JP2024506883A

JP2024506883A - 増殖硝子体網膜症を治療するための二重鎖核酸分子及びその使用

Info

Publication number: JP2024506883A
Application number: JP2023547508A
Authority: JP
Inventors: ロンチョンリ，; ムーリンカン，
Original assignee: ラクティゲンセラピューティクス
Priority date: 2021-02-07
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2024-02-15
Also published as: EP4289953A1; WO2022166815A1; CN116848245A

Abstract

【課題】本願は、二重鎖核酸分子、特に低分子活性化核酸分子、及び医薬品の調製における二重鎖核酸分子の使用、特に、増殖硝子体網膜症を治療又は緩和するための、ｐ２１遺伝子を活性化する医薬品の調製における使用を提供する。【解決手段】前記の低分子活性化核酸分子は、完全に相補する又は不完全に相補するように二重鎖構造を形成する第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖を含み、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ヒトｐ２１遺伝子プロモーター領域のいずれか一つの１６－３５個ヌクレオチド長さの連続フラグメントに対して少なくとも７５％の相同性又は相補性を有する。【選択図】なし

Description

本願は、生物医薬分野に関し、具体的に、遺伝子活性化に関連する二重鎖核酸分子（例えば低分子活性化核酸分子）、とサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（Ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ｐ２１）の遺伝子転写の活性化／アップレギュレーションにおける低分子活性化核酸分子の使用、及び関連する疾患の調節における作用、例えば増殖硝子体網膜症の治療又は関連する医薬品の調製における使用に関する。

増殖硝子体網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ、ＰＶＲ）は、眼疾患の一つで、裂孔原性網膜剥離や網膜剥離手術後の主な合併症である。裂孔原性網膜剥離の症例において、ＰＶＲの発生率は１０％にも及び、網膜剥離手術成功後の機能障害の主な原因である（ＳａｄａｍａａｎｄＧｉｕｌｉａｒｉ２０１２；Ｋｗｏｎ，Ｓｏｎｇ，ａｎｄＲｏｈ２０１６）。ＰＶＲは、細胞の遊走と増殖による網膜破裂または外傷後の網膜周囲膜の形成と、それに続く細胞膜の収縮と網膜の伸張による網膜剥離を特徴とする（Ｚａｎｄｉら、２０１９）。ＰＶＲに関与する主な細胞の種類は、網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ、ＲＰＥ）、グリア細胞（主にミュラー細胞）、と炎症細胞（マクロファージおよびリンパ球）である。ＲＰＥは、網膜の感覚神経に付着した色素細胞の層であり、ＰＶＲの増殖の主要な細胞である。ＲＰＥ細胞は、硝子体に入り、多数の細胞成長因子や炎症因子を露出させ、血液眼関門が破壊され、それによって上皮間葉転換、細胞の遊走と拡散、基底膜とコラーゲンの収縮などの一連の細胞プロセスを引き起こし、最終的に網膜症につながる（Ｍｕｄｈａｒ２０２０）。

ＰＶＲは身体損傷後の過剰な修復プロセスであり、まだ研究および治験段階にあるいくつかの薬剤は、抗増殖および抗代謝の観点からこれに介入しようとする。ＰＶＲの外科的治療には一定の効果があるが、それは罹患した過形成組織の切除に限定されており、ＰＶＲの発生を予防および治療することはできない。したがって、ＰＶＲの発生を予防および治療するための安全で効果的な薬を見つけることが研究のホットスポットとなる。

ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ファミリーの重要なメンバーであるｐ２１タンパク質をコードし、細胞周期の進行を阻害し、細胞老化を促進することで、腫瘍細胞やその他の細胞の良性増殖を阻害する（Ｆｉｌｌｉｅｓら、２００７；ＲｏｍａｎｏｖａｎｄＲｕｄｏｌｐｈ２０１６）。最近の研究では、ｐ２１の発現低下が、翼状片と網膜芽細胞腫などの眼の増殖性疾患と関連することが判明した（Ｕｅｄａら、２００１；Ａｕｄｏｅｔａｌ．２００３）；緑内障のウサギモデルにおいて、ｐ２１を発現する組換えアデノウイルスベクターを、結膜下に注射し、線維形成と創傷治癒が阻害されることが判明した（Ｈｅａｔｌｅｙら、２００４）。ｐ２１の過剰発現によりＰＶＲを介入または治療する可能性は、さらに引き出す必要がある。

本願は、ＲＮＡ活性化プロセスに基づく低分子活性化核酸分子、例えば低分子活性化ＲＮＡ（ｓｍａｌｌａｃｔｉｖａｔｉｎｇＲＮＡ，ｓａＲＮＡ）分子を提供し、それが、ｐ２１遺伝子の発現を活性化／アップレギュレートすることで、ｐ２１遺伝子の発現レベルと関連する疾患又は状態、例えば増殖硝子体網膜症を治療する。

本願の少なくとも一つの目標は、ＲＮＡ活性化プロセスに基づく低分子活性化核酸分子を提供し、それがｍｐ２１遺伝子の転写を活性化／アップレギュレートすることで、ｐ２１タンパク質の発現量を増加する；さらに、本願は、上記の低分子活性化核酸分子を含む組成物又は製剤を提供する。

本願のもう一つの目標は、細胞中のｐ２１遺伝子の発現を活性化／アップレギュレートする医薬品の調製におけるＲＮＡ活性化プロセスに基づく低分子活性化核酸分子又はそれを含む組成物の使用を提供する。

本願のもう一つの目標は、ｐ２１遺伝子の発現レベルに関連する疾患又は状態を治療する医薬品の調製におけるＲＮＡ活性化プロセスに基づく低分子活性化核酸分子の使用を提供し、さらに、前記のｐ２１遺伝子の発現レベルに関連する疾患又は状態は、増殖硝子体網膜症であっても良い。

本願のもう一つの目標は、ｐ２１遺伝子の細胞中の発現を活性化／アップレギュレートする方法、及び増殖硝子体網膜症を治療する方法を提供する。
本発明者らは、驚くべきことに、本願の低分子活性化核酸分子には、（１）ＧＣ含有量は、３５～６５％にある；（２）５個又はそれ以上の連続する同一ヌクレオチドを含まない；かつ（３）３個又はそれ以上のダブルリピートヌクレオチド又はトリプルリピートヌクレオチドを含まない場合、ｐ２１遺伝子発現の活性化活性をよりよく示すことができることを発見した。

また、ｐ２１遺伝子の発現を少なくとも１０％アップレギュレートすることができる機能性低分子活性化核酸分子の標的が、ｐ２１遺伝子のプロモーター領域に均一またはランダムに分布しておらず、凝集していることを発見したことも驚くべきことである。特定の実施形態では、少なくとも２５ｂｐの長さを有するいくつかの遺伝子のプロモーター領域は、機能性低分子活性化核酸分子の標的部位の凝集を示し、すなわち、これらの「ホットスポット」領域を標的とする低分子活性化核酸分子の少なくとも３０％は、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現を、１．１倍以上に誘導することができる；特に、他の実施形態では、注目されるホットスポットは、少なくとも３０ｂｐの長さを有する遺伝子のプロモーター領域であり、これらの領域は、機能性低分子活性化核酸分子の標的部位の凝集を示し、すなわち、これらのホットスポット領域を標的とする低分子活性化核酸分子の少なくとも６０％は、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を、１．５倍以上に誘導することができる。

当業者は、以下の詳細な説明から、本願の他の態様および利点を容易に認識することができる。以下の詳細な説明では、本願の例示的な実施形態のみが示される。当業者が理解するように、本願の内容により、当業者は、本願が関連する発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に変更を加えることができる。同様に、本出願の明細書における図面および説明は、限定的なものではなく、単なる例示的なものである。

本出願が関する本発明の特定の特徴は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本出願が関する本発明の特徴および利点は、以下に詳細に説明する例示的な実施形態および添付の図面を参照して、よりよく理解することができる。図面を、以下の通り簡単に説明する：

図１は、転写開始部位（ＴＳＳ）の１０００ｂｐ上流からＴＳＳの３ｂｐ下流までのｐ２１遺伝子プロモーターの配列、すなわちＳＥＱＩＤＮＯ：４６９を示す。ＴＳＳは曲線矢印で示される。

図２Ａ－２Ｂは、スクリーニングされたｐ２１遺伝子のプロモーターの低分子活性化ＲＮＡホットスポット領域を示す。図１に示すｐ２１プロモーター配列に合わせて、４３９個の二本鎖ＲＮＡ分子を設計・化学合成し、それぞれにＰＣ３細胞にトランスフェクトした。７２時間後、ｐ２１遺伝子のｍＲＮＡレベルを、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０法により分析した。図２Ａは、コントロール処理と比較した、それぞれ４３９個の二本鎖ＲＮＡ分子（Ｘ軸）によって引き起こされるｐ２１ｍＲＮＡレベルの変化倍数（Ｙ軸）を示す。Ｘ軸上の二本鎖ＲＮＡ分子は、ｐ２１遺伝子のＴＳＳに対する相対的な位置に従って（最上流のＲＡＧ－８９８から最下流のＲＡＧ－１７７まで）並べられる。図では、８つのホットスポット（ｈｏｔｓｐｏｔ）領域（明るい灰色の長方形枠）がマークされる。図２Ｂでは、各二本鎖ＲＮＡ分子によって誘導されるｐ２１ｍＲＮＡ発現の変化倍率に関して、図２Ａのデータは、低位から高位まで並べられる。図２Ａおよび２Ｂの破線は２倍の誘導を示す。

図３Ａ～３Ｄ、３Ｅ～３Ｈは、ｐ２１遺伝子に対する、低分子活性化ＲＮＡホットスポットの１～８の二本鎖ＲＮＡ分子の活性化作用を示す。

図４Ａ～４Ｂは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０の実験結果を検証するための、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によるｐ２１遺伝子のｍＲＮＡレベルの分析を示す。図４Ａでは、４３９個の二本鎖ＲＮＡ分子を、ｐ２１ｍＲＮＡ発現誘導活性に応じて４つの領域（グループ）に分け、各グループから５個の二本鎖ＲＮＡ分子をランダムに選択し、それぞれに１０ｎＭの濃度でＰＣ３細胞にトランスフェクトした。７２時間後、細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写後、ＲＴ－ｑＰＣＲ方法でｐ２１遺伝子ｍＲＮＡレベルを分析した。図４Ｂは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０（Ｘ軸）およびＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｙ軸）によって検出された二本鎖ＲＮＡ分子によって誘導されるｐ２１遺伝子の相対ｍＲＮＡレベルの相関性を示す。

図５は、代表的なｓａＲＮＡが網膜色素上皮細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡ発現を活性化することを示す。最終濃度１０ｎＭのｓａＲＮＡで、ＡＲＰＥ－１９細胞を７２時間トランスフェクトし、トランスフェクション後、各細胞サンプルにおけるｐ２１ｍＲＮＡの相対発現値を分析した。トランスフェクション完了後、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキットでＲＮＡを抽出し、逆転写後、ＡＢＩ７５００高速リアルタイムＰＣＲシステムを使用し、ｑＰＣＲ増幅を行い、同時に、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部参照として増幅した。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。

図６は、異なる濃度のｓａＲＮＡによる網膜色素上皮細胞のトランスフェクション後のｐ２１ｍＲＮＡ発現の活性化を示す。ＡＲＰＥ－１９細胞に、最終濃度１、５、１０、および５０ｎＭのｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３）を７２時間トランスフェクトし、トランスフェクション後、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキットでＲＮＡを抽出し、逆転写後、ＡＢＩ７５００高速リアルタイムＰＣＲシステムを使用し、ｑＰＣＲ増幅を行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部参照として増幅した。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。

図７Ａ－７Ｂは、異なる濃度のｓａＲＮＡによる網膜色素上皮細胞のトランスフェクション後のｐ２１タンパク質発現の活性化を示す。ＡＲＰＥ－１９細胞に最終濃度１、５、１０、５０ｎＭのｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３）を７２時間トランスフェクトし、細胞を回収し、全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットによりｐ２１タンパク質の発現レベルを検出し、同時に、チューブリン（α／β－Ｔｕｂｕｌｉｎ）を内部参照として検出した。図７Ａは、細胞を、異なる濃度のｓａＲＮＡで処理した後にウェスタンブロットによって検出されたバンドの結果を示し、図７Ｂは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用し、図７Ａのバンドを定量分析した後のｐ２１タンパク質発現値を示す。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。

図８Ａ～８Ｂは、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－４０－５３が、異なる濃度で網膜色素上皮細胞の生長を阻害することを示す。ＡＲＰＥ－１９細胞に、最終濃度０．０１～５０ｎＭのｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３）をトランスフェクトし、細胞の生長を５０％ＴＣＡで固定し、乾燥し、実験を７日間わたって、毎日同じ時間に同じ処理を実行し、７日後、すべてのサンプルをＳＲＢで均一に染色し、細胞の生長・増殖を５６０ｎｍでマイクロプレートリーダーで検出し、０日目を細胞生長の基準値とした。図８Ａは、異なる濃度のｓａＲＮＡで細胞を処理した７日後、ブランクコントロールと比較した細胞の相対増殖パーセンテージである。図８Ｂは、異なる濃度のｓａＲＮＡで細胞を処理した７日後、処理前と比較した細胞の相対増殖パーセンテージである。

図９は、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－４０－５３による処理が網膜色素上皮細胞のアポトーシスを誘導しないことを示す。ＡＲＰＥ－１９細胞を、最終濃度１、５、１０、および５０ｎＭのｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３）で４８時間トランスフェクトし、トランスフェクション後に遠心分離によって細胞を収集した。２×１０⁵細胞を含む遠心管に、ＦＩＴＣＡｎｎｅｘｉｎＶおよびＰＩ試薬をそれぞれ５μＬ加え、暗所、室温で１５分間インキュベートし、フローサイトメーターを使用して初期および後期の細胞アポトーシスを検出した。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。

図１０Ａ－１０Ｂは、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－４０－５３による処理が網膜色素上皮細胞の遊走を抑制することを示す。０時間処理として、ＡＲＰＥ－１９細胞を壁に接着した後に、引っかき傷を付けて写真撮影し、その後、細胞を、ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３、１０ｎＭ）およびＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、２４時間後に傷の写真を撮影し、細胞遊走をＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析した。図１０Ａは、異なる処理によるトランスフェクションの２４時間後に撮影された細胞遊走の写真である；図１０Ｂは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで、図１０Ａの各グループにおける細胞遊走の相対面積の統計である。コントロールは、ブランクトランスフェクションである。

図１１は、ＡＲＰＥ－１９細胞にセルフトランスフェクトされたコレステロール結合ｓａＲＮＡが、ＡＲＰＥ－１９細胞の増殖を阻害することを示す。ＡＲＰＥ－１９細胞を、トランスフェクション試薬を使用せずに自己送達形式で、最終濃度０．０１～３μＭのｓａＲＮＡＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１で処理した。ｓａＲＮＡ処理の５日後、１００μＬを含む９６ウェルプレートにＣＣＫ８試薬１０μＬを加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍで細胞の増殖を検出した。

図１２Ａ～１２Ｂは、ウサギモデルにおけるｓａＲＮＡの薬物動態研究を示す。１５匹の雌ウサギをランダムに３つのグループに分け、１匹を生理食塩水コントロールグループに、７匹を各投与グループに分けた。ｓａＲＮＡＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１を、それぞれ０．１ｍｇおよび０．３ｍｇの用量で、５０μＬの注射体積でウサギの目の硝子体に注射し、それぞれに４時間後、１日、２日、４日、８日、１４日および２１日後にサンプルを採取し、ウサギの硝子体および網膜中のｓａＲＮＡＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１の含有量を検出した。図１２Ａは、投与後の異なる時点における硝子体および網膜におけるｓａＲＮＡの含有量の変化である；図１２Ｂは、投与後の異なる時点におけるウサギの眼におけるｓａＲＮＡ含有量の変化である。

図１３は、ウサギモデルにおける薬力学的研究を示す。１９匹の雌ウサギをランダムに８グループに分け、各グループに１～４匹のウサギがいる。ｓａＲＮＡＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１を、それぞれ０．０３、０．１、０．２４、０．３、１ｍｇの総用量でウサギの眼の硝子体に注射し、注射体積はいずれも１００μＬで、３日後に、ウサギ硝子体におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を検出した。ＲＡＧ１－４０－５３－Ｓｃｒ－Ｃ１（総注射量０．３および１ｍｇ）を無関係な配列コントロールとして使用し、生理食塩水をブランクコントロールとして使用した。

図１４は、ヒトＫｕ－７－ＬＧ細胞への異なるｓａＲＮＡのトランスフェクション後のｐ２１ｍＲＮＡの発現レベルを示す。最終濃度１０ｎＭの複数のｓａＲＮＡで、Ｋｕ－７－ＬＧ細胞を７２時間トランスフェクトし、トランスフェクション後、各細胞サンプルにおけるｐ２１ｍＲＮＡの相対発現値を分析した。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。

図１５Ａ～１５Ｃは、化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４を、網膜色素上皮細胞ＡＰＲＥ－１９にトランスフェクトした後、異なる時点でのｐ２１ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルを示す。最終濃度２５ｎＭのｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４で、ＡＲＰＥ－１９細胞を７２時間トランスフェクトし、トランスフェクション後、各細胞サンプルにおけるｐ２１ｍＲＮＡとタンパク質（図１５Ｂと図１５Ｃ）の発現値を分析した。図１５Ａは、化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４を、網膜色素上皮細胞ＡＰＲＥ－１９にトランスフェクトした後のｐ２１ｍＲＮＡの発現レベルであり、図１５Ｂ～１５Ｃは、化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４を、網膜色素上皮細胞ＡＰＲＥ－１９にトランスフェクトした後のｐ２１のタンパク質発現レベルである。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。

図１６Ａ～１６Ｃは、異なる濃度の化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４を、網膜色素上皮細胞にトランスフェクトした後、異なる時点でのｐ２１ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルを示す。最終濃度１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８、０．３９、０．２および０．１ｎＭのｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４で、ＡＲＰＥ－１９細胞を７２時間トランスフェクトし、トランスフェクション後、各細胞サンプルにおけるｐ２１ｍＲＮＡとタンパク質の発現値を分析した。図１６Ａは、異なる濃度の化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４を、網膜色素上皮細胞にトランスフェクトした後のｐ２１ｍＲＮＡの発現値であり、図１６Ｂは、異なる濃度の化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４を、網膜色素上皮細胞にトランスフェクトした後のｐ２１のタンパク質発現値である。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。

図１７Ａ～１７Ｂは、ウサギモデルにおける化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４－Ｃ３（３’）の薬物動態研究を示す。４匹の雌ウサギをランダムに２グループに分け、各グループに２匹のウサギがいる。ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）を、それぞれ０．１ｍｇおよび０．３ｍｇの用量で、ウサギの目の硝子体に注射し、注射後の０、０．１７、１、３、７および１４日目に、ウサギの硝子体、血漿および網膜におけるｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）の含有量の変化を、ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐＰＣＲ法によって検出した。図１７Ａは、低用量投与後の異なる時点における硝子体、血漿および網膜におけるｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）含有量の変化である；図１７Ｂは、高用量投与後の異なる時点における硝子体、血漿および網膜におけるｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）含有量の変化である。

図１８は、ウサギモデルにおける薬力学的研究を示す。９匹の雌ウサギをランダムに４グループに分け、各グループに２～３匹のウサギがいる。ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）を、それぞれ０．３ｍｇの用量でウサギの眼の硝子体に注射し、注射体積はいずれも０．５ｍＬで、注射の３日と７日後に、それぞれに、ウサギ硝子体におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を検出した。生理食塩水をブランクコントロールとして使用した。

図１９は、異なる濃度の化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖで、ＡＲＰＥ－１９細胞をトランスフェクトした後のｐ２１ｍＲＮＡの発現レベルを示す。最終濃度３、１０と３０ｎＭのｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖで、ＡＲＰＥ－１９細胞を７２時間トランスフェクトし、トランスフェクション後、各細胞サンプルにおけるｐ２１ｍＲＮＡの発現値を分析した。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。

図２０Ａ～２０Ｂは、化学修飾されたｓａＲＮＡでトランスフェクトされたＡＲＰＥ－１９細胞の生長およびアポトーシスのレベルを示す。図２０Ａは、最終濃度３、１０および３０ｎＭで、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖを７２時間トランスフェクトしたＡＲＰＥ－１９細胞の生長・増殖割合である。図２０Ｂは、最終濃度３、１０および３０ｎＭで、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖを７２時間トランスフェクトしたＡＲＰＥ－１９細胞のＣａｓｐａｓｅ３／７の活性である。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。

図２１Ａ～２１Ｂは、異なる化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０、ＲＡＧ１－ＯＭ４ｖ、およびＲＡＧ１－ＯＭ４ｖ－Ｃ３（３’）をトランスフェクトしたＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現およびアポトーシスのレベルを示す。最終濃度１０ｎＭのｓａＲＮＡＲＡＧ１－０、ＲＡＧ１－０Ｍ４ｖとＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）で、ＡＲＰＥ－１９細胞を７２時間トランスフェクトし、トランスフェクション後、各細胞サンプルにおけるｐ２１ｍＲＮＡの発現とＣａｓｐａｓｅ３／７の活性を分析した。図２１Ａは、異なる化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０、ＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ、およびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）を網膜色素上皮細胞にトランスフェクトした後のｐ２１ｍＲＮＡの発現値であり、図２１Ｂは、異なる化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０、ＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）を網膜色素上皮細胞にトランスフェクトした後のＣａｓｐａｓｅ３／７の活性である。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。

図２２Ａ－２２Ｃは、異なる濃度の化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）で、ＡＲＰＥ－１９細胞をトランスフェクトした後のｐ２１ｍＲＮＡとタンパク質の発現レベルを示す。最終濃度１００、３３．３、１１．１、３．７、１．２、０．４１２、０．１３７、０．０４６、０．０１５、０．００５および０．００２ｎＭのｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４で、ＡＲＰＥ－１９細胞を７２時間トランスフェクトし、トランスフェクション後、各細胞サンプルにおけるｐ２１ｍＲＮＡとタンパク質の発現値を分析した。図２２Ａは、異なる濃度の化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）を、網膜色素上皮細胞にトランスフェクトした後のｐ２１ｍＲＮＡの発現レベルであり、図２２Ｂ－２２Ｃは、異なる濃度の化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）を、網膜色素上皮細胞にトランスフェクトした後のｐ２１のタンパク質の発現レベルである。コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。

図２３Ａ～２３Ｃは、異なる濃度の化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖとＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）で末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をトランスフェクトした後の培地中の様々な炎症因子のレベルを示す。１３３ｎＭでｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）をＰＢＭＣ細胞にトランスフェクトした２４時間後のＩＬ－６、ＩＦＮ－α、およびＴＮＦ－α炎症因子の含有量。図２３Ａは、異なる濃度の化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－ＯＭ４ｖ－Ｃ３（３’）をトランスフェクトしたＰＢＭＣ細胞のＩＬ－６炎症因子のレベルであり、図２３Ｂは、異なる濃度の化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）をトランスフェクトしたＰＢＭＣ細胞のＩＦＮ－α炎症因子のレベルであり、図２３Ｃは、異なる濃度の化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）をトランスフェクトしたＰＢＭＣ細胞のＴＮＦ－α炎症因子のレベルである。ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＲＡＧ－ＩＳ－１を、ポジティブコントロールグループとし、未処理とは、トランスフェクション試薬が添加されず、ＰＢＭＣ細胞と培地のみが添加されたことを意味する。コントロールとｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションと無関係な配列二本鎖ＲＮＡトランスフェクションでした。縦軸の値は、２回の反復処理の平均値±ＳＤを表す。

図２４は、ウサギモデルにおける薬力学的研究を示す。９匹の雌ウサギをランダムに４グループに分け、各グループに２匹のウサギがいる。ａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖとＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）を、２×１０⁶ＡＲＰＥ－１９ｃｅｌｌｓ／０．０５ｍＬと混合した後、それぞれ０．３ｍｇの用量でウサギの眼の硝子体に注射し、注射体積はいずれも０．５ｍＬで、注射の３日後に、それぞれに、ウサギ硝子体におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を検出した。生理食塩水をブランクコントロールとし、コントロールおよびｄｓＣｏｎ２は、それぞれブランクトランスフェクションおよび無関係な配列を含む二本鎖ＲＮＡトランスフェクションである。

本願発明の実施形態は、以下の特定の具体的な実施例で説明されるが、当業者は、本明細書に開示された内容から、本願発明の他の利点および効果を容易に理解することができる。

本願の一つの様態では、低分子活性化核酸分子、例えば低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）分子を提供し、それが、細胞中のｐ２１遺伝子の発現を活性化あるいはアップレギュレートし、前記の低分子活性化核酸分子は、完全に相補する又は不完全に相補するように二重鎖構造を形成する第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖を含み、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ヒトｐ２１遺伝子プロモーター領域のいずれか一つの１６－３５個ヌクレオチド長さの連続フラグメントに対して少なくとも７５％の相同性又は相補性を有し、ただし、前記の低分子活性化核酸分子には、（１）ＧＣ含有量は、３５～６５％にある；（２）５個又はそれ以上の連続する同一ヌクレオチドを含まない；かつ（３）３個又はそれ以上のダブルリピートヌクレオチド又はトリプルリピートヌクレオチドを含まない。ある実施形態において、前記のｐ２１遺伝子プロモーター領域は、任意的に、ｐ２１遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）から、その上流の１０００個ヌクレオチドまでの領域（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９）である。ある実施形態において、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ｐ２１遺伝子の転写開始部位からその上流の１０００個ヌクレオチドまでの領域（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９）中のいずれか一つの１６－３５個ヌクレオチド長さの連続フラグメントに対して、少なくとも７５％の相同性又は相補性を有する。

ある実施形態において、前記の低分子活性化核酸分子の第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、６、７、８、９、１０、１１、１２からのいずれか一つの配列の任意的に連続する１６－３５個ヌクレオチドのフラグメントに対して、少なくとも７５％の相同性又は相補性を有する。ある実施形態において、前記の少なくとも７５％の相同性又は相補性は、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖が、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、６、７、８、９、１０、１１、１２からのいずれか一つの配列中の任意的に連続する１６－３５個ヌクレオチドのフラグメントと３個、２個又は１個だけの不相同又はミスマッチのヌクレオチドを有することに反映される。ある実施形態において、前記の不相同又はミスマッチのヌクレオチドは、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖の両端にあり、あるいは中央のヌクレオチド位置から０－３個ヌクレオチド離れた位置にある。

ある実施形態において、前記の低分子活性化核酸分子の第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３－３０、３５－４６、５９－６２、６７－７４、７７－８０、８５－９６、１０３－１０８、１１１－１１８、１２１－１３２、１３９－１４０、１４７－１８０、１８５－１８６、１８９－１９０、１９５－１９８、２０１－２０２、２０９－２１２、２１５－２１８、２２５－２４０、２４３－２４６、２４９－２５８、２６１－２６２、２６５－２７０、２７５－２８０、２８３－３００、３０３－３０８、３１７－３２０、３２３－３２４、３２９－３４８、３５１－３５２、３５７－３５８、３６１－３６６、３７１－３９２、３９９－４００、４０５－４１２、４１５－４１６、４１９－４２４、４２９－４３２、４３９－４４２、４４７－４５０、４５３－４５８、４６３－４６８、４７９－４８６から選ばれるいずれか一つの配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相補性又は相同性を有する。ある実施形態において、前記の少なくとも７５％の相同性又は相補性は、３個、２個又は１個だけの不相同又はミスマッチのヌクレオチドを有することに反映される。ある実施形態において、前記の不相同又はミスマッチのヌクレオチドは、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖の両端にあり、あるいは中央のヌクレオチド位置から０－３個ヌクレオチド離れた位置にある。

ある実施形態において、前記の低分子活性化核酸分子の第一のオリゴヌクレオチド鎖又は第二のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３－３０、３５－４６、５９－６２、６７－７４、７７－８０、８５－９６、１０３－１０８、１１１－１１８、１２１－１３２、１３９－１４０、１４７－１８０、１８５－１８６、１８９－１９０、１９５－１９８、２０１－２０２、２０９－２１２、２１５－２１８、２２５－２４０、２４３－２４６、２４９－２５８、２６１－２６２、２６５－２７０、２７５－２８０、２８３－３００、３０３－３０８、３１７－３２０、３２３－３２４、３２９－３４８、３５１－３５２、３５７－３５８、３６１－３６６、３７１－３９２、３９９－４００、４０５－４１２、４１５－４１６、４１９－４２４、４２９－４３２、４３９－４４２、４４７－４５０、４５３－４５８、４６３－４６８、４７９－４８６のいずれか一つのヌクレオチド配列と完全相同又は完全相補的であるか、又は、１～２個の塩基の不相同又はミスマッチを有する。

ある実施形態において、本願の低分子活性化核酸分子は、二重鎖核酸であり、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖と前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖は、それぞれに、前記の二重鎖核酸の２本の鎖に位置する。二重鎖核酸とは、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖と前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖が、相補することで、二重鎖核酸構造を形成できることを指す。

本願の低分子活性化核酸分子の第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖は、２つの異なるオリゴヌクレオチド鎖上に存在してもよいし、同一のオリゴヌクレオチド鎖上に存在してもよい。第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖が、それぞれ２本の鎖上に位置する場合、低分子活性化核酸分子の少なくとも１つの鎖は、５’末端および／または３’末端に突出（またはオーバーハングと呼ばれる）を有してもよく、例えば、３’末端に０～６個ヌクレオチドの突出、例えば０、１、２、３、４、５または６個ヌクレオチドの突出があってもよい。ある実施形態において、本願の低分子活性化核酸分子の２本の鎖は、いずれも突出を有する。他の実施形態において、低分子活性化核酸分子の２本の鎖の３’末端は、いずれも０－６個ヌクレオチドの突出を有してもよい；例えば、０、１、２、３、４、５又は６個ヌクレオチドの突出を有する；任意的に、２個又は３個ヌクレオチドの突出を有する。ある実施形態において、前記の突出のヌクレオチドのタイプは、ｄＴ（チミンデオキシヌクレオチド、、またはＴと表記する）であっても良い。ある実施形態において、５’末端および／または３’末端の突出は、ｄＴｄＴまたはｄＴｄＴｄＴであっても良く、または標的遺伝子上の対応する位置のヌクレオチドと同一または相補的であっても良い。

本願の低分子活性化核酸分子の第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖が同一のオリゴヌクレオチド鎖上に存在する場合、本願の低分子活性化核酸分子は、連続する一本鎖核酸であり、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖は、前記の連続する一本鎖核酸上に位置し、かつ二本鎖構造を形成し得る相補的領域を有し、そして、前記の一本鎖核酸は二本鎖領域を形成できるヘアピン構造を持つことができる。ある実施形態において、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド構造は、例えばＲＮＡ活性化機構を通じて細胞内のｐ２１遺伝子の発現を促進することができる。

上記の低分子活性化核酸分子には、第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖の長さは、それぞれに１６－３５個ヌクレオチド、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５個ヌクレオチドであっても良い。前記の低分子活性化核酸分子の第一のオリゴヌクレオチド鎖の長さは、第二のオリゴヌクレオチド鎖の長さと同じであっても異なっていてもよい。

ある実施形態において、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖配列中の少なくとも１５個ヌクレオチド長さの配列は、前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖と塩基相補になる。例えば、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖又は第二のオリゴヌクレオチド鎖における標的遺伝子プロモーター配列とマッチするヌクレオチド配列の長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個ヌクレオチドであっても良い。ある実施形態において、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖は、前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相補性を有しても良い。ある実施形態において、前記の相補性は、３個、２個又は１個だけのミスマッチのヌクレオチドを有することに反映される。ある実施形態において、前記のミスマッチのヌクレオチドは、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖又は第二のオリゴヌクレオチド鎖の３’あるいは５’末端あるいは両端にあり、あるいは中央のヌクレオチド位置から０－３個ヌクレオチド離れた位置にある。ある実施形態において、前記のミスマッチのヌクレオチドは、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖又は第二のオリゴヌクレオチド鎖の３’あるいは５’末端にあり、もう一つの末端は平滑末端あるいは１－３個の突出を有しても良い。

ある実施形態において、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖の３’又は５’領域と標的遺伝子プロモーター配列のコード鎖又はテンプレート鎖との間に、少なくとも１個ヌクレオチドのミスマッチ、例えば、１、２、３又は４個のミスマッチが存在しても良い。ある実施形態において、前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖の３’又は５’領域と標的遺伝子プロモーター配列のコード鎖又はテンプレート鎖との間に、少なくとも１個ヌクレオチドのミスマッチ、例えば、１、２、３又は４個のミスマッチが存在しても良い。ある実施形態において、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端ヌクレオチドと標的遺伝子プロモーター配列のコード鎖又はテンプレート鎖の対応位置の間に、１個ヌクレオチドのミスマッチが存在しても良い。ある実施形態において、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチドと標的遺伝子プロモーター配列のコード鎖又はテンプレート鎖の対応位置の間に、１個ヌクレオチドのミスマッチが存在しても良い。

本願に記載される低分子活性化核酸分子中のヌクレオチドは、天然の化学修飾されないヌクレオチドであってもよく、または１つ又は複数の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。ある実施形態において、本願に記載される低分子活性化核酸分子におけるヌクレオチドの修飾は、一つ又は複数の化学修飾を含んでもよく、例えば、一つのオリゴヌクレオチド鎖の両端または２つの末端の間に、少なくとも１つのヌクレオチドが、化学修飾を有することにしても良い。本出願で主張・使用される化学修飾は、以下の修飾の１つまたはそれらの２つ以上の任意の組み合わせが含まれるか、またはそこから選択されてもよい：
（１）ヌクレオチドのホスホジエステル結合の修飾；
（２）ヌクレオチドのリボースの２’－ＯＨの修飾；
（３）ヌクレオチドの塩基の修飾；
（４）ヌクレオチドは、ロックド核酸である；及び
（５）前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖と／又は前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端のヌクレオチドは、ビニルホスホネート修飾（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）である。

前記の化学修飾は、当該技術分野で一般的に用いられるヌクレオチド修飾法を採用する。例えば、前記のホスホジエステル結合の修飾の１つは、ホスホジエステル結合中の酸素を修飾することであり、ホスホロチオエート修飾またはボラノホスフェート修飾を含むが、これらに限定されない。どちらの修飾も、ｓａＲＮＡの構造を安定化し、塩基対の高い特異性と高い親和性を維持することに寄与する。リボース修飾とは、ヌクレオチドペントースの２’－ＯＨの修飾を指し、たとえば、リボースのヒドロキシル位置に特定の置換基を導入することであり、例としては、２’－フロロ修飾、２’－メトキシ修飾、２’－オキシエチレンメトキシ修飾、２，４’－ジニトロフェノール修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、２’－アミノ修飾、２’－デオキシ修飾などが挙げられるが、これらに限定されない。塩基修飾とは、ヌクレオチドの塩基の修飾を指し、例えば、５’－ブロモウラシル修飾、５’－ヨードウラシル修飾、Ｎ－メチルウラシル修飾、２，６－ジアミノプリン修飾など。前記の修飾は、リボースの２’－ＯＨが２’－Ｈに置換されること、または化学修飾されたヌクレオチドが、リボ核酸（ＲＮＡ）からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に変化することであっても良い。前記の修飾は、任意のヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）であっても良い。または、例えば、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖と／又は前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端のヌクレオチドは、ビニルホスホネート修飾（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）である。これらの修飾は、低分子活性化核酸分子のバイオアベイラビリティを高め、標的配列に対する親和性を高め、または細胞内でのヌクレアーゼ加水分解に対する耐性を高めることができる。

ある実施形態において、本願に記載される低分子活性化核酸分子の前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖または第二のオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含んでも良い。前記の化学修飾は、ヌクレオチド中のリボース２’－ＯＨの化学修飾であってもよく、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の化学修飾であってもよく、ヌクレオチド中の塩基の化学修飾であってもよく、または任意のヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）によって置換されてもよく、またはオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに対してビニルホスホネート修飾が行われてもよい。ある実施形態において、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖又は第二のオリゴヌクレオチド鎖は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、あるいは以上の化学修飾されたヌクレオチドを含んでも良い。ある実施形態において、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖又は第二のオリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、あるいは１００％の化学修飾されたヌクレオチドを含んでも良い。ある実施形態において、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖又は第二のオリゴヌクレオチド鎖を構成する全てのヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドであっても良い。

此外、ある実施形態において、本願に記載される低分子活性化核酸分子は、以下の組み合わせの１つまたは複数の基と複合しても良い：脂質、脂肪酸、蛍光基、リガンド、糖類、高分子化合物、ポリペプチド、抗体、及びコレステロール。前記の基と複合することは、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖または第二のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端にあっても良く、または３’末端と５’末端との間にあっても良い。ある実施形態において、本願の低分子活性化ＲＮＡのの前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖または第二のオリゴヌクレオチド鎖は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端に位置する少なくとも１つの脂質基と複合しても良い。ある実施形態において、前記の脂質基は、脂肪酸アシル（ｆａｔｔｙａｃｙｌ）、カチオン性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃｌｉｐｉｄ）、アニオン性脂質（ａｎｉｏｎｉｃｌｉｐｉｄ）、イオン化可能脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅｌｉｐｉｄ）、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、グリセロ脂質（ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄ）、グリセロリン脂質（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、ステロール脂質（ｓｔｅｒｏｌｌｉｐｉｄ）、スフィンゴール脂質（ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）、プレノール脂質（ｐｒｅｎｏｌｌｉｐｉｄ）、およびポリケチド（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）の１つまたは複数から選択される。ある実施形態において、本願の低分子活性化核酸分子の前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖または第二のオリゴヌクレオチド鎖は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端に位置する少なくとも１つのコレステロール基と複合しても良い。ある実施形態において、本願の低分子活性化核酸分子の前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖または第二のオリゴヌクレオチド鎖は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端または５’末端に位置する少なくとも１つの糖類基と複合しても良い。前記の糖類基は、例えばＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）と他の好適な糖類基を含む。ある実施形態において、１つまたは複数の基との複合により、本願の低分子活性化核酸分子が、特定の器官、組織または細胞へのより良好な送達能力を示す、また、本願の低分子活性化核酸分子が、所望の薬学的特性、例えば、薬物動態（ｐＫ）、薬力学（ｐＤ）、毒性（ｔｏｘｉｃｉｔｙ）、および外因性化学物質に対する身体の吸収（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、分布（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、代謝（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）および排泄（ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ）の特性などを有することが可能になる。

低分子活性化核酸分子の細胞への進入を促進するために、ある実施形態において、以上の修飾に基づき、低分子活性化核酸分子の第一のオリゴヌクレオチド鎖および／または第二のオリゴヌクレオチド鎖の末端に、親油性基を導入し、脂質二重層から構成される細胞膜および核膜を介した核内の遺伝子プロモーター領域との相互作用を促進することができる。ある実施形態において、前記の低分子活性化核酸分子の複合される化学基は、構造（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）の１つまたは複数から選択することができる：

本願に提供される低分子活性化核酸分子は、細胞と接触した後、または細胞に導入された後、細胞内のＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）遺伝子の発現を効果的に活性化又はアップレギュレートできる。ある実施形態において、前記の低分子活性化核酸分子が、ｐ２１遺伝子の発現を、少なくとも１０％、少なくとも２０％又は少なくとも３０％アップレギュレートできる。体外細胞トランスフェクション試験を経て、本発明者らは、驚くべきことに、本願の低分子活性化核酸分子には、（１）ＧＣ含有量は、３５～６５％にある；（２）５個又はそれ以上の連続する同一ヌクレオチドを含まない；かつ（３）３個又はそれ以上のダブルリピートヌクレオチド又はトリプルリピートヌクレオチドを含まない場合、ｐ２１遺伝子発現の活性化活性をよりよく示すことができることが発見した。例えば、具体的な実施形態の一つとして、低分子活性化核酸分子の第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖の配列は、配列表のＳＥＱＩＤＮＯ：１７～ＳＥＱＩＤＮＯ：４６８に示される配列から選ばれる。または、例えば、他の実施形態として、低分子活性化核酸分子の第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖の配列は、表４に示される配列から選ばれ、（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：４７９とＳＥＱＩＤＮＯ：４８０；（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４８１とＳＥＱＩＤＮＯ：４８２；（３）ＳＥＱＩＤＮＯ：４８３とＳＥＱＩＤＮＯ：４８４；（４）ＳＥＱＩＤＮＯ：４８５とＳＥＱＩＤＮＯ：４８６；（５）ＳＥＱＩＤＮＯ：４８７とＳＥＱＩＤＮＯ：４８８；（６）ＳＥＱＩＤＮＯ：４８９とＳＥＱＩＤＮＯ：４８８；（７）ＳＥＱＩＤＮＯ：６１とＳＥＱＩＤＮＯ：６２；（８）ＳＥＱＩＤＮＯ：４９６とＳＥＱＩＤＮＯ：４９７；（９）ＳＥＱＩＤＮＯ：４９８とＳＥＱＩＤＮＯ：４９９；（１０）ＳＥＱＩＤＮＯ：４９８とＳＥＱＩＤＮＯ：５００；（１１）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０１とＳＥＱＩＤＮＯ：４９９；（１２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０１とＳＥＱＩＤＮＯ：５００；（１３）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０２とＳＥＱＩＤＮＯ：５０３；（１４）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０４とＳＥＱＩＤＮＯ：５０５；（１５）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０６とＳＥＱＩＤＮＯ：５０７；（１６）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０８とＳＥＱＩＤＮＯ：５０９；又は（１７）ＳＥＱＩＤＮＯ：５１０とＳＥＱＩＤＮＯ：５１１を含む。

また、ｐ２１遺伝子の発現を少なくとも１０％アップレギュレートすることができる機能性低分子活性化核酸分子の標的が、ｐ２１遺伝子のプロモーター領域に均一またはランダムに分布しておらず、凝集していることを発見したことも驚くべきことである。特定の実施形態では、少なくとも２５ｂｐの長さを有するいくつかの遺伝子のプロモーター領域は、機能性低分子活性化核酸分子の標的の凝集を示してもよく、すなわち、これらの「ホットスポット」領域を標的とする低分子活性化核酸分子の少なくとも３０％は、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現を、１．１倍以上に誘導することができる；特に、他の実施形態では、注目されるホットスポットは、少なくとも３０ｂｐの長さを有する遺伝子のプロモーター領域であっても良く、これらの領域は、機能性低分子活性化核酸分子の標的の凝集を示し、すなわち、これらのホットスポット領域を標的とする低分子活性化核酸分子の少なくとも６０％は、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を、１．５倍以上に誘導することができる。

これらのホットスポット領域は、Ｈ１～Ｈ８を含む。ただし、第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ｐ２１遺伝子プロモーター中の転写開始部位からの－８９３～－８０１領域（領域Ｈ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、－７１７～－６３２領域（領域Ｈ２，ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、－５８５～－５５１領域（領域Ｈ３，ＳＥＱＩＤＮＯ：７）、－５５４～－５０４領域（領域Ｈ４，ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、－５１４～－４８５領域（領域Ｈ５、ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、－４４２～－４０５領域（領域Ｈ６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、－３５２～－３１３領域（領域Ｈ７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）、－３２５～－２６０領域（領域Ｈ８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）中の連続する１６－３５個ヌクレオチドに対して、少なくとも７５％、例えば少なくとも約７９％、約８０％、約８５％、約９０％、９５％、約９９％、又は約１００％の相同性又は相補性を有しても良い。より具体的に、第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３－４６８のいずれか一つのヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、例えば少なくとも約７９％、約８０、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、又は約１００％の相同性又は相補性を有する。

本願のもう一つの様態では、単離されたｐ２１遺伝子低分子活性化核酸分子の標的部位配列を提供し、ただし、前記の標的部位配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５－１２のいずれか一つの配列上の任意的に連続する１６－３５個ヌクレオチドの配列、又は、上記の任意的に連続する１６－３５個ヌクレオチドからなる配列に対して少なくとも７５％、例えば少なくとも約７９％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む。ある実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３－３０、３５－４６、５９－６２、６７－７４、７７－８０、８５－９６、１０３－１０８、１１１－１１８、１２１－１３２、１３９－１４０、１４７－１８０、１８５－１８６、１８９－１９０、１９５－１９８、２０１－２０２、２０９－２１２、２１５－２１８、２２５－２４０、２４３－２４６、２４９－２５８、２６１－２６２、２６５－２７０、２７５－２８０、２８３－３００、３０３－３０８、３１７－３２０、３２３－３２４、３２９－３４８、３５１－３５２、３５７－３５８、３６１－３６６、３７１－３９２、３９９－４００、４０５－４１２、４１５－４１６、４１９－４２４、４２９－４３２、４３９－４４２、４４７－４５０、４５３－４５８、４６３－４６８、４７９－４８９から選ばれるいずれか一つのヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、例えば少なくとも約７９％、約８０、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、又は約１００％の相同性又は相補性を有する。ある実施形態において、前記の相同性又は相補性とは、２つのオリゴヌクレオチド配列が同一または相補的であるか、または１～２個の塩基の不相同又はミスマッチを有することを指す。

本願の低分子活性化核酸分子は、人工的に合成されたもの、ｉｎｖｉｔｒｏ転写されたもの、またはベクターによって発現されたものであってもよい。

本願のもう一つの様態では、本願に記載される低分子活性化核酸分子をコードする核酸分子に関する。ある実施形態において、前記の核酸分子は、ＤＮＡ分子であっても良い。ある実施形態において、前記の核酸分子は、発現ベクターであっても良い。ある実施形態において、当該発現ベクターは、本願に記載される低分子活性化核酸分子をコードするフラグメントを含んでも良く、当該発現ベクターを細胞に導入した後、本願に記載される低分子活性化核酸分子を発現することができる。
本願のもう一つの様態では、前記の低分子活性化核酸分子又は前記の低分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む細胞を提供する。ある実施形態において、前記の低分子活性化核酸分子は、ｐ２１遺伝子プロモーター領域を標的とする二重鎖低分子活性化核酸分子、例えば二重鎖低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）分子であっても良く、それが、第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖を含む。他の実施形態において、前記の低分子活性化核酸分子は、ｐ２１遺伝子プロモーター領域を標的とする一本鎖低分子活性化核酸分子、例えば二重鎖低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）分子であっても良い。

本願のもう一つの様態では、組成物（例えば医薬品組成物）を提供し、当該組成物は、本願に記載される低分子活性化核酸分子又は本願に記載される低分子活性化核酸分子をコードする核酸分子、と任意の、薬学のに許容される担体を含む。ある実施形態において、前記の薬学のに許容される担体は、リポソーム、高分子ポリマー又はポリペプチドを含み、又はこれらから選ばれる。

任意的に、前記の医薬品組成物は、ｐ２１遺伝子を標的とする医薬品組成物であっても良く、ｐ２１遺伝子を標的とする低分子活性化核酸分子、本願に記載される低分子活性化核酸分子をコードする核酸分子、と任意の、薬学のに許容される担体を含んでも良い。任意的に、前記の製剤は、ｐ２１遺伝子を標的とする製剤であり、前記のｐ２１遺伝子を標的とする低分子活性化核酸分子、本願に記載される低分子活性化核酸分子をコードする核酸分子、細胞、又は医薬品組成物を含む。任意的に、前記のキットは、前記のｐ２１遺伝子を標的とする低分子活性化核酸分子、前記に記載される低分子活性化核酸分子をコードする核酸分子、細胞、医薬品組成物、又は製剤を含む。

本願に記載される薬学のに許容される担体は、通常に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）のような小核酸系活性分子分野で使用される脂質ベースのカプセル化システム、生体内の糖類受容体を標的とした、例えばＮ－アセチルガラクトシルアミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）及びその他の好適な糖類基を含む複合体、異なる脂質またはポリペプチド基をリガンドとする共有結合複合体（ｃｏｖｌｅｎｔｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を含んでも良く、例えば、上文に記載される構造図（Ａ）、（Ｂ）、又は（Ｃ）から選ばれる一つ又は複数の化学修飾を含む。適切なベクターの選択は、小核酸分子が、所望の投与される器官または組織に到達するのを助けるだけでなく、小核酸分子が標的細胞乃至亜細胞構造に入るのを助けることもでき、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖（ＡＳＯ）を細胞質に、またはｓａＲＮＡ分子を細胞核に入り、そして対応する小核酸分子の生物学的調節効果を得る。

本願のもう一つの様態では、製剤を提供し、当該製剤は、本願に記載される低分子活性化核酸分子、前記の本願に記載される低分子活性化核酸分子をコードする核酸、前記の本願の低分子活性化核酸分子又は本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸分子を含む細胞、又は前記の本願の低分子活性化核酸分子を含む組成物を含む。

本願のもう一つの様態では、キットを提供し、前記のキットは、本願の低分子活性化核酸分子、前記の本願に記載される低分子活性化核酸分子をコードする核酸、前記の本願の低分子活性化核酸分子又は本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸分子を含む細胞、又は前記の本願の低分子活性化核酸分子を含む組成物を含む。
本願のもう一つは、細胞中のｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレートする医薬品又は製剤の調製における本願に記載される低分子活性化核酸分子、前記の本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸、前記の本願の低分子活性化核酸分子又は本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む細胞、又は前記の本願の低分子活性化核酸分子を含む組成物の使用に関する。ある実施形態において、前記の使用、増殖硝子体網膜症を治療又は緩和する医薬品又は製剤の調製である。ある実施形態において、前記の細胞は、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞、例えば人網膜色素上皮細胞を含む。ある実施形態において、前記の細胞は、体外であってもよく、哺乳動体内、例えば人体内に存在してもよい。

本願のもう一つの様態では、細胞中のｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレートする方法に関し、当該方法は、前記の細胞へ、本願に記載される低分子活性化核酸分子、前記の本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸、又は前記の本願の低分子活性化核酸分子を含む組成物又は製剤を投与することを含む。ある実施形態において、細胞中のｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレートする方法は、は、前記の細胞へ、本願に記載される低分子活性化核酸分子、前記の本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸、又は前記の本願の低分子活性化核酸分子を含む組成物を投与することを含む。ある実施形態において、前記の細胞は、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞、例えば人網膜色素上皮細胞を含む。ある実施形態において、前記の細胞は、体外であってもよく、哺乳動体内、例えば人体内に存在してもよい。

本願の低分子活性化核酸分子は、直接に細胞に導入されてもよく、本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸配列を細胞に導入した後に細胞内に産生されても良い。ある実施形態において、前記の細胞は、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞、例えば人網膜色素上皮細胞を含んでも良い。ある実施形態において、前記の細胞は、体外のもの、例えば細胞系や細胞株などであってもよく、哺乳動体内、例えば人体内に存在してもよい。当該人体は、ｐ２１タンパク質発現の不足または減少に関連する疾患または状況を有する個体、例えば増殖性硝子体網膜病変が発生する患者であってもよい。本願に記載される低分子活性化核酸分子は、ｐ２１タンパク質量の不足またはｐ２１タンパク質発現の不足または減少に関連する疾患または状況の治療を可能にするのに十分な量を投与することができる。具体的には、前記のｐ２１タンパク質量の不足またはｐ２１発現の減少に関連する疾患または状況は、例えば増殖性硝子体網膜病変などを含むことができる。

本願のもう一つの様態では、個体中のｐ２１タンパク質発現の不足または減少に関連する疾患または状況を治療する方法に関し、前記の個体へ、治療有効量の本願の低分子活性化核酸分子、前記の本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸、前記の本願の低分子活性化核酸分子又は本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む細胞、又は前記の本願の低分子活性化核酸分子を含む組成物を投与することを含む。ある実施形態において、本願の、個体中のｐ２１タンパク質発現の不足または減少に関連する疾患または状況を治療する方法は、前記の個体へ、治療有効量の本願の低分子活性化核酸分子、前記の本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸、前記の本願の低分子活性化核酸分子又は本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む細胞、又は前記の本願の低分子活性化核酸分子を含む組成物と、治療有効量の他の薬剤を投与することを含んでも良く、前記の他の薬剤は、例えば小分子化合物、抗体、ポリペプチド、タンパク質などを含む。ある実施形態において、前記の個体は、哺乳動物であってもよく、例えばヒトを含む。ある実施形態において、ｐ２１タンパク質発現の不足または減少に関連する疾患または状況は、例えば増殖硝子体網膜症を含んでも良い。

本願のもう一つの様態では、個体中の増殖硝子体網膜症を治療又は緩和する方法に関し、前記の個体へ、治療有効量の本願の低分子活性化核酸分子、前記の本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸、前記の本願の低分子活性化核酸分子又は本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む細胞、又は前記の本願の低分子活性化核酸分子を含む組成物を投与することを含む。ある実施形態において、本願の、増殖硝子体網膜症を治療又は緩和する方法は、前記の個体へ、治療有効量の本願の低分子活性化核酸分子、前記の本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸、前記の本願の低分子活性化核酸分子又は本願の低分子活性化核酸分子をコードする核酸を含む細胞、又は前記の本願の低分子活性化核酸分子を含む組成物と、治療有効量の他の薬剤を投与することを含んでも良く、前記の他の薬剤は、例えば小分子化合物、抗体、ポリペプチド、タンパク質などを含む。ある実施形態において、前記の個体は、哺乳動物であってもよく、例えばヒトを含む。

本願は、先行技術と比較して、少なくとも以下の１つまたは複数の態様の有益な効果を有する：

本願に提供されるｐ２１遺伝子発現を活性化／アップレギュレートすることができる低分子活性化核酸分子、例えば低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）は、ｐ２１遺伝子を確実に活性化することができ、したがって、ｐ２１遺伝子とタンパク質の発現を効率的で、特異的にアップレギュレート又は回復しつつ、比較的に良い安全性能を有し、ｐ２１タンパク質発現の不足または減少に関連する疾患または状況を治療するために使用することができ、また、ｐ２１タンパク質レベルを高めることによって、良性細胞増殖性疾患、例えば増殖性硝子体網膜病変（ＰＶＲ）を治療することを含む細胞増殖抑制効果を達成することができる。ＰＶＲは、裂孔原性網膜剥離リセット手術後の網膜表面と硝子体後の広範な繊維増殖膜の収縮、伸張による再びの網膜剥離を抑制する。ｐ２１ｓａＲＮＡは、繊維増殖膜の原因となる色素上皮細胞、膠質細胞、繊維細胞、繊維芽細胞、マクロファージの１つまたは複数の細胞増殖を抑制するための医薬成分として作用することができる。
本出願では、関連する用語は以下のように定義される：

本願で使用されるように、「相補」またはパーセントの「相補性」という用語は、２つのオリゴヌクレオチド鎖が、互いに塩基対を形成する能力を意味する。塩基対は通常、逆平行オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオチド間の水素結合により形成される。相補的なオリゴヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリーク（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）方式で塩基のマッチ（例えば、Ａ－Ｔ、Ａ－Ｕ、Ｃ－Ｇ）を行うことができ、または二重鎖体を形成することを可能にする他の任意の方法（例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基の対）で塩基のマッチを行うことができる。相補には、完全に相補する又は不完全に相補する２つの場合がある。完全に相補することまたは１００％相補性とは、二本鎖オリゴヌクレオチド分子の二本鎖領域には、第一のオリゴヌクレオチド鎖からの各ヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチド鎖の対応する位置のヌクレオチドと、ミスマッチがないように水素結合を形成することができることを指す。不完全に相補することとは、２本の鎖のヌクレオチド単位が、すべてに互いに水素結合で結合できないことを指す。例えば、２本の二重鎖領域が、２０個ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチド鎖について、各鎖に２つの塩基対だけが互いに水素結合で結合できる場合、オリゴヌクレオチド鎖は１０％の相補性を示す。同じ例では、各鎖上の１８個塩基対が、互いに水素結合で結合できる場合、オリゴヌクレオチド鎖は９０％の相補性を示す。本願において、具体的なパーセントを与えない相補性とは、少なくとも約７５％、約７９％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％の相補性を意味する。

本願で使用されるように、「同一性」または「相同性」という用語は、低分子活性化ＲＮＡの１つのオリゴヌクレオチド鎖（センス鎖またはアンチセンス鎖）と、別のオリゴヌクレオチド鎖、または標的遺伝子のプロモーター配列のある領域のコード鎖またはテンプレート鎖との類似性を意味する。配列アライメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮまたは利用可能な他のアルゴリズム）を使用するか、目視によるアライメントおよび位置合わせにより最大の対応を得る場合に、２つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチド配列は、一定の割合の同じヌクレオチドを有する。パーセント同一性および相同性を決定する際の使用に適したアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。本願において、具体的なパーセントを与えない「同一性」または「相同性」とは、少なくとも約７５％、約７９％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％の相同性を意味する。

本願で使用されるように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの一本鎖または二本鎖分子、規則的および不規則に交互するデオキシリボース部分とリボース部分を含むオリゴヌクレオチド鎖、ならびにこれらの種類のオリゴヌクレオチドの修飾および天然または非天然骨格を含むが、これらに限定されない。本願に記載される標的遺伝子の転写を活性化するためのオリゴヌクレオチドは、低分子活性化核酸分子である。

本願で使用されるように、「オリゴヌクレオチド鎖」および「オリゴヌクレオチド配列」という用語は、互換的に使用され、３５個塩基以下の短鎖ヌクレオチドのの総称を指す（デオキシリボ核酸ＤＮＡ、リボ核酸ＲＮＡなどのヌクレオチド鎖と、１つ又は複数以上のデオキシヌクレオチドと１つ又は複数以上のリボヌクレオチドによって形成される混合オリゴヌクレオチド鎖を含む）。本願において、オリゴヌクレオチド鎖の長さは、１６～３５個ヌクレオチドのいずれかであっても良い。

本願に使用されるように、「第一のオリゴヌクレオチド鎖」という用語は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれであってもよく、低分子活性化ＲＮＡのセンス鎖とは、低分子活性化ＲＮＡ二本鎖における標的遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列のコード鎖と同一性を有する核酸鎖を指し、アンチセンス鎖とは、低分子活性化ＲＮＡ二本鎖においてセンス鎖に相補的な核酸鎖を指す。

本願に使用されるように、「第二のオリゴヌクレオチド鎖」という用語は、センス鎖又はアンチセンス鎖であっても良い。第一のオリゴヌクレオチド鎖はセンス鎖である場合、第二のオリゴヌクレオチド鎖は、アンチセンス鎖であり、第一のオリゴヌクレオチド鎖はアンチセンス鎖である場合、第二のオリゴヌクレオチド鎖は、センス鎖である。

本願に使用されるように、「遺伝子」という用語は、一本のポリペプチド鎖をコードする又は一本の機能性ＲＮＡを転写するのに必要な全てのヌクレオチド配列を指す。「遺伝子」は、宿主細胞にとって内因性である、または完全もしくは部分的に組み換えられた遺伝子（例えば、プロモーターをコードする外因性オリゴヌクレオチドおよびコード配列の導入、または内因性コード配列に隣接する異種プロモーターの宿主細胞への導入によるもの）であっても良い。例えば、「遺伝子」という用語は、エクソンおよびイントロンから構成され得る核酸配列を含む。タンパク質をコードする配列は、例えば、開始コドンと終止コドンの間のオープンリーディングフレーム内のエクソン内に含まれる配列であり、本願で使用されるように、「遺伝子」は、例えば、プロモーター、エンハンサーなどの遺伝子調節配列、および、他の遺伝子にコード配列が含まれているか非コード配列が含まれているかには関わらず、他の遺伝子の転写、発現または活性を制御する当技術分野で知られている他のすべての配列を含むことを指しても良い。ある場合では、例えば、「遺伝子」は、プロモーターまたはエンハンサーなどの調節配列を含む機能性核酸を記述するために使用されても良い。組換え遺伝子の発現は、１つまたは複数の異種調節配列によって制御されてもよい。

本願で使用されるように、「標的遺伝子」という用語は、生物体内に天然に存在する核酸配列、組み換え遺伝子、ウイルス配列または細菌配列、染色体または染色体外、および／または一時的または安定にトランスフェクトされるか、または細胞および／またはそのクロマチンに組み込まれる核酸配列であっても良い。標的遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であってもよく、タンパク質をコードしない遺伝子（例えばマイクロＲＮＡ遺伝子、長鎖非コードＲＮＡ遺伝子）であってもよい。通常に、標的遺伝子は、プロモーター配列を含み、プロモーター配列と同一性（相同性とも呼ばれる）を有する低分子活性化核酸分子を設計することで、標的遺伝子の正の調節を達成でき、これは標的遺伝子の発現のアップレギュレーションを表す。「標的遺伝子プロモーター配列」とは、標的遺伝子の非コード配列を指し、本願において、「標的遺伝子プロモーター配列に相補」における標的遺伝子プロモーター配列は、当該遺伝子コード配列と同じ核酸配列である、非テンプレート鎖としても知られる当該配列のコード鎖を指す。「標的部位」または「標的部位配列」とは、標的遺伝子のプロモーター配列における低分子活性化核酸分子のセンスオリゴヌクレオチド鎖またはアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖と相同または相補的な配列フラグメントを指す。

本願に使用されるように、「センス鎖」、「センス核酸鎖」という用語は、互換的に使用され、低分子活性化核酸分子のセンスオリゴヌクレオチド鎖とは、低分子活性化核酸分子に二重鎖体に含まれる、標的遺伝子のプロモーター配列のコード鎖に対して同一性を有する第一のオリゴヌクレオチド鎖を指す。

本願に使用されるように、「アンチセンス鎖」、「アンチセンス核酸鎖」という用語は、互換的に使用され、低分子活性化核酸分子のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖とは、低分子活性化核酸分子の二重鎖体中の、センスオリゴヌクレオチド鎖と相補する第二のオリゴヌクレオチド鎖を指す。

本願に使用されるように、「コード鎖」という用語は、転写できない標的遺伝子内のＤＮＡ鎖を指し、当該鎖のヌクレオチド配列は、転写によって生成されるＲＮＡの配列と一致する（ＲＮＡでは、ＵでＤＮＡにおけるＴを置換する）。本願に記載される標的遺伝子プロモーターの二本鎖ＤＮＡ配列のコード鎖とは、標的遺伝子のＤＮＡコード鎖と同じＤＮＡ鎖上のプロモーター配列を指す。

本願に使用されるように、「テンプレート鎖」という用語は、標的遺伝子の二本鎖ＤＮＡ中のコード鎖と相補するもう一方の鎖を指し、ＲＮＡに転写するためのテンプレートとして使用することができ、当該鎖は、転写されたＲＮＡ塩基（Ａ～Ｕ、Ｇ～Ｃ）と相補する。転写中、ＲＮＡポリメラーゼは、テンプレート鎖に結合し、テンプレート鎖の３’→５’方向に沿って移動し、５’→３’方向で、ＲＮＡ合成を触媒する。本願に記載される標的遺伝子プロモーターの二本鎖ＤＮＡ配列のテンプレート鎖とは、標的遺伝子のＤＮＡテンプレート鎖と同じＤＮＡ鎖上のプロモーター配列を指す。

本願で使用されるように、「プロモーター」という用語は、タンパク質をコードする核酸配列またはＲＮＡをコードする核酸配列と位置的に関連することで、それらの転写に調節効果を及ぼす配列を指す。通常に、真核生物遺伝子プロモーターは、１００～５，０００塩基対を含むが、この長さの範囲は、本願で使用される「プロモーター」という用語を限定することを意味するものではない。プロモーター配列は通常に、タンパク質コード配列またはＲＮＡコード配列の５’末端に位置するが、プロモーター配列は、エクソン配列およびイントロン配列にも存在しても良い。
本願で使用されるように、「転写開始部位」またはその略語「ＴＳＳ」という用語は、遺伝子のテンプレート鎖に、転写の開始を示すヌクレオチドを指す。転写開始部位は、プロモーター領域のテンプレート鎖上に存在してもよい。一つの遺伝子は、複数の転写開始部位を持つことができる。

本願で使用されるように、「突出」、「ｏｖｅｒｈａｎｇ」、および「オーバーハング」という用語は、互換的に使用され、オリゴヌクレオチド鎖の末端（５’または３’）にある非塩基対のヌクレオチドを指し、それが、二本鎖オリゴヌクレオチド内の一方の鎖を越えて伸びるもう一方の鎖によって生成される。二本鎖の３’および／または５’末端を越えて伸びる一本鎖領域は、突出と呼ばれる。
本願で使用されるように、「遺伝子活性化」もしくは「活性化された遺伝子」または「遺伝子アップレギュレーション」もしくは「アップレギュレートされた遺伝子」という用語は、互換的に使用され、遺伝子転写レベル、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、酵素活性、メチル化状態、クロマチンの状態または配置、翻訳レベル、または細胞または生物学的システムにおけるその活性または状態を測定することによる、特定の核酸の転写、翻訳もしくは発現もしくは活性の増加を測定することを指す。これらの活動または状態は、直接的または間接的に測定できる。さらに、「遺伝子活性化」もしくは「活性化された遺伝子」または「遺伝子アップレギュレーション」もしくは「アップレギュレートされた遺伝子」とは、そのような活性化が起こるメカニズムに関係なく、核酸配列に関連する活性の増加を意味し、例えば、調節配列として調節作用を有し、ＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳され、タンパク質の発現を増加させることを指す。

本願に使用されるように、「低分子活性化ＲＮＡ」、「ｓａＲＮＡ」、「低分子活性化核酸分子」という用語は、互換的に使用され、遺伝子発現を促進することができる核酸分子を指し、標的遺伝子の非コード核酸配列（例えばプロモーター、エンハンサーなど）と配列同一性または相同性を有するヌクレオチド配列を含む第一の核酸フラグメント（アンチセンス核酸鎖；アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖とも呼ばれる）と、第一の核酸フラグメントと相補するヌクレオチド配列を含む第二の核酸フラグメント（センス核酸鎖；センス鎖またはセンスオリゴヌクレオチド鎖とも呼ばれる）からなってもよく、ただし、第一の核酸フラグメントと第二の核酸フラグメントは、二重鎖体を形成する。低分子活性化核酸分子は、二本鎖領域にヘアピン構造を形成する合成またはベクター発現された一本鎖ＲＮＡ分子から構成され、ただし、第一の領域は、遺伝子のプロモーター標的配列と配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、第二の領域は、第一の領域に相補するヌクレオチド配列を含む。低分子活性化核酸分子の二重鎖体領域の長さが、通常に、約１０～約５０塩基対、約１２～約４８塩基対、約１４～約４６塩基対、約１６～約４４塩基対、約１８～約４２塩基対、約２０～約４０塩基対、約２２～約３８塩基対、約２４～約３６塩基対、約２６～約３４塩基対、約２８～約３２塩基対、通常約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０塩基対であっても良い。さらに、「ｓａＲＮＡ」、「低分子活性化ＲＮＡ」および「低分子活性化核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド部分以外の核酸も含有し、修飾されたヌクレオチドまたは類似体を含むが、これらに限定されない。

本願に使用されるように、「ホットスポット（ｈｏｔｓｐｏｔ、Ｈ領域）」という用語とは、少なくとも２５ｂｐの長さを有するいくつかの遺伝子のプロモーター領域を指し、これらの領域では、機能性低分子活性化核酸分子の標的部位の凝集を示し、すなわち、これらのホットスポット領域を標的とする低分子活性化核酸分子の少なくとも３０％は、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現を、１．１倍以上に誘導することができる；特に、他の実施形態では、注目されるホットスポットは、少なくとも３０ｂｐの長さを有する遺伝子のプロモーター領域であり、これらの領域は、機能性低分子活性化核酸分子の標的の凝集を示し、すなわち、これらのホットスポット領域を標的とする低分子活性化核酸分子の少なくとも６０％は、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を、１．５倍以上に誘導することができる。

本願で使用されるように、「ダブルリピートヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド配列中に存在する２つの連続する同一のヌクレオチド、例えば、ＧＧ、ＣＣ、ＴＴ、ＡＡ、またはＵＵを指す。本願で使用されるように、「トリプルリピートヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド配列中に存在する３つの連続する同一のヌクレオチド、例えば、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＴＴＴ、ＡＡＡ、又はＵＵＵを指す。

本願で使用されるように、「合成」という用語は、オリゴヌクレオチドを合成する方法を指し、化学合成、インビトロ転写、ベクター発現などのＲＮＡを合成できる任意の方法を含む。

本願では、ＲＮＡを活性化する方式で、ｐ２１遺伝子の発現をアップレギュレートし、ｐ２１タンパク質の発現量の増加で関連する疾患、特に増殖硝子体網膜症を治療する。本願では、ｐ２１遺伝子は、標的遺伝子と呼ばれることもある。

本願に提供される低分子活性化核酸分子の調製方法は、配列設計および配列合成を含む。

本願の低分子活性化核酸分子配列の合成には、化学合成を採用してもよく、核酸合成を専門とするバイオテクノロジー会社に委託することもできる。一般的に、化学合成の方法は、（１）オリゴリボヌクレオチドの合成、（２）脱保護、（３）精製・単離、（４）脱塩・アニーリングの４つのプロセスを含む。

例えば、本願に記載されているｓａＲＮＡ化学合成の具体的なステップは次の通りであった：

（１）オリゴポリリボヌクレオチドの合成
自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＥＸＰＥＤＩＴＥ８９０９）で、１マイクロモルのＲＮＡを合成するように設定し、各サイクルのカップリング時間を１０～１５分に設定し、出発物質は、固相結合５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－チミジン支持体であり、最初のサイクルでは、一つの塩基を固体支持体に接続し、次にｎ番目（１９≧ｎ≧２）のサイクルでは、ｎ－１番目サイクルで接続された塩基に塩基を接続し、このサイクルを、全ての核酸配列の合成が完了するまで繰り返す。

（２）脱保護
ｓａＲＮＡを接続した固体支持体を、試験管に加え、エタノール／アンモニア溶液（体積比１：３）１ｍｌを当該試験管に加え、密閉し、２５～７０℃のインキュベーターに入れ、２～３０時間インキュベートし、ｓａＲＮＡを含む固相支持体の溶液を濾過し、濾液を収集し、固相支持体を再蒸留水で２回（各回１ｍｌ）リンスし、濾液を収集し、溶出液を合わせて収集し、真空下で１～１２時間乾燥させる。次に、フッ化テトラブチルアンモニウムテトラヒドロフラン溶液（１Ｍ）１ｍｌを加え、室温で４～１２時間放置した後、ｎ－ブタノール２ｍｌを加え、高速遠心分離により沈殿を回収し、ｓａＲＮＡ一本鎖の粗生成物を得る。

（３）精製・単離
得られたｓａＲＮＡ粗生成物を、１ｍｏｌ／Ｌ濃度の酢酸トリエチルアミン溶液２ｍｌに溶解し、そして、高速液体クロマトグラフィー逆相Ｃ１８カラムで単離し、精製されたｓａＲＮＡ一本鎖産物を得る。

（４）脱塩・アニーリング
サイズ排除ゲルろ過を用いて、塩を除去し、センス鎖とアンチセンス鎖のオリゴポリリボ核酸の一本鎖を、１～２ｍｌの緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ＝７．５～８．０、５０ｍＭＮａＣｌ）に同じモル比で混合し、当該溶液を９５℃に加熱した後、室温までゆっくり冷却し、ｓａＲＮＡを含む溶液を得る。

本願は、上記のｓａＲＮＡを細胞に導入した後、ｐ２１のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を、効果的に増加させることができることを見出した。

以下、具体的な実施例と図面を参照し、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本願の範囲を限定するものではなく、本願の単なる例示であることが理解されるべく。以下の実施例における特定の条件を特定しない実験方法は、通常に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）」に記載された通常条件に従って実施され、或いはメーカーが推奨する条件に従って実施される。

本願における一般的な実験条件は次の通りである。
ＲＮＡの単離と逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
細胞を、２～３×１０⁵細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、オリゴヌクレオチド二重鎖体で逆トランスフェクトする。ＲＮｅａｓｙＰｌｕｓＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、その説明書に従って全細胞ＲＮＡを抽出する。ｇＤＮＡＥｒａｓｅｒを備えたＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴキット（Ｔａｋａｒａ、Ｓｈｌｇａ、日本）を使用し、ＲＮＡ（１μｇ）をｃＤＮＡに逆転写する。ｑＰＣＲにはＡＢＩ７５００ＦａｓｔＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｌｇａ，日本）試薬を使用し、反応条件は、９５℃ ３秒、６０℃ ３０秒、４０サイクルで増幅する。ＧＡＰＤＨを内部参照とする。各実施例で使用したプライマー配列を、表１に示す。

ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０分析
細胞を、９６ウェルプレートに播種し、オリゴヌクレオチド二重鎖体をトランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０キット（ＡｆｆｙＭｅｔｒｉｘ）を使用し、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを定量的に検出する。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０キットは、ハイブリダイゼーションに基づく方法であり、遺伝子特異的プローブの使用でｍＲＮＡレベルを直接定量する。

実験手順を、次のように簡単に説明する：溶解液を添加し、トランスフェクトされた細胞を溶解し、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）およびＨＰＲＴ１（ハウスキーピング遺伝子）プローブでコーティングされたキャプチャウェルプレートに細胞溶解物を添加し、５５℃で一晩ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションシグナルを増強するために、１００μＬの対応するバッファー（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ２．０キットで提供）中で２．０ＰｒｅＡＭＰ、２．０ＡＭＰ、および２．０ＬａｂｌｅＰｒｏｂｅと順次ハイブリダイズさせる。全てのハイブリダイゼーションを、５０～５５℃で１時間振盪する。最後の洗浄ステップの後、２．０Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを加え、室温で５分間インキュベートする。次いで、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ＰＲＯプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、スイス）を使用し、光シグナルを検出する。

統計分析
結果は、平均値±標準偏差として表される。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用して一元配置分散分析を実行し、続いて統計分析のためにＴｕｋｅｙのｔ検定を実行する。統計的有意性の基準は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１に設定される。

以下、本願の実施形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、当業者は、以下の実施例が本願を例示するためにのみ使用され、本願の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解する。実施例中、特に条件を示さない限り、従来の条件またはメーカーの推奨条件に準じて実施する。メーカーを標識していない試薬または機器は、いずれも市販される一般的な製品である。

実施例１ｐ２１遺伝子のプロモーター領域を標的とする機能性低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）のスクリーニング

ｐ２１遺伝子の発現を活性化できる機能性低分子活性化ＲＮＡをスクリーニングするために、ＵＣＳＣゲノムデータベースから、ｐ２１遺伝子の１ｋｂプロモーター配列を検索した（図１；ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９）。転写開始部位（ＴＳＳ）の上流－１ｋｂから、１９ｂｐの大きさの標的部位を選択し、ＴＳＳ部位に１ｂｐずつ移動させることで、合計９８２個の標的部位配列を得た。標的部位配列をフィルターし、ＧＣ含量が６５％を超えるまたは３５％未満である標的部位配列と、５つ以上の連続する同一ヌクレオチドを有する標的部位配列と、３つ以上のダブルリピートヌクレオチド又はトリプルリピートヌクレオチドを含む標的部位配列を除外した。フィルタリング後、残りの４３９個の標部位的配列が候補として、スクリーニングプロセスに入った。これらの候補配列に基づいて、対応する二本鎖ＲＮＡ分子を化学合成した。ただし、当該実験に使用される二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、どちらも２１個ヌクレオチドであり、前記の二本鎖ＲＮＡ分子（例えば二本鎖ｓａＲＮＡ）の第一のリボース核酸鎖（センス鎖）の５’領域の１９個ヌクレオチドは、プロモーター標的部位配列に対して１００％の同一性を有し、その３’末端が、ｄＴｄＴ突出を有する；第二のリボース核酸鎖の５’領域の１９個ヌクレオチドは、第一のリボース核酸鎖の３’領域配列の１９個ヌクレオチドと完全に相補し、その３’末端が、ｄＴｄＴ突出を有する。

最終濃度１０ｎＭで、前記の二本鎖ＲＮＡ分子をＰＣ３細胞にトランスフェクトし、７２時間後に、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０キットを用いてｐ２１遺伝子のｍＲＮＡレベルを検出した。ブランクコントロール処理に対する各二本鎖ＲＮＡ分子によるｐ２１ｍＲＮＡレベルの変化倍数を計算し、図２にプロットした。試験したすべての二本鎖ＲＮＡ分子によるｐ２１遺伝子ｍＲＮＡの変化倍数は、０．６６（抑制）から８．１２（誘導）の範囲にある（図２Ｂ）。ｐ２１発現を１．０１～８．１２倍誘導した二本鎖ＲＮＡ分子が、３６１個（８２．２％）あり、７４個（１６．９％）の二本鎖ＲＮＡ分子は、阻害効果を示した（０．９９～０．６６倍）；４個（０．９％）の二本鎖ＲＮＡ分子は、ｐ２１遺伝子ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさなかった（１．０倍）。

スクリーニングされた４３９個の二本鎖ＲＮＡ分子には、１３２個（３０．１％）の二本鎖ＲＮＡ分子が、ｐ２１ｍＲＮＡを少なくとも２倍に誘導することができる；２２９個（５２．４％）の二本鎖ＲＮＡ分子が、ｐ２１ｍＲＮＡを少なくとも１．５倍に誘導し、ｐ２１ｍＲＮＡの発現を１０％以上増加させるこれらの二本鎖ＲＮＡ分子は、ｓａＲＮＡ、つまり機能性ｓａＲＮＡである。これらの機能性ｓａＲＮＡは、ｐ２１プロモーター領域全体に散在する。しかし、８つの分散領域は、機能性低分子活性化ＲＮＡの凝集を示し、これらの領域は、「ホットスポット」と呼ばれる。ホットスポットは、少なくとも１０個の対応する低分子活性化ＲＮＡを含む領域として定義され、ただし、少なくとも６０％の低分子活性化ＲＮＡが、ｐ２１ｍＲＮＡ発現を１．５倍以上誘導できた（図２Ａおよび図３）。ホットスポット１～８（Ｈ１～Ｈ８）の標的配列及び対応する低分子活性化ＲＮＡ配列を、それぞれ表２と配列表に示す。

これらのホットスポットは、次を含む：
ホットスポット領域１（Ｈ１）、対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の－８９３ｂｐから－８０１ｂｐであり、配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５に示され、この領域に、４４個の機能性ｓａＲＮＡが見つかり（図３Ａ）、それぞれは、ＲＡＧ－８３４、ＲＡＧ－８４５、ＲＡＧ－８９２、ＲＡＧ－８４６、ＲＡＧ－８２１、ＲＡＧ－８８４、ＲＡＧ－８６４、ＲＡＧ－８４３、ＲＡＧ－８５４、ＲＡＧ－８４４、ＲＡＧ－８８７、ＲＡＧ－８３８、ＲＡＧ－８５８、ＲＡＧ－８３５、ＲＡＧ－８７６、ＲＡＧ－８７０、ＲＡＧ－８５３、ＲＡＧ－８８１、ＲＡＧ－８２８、ＲＡＧ－８７２、ＲＡＧ－８４１、ＲＡＧ－８３１、ＲＡＧ－８２９、ＲＡＧ－８２０、ＲＡＧ－８２２、ＲＡＧ－８６８、ＲＡＧ－８４９、ＲＡＧ－８６２、ＲＡＧ－８６５、ＲＡＧ－８９３、ＲＡＧ－８４８、ＲＡＧ－８２４、ＲＡＧ－８６６、ＲＡＧ－８４０、ＲＡＧ－８７５、ＲＡＧ－８８０、ＲＡＧ－８７１、ＲＡＧ－８８８、ＲＡＧ－８８５、ＲＡＧ－８９４、ＲＡＧ－８３３、ＲＡＧ－８２５、ＲＡＧ－８８９、ＲＡＧ－８２３である；

ホットスポット領域２（Ｈ２）、対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の－７１７ｂｐから－６３２ｂｐであり、配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示され、この領域に、３１個の機能性ｓａＲＮＡが見つかり（図３Ｂ）、それぞれは、ＲＡＧ－６９３、ＲＡＧ－６９２、ＲＡＧ－６８８、ＲＡＧ－６９６、ＲＡＧ－６９４、ＲＡＧ－６８７、ＲＡＧ－６９１、ＲＡＧ－６９０、ＲＡＧ－６８９、ＲＡＧ－６８２、ＲＡＧ－６８６、ＲＡＧ－６６２、ＲＡＧ－６９５、ＲＡＧ－６５４、ＲＡＧ－６５８、ＲＡＧ－６８５、ＲＡＧ－７０４、ＲＡＧ－７１４、ＲＡＧ－７０５、ＲＡＧ－６６１、ＲＡＧ－６５６、ＲＡＧ－６９８、ＲＡＧ－６９７、ＲＡＧ－６５７、ＲＡＧ－７１５、ＲＡＧ－６５２、ＲＡＧ－６５１、ＲＡＧ－６５０、ＲＡＧ－７１６、ＲＡＧ－７１７、ＲＡＧ－７１１である；

ホットスポット領域３（Ｈ３）、対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の－５８５ｂｐから－５５１ｂｐであり、配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示され、この領域に、９個の機能性ｓａＲＮＡが見つかり（図３Ｃ）、それぞれは、ＲＡＧ－５８０、ＲＡＧ－５７７、ＲＡＧ－５６９、ＲＡＧ－５７６、ＲＡＧ－５７０、ＲＡＧ－５７４、ＲＡＧ－５８５、ＲＡＧ－５７９、ＲＡＧ－５８４である；
ホットスポット領域４（Ｈ４）、対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の－５５４ｂｐから－５０５ｂｐであり、配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示され、この領域に、１７個の機能性ｓａＲＮＡが見つかり（図３Ｄ）、それぞれは、ＲＡＧ－５２４、ＲＡＧ－５５３、ＲＡＧ－５３７、ＲＡＧ－５２６、ＲＡＧ－５５４、ＲＡＧ－５２３、ＲＡＧ－５３４、ＲＡＧ－５４３、ＲＡＧ－５２５、ＲＡＧ－５３５、ＲＡＧ－５４６、ＲＡＧ－５４５、ＲＡＧ－５４２、ＲＡＧ－５３１、ＲＡＧ－５２２、ＲＡＧ－５２９、ＲＡＧ－５５２である；

ホットスポット領域５（Ｈ５）、対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の－５１４ｂｐから－４８５ｂｐであり、配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９７に示され、この領域に、９個の機能性ｓａＲＮＡが見つかり（図３Ｅ）、それぞれは、ＲＡＧ－５０３、ＲＡＧ－５０４、ＲＡＧ－５０５、ＲＡＧ－５０６、ＲＡＧ－５０７、ＲＡＧ－５０８、ＲＡＧ－５０９、ＲＡＧ－５１０、ＲＡＧ－５１１、ＲＡＧ－５１２、ＲＡＧ－５１３、ＲＡＧ－５１４である；

ホットスポット領域６（Ｈ６）、対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の－４４２ｂｐから－４０５ｂｐであり、配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９８に示され、この領域に、１２個の機能性ｓａＲＮＡが見つかり（図３Ｆ）、それぞれは、ＲＡＧ－４２７、ＲＡＧ－４３０、ＲＡＧ－４３１、ＲＡＧ－４２３、ＲＡＧ－４２５、ＲＡＧ－４３３、ＲＡＧ－４３５、ＲＡＧ－４３４、ＲＡＧ－４３９、ＲＡＧ－４２６、ＲＡＧ－４２８、ＲＡＧ－４４２である；

ホットスポット領域７（Ｈ７）、対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の－３５２ｂｐから－３１３ｂｐであり、配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９９に示され、この領域に、１３個の機能性ｓａＲＮＡが見つかり（図３Ｇ）、それぞれは、ＲＡＧ－３３５、ＲＡＧ－３５１、ＲＡＧ－３５２、ＲＡＧ－３３１、ＲＡＧ－３４４、ＲＡＧ－３４２、ＲＡＧ－３４１、ＲＡＧ－３３３、ＲＡＧ－３４５、ＲＡＧ－３４６、ＲＡＧ－３３６、ＲＡＧ－３３２、ＲＡＧ－３４３である；

ホットスポット領域８（Ｈ８）、対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の－３２５ｂｐから－２６０ｂｐであり、配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１００に示され、この領域に、１８個の機能性ｓａＲＮＡが見つかり（図３Ｈ）、それぞれは、ＲＡＧ－２９４、ＲＡＧ－２８５、ＲＡＧ－２８６、ＲＡＧ－２９２、ＲＡＧ－２９１、ＲＡＧ－２８４、ＲＡＧ－２７９、ＲＡＧ－２８０、ＲＡＧ－３２５、ＲＡＧ－２９３、ＲＡＧ－３２２、ＲＡＧ－３２１、ＲＡＧ－２８１、ＲＡＧ－２８９、ＲＡＧ－２７８、ＲＡＧ－２８３、ＲＡＧ－２８２、ＲＡＧ－２９５である。

さらにＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０検測結果を検証するために、４３９個の二本鎖ＲＮＡ分子を、ｐ２１ｍＲＮＡ発現誘導活性に応じて４つの領域（ｂｉｎ）に分け、各グループから５個の二本鎖ＲＮＡ分子をランダムに選択し、それぞれに１０ｎＭの濃度でＰＣ３細胞にトランスフェクトした。７２時間後、細胞の全ＲＮＡを抽出し、逆転写後、ＲＴ－ｑＰＣＲ方法でｐ２１遺伝子ｍＲＮＡレベルを分析した。２つの方法で明らかになったｐ２１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、有意な相関関係を示した（Ｒ²＝０．８２）（図４）。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０法で得られたすべての機能性ｓａＲＮＡは、ＲＴ－ｑＰＣＲ法により実際の機能性低分子活性化ＲＮＡであることが確認でき、ただし、一部の機能性ｓａＲＮＡは、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析で、ｐ２１ｍＲＮＡ発現のより強力な誘導を示した（表３）。

機能性低分子活性化ＲＮＡをスクリーニングした後、さらなるテストと最適化のために、いくつかの代表的なＲＮＡを選択した。以下の実施例２～１２で使用したｓａＲＮＡの具体的な情報を以下の表４に示す。

表４では、一部のｓａＲＮＡが化学修飾された。アスタリスク（＊）は、ヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合によって接続されることを示し、ｆは、ヌクレオチドペントースの２’－フルオロ（２’Ｆ）修飾を示し、ｍは、ヌクレオチドペントースの２’－メトキシ（２’－Ｏ－メチル、２’ＯＭｅ）修飾を示し、Ｖｐは、５’－（末端）－ビニルホスホネート（５’‐（Ｅ）‐ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）を示し、Ｃｈｏｌ－ＴＥＧは、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを介して結合されたコレステロール（Ｃｈｏｌ）複合体を示し、Ｃ３またはＣ３（３’）は、オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏ）が次のようにリポソーム構造基と複合することを示し、（３’）は、オリゴヌクレオチドの３’末端に複合することを示す：

実施例２ｓａＲＮＡは網膜色素上皮細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進する
（１）細胞の培養とトランスフェクション
ヒト網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ－１９）（上海酵素研究生物技術有限公司から購入）を、１０％子ウシ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂で培養した。ＡＲＰＥ－１９細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１０×１０⁴個でプレーティングし、製造元の指示に従って、ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、１０ｎＭの濃度で（特に指定しない限り）低分子ＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション時間は７２時間であり、各処理に２つの重複ウェルを使用した。

（２）二段階ＲＴ－ｑＰＣＲ
トランスフェクション後、培地を捨て、ウェルごとに５００μｌの細胞溶解液を加え、室温で５分間インキュベートした。ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキットを使用してＲＮＡを抽出し、逆転写後、ＡＢＩ７５００ＦａｓｔＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でｑＰＣＲ分析を実行し、サンプルごとには、３つの複製ウェルで増幅され、ＰＣＲ反応条件は表５に示される。

ＰＣＲ反応条件は：９５℃で３０秒間、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間、４０サイクルを増幅した。同時に、内部参照としてＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅し、ただし、ｐ２１を、ｐ２１Ｆ１／Ｒ１プライマー対を使用して増幅し、増幅プライマーの具体的な配列を表１に示す。

コントロール処理に対するｓａＲＮＡトランスフェクションサンプルのｐ２１（目的遺伝子）の発現値（Ｅｒｅｌ）を計算するために、式１を使用して、目的遺伝子と内部参照遺伝子のＣｔ値を代入して計算した。

ただし、ＣｔＴｍは、コントロール処理サンプルからの目的遺伝子のＣｔ値であり、ＣｔＴｓは、ｓａＲＮＡ処理サンプルからの目的遺伝子のＣｔ値であり、ＣｔＲｍは、コントロール処理サンプルからの内部参照遺伝子のＣｔ値であり、ＣｔＲｓは、ｓａＲＮＡ処理サンプルからの内部参照遺伝子のＣｔ値である。

本実施例では、さまざまなｓａＲＮＡで処理されたＡＲＰＥ－１９細胞のｐ２１ｍＲＮＡレベルを、図５に示した。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、ＲＡＧ１－３６、ＲＡＧ１－４０、ＲＡＧ１－５５４およびＲＡＧ１－８８４群の相対ｍＲＮＡ発現値は、それぞれに、３．６、５．２、５．０および２．７倍増加し、ＲＡＧ１－４０の活性化効果が特に顕著であった。これは、ランダムに選択された機能性ｓａＲＮＡが、ＡＲＰＥ－１９細胞に、さまざまな程度でｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進できることを示した。

実施例３ｓａＲＮＡの化学修飾とコレステロール複合
生体内でのｓａＲＮＡの安定性を高め、それに自己送達能力を与えるために、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－４０を化学修飾（特定部位への２’－メトキシ修飾、２’－フルオロ修飾、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合修飾を含む）し、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－４０－５３を得、さらに、センス鎖の５’末端に、ＴＥＧによりコレステロール基と複合し、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１を得た（表４）。ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１配列をスクランブルすることで、対照配列ＲＡＧ１－４０－５３－Ｓｃｒ－Ｃ１を得た（表４）。

実施例４異なる用量のｓａＲＮＡは、網膜色素上皮細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現をアップレギュレートする
（１）細胞の培養とトランスフェクション
実施例２のように細胞を培養し、ＡＲＰＥ－１９細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１０×１０⁴個でプレーティングし、ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、１、５、１０と５０ｎＭの最終濃度で低分子活性化ＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション時間は７２時間であり、各処理に２つの重複ウェルを使用した。二段階ＲＴ－ｑＰＣＲは、実施例２に記載の通りであった。

実施例４の実験結果は、図６に示した。実施例２の結果に基づいて、ｐ２１を効果的に活性化できるＲＡＧ１－４０を、化学修飾のために選択し、ＲＡＧ１－４０－５３は、化学修飾されたｐ２１ｓａＲＮＡである（具体的な修飾部位および方法については表４を参照）。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、１、５、１０、および５０ｎＭの濃度でＲＡＧ１－４０－５３をトランスフェクトした後、細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現は、それぞれ２．０、３．１、２．８、および２．３倍増加し、かつ、５ｎＭでｐ２１ｍＲＮＡの発現は最も高く、これは、異なる濃度のＲＡＧ１－４０－５３が、さまざまな程度で、ｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進できることを示す。

実施例５異なる用量のｓａＲＮＡは、網膜色素上皮細胞におけるｐ２１タンパク質の発現をアップレギュレートする
（１）タンパク質の収集と検測
細胞培養は、実施例２に記載の通りで、細胞のトランスフェクションは、実施例４に記載の通りであった。トランスフェクションの７２時間後、適切な量のプロテアーゼ阻害剤を含む細胞溶解液（１×ＲＩＰＡ緩衝液、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて細胞を溶解した。ＢＣＡ法で、タンパク質の定量を行い、その後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単離し、０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に転写した。使用された一次抗体は、ウサギモノクローナル抗ｐ２１（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９４７ｓ）、α／β－チューブリン（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１４８ｓ）で、ブロットを検出した；二次抗体は、抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である。ＩｍａｇｅＬａｂ（ＢＩＯ－ＲＡＤ、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＤｏｃｔｍＭＰＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ）で、膜をスキャンしてシグナルを検出した。

実験結果を図７に示し、異なる用量のｓａＲＮＡにより、ｐ２１タンパク質の発現を、アップレギュレートした。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、１、５、１０、および５０ｎＭの濃度でＲＡＧ１－４０－５３をトランスフェクトした後、ｐ２１タンパク質の発現は、それぞれ１．４、１．３、１．４、１．４倍増加した。実験結果は、ｐ２１タンパク質の発現とＲＡＧ１－４０－５３のトランスフェクション濃度の間に、厳密な用量依存関係はなく、低用量のトランスフェクション濃度（１ｎＭ）でも比較的高いタンパク質発現が見られたことを示した。

実施例６ｐ２１を活性化するｓａＲＮＡが網膜色素上皮細胞の生長を阻害する
（１）細胞の培養とトランスフェクション
実施例２のように細胞を培養し、ＡＲＰＥ－１９細胞を、９６ウェルプレートに、ウェルあたり２０００個でプレーティングし、ＲＮＡｉＭａｘを使用して低分子活性化ＲＮＡをトランスフェクトし、最終濃度０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２５と５０ｎＭのＲＡＧ１－４０－５３でＡＲＰＥ－１９細胞にトランスフェクトし、ブランクトランスフェクションのグループをコントロールとし、トランスフェクションの当日を０日目（Ｄ０）とし、トランスフェクション後の実験時間は７日間で、各処理に３つの複製ウェルを使用した。

（２）ＳＲＢ染色実験
ＡＲＰＥ－１９細胞トランスフェクションから７日以内に、毎日同じ時間に、細胞を５０％ＴＣＡ、４℃で１時間固定し、蒸留水ですすぎ、使用するために室温で乾燥させた；実験完了後、７日間のサンプルに対して、ＳＲＢ染色実験を行い、５０μＬの０．４％ＳＲＢ染色溶液をウェルごとに添加し、室温で３０分間インキュベートした；インキュベーション後、ＳＲＢ染色液を除去し、２００μＬの１％酢酸を加えて４回洗浄し、余分なＳＲＢ染色液を除去し、室温で乾燥させた；１００μＬの１０ｍＭＴｒｉｓ塩基（ｐＨ１０．５）を加え、シェーカー上で１０分間インキュベートした；吸光度を、マイクロプレートリーダーで５６０ｎｍで読み取り、細胞の生長と増殖の状況を反映した。０日目の値を細胞増殖の基準値として、その後１日目から７日目まで、ブランクトランスフェクショングループの値を、その日の細胞増殖の基準として使用し、ブランクトランスフェクション細胞と比較した、採取日数が同じである様々な濃度でのＲＡＧ１－４０－５３トランスフェクション細胞の相対増殖百分比を計算した。

図８Ａは、７日間の異なる濃度のｓａＲＮＡで処理した細胞の相対増殖百分比である。１日目と２日目では、ＡＲＰＥ－１９胞では、いずれのＲＡＧ１－４０－５３処理濃度でも細胞の相対増殖百分比の減少は見られなく、３日目以降、０．１ｎＭの処理濃度で、ＡＲＰＥ－１９細胞は、相対増殖百分比の減少を始めたことは見られ、４日目以降、１ｎＭの用量処理で、細胞の相対増殖百分比の顕著な減少は見られ、７日目に、１０ｎＭ用量の処理での細胞の相対増殖百分比は、わずか約１０％である。図８Ｂは、異なる濃度のＲＡＧ１－４０－５３で細胞を処理した後の０日目の細胞数に対する１～７日目の各グループの細胞数の百分比を示す。ＡＲＰＥ－１９細胞処理の最初の３日間では、各濃度のＲＡＧ１－４０－５３処理グループの細胞は、わずかに増殖するだけであり、かつＲＡＧ１－４０－５３トランスフェクション濃度の増加とともに、細胞数の増殖は徐々に減少し、４日目以降、０．０１ｎＭ処理グループの細胞には、明らかな増殖を示したが、ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３）濃度の増加とともに、細胞数の増殖は減少し始めった。７日以内の各濃度のＲＡＧ１－４０－５３処理グループの細胞数は、ブランクトランスフェクショングループよりも少なかったが、トランスフェクション１～７日後の各グループの細胞数は、０日目の細胞数よりも依然として多く、これは、ｐ２１ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３）によって引き起こされる細胞の全体的な増殖の減速が、細胞毒性によって引き起こされるのではなく、細胞増殖の阻害によって引き起こされることを示した。

実施例７ｐ２１を活性化するｓａＲＮＡが網膜色素上皮細胞の増殖を阻害する効果は、アポトーシスによって引き起こされるものではない
（１）細胞の培養とトランスフェクション
実施例２のように細胞を培養し、ＡＲＰＥ－１９細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１０×１０⁴個でプレーティングし、ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、１、５、１０と５０ｎＭの最終濃度で低分子活性化ＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション時間は４８時間であり、各処理に２つの重複ウェルを使用した。

（２）フローサイトメトリーによって細胞アポトーシスを検出する
細胞トランスフェクション後、上清を捨て、細胞を収集し、ウェルごとに５００μｌのＰＢＳを加えて１回洗浄し、ＰＢＳを捨て、ウェルごとに、１００μｌのトリプシンを加え、９００μの培地を加えて、消化を停止し、１．５ｍＬ遠心管に移し、遠心分離（４００ｒｃｆ、５分間）して、すべての細胞を収集し、カウントした（１～２×１０⁵細胞／１００μｌバインディングバッファー）。１００μＬの１×バインディングバッファー（Ｂ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、５１－６６１２１Ｅ）と５μＬのＦＩＴＣＡｎｎｅｘｉｎＶ（Ｂ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、５１－６５８７４Ｘ）と５μＬのＰＩ（Ｂ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、５１－６６２１１Ｅ）をそれぞれ加え、室温、暗所で、１５分間インキュベートし、完了した後、１００μＬの１×バインディングバッファーを加え、均一に混合し、フローサイトメーター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）分析のために９６ウェルプレートに移し、サンプルを１時間以内に分析する必要がある。

図９に示すように、コントロールグループの生細胞および初期および後期アポトーシス細胞の割合は、それぞれ９６．２％および１．４％であり、各ｐ２１ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３）処理グループの生細胞数は、９０％以上であり、初期および後期の細胞アポトーシスの割合は、１、５、１０、および５０ｎＭの処理濃度でそれぞれ２．５％、３．２％、３．２％、および２．９％である。コントロールグループと比較して、ｐ２１ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３）の各処理グループの間に有意差はなく、細胞アポトーシスの有意な増加は見られなかった。これは、ＡＲＰＥ－１９細胞の増殖に対するヒトｐ２１ｓａＲＮＡの阻害が、アポトーシスによって引き起こされるものではないことを示した。

実施例８ｐ２１を活性化するｓａＲＮＡが網膜色素上皮細胞の遊走を阻害する
（１）細胞の培養とトランスフェクション
実施例２のように細胞を培養し、ＡＲＰＥ－１９細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１０×１０⁴個でプレーティングし、細胞が壁に付着したから、滅菌ピペットチップを使用してウェルプレートに引っかき傷を付けて、５００μＬのＰＢＳを加えて、３回洗浄し、ウェルプレート内の浮遊細胞を洗い、写真を撮って観察し、０時間とした。ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、最終濃度１０ｎＭで低分子活性化ＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３）をトランスフェクトするか、ＴＧＦ－βを、ポジティブリファレンスとして成長因子として単独で、またはｐ２１ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３）と組み合わせて使用し、トランスフェクションの２４時間後に、写真を撮ることによって細胞遊走を観察した。

図１０Ａは、０時間後と２４時間後に顕微鏡下での細胞遊走の写真であり、細胞遊走の面積はＩｍａｇｅＪソフトウェアによって分析され、図１０Ｂは、図１０Ａに対応する細胞遊走の相対面積を示す（コントロールグループの遊走面積を基準とし、１とする）。コントロールグループと比較して、ＴＧＦ－β処理グループにおける細胞遊走の相対面積は１．４１であり、ＴＧＦ－βが、２４時間内に、細胞遊走を成功に誘導できたことを示した。コントロールグループと比較して、ＲＡＧ１－４０－５３処理グループにおける細胞遊走の相対面積は０．８２であり、ＲＡＧ１－４０－５３が細胞遊走を阻害できることを示した。ＴＧＦ－βまたはＲＡＧ１－４０－５３単独処理と比較して、ＲＡＧ１－４０－５３＋ＴＧＦ－β併用処理グループにおける細胞遊走の相対面積は０．９８であり、ＲＡＧ１－４０－５３は、ＴＧＦ－βに誘導される細胞遊走を阻害できることが示された。

実施例９コレステロールと複合するｐ２１を活性化するｓａＲＮＡは、網膜色素上皮細胞に自己送達され、その増殖を阻害することができる
（１）細胞の培養と処理
実施例２のように細胞を培養し、ＡＲＰＥ－１９細胞を、９６ウェルプレートに、ウェルあたり２０００個でプレーティングし、ＲＮＡｉＭａｘを使用せずに、図１１のｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１、表４を参照）で最終濃度０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、および３μＭで、ＡＲＰＥ－１９細胞を、自己処理し、そして、未処理の細胞のグループをコントロールとして設定し、処理の当日を０日目（Ｄ０）とし、細胞にｓａＲＮＡを自由に取り込ませ、処理時間は５日間にして、各処理に３つの複製ウェルを使用した。

（２）ＣＣＫ８実験
細胞処理終了後、細胞培地１００μＬにＣＣＫ８試薬１０μＬを加え、細胞インキュベーター内で、１時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸光度を検出し、コントロールで処理された細胞をコントロールとした。吸光度の値は、細胞の生長と増殖を反映した。０日目の値を、細胞増殖の基準値とし、処理終了時のコントロールグループの値を、その日の細胞増殖の基準（１とする）として使用し、各濃度のＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１で処理した細胞のコントロールグループの細胞と比較した相対増殖率を計算した。

図１１に示すように、ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）濃度が増加するにつれて、細胞相対増殖率は、徐々に減少し、一定のレベルで安定した。ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）処理濃度が０．３μＭである場合、細胞相対増殖率は、約５０％であった。ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）の処理濃度が１μＭである場合、細胞相対増殖率は、基本的にプラトーに達し、約５０％を維持した。これは、コレステロール修飾されたｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）が、ＡＲＰＥ－１９細胞に自己送達され、細胞の生長と増殖を阻害できることを示した。

実施例１０ウサギモデルにおける薬物動態研究
（１）動物のグループ分け
江蘇省正州市東方繁殖有限公司からメスのニュージーランドシロウサギ１５匹を購入し、普通級ウサギ屋で、餌と水を自由に摂取できる単一ケージで飼育した。１５匹の雌ウサギをランダムに３つのグループに分け、生理食塩水コントロールグループに１匹を、各投与グループにつき７匹を分けた。

（２）薬物の調製
ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）凍結乾燥粉末を、室温、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳに６０ｍｇ／ｍｌまで再溶解し、ＰＢＳで順に必要な濃度まで希釈した。

（３）硝子体へ注射投与
ウサギの体重を量り、ウサギ箱に固定し、耳の辺縁静脈に３％ペントバルビタールナトリウム溶液を３０ｍｇ／ｋｇの用量で注射することによって麻酔をかけ、散瞳のために、化合物トロピカミドを１～２滴点眼し（約１５分かかった）、リドカイン２～３滴を、１～２分間の間隔で点滴して局所麻酔後、前房に３０Ｇ注射器で房水を０．０５ｍＬ採取し、０．０５ｍＬの対応する濃度（０．１ｍｇおよび０．３ｍｇ）のｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）溶液を各眼の硝子体に単回注射した。ウサギ硝子体と網膜中のｓａＲＮＡの含有量を検出するために、４時間、１、２、４、８、１４、および２１日目にそれぞれサンプルを採取し、最初の注射日を０日目とした。

（４）Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐＰＣＲ
異なる時点で処理したウサギの目の硝子体を採取し、１．５ｍＬの遠心管に入れ、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ－２（中美瑞康会社）を加え、均一に混合・溶解し、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。遠心分離終了後、サンプルを９５℃で５分間加熱し、使用するためにすぐに氷に移した。ＲＴ－ＰＣＲの反応系と条件を表６に、プライマー配列を表１に示す。

反応条件は：９５℃で３０秒間、９５℃で５秒間、６０℃で２０秒間、４０サイクルを増幅し、７２℃で１０秒間である。

図１２Ａに示すように、投与時間の増加とともに、硝子体と網膜におけるｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）の含有量は、徐々に減少した。投与４時間後、硝子体および網膜中のｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）の含有量は、５０％以上減少し、投与１４日後に、ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）が、ほぼ完全に代謝された。図１２Ｂは、ウサギの眼全体におけるｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）の含有量であり、投与４時間後のｓａＲＮＡ含有量（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１、０．１ｍｇ）は、約８１％で、投与１日後、ｓａＲＮＡ含有量は、急激に減少し、投与２日後、ｓａＲＮＡ含有量は、約２３％で、投与１４日後、ｓａＲＮＡは、ほぼ完全に代謝され、これは、ウサギの目に低用量のｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１、０．１ｍｇ）を投与すると、短期間で一定の薬物レベルを維持でき、２日後には、ｓａＲＮＡの含有量が徐々に代謝されることを示した。高用量のｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１、０．３ｍｇ）で、ウサギの眼を４時間処理した後、ｓａＲＮＡの含有量は、約５７％で、投与２日後、ｓａＲＮＡの含有量は、約２１％で、投与１４日後、ｓａＲＮＡはほぼ完全に代謝され、高用量の薬物は、ウサギの眼においてより速く代謝され、短時間持続することが示された。

実施例１１ウサギモデルにおける薬力学的研究
（１）動物のグループ分け
メスのニュージーランドシロウサギ１９匹を購入し、普通級ウサギ屋で、餌と水を自由に摂取できる単一ケージで飼育した。１９匹の雌ウサギをランダムに８グループに分け、各グループに１～４匹のウサギがいる。薬物の調製は、実施例１０に記載の通りであった。

（２）硝子体へ注射投与
ウサギの体重を量り、ウサギ箱に固定し、耳の辺縁静脈に３％ペントバルビタールナトリウム溶液を３０ｍｇ／ｋｇの用量で注射することによって麻酔をかけ、散瞳のために、化合物トロピカミドを１～２滴点眼し（約１５分かかった）、リドカイン２～３滴を、１～２分間の間隔で点滴して局所麻酔後、前房に３０Ｇ注射器で房水を０．０５ｍＬ採取し、０．１ｍＬの異なる濃度のＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１溶液（各グループに注入されたｓａＲＮＡの総量は、それぞれ０．０３ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２４ｍｇ、０．３ｍｇ、１ｍｇ）、または０．１ｍＬの異なる濃度のコントロールＲＡＧ１－４０－５３－Ｓｃｒ－Ｃ１溶液（ランダムな無関係な配列コントロールとして、各グループに注射されたＲＡＧ１－４０－５３－Ｓｃｒ－Ｃ１の総量は、それぞれ０．３ｍｇと１ｍｇ）を各眼の硝子体に単回注射した。

（３）二段階ＲＴ－ｑＰＣＲ
投与３日後にウサギの眼を採取し、眼球を摘出し、角膜を切り取り、水晶体を剥がし、硝子体をできるだけ多く採取し、１．５ｍＬ遠心管に移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てた。硝子体沈降物が約２００μＬであり、Ｔｒｉｚｏｌを１ｍＬ加えて振とう混合し、室温で５分間放置した。ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキットを用いてＲＮＡを抽出し、逆転写後、ＡＢＩ７５００ＦａｓｔＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｑＰＣＲ解析を行い、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で３０秒間、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間、４０サイクルを増幅した。ＴＢＰおよびＢ２Ｍ遺伝子を、内部参照として同時に増幅し、ただし、ｐ２１を、ｐ２１Ｆ１／Ｒ１プライマー対を使用して増幅し、プライマーは表１に示す。

コントロール処理（生理食塩水）に対する特定のｓａＲＮＡ（例えばＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）サンプルのｐ２１（目的遺伝子）の発現値（Ｅｒｅｌ）を計算するために、式２を使用して、目的遺伝子と２つの内部参照遺伝子のＣｔ値を代入して計算した。

ただし、ＣｔＴｍは、コントロール処理（生理食塩水）サンプルからの目的遺伝子のＣｔ値であり、ＣｔＴｓは、低分子活性化ＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）処理サンプルからの目的遺伝子のＣｔ値であり、ＣｔＲ１ｍは、コントロール処理サンプルからの内部参照遺伝子１のＣｔ値であり、ＣｔＲ１ｓは、低分子活性化ＲＮＡ処理サンプルからの内部参照遺伝子１のＣｔ値であり、ＣｔＲ２ｍは、コントロール処理サンプルからの内部参照遺伝子２のＣｔ値であり、ＣｔＲ２ｓは、低分子活性化ＲＮＡ処理サンプルからの内部参照遺伝子２のＣｔ値である。

図１３は、異なる処理でのｐ２１遺伝子ｍＲＮＡの発現レベルを示す。コントロールグループ（生理食塩水）と比較して、二つのＲＡＧ１－４０－５３－Ｓｃｒ－Ｃ１グループ（０．３ｍｇと１ｍｇ）には、ｐ２１ｍＲＮＡの発現は増加せず、これは、ｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）の無関係な配列コントロールとするＲＡＧ１－４０－５３－Ｓｃｒ－Ｃ１が、ｐ２１の発現に影響を及ぼさないことが示された。コントロールグループ（生理食塩水）と比較して、０．０３、０．１、０．２４、０．３、１ｍｇの濃度のＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１で、ｐ２１ｍＲＮＡの発現は、それぞれ１．３、２．２、２、２．２、２倍増加し、その発現は、０．１ｍｇの濃度で最も高く、これは、ｓａＲＮＡが低用量の処理でもｐ２１ｍＲＮＡの発現を活性化できることを示した。

実施例１２ｐ２１を活性化するｓａＲＮＡは、動物モデルにおけるＰＶＲの発生を遅らせることができる
（１）ウサギＰＶＲモデルの構築
メスのニュージーランドシロウサギ５匹を購入し、普通級ウサギ屋で、餌と水を自由に摂取できる単一ケージで飼育した。５匹の雌ウサギをランダムに３グループに分け、各グループに２～３匹のウサギがいる。硝子体注射の方法は実施例１０に記載した通りで、２．５×１０⁵個のＡＲＰＥ－１９細胞を含む懸濁液０．１ｍＬを、モデリングのために、ウサギの硝子体に注射した。モデリング後、眼底顕微鏡と細隙灯顕微鏡を使用し、ＰＶＲモデルが、正常に構築されたかどうかを観察した。

（２）硝子体へ注射投与
ＰＶＲモデルの構築が成功した後、硝子体へ単回注射で投与し、生理食塩水グループとＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１グループの２つのグループに分け、硝子体の投与方式は、実施例１１に記載した通りであった。

（３）ｉｎｖｉｖｏ顕微鏡検査とｉｎｖｉｔｒｏ観察のスコアリング
投与前（細胞注射後３３日）、と投与後１３日と２７日に、眼底顕微鏡および細隙灯顕微鏡により、ＰＶＲのグレード変化を観察し、投与２８日後に、ｉｎｖｉｔｒｏでＰＶＲのグレード変化を観察し、グレードは、Ｆａｓｔｅｎｂｅｒｇに従って分類され（Ｆａｓｔｅｎｂｅｒｇら、１９８２）、グレード０は、正常を表し、グレード１～５は、ＰＶＲの重症度を表し、グレード５が、最も重症であり、詳細なものを、表７に示す。薬物治療後のｉｎｖｉｖｏ顕微鏡検査およびｉｎｖｉｔｒｏ観察のスコアリング結果を表８に示す。

前述したように、ＰＶＲモデルを成功に構築した後、ランダムにグループ分け、薬物（ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１）を投与し、治療を施した。投与前に、眼底画像と細隙灯画像によって、ＰＶＲのグレードを１または２と評価し、軽度のＰＶＲ変化を示した。投与１３日と２８日後、生理食塩水グループとＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１のそれぞれにウサギの眼に対する治療効果を観察し、１３日の投与と治療後、生理食塩水（コントロール）グループの眼底顕微鏡と細隙灯画像により評価されたＰＶＲのグレードは２または３であり、ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１治療グループの眼底顕微鏡と細隙灯画像により評価されたＰＶＲのグレードは２であり、２７日の投与と治療後、生理食塩水治療グループの眼底顕微鏡と細隙灯画像によって評価されたＰＶＲのグレードは３または４であり、ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１治療グループの眼底顕微鏡と細隙灯画像によって評価されたＰＶＲのグレードは１または２である。投与２８日後、ウサギの目を摘出し、直視下で、ＰＶＲに対するＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１の治療効果をさらに観察した。ｉｎｖｉｔｒｏ観察では、生理食塩水グループのＰＶＲグレードは、２または３であり、ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１治療グループのＰＶＲグレードは、１であることが示された。上記の結果は、生理食塩水（コントロール）グループと比較して、ＲＡＧ１－４０－５３－Ｃ１治療が、ＰＶＲの発生と進行を遅らせるか抑制できることを示唆し、長期治療によりＰＶＲの症状が改善することが期待される。

実施例１３ｓａＲＮＡはヒト膀胱がん細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進する
ヒト膀胱癌細胞（Ｋｕ－７－ＬＧ）（ＡＴＣＣ）を、１０％子ウシ牛血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＭｃＣｏｙ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂で培養した。Ｋｕ－７－ＬＧ細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１０×１０⁴個でプレーティングし、製造元の指示に従って、ＲＮＡｉＭａｘを使用して、１０ｎＭの濃度で（特に指定しない限り）ｓａＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション時間は７２時間であり、各処理に２つの重複ウェルを使用した。二段階ＲＴ－ｑＰＣＲは、実施例２に記載の通りであった。

異なるｓａＲＮＡで処理した後のＫｕ－７－ＬＧ細胞における相対ｐ２１ｍＲＮＡレベルを図１４に示し、コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとし、コントロールグループと比較して、ＲＡＧ－３３２、ＲＡＧ－３３１、ＲＡＧ－３３０、ＲＡＧ－３２９、ＲＡＧ－３２７、ＲＡＧ－３２５、ＲＡＧ－３２３、ＲＡＧ－３２２、ＲＡＧ－３２１、ＲＡＧ－２９９とＲＡＧ－２９７グループのｍＲＮＡ相対発現値が、それぞれに１．５、３．８、１．７、１．６、１．２、１．３、２．０、６．４、５．６、１．６と１．４倍増加し、ＲＡＧ－３３１、ＲＡＧ－３２２とＲＡＧ－３２１の活性化効果が、特に顕著であった。これは、ランダムに選択された機能性ｓａＲＮＡが、Ｋｕ－７－ＬＧ９細胞に、さまざまな程度でｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進できることを示した。

実施例１４化学修飾されたｓａＲＮＡは網膜色素上皮細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡとタンパク質の発現を促進する
ｓａＲＮＡの安定性と活性を高めるために、ｓａＲＮＡＲＡＧ－３２２（ＲＡＧ１－０とも呼ばれる）のすべてのヌクレオチドを、（特定の部位での２’－メトキシ修飾、２’－フルオロ修飾、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合修飾の導入を含む）化学修飾し、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４を得た（表４）。ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４の送達効率を、さらに向上させるために、脂質基を固体支持体ＣＰＧ（制御多孔性ガラス）を介してオリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏ）のセンス鎖の３’末端に結合させて、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）を得た（表４）。複合された脂質構造基は次の通りである：

実施例２のように細胞を培養し、ＡＲＰＥ－１９細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１０×１０⁴個でプレーティングし、ＲＮＡｉＭａｘを使用して、２５ｎＭの最終濃度で低分子活性化ＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション時間は、それぞれに、１、２、３、４、５、６と７日であり、各処理に２つの重複ウェルを使用した。二段階ＲＴ－ｑＰＣＲは、実施例２に記載の通りであった。タンパク質の収集と検出は実施例５に記載されている通りであった。

図１５Ａは、異なる日数にｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４で処理したＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現レベルである。

コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４で２、３、４、５、６、７日間処理した後、ｐ２１ｍＲＮＡの発現値は、それぞれ１．２、２．０、１．９、１．７、１．９、２．０倍に増加した。ＲＡＧ１－０Ｍ４の２日の処理後に、ｐ２１ｍＲＮＡの発現は、増加し始め（１．２倍）、３日の処理後に、ｐ２１ｍＲＮＡの発現は、ピーク（２．０倍）に達し、４日の処理後に、ｐ２１ｍＲＮＡの発現は、減少し始め（依然として高い活性を有し）、ｐ２１ｍＲＮＡの発現は、６日の処理後に増加し始め、７日の処理後に再びピークに達した。これは、機能性ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４が、処理３日後のＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進し、高い発現レベルを維持できることを示している。

図１５Ｂと１５Ｃは、異なる日数にｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４で処理したＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ２１タンパク質の発現レベルである。図１５Ｂは、タンパク質バンド図であり、図１５Ｃは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して図１５Ｂのタンパク質バンドを分析することによって得られた統計図である。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４で１、２、３、４、５、６と７日間処理した後、ｐ２１ｍＲＮＡの発現値は、それぞれ３．９、８．０、１１．２、８．７、５．５、４．４と２．８倍に増加した。ＲＡＧ１－０Ｍ４を１日間処理した後、ｐ２１タンパク質の発現は、増加し始め（３．９倍）、３日の処理後に、ｐ２１タンパク質の発現は、ピーク（１１．２倍）に達し、４日の処理後、ｐ２１タンパク質の発現は、処理時間の増加とともに徐々に減少した。これは、機能性ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４が、ｐ２１タンパク質の発現を促進し、ＡＲＰＥ－１９細胞における３日の処理後にピークに達することができることを示する。

その結果、異なる日数で処理されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４は、ＡＲＰＥ－１９細胞において、ｐ２１ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を、異なる程度で促進することができ、かつ３日間の処理後に、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４の活性は、最も高かったことが示された。

実施例１５化学修飾されたｓａＲＮＡは網膜色素上皮細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡとタンパク質の発現を促進する
細胞培養とトランスフェクション細胞培養。
実施例２のように、ＡＲＰＥ－１９細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１０×１０⁴個でプレーティングし、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４には、最高トランスフェクション濃度は１００ｎＭにして、これを半希釈（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８、０．３９、０．２および０．１ｎＭ）し、ＲＮＡｉＭａｘを使用して３日間トランスフェクトし、各処理では２つの複製ウェルを使用した。二段階ＲＴ－ｑＰＣＲ法は、実施例２に記載の通りで、タンパク質の収集および検出は、実施例５に記載の通りで、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４の化学修飾は、実施例１４に記載の通りであった。

図１６Ａは、異なる用量のｓａＲＮＡを用いたＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現レベルを示す。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４で１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６と０．７８ｎＭの複数の濃度で３日間処理した後、ｐ２１ｍＲＮＡの発現値は、それぞれ２．２、２．４、２．１、２．５、２．８、２．１、１．７と１．４倍に増加した。ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４のｐ２１ｍＲＮＡの発現は、０．７８ｎＭで処理したから増加し始め（１．４倍）、６．２５ｎＭでピーク（２．８倍）に達し、その後減少し始め、２５～１００ｎＭで安定したレベル（２．０倍）を維持した。これは、異なる用量の機能性ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４が、ＡＲＰＥ－１９細胞にｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進し、６．２５ｎＭのトランスフェクション濃度でピークに達することができることを示す。

図１６Ｂと１６Ｃは、異なる用量でｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４で処理したＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ２１タンパク質の発現レベルである。図１５Ｂは、タンパク質バンド図であり、図１６Ｃは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して図１６Ｂのタンパク質バンドを分析することによって得られた統計図である。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４で１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８、０．３９、０．２と０．１ｎＭの複数の濃度で３日間処理した後、ｐ２１ｍＲＮＡの発現値は、それぞれ２．８、４．７、４．５、４．８、４．１、２．２、２．２、１．８、１．７、１．６と１．２倍に増加した。これは、異なる用量の機能性ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４により、ｐ２１タンパク質の発現が、６．２５～５０ｎＭの範囲で高く安定し、ｐ２１タンパク質の発現が、１２．５ｎＭでピークに達することを示す。

その結果、異なる用量のｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４は、ＡＲＰＥ－１９細胞において、ｐ２１ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を、異なる程度で促進することができ、かつ６．２５－１２．５ｎＭでの処理において、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４の活性は、最も高かったことが示された。

実施例１６化学修飾されたｓａＲＮＡのウサギモデルにおける薬物動態研究
実施例１０と同じ来源のメスのニュージーランドシロウサギ４匹を購入し、普通級ウサギ屋で、餌と水を自由に摂取できる単一ケージで飼育した。

ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）凍結乾燥粉末を、室温、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳに６０ｍｇ／ｍｌまで再溶解し、ＰＢＳで順に、２ｍｇ／ｍｌ（０．１ｍｇ）と６ｍｇ／ｍｌ（０．３ｍｇ）の濃度まで希釈した。

ウサギの体重を量り、ウサギ箱に固定し、耳の辺縁静脈に３％ペントバルビタールナトリウム溶液を３０ｍｇ／ｋｇの用量で注射することによって麻酔をかけ、散瞳のために、化合物トロピカミドを１～２滴点眼し（約１５分かかった）、リドカイン２～３滴を、１～２分間の間隔で点滴して局所麻酔後、前房に３０Ｇ注射器で房水を０．０５ｍＬ採取し、０．０５ｍＬの対応する濃度（０．１ｍｇおよび０．３ｍｇ）のｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）溶液を各眼の硝子体に単回注射した。ウサギ硝子体、血漿と網膜中のｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）の含有量を検出するために、４時間、１、３、７、および１４日目にそれぞれサンプルを採取し、最初の注射日を０日目とした。

Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐＰＣＲ方法より、異なる時点に、ウサギ硝子体、血漿および網膜中のｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）の含有量を検出した。Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐＰＣＲ方法は、実施例１０に記載の通りであった。

図１７Ａは、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）（０．１ｍｇ）の単回硝子体注射後の異なる時点でのウサギ硝子体、血漿および網膜中の薬物含量を示す。硝子体注射後、薬物は網膜に急速に吸収され、その結果、網膜で薬物濃度が最も高く、次に硝子体で、血漿で最も低い濃度となり、これは、硝子体内注射後のｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）の全身曝露が非常に有限であることを示す。網膜および硝子体では、ＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）の濃度は、投与１日後に減少し始め、３日後から１４日目まで、安定したレベルを維持し、これは、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）が、ウサギの眼に、良好な安定性と遅い代謝を有することを示す。

図１７Ｂは、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）（０．３ｍｇ）の単回硝子体注射後の異なる時点でのウサギ硝子体、血漿および網膜中の薬物含量を示す。硝子体注射後、薬物は網膜に急速に吸収され、その結果、網膜で薬物濃度が最も高く、次に硝子体で、血漿で最も低い濃度となり、これは、硝子体内注射後のｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）の全身曝露が非常に有限であることを示す。網膜内の薬物濃度は、投与後１４日まで、安定したレベルを維持したが、硝子体内では、ＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）の濃度は、投与１日後から減少し始め、１４日までに血漿中濃度を下回った。血漿において、薬物濃度は、ウサギの眼から全身分布への薬物の移動を表し、３日目から１４日目までゆっくりとした上昇傾向を示した。これらの結果は、投与量と投与タイミングの取り決めに対するデータサポートを提供した。

実施例１７化学修飾されたｓａＲＮＡのウサギモデルにおける薬力学研究
実施例１０と同じ来源のメスのニュージーランドシロウサギ９匹を購入し、普通級ウサギ屋で、餌と水を自由に摂取できる単一ケージで飼育した。ランダムに４グループに分け、各グループに２～３匹のウサギがいる。薬物の調製は、実施例１６に記載の通りであった。

ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）凍結乾燥粉末を、室温、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳに６０ｍｇ／ｍｌまで再溶解し、濃度０．３ｍｇ／０．０５ｍＬのｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４－Ｃ３（３’）を、ｉｎｖｉｔｒｏで２×１０⁶ ＡＲＰＥ－１９細胞／０．０５ｍｌと混合し、ウサギ硝子体注射用の最終体積０．１ｍＬにした。

硝子体注射の投与方法は、実施例１６に記載した通りで、実験グループには、混合体積０．１ｍＬ、濃度０．３ｍｇの上記ｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４－Ｃ３（３’）溶液を硝子体に単回注射し、生理食塩水グループには、コントロールグループとして同量の生理食塩水を同時に１回投与した。ウサギ硝子体中のｐ２１ｍＲＮＡの含有量を検出するために、サンプルを、３日目と７日目にそれぞれ収集し、最初の注射の日を、０日目として記録した。サンプルの採取・処理方法と二段階ＲＴ－ｑＰＣＲ法は、実施例１１に記載の通りであった。

図１８は、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４－Ｃ３（３’）によるウサギ硝子体におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を示す。生理食塩水をコントロールグループとし、コントロールグループと比較して、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）によるｐ２１ｍＲＮＡの発現は、３日目と７日目に、それぞれに４．０倍と５．３倍に増加し、７日目の発現が最も高かったことから、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）が、ウサギ硝子体におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を短期間で促進できることを示した。

実施例１８化学修飾されたｓａＲＮＡは網膜色素上皮細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進する
ｓａＲＮＡの安定性と活性を高めるために、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４に基づいて、５’－（末端）－ビニルホスホネートですべてのヌクレオチドを化学修飾し、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖを得た（表４）。

ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖの送達効率を、さらに向上させるために、脂質構造基を固体支持体ＣＰＧ（制御多孔性ガラス）を介してセンス鎖の３’末端に結合させて、送達構造を有するｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）を得た（表４）。複合させる脂質構造基は実施例１４と同じである。

実施例２のように細胞を培養し、ＡＲＰＥ－１９細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１０×１０⁴個でプレーティングし、ＲＮＡｉＭａｘを使用して、３、１０、と３０ｎＭの最終濃度で低分子活性化ＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション時間は３日であり、各処理に２つの重複ウェルを使用した。二段階ＲＴ－ｑＰＣＲは、実施例２に記載の通りであった。

図１９は、異なるトランスフェクション濃度のｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖを用いたＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を示す。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖのｐ２１ｍＲＮＡの発現は、３ｎＭ、１０ｎＭ、および３０ｎＭで、それぞれ２．０、２．３、および２．２倍増加した。これは、機能性ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖが、より低濃度でもｐ２１ｍＲＮＡの発現を誘導できることを示した。

実施例１９化学修飾されたｓａＲＮＡが網膜色素上皮細胞の増殖を阻害する効果は、アポトーシスによって引き起こされるものではない
細胞トランスフェクション完了後、１００μＬの細胞培地を、Ｃａｓｐａｓｅ３／７（カタログ番号：ＰｒｏｍｅｇａＧ８０９２、会社名：Ｐｒｏｍｅｇａ）実験用白色プレートに移し、１５μＬのＣａｓｐａｓｅ３／７反応基質を、１００μＬの細胞培地に加え、細胞インキュベーターで２０分間インキュベートし、インキュベート完了後、マイクロプレートリーダーを用いて、蛍光強度を検出し、蛍光強度が、細胞内のＣａｓｐａｓｅ３／７の活性を反映し、Ｃａｓｐａｓｅ３／７の活性は、細胞のアポトーシスの指標であり、その活性の強さを検出することで、細胞のアポトーシスの状況を判断した。化学修飾、細胞培養およびトランスフェクションは、実施例１８に記載の通りであり、ＣＣＫ８実験は実施例９に記載の通りであった。

図２０Ａは、異なるトランスフェクション濃度のｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖで３日間処理したＡＲＰＥ－１９細胞の数である。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、３ｎＭ、１０ｎＭおよび３０ｎＭでのｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖによる細胞の相対増殖率は、それぞれ５７％、５４％および３４％である。図２０Ｂは、異なるトランスフェクション濃度のｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖで３日間処理したＡＲＰＥ－１９細胞におけるＣａｓｐａｓｅ３／７の活性を示す。コントロールグループと比較して、３ｎＭ、１０ｎＭ、および３０ｎＭのｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖによる細胞のＣａｓｐａｓｅ３／７活性に有意差はなかった。これは、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖが、用量の増加とともに、細胞の増殖を阻害できることを示したが、こんな細胞生長の阻害効果は、アポトーシスによって引き起こされるものではない。

実施例２０化学修飾されたｓａＲＮＡは網膜色素上皮細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進するが、アポトーシス促進効果がない
実施例２のように細胞を培養し、ＡＲＰＥ－１９細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１０×１０⁴個でプレーティングし、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０、ＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ、およびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）を、ＲＮＡｉＭａｘを使用し、１０ｎＭのトランスフェクション濃度で、３日間トランスフェクトし、各処理に２つの重複ウェルを使用した。二段階ＲＴ－ｑＰＣＲ法は、実施例２に記載の通りで、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖおよびＲＡＧ１－ＯＭ４ｖ－Ｃ３（３’）の化学修飾は実施例１８に記載の通りであった。Ｃａｓｐａｓｅ３／７活性実験は、実施例１９に記載の通りであった。

図２１Ａは、１０ｎＭの異なるｓａＲＮＡで３日間処理したＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を示す。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０、ＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ、およびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）によるｐ２１ｍＲＮＡ発現は、ＡＲＰＥ－１９細胞においてそれぞれ４．２、４．０、および２．９倍増加した。これは、化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）が、ｐ２１遺伝子を活性化する活性を維持していることを示した。図２１Ｂは、１０ｎＭの異なるｓａＲＮＡで３日間処理したＡＲＰＥ－１９細胞におけるＣａｓｐａｓｅ３／７の活性を示す。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０、ＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ、およびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）によるＣａｓｐａｓｅ３／７の活性は、ＡＲＰＥ－１９細胞においてそれぞれ１．３、１．３、および１．１倍である。Ｃａｓｐａｓｅ３／７の活性はアポトーシスの指標であり、活性が強いほどアポトーシスは重度になる。これは、化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）が、アポトーシス促進活性を低下させることを示した。

実験結果は、化学修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）が、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進するだけでなく、アポトーシスのリスクも低下させることを示した。

実施例２１化学修飾されたｓａＲＮＡは網膜色素上皮細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡとタンパク質の発現を促進する
細胞培養には、実施例２のように、ＡＲＰＥ－１９細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１０×１０⁴個でプレーティングし、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）には、最高トランスフェクション濃度は１００ｎＭにして、これを３倍希釈（３３．３、１１．１、３．７、１．２、０．４１２、０．１３７、０．０４６、０．０１５、０．００５と０．００２ｎＭ）し、ＲＮＡｉＭａｘを使用して３日間トランスフェクトし、各処理では２つの複製ウェルを使用した。二段階ＲＴ－ｑＰＣＲ法は、実施例２に記載の通りで、タンパク質の収集および検出は、実施例５に記載の通りで、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）の化学修飾は、実施例１８に記載の通りであった。

図２２は、異なる用量のｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）を用いたＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を示す。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）で１００、３３．３、１１．１、３．７と１．２ｎＭの複数の濃度で３日間処理した後、ｐ２１ｍＲＮＡの発現は、それぞれ１．９、１．９、１．７、１．５と１．４倍に増加した。ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）によるｐ２１ｍＲＮＡの発現は、１．２ｎＭで処理したから増加し始め（１．４倍）、３３．３ｎＭでピーク（１．９倍）に達し、３３．３～１００ｎＭで安定したレベル（１．９倍）を維持した。これは、異なる用量の機能性ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）が、ＡＲＰＥ－１９細胞にｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進し、３３．３ｎＭのトランスフェクション濃度でピークに達することができることを示す。

図２２Ｂと２２Ｃは、異なる用量のｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）とｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖでの、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるｐ２１タンパク質の発現レベルである。図２２Ｂは、タンパク質バンド図であり、図２２Ｃは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して図２１Ｂのタンパク質バンドを分析することによって得られたバンドの輝度値統計図である。コントロールグループを、ブランクトランスフェクションコントロールとした場合、コントロールグループと比較して、３、１０および３０ｎＭのｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）でのｐ２１ｍＲＮＡの発現は、それぞれ４．５、５．３と４．８倍増加した。ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖとＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）の同じ用量（１０ｎＭ）では、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）のｐ２１タンパク質発現は、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖのｐ２１タンパク質発現より（４．０倍）高かった。これは、送達構造を有するｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）が、ｐ２１タンパク質の発現を増加させることができるだけでなく、ｐ２１タンパク質の発現が、送達構造を有しないｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖの発現よりも優れていることを示した。

結果は、送達構造を有するｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）が、ＡＲＰＥ－１９細胞には、ｐ２１ｍＲＮＡとタンパク質の発現をさまざまな程度に促進することができ、かつｐ２１タンパク質の発現は、送達構造を有しないｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖの発現より良好であることを示した。

実施例２２化学修飾されたｓａＲＮＡは、ＰＢＭＣ細胞における炎症因子の免疫刺激反応を低下させる
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（江蘇シディエバイオテクノロジー株式会社）を、１０％子ウシ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂で培養した。ＰＢＭＣ細胞を、９６ウェルプレートに、ウェルあたり１００×１０⁴個でプレーティングし、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０、ＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ、およびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）を、ＲＮＡｉＭａｘを使用し、１３３ｎＭのトランスフェクション濃度で、２４時間トランスフェクトし、各処理に２つの重複ウェルを使用した。ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＲＡＧ－ＩＳ－１をポジティブコントロールグループとし、コントロールグループをブランクトランスフェクションコントロールとし、未処理とは、トランスフェクション試薬が添加されず、ＰＢＭＣ細胞と培地のみが添加されたことを意味する。

ｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖおよびＲＡＧ１－ＯＭ４ｖ－Ｃ３（３’）の化学修飾は、実施例１８に記載された通りであった。

細胞トランスフェクション完了後、ヒトＩＬ－６、ＩＦＮ－α、ＴＮＦ－α炎症因子の含有量を検出するために、各サンプルから１００μＬ（３×１００μＬ）の細胞懸濁液を３コピー収集し、具体的な操作方法については、各炎症因子のキットの説明書を参照し、具体的なキット情報は以下の通りであった：ＩＬ－６ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：１１１０６０２、会社名：上海達科為生物技術有限公司）、ＩＦＮ－α ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：７０－ＥＫ１９９－９６、会社名：杭州聯科生物技術有限公司）、およびＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：１１１７２０２、会社名：上海達科為生物技術有限公司）。

図２３Ａは、ＰＢＭＣ細胞におけるｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖおよびＲＡＧ１－ＯＭ４ｖ－Ｃ３（３’）によるヒトＩＬ－６含量である。未処理、コントロール、ｄｓＣｏｎ２、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）グループのＰＢＭＣ細胞中のヒトＩＬ－６の含有量は、それぞれ、３．６、５．９、１５．５、４４３．０、３．４、および１．８ｐｇ／ｍＬであり、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）グループのＩＬ－６含有量は、コントロールグループよりもはるかに低く、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）グループのヒトＩＬ－６含有量は最も低かった。これは、送達構造に修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）が、送達構造に修飾されないｓａＲＮＡと比較して、ＩＬ－６炎症因子に対する刺激効果が抑制されていることを示した。

図２３Ｂは、ＰＢＭＣ細胞におけるｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖおよびＲＡＧ１－ＯＭ４ｖ－Ｃ３（３’）によるヒトＩＦＮ－α含有量である。未処理、コントロール、ｄｓＣｏｎ２、ＲＡＧ－ＩＳ－１、ＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）グループのＰＢＭＣ細胞中のヒトＩＦＮ－αの含有量は、それぞれ、９．７、３８．８、２７．８、１７６．３、２３．５、および２０ｐｇ／ｍＬであり、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）グループのＩＦＮ－α含有量は、コントロールグループよりもはるかに低く、ＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）グループのヒトＩＦＮ－α含有量は最も低かった。これは、送達構造に修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）が、送達構造に修飾されないｓａＲＮＡと比較して、ＩＦＮ－α炎症因子に対する刺激効果が抑制されていることを示した。

図２３Ｃは、ＰＢＭＣ細胞におけるｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖおよびＲＡＧ１－ＯＭ４ｖ－Ｃ３（３’）によるヒトＴＮＦ－α含有量である。未処理、コントロール、ｄｓＣｏｎ２、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）グループのＰＢＭＣ細胞中のヒトＴＮＦ－αの含有量は、それぞれ、６１．０、１３４．５、１５４．６、３３０．３、１１５．４および１２４．０ｐｇ／ｍＬであり、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）グループのＴＮＦ－α含有量は、コントロールグループよりもはるかに低かった。これは、修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）が、送達構造に修飾されないｓａＲＮＡと比較して、ＴＮＦ－α炎症因子に対する刺激効果が抑制されていることを示した。

実施例２３化学修飾されたｓａＲＮＡのウサギモデルにおける薬力学研究
実施例１０と同じソースからのメスのニュージーランドシロウサギ９匹を、普通級ウサギ屋で、餌と水を自由に摂取できる単一ケージで飼育した。ランダムに４グループに分け、各グループに２～３匹のウサギがいる。

使用したｓａＲＮＡがＲＡＧ１－ＯＭ４ｖおよびＲＡＧ１－ＯＭ４ｖ－Ｃ３（３’）であったことを除いて、薬物調製は、実施例１７に記載した通りであった。ｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４ｖおよびＲＡＧ１－ＯＭ４ｖ－Ｃ３（３’）の化学修飾は、実施例１８に記載された通りであった。

硝子体注射の投与方法は、実施例１６に記載した通りで、各実験グループには、濃度０．３ｍｇのｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）溶液０．１ｍＬ、または濃度０．３ｍｇのｄｓＣｏｎ２Ｍ４グループ０．１ｍＬ（無関係な配列コントロールグループとして）を単回注射し、コントロールグループとして同量の生理食塩水を注射した。ウサギ硝子体中のｐ２１ｍＲＮＡの含有量を検出するために、サンプルを、３日後収集し、最初の注射の日を、０日目として記録した。サンプルの採取・処理方法と二段階ＲＴ－ｑＰＣＲ法は、実施例１１に記載の通りであった。

図２４は、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖとｓａＲＮＡＲＡＧ１－ＯＭ４－Ｃ３（３’）によるウサギ硝子体におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を示す。生理食塩水をコントロールグループとし、コントロールグループと比較して、ｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖおよびＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）は、ウサギ硝子体におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現を、それぞれ０．９倍および３．５倍増加させ、送達構造に修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４ｖ－Ｃ３（３’）は、ウサギ硝子体におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現が高く、これは、送達構造に修飾されたｓａＲＮＡＲＡＧ１－０Ｍ４－Ｃ３（３’）が、ｐ２１ｍＲＮＡの発現を促進し、ｉｎｖｉｖｏ送達効率をさらに向上できることを示した。

つまり、ヒトｐ２１ｓａＲＮＡは、ｐ２１遺伝子の発現を活性化し、ヒト網膜色素上皮細胞の生長を阻害し、増殖性硝子体網膜症などのｐ２１の減少または不足による疾患をさらに改善または治療することができる。

本願は、低分子活性化ＲＮＡの作用メカニズムを採用し、ｐ２１遺伝子の転写・発現をアップレギュレートし、これはｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ実験の両方で検証された。ＡＲＰＥ－１９細胞では、ｐ２１の発現の増加が、細胞の増殖と遊走を阻害できることが証明され、ｐ２１の発現をアップレギュレートすることが、細胞の増殖と遊走を、効果的に阻害できることが示された。ウサギＰＶＲモデルを、ｉｎｖｉｖｏ実験に使用し、本願のもので治療した後、ＰＶＲの症状が顕著に改善された。この遺伝子治療法の高い選択性、標的化、精度により、ＰＶＲの治療に新たな方向性がもたらす。

本願の様々な実施形態を上で説明したが、上記の説明は例示的なものであり、網羅的なものではなく、開示された実施例に限定されるものではない。記載された実施形態の範囲および精神から逸脱することなく、当業者にとって多くの修正および変更は、自明なものである。本願に使用される用語の選択は、各実施例の原理、実際の応用又は市場における技術的改良を最もよく説明すること、又は他の当業者が、本願で開示される様々な実施例を理解できるようにすることを目的としている。

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Ｆａｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｍ．，Ｋ．Ｒ．Ｄｉｄｄｉｅ，Ｎ．Ｓｏｒｇｅｎｔｅ，ａｎｄＳ．Ｊ．Ｒｙａｎ．１９８２． ’Ａｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｉｎｏｃｕｌａｉｎａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｏｄｅｌｏｆｍａｓｓｉｖｅｐｅｒｉｒｅｔｉｎａｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ’，ＡｍＪＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ，９３：５５９－６４．

Claims

低分子活性化核酸分子であって、前記の低分子活性化核酸分子は、完全に相補する又は不完全に相補するように二重鎖構造を形成する第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖を含み、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６９の１６－３５個ヌクレオチドの連続するフラグメントに対して、少なくとも７５％の相同性又は相補性を有し、前記の低分子活性化核酸分子には、（１）ＧＣ含有量は、３５～６５％にある；（２）５個又はそれ以上の連続する同一ヌクレオチドを含まない；かつ（３）３個又はそれ以上のダブルリピートヌクレオチド又はトリプルリピートヌクレオチドを含まないことを特徴とする低分子活性化核酸分子。
前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、６、７、８、９、１０、１１、１２に示されるいずれか一つの配列の任意的に連続する１６－３５個ヌクレオチドのフラグメントに対して、少なくとも７５％の相同性又は相補性を有することを特徴とする請求項１に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３－３０、３５－４６、５９－６２、６７－７４、７７－８０、８５－９６、１０３－１０８、１１１－１１８、１２１－１３２、１３９－１４０、１４７－１８０、１８５－１８６、１８９－１９０、１９５－１９８、２０１－２０２、２０９－２１２、２１５－２１８、２２５－２４０、２４３－２４６、２４９－２５８、２６１－２６２、２６５－２７０、２７５－２８０、２８３－３００、３０３－３０８、３１７－３２０、３２３－３２４、３２９－３４８、３５１－３５２、３５７－３５８、３６１－３６６、３７１－３９２、３９９－４００、４０５－４１２、４１５－４１６、４１９－４２４、４２９－４３２、４３９－４４２、４４７－４５０、４５３－４５８、４６３－４６８、４７９－４８６に示されるいずれか一つの配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相補性又は相同性を有することを特徴とする請求項２に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖又は前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３－３０、３５－４６、５９－６２、６７－７４、７７－８０、８５－９６、１０３－１０８、１１１－１１８、１２１－１３２、１３９－１４０、１４７－１８０、１８５－１８６、１８９－１９０、１９５－１９８、２０１－２０２、２０９－２１２、２１５－２１８、２２５－２４０、２４３－２４６、２４９－２５８、２６１－２６２、２６５－２７０、２７５－２８０、２８３－３００、３０３－３０８、３１７－３２０、３２３－３２４、３２９－３４８、３５１－３５２、３５７－３５８、３６１－３６６、３７１－３９２、３９９－４００、４０５－４１２、４１５－４１６、４１９－４２４、４２９－４３２、４３９－４４２、４４７－４５０、４５３－４５８、４６３－４６８、４７９－４８６のいずれか一つのヌクレオチド配列と完全相同又は完全相補的であるか、又は、１～２個の塩基の不相同又はミスマッチを有することを特徴とする請求項３に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の低分子活性化核酸分子は、二重鎖核酸であり、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖と前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖は、それぞれに、前記の二重鎖核酸の２本の鎖に位置することを特徴とする請求項１に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖と前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖の一方または両方が、０－６個ヌクレオチドの突出を有し、前記の突出は、前記のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端又は３’末端、又は５’末端と３’末端に位置することを特徴とする請求項５に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の突出は、ｄＴｄＴまたはｄＴｄＴｄＴであっても良く、または標的遺伝子上の対応する位置のヌクレオチドと同一または相補的であることを特徴とする請求項６に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の低分子活性化核酸分子は、連続する一本鎖核酸であり、前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖と第二のオリゴヌクレオチド鎖は、前記の連続する一本鎖核酸上に位置し、かつ二本鎖構造を形成し得る相補的領域を有し、そして、前記の一本鎖核酸は二本鎖領域を形成できるヘアピン構造を持つことを特徴とする請求項１に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の低分子活性化核酸分子を構成するヌクレオチドは、化学修飾されない天然のヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の低分子活性化核酸分子における一つ又は複数のヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の化学修飾は、ヌクレオチドのホスホジエステル結合の修飾、ヌクレオチドのリボースの２’－ＯＨの修飾、ヌクレオチドの塩基の修飾、ヌクレオチドは、ロックド核酸である、及び前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖と／又は前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端のヌクレオチドは、ビニルホスホネート修飾であることから選ばれる一つ又は複数であることを特徴とする請求項１０に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の化学修飾は、ホスホロチオエート修飾、ボラノホスフェート修飾、２’－フロロ修飾、２’－メトキシ修飾、２’－オキシエチレンメトキシ修飾、２，４’－ジニトロフェノール修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、２’－アミノ修飾、２’－デオキシ修飾、５’－ブロモウラシル修飾、５’－ヨードウラシル修飾、Ｎ－メチルウラシル修飾、２，６－ジアミノプリン修飾から選ばれる一つ又は複数であることを特徴とする請求項１１に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の低分子活性化核酸分子が、脂質、脂肪酸、蛍光基、リガンド、糖類、高分子化合物、ポリペプチド、抗体、及びコレステロールから選ばれる一つ又は複数の化学基と複合することを特徴とする請求項１０に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の低分子活性化核酸分子の複合される化学基は、構造（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）の１つまたは複数から選ばれることを特徴とする請求項１３に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の低分子活性化核酸分子が、ｐ２１遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％又は少なくとも３０％アップレギュレートすることを特徴とする請求項１に記載される低分子活性化核酸分子。
前記の第一のオリゴヌクレオチド鎖と前記の第二のオリゴヌクレオチド鎖は、それぞれに以下の配列番号に示されることを特徴とする請求項１－４又は１０のいずれか一つに記載される低分子活性化核酸分子：
（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：４７９とＳＥＱＩＤＮＯ：４８０；
（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４８１とＳＥＱＩＤＮＯ：４８２；
（３）ＳＥＱＩＤＮＯ：４８３とＳＥＱＩＤＮＯ：４８４；
（４）ＳＥＱＩＤＮＯ：４８５とＳＥＱＩＤＮＯ：４８６；
（５）ＳＥＱＩＤＮＯ：４８７とＳＥＱＩＤＮＯ：４８８；
（６）ＳＥＱＩＤＮＯ：４８９とＳＥＱＩＤＮＯ：４８８；
（７）ＳＥＱＩＤＮＯ：６１とＳＥＱＩＤＮＯ：６２；
（８）ＳＥＱＩＤＮＯ：４９６とＳＥＱＩＤＮＯ：４９７；
（９）ＳＥＱＩＤＮＯ：４９８とＳＥＱＩＤＮＯ：４９９；
（１０）ＳＥＱＩＤＮＯ：４９８とＳＥＱＩＤＮＯ：５００；
（１１）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０１とＳＥＱＩＤＮＯ：４９９；
（１２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０１とＳＥＱＩＤＮＯ：５００；
（１３）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０２とＳＥＱＩＤＮＯ：５０３；
（１４）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０４とＳＥＱＩＤＮＯ：５０５；
（１５）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０６とＳＥＱＩＤＮＯ：５０７；
（１６）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０８とＳＥＱＩＤＮＯ：５０９；又は
（１７）ＳＥＱＩＤＮＯ：５１０とＳＥＱＩＤＮＯ：５１１。
請求項１－４と１６のいずれか一つに記載される低分子活性化核酸分子をコードするフラグメントを含むことを特徴とする核酸分子。
前記の核酸分子は、発現ベクターであることを特徴とする請求項１７に記載される核酸分子。
請求項１－４と１６のいずれか一つに記載される低分子活性化核酸分子又は請求項１７又は１８に記載される核酸分子を含むことを特徴とする細胞。
請求項１－４と１６のいずれか一つに記載される低分子活性化核酸分子、又は請求項１７又は１８に記載される核酸分子、と任意の、薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬品組成物。
請求項１－４と１６のいずれか一つに記載される低分子活性化核酸分子、又は請求項１７又は１８に記載される核酸分子、又は請求項１９に記載される細胞、又は請求項２０に記載される医薬品組成物を含むことを特徴とする製剤。
請求項１－４と１６のいずれか一つに記載される低分子活性化核酸分子、又は請求項１７又は１８に記載される核酸分子、又は請求項１９に記載される細胞、又は請求項２０に記載される医薬品組成物を含むことを特徴とするキット。
細胞中のｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレートする医薬品又は製剤の調製における請求項１－４と１６のいずれか一つに記載される低分子活性化核酸分子、又は請求項１７又は１８に記載される核酸分子、又は請求項１９に記載される細胞、又は請求項２０に記載される医薬品組成物の使用。
前記の使用は、増殖硝子体網膜症を治療又は緩和する医薬品又は製剤の調製であることを特徴とする請求項２３に記載される使用。
必要がある個体へ、請求項１－４と１６のいずれか一つに記載される低分子活性化核酸分子、又は請求項１７又は１８に記載される核酸分子、又は請求項１９に記載される細胞、又は請求項２０に記載される医薬品組成物、又は請求項２１に記載される製剤を投与することを含むことを特徴とする増殖硝子体網膜症を治療又は緩和する方法。