JP2008538896A - 小分子活性化ｒｎａ分子及び使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、遺伝子の非コード化核酸配列に相補的なリボ核酸鎖を含む小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）と細胞とを接触させることにより、細胞における遺伝子産物の発現を増加させるための組成物、製薬製剤、キット及び方法を提供する。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、早期出願された米国仮出願番号第６０／６７１，６６６、２００５年４月１５日出願、及び米国仮出願番号第６０／７１５，７５９、２００５年９月９日出願の利益を主張し、これらの出願はその全体が出典としてここに取り込まれる。

政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により授与された連邦政府のグラント番号ＲＯ１ＡＧ２１４１８及びＲＯ１ＣＡ１０１８４４７の下、政府のサポートによって行われた。

ＲＮＡ代謝の分野における比較的最近の知見により、ある種の二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の取り込みがＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる現象を誘導し得ることが明らかとなった。ＲＮＡｉは、例えば、メッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害することを通じて、ポリヌクレオチドが遺伝子の発現を直接又は間接に阻害するプロセスである。この現象は線虫、ショウジョウバエ及びヒトを含む様々なグループの生物の細胞中で観察されており、ヒトの疾患の遺伝学的コントロールに対する強力な治療上のアプローチを提供する。

ショートＲＮＡ二重鎖が培養中の哺乳動物細胞中に導入されると、標的ｍＲＮＡの配列特異的阻害がインターフェロンの応答なしに達成される。小分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）と称されるこれらの短いｄｓＲＮＡｓは、例えば、細胞中の標的ｍＲＮＡの９５％以上を切断するために、モル濃度以下で触媒的に作用することができる。ｓｉＲＮＡ活性に関するメカニズムの詳細、並びにその適用については、Ｐｒｏｖｏｓｔら，Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｃｅｒ，Ｅ．Ｍ．Ｂ．Ｏ．Ｊ．，２００２ Ｎｏｖ．，１， ２１（２１）：５８６４−５８７４；Ｔａｂａｒａら，Ｔｈｅ ｄｓＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＤＥ−４ Ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＲＤＥ−１， ＤＣＲ−１ ａｎｄ ａ ＤｅｘＨ−ｂｏｘ Ｈｅｌｉｃａｓｅ ｔｏ Ｄｉｒｅｃｔ ＲＮＡｉ ｉｎ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ，Ｃｅｌｌ，２００２，Ｊｕｎ．２８， １０９（７）：８６１−７１；Ｋｅｔｔｉｎｇら，Ｄｉｃｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｉｍｉｎｇ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ；及びＭａｒｔｉｎｅｚら，Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｉＲＮＡｓ Ｇｕｉｄｅ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ＲＮＡｉ，Ｃｅｌｌ ２００２，Ｓｅｐ．６，１１０（５）：５６３中に記載されている。

哺乳動物細胞中でのＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングは、現在のところ３つの異なるレベルにおけるコントロールのうち、少なくとも１つに関連すると考えられている：（ｉ）転写不活性化（ｓｉＲＮＡにガイドされるＤＮＡ及びヒストンの修飾、例えば、メチル化）（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ誘導性ｍＲＮＡ分解；及び（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ誘導性転写終結。従って、ｓｉＲＮＡを介した手法による遺伝子機能の評価、並びにｓｉＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングに基づいた治療法を開発することは、生物医学及び生物学的研究の広範囲にわたるゲノムワイドな調査を加速するであろう刺激的で価値のあるツールを提供する。

従って、未だに遺伝子発現を活性化する化合物、及びそのような化合物を遺伝病の研究及び治療のために使用する方法に対するニーズが存在する。本発明はこれらのニーズとその他に関する。

関連文献
米国特許出願公開第２００４／０２２４４０５；Ｐｒｏｖｏｓｔら，Ｅ．Ｍ．Ｂ．Ｏ．Ｊ．， １，２１（２１）：５８６４−５８７４（２００２）；Ｔａｂａｒａら，Ｃｅｌｌ，１０９（７）：８６１−７１（２００２）；Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｃｅｌｌ １１０（５）：５６３（２００２）；Ｍｅｔｔｅら Ｅｍｂｏ Ｊ １９：５１９４−２０１（２０００）； Ｓｉｊｅｎ Ｔら Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：４３６−４０（２００１）；Ｖｏｌｐｅ Ｔ． Ａ．ら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８３３−７（２００２）；Ｍｏｒｒｉｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１２８９−９２（２００４）；Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ ４３１：２１１−７（２００４）；Ｅｌｂａｓｈｉｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６：１９９−２１３（２００２）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３２６−３０（２００４）；Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１６２５−３４（１９９９）；Ｔｉｎｇら，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．３７（８）：９０６−１０（２００５）；Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ ９：４３１（７００５）：２１１−７（２００４），Ｍｏｒｒｉｓ，ら Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５（５６８８）：１２８９−９２（２００４）；Ｓｃｈｒａｍｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４６）： １２７５−９（２００５）；及びＪａｅｎｉｓｃｈら．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３３ Ｓｕｐｐｌ：２４５−５４（２００３）。

本発明の概要
本発明は、遺伝子の非コード核酸配列と相補的なリボ核酸ストランドを含む小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）と細胞を接触させることにより、細胞中の遺伝子産物の発現を増加させるための組成物、薬学的調製物、キットに関する。

本発明のこれらの点及び他の利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。
本発明は、以下の詳細な説明を添付の図面と関連づけて読むと最もよく理解できる。通常の実施に従えば、図面の種々の特徴は一定の比例に拡大されないことが強調される。逆に、種々の特徴のディメンションは任意に拡張され、明確性のために縮小される。含まれる図面は以下の図面である。

発明の詳細な説明
本発明は、遺伝子の非コード核酸配列に相補的なリボ核酸ストランドを含む小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を細胞に接触させることにより、細胞内のコード遺伝子の転写活性化を介して、遺伝子産物の活性を増大させるための組成物、薬学的調製物及び方法を提供する。また、本発明の対象となる方法を実施するためのキットも提供される。

本発明が論ぜられる前に、この発明はここに記載される特定の実施例に限定されず、もちろん、それ自体変動し得ることが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるものであるので、ここで使用される専門用語は特定の実施例のみを記述する目的のためであることも理解されるべきである。

値の範囲が示される場合、その範囲の上限と下限の間の各介在値は、他に文脈が明確に指示しない限り下限の単位の１０分の１まで、特異的に開示されていると理解されるべきである。各全ての記述される値間のより小さな範囲、又は記述される範囲の介在値及び他の全ての記述又は記述される範囲における介在値は本発明に含まれる。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、非依存的に範囲に含まれるか又は除かれ、いずれか又は両方の限定がより小さな範囲に含まれるような各範囲は、本発明に含まれ、全ての特異的に除かれた記述される範囲における限定を対象とする。記述される範囲は１又は両方の限定を含む場合、限定に含まれるものいずれか又は両方を除外する範囲は本発明に含まれる。

他に定義しない限り、ここで使用される全ての技術的及び化学的用語は本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じような意味を持つ。ここで記述されるものと類似又は等価な全ての方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、より好ましい方法及び材料をここに記載する。ここで言及される全ての刊行物は、該刊行物が関連するとして挙げられている方法及び／又は材料を開示し記述することに言及することによってここに取り込まれる。本開示内容は、取り込まれた刊行物の全ての開示内容を矛盾のある範囲で更新することが理解される。

本明細書中及び添付の請求の範囲で使用されるように、文脈が明らかに別途指示しない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」には複数の対象物が含まれる。従って、例えば、「サンプル」に対する言及には、複数のそのようなサンプルが含まれ、「分子」に対する言及には、１又は複数の分子及び当業者に既知の等価物に対する言及が含まれる。

ここで議論される刊行物は、本出願の出願日に先立つ開示に関してのみ提供されるものである。先行発明の効力によって、本発明がそのような刊行物の日付を早めるような資格を与えられてはいないという許可として理解されるべき事情は存在しない。さらに、提供される公開日は、実際の公開日と異なるかもしれず、独立して確認される必要がある。

ここで使用される「単離された」という用語は、天然に生じる環境とは異なる環境に存在する対象化合物（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）を表すことを意味する。

ここで用いられる「精製された」は、それが製造された環境から除去され、天然に相互作用しており又は製造の過程で相互作用した他の要素から少なくとも６０％フリー、好ましくは７５％フリー、最も好ましくは９０％フリーである化合物の事を示す。

「相補性」とは、他のポルヌクレオチドと塩基対を形成する能力のことである。塩基対は典型的にはアンチパラレルなポリヌクレオチドストランドでヌクレオチドユニット間の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチドストランドはワトソン−クリック様式（例えば、ＡとＴ、ＡとＵ、ＣとＧ）、又はその他二重鎖の形成を可能にする全ての様式で塩基対を形成する。

完全に相補的又は１００％相補的とは、１つのポリヌクレオチドストランドの各ヌクレオチドユニットが第２のポリヌクレオチドストランドのヌクレオチドユニットと「ミスマッチ」無く水素結合を形成し得る状況のことである。完全ではない相補性とは、２つのストランドの全てのヌクレオチドユニットが互いに水素結合しているわけではない状況のことである。例えば、２つの２０マーに関し、各ストランドの２塩基対のみが互いに水素結合している場合、該ポリヌクレオチドストランドは１０％の相補性を示す。同じ例において、各ストランドの１８塩基対が互いに水素結合している場合には、該ポリヌクレオチドストランド９０％の相補性を示す。実質的に相補的であるとは、約７９％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又はそれ以上の相補性のことである。従って、例えば、各々２９ヌクレオチドユニットの２のポリヌクレオチドにおいて、各々３’末端にｄｉ−ｄＴを含み、二重鎖領域が２７塩基対に及び、二重鎖の２７塩基対のうち２６塩基対が相補的な場合、それはｄｉ−ｄＴオーバーハングを除くと９６．３％相補的であるので、それらは実施的に相補的である。

「抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」なる用語は、安定性を増大させるなどポリヌクレオチドの物理的性質を変更し、及び／又は二本鎖ＲＮＡの細胞内への取り込みをそれ自体が促進する分子又は成分と、共有結合的又は非共有結合的に結合しているポリヌクレオチドのことを指す。「末端抱合体」は、ポリヌクレオチド又は二本鎖ポリヌクレオチドの３’及び／又は５’端へのリンカーを介して直接又は間接に結合した分子又は成分を有している。内部的抱合体は、塩基、リボースの２’位、又はワトソン−クリック塩基対を邪魔しない他の位置、例えば、５−アミノアリルウリジンに対するリンカーを介して直接又は間接に結合した分子又は成分を有している。

二本鎖ポリヌクレオチド中、二本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドストランドの１又は両方の５’端は、抱合体分子又は成分を有し、及び／又は二本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドストランドの１又は両方の３’端は抱合体分子又は成分を有し得る。

抱合体は、例えば、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖、炭水化物、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールなどのポリマー、並びに、これらのクラスの全ての物質のアナログ又は誘導体を含んでもよい。抱合体の更なる例は、コレステロールなどのステロイド、リン脂質、ジ−及びトリ−アシルグリセロール、脂肪酸、不飽和又は置換を含んでも含まなくてもよい炭化水素、酵素、基質、ビオチン、ジゴキシゲニン及びポリサッカライドである。更に他の例には、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロールなどのチオエーテル、ドデカンジオール又はウンデシルグループなどのアシル鎖、ジ−ヘキサデシル−ラク−グリセロールなどのリン脂質、トリエチルアンモニウム １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ラク−グリセル−ｏ−３−Ｈ−ホスフェート、ポリアミン、ポリエチレングレコール、アダマンタン酢酸、パルミチル成分、アクタデシルアミン成分、ヘキシルアミノカルボニル−オキシク−ホルステロール、ファルネシル、ゲラニル及びゲラニルゲラニル成分が含まれる。

また、抱合体には、検出可能な標識も含まれる。例えば、抱合体はフルオロフォアーと共有結合したポリヌクレオチドでもよい。抱合体には、ＴＡＭＵＲＡ、ＢＯＤＩＰＹなどのフルオロフォアー、Ｃｙ３又はＣｙ５などのシアニン誘導体、Ｄａｂｓｙｌ、又は当該技術分野において知られる他の全ての適当なフルオロフォアーが含まれる。

抱合体分子又は成分は、都合が良く、それを有するポリヌクレオチドの所望の活性を実質的に邪魔しない末端ヌクレオチドの全ての位置、例えば、リボシル化糖の３’又は５’位と結合してもよい。抱合体分子又は成分は、その機能が形質移入後２４時間で測定された場合において、遺伝子活性化をメディエートするｓａＲＮＡの能力が使用した細胞のインビトロにおけるアッセイにおいて８０％以上減少するなど、その機能に悪影響を及ぼす場合、ＲＮＡの所望の活性を実質的に干渉する。

「有効濃度」なる句は、細胞内の対象遺伝子の転写の増加を誘導する、ｓａＲＮＡの細胞内有効濃度のことである。特に、２４、４８、７２及び９６時間後の投与における約１０ｎＭのレベルにおいて、基底発現レベルに対する標的配列活性の、約５９％又はそれ以上、約６０％又はそれ以上、約７０％又はそれ以上、約７５％又はそれ以上、約８０％又はそれ以上の増大を含む、少なくとも約４５％又はそれ以上を超えるか又は等価の増大を提供する有効濃度、２４時間後の投与における約１０ｎＭのレベルにおいて、標的配列活性の約３０％又はそれ以上、約３５％又はそれ以上、約４０％又はそれ以上増大を含む、少なくとも約２５％又はそれ以上を超える又は等価の増大を提供するｓａＲＮＡの有効濃度、さらに、興味の有無に関わらず、有効と考えられる濃度が対象である。標的配列の活性は、当該技術分野で既知の全ての方法によって測定することができる。例えば、標的配列がプロモーターである場合、標的配列活性は転写レベル、その転写が該プロモーターと作用可能に連結又は作用可能に結合するタンパク質のレベル、又はその転写が該プロモーターと作用可能に連結又は作用可能に結合するタンパク質の活性によって測定してもよい。

「ポリヌクレオチド」なる用語はヌクレオチドのポリマーを意味し、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの一本鎖又は二本鎖分子を含み、前記ハイブリッドは、調節及び非調節なデオキシリボシル部分及びリボシル部分のポリヌクレオチド鎖（即ち、繰り返しヌクレオチド単位が糖部分の２’位に−ＯＨ、次いで−Ｈ、次いで−ＯＨ、次いで−Ｈ、等々を有する場合）を含み、また、この種のポリヌクレオチドの修飾物であって、ヌクレオチド鎖単位の任意の位置に様々な要素又は部分で置換又は付加されているもの、並びに天然又は非天然の骨格も含まれる。

「ポリリボヌクレオチド」なる用語は、１又は複数の修飾又は非修飾のリボヌクレオチド及び／又はそのアナログを含むポリヌクレオチドのことである。

「リボヌクレオチド」なる用語及び「リボ核酸（ＲＮＡ）」なる句は、天然由来又は非天然由来（人工的、合成的）の修飾又は非修飾ヌクレオチド又はポリヌクレオチドのことである。リボヌクレオチドユニットは、リボシル部分の１’位にＮ−グリコシディック結合で結合した窒素を含む塩基を有するリボシル部分の２’位と結合した酸素を含み、該リボシル部分は他のヌクレオチドと結合可能でも結合を予め除外してもよい。ここで使用される「リボ核酸」は、天然由来又は修飾された（例えば、合成技術によって製造される）リン酸バックボーンを有し、天然由来又は非天然由来で、遺伝的にコードされ、又は非遺伝的にコードされた残基を含み得る。

「デオキシリボヌクレオチド」なる用語は、糖部分の２’及び／又は３’位のＯＨ基を欠くヌクレオチド又はポリヌクレオチドのことである。そのかわり、２’及び／又は３’炭素と結合した水素を持つ。１又は複数のデオキシリボヌクレオチドを含むｓａＲＮＡ分子内において、「デオキシリボヌクレオチド」は、糖部分の２’及び／又は３’位のＯＨ基を欠き、そのかわりに、２’炭素と結合した水素をもつ。ここで使用される「デオキシリボ核酸」は、天然由来又は修飾された（例えば、合成技術によって製造される）リン酸バックボーンを有し、天然由来又は非天然由来で、遺伝的にコードされ、又は非遺伝的にコードされた残基を含み得る。

ここで使用される「遺伝子」なる用語には、適切な宿主細胞内に存在する場合に、遺伝子産物の生産を促進する核酸配列が含まれる。「遺伝子」にはタンパク質をコードする核酸配列、及びタンパク質をコードしない核酸配列が含まれ、さらに宿主細胞にとって内在性又は完全に若しくは一部組換体である遺伝子（例えば、宿主細胞へのプロモーター及びコード化配列をコードする外来性ポリヌクレオチドの導入、内在性コード化配列に隣接する異種性プロモーターの導入）が含まれる。例えば、「遺伝子」なる用語には、エクソン及びイントロンで構成される核酸が含まれる。タンパク質をコードする配列は、例えば、スタートコドンとストップコドン間のオープンリーディングフレーム中のエクソン内に含まれる。ここで使用され「遺伝子」は、例えば、プロモーター、エンハンサー及びその他当該技術分野において転写、発現又は、他の遺伝子活性（該他の遺伝子がコード化配列又は非コード化配列を含むかどうかを問わず）をコントロールすることが知られている全ての配列などの制御配列が含まれる。ある文脈において、例えば、「遺伝子」はプロモーター又はエンハンサーなどの制御配列を含む機能的核酸を記述するために使用される。組換え遺伝子の発現は、１又は複数の異種性制御配列によって制御し得る。「異種性」とは、通常、天然状態において結合していない２つの成分のことである。

「標的遺伝子」は、例えば、プロモーター、エンハンサーなどの配列を含む核酸で、これに対してｓａＲＮＡが発現の活性化達成する目的に向けられる。「遺伝子」、「標的遺伝子」のいずれか又は両方は、生物体内に自然に生じる核酸配列、導入遺伝子、ウィルス又は細菌の配列、染色体又は染色体外配列、及び／又は細胞及び／又はクロマチン中に一時的又は慢性的に形質移入又は取り込まれた核酸配列である。「標的遺伝子」は、ｓａＲＮＡを介した活性化により、タンパク質をコードする遺伝子などの他の「遺伝子」の活性を抑制することができる（該遺伝子のタンパク質産物の転写、翻訳、発現、又は存在又は活性を測定することにより）。他の例において、「標的遺伝子」はエンハンサーを含んでもよく、該エンハンサーのｓａＲＮＡを介した活性化は作用可能に結合したプロモーターの機能を増大させ、その結果、増大したプロモーター及び／又はエンハンサーと作用可能に結合したタンパク質をコードする遺伝子などの他の「遺伝子」の活性を増加させる。

「制御エレメント」は、タンパク質又はそれらが作用可能に連結又は作用可能に結合する核酸配列によりコードされるＲＮＡの転写、翻訳を制御、誘導、抑制又はその他メディエートする核酸配列である。典型的には、例えば、エンハンサー又はリプレッサー配列などの制御エレメント又は配列は、該制御エレメント又は制御配列が転写、翻訳及び／又は発現をコントロールする１又は複数制御因子の存在又は不存在に応答して、タンパク質コード核酸配列の転写、翻訳又は発現レベルをディメートする場合、タンパク質又はＲＮＡコード核酸配列を作用可能に連結又は作用可能に結合している。制御因子は、例えば、転写因子を含む。制御配列はイントロン中に見出される。

制御配列又はエレメントは、例えば、「ＴＡＴＡＡ」ボックス、「ＣＡＡＴ」ボックス、分化特異的エレメント、ｃＡＭＰ結合タンパク質応答エレメント、ステロール制御エレメント、血清応答エレメント、グルココルチコイド応答エレメント、ＳＰＩ結合エレメントなど転写因子結合エレメントなどを含む。「ＣＡＡＴ」ボックスは典型的にはタンパク質又はＲＮＡをコードする真核生物の核酸配列のスタートコドンの上流（５’方向へ）に位置する。他の制御配列の例には、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどが含まれる。さらに、制御配列を含む核酸配列の例には、ラウスサルコーマウィルス及び他のレトロウィルスの長い終結リピートが含まれる。組織特異的転写をコントロール制御配列の例は、肺、脳、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸及び膵臓組織と比較して、胎盤、気管及び子宮中でタンパク質をコードする作用可能に連結した配列の生産を好んで誘導するインターフェロンε制御配列である。数多くの制御配列が当該技術分野において知られており、上述のものは、単なる少数の例示にすぎない。

「エンハンサー」という用語、「エンハンサー配列」という成句は、エンハンサー配列の方向、プロモーター、転写開始サイト、又はエンハンサーが作用可能に連結又は結合するタンパク質をコードする核酸の最初のコドンからの距離又は空間的位置には関係なく、転写効率を増大させ得る種々の制御配列のことである。

「プロモーター」なる用語は、タンパク質をコードせず、作用可能に連結又は作用可能に結合したタンパク質コード化又はＲＮＡコード化核酸配列の転写がプロモーターによってコントロールされるようなタンパク質コード化又はＲＮＡコード化核酸配列を作用可能に連結又は作用可能に結合する核酸配列のことである。典型的には真核生物のプロモーターは１００〜５０００塩基対を含むが、この長さの範囲はここで使用される「プロモーター」なる用途に関し限定されることが意味されるものではない。典型的には、それらが採用可能に連結又は作用可能に結合するタンパク質コード化核酸配列の５’側に見出されるが、プロモーターはイントロン配列中にも見出すことができる。

「プロモーター」なる用語は、プロモーターと作用可能に連結又は作用可能に結合する同じタンパク質又はＲＮＡコード化配列と作用可能に連結又は作用可能に結合する制御配列を含むことを意味する。プロモーターは、制御エレメントを含む多くのエレメントを含み得る。

「プロモーター」なる用語には、誘導性プロモーターが含まれ、この場合、作用可能に連結したタンパク質をコードする核酸配列の転写は、誘導試薬に応答して増大する。また、「プロモーター」なる用語は、構成的で誘導性試薬で制御されないプロモーターも含む。

「作用可能に結合」及び「作用可能に連結」なる成句は、機能的に核酸配列と関連することを意味する。例えば、制御配列がコードされるタンパク質の発現に影響を及ぼし得る場合、タンパク質コード化核酸配列と作用可能に連結又は作用可能に結合する。他の例において、プロモーターは、コードされるタンパク質の転写をコントロールする場合、タンパク質コード化核酸配列と作用可能に連結又は作用可能に結合する。作用可能に連結又は作用可能に結合する核酸配列は、それらがコントロールする核酸配列と接触し得るが、「作用可能に結合」及び「作用可能に連結」なる成句は、それらがコントロールする核酸配列を制御配列が接触するような場合に限定することを意味するものではない。

「非コード化標的配列」又は「非コード化核酸配列」は、エクソン内に含まれないか又は制御配列である対象の核酸配列のことである。

「ヌクレオチド」なる用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はそれらのアナログのことである。ヌクレオチドは、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン及びその誘導体及びアナログなどのプリン、並びに、例えば、シトシン、ウラシル、チミン及びそれらの誘導体及びアナログなどのピリミジンを含む種を含む。

「ヌクレオチドアナログ」には、例えば、限定はしないが、５−位ピリミジン修飾、８−プリン修飾、シトシンの環外アミンの修飾、及び５−ブロモ−ウラシルの置換を含み；限定はしないが、２’−ＯＨがＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２又はＣＮであって、Ｒがここで定義されたアルキル部であるグループで置換される、糖修飾リボヌクレオチドを含む、塩基、糖及び／又はリン酸の化学構造に修飾を持つ核酸が含まれる。また、核酸アナログは、イノシン、ケオシン、キサンチンなどの塩基、２’−メチルリボースなどの糖、メチルホスホネート、ホスホロチオネート及びペプチドなどの非天然ホスホジエステル結合を持つヌクレオチドが含まれることも意味する。

「修飾された塩基」は、例えば、１又は複数の原子又は基の置換又は付加によって修飾されたアデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシル、キサンチン、イノシン及びケオシンなどのヌクレオチド塩基のことである。塩基部分が修飾されたヌクレオチドを含む修飾のタイプの例には、限定はしないが、個々に又は組み合わせて、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化又はアセチル化された塩基が含まれる。さらに特異的な例には、例えば、５−プロプニルウリジン、５−プロプニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン及び他の５位に修飾を有するヌクレオチド、５（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシジチン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルキシウリジン、７−デアザ−アデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジンなどのデアザヌクレオチド、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン及び４−チオウリジン及び２−チオウリジンなどの他のチオ塩基、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、ケオシン、アルケオシン、ナフチル及び置換されたナフチル基、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、プリジン−４−オン、プリジン−２−オンなど任意のＯ−及びＮ−アルキル化プリン及びピリミジン、フェニル及びアミノフェノー又は２，４，６−トリメトキシベンゼンなどの修飾されたフェノール基、Ｇ−クランプヌクレオチドとして作用する修飾されたシトシン、８−置換アデノシン及びグアニン、５−置換ウラシル及びチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、及びアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドなどが含まれる。また、修飾されたヌクレオチドには糖部分ついて修飾されるヌクレオチド、並びにその糖又はアナログを有するリボシルではないヌクレオチドも含まれる。例えば、該糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース及びその他のヘテロサイクル又はカーボサイクルに基づくものである。ヌクレオチドという用語は、当該技術分野において一般的な塩基として知られるものを含むことも意味する。例えば、一般的な塩基には、限定はしいないが、３−ニトロピロール、５−ニロトインドール又はネブラリンなどである。「ヌクレオチド」なる用語は、リボシル３’酸素をアミングループで置換した結果生じるＮ３’−Ｐ５’ホスホルアミデートを含むことを意味する。

さらに、「ヌクレオチド」なる用語は、放射活性又は蛍光部分、又はヌクレオチドに結合された質量標識など検出可能なラベルを持つものも含まれる。

「ヌクレオチドユニット」なる成句は、単一のヌクレオチド残基を指し、修飾された又は修飾されない窒素塩基、修飾された又は修飾されない糖、及び２つのヌクレオチド同士又は１つのヌクレオチドと更なる連結を阻止する抱合体との連結を可能にする修飾された又は修飾されない部分を含む。単一のヌクレオチド残基はポリヌクレオチド中に存在してもよい。従って、２７塩基を有するポリヌクレオチドは２７ヌクレオチドユニットである。

「核の取り込みを促進する修飾」なる成句は、促進された核の取り込みを提供する天然又は非天然のポリヌクレオチドの修飾を指す。「核の取り込みを促進する修飾」の例は、関連する核酸が細胞内に外部から導入された場合、細胞核に蓄積するような、核酸などの分子に対して十分な安定性を与えて、分解（例えば、ヌクレアーゼにより）に対し十分な抵抗性を付与するような、修飾されたヌクレオチド間結合などの安定化修飾である。この例では、細胞核への導入が、ヌクレアーゼに対して十分に抵抗性を示し、核酸の有効濃度が核内において達成されるように修飾された核酸の能力によって促進される。有効濃度は、核内での核酸の蓄積の結果、遺伝子又は標的配列の転写又は活性が検出可能に変動することになる濃度のことである。

「オルトエステル保護」及び「オルトエステル修飾」なる成句は、ヌクレオチドユニット内の糖部分のオルトエステルによる修飾のことを指す。好ましくは、糖部分は、リボシル部である。一般に、オルトエステルはＲＣ（ＯＲ’）_３の構造をもち、Ｒ’は同一又は異なってもよく、ＲはＨであり、アンダーラインを引いたＣはオルトエステルの中心炭素である。本発明のオルトエステルには、ヌクレオチドユニットの糖部分の炭素酸素に結合し、次に、オルトエステルの中心炭素に結合するオルトエステルが含まれる。次に、オルトエステルの中心炭素に対しては、２つの酸素が結合し、全部で３つの酸素がオルトエステルの中心炭素に結合する。中心炭素に結合したこれらの２つの酸素（いずれも糖部分の炭素には結合していない）は、次に、同一又は異なってもよい２つの部分を含む炭素原子と結合する。例えば、酸素の１つはエチル部分と結合し、他の部分はイソプロピル部分と結合することができる。例えば、ＲはＨでもよく、１つのＲ’はリボシル部分でもよく、他の２つのＲ’部分は２−メチル−ヒドロキシル部分でもよい。オルトエステルは糖部分のいかなる位置にあってもよく、例えば、２’，３’及び／又は５’位置でもよい。オルトエステル及びオルトエステル保護ポリヌクレオチドの作製方法の例は、米国特許第５，８８９，１３６及び６，００８，４００に記載されており、各々、その全体を出典としてここに取り込む。

「安定化された」なる用語は、機能を維持する間分解に耐性を示し、例えば、血清などの生物物質の存在下における半減期といった点において測定可能なｄｓＲＮＡの能力を指す。例えば、血清中におけるｓａＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの半減期はｓａＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの５０％が分解されるのに必要な時間のことである。

「二重鎖領域」なる成句は、互いに塩基対を形成する２つの相補的又は実質的に相補的なポリヌクレオチド領域のことであり、ワトソン−クリック塩基対又は相補的又は実質的に相補的なポリヌクレオチドストランド間の二重鎖を可能にする他の任意な様式のいずれかによる。例えば、２１ヌクレオチドユニットを有するポリヌクレオチドストランドは他の２１ヌクレオチドユニットのポリヌクレオチドと塩基対を形成することができるが、各ストランドの１９塩基のみが相補的又は実質的に相補的だと、「二重鎖領域」は１９塩基対から構成される。残りの塩基対は、例えば、５’又は３’オーバーハングとして存在する。さらに、二重鎖領域内において、１００％の相補的性は必要とされず；実質的な相補性が二重鎖領域内において許容される。実質的相補性は、通常、約少なくとも７９％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又はそれ以上の相補性のことである。例えば、１９塩基対から構成される二重鎖領域中のミスマッチ（即ち、１８塩基対と１つのミスマッチ）は、約９４．７％の相補性となり、二重鎖領域に実質的な相補性を与える。他の例としては、１９塩基対から構成される二重鎖領域中の３ミスマッチ（即ち、１６塩基対と３つのミスマッチ）は、約８４．２％の相補性となり、二重鎖領域に実質的な相補性を与える。

「オーバーハング」という用語は、二本鎖ポリヌクレオチド内の他方のストランドを越えて突き出した一方のストランドから生じる末端（５’又は３’）の非塩基対ヌクレオチドのことである。塩基対の水素結合を介して二重鎖を形成することができる２つのポリヌクレオドの一方又は両方は、２つのポリヌクレオチドによって共有される相補性の３’及び／又は５’末端を越えて突き出ている５’及び／又は３’末端を有する。二重鎖の３’及び／又は５’末端を越えて突き出している一本鎖領域は、オーバーハングと呼ぶ。

「遺伝子サイレンシング」なる成句は、転写レベル、ｍＲＮＡレベル、酵素活性、メチル化サイト、クロマチンの状態又は構造、翻訳レベルによって測定されるか、又は細胞又は生物システム中のその活性又は状態のその他の測定による、核酸の転写、翻訳又は発現又は活性の減少のことである。そのような活性又は状態は直接又は間接的にアッセイできる。「遺伝子サイレンシング」は、サイレンシングが生じるメカニズムに関わらず、制御配列として機能する能力、転写される能力、翻訳されてタンパク質の発現が生じる能力などの核酸配列に関連した活性の減少又は改善のことである。

ここで用いられる場合、「遺伝子の活性化」、「遺伝子を活性化する」又は「遺伝子活性化」なる用語は、交換可能であり、転写レベル、ｍＲＮＡレベル、酵素活性、メチル化サイト、クロマチンの状態又は構造、翻訳レベルによって測定されるか、又は細胞又は生物システム中のその活性又は状態のその他の測定による、核酸の転写、翻訳又は発現又は活性の増大のことである。そのような活性又は状態は直接又は間接的にアッセイできる。さらに、「遺伝子の活性化」、「遺伝子を活性化する」又は「遺伝子活性化」は、活性化が生じるメカニズムに関わらず、制御配列として機能する能力、転写される能力、翻訳されてタンパク質の発現が生じる能力などの核酸配列に関連した活性の増大のことである。

「ＲＮＡ干渉」なる成句、及び「ＲＮＡｉ」なる用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチドユニットを含むポリヌクレオチド又は二本鎖ポリヌクレオチドが遺伝子発現の破壊を通じて生物学的過程に影響を与えるプロセスのことである。このプロセスには、限定はしないが、ｍＲＮＡの分解、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡとの相互作用、並びに補助的タンパク質及びＤＮＡのメチル化による遺伝子サイレンシングが含まれる。

「ｓｉＲＮＡ」なる用語及び「ショート干渉ＲＮＡ」なる成句は、ＲＮＡｉを実施することができる二本鎖核酸で、長さが１８−３０塩基対（即ち、１８−３０塩基対の二重鎖領域）のことである。さらに、ｓｉＲＮＡなる用語及び「ショート干渉ＲＮＡ」なる成句には、リボヌクレオチド部分以外の部分が含まれ、限定はしないが、修飾されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド間結合、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド及びこれらのヌクレオチドのアナログが含まれる。これに対し、本発明のｓａＲＮＡはこれらとは異なり、従って、ｓｉＲＮＡではない。ｓａＲＮＡはＲＮＡｉ又は遺伝子サイレンシングを促進しない。

ｓｉＲＮＡｓは二重鎖であり、また、ショートヘアピンＲＮＡｓ、例えば、４−２３又はそれ以上のヌクレオチドのループＲＮＡｓ、ステムループバルジを持つＲＮＡｓ、マイクロＲＮＡｓ及びショートテンポラルＲＮＡｓも含まれる。ループ又はヘアピンループを持つＲＮＡｓは、ループが可動性リンカーなどのリンカーによりステムと連結されている構造を含んでもよい。可動性リンカーには、ステム成分の有効な分子内ハイブリダイゼーションを可能にする十分な長さ及び物質である限りにおいて、様々な化学構造が含まれる。典型的には、その長さは少なくとも約１０−２４原子の範囲である。

「ヒストン」なる用語は、真核細胞の各に見出されるタンパク質のタイプである。ヒストンと呼ばれるタンパク質のクラスは、コンパクトになるためにＤＮＡがその周りにコイルを巻くタンパク質のことである。

「哺乳動物細胞」なる成句は、ヒトを含む任意の哺乳動物の細胞のことである。この成句は、例えば、生物体又は生物体の器官などのインビボの細胞のことである。また、この成句は、例えば、細胞培養中で維持される細胞などのインビトロの細胞のことでもある。

「メチル化」なる用語は、他の分子とメチル基（−−ＣＨ_３）の結合のことである。典型的には、ＤＮＡがメチル化される場合、メチル基はヌクレオチドのシトシン、通常、ＣｐＧ配列に付加されるが、メチル化は他のサイトでも同様に起きる。例えば、ヒストン３などのタンパク質も、リジン９などのリジンにメチル化が起きる。

「脱メチル化」なる用語は、他の分子からのメチル基（−−ＣＨ_３）脱離のことである。典型的には、ＤＮＡが脱メチル化される場合、メチル基はヌクレオチドのシトシン、通常、ＣｐＧ配列から除去されるが、脱メチル化は他のサイトでも同様に起きる。例えば、ヒストン３などのタンパク質も、リジン９などのリジンに脱メチル化が起きる。

「薬学的に許容な担体」なる成句は、細胞へのｄｓＲＮＡの導入を促進する組成物のことで、限定はしないが、溶媒、分散剤、コーティング剤、抗感染剤、アイソトニック剤、本発明のポリヌクレオチド及び二本鎖ポリヌクレオチドの吸着時間又は放出時間をメディエートする薬剤を含む。「薬学的に許容な担体」の例は、天然又はカチオン性のリポソームのことで、エンドソームを脱安定化し、それによってリポソームの内容物を細胞（細胞核）へ送達ことを補助するクロロキン及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルタノラミンなどの分子も含んでよい。他の薬学的に許容な担体の例には、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアルキルシアノアシレートナノパーティクル、ポリエチレンイミン、及びエチレンジアミンコアなどの種々のコアを持つ当該技術分野で知られるＰＡＭＡＭデンドリマー（ポリアミドアミン）、及びカチオン及びアニオン機能グループ、アミン、エタノールアミン、アミノデシルなどの種々の表面機能グループが含まれる。

概要
本発明は、細胞核へ少なくとも１つの小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）分子を導入することによる遺伝子の活性化のための方法及び組成物を提供する。該ｓａＲＮＡは、遺伝子の非コード核酸配列と相補的なリボヌクレオチド配列を含み、この相補性領域は、対応する遺伝子の転写を増大させるように選択され、通常、非コード配列に相補的でない少なくとも２つの末端残基（例えば、ｄＴｄＴ）を含む。該相補性領域は、通常１４残基より多く、３０未満であり、通常２６ヌクレオチド未満である。ｓａＲＮＡは、第１のストランドと相補的な第２のストランドを持ち、第１ストランドと二重鎖領域を形成し、通常、各第１及び第２ストランドの各々の３’末端で少なくとも２つの残基がオーバーハングしている二本鎖分子として提供される。ｓａＲＮＡは二本鎖領域を形成する一本鎖分子としても提供され、第１の領域には遺伝子非コード核酸配列が含まれ、第２の領域には第１の領域と相補的なリボ核酸配列が含まれ、第１の領域と二重鎖を形成し、通常、３’末端で少なくとも２つの残基がオーバーハングしている。

本発明は一部において、ｓａＲＮＡ分子の細胞への導入が哺乳動物細胞の配列特異的な転写活性に影響を与えるという驚くべき発見に基づいている。さらに、遺伝子活性化に対する新しいメカニズムが細胞培養研究から確立された。

実施例においてさらに詳細に記述されるように、本発明は、Ｅカドヘリンプロモーター、ｐ２１プロモーター又はＶＥＧＦプロモーターを標的するｓａＲＮＡｓが、ヒト細胞中におけるＥカドヘリンのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現、ヒト細胞中におけるｐ２１のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現、ヒト細胞におけるＶＥＧＦのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を各々誘導するという発見に基づいている。理論に拘泥するつもりはないが、機構的には、ｓａＲＮＡによる転写活性（ＲｄＴＡ）はヒストンのメチル化の減少（例えば、リジン残基（例えば、リジン残基９）において観察されるヒストン３）と関連し、Ａｇｏ２タンパク質によってメディエートされる。これらの観察によって、ゲノム構造及び機能の制御におけるｓａＲＮＡに関する基本的な役割が支持され、標的遺伝子の活性化（例えば、遺伝子発現の増大）におけるｓａＲＮＡに関する治療的使用が確認される。

ある態様において、本発明は、ｓａＲＮＡ分子を哺乳動物細胞に導入することにより（ｓａＲＮＡを細胞へ直接送達か、細胞内へ導入したＤＮＡからの発現の結果達成される）遺伝子の発現を増大する（即ち、遺伝子活性化）方法を提供する。該ｓａＲＮＡ分子は該遺伝子の非コード核酸配列領域と相補的であるストランドを有し、導入の結果遺伝子発現の増加が起こる。遺伝子活性の増大は、腫瘍サプレッサー遺伝子とのからみで、例えば、細胞増殖の阻害、細胞のトランスフォーメーションの阻害及び細胞移動の阻害（例えば、抗癌剤として）において有用である。他の態様において、本発明は、少なくとも１つのｓａＲＮＡ分子を含む組成物及び薬学的調製物を提供する。

組成物
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。

前述のごとく、本発明は、遺伝子の非コード核酸配列領域（例えば、制御配列）を標的することにより、哺乳動物細胞中での遺伝子活性化（例えば、遺伝子発現の増大）の実施における使用のために、小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）分子を提供する。

ここで使用される場合、「ｓａＲＮＡ」なる用語及び「小分子活性化ＲＮＡ」なる成句は、遺伝子活性化を促進することができる分子のことであり、遺伝子の非コード核酸配列と相補的なリボヌクレオチドを含む第１のリボ核酸ストランドと、第１ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のリボ核酸ストランドから構成され、該第１及び第２ストランドは二重鎖領域を形成する。また、ｓａＲＮＡは、二本鎖領域を形成する一本鎖ＲＮＡ分子からも構成され、第１領域は遺伝子の非コード核酸配列と相補的なリボ核酸配列を含み、第２領域は第１領域と相補的なリボ核酸配列を含み、第１領域と二重鎖領域を形成する。ｓａＲＮＡ分子の二重鎖領域は、通常、長さが約１０から約５０塩基対、約１２から約４８塩基対、約１４から約４６塩基対、約１６から約４４塩基対、約１８から約４２塩基対、約２０から約４０塩基対、約２２から約３８塩基対、約２４から約３６塩基対、約２６から約３４塩基対、約２８から約３２塩基対の間であり、通常、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０塩基対の長さである。さらに、「ｓａＲＮＡ」なる用語及び「小分子活性化ＲＮＡ」なる成句には、限定はしないが、修飾されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド間結合、非ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及び前記ヌクレオチドのアナログを含む、リボヌクレオチド部分以外の部分をも含む核酸が含まれる。

ここで使用される場合、「遺伝子の活性化」、「遺伝子を活性化する」又は「遺伝子活性化」なる用語は、交換可能で、転写レベル、ｍＲＮＡレベル、酵素活性、メチル化サイト、クロマチンの状態又は構造によって測定されるか、又は細胞又は生物システム中のその活性又は状態のその他の測定による。さらに、「遺伝子の活性化」、「遺伝子を活性化する」又は「遺伝子活性化」は、活性化が生じるメカニズムに関わらず、制御配列として機能する能力、転写される能力、翻訳されてタンパク質の発現が生じる能力などの核酸配列に関連することが知られる活性の増大のことである。

本発明のｓａＲＮＡｓ化合物は、二重鎖であり、別個のストランドから構成されるか、又はショートヘアピンＲＮＡｓ、例えば、約４から約２３又はそれ以上のヌクレオチド、約５から約２２、約６から約２１、約７から約２０、約８から約１９、約９から約１８、約１０から約１７、約１１から約１６、約１２から約１５、約１３から約１４ヌクレオチドの長さのループを持つＲＮＡｓ、ステムループパルジを持つＲＮＡｓ及びショートテンポラルＲＮＡを形成する一本鎖のＲＮＡを含む。ループ又はヘアピンループを持つＲＮＡｓは、ループが可動性のリンカーによってステムに連結されるような構造を含み得る。可動性のリンカーは、十分な長さの種々の化学構造、及びステムエレメントの分子内ハイブリダイゼーションを可能にする物質から選択することができる。典型的には、全長の長さは、少なくとも約１０−２４原子である。いくつかの実施態様において、ｓａＲＮＡ分子は別個のストランド、例えば、共有結合的に連結されていない異なる２つの異なるストランドである。

本発明のｓａＲＮＡ分子には、隣接したコード化配列の転写活性化を提供する適切な長さの非コード領域に対して相補的な領域が含まれる。また、典型的には、ｓａＲＮＡ分子には、非コード配列に対して相補的でない３’末端ヌクレオチドも含まれる。典型的には、ｓａＲＮＡは、１０ヌクレオチドより多く５０ヌクレオチド未満を含み、通常、長さ約１４ヌクレオチドから約４６ヌクレオチド、長さ約１６ヌクレオチドから約４４ヌクレオチドのように１２ヌクレオチドより多く４８ヌクレオチド未満であり、長さ約１８ヌクレオチドから約４２ヌクレオチド、長さ約２０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチド、長さ約２２ヌクレオチドから約３８ヌクレオチド、長さ約２４ヌクレオチドから約３６ヌクレオチド、長さ約２６ヌクレオチドから約３４ヌクレオチド、長さ約２８ヌクレオチドから約３２ヌクレオチドを含む。代表的な実施態様において、ｓａＲＮＡ分子は、長さ約１５ヌクレオチドから約２９ヌクレオチド、長さ約１６ヌクレオチドから約２８ヌクレオチドなど、長さ約１４ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドを含み、長さ約１７ヌクレオチドから約２７ヌクレオチド、長さ約１８ヌクレオチドから約２６ヌクレオチド、長さ約１９ヌクレオチドから約２５ヌクレオチド、長さ約２０ヌクレオチドから約２４ヌクレオチド、長さ約２１ヌクレオチドから約２３ヌクレオチド、又は長さ約２２ヌクレオチドを含む。

本発明の二本鎖形態のｓａＲＮＡ分子は、典型的には、長さ１０塩基対より多く約５０塩基対未満の相補性領域を含む。いくつかの実施態様において、ｓａＲＮＡ分子は、約１４塩基対から約４６塩基対、約１６塩基対から約４４塩基対のような長さ約１２塩基対から４８塩基対の二重鎖領域を含み、長さ約１８塩基対から約４２塩基対、長さ約２０塩基対から約４０塩基対、長さ約２２塩基対から約３８塩基対、長さ約２４塩基対から約３６塩基対、長さ約２６塩基対から約３４塩基対、長さ約２８塩基対から約３２塩基対を含む。代表的な実施態様においてｓａＲＮＡ分子は、約１６塩基対から約２９塩基対、約１７塩基対から約２８塩基対のような長さ約１５塩基対から３０塩基対の二重鎖領域を含み、長さ約１８塩基対から約２７塩基対、長さ約１９塩基対から約２６塩基対、長さ約２０塩基対から約２５塩基対、長さ約２１塩基対から約２４塩基対、長さ約２２塩基対から約２３塩基対を含む。

例えば、Ｅカドヘリン遺伝子の活性化のためのｓａＲＮＡは、以下の実施例において記載するように、Ｅカドヘリンの非コード領域に対する相補的な１９ヌクレオチドの領域及び３’末端ｄＴｓを含み、ｓａＲＮＡは全長２１ヌクレオチドである。

代表的な実施耒陽において、ｓａＲＮＡ分子は、例えば、プロモーターなどの制御配列など、遺伝子の非コード核酸配列の一部と相補的であるストランドを含む。いくつかの実施態様において、ストランドは、遺伝子の非コード核酸配列と１００％相補的であり、遺伝子の非コード核酸配列約９９％相補的、約９８％相補的、約９７％相補的、約９６％相補的、約９５％相補的、約９４％相補的、約９３％相補的、約９２％相補的、約９１％相補的、約９０％相補的、約８５％相補的、約８０％相補的、約７５％相補的、約７０％相補的である。

非常に詳細に上述したように、本発明のｓａＲＮＡ分子は、例えば、プロモーターなどの制御配列など、遺伝子の非コード核酸配列の一部相補的なストランドを含む。本発明のｓａＲＮＡ分子の相補的なストランド（例えば、遺伝子の非コード核酸配列の一部と相補的なｓａＲＮＡ分子のストランド）をデザインする場合、該配列は任意のＣｐＧアイランド領域との相補性を回避するように選択される。「ＣｐＧアイランド領域」とは、ジヌクレオチドの「ＣＧ」（シトシン−グアニン）に富む任意の核酸領域のことである。ジヌクレオチド中のシトシンのメチル化は、細胞分裂を介して維持され、遺伝子発現をサイレンシングすることにより近くの遺伝子の転写レベルに影響を与え、遺伝子発現の発生的制御に重要である。理論に拘泥するわけではないが、ＣｐＧアイランドを回避することは、ＣｐＧアイランドのシトシン残基のメチル化を回避するのに役立ち、その結果、近くの遺伝子の発現をサイレンシングする。

さらに、本発明のｓａＲＮＡ分子の相補的なストランド（例えば、遺伝子の非コード核酸配列の一部と相補的なｓａＲＮＡ分子のストランド）をデザインする場合、該配列は任意のＧＣリッチ領域との相補性を回避するように選択される。「ＧＣリッチ」とは、該核酸が存在するゲノムの他の部分に存在するグアニン及びシトシンの平均数と比較して、チミン及びアデニン塩基対よりもグアニン及びシトシン塩基対をより多く含む任意の核酸領域のことである。

ＣｐＧアイランド領域又はＧＣリッチ領域は、例えば、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ｃｐｇｐｌｏｔ／のワールドワイドウェッブ上のＣｐＧＰｌｏｔ／ＣｐＧＲｅｐｏｒｔ／Ｉｓｏｃｈｏｒｅプロトコール、又はｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／ｉｎｄｅｘ１．ｈｔｍｌ．のワールドワイドウェッブ上のＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒプロトコールなどの予測プロトコールを使用して決定することができる。

さらに、遺伝子の非コード核酸配列の一部と相補的であるｓａＲＮＡ分子のストランドは、一般に、３’末端領域と比較して、その５’末端領域の標的配列に対してより低い相補性の程度を許容する。換言すれば、本発明のｓａＲＮＡ分子は、典型的には、非コード核酸配列に対して相補的ｓａＲＮＡのストランドが、ミスマッチの許容される５’末端と比較して、３’末端におけるより高度な、好ましくは完璧な相補性を有するようにデザインされる。一般には、理論に拘泥するわけではないが、３’末端領域には、相補性領域が含まれ、さらに、相補性領域の３’末端とｓａＲＮＡの３’末端は同一である（即ち、相補性領域の３’末端はｓａＲＮＡの３’端によって定義される）。

３’末端領域とは、ｓａＲＮＡ分子の３’末端から少なくとも約１０、１１、１２、１３又は１４ヌクレオチドを含み、一般には、分子のヌクレオチドの半数より多くを含まないリボヌクレオチドストランド部分のことである。いくつかの実施態様において、非コード核酸配列の一部と相補的なｓａＲＮＡ分子ストランドの３’末端は、一般に、非コード核酸配列と１００％相補的であり、約９９％相補的、９８％相補的、９７％相補的、９６％相補的又は９５％相補的であってもよい。

さらに、本発明のｓａＲＮＡ分子は、典型的には、約５０％より多く又は約３０％未満のＧＣ含量を含む遺伝子の非コード核酸配列を回避するようにデザインされる。ある実施態様では、本発明のｓａＲＮＡ分子、典型的には、約５０％より多く又は３０％未満のＧＣ含量を含み、約３２％のＧＣ含量、約３４％のＧＣ含量、約３６％のＧＣ含量、約３８％のＧＣ含量、約４０％のＧＣ含量、約４２％のＧＣ含量、約４４％のＧＣ含量、約４６％のＧＣ含量、約４８％のＧＣ含量、約５０％のＧＣ含量を含むようにデザインされる。

本発明のｓａＲＮＡ分子は、典型的には、約５０％より多く、８０％未満のＡＴ含量を含むようにデザインされる。ある実施態様においては、本発明のｓａＲＮＡ分子は、約５２％のＡＴ含量、約５４％のＡＴ含量、約５６％のＡＴ含量、約５８％のＡＴ含量、約６０％のＡＴ含量、６２％のＡＴ含量、約６４％のＡＴ含量、約６６％のＡＴ含量、約６８％のＡＴ含量、約７０％のＡＴ含量、約７２％のＡＴ含量、約７４％のＡＴ含量、約７６％のＡＴ含量、約７８％のＡＴ含量、約８０％のＡＴ含量を含むようにデザインされる。

本発明のｓａＲＮＡ分子は、典型的には、ＡＡＡＡ又はＣＣＣＣのように４又はそれ以上並んだ同一塩基の配列など、ヌクレオチドリピート及び低い複雑さの配列を含む、遺伝子の非コード核酸配列を回避するためにデザインされる。さらに、本発明のｓａＲＮＡ分子は、典型的には、１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）サイトを含む遺伝子の非コード核酸配列を回避するようにデザインされる。理論に拘泥するわけではないが、ＧＣリッチ領域、リピート及び非複雑配列を避けることは、標的配列と二重鎖を作る際に、「滑り（ｓｌｉｐｐａｇｅ）」を避けるのに役立つ（例えば、ＧＣリッチ配列は、標的と相補的に設計された全ての領域に悪影響を及ぼす様式で標的にｓａＲＮＡがアニールされ得る）。

本発明のｓａＲＮＡ分子は、非コード標的核酸配列と相補的な領域を含む。非コード標的核酸配列はエクソン内に含まれない、又は、制御配列である対象核酸配列のことである。一般に、そのような非コード標的配列は、標的遺伝子の転写開始部位からおよそ２ｋｂ上流の核酸配列で、約１．９ｋｂ、約１．８ｋｂ、約１．７ｋｂ、約１．６ｋｂ、約１．５ｋｂ、約１．４ｋｂ、約１．３ｋｂ、約１．２ｋｂ、約１．１ｋｂ、約１ｋｂ、約９５０ｋｂ、約９００ｋｂ、約８５０ｋｂ、約８００ｋｂ、約７５０ｋｂ、約７００ｋｂ、約６５０ｋｂ、約６００ｋｂ、約５５０ｋｂ、約５００ｋｂ、約４５０ｋｂ、約４００ｋｂ、約３５０ｋｂ、約３００ｋｂ、約２５０ｋｂ、約２００ｋｂ、約１５０ｋｂ、約１００ｋｂ、約５０ｋｂ上流などが含まれる。

ある実施態様において、非コード標的核酸配列には、標的遺伝子の転写開始部位から上流約５ｋｂ領域内に任意のエンハンサー配列が含まれ、約４．５ｋｂ、約４ｋｂ、約３．５ｋｂ、約３ｋｂ、約２．５ｋｂ、約２ｋｂ、約１．５ｋｂ領域などが含まれる。他の実施態様において、非コード標的核酸配列には、標的遺伝子の転写開始部位の下流の最初のイントロン配列が含まれる。そのような標的領域は、図２３、パネルＤに概略的に例示されている。標的遺伝子の非コード配列の標的位置と相補的なｓａＲＮＡｓの例は、図２３、パネルＡ（Ｅカドヘリン）、パネルＢ（ｐ２１）及びパネルＣ（ＶＥＧＦ）に示される。

ｓａＲＮＡ分子の鎖は、任意の長さの末端（５’又は３’）オーバーハング領域を有し得、それは、二本鎖ポリヌクレオチド内で他方の鎖より長く伸長している一方の鎖から生じる、塩基対合していないヌクレオチドである。さらに、このオーバーハング領域は、遺伝子の非コード配列に対しても相補的でない（非相補的領域）。オーバーハング領域を有する場合、代表的な実施形態におけるこれらの領域は、８ヌクレオチド長又はそれよりも短く、７ヌクレオチド長又はそれよりも短く、６ヌクレオチド長又はそれよりも短く、約５ヌクレオチド長、約４ヌクレオチド長、例えば、約３ヌクレオチド長又はそれよりも短く、約２ヌクレオチド長、及び約１ヌクレオチド長である。かかる実施形態において、当該領域は以下の式によりさらに表される：
３’−Ｎ_{（１＋ｎ）}−ｓａＲＮＡ−５’、又は
５’−Ｎ_{（１＋ｎ）}−ｓａＲＮＡ−３’
式中、Ｎは、天然又は非天然の、遺伝子的にコード化可能な、又は遺伝子的にコード化不可能な残基を含む任意のヌクレオチドであり、ｎは０〜７の任意の整数である。

ｓａＲＮＡのヌクレオチド、又は二本鎖ｓａＲＮＡの少なくとも一方の鎖は、所望の特徴をもたらすように修飾することができる。例えば、本発明のｓａＲＮＡ分子は、核による取り込みの増大をもたらす天然又は非天然ポリヌクレオチドの修飾を含むことができる。核による取り込みを増大させる修飾の一例は、ヌクレオチド間結合の修飾等の安定化させる修飾であり、このことは核酸等の分子に十分な安定性を付与して（例えば、ヌクレアーゼによる）分解に対し十分な抵抗性をもたらし、その結果、細胞内に核酸が外来的に導入される時に、関連した核酸を細胞核内に蓄積させることができる。この例においては、修飾核酸のヌクレアーゼに対して十分に抵抗する能力によって、細胞核への進入が促進され、その結果、有効な核酸の濃度を核内において達成することができる。

さらに、ｓａＲＮＡは、リボ核酸分子の安定性をもたらすよう修飾されている２’−Ｏ−ビス（２−ヒドロキシエトキシ）メチルオルトエステルであることができる。その他の修飾としては、例えば、骨格リン酸基修飾（例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート及びホスホロジチオエートヌクレオチド間結合）を挙げることができ、これらの修飾は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの安定性を増大させ、特に治療的用途においてそれらを有用なものとすることができる。特に有用なリン酸基修飾は、ｓａＲＮＡのホスホロチオエート又はホスホロジチオエート形態への変換である。ホスホロチオエート及びホスホロジチオエートは、それらの非修飾オリゴヌクレオチド対応物よりもｉｎ ｖｉｖｏにおいて分解に対し抵抗性を有することにより、ｓａＲＮＡの半減期が増大し、処置される対象にとって利用可能性が増大される。ｓａＲＮＡは、Ｎ３’−Ｐ５’（ＮＰ）ホスホロアミデート、モルホリノホスホロシアミデート（ＭＦ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）、又は２’−フルオロ，アラビノ−核酸（ＦＡＮＡ）を含むように修飾することもでき、これらはヌクレアーゼによる分解に対するポリヌクレオチドの抵抗性を増大させることができる（例えば、Ｆａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４０−４４； Ｔｏｕｌｍｅ（２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１７−１８を参照されたい）。

ｓａＲＮＡは、ｓａＲＮＡ分子を合成するために現在知られている、又は知られるようになる、並びに本開示から読み取ることができる任意の方法により合成することができ、当業者であれば本発明と関連して有用であると結論付けるであろう。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．独自のＡＣＥ（登録商標）技術を使用する方法等の化学合成方法を用いることができる。あるいは、テンプレート依存型の合成方法も使用することができる。合成は、本明細書中で開示される、修飾又は非修飾、天然又は非天然の塩基を用いて行うことができる。さらに、本明細書中で開示される修飾又は非修飾核酸骨格を用いても、あるいは用いずとも、合成を行うことができる。

さらに、ｓａＲＮＡ分子は、宿主細胞においてｓａＲＮＡ分子を合成するために現在知られている、又は、知られるようになる任意の方法により宿主細胞において合成することができる。例えば、ｓａＲＮＡ分子は、任意の好適なプロモーターを使用して、組み換え環状又は直線状ＤＮＡベクターから発現させることができる。ベクターから本発明のｓａＲＮＡ分子を発現させるための好適なプロモーターとしては、例えば、Ｕ６又はＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウィルスプロモーターが挙げられる。その他の好適なプロモーターの選択は当技術分野の技術範囲内である。本発明において使用するための好適なベクターとしては、米国特許第５，６２４，８０３号に記載されているものを挙げることができ、該文献の開示はその全体が本明細書中に組み入れられる。本発明の組み換えプラスミドは、特定の組織又は特定の細胞内環境においてｓａＲＮＡ分子を発現させるための誘導性又は調節性プロモーターを含むこともできる。

本発明のｓａＲＮＡ分子は、２つ別個の相補的なＲＮＡ分子、又は２つの相補的な領域を有する単一のＲＮＡ分子のいずれかの組み換え核酸ベクターから発現させることができる。本発明のｓａＲＮＡを発現させるために好適なベクターの選択、ｓａＲＮＡを発現させるための核酸配列のベクターへの挿入方法、及び、組み換えベクターの対象細胞への送達方法は、当技術分野の技術範囲内である。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６−４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ Ｔ Ｒ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８；Ｌｅｅ Ｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｌｉｎｏｌ．２０：５００−５０５；及び、Ｐａｕｌ Ｃ Ｐ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８を参照されたい、これらの全ての開示は参照により本明細書に組み入れられる。本発明で使用するために好適な送達及び細胞内での発現のためのその他の方法は、例えば、米国特許出願第２００４０００５５９３号、同第２００５００４８６４７号、同第２００５００６０７７１号に記載されており、これらの全ての開示は参照により本明細書に組み入れられる。

一旦合成されれば、本発明のポリヌクレオチドは、直ちに使用してもよいし、又は将来における使用のために保存してもよい。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、好適なバッファー中に二本鎖として保存される。多くのバッファーがｓａＲＮＡを保存するために好適であることが当技術分野において周知である。例えば、バッファーは、１００ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ｐＨ７．５、及び１ｍＭのＭｇＣｌ_２を含んでもよい。代表的な実施形態において、本発明の二本鎖ポリヌクレオチドは、４℃の状態でかかるバッファー中に１年間保存した場合、それらの活性の３０％〜１００％を保持する。より好ましくは、それらは、４℃の状態でかかるバッファー中に１年間保存した場合、それらの生物学的活性の８０％〜１００％を保持する。あるいは、組成物は、−２０℃の状態でかかるバッファー中に少なくとも１年間又はそれ以上保存することができる。通常、−２０℃の状態での１年間又はそれ以上の保存は、生物学的活性の５０％未満の減少をもたらす。より通常には、−２０℃の状態での１年間又はそれ以上の保存は、１年後又はそれ以降に生物学的活性の２０％未満の減少をもたらす。さらに、−２０℃の状態での１年間又はそれ以上の保存は、生物学的活性の１０％未満の減少をもたらす。

使用前におけるｓａＲＮＡの安定性を確実にするために、使用準備ができるまで−２０℃で乾燥状態（例えば、凍結乾燥状態）で保存してもよい。使用前に、それらは再懸濁すべきであるが、一旦、例えば、上記バッファー中に再懸濁したならば、使用するまで−２０℃の状態で保存すべきである。使用前に、上記バッファーは、約４℃又は室温で保存してもよい。トランスフェクションを行うための有効な温度は当業者には周知であるが、例えば、室温が挙げられる。

方法
本発明は、ｓａＲＮＡ分子を哺乳動物細胞の核に導入する工程を含む、遺伝子発現を増大させる方法を提供し、ｓａＲＮＡ分子は遺伝子の非コード核酸配列領域に相補的な鎖を有し、導入は遺伝子発現の増大をもたらす。一般的に、「遺伝子発現を増大させること」とは、その活性化が生じるメカニズムにかかわらず、遺伝子が転写される能力、それが翻訳されてタンパク質の発現を生じる能力の増大のことを言う。

一般的に、本発明の方法は細胞をｓａＲＮＡ分子と接触させることにより行うことができ、このｓａＲＮＡ分子は、遺伝子の非コード核酸配列に相補的なリボヌクレオチド配列を含む第１のリボ核酸鎖と、第１の鎖と相補的なヌクレオチド配列を含む第２のリボ核酸鎖とを含み、第１及び第２の鎖はｓａＲＮＡ分子における約１５〜約３０塩基対同士の領域で二本鎖を形成しており、導入により遺伝子発現における増大がもたらされる。

代表的な実施形態において、遺伝子発現の増大は、例えば、ｓａＲＮＡ分子が存在しない状態の対照と比較した場合、核酸配列と関連する転写において少なくとも約２倍の増大又はそれ以上になる。いくつかの実施形態において、遺伝子発現の増大は、少なくとも約２．５倍の増大又はそれ以上、少なくとも約３倍の増大又はそれ以上、少なくとも約３．５倍の増大又はそれ以上、少なくとも約４倍の増大又はそれ以上、少なくとも約４．５倍の増大又はそれ以上、少なくとも約５倍の増大又はそれ以上、少なくとも約５．５倍の増大又はそれ以上、少なくとも約６倍の増大又はそれ以上、少なくとも約６．５倍の増大又はそれ以上、少なくとも約７倍の増大又はそれ以上、少なくとも約７．５倍の増大又はそれ以上、少なくとも約８倍の増大又はそれ以上、及び、約１５倍の増大又はそれ以上、約２０倍の増大又はそれ以上、例えば、２５倍の増大又はそれ以上を含む、約１０倍までの増大又はそれ以上の増大をもたらす。遺伝子発現又は活性の増大は、当技術分野において周知の任意の様々な方法により測定することができる。遺伝子発現又は活性を調べる好適な方法としては、核酸転写レベル、ｍＲＮＡレベル、酵素活性、メチル化の状態、クロマチンの状態又は構造、或いは、細胞又は生物系における核酸の活性又は状態のその他の指標を調べることが挙げられる。

ｓａＲＮＡ分子の細胞への導入後、この導入によりヒストンのメチル化（例えば、リジンの位置における）の減少がもたらされる。したがって、ｓａＲＮＡ分子の細胞への導入は、ヒストン分子、例えばヒストン３、の脱メチル化を、通常はリジン残基、例えば、リジン９残基の位置においてもたらす。

本発明の修飾ｄｓＲＮＡの機能保持能力及び化合物の分解に対する抵抗能力は、塩基配列、細胞型、又はそれが導入される種に依存していないため、本発明は、限定するものではないが、ヒトを含む、広範な哺乳動物にわたって適用することができる。本発明は、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ハムスター、マウス、及びラット等の齧歯類、並びに、例えば、ゴリラ、チンパンジー、及びヒト等の霊長類等の哺乳動物における使用に対して特に有利である。トランスジェニック哺乳動物を使用してもよく、例えば、キメラ遺伝子配列を有する哺乳動物が挙げられる。トランスジェニック動物を作製する方法は当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第５，６１４，３９６号を参照されたい。

本発明は生殖細胞系並びに体細胞等の多様な細胞型と共に有利に使用することができる。細胞は幹細胞又は分化細胞であってもよい。例えば、細胞型は、胚細胞、卵母細胞精細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、造骨細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺又は外分泌腺の細胞であってもよい。

本発明は、限定するものではないが、糖尿病、アルツハイマー病及び癌等の疾患に関わるもの等のヒトゲノム遺伝子、並びに、上記生物のゲノムにおける全ての遺伝子を含む広範な遺伝子の活性化（例えば、発現の増大）に使用するために適用することができる。さらに、本発明の組成物及び方法は、核酸ベクターに導入される遺伝子等の組み換え遺伝子を標的とするために使用することもできる。

本発明の組成物及び方法は、現在知られている又は知られるようになる並びに本開示から読み取ることができる任意の方法により細胞に投与又は適用することができ、当業者であれば、本発明によりそれが有用であることが結論付けられるであろう。例えば、ポリヌクレオチドを、細胞に受動的に送達させることができる。

修飾ポリヌクレオチドの受動的取り込みは、例えば、センス鎖の５’末端におけるポリエチレングリコール成分又はコレステロール成分等のコンジュゲートの存在により、及び／又は、薬学的に許容可能な担体等の適当な環境において、変化させることができる。

ｓａＲＮＡは、現在知られている又は知られるようになる、並びに、本開示から読み取ることができる任意の方法により細胞に送達することができ、当業者であれば、細胞膜及び／又は核膜にｓａＲＮＡを通過させようとする場合に、本発明と関連してそれは有用であると決定するであろう。これらの方法としては、限定するものではないが、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム、陽イオン性脂質／リポソーム、ミセル、圧力操作、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、イムノポレーション、ウィルス（例えば、ＲＮＡウィルス）等のベクターの使用、プラスミド、細胞融合、及び、抗体、抗原、又は受容体等の特異的なコンジュゲート又はリガンドとのポリヌクレオチドの結合、受動的導入、取り込みを容易にする成分のｓａＲＮＡへの添加等を用いるトランスフェクション等の任意のトランスフェクション様式が挙げられる。

本発明の安定化ｄｓＲＮＡは、限定するものではないが、基礎研究、創薬及び開発、診断及び治療を含む多様な用途群において使用することができる。例えば、本発明は、ある遺伝子産物が創薬及び開発のための標的であるか否かを検証するために使用することができる。この用途においては、対象の標的核酸配列は、活性化（例えば、発現の増大）について同定される。例えば、対象となる特定の標的配列の調節配列を特異的に標的とするｓａＲＮＡと細胞を接触させる。標的ＤＮＡのメチル化及び／又は、例えば１種類又はそれ以上のヒストン等核タンパク質のメチル化が可能な条件下で細胞は維持され、それにより遺伝子の活性又は転写の低下が生じる。例えば、遺伝子の転写又は翻訳等の任意の活性の増大の程度を、増大した活性の影響と共に次に評価して、活性が増大しているか否か、次に、対象の核酸配列が創薬又は開発のための標的であるか否かが判定される。このように、表現型的に望ましい効果は、特定の対象標的核酸のｓａＲＮＡによる活性化と関連している可能性があり、適当な場合においては、毒性及び薬物動態学的研究を行い、治療用調製物を開発することができる。

本発明は、疾患又は障害の動物モデルを提供するために、対象となる疾患又は障害の原因又は因子であると信じられている対象標的核酸の活性を増大させることにより（例えば、転写又は翻訳を増大させることにより）生物の疾患又は障害の一時的又は恒常的状態を誘導するという用途において使用することもできる。対象となる標的核酸の活性の増大は、場合によって、疾患又は障害を悪化させるか、又は、対象の疾患又は障害を改善若しくは治癒する傾向があり得る。同様に、対象となる標的核酸の活性の増大は、場合によって、疾患又は障害を引き起こすか、悪化するか、又は、改善若しくは治癒する傾向があり得る。対象の標的核酸はゲノム又は染色体核酸、又はウィルス核酸等の染色体外核酸を含むことができる。対象となる標的核酸としては、例えば、非コードＤＮＡ、調節ＤＮＡ、反復ＤＮＡ、逆反復、中心体ＤＮＡ、ユークロマチン領域におけるＤＮＡ、ヘテロクロマチン領域におけるＤＮＡ、プロモーター配列、エンハンサー配列、イントロン配列、エクソン配列等の全様式の核酸を挙げることができる。

さらに、本発明は、診断、予防、及び治療等の用途において使用することができる。これらの用途のために、対象となる特定標的遺伝子の操作による調節に敏感に反応する疾患又は障害を有する疑いのある生物は、ｓａＲＮＡを投与することにより処置される。ｓａＲＮＡ処置の結果は、特定の疾患又は障害に対して改善的、緩和的、予防的、及び／又は診断的であることができる。代表的な実施形態において、ｓａＲＮＡは、希釈剤を伴い又は伴わずに、薬学的に許容可能な担体と共に、薬学的に許容可能な様式で投与される。

いくつかの実施形態においては、腫瘍抑制遺伝子の発現を増大させることが望ましい。そのようなものとして、かかる遺伝子における遺伝子活性を増大させるように機能する薬剤は、細胞増殖性疾患、例えば、癌等の、無制御の細胞増殖によって生じる任意の症状、障害又は疾患の処置において有用である。癌は本発明の化合物を使用して処置することができる症状の一例である。細胞増殖性疾患の処置における使用のために第２の化合物と組み合わせた本発明のｓａＲＮＡの使用は特に興味深い。本発明の方法による処置のために好適な例示的癌としては、結直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、腎細胞癌等が挙げられる。

例示的腫瘍抑制遺伝子としては、限定するものではないが、ｐ５３、ｐ２１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＰＣ、ＲＢ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＣＣ、ＤＰＣ４（ＳＭＡＤ４）、ＭＡＤＲ２／ＪＶ１８（ＳＭＡＤ２）、ＭＥＮ１、ＭＴＳ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＰＴＥＮ、ＶＨＬ、ＷＲＮ、及びＷＴ１が挙げられる。対象となるその他の遺伝子としては、限定するものではないが、ＮＯＳ１（ｎＮＯＳ）及びＮＯＳ３（ｅＮＯＳ）を含む一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子、ｅ−カドヘリン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）等の増殖因子等が挙げられる。

ｓａＲＮＡを含む本発明の方法による処置に適した対象としては、新生物疾患（例えば、癌）等の細胞増殖性疾患を有する個体が挙げられる。細胞増殖性疾患は、限定するものではないが、新生物疾患症状、例えば癌、を含む、望ましくない細胞の繁殖によって特徴付けられる。細胞増殖性疾患の例としては、限定するものではないが、内皮細胞の異常な増殖（例えば、アテローム性動脈硬化症）、固形癌及び腫瘍転移、良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫、血管機能障害、異常創傷治癒、炎症性疾患及び免疫疾患、ベーチェット病、痛風又は痛風性関節炎、例えば、関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症に伴う異常血管新生、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植拒絶、神経性緑内障及びオスター・ウェッバー症候群等のその他の眼における血管新生疾患（水晶体後方における繊維形成性）、乾癬、動脈狭窄、真菌感染、寄生虫感染及びサイトメガロウィルス感染等のウィルス感染が挙げられる。本発明の方法に従って処置される対象としては、上記疾患のいずれかを有する任意の個体が挙げられる。

本発明は細胞増殖性疾患を有する患者の処置のみに限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、本発明の方法から恩恵を受け得る特定遺伝子の発現低減と関連する症状又は疾患を有する患者の処置を含むと解釈されるべきである。

かかる対象は、対象となるｓａＲＮＡの活性及び有効性をアッセイするために試験することができる。１つ又はそれ以上のパラメータにおける有意な改善は有効性の指標である。様々な因子（例えば、疾患等の重篤度、投与される化合物等の患者に依存する因子等）に従う患者に対する最適な恩恵を提供するために、投与計画及び投与量を調整することは、通常のヘルスケア従事者（例えば、医師）の十分に技術範囲内である。

本発明の化合物を含む医薬調製物
上記した本発明のｓａＲＮＡ化合物の医薬調製物も本発明により提供される。本発明のｓａＲＮＡ化合物は、様々な経路による治療的投与のための多様な製剤に含有させることができる。より特定的には、本発明の化合物は、適当な薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤及び／又はアジュバントと組み合わせることにより、医薬組成物として製剤化することができ、固体、半固体、液体又は気体形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射、吸入剤及びエアロゾルとして、滅菌バイアル又はシリンジ中に製剤化することができる。製剤が経皮投与用である場合、化合物は、検出可能なＤＭＳＯは含まないか、又は、ＤＭＳＯに加えて担体と共に製剤化するのが好ましい。製剤は、それを必要としている対象又は患者に、経口、舌下、経直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内等を含む多数の異なる経路により投与するために設計することができる。投与は全身性であることもでき、又は、処置を必要としている部位への製剤の送達、例えば、腫瘍への局所送達等の局所送達であることができる。

ビヒクル、アジュバント、担体又は希釈剤等の本発明と共に使用することができる薬学的に許容可能な賦形剤は公衆にとって容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝化剤、浸透圧調整剤、安定化剤、湿潤剤等の薬学的に許容可能な補助物質は公衆にとって容易に入手可能である。

好適な添加ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等又はその混合物である。さらに、所望であれば、ビヒクルは、少量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝化剤等の補助物質を含んでもよい。かかる投与形態の実際の調製方法は、当業者には周知であるか又は明らかである。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい。投与される組成物又は製剤は、任意の事象において、処置される対象の所望の状態を達成するために適当な薬剤の量を含むことになる。

本発明の化合物の投与形態
医薬投与形態において、本発明の対象であるｓａＲＮＡ化合物は、それらの薬学的に許容可能な塩の形態で投与してもよく、或いは、それらは単独で使用してもよく、又は、その他の薬学的に活性な化合物と適当に結合させ、並びに組み合わせて投与してもよい。以下の方法及び賦形剤は例示にすぎず、何ら限定的なものではない。

薬剤は、全身的な、又は局所的な経路を含む、従来の薬物送達のために好適な任意の可能な従来法及び経路を用いて宿主へと投与することができる。通常、本発明により意図される投与経路は、必ずしも限定される必要はないが、肺内又は鼻腔内輸送等、腸内、腹腔内、又は吸入による経路を含む。

従来の、かつ薬学的に許容可能な投与経路には、鼻腔内、肺内、気管内、腫瘍内、皮下、皮内、局所的適用、静脈内、直腸内、経鼻、経口及びその他の非経口的経路が挙げられる。投与経路は所望の場合、組み合わせることができ、あるいは薬剤及び／又は所望される効果に依存して調整され得る。組成物は単一投与量又は複数の投与量で投与され得る。

経口調製物に関しては、主題のｓａＲＮＡ組成物は単独で、又は、錠剤、粉末、顆粒又はカプセルを製造するための好適な添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ又はポテトスターチ等の従来の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン等の結合剤；コーンスターチ、ポテトスターチ又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等の分解剤；タルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑剤；及び所望により希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤及び香料等と組み合わせて使用される。

吸入による投与以外の非経口的な投与経路には、必ずしも限定される必要はないが、局所的、皮内、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、髄腔内、胸骨内、静脈内経路、すなわち消化管を経由する以外の任意の経路を含み、また、特に腫瘍が固体又は半固体腫瘍である場合（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫等）における、局所的な注入対象である腫瘍内又は腫瘍周辺への注入を含む。生物学的区画を規定する組織（例えば、前立腺、卵巣、心臓の領域（例えば、心膜により規定される心膜腔）、くも膜下腔、滑膜腔等）への局所的な注入もまた対象となる。非経口的投与は、全身性又は局所的な薬物の輸送に影響を及ぼすために行い得る。全身的な輸送が所望される場合には、投与は典型的には、侵襲的又は全身に吸収される医薬調製物の局所的又は経粘膜的投与を含む。

皮膚又は粘膜を経由する投与方法は、必ずしも限定される必要はないが、好適な医薬調製物の局所的な適用、経皮的送達、注射又は表皮への適用を含む。経皮的送達のためには、吸収促進剤又はイオン導入が好適な方法である。イオン導入による送達（Ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）は、電気パルスを介して連続的に数日以上の期間、無傷の皮膚を通じてそれらの産物を輸送する市販の「パッチ」を用いて行われる。

本発明の主題のｓａＲＮＡ組成物は、植物性又はその他の同様のオイル、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸又はプロピレングリコールのエステル、コラーゲン、コレステロール等の水性又は非水性の溶媒へとそれらを溶解、懸濁又はエマルジョン化することにより調製物へと製剤化することができ；所望される場合には、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、エマルジョン化剤、安定剤及び保存料等の従来の添加剤と共に製剤化することができる。

ｓａＲＮＡ化合物はまた、腸内投与により輸送され得る。腸内の投与経路は、必ずしも限定される必要はないが、経口及び直腸内（例えば、坐剤を用いて）送達を含む。

さらに、主題のｓａＲＮＡ化合物は、エマルジョン化基材又は水溶性基材等の各種の基材と混合することにより坐剤へと調製することができる。本発明の化合物は坐剤を介して直腸的に投与することができる。坐剤はカカオバター、カーボワックス、及びポリエチレングリコール等のビヒクルを含むことができ、それらは体温で溶解するが室温では固体化されている。

本発明の化合物の投与量
主題及び処理される条件及び投与経路に依存して、主題のｓａＲＮＡ化合物を、例えば、１日あたり０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与することができる。特定の実施形態において、所望の効果が達成されるまで治療的投与を繰り返す。その範囲は広範である、なぜなら通常、異なる哺乳類に関する治療効果は大きく異なり、ヒトにおいてはラットよりも通常（単位体重あたり）２０、３０又は４０倍以上も小さいからである。同様に、投与のモードは投与量において大きな影響を及ぼし得る。したがって、例えば、経口の投与量は注射の投与量の約１０倍であり得る。局所化された経路での輸送に関しては、より高い投与量が用いられる場合がある。

典型的な投与量は、静脈内投与に好適な溶液であり得；一日２〜６回服用する錠剤、又は一日一回服用する、比率として高い含量の活性成分を含む徐放性カプセル又は錠剤等であり得る。徐放性の効果は、異なるｐＨ値において溶解するカプセル素材により、浸透圧によりゆっくりと放出するカプセルにより、又は制御された放出における任意のその他公知の方法により得ることができる。

当業者であれば、投与量のレベルが特定の化合物の機能として異なり得、症状の深刻さ、及び、被検体が副作用を受けやすいかどうかが異なり得ることを直ちに理解するであろう。所定の化合物に対する投与量は、当業者によって容易に、各種の手段により調べることが可能である。

投与量は、達成すべき臨床的目標に依存して異なりはするが、好適な投与量範囲は、主題の化合物が被験動物中の症状を低減させるための、約１μｇ〜約１，０００μｇ、又は約１０，０００μｇまでの主題の組成物を提供するものである。

例えば、シロップ、エリキシル剤、及び懸濁液等の経口又は直腸投与に関する単位投与量が提供され、例えば、ティースプーン１杯、テーブルスプーン１杯、錠剤又は坐剤等という各投与ユニットは、予め決められた量の組成物を含有する１又はそれ以上の本発明の化合物を含有する。同様に、注射又は静脈内投与のための単位投与量は、滅菌水溶液における組成中に、正常生理食塩水又はその他の薬学的に許容可能な担体としてこの化合物を含んでもよい。

本発明の化合物を使用する併用療法
本発明の方法における使用のために、本発明の化合物は、生物学的活性を活性化又は抑制するその他の薬剤、例えば、化学治療薬を含むその他の薬学的に活性な薬剤と共に製剤化することができ、さもなければ、併用して投与することができる。本発明の化合物は、別の化学物質、例えば医薬の有効性を増大させるために、又は、別の化学物質、例えば医薬の所望の生物学的活性を得るために必要な量を低減させるために使用することができる。

併用療法において使用するための化学治療薬の例としては、限定するものではないが、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イフォスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソウレア、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトリキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲンシタビン、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が挙げられる。

さらに、本発明のｓａＲＮＡ化合物はｓｉＲＮＡ分子との併用療法においても使用することができる。かかる実施形態において、ｓａＲＮＡ分子は第１の遺伝子の活性化を増大させるために投与することができ、ｓｉＲＮＡ分子は第２の遺伝子の発現を封じるために投与することができる。例えば、ｓａＲＮＡ分子は腫瘍抑制遺伝子の活性化を増大させるために投与することができ、ｓｉＲＮＡ分子は癌遺伝子の発現を封じるために投与することができる。

本発明の化合物との併用療法において使用するために本明細書中で開示される化合物は、投与する本発明の化合物と同じ投与経路（例えば、肺内、経口、経腸等）により投与することができる。あるいは、本発明の化合物との併用療法において使用するための化合物は、投与する本発明の化合物と異なる投与経路により投与することができる。
キット

本発明の化合物の単位投与形態を有するキットは、通常は経口用又は注射投与用として提供される。かかるキットにおいては、単位投与形態を含む容器の他に、対象となる病的状態を処置する際における薬物の用途及び付随する利点を記載する情報パッケージ挿入物が存在し得る。代表的な化合物及び単位投与形態は本明細書中に上記されたものである。

一実施形態において、キットは滅菌バイアル又はシリンジ中にｓａＲＮＡ製剤を含み、この製剤は、哺乳動物、特にヒトにおける注射のために好適であり得る。
（実施例）

以下の実施例は、本発明を作製し使用する方法の完全な開示と記載を当業者に提供するために示され、発明者らが自分たちの発明とみなす範囲を限定することを意図するものでなく、以下の実験を全て又は一部の実施を表すことを意図しているのではない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関する正確性を確保するために努力はしているが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮すべきである。特に明記しない限り、割合は重量部であり、分子量は加重平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又は大気圧近傍である。

以下の方法及び材料を以下の実施例において使用した。

ｓａＲＮＡの設計及び合成
全てのｓａＲＮＡは手動的に設計され、ホモロジー検索は、ヒトゲノムデータベース中のその他の非標的配列と実質的ホモロジーを共有する配列を排除するために、（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕにおいてワールドワイドウェブにおいて利用可能な）ＵＣＳＣヒトゲノムデータベースを参照することにより行った。２つの対照ｓａＲＮＡ（ｓａＣｏｎｔｒｏｌ及びｓａＣｏｎ−２）は、全ての既知のヒト配列とのホモロジーを欠如するように特に設計された。ｓａＲＮＡは、ｄＴｄＴ３’オーバーハングを用いてインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カールズバッド、カリフォルニア州）により化学的に合成された。各遺伝子について少なくとも２つの別バッチの合成ｓａＲＮＡをトランスフェクション実験のために使用した。ｓａＲＮＡ配列は以下に示される。
ｓａＥｃａｄ−Ｐ１（−３１２／−２８４）：
センス：5'- AGAACUCAGCCAAGUGUAA[dT][dT] - 3' （配列番号０１）
アンチセンス：5 '- UUACACUUGGCUGAGUUCU[dT] [dT] - 3'（配列番号０２）
ｓａＥｃａｄ−Ｐ１−２６（３’末端に５ヌクレオチド付加することにより２６ヌクレオチドに伸長されたｓａＥｃａｄ−Ｐ１）：
センス：5'- AGAACUCAGCCAAGUGUAAAAGCC[dT][dT] - 3'（配列番号０３）
アンチセンス：5'- GGCUUUUACACUUGGCUGAGUUCU[dT][dT] - 3'（配列番号０４）
ｓａＥｃａｄ−Ｐ２（−２１５／−１９７）：
センス：5'- AACCGUGCAGGUCCCAUAA[dT][dT] - 3'（配列番号０５）
アンチセンス：5'- UUAUGGGACCUGCACGGUU[dT][dT] - 3' （配列番号０６）
ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−５（ｓａＥｃａｄ−Ｐ２のアンチセンス５’末端で５−ｂｐが変異している）：
センス：5 '- AACCGUGC AGGUCCUU AUC [dT] [dT] - 3' （配列番号０７）
アンチセンス：5'- GAUAAGGACCUGCACGGUU[dT][dT] - 3' （配列番号０８）
ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−３（ｓａＥｃａｄ−Ｐ２のアンチセンス３’末端で５−ｂｐが変異している）：
センス：5'- CGUAAUGCAGGUCCCAUAA[dT][dT] - 3'（配列番号０９）
アンチセンス：5'- UUAUGGGACCUGCAUUACG[dT] [dT] - 3' （配列番号１０）
ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−２６（３’末端に５ヌクレオチド付加することにより２６ヌクレオチドに伸長されたｓａＥｃａｄ−Ｐ２）：
センス：5'- AACCGUGCAGGUCCCAUAACCCAC[dT][dT] - 3' （配列番号１１）
アンチセンス：5'- GUGGGUUAUGGGACCUGCACGGUU[dT][dT] - 3'（配列番号１２）
ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−１６（１６ヌクレオチドになるまでその５’末端から切断されたｓａＥｃａｄ−Ｐ２）：
センス：5'- UGCAGGUCCCAUAA[dT][dT] - 3’（配列番号１３）
アンチセンス：5'- UUAUGGGACCUGCA[dT][dT] - 3'（配列番号１４）
ｓａＥｃａｄ−Ｐ３（−５６／−３３）：
センス：5 '- GCGGUACGGGGGGCGGUGCCUCCGG - 3' （配列番号１５）
アンチセンス：5'- GGAGGCACCGCCCCCCGUACCGCUG - 3' （配列番号１６）
ｓａＥｃａｄ−８３７（−１６６／−１８４）：
センス：5'- CUAGCAACUCCAGGCUAGA[dT][dT] - 3'（配列番号１７）
アンチセンス：5'- UCUAGCCUGGAGUUGCUAG[dT][dT] - 3' （配列番号１８）
ｓａＥｃａｄ−９４７（−５６／−７４）：
センス：5'- UGAACCCUCAGCCAAUCAG[dT][dT] - 3' （配列番号１９）
アンチセンス：5'- CUGAUUGGCUGAGGGUUCA[dT] [dT] - 3' （配列番号２０）
ｓａＥｃａｄ−９６２（−４１／−５９）：
センス：5'- UCAGCGGUACGGGGGGCGG[dT][dT] - 3' （配列番号２１）
アンチセンス：5'- CCGCCCCCCGUACCGCUGA[dT][dT] - 3'（配列番号２２）
ｓａＰ２１−３２２（−３２２／−３０３）：
センス：5'- CCAACUCAUUCUCCAAGUA[dT][dT] - 3' （配列番号２３）
アンチセンス：5'- UACUUGGAGAAUGAGUUGG[dT][dT] - 3'（配列番号２４）
ｓａＰ２１−３２２−Ｇ５’（ｓａＰ２１−３２２のアンチセンス５’末端で５−ｂｐが変異している）：
センス：5' - CCAACUCAUUCUCCCGUUC[dT][dT] - 3' （配列番号２５）
アンチセンス：5' - GAACGGGAGAAUGAGUUGG[dT][dT] - 3' （配列番号２６）
ｓａＰ２１−３２２−Ｇ３’（ｓａＰ２１−３２２のアンチセンス３’末端で５−ｂｐが変異している）：
センス：5' - UGUGGUCAUUCUCCAAGUA[dT][dT] - 3' （配列番号２７）
アンチセンス：5' - UACUUGGAGAAUGACCACA[dT][dT] - 3' （配列番号２８）
ｓａＰ２１−３２２−ｍ（ｓａＰ２１−３２２の中間領域の５−ｂｐが変異している）：
センス：5 ' - CCAACUUUCCAUCCAAGUA[dT] [dT] - 3 ' （配列番号２９）
アンチセンス：5 ' - UACUUGGAUGGAAAGUUGG[dT] [dT] - 3 '（配列番号３０）
ｓａＶＥＧＦ−７０６（−７０６／−６８８）：
センス：5' - GCAACUCCAGUCCCAAAUA[dT][dT] - 3' （配列番号３１）
アンチセンス：5' - UAUUUGGGACUGGAGUUGC[dT][dT] - 3' （配列番号３２）
ｓａＣｏｎｔｒｏｌ：
センス：5 '- ACUUACGAGUGACAGUAGA[dT] [dT] - 3' （配列番号３３）
アンチセンス：5'- UCUACUGUCACUCGUAAGU[dT][dT] - 3'（配列番号３４）
ｓａＣｏｎ−２
センス：5' - ACUACUGAGUGACAGUAGA[dT][dT] - 3' （配列番号３５）
アンチセンス：5' - UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT] - 3' （配列番号３６）

ｓｉＲＮＡ設計及び合成
Ａｇｏ特異的ｓｉＲＮＡをマイスターら（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．），モレキュラー・セル（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．）１５：１８５（２００４）に記載されるように合成した。ｓｉＲＮＡ配列は以下に示される。
ｓｉＡｇｏ２
センス：5' - GCACGGAAGUCCAUCUGAAUU - 3'（配列番号３７）
アンチセンス：5' - pUUCAGAUGGACUUCCGUGCUU - 3' （配列番号３８）
ｓｉＡｇｏ１
センス：5' - GAGAAGAGGUGCUCAAGAAUU - 3' （配列番号３９）
アンチセンス：5' - pUUCUUGAGCACCUCUUCUCUU - 3' （配列番号４０）
ｓｉＡｇｏ３
センス：5' - GAAAUUAGCAGAUUGGUAAUU - 3'（配列番号４１）
アンチセンス：5' - pUUACCAAUCUGCUAAUUUCUU - 3'（配列番号４２）
ｓｉＡｇｏ４
センス：5' - GGCCAGAACUAAUAGCAAUUU - 3'（配列番号４３）
アンチセンス：5' - pAUUGCUAUUAGUUCUGGCCUU - 3'（配列番号４４）
ｓｉＡｇｏＣ
センス： 5' - UUCUCCGAACGUGUCACGUUU - 3' （配列番号４５）
アンチセンス：5' - pACGUGACACGUUCGGAGAAUU - 3' （配列番号４６）

細胞培養及びトランスフェクション
ヒト前立腺癌細胞株であるＰＣ−３、ＤＵ−１４５、及びＬＮＣａＰを、１０％の胎児ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、５％のＣＯ_２の湿度環境において、３７℃にて培養した。ＨｅＬａ、Ｊ８２、Ｔ２４、ＨＥＫ２９３細胞を、２ｍＭのＬ−グルタミン、アール（Ｅａｒｌｅ）のＢＳＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び１０％のＦＢＳを添加した最小栄養培地（イーグル）中で培養した。ＭＣＦ−７及びＨｅＬａ細胞に、さらに１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリンを添加した。トランスフェクションの前日、抗生物質を含まない生育培地中に、細胞を５０〜６０％の密度でプレーティングした。リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って用いてｓａＲＮＡによるトランスフェクションを実行し、７２時間持続させた（例外は経時変化実験の間に生じた）。１〜１０μＭの５−アザシチジン存在下で、Ｅ−カドヘリンｓａＲＮＡによってＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。インターフェロン−α２ａ（シグマ（Ｓｉｇｍａ），セントルイス，ミズーリ州）処理を、ＰＣ−３細胞において、特定濃度にて行った。

核酸抽出
全細胞ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡは、製造業者の教示に従うことにより、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，シンシナティ，オハイオ州）を使用して抽出した。

ウェスタン分析
培養細胞はＰＢＳを用いて洗浄し、Ｍ−ＰＥＲタンパク質抽出バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ロックフォード，イリノイ州）を用いて溶解した。細胞溶解物を１２，０００ｇにて１０分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質を定量し、次いで同濃度となるように希釈した。７．５〜１５％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルを使用してサンプルを分離した。分離されたタンパク質をポリビニリデンジフロリド製の膜へと移し、その膜を５％の無脂肪ドライミルクを用いて一晩ブロッキングした。膜を抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ， Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）、抗ＧＡＰＤＨ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ， Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ）、抗Ｅ−カドヘリン（Ｚｙｍｅｄ， Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）、又は抗Ｐ２１（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）抗体を用いて１時間イムノブロッティングし、次いで５分間洗浄した。次いで膜を、抗Ｅ−カドヘリン（Ｚｙｍｅｄ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）又は抗ｐ２１（Ｕｐｓｔａｔｅ）抗体と共にさらに１時間インキュベートした。５分間の洗浄を３回した後、膜を２次抗体と共にインキュベートした。免疫反応性のタンパク質を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｌｕｍｉｎｏ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）により検出した。

免疫細胞化学
ガラス製カバースリップ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＮＹ）上に生育させた単層細胞において、Ｅ−カドヘリンに対する免疫染色を実行した。トランスフェクション７２時間後に、細胞を４％のパラホルムアルデヒド中で固定し（２０分間）、７０％、９０％、及び１００％のエタノール浴に、順に供した。スリップをブロッキングバッファー中で３０分間浸透後に、マウス抗Ｅ−カドヘリン（Ｚｙｍｅｄ）を加えて４℃で一晩インキュベートした。免疫染色をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識２次抗体（Ｚｙｍｅｄ）を用いて視覚化した。過剰な２次抗体を除去した後に、プロピジウムイオダイド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＯＲ）を用いた核の対比染色を行った。スライドを、Ｌｅｉｃａ共焦点レーザー顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，ＰＡ）によって倍率８００倍で撮影した。対照実験は一次抗体を使用せずに行った。

ゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩修飾、ＰＣＲ増幅及びクローニング
先に開発されたオンラインプログラムであるＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １８：１８９２−１８９７（２００４））を用いて、重亜硫酸塩ゲノム配列解析ＰＣＲのためのプライマーを設計した。ＣｐＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を製造者の説明に従って用いて、ＤＮＡ（１μｇ）の重亜硫酸塩修飾を実行した。重亜硫酸塩修飾されたＤＮＡを先に記載された方法で増幅した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：７０２−７０６（２０００））。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローニングし、ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとトランスフェクトした。各ＰＣＲ反応から得られた１０個の陽性クローンをランダムに選択して、２ｍｌのＬＢ培地中で一晩生育させた。プラスミドＤＮＡを単離し、配列解析を行った。重亜硫酸配列解析ＰＣＲのためのプライマーは以下の通りである。
Ｅ−カドヘリン
Ｓ１（センス）：5'- ATTTTAGTTTGGGTGAAAGAGTGAG - 3'（配列番号４７）
Ｓ２（アンチセンス）：5'- AACCCTCTAACCTAAAATTACTAAAATCTA - 3'（配列番号４８）
Ｓ１及びＳ２の産物：−３７０〜−１６１
Ｓ３（センス）：5'- TTTAGTAATTTTAGGTTAGAGGGTTAT -3' （配列番号４９）
Ｓ４（アンチセンス）：5'- AAACTCACAAATACTTTACAATTCC -3' （配列番号５０）
Ｓ３及びＳ４の産物：−１９３〜＋３５。

クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ
ＣｈＩＰアッセイキット（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ， ＮＹ）を販売者の説明に従って使用し、ＣｈＩＰアッセイを実行した。手短にいえば、細胞を、１００ｍｍのディッシュ中でｓａＲＮＡにて７２時間トランスフェクトした。次いでホルムアルデヒドを最終濃度１％となるよう細胞に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を次いで溶菌し、超音波処理した。超音波処理されたサンプルを、サケ精子ＤＮＡ／プロテインＡアガローススラリーにより予めきれいにし、抗体と共に、又は抗体を伴わずに４℃で一晩インキュベートした。ヒストンのメチル化パターンにおける特定の変化を検出するために、リジン９におけるヒストンの脱メチル化（Ｈ３ｍ２Ｋ９）、及びリジン４におけるヒストンの脱メチル化（Ｈ３ｍ２Ｋ４）（Ｕｐｓｔａｔｅ）を認識する抗体を使用した。サケ精子ＤＮＡ／プロテインタンパク質Ａアガローススラリーを用いてクロマチン−抗体複合体を回収し、洗浄後にクロスリンクを外した。免疫沈降されたＤＮＡをＰＣＲにより分析した。９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間、２５〜３２サイクルのＰＣＲを行った。使用されたＣｈＩＰ ＰＣＲプライマーは以下の通りである：
Ｅ−カドヘリンＣｈＩＰプライマー（−３５９／−７１）
センス：5'- GGTGAAAGAGTGAGCCCCATCTC-3' （配列番号５１）；
アンチセンス：5'-TTCACCTGCCGGCCACAGCCAATCA-3' （配列番号５２）．
ｐ２１プロモータープライマー（−４３４／−２７８）
センス：5'- CAGCTGCATTGGGTAAATCC - 3'（配列番号５３）
アンチセンス：5'- GACACATTTCCCCACGAAGT - 3'（配列番号５４）

半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
Ｅ−カドヘリンｓａＲＮＡトランスフェクション実験全体にわたって、Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いた半定量的ＲＴ−ＰＣＲを実行した。各逆転写反応について、全細胞ＲＮＡ（５０ｎｇ）を使用した。ｐ２１及びＶＥＧＦ ｓａＲＮＡトランスフェクション実験のために、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）トランスクリプターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。得られたｃＤＮＡサンプルは、Ｅ−カドヘリン、ｐ２１、ＶＥＧＦ、Ａｇｏ２、ＧＡＰＤＨ、ＯＡＳ１、又はＯＡＳ３に特異的なプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。ＧＡＰＤＨの増幅はローディングコントロールとした。ｃＤＮＡサンプルもまた、ｐ２１及びＥ−カドヘリンプロモーター中に位置する潜在的転写産物の増幅のためのランダムヘキサマープライマーを用いて作製した。ＲＴ−ＰＣＲプライマー配列は以下の通りであった：
Ｅ−カドヘリン：
センス：5'- CCTGGGACTCCACCTACAGA -3' （配列番号５５）
アンチセンス：5'- GGATGACACAGCGTGAGAGA -3' （配列番号５６）
ＧＡＰＤＨ：
センス：5'- TCCCATCACCATCTTCCA -3' （配列番号５７）
アンチセンス：5'- CATCACGCCACAGTTTCC -3' （配列番号５８）
β−アクチン：
センス：5'- TCTACAATGAGCTGCGTGTG -3' （配列番号５９）
アンチセンス：5'- ATCTCCTTCTGCATCCTGTC -3' （配列番号６０）
ＯＡＳ１：
センス：5'- GCTGGAAGCCTGTCAAAGAG -3' （配列番号６１）
アンチセンス：5'- GAGCTCCAGGGCATACTGAG -3'（配列番号６２）
ＯＡＳ３：
センス：5'- TACCACCAGGTGTGCCTACA -3' （配列番号６３）
アンチセンス：5'- AAAGCATGGGTGGTCATAGC -3'（配列番号６４）
ｐ２１
センス：5' - GCCCAGTGGACAGCGAGCAG - 3' （配列番号６５）
アンチセンス：5' - GCCGGCGTTTGGAGTGGTAGA - 3' （配列番号６６）
ｐ５３
センス：5' - CCTCACCATCATCACACTGG - 3' （配列番号６７）
アンチセンス：5' - TCTGAGTCAGGCCCTTCTGT - 3' （配列番号６８）
ＶＥＧＦ
センス：5'- CCCACTGAGGAGTCCAACAT - 3' （配列番号６９）
アンチセンス：5'- AAATGCTTTCTCCGCTCTGA - 3' （配列番号７０）
Ａｇｏ１：
センス：5' - GCGAATTGGGAAGAGTGGTA - 3' （配列番号７１）
アンチセンス：5' - GCAGGTGCTGGGATAGAGAC - 3' （配列番号７２）
Ａｇｏ２：
センス：5' - CGCGTCCGAAGGCTGCTCTA - 3' （配列番号７３）
アンチセンス：5' - TGGCTGTGCCTTGTAAAACGCT - 3'（配列番号７４）
Ａｇｏ３：
センス：5' - ATCCCAGCTGGAACAACAGT - 3' （配列番号７５）
アンチセンス：5' - GCGTACGTAAGTGTGGCAGA - 3' （配列番号７６）
Ａｇｏ４：
センス：5' - GGGTAGGGAAAAGTGGCAAT - 3' （配列番号７７）
アンチセンス：5' - GAGCGAGTGCACCTCACATA - 3'（配列番号７８）

マウス異種腫瘍モデルの確立
１２匹の４週齢の胸腺欠損ホモ接合型雄ヌードマウスを、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．より購入した。５日間の訓化期間後、合計５．０×１０^６個のＰＣ−３細胞を、０．３ｍｌのＰＢＳ中で、ゲージ２５の針を介してマウスの下部脇腹へと皮下（ｓ．ｃ．）接種した。２週間後、腫瘍が平均体積約５５ｍｍ^３に到達したとき、腫瘍を有するヌードマウスをランダムに２つの処理群に分け、１群はｐ２１ｓａＲＮＡ（ｓａＰ２１−３２２）を用いて、もう１群は対照ｓａＲＮＡ（ｓａＣｏｎｔｒｏｌ）を用いて処理した。

動物へのｓａＲＮＡの送達
ｉｎ ｖｉｖｏ ｊｅｔＰＥＩ（商標）（ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）、鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、ｓａＲＮＡの腫瘍内送達を実行した。５％のグルコース溶液に溶解した４０マイクログラムのｓａＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、同じく５％のグルコース溶液に溶解した６．４μｌのｉｎ ｖｉｖｏ ｊｅｔＰＥＩ（商標）と混合した（Ｎ／Ｐ比率：８）。この混合物を、注入前に室温に１５分間置いた。得られたＰＥＩ−ｓａＲＮＡ複合体を、ゲージ２７の針を用いて腫瘍へと注入した。ｓａＲＮＡの注入は３日毎に９日間、合計３回繰り返した。マウスの体重及び腫瘍の大きさを毎週記録した。最初の処理から４週間後にマウスを屠殺し、腫瘍を除去して秤量した。腫瘍体積は次式：体積＝（幅）^２×長さ／２により、ｍｍ^３で計算した。

免疫組織化学法
パラフィン包埋した腫瘍塊を５μｍに切断し、切片を５５℃で１時間乾燥させた。緩衝液（０．０５ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて再水和した後、切片を０．３％の水素ペルオキシダーゼのメタノール溶液により１０分間処理して、内在性のペルオキシダーゼを不活化させた。抗原回復は、スライドを１０分間、１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．０中でオートクレーブすることによって行った。３％の正常ヤギ血清により４時間ブロッキング後、切片を、ＰＢＳで１：１００に希釈した抗ｐ２１一次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と共に、恒湿槽中、一晩４℃でインキュベートした。２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ、ｐＨ７．８を用いて切片を洗浄し、次いで２次抗体と共に３０分間インキュベートした。ジアミノベンジジンをクロマゲンとして用いたアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法（Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ．）により免疫染色を行い、次いでヘマトキシリンにより対比染色を行った。

Ｅ−カドヘリン遺伝子プロモーターを標的とするｓａＲＮＡはＥ−カドヘリンｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を引き起こす
タンパク質の発現を引き起こすためにエピジェネティックなコードが標的とされ得るか否かを試験するために、Ｅ−カドヘリンプロモーターに対する２種類の２１ヌクレオチドからなる低分子活性化ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ）（ｓａＲＮＡ）を設計し、化学合成した。ｓａＲＮＡ（ｓａＥｃａｄ−Ｐ１）のうちの１つはＥ−カドヘリンプロモーター上のＣｐＧアイランドの上流にある領域（転写開始点に対して−３１２／−２８４の部位）を標的とするように設計され；２番目のｓａＲＮＡ（ｓａＥｃａｄ−Ｐ２）はＣｐＧアイランドの５’側の境界（−２１５／−１９７）を標的とするように設計された。公知のヒト配列に対する相同性を欠く、２１−ヌクレオチドからなる対照ｓａＲＮＡ（ｓａＣｏｎｔｒｏｌ）も設計された。ヒト前立腺癌細胞株であり、Ｅ−カドヘリンの構成的発現が低いＰＣ−３細胞を、分析のために選択した。

ｓａＥｃａｄ−Ｐ１又はｓａＥｃａｄ−Ｐ２によりトランスフェクトされたＰＣ−３細胞中では、トランスフェクトしない細胞と比較して、トランスフェクション７２時間以内にＥ−カドヘリンタンパク質の発現における劇的な誘導が観察された（図１、パネルＡ、及び図２）。ｓａＥｃａｄ−Ｐ１及びｓａＥｃａｄ−Ｐ２は、タンパク質発現においてそれぞれ３．１及び８．４倍の増加を引き起こした。２種のｓａＲＮＡを組み合わせて用いたとき、Ｅ−カドヘリンの発現はさらに増強された（１３．４倍の誘導）。Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡの発現もまた、ｓａＥｃａｄ−Ｐ１及びｓａＥｃａｄ−Ｐ２の両方によって、タンパク質発現の誘導と非常に類似した変化の程度を伴って誘導され（図１、パネルＢ）、この誘導が転写レベルのものであることを示唆した。しかし、ｓａＣｏｎｔｒｏｌは、Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡ及びタンパク質発現における効果を示さず（図１、パネルＡ及びＢ、及び図２）、ｓａＲＮＡによるＥ−カドヘリンの誘導が配列特異的であるという示唆を示した。これらの結果は、２つの別々のバッチから合成したｓａＲＮＡを用いた少なくとも５回の独立した実験において再現性を有していた。ｓａＲＮＡにより誘導されたＥ−カドヘリンの発現は、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２を用いてトランスフェクトした細胞中で、擬似的にトランスフェクトした細胞及びｓａＣｏｎｔｒｏｌによりトランスフェクトされた細胞と比較してＥ−カドヘリン染色がより強いということを示す免疫細胞化学法によって、さらに確認された（図３）。

２５ヌクレオチド長からなり、高いＧＣ含有率（８４％）を有する第３のｓａＲＮＡ（ｓａＥｃａｄ−Ｐ３）は、Ｅ−カドヘリンの発現を誘導しなかった（図１、パネルＡ及びＢ、レーン９及び１０、及び図２）。

Ｅ−カドヘリンプロモーターを標的とするｓａＲＮＡは長期に及ぶＥ−カドヘリンの発現及び細胞死を引き起こす
ｓａＲＮＡ指向性転写活性化（ＲｄＴＡ）をさらに特徴付けるため、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２を用いたさらなる研究を行った。用量反応試験により、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２が１ｎＭという低濃度でＥ−カドヘリンの発現を誘導し、その誘導が１〜１０ｎＭの範囲で濃度依存的であることが示された（図４）。投与量が１０ｎＭを超えても、さらなるＥ−カドヘリン発現の増加はもたらされなかった。経時変化試験により、Ｅ−カドヘリンタンパク質の発現がｓａＲＮＡトランスフェクションから４８時間以内に起こり、７２時間でピークとなることが示された（図５、パネルＡ及びＢ）。

ＰＣ−３細胞中での、より長期間のトランスフェクションも試験された。擬似的にトランスフェクトした細胞及びｓａＣｏｎｔｒｏｌによりトランスフェクトされた細胞はトランスフェクション後も健常な成長を維持したのに対し、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２によりトランスフェクトされた細胞は５日目から徐々に生存能力を失った（図６、パネルＣ）。１４日後に生き残った細胞は存在しなかった。この知見は、Ｅ−カドヘリンの強制的な発現が細胞サイクル捕捉及びアポトーシスを介することによる細胞の成長阻害をもたらすという先の研究と合致する（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５６：１５１５−２５（２０００）；Ｓｔｏｃｋｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５４：１１８５−９６（２００１））。さらに、ｓｉＥｃａｄ−Ｐ２トランスフェクト細胞においては、フィロポディア形成や、指状の突起（図６、パネルＣ）も観察された。この表現型は、Ｅ−カドヘリンにより引き起こされる接着性増加に関連する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：３６９９９−７００５（２０００））。

ｓａＲＮＡ活性化の持続効果を調べるために、トランスフェクトした細胞中での１０日間及び１３日間のＥ−カドヘリンタンパク質の発現も調べた。細胞が死滅するため、１３日間より長い評価は不可能であった。予期せぬことに、１０日目及び１３日目において、１０日目の擬似的にトランスフェクトした細胞中のものと比較して、ｓｉＥｃａｄ−Ｐ２トランスフェクト細胞中でＥ−カドヘリン発現のそれぞれ１４及び３．８倍の増加が検出され（図６、パネルＡ及びＢ）、ＲｄＴＡが持続を維持でき恒久的であり得ることが示唆された。この知見は興味あるものである、なぜなら、ｓｉＲＮＡトランスフェクションによる典型的なＲＮＡｉは一時的なものであり、ｓｉＲＮＡが使い尽くされれば、その効果は５〜７日で失われると考えられているからである（Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ＲｅｖＭｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４：４５７−６７（２００３）；Ｎｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ８：６８１−６（２００２）；及びＴｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：４４６−８（２００２））。転写誘導が長期持続することに関しては、ｓａＲＮＡがＤＮＡ標的に結合した後に、ヒストン修飾における変化に関与するエピジェネティックなマークを刻み込み、それがｓａＲＮＡの非存在下での細胞分裂にわたり維持されているというものであると説明するのが妥当である。このため、エピジェネティックなメカニズムがＲｄＴＡに関与しているか否かを後に試験した。

ｓａＲＮＡはＤＵ１４５及びＨＥＬＡ細胞におけるＥ−カドヘリンの発現を誘導する
ＲｄＴＡがその他の細胞中で起こるか否かを試験するために、ｓａＲＮＡをヒト前立腺癌細胞株のＤＵ１４５及び子宮頸癌細胞株のＨｅＬａ細胞へとトランスフェクトした。ＤＵ１４５においては、Ｅ−カドヘリンのＣｐＧアイランドはメチル化されておらず（図１９、パネルＣ）、細胞は通常レベルのＥ−カドヘリンを発現する（図７、パネルＡ及びＢ）。中程度で一貫したレベルのＥ−カドヘリンタンパク質及びｍＲＮＡ発現の誘導が、ｓａＥｃａｄ−Ｐ１及びｓａＥｃａｄ−Ｐ２処理に対する反応として、ＤＵ１４５細胞中で観察された（図７、パネルＡ及びＢ）。対照的に、ＨｅＬａ細胞はＥ−カドヘリンを発現せず、Ｅ−カドヘリンのＣｐＧアイランドは高度にメチル化されている。ｓａＲＮＡトランスフェクション（７２時間）は、ウェスタンブロッティングによって検出されるようなＥ−カドヘリンの発現を発現できなかった。先に確立されたＣｐＧアイランドのメチル化が、ｓａＲＮＡの転写活性化を妨げるのかもしれない。この仮説を試験するために、ＨｅＬａ細胞を低濃度（１〜１０μＭ）の５’−アザ−シチジン（Ａｚａ−Ｃ）存在下でトランスフェクトした。Ａｚａ−Ｃは単独で、低レベルのＥ−カドヘリンｍＲＮＡ発現を誘導した（図８、ＲＴ−ＰＣＲ）。しかし、細胞を低投与量のＡｚａ−Ｃ及びｓａＲＮＡの両方で処理したときには、Ｅ−カドヘリンの発現は、Ａｚａ−Ｃ単独の処理を行った時よりもかなり高いレベルへと上昇した（図８）。Ｅ−カドヘリンタンパク質は、Ａｚａ−Ｃ及びｓａＥｃａｄ−Ｐ１を用いて共処理した細胞のウェスタンブロット分析によってのみ検出可能であった（図８、Ｗ．Ｂ．）。これらの知見は、遺伝子プロモーター上の抑制的メチル化マーカーがｓａＲＮＡの転写活性化を妨げ得るという見解を支持する。

ｓａＲＮＡはＥ−カドヘリンの発現及びＩＮ ＶＩＶＯにおける腫瘍の成長／転移阻害を誘導する
２×１０^６個のＰＣ−３前立腺癌胞を、８週齢の免疫不全ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の前立腺の背側葉へと全身麻酔下で接種することにより、同所性前立腺癌／転移モデルを確立した。マウスは２、３及び４週目に、ハイドロダイナミックトランスフェクション法を用いてｓａＲＮＡを与えられる。手短にいえば、５０μｇのｓａＥｃａｄ−Ｐ２及びｓａＣｏｎｔｒｏｌを１ｍｌのＰＢＳ中に溶解し、得られる溶液を迅速に尾静脈へと注入する。擬似的な処理としては、１ｍｌのＰＢＳを注入する。

マウスを腫瘍細胞接種後８週目に屠殺する。前立腺中の原発腫瘍全体を切除し、秤量する。全ての外腸骨リンパ節及び仙骨リンパ節ならびにその他の肉眼的に拡大された領域のリンパ節を、全てのマウスから回収する。肺は縦隔リンパ節及び心臓と共に回収する。肝臓、脳及び四肢の長骨も各マウスから単離する。これらの組織を１０％のホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋して、ヘマトキシリン及びエオシン染色のため１５μｍ間隔で切断する。腫瘍性及び転移性の疾患は組織学的検査によって確認する。前立腺中でのＥ−カドヘリンの発現は免疫組織化学法により評価する。

ｓａＲＮＡはＰ２１のｍＲＮＡ及びタンパク質発現を誘導する
ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１／Ｓｄｉ１（ｐ２１）は、サイクリン／サイクリン依存的キナーゼ（ＣＤＫ）複合体の阻害剤として最初に同定された、細胞増殖を負に調節する主要なチェックポイントコントロールタンパク質のひとつである。二本鎖ＲＮＡが遺伝子の転写を活性化するという別の例として、ｓａＲＮＡにより誘導される発現のためにｐ２１が選択された。２１ヌクレオチドからなるｓａＲＮＡ（ｓａＰ２１−３２２）を、ｐ２１の転写開始点に対して−３２２の位置のｐ２１遺伝子プロモーター配列を標的として設計し、化学的に合成した。

ｓａＲＮＡ分子であるｓａＰ２１−３２２がｐ２１の発現を誘導するか否かを試験するために、ｓａＰ２１−３２２をヒトＰＣ−３、ＭＣＦ−７及びＨｅＬａ細胞へとトランスフェクトした。図９に示すように、ｓａＰ２１−３２２は、ｐ２１のｍＲＮＡ及びタンパク質発現を、全ての試験した細胞中で顕著に増加させた。さらに、ｐ５３の発現は、ｓａＲＮＡトランスフェクションによって影響を受けなかった。ヒト胚腎臓細胞ＨＥＫ−２９３、膀胱癌細胞Ｊ８２及びＴ２４、及びヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを含む４つのさらなる細胞株も試験した。結果（図１０）は、ｓａＲＮＡ分子であるｓａＰ２１−３２２によるトランスフェクションがｐ２１タンパク質の誘導を様々な程度で引き起こすことを示した。

上記に示すように、ヒトｐ２１プロモーターを標的とする単独のｓａＲＮＡは、全ての試験した細胞において、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方で強いｐ２１の発現を誘導する。この誘導は配列特異的である、なぜなら、何らかの配列に対するホモロジーを欠く対照ｓａＲＮＡはｐ２１発現を誘導しないからである。さらに、ｓａＲＮＡによるｐ２１の誘導はｐ５３に非依存的である、なぜなら何らかのｓａＲＮＡトランスフェクト細胞中でｐ５３に関する発現の変化は観察されず、またＰＣ−３細胞はｐ５３を欠くためである。

ｓａＲＮＡはＩＮ ＶＩＴＲＯでの腫瘍細胞増殖を阻害する
ｐ２１は、公知の細胞周期における負の調節因子である。従って、培養細胞におけるｐ２１の発現増加が細胞増殖の阻害をもたらすであろうと仮定された。ＰＣ−３、ＭＣＦ−７及びＨｅＬａ細胞を対照ｓａＣｏｎ−２又はｐ２１のｓａＲＮＡ分子であるｓａＰ２１−３２２のいずれかによりトランスフェクトした。結果は、対照ｓａＲＮＡ分子であるｓａＣｏｎ−２でトランスフェクトした細胞と比較して、ｓａＰ２１−３２２であるｓａＲＮＡでトランスフェクトした細胞が、顕著に遅れた成長を示すことを示す（図１１）。

ｓａＲＮＡはＶＥＧＦの発現を誘導する
ＲｄＴＡの一般性をさらに試験するために、ｓａＲＮＡによる血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡ発現の誘導も試験した。ＶＥＧＦの転写開始点に対し−７０６の位置でＶＥＧＦプロモーターを標的とする２１ヌクレオチドのｓａＲＮＡ（ｓａＶＥＧＦ−７０６）を設計し、化学合成した。このｓａＲＮＡをＨｅＬａ細胞中へ７２時間トランスフェクトした。ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出した。全細胞ＲＮＡ（１μｇ）を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写した。得られたｃＤＮＡを、２つのアイソマー（ＶＥＧＦ１８９及び１６５）を同時に増幅するＶＥＧＦプライマーを用いて増幅した。擬似的にトランスフェクトした細胞と比較して、ｓａＶＥＧＦ−７０６でトランスフェクトした細胞は、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ１６５のｍＲＮＡ発現において、それぞれ３．７及び４倍の増加を示し；一方、対照ｓａＲＮＡはＶＥＧＦの発現に何ら影響しなかった（図１２）。

標的配列に対するｓａＲＮＡの相補性分析
標的部位に対するｓａＲＮＡ分子の相補性を分析するために、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２分子に基づく２つの変異ｓａＲＮＡ分子を作製した。この変異ｓａＲＮＡ分子は、ｄｓＥｃａｄ−Ｐ２のアンチセンス鎖に関する５’末端における５つの塩基対ミスマッチ（ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−５）、又は３’末端における５つの塩基対ミスマッチ（ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−３）のいずれかを含んでいた。図１３、パネルＡ〜Ｃ中にｓａＲＮＡの概略図を示す。ＰＣ−３細胞を５０ｎＭの各ｓａＲＮＡでトランスフェクトし、７２時間培養し、Ｅ−カドヘリン及びβ−アクチンの発現をウェスタンブロット分析により調べた。

結果は、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２が、Ｅ−カドヘリンの発現の顕著な増加をもたらしたことを示す（図１３、パネルＤ及びＥ、レーン３又は４）。ｓａＥｃａｄ−Ｐ２アンチセンス鎖の３’末端における５塩基対（ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−３）に対する変異は、Ｅ−カドヘリンの活性化に及ぼすｓａＥｃａｄ−Ｐ２の効果に影響せず（図１３、パネルＤ及びＥ、レーン５及び６）、一方、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２アンチセンス鎖の５’末端に対する変異（ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−５）は、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２の効果を完全に失わせた（図１３、パネルＤ及びＥ、レーン７及び８）。

さらに、ｓａＰ２１−３２２由来の３つの変異ｓａＲＮＡを、５’末端における５−ｂｐ変異体（ｓａＰ２１−３２２−Ｇ５’、アンチセンス鎖に対して）、３’末端における５−ｂｐ変異体（ｓａＰ２１−３２２−Ｇ３’）、及び中央領域における５−ｂｐ変異体（ｓａＰ２１−３２２−ｍ）を含むＰＣ−３及びＨｅＬａ細胞中で試験した（図１３、パネルＦ）。Ｅ−カドヘリンのｓａＲＮＡ変異分析から得られた結果と一致して、ｓａＰ２１−３２２アンチセンス鎖の５’末端に対する変異体（ｓａＰ２１−３２２−Ｇ５’）は、ｐ２１の発現をＰＣ−３及びＨｅＬａ細胞の両者において活性化するための能力を失った（図１３、パネルＧ及びＨ）。３’末端又は中央領域のいずれかに対する変異は、ｐ２１を活性化するための能力を様々な程度で保っていた（図１３、パネルＧ及びＨ）。これらの結果は、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２及びｄｓａＰ２１−３２２におけるアンチセンス鎖の５’部分（「シード」配列）が転写の活性化を開始するために重要であり、一方３’末端又は中央領域に対するミスマッチは容認されることを示す（図１３、パネルＣ）。

従って、結果は、ｓａＲＮＡによって起こる転写活性化が高度に配列特異的であり、ｓａＲＮＡの作用が非コードＤＮＡ配列上のその標的部位に対するアンチセンス鎖の結合に関連していることを示す。さらに結果は、１４ヌクレオチドという小さい相補的な領域を有するｓａＲＮＡがＲｄＴＡを引き起こし得ることを示す。

ｓａＲＮＡのサイズ及び遺伝子活性化
ＲｄＴＡに関する配列要件を調べるため、２６ヌクレオチド長の（ｓａＥｃａｄ−Ｐ１−２６及びｓａＥｃａｄ−Ｐ２−２６）、又は１６ヌクレオチド長に短くした（ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−１６）ｓａＲＮＡを作製した。図１４のパネルＡは、Ｅ−カドヘリンプロモーターを標的とする２１ヌクレオチドのｓａＲＮＡ（ｓａＥｃａｄ−Ｐ２）、Ｅ−カドヘリンプロモーターを標的とする２６ヌクレオチドのｓａＲＮＡ（ｓａＥｃａｄ−Ｐ１−２６及びｓａＥｃａｄ−Ｐ２−２６）、及びＥ−カドヘリンプロモーターを標的とする１６−ヌクレオチドのｓａＲＮＡ（ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−１６）の概略の説明を示す。

ＰＣ−３細胞を、既に記載のように５０ｎＭのｓａＲＮＡを用いてトランスフェクトし、７２時間培養して、Ｅ−カドヘリンの発現をウェスタンブロット分析により調べた。結果は、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２（図１４、パネルＢ、レーン２）がＥ−カドヘリンの発現を増加させ、２６ヌクレオチドのｓａＥｃａｄ−Ｐ１−２６（図１４、パネルＢ、レーン３）、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−２６（図１４、パネルＢ、レーン４）、及び１６ヌクレオチドのｓａＥｃａｄ−Ｐ２−１６（図１４、パネルＢ、レーン５）は、２１ヌクレオチドのｓａＥｃａｄ−Ｐ２ほどにはＥ−カドヘリンの発現を十分に活性化しないことを示した。これらの結果は、ＧＡＤＰＨに対して標準化し、ｓａＣｏｎｔｒｏｌで処理した細胞に対する倍率の変化としてプロットしたＥ−カドヘリンタンパク質のレベルを示す図１４、パネルＣ中で、さらに示される。これらの結果は、大きさ約２１ヌクレオチドのｓａＲＮＡがＲｄＴＡにとって好適であることを示す。

Ｅ−カドヘリン転写を誘導できないＥ−カドヘリンプロモーターのＣ _Ｐ Ｇアイランド（ＧＣリッチな領域）を標的とするｓａＲＮＡ
ｓａＲＮＡにより誘導される転写活性化に関する標的要件を分析するために、Ｅ−カドヘリンプロモーターのＣｐＧアイランドを標的とし、高いＧＣ含量を有する３つのさらなるｓａＲＮＡ分子（ｓａＥｃａｄ−８３７、ｓａＥｃａｄ−９４７及びｓａＥｃａｄ−９６２）を作製した。ｓａＲＮＡ分子の位置の概略図を図１５、パネルＡ中に示す。ＰＣ−３細胞を、５０ｎＭの各ｓａＲＮＡを用いてトランスフェクトし、７２時間培養して、Ｅ−カドヘリンの発現をウェスタンブロット分析により調べた。

結果は、ｓａＥｃａｄ−Ｐ１及びｓａＥｃａｄ−Ｐ２がＥ−カドヘリン転写を引き起こし（図１５、パネルＢ、レーン２及び３）、一方、ＣｐＧアイランドを標的とするｓａＥｃａｄ−８３７、−９４７及び−９６２は誘導を示さなかった（図１５、パネルＢ、レーン４、５及び６）。図１５のパネルＢにおける下部のパネルは、ＧＡＤＰＨに対して標準化し、擬似的なトランスフェクションに対する倍率の変化としてプロットしたＥ−カドヘリンタンパク質のレベルを示す。従って、結果は、ＣｐＧアイランド又は核酸配列のＧＣリッチな領域を標的とするｓａＲＮＡが、検出可能な遺伝子活性化を提供しないことを示す。

ｓａＲＮＡは腫瘍抑制遺伝子Ｐ２１の発現及びＩＮ ＶＩＶＯでの腫瘍成長阻害を誘導する
５．０×１０^６個のＰＣ−３前立腺癌細胞を、２４週齢の胸腺欠損ホモ接合型雄ヌードマウスの下部脇腹へと接種することにより、異種性前立腺癌モデルを確立した。ｓａＰ２１−３２２（４０ｍｇ）を、ポリエチレンイミン−ｓａＲＮＡ複合体の処方中で、確立された異種性腫瘍（約５５ｍｍ^３）を有するマウスの腫瘍内に、３日毎に９日間、合計３回注入した。最初の処理から４週間後にマウスを屠殺した。

図１６のパネルＡに示すように、最初のｓａＲＮＡ注入から１週間後に、ｓａＲＮＡ処理マウスにおいて、ｓａＣｏｎｔｒｏｌ群のマウスと比較して、より遅い腫瘍の成長が観察された（１４９対２２４ｍｇ）。４週目において、ｓａＰ２１−３２２及びｓａＣｏｎｔｒｏｌ処理群間の腫瘍の大きさにおける差は最大に到達した（３９７．５対７００ｍｇ）（図１６、パネルＡ及びＢ）。これらの２群間でマウスにおける顕著な体重差はなかった。結果は、腫瘍抑制遺伝子ｐ２１に対するｓａＲＮＡが、対照と比較して遺伝子発現を活性化し、腫瘍成長の阻害を仲介することを示す。

観察されたｓａＰ２１−３２２の抗腫瘍効果が、腫瘍細胞中のｐ２１発現を活性化することにより仲介されることを立証するために、マウス腫瘍中でのｐ２１の発現を、抗ｐ２１抗体を用いた免疫組織化学的染色により評価した。図１７に示すように、ｓａＣｏｎｔｒｏｌ群の腫瘍中でｐ２１に対する陽性の染色はみられないのに対し、ｓａＰ２１−３２２処理された腫瘍においては、ほとんどの細胞がｐ２１に対する典型的な核染色を示している。この結果から、ｓａＲＮＡが実際にｐ２１の発現をｉｎ ｖｉｖｏで活性化することがわかる。

ｓａＲＮＡによる転写誘導はアルゴノート２タンパク質を必要とする
ＲＮＡｉにおいては、２種の公知のＲＮＡｉエフェクター複合体、ＲＩＳＣ及びＲＩＴＳ（ＲＮＡに誘導される転写的遺伝子サイレンシングの開始）が知られている。両複合体に共通するコア成分は、両者での標的認識及びｍＲＮＡ開裂において機能を果たすアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリータンパク質である。ヒト細胞において、Ａｇｏ２はＲＩＳＣの唯一のＡｇｏメンバーである（Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１４３７−４１（２００４））。ＲｄＴＡがＡｇｏ２タンパク質によって、又はｓａＲＮＡ及びその標的ＤＮＡ配列の間の直接的な相互作用によって仲介されるか否かを試験するため、我々はＡｇｏ２の発現をノックダウンするためにｓｉＲＮＡを用い、Ａｇｏ２非存在下でもなお、ｓａＲＮＡがＥ−カドヘリン及びｐ２１の転写を刺激できるかどうかを調べた。Ａｇｏ２に特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｇｏ２）及び対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｇｏ−Ｃ）を用いた。対照ｓｉＲＮＡ分子であるｓｉＡｇｏ−Ｃは、組成及び末端改変に関してｓｉＡｇｏ２に類似するが、ランダム配列を含む。

ＰＣ−３細胞を、以下のｓｉＲＮＡ又はｓａＲＮＡ：ｓｉＡｇｏ２、ｓｉＡｇｏ−Ｃ、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２を単独で若しくはその組み合わせを用いてトランスフェクトし、６０時間培養した。図１８、パネルＡに示すように、ｓｉＡｇｏ２はＡｇｏ２の発現のみを約７０％と、顕著にノックダウンし（レーン３）、一方、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｇｏ−Ｃ）はノックダウンしなかった（レーン２）。Ｅ−カドヘリンｓａＲＮＡ単独又はｓｉＡｇｏ−Ｃとの組み合わせは、Ｅ−カドヘリンの転写の顕著な発現を引き起こした（図１８、パネルＡ、レーン４及び５）。しかし、Ａｇｏ２ノックダウン細胞において、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２はＥ−カドヘリンの発現を誘導できなかった（図１８、パネルＡ、レーン６）。図１８、パネルＢ及びパネルＣは、ＧＡＰＤＨレベルに対し標準化されたＥ−カドヘリン及びＡｇｏ２のｍＲＮＡの発現を示す。結果を２つの独立した試験における平均値±標準誤差として表す。さらに、図１８、パネルＤは、パネルＡ中で処理された時のＰＣ−３細胞においてウェスタンブロット分析により検出されたＥ−カドヘリン及びＧＡＰＤＨのタンパク質レベルを示す。従って結果はＲｄＴＡがＡｇｏ２タンパク質に依存的であることを示す。

その他のＡｇｏファミリーメンバーがＲｄＴＡにおいて有する効果を評価するために、我々は、特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｇｏ１、ｓｉＡｇｏ２、ｓｉＡｇｏ３、及びｓｉＡｇｏ４）（Ｍａｔｒａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １２３，６０７（２００５））を用いてＡｇｏ１−４を標的化した。各ＡｇｏのｓｉＲＮＡを単独で、又は、ｐ２１に特異的なｓａＲＮＡであるｓａＰ２１−３２２と組み合わせて用いて、ＰＣ−３細胞をトランスフェクトした（図１８、パネルＥ〜Ｈ）。各ＡｇｏのｓｉＲＮＡをｓａＰ２１−３２２と共にトランスフェクトした場合、ｓｉＡｇｏ２のみが完全にｐ２１の誘導を妨げた（図１８、パネルＧ及びＨ）。Ａｇｏ１、３、及び４のノックダウンは、ｓａＲＮＡにより誘導されるｐ２１の発現を、それぞれ約０．３、０．４、及び０．３倍低減させた（図１８、パネルＨ）。その他のＡｇｏファミリーメンバーはＲｄＴＡにおいて支援的な役割を果たし得る可能性がある一方、Ａｇｏ２はｓａＲＮＡにより誘導される遺伝子活性化にとって不可欠である。ｓａＲＮＡによるＥ−カドヘリンの活性化に関する知見と一致して、ｐ２１の活性化の場合も、それを機能させるには、Ａｇｏ２タンパク質を必要とする。

ｓａＲＮＡはリジン９におけるヒストンのメチル化の損失を誘導する
エピジェニックな変化がＲｄＴＡに関与するメカニズムであるか否かを調べるため、Ｅ−カドヘリンプロモーター中のｓａＲＮＡに標的化される領域におけるＤＮＡのメチル化の変化を、まず、バイサルファイト・ゲノム・シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いて調べた。Ｅ−カドヘリンプロモーター内のＣｐＧアイランドは、擬似的にトランスフェクトしたＰＣ−３及びＤＵ１４５細胞中では原則的にメチル化されていない（図１９、パネルＢ）。ｓａＲＮＡでトランスフェクトしたＰＣ−３及びＤＵ１４５細胞中では、（ｓａＥｃａｄ−Ｐ１）（図１９、パネルＢ及びＣ）に隣接するＣｐＧ部位に、又は標的配列（ｓａＥｃａｄ−Ｐ２）（図１９、パネルＢ及びＣ）内に限定されるＣｐＧのメチル化においてわずかな増加が観察され、ｓａＲＮＡが引き起こすメチル化がＤＮＡ中に広がるものではないことを示す。この知見は、植物におけるＲＮＡ指向性ＤＮＡメチル化（ＲｄＤＭ）で見られる知見と一致する（Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１６２５−３４（１９９９））。ｓａＲＮＡは顕著ではないがＤＮＡメチル化の増加を引き起こし、観察される発現誘導と相反するようにみえる、なぜならＤＮＡの高度のメチル化は転写サイレンシングに関連するためである。この矛盾は、２つのｓａＲＮＡ標的部位がＥ−カドヘリンＣｐＧアイランドの外側に存在し、ＣｐＧアイランドの外側でのメチル化は遺伝子転写に影響を及ぼさないことから簡単に説明がつく。ＣｐＧアイランドを標的化し、既に示したように、より高いＧＣ含量（８４％）を有するｓａＥｃａｄ−Ｐ３が、Ｅ−カドヘリンの発現誘導において効果を示さないこと（図１、パネルＡ及びＢ、及び図２）が、さらなる裏付けとなる。従ってこの結果は、ＤＮＡのメチル化がｓａＲＮＡ依存的なＥ−カドヘリン発現の誘導において役割を果たしていないように見えることを示す。さらに、ヒト細胞における先の報告とは対照的に、ｓｉＲＮＡ処理に関連する非ＣｐＧのメチル化が観察されなかった（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３１：２１１−７（２００４））。

ＲｄＴＡがヒストンに基づく調節機序に関連し得るか否かを、次いで試験した。リジン４の位置でジメチル化されたヒストン３（Ｈ３ｍ２Ｋ４）及び、リジン９の位置でのジメチル化（Ｈ３ｍ２Ｋ９）を認識する抗体を用いて、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）アッセイを実行した。擬似的な、及びｓａＣｏｎｔｒｏｌによるトランスフェクト細胞においては、顕著な量のＥ−カドヘリンプロモーターに相当するゲノムＤＮＡが、Ｈ３ｍ２Ｋ４及びＨ３ｍ２Ｋ９の両方と関連していた（図２０、パネルＡ及びＢ）。意義深いことに、ｓａＥｃａｄ−Ｐ１又はｓａＥｃａｄ−Ｐ２を用いてトランスフェクトされた細胞において、Ｅ−カドヘリンプロモーターＤＮＡに関連するメチル化されたヒストンのレベルは、疑似的なトランスフェクト細胞におけるものと比較して、それぞれ７４％及び８０％減少した（図２０、パネルＢ及びＣ）。Ｈ３ｍ２Ｋ９損失の程度は、Ｅ−カドヘリンの発現誘導と逆相関していた。しかし、ｓａＲＮＡで処理した細胞のいずれにおいても、Ｈ３ｍ２Ｋ４中に類似の変化は観察されなかった（図２０、パネルＢ及びＣ）。結果は、細胞をｓａＥｃａｄ−Ｐ１又はｓａＥｃａｄ−Ｐ２で処理すると、Ｅ−カドヘリンプロモーター上のＨ３ｍ２Ｋ９の脱メチル化がもたらされることを示す。

このような脱メチル化は、クロマチンの再モデリング及び転写誘導をもたらし得る（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２，６４５６−６１（２００２））。結果を踏まえれば、ひとたびｓａＲＮＡが核へと導入されると、Ａｇｏ２タンパク質を含むエフェクター複合体（Ｖｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：６７２−６（２００４））が形成され、それがさらにその他の酵素を誘導してヒストンを脱メチル化し、それによりＲｄＴＡに影響を及ぼし得ることが観察される。この点に関し、ヒストンのアルギニン及びリジンの脱メチル化を調節する酵素が最近同定されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：２７９−８３（２００４）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１９：９４１−９５３（２００４））。メチル化ヒストンの標的化された分解、メチル化されたヒストンの非メチル化変異体による置換、及び、プロテアーゼによるヒストン尾部の切り落とし等の、その他の可能性も無いとは言えない。（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０９：８０１−６（２００２）；Ｏｒｐｈａｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０８：４３９−５１（２００２）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３１：６３７−９（２００４））。

ｓａＲＮＡはインターフェロンインターフェロン応答を引き起こさない
ｓａＲＮＡによる、Ｅ−カドヘリンの発現において観察される誘導にインターフェロン応答が関与している可能性を除外するために、２種の典型的なインターフェロン応答遺伝子であるＯＡＳ１及びＯＡＳ３の発現が、なんらかのｓｉＲＮＡにより誘導を受け得るかを分析した（Ｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３４：２６３−４（２００３）；Ｓｌｅｄｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５：８３４−９（２００３））。結果は、ＯＡＳ１及びＯＡＳ３のｍＲＮＡの発現レベルが、いずれのｓａＲＮＡによっても影響を受けなかったことを示す（図２１、パネルＡ及びＢ）。同様に、２つのハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチン及びＧＡＰＤＨの発現も、いずれのｓａＲＮＡトランスフェクション試験においても影響を受けなかった。さらに、ＰＣ−３細胞をタイプＩインターフェロン−α２ａ（ＩＦＮ−α２ａ）を用いて処理し、Ｅ−カドヘリン及びｐ２１の発現がインターフェロン処理の影響を受けやすいかどうかを調べた。図２１、パネルＣに示すように、処理細胞中でＥ−カドヘリン及びｐ２１の発現における変化は観察されず、一方で、ＯＳＡ１及びＯＡＳ３はインターフェロン処理により迅速に誘導された。

従って、結果は、インターフェロン応答がＥ−カドヘリン及びｐ２１のｓａＲＮＡによる誘導には関与しないことを示す。それよりも、この結果によれば、ＲＮＡｉ試験で観察される的外れの効果のいくつかに対して説明がつき（Ｓｃａｃｈｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０１：１８９２−７（２００４））、ｓｉＲＮＡ及び非コード配列の間のホモロジーが生じ得ることがわかる。したがって、いくつかのｓｉＲＮＡは、転写活性化の開始により、又は、プロモーター配列がｓｉＲＮＡのものに類似している遺伝子をサイレンシングすることにより、意図せぬ効果を生じる場合があるだろう。

ｓａＲＮＡは隠れたプロモーター転写を標的としない
プロモーター領域由来の隠れた転写物が、ｓａＲＮＡの現実の標的であったか否かを調べるために、ｐ２１及びＥ−カドヘリンプロモーター配列に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析を実行した。全細胞ＲＮＡをＰＣ−３細胞から単離し、擬似的にトランスフェクトするか、ｓａＣｏｎ−２、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２、又はｓａＰ２１−３２２により７２時間トランスフェクトした。１マイクログラムの総ＲＮＡを、ＤＮａｓｅＩを用いて処理し、ランダムヘキサマープライマーを用いて逆転写した。Ｅ−カドヘリン、ｐ２１及びＧＡＰＤＨの発現は遺伝子特異的なプライマーセットを用いて検出した。図２２、パネルＡに示すようなＥ−カドヘリンプロモーターに相補的なプライマーを用いて、隠れた転写物は検出されなかった。さらに、図２２、パネルＢに示すような、ｐ２１プロモーターにおける隠れた転写物は検出されなかった。従って、結果は、ｓａＲＮＡに誘導される転写が、プロモーターの標的化を通じて活性化されることを示す。

前述のものは本発明の原理を説明するにすぎない。当業者であれば、本明細書中に明確には記載されていない又は示されていない場合でも、多様な改変を考案し、その精神及び範囲内で発明の原理を具現化し得るだろうことが理解されよう。さらに、本明細書中に列挙される全ての例及び条件的な用語は、原則的に、読者が本発明の原理、及び、技術を進歩させるため発明者によって提供される概念を理解するための助けとなるためのものであり、このように特定的に列挙される例又は条件へと限定されて解釈されるものではない。さらに、発明の原理、態様、及び実施形態ならびにその特定の実施例を列挙する本明細書中の全ての記載は、それらの構造的及び機能的な均等物の両者を包含するものとする。さらに、このような均等物には、現在公知の均等物、及び、将来的に開発される均等物、すなわち、構造を問わず同様の機能を実行する任意の開発される要素を含むものとする。本発明の範囲は、従って、本明細書中に示され記載される実施形態に限定されるものではない。むしろ、本発明の範囲及び精神は、添付される特許請求の範囲により具現化される。

パネルＡは、５０ｎＭ ｓａＲＮＡを７２時間形質移入したＰＣ−３細胞中のＥカドヘリン、βアクチン及びＧＡＰＤＨの発現を示すウェスタンブロットである。パネルＢは、パネルＡのように形質移入されたＰＣ−３細胞中におけるＲＴ−ＰＣＲによって解析されたＥカドヘリンのｍＲＮＡ発現を示す。 図２は図１と同様に処理したＰＣ−３細胞中でのＥカドヘリンタンパク質発現の倍率変化を示すグラフである。発現はβアクチンで標準化した。結果は、２回繰り返したｓａＥｃａｄ−Ｐ３形質移入の場合を除き、５回の独立な実験結果（少なくとも２つのサンプルを各実験で繰り返した）の平均値±ＳＥＭで示した。 図３は、モック、ｓａコントロール及びｓａＥｃａｄ−Ｐ２形質移入ＰＣ−３細胞中のＥカドヘリンを蛍光染色した画像である。形質移入は５０ｎＭ ｓａＲＮＡを用いて７２時間行った。ｓａＥｃａｄ−Ｐ２形質移入細胞に由来する緑色蛍光強度がより高いレベルのため、モック又はｓａコントロール形質移入細胞よりも細胞が大きく見えるが、全ての画像は同じ倍率（８００×）で撮ったものであることに注意。 図４はｓａＲＮＡ形質移入が量依存的にＥカドヘリンタンパク質の発現を誘導することを示すウェスタンブロット（上のパネル）の結果である。ＰＣ−３細胞は、表示した濃度で７２時間ｓａＥｃａｄ−Ｐ２で処理した。下のパネルは表示した濃度のｓａＲＮＡ存在下におけるＥカドヘリンの相対的発現量を示す。 パネルＡは、５０ｎＭ ｓａＥｃａｄ−Ｐ２で表示した時間処理したＰＣ−３細胞中のＥカドヘリンの発現を示すウェスタンブロットの結果である。パネルＢは、パネルＡのＥカドヘリンの発現の誘導倍率を示すグラフである。 パネルＡは、表示した時間モック形質移入又は５０ｎＭのｓａコントロール若しくはｓａＥｃａｄ−Ｐ２で形質移入したＰＣ−３細胞中でのＥカドヘリンの発現を示すウェスタンブロットの結果である。パネルＢは、パネルＡのＥカドヘリンの発現の誘導倍率を示すグラフである。パネルＣは、モック処理、ｓａコントロール又はｓａＥｃａｄ−Ｐ２形質移入したＰＣ−３細胞を表す一連の画像である。代表的な画像は、形質移入８日後に位相差顕微鏡（２００×）下で撮影した。糸状偽足のような膜の突出を矢印で示した。 図７は、ｓａＲＮＡｓがＤＵ１４５細胞中でＥカドヘリンの発現を誘導することを示す。パネルＡは、５０ｎＭ ｓｉＲＮＡで７２時間形質移入したＤＵ１４５細胞中でのＥカドヘリン及びＧＡＰＤＨのタンパク質発現を示すウェスタンブロットである。パネルＢはＧＡＰＤＨに対して標準化したパネルＡに示した細胞中でのＥカドヘリンタンパク質の発現の誘導倍率を示すグラフである。データは、２回繰り返したｓａＥｃａｄ−Ｐ１とｓａＥｃａｄ−Ｐ２を用いた組合せ形質移入の場合を除き、４回の独立の実験（少なくとも２つのサンプルを各実験で繰り返した）の平均値±ＳＥＭで表示した。 図８は、Ａｚａ−ＣがｓａＲＮＡ誘導性Ｅカドヘリン発現をＨｅＬａ細胞中で促進することを示す。ＨｅＬａ細胞は、１−１０μＭのＡｚａ−Ｃの存在下又は非存在下において、７２時間、５０ｎＭ ｓａＲＮＡで形質移入した。ＥカドヘリンのｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット（Ｗ．Ｂ．）解析で各々評価した。また、ＧＡＰＤＨのレベルは、泳動コントロールとして測定し、使用した。Ｅカドヘリンタンパク質は、ｓａＥｃａｄ−Ｐ１とＡｚａ−Ｃで同時形質移入した細胞においてのみ検出可能であった。 図９は、ＰＣ−３、ＭＣＦ−７及びＨｅＬａ細胞中におけるｐ５３非依存的ｐ２１ｍＲＮＡのｓａＲＮＡによる誘導の結果を示す。細胞は５０μＭ ｓａＲＮＡｓで７２時間形質移入した。パネルＡは、ＰＣ−３細胞、ＭＣＦ−７細胞及びＨｅＬａ細胞におけるｐ２１に対するｓａＲＮＡ（ｓａＰ２１−３２２）で処理、ネガティブコントロール（モック及びｓａＣｏｎ−２）細胞中でのｍＲＮＡレベルを示すゲルである（Ｍは分子量マーカー）。パネルＢは、ＧＡＰＤＨに対し標準化したｐ２１のｍＲＮＡ発現を示す。結果は、実験毎２サンプルを用いて２回の独立に行った実験の平均値±ＳＥＭで示した。ｓａＰ２１−３２２ｓａＲＮＡで処理した細胞は、ＰＣ−３、ＭＣＦ−７及びＨｅＬａ細胞中のｐ２１発現において、各々、１２．５、２．４及び１０．１−倍の増加を示した。パネルＣは、抗ｐ２１及び抗ＧＡＰＤＨ抗体を使用したｐ２１及びＧＡＰＤＨタンパク質発現を示すウェスタンブロットの結果である。ｓａＰ２１−３２２ｓａＲＮＡによって誘導されるｐ２１タンパク質レベルは、ＲＴ−ＰＣＲで検出されたｍＲＮＡ誘導のレベルに一致した。 図１０は、ＨＥＫ−２９３、Ｊ８２、ＬＮＣａＰ及びＴ２４細胞中におけるｐ２１ｓａＲＮＡ誘導性ｐ２１タンパク質発現を示すウェスタンブロットである。細胞は、７２時間、５０μＭ ｓａＲＮＡｓで形質移入した。 図１１は、ｓａＲＮＡ分子であるｓａＰ２１−３２２で処理した腫瘍細胞の画像を示す。ＰＣ−３、ＭＣＦ−７及びＨｅＬａ細胞は、コントロールｓａＲＮＡｓａＣｏｎ−２又はｓａＰ２１−３２２のいずれかで形質移入した。細胞の画像は、１００×の倍率にて、形質移入７２時間後に撮影された。ｓａＰ２１−３２２形質移入によって、ＰＣ−３、ＭＣＦ−７及びＨｅＬａの細胞増殖が阻害された。 図１２は、ＨｅＬａ細胞中におけるｓａＲＮＡ誘導性ＶＥＧＦ発現を示す。ＨｅＬａ細胞は６ウェルプレート中にプレーティングし、モック、ｓａＣｏｎ−２又はｓａＶＥＧＦ−７０６で７２時間、形質移入した。ｍＲＮＡ発現はＲＴ−ＰＣＲで評価した。パネルＡは、ＶＥＧＦの２つのアイソフォーム（ＶＥＧＦ１８９及び１６５）のｍＲＮＡを増幅したＲＴ−ＰＣＴを示すゲルである。パネルＢは、ＧＡＰＤＨに対して標準化したＶＥＧＦｍＲＮＡの発現を示す。モック形質移入細胞と比較すると、ＶＥＧＦ−１８９及び−１６５について、各々、３．７及び４倍の増加が観察された。 図１３は、ｓａＲＮＡによって誘導される転写活性化に対する配列特異性について示す。パネルＡは、ＥカドヘリンｓａＲＮＡであるｓａＥｃａｄ−Ｐ２に関する配列を示す。パネルＢは、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２の変異体の配列を示す。ｓａＥｃａｄ−Ｐ２二重鎖の最初及び最後の５塩基対の変異を、各々、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−３及びｓａＥｃａｄ−Ｐ２−５とした。パネルＣは、ｓａＥｃａｄ−Ｐ２−３及びｓａＥｃａｄ−Ｐ２−５アンチセンスＲＮＡストランドとその標的ＤＮＡ配列である３’−及び５’末端間における、各々のミスマッチを概略的に例示している。白抜きの曲がった矢印は転写誘導を示し、黒塗りの曲がった矢印は影響を転写が受けないことを示す。パネルＤは５０ｎＭの表示のｓａＲＮＡで、７２時間形質移入したＰＣ−３細胞中のＥカドヘリン及びβアクチンのウェスタンブロットによる発現レベルを示す。パネルＥはβアクチンで標準化し、２回の独立した実験の平均値±ＳＥＭとして表した、ウェスタンブロットに対応するＥカドヘリンレベルを示す。パネルＦはｓａＰ２１−３２２及びこれに対応する変異型ｓａＲＮＡｓの配列を示す。パネルＧ及びパネルＨは、５０ｎＭの表示したｓａＲＮＡ分子で、７２時間形質移入したＰＣ−３細胞（パネルＧ）又はＨｅＬａ細胞（パネルＨ）中でのｐ２１及びＧＡＤＰＨの発現レベルを表すウェスタンブロットを示す。 パネルＡは特定の実施態様に対して必要とされるｓａＲＮＡのサイズの概略的な説明を示す。パネルＢは異なる長さのｓａＲＮＡで形質移入したＰＣ−３細胞中でのＥカドヘリンタンパク質発現を示すウェスタンブロットである。パネルＣはＧＡＤＰＨに対して標準化し、ｓａコントロール−１処理細胞と比較した変動倍率としてプロットしたパネルＢ由来のＥカドヘリンタンパク質レベルを示す。 パネルＡはＣｐＧアイランドに関し、ｓａＲＮＡで誘導される転写活性化に必要な標的の概略的模式図を示す。パネルＢは、上のパネル中に、表示される５０ｎＭ ｓａＲＮＡで７２時間形質移入及び培養したＰＣ−３細胞中での、Ｅカドヘリン及びＧＡＤＰＨの発現を示すウェスタンブロットを示す。ｓａＥｃａｄ−Ｐ２はＥカドヘリンの転写（レーン２）を誘導したが、ｓａＥｃａｄ−８３７、−９４７及び−９６２は誘導を示していない（レーン３、４及び５）。パネルＢの下のパネルは、ＧＡＤＰＨに対して標準化し、モック形質移入と比較した変動倍率としてプロットしたＥカドヘリンレベルを示す。 図１６は、マウス前立腺癌の異種移植腫瘍モデルにおけるｓａＰ２１−３２２ｓａＲＮＡの抗腫瘍効果を示す。腫瘍の定着したマウスは、ＰＥＩ−ｓａＲＮＡ複合体の腫瘍内注射を９日間、３日毎に合計３回のインジェクション受けた。パネルＡは腫瘍成長曲線を示すグラフである。腫瘍サイズはデジタルキャリパーを使用して週毎に測定した。結果は平均値±ＳＤ（ｎ＝６腫瘍）で示した。パネルＢは最初のｓａＲＮＡインジェクション後４週間目で屠殺したマウスとその腫瘍の像である。ｓａＣｏｎｔｒｏｌ及びｓａＰ２１−３２２処理グループに関し、２つの代表的なマウスとその腫瘍が示される。 図１７は、ｓａＰ２１−３２２がインビボでｐ２１発現を誘導することを示す。腫瘍の定着したマウスは、ＰＥＩ−ｓａＲＮＡ複合体の腫瘍内注射を９日間、３日毎に合計３回のインジェクション受けた。抗ｐ２１抗体を用いて腫瘍組織切片に対し免疫染色を行った。ｓａＣｏｎｔｒｏｌグループ腫瘍の細胞はＰ２１染色に対しネガティブであるが、Ｐ２１−３２２グループ腫瘍の多くの細胞はｐ２１のポジティブな核染色を示す。 図１８は、ｓａＲＮＡによって誘導される転写活性化にはＡｇｏ２タンパク質が必要であることを示す。パネルＡは５０ｎＭ表示される各ｓａＲＮＡを６０時間形質移入したＰＣ−３細胞の結果を示す。Ｅカドヘリン、Ａｇｏ２及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現はＲＴ−ＰＣＲによって測定した。パネルＢ及びパネルＣは、ＧＡＰＤＨレベルに対して標準化したＥカドヘリン及びＡｇｏ２ｍＲＮＡ発現を示す。結果は２回の異なる実験の平均値±ＳＥＭで示す。パネルＤは、パネルＡと同様に処理したＰＣ−３細胞中でのウェスタンブロット解析によって測定されたＥカドヘリン及びＧＡＰＤＨのタンパク質レベルを示す。パネルＥは、５０ｎＭの表示されるｓａＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡ分子で７２時間形質移入したＰＣ−３細胞の結果を示す。Ａｇｏ１−４のｍＲＮＡ発現はＲＴ−ＰＣＴで評価した。各Ａｇｐファミリーメンバーはそれらに対応するＡｇｏ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｇｏ１、２、３又は４）によってノックダウンされた。パネルＦはＧＡＰＤＨ発現に対して標準化され、２回の独立した実験に由来する平均値±ＳＥＭで表されたＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。パネルＧは、５０ｎＭの各表示されたｓａＲＮＡで７２時間形質移入したＰＣ−３細胞の結果を示す。ｐ２１及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡとタンパク質レベルは、共にＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット（Ｗ．Ｂ．）分析によって各々測定された。パネルＨはＧＡＰＤＨに対し標準化され、少なくとも２回の独立な実験（実験毎に２サンプルの繰り返しを含む）に由来する平均値±ＳＥＭで表されたｐ２１ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。 図１９はｓａＲＮＡ形質移入したＰＣ−３及びＤＵ１４５細胞中のＥカドヘリンプロモーターでのＤＮＡメチル化の変化を示す。パネルＡは、ＣｐＧサイト（垂直バー）、ｓａＲＮＡ標的（短いライン）及びゲノム配列決定ＰＣＲプライマー亜硫酸水素塩（矢印）の表示のあるＥカドヘリンプロモーターの模式図である。パネルＢは、各々モック形質移入、ｓａＥｃａｄ−Ｐ１形質移入及びｓａＥｃａｄ−Ｐ２形質移入ＰＣ−３細胞中におけるＥカドヘリンプロモーターのメチル化プロファイルを示す。パネルＣは、モック形質移入、ｓａＥｃａｄ−Ｐ１形質移入及びｓａＥｃａｄ−Ｐ２形質移入ＤＵ１４５細胞中におけるＥカドヘリンプロモーターのメチル化プロファイルを示す。黒塗りの丸はメチル化されたＣｐＧサイトを示し、白抜きの丸は非メチルかＣｐＧサイトを示す。 図２０はｓａＲＮＡによって誘導される転写活性化がヒストン３のリジン９のメチル化の喪失と関係していることを示す。パネルＡはＥカドヘリンプロモーターとＣｈＩＰ ＰＣＲの位置の概略図である。パネルＢ：ＰＣ−３細胞を５０ｎＭの表示したｓａＲＮＡ分子で７２時間形質移入した。ＣｈＩＰアッセイは、関連するＤＮＡのプルダウンアッセイを行うために抗Ｈ３ｍ２Ｋ９及びＨ３ｍ２Ｋ４抗体を用いて実施した。沈殿したＤＮＡをＰＣＲで増幅した。加えたＤＮＡはコントロールとして増幅した。抗体無しのコントロールはＡｂ（−）と表した。パネルＣは、添加したレーンのＤＮＡレベルに対して標準化したＨ３ｍ２Ｋ４及びＨ３ｍ２Ｋ９のシグナルを示すグラフである。結果は少なくとも２回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。 パネルＡはｓａＲＮＡはインターフェロン応答遺伝子を誘導しないことを示す。細胞は形質移入試薬としてリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、７２時間形質移入した。ＯＳＡ１及びＯＳＡ３ｍＲＮＡの発現はＲＴ−ＰＣＲによって分析した。また、βアクチン遺伝子をＲＮＡの泳動のためのコントロールとして増幅した。パネルＢはパネルＡに示されたサンプルに対する相対的な発現を示すグラフである。結果は各実験において２サンプルによる２回の独立の実験の平均値±ＳＥＭである（ブランク：培地のみ、モック：リポフェクタミンのみ）。パネルＣは、明記した濃度で２４時間インターフェロン−α２ａ（ＩＦＮ−α２ａ）処理を行ったＰＣ−３細胞中のＲＴ−ＰＣＲで解析したＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ｐ２１、Ｅカドヘリン及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現レベルを示す。 図２２は潜在的な転写に対するｐ２１及びＥカドヘリンの解析を示す。パネルＡはＰＣ−３細胞中のＰＣＲ法によるＥカドヘリン及びＧＡＰＤＨ発現の検出を示す。総細胞ＲＮＡはモック、ｓａＣｏｎ−２又はｓａＥｃａｄ−Ｐ２で７２時間形質移入したＰＣ−３細胞から単離した。１μｇの総ＲＮＡをＤＮａｓｅＩで処理し、ランダムヘキサマープライマーを用いて逆転写した。Ｅカドヘリン及びＧＡＰＤＨの発現を遺伝子特異的なプライマーセットを用いて検出した。Ｅカドヘリンプロモーターと相補的なプライマーを使用して潜在的な転写は検出されなかった。ゲノムＤＮＡ（ＤＮＡ）はポジティブコントロールとして使用した。パネルＢは、ＰＣ−３細胞中のＰＣＲによるｐ２１及びＧＡＰＤＨ発現の検出を示す。ＰＣ−３細胞は、表示されるように、モック、ｓａＣｏｎ−２又はｓａＰ２１−３２２で７２時間形質移入した。ｐ２１及びＧＡＰＤＨの発現レベルはパネルＡに示されるようにＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ｐ２１プロモーターにおいては潜在的な転写は増幅されなかった。 図２３は、標的遺伝子（パネルＡ−Ｃ）の非コード配列の標的位置に対する、本発明のｓａＲＮＡの相補性領域の相対的な位置を示す概略と、標的遺伝子に対するｓａＲＮＡｓの相補領域の選択に関する一般的なモデルである（パネルＤ）。パネルＡはＥカドヘリン遺伝子の非コード配列の標的位置に対するｓａＲＮＡｓｓａＥｃａｄ−Ｐ１及びＳａＥｃａｄ−Ｐ２の相補性を示す。パネルＢはｐ２１遺伝子の非コード配列の標的位置に対するｓａＲＮＡｓａＰ２１−３２２の相補性を示す。パネルＣはＶＥＧＦ遺伝子の非コード配列の標的位置に対するｓａＲＮＡｓａＶＥＧＦ−６０７の相補性を示す。パネルＤは例示的な標的遺伝子のｓａＲＮＡ標的領域に一般的なモデルを示す。

Claims (73)

1. 遺伝子の発現を増加させる方法であって、該遺伝子の非コード配列と相補的な５’領域と該非コード領域と少なくとも１つのヌクレオチドが非相補的な３’末端領域を含む第１のリボ核酸ストランドを少なくとも含む小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を、該遺伝子の発現を増加させるのに十分な量で哺乳類細胞中に導入することを含み、その結果、該遺伝子の発現が増加する方法。
2. 前記ｓａＲＮＡ分子が、前記第１のリボ核酸ストランドと相補性な５’領域と相補的なヌクレオチド配列を含む第２のリボ核酸ストランドを含む、請求項１の方法。
3. 前記第２のリボ核酸ストランドが第１ストランドと少なくとも１つのヌクレオチドが非相補的な３’末端領域を含む、請求項２の方法。
4. ｓａＲＮＡ分子が、核酸ベクターからの発現によって哺乳動物細胞中へ導入される請求項１の方法。
5. 相補性領域が約１４から約３０塩基対を含む請求項１の方法。
6. 相補性領域が約２０から約２５塩基対を含む請求項１の方法。
7. ｓａＲＮＡ分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項１の方法。
8. 細胞増殖疾患をもつ対象中の細胞増殖を減少させる方法であって、細胞増殖を阻害するポリペプチドをコードする遺伝子の非コード配列と相補的な５’領域及び該非コード配列と少なくとも１つのヌクレオチドが非相補的な３’末端領域を含む第１のリボ核酸ストランドを少なくとも含む小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）の有効量を、対象に投与することを含み、その投与が該ポリペプチドの発現の増加と細胞増殖の減少を提供する方法。
9. 前記ｓａＲＮＡ分子が、前記第１のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のリボ核酸ストランドを含む、請求項８の方法。
10. 前記第２のリボ核酸ストランドが第１ストランドと少なくとも１つのヌクレオチドが非相補的な３’末端領域を含む、請求項９の方法。
11. ｓａＲＮＡ分子が、核酸ベクターからの発現によって哺乳動物細胞中へ導入される請求項８の方法。
12. 前記ポリペプチドが腫瘍サプレッサーである請求項８の方法。
13. 相補性領域が約１４から約３０塩基対を含む請求項８の方法。
14. 相補性領域が約２０から約２５塩基対を含む請求項８の方法。
15. ｓａＲＮＡ分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項８方法。
16. Ｅカドヘリン遺伝子の転写を活性化するのに十分なＥカドヘリン遺伝子の非コード核酸配列と相補な領域を含む第１のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を包含する単離された組成物。
17. 前記ｓａＲＮＡ分子が、第１のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のリボ核酸ストランドを含む、請求項１６の組成物。
18. 前記ｓａＲＮＡ分子が核酸ベクター上にコードされる請求項１６の組成物。
19. 前記リボヌクレオチドストランドが３’末端の少なくとも１ヌクレオチドの非コード核酸配列と非相補的な領域を含む請求項１６の組成物。
20. 相補性領域が約１４から約３０塩基対を含む請求項１６の組成物。
21. 相補性領域が約２０から約２５塩基対を含む請求項１６の組成物。
22. ｓａＲＮＡ分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項１６の組成物。
23. リボ核酸ストランドが配列番号０２の配列を含む請求項１６の組成物。
24. リボ核酸ストランドが配列番号０６の配列を含む請求項１６の組成物。
25. リボ核酸ストランドが配列番号１０の配列を含む請求項１６の組成物。
26. 前記組成物が、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントの少なくとも１つをさらに含む請求項１６の組成物。
27. ｐ２１遺伝子の転写を活性化するのに十分なｐ２１遺伝子の非コード核酸配列と相補な領域を含む第１のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を包含する単離された組成物。
28. 前記ｓａＲＮＡ分子が、第１のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のリボ核酸ストランドを含む、請求項２７の組成物。
29. 前記ｓａＲＮＡ分子が核酸ベクター上にコードされる請求項２７の組成物。
30. 前記リボヌクレオチドストランドが３’末端の少なくとも１ヌクレオチドの非コード核酸配列と非相補的な領域を含む請求項２７の組成物。
31. 相補性領域が約１４から約３０塩基対を含む請求項２７の組成物。
32. 相補性領域が約２０から約２５塩基対を含む請求項２７の組成物。
33. ｓａＲＮＡ分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項２７の組成物。
34. リボ核酸ストランドが配列番号２４の配列を含む請求項２７の組成物。
35. 前記組成物が、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントの少なくとも１つをさらに含む請求項２７の組成物。
36. 血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子の転写を活性化するのに十分なＶＥＧＦ遺伝子の非コード核酸配列と相補な領域を含む第１のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を包含する単離された組成物。
37. 前記ｓａＲＮＡ分子が、第１のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のリボ核酸ストランドを含む、請求項３６の組成物。
38. 前記ｓａＲＮＡ分子が核酸ベクター上にコードされる請求項３６の組成物。
39. 前記リボヌクレオチドストランドが３’末端の少なくとも１ヌクレオチドの非コード核酸配列と非相補的な領域を含む請求項３６の組成物。
40. 相補性領域が約１４から約３０塩基対を含む請求項３６の組成物。
41. 相補性領域が約２０から約２５塩基対を含む請求項３６の組成物。
42. ｓａＲＮＡ分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項３６の組成物。
43. リボ核酸ストランドが配列番号３２の配列を含む請求項３６の組成物。
44. 前記組成物が、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントの少なくとも１つをさらに含む請求項３６の組成物。
45. Ｅカドヘリン遺伝子の転写を活性化するのに十分なＥカドヘリン遺伝子の非コード核酸配列と相補な領域を含む第１のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を包含するキット。
46. 前記ｓａＲＮＡ分子が、第１のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のリボ核酸ストランドを含む、請求項４５のキット。
47. 前記ｓａＲＮＡ分子が核酸ベクター上にコードされる請求項４５のキット。
48. 前記リボヌクレオチドストランドが３’末端の少なくとも１ヌクレオチドの非コード核酸配列と非相補的な領域を含む請求項４５のキット。
49. 相補性領域が約１４から約３０塩基対を含む請求項４５のキット。
50. 相補性領域が約２０から約２５塩基対を含む請求項４５のキット。
51. ｓａＲＮＡ分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項４５のキット。
52. リボ核酸ストランドが配列番号０２の配列を含む請求項４５のキット。
53. リボ核酸ストランドが配列番号０６の配列を含む請求項４５のキット。
54. リボ核酸ストランドが配列番号１０の配列を含む請求項４５のキット。
55. 前記組キットが、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントの少なくとも１つをさらに含む請求項４５のキット。
56. ｐ２１遺伝子の転写を活性化するのに十分なｐ２１遺伝子の非コード核酸配列と相補な領域を含む第１のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を包含するキット。
57. 前記ｓａＲＮＡ分子が、第１のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のリボ核酸ストランドを含む、請求項５６のキット。
58. 前記ｓａＲＮＡ分子が核酸ベクター上にコードされる請求項５６のキット。
59. 前記リボヌクレオチドストランドが３’末端の少なくとも１ヌクレオチドの非コード核酸配列と非相補的な領域を含む請求項５６のキット。
60. 相補性領域が約１４から約３０塩基対を含む請求項５６のキット。
61. 相補性領域が約２０から約２５塩基対を含む請求項５６のキット。
62. ｓａＲＮＡ分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項５６のキット。
63. リボ核酸ストランドが配列番号２４の配列を含む請求項５６のキット。
64. 前記キットが、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントの少なくとも１つをさらに含む請求項５６のキット。
65. 血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子の転写を活性化するのに十分なＶＥＧＦ遺伝子の非コード核酸配列と相補な領域を含む第１のリボ核酸ストランドを少なくとも含む、小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）を包含するキット。
66. 前記ｓａＲＮＡ分子が、第１のリボ核酸ストランドと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のリボ核酸ストランドを含む、請求項６５のキット。
67. 前記ｓａＲＮＡ分子が核酸ベクター上にコードされる請求項６５のキット。
68. 前記リボヌクレオチドストランドが３’末端の少なくとも１ヌクレオチドの非コード核酸配列と非相補的な領域を含む請求項６５のキット。
69. 相補性領域が約１４から約３０塩基対を含む請求項６５のキット。
70. 相補性領域が約２０から約２５塩基対を含む請求項６５のキット。
71. ｓａＲＮＡ分子がチオ修飾ヌクレオチド間結合を含む請求項６５のキット。
72. リボ核酸ストランドが配列番号３２の配列を含む請求項６５のキット。
73. 前記組キットが、薬学的に許容な担体、薬学的に許容な希釈剤、薬学的に許容な賦形剤及び薬学的に許容なアジュバントをさらに含む請求項６５のキット。