WO2022166815A1 - 用于治疗增殖性玻璃体视网膜病变的双链核酸分子及其应用 - Google Patents

用于治疗增殖性玻璃体视网膜病变的双链核酸分子及其应用 Download PDF

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Abstract

一种双链核酸分子，特别是小激活核酸分子，以及双链核酸分子在制备药物中的用途，特别是在制备用于激活p21基因的药物中的用途，用于治疗或缓解增殖性玻璃体视网膜病变。所述小激活核酸分子包含通过完全互补或不完全互补形成双链结构的第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链，所述第一寡核苷酸链与人p21基因启动子区的任一长度为16-35个核苷酸的连续片段具有至少75％的同源性或互补性。

Description

用于治疗增殖性玻璃体视网膜病变的双链核酸分子及其应用 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体来讲，涉及基因激活相关的双链核酸分子，例如小激活核酸分子，和小激活核酸分子在激活/上调周期蛋白依赖性激酶抑制剂(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1，CDKN1A，p21)基因转录中的应用，以及其在调控相关疾病中的作用，例如在增殖性玻璃体视网膜病变的治疗或相关药物制备中的应用。
背景技术
增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是一种眼科疾病，是在孔源性视网膜脱离和视网膜脱离手术后的主要并发症。在孔源性视网膜脱离病例中，PVR的发生率高达10％，这也是在视网膜脱离手术成功后发生功能不良的主要原因(Sadaka and Giuliari 2012；Kwon,Song,and Roh 2016)。PVR的特征是视网膜破裂或创伤后由于细胞的迁移和增殖所导致视网膜周围膜的形成，随后细胞膜通过收缩及视网膜的牵拉而导致视网膜脱离(Zandi et al.2019)。参与PVR的主要细胞类型是视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)、胶质细胞(主要是穆勒细胞)和炎症细胞(巨噬细胞和淋巴细胞)。RPE是一层紧贴于视网膜感觉神经之外的色素细胞，是PVR发生增殖的主要细胞。RPE细胞进入玻璃体并暴露大量的细胞生长因子和炎症因子，血-眼屏障被破坏，从而引发一连串的细胞过程，如上皮间充质转换、细胞迁移和扩散、基底膜和胶原蛋白的收缩，最终导致视网膜病变(Mudhar 2020)。
PVR为机体损伤后一种过度修复过程，还处于研究试验阶段的一些药物从抗增殖、抗代谢的角度出发尝试对其进行干预。尽管手术治疗PVR有一定的效果，但仅限于切除病变的增生组织，并不能预防和治疗PVR的发生。因此，寻找安全有效的药物防治PVR的发生成为研究的热点。
CDKN1A(p21)基因编码p21蛋白，是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族中的重要成员，通过抑制细胞周期进展和促进细胞衰老而抑制肿瘤细胞及其他细胞的良性增殖(Fillies et al.2007；Romanov and Rudolph 2016)。近年来的研究发现，p21的表达降低与翼状胬肉和视网膜母细胞瘤等眼部增生性疾病有关(Ueda et al.2001；Audo et al.2003)；在患青光眼的兔模型中，于结膜下注射表达p21的重组腺病毒载体，发现纤维增生及伤口愈合受抑制(Heatley  et al.2004)。通过过表达p21的手段，干预或治疗PVR的潜力有待于进一步挖掘。
发明内容
本申请提供了一种基于RNA激活过程的小激活核酸分子，例如小激活RNA(small activating RNA,saRNA)分子，其通过激活/上调p21基因表达来治疗与p21基因表达水平相关的疾病或状况，例如增殖性玻璃体视网膜病变。
本申请的至少一个目标是提供基于RNA激活过程的小激活核酸分子，其通过激活/上调p21基因转录，从而增加p21蛋白的表达量；进一步地，本申请还提供包含上述小激活核酸分子的组合物或制剂。
本申请的另一目标是提供基于RNA激活过程的小激活核酸分子或包含其的组合物在制备用于激活/上调p21基因在细胞中的表达的药物中的应用。
本申请的又一目标是提供基于RNA激活过程的小激活核酸分子在制备用于治疗与p21基因表达水平相关的疾病或状况的药物中的应用，进一步地，所述与p21基因表达水平相关的疾病或状况可以是增殖性玻璃体视网膜病变。
本申请的再一个目标是提供激活/上调p21基因在细胞中的表达的方法，以及治疗增殖性玻璃体视网膜病变的方法。
发明人惊奇地发现，当本申请的小激活核酸分子(1)GC含量介于35～65％；(2)不含5个或以上连续的相同核苷酸；且(3)不含3个或以上的双重复或三重复核苷酸时，能够更好地体现p21基因表达的激活活性。
同样惊奇的发现是，能够上调p21基因表达至少10％的功能性的小激活核酸分子的靶点不是平均或者随机地分布在p21基因的启动子区域的，而是呈现聚集性地分布。在某些实施方式中，数个长度至少为25bp的基因启动子区域中，呈现出功能性小激活核酸分子靶点的聚集，即靶向这些“热点”区域的小激活核酸分子中，至少30％能够诱导靶基因mRNA表达达到1.1倍及以上；特别地，在另一些实施方式中，受关注的热点是长度至少为30bp的基因启动子区域，在这些区域，呈现出功能性小激活核酸分子靶点的聚集，即靶向这些热点区域的小激活核酸分子至少60％能够诱导靶基因mRNA表达达到1.5倍或以上。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限 制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示p21基因启动子序列，从转录起始位点(TSS)上游-1000bp至TSS下游3bp，即SEQ ID NO:469。TSS由弯曲的箭头表示。
图2A-2B显示筛选p21基因启动子上的小激活RNA热点区域。针对图1所示p21启动子序列设计并化学合成439个双链RNA分子，分别转染至PC3细胞。72小时后用QuantiGene 2.0方法分析p21基因mRNA水平。图2A为439个双链RNA分子(X轴)分别所致的p21 mRNA水平相对于对照处理的倍数变化(Y轴)。X轴上的双链RNA分子按照它们相对于p21基因的TSS的位置(从最上游的RAG-898到最下游的RAG-177)进行排序。图示中标出了8个热点(hotspot)区域(浅灰色长方形框)。图2B对图2A的数据按照每个双链RNA分子诱导p21 mRNA表达改变的倍数大小从低到高进行排序。图2A和2B中的虚线表示2倍诱导。
图3A-3D、3E-3H显示小激活RNA热点区1至8的双链RNA分子对p21基因的激活作用。
图4A-4B显示采用RT-qPCR方法分析p21基因mRNA水平，以验证QuantiGene 2.0的实验结果。图4A将439个双链RNA分子按照它们诱导p21 mRNA表达的活性大小分成四个区域(组)，从每组中随机挑选5个双链RNA分子，分别以10nM的浓度转染至PC3细胞。72小时后，提取细胞总RNA、在反转录后采用RT-qPCR方法分析p21基因mRNA水平。图4B为QuantiGene 2.0(X轴)和RT-qPCR(Y轴)方法检测双链RNA分子诱导的p21基因相对mRNA水平的相关性。
图5显示代表性的saRNA在视网膜色素上皮细胞中激活p21 mRNA的表达。saRNA以10nM的终浓度转染ARPE-19细胞72小时，转染结束后分析各细胞样品中p21 mRNA的相对表达值。转染结束后用Qiagen RNeasy试剂盒提取RNA，反转录后用ABI 7500快速实时PCR系统进行qPCR扩增，同时扩增GAPDH基因作为内参。对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。纵坐标值代表2个重复处理的平均值±SD。
图6显示以不同浓度的saRNA转染视网膜色素上皮细胞后p21 mRNA表达激活的情况。用 saRNA(RAG1-40-53)以1、5、10和50nM的终浓度转染ARPE-19细胞72小时，转染结束后用Qiagen RNeasy试剂盒提取RNA，反转录后用ABI 7500快速实时PCR系统进行qPCR扩增，同时扩增GAPDH基因作为内参。对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。纵坐标值代表2个重复处理的平均值±SD。
图7A-7B显示不同浓度的saRNA转染视网膜色素上皮细胞后p21蛋白表达激活的情况。用saRNA(RAG1-40-53)以1、5、10和50nM终浓度转染ARPE-19细胞72小时，收集细胞并提取细胞总蛋白后用western blot检测p21蛋白表达水平，同时检测微管蛋白(α/β-Tubulin)作为内参。图7A为不同浓度的saRNA处理细胞后用western blot检测显示出的条带结果，图7B显示为利用Image J软件定量分析图7A条带后的p21蛋白表达值。对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。
图8A-8B显示saRNA RAG1-40-53在不同浓度下抑制视网膜色素上皮细胞生长。saRNA(RAG1-40-53)以0.01-50nM终浓度转染ARPE-19细胞，采用50％TCA固定细胞的生长并晾干，实验时间为7天，每天在同一时间进行相同的处理，7天后将所有的样本统一进行SRB染色实验，并在560nm处利用酶标仪检测细胞的生长增殖，第0天作为细胞生长的基值。图8A为细胞在不同浓度saRNA处理后7天中相对于空白对照的相对增殖百分比。图8B为细胞在不同浓度saRNA处理后7天中相对于处理前的相对增殖百分比。
图9显示经saRNA RAG1-40-53处理后不会诱导视网膜色素上皮细胞的凋亡。用所示saRNA(RAG1-40-53)以1、5、10和50nM终浓度转染ARPE-19细胞48小时，转染结束后离心收集细胞。加入FITC Annexin V和PI试剂各5μL到含2×10 5个细胞的离心管中，室温避光孵育15分钟后用流式细胞分选仪检测细胞早期和晚期凋亡。对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。纵坐标值代表2个重复处理的平均值±SD。
图10A-10B显示经saRNA RAG1-40-53处理后会抑制视网膜色素上皮细胞的迁移。ARPE-19细胞贴壁后对其进行划痕拍照作为0小时处理，然后用saRNA(RAG1-40-53，10nM)和TGF-β(10ng/ml)处理细胞，24小时后在划痕处拍照，用ImageJ软件对细胞迁移进行分析。图10A为不同处理转染24小时后拍摄的细胞迁移照片；图10B为用ImageJ软件对图10A各组细胞迁移的相对面积的统计。对照为空白转染。
图11显示胆固醇缀合的saRNA自转染ARPE-19细胞后抑制其增殖。用saRNA RAG1-40- 53-C1以0.01-3μM终浓度处理ARPE-19细胞，不使用转染试剂采用自递送的形式。saRNA处理5天后加入CCK8试剂10μL于含100μL的96孔板中，细胞37℃孵育1小时后在450nm处利用酶标仪检测细胞的增殖。
图12A-12B显示saRNA在兔模型中的药物代谢动力学研究。雌性兔子15只，随机分成3组，生理盐水对照组1只，给药组各7只。saRNA RAG1-40-53-C1分别以0.1和0.3mg的剂量注射到兔眼睛的玻璃体内，注射体积均为50μL，分别在4小时、1、2、4、8、14和21天取材并检测兔玻璃体和视网膜中saRNA RAG1-40-53-C1的含量。图12A为给药后不同时间点玻璃体和视网膜中saRNA的含量变化；图12B为给药后不同时间点兔眼中saRNA的含量变化。
图13显示兔模型中的药效动力学研究。雌性兔子19，随机分成8组，每组1-4只不等。用saRNA RAG1-40-53-C1分别以0.03、0.1、0.24、0.3和1mg的总剂量注射到兔眼的玻璃体内，注射体积均为100μL，3天后检测兔玻璃体内p21 mRNA的表达。RAG1-40-53-Scr-C1(注射总剂量为0.3和1mg)为无关序列对照，生理盐水为空白对照。
图14显示不同saRNA转染人Ku-7-LG细胞后p21 mRNA的表达水平。用多个saRNA以10nM的终浓度转染Ku-7-LG细胞72小时，转染结束后分析各细胞样品中p21 mRNA的相对表达值。对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。纵坐标值代表2个重复处理的平均值±SD。
图15A-15C显示化学修饰的saRNA RAG1-0M4转染视网膜色素上皮细胞APRE-19不同时间后p21 mRNA和蛋白的表达水平。saRNA RAG1-0M4以25nM的终浓度转染ARPE-19细胞72小时，转染结束后分析各细胞样品中p21 mRNA和蛋白(图15B和图15C)的表达值。图15A为化学修饰的saRNA RAG1-0M4转染视网膜色素上皮细胞APRE-19后p21 mRNA的表达水平，图15B-15C为化学修饰的saRNA RAG1-0M4转染视网膜色素上皮细胞APRE-19后p21的蛋白表达水平。对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。纵坐标值代表2个重复处理的平均值±SD。
图16A-16C显示不同浓度化学修饰的saRNA RAG1-0M4转染视网膜色素上皮细胞后p21mRNA和蛋白的表达水平。saRNA RAG1-0M4以100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2和0.1nM的终浓度转染ARPE-19细胞72小时，转染结束后分析各细胞样品中p21mRNA和蛋白的表达值。图16A为不同浓度化学修饰的saRNA RAG1-0M4转染视网膜色素上皮 细胞后p21 mRNA的表达值，图16B为不同浓度化学修饰的saRNA RAG1-0M4转染视网膜色素上皮细胞后p21蛋白表达值。对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。纵坐标值代表2个重复处理的平均值±SD。
图17A-17B显示化学修饰的saRNA RAG1-0M4-C3(3')在兔模型中的药物代谢动力学研究。雌性兔子4只，随机分成2组，每组2只。saRNA RAG1-0M4-C3(3')分别以0.1 mg和0.3mg的剂量注射到兔眼球玻璃体内，在注射后0、0.17、1、3、7和14天用stem-loop PCR方法分别检测兔玻璃体、血浆和视网膜中saRNA RAG1-0M4-C3(3')的含量变化。17A是低剂量给药后不同时间点玻璃体、血浆和视网膜中saRNA RAG1-0M4-C3(3')的含量变化；17B是高剂量给药后不同时间点玻璃体、血浆和视网膜中saRNA RAG1-0M4-C3(3')的含量变化。
图18显示兔模型中的药效动力学研究。雌性兔子9只，随机分为4组，每组2～3只不等。用saRNA RAG1-0M4-C3(3')分别以0.3mg的剂量注射到兔眼的玻璃体内，注射体积均为0.5mL，注射3天和7天后分别检测兔玻璃体内p21 mRNA的表达。生理盐水为空白对照。
图19显示不同浓度化学修饰的saRNA RAG1-0M4v转染ARPE-19细胞后p21 mRNA的表达水平。saRNA RAG1-0M4v以3、10和30nM的终浓度转染ARPE-19细胞72小时，转染结束后分析各细胞样品中p21 mRNA的表达值。对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。纵坐标值代表2个重复处理的平均值±SD。
图20A-20B显示化学修饰的saRNA转染ARPE-19细胞后细胞的生长及凋亡水平。20A是saRNA RAG1-0M4v以3、10和30nM的终浓度转染ARPE-19细胞72小时后细胞的生长增殖比例。20B是saRNA RAG1-0M4v以3、10和30nM的终浓度转染ARPE-19细胞72小时后细胞的Caspase3/7的活性。对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。纵坐标值代表2个重复处理的平均值±SD。
图21A-21B显示不同化学修饰的saRNA RAG1-0、RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')转染ARPE-19细胞后p21 mRNA的表达及凋亡水平。saRNA RAG1-0、RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')以10nM的终浓度转染ARPE-19细胞72小时，转染结束后分析各细胞样品中p21 mRNA的表达和Caspase3/7的活性。图21A为不同化学修饰的saRNA RAG1-0、RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')转染视网膜色素上皮细胞后p21 mRNA的表达值，图21B不同化学修饰的saRNA RAG1-0、RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')转染视网膜色素上皮细胞后Caspase3/7的活性。 对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。纵坐标值代表2个重复处理的平均值±SD。
图22A-22C显示不同浓度化学修饰的saRNA RAG1-0M4v-C3(3')转染ARPE-19细胞后p21mRNA和蛋白的表达水平。saRNA RAG1-0M4以100、33.3、11.1、3.7、1.2、0.412、0.137、0.046、0.015、0.005和0.002nM的终浓度转染ARPE-19细胞72小时，转染结束后分析各细胞样品中p21mRNA和蛋白的表达值。图22A为不同浓度化学修饰的saRNA RAG1-0M4v-C3(3')转染视网膜色素上皮细胞后p21 mRNA的表达水平，图22B-22C为不同浓度化学修饰的saRNA RAG1-0M4v-C3(3')转染视网膜色素上皮细胞后p21蛋白的表达水平。对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。纵坐标值代表2个重复处理的平均值±SD。
图23A-23C显示不同浓度化学修饰的saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')转染外周血单核细胞(PBMC)后各炎症因子在培养基中的水平。saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')以133nM转染PBMC细胞24小时后IL-6、IFN-α和TNF-α炎症因子的含量。图23A为不同浓度化学修饰的saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')转染PBMC细胞后IL-6炎症因子的水平，图23B为不同浓度化学修饰的saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')转染PBMC细胞后IFN-α炎症因子的水平,图23C为不同浓度化学修饰的saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')转染PBMC细胞后TNF-α炎症因子的水平。LPS(50ng/mL)和RAG-IS-1作为阳性对照组，未处理是指未加任何转染试剂，只有PBMC细胞和培养基，对照和dsCon2分别为空白转染和无关序列双链RNA转染。纵坐标值代表2个重复处理的平均值±SD。
图24显示兔模型中的药效动力学研究。雌性兔子9只，随机分为4组，每组2两只。用saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')与2×10 6ARPE-19cells/0.05mL混合后分别以0.3mg的剂量注射到兔眼的玻璃体内，注射体积均为0.5mL，3天后分别检测兔玻璃体内p21mRNA的表达。生理盐水为空白对照，dsCon2M4分别为空白转染和带有化学修饰的无关序列双链RNA转染。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
在本申请的一个方面，提供小激活核酸分子，例如小激活RNA(saRNA)分子，其激活 或者上调细胞中p21基因的表达，所述小激活核酸分子包含通过完全互补或不完全互补形成双链结构的第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链，所述第一寡核苷酸链与人p21基因启动子区的任一长度为16-35个核苷酸的连续片段具有至少75％的同源性或互补性，其中，所述的小激活核酸分子(1)GC含量介于35～65％，(2)不含5个或以上连续的相同核苷酸，且(3)不含3个或以上的双重复或三重复核苷酸。在某些实施方式中，所述p21基因启动子区可选地从p21基因的转录起始位点(TSS)至其上游的1000个核苷酸的区域(SEQ ID NO:469)。在某些实施方式中，所述第一寡核苷酸链与从p21基因的转录起始位点至其上游的1000个核苷酸的区域(SEQ ID NO:469)中的任一长度为16-35个核苷酸的连续片段具有至少75％的同源性或互补性。
在某些实施方式中，所述小激活核酸分子的第一寡核苷酸链与SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12中的任一序列中的任意连续16-35个核苷酸的片段具有至少75％的同源性或互补性。在某些实施方式中，所述的至少75％的同源性或互补性体现在所述第一寡核苷酸链与SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12中的任一序列中的任意连续16-35个核苷酸的片段仅有3个、2个或1个不同源或错配的核苷酸。在某些实施方式中，所述的不同源或错配核苷酸位于所述第一寡核苷酸链的两端、或者离最中央的核苷酸位置距离0-3个核苷酸。
在某些实施方式中，所述小激活核酸分子的第一寡核苷酸链与选自SEQ ID NO：13-30、35-46、59-62、67-74、77-80、85-96、103-108、111-118、121-132、139-140、147-180、185-186、189-190、195-198、201-202、209-212、215-218、225-240、243-246、249-258、261-262、265-270、275-280、283-300、303-308、317-320、323-324、329-348、351-352、357-358、361-366、371-392、399-400、405-412、415-416、419-424、429-432、439-442、447-450、453-458、463-468、479-486中的任一序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的互补性或同源性。在某些实施方式中，所述的至少75％的同源性或互补性体现在仅有3个、2个或1个不同源或错配的核苷酸。在某些实施方式中，所述的不同源或错配核苷酸位于所述第一寡核苷酸链的两端、或者离最中央的核苷酸位置距离0-3个核苷酸。
在某些实施方式中，所述小激活核酸分子的第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链与SEQ ID NO：13-30、35-46、59-62、67-74、77-80、85-96、103-108、111-118、121-132、139-140、147-180、185-186、189-190、195-198、201-202、209-212、215-218、225-240、243-246、249-258、261-262、265-270、275-280、283-300、303-308、317-320、323-324、329-348、351-352、357-358、361-366、371-392、399-400、405-412、415-416、419-424、429-432、439-442、447-450、453-458、463-468、479-486任一核苷酸序列完全相同或完全互补、或有1～2个碱基不同或错 配。
在某些实施方式中，本申请的小激活核酸分子为双链核酸，所述第一寡核苷酸链和所述第二寡核苷酸链分别位于所述双链核酸的两条链上。双链核酸指所述第一寡核苷酸链和所述第二寡核苷酸链可通过互补形成双链核酸结构。
本申请的小激活核酸分子的第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链可以存在于两条不同的寡核酸链上，也可以存在于同一条寡核酸链上。当第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链分别位于两条链上时，小激活核酸分子的至少一条链可以在5’端和/或3’端具有突出(或称为悬垂)，例如在3’端可以具有0-6个核苷酸的突出，如，0、1、2、3、4、5或6个核苷酸的突出。在某些实施方式中，本申请的小激活核酸分子的两条链都具有突出。在另一些实施方式中，小激活核酸分子的两条链的3’端均可以具有0-6个核苷酸的突出；例如，具有0、1、2、3、4、5或6个核苷酸的突出；可选地，具有2个或3个核苷酸的突出。在某些实施方式中，所述突出的核苷酸类型可以是dT(胸腺嘧啶脱氧核苷酸，或写作T)。在某些实施方式中，5’端和/或3’端的突出可以为dTdT或dTdTdT或与靶基因上相应位置的核苷酸相同或互补。
当本申请的小激活核酸分子的第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链存在于同一条寡核酸链上时，本申请的小激活核酸分子为连续的单链核酸，所述第一寡核苷酸链和所述第二寡核苷酸链位于所述的连续的单链核酸上且具有可形成双链结构的互补区域，使所述单链核酸中可以具有可形成双链区的发夹结构。在某些实施方式中，所述单链寡核酸结构可以通过例如RNA激活机制促进p21基因在细胞中的表达。
上述小激活核酸分子中，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链的长度可以分别为16-35个核苷酸，例如，可以为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸。所述的小激活核酸分子的第一寡核苷酸链的长度可以与第二寡核苷酸链长度相同，也可以不同。
在某些实施方式中，所述第一寡核苷酸链序列中有至少15个核苷酸长度的序列与所述第二寡核苷酸链形成碱基互补。例如，所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链中与靶基因启动子序列匹配的核苷酸序列长度可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28个核苷酸。在某些实施方式中，所述第一寡核苷酸链和所述第二寡核苷酸链可以具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的互补性。在某些实施方式中，所述的互补性可以体现在仅有3个、2个或1个错配的核苷酸。在某些实施方式中，所述的错配核苷酸可以位于所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链的3’或者5’端或者两端、或者离最中央的核苷酸位置距离0-3个核苷酸。在某些实施方式中，所述的错配核苷酸可以位于所 述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链的3’或者5’端，另一端为平末端或者具有1-3个突出。
在某些实施方式中，在所述第一寡核苷酸链的3’或5’区域与靶基因启动子序列的编码链或模板链可以存在至少1个核苷酸的错配，例如，1、2、3或4个错配。在某些实施方式中，在所述第二寡核苷酸链的3’或5’区域与靶基因启动子序列的编码链或模板链可以存在至少1个核苷酸的错配，例如，1、2、3或4个错配。在某些实施方式中，在所述第一寡核苷酸链的3’端核苷酸与靶基因启动子序列的编码链或模板链相应位置可以存在1个核苷酸的错配。在某些实施方式中，在所述第一寡核苷酸链的5’端核苷酸与靶基因启动子序列的编码链或模板链相应位置可以存在1个核苷酸的错配。
本申请所述小激活核酸分子中的核苷酸可以为天然的未经化学修饰的核苷酸，也可以包括一种或多种修饰的核苷酸。在某些实施方式中，本申请所述的小激活核酸分子中核苷酸的修饰可以包括一种或多种化学修饰，如在一条寡核苷酸链的两端或者两端之间，至少一个核苷酸可以具有化学修饰。本申请所称和所使用的化学修饰可以包括或选自如下修饰中的一种或其任意一种以上的组合：
(1)对核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
(2)对核苷酸中核糖的2’-OH的修饰；
(3)对核苷酸中碱基的修饰；
(4)核苷酸为锁核酸；以及
(5)所述第一寡核苷酸链和/或所述第二寡核苷酸链的5’末端核苷酸为乙烯基膦酸酯修饰(5’-(E)-vinylphosphonate)。
所述化学修饰采用本领域通常使用的核苷酸修饰方法。例如，所述磷酸二酯键的修饰之一是对磷酸二酯键中的氧进行修饰，可以包括但不限于，硫代磷酸修饰或硼烷化磷酸盐修饰。两种修饰都有利于稳定saRNA结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，例如，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例子可以包括但不限于，2’-氟代修饰、2’-甲氧基修饰、2’-氧亚乙基甲氧基修饰、2,4’-二硝基苯酚修饰、锁核酸(LNA)修饰、2’-氨基修饰、2’-脱氧修饰等。碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5’-溴尿嘧啶修饰、5’-碘尿嘧啶修饰、N-甲基脲嘧啶修饰、2,6-二氨基嘌呤修饰等。所述的修饰可以是核糖的2'-OH被2’-H取代，可以使被化学修饰的核苷酸从核糖核酸(RNA)成为脱氧核糖核酸(DNA)。所述的修饰也可以是任一核苷酸为锁核酸(LNA)。又例如，所述第一寡核苷酸链和/或所述第二寡核苷酸链的5’末端核苷酸为乙烯基膦酸酯修饰(5’-(E)-vinylphosphonate)等等。这些修饰可以增加小激活核酸分子的生物可利用性，提高与靶序列 的亲和性，或者增强在细胞内抵抗核酸酶水解的能力。
在某些实施方式中，本申请所述的小激活核酸分子的所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链可以含有至少一个化学修饰的核苷酸。所述化学修饰可以是对核苷酸中核糖2'-OH的化学修饰，可以是对核苷酸之间磷酸二酯键的化学修饰，可以是对核苷酸中碱基的化学修饰，也可以将任一核苷酸替换为锁核酸(LNA)，或者可以对寡核苷酸的5’-末端核苷酸进行乙烯基膦酸酯修饰。在某些实施方式中，所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链可以含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、或者更多个化学修饰的核苷酸。在某些实施方式中，所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链可以含至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或者100％的化学修饰的核苷酸。在某些实施方式中，构成所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链的所有核苷酸可以为化学修饰的核苷酸。
此外，在某些实施方式中，本申请所述的小激活核酸分子可以与以下组合中的一种或多种基团缀合：脂质、脂肪酸、荧光基团、配体、糖类、高分子化合物、多肽、抗体、及胆固醇。所述的基团缀合既可以在所述第一寡核苷酸链或所述第二寡核苷酸链的3’端或者5’端，也可以在3’端和5’端之间。在某些实施方式中，本申请的小激活RNA的所述第一寡核苷酸链或所述第二寡核苷酸链可以与至少一个脂质基团缀合，位于寡核苷酸链的3’端或者5’端。在某些实施方式中，所述的脂质基团选自脂肪酸(fatty acyl)、(阳离子脂质cationic lipid)、阴离子脂质(anionic lipid)、和可离子化的脂质(ionizable lipid)、糖脂(saccharolipid)、甘油酯(glycerolipid)、甘油磷脂(glycerophospholipid)、甾醇酯类(sterol lipid)、鞘脂(sphingolipid)、异戊烯醇酯(prenol lipid)、和多聚酮(polyketide)中的一种或一种以上。在某些实施方式中，本申请的小激活核酸分子的所述第一寡核苷酸链或所述第二寡核苷酸链可以与至少一个胆固醇基团缀合，位于寡核苷酸链的3’端或者5’端。在某些实施方式中，本申请的小激活核酸分子的所述第一寡核苷酸链或所述第二寡核苷酸链可以与至少一个糖类基团缀合，位于寡核苷酸链的3’端或者5’端。所述的糖类基团包括，例如N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)和其他适用的糖类基团。在某些实施方式中，所述的一种或多种基团缀合使本申请的小激活核酸分子表现出更好的进入特定器官、组织或者细胞的递送能力，也使本申请的小激活核酸分子具备渴望到达的药学特征，如药物动力学(pK)、药物效应动力学(pD)、毒性(toxicity)、和机体对外源化学物的吸收(absorption)、分布 (distribution)、代谢(metabolism)及排泄(excretion)过程的特征。
为了促进小激活核酸分子进入细胞，一些实施方式在以上修饰的基础上，可以在小激活核酸分子的第一寡核苷酸链和/或第二寡核苷酸链的末端引入亲脂性基团，以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜及核膜与细胞核内的基因启动子区发生作用。在某些实施方式中，所述小激活核酸分子缀合的化学基团可以选自结构(A),(B),或(C)中的一种或一种以上：
Figure PCTCN2022074637-appb-000001
本申请提供的小激活核酸分子可以在与细胞接触或引入细胞后可有效激活或上调细胞中CDKN1A(p21)基因的表达。在某些实施方式中，所述小激活核酸分子可以上调p21基因的表达至少10％、至少20％或至少30％。经过体外细胞转染测试，发明人惊奇地发现，当本申请的小激活核酸分子(1)GC含量介于35～65％；(2)不含5个或以上连续的相同核苷酸；且(3)不含3个或以上的双重复或三重复核苷酸时，能够更好地体现p21基因表达的激活活性。例如，作为具体实施方式之一，小激活核酸分子的第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链的序列选自序列表中SEQ ID NO：17到SEQ ID NO：468所示的序列。又例如，作为另一些实施方式，小激活核酸分子的第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链的序列选自如表4所示的序列，包括：(1)SEQ ID NO：479和SEQ ID NO：480；(2)SEQ ID NO：481和SEQ ID NO：482；(3)SEQ ID NO：483和SEQ ID NO：484；(4)SEQ ID NO：485和SEQ ID NO：486；(5) SEQ ID NO：487和SEQ ID NO：488；(6)SEQ ID NO：489和SEQ ID NO：488；(7)SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62；(8)SEQ ID NO：496和SEQ ID NO：497；(9)SEQ ID NO：498和SEQ ID NO：499；(10)SEQ ID NO：498和SEQ ID NO：500；(11)SEQ ID NO：501和SEQ ID NO：499；(12)SEQ ID NO：501和SEQ ID NO：500；(13)SEQ ID NO：502和SEQ ID NO：503；(14)SEQ ID NO：504和SEQ ID NO：505；(15)SEQ ID NO：506和SEQ ID NO：507；(16)SEQ ID NO：508和SEQ ID NO：509；或(17)SEQ ID NO：510和SEQ ID NO：511。
同样惊奇的发现是，能够上调p21基因表达至少10％的功能性的小激活核酸分子的靶点可以不是平均或者随机地分布在p21基因的启动子区域的，而是呈现聚集性地分布。在某些实施方式中，数个长度至少为25bp的基因启动子区域中，可以呈现出功能性小激活核酸分子靶点的聚集，即靶向这些“热点”区域的小激活核酸分子中，至少30％能够诱导靶基因mRNA表达达到1.1倍及以上；特别地，在另一些实施方式中，受关注的热点可以是长度至少为30bp的基因启动子区域，在这些区域，呈现出功能性小激活核酸分子靶点的聚集，即靶向这些热点区域的小激活核酸分子至少60％能够诱导靶基因mRNA表达达到1.5倍或以上。
这些热点区域包括H1～H8。其中，第一寡核苷酸链可以与p21基因启动子中距转录起始位点的-893至-801区域(区域H1，SEQ ID NO:5)、-717至-632区域(区域H2,SEQ ID NO:6)、-585至-551区域(区域H3,SEQ ID NO:7)、-554至-504区域(区域H4,SEQ ID NO:8)、-514至-485区域(区域H5，SEQ ID NO:9)、-442至-405区域(区域H6，SEQ ID NO:10)、-352至-313区域(区域H7，SEQ ID NO:11)、-325至-260区域(区域H8，SEQ ID NO:12)中的连续16-35个核苷酸具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同源性或互补性。更具体地，第一寡核苷酸链与选自SEQ ID NO:13-468的任一核苷酸序列具有至少75％、例如至少约79％、约80、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同源性或互补性。
本申请的另一方面是提供分离的p21基因小激活核酸分子的靶位点序列，其中所述靶位点序列可以包括选自SEQ ID NO:5-12的任一条序列上的任意连续16-35个核苷酸的序列，或与上述任意连续16-35个核苷酸组成的序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或100％的同源性的序列。在某些实施方式中，第一寡核苷酸链可以与选自SEQ ID NO:13-30、35-46、59-62、67-74、77-80、85-96、103-108、111-118、121-132、139-140、147-180、185-186、189-190、195-198、201-202、209-212、215-218、225-240、243-246、249-258、261-262、265-270、275-280、283-300、303-308、317-320、323-324、329- 348、351-352、357-358、361-366、371-392、399-400、405-412、415-416、419-424、429-432、439-442、447-450、453-458、463-468、479-489的任一核苷酸序列具有至少75％、例如至少约79％、约80、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同源性或互补性。在某些实施方式中，所述的同源性或互补性指两条寡核苷酸序列相同或互补、或有1～2个碱基不同或错配。
本申请的小激活核酸分子可以是人工合成的、体外转录的或者载体表达的。
本申请的另一方面还涉及编码本申请所述的小激活核酸分子的核酸分子。在某些实施方式中，所述核酸分子可以是DNA分子。在某些实施方式中，所述核酸分子可以为表达载体。在某些实施方式中，该表达载体可以包含编码本申请所述的小激活核酸分子的片段，将该表达载体引入细胞后，可表达本申请所述的小激活核酸分子。
在本申请的另一方面，提供了包含所述的小激活核酸分子或所述的编码小激活核酸分子的核酸的细胞。在某些实施方式中，所述的小激活核酸分子可以是靶向p21基因启动子区的双链小激活核酸分子例如双链小激活RNA(saRNA)分子，其包括第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链。在另一些实施方式中，所述的小激活核酸分子可以是靶向p21基因启动子区的单链小激活核酸分子例如双链小激活RNA(saRNA)分子。
本申请的另一方面提供了组合物(例如药物组合物)，该组合物包含本申请所述的小激活核酸分子或编码本申请所述的小激活核酸分子的核酸分子，和任选地，药学上可接受的载体。在某些实施方式中，所述药学上可接受的载体可以包括或选自脂质体、高分子聚合物或多肽。
可选地，所述的药物组合物可以为靶向p21基因的药物组合物，可以包含靶向p21基因的小激活核酸分子、编码本申请所述的小激活核酸分子的核酸分子，和任选地，药学上可接受的载体。可选地，所述的制剂为靶向p21基因的制剂，含有所述的靶向p21基因的小激活核酸分子、编码本申请所述的小激活核酸分子的核酸分子、细胞、或药物组合物。可选地，所述的试剂盒含有所述的靶向p21基因的小激活核酸分子、编码本申请所述的小激活核酸分子的核酸分子、细胞、药物组合物、或制剂。
本申请所述的药学上可接受的载体通常可以包括小核酸类活性分子领域使用的以脂质为基础的包载系统如脂质纳米颗粒(LNP)、以机体内糖类受体为靶向的含有例如N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)和其他适用的糖类基团的缀合物、以不同脂质或多肽基团为配体的共价缀合物(covlent conjugates)，例如，上文所述选自结构图(A),(B),或(C)中的一种或一种以上的化学修饰。选择合适的载体不但可以协助小核酸分子达到所要施用的器官或组织，还可以协助小核酸分子进入目标细胞乃至亚细胞结构，例如双 链siRNA或反义寡核苷酸链(ASO)进入细胞质、或者saRNA分子进入细胞核，进而获得相应的小核酸分子的生物学调节效果。
在本申请的另一方面，提供了一种制剂，该制剂包括：本申请所述的小激活核酸分子、所述的编码本申请所述的小激活核酸分子的核酸、所述的包含本申请的小激活核酸分子或编码本申请的小激活核酸分子的核酸分子的细胞、或所述的包含本申请的小激活核酸分子的组合物。
在本申请的另一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：本申请的小激活核酸分子、所述的编码本申请所述的小激活核酸分子的核酸分子、所述的包含本申请的小激活核酸分子或编码本申请的小激活核酸分子的核酸的细胞、或所述的包含本申请的小激活核酸分子的组合物。
本申请的另一方面涉及本申请所述的小激活核酸分子、所述的编码本申请的小激活核酸分子的核酸、所述的包含本申请的小激活核酸分子或编码本申请的小激活核酸分子的核酸的细胞、或所述的包含本申请的小激活核酸分子的组合物在制备用于激活或上调p21基因在细胞中的表达的药物或制剂中的应用。在某些实施方式中，所述的应用为制备治疗或缓解增殖性玻璃体视网膜病变的药物或制剂。在某些实施方式中，所述细胞包括哺乳动物细胞，例如来自人体的细胞，如人视网膜色素上皮细胞。在某些实施方式中，所述细胞可以是离体的，也可以存在于哺乳动物体内，如人体内。
本申请的另一方面还涉及激活或上调p21基因在细胞中的表达的方法，该方法包括给所述细胞施用本申请所述的小激活核酸分子、所述的编码本申请的小激活核酸分子的核酸、或所述的包含本申请的小激活核酸分子的组合物或制剂。在某些实施方式中，激活或上调p21基因在细胞中的表达的方法包括给所述细胞施用本申请所述的小激活核酸分子、所述的编码本申请的小激活核酸分子的核酸、或所述的包含本申请的小激活核酸分子的组合物。在某些实施方式中，所述细胞包括哺乳动物细胞，例如来自人体的细胞，如人视网膜色素上皮细胞。在某些实施方式中，所述细胞可以是离体的，也可以存在于哺乳动物体内，如人体内。
本申请的小激活核酸分子可以被直接导入细胞中，也可以是将编码本申请的小激活核酸分子的核酸序列导入细胞后在细胞内产生。在某些实施方式中，所述细胞可以包括哺乳动物细胞，例如来自人体的细胞，如人视网膜色素上皮细胞。在某些实施方式中，所述细胞可以是离体的，如细胞系或细胞株等，也可以存在于哺乳动物体内，如人体内。该人体可以是具有与p21蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的个体，例如发生增殖性玻璃体视网膜病变的患者。本申请所述的小激活核酸分子可以被施以足够的量以实现对与p21蛋白量的缺乏或 与p21蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的治疗。具体情况下，所述与p21蛋白量不足或与p21表达减少相关的疾病或状况可以包括例如增殖性玻璃体视网膜病变等。
本申请的另一方面涉及治疗个体中与p21蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的方法，包括给所述个体施用治疗有效量的本申请的小激活核酸分子、所述的编码本申请的小激活核酸分子的核酸、所述的包含本申请的小激活核酸分子或编码本申请的小激活核酸分子的核酸的细胞、或所述的包含本申请的小激活核酸分子的组合物。在某些实施方式中，本申请的治疗个体中与p21蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的方法可以包括给个体施用治疗有效量的本申请所述的小激活核酸分子、所述的编码本申请的小激活核酸分子的核酸、所述的包含本申请的小激活核酸分子或编码本申请的小激活核酸分子的核酸的细胞、或所述的包含本申请的小激活核酸分子的组合物和治疗有效量的其它剂，所述其它剂包括例如小分子化合物、抗体、多肽、蛋白等。在某些实施方式中，所述个体可以是哺乳动物，包括例如人。在某些实施方式中，与p21蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况可以包括例如增殖性玻璃体视网膜病变。
本申请的另一方面涉及治疗或缓解个体中增殖性玻璃体视网膜病变的方法，包括给所述个体施用治疗有效量的本申请的小激活核酸分子、所述的编码本申请的小激活核酸分子的核酸、所述的包含本申请的小激活核酸分子或编码本申请的小激活核酸分子的核酸的细胞、或所述的包含本申请的小激活核酸分子的组合物。在某些实施方式中，本申请的治疗或缓解增殖性玻璃体视网膜病变的方法包括给个体施用治疗有效量的本申请所述的小激活核酸分子、所述的编码本申请的小激活核酸分子的核酸、所述的包含本申请的小激活核酸分子或编码本申请的小激活核酸分子的核酸的细胞、或所述的包含本申请的小激活核酸分子的组合物和治疗有效量的其它剂，所述其它剂包括例如小分子化合物、抗体、多肽、蛋白等。在某些实施方式中，所述个体可以是哺乳动物，包括例如人。
与现有技术相比，本申请至少具有以下一方面或几方面的有益效果：
本申请提供的能够激活/上调p21基因表达的小激活核酸分子例如小激活RNA(saRNA)，能够可靠地激活p21基因，因而高效、特异地上调或恢复p21基因和蛋白的表达并同时具有较好的安全性能，可用于治疗与p21蛋白表达不足或减少相关的疾病或病症，也可以通过提高p21蛋白水平来达到抑制细胞增殖的效果，包括用于治疗良性细胞增殖性疾病，例如增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)。PVR为抑制孔源性视网膜脱离复位手术后视网膜表面和玻璃体后面广泛纤维增殖膜收缩、牵拉而引起的再次视网膜脱离。p21 saRNA可作为抑制导致纤维增殖膜的色素上皮细胞、胶质细胞、纤维细胞、成纤维细胞和巨噬细胞之一或一种以上细 胞增殖的药物成分。
在本申请中，相关术语采用如下定义：
如本申请所用，术语“互补”或者百分比的“互补性”是指两条寡核苷酸链彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行的寡核苷酸链中的核苷酸之间通过氢键形成。互补寡核苷酸链可以沃森-克里克(Watson-Crick)方式碱基配对(例如，A-T，A-U，C-G)，或以允许形成双链体的任何其他方式(例如Hoogsteen型或者反向Hoogsteen型碱基配对)进行碱基配对。互补包括完全互补和不完全互补两种情况。完全互补或100％互补性是指双链寡核苷酸分子的双链区中来自第一条寡核苷酸链的每个核苷酸可以与第二条寡核苷酸链相应位置的核苷酸形成氢键而没有错配的情况。不完全互补是指两条链的核苷酸单元不能全部互相氢键结合的情况。例如，对于两条双链区为20个核苷酸长度的寡核苷酸链，如果每条链上只有两个碱基对可以彼此氢键结合，则寡核苷酸链展现出10％的互补性。在同一实例中，如果每条链上的18个碱基对可以彼此氢键结合，则寡核苷酸链展现出90％的互补性。在本申请中，未给出具体百分比的互补性是指至少约75％、约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的互补。
如本申请所用，术语“同一性”或“同源性”是指小激活RNA的其中一条寡核苷酸链(正义链或者反义链)与另一条寡核苷酸链、或者靶基因的启动子序列的某一区域的编码链或者模板链存在的相似性。当使用序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或可用的其他算法)或通过目检进行比较和对齐来获得最大对应时，两个或多个寡核苷酸序列具有确定百分比的相同核苷酸。适合用于确定百分比同一性和同源性的算法的一个实例是Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中所述的BLAST算法。在本申请中，未给出具体百分比的“同一性”或“同源性”是指至少约75％、约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％的同源。
如本申请所用，术语“寡核苷酸”是指核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA，RNA或DNA/RNA杂交体的单链或双链分子，包括规则地和不规则地交替的脱氧核糖基部分和核糖基部分的寡核苷酸链，以及这些种类的寡核苷酸的修饰和以及天然存在的或非天然存在的骨架。本申请中所述的用于激活靶基因转录的寡核苷酸为小激活核酸分子。
如本申请所用，术语“寡核苷酸链”和“寡核苷酸序列”可互换地使用，是指35个以下碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA、核糖核酸RNA在内的核苷酸链，也包括由一个或多个脱氧核苷酸以及一个或多个核糖核苷酸共同形成的混合寡核苷酸链)。在本申请中，寡核苷酸链的长度可以是16至35个核苷酸的任一长度。
如本申请所用，术语“第一寡核苷酸链”可以是正义链也可以是反义链，小激活RNA的正义链是指小激活RNA双链体中与靶基因的启动子DNA序列的编码链具有同一性的核酸链，反义链是指小激活RNA双链体中与正义链互补的核酸链。
如本申请所用，术语“第二寡核苷酸链”也可以是正义链或者反义链。当第一寡核酸链为正义链时，第二寡核酸链为反义链，当第一寡核酸链为反义链时，第二寡核酸链为正义链。
如本申请所用，术语“基因”是指编码一条多肽链或转录一条功能RNA所需的全部核苷酸序列。“基因”可以是对于宿主细胞而言内源的或完全或部分重组的基因(例如，由于引入编码启动子的外源寡核苷酸和编码序列或将邻近内源编码序列的异源启动子导入宿主细胞)。例如，术语“基因”包括可以由外显子和内含子组成的核酸序列。编码蛋白质的序列是，例如，包含在起始密码子和终止密码子之间的开放阅读框中的外显子内的序列，如本申请所用，“基因”可以指包括例如基因调控序列例如启动子，增强子和本领域已知的控制另一基因的转录，表达或活性的所有其他序列，无论另一基因是否包含编码序列或非编码序列。在一种情况下，例如，“基因”可以用于描述包含调控序列例如启动子或增强子的功能性核酸。重组基因的表达可以通过一种或多种异源调节序列来控制。
如本申请所用，术语“靶基因”可以是天然存在于生物体中的核酸序列、转基因、病毒或细菌序列、染色体或染色体外和/或瞬时或稳定转染或掺入细胞和/或其染色质。靶基因可以为蛋白质编码基因，也可为非蛋白质编码基因(例如微小RNA基因、长链非编码RNA基因)。靶基因通常含有启动子序列，设计与启动子序列具有同一性(也称同源性)的小激活核酸分子可以实现对靶基因的正向调控，表现为靶基因表达的上调。“靶基因启动子序列”是指靶基因的非编码序列，在本申请中涉及“与靶基因启动子序列互补”中靶基因启动子序列是指该序列的编码链，亦称非模板链，即为与该基因编码序列为同一序列的核酸序列。“靶点”或“靶点序列”是指靶基因启动子序列中小激活核酸分子的正义寡核苷酸链或反义寡核苷酸与之同源或互补的序列片段。
如本申请所用，术语“正义链”、“正义核酸链”可互换地使用，小激活核酸分子的正义寡核苷酸链是指小激活核酸分子双链体中含与靶基因的启动子序列的编码链具有同一性的第一寡核苷酸链。
如本申请所用，术语“反义链”、“反义核酸链”可互换地使用，小激活核酸分子的反义寡核苷酸链是指小激活核酸分子双链体中与正义寡核苷酸链互补的第二寡核苷酸链。
如本申请所用，术语“编码链”是指靶基因中不能进行转录的那一条DNA链，该链的核苷酸序列与转录生成的RNA的序列一致(在RNA中是以U取代了DNA中的T)。本申请中所 述的靶基因启动子双链DNA序列的编码链是指与靶基因DNA编码链在同一条DNA链上的启动子序列。
如本申请所用，术语“模板链”是指靶基因的双链DNA中与编码链互补的另一条链，可作为模板转录为RNA的那条链，该链与转录的RNA碱基互补(A-U，G-C)。在转录过程中，RNA聚合酶与模板链结合，并沿着模板链的3'→5'方向移动，按照5'→3'方向催化RNA的合成。本申请中所述的靶基因启动子双链DNA序列的模板链是指与靶基因DNA模板链在同一条DNA链上的启动子序列。
如本申请所用，术语“启动子”是指通过与蛋白质编码或RNA编码核酸序列在位置上关联而对它们的转录发挥调控作用的序列。通常，真核基因启动子包含100～5,000个碱基对，尽管此长度范围并不意味着限制本申请所用的术语“启动子”。虽然启动子序列一般位于蛋白质编码或者RNA编码序列的5'端，但启动子序列也可存在于外显子及内含子序列中。
如本申请所用，术语“转录起始位点”或者其简称“TSS”是指在基因的模板链上标志转录起始的核苷酸。转录起始位点可出现于启动子区的模板链上。一个基因可以有多于一个的转录起始位点。
如本申请所用，术语“突出”、“overhang”、“悬垂”可互换地使用，是指寡核苷酸链末端(5'或3')非碱基配对核苷酸，其是由延伸超出双链寡核苷酸内的其中一条链的另一条链产生的。延伸超出双链体3'和/或5'端的单链区域被称为突出。
如本申请所用，术语“基因激活”或“激活基因”或“基因上调”或“上调基因”可互换地使用，是指通过测量基因转录水平、mRNA水平、蛋白水平、酶活性、甲基化状态、染色质状态或构型、翻译水平、或其在细胞或生物系统中的活性或状态来测定某一核酸转录、翻译或表达或活性的增加。这些活动或状态可以直接或间接的测定。此外，“基因激活”、“激活基因”、“基因上调”、“上调基因”是指与核酸序列相关的活性增加，而不管发生这种激活的机制如何，例如其作为调节序列发挥调控作用、被转录成RNA，被翻译为蛋白质并增加蛋白质的表达。
如本申请所用，术语“小激活RNA”、“saRNA”、“小激活核酸分子”可互换地使用，是指能够促进基因表达的核酸分子，并且可以由包含与靶基因的非编码核酸序列(例如启动子、增强子等)具有序列同一性或同源性的核苷酸序列的第一核酸片段(反义核酸链，也称反义寡核苷酸链)和包含与第一核酸片段互补的核苷酸序列的第二核酸片段(正义核酸链，也称有义链或正义寡核苷酸链)组成，其中所述第一核酸片段和第二核酸片段形成双链体。小激活核酸分子也可以由合成的或者载体表达的可形成双链区发夹结构的单链RNA分子组成，其中第一区域包含与基因的启动子靶序列具有序列同一性的核苷酸序列，第二区域包含的核 苷酸序列与第一区域互补。小激活核酸分子的双链体区域长度通常可以为约10至约50个碱基对、约12个至约48个碱基对、约14个至约46个碱基对、约16个至约44个碱基对、约18个至约42个碱基对、约20个至约40个碱基对、约22个至约38个碱基对、约24个至约36个碱基对、约26个至约34个碱基对、约28个至约32个碱基对、通常约10个、约15个、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50个碱基对。此外，术语“saRNA”、“小激活RNA”和“小激活核酸分子”还含有除核糖核苷酸部分之外的核酸，包括但不限于修饰的核苷酸或类似物。
如本申请所用，术语“热点(hot spot，H区)”是指长度至少为25bp的基因启动子区域，在这些区域，呈现出功能性小激活核酸分子靶点的聚集，即靶向这些热点区域的小激活核酸分子中至少30％的分子能够诱导靶基因mRNA表达达到1.1倍及以上；特别地，受关注的热点是长度至少为30bp的基因启动子区域，在这些区域，呈现出功能性小激活核酸分子靶点的聚集，即靶向这些热点区域的小激活核酸分子至少60％能够诱导靶基因mRNA表达达到1.5倍或以上。
如本申请所用，术语“双重复核苷酸”指核苷酸序列中存在的两个连续的相同核苷酸，如GG、CC、TT、AA、或UU。如本申请所用，术语“三重复核苷酸”指核苷酸序列中存在的三个连续的相同核苷酸，如GGG、CCC、TTT、AAA、或UUU。
如本申请所用，术语“合成”是指寡核苷酸的合成方式，包括任何能够合成RNA的方式，例如化学合成、体外转录、载体表达等。
本申请通过RNA激活方式上调p21基因的表达，通过增加p21蛋白的表达量来治疗相关疾病，尤其是增殖性玻璃体视网膜病变。本申请中p21基因有时也称为靶基因。
本申请提供的小激活核酸分子的制备方法包括序列设计和序列合成。
本申请的小激活核酸分子序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成。一般来说，化学合成的方法包括以下四个过程：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐及退火。
例如，本申请所述saRNA化学合成的具体步骤如下：
(1)寡聚核糖核苷酸的合成
在自动DNA/RNA合成仪(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上设定合成1微摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(19≥n≥2)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全 部核酸序列的合成。
(2)脱保护
将连接有saRNA的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/氨水溶液(体积比为1：3)，然后密封，置于25-70C温箱中，孵育2-30小时，过滤含有saRNA的固相支持物的溶液并收集滤液，用双蒸水淋洗固相支持物2次(每次1毫升)并收集滤液，合并收集洗脱液，在真空条件下干燥1-12小时。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再加入2毫升正丁醇，高速离心收集沉淀即得到saRNA单链的粗产物。
(3)纯化分离
将得到的saRNA的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/升的三乙胺乙酸盐溶液中，然后通过高压液相色谱反相C18柱进行分离，得到纯化的saRNA单链产物。
(4)脱盐及退火
用体积排阻凝胶过滤法去除盐份，将正义链和反义链的寡聚核糖核酸单链按相同摩尔比混合在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，得到含有saRNA的溶液。
本申请发现，将上述saRNA导入细胞后，能够有效增加p21 mRNA和蛋白质的表达。
下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本申请中通用的实验条件如下。
RNA分离和反转录聚合酶链式反应
细胞以2-3×10 5个细胞/孔接种在6孔板中，反向转染寡核苷酸双链体。使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)，按照其说明书提取细胞总RNA。使用含有gDNA Eraser(Takara，Shlga，Japan)的PrimeScript RT试剂盒将RNA(1μg)反转录为cDNA。qPCR采用ABI 7500Fast Real-time PCR System(Applied Biosystems)和SYBR Premix Ex Taq II(Takara，Shlga，Japan)试剂，反应条件为：95℃3秒，60℃30秒，扩增40个循环。以GAPDH为内参。各实施例中使用的引物序列列于表1中。
表1 qRT-PCR分析的引物序列
Figure PCTCN2022074637-appb-000002
QuantiGene 2.0分析
将细胞铺板于96孔板中并转染寡核苷酸双链体，转染72小时后，使用QuantiGene 2.0试剂盒(AffyMetrix)定量检测目的基因mRNA水平。QuantiGene 2.0试剂盒是基于杂交技术的方法，使用基因特异性探针直接定量mRNA水平。
实验步骤简述如下：添加裂解液以裂解转染后的细胞，细胞裂解物加样至包有CDKN1A(p21)和HPRT1(管家基因)探针的捕获孔板中，55℃杂交过夜。为了增强杂交信号，在100μL相应的缓冲液(Quantigene 2.0试剂盒提供)中顺次与2.0PreAMP，2.0AMP和2.0Lable Probe杂交。所有杂交均在50-55℃震荡1小时。最后一步洗涤后，加入2.0Substrate并在室温下孵育5分钟。然后使用Infinite 200PRO读板仪(Tecan，瑞士)检测光信号。
统计分析
结果表示为平均值±标准偏差。使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software)进行单因素方差分析，后进行Tukey's t检验以进行统计分析。统计学显著性的标准设定为*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为对本申请的范围的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
实施例1 筛选靶向p21基因启动子区的功能性小激活RNA(saRNA)
为了筛选能够激活p21基因表达的功能性小激活RNA，从UCSC Genome数据库中检索获得p21基因的1kb启动子序列(图1；SEQ ID NO:469)。从转录起始位点(TSS)上游-1kb处开始选定大小为19bp的靶点，通过每次移动1bp的方式，向TSS位点移动，获得总共982个靶点序列。对靶点序列进行过滤处理，以排除GC含量高于65％或低于35％，和含有5个或者多于5个的连续同一核苷酸，以及含3个或以上的双重复或三重复核苷酸的靶点序列。过滤后，剩余439个靶点序列作为候选进入筛选过程。基于这些候选序列，化学合成相应的双链RNA分子。其中，该实验中使用的双链RNA分子的正义和反义链的长度均为21个核苷酸，所述双链RNA分子例如双链saRNA的第一核糖核酸链(正义链)的5’区域的19个核苷酸与启动子靶点序列具有100％的同一性，其3’末端含有dTdT突出；第二核糖核酸链的5’区域的19个核苷酸与第一核糖核酸链的3’区域序列的19个核苷酸完全互补，其3’末端含有dTdT突出。
将前述双链RNA分子以10nM的终浓度转染至PC3细胞，72小时后，使用QuantiGene 2.0试剂盒检测p21基因mRNA水平。计算每个双链RNA分子相对于空白对照处理的p21 mRNA水平的倍数变化并绘制在图2中。测试中所有双链RNA分子所引起的p21基因mRNA的倍数变化涵盖从0.66(抑制)至8.12(诱导)的范围(图2B)。有361个(82.2％)双链RNA分子诱导p21表达1.01至8.12倍；74个(16.9％)双链RNA分子表现出抑制作用(0.99至0.66倍)；4个双链RNA分子(0.9％)对p21基因mRNA水平无影响(1.0倍)。
在被筛选的439个双链RNA分子中，132个双链RNA分子(30.1％)能够诱导p21 mRNA至少2倍；229个(52.4％)双链RNA分子诱导p21 mRNA至少1.5倍，这些诱导p21 mRNA表达上升10％以上双链RNA分子为saRNA，即具有功能的saRNA。这些具有功能的saRNA分散在整个p21启动子区域。然而，在8个游离的区域呈现功能性小激活RNA的聚集，这些区域被称为“热点”。热点区域的定义为一个区域内含有至少10个对应的小激活RNA，其中，至少60％的小激活RNA能够诱导p21 mRNA表达达到1.5倍或以上(图2A和图3)。热点1至8(H1～H8)的靶序列及对应的小激活RNA序列分别在表2和序列表中列出。
表2 p21启动子热点区域靶序列
Figure PCTCN2022074637-appb-000003
Figure PCTCN2022074637-appb-000004
这些热点包括：
热点区域1(H1)，相应的靶序列为p21启动子序列的-893bp至-801bp，序列如SEQ ID NO:5所示，在这个区域发现有44个具有功能的saRNA(图3A)，分别为RAG-834、RAG-845、RAG-892、RAG-846、RAG-821、RAG-884、RAG-864、RAG-843、RAG-854、RAG-844、RAG-887、RAG-838、RAG-858、RAG-835、RAG-876、RAG-870、RAG-853、RAG-881、RAG-828、RAG-872、RAG-841、RAG-831、RAG-829、RAG-820、RAG-822、RAG-868、RAG-849、RAG-862、RAG-865、RAG-893、RAG-848、RAG-824、RAG-866、RAG-840、RAG-875、RAG-880、RAG-871、RAG-888、RAG-885、RAG-894、RAG-833、RAG-825、RAG-889、RAG-823；
热点区域2(H2)相应的靶序列为p21启动子序列的-717至-632bp，序列如SEQ ID NO:6所示，在这个区域发现31个具有功能的saRNA(图3B)，分别为RAG-693、RAG-692、RAG-688、RAG-696、RAG-694、RAG-687、RAG-691、RAG-690、RAG-689、RAG-682、RAG-686、RAG-662、RAG-695、RAG-654、RAG-658、RAG-685、RAG-704、RAG-714、RAG-705、RAG-661、RAG-656、RAG-698、RAG-697、RAG-657、RAG-715、RAG-652、RAG-651、RAG-650、RAG-716、RAG-717、RAG-711；
热点区域3(H3)，相应的靶序列为p21启动子序列的-585bp至-551bp，序列如SEQ ID NO:7所示，在这个区域发现其包含9个具有功能的saRNA(图3C)，分别为RAG-580、RAG-577、RAG-569、RAG-576、RAG-570、RAG-574、RAG-585、RAG-579、RAG-584；
热点区域4(H4)，相应的靶序列为p21启动子序列的-554bp至-505bp，序列如SEQ ID NO:8所示，在这个区域发现包含17个具有功能的saRNA(图3D)，分别为RAG-524、RAG-553、RAG-537、RAG-526、RAG-554、RAG-523、RAG-534、RAG-543、RAG-525、RAG-535、RAG-546、RAG-545、RAG-542、RAG-531、RAG-522、RAG-529、RAG-552；
热点区域5(H5)，相应的靶序列为p21启动子序列的-514bp至-485bp，序列如SEQ ID NO:97所示，在这个区域发现包含9个具有功能的saRNA(图3E)，分别是RAG-503、RAG-504、RAG-505、RAG-506、RAG-507、RAG-508、RAG-509、RAG-510、RAG-511、RAG-512、RAG-513、RAG-514；
热点区域6(H6)，相应的靶序列为p21启动子序列的-442bp至-405bp，序列如SEQ ID NO:98所示，在这个区域发现包含12个具有功能的saRNA(图3F)，分别是RAG-427、RAG-430、RAG-431、RAG-423、RAG-425、RAG-433、RAG-435、RAG-434、RAG-439、RAG-426、RAG-428、RAG-442；
热点区域7(H7)，相应的靶序列为p21启动子序列的-352bp至-313bp，序列如SEQ ID NO:99所示，在这个区域发现包含13个具有功能的saRNA(图3G)，分别是RAG-335、RAG-351、RAG-352、RAG-331、RAG-344、RAG-342、RAG-341、RAG-333、RAG-345、RAG-346、RAG-336、RAG-332、RAG-343；
热点区域8(H8)，相应的靶序列为p21启动子序列的-325bp至-260bp，序列如SEQ ID NO:100所示，在这个区域发现包含18个具有功能的saRNA(图3H)，分别是RAG-294、RAG-285、RAG-286、RAG-292、RAG-291、RAG-284、RAG-279、RAG-280、RAG-325、RAG-293、RAG-322、RAG-321、RAG-281、RAG-289、RAG-278、RAG-283、RAG-282、RAG-295。
为进一步验证QuantiGene 2.0检测结果，将439个双链RNA分子按照激活p21 mRNA表达的活性大小分成四个组(bin)，从每组中随机挑选5个双链RNA分子，分别以10nM的浓度转染至PC3细胞。72小时后，提取细胞总RNA、反转录后采用RT-qPCR方法分析p21基因mRNA水平。两种方法所揭示的p21基因mRNA表达水平显示出显著的相关性(R 2＝0.82)(图4)。QuantiGene 2.0方法所得的所有功能性saRNA均可通过RT-qPCR方法验证为真实的功能性小激活RNA，其中一些功能性saRNA在RT-qPCR分析中显示出更强的p21 mRNA表达诱导(表3)。
表3 对QuantiGene 2.0方法的验证
Figure PCTCN2022074637-appb-000005
Figure PCTCN2022074637-appb-000006
在筛选出功能性小激活RNA后，选取其中部分代表性RNA，作进一步的测试和优化改进。在下文实施例2-12中使用的saRNA的具体信息如下列表4所示。
表4 用于体外转染细胞或动物给药的saRNA
Figure PCTCN2022074637-appb-000007
Figure PCTCN2022074637-appb-000008
在表4中，部分saRNA经过化学修饰。星号(*)表示核苷酸之间由硫代磷酸酯键连接，f表示核苷酸戊糖的2’-氟代(2’F)修饰，m表示核苷酸戊糖的2’-甲氧基(2’-O-methyl，2’OMe)修饰，Vp表示5’-(末端)-乙烯基膦酸酯(5’‐(E)‐vinylphosphonate)，Chol-TEG表示通过三乙二醇(TEG)接头连接胆固醇(Chol)缀合物，C3或C3(3’)表示寡核苷酸(Oligo)缀合如下的脂质体结构基团，(3’)表示寡核苷酸的3’端缀合：
Figure PCTCN2022074637-appb-000009
实施例2 saRNA促进视网膜色素上皮细胞中p21 mRNA的表达
(1)细胞培养和转染
人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)(购自上海酶研生物科技有限公司)培养在DMEM培养基(Gibco)中，培养基含有10％小牛血清(Sigma-Aldrich)和1％青霉素/链霉素(Gibco)。细胞在5％的CO 2，37℃条件下培养。ARPE-19细胞以每孔10×10 4个铺板到12孔板中，依照制造商的说明，使用RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad,CA)以10nM(除非另有说明)浓度转染小RNA，转染时间为72小时，每种处理使用2个复孔。
(2)两步法RT-qPCR
转染结束后，弃掉培养基，每孔加入500μl细胞裂解液，室温孵育5分钟。用Qiagen RNeasy试剂盒提取RNA，反转录后在ABI 7500快速实时(Fast Real-time)PCR系统(Applied Biosystems)进行qPCR分析，每个样本重复3个复孔扩增，PCR反应条件见表5。
表5 反转录(RT)反应制备
Figure PCTCN2022074637-appb-000010
Figure PCTCN2022074637-appb-000011
PCR反应条件为：95℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，扩增40个循环。同时扩增GAPDH基因作为内参，其中p21用p21F1/R1引物对扩增，扩增引物的具体序列见表1。
为了计算某个saRNA转染样本的p21(目的基因)的相对于对照处理的表达值(Erel)，用公式1代入目的基因及1个内参基因的Ct值计算。
E rel＝2 (CtTm-CtTs)/2 (CtRm-CtRs)      (公式1)
其中，CtTm为来自对照处理样本的目的基因的Ct值，CtTs为来自saRNA处理样本的目的基因的Ct值，CtRm为来自对照处理样本的内参基因的Ct值，CtRs为来自saRNA处理样本的内参基因的Ct值。
本实施例中以不同saRNA处理后ARPE-19细胞中的p21 mRNA水平如图5。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，RAG1-36、RAG1-40、RAG1-554和RAG1-884组的mRNA相对表达值分别上升了3.6、5.2、5.0和2.7倍，RAG1-40的激活效果尤为显著。这说明随机选择的功能性saRNA在ARPE-19细胞中能够不同程度地促进p21 mRNA的表达。
实施例3 saRNA的化学修饰与胆固醇缀合
为了增加saRNA在体内的稳定性及赋予其自递送能力，对saRNA RAG1-40进行化学修饰，包括在特定位点引入2’-甲氧基修饰，2’-氟代修饰和核苷酸之间的硫代磷酸酯键修饰，得到saRNA RAG1-40-53，进一步在正义链5’端通过TEG缀合胆固醇基团，得到saRNA RAG1-40-53-C1(表4)。通过对RAG1-40-53-C1序列进行打乱，得到对照序列RAG1-40-53-Scr-C1(表4)。
实施例4 不同剂量的saRNA上调视网膜色素上皮细胞中p21 mRNA的表达
(1)细胞培养和转染
细胞培养如实施例2所述，ARPE-19细胞以每孔10×10 4个铺板到12孔板中，使用RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad,CA)以1、5、10和50nM终浓度转染小激活RNA，转染时间为72小时，每种处理使用2个复孔。两步法RT-qPCR如实施例2所述。
实施例4的实验结果如图6。基于实施例2的结果，选取可有效激活p21的RAG1-40进行化学修饰，RAG1-40-53为化学修饰后的p21 saRNA(具体修饰位点和方式参见表4)。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，以1、5、10和50nM的浓度转染RAG1-40-53后，细胞p21 mRNA的表达分别增加了2.0、3.1、2.8和2.3倍，且在5nM时p21 mRNA的表达最高，表明不同浓度的RAG1-40-53可不同程度地促进p21 mRNA的表达。
实施例5 不同剂量的saRNA上调视网膜色素上皮细胞中p21蛋白的表达
(1)蛋白的收集和检测
细胞培养如实施例2所述，细胞转染如实施例4所述。转染72小时后，使用适量含有蛋 白酶抑制剂的细胞裂解液(1×RIPA缓冲液,Cell Signaling Technology)裂解。BCA法进行蛋白质定量，随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转至0.45μm的PVDF膜。所用一抗为：兔单克隆抗p21(Cell Signaling Technology,2947s)，α/β-Tubulin(Cell Signaling Technology,2148s)对印迹进行检测；二抗用抗兔IgG,HRP-连接的抗体(Cell Signaling Technology)。用Image Lab(BIO-RAD,Chemistry Doctm MP Imaging System)扫膜检测信号。
实验结果如图7，不同剂量的saRNA均可上调p21蛋白的表达。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，RAG1-40-53在转染浓度为1、5、10和50nM时p21蛋白的表达分别增加了1.4、1.3、1.4和1.4倍。实验结果显示p21蛋白的表达与RAG1-40-53的转染浓度不存在严格的剂量依赖关系，低剂量的转染浓度(1nM)就有相对较高的蛋白表达。
实施例6 激活p21的saRNA抑制视网膜色素上皮细胞的生长
(1)细胞培养和转染
细胞培养如实施例2所述，ARPE-19细胞以每孔2000个铺板到96孔板中，使用RNAiMax转染小激活RNA，用RAG1-40-53以0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、25和50nM的终浓度转染ARPE-19细胞，并设一组空白转染作为对照，以转染当天为第0天(D0)，转染后实验时间为7天，每种处理使用3个复孔。
(2)SRB染色实验
在ARPE-19细胞转染的7天内，每天在同一时间采用50％TCA固定4℃固定细胞1小时并用蒸馏水冲洗并室温晾干备用；实验结束后将7天的样本统一进行SRB染色实验，每孔加入50μL 0.4％SRB染色液室温孵育30分钟；孵育结束后移除SRB染液并加入200μL 1％醋酸冲洗4次，以便去除多余的SRB染液，室温晾干；加入100μL 10mM Tris base(pH10.5)并在摇床上孵育10分钟；在560nm处利用酶标仪读取吸光度，从而反映细胞的生长增殖情况。以第0天的数值作为细胞生长的基值，此后第1-7天，分别以空白转染组的数值作为当日细胞增殖情况的参比，计算同一收样天数下各浓度RAG1-40-53转染细胞相比于空白转染细胞的相对增殖百分比。
图8A为7天中细胞在不同浓度saRNA处理后的相对增殖百分比。第1天和第2天ARPE-19细胞在RAG1-40-53任一处理浓度下未见细胞相对增殖百分比降低，第3天开始在0.1nM处理浓度下观察到ARPE-19细胞开始发生相对增殖百分比降低，第4天后在1nM剂量处理下观察到细胞发生明显的相对增殖百分比降低，第7天细胞在10nM剂量处理下时的相对增殖百分比仅为10％左右。图8B显示以不同浓度RAG1-40-53处理细胞后，第1-7天各组细胞数目相对于第0天细胞数目的百分比。在ARPE-19细胞处理的前3天，各浓度RAG1-40-53 处理组细胞仅有小幅度增殖，且随着RAG1-40-53转染浓度的增加，细胞数目的增长量逐渐降低，第4天后0.01nM处理组的细胞出现较明显的增殖，但随着saRNA(RAG1-40-53)浓度的增加，细胞数目的增长量开始降低。虽然7天内各浓度RAG1-40-53处理组的细胞的数目均少于空白转染组的细胞数目，但转染后1-7天各组的细胞数目仍高于第0天的细胞数目，这说明p21 saRNA(RAG1-40-53)引起的细胞总体增殖减缓不是细胞毒性引起的而是抑制细胞生长所致。
实施例7 激活p21的saRNA抑制视网膜色素上皮细胞的生长的作用并不是细胞凋亡所致
(1)细胞培养和转染
细胞培养如实施例2所述，ARPE-19细胞以每孔10×10 4个铺板到12孔板中，使用RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad,CA)以1、5、10和50nM终浓度转染小激活RNA，转染时间为48小时，每种处理使用2个复孔。
(2)流式细胞术检测细胞凋亡
细胞转染结束后弃上清收集细胞，每孔加入500μl PBS清洗一次，弃掉PBS，每孔再加入100μl胰酶，加900μl培养基终止消化并转移至1.5mL离心管中，离心(400rcf，5min)收集所有的细胞并计数(1～2×10 5个细胞/100μl Binding Buffer)。分别加入100μL的1×Binding Buffer(B&D Systems，51-66121E)和5μL FITC Annexin V(B&D Systems，51-65874X)和5μL PI(B&D Systems，51-66211E)室温避光孵育15分钟，孵育结束后加入100μL的1×Binding Buffer混匀并转移至96孔板中用流式细胞仪(Beckman Coulter)进行分析，样本应在1小时以内分析结束。
如图9所示，对照组的活细胞和早晚期的凋亡比例分别为96.2％和1.4％，p21 saRNA(RAG1-40-53)各处理组的活细胞数目均在90％以上，在1、5、10和50nM的处理浓度下早晚期细胞凋亡比例分别为2.5％，3.2％，3.2％和2.9％。与对照组相比，p21 saRNA(RAG1-40-53)各处理组没有显著性差异，未见细胞凋亡明显增加。这说明人p21 saRNA抑制ARPE-19细胞生长并不是细胞凋亡所致。
实施例8 激活p21的saRNA抑制视网膜色素上皮细胞迁移
(1)细胞培养和转染
细胞培养如实施例2所述，ARPE-19细胞以每孔30×10 4个铺板到12孔板中，待细胞贴壁后使用灭菌的枪尖在孔板上划痕，加入500μL PBS冲洗3遍以洗去孔板中漂浮的细胞，拍照观察并记为0小时。使用RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad,CA)以10nM终浓度转染小激 活RNA(RAG1-40-53)或加入TGF-β(10ng/ml)，TGF-β作为生长因子单独使用作为阳性参照，或联合p21 saRNA(RAG1-40-53)一起使用，转染24小时后拍照观察细胞迁移。
图10A是0和24小时后在显微镜下的细胞迁移图片，利用Image J软件分析细胞迁移的面积，图10B显示图10A对应的细胞迁移的相对面积(以对照组细胞迁移面积为基准，记为1)。与对照组相比，TGF-β处理组细胞迁移的相对面积为1.41，表明TGF-β在24小时内可以成功诱导细胞迁移。与对照组相比，RAG1-40-53处理组细胞迁移的相对面积为0.82，表明RAG1-40-53可以抑制细胞迁移。与TGF-β或RAG1-40-53单独处理相比，RAG1-40-53+TGF-β联合处理组细胞迁移的相对面积为0.98，表明RAG1-40-53可抑制TGF-β诱导的细胞迁移。
实施例9 胆固醇缀合的激活p21的saRNA可自递送至视网膜色素上皮细胞并抑制其增殖
(1)细胞培养和处理
细胞培养如实施例2所述，ARPE-19细胞以每孔2000个铺板到96孔板中，不使用RNAiMax，而用图11的saRNA(RAG1-40-53-C1，详见表4)以0.01、0.03、0.1、0.3、1和3μM的终浓度自处理ARPE-19细胞，并设一组未施加任何处理的细胞作为对照，以处理当天为第0天(D0)，让细胞自由摄取saRNA，处理时间为5天，每种处理使用3个复孔。
(2)CCK8实验
细胞处理结束后，加入10μL的CCK8试剂于100μL细胞培养基中，细胞培养箱孵育1小时，孵育结束后使用酶标仪在450nm处检测吸光度，以对照处理的细胞作为对照。吸光度的数值反映细胞的生长增殖情况。以第0天的数值作为细胞生长的基值，以处理结束时对照组的数值作为当日细胞增殖情况的参比(记为1)，计算各浓度RAG1-40-53-C1处理组细胞相比于对照组细胞的相对增殖比。
如图11所示，随着saRNA(RAG1-40-53-C1)浓度的增加，细胞相对增殖比逐渐降低并稳定在一定水平。在saRNA(RAG1-40-53-C1)处理浓度为0.3μM时，细胞相对增殖比约为50％。在saRNA(RAG1-40-53-C1)处理浓度为1μM时，细胞相对增殖比基本达到平台期，维持在50％左右。这说明经胆固醇修饰的saRNA(RAG1-40-53-C1)可自递送到ARPE-19细胞并抑制细胞的生长增殖。
实施例10 兔模型中的药物代谢动力学研究
(1)动物分组
自江苏省邳州市东方养殖有限公司订购15只雌性新西兰大耳白兔，饲养于普通级兔房中，单只单笼饲养，自由摄食和饮水。将15只雌性兔子随机分成3组，生理盐水对照组1只， 给药组各7只。
(2)药物配制
将saRNA(RAG1-40-53-C1)冻干粉室温下13000rpm离心5min，PBS复溶至60mg/ml，并用PBS依次稀释至所需的浓度。
(3)玻璃体注射给药
称量兔子体重并用兔箱进行固定，按30mg/kg的剂量耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠溶液进行麻醉，眼睛滴1-2滴复方托吡卡胺散瞳(约需要15分钟)，间隔1-2分钟滴2-3滴利多卡因进行局部麻醉后，前房用30G注射器抽取0.05mL房水，每只眼睛玻璃体单次注射0.05mL相应浓度(0.1mg和0.3mg)的saRNA(RAG1-40-53-C1)溶液。分别在4小时、1、2、4、8、14和21天取材并检测兔玻璃体和视网膜中saRNA的含量，第一次注射当天记为第0天。
(4)Stem-loop PCR
将不同时间点处理的兔眼玻璃体摘取置于1.5mL的离心管中，加入500μL的Buffer-2(中美瑞康)充分混匀溶解，3000rpm离心3分钟。离心结束后将样品95℃加热5分钟，并快速转移至冰上备用。RT-PCR的反应体系及条件见表6，引物序列见表1。
表6 RT-PCR反应制备
Figure PCTCN2022074637-appb-000012
反应条件：95℃30秒，95℃5秒，60℃20秒，扩增40个循环，72℃10秒。
如图12A所示，随着给药时间的增加，玻璃体和视网膜中saRNA(RAG1-40-53-C1)的含量逐渐降低。给药4小时后，玻璃体和视网膜中saRNA(RAG1-40-53-C1)的含量下降了50％以上，给药14天后，saRNA(RAG1-40-53-C1)几乎完全被代谢掉。图12B为兔整只眼睛中saRNA(RAG1-40-53-C1)的含量，给药4小时后，saRNA(RAG1-40-53-C1，0.1mg)的含量约为81％，给药1天后saRNA的含量急剧下降，给药后2天saRNA的含量约为23％，给药后14天saRNA几乎完全代谢掉，表明对兔眼给予低剂量的saRNA(RAG1-40-53-C1，0.1mg)短时间内可维持一定的药物水平，2天后saRNA的含量逐渐被代谢掉。高剂量的 saRNA(RAG1-40-53-C1，0.3mg)处理兔眼4小时后，saRNA的含量约为57％，给药后2天saRNA的含量约为21％，给药后14天saRNA几乎完全代谢掉，表明高剂量的药物在兔眼中的代谢较快且维持时间短。
实施例11 兔模型中的药效动力学研究
(1)动物分组
订购19只雌性新西兰大耳白兔饲养于普通级兔房中，单只单笼饲养，自由摄食和饮水。将19只雌性兔子随机分成8组，每组1-4只不等。药物配制如实施例10所述。
(2)玻璃体注射给药
称量兔子体重并用兔箱进行固定，按30mg/kg的剂量耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠溶液进行麻醉，眼睛滴1-2滴复方托吡卡胺散瞳(约需要15分钟)，间隔1-2分钟滴2-3滴利多卡因进行局部麻醉后，前房用30G注射器抽取0.05mL房水，每只眼睛玻璃体单次注射0.1mL不同浓度的RAG1-40-53-C1溶液(各组注射saRNA的总量分别为0.03mg、0.1mg、0.24mg、、0.3mg、1mg)，或0.1mL不同浓度的对照RAG1-40-53-Scr-C1溶液(作为乱序无关序列对照，各组注射RAG1-40-53-Scr-C1的总量分别为0.3mg、1mg)。
(3)两步法RT-qPCR
兔眼给药3天后取材，摘除眼球，剪去角膜，剥离晶状体，尽可能多地收集玻璃体并转移至1.5mL的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清。玻璃体沉淀约200μL，再加入1mL的Trizol振荡混匀，室温放置5分钟。用Qiagen RNeasy试剂盒提取RNA，反转录后在ABI 7500快速实时(Fast Real-time)PCR系统(Applied Biosystems)进行qPCR分析，PCR反应条件：95℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，扩增40个循环。同时扩增TBP和B2M基因作为内参，其中p21用p21F1/R1引物对扩增，引物见表1。
为了计算某个saRNA(如：RAG1-40-53-C1)样本的p21(目的基因)相对于对照处理(生理盐水)的表达值(Erel)，用公式2代入目的基因及2个内参基因的Ct值计算。
E rel＝2 (CtTm-CtTs)/((2 (CtR1m-CtR1s)*2 (CtR2m-CtR2s)) (1/2))    (公式2)
其中，CtTm为来自对照处理(生理盐水)样本的目的基因的Ct值，CtTs为来自saRNA(RAG1-40-53-C1)处理样本的目的基因的Ct值，CtR1m为来自对照处理样本的内参基因1的Ct值，CtR1s为来自saRNA处理样本的内参基因1的Ct值，CtR2m为来自对照处理样本的内参基因2的Ct值，CtR2s为来自saRNA处理样本的内参基因2的Ct值。
图13为不同处理下p21基因mRNA的表达水平。与对照组(生理盐水)相比，RAG1- 40-53-Scr-C1两组(0.3和1mg)p21 mRNA的表达均没有增加，表明RAG1-40-53-Scr-C1作为saRNA(RAG1-40-53-C1)的无关序列对照对p21表达无影响。与对照组(生理盐水)相比，RAG1-40-53-C1在0.03、0.1、0.24、0.3和1mg浓度作用下其p21 mRNA的表达分别上升了1.3、2.2、2、2.2和2倍，在0.1mg浓度处理时其表达最高，这说明saRNA在低剂量处理下即可以激活p21 mRNA的表达。
实施例12 激活p21的saRNA可减缓动物模型PVR的发生。
(1)兔PVR模型构建
订购5只雌性新西兰大耳白兔饲养于普通级兔房中，单只单笼饲养，自由摄食和饮水。将5只雌性兔子随机分成3组，每组2-3只不等。玻璃体注射方式如实施例10所述，将0.1mL含2.5×10 5个ARPE-19细胞的悬液注射到兔玻璃体中进行造模。造模后通过眼底显微镜和裂隙灯显微镜观察PVR模型是否构建成功。
(2)玻璃体注射给药
PVR模型构建成功后，玻璃体单次注射给药，分为以下2组：生理盐水组和RAG1-40-53-C1组，玻璃体给药方式如实施例11所述。
(3)活体显微检查和离体观察评分
给药前(细胞注射后33天)和给药后13和27天均通过眼底显微镜和裂隙灯显微镜观察PVR的等级变化，给药后28天进行离体观察PVR等级变化，等级按照Fastenberg分级(Fastenberg et al.1982)来划分，0级代表正常，1-5级代表PVR的严重程度，5级最为严重，具体内容见表7。经药物治疗后，活体显微检查和离体观察评分结果见表8。
表7 Fastenberg分级
Figure PCTCN2022074637-appb-000013
表8 活体显微检查和离体观察Fastenberg分级评分结果
Figure PCTCN2022074637-appb-000014
Figure PCTCN2022074637-appb-000015
如上所述，当PVR模型构建成功后，随机分组并给予药物(RAG1-40-53-C1)治疗。给药前通过眼底和裂隙灯图像评价PVR的等级为1或2级，表现为轻度的PVR改变。给药13天和28天后分别观察生理盐水组和RAG1-40-53-C1对兔眼睛的治疗效果，给药治疗13天后，生理盐水(对照)组的眼底镜和裂隙灯图像评价PVR的等级为2或3级，给予RAG1-40-53-C1治疗组的眼底镜和裂隙灯图像评价PVR的等级为2级，给药治疗27天后，生理盐水处理组的眼底镜和裂隙灯图像评价PVR的等级为3或4级，给予RAG1-40-53-C1治疗组的眼底镜和裂隙灯图像评价PVR的等级为1或2级。给药28天后，摘取兔眼球直视下进一步观察RAG1-40-53-C1对PVR的治疗效果。离体观察显示，生理盐水组的PVR等级为2或3级，RAG1-40-53-C1治疗组的PVR等级为1级。上述结果提示，与生理盐水(对照)组相比，RAG1-40-53-C1治疗可以减缓或者抑制PVR的发生发展，长期治疗并有望改善PVR的症状。
实施例13 saRNA促进人膀胱癌细胞中p21 mRNA的表达
人膀胱癌细胞(Ku-7-LG)(ATCC)培养在McCoy培养基(Gibco)中，培养基含有10％小牛血清(Sigma-Aldrich)和1％青霉素/链霉素(Gibco)。细胞在5％的CO 2，37℃条件下培养。Ku-7-LG细胞以每孔10×10 4个铺板到12孔板中，依照制造商的说明，使用RNAiMax以10nM(除非另有说明)浓度转染saRNA，转染时间为72小时，每种处理使用2个复孔。两步法RT-qPCR如实施例2所述。
不同saRNA处理后Ku-7-LG细胞中相对p21 mRNA水平如图14，以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，RAG-332、RAG-331、RAG-330、RAG-329、RAG-327、RAG-325、RAG-323、RAG-322、RAG-321、RAG-299和RAG-297组的mRNA相对表达值分别上升了1.5、3.8、1.7、1.6、1.2、1.3、2.0、6.4、5.6、1.6和1.4倍，RAG-331、RAG-322和RAG-321的激活效果尤为显著。这说明随机选择的功能性saRNA在Ku-7-LG9细胞中能够不同程度地促进p21 mRNA的表达。
实施例14 化学修饰的saRNA促进视网膜色素上皮细胞中p21 mRNA和蛋白的表达
为了增加saRNA的稳定性及活性，对saRNA RAG-322(又称RAG1-0)的所有核苷酸进行化学修饰，包括在特定位点引入2’-甲氧基修饰，2’-氟代修饰和核苷酸之间的硫代磷酸酯键修饰，得到saRNA RAG1-0M4(表4)。为了进一步提高saRNA RAG1-0M4的递送效率，在其寡核苷酸(Oligo)正义链3’端通过固相支持体CPG(可控微孔玻璃)缀合脂质基团，得到saRNA RAG1-0M4-C3(3')(表4)。缀合的脂质结构基团如下：
Figure PCTCN2022074637-appb-000016
细胞培养如实施例2所述，ARPE-19细胞以每孔10×10 4个铺板到12孔板中，使用RNAiMax以25nM终浓度转染小激活RNA，转染时间分别为1、2、3、4、5、6和7天，每种处理使用2个复孔。两步法RT-qPCR如实施例2所述。蛋白的收集和检测如实施例5所述。
图15A为处理不同天数的saRNA RAG1-0M4在ARPE-19细胞中p21 mRNA的表达水平。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，saRNA RAG1-0M4处理2、3、4、5、6和7天后p21 mRNA的表达值分别上升了1.2、2.0、1.9、1.7、1.9和2.0倍。RAG1-0M4处理2天后p21 mRNA的表达开始增加(1.2倍)，处理3天后p21 mRNA的表达达到顶峰(2.0倍)，处理4天后开始下降(仍有很高的活性)，处理6天后又开始上升并在处理7天后再次达到顶峰。这说明功能性saRNA RAG1-0M4在ARPE-19细胞中处理3天后可促进p21 mRNA的表达，并维持在一个高的表达水平。
图15B和15C为处理不同天数的saRNA RAG1-0M4在ARPE-19细胞中p21蛋白的表达水平。图15B为蛋白条带图，图15C为根据图15B的蛋白条带利用Image J软件分析得到的统计图。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，saRNA RAG1-0M4处理1、2、3、4、5、6和7天后p21蛋白表达值分别上升了3.9、8.0、11.2、8.7、5.5、4.4和2.8倍。RAG1-0M4处理1天后p21蛋白表达开始增加(3.9倍)，处理3天后p21蛋白表达达到顶峰(11.2倍)，处理4天后随着处理时间的增加，p21蛋白表达逐渐下降。这说明功能性saRNA RAG1-0M4在ARPE-19细胞中处理3天后可促进p21蛋白表达并达到顶峰。
结果显示处理不同天数的saRNA RAG1-0M4在ARPE-19细胞中可不同程度地促进p21 mRNA和蛋白的表达，并在处理3天后saRNA RAG1-0M4活性最好。
实施例15 化学修饰的saRNA促进视网膜色素上皮细胞中p21 mRNA和蛋白的表达
细胞培养和转染细胞培养。如实施例2所述，ARPE-19细胞以每孔10×10 4个铺板到12 孔板中，saRNA RAG1-0M4以100nM为最高转染浓度，以此对半稀释(50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2和0.1nM)并使用RNAiMax转染3天，每种处理使用2个复孔。两步法RT-qPCR如实施例2所述，蛋白的收集和检测如实施例5所述，saRNA RAG1-0M4化学修饰如实施例14所述。
图16A为不同剂量的saRNA在ARPE-19细胞中p21 mRNA的表达水平。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，saRNA RAG1-0M4在100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56和0.78nM多浓度处理3天后p21 mRNA的表达分别上升了2.2、2.4、2.1、2.5、2.8、2.1、1.7和1.4倍。saRNA RAG1-0M4在0.78nM处理时p21 mRNA的表达开始上升(1.4倍)，在6.25nM时达到顶峰(2.8倍)后开始下降，并在25-100nM时维持在一个稳定的水平(2.0倍)。这说明不同剂量的功能性saRNA RAG1-0M4在ARPE-19细胞中可促进p21mRNA的表达，并在6.25nM的转染浓度时达到顶峰。
图16B和16C为不同剂量的saRNA RAG1-0M4在ARPE-19细胞中p21蛋白的表达水平。图16B为蛋白条带图，图16C为根据图16-B的蛋白条带利用Image J软件分析得到的统计图。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，saRNA RAG1-0M4在100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2和0.1nM多浓度处理3天后p21蛋白表达分别上升了2.8、4.7、4.5、4.8、4.1、2.2、2.2、1.8、1.7、1.6和1.2倍。这说明不同剂量的功能性saRNA RAG1-0M4在6.25-50nM区间内p21蛋白表达较高且稳定，在12.5nM处p21蛋白表达达到顶峰。
结果显示不同剂量的saRNA RAG1-0M4在ARPE-19细胞中可不同程度地促进p21 mRNA和蛋白的表达，在6.25-12.5nM处理时saRNA RAG1-0M4活性最好。
实施例16 化学修饰的saRNA在兔模型中的药物代谢动力学研究
实施例10相同来源的4只雌性新西兰大耳白兔，饲养于普通级兔房中，单只单笼饲养，自由摄食和饮水。
将saRNA RAG1-0M4-C3(3')冻干粉室温下13000rpm离心5min，PBS复溶至60mg/ml，并用PBS依次稀释至2mg/ml(0.1mg)和6mg/ml(0.3mg)的浓度。
称量兔子体重并用兔箱进行固定，按30mg/kg的剂量耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠溶液进行麻醉，眼睛滴1-2滴复方托吡卡胺散瞳(约需要15分钟)，间隔1-2分钟滴2-3滴利多卡因进行局部麻醉后，前房用30G注射器抽取0.05mL房水，每只眼睛玻璃体单次注射0.05mL相应浓度(0.1mg和0.3mg)的saRNA RAG1-0M4-C3(3')溶液。分别在4小时、1、3、7和14天取材并检测兔玻璃体、血浆和视网膜中saRNA RAG1-0M4-C3(3')的含量，第一次注射当天记为第0天。
采用Stem-loop PCR方法检测不同时间点saRNA RAG1-0M4-C3(3')在兔玻璃体、血浆和视网膜中的含量。Stem-loop PCR方法如实施例10所述。
图17A为一次性玻璃体注射saRNA RAG1-0M4-C3(3')(0.1mg)后不同时间点药物在兔玻璃体、血浆和视网膜中的含量。玻璃体注射后药物很快被视网膜吸收，导致药物在视网膜中的浓度为最高，玻璃体次之，而在血浆中的浓度为最低，说明saRNA RAG1-0M4-C3(3')在玻璃体内注射后全身暴露非常有限。在视网膜和玻璃体中，给药1天后RAG1-0M4-C3(3')浓度开始下降，3天后维持在一个稳定的水平直至14天，说明saRNA RAG1-0M4-C3(3')在兔眼内有很好的稳定性及缓慢代谢。
图17B为一次性玻璃体注射saRNA RAG1-0M4-C3(3')(0.3mg)后不同时间点药物在兔玻璃体、血浆和视网膜中的含量。玻璃体注射后药物很快被视网膜吸收，导致药物在视网膜中的浓度为最高，玻璃体次之，而在血浆中的浓度为最低，说明saRNA RAG1-0M4-C3(3')在玻璃体内注射后全身暴露非常有限。视网膜的药物浓度在给药后至14天维持在稳定的水平，而在璃体中，给药1天后RAG1-0M4-C3(3')浓度开始下降，至14天下降至低于血浆的浓度。而在血浆中，药物浓度从第3天开始至14天呈现缓慢上升的趋势，反映出药物从兔眼内向全身分布的转移。这些结果为我们在给药剂量和给药时间上的安排上提供了数据支持。
实施例17 化学修饰的saRNA在兔模型中的药效动力学研究
实施例10相同来源的9只雌性新西兰大耳白兔饲养于普通级兔房中，单只单笼饲养，自由摄食和饮水。随机将其分为4组，每组2～3只。药物配制如实施例16所述。
将saRNA RAG1-0M4-C3(3')冻干粉室温下13000rpm离心5min，PBS复溶至6mg/ml，将浓度为0.3mg/0.05mL浓度的saRNA RAG1-0M4-C3(3')与含2×10^6ARPE-19cells/0.05Ml体外混合为0.1mL的终体积，用于注射到兔玻璃体内。
玻璃体注射给药方式如实施例16所述，实验组玻璃体单次注射上述混合体积为0.1mL浓度为0.3mg的saRNA RAG1-0M4-C3(3')溶液，生理盐水组单次同时注射同体积的生理盐水作为对照组。分别在3和7天取材并检测兔玻璃体p21 mRNA的含量，第一次注射当天记为第0天。样品取材处理方法和两步法RT-qPCR法如实施例11所述。
图18为saRNA RAG1-0M4-C3(3')在兔玻璃体中p21 mRNA的表达。生理盐水作为对照组，与对照组相比，saRNA RAG1-0M4-C3(3')在3天和7天p21 mRNA的表达分别上升了4.0和5.3倍，在7天的表达最高，这说明saRNA RAG1-0M4-C3(3')在短时间内可促进兔玻璃体中p21 mRNA的表达。
实施例18 化学修饰的saRNA促进视网膜色素上皮细胞中p21 mRNA的表达
为了增加saRNA的稳定性及活性，在saRNA RAG1-0M4的基础上增加了5’-(末端)-乙烯基膦酸酯所有核苷酸进行化学修饰，得到saRNA RAG1-0M4v(表4)。为了进一步提高saRNA RAG1-0M4v的递送效率，在其正义链3’端通过固相支持体CPG(可控微孔玻璃)缀合脂质结构基团，得到带有递送结构的saRNA RAG1-0M4v-C3(3')(表4)。缀合的脂质结构基团与实施例14相同。
细胞培养如实施例2所述，ARPE-19细胞以每孔10×10 4个铺板到12孔板中，使用RNAiMax以3、10和30nM终浓度转染小激活RNA，转染时间为3天，每种处理使用2个复孔。两步法RT-qPCR如实施例2所述。
图19为不同转染浓度的saRNA RAG1-0M4v在ARPE-19细胞中p21 mRNA的表达。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，saRNA RAG1-0M4v在3nM、10nM和30nM处的p21 mRNA的表达分别上升了2.0、2.3和2.2倍。这说明功能性saRNA RAG1-0M4v在较低的浓度下就可以诱导p21 mRNA的表达。
实施例19 化学修饰的saRNA抑制视网膜色素上皮细胞的生长的作用并非细胞凋亡所致
细胞转染结束后，吸取100μL的细胞培养基转移至Caspase3/7(货号：Promega G8092，公司：普洛麦格Promega)实验专用白板中，加入15μL Caspase3/7反应底物于100μL的细胞培养基中，细胞培养箱孵育20分钟，孵育结束后使用酶标仪检测荧光强度，荧光强度反映细胞的Caspase3/7活性，Caspase3/7的活性是细胞凋亡指示剂，通过检测其活性强弱，判断细胞凋亡情况。化学修饰、细胞培养和转染如实施例18所述，CCK8实验如实施例9所述。
图20A为不同转染浓度的saRNA RAG1-0M4v处理3天后ARPE-19细胞的数目。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，saRNA RAG1-0M4v在3nM、10nM和30nM处细胞相对增殖比分别为57％、54％和34％。图20B为不同转染浓度的saRNA RAG1-0M4v处理3天后ARPE-19细胞中Caspase3/7的活性。与对照组相比，saRNA RAG1-0M4v在3nM、10nM和30nM处细胞的Caspase3/7活性无明显差别。这说明saRNA RAG1-0M4v随着剂量的增加可抑制细胞的生长，但这种抑制细胞生长的作用并不是细胞凋亡所致。
实施例20 化学修饰的saRNA促进视网膜色素上皮细胞中p21 mRNA的表达但无促进细胞凋亡的效果
细胞培养如实施例2所述，ARPE-19细胞以每孔10×10 4个铺板到12孔板中，saRNA RAG1-0、RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)以10nM的转染浓度使用RNAiMax转染3天，每种处理使用2个复孔。两步法RT-qPCR如实施例2所述，saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)化学修饰如实施例18所述。Caspase3/7活性实验如实施例19所述。
图21A为不同saRNA以10nM处理3天后ARPE-19细胞中p21 mRNA的表达。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，saRNA RAG1-0、RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)在ARPE-19细胞中p21 mRNA的表达分别上升了4.2、4.0和2.9倍。这说明saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)经过化学修饰后仍保持激活p21基因的活性。图21-B为不同saRNA以10nM处理3天后ARPE-19细胞中Caspase3/7的活性。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，saRNA RAG1-0、RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)在ARPE-19细胞中Caspase3/7的活性分别为1.3、1.3和1.1倍。Caspase3/7的活性是细胞凋亡指示剂，活性越强细胞凋亡越严重。这说明saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)经化学修饰后降低了促进细胞凋亡的活性。
实验结果说明经化学修饰的saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)不仅促进ARPE-19细胞中p21mRNA的表达，而且降低了导致细胞凋亡的风险。
实施例21 化学修饰的saRNA促进视网膜色素上皮细胞中p21 mRNA和蛋白的表达
细胞培养如实施例2所述，ARPE-19细胞以每孔10×10 4个铺板到12孔板中，saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)以100nM为最高转染浓度，以此3倍稀释(33.3、11.1、3.7、1.2、0.412、0.137、0.046、0.015、0.005和0.002nM)并使用RNAiMax转染3天，每种处理使用2个复孔。两步法RT-qPCR如实施例2所述，蛋白的收集和检测如实施例5所述，saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)化学修饰如实施例18所述。
图22A为不同剂量的saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)在ARPE-19细胞中p21 mRNA的表达。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比，saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)以100、33.3、11.1、3.7和1.2nM多浓度处理3天后p21mRNA的表达分别上升了1.9、1.9、1.7、1.5和1.4倍。saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)在1.2nM处理时p21 mRNA的表达开始上升(1.4倍)，在33.3nM时达到顶峰(1.9倍)，在33.3-100nM时维持在一个稳定的水平(1.9倍)。这说明不同剂量的功能性saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)在ARPE-19细胞中可促进p21mRNA的表达，并在33.3nM的转染浓度时达到顶峰。
图22B和22C为不同剂量的saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)和saRNA RAG1-0M4v在ARPE-19细胞中p21蛋白的表达水平。图22B为蛋白条带图，图22C为根据图21B的蛋白条带利用Image J软件分析得到的条带亮度值统计图。以对照组作为空白转染对照，与对照组相比， saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)在3、10和30nM时p21蛋白表达分别上升了4.5、5.3和4.8倍。saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)在相同剂量(10nM)下,saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)的p21蛋白表达高于saRNA RAG1-0M4v(4.0倍)。这说明带有递送结构的saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)不仅能提高p21蛋白表达，而且p21蛋白表达要优于未带递送结构的saRNA RAG1-0M4v。
结果显示带有递送结构的saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)在ARPE-19细胞中可不同程度地促进p21 mRNA和蛋白的表达，且p21蛋白表达要优于未带递送结构的saRNA RAG1-0M4v。
实施例22 化学修饰的saRNA降低PBMC细胞中炎症因子的免疫刺激反应
外周血单个核细胞PBMC(江苏西迪尔生物技术有限公司)培养在RPMI1640培养基(Gibco)中，培养基含有10％小牛血清(Sigma-Aldrich)和1％青霉素/链霉素(Gibco)。细胞在5％的CO 2，37℃条件下培养。PBMC细胞以每孔100×10 4个铺板到96孔板中，saRNA RAG1-0、RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)以133nM的转染浓度使用RNAiMax转染24小时，每种处理使用2个复孔。LPS(50ng/mL)和RAG-IS-1作为阳性对照组，对照组作为空白转染对照，未处理指未加任何转染试剂，只有PBMC细胞和培养基。
saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)化学修饰如实施例18所述。
细胞转染结束后每个样品分别收集3份各100μL(3×100μL)的细胞悬液，用于检测人IL-6、IFN-α和TNF-α炎症因子的含量，具体的操作方法参照各炎症因子的试剂盒说明书，具体的试剂盒信息如下：IL-6ELISA试剂盒(货号：1110602公司：上海达科为生物技术有限公司)、IFN-αELISA试剂盒(货号：70-EK199-96，公司：杭州联科生物技术股份有限公司)和TNF-αELISA试剂盒(货号：1117202，公司：上海达科为生物技术有限公司)。
图23A为saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)在PBMC细胞中人IL-6的含量。未处理、对照、dsCon2、LPS(50ng/mL)、RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)各组在PBMC细胞中人IL-6的含量分别为3.6、5.9、15.5、443.0、3.4和1.8pg/mL，saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)组的IL-6含量远低于对照组，saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)组的人IL-6含量最低。这说明经递送结构修饰的saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)与未经递送机构修饰的saRNA比较，呈现被抑制的对IL-6炎症因子的刺激作用。
图23B为saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)在PBMC细胞中人IFN-α的含量。未处理、对照、dsCon2、RAG-IS-1、RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)各组在PBMC细胞中人IFN-α的含量分别为9.7、38.8、27.8、176.3、23.5和20pg/mL，saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)组的IFN-α含量远低于对照组，saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)组的 人IFN-α含量最低。这说明经递送结构修饰的saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)与未经递送机构修饰的saRNA比较，呈现被抑制的对IFN-α炎症因子的刺激作用。
图23C为saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)在PBMC细胞中人TNF-α的含量。未处理、对照、dsCon2、LPS(50ng/mL)、RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)各组在PBMC细胞中人TNF-α的含量分别为61.0、134.5、154.6、330.3、115.4和124.0pg/mL，saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3’)组的TNF-α含量远低于对照组。这说明经修饰的saRNA RAG1-0M4v-C3(3’)与未经递送机构修饰的saRNA比较，呈现被抑制的对TNF-α炎症因子的刺激作用。
实施例23 化学修饰的saRNA在兔模型中的药效动力学研究
实施例10相同来源的9只雌性新西兰大耳白兔饲养于普通级兔房中，单只单笼饲养，自由摄食和饮水。随机将其分为4组，每组2～3只。
药物配制如实施例17所述，与之不同的是所用的saRNA为RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')。saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')的化学修饰如实施例18所述。
玻璃体注射给药方式如实施例16所述，各实验组玻璃体单次注射0.1mL浓度为0.3mg的saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')溶液，或0.1mL浓度为0.3mg的dsCon2M4组(作为无关序列对照组)，注射同体积的生理盐水作为对照组。在3天后取材并检测兔玻璃体p21 mRNA的含量，第一次注射当天记为第0天。样品取材处理方法和两步法RT-qPCR法如实施例11所述。
图24为saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')在兔玻璃体中p21 mRNA的表达。生理盐水作为对照组，与对照组相比，saRNA RAG1-0M4v和RAG1-0M4v-C3(3')在兔玻璃体中p21 mRNA的表达分别上升了0.9和3.5倍，带有递送结构修饰的saRNA RAG1-0M4v-C3(3')在兔玻璃体中p21 mRNA的表达较高，这说明经递送结构修饰的saRNA RAG1-0M4-C3(3')可促进p21 mRNA的表达，并进一步提高体内递送的效率。
综上所述，人p21 saRNA可激活p21基因的表达并抑制人视网膜色素上皮细胞的生长，并进一步改善或治疗由p21减少或不足所致的疾病，如增殖性玻璃体视网膜病。
本申请采用小激活RNA的作用机制上调p21基因转录表达，在体外和体内实验均有验证。在ARPE-19细胞中证明增加p21的表达可以抑制细胞的增殖和迁移，说明上调p21的表达可以有效抑制细胞的增殖和迁移。体内实验采用兔PVR模型，给予本申请物治疗后，PVR的症状明显改善。这种基因治疗方法的高选择性、靶向性和准确性为治疗PVR提供了新的方向。
以上已经描述了本申请的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所述明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本申请中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本申请披露的各实施例。
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Claims (25)

  1. 一种小激活核酸分子，所述小激活核酸分子包含通过完全互补或不完全互补形成双链结构的第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链，所述第一寡核苷酸链与SEQ ID NO:469上16-35个核苷酸的连续片段具有至少75％的同源性或互补性，其特征在于，所述的小激活核酸分子(1)GC含量介于35～65％，(2)不含5个或以上连续的相同核苷酸，且(3)不含3个或以上的双重复或三重复核苷酸。
  2. 根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述第一寡核苷酸链与SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12所示的任一序列中的任意连续16-35个核苷酸的片段具有至少75％的同源性或互补性。
  3. 根据权利要求2所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述第一寡核苷酸链与选自SEQ ID NO：13-30、35-46、59-62、67-74、77-80、85-96、103-108、111-118、121-132、139-140、147-180、185-186、189-190、195-198、201-202、209-212、215-218、225-240、243-246、249-258、261-262、265-270、275-280、283-300、303-308、317-320、323-324、329-348、351-352、357-358、361-366、371-392、399-400、405-412、415-416、419-424、429-432、439-442、447-450、453-458、463-468、479-486所示的任一序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的互补性或同源性。
  4. 根据权利要求3所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述第一寡核苷酸链或所述第二寡核苷酸链与SEQ ID NO：13-30、35-46、59-62、67-74、77-80、85-96、103-108、111-118、121-132、139-140、147-180、185-186、189-190、195-198、201-202、209-212、215-218、225-240、243-246、249-258、261-262、265-270、275-280、283-300、303-308、317-320、323-324、329-348、351-352、357-358、361-366、371-392、399-400、405-412、415-416、419-424、429-432、439-442、447-450、453-458、463-468、479-486任一核苷酸序列相同或互补、或有1～2个碱基不同或错配。
  5. 根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述小激活核酸分子为双链核酸，所述第一寡核苷酸链和所述第二寡核苷酸链分别位于所述双链核酸的两条链上。
  6. 根据权利要求5所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述第一寡核苷酸链和所述第二寡核苷酸链之一或两者均具有0-6个核苷酸的突出，所述突出位于所述寡核苷酸链的5’端或3’端、或5’端和3’端。
  7. 根据权利要求6所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述突出为dTdT或dTdTdT或与靶基因上相应位置的核苷酸相同或互补。
  8. 根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述小激活核酸分子为连续的单链核酸，所述第一寡核苷酸链和所述第二寡核苷酸链位于所述的连续的单链核酸上且具有可形成双链结构的互补区域，使所述单链核酸中具有可形成双链区的发夹结构。
  9. 根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其特征在于，构成所述小激活核酸分子的核苷酸为天然的未经化学修饰的核苷酸。
  10. 根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述小激活核酸分子中的一个或多个核苷酸为经过化学修饰的核苷酸。
  11. 根据权利要求10所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述化学修饰选自以下修饰的一种或多种：对核苷酸的磷酸二酯键的修饰、对核苷酸中核糖的2’-OH的修饰、对核苷酸中碱基的修饰、核苷酸为锁核酸、及所述第一寡核苷酸链或所述第二寡核苷酸链的5’末端核苷酸的乙烯基膦酸酯修饰。
  12. 根据权利要求11所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述化学修饰选自以下修饰的一种或多种：硫代磷酸修饰、硼烷化磷酸盐修饰、2’-氟代修饰、2’-甲氧基修饰、2’-氧亚乙基甲氧基修饰、2,4’-二硝基苯酚修饰、锁核酸修饰、2’-氨基修饰、2’-脱氧修饰、5′-溴尿嘧啶修饰、5′-碘尿嘧啶修饰、N-甲基脲嘧啶修饰、及2,6-二氨基嘌呤修饰。
  13. 根据权利要求10所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述小激活核酸分子缀合以下化学基团中的一种或多种：脂质、脂肪酸、荧光基团、配体、糖类、高分子化合物、多肽、抗体、及胆固醇。
  14. 根据权利要求13所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述小激活核酸分子缀合的化学基团选自结构(A),(B),或(C)中的一种或一种以上：
    Figure PCTCN2022074637-appb-100001
    Figure PCTCN2022074637-appb-100002
  15. 根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述小激活核酸分子上调p21基因的表达至少10％、至少20％或至少30％。
  16. 根据权利要求1-4或10中任一项所述的小激活核酸分子，其特征在于，所述第一寡核苷酸链和所述第二寡核苷酸链分别如下列序列号所示：
    (1)SEQ ID NO：479和SEQ ID NO：480；
    (2)SEQ ID NO：481和SEQ ID NO：482；
    (3)SEQ ID NO：483和SEQ ID NO：484；
    (4)SEQ ID NO：485和SEQ ID NO：486；
    (5)SEQ ID NO：487和SEQ ID NO：488；
    (6)SEQ ID NO：489和SEQ ID NO：488；
    (7)SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62；
    (8)SEQ ID NO：496和SEQ ID NO：497；
    (9)SEQ ID NO：498和SEQ ID NO：499；
    (10)SEQ ID NO：498和SEQ ID NO：500；
    (11)SEQ ID NO：501和SEQ ID NO：499；
    (12)SEQ ID NO：501和SEQ ID NO：500；
    (13)SEQ ID NO：502和SEQ ID NO：503；
    (14)SEQ ID NO：504和SEQ ID NO：505；
    (15)SEQ ID NO：506和SEQ ID NO：507；
    (16)SEQ ID NO：508和SEQ ID NO：509；或
    (17)SEQ ID NO：510和SEQ ID NO：511。
  17. 一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1-4和16中任一项所 述的小激活核酸分子的片段。
  18. 根据权利要求17所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为表达载体。
  19. 一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1-4和16任一项所述的小激活核酸分子或权利要求17或18所述的核酸分子。
  20. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：权利要求1-4和16任一项所述的小激活核酸分子，或权利要求17或18所述的核酸分子，和任选地，药学上可接受的载体。
  21. 一种制剂，其特征在于，所述制剂包含权利要求1-4和16任一项所述的小激活核酸分子，或权利要求17或18所述的核酸分子，或权利要求19所述的细胞，或权利要求20所述的药物组合物。
  22. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-4和16任一项所述的小激活核酸分子，或权利要求17或18所述的核酸分子，或权利要求19所述的细胞，或权利要求20所述的药物组合物。
  23. 权利要求1-4和16任一项所述的小激活核酸分子，或权利要求17或18所述的核酸分子，或权利要求19所述的细胞，或权利要求20所述的药物组合物在制备用于激活或上调p21基因在细胞中的表达的药物或制剂中的用途。
  24. 根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述的用途为用于制备治疗或缓解增殖性玻璃体视网膜病变的药物或制剂。
  25. 一种治疗或缓解增殖性玻璃体视网膜病变的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的个体施用根据权利要求1-4和16任一项所述的小激活核酸分子，或权利要求17或18所述的核酸分子，或权利要求19所述的细胞，或权利要求20所述的药物组合物，或权利要求21所述的制剂。
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