JP5362350B2 - 小分子活性化rna分子及び使用方法 - Google Patents
小分子活性化rna分子及び使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5362350B2 JP5362350B2 JP2008506609A JP2008506609A JP5362350B2 JP 5362350 B2 JP5362350 B2 JP 5362350B2 JP 2008506609 A JP2008506609 A JP 2008506609A JP 2008506609 A JP2008506609 A JP 2008506609A JP 5362350 B2 JP5362350 B2 JP 5362350B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sarna
- complementary
- sequence
- kit
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/13—Decoys
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
Description
本出願は、早期出願された米国仮出願番号第60/671,666、2005年4月15日出願、及び米国仮出願番号第60/715,759、2005年9月9日出願の利益を主張し、これらの出願はその全体が出典としてここに取り込まれる。
本発明は、国立衛生研究所により授与された連邦政府のグラント番号RO1AG21418及びRO1CA1018447の下、政府のサポートによって行われた。
米国特許出願公開第2004/0224405;Provostら,E.M.B.O.J., 1,21(21):5864−5874(2002);Tabaraら,Cell,109(7):861−71(2002);Martinezら,Cell 110(5):563(2002);Metteら Embo J 19:5194−201(2000); Sijen Tら Curr Biol 11:436−40(2001);Volpe T. A.ら Science 297:1833−7(2002);Morrisら, Science 305:1289−92(2004);Kawasakiら,Nature 431:211−7(2004);Elbashirら,Methods 26:199−213(2002);Reynoldsら,Nat Biotechnol 22:326−30(2004);Pelissierら,Nucleic Acids Res 27:1625−34(1999);Tingら,Nat Genet.37(8):906−10(2005);Kawasakiら,Nature 9:431(7005):211−7(2004),Morris,ら Science 305(5688):1289−92(2004);Schramkeら,Nature 435(7046): 1275−9(2005);及びJaenischら.,Nat Genet 33 Suppl:245−54(2003)。
本発明は、遺伝子の非コード核酸配列と相補的なリボ核酸ストランドを含む小分子活性化RNA(saRNA)と細胞を接触させることにより、細胞中の遺伝子産物の発現を増加させるための組成物、薬学的調製物、キットに関する。
本発明は、以下の詳細な説明を添付の図面と関連づけて読むと最もよく理解できる。通常の実施に従えば、図面の種々の特徴は一定の比例に拡大されないことが強調される。逆に、種々の特徴のディメンションは任意に拡張され、明確性のために縮小される。含まれる図面は以下の図面である。
本発明は、遺伝子の非コード核酸配列に相補的なリボ核酸ストランドを含む小分子活性化RNA(saRNA)を細胞に接触させることにより、細胞内のコード遺伝子の転写活性化を介して、遺伝子産物の活性を増大させるための組成物、薬学的調製物及び方法を提供する。また、本発明の対象となる方法を実施するためのキットも提供される。
本発明は、細胞核へ少なくとも1つの小分子活性化RNA(saRNA)分子を導入することによる遺伝子の活性化のための方法及び組成物を提供する。該saRNAは、遺伝子の非コード核酸配列と相補的なリボヌクレオチド配列を含み、この相補性領域は、対応する遺伝子の転写を増大させるように選択され、通常、非コード配列に相補的でない少なくとも2つの末端残基(例えば、dTdT)を含む。該相補性領域は、通常14残基より多く、30未満であり、通常26ヌクレオチド未満である。saRNAは、第1のストランドと相補的な第2のストランドを持ち、第1ストランドと二重鎖領域を形成し、通常、各第1及び第2ストランドの各々の3’末端で少なくとも2つの残基がオーバーハングしている二本鎖分子として提供される。saRNAは二本鎖領域を形成する一本鎖分子としても提供され、第1の領域には遺伝子非コード核酸配列が含まれ、第2の領域には第1の領域と相補的なリボ核酸配列が含まれ、第1の領域と二重鎖を形成し、通常、3’末端で少なくとも2つの残基がオーバーハングしている。
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
3’−N(1+n)−saRNA−5’、又は
5’−N(1+n)−saRNA−3’
式中、Nは、天然又は非天然の、遺伝子的にコード化可能な、又は遺伝子的にコード化不可能な残基を含む任意のヌクレオチドであり、nは0〜7の任意の整数である。
本発明は、saRNA分子を哺乳動物細胞の核に導入する工程を含む、遺伝子発現を増大させる方法を提供し、saRNA分子は遺伝子の非コード核酸配列領域に相補的な鎖を有し、導入は遺伝子発現の増大をもたらす。一般的に、「遺伝子発現を増大させること」とは、その活性化が生じるメカニズムにかかわらず、遺伝子が転写される能力、それが翻訳されてタンパク質の発現を生じる能力の増大のことを言う。
上記した本発明のsaRNA化合物の医薬調製物も本発明により提供される。本発明のsaRNA化合物は、様々な経路による治療的投与のための多様な製剤に含有させることができる。より特定的には、本発明の化合物は、適当な薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤及び/又はアジュバントと組み合わせることにより、医薬組成物として製剤化することができ、固体、半固体、液体又は気体形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射、吸入剤及びエアロゾルとして、滅菌バイアル又はシリンジ中に製剤化することができる。製剤が経皮投与用である場合、化合物は、検出可能なDMSOは含まないか、又は、DMSOに加えて担体と共に製剤化するのが好ましい。製剤は、それを必要としている対象又は患者に、経口、舌下、経直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内等を含む多数の異なる経路により投与するために設計することができる。投与は全身性であることもでき、又は、処置を必要としている部位への製剤の送達、例えば、腫瘍への局所送達等の局所送達であることができる。
医薬投与形態において、本発明の対象であるsaRNA化合物は、それらの薬学的に許容可能な塩の形態で投与してもよく、或いは、それらは単独で使用してもよく、又は、その他の薬学的に活性な化合物と適当に結合させ、並びに組み合わせて投与してもよい。以下の方法及び賦形剤は例示にすぎず、何ら限定的なものではない。
主題及び処理される条件及び投与経路に依存して、主題のsaRNA化合物を、例えば、1日あたり0.1μg〜100mg/kg体重の投与量で投与することができる。特定の実施形態において、所望の効果が達成されるまで治療的投与を繰り返す。その範囲は広範である、なぜなら通常、異なる哺乳類に関する治療効果は大きく異なり、ヒトにおいてはラットよりも通常(単位体重あたり)20、30又は40倍以上も小さいからである。同様に、投与のモードは投与量において大きな影響を及ぼし得る。したがって、例えば、経口の投与量は注射の投与量の約10倍であり得る。局所化された経路での輸送に関しては、より高い投与量が用いられる場合がある。
本発明の方法における使用のために、本発明の化合物は、生物学的活性を活性化又は抑制するその他の薬剤、例えば、化学治療薬を含むその他の薬学的に活性な薬剤と共に製剤化することができ、さもなければ、併用して投与することができる。本発明の化合物は、別の化学物質、例えば医薬の有効性を増大させるために、又は、別の化学物質、例えば医薬の所望の生物学的活性を得るために必要な量を低減させるために使用することができる。
キット
(実施例)
全てのsaRNAは手動的に設計され、ホモロジー検索は、ヒトゲノムデータベース中のその他の非標的配列と実質的ホモロジーを共有する配列を排除するために、(genome.ucsc.eduにおいてワールドワイドウェブにおいて利用可能な)UCSCヒトゲノムデータベースを参照することにより行った。2つの対照saRNA(saControl及びsaCon−2)は、全ての既知のヒト配列とのホモロジーを欠如するように特に設計された。saRNAは、dTdT3’オーバーハングを用いてインビトロジェン(Invitrogen)(カールズバッド、カリフォルニア州)により化学的に合成された。各遺伝子について少なくとも2つの別バッチの合成saRNAをトランスフェクション実験のために使用した。saRNA配列は以下に示される。
saEcad−P1(−312/−284):
センス:5'- AGAACUCAGCCAAGUGUAA[dT][dT] - 3' (配列番号01)
アンチセンス:5 '- UUACACUUGGCUGAGUUCU[dT] [dT] - 3'(配列番号02)
saEcad−P1−26(3’末端に5ヌクレオチド付加することにより26ヌクレオチドに伸長されたsaEcad−P1):
センス:5'- AGAACUCAGCCAAGUGUAAAAGCC[dT][dT] - 3'(配列番号03)
アンチセンス:5'- GGCUUUUACACUUGGCUGAGUUCU[dT][dT] - 3'(配列番号04)
saEcad−P2(−215/−197):
センス:5'- AACCGUGCAGGUCCCAUAA[dT][dT] - 3'(配列番号05)
アンチセンス:5'- UUAUGGGACCUGCACGGUU[dT][dT] - 3' (配列番号06)
saEcad−P2−5(saEcad−P2のアンチセンス5’末端で5−bpが変異している):
センス:5 '- AACCGUGC AGGUCCUU AUC [dT] [dT] - 3' (配列番号07)
アンチセンス:5'- GAUAAGGACCUGCACGGUU[dT][dT] - 3' (配列番号08)
saEcad−P2−3(saEcad−P2のアンチセンス3’末端で5−bpが変異している):
センス:5'- CGUAAUGCAGGUCCCAUAA[dT][dT] - 3'(配列番号09)
アンチセンス:5'- UUAUGGGACCUGCAUUACG[dT] [dT] - 3' (配列番号10)
saEcad−P2−26(3’末端に5ヌクレオチド付加することにより26ヌクレオチドに伸長されたsaEcad−P2):
センス:5'- AACCGUGCAGGUCCCAUAACCCAC[dT][dT] - 3' (配列番号11)
アンチセンス:5'- GUGGGUUAUGGGACCUGCACGGUU[dT][dT] - 3'(配列番号12)
saEcad−P2−16(16ヌクレオチドになるまでその5’末端から切断されたsaEcad−P2):
センス:5'- UGCAGGUCCCAUAA[dT][dT] - 3’(配列番号13)
アンチセンス:5'- UUAUGGGACCUGCA[dT][dT] - 3'(配列番号14)
saEcad−P3(−56/−33):
センス:5 '- GCGGUACGGGGGGCGGUGCCUCCGG - 3' (配列番号15)
アンチセンス:5'- GGAGGCACCGCCCCCCGUACCGCUG - 3' (配列番号16)
saEcad−837(−166/−184):
センス:5'- CUAGCAACUCCAGGCUAGA[dT][dT] - 3'(配列番号17)
アンチセンス:5'- UCUAGCCUGGAGUUGCUAG[dT][dT] - 3' (配列番号18)
saEcad−947(−56/−74):
センス:5'- UGAACCCUCAGCCAAUCAG[dT][dT] - 3' (配列番号19)
アンチセンス:5'- CUGAUUGGCUGAGGGUUCA[dT] [dT] - 3' (配列番号20)
saEcad−962(−41/−59):
センス:5'- UCAGCGGUACGGGGGGCGG[dT][dT] - 3' (配列番号21)
アンチセンス:5'- CCGCCCCCCGUACCGCUGA[dT][dT] - 3'(配列番号22)
saP21−322(−322/−303):
センス:5'- CCAACUCAUUCUCCAAGUA[dT][dT] - 3' (配列番号23)
アンチセンス:5'- UACUUGGAGAAUGAGUUGG[dT][dT] - 3'(配列番号24)
saP21−322−G5’(saP21−322のアンチセンス5’末端で5−bpが変異している):
センス:5' - CCAACUCAUUCUCCCGUUC[dT][dT] - 3' (配列番号25)
アンチセンス:5' - GAACGGGAGAAUGAGUUGG[dT][dT] - 3' (配列番号26)
saP21−322−G3’(saP21−322のアンチセンス3’末端で5−bpが変異している):
センス:5' - UGUGGUCAUUCUCCAAGUA[dT][dT] - 3' (配列番号27)
アンチセンス:5' - UACUUGGAGAAUGACCACA[dT][dT] - 3' (配列番号28)
saP21−322−m(saP21−322の中間領域の5−bpが変異している):
センス:5 ' - CCAACUUUCCAUCCAAGUA[dT] [dT] - 3 ' (配列番号29)
アンチセンス:5 ' - UACUUGGAUGGAAAGUUGG[dT] [dT] - 3 '(配列番号30)
saVEGF−706(−706/−688):
センス:5' - GCAACUCCAGUCCCAAAUA[dT][dT] - 3' (配列番号31)
アンチセンス:5' - UAUUUGGGACUGGAGUUGC[dT][dT] - 3' (配列番号32)
saControl:
センス:5 '- ACUUACGAGUGACAGUAGA[dT] [dT] - 3' (配列番号33)
アンチセンス:5'- UCUACUGUCACUCGUAAGU[dT][dT] - 3'(配列番号34)
saCon−2
センス:5' - ACUACUGAGUGACAGUAGA[dT][dT] - 3' (配列番号35)
アンチセンス:5' - UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT] - 3' (配列番号36)
Ago特異的siRNAをマイスターら(Meister et al.),モレキュラー・セル(Mol.Cell.)15:185(2004)に記載されるように合成した。siRNA配列は以下に示される。
siAgo2
センス:5' - GCACGGAAGUCCAUCUGAAUU - 3'(配列番号37)
アンチセンス:5' - pUUCAGAUGGACUUCCGUGCUU - 3' (配列番号38)
siAgo1
センス:5' - GAGAAGAGGUGCUCAAGAAUU - 3' (配列番号39)
アンチセンス:5' - pUUCUUGAGCACCUCUUCUCUU - 3' (配列番号40)
siAgo3
センス:5' - GAAAUUAGCAGAUUGGUAAUU - 3'(配列番号41)
アンチセンス:5' - pUUACCAAUCUGCUAAUUUCUU - 3'(配列番号42)
siAgo4
センス:5' - GGCCAGAACUAAUAGCAAUUU - 3'(配列番号43)
アンチセンス:5' - pAUUGCUAUUAGUUCUGGCCUU - 3'(配列番号44)
siAgoC
センス: 5' - UUCUCCGAACGUGUCACGUUU - 3' (配列番号45)
アンチセンス:5' - pACGUGACACGUUCGGAGAAUU - 3' (配列番号46)
ヒト前立腺癌細胞株であるPC−3、DU−145、及びLNCaPを、10%の胎児ウシ胎児血清(FBS)、2mMのL−グルタミン、ペニシリン(100U/ml)、及びストレプトマイシン(100μg/ml)を添加したRPMI−1640培地中で、5%のCO2の湿度環境において、37℃にて培養した。HeLa、J82、T24、HEK293細胞を、2mMのL−グルタミン、アール(Earle)のBSS、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び10%のFBSを添加した最小栄養培地(イーグル)中で培養した。MCF−7及びHeLa細胞に、さらに1mMのピルビン酸ナトリウム及び0.01mg/mlのウシインスリンを添加した。トランスフェクションの前日、抗生物質を含まない生育培地中に、細胞を50〜60%の密度でプレーティングした。リポフェクトアミン(Lipofectamine)2000インビトロゲン(Invitrogen)を製造者のプロトコルに従って用いてsaRNAによるトランスフェクションを実行し、72時間持続させた(例外は経時変化実験の間に生じた)。1〜10μMの5−アザシチジン存在下で、E−カドヘリンsaRNAによってHeLa細胞をトランスフェクトした。インターフェロン−α2a(シグマ(Sigma),セントルイス,ミズーリ州)処理を、PC−3細胞において、特定濃度にて行った。
全細胞RNA及びゲノムDNAは、製造業者の教示に従うことにより、TriReagent(商標)(Molecular Research Center,Inc.,シンシナティ,オハイオ州)を使用して抽出した。
培養細胞はPBSを用いて洗浄し、M−PERタンパク質抽出バッファー(Pierce Biotechnology,Inc.,ロックフォード,イリノイ州)を用いて溶解した。細胞溶解物を12,000gにて10分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質を定量し、次いで同濃度となるように希釈した。7.5〜15%のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルを使用してサンプルを分離した。分離されたタンパク質をポリビニリデンジフロリド製の膜へと移し、その膜を5%の無脂肪ドライミルクを用いて一晩ブロッキングした。膜を抗βアクチン(Sigma, Saint Louis,MI)、抗GAPDH(Chemicon, Temecula, CA)、抗E−カドヘリン(Zymed, S. San Francisco, CA)、又は抗P21(Upstate Biotechnology, Lake Placid,NY)抗体を用いて1時間イムノブロッティングし、次いで5分間洗浄した。次いで膜を、抗E−カドヘリン(Zymed, South San Francisco,CA)又は抗p21(Upstate)抗体と共にさらに1時間インキュベートした。5分間の洗浄を3回した後、膜を2次抗体と共にインキュベートした。免疫反応性のタンパク質を、SuperSignal West Dura Lumino/Enhancer Solution(Pierce)により検出した。
ガラス製カバースリップ(Nalge Nunc International,NY)上に生育させた単層細胞において、E−カドヘリンに対する免疫染色を実行した。トランスフェクション72時間後に、細胞を4%のパラホルムアルデヒド中で固定し(20分間)、70%、90%、及び100%のエタノール浴に、順に供した。スリップをブロッキングバッファー中で30分間浸透後に、マウス抗E−カドヘリン(Zymed)を加えて4℃で一晩インキュベートした。免疫染色をフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識2次抗体(Zymed)を用いて視覚化した。過剰な2次抗体を除去した後に、プロピジウムイオダイド(Molecular Probes、OR)を用いた核の対比染色を行った。スライドを、Leica共焦点レーザー顕微鏡(Leica Microsystems Inc.,PA)によって倍率800倍で撮影した。対照実験は一次抗体を使用せずに行った。
先に開発されたオンラインプログラムであるMethPrimer(Li et al., Bioinformatics 18:1892−1897(2004))を用いて、重亜硫酸塩ゲノム配列解析PCRのためのプライマーを設計した。CpGenome DNA Modification Kit(Chemicon)を製造者の説明に従って用いて、DNA(1μg)の重亜硫酸塩修飾を実行した。重亜硫酸塩修飾されたDNAを先に記載された方法で増幅した(Li et al., Cancer Res.60:702−706(2000))。PCR産物をpCR2.1プラスミド(Invitrogen)へとクローニングし、TOP10細胞(Invitrogen)へとトランスフェクトした。各PCR反応から得られた10個の陽性クローンをランダムに選択して、2mlのLB培地中で一晩生育させた。プラスミドDNAを単離し、配列解析を行った。重亜硫酸配列解析PCRのためのプライマーは以下の通りである。
E−カドヘリン
S1(センス):5'- ATTTTAGTTTGGGTGAAAGAGTGAG - 3'(配列番号47)
S2(アンチセンス):5'- AACCCTCTAACCTAAAATTACTAAAATCTA - 3'(配列番号48)
S1及びS2の産物:−370〜−161
S3(センス):5'- TTTAGTAATTTTAGGTTAGAGGGTTAT -3' (配列番号49)
S4(アンチセンス):5'- AAACTCACAAATACTTTACAATTCC -3' (配列番号50)
S3及びS4の産物:−193〜+35。
ChIPアッセイキット(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)を販売者の説明に従って使用し、ChIPアッセイを実行した。手短にいえば、細胞を、100mmのディッシュ中でsaRNAにて72時間トランスフェクトした。次いでホルムアルデヒドを最終濃度1%となるよう細胞に添加し、37℃で10分間インキュベートした。細胞を次いで溶菌し、超音波処理した。超音波処理されたサンプルを、サケ精子DNA/プロテインAアガローススラリーにより予めきれいにし、抗体と共に、又は抗体を伴わずに4℃で一晩インキュベートした。ヒストンのメチル化パターンにおける特定の変化を検出するために、リジン9におけるヒストンの脱メチル化(H3m2K9)、及びリジン4におけるヒストンの脱メチル化(H3m2K4)(Upstate)を認識する抗体を使用した。サケ精子DNA/プロテインタンパク質Aアガローススラリーを用いてクロマチン−抗体複合体を回収し、洗浄後にクロスリンクを外した。免疫沈降されたDNAをPCRにより分析した。95℃で30秒間、60℃で30秒間、及び72℃で30秒間、25〜32サイクルのPCRを行った。使用されたChIP PCRプライマーは以下の通りである:
E−カドヘリンChIPプライマー(−359/−71)
センス:5'- GGTGAAAGAGTGAGCCCCATCTC-3' (配列番号51);
アンチセンス:5'-TTCACCTGCCGGCCACAGCCAATCA-3' (配列番号52).
p21プロモータープライマー(−434/−278)
センス:5'- CAGCTGCATTGGGTAAATCC - 3'(配列番号53)
アンチセンス:5'- GACACATTTCCCCACGAAGT - 3'(配列番号54)
E−カドヘリンsaRNAトランスフェクション実験全体にわたって、Titanium One−Step RT−PCR kit(BD Biosciences, Palo Alto,CA)を用いた半定量的RT−PCRを実行した。各逆転写反応について、全細胞RNA(50ng)を使用した。p21及びVEGF saRNAトランスフェクション実験のために、Superscript(商標)トランスクリプターゼ(Invitrogen)及びオリゴ(dT)プライマーを用いて1μgの全RNAを逆転写した。得られたcDNAサンプルは、E−カドヘリン、p21、VEGF、Ago2、GAPDH、OAS1、又はOAS3に特異的なプライマーを用いるPCRにより増幅した。GAPDHの増幅はローディングコントロールとした。cDNAサンプルもまた、p21及びE−カドヘリンプロモーター中に位置する潜在的転写産物の増幅のためのランダムヘキサマープライマーを用いて作製した。RT−PCRプライマー配列は以下の通りであった:
E−カドヘリン:
センス:5'- CCTGGGACTCCACCTACAGA -3' (配列番号55)
アンチセンス:5'- GGATGACACAGCGTGAGAGA -3' (配列番号56)
GAPDH:
センス:5'- TCCCATCACCATCTTCCA -3' (配列番号57)
アンチセンス:5'- CATCACGCCACAGTTTCC -3' (配列番号58)
β−アクチン:
センス:5'- TCTACAATGAGCTGCGTGTG -3' (配列番号59)
アンチセンス:5'- ATCTCCTTCTGCATCCTGTC -3' (配列番号60)
OAS1:
センス:5'- GCTGGAAGCCTGTCAAAGAG -3' (配列番号61)
アンチセンス:5'- GAGCTCCAGGGCATACTGAG -3'(配列番号62)
OAS3:
センス:5'- TACCACCAGGTGTGCCTACA -3' (配列番号63)
アンチセンス:5'- AAAGCATGGGTGGTCATAGC -3'(配列番号64)
p21
センス:5' - GCCCAGTGGACAGCGAGCAG - 3' (配列番号65)
アンチセンス:5' - GCCGGCGTTTGGAGTGGTAGA - 3' (配列番号66)
p53
センス:5' - CCTCACCATCATCACACTGG - 3' (配列番号67)
アンチセンス:5' - TCTGAGTCAGGCCCTTCTGT - 3' (配列番号68)
VEGF
センス:5'- CCCACTGAGGAGTCCAACAT - 3' (配列番号69)
アンチセンス:5'- AAATGCTTTCTCCGCTCTGA - 3' (配列番号70)
Ago1:
センス:5' - GCGAATTGGGAAGAGTGGTA - 3' (配列番号71)
アンチセンス:5' - GCAGGTGCTGGGATAGAGAC - 3' (配列番号72)
Ago2:
センス:5' - CGCGTCCGAAGGCTGCTCTA - 3' (配列番号73)
アンチセンス:5' - TGGCTGTGCCTTGTAAAACGCT - 3'(配列番号74)
Ago3:
センス:5' - ATCCCAGCTGGAACAACAGT - 3' (配列番号75)
アンチセンス:5' - GCGTACGTAAGTGTGGCAGA - 3' (配列番号76)
Ago4:
センス:5' - GGGTAGGGAAAAGTGGCAAT - 3' (配列番号77)
アンチセンス:5' - GAGCGAGTGCACCTCACATA - 3'(配列番号78)
12匹の4週齢の胸腺欠損ホモ接合型雄ヌードマウスを、Simonsen Laboratories, Inc.より購入した。5日間の訓化期間後、合計5.0×106個のPC−3細胞を、0.3mlのPBS中で、ゲージ25の針を介してマウスの下部脇腹へと皮下(s.c.)接種した。2週間後、腫瘍が平均体積約55mm3に到達したとき、腫瘍を有するヌードマウスをランダムに2つの処理群に分け、1群はp21saRNA(saP21−322)を用いて、もう1群は対照saRNA(saControl)を用いて処理した。
in vivo jetPEI(商標)(PolyPlus Transfection、Illkirch、フランス)、鎖状ポリエチレンイミン(PEI)を用いて、saRNAの腫瘍内送達を実行した。5%のグルコース溶液に溶解した40マイクログラムのsaRNA(Invitrogen)を、同じく5%のグルコース溶液に溶解した6.4μlのin vivo jetPEI(商標)と混合した(N/P比率:8)。この混合物を、注入前に室温に15分間置いた。得られたPEI−saRNA複合体を、ゲージ27の針を用いて腫瘍へと注入した。saRNAの注入は3日毎に9日間、合計3回繰り返した。マウスの体重及び腫瘍の大きさを毎週記録した。最初の処理から4週間後にマウスを屠殺し、腫瘍を除去して秤量した。腫瘍体積は次式:体積=(幅)2×長さ/2により、mm3で計算した。
パラフィン包埋した腫瘍塊を5μmに切断し、切片を55℃で1時間乾燥させた。緩衝液(0.05MのPBS、pH7.4)を用いて再水和した後、切片を0.3%の水素ペルオキシダーゼのメタノール溶液により10分間処理して、内在性のペルオキシダーゼを不活化させた。抗原回復は、スライドを10分間、10mMのクエン酸、pH6.0中でオートクレーブすることによって行った。3%の正常ヤギ血清により4時間ブロッキング後、切片を、PBSで1:100に希釈した抗p21一次抗体(Chemicon)と共に、恒湿槽中、一晩4℃でインキュベートした。20mMのTris、150mMのNaCl、0.025%のTween、pH7.8を用いて切片を洗浄し、次いで2次抗体と共に30分間インキュベートした。ジアミノベンジジンをクロマゲンとして用いたアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法(Elite ABC,Vector Lab,Burlingame,CA.)により免疫染色を行い、次いでヘマトキシリンにより対比染色を行った。
タンパク質の発現を引き起こすためにエピジェネティックなコードが標的とされ得るか否かを試験するために、E−カドヘリンプロモーターに対する2種類の21ヌクレオチドからなる低分子活性化RNA(small activating RNA)(saRNA)を設計し、化学合成した。saRNA(saEcad−P1)のうちの1つはE−カドヘリンプロモーター上のCpGアイランドの上流にある領域(転写開始点に対して−312/−284の部位)を標的とするように設計され;2番目のsaRNA(saEcad−P2)はCpGアイランドの5’側の境界(−215/−197)を標的とするように設計された。公知のヒト配列に対する相同性を欠く、21−ヌクレオチドからなる対照saRNA(saControl)も設計された。ヒト前立腺癌細胞株であり、E−カドヘリンの構成的発現が低いPC−3細胞を、分析のために選択した。
saRNA指向性転写活性化(RdTA)をさらに特徴付けるため、saEcad−P2を用いたさらなる研究を行った。用量反応試験により、saEcad−P2が1nMという低濃度でE−カドヘリンの発現を誘導し、その誘導が1〜10nMの範囲で濃度依存的であることが示された(図4)。投与量が10nMを超えても、さらなるE−カドヘリン発現の増加はもたらされなかった。経時変化試験により、E−カドヘリンタンパク質の発現がsaRNAトランスフェクションから48時間以内に起こり、72時間でピークとなることが示された(図5、パネルA及びB)。
RdTAがその他の細胞中で起こるか否かを試験するために、saRNAをヒト前立腺癌細胞株のDU145及び子宮頸癌細胞株のHeLa細胞へとトランスフェクトした。DU145においては、E−カドヘリンのCpGアイランドはメチル化されておらず(図19、パネルC)、細胞は通常レベルのE−カドヘリンを発現する(図7、パネルA及びB)。中程度で一貫したレベルのE−カドヘリンタンパク質及びmRNA発現の誘導が、saEcad−P1及びsaEcad−P2処理に対する反応として、DU145細胞中で観察された(図7、パネルA及びB)。対照的に、HeLa細胞はE−カドヘリンを発現せず、E−カドヘリンのCpGアイランドは高度にメチル化されている。saRNAトランスフェクション(72時間)は、ウェスタンブロッティングによって検出されるようなE−カドヘリンの発現を発現できなかった。先に確立されたCpGアイランドのメチル化が、saRNAの転写活性化を妨げるのかもしれない。この仮説を試験するために、HeLa細胞を低濃度(1〜10μM)の5’−アザ−シチジン(Aza−C)存在下でトランスフェクトした。Aza−Cは単独で、低レベルのE−カドヘリンmRNA発現を誘導した(図8、RT−PCR)。しかし、細胞を低投与量のAza−C及びsaRNAの両方で処理したときには、E−カドヘリンの発現は、Aza−C単独の処理を行った時よりもかなり高いレベルへと上昇した(図8)。E−カドヘリンタンパク質は、Aza−C及びsaEcad−P1を用いて共処理した細胞のウェスタンブロット分析によってのみ検出可能であった(図8、W.B.)。これらの知見は、遺伝子プロモーター上の抑制的メチル化マーカーがsaRNAの転写活性化を妨げ得るという見解を支持する。
2×106個のPC−3前立腺癌胞を、8週齢の免疫不全BALB/cヌードマウス(nu/nu)の前立腺の背側葉へと全身麻酔下で接種することにより、同所性前立腺癌/転移モデルを確立した。マウスは2、3及び4週目に、ハイドロダイナミックトランスフェクション法を用いてsaRNAを与えられる。手短にいえば、50μgのsaEcad−P2及びsaControlを1mlのPBS中に溶解し、得られる溶液を迅速に尾静脈へと注入する。擬似的な処理としては、1mlのPBSを注入する。
p21Waf1/Cip1/Sdi1(p21)は、サイクリン/サイクリン依存的キナーゼ(CDK)複合体の阻害剤として最初に同定された、細胞増殖を負に調節する主要なチェックポイントコントロールタンパク質のひとつである。二本鎖RNAが遺伝子の転写を活性化するという別の例として、saRNAにより誘導される発現のためにp21が選択された。21ヌクレオチドからなるsaRNA(saP21−322)を、p21の転写開始点に対して−322の位置のp21遺伝子プロモーター配列を標的として設計し、化学的に合成した。
p21は、公知の細胞周期における負の調節因子である。従って、培養細胞におけるp21の発現増加が細胞増殖の阻害をもたらすであろうと仮定された。PC−3、MCF−7及びHeLa細胞を対照saCon−2又はp21のsaRNA分子であるsaP21−322のいずれかによりトランスフェクトした。結果は、対照saRNA分子であるsaCon−2でトランスフェクトした細胞と比較して、saP21−322であるsaRNAでトランスフェクトした細胞が、顕著に遅れた成長を示すことを示す(図11)。
RdTAの一般性をさらに試験するために、saRNAによる血管内皮細胞成長因子(VEGF)のmRNA発現の誘導も試験した。VEGFの転写開始点に対し−706の位置でVEGFプロモーターを標的とする21ヌクレオチドのsaRNA(saVEGF−706)を設計し、化学合成した。このsaRNAをHeLa細胞中へ72時間トランスフェクトした。RNeasy kit(Qiagen)を用いてRNAを抽出した。全細胞RNA(1μg)を、SuperScript(商標)逆転写酵素(Invitrogen)及びオリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写した。得られたcDNAを、2つのアイソマー(VEGF189及び165)を同時に増幅するVEGFプライマーを用いて増幅した。擬似的にトランスフェクトした細胞と比較して、saVEGF−706でトランスフェクトした細胞は、VEGF189及びVEGF165のmRNA発現において、それぞれ3.7及び4倍の増加を示し;一方、対照saRNAはVEGFの発現に何ら影響しなかった(図12)。
標的部位に対するsaRNA分子の相補性を分析するために、saEcad−P2分子に基づく2つの変異saRNA分子を作製した。この変異saRNA分子は、dsEcad−P2のアンチセンス鎖に関する5’末端における5つの塩基対ミスマッチ(saEcad−P2−5)、又は3’末端における5つの塩基対ミスマッチ(saEcad−P2−3)のいずれかを含んでいた。図13、パネルA〜C中にsaRNAの概略図を示す。PC−3細胞を50nMの各saRNAでトランスフェクトし、72時間培養し、E−カドヘリン及びβ−アクチンの発現をウェスタンブロット分析により調べた。
RdTAに関する配列要件を調べるため、26ヌクレオチド長の(saEcad−P1−26及びsaEcad−P2−26)、又は16ヌクレオチド長に短くした(saEcad−P2−16)saRNAを作製した。図14のパネルAは、E−カドヘリンプロモーターを標的とする21ヌクレオチドのsaRNA(saEcad−P2)、E−カドヘリンプロモーターを標的とする26ヌクレオチドのsaRNA(saEcad−P1−26及びsaEcad−P2−26)、及びE−カドヘリンプロモーターを標的とする16−ヌクレオチドのsaRNA(saEcad−P2−16)の概略の説明を示す。
saRNAにより誘導される転写活性化に関する標的要件を分析するために、E−カドヘリンプロモーターのCpGアイランドを標的とし、高いGC含量を有する3つのさらなるsaRNA分子(saEcad−837、saEcad−947及びsaEcad−962)を作製した。saRNA分子の位置の概略図を図15、パネルA中に示す。PC−3細胞を、50nMの各saRNAを用いてトランスフェクトし、72時間培養して、E−カドヘリンの発現をウェスタンブロット分析により調べた。
5.0×106個のPC−3前立腺癌細胞を、24週齢の胸腺欠損ホモ接合型雄ヌードマウスの下部脇腹へと接種することにより、異種性前立腺癌モデルを確立した。saP21−322(40mg)を、ポリエチレンイミン−saRNA複合体の処方中で、確立された異種性腫瘍(約55mm3)を有するマウスの腫瘍内に、3日毎に9日間、合計3回注入した。最初の処理から4週間後にマウスを屠殺した。
RNAiにおいては、2種の公知のRNAiエフェクター複合体、RISC及びRITS(RNAに誘導される転写的遺伝子サイレンシングの開始)が知られている。両複合体に共通するコア成分は、両者での標的認識及びmRNA開裂において機能を果たすアルゴノート(Ago)ファミリータンパク質である。ヒト細胞において、Ago2はRISCの唯一のAgoメンバーである(Liu, et al. Science 305,1437−41(2004))。RdTAがAgo2タンパク質によって、又はsaRNA及びその標的DNA配列の間の直接的な相互作用によって仲介されるか否かを試験するため、我々はAgo2の発現をノックダウンするためにsiRNAを用い、Ago2非存在下でもなお、saRNAがE−カドヘリン及びp21の転写を刺激できるかどうかを調べた。Ago2に特異的なsiRNA(siAgo2)及び対照siRNA(siAgo−C)を用いた。対照siRNA分子であるsiAgo−Cは、組成及び末端改変に関してsiAgo2に類似するが、ランダム配列を含む。
エピジェニックな変化がRdTAに関与するメカニズムであるか否かを調べるため、E−カドヘリンプロモーター中のsaRNAに標的化される領域におけるDNAのメチル化の変化を、まず、バイサルファイト・ゲノム・シークエンシング(bisulfite genomic sequencing)を用いて調べた。E−カドヘリンプロモーター内のCpGアイランドは、擬似的にトランスフェクトしたPC−3及びDU145細胞中では原則的にメチル化されていない(図19、パネルB)。saRNAでトランスフェクトしたPC−3及びDU145細胞中では、(saEcad−P1)(図19、パネルB及びC)に隣接するCpG部位に、又は標的配列(saEcad−P2)(図19、パネルB及びC)内に限定されるCpGのメチル化においてわずかな増加が観察され、saRNAが引き起こすメチル化がDNA中に広がるものではないことを示す。この知見は、植物におけるRNA指向性DNAメチル化(RdDM)で見られる知見と一致する(Pelissier et al.,Nucleic Acids Res 27:1625−34(1999))。saRNAは顕著ではないがDNAメチル化の増加を引き起こし、観察される発現誘導と相反するようにみえる、なぜならDNAの高度のメチル化は転写サイレンシングに関連するためである。この矛盾は、2つのsaRNA標的部位がE−カドヘリンCpGアイランドの外側に存在し、CpGアイランドの外側でのメチル化は遺伝子転写に影響を及ぼさないことから簡単に説明がつく。CpGアイランドを標的化し、既に示したように、より高いGC含量(84%)を有するsaEcad−P3が、E−カドヘリンの発現誘導において効果を示さないこと(図1、パネルA及びB、及び図2)が、さらなる裏付けとなる。従ってこの結果は、DNAのメチル化がsaRNA依存的なE−カドヘリン発現の誘導において役割を果たしていないように見えることを示す。さらに、ヒト細胞における先の報告とは対照的に、siRNA処理に関連する非CpGのメチル化が観察されなかった(Kawasaki et al.,Nature 431:211−7(2004))。
saRNAによる、E−カドヘリンの発現において観察される誘導にインターフェロン応答が関与している可能性を除外するために、2種の典型的なインターフェロン応答遺伝子であるOAS1及びOAS3の発現が、なんらかのsiRNAにより誘導を受け得るかを分析した(Bridge et al.,Nat Genet 34:263−4(2003);Sledz et al.,Nat Cell Biol 5:834−9(2003))。結果は、OAS1及びOAS3のmRNAの発現レベルが、いずれのsaRNAによっても影響を受けなかったことを示す(図21、パネルA及びB)。同様に、2つのハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチン及びGAPDHの発現も、いずれのsaRNAトランスフェクション試験においても影響を受けなかった。さらに、PC−3細胞をタイプIインターフェロン−α2a(IFN−α2a)を用いて処理し、E−カドヘリン及びp21の発現がインターフェロン処理の影響を受けやすいかどうかを調べた。図21、パネルCに示すように、処理細胞中でE−カドヘリン及びp21の発現における変化は観察されず、一方で、OSA1及びOAS3はインターフェロン処理により迅速に誘導された。
プロモーター領域由来の隠れた転写物が、saRNAの現実の標的であったか否かを調べるために、p21及びE−カドヘリンプロモーター配列に特異的なプライマーを用いてRT−PCR分析を実行した。全細胞RNAをPC−3細胞から単離し、擬似的にトランスフェクトするか、saCon−2、saEcad−P2、又はsaP21−322により72時間トランスフェクトした。1マイクログラムの総RNAを、DNaseIを用いて処理し、ランダムヘキサマープライマーを用いて逆転写した。E−カドヘリン、p21及びGAPDHの発現は遺伝子特異的なプライマーセットを用いて検出した。図22、パネルAに示すようなE−カドヘリンプロモーターに相補的なプライマーを用いて、隠れた転写物は検出されなかった。さらに、図22、パネルBに示すような、p21プロモーターにおける隠れた転写物は検出されなかった。従って、結果は、saRNAに誘導される転写が、プロモーターの標的化を通じて活性化されることを示す。
Claims (72)
- 遺伝子の発現を増加させる方法であって、
該遺伝子のプロモーター配列と相補的な5’領域と、
該プロモーター配列と少なくとも1つのヌクレオチドが非相補的な3’末端領域
とを含む第1のリボ核酸ストランドを少なくとも含む17から25塩基対の長さの小分子活性化RNA(saRNA)を、該遺伝子の発現を増加させるのに十分な量でヒト以外の哺乳類細胞中に導入することを含み、
前記遺伝子がEカドヘリン、p21、又はVEGFの遺伝子である、
前記saRNA分子の導入により遺伝子の発現が増加する方法。 - 前記saRNA分子が、前記第1のリボ核酸ストランドと相補性な5’領域と相補的なヌクレオチド配列を含む第2のリボ核酸ストランドを含む、請求項1の方法。
- 前記第2のリボ核酸ストランドが第1ストランドと少なくとも1つのヌクレオチドが非相補的な3’末端領域を含む、請求項2の方法。
- saRNA分子が、核酸ベクターからの発現によってヒト以外の哺乳動物細胞中へ導入される請求項1の方法。
- 相補性領域が19から23塩基対を含む請求項1の方法。
- 相補性領域が20から25塩基対を含む請求項1の方法。
- saRNA分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項1の方法。
- 細胞増殖疾患をもつヒト以外の対象における細胞増殖を減少させる方法であって、
Eカドヘリン又はp21の遺伝子のプロモーター配列と相補的な5’領域、及び
該プロモーター配列と少なくとも1つのヌクレオチドが非相補的な3’末端領域
を含む第1のリボ核酸ストランドを少なくとも含む17から25塩基対の長さの小分子活性化RNA(saRNA)の有効量を、対象に投与することを含み、その投与が該ポリペプチドの発現の増加と細胞増殖の減少を提供する方法。 - 前記saRNA分子が、前記第1のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第2のリボ核酸ストランドを含む、請求項8の方法。
- 前記第2のリボ核酸ストランドが第1ストランドと少なくとも1つのヌクレオチドが非相補的な3’末端領域を含む、請求項9の方法。
- saRNA分子が、核酸ベクターからの発現によってヒト以外の哺乳動物細胞中へ導入される請求項8の方法。
- 相補性領域が19から23塩基対を含む請求項8の方法。
- 相補性領域が20から25塩基対を含む請求項8の方法。
- saRNA分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項8の方法。
- Eカドヘリン遺伝子の転写を活性化するのに十分なEカドヘリン遺伝子のプロモーター核酸配列と相補的な領域を含む第1のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、17から25塩基対の長さの小分子活性化RNA(saRNA)を包含する単離された組成物。
- 前記saRNA分子が、第1のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第2のリボ核酸ストランドを含む、請求項15の組成物。
- 前記saRNA分子が核酸ベクター上にコードされる請求項15の組成物。
- 前記リボヌクレオチドストランドが3’末端の少なくとも1ヌクレオチドのプロモーター核酸配列と非相補的な領域を含む請求項15の組成物。
- 相補性領域が19から23塩基対を含む請求項15の組成物。
- 相補性領域が20から25塩基対を含む請求項15の組成物。
- saRNA分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項15の組成物。
- リボ核酸ストランドが配列番号02の配列を含む請求項15の組成物。
- リボ核酸ストランドが配列番号06の配列を含む請求項15の組成物。
- リボ核酸ストランドが配列番号10の配列を含む請求項15の組成物。
- 前記組成物が、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントの少なくとも1つをさらに含む請求項15の組成物。
- p21遺伝子の転写を活性化するのに十分なp21遺伝子のプロモーター核酸配列と相補的な領域を含む第1のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、17から25塩基対の長さの小分子活性化RNA(saRNA)を包含する単離された組成物。
- 前記saRNA分子が、第1のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第2のリボ核酸ストランドを含む、請求項26の組成物。
- 前記saRNA分子が核酸ベクター上にコードされる請求項26の組成物。
- 前記リボヌクレオチドストランドが3’末端の少なくとも1ヌクレオチドのプロモーター核酸配列と非相補的な領域を含む請求項26の組成物。
- 相補性領域が19から23塩基対を含む請求項26の組成物。
- 相補性領域が20から25塩基対を含む請求項26の組成物。
- saRNA分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項26の組成物。
- リボ核酸ストランドが配列番号24の配列を含む請求項26の組成物。
- 前記組成物が、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントの少なくとも1つをさらに含む請求項26の組成物。
- 血管内皮増殖因子(VEGF)遺伝子の転写を活性化するのに十分なVEGF遺伝子のプロモーター核酸配列と相補的な領域を含む第1のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、17から25塩基対の長さの小分子活性化RNA(saRNA)を包含する単離された組成物。
- 前記saRNA分子が、第1のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第2のリボ核酸ストランドを含む、請求項35の組成物。
- 前記saRNA分子が核酸ベクター上にコードされる請求項35の組成物。
- 前記リボヌクレオチドストランドが3’末端の少なくとも1ヌクレオチドのプロモーター核酸配列と非相補的な領域を含む請求項35の組成物。
- 相補性領域が19から23塩基対を含む請求項35の組成物。
- 相補性領域が20から25塩基対を含む請求項35の組成物。
- saRNA分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項35の組成物。
- リボ核酸ストランドが配列番号32の配列を含む請求項35の組成物。
- 前記組成物が、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントの少なくとも1つをさらに含む請求項35の組成物。
- Eカドヘリン遺伝子の転写を活性化するのに十分なEカドヘリン遺伝子のプロモーター核酸配列と相補的な領域を含む第1のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、17から25塩基対の長さの小分子活性化RNA(saRNA)を包含するキット。
- 前記saRNA分子が、第1のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第2のリボ核酸ストランドを含む、請求項44のキット。
- 前記saRNA分子が核酸ベクター上にコードされる請求項44のキット。
- 前記リボヌクレオチドストランドが3’末端の少なくとも1ヌクレオチドのプロモーター核酸配列と非相補的な領域を含む請求項44のキット。
- 相補性領域が19から23塩基対を含む請求項44のキット。
- 相補性領域が20から25塩基対を含む請求項44のキット。
- saRNA分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項44のキット。
- リボ核酸ストランドが配列番号02の配列を含む請求項44のキット。
- リボ核酸ストランドが配列番号06の配列を含む請求項44のキット。
- リボ核酸ストランドが配列番号10の配列を含む請求項44のキット。
- 前記キットが、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントの少なくとも1つをさらに含む請求項44のキット。
- p21遺伝子の転写を活性化するのに十分なp21遺伝子のプロモーター核酸配列と相補的な領域を含む第1のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、17から25塩基対の長さの小分子活性化RNA(saRNA)を包含するキット。
- 前記saRNA分子が、第1のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第2のリボ核酸ストランドを含む、請求項55のキット。
- 前記saRNA分子が核酸ベクター上にコードされる請求項55のキット。
- 前記リボヌクレオチドストランドが3’末端の少なくとも1ヌクレオチドのプロモーター核酸配列と非相補的な領域を含む請求項55のキット。
- 相補性領域が19から23塩基対を含む請求項55のキット。
- 相補性領域が20から25塩基対を含む請求項55のキット。
- saRNA分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項55のキット。
- リボ核酸ストランドが配列番号24の配列を含む請求項55のキット。
- 前記キットが、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントの少なくとも1つをさらに含む請求項55のキット。
- 血管内皮増殖因子(VEGF)遺伝子の転写を活性化するのに十分なVEGF遺伝子のプロモーター核酸配列と相補的な領域を含む第1のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、17から25塩基対の長さの小分子活性化RNA(saRNA)を包含するキット。
- 前記saRNA分子が、第1のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第2のリボ核酸ストランドを含む、請求項64のキット。
- 前記saRNA分子が核酸ベクター上にコードされる請求項64のキット。
- 前記リボヌクレオチドストランドが3’末端の少なくとも1ヌクレオチドのプロモーター核酸配列と非相補的な領域を含む請求項64のキット。
- 相補性領域が19から23塩基対を含む請求項64のキット。
- 相補性領域が20から25塩基対を含む請求項64のキット。
- saRNA分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項64のキット。
- リボ核酸ストランドが配列番号32の配列を含む請求項64のキット。
- 前記キットが、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントをさらに含む請求項64のキット。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US67166605P | 2005-04-15 | 2005-04-15 | |
US60/671,666 | 2005-04-15 | ||
US71575905P | 2005-09-09 | 2005-09-09 | |
US60/715,759 | 2005-09-09 | ||
PCT/US2006/013559 WO2006113246A2 (en) | 2005-04-15 | 2006-04-11 | Small activating rna molecules and methods of use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008538896A JP2008538896A (ja) | 2008-11-13 |
JP5362350B2 true JP5362350B2 (ja) | 2013-12-11 |
Family
ID=37115673
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008506609A Expired - Fee Related JP5362350B2 (ja) | 2005-04-15 | 2006-04-11 | 小分子活性化rna分子及び使用方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8877721B2 (ja) |
EP (1) | EP1871426B1 (ja) |
JP (1) | JP5362350B2 (ja) |
CA (1) | CA2604532C (ja) |
WO (1) | WO2006113246A2 (ja) |
Families Citing this family (52)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8999943B2 (en) | 2005-03-14 | 2015-04-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antigene oligomers inhibit transcription |
US7709456B2 (en) | 2005-11-17 | 2010-05-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA |
JPWO2007088900A1 (ja) * | 2006-01-31 | 2009-06-25 | 国立大学法人徳島大学 | 細胞死を誘導する2本鎖rna |
JP5196526B2 (ja) * | 2006-09-11 | 2013-05-15 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 遺伝子導入による内在性遺伝子の転写活性化 |
EP2235033A4 (en) * | 2007-12-28 | 2011-11-02 | Univ California | METHOD AND COMPOSITIONS FOR INCREASING GENE EXPRESSION |
US20110065774A1 (en) * | 2008-01-31 | 2011-03-17 | Alnylam Pharmaceuticals | Chemically modified oligonucleotides and uses thereof |
CA2726052A1 (en) | 2008-06-04 | 2009-12-10 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Modulation of gene expression through endogenous small rna targeting of gene promoters |
US20120036594A1 (en) | 2009-04-21 | 2012-02-09 | Basf Plant Science Company Gmbh | RNA-Mediated Induction of Gene Expression in Plants |
WO2010121952A1 (en) | 2009-04-21 | 2010-10-28 | Basf Plant Science Company Gmbh | Rna-mediated induction of gene expression in plants |
WO2010124231A2 (en) | 2009-04-24 | 2010-10-28 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Modulation of gene expression using oligomers that target gene regions downstream of 3' untranslated regions |
WO2011112607A2 (en) * | 2010-03-11 | 2011-09-15 | The Regents Of The University Of California | NKX3-1 saRNA AND KLF4 saRNA AND USES THEREOF |
US9045751B2 (en) | 2010-04-28 | 2015-06-02 | The Regents Of The University Of California | Modified small activating RNA molecules and methods of use |
JP5681955B2 (ja) | 2010-10-08 | 2015-03-11 | ミナ セラピューティクス リミテッド | 短いrna分子 |
US9920317B2 (en) | 2010-11-12 | 2018-03-20 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding RNAs |
AU2011325956B2 (en) | 2010-11-12 | 2016-07-14 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding RNAs |
US10941399B2 (en) * | 2011-04-14 | 2021-03-09 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods and compositions for gene-specific demethylation by DNA methyltransferase (DNMT)-RNA interaction |
KR102195514B1 (ko) | 2011-06-21 | 2020-12-29 | 미나 테라퓨틱스 리미티드 | 알부민 생산 및 세포 증식 |
US9844592B2 (en) * | 2011-07-18 | 2017-12-19 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Bacterial RNAs as vaccine adjuvants |
KR102028784B1 (ko) | 2012-05-16 | 2019-10-04 | 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 | 유전자 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법 |
EA201492120A1 (ru) | 2012-05-16 | 2015-10-30 | Рана Терапьютикс, Инк. | Композиции и способы для модулирования экспрессии atp2a2 |
EA201492116A1 (ru) | 2012-05-16 | 2015-05-29 | Рана Терапьютикс, Инк. | Композиции и способы для модулирования экспрессии mecp2 |
AU2013262700A1 (en) | 2012-05-16 | 2015-01-22 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating hemoglobin gene family expression |
AU2013262649A1 (en) | 2012-05-16 | 2015-01-22 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating smn gene family expression |
US10837014B2 (en) | 2012-05-16 | 2020-11-17 | Translate Bio Ma, Inc. | Compositions and methods for modulating SMN gene family expression |
WO2013173645A1 (en) | 2012-05-16 | 2013-11-21 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating utrn expression |
EP3985118A1 (en) * | 2013-11-22 | 2022-04-20 | MiNA Therapeutics Limited | C/ebp alpha short activating rna compositions and methods of use |
WO2015162422A1 (en) * | 2014-04-22 | 2015-10-29 | Mina Therapeutics Limited | Sarna compositions and methods of use |
FR3026409B1 (fr) * | 2014-09-26 | 2018-03-30 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Procede de criblage de molecules interferentes |
WO2016070060A1 (en) | 2014-10-30 | 2016-05-06 | The General Hospital Corporation | Methods for modulating atrx-dependent gene repression |
CN106032532A (zh) * | 2015-03-17 | 2016-10-19 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种小激活rna及其制备方法和应用 |
US10900036B2 (en) | 2015-03-17 | 2021-01-26 | The General Hospital Corporation | RNA interactome of polycomb repressive complex 1 (PRC1) |
WO2016145608A1 (zh) * | 2015-03-17 | 2016-09-22 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种小激活rna及其制备方法和应用 |
WO2016170348A2 (en) * | 2015-04-22 | 2016-10-27 | Mina Therapeutics Limited | Sarna compositions and methods of use |
EP3290054B1 (en) * | 2015-05-01 | 2022-04-13 | Japan Science and Technology Agency | Anti-tumor agent suppressing or inhibiting zic5 |
EP3316894A4 (en) * | 2015-07-02 | 2019-06-19 | City of Hope | COMPOUNDS AND COMPOSITIONS USING PHOSPHOROIDED OLIGODESOXYNUCLEOTIDE AND METHOD OF USE THEREOF |
TW201920669A (zh) | 2017-09-08 | 2019-06-01 | 英商美納治療公司 | HNF4a saRNA組成物和使用方法 |
US20200208152A1 (en) | 2017-09-08 | 2020-07-02 | Mina Therapeutics Limited | Stabilized sarna compositions and methods of use |
CN110678549B (zh) * | 2018-04-10 | 2021-06-22 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种激活p21基因表达的方法 |
KR20200140377A (ko) * | 2018-04-10 | 2020-12-15 | 락티젠 세러퓨틱스 | 신규 작은 활성 rna |
US11566246B2 (en) | 2018-04-12 | 2023-01-31 | Mina Therapeutics Limited | SIRT1-saRNA compositions and methods of use |
US20210254069A1 (en) | 2018-06-15 | 2021-08-19 | Mina Therapeutics Limited | Combination therapies comprising c/ebp alpha sarna |
CN112912501B (zh) * | 2019-01-30 | 2024-07-16 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 寡核苷酸分子及其在肿瘤治疗中的应用 |
US20220211740A1 (en) | 2019-04-12 | 2022-07-07 | Mina Therapeutics Limited | Sirt1-sarna compositions and methods of use |
US20220281911A1 (en) | 2019-08-19 | 2022-09-08 | Mina Therapeutics Limited | Oligonucleotide conjugate compositions and methods of use |
CA3214137A1 (en) | 2021-03-26 | 2022-09-29 | Mina Therapeutics Limited | Tmem173 sarna compositions and methods of use |
EP4329777A1 (en) | 2021-04-28 | 2024-03-06 | MiNA Therapeutics Limited | Combination therapies comprising c/ebp alpha sarna |
CN114306367B (zh) * | 2021-08-27 | 2023-03-28 | 赵小洋 | 一种含有C/EBPα-saRNA的组合物 |
WO2023099884A1 (en) | 2021-12-01 | 2023-06-08 | Mina Therapeutics Limited | Pax6 sarna compositions and methods of use |
WO2023170435A1 (en) * | 2022-03-07 | 2023-09-14 | Mina Therapeutics Limited | Il10 sarna compositions and methods of use |
CN114921464B (zh) * | 2022-04-11 | 2023-12-01 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种调控胡萝卜素类化合物合成产量的人工非编码RNA分子CsiX及其应用 |
CN114921463B (zh) * | 2022-04-11 | 2023-12-01 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种调控萜类化合物合成产量的人工非编码RNA分子CsiY及其应用 |
WO2024134199A1 (en) | 2022-12-22 | 2024-06-27 | Mina Therapeutics Limited | Chemically modified sarna compositions and methods of use |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5614396A (en) * | 1990-06-14 | 1997-03-25 | Baylor College Of Medicine | Methods for the genetic modification of endogenous genes in animal cells by homologous recombination |
US5624803A (en) * | 1993-10-14 | 1997-04-29 | The Regents Of The University Of California | In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom |
US5889136A (en) * | 1995-06-09 | 1999-03-30 | The Regents Of The University Of Colorado | Orthoester protecting groups in RNA synthesis |
US20030176384A1 (en) * | 1998-04-17 | 2003-09-18 | Eugen Uhlmann | Antisense oligonucleotides for the inhibition of integrin alphav -subunit expression |
WO2003046173A1 (fr) * | 2001-11-28 | 2003-06-05 | Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. | Systeme d'expression d'arn si et procede de production de cellules d'inactivation de genes fonctionnelles et analogues au moyen de ce systeme |
AU2003228301A1 (en) * | 2002-03-06 | 2003-09-22 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Novel method for delivery and intracellular synthesis of sirna molecules |
US20040171118A1 (en) * | 2003-02-13 | 2004-09-02 | City Of Hope | Methods for directing DNA methylation in mammalian cells using homologous short double stranded RNAs |
US20040224405A1 (en) * | 2003-05-06 | 2004-11-11 | Dharmacon Inc. | siRNA induced systemic gene silencing in mammalian systems |
US20050060771A1 (en) * | 2003-09-11 | 2005-03-17 | Farmer Andrew Alan | siRNA encoding constructs and methods for using the same |
US7709456B2 (en) * | 2005-11-17 | 2010-05-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA |
-
2006
- 2006-04-11 WO PCT/US2006/013559 patent/WO2006113246A2/en active Application Filing
- 2006-04-11 EP EP06758308.8A patent/EP1871426B1/en not_active Not-in-force
- 2006-04-11 JP JP2008506609A patent/JP5362350B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-04-11 CA CA2604532A patent/CA2604532C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-04-11 US US11/910,722 patent/US8877721B2/en active Active
-
2014
- 2014-10-01 US US14/504,303 patent/US9297008B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20100210707A1 (en) | 2010-08-19 |
US20150104869A1 (en) | 2015-04-16 |
WO2006113246A2 (en) | 2006-10-26 |
CA2604532A1 (en) | 2006-10-26 |
US8877721B2 (en) | 2014-11-04 |
EP1871426B1 (en) | 2017-06-07 |
US9297008B2 (en) | 2016-03-29 |
WO2006113246A3 (en) | 2010-09-16 |
EP1871426A2 (en) | 2008-01-02 |
CA2604532C (en) | 2017-03-07 |
JP2008538896A (ja) | 2008-11-13 |
EP1871426A4 (en) | 2013-12-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5362350B2 (ja) | 小分子活性化rna分子及び使用方法 | |
JP6236498B2 (ja) | 非対称性干渉rnaの組成物およびその使用 | |
JP2022037070A (ja) | 内部非核酸スペーサーを含む一本鎖RNAi剤 | |
JP6197057B2 (ja) | Hsp47発現の調節 | |
CN106434665B (zh) | 用于抑制乙型肝炎病毒的基因表达的组合物和方法 | |
US9074205B2 (en) | Nicked or gapped nucleic acid molecules and uses thereof | |
US20160281083A1 (en) | Modulation of timp1 and timp2 expression | |
JP2014097072A5 (ja) | ||
US20110054012A1 (en) | Methods and Compositions for Increasing Gene Expression | |
US9045751B2 (en) | Modified small activating RNA molecules and methods of use | |
JP7527437B2 (ja) | 内部非核酸スペーサーを含む一本鎖RNAi剤 | |
JP2022541984A (ja) | Eph2aアプタマーおよびその使用 | |
KR20230165907A (ko) | 올리고뉴클레오티드 | |
AU2004284013A1 (en) | The use of siRNA silencing in the prevention of metastasis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080916 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090408 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110902 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111201 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111208 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111216 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111226 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120130 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120206 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120302 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120511 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120801 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120808 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121108 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130201 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130426 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130508 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130729 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130823 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130904 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5362350 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |