CN112662671B

CN112662671B - 靶向SMN2启动子区甲基化位点nt-290所在区域的反义寡核苷酸

Info

Publication number: CN112662671B
Application number: CN202011615369.5A
Authority: CN
Inventors: 瞿宇晋; 宋昉; 王嘉; 白晋丽
Original assignee: Capital Institute of Pediatrics
Current assignee: Capital Institute of Pediatrics
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN112662671A

Abstract

本发明提出靶向SMN2启动子区甲基化位点nt‑290所在区域的反义寡核苷酸。所述的反义寡核苷酸能够结合至SMN2基因启动子区的关键甲基化区域来促进脊髓性肌萎缩症患者细胞中SMN2基因的整体转录水平和SMN蛋白的表达水平，可以作为SMN靶向性治疗策略中的新治疗靶点。

Description

靶向SMN2启动子区甲基化位点nt-290所在区域的反义寡核苷酸

技术领域

本发明涉及反义寡核苷酸技术领域，特别是涉及靶向SMN2启动子区甲基化位点nt-290所在区域的反义寡核苷酸。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传性神经肌肉病，由脊髓前角及延髓运动神经元变性导致，以近端肢体和躯干进行性、对称性肌无力和肌萎缩为特点，随病情进展常累及多系统。该病的发病率在存活新生儿中约为1/6000～1/10000，位居婴儿致死性遗传病的首位，其中呼吸衰竭是最常见的死亡原因。SMA的临床表现差异较大，根据患者的发病年龄和获得的最大运动功能分为5型。位于染色体5q11.2-q13.3区域的运动神经元存活基因1(survival motor neuron 1，SMN1)的纯合缺失或者复合杂合突变均使得SMN蛋白表达水平下降而导致SMA的发生。SMN1基因存在与其高度同源的SMN2基因，SMN2在外显子7的一个碱基差异(c.840C>T)导致了前体mRNA的选择性剪接的改变，使大多数SMN2转录产物跳跃了外显子7，产生截断的不稳定的SMN蛋白质(称为SMNΔ7)，但仍有10％的SMN2基因表达全长转录本，产生少量的有功能的SMN蛋白。因此SMN2是SMA的表型修饰基因，其拷贝数的多少与疾病的严重程度呈负相关，修正SMN2的剪接或提升SMN2表达水平是目前SMA的治疗策略。反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)是人工合成的单链核酸链，长度在8～50个核苷酸之间，通过标准Watson-Crick碱基配对原则与靶基因mRNA 结合，从而干扰靶基因的表达。反义寡核苷酸药物具有特异性高、药效高、毒副作用低等特点，随着化学修饰的改进，其与靶基因的杂交亲和力增强，也获得了更高的稳定性。近年来ASO技术的进步，通过脊髓腔注射可以使ASO在神经系统中广泛分布，并且在治疗神经退行性疾病(肌萎缩侧索硬化症、SMA、杜氏肌营养不良症等)中取得突破性进展。寻找新的有效的反义寡核苷酸靶标，对于开发新的SMA治疗方案非常有益。

近年来SMA治疗进展很快。治疗策略主要以提升全长SMN蛋白水平的SMN靶向性治疗为主，包括：(1)基因替代治疗：腺相关病毒AAV9导入外源性的SMN1 cDNA序列，如2019年在美国上市的AVXS-101；(2)纠正SMN2错误剪接：2016年在美国经FDA批准上市的Nusinersen(诺西那生钠，Biogen公司)，靶向屏蔽SMN2内含子7的关键剪接开关区ISS-N1调控SMN2选择性剪接的一种反义寡核苷酸，于2019年2月进入中国，2019年10月应用于SMA病人治疗；2020年在美国上市的罗氏公司的靶向SMN2基因外显子7的剪接负性调控区5’末端的小分子化合物药物(Evrysid/Risdiplam)；(3)增加SMN2转录水平：如组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)。然而，这些药物存在以下缺点：(1)AVXS-101：天价治疗药物(约合人民币1400万)，系病毒载体导入外源基因病毒载量对肝肾的损伤等副反应，存在价格昂贵和药物长期安全性不明的局限性。(2)Nusinersen和Evrysid/Risdiplam：均为国外进口药物，存在治疗价格十分昂贵(100万/年)、应答率50％左右、长期疗效及安全性不明等局限性。而且两种药物只是在较低的SMN2基因整体转录水平上去调控SMN2选择性剪接来提升全长转录版本的表达水平，进而增加SMN蛋白表达的水平，并不能增加SMN2基因的转录水平的总量。(3)组蛋白去乙酰化酶抑制剂：HDACi可以促进SMN2基因启动子区的高乙酰化，增强转录，提升SMN水平，但是HDACi的作用是广谱的，对众多基因的启动子区均产生效应，并不特异性靶向SMN2基因的启动子区，最终在临床实验中并没有取得理想的治疗效果。

我们前期研究发现：SMN2基因的表达还受到其启动子区的甲基化水平的表观调控作用。SMN2基因转录活性与启动子区甲基化水平呈负相关、并发现与SMN2表达相关的关键甲基化位点，其中nt-290位点的甲基化水平与疾病严重程度存在显著负相关。本次研究也沿用了反义寡核苷酸可以通过特异性与靶基因结合干扰靶基因的表达特点，针对前期研究的结果明确的SMN2启动子区的关键甲基化位点/区(nt-290)设计了靶向性结合的ASO(ASO-AP1)。

发明内容

鉴于此，本发明提供了靶向SMN2启动子区甲基化位点nt-290所在区域的反义寡核苷酸，具体技术方案如下：

靶向SMN2启动子区甲基化位点nt-290所在区域的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸能够结合至SMN2基因启动子区，所述反义寡核苷酸的结合发生在SMN2基因启动子区的关键甲基化区域内；

所述关键甲基化区域为SMN2基因启动子区的-300～-276之间的区域内；

所述反义寡核苷酸能够与SMN2基因启动子区上-300～-276之间的区域序列杂交；

所述反义寡核苷酸的序列为5’-GAGUGCAGCGGCGCGAUCUCGGCUC-3’；

所述反义寡核苷酸均经过2’-甲氧乙基修饰和硫代修饰来提高稳定性。

一种药物组合物，所述药物组合物包含所述反义寡核苷酸与可药用载体，所述可药用载体将所述反义寡核苷酸转运到靶细胞中，所述药物组合物被装载细胞中。

进一步的，所述可药用载体包括糖、聚胺、氨基酸、肽、脂质中的至少一种。

一种用于促进细胞中SMN2基因表达的方法，包括使所述细胞与有效量的能够结合至SMN2启动子区的反义寡核苷酸接触，其中所述反义寡核苷酸的结合发生在所述启动子区上的-300～-276之间的区域内，所述反义寡核苷酸包含上述定义的特征；

进一步的，所述细胞为脊髓性肌萎缩症患者的皮肤成纤维细胞。

一种用于治疗脊髓性肌萎缩症的方法，要求调节对其有需要的个体的SMN2基因的表达，所述方法包括使所述个体的细胞与有效量的能够结合至SMN2启动子区的反义寡核苷酸接触，其中所述反义寡核苷酸的结合发生在所述启动子区上的-300～-276之间的区域内。

进一步的，所述反义寡核苷酸包含上述定义的特征。

采用上述技术方案，具有如下有益效果：

本发明提供靶向SMN2基因启动子区甲基化位点nt-290所在区域的反义寡核苷酸。所述的反义寡核苷酸结合发生在所述启动子区上的-300～-276之间的区域内，所述反义寡核苷酸的序列为5’-GAGUGCAGCGGCGCGAUCUCGGCUC-3’。所述的反义寡核苷酸能够通过靶向屏蔽所述的SMN2基因启动子区关键甲基化区域来提升SMA患者成纤维细胞中SMN2基因的整体转录水平和SMN蛋白的表达水平，与已上市的药物nusinersen处理的效果接近，可以作为SMN靶向性治疗策略中的新治疗靶点。

附图说明

图1为本发明ASO-P1分别对两例患者皮肤成纤维细胞系的SMN2基因全长转录水平的影响；用同样浓度的ASO-P1或ASO-NUS处理患者成纤维细胞24h后两名患者细胞fl-SMN2转录的水平，以GAPDH mRNA为加载对照，采用qRT-PCR检测SMN2 mRNA。Mock是指NC ASO细胞组，柱状图代表三个独立实验的平均值±SEM；

图2为本发明ASO-P1分别作用于两例患者皮肤成纤维细胞系的蛋白免疫印迹图。成纤维细胞分别用ASO-P1或ASO-NUS处理48-72h后提取蛋白，进行SDS-PAGE电泳检测。然后以beta actin作为内参蛋白，用Western blotting检测SMN蛋白的表达；

图3为本发明ASO-P1对两例患者皮肤成纤维细胞系的SMN蛋白表达水平的影响，将SMN蛋白水平以beta actin为内参蛋白进行均一化，直方图显示相应的定量，Mock是指NCASO细胞组，柱状图代表三个独立实验的平均值±SEM；

图4中A为本发明ASO-P1对患者皮肤成纤维细胞系的SMN蛋白相关的核内gem小体(检测功能性的SMN蛋白复合体)的数量的影响，其中Goat anti-mouse antibody AlexaFluor 488为二抗，细胞核用DAPI染色，箭头所指为gem小体。Control代表正常细胞组。Mock是指NC ASO细胞组。B显示了每个ASO处理组中每100个细胞中gem小体的总数。C显示了每个ASO处理组中含有多个gem小体的细胞的数量，柱状图代表三个独立实验的平均值±SEM。

具体实施方式

本发明涉及特定的反义寡核苷酸，其在SMN2基因启动子区上的-300～-276之间的区域内结合，并且所述反义寡核苷酸均经过2’-甲氧乙基修饰和硫代修饰来提高稳定性，每个反义寡核苷酸都具有显著的效率和有效性。

为了确定所述反义寡核苷酸的结合区域，针对前期研究的与疾病严重程度明显相关的SMN2启动子区关键甲基化位点nt-290设计了靶向性结合的反义寡核苷酸(ASO-P1)。最后通过评估所述的反义寡核苷酸对SMA患者成纤维细胞的SMN2基因表达的提升效果来确定新的治疗方案。

以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

反义寡核苷酸是人工合成的单链核酸链，通过序列特异地与疾病相关靶基因mRNA结合，改变或减少靶基因的表达而发挥治疗作用。

本发明涉及靶向SMN2基因启动子区甲基化位点nt-290所在区域的反义寡核苷酸，其结合至SMN2基因启动子区的-300～-276之间的区域内。

“反义寡核苷酸”在本文中可以被称为“ASO”。

反义寡核苷酸采用2’-甲氧乙基修饰和硫代修饰。所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性，增强其与靶基因的杂交亲和力。

2’-甲氧乙基修饰是指核糖2’位的羟基被甲氧乙氧基取代。这一修饰技术不仅提高反义寡核苷酸的稳定性，提高其与靶基因的杂交亲和力，而且降低了反义寡核苷酸的副作用，同时可以保留其激活RNase H的活性。

硫代修饰是指对磷酸骨架的修饰，用一个硫原子取代主链中的一个非桥氧原子，这一修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性，延长其血清半衰期。

本发明还涉及药物组合物，包括本发明所述的反义寡核苷酸和可药用载体，其中载体将反义寡核苷酸转运到靶细胞中。

所述反义寡核苷酸可与各种可药用载体分子配制成药用制剂。当前描述的反义寡核苷酸可与增强其进入靶细胞能力的可药用载体分子复合。这种可药用载体分子包括但不限于糖、聚胺、氨基酸、肽、脂质和其它对细胞生长不可或缺的分子。

本发明还涉及装载有所述药物组合物的细胞，所述的细胞为SMA患者皮肤成纤维细胞。

涉及用于促进细胞中SMN2基因表达的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的能够结合至SMN2启动子区的反义寡核苷酸接触，其中所述反义寡核苷酸的结合发生在所述启动子区上的-300～-276之间的区域内。

还涉及用于治疗脊髓性肌萎缩症的方法，其要求调节对其有需要的个体的SMN2基因的表达，所述方法包括使所述个体的细胞与有效量的能够结合至SMN2启动子区的反义寡核苷酸接触，其中所述反义寡核苷酸的结合发生在所述启动子区上的-300～-276之间的区域内。

下面结合实验与附图，进一步说明本发明的技术方案。

1.材料与方法：

1.1细胞培养和转染：

SMA患者皮肤成纤维细胞系采用组织块贴壁法进行原代培养，接种于25ml培养瓶中。用15％DMEM培养基：DMEM培养基，15％胎牛血清(GIBCO)和100单位抗生素(TRANS)在条件为5％CO2，37℃、90％湿度的孵箱中培养细胞。将成纤维细胞接种在6孔培养板中，待细胞汇合度达到70％～80％时，随机分为NC ASO细胞组、ASO-P1细胞组、和ASO-NUS细胞组。其中NC ASO细胞组为阴性对照组；ASO-NUS细胞组为阳性对照组，ASO-NUS的序列为5’-TCACTTTCATAATGCTGG-3’，与已上市的药物nusinersen序列相同，ASOs均由生工生物工程股份有限公司提供。用含5ul EL转染试剂和100uM ASO的转染复合物转染成纤维细胞，所述的转染复合物用Opti-MEM培养基稀释。加入15％DMEM培养基在所述条件下继续培养。

1.2逆转录及qRT-PCR反应：

用反义寡核苷酸转染成纤维细胞24h后收集细胞，使用RNAsimple total RNA试剂盒(TIANGEN)按照说明书来提取总RNA。取800ng总RNA使用随机引物和M-MLV逆转录酶(Invitrogen)进行逆转录。对所有RNA样品，采用吸光度法测定其浓度。通过实时定量PCR对SMN2转录本进行定量。应用7500Real-Time PCR System系统(Applied Biosystems)，热循环条件为：50℃2min，95℃10min,40循环的95℃15s和60℃1min。Primer Express v1.5software(Applied Biosystems)用来设计引物和探针。fl-SMN1和fl-SMN2转录本用同样的引物来扩增，得到75bp的PCR产物。利用两种不同的Taqman MGB探针，根据位于7外显子中的C→T转变来区分两个基因的全长转录本。对于GAPDH，引物和MGB探针序列如下所示，得到73bp的PCR产物。数据评估应用7500 Software SDS version 1.4。所涉及的引物和探针如下所示：

1.3蛋白免疫印迹分析：

用反义寡核苷酸转染成纤维细胞48～72h后收集细胞，向细胞中加入总蛋白提取缓冲液(TPEB)和蛋白酶抑制剂(TRANS)并在冰上裂解30分钟，期间每10min震荡一次。4℃,14000x g离心10分钟，小心收集上清(细胞总蛋白)。采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。蛋白质样品在SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离，并转移到膜上(Whatman)。用单克隆小鼠抗SMN抗体(BD)、beta actin小鼠单克隆抗体(proteintech)和山羊抗小鼠抗体(TRANS)进行蛋白印迹。用化学发光底物(Thermo)孵育膜，观察蛋白条带，用Quantity one 1-D分析软件(Bio-Rad)分析蛋白条带的净光密度。

1.4细胞荧光免疫染色和核内gem小体计数：

将成纤维细胞铺在玻璃底细胞培养皿(NEST)上，在15％DMEM中培养。生长过夜后，用100nm的反义寡核苷酸转染细胞。转染24～72h后，用PBS洗涤3次，室温下用甲醇固定10min。PBS洗涤后，室温下在BSA(1％BSA,225ug甘氨酸，PBS,0.1％Tween 20)中封闭细胞1h，4℃条件下用单克隆小鼠抗SMN孵育过夜(1:100；BD)。PBS洗涤细胞3次，用山羊抗小鼠抗体Alexa Fluor 488(1:100,ZSGB-BIO)室温孵育1h。再次用PBS洗涤细胞，使用DAPI(Solarbio)进行细胞核染色。用Ultra VIEW VoX共聚焦显微镜(Perkin Elmer)进行细胞分析，用Nikon Ti倒置显微镜(Nikon Ti Instruments)计数核内gem小体的数量。1.5统计学分析

使用SPSS21.0版本软件，执行独立样本单因素方差分析，所有数据均采用双尾检测及方差齐性分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001具有统计学意义。

2.结果

2.1 ASO-P1对患者皮肤成纤维细胞系的SMN2基因表达的影响。

在SMA患者成纤维细胞系内通过上述实验方法分别建立NC ASO、ASO-P1和ASO-NUS干扰模型。使用qRT-PCR方法分别检测转染NC ASO、ASO-P1和ASO-NUS后的成纤维细胞的SMN2转录水平的变化，以GAPDH mRNA作为内参对照来计算SMN2全长mRNA(fl-SMN2)与GAPDHmRNA的比值(校正的fl-SMN2)，具体如图一所示。经ASO-P1处理的细胞中fl-SMN2转录水平增加了约1.32±0.07倍，△7-SMN2转录水平增加了约1.22±0.10倍。经ASO-NUS处理后的细胞fl-SMN2转录水平显著升高了1.48±0.15倍，而△7-SMN2转录水平与NC ASO细胞组之间相比无统计学差异(P>0.15)。使用ASO-P1和ASO-NUS治疗后，两名患者fl-SMN2转录水平均显著升高，且两个ASO之间比较无统计学差异(P>0.06)。

结论：靶向SMN2启动子区-300～-276区域的ASO-P1处理SMA患者成纤维细胞系后，SMN2的整体转录水平均得到提升，而ASO-NUS细胞组仅显著提升了fl-SMN2的转录水平。两者提升的效果在两个ASO之间并没有统计学差异。说明屏蔽SMN2启动子区高甲基化水平位点后可促进SMN2基因转录，提升SMN2整体转录水平，且提升效果接近已上市的药物nusinersen。

2.2 ASO-P1对患者皮肤成纤维细胞系的SMN蛋白表达的影响。

为了评估SMN蛋白水平的变化，我们使用beta actin作为内参因子。在用ASO-P1治疗后，两名患者的细胞中SMN蛋白均有所增加，具体如图三所示。经ASO-P1处理后，病例I和病例II的成纤维细胞中的SMN蛋白水平分别增加了1.28倍(P<0.0004)和1.34倍(P<0.0008)。在ASO-NUS处理组中，病例I和病例II的成纤维细胞中的SMN蛋白水平分别增加1.34倍(P<0.0021)和1.45倍(P<0.003)。ASO-P1细胞组的这些作用与相同实验条件的ASO-NUS细胞组间比较，无统计学差异(P>0.233)。

结论：靶向SMN2启动子区-300～-276区域的ASO-P1处理SMA患者成纤维细胞系后，SMN蛋白表达的水平均得到提升，提升的效果接近已上市的药物nusinersen。

2.3 ASO-P1对患者皮肤成纤维细胞系的gem小体的数量的影响。

Gem小体是SMN蛋白形成稳定的多蛋白复合物的核结构。SMA患者的核gem小体的数量显著减少，并与SMA临床严重程度相关。为了评估ASO-P1对核gem小体的影响，我们使用共聚焦显微镜分别分析了ASO-P1和ASO-NUS细胞组中SMN蛋白的细胞内定位，具体如图四A所示。与NC ASO细胞组的平均每100个细胞含有的7个gem小体相比，用ASO-P1处理的SMA成纤维细胞的细胞核gem小体的数量显著增加到每100个细胞含有29个，具体如图四B所示。此外，经ASO-P1处理后，含有多个gem小体的细胞数量增加，不含gem小体的细胞数量减少，具体如图四C所示。用ASO-NUS处理的细胞平均每100个细胞有38个gem小体。正常细胞组平均每100个细胞有58个gem小体。这些结果表明，ASO-P1显著提高了SMN蛋白的功能性表达，其作用与ASO-NUS相似。

结论：靶向SMN2启动子区-300～-276区域的ASO-P1处理SMA患者成纤维细胞系后，细胞核gem小体的数量均显著增加，这说明屏蔽SMN2启动子区高甲基化水平位点后可以显著提高SMN蛋白的功能性表达。

以上描述了本发明的基本原理和主要特征，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种靶向SMN2启动子区甲基化位点nt-290所在区域的反义寡核苷酸在制备用于治疗脊髓性肌萎缩症的药物组合物中的用途，其特征在于，

所述反义寡核苷酸能够结合至SMN2基因启动子区，所述反义寡核苷酸的结合发生在SMN2基因启动子区的关键甲基化区域内；

所述反义寡核苷酸能够与SMN2基因启动子区-300～-276之间的区域序列杂交；

所述反义寡核苷酸的序列为5’-GAGUGCAGCGGCGCGAUCUCGGCUC-3’；

所述反义寡核苷酸均经过2’-甲氧乙基修饰和硫代修饰来提高稳定性；

所述药物组合物包含所述反义寡核苷酸与可药用载体，所述可药用载体将所述反义寡核苷酸转运到靶细胞中，所述药物组合物被装载细胞中；所述可药用载体包括糖、聚胺、氨基酸、肽、脂质中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述反义寡核苷酸能调节对其有需要的个体的SMN2基因的表达。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途包括使所述靶细胞与有效量的所述反义寡核苷酸接触。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述靶细胞为脊髓性肌萎缩症患者的皮肤成纤维细胞。