる。いくつかの実施形態では、相同ポリヌクレオチド配列は、ユニークに特定された少なくとも４～５アミノ酸のストレッチをコードする能力により特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列では、相同性は、ユニークに特定された少なくとも４～５アミノ酸のストレッチをコードする能力により決定される。本発明によれば、２つのタンパク質配列は、タンパク質が少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチに関して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一であれば、相同であると見なされる。
「過剰増殖性細胞」という用語は、均等な健常細胞（「対照」と呼ばれうる）の増殖速度と比較して異常に高い速度で増殖する任意の細胞を意味しうる。「均等な健常」細胞とは、細胞の正常な健常カウンターパートである。したがって、それは、同一のタイプの細胞、たとえば、コンパレータ細胞と同一の機能を行う、同一の器官の細胞である。たとえば、過剰増殖性肝細胞の増殖は健常肝細胞を基準にして評価すべきであり、一方、過剰増殖性前立腺細胞の増殖は健常前立腺細胞を基準にして評価すべきである。
増殖の「異常に高い」速度とは、過剰増殖性細胞の増殖速度が均等な健常（非過剰増殖性）細胞の増殖速度と比較して少なくとも２０、３０、４０％、または少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、または少なくとも８０％増加することを意味する。増殖の「異常に高い」速度とはまた、均等な健常細胞の増殖速度と比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、または少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍増加する速度を意味しうる。
過剰増殖性障害：本明細書で用いられる場合、「過剰増殖性障害」とは、以上に定義される過剰増殖性細胞を含む任意の障害でありうる。過剰増殖性障害の例としては、新生物障害、たとえば癌、乾癬性関節炎、関節リウマチ、胃過剰増殖性障害、たとえば炎症性腸疾患、皮膚障害、たとえば乾癬、ライター症候群、毛孔性紅色粃糠疹、および角化障害の過剰増殖性異型障害が挙げられる。
過剰増殖性細胞をいかに識別するかは当業者の熟知するところである。動物内の過剰増殖性細胞の存在は、Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴスキャンなどのスキャンを用いて識別可能でありうる。ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＭＴＳ、またはＷＳＴ－１アッセイなどの細胞増殖アッセイを用いてインビトロでサンプルを培養することによっても過剰増殖性細胞を同定しうるか、または細胞増殖をアッセイしうる。インビトロでの細胞増殖はまた、フローサイトメトリーを用いて決定可能である。
同一性：本明細書で用いられる場合、「同一性」という用語は、高分子間、たとえば、オリゴヌクレオチド分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を意味する。たとえば、２つのポリヌクレオチド配列のパーセント同一性の計算は、最適比較目的で２つの配列をアライメントすることにより、行うことが可能である（たとえば、最適アライメントになるように第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することが可能であり、比較目的では異なる配列を無視することが可能である）。特定の実施形態では、比較目的でアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチドポジションのヌクレオチドが比較される。第１の配列のポジションが第２の配列の対応するポジションと同一のヌクレオチドにより占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列が最適アライメントになるように導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一ポジションの数の関数である。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。たとえば、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），レスク、エー エム（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；バイオコンピューティング：インフォマティクスとゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ），スミス、ディー ダブリュー（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），フォン・ハインジェ、ジー（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；配列データのコンピュータ分析、第Ｉ部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ），グリフィン、エー エム（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）とグリフィン、エイチ ジー（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；および配列解析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ），グリブスコフ、エム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）とデヴロー、ジェイ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に記載されるような方法を用いて決定可能であり、これらの各々を本願明細書に援用する。たとえば、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているマイヤー（Ｍｅｙｅｒｓ）とミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７）により、決定可能である。２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、他の選択肢として、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムにより、決定可能である。配列間のパーセント同一性を決定するのに一般に利用される方法は、本願明細書に援用するカリロ、エイチ（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．）およびリップマン、ディー（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．），ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されるものを含むが、これに限定されるものではない。同一性を決定するための技術は、公的に入手可能なコンピュータプログラムの形態で体系化されている。２つの配列間の相同性を決定する例示的なコンピュータソフトウェアは、ＧＣＧプログラムパッケージ、デベロー、ジェイら（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ、アルツシュール、エス エフら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）を含むが、これらに限定されるものではない。
遺伝子発現の阻害：本明細書で用いられる場合、「遺伝子発現の阻害」という表現は、遺伝子の発現産物の量の低減を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されるＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ）または遺伝子から転写されるｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドでありうる。典型的には、ｍＲＮＡのレベルの低減は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的技術を用いて決定可能である。
インビトロ：本明細書で用いられる場合、「インビトロ」という用語は、生物（たとえば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工環境下、たとえば、試験管または反応容器、細胞培養物、ペトリ皿などで起こるイベントを意味する。
インビボ：本明細書で用いられる場合、「インビボ」という用語は、生物（たとえば、動物、植物、もしくは微生物、またはそれらの細胞もしくは組織）内に起こるイベントを意味する。
単離された：本明細書で用いられる場合、「単離された」という用語は、一体化された成分（自然環境または実験現場のいずれであるかにかかわらず）の少なくとも一部から分離された物質または要素を意味する。単離された物質は、一体化されていた物質に対してさまざまなレベルの純度を有しうる。単離された物質および／または要素は、それが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはより多くから分離されうる。いくつかの実施形態では、単離された作用剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超の純度である。本明細書で用いられる場合、物質は、それが他の成分を実質的に含まないのであれば、「純粋」である。実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、生成または検出された環境から化合物が実質的に分離されていることを意味する。部分的な分離は、たとえば、本開示にかかる化合物が富化された組成物を含みうる。実質的な分離は、重量基準で、本開示にかかる化合物またはその塩の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％を含有する組成物を含みうる。化合物およびその塩を単離する方法は、当技術分野で慣用されているものである。
標識：「標識」という用語は、物質、化合物、または対象物を検出できるように対象物に組み込まれる物質または化合物を意味する。
リンカー：本明細書で用いられる場合、リンカーとは原子団（たとえば、１０～１，０００原子）を意味し、限定されるものではないが炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、イミンなどの原子または基で構成可能である。リンカーは、第１の末端を修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドの核酸塩基または糖部分に、かつ第２の末端を検出可能剤または治療剤などのペイロードに装着可能である。リンカーは、核酸配列中への組込みを妨害しない十分な長さでありうる。リンカーは、本明細書に記載されるように、ｓａＲＮＡコンジュゲートを形成したりさらにはペイロードを投与したりするなど、任意の有用な目的に使用可能である。
リンカーおよび／またはスペーサーに組込み可能な化学基の例としては、限定されるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられ、それらは、それぞれ本明細書に記載されるように任意選択的に置換可能である。スペーサーの例は、限定されるものではないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（たとえば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマーユニット、たとえば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、およびデキストランポリマー、ならびにそれらの誘導体を含む。リンカーの例は、たとえばジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）やアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）など、リンカー内に還元剤や光分解で切断可能な部分を持つものを含むが、これらに限定はされない。選択的に切断可能な結合の非限定的な例は、たとえば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）または他の還元剤の使用によって切断可能なジスルフィド結合を含む。
転移：本明細書で用いられる場合、「転移」という用語は、原発腫瘍として最初に生じた場所から体内の離れた位置に癌が広がるプロセスを意味する。転移はまた、原発腫瘍の広がりから得られる癌も意味する。たとえば、ある乳癌罹患者は、自身のリンパ系、肝臓、骨、または肺に転移を発症しうる。
修飾：本明細書で用いられる場合、「修飾」とは、本発明にかかる分子の変化した状態または構造を意味する。分子は、化学的、構造的、および機能的なものを含めて、多くの方法で修飾されうる。一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、非天然のヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入により修飾される。
天然に存在する：本明細書で用いられる場合、「天然に存在する」とは、人為的な支援を受けることなく天然に存在することを意味する。
核酸：本明細書で用いられる「核酸」という用語は、１つ以上のヌクレオチド、すなわち、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその両方で構成された分子を意味する。この用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを含み、ポリマーの場合、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドは、５’から３’への結合を介して結合一体化される。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのポリマーは一本鎖または二本鎖でありうる。しかしながら、結合は当技術分野で公知の任意の結合を含んでいてもよく、たとえば、核酸は５’から３’への結合を含む。ヌクレオチドは天然に存在しうるか、または天然に存在する塩基対との塩基対関係を形成可能な合成により生成されたアナログでありうる。塩基対合関係を形成可能な天然に存在しない塩基の例は、限定されるものではないが、アザおよびデアザピリミジンアナログ、アザおよびデアザプリンアナログ、ならびにピリミジン環の炭素原子および窒素原子の１つ以上がヘテロ原子、たとえば、酸素、硫黄、セレン、リンなどにより置換された他のヘテロ環塩基アナログを含む。
患者：本明細書で用いられる場合、「患者」とは、治療を求めているか、もしくはそれが必要な状態にあると思われる、治療を必要とする、治療を受けている、または治療を受けるであろう対象、あるいは特定の疾患もしくは病態に対して訓練された専門家によるケアを受けている対象を意味する。
ペプチド：本明細書で用いられる場合、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、たとえば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。
薬学的に許容可能：「薬学的に許容可能」という表現は、本明細書では、妥当な便益／リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、もしくは他の問題、または合併症を伴うことなく、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織に接触させて使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を意味する。
薬学的に許容可能な賦形剤：本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」という表現は、本明細書に記載の化合物以外で患者において実質的に非毒性かつ非炎症性の性質を有する任意の成分を意味する（たとえば、活性化合物の懸濁または溶解が可能な媒体）。賦形剤は、たとえば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、膜形成剤またはコーティング剤、風味剤、香気剤、滑剤（流動促進剤）、滑沢剤、保存剤、プリントインク、収着剤、懸濁化剤または分散剤、甘味剤、および水和水を含みうる。例示的な賦形剤は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（第２）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、ナトリウムデンプングリコレート、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールを含むが、これらに限定されるものではない。
薬学的に許容可能な塩：本開示はまた、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩を包含する。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能な塩」とは、既存の酸部分または塩基部分をその塩形に変換することにより（たとえば、遊離塩基基と好適な有機酸とを反応させることにより）親化合物が修飾された開示化合物の誘導体を意味する。薬学的に許容可能な塩の例は、アミンなどの塩基残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸残基のアルカリ塩または有機塩などを含むが、これらに限定されるものではない。代表的な酸付加塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、さらには非毒性のアンモニウム、第４級アンモニウム、およびアミンカチオン、たとえば、限定されるものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む。本開示にかかる薬学的に許容可能な塩は、親化合物の従来型の非毒性塩、たとえば、非毒性の無機酸または有機酸から生成されたものを含む。本開示にかかる薬学的に許容可能な塩は、塩基部分または酸部分を含有する親化合物から従来の化学的方法により合成可能である。一般的には、そのような塩は、水中もしくは有機溶媒中または両者の混合物中で、これらの化合物の遊離の酸形または塩基形と化学量論量の適切な塩基または酸とを反応させることにより、調製可能である；一般的には、エーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストは、レミングトンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）第１７版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８、ピー エイチ スタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）とシー ジー ワーマス（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）編，医薬塩：性質、選択、および使用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８、ならびにベルジェら（Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に見いだされ、それぞれその全体を本願明細書に援用する。
薬学的に許容可能な溶媒和物：「薬学的に許容可能な溶媒和物」という用語は、本明細書で用いられる場合、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれた本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投与量で生理学的に耐容性である。たとえば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、または沈殿により調製しうる。好適な溶媒の例は、エタノール、水（たとえば、一、二、および三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、エチルアセテート、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、ベンジルベンゾエートなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。
薬理学的効果：本明細書で用いられる場合、「薬理学的効果」とは、生物または系が外因性作用剤と接触した後またはそれに暴露された後に起こる生物または系において測定可能な生物学的現象のことである。薬理学的効果は、治療上有効なアウトカム、たとえば、１つ以上の症状の治療や改善、疾患、障害、病態、または感染の診断、予防、およびそれらの発症の遅延をもたらしうる。そのような生物学的現象の測定は、定量的、定性的、または他の生物学的現象に対して相対的でありうる。定量測定は統計的に有意でありうる。定量測定は統計的に有意でありうる。定性的測定は、程度または種類でありうると共に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えて異なりうる。それらは、存在するまたは不在である、より良好であるまたはより悪い、より多いまたはより少ないとして観測可能である。外因性作用剤とは、薬理学的効果を参照する場合、全体または一部が生物または系に対して外来性である作用剤のことである。たとえば、野生型バイオ分子への修飾は、構造的か化学的かにかかわらず、外因性作用剤を生じるであろう。同様に、生物または系では天然に見いだされない化合物、分子、または物質への野生型分子の組込みまたはそれらと野生型分子との組合せも外因性作用剤を生じるであろう。
本発明のｓａＲＮＡは外因性作用剤を含む。薬理学的効果の例は、限定されるものではないが、細胞数の変化、たとえば、好中球、網状赤血球、顆粒球、赤血球（赤血球）、巨核球、血小板、単球、結合組織マクロファージ、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、または網状赤血球の増加または減少を含む。薬理学的効果はまた、血液化学、ｐＨ、ヘモグロビン、ヘマトクリットの変化、酵素、たとえば限定されるものではないが、肝酵素ＡＳＴおよびＡＬＴのレベルの変化、脂質プロファイル、電解質、代謝マーカー、ホルモン、または当業者に公知の他のマーカーもしくはプロファイルの変化を含む。
物理化学的：本明細書で用いられる場合、「物理化学的」とは、物理的および／もしくは化学的な性質またはそれに関することを意味する。
予防：本明細書で用いられる場合、「予防」という用語は、感染、疾患、障害、および／もしくは病態の発生を部分的にもしくは完全に遅延すること、特定の感染、疾患、障害、および／もしくは病態の１つ以上の症状、特徴、もしくは臨床病変の発生を部分的にもしくは完全に遅延すること、特定の感染、疾患、障害、および／もしくは病態の１つ以上の症状、特徴、もしくは病変の発生を部分的にもしくは完全に遅延すること、感染、特定の疾患、障害、および／もしくは病態からの進行を部分的にもしくは完全に遅延すること、ならびに／または感染、疾患、障害、および／もしくは病態に関連付けられる病理発生のリスクを減少させることを意味する。
プロドラッグ：本開示はまた、本明細書に記載の化合物のプロドラッグを包含する。本明細書で用いられる場合、「プロドラッグ」とは、物質、分子、または要素が化学的または物理的な変化を受けたときに治療剤として作用すると見なされる形態をとる任意の物質、分子、または要素を意味する。プロドラッグは、共有結合されていても、何らかの方法で捕獲されていてもよく、哺乳動物対象への投与前、投与時、または投与後、活性薬物部分を放出するかまたはそれに変換される。プロドラッグは、慣例的な操作によりまたはインビボで修飾が切断されて親化合物になるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することにより、調製可能である。プロドラッグは、ヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、またはカルボキシル基が、哺乳動物対象に投与されたときにそれぞれ遊離のヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、またはカルボキシル基を生成するように切断される任意の基に結合されている化合物を含む。プロドラッグの調製および使用は、ティー ヒグチ（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）とヴイ ステラ（Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ）、「新規な送達系としてのプロドラッグ（Ｐｒｏ－ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ｖｏｌ．１４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、ならびにエドワード ビー ロッシュ（Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ）編、「薬物設計における生体可逆性担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）」、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７で考察されており、両方ともその全体を本願明細書に援用する。
予後予測：本明細書で用いられる場合、「予後予測」という用語は、特定の生物学的イベントが将来起こるであろうことまたは起こる可能性が非常に高いことの陳述または主張を意味する。
進行：本明細書で用いられる場合、「進行」または「癌の進行」という用語は、疾患もしくは病態のまたはそれらに向かう促進もしくは悪化を意味する。
増殖：本明細書で用いられる場合、「増殖」という用語は、成長、拡張、もしくは増大すること、または迅速に成長、拡張、もしくは増大を引き起こすことを意味する。「増殖」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖」とは、増殖性質に対抗するまたは不適である性質を有することを意味する。
タンパク質：「タンパク質」とは、ペプチド結合により結合一体化されたアミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で用いられる場合、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを意味する。しかしながら、典型的には、タンパク質は少なくとも５０アミノ酸長であろう。いくつかの場合、コードされたタンパク質は約５０アミノ酸未満である。この場合、ポリペプチドはペプチドと称される。タンパク質が短いペプチドである場合、それは少なくとも約１０アミノ酸残基長であろう。タンパク質は、天然に存在するもの、組み換えられたもの、もしくは合成されたもの、またはこれらの任意の組合せでありうる。タンパク質はまた、天然に存在するタンパク質またはペプチドの断片を含みうる。タンパク質は、単分子でありうるか、または多分子複合体でありうる。タンパク質という用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学アナログであるアミノ酸ポリマーにも当てはまりうる。
タンパク質発現：「タンパク質発現」という用語は、アミノ酸配列またはタンパク質の検出可能なレベルが発現されるように核酸配列が翻訳を受けるプロセスを意味する。
精製された：本明細書で用いられる場合、「精製する」、「精製された」、「精製」とは、望ましくない成分、材料汚染、混合、または不完全から実質的に純粋または清澄にすることを意味する。
退縮：本明細書で用いられる場合、「退縮」または「退縮度」という用語は、表現型または遺伝子型のいずれかにおける癌の進行の逆転を意味する。癌の進行の遅延または停止は退縮であると見なされうる。
サンプル：本明細書で用いられる場合、「サンプル」または「生物学的サンプル」という用語は、その組織、細胞、または構成部分（たとえば、限定されるものではないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血、尿、膣液、および精液をはじめとする体液）のサブセットを意味する。サンプルは、たとえば、限定されるものではないが、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、外側皮膚切片、呼吸管、腸管、および泌尿生殖管、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官を含めて、全生物体、またはその組織、細胞、もしくは構成部分のサブセット、またはそれらの画分もしくは一部分から調製されるホモジネート、ライセート、または抽出物をさらに含みうる。サンプルは、タンパク質分子または核酸分子などの細胞成分を含有している可能性がある媒体、たとえば、栄養ブロスまたはゲルをさらに意味する。
シグナル配列：本明細書で用いられる場合、「シグナル配列」という表現は、タンパク質の輸送または局在化を指示可能な配列を意味する。
単回ユニット用量：本明細書で用いられる場合、「単回ユニット用量」とは、１回で／一時点／一経路／一接触点で、すなわち単回投与イベントで投与される任意の治療剤の用量のことである。
類似性：本明細書で用いられる場合、「類似性」という用語は、高分子間、たとえば、ポリヌクレオチド分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を意味する。互いの高分子のパーセント類似性の計算は、当技術分野で理解されている保存的置換を考慮してパーセント類似性を計算すること以外、パーセント同一性の計算と同一の方式で実施可能である。
分割用量：本明細書で用いられる場合、「分割用量」とは、単回ユニット用量または全一日用量を２つ以上に分割した用量のことである。
安定：本明細書で用いられる場合、「安定」とは、反応混合物から有用な純度への単離に耐えるのに十分なロバスト性のある、一実施形態において、有効な治療剤への製剤化が可能である化合物を意味する。
安定化された：本明細書で用いられる場合、「安定化する」、「安定化された」、「安定化領域」という用語は、安定にすることまたは安定になることを意味する。
対象：本明細書で用いられる場合、「対象」または「患者」という用語は、たとえば、実験、診断、予防、および／または治療の目的で、本発明にかかる組成物が投与されうる任意の生物を意味する。典型的な対象は、動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物、およびヒトなどの哺乳動物）および／または植物を含む。
実質的に：本明細書で用いられる場合、「実質的に」という用語は、対象の特徴または性質の全体または、ほぼ全体の範囲または度合いを呈する定性的条件を意味する。生物学技術分野の当業者であれば、生物学的および化学的な現象が、最終状態に達することおよび／または完全に進行することまたは絶対的結果を達成もしくは回避することは、あっても稀であるものと理解されよう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的な現象に固有の完全性の欠如の可能性を取り込むように本明細書で用いられる。
実質的に等しい：用量間の時間差に関して本明細書で用いられる場合、この用語は、±２％を意味する。
実質的に同時に：複数の用量に関係して本明細書で用いられる場合、この用語は、２秒間以内を意味する。
に罹患している：疾患、障害、および／または病態「に罹患している」個体は、疾患、障害、および／または病態と診断されているまたはそれらの１つ以上の症状を呈する。
に罹患しやすい：疾患、障害、および／または病態「に罹患しやすい」個体は、疾患、障害、および／または病態の症状で診断されていないか、かつ／またはその症状を呈していなくてもよいが、疾患またはその症状を発症する傾向を有する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病態（たとえば、癌）に罹患しやすい個体は、次のもの、すなわち、（１）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる遺伝子突然変異、（２）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる遺伝子多型、（３）疾患、障害、および／または病態に関連付けられるタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増大および／または低減、（４）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる習性および／または生活習慣、（５）疾患、障害、および／または病態の家族歴、ならびに（６）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる微生物への暴露および／またはその感染、の１つ以上により特徴付け可能である。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または病態を発生するであろう。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または病態を発生しないであろう。
持続放出：本明細書で用いられる場合、「持続放出」という用語は、特定の期間にわたり放出速度に適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを意味する。
合成：「合成」という用語は、ヒトの手により産生、調製、および／または製造されることを意味する。本発明にかかるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的もしくは酵素的でありうる。
ターゲティングされる細胞：本明細書で用いられる場合、「ターゲティングされる細胞」とは、任意の１つ以上の目的の細胞を意味する。細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュ、または生物の組織もしくは器官で見いだされうる。生物は、動物、一実施形態では、哺乳動物、またはヒトであってもよく、もっともな一実施形態では、患者でありうる。
治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与したとき、治療効果、診断効果、および／もしくは予防効果を有する、ならびに／または所望の生物学的効果および／もしくは薬理学的効果を誘発する任意の作用剤を意味する。
治療上有効量：本明細書で用いられる場合、「治療上有効量」という用語は、感染、疾患、障害、および／または病態に罹患しているまたは罹患しやすい対象に投与したとき、感染、疾患、障害、および／または病態を治療、その症状を改善、その発生を診断、予防、および／または遅延するのに十分な送達作用剤（たとえば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。
治療上有効なアウトカム：本明細書で用いられる場合、「治療上有効なアウトカム」という用語は、感染、疾患、障害、および／または病態に罹患しているまたは罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害、および／または病態を治療、その症状を改善、その発症を診断、予防、および／または遅延するのに十分なアウトカムを意味する。
全一日用量：本明細書で用いられる場合、「全一日用量」とは、２４時間以内で投与または処方される量のことである。それは、単回ユニット用量として投与されうる。
転写因子：本明細書で用いられる場合、「転写因子」という用語は、たとえば、転写の活性化または抑圧により、ＤＮＡからＲＮＡへの転写を調節するＤＮＡ結合タンパク質を意味する。いくつかの転写因子は、転写のみの調節を行うが、他のものは、他のタンパク質と協奏的に作用する。いくつかの転写因子は、特定の条件下で転写の活性化および抑制の両方を行うことが可能である。一般的には、転写因子は、ターゲット遺伝子の調節領域の特定のコンセンサス配列にきわめて類似した１つもしくは複数の特異的ターゲット配列に結合する。転写因子は、ターゲット遺伝子の転写を単独でまたは他の分子との複合体で調節しうる。
治療：本明細書で用いられる場合、「治療」という用語、特定の感染、疾患、障害、および／または病態を部分的にまたは完全に緩和、寛解、改善、軽減したり、その発症を遅延したり、その進行を阻害したり、その重症度を低減したり、かつ／またはその１つ以上の症状もしくは特徴の出現を低減したりすることを意味する。たとえば、癌を「治療」することは、腫瘍の生存、増殖、および／または拡がりを阻害することを意味しうる。治療は、疾患、障害、および／もしくは病態の徴候を呈しない対象に、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは病態に関連付けられる病変を発生するリスクを低減する目的で、疾患、障害、および／もしくは病態の早期徴候を呈する対象に施すことが可能である。
「治療方法」という表現またはその均等語は、たとえば癌に適用する場合、個体において癌細胞の数を低減、排除、もしくは予防するようにまたは癌の症状を軽減するように設計された手順または行動方針を意味する。癌または他の増殖性障害の「治療方法」は、癌細胞もしくは他の障害が実際上完全に排除されること、細胞数もしくは障害が実際上低減されること、または癌もしくは他の障害の症状が実際上軽減されることを必ずしも意味するとは限らない。多くの場合、癌の治療方法は、成功する可能性が低い場合でさえも行われるであろう。ただし、それにもかかわらず、個体の病歴および推定余命を考慮して全体的に有益な行動方針と見なされる。
腫瘍成長：本明細書で用いられる場合、「腫瘍成長」または「腫瘍転移成長」という用語は、特に指定がない限り、腫瘍学で通常使用されるように用いられる。ただし、この用語は、主に腫瘍細胞成長の結果としての腫瘍または腫瘍転移の増加量または増加体積に主に関連付けられる。
腫瘍負荷：本明細書で用いられる場合、「腫瘍負荷」という用語は、対象が有する直径３ｍｍ超の全腫瘍小結節の全腫瘍体積を意味する。
腫瘍体積：本明細書で用いられる場合、「腫瘍体積」という用語は、腫瘍のサイズを意味する。ｍｍ３単位の腫瘍体積は、式：体積＝（幅）２×長さ／２により計算される。
非修飾：本明細書で用いられる場合、「非修飾」とは、何らかの方法で変化させる前の任意の物質、化合物、または分子を意味する。非修飾とは、生体分子の野生型または未修飾型を意味するが、常にそうであるとは限らない。分子は、一連の修飾を受けうるが、それにより、各修飾分子は、それに続く修飾のための「非修飾」出発分子として役立ちうる。
均等物および範囲
当業者であれば、通常の実験の域を出ることなく、本明細書に記載の本発明にかかる特定の実施形態に対する多くの均等物が分かるか、またはそれらを確認できるであろう。本発明の範囲は、以上の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に明記される通りである。
特許請求の範囲では、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、相反する指摘がない限りまたは特に文脈から自明でない限り、１つ以上を意味しうる。グループの１つ以上のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、相反する指摘がない限りまたは特に文脈から自明でない限り、グループメンバーの１つ、１つ超、またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、または他の方法でそれに適合する場合、満たされると考えられる。本発明は、厳密にグループの１つのメンバーが所与の製品またはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、または他の方法でそれに適合する、実施形態を含む。本発明は、グループメンバーの１つ超またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、または他の方法でそれに適合する、実施形態を含む。
また、「含む」という用語は、オープンであることが意図され、追加の要素または工程の組込みを許容することにも留意されたい。
範囲が与えられた場合、端点が含まれる。さらに、特に指定がない限り、または特に文脈および当業者の理解から自明でない限り、範囲として表現された値は、文脈上明らかに異なる場合を除いて、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明のさまざまな実施形態で指定の範囲内の任意の特定の値または部分範囲を仮定しうると理解されるべきである。
それに加えて、先行技術に包含される本発明の特定の実施形態はいずれも請求項の任意の１項以上から明示的に除外されうると理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者に公知であると見なされるため、たとえ本明細書で明示的に除外が明記されていないとしても、それらは除外されうる。本発明にかかる組成物の特定の実施形態（たとえば、任意の核酸、またはそれによりコードされたタンパク質、任意の製造方法、任意の使用方法など）はいずれも、先行技術の存在の有無にかかわらず、任意の理由でいずれか１項以上の請求項から除外されうる。
引用された出典、たとえば、本明細書に引用された参考文献、刊行物、データベース、データベース項目、および技術はすべて、たとえ引用に明確に記載されていないとしても、本願明細書に援用する。引用された出典の記載内容と本出願の記載内容とが矛盾する場合、本出願の記載内容が優先するものとする。
以下の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。
実施例１：ＧａｌＮＡｃモノマーの合成
（３ａＳ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－５－（アセトキシメチル）－２－メチル－３ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－５Ｈ－ピラノ［３，２－ｄ］オキサゾール－６，７－ジイルジアセテート２
室温でジクロロメタン（５８０ｍＬ）中のＧａｌＮＡｃ（５０ｇ、１２９ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（４７ｍＬ、３１６ｍｍｏｌ、２．４６当量）を加え、反応混合物を加熱還流する。反応を２４時間撹拌し、次に０℃に冷却した。反応をトリエチルアミンでクエンチし、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、２を次のステップで直接使用する粗褐色ガムとして得る。
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－５－アセトアミド－２－（アセトキシメチル）－６－（アリルオキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４－ジイルジアセテート３
ジクロロメタン（１０００ｍＬ）中の２（４２ｇ、１２８ｍｍｏｌ）の溶液を、活性化４Ａモレキュラーシーブ（１６０ｇ）上で室温において撹拌し、アリルアルコール（９．６ｍＬ、１４１ｍｍｏｌ、１．１当量）を加える。反応混合物を３０分間撹拌した後、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（２０．５ｍＬ、１３８ｍｍｏｌ、１．０当量）を加える。反応混合物をさらに３時間１５分間撹拌した後、セライトで濾過し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄する。混合物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮する。粗生成物を酢酸エチル／ジエチルエーテル、次に酢酸エチルから再結晶化させ、酢酸エチル（×４）、ジエチルエーテル（×２）で洗浄し、高真空下で乾燥させて、３を茶色の固体としてＧａｌＮＡｃから３５％の収率で得る。
２－（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）酢酸４
室温で１：１のジクロロメタン／アセトニトリル（１９２ｍＬ）中の３（１９．２ｇ、４９．６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、過ヨウ素酸ナトリウム（４０．３ｇ、１８９ｍｍｏｌ、３．８当量）および水（４５ｍＬ）を加えた。混合物を５℃に冷却し、塩化ルテニウム（１．０３ｇ、４．９６ｍｍｏｌ、０．１当量）を一度に加えた。反応物を室温に温め、１６時間撹拌した。有機溶媒を真空中で除去し、水相をジクロロメタン（×９）で抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。粗生成物を酢酸エチルから再結晶化し、酢酸エチル（×２）、ジエチルエーテル（×２）で洗浄し、高真空下で乾燥させて、４をオフホワイト固体として７０％の収率で得た。
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－５－アセトアミド－２－（アセトキシメチル）－６－（２－（（６－（（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）ヘキシル）アミノ）－２－オキソエトキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４－ジイルジアセテート６
室温でテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の４（４．６５ｇ，１１．５ｍｍｏｌ）と５（６．１５ｇ，１１．５ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．８６ｇ，１３．８ｍｍｏｌ，１．２当量）、次に１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２．６５ｇ，１３．８ｍｍｏｌ，１．２当量）を加えて、反応混合液を１６時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチルに溶解し、１０：３の水／ブラインで洗浄し、酢酸エチルで逆抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。粗油をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／アセトン勾配）により精製して、６を黄色の固体として６８％の収率で得た。
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－５－アセトアミド－２－（アセトキシメチル）－６－（２－（（６－（（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－（（（２－シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）ヘキシル）アミノ）－２－オキソエトキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４－ジイルジアセテートＭ１’（ここで、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝ＡｃおよびＲ４＝ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、Ｒ５＝Ｒ６＝２－プロピル）。
６（６．８８ｇ、７．３８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（×３）で共沸させた後、ジクロロメタン（７０ｍＬ）に溶解し、室温で撹拌する。この混合物に、ジクロロメタン中の２－シアノエトキシ－ビス（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（２．４５ｇ、８．１２ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液、続いてジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．６３ｇ、３．６９ｍｍｏｌ，０．５当量）を加え、混合物を１６時間室温で撹拌する。反応混合物を水、次にブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。粗油をペンタン（×５）で沈殿させ、次にフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）によって精製して黄色のガムを得、これをアセトニトリルに溶解し、濾過し、真空中で濃縮して、７を黄色の固体として６３％の収率で得る。
トリエチルアンモニウム４－（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－５－（（６－（２－（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）アセトアミド）ヘキシル）オキシ）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）－４－オキソブタノエート８
室温でジクロロメタン（６ｍＬ）中の６（２ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に無水コハク酸（０．５４ｇ、５．４２ｍｍｏｌ、２．５当量）とトリエチルアミン（０．７６ｍＬ、５．４２ｍｍｏｌ、２．５当量）を加え、混合物を１６時間、室温で撹拌する。混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、次いでブラインで洗浄した。水相を合わせ、ジクロロメタンで逆抽出し、ＮａＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。粗製品をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール勾配）で精製し、２９％の収率で８を得た。
β－ｄＲ－ＧａｌＮＡｃ－サクシニル－ＬＣＡＡ－ＣＰＧ（１０００Å）Ｍ４’（ここで、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ａｃ、Ｌ１＝サクシニル、サポートは１０００Å ＬＣＡＡ－ＣＰＧである）
２％トリエチルアミン／ジクロロメタン（８ｍＬ）中の８（２．３８ｇ、２．１１ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３，－テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート（１．０２ｇ、３．１８ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、混合物を室温で１５分間撹拌する。反応混合物を、事前に洗浄したアミノＳｙｎＢａｓｅ（商標）ＬＣＡＡ ＣＰＧ １０００／１００（４９ｇ）に加え、窒素流で２時間バブリングすることにより混合する。ＣＰＧを濾過し、ジクロロメタン（×３）で洗浄し、次に、ピリジン（１５０ｍＬ）中のジメチルアミノピリジン（０．２５ｇ）および無水酢酸（３．８ｍＬ）の溶液に懸濁する。混合物を時々穏やかに撹拌しながら３０分間静置した後、濾過し、メタノール（×３）、ジクロロメタン（×３）およびジエチルエーテル（×３）で洗浄し、風乾して自由流動性の白色固体を得る。
実施例２：ｓａＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートの合成
モノマーＧａｌＮＡｃビルディングブロックは、ホスホルアミダイト法による標準的なオリゴヌクレオチド合成に適合する。ホスホルアミダイトと官能化された固体支持体が、合成プロセス中に使用される。ＧａｌＮＡｃホスホルアミダイトは、オリゴヌクレオチドの任意のポジションに単独で、または他のＧａｌＮＡｃモノマーと組み合わせて加えられる。それらは、スペーサーまたはリンカーなしで順次加えられるか、またはヌクレオチド、スペーサーもしくはリンカーによって分離される。ＧａｌＮＡｃ固体支持体は、オリゴヌクレオチドの３’末端にＧａｌＮＡｃ修飾を組み込むために使用される。
このタイプの修飾オリゴヌクレオチドのための典型的なオリゴヌクレオチド合成、脱保護、精製、およびアニーリングプロトコルを使用して、ｓａＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートを調製した。
実施例３：ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートを用いたインビトロおよびインビボ試験
表５の２４個のＧａｌＮＡｃ－ＣＥＢＰＡ－ｓａＲＮＡコンジュゲートを合成し、本明細書に記載のＣ６－ＧａｌＮＡｃ構造に含まれる、以前に記述された完全修飾ＧａｌＮＡｃ－Ｃ６－ＣＥＢＰＡ ｓａＲＮＡコンジュゲート（２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７４２１１の実施例２）に対して、パッシブトランスフェクションにより、初代肝細胞においてインビトロで活性をテストした。すべての新規設計が、５００ｎＭ（図１および図２）および１μＭ（図３および図４）での初代ラット肝細胞におけるパッシブトランスフェクションにより、ＧａｌＮＡｃ－Ｃ６－ＣＥＢＰＡと均等またはそれ以上のＣＥＢＰＡおよびアルブミンｍＲＮＡのアップレギュレーションをもたらした。
Ｌ１：
Figure 2022545101000098
Ｌ２：
Figure 2022545101000099
Ｌ３：
Figure 2022545101000100
Ｌ４：
Figure 2022545101000101
Ｌ５：
Figure 2022545101000102
Ｌ６：
Figure 2022545101000103
Ｌ１４：
Figure 2022545101000104
Ｌ１５：
Figure 2022545101000105
Ｌ１６：
Figure 2022545101000106
Ｌ１７：
Figure 2022545101000107
Ｌ１８：
Figure 2022545101000108
Ｌ１９：
Figure 2022545101000109
Ｌ４０：
Figure 2022545101000110
Ｌ４１：
Figure 2022545101000111
Ｌ４２：
Figure 2022545101000112
Ｌ４３：
Figure 2022545101000113
Ｌ４４：
Figure 2022545101000114
Ｌ４５：
Figure 2022545101000115
Ｌ５３：
Figure 2022545101000116
Ｌ５４：
Figure 2022545101000117
Ｌ５５：
Figure 2022545101000118
Ｌ５６：
Figure 2022545101000119
Ｌ５７：
Figure 2022545101000120
Ｌ５８：
Figure 2022545101000121
インビトロ実験に続いて、最も有望な化合物を正常なマウスにインビボで摂取させた。
コンジュゲートＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ１６、Ｌ４０、Ｌ４１、Ｌ４２、Ｌ４３、およびＬ５５を１日目と３日目に３０ｍｇ／Ｋｇで静脈内（ＩＶ）注射し、５日目に肝臓を採取して、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを調べた（図５）。Ｌ５５のみが肝臓でＣＥＢＰＡのアップレギュレーションを示した一方、ＧａｌＮＡｃ－Ｃ６－ＣＥＢＰＡコンジュゲートはこの投与方法では何も示さなかった。予期せぬことに、Ｌ１はＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを示した。
その後、Ｌ１４、Ｌ５３、およびＬ５４を前の実験と同じプロトコルに従って静脈内注射した（図６および図７）。元のＧａｌＮＡｃ－Ｃ６－ＣＥＢＰＡコンジュゲートは、ＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡの有意なアップレギュレーションを示し、Ｌ５３はＣＥＢＰＡとアルブミンｍＲＮＡの両方の有意なアップレギュレーションを示した。この実験では、ＧａｌＮＡｃ－Ｃ６－ＣＥＢＰＡよりもＬ５３の方がよく効いた。
最後に、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ５６、Ｌ５７、およびＬ５８を正常なマウスに１日目と３日目に３０ｍｇ／ｋｇを皮下（ＳＣ）注射し、５日目に肝臓を採取した。テストしたコンジュゲートのいずれも、これらの条件ではアップレギュレーションを示していない。
さらなる試験では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ１６、Ｌ４０、Ｌ４１、Ｌ４２、およびＬ５５が再度合成され、皮下注射（ＳＣ）される。正常なマウスに３０ｍｇ／ｋｇのＧａｌＮＡｃ ｓａＲＮＡコンジュゲートを１日目と３日目にＳＣで注射し、５日目に肝臓を採取した。図８に示すように、Ｌ５５は、ＳＣ投与によっても元のＧａｌＮＡｃ－Ｃ６－ＣＥＢＰＡコンジュゲートよりも有意に優れたＣＥＢＰＡ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示した。
さらに別の試験では、ＣＥＢＰａ－ｓａＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬ８０（ＧａｌＮａｃクラスターＧ７にコンジュゲートしたＸＤ－１４３６９Ｋ１）およびＬ８１（ＧａｌＮａｃクラスターＧ８にコンジュゲートしたＸＤ－１４３６９Ｋ１）を１０００ｎＭまでのさまざまな用量で細胞に投与した。ＣＥＢＰＡのｍＲＮＡレベルを測定した。図９は、Ｌ８０およびＬ８１のインビトロにおける用量反応を示している。
実施例４：Ｃ５－ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのインビトロ試験
このインビトロ試験では、補体Ｃ５遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡ（Ｃ５－ｓｉＲＮＡ）をＧａｌＮＡｃクラスターにコンジュゲートさせた。Ｃ５－ｓｉＲＮＡをパッシブトランスフェクションで細胞に送達し、Ｃ５ ｍＲＮＡレベルをその後測定した。ｓｉＲＮＡの配列は以下である：
Figure 2022545101000122
この試験でテストされたＣ５－ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは以下：
１．以下の構造を有するＣ５－ｓｉＲＮＡ－Ｃ６－ＧａｌＮＡｃ（図１０のＧａｌＮＡｃ－Ｃ６－ｓｉＣ５）
Figure 2022545101000123
２．以下の構造を有するＣ５－ｓｉＲＮＡ－Ｇ７（図１０のＧａｌＮＡｃ－５３－ｓｉＣ５）
Figure 2022545101000124
および
３．以下の構造を有するＣ５－ｓｉＲＮＡ－Ｇ９（図１０のＧａｌＮＡｃ－５５－ｓｉＣ５）
Figure 2022545101000125
を含む。
ＧａｌＮＡｃ－Ｃ６－ｓｉＣ５、ＧａｌＮＡｃ－５３－ｓｉＣ５、ＧａｌＮＡｃ－５５－ｓｉＣ５、および対照（ＧａｌＮＡｃ－Ｃ６－ＦＬＵＣ、ＧａｌＮＡｃ－５３－ＦＬＵＣ、ＧａｌＮＡｃ－５５－ＦＬＵＣ）を０．３１２５ｎＭから２０ｎＭの間の用量で初代ラット肝細胞に投与した。次に、細胞内のＣ５ ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲで測定した。図１０に示すように、ＧａｌＮＡｃクラスターＧ７にコンジュゲートしたＣ５－ｓｉＲＮＡ（ＧａｌＮＡｃ－５３－ｓｉＣ５）、ＧａｌＮＡｃクラスターＧ９にコンジュゲートしたＣ５－ｓｉＲＮＡ（ＧａｌＮＡｃ－５５－ｓｉＣ５）、およびＧａｌＮＡｃ－Ｃ６－ｓｉＣ５はすべて、Ｃ５ ｍＲＮＡレベルを低下させた。
他の実施形態
本開示をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、例示を意図したものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定しないと理解されるべきものである。他の側面、利点、および修飾は以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (43)

  1. Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）モノマーであって、以下：
    Figure 2022545101000126
    ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、アルキル、アリール、およびアルケニル基から独立して選択され、
    Ｒ４は、適切な保護基またはＣ１～６の直鎖もしくは分岐のアルキル基であり、
    Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立してＣ１～６の直鎖または分岐のアルキル基であり、かつ
    Ｒ７は、適切な保護基である；
    Figure 2022545101000127
    ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、アルキル、アリール、およびアルケニル基から独立して選択され；
    Ｒ４は、保護基またはＣ１～６の直鎖もしくは分岐のアルキル基であり、
    Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立してＣ１～６の直鎖または分岐のアルキルであり；かつ
    Ｒ７は、適切な保護基である；
    Figure 2022545101000128
    ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立して、アルキル、アリール、およびアルケニル基から選択され、
    Ｒ７は、適切な保護基であり、かつ
    リンカー１は切断可能なリンカーである；
    および
    Figure 2022545101000129
    ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、アルキル基、アリール基、およびアルケニル基からなる群から独立して選択され、
    Ｒ７は、適切な保護基であり、かつ
    リンカー１は切断可能なリンカーである、
    からなる群から選択される構造を含む、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）モノマー。
  2. 少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを含むＧａｌＮＡｃ部分であって、前記ＧａｌＮＡｃモノマーが以下：
    Figure 2022545101000130
    ここで、Ｒ８は－ＨまたはＣ１～６の直鎖もしくは分岐のアルキル基である；
    Figure 2022545101000131
    ここで、Ｒ８は－ＨまたはＣ１～６の直鎖もしくは分岐のアルキル基であり、ＸはＯまたはＳである；
    Figure 2022545101000132
    ここで、ＸはＯまたはＳである；
    Figure 2022545101000133
    からなる群から選択され、
    前記ＧａｌＮＡｃ部分は、２つ以上のＭ４、Ｍ５またはＭ６モノマーを含まず、
    前記ＧａｌＮＡｃ部分は、１つのＭ３モノマーのみ、１つのＭ６モノマーのみ、または１つのＭ６モノマーと２つのＭ３モノマーからなるＧａｌＮＡｃ部分ではない、ＧａｌＮＡｃ部分。
  3. ＨＥＧ、Ｃ１２、ａｂ、ＴＥＧ、またはＣ３の構造を含むスペーサーを含む、請求項２に記載のＧａｌＮＡｃ部分。
  4. ２つまたは３つのＧａｌＮＡｃモノマーを含む、請求項２に記載のＧａｌＮＡｃ部分。
  5. ３つのＭ１、Ｍ２またはＭ３モノマーを含む、請求項２に記載のＧａｌＮＡｃ部分。
  6. ３つのＭ１モノマーを含む、請求項５に記載のＧａｌＮＡｃ部分。
  7. ＧａｌＮＡｃクラスターが以下：
    Figure 2022545101000134
    Figure 2022545101000135
    Figure 2022545101000136
    Figure 2022545101000137
    Figure 2022545101000138
    Figure 2022545101000139
    Figure 2022545101000140
    Figure 2022545101000141
    Figure 2022545101000142
    Figure 2022545101000143
    Figure 2022545101000144
    Figure 2022545101000145
    Figure 2022545101000146
    Figure 2022545101000147
    Figure 2022545101000148
    Figure 2022545101000149
    Figure 2022545101000150
    Figure 2022545101000151
    Figure 2022545101000152
    Figure 2022545101000153
    の構造を含む、請求項２に記載のＧａｌＮＡｃ部分。
  8. 以下の工程：
    １）．請求項１に記載のいずれかのモノマー、
    Figure 2022545101000154
    からなる群から選択される少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを提供する工程；および
    ２）．工程１）におけるＧａｌＮＡｃモノマーからＧａｌＮＡｃ部分を合成する工程；任意選択的に少なくとも１つのスペーサーを追加する工程、および任意選択的に保護基を除去する工程
    を含むプロセスによって調製されるＧａｌＮＡｃ部分。
  9. オリゴヌクレオチドと請求項２～８のいずれか１項に記載のＧａｌＮＡｃ部分とを含むコンジュゲートであって、前記オリゴヌクレオチドがターゲット遺伝子の発現を調節し、前記オリゴヌクレオチドと前記ＧａｌＮＡｃ部分が結合または切断可能なリンカーによって接続されている、コンジュゲート。
  10. オリゴヌクレオチドおよびＧａｌＮＡｃ部分が切断可能なリンカーによって接続されている、請求項９に記載のコンジュゲート。
  11. リンカーがＣ６ｓｓＣ６またはｄＴである、請求項１０に記載のコンジュゲート。
  12. オリゴヌクレオチドおよびＧａｌＮＡｃ部分が結合によって接続されており、前記結合がホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合である、請求項９に記載のコンジュゲート。
  13. ＣＪ１、ＣＪ２、ＣＪ３、ＣＪ４、ＣＪ５、ＣＪ６、ＣＪ７、ＣＪ８、ＣＪ９、ＣＪ１０、ＣＪ１１、ＣＪ１２、ＣＪ１３、ＣＪ１４、ＣＪ１５、ＣＪ１６、ＣＪ１７、ＣＪ１８、ＣＪ１９、ＣＪ２０、ＣＪ２１、ＣＪ２２、ＣＪ２３、ＣＪ２４、またはＣＪ２５の構造を含む、請求項９に記載のコンジュゲート。
  14. オリゴヌクレオチドが単離された合成低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）である、請求項９～１３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  15. ターゲット遺伝子がＣＥＢＰＡである、請求項１４に記載のコンジュゲート。
  16. ｓａＲＮＡが二本鎖ｓａＲＮＡである、請求項１４に記載のコンジュゲート。
  17. ＧａｌＮＡｃクラスターがセンス鎖の５’または３’末端に接続されている、請求項１６に記載のコンジュゲート。
  18. 前記二本鎖ｓａＲＮＡが、ＸＤ－０３３０２、Ｓ１（ＸＤ－０６４０９）、Ｓ２（ＸＤ－０６４１０）、Ｓ３（ＸＤ－０６４１１）、Ｓ４（ＸＤ－０６４１２）、Ｓ５（ＸＤ－０６４１３）、Ｓ６（ＸＤ－０６４１４）、Ｓ７（ＸＤ－０６４１５）、Ｓ８、ＸＤ－０７１３９、ＸＤ－０３９３４、およびＸＤ－１４３６９Ｋ１からなる群から選択される、請求項１６に記載のコンジュゲート。
  19. 前記ｓａＲＮＡが、配列番号１５を含むアンチセンス鎖および配列番号１４を含むセンス鎖を有するＸＤ－０６４１４である、請求項１６に記載のコンジュゲート。
  20. 前記コンジュゲートが、以下：
    Ｌ１：
    Figure 2022545101000155
    Ｌ２：
    Figure 2022545101000156
    Ｌ３：
    Figure 2022545101000157
    Ｌ４：
    Figure 2022545101000158
    Ｌ５：
    Figure 2022545101000159
    Ｌ６：
    Figure 2022545101000160
    Ｌ１４：
    Figure 2022545101000161
    Ｌ１５：
    Figure 2022545101000162
    Ｌ１６：
    Figure 2022545101000163
    Ｌ１７：
    Figure 2022545101000164
    Ｌ１８：
    Figure 2022545101000165
    Ｌ１９：
    Figure 2022545101000166
    Ｌ４０：
    Figure 2022545101000167
    Ｌ４１：
    Figure 2022545101000168
    Ｌ４２：
    Figure 2022545101000169
    Ｌ４３：
    Figure 2022545101000170
    Ｌ４４：
    Figure 2022545101000171
    Ｌ４５：
    Figure 2022545101000172
    Ｌ５３：
    Figure 2022545101000173
    Ｌ５４：
    Figure 2022545101000174
    Ｌ５５：
    Figure 2022545101000175
    Ｌ５６：
    Figure 2022545101000176
    Ｌ５７：
    Figure 2022545101000177
    および
    Ｌ５８：
    Figure 2022545101000178
    からなる群から選択される、請求項１９に記載のコンジュゲート。
  21. Ｌ５３である、請求項１９に記載のコンジュゲート。
  22. Ｌ５５である、請求項１９に記載のコンジュゲート。
  23. オリゴヌクレオチドが単離された合成低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項９～１３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  24. ｓｉＲＮＡが二本鎖ｓｉＲＮＡである、請求項２３に記載のコンジュゲート。
  25. ＧａｌＮＡｃクラスターがセンス鎖の５’または３’末端に接続されている、請求項２４に記載のコンジュゲート。
  26. 以下の工程：
    １）．Ｍ１’、Ｍ２’、Ｍ３’、Ｍ４’、Ｍ５’およびＭ６’からなる群から選択される少なくとも１つのＧａｌＮＡｃモノマーを提供する工程；任意選択的に少なくとも１つのスペーサーを追加する工程；
    ２）．少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを提供する工程；任意選択的に少なくとも１つのリンカーを追加する工程；ならびに
    ３）．工程１）のＧａｌＮＡｃモノマー（単数または複数）と工程２）のオリゴヌクレオチド（単数または複数）からコンジュゲートを合成する工程、任意選択的に保護基を除去する工程
    を含むプロセスによって調製されるコンジュゲート。
  27. オリゴヌクレオチドがｓａＲＮＡである、請求項２６に記載のコンジュゲート。
  28. 前記ｓａＲＮＡが、ＸＤ－０３３０２、Ｓ１（ＸＤ－０６４０９）、Ｓ２（ＸＤ－０６４１０）、Ｓ３（ＸＤ－０６４１１）、Ｓ４（ＸＤ－０６４１２）、Ｓ５（ＸＤ－０６４１３）、Ｓ６（ＸＤ－０６４１４）、Ｓ７（ＸＤ－０６４１５）、Ｓ８、ＸＤ－０７１３９、ＸＤ－０３９３４、およびＸＤ－１４３６９Ｋ１からなる群から選択される、請求項２７に記載のコンジュゲート。
  29. 前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項２６に記載のコンジュゲート。
  30. 請求項９～２９のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と含む、医薬組成物。
  31. コンジュゲートがｓａＲＮＡを含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. コンジュゲートがｓｉＲＮＡを含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
  33. 請求項９～２９のいずれか１項に記載のコンジュゲートを細胞に投与する工程を含むオリゴヌクレオチドを細胞に送達する方法であって、トランスフェクション剤が使用されない、方法。
  34. 前記オリゴヌクレオチドがｓａＲＮＡを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡを含む、請求項３３に記載の方法。
  36. 請求項９～２９のいずれか１項に記載のコンジュゲートを投与する工程を含む、処置を必要とする患者におけるターゲット遺伝子の発現を調節する方法。
  37. 前記コンジュゲートがｓａＲＮＡを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. ターゲット遺伝子の発現が増加する、請求項３６に記載の方法。
  39. ターゲット遺伝子がＣＥＢＰＡである、請求項３７に記載の方法。
  40. アルブミンの発現が患者において増加する、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記コンジュゲートがｓｉＲＮＡを含む、請求項３６に記載の方法。
  42. ターゲット遺伝子の発現が低減する、請求項３６に記載の方法。
  43. ターゲット遺伝子がＣ５である、請求項４２に記載の方法。
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