EA029094B1 - Антисмысловые соединения, нацеленные на коннексины, и способы их применения - Google Patents

Abstract

В изобретении представлены способы и композиции для модуляции активностей коннексинов, в том числе, например, для применения в постхирургических применениях, применениях при травме или применениях для конструирования ткани. Эти соединения и способы могут быть использованы терапевтически, например для уменьшения тяжести связанных с побочными эффектами заболеваний и нарушений, при которых является желательным локализованное разрушение прямой коммуникации клетка-клетка.

Description

изобретение относится к агентам, композициям и способам и описывает агенты, композиции и способы применения соединений для модуляции экспрессии белка, ассоциированного со щелевым контактом. Эти агенты, композиции и способы применимы, например, для конструирования ткани ίη νίνο и ίη νίίτο, в том числе, например, в коже, в ткани роговицы и в связи с хирургическими процедурами глаза.

Уровень техники

Декомпенсация ткани или органа, связанная с заболеванием или повреждением, является главной проблемой здравоохранения во всем мире с низкой возможностью выбора для полного восстановления, другого, чем трансплантация органа или ткани. Однако проблемы нахождения подходящего донора означают, что эта возможность выбора является недоступной для большинства пациентов. В качестве замен в настоящее время исследуется конструирование или ремоделирование ткани посредством синтетических или полусинтетических миметиков ткани или органа, которые либо являются полностью функциональными, либо приобретают желаемую функциональность.

В частности, одной областью, в которой эта технология становится все более важной, является область, касающаяся роговицы глаза. Трансплантация роговицы является наиболее обычной формой трансплантации твердых органов, проводимой во всем мире. Каждый год приблизительно 80000 трансплантаций роговицы выполняют только в США и Соединенном Королевстве Великобритании и Северной Ирландии. Преобладание рефракционной хирургии для коррекции миопической рефракции глаза (близорукости), такой как фоторефрактивная кератэктомия (иссечение роговицы) (РКК) и лазерное ίη κϊΙη изменение рефракции роговицы удалением ее слоев, их замораживанием и шлифовкой для изменения кривизны и последующим возвращением на тот же участок (ЬА§1К), привело к дефициту подходящей роговицы для трансплантата для ремоделирования ткани после хирургии или патологических процессов и для манипуляции ткани ίη νίνο для конструирования изменений. Кроме того, приблизительно 5% пациентов, подвергающихся лазерной хирургии, претерпевают неожиданные результаты.

Роговица представляет собой прозрачную ткань, которая включает в себя центральную одну шестую часть наружной оболочки глазного яблока. Ее унифицированная структура и функция обеспечивают глаз прозрачной рефракционной поверхностью раздела, прочностью на разрыв и защитой от внешних факторов. Роговица построена из трех различных основных слоев клеток: эпителия, стромы и эндотелия (Рероке Τδ. с1 а1., "ТЬе сотеа; Ай1ег'к РЬукю1о§у οί 1Ье еуе: С1Ьиса1 αρρίίοαίίοη". 9⁴¹¹ ей. δΐ. Ьошк: МокЬу Уеаг Воок, 1992, 29-47; Зрспссг ν.Η., "ТЬе сотеа; ОрЬЬа1тк Ра1Ьо1о§у: αη айак аий 1ех1Ьоок; 4'¹' ей., РИ1айе1рЫа: ν.Β. Занийегк Со., 1996, 157-65). Кроме того, Десцеметова оболочка, оболочка Боумана и базальная мембрана являются структурами, которые образуются некоторыми путями из одного из этих основных клеточных слоев.

Роговичный эпителий является слоем, находящимся в прямом контакте с наружной средой. Он является слоистой, сквамозной, некератинизированной структурой с толщиной в диапазоне 40-100 мкм у крыс и у людей соответственно. Он состоит из поверхностной зоны, обычно образованной двумя-тремя слоями плоских сквамозных клеток; средней зоны, образованной двумя-тремя слоями полиэдрических "крылатых" клеток; и базальной зоны, состоящей из единственного ряда цилиндрических клеток (столбчатых эпителиоцитов). Этот слоистый роговичный эпителий характеризуется как "плотный" транспортирующий ионы функциональный синцитий, который служит как в качестве защитного барьера для поверхности глаза, так и в качестве вспомогательного секретирующего жидкость слоя, помогающего роговичному эндотелию в регуляции гидратации стромы и способствующего тем самым поддержанию прозрачности роговицы. Было показано, что эти уникальные и специализированные качества, предоставляемые роговичным эпителием, являются важными для функционирования роговицы в качестве главного рефракционного элемента глаза. Таким образом, важно, чтобы его слоистая структура поддерживалась независимо от любых стрессов окружающей среды.

Травма поверхности роговицы является широко распространенной; например небольшие царапины, глазные инфекции и заболевания, химические или механические травмы и хирургическая практика - все могут повреждать роговицу. Одним основным осложнением в заживлении ран после травмы роговицы является потеря остроты зрения вследствие реорганизации ткани. Пациенты, имеющие риск возникновения проблем офтальмологического заживления, включают в себя пациентов, которые были подвергнуты хирургии. Примеры такой хирургии включают в себя, но не ограничиваются ими, удаление катаракты с заменой или без замены хрусталика; трансплантацию роговицы или другие проникающие процедуры, такие как проникающая кератопластика (пересадка роговицы) (РКК); эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия; фильтрующая хирургия глаукомы; радиальная кератотомия и другие типы хирургии для коррекции рефракции или замены хрусталика.

Роговица обеспечивает наружную оптически гладкую поверхность для передачи света в глаз. Хирургия нарушает силы, которые удерживают роговицу в ее нормальной конфигурации. У пациентов с катарактой хирургический разрез полной толщины делают в участке лимба (края) роговицы. Роговица сокращается при заживлении, вызывая локальную деформацию ткани и сопутствующее искажение в поле зрения в пораженном участке (астигматизм).

- 1 029094

Другие хирургические раны в роговице могут инициировать процесс заживления раны, который вызывает заранее определенное локальное смещение в кривизне роговицы. Наиболее широко известным из этих способов является радиальная кератотомия (КК), в которой делают несколько разрезов частичной толщины для индуцирования центрального уплощения роговицы. Однако этот способ является ограниченным вследствие отсутствия предсказуемых результатов и значительных флуктуаций в зрении, оба из которых связаны с характером и степенью заживления раны Денег е! а1., Согпеа (1992) 11: 191). Например, у большинства пациентов с КК наблюдали уменьшение периферического вспучивания ткани роговицы с ассоциированным регрессом в начальном улучшении зрения (МеОоппе1 апй ЗсНап/Пп. АтсК ОрЫа1то1. (1988), 106:212).

Раны в роговице также медленно заживают, и неполное заживление имеет тенденцию быть ассоциированным с нестабильностью остроты зрения (с флюктуациями в зрении с утра до вечера, а также со сдвигом остроты зрения, наблюдающимся на протяжении периода недель-месяцев). Это может быть причиной того, что 34% или более пациентов, которые имели радиальную кератотомию, жаловались на флюктуирующее (меняющееся) зрение спустя один год после хирургии ^атш§ е! а1., Атег. 1. Ор1иНа1то1. (1991) 111:133). Кроме того, если ранение роговицы не заживляется полностью, может встречаться "раскрывание" раны, приводящее к эффекту дальнозоркости. До 30% пациентов, имеющих ККпроцедуру, подвержены сдвигам в сторону дальнозоркости, ассоциированным с раскрытием раны (Э1е1/ е! а1., ОрЙЬа1то1о§у (1986) 93:1284).

Регенерация роговицы после травмы является комплексной и не вполне понимаемой. Она включает в себя регенерацию трех тканей: эпителия, стромы и эндотелия. Считается, что три основных пути передачи сигналов координируют регенерацию ткани: один, опосредованный факторами роста (Ва1й\\1п Н.С. апй МатксЬа11, Ас!а Ор1иНа1то1. 8сапй., (2002) 80: 238-47), цитокинами (АЬтаЙ1 Ай. апй 1асоЫес Р.А., 1п1. Ор1иНа1то1. Сйтск, (2002) 42(3): 13-22) и хемокинами (Киграки5-^Ьеа1ег М., е! а1., Вю!есК Н1к!осЬет. (1999) 74: 146-59); другой, опосредованный взаимодействиями клетка-матрикс (Тапака Т., е! а1., 1рп. 1. ОрЫЬа1шо1., (1999) 43: 348-54); и другой, опосредованный щелевыми контактами клеток и семейством коннексинов, образующих каналы белков.

Щелевые контакты (нексусы) являются структурами клеточных мембран, которые облегчают прямую коммуникацию клетка-клетка. Канал щелевого контакта образуется двумя коннексонами, каждый из которых состоит из шести субъединиц коннексинов. Каждый гексамерный коннексон стыкуется с коннексоном в противолежащей мембране с образованием единого щелевого контакта. Каналы щелевых контактов могут быть обнаружены по всему телу. Ткань, например роговичный эпителий, имеет шестьвосемь слоев клеток, но все еще экспрессирует каналы щелевых контактов в различных слоях с коннексином-43 в базальном слое и коннексином-26 от базального до среднего слоя "крылатых" клеток. В целом, коннексины являются семейством белков, обычно называемых в соответствии с их молекулярной массой или классифицируемых на филогенетической основе на подклассы альфа, бета и гамма. К настоящему времени были идентифицированы 20 изоформ для человека и 19 изоформ для мышей (ХУШеске К. е! а1., Вю1. С1ет., (2002) 383, 725-37), что, возможно, свидетельствует о том, что каждый отличающийся белок коннексин может быть функционально специализирован. Различные типы тканей и клеток имеют характерные картины экспрессии белков коннексинов, и было показано, что такие ткани, как роговица, изменяют картину экспрессии белков-коннексинов после повреждения или трансплантации (Οιιί С. е! а1., (2003) Ситтеи! Вю1о§у, 13: 1967-1702; Вгапйег е! а1., (2004) 1. 1пуек!. Эетта!о1. 122 (5): 1319-20).

Процесс регенерации роговицы после травмы может приводить к потере прозрачности роговицы и, следовательно, влиять на результат рефракционной хирургии. Существующие способы обработки для поврежденной роговицы включают в себя трансплантацию роговицы или попытки использования роговичных клеток/тканей для ремоделирования. Однако послеоперационная травма роговицы и окружающей мягкой ткани после хирургических процедур, таких как, например, эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия, часто приводит к образованию рубцов вследствие гиперцеллюлярности (повышенного содержания клеток), связанной с модификацией внеклеточного матрикса, включающей в себя изменение паттернинга эпителиальных клеток, дифференцировки миофибробластов, стромального ремоделирования и эпителиальной гиперплазии в участке индуцированного лазером повреждения.

При тяжелых повреждениях спинного мозга патологические изменения, которые происходят независимо от того, вызваны ли они рассечением, закрытой травмой или сдавливанием, имеют некоторые сходные признаки с послеоперационным образованием рубцов и ремоделированием ткани. В пределах 24-48 ч после повреждения это повреждение распространяется и значительно увеличивает размер пораженной зоны. В этом может принимать участие опосредованный щелевым контактом эффект свидетеля (Ьш 1.Н. е! а1., 1998, Ыа!иге Дешокск 1: 431-432), при помощи которого каналы щелевого контакта распространяют волны нейротоксинов и кальция из участка повреждения к здоровой в остальном ткани. Это сопровождается характерным воспалительным опуханием. Участок повреждения в спинном мозгу заменяется полостью или рубцом из соединительной ткани, которые в каждом случае препятствуют регенерации аксонов (МсЭопа1й IV. е! а1., (8ер!етЬет 1999) Заепййс Атепсап, 55-63; Катег М.8. е! а1., 8р1па1 Согй. (2000) 38: 449-472; 8сЬт1й! С.Е. апй Ва1ег Ьеасй 1., (2003) Апп. Кеу. Вютей. Епд. 5: 293-347). Хотя был достигнут прогресс с некоторыми существующими терапевтическими способами, все еще остаются

- 2 029094

основные ограничения в отношении репарации спинного мозга, в том числе то, что само инвазивное вмешательство может дополнительно расширять повреждение и образование глиальных рубцов, препятствуя процессу заживления, и увеличивать риск дополнительной потери нервной функции (Ка18шап СП. Коуа1 8ос. Меб. 96: 259-261).

Антисмысловую технологию использовали для модуляции экспрессии генов, участвующих в вирусных, грибковых и метаболических заболеваниях. В патенте США № 5166195 предложены олигонуклеотидные ингибиторы ВИЧ. В патенте США № 5004810 предложены олигомеры для гибридизации с мРНК вируса простого герпеса Ушет65 и ингибирования репликации (см. также νΟ 00/44409, выданный Вескег е! а1., поданный 27 января 2000 г. и озаглавленный "Рогти1а1юп8 Сотрпкшд Апйкепке Ыиекойбек 1о Соппехиъ". содержание которого включено тем самым путем отсылки в его полном объеме и который описывает применение антисмысловых (А8) олигодезоксинуклеотидов для понижающей регуляции экспрессии коннексина для лечения локального нейронного повреждения в головном мозгу, спинном мозгу или зрительном нерве, в стимуляции заживления ран и уменьшения образования рубцов ткани кожи после хирургии или ожогов). Однако остаются многочисленные трудности, которые требуется преодолеть. Часто бывает так, например, что понижающая регуляция продукта конкретного гена в типе клеток, не являющихся мишенью, может быть губительной. Дополнительные проблемы, которые должны быть преодолены, включают в себя короткий полупериод существования в теле таких ΟΌΝ (немодифицированных фосфодиэфирных олигомеров), которые имеют внутриклеточный полупериод существования только 20 мин вследствие деградации внутриклеточной нуклеазой ^адпег 1994, 8ирга) и их стойкую и надежную доставку к тканям-мишеням.

Таким образом, существует потребность, и имеются огромные потенциальные преимущества в развитии соединений, требуемых для описанных выше проблем. Такие соединения, родственные композиции и способы их применения описаны и заявлены здесь.

Сущность изобретения

Описанные и заявленные здесь изобретения имеют много признаков и вариантов осуществления, в том числе, но не только, признаки и варианты осуществления, представленные, или описанные, или упоминаемые в этом разделе "Сущность изобретения". Изобретения, описанные и заявленные здесь, не ограничиваются признаками или вариантами осуществления, идентифицированными в этом разделе "Сущность изобретения", который включен только с целью иллюстрации, а не с целью ограничения.

Здесь обеспечены соединения, применимые для конструирования ткани, в том числе антисмысловые соединения. Обеспечены также антисмысловые соединения и способы уменьшения повреждения ткани, связанного с офтальмологическими процедурами. Эти способы предусматривают, например, введение антисмыслового соединения в глаз субъекта в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина в глазу или в клетках, ассоциированных с глазом этого субъекта. Хотя предпочтительно ингибирование экспрессии белка коннексина, ожидается, что другие белки могут быть мишенями для модуляции этими соединениями, в том числе антисмысловыми соединениями, либо отдельно, либо в комбинации с антисмысловыми или другими соединениями, которые ингибируют экспрессию коннексинов человека.

В некоторых вариантах осуществления офтальмологической процедурой является офтальмологическая хирургия, в том числе, но не только, эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия, удаление катаракты, трансплантация роговицы, хирургия для коррекции рефракции (преломления), радиальная кератотомия, фильтрующая хирургия глаукомы, кератопластика, эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия, трансплантация роговицы, хирургия для коррекции рефракции (преломления), иссечение неоплазии глазной поверхности, трансплантация конъюнктивы или амниотической оболочки, иссечение птеригия и пингвекулы, глазная пластическая хирургия, иссечение опухоли века, процедуры ремоделирования века для врожденных патологий, репарация эктропиона и энтропиона глазного века, хирургия по поводу страбизма (косоглазия) или любой проникающей травмы глаза.

Обычно известна по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности для коннексинов, в которой желательно ингибирование экспрессии. Предпочтительно антисмысловое соединение нацелено на один или несколько специфических типов коннексинов. Специфические изотипы коннексинов, на которые могут быть нацелены антисмысловые соединения, включают в себя, без ограничения, коннексины 43, 37, 31.1 и 26. Предпочтительно, но необязательно, коннексины-мишени являются коннексинами человека. Коннексин (например, человека) может, например, иметь последовательность нуклеотидов, выбранную из 8ЕО ГО ΝΟ: 12-31.

В некоторых вариантах осуществления антисмысловые соединения нацелены по меньшей мере на приблизительно 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидов, выбранную из 8ЕО ГО N0:12-31.

В некоторых других вариантах осуществления второе антисмысловое соединение вводят субъекту (например, в глаз), причем один или несколько других антисмысловых соединений нацелены по меньшей мере на приблизительно 8 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин (например, человека), имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из 8ЕО ГО N0:12-31. По меньшей мере второе антисмысловое соединение может быть, например, нацелено на кон- 3 029094

нексин другой, чем коннексин, на который нацелено первое антисмысловое соединение.

Примеры типов антисмысловых соединений, которые могут быть использованы в различных аспектах данного изобретения, включают в себя антисмысловые олигонуклеотиды, антисмысловые полинуклеотиды, дезоксирибозимы, морфолиноолигонуклеотиды, άδΚΝΆ (двухцепочечные РНК), молекулы ΚΝΆί (интерферирующие РНК), молекулы ПНК, ДНКзимы и мутированные по 5'-концу малые ядерные РНК υΐ, аналоги вышеупомянутых молекул, а также другие соединения, обеспеченные здесь или известные в данной области, в том числе, но не только, например, неспецифические разобщители, такие как октанол, глицеретиновые кислоты и гептанол.

В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловыми соединениями являются антисмысловые олигонуклеотиды, которые содержат природные нуклеотиды и немодифицированную межнуклеозидную связь. В других вариантах осуществления, например, антисмысловыми соединениями являются антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, в том числе антисмысловые олигонуклеотиды с фосфоротиоатной связью. Подходящие антисмысловые олигонуклеотиды включают в себя также, например, олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну модифицированную сахарную часть молекулы. Подходящие антисмысловые соединения включают в себя также, например, олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одно модифицированное нуклеотидное основание.

В некоторых вариантах осуществления обеспеченные здесь антисмысловые соединения вводят в комбинации с другим соединением, например соединением, полезным для уменьшения повреждения ткани, уменьшения воспаления, стимуляции заживления или некоторой другой желаемой активности.

В другом аспекте данное изобретение включает в себя способы лечения субъекта (например, пациента) введением антисмысловых соединений этому субъекту.

В некоторых вариантах осуществления обеспеченные здесь антисмысловые соединения вводят путем локального или местного введения. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть также введены системно или внутриглазной инъекцией.

Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены субъекту в заранее определенное время, например, относительно образования раны, так, как это имеет место в офтальмологической процедуре (например, хирургической). Например, антисмысловые соединения могут быть введены перед офтальмологической процедурой, во время офтальмологической процедуры или после офтальмологической процедуры. Например, антисмысловые соединения могут быть введены субъекту в пределах минут или часов до или после выполнения офтальмологической процедуры. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение вводят после выполнения офтальмологической процедуры и, например, антисмысловое соединение вводят в пределах приблизительно 4 ч от этой процедуры, в пределах приблизительно 3 ч от этой процедуры и более часто в пределах приблизительно 2 ч от офтальмологической процедуры или в пределах приблизительно ΐ ч от офтальмологической процедуры.

В другом аспекте обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в способах для выполнения конструирования ткани. Например, обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в сочетании со способом, который увеличивает толщину ткани роговицы в субъекте. Такой способ может быть связан или может не быть связан с офтальмологической процедурой (например, хирургией). В качестве примера обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в сочетании со способом, который стимулирует заживление или предотвращает повреждение ткани в клетках, ассоциированных с роговицей этого субъекта (например, клетках роговицы).

В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение уменьшает образование рубцов. В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение уменьшает воспаление. В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение стимулирует заживление ран.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение используют вместе с хирургической процедурой имплантации.

В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение нацеливают на коннексин 43 и вводят для регуляции деления и роста эпителиальных базальных клеток.

В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение нацеливают на коннексин 31.1 и вводят для регуляции кератинизации наружного слоя.

Согласно некоторым вариантам осуществления, например, офтальмологической процедурой является удаление катаракты. В других вариантах осуществления, например, этой офтальмологической процедурой является трансплантация роговицы. В других вариантах осуществления, например, этой офтальмологической процедурой является хирургия для коррекции рефракции. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является радиальная кератотомия. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является фильтрующая хирургия глаукомы. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является иссечение неоплазмии глазной поверхности. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является трансплантация конъюнктивы или амниотической оболочки. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является иссечение птеригия или пин- 4 029094

гвекулы. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является глазная пластическая хирургия. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является иссечение опухоли века. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является реконструктивная процедура века для врожденных патологий. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является репарация эктропиона и энтропиона глазного века. В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является хирургия страбизма (косоглазия) (глазной мышцы). В других вариантах осуществления, например, офтальмологической процедурой является проникающая глазная травма.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления соединения и композиции используют для стимуляции заживления или для предотвращения повреждения ткани в клетках, связанных с роговицей, где этими клетками, связанными с роговицей, могут быть любые клетки в глазу, в том числе, но не только, роговичные клетки.

Обеспеченные здесь агенты, в том числе антисмысловые соединения, могут увеличивать толщину ткани роговицы в субъекте. В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение используют в комбинации с другим соединением, применимым для уменьшения повреждения ткани или стимуляции заживления. Например, антисмысловые соединения могут вводиться совместно с фактором роста, цитокином или т.п.

В другом аспекте, например, обеспечена фармацевтическая композиция для уменьшения повреждения ткани, связанного с офтальмологической хирургией. Эту фармацевтическую композицию готовят подходящим образом, например, для местного или локального введения в глаз субъекта, и эта композиция содержит антисмысловое соединение, присутствующее в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина человека в клетках, ассоциированных с глазом этого субъекта. Это антисмысловое соединение, например, нацелено предпочтительно по меньшей мере на 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин (например, человека), имеющей последовательность нуклеотидов, выбранную из 8ЕО ГО N0:12-31.

В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловые соединения находятся в форме фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель или переносчик, и этот агент или антисмысловое соединение присутствует в количестве, эффективном для стимуляции заживления раны в субъекте. В некоторых вариантах осуществления эти фармацевтические композиции могут быть, например, в форме, подходящей для местного введения, в том числе в форме, подходящей для местного или локального введения в глаз субъекта. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, например, эти композиции и готовые формы могут быть в форме геля, крема или любой из форм, описанных здесь или известных в данной области, независимо от того, существуют ли они в настоящее время или будут созданы в будущем.

В другом аспекте данное изобретение включает в себя фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения. В одном варианте осуществления, например, обеспечена фармацевтическая композиция для уменьшения повреждения ткани, связанного с офтальмологической процедурой (например, хирургией), так что эту фармацевтическую композицию готовят для местного или локального введения в глаз субъекта, и она содержит антисмысловое соединение, присутствующее в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина человека в клетках, связанных с глазом этого субъекта. В некоторых вариантах осуществления, например, это антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин (например, человека), имеющей последовательность нуклеотидов, выбранную из 8Е0 ГО N0:12-31.

В некоторых вариантах осуществления, например, эта фармацевтическая композиция включает в себя фармацевтически приемлемый носитель, содержащий плюроник (кислоту или гель). В одном варианте осуществления она включает в себя, например, до приблизительно 30% Плюроника в виде кислоты в забуференном фосфатом солевом растворе.

В другом аспекте обеспечены способы конструирования антисмысловых олигонуклеотидов, которые нацелены на один или несколько коннексинов. Этот способ может включать в себя оптимизацию выбранных параметров, таких как термостабильность, аффинность и специфичность конкретного олигонуклеотида в отношении выбранной мишени. Этот способ может быть использован для отбора и разработки олигонуклеотидов, содержащих одну или несколько конкретных желаемых полинуклеотидных последовательностей. Испытание антисмысловых олигонуклеотидов может выполняться в сочетании со способом, например, на их способность расщеплять мРНК или блокировать трансляцию белка коннексина.

Описание фигур

Фиг. 1 показывает конфокальные микроскопические изображения ίη νίνο роговицы спустя 12 ч после фоторефрактивной кетатэктомии в контрольных и обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами глазах.

Фиг. 2 показывает гистологическое исследование ремоделирования роговицы в контрольных (2А, 2В, 2С) и обработанных антисмысловым олигодезоксинуклеотидом роговицах крыс (2И, 2Е) спустя 24 ч после эксимерного лазерного фотоиссечения.

- 5 029094

Фиг. 3 обеспечивает микрофотографические изображения, показывающие экспрессию белка коннексина 43 в контрольной (3А, 3В, 3С) и обработанных антисмысловым олигонуклеотидом роговицах (3Ό, 3Е, 3Р) спустя 24 ч после эксимерного лазерного иссечения. Эти результаты демонстрируют, что уровни белка коннексина 43 уменьшаются после обработки ΘΌΝ против коннексина 43 и это приводит к меньшей степени рекрутинга клеток в строме.

Фиг. 4 показывает мечение миофибробласта спустя 1 неделю после хирургии с использованием антител против альфа-актина гладких мышц. Фиг. 4А, 4В и 4С являются контролями, и 4Ό, 4Е и 4Р являются обработанными антисмысловым соединением роговицами.

Фиг. 5 показывает мечение ламинином-1 контрольных (5А, 5В) и обработанных антисмысловым олигонуклеотидом против коннексина 43 роговиц спустя 24 ч (5А -5Ό) и 48 ч (5Е - 5Н) после фоторефрактивной кератэктомии. При 24 ч контроли имели небольшое и/или неравномерное отложение ламинина на краю иссеченной зоны (5А) и более центрально (5В), тогда как обработанные антисмысловым олигонуклеотидом роговицы показали более регулярное отложение ламинина на обоих из этих участков (5С, 5Ό). При 48 ч контроли все еще не имеют непрерывного отложения ламинина (5Е - край иссеченной зоны; фиг. 5Р - центральное положение), и отложение было очень неравномерным (5Е). В противоположность этому обработанные ΘΌΝ роговицы имели непрерывный и относительно ровный базальный слой на краю раны (5С) и в центре (5Н).

Фиг. 6 показывает схематическую диаграмму количественного определения нерегулярности ламинина-1.

Фиг. 7 показывает иммуногистохимическое мечение для коннексинов 26 и 43 в контрольных культурах (7А) и после трех обработок олигодезоксинуклеотидами против коннексина 43 на протяжении 24часового периода (7В) и после обработки специфическим в отношении коннексина 31.1 антисмысловым соединением (7С, 7Ό).

Фиг. 8 показывает сегменты спинного мозга из детенышей крыс Р7 спустя 24 ч после помещения в культуру. Контрольный сегмент (1) является распухшим (стрелки), с тканью, выступающей из концов разреза. Пунктирные линии отмечают начальные разрезы. Гистологическое исследование показывает, что клетки являются вакуолизированными и отечными. В день 5 эти сегменты имеют активированную микроглию повсюду и несколько выживших нейронов. В противоположность этому обработанный антисмысловым соединением сегмент (2) имеет значимо уменьшенное опухание в сравнении с контролями (р<0,001) с минимальным отеком и минимальной вакуолизацией. Даже после 20 дней в культуре нейроны в сером веществе остаются жизнеспособными и имеют активированную микроглию, ограниченную наружными краями.

Фиг. 9 показывает нейроны из обработанного контролем сегмента (9А) и обработанного антисмысловым соединением в отношении коннексина 43 сегмента (9В). Нейроны в контрольном сегменте являются вакуолизированными и отечными, и окружающая ткань разрушена, но нейроны в обработанном сегменте кажутся здоровыми и жизнеспособными.

Фиг. 10 иллюстрирует МАР-2-иммуномечение вблизи концов культивируемых сегментов спинного мозга спустя пять дней после помещения в культуру. Контрольные сегменты имеют небольшое количество жизнеспособных нейронов и низкое МАР-2-мечение (16% обнаруживают какую-либо МАР-2-метку) (10А), тогда как 66% обработанных сегментов имеют зоны экспрессии МАР-2 на сторонах разрезов, экспонированных в среду и/или смежных с остальным материалом белого вещества.

Фиг. 11 иллюстрирует, что дезоксирибозимы селективно расщепляют специфические районы мРНК-мишени коннексина-43 ίη νίίτο. мРНК 2,4 т.п.н. крысы (11А) и мРНК 1,2 т.п.н. коннексина-43 мыши (11В) транскрибировали ίη νίίτο из плазмиды и инкубировали с различными дезоксирибозимами в течение 1 ч. Район 896-953 крысиной мРНК (11А) был неубедительным, так как дезоксирибозимы не были сконструированы для соответствующего района в мыши. Расщепление дезоксирибозимами района 367-466 в мышиной мРНК не согласуется с результатами из мРНК крысиного коннексина-43, возможно, вследствие присутствия 200 п.н. 5'-нетранслируемого района в крысиной мРНК. Дефектные контрольные дезоксирибозимы с единственной точковой мутацией, 6Г605 и 61783. показали, что такие расщепления были специфическими. Некоторый неспецифический ошибочный прайминг дезоксирибозимами против мышиной мРНК наблюдали в случае мышиных 6/1007 и 6ζ1028. В целом, дезоксирибозимы, нацеленные на районы нуклеотидов 526-622, 783-885 и 1007-1076, обнаруживали значимое расщепление в мРНК как крысы, так и мыши.

Фиг. 12 показывает, что дезоксирибозимы селективно расщепляют специфические районы мРНКмишени коннексина-26 ίη νίίτο. мРНК 0,7 т.п.н. крысы (12А) и мРНК коннексина-43 мыши (12В) транскрибировали ίη νίίτο из плазмиды и инкубировали с различными дезоксирибозимами в течение 1 ч. Результаты расщепления показывают, что мРНК коннексина-26 грызунов имеет по меньшей мере два района, на которые нацелены дезоксирибозимы, в районах нуклеотидов 318-379 и 493-567. Дефектные контрольные дезоксирибозимы с единственной точковой мутацией, 6ί351 и 6ί379, показали, что такие расщепления были специфическими.

Фиг. 13 показывает проникновение и стабильность антисмыслового олигомера в культивируемых роговицах в течение до одного часа. Су3-меченые олигомеры показывают пятнистое ядерное и цито- 6 029094

плазматическое мечение спустя один час после доставки с использованием геля Плюроника (13А). Скорость видимого проникновения Су3 была 10-15 мкм спустя один час в роговичном эпителии (13В). Тас.|тап-меченые олигомерные зонды использовали для измерения стабильности антисмысловых олигомеров внутри эпителиальных клеток с использованием Лямбда-сканирования, причем каждая панель показывает спектр испускания света 5 нм в направлении красного цвета (13В). Интактный Тацтап-зонд показывает резонансный перенос энергии флуоресценции с красным флуоресцентным светом ТАМКА, представленным на шкале уровней серого цвета (нейтральной) (13Ό), тогда как продукты распада представлены в виде зеленой флуоресценции, как и ожидалось от РАМ (также показанные на шкале уровней серого цвета (13С)). Эффективная концентрация антисмыслового олигомера в клетках могла бы быть более низкой, чем эффективная концентрация, которая может быть детектирована флуоресцентным способом.

Фиг. 14 иллюстрирует эффекты различных антисмысловых олигомеров на экспрессию белка коннексина-43 (светлый, шкала уровней серого цвета) и белка коннексина-26 (темный, шкала уровней серого цвета), которые были показаны расщеплением ίη νίίτο мРНК дезоксирибозимом. Фиг. 14А показывает нормальную экспрессию белка коннексина-43 (светлый, шкала уровней серого цвета) в базальных клетках и экспрессию белка коннексина-26 (темный, шкала уровней серого цвета) в базальных - промежуточных клетках обработанного гелем Плюроника роговичного эпителия. АЛ4 (14В), а5769 (14Ό), а5892 (14Р) (все три не обнаруживающие расщепления дезоксирибозимом ίη νίίτο) и смысловые контрольные олигомеры ΌΒ1 (14Н) не влияли на экспрессию обоих коннексинов в культурах ех νίνο. а§605 (14С), ;·ΐδ783 (14Е) и ΌΒ1 (140) (все три обнаруживающие положительный эффект ίη νίίτο расщепления дезоксирибозимом) обнаруживали только специфическое снижение коннексина-43 в эпителии обработанных роговиц.

Фиг. 15 показывает, что антисмысловые олигомеры коннексина-43 селективно уменьшают экспрессию белков коннексина-43 в роговицах крыс. Каждое пятно представляет единственную роговицу с различными обработками. Сплошное пятно (окрашенное в черный цвет, ΌΒ1, 35605. 35783. 35885. 35953 и 351076) показало в среднем уменьшение 36-85% в экспрессии коннексина-43 в сравнении с окрашенными в белый цвет пятнами (ΌΒ1 смысловой олигомер, а514, а5769 и а5892). Все антисмысловые олигомеры, которые согласно способу тройственного предсказания дезоксирибозима имели низкий эффект или не имели эффекта, обнаруживали в среднем 85-134% нормальной экспрессии коннексина-43. Все эксперименты нормализовали с использованием средней плотности коннексина-43 при обработке ΌΒ1, и в результате два отрицательных олигомера (а5769 и а5892) показали более высокую плотность коннексина43, чем контрольная обработка смысловым олигомером ΌΒ1.

Фиг. 16 иллюстрирует сравнение уровней мРНК коннексина-43 в роговицах крыс, обработанных антисмысловыми или смысловыми олигомерами, оцениваемых с использованием ПЦР реального времени. Этот уровень выражали в виде процента обработанной только гелем Плюроника роговицы. Три антисмысловых олигодезоксинуклеотида, которые были предсказаны анализом ίη νίίτο как функциональные, ΌΒ1Α5, А5605 и А5783 (черные столбцы), уменьшали экспрессию мРНК коннексина-43 до 46,8, 44 и 25% нормальных (только гель, белые столбцы) уровней соответственно (** р<0,001). Не наблюдали уменьшения для смыслового контрольного олигомера ΌΒ1 (106%) (белый столбец, ΌΒ1 смысловой олигомер). А5769, который не обнаруживал какого-либо расщепления мРНК Сх43 в способе тройственного предсказания дезоксирибозима ίη νίίτο, служил в качестве отрицательного контроля (148%) (белый столбец, А5769).

Фиг. 17 иллюстрирует сравнение уровней мРНК коннексина-26 в роговицах крыс, обработанных антисмысловыми или смысловыми (контрольными) олигомерами, оцениваемых с использованием ПЦР реального времени. Этот уровень выражали в виде процента обработанной только гелем Плюроника роговицы (белый столбец, только гель). А5330 и А5375 уменьшали экспрессию мРНК Сх26 до 33 и 71% соответственно (** р<0,001). Не наблюдали уменьшения для смыслового олигомера Κν330 (109%) (Κν330, белый столбец).

Подробное описание

Практика данных изобретений может использовать различные общепринятые способы молекулярной биологии (в том числе рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии, химии нуклеиновых кислот и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации в данной области. Такие способы полностью объяснены в литературе и включают в себя, но не ограничиваются ими, например, ΜοΚοιιΐ3Γ Οοηίη§: А Ρ·30οΓ3ΐοΙ\· МагшаБ 5есοηб ебНюг! (§атЬ^οοк еί а1., 1989) и ΜοΚοιιΐ3Γ Οοηйгд: А 030οΓ3ΐοΙ\' Маша! бйгб ебНюг! (§атЬ^οοк ;тб Ки55е1, 2001), вместе и индивидуально называемые здесь "δ;ηηόΐΌο1<": Ο1^дοηис1еοί^бе 8уЩЬе515 (М.Т Сай, еб., 1984); Атта1 Се11 Си11иге (К.1. ΡΐΌ5ΐΐ№2\\ еб., 1987); ΗаηбЬοοк οί ЕхрептеШа1 Iттиηο1οду (Э.М. \УеЬ & С.С. Β1;κ1<\\ό11, еб5.); Семе ТгатГсг УесЮг5 ίοτ МаттаНа]·! Се115 Ц.М. МШет & М.Р. Τ’;·ι1ο5ΐη еб5., 1987); СиггеШ ΡΐΌΐοαοΐ5 ίη Мο1еси1а^ ЕюКду (Р.М. Аи5иЬе1 еί а1., еб5., 1987, в том числе 5ирр1етей5 ηο 2001 год); РСК: ТЬе ΡοΚιικπ·^ СЬат ^;κθοη (Ми1Ь5 еί а1., еб5., 1994); СиггеШ ΡγοΙοοοΕ ίη Ιιηιηιιηο1ο§\· (ТЕ. СоИдам еί а1., еб5., 1991); ТЬе Iттиηοа55ау ΗаηбЬοοк (Ό. ХУПб, еб., δίοαίΐοη Рге55 ΝΥ, 1994); Β^οсοη^идаίе ТесЬтдие5 (Сгед Т. ^πη3η5οιι еб., Асабетю Рге55, 1996); МеίЬοб5 οί Ιιηιηι.ιηο1ο§Η;·ι1 Апз1у515 (К. Ма55еуеГГ, \У.Н. А1Ьег1 ;тб КА. ЗБит^, еб5., ХУешЬеип: УСН Уег1ад5 Се5е115сЬай тЬН, 1993), Η;·ιγ1ο\υ ;тб Бане (1988) Ληί^Ьοб^е5, А ^аЬο^аίο^у Маша1, С.о1б §ргтд

- 7 029094

НагЬог РиЪПсаОопк. Νον Уогк, апк Наг1оте апк Ьапе (1999) Икшд АпйЪоФек: А ЬаЪогаЮгу Мапиа1 Со1к 8ргшд НагЬог ЬаЪогаЮгу Ргекк, Со1к 8ргшд НагЬог, ΝΥ (вместе и индивидуально называемые здесь Наг1о\у апк Ьапе), Веаисаде е! а1., екк., Ситгеп! РгоЮсо1к ш ШсЫс Ас1к СЬепикйу 1оЬп Шкеу & 8опк, 1пс., №ν Υо^к, 2000); и Адга^а1, ек., РгоЮсо1к Гог ОПдопис1ео0кек апк Апа1одк, 8уп1Ьек1к апк Ргорегйек Нитапа Ргекк 1пс., №ν .Тегкеу, 1993).

Определения.

Перед дальнейшим описанием данных изобретений в общем и в виде различных неограничивающих конкретных вариантов осуществления приводятся некоторые термины, используемые в контексте описания данного изобретения. Если нет других указаний, следующие термины имеют следующие значения при применении их здесь и в прилагаемой формуле изобретения. Термины, которые не определены ниже или в другом месте в этом описании, должны иметь их общепринятое в данной области значение.

"Антисмысловые соединения" включают в себя различные типы молекул, которые действуют ингибирующим образом на экспрессию, трансляцию или функцию гена, в том числе типы молекул, которые действуют последовательность-специфическим нацеливанием на мРНК для терапевтических применений.

Таким образом, антисмысловые соединения включают в себя, например, основные молекулы сайленсинга генов на основе нуклеиновых кислот, такие как, например, химически модифицированные олигодезоксирибонуклеиновые кислоты (ΟΌΝ), рибозимы и δίΡ,ΝΛ (короткие интерферирующие РНК) (8сЬегег Ь.Т апк Кока ТТ №йиге Вю1есЬпо1. 21: 1457-1465 (2003). Антисмысловые соединения могут также включать в себя антисмысловые молекулы, такие как, например, пептиднуклеиновые кислоты (ПНК) (ВгааксЬ Ь.А. апк Согеу Ό.Κ., ВюсЬепикйу 41, 4503-4510 (2002)), морфолинофосфородиамидаты (Неактап Ь, Оеу. Вю1., 243, 209-214 (2002), ДНКзимы (8сЬиЪей 8. е! а1., ШсЫс Аакк Кек. 31, 5982-5992 (2003), СЬакгаЪогй 8. апк Вапецеа А.С., Мо1.ТЬег. 7, 817-826 (2003), 8ап!ого 8.Ш. апк 1оусе О.Р. Ргос. №0. Асак. 8ск И8А 94, 4262-4266 (1997), и недавно разработанные короткие ядерные РНК, мутированные на 5'-конце, И1 (Ройек Р. е! а1., Ргос. №Й. Асак. 8ск И8А 100, 8264-8269)).

Термин "антисмысловые последовательности" относится к полинуклеотидам, имеющим активность антисмыслового соединения, и включает в себя, но не ограничивается ими, последовательности, комплементарные или частично комплементарные, например, последовательности РНК. Таким образом, антисмысловые последовательности включают в себя, например, последовательности нуклеиновых кислот, которые связываются с мРНК или их частями, блокируя транскрипцию мРНК рибосомами. Антисмысловые способы обычно хорошо известны в данной области. См., например, РСТ риЪЬсайои ШО94/12633 и №е1кеи е! а1., 1991, 8шепсе 254:1497; ОИдошс1еойкек апк Апа1одиек, А Ргасйса1 АрргоасЬ, екйек Ъу Р. Ескк!еш, 1КЬ Ргекк а! ОхГогк Ишуегкйу Ргекк (1991); АнЬкенке КекеагсЬ апк Аррйсайопк (1993, СКС Ргекк).

В данном контексте "информационная РНК" включает в себя не только информацию последовательности для кодирования белка с использованием трехбуквенного генетического кода, но также ассоциированные рибонуклеотидные последовательности, которые образуют 5'-нетранслируемый район, 3'нетранслируемый район и 5'-кэп-район, а также рибонуклеотидные последовательности, которые образуют различные вторичные структуры. В соответствии с данным изобретением могут быть образованы олигонуклеотиды, которые нацелены полностью или частично на любую из этих последовательностей.

Обычно нуклеиновые кислоты (в том числе олигонуклеотиды) могут быть описаны как "ДНКподобные" (т.е. имеющие 2'-дезоксисахара и обычно нуклеотиды Т, а не и) или "РНК-подобные" (т.е. имеющие 2'-гидроксил или 2'-модифицированные сахара и обычно нуклеотиды Т, а не И). Спирали нуклеиновых кислот могут принимать более чем один тип структуры, наиболее часто А- и В-формы. Обычно считают, что олигонуклеотиды, которые имеют структуру, подобную В-форме, являются "ДНКподобными", а олигонуклеотиды, которые имеют структуру, подобную А-форме, являются "РНКподобными".

Термин "комплементарный" обычно относится к природному связыванию полинуклеотидов при пермиссивных условиях соли и температуры посредством спаривания оснований. Например, последовательность "А-О-Т" связывается с комплементарной последовательностью "Т-С-А". Комплементарность между одноцепочечными молекулами может быть "частичной", так что только некоторые части нуклеиновых кислот связываются, или может быть "полной", так что существует полная комплементарность между одноцепочечными молекулами. Степень комплементарности между молекулами нуклеиновых кислот имеет значимые влияния на эффективность и прочность гибридизации между ними. "Гибридизуемые" и "комплементарные" являются терминами, которые используют для указания достаточной степени комплементарности, так что происходит стабильное связывание между ДНК- или РНК-мишенью и олигонуклеотидом. Понятно, что олигонуклеотид не должен быть обязательно на 100% комплементарным его последовательности нуклеиновой кислоты-мишени для того, чтобы быть гибридизуемым, и понятно также, что это связывание может быть мишень-специфическим, или олигонуклеотид может связываться с другими молекулами, не являющимися мишенями, пока это неспецифическое связывание не мешает значимо или нежелательным образом терапевтической или другой цели. Олигонуклеотид используют для препятствования нормальной функции молекулы-мишени для индуцирования потери или уменьшения активности, и предпочтительно существует достаточная степень комплементарности для

- 8 029094

избегания неспецифического или нежелательного связывания этого олигонуклеотида с последовательностями, не являющимися мишенями, в условиях, в которых является желательным специфическое связывание, или в случае анализов ίη νίίτο в условиях, в которых проводят эти анализы. В контексте некоторых вариантов данного изобретения абсолютная комплементарность не требуется. Полинуклеотиды, которые имеют достаточную комплементарность для образования дуплекса, имеющего температуру плавления, большую чем 20, 30 или 40°С при физиологических условиях, обычно являются предпочтительными.

"Нарушением" является любое состояние, которое получило бы пользу от обработки молекулой или композицией данного изобретения, в том числе состояния, описанные и заявленные здесь. Нарушение включает в себя хронические и острые нарушения или заболевания, в том числе патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому нарушению.

"Нацеливание" олигонуклеотида на выбранную нуклеиновую кислоту-мишень может быть многоступенчатым процессом. Этот процесс может начинаться идентификацией последовательности нуклеиновой кислоты, функция которой должна быть модулирована. Это может быть, например, клеточный ген (или мРНК, полученная из этого гена), экспрессия которого ассоциирована с конкретным состоянием заболевания, или чужеродная нуклеиновая кислота (РНК или ДНК) из инфекционного агента. Процесс нацеливания может включать в себя также определение сайта или сайтов в последовательности нуклеиновой кислоты для взаимодействия с олигонуклеотидом, происходящего таким образом, что будет происходить желаемый эффект, т.е. ингибирование экспрессии белка, уменьшенное детектирование белка или другая модуляция активности. После идентификации сайта-мишени или сайтов-мишеней выбирают антисмысловые соединения (например, олигонуклеотиды), которые являются достаточно или желательным образом комплементарными этой мишени, т.е. гибридизуются в достаточной степени и с адекватной или иным образом желаемой специфичностью, с обеспечением желаемой модуляции. В данном изобретении мишени включают в себя молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие один или несколько коннексинов. Процесс нацеливания может включать в себя также определение сайта или сайтов в последовательности нуклеиновой кислоты для антисмыслового взаимодействия, происходящего таким образом, что будет получен желаемый эффект. Предпочтительным внутригенным сайтом является, например, район, включающий в себя кодон инициации или терминации трансляции открытой рамки считывания (ОКБ) этого гена. Кодоном инициации трансляции является обычно 5'-ЛиС (в транскрибируемых мРНКмолекулах; 5'-ЛТС в соответствующей ДНК-молекуле), и он может называться "кодоном ЛИС", "стартовым кодоном" или "стартовым кодоном ЛИС". Небольшое число генов имеют кодон инициации трансляции, имеющий РНК-последовательность 5'-СИС, 5'-ииС или 5'-СИС, и было показано, что 5'-ЛИЛ, 5'АСС и 5'-СиС функционируют ίη νίνο. Таким образом, термины "кодон инициации трансляции" и "стартовый кодон" могут включать в себя многочисленные последовательности кодонов, даже хотя инициаторной аминокислотой в каждом случае является обычно метионин (в эукариотах) или формилметионин (в прокариотах). В данной области известно также, что эукариотические и прокариотические гены могут иметь два или более альтернативных стартовых кодонов, любой из которых может быть предпочтительно используемым для инициации трансляции в конкретном типе клеток, или в конкретной ткани, или при конкретном наборе условий.

Термин "олигонуклеотид" включает в себя олигомер или полимер нуклеотидных или нуклеозидных мономеров, состоящий из природно встречающихся оснований, сахаров и межсахарных (скелетных) связей. Термин "олигонуклеотид" включает в себя также олигомеры или полимеры, содержащие не встречающиеся в природе мономеры или их части, которые функционируют сходным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто являются более предпочтительными, чем природные формы вследствие таких свойств, как, например, увеличенное клеточное поглощение, увеличенная стабильность в присутствии нуклеаз или повышенная аффинность в отношении мишени. Было показано, что ряд нуклеотидных и нуклеозидных модификаций делает олигонуклеотид, в который они включены, более устойчивым к расщеплению нуклеазами, чем природный олигодезоксинуклеотид (ΟΌΝ). Устойчивость к нуклеазам измеряют рутинным образом инкубированием олигонуклеотидов с клеточными экстрактами или растворами выделенных нуклеаз и измерением степени оставшегося интактного олигонуклеотида во времени, обычно с использованием гель-электрофореза. Олигонуклеотиды, которые были модифицированы для увеличения их устойчивости к нуклеазам, могут выживать в интактном виде в течение более продолжительного времени, чем немодифицированные олигонуклеотиды. Было показано, что ряд модификаций увеличивает связывание (аффинность) олигонуклеотида в отношении его мишени. Аффинность олигонуклеотида в отношении его мишени определяют рутинным образом измерением Т_т (температуры плавления) пары олигонуклеотид/мишень, которая является температурой, при которой олигонуклеотид и мишень диссоциируются друг от друга.

Диссоциацию детектируют спектрофотометрически. Чем больше Т_т, тем большую аффинность имеет этот олигонуклеотид в отношении мишени. В некоторых случаях модификации олигонуклеотида, которые увеличивают аффинность связывания мишени, способны также увеличивать устойчивость к нуклеазам.

Термин "полинуклеотид" обозначает множество нуклеотидов. Таким образом, термины "нуклеотидная последовательность", или "нуклеиновая кислота", или "полинуклеотид", или "олигонуклеотид",

- 9 029094

или "олигодезоксинуклеотид" - все относятся к гетерополимеру нуклеотидов или последовательности этих нуклеотидов. Эти выражения относятся также к ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечнными и могут представлять смысловую или антисмысловую цепь, к пептиднуклеиновой кислоте (ПНК) или к любому ДНК-подобному или РНК-подобному материалу.

Полинуклеотид, который кодирует коннексин, фрагмент коннексина или вариант коннексина, включает в себя полинуклеотид, кодирующий зрелую форму коннексина, обнаруживаемую в природе; зрелую форму коннексина, обнаруживаемую в природе, и дополнительную кодирующую последовательность, например лидерную или сигнальную последовательность или последовательность пробелка; либо предыдущее и некодирующие последовательности (например, интроны или некодирующую последовательность 5'- и/или 3' (слева или справа) от кодирующей последовательности для зрелой формы полипептида, обнаруживаемого в природе); фрагменты зрелой формы коннексина, обнаруживаемой в природе; и варианты зрелой формы коннексина, обнаруживаемой в природе. Таким образом, "кодирующий коннексин полинуклеотид" и т.п. включает в себя полинуклеотиды, которые включают в себя только кодирующую последовательность для желаемого коннексина, фрагмента или варианта, а также полинуклеотид, который включает в себя дополнительные кодирующие и/или некодирующие последовательности.

Термины "пептидомиметик" и "миметик" относятся к синтетическому химическому соединению, которое может иметь, по существу, те же самые структурные и функциональные характеристики антисмысловых полипептидов, обеспеченных здесь, и которые имитируют коннексин-специфическую ингибиторную активность, по меньшей мере, частично и до некоторой степени. Аналоги пептидов обычно используют в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарственных средств со свойствами, аналогичными свойствам пептида-шаблона. Эти типы непептидного соединения называют "миметиками пептидов" или "пептидомиметиками" (Раиейеге, ί. Αάν. Эгид Рек. 15: 29 (1986); УеЬет аий РтеМтдет; ΤΙΝδ; 392 (1985) и Εναηκ е! а1., 1. Мей. СНет. 30: 1229 (1987); Вее1у Ν., Ттеийк Вю1есЬио1. 1994 1ии; 12(6): 213-6; К1еЬег-Еттоик Т., е! а1.,; Сигг. Ορίη Вю1есЬио1. 1997 Аид; 8(4): 435-41). Миметики пептидов, которые являются структурно сходными с терапевтически применимыми пептидами, могут быть использованы для получения эквивалентного или усиленного терапевтического или профилактического эффекта. Обычно пептидомиметики являются структурно сходными с полипептидом-шаблоном (т.е. полипептидом, который имеет биологическую или фармакологическую активность), таким как антисмысловой полинуклеотид, но имеют одну или более пептидных связей, необязательно замененных связью, выбранной из группы, состоящей, например, из -ΟΗ₂ΝΗ-, -СН₂§-, -СН₂СН₂-, -СН=СН- (цис и транс), -СОСН₂-, -СН(ОН)СН₂- и -СН₂§0-. Миметик может либо быть полностью составлен из синтетических, неприродных аналогов аминокислот, либо является химерной молекулой частично природных аминокислот пептидов и частично неприродных аналогов аминокислот. Миметик может также включать в себя любое количество консервативных замен природных аминокислот, пока такие замены также, по существу, не изменяют структуру и/или активность миметика. Например, композиция миметика находится в объеме данного изобретения, если она способна отрицательно регулировать биологические активности белков коннексинов, таких как, например, опосредованную щелевым контактом коммуникацию клеткаклетка.

Термин "композиция" включает в себя продукт, содержащий один или более ингредиентов.

Термины "модулятор" и "модуляция" активности коннексина, используемые в данном контексте в их различных формах, обозначает ингибирование полностью или частично экспрессии или активности коннексина. Такие модуляторы включают в себя малые молекулы, агонисты и антагонисты функции или экспрессии коннексина, антисмысловые молекулы, рибозимы, триплексные молекулы и полинуклеотиды интерференции РНК, способы генотерапии и другие.

Фраза "процент (%) идентичности" относится к проценту сходства последовательности, обнаруженному в сравнении двух или более последовательностей. Процентная идентичность может быть определена электронными способами с использованием любого подходящего программного обеспечения. Подобным образом "сходство" между двумя последовательностями (или одной или нескольких частей любой или обеих их них) определяют сравнением нуклеотидной последовательности одной последовательности с нуклеотидной последовательностью другой последовательности.

"Фармацевтически приемлемые" обозначает, например, носитель, разбавитель или эксципиент, который является совместимым с другими ингредиентами композиции и пригоден для введения его реципиенту.

Обычно термин "белок" относится к любому полимеру двух или более индивидуальных аминокислот (независимо от того, являются или не являются они природно встречающимися), связанных пептидными связями, которые образуются, когда атом углерода карбоксила группы карбоновой кислоты, связанный с альфа-углеродом одной аминокислоты (или аминокислотного остатка), становится ковалентно связанным с атомом азота амино аминогруппы, связанным с альфа-углеродом соседней аминокислоты. Эти пептидные связи и атомы, составляющие их (т.е. атомы альфа-углерода, атомы углерода карбоксила (и их заместители атомы кислорода), и атомы азота амино (и их заместители атомы водрода) образуют "полипептидный скелет" белка. Кроме того, в данном контексте термин "белок" включает в себя терми- 10 029094

ны "полипептид" и "пептид" (которые, иногда, могут быть использованы здесь взаимозаменяемо). Подобным образом фрагменты, аналоги, производные и варианты белков могут называться здесь "белками" и будут считаться "белками", если нет других указаний. Термин "фрагмент белка" относится к полипептиду, содержащему меньшее число аминокислотных остатков, чем число аминокислотных остатков данного белка. Как будет понятно, "фрагмент белка" может быть формой белка, укороченной на аминоконце, карбокси-конце и/или внутри (например, природным сплайсингом) и может быть также вариантом или производным. "Домен" белка является также фрагментом и содержит аминокислотные остатки белка, требующиеся для придания биохимической активности, соответствующей природно встречающемуся белку. Укороченные молекулы, которые являются линейными биологическими полимерами, такими как молекулы нуклеиновых кислот или полипептиды, могут иметь одну или более делеций из любого конца этой молекулы и/или одну или несколько делеций из неконцевого района этой молекулы, где такими делециями могут быть делеций из приблизительно 1-1500 смежных нуклеотидных или аминокислотных остатков, предпочтительно приблизительно 1-500 смежных нуклеотидных или аминокислотных остатков и более предпочтительно приблизительно 1-300 смежных нуклеотидных или аминокислотных остатков, в том числе делеций приблизительно 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31-40, 41-50, 51-74, 75-100, 101-150, 151-200, 201-250 или 251-299 смежных нуклеотидных или аминокислотных остатков.

Термин "строгие условия" относится к условиям, которые делают возможной гибридизацию между полинуклеотидами. Строгие условия могут определяться концентрацией соли, концентрацией органического растворителя (например, формамида), температурой и другими условиями, хорошо известными в данной области. Строгость может быть увеличена уменьшением концентрации соли, увеличением концентрации органических растворителей (например, формамида) или повышением температуры гибридизации. Например, строгая концентрация соли будет обычно менее чем приблизительно 750 мМ ЫаС1 и 75 мМ тринатриевой соли цитрата, предпочтительно менее чем приблизительно 500 мМ ЫаС1 и 50 мМ тринатриевой соли цитрата и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 250 мМ ЫаС1 и 25 мМ тринатриевой соли цитрата. Гибридизация низкой строгости может быть получена в отсутствие органического растворителя, например формамида, тогда как гибридизация высокой строгости может быть получена в присутствии органического растворителя (например, по меньшей мере приблизительно 35% формамида, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50% формамида). Строгие условия температуры будут обычно включать в себя температуру по меньшей мере приблизительно 30°С, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 37°С и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 42°С. Варьирование дополнительных параметров, например времени гибридизации, концентрации детергента, например додецилсульфата натрия (ДСН), и включение или исключение ДНК-носителя, хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области. Различные уровни строгости выполняются комбинированием этих различных условий, как это необходимо, и они находятся в пределах квалификации в данной области. Строгие условия гибридизации могут определяться также условиями в диапазоне приблизительно 5°С - приблизительно 20°С ниже температуры плавления (Т_т) последовательности-мишени и зондом с точной или почти точной комплементарностью с мишенью. В данном контексте температура плавления является температурой, при которой популяция двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты становится наполовину диссоциированной до отдельных цепей. Способы расчета Т_т нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области (см., например, Вегдег аий К1тте1, 1987, Ме1йой8 Ιη Ет7уто1оду, νοί. 152: Сшйе То Мо1еси1аг С1оти§ ТесНпищеь §аи О1едо: Асайет1с Рге88, 1ис. и ЗатЬгоок е! а1., (1989) Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬога1огу Маииа1, 2^ий Ей., νο1. 1-3, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу). Как указано стандартными ссылками, простая оценка величины Т_т может быть рассчитана с использованием уравнения Т_т=81,5+0,41 (% С+С), когда нуклеиновая кислота находится в водном растворе при 1М ЫаС1 (см., например, Аийегкои аий Уоиид, "ЦиаиШаЩе РШег НуЬпШ/айоп" ίη ЫисШс Ас1й НуЬпШ/аиои (1985)). На температуру плавления гибрида (и, следовательно, условия для строгой гибридизации) влияют различные факторы, такие как длина и природа (ДНК, РНК, состав оснований) зонда и природа мишени (ДНК, РНК, состав оснований, присутствует ли она в растворе или иммобилизована и т.п.), и концентрация солей и других компонентов (например, присутствие или отсутствие формамида, сульфата декстрана, полиэтиленгликоля). Влияния этих факторов хорошо известны и обсуждены в стандартных ссылках в данной области (см., например, 8атЬгоок, 8ирга, и Аи8иЬе1, 8ирга). Обычно строгими условиями гибридизации являются концентрация солей, менее чем приблизительно 1,0М ион натрия, обычно приблизительно 0,01-1,0М ион натрия при рН 7,0-8,3, и температура по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, больших чем 50 нуклеотидов). Как отмечалось, строгие условия могут быть также достигнуты добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид, и в этом случае могут использоваться более низкие температуры. В данном изобретении полинуклеотидом может быть полинуклеотид, который гибридизуется с мРНК коннексина при условиях средней-высокой строгости, такой как 0,03М хлорид натрия и 0,03М цитрат натрия при приблизительно 50°С - приблизительно 60°С.

Термин "терапевтически эффективное количество" обозначает количество рассматриваемого со- 11 029094

единения, которое будет индуцировать желаемую реакцию, например биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека, которая является желательной, например, для исследователя, ветеринара, медицинского доктора или другого клинициста.

Термин "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают в себя субъектов, которые уже имеют нарушение, а также субъектов, у которых необходимо предупредить это нарушение.

Термин "вектор" относится к носителю для амплификации, репликации и/или экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в форме плазмиды, фага, вирусной или другой системы (независимо от того, является она природно встречающейся или синтетической) для доставки нуклеиновых кислот в клетки, где эти плазмида, фаг или вирус могут быть функциональными с бактериальными, дрожжевыми клеткамихозяевами, клетками-хозяевами позвоночных и/или клетками-хозяевами млекопитающих. Этот вектор может оставаться независимым от геномной ДНК клетки-хозяина или может интегрироваться полностью или частично в геномную ДНК. Этот вектор будет обычно, но необязательно, содержать все необходимые элементы, так чтобы быть функциональным в любой клетке-хозяине, с которой он является совместимым. "Экспрессионный вектор" является вектором, способным направлять экспрессию экзогенного полинуклеотида, например полинуклеотида, кодирующего слитый белок домена связывания, при подходящих условиях.

Как описано здесь, термины "гомология и гомологи" включают в себя полинуклеотиды, которые могут быть гомологом последовательности полинуклеотида коннексина (например, мРНК). Такие полинуклеотиды обычно имеют по меньшей мере приблизительно 70% гомологию, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80, 90, 95, 97 или 99% гомологию с релевантной последовательностью, например, на протяжении района из по меньшей мере приблизительно 15, 20, 30, 40, 50, 100 или более смежных нуклеотидов (гомологичной последовательности).

Гомология может быть рассчитана на основе любого способа в данной области. Например, пакет и\УССС обеспечивает программу ВЕЗТНТ, которая может быть использована для расчета гомологии (например, используемую с ее установками по умолчанию) (Эсусгсих с1 а1. (1984) Νιιοίοία Άοίάδ Кекеагсй 12, р.387-395). Алгоритмы Р1ЬЕиР и ВЬАЗТ могут быть использованы для расчета гомологии или выравнивания последовательностей (обычно с установками по умолчанию), например, как описано в Αίί5сйи1 З.Р. (1993); 1 Μοί Ενοί 36: 290-300; АЙ5сЬи1 З.Р. е1 а1.; (1990); 1 Μοί Βίοί 215: 403-10. Программное обеспечение для выполнения анализов ВЬАЗТ является публично доступным через Национальный Центр Информации по Биотехнологии (1ιΠρ://\γ\γ\γ.ικόί.η1ιη.ηί1ι.§ον./Ρ). Этот алгоритм включает в себя сначала идентификацию пары последовательностей с высокой оценкой посредством идентификации коротких слов длины Υ в запрашиваемой последовательности, которые либо соответствуют, либо удовлетворяют некоторой положительной пороговой оценке Т при выравнивании со словом той же длины в базе данных. Т обозначает порог оценки слова окружения (АЙ8сЬи1 е1 а1., 8ирга). Эти исходные соседние слова-совпадения действуют в качестве начальных средств для инициации поисков для нахождения Н8Р, содержащих их. Эти слова-совпадения продлеваются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличена кумулятивная оценка выравнивания. Удлинения для слов-совпадений в каждом направлении останавливают, когда:кумулятивная оценка выравнивания уменьшается на количество X от ее максимально достигаемой величины; кумулятивная оценка опускается до нуля или ниже вследствие накопления одного или нескольких выравниваний остатков, имеющих отрицательную оценку; или достигается конец любой последовательности. Параметры Υ, Т и X алгоритма ВЬАЗТ определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа ВЬАЗТ использует по умолчанию длину слова (Υ) 11, матрицу оценок ВЬОЗиМ62 (см. НетЫ апб Нет^Т (1992) Ртос. Ν;·ιΐ1. Асаб. Зск иЗА 89: 10915-10919), число выравниваний 50, ожидание (Е) 10, М=5, N=4 и сравнение обеих цепей.

Алгоритм ВЬАЗТ выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Каг1ш анб АЙ8сЬи1 (1993) Ртос. Ν;·ιΐ1. Асаб. Зск иЗА 90: 5873-5787). Одной мерой сходства, обеспечиваемой алгоритмом ВЬАЗТ, является наименьшая вероятность суммы (Ρ(Ν)), которая обеспечивает указание вероятности, посредством которой соответствие между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями могло бы встречаться случайным образом. Например, последовательность считается сходной с другой последовательностью, если наименьшая вероятность суммы в сравнении с первой последовательностью меньше чем приблизительно 1, предпочтительно меньше чем приблизительно 0,1, более предпочтительно меньше чем приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше чем приблизительно 0,001.

Гомологичная последовательность обычно отличается от релевантной последовательности по меньшей мере (или не более чем) приблизительно 1, 2, 5, 10, 15, 20 или более мутациями (которые могут быть заменами, делециями или инсерциями). Эти мутации могут быть измерены в любом из районов, упомянутых выше в отношении расчета гомологии. Гомологичная последовательность обычно гибридизуется селективно с исходной последовательностью при уровне, значимо более высоком, чем фон. Селективная гибридизация обычно достигается с использованием условий средней-высокой строгости (например, 0,03М хлорид натрия и 0,03М цитрат натрия при приблизительно 50°С - приблизительно 60°С).

- 12 029094

Однако такая гибридизация может проводиться при любых подходящих условиях, известных в данной области (см. §атЬтоок с1 а1. (1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота1огу Мапиа1). Например, если требуется высокая строгость, подходящие условия включают в себя 0,1х§§С при 60°С. Если требуется более низкая строгость, подходящие условия включают в себя 2х§§С при 60°С.

"Клетка" обозначает любую живую клетку, подходящую для желаемого применения. Клетки включают в себя эукариотические и прокариотические клетки.

Термин "продукт гена" относится к молекуле РНК, транскрибированной с гена, или полипептиду, кодируемому этим геном или транслируемому с этой РНК.

Термин "рекомбинантный" относится к полинуклеотиду, синтезированному или иным образом подвергнутому манипуляции ίη νίΙΐΌ (например, "рекомбинантный полинуклеотид"), к способам применения рекомбинантных полинуклеотидов для получения продуктов генов в клетках или других биологических системах, или к полипептиду ("рекомбинантный белок"), кодируемому рекомбинантным полинуклеотидом. Таким образом, "рекомбинантный" полинуклеотид определяется либо способом его получения, либо его структурой. При ссылке на его способ получения этот способ относится к использованию рекомбинантных способов нуклеиновых кислот, в том числе, например, вмешательству человека в данную нуклеотидную последовательность, обычно отбору или продуцированию. Альтернативно, это может быть полинуклеотид, полученный генерированием последовательности, содержащей слияние двух или более фрагментов, которые в природе не являются смежными одна с другой. Так, например, включены продукты, производимые трансформацией клеток любым природно не встречающимся вектором, а также полинуклеотиды, содержащие последовательность, полученную с использованием любого способа синтеза олигонуклеотидов. Подобным образом "рекомбинантный" полипептид является полипептидом, экспрессируемым из рекомбинантного полинуклеотида.

"Рекомбинантной клеткой-хозяином" является клетка, которая содержит вектор, например клонирующий вектор или экспрессирующий вектор, или клетка, которая была другим образом подвергнута манипуляции рекомбинантными способами для экспрессии представляющего интерес белка.

Данное изобретение включает в себя способы применения соединений и композиций для сайтспецифического модулирования связанной со щелевым контактом клеток экспрессии белка для заживления ран, например связанного с хирургией заживления ран и/или для применений в ремоделировании тканей. Данное изобретение применимо, например, для коррекции дефектов зрения вместе с лазерной хирургией, для конструирования роговицы ίη νίΙΐΌ и для прямых обработок глаз, когда желательным является ремоделирование роговицы, в том числе прямых обработок, выполняемых независимо или, альтернативно, в сочетании с процедурой (например, хирургией), выполняемой на глазу. Антисмысловая модуляция прямой коммуникации клетка-клетка предпочтительно опосредована молекулами, которые прямо или опосредованно уменьшают связывание между клетками в тканях. Такие молекулы включают в себя полинуклеотиды, такие как антисмысловые дезоксинуклеотиды, морфолинонуклеотиды, интерферирующие РНК и дезоксирибозимы, нацеленные на специфические изоформы коннексинов, которые приводят к уменьшенной трансляции этой изоформы белка и препятствуют функции клеточных щелевых контактов. Введение этих антисмысловых соединений приводит к уменьшению опосредованной щелевым контактом межклеточной коммуникации в сайте, в котором отрицательно регулируется экспрессия коннексина.

Коннексины играют важные роли в опосредованной щелевым контактом клеток передаче сигналов от клетки к клетке. Сверхэкспрессия коннексина связана с послехирургическим образованием рубцов и индуцируемым после травмы ремоделированием ткани. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения коннексины представляют собой ценные мишени для лечения вредных эффектов, связанных с травмой роговицы и послехирургического ремоделирования ткани; и для заболеваний и нарушений, в которых желательно локализованное разрушение прямой коммуникации клеткаклетка. В частности, модуляция экспрессии коннексинов может быть полезной для сайт-специфической модуляции, связанной со щелевым контактом клеток экспрессии белка, для применений в ремоделировании/конструировании тканей. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть использованы для модуляции коннексинов в связи с офтальмологическими процедурами или хирургиями, такими как, например, хирургия по поводу катаракты, внутриглазная хирургия хрусталика, хирургия трансплантации роговицы и некоторые типы хирургии глаукомы , и другие описанные здесь процедуры.

В некоторых вариантах осуществления модуляция коннексинов может быть использована в офтальмологических нарушениях, поражающих задний сегмент, включающий в себя сетчатку и хрусталик. В другом аспекте данного изобретения модуляция коннексинов может быть использована в офтальмологических нарушениях, влияющих на передний сегмент, который включает в себя роговицу, конъюнктиву и склеру. В контексте данного изобретения нарушения заднего сегмента включают в себя разрывы и дегенерацию желтого пятна, разрывы сетчатки, диабетическую ретинопатию, витреоретинопатию и разнообразные нарушения. В контексте этого изобретения нарушения хрусталика могут включать в себя катаракты. Еще в одном аспекте обсуждается, что нарушения роговицы и рефракционные нарушения, такие как осложнения радиальной кератотомии, сухие глаза, вирусный конъюнктивит, язвенный конъюнктивит

- 13 029094

и образование рубцов в заживлении ран, таких как, например, раны эпителия роговицы, и осложнения синдрома Шегрена.

Данное изобретение описывает антисмысловые соединения, в частности олигонуклеотиды, для применения в модуляции функции молекул нуклеиновых кислот, кодирующих коннексины, в конечном счете, модуляции количества продуцируемых коннексинов. Это выполняют обеспечением олигонуклеотидов, которые специфически гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, предпочтительно мРНК, кодирующими коннексины.

Эту взаимосвязь между антисмысловым соединением, таким как олигонуклеотид, и его комплементарной нуклеиновой кислотой-мишенью, с которой он гибридизуется, обычно называют "антисмысловой". Как описано здесь, "нацеливание" олигонуклеотида на выбранную нуклеиновую кислоту-мишень является обычно многоступенчатым процессом. Этот процесс обычно начинается идентификацией последовательности нуклеиновой кислоты, функция которой должна быть модулирована. Это может быть, например, клеточный ген (или мРНК, полученная из этого гена), экспрессия которого ассоциирована с конкретным состоянием заболевания. В данном изобретении мишенями являются нуклеиновые кислоты, кодирующие коннексин, или мРНК, экспрессируемые из этого гена коннексина. мРНК, которая кодирует коннексин, является в настоящее время предпочтительной мишенью. Процесс нацеливания включает в себя также определение сайта или сайтов в последовательности нуклеиновой кислоты для антисмыслового взаимодействия, происходящего таким образом, что будет происходить модуляция экспрессии гена.

В контексте данного изобретения информационная РНК включает в себя не только информацию для кодирования белка с использованием трехбуквенного генетического кода, но также ассоциированные рибонуклеотиды, которые образуют район, известный специалистам как 5'-нетранслируемый район, 3'нетранслируемый район и 5'-кэп-район и рибонуклеотиды интрон/экзонных стыков. Таким образом, в соответствии с данным изобретением могут быть образованы олигонуклеотиды, которые нацелены полностью или частично на эти ассоциированные рибонуклеотиды. Таким образом, этот олигонуклеотид может быть специфически гибридизуемым с районом сайта инициации транскрипции, районом кодона инициации трансляции, 5'-кэп-районом, интрон/экзонным сочленением, кодирующими последовательностями, районом кодона терминации трансляции или последовательностями в 5'- или З'-нетранслируемом районе. Поскольку кодоном инициации трансляции является обычно 5'-АИО (в транскрибируемых мРНК-молекулах; 5'-АТО в соответствующей ДНК-молекуле), кодон инициации трансляции называют также "кодоном АИО", "стартовым кодоном" или "стартовым кодоном АИО". Небольшое число генов имеют кодон инициации трансляции, имеющий РНК-последовательность 5'-ОИО, 5'-ииО или 5'-СИО, и было показано, что 5'-АИА, 5'-АСО и 5'-СИО функционируют ίη νίνο. Таким образом, термины "кодон инициации трансляции" и "стартовый кодон" могут включать в себя многочисленные последовательности кодонов, даже хотя инициаторной аминокислотой в каждом случае является обычно метионин (в эукариотах) или формилметионин (в прокариотах). В данной области известно также, что эукариотические и прокариотические гены могут иметь два или более альтернативных стартовых кодонов, любой из которых может быть предпочтительно используемым для инициации трансляции в конкретном типе клеток, или в конкретной ткани, или при конкретном наборе условий. В контексте данного изобретения "стартовый кодон" и "кодон инициации трансляции" обозначают кодон или кодоны, которые используются ίη νίνο для инициации трансляции молекулы мРНК, транскрибированной из гена, кодирующего коннексин, независимо от последовательности (последовательностей) таких кодонов. В данной области известно также, что кодон терминации трансляции (или "стоп-кодон") гена может быть одной из трех последовательностей, т.е. 5'-ИАА, 5'-ИАО и 5'-ИОА (соответствующими ДНК-последовательностями являются 5'ТАА, 5'-ТАО и 5'-ТОА соответственно). Термины "область стартового кодона", "область АИО" и "область кодона инициации трансляции" относятся к части такой мРНК или к части такого гена, которая включает в себя приблизительно 25-приблизительно 50 смежных нуклеотидов в любом направлении (т.е. 5' или 3' (слева или справа)) от кодона инициации трансляции. Эта область является предпочтительной областью-мишенью. Подобным образом термины "область стоп-кодона" и "область кодона терминации трансляции" относятся к части такой мРНК или к части такого гена, которая включает в себя приблизительно 25 -приблизительно 50 смежных нуклеотидов в любом направлении (т.е. 5' или 3' (слева или справа)) от кодона инициации трансляции. Эта область является предпочтительной областью-мишенью. Открытая рамка считывания (ОКБ) или "кодирующая область", которая, как известно в данной области, обозначает область между кодоном инициации трансляции и кодоном терминации трансляции, является также областью, на которую может эффективно производиться нацеливание. Другие предпочтительные области-мишени включают в себя 5'-нетранслируемый район (5'ИТК), известный в данной области как часть мРНК в 5'-направлении (слева) от кодона инициации трансляции и, следовательно, включающий в себя нуклеотиды между 5'-кэп-сайтом и кодоном инициации трансляции мРНК или соответствующими нуклеотидами на этом гене, и З'-нетранслируемый район (З'ИТК), известный в данной области как часть мРНК в 3'-направлении (справа) от кодона терминации трансляции, и, следовательно, включающий в себя нуклеотиды между кодоном терминации трансляции и З'-концом мРНК или соответствующими нуклеотидами на этом гене. 5'-кэп мРНК содержит остаток Ы7-метилированного гуанозина, присоединенный к 5'-крайнему остатку мРНК через 5'-5'-трифосфатную связь. Считается, что 5'-кэп-район мРНК

- 14 029094

включает в себя саму 5'-кэп-структуру, а также первые 50 нуклеотидов, смежные с этим кэпом. 5'-кэпобласть также может быть предпочтительной областью-мишенью.

Хотя некоторые эукариотические мРНК-транскрипты транслируются непосредственно, многие содержат одну или несколько областей, известных как "интроны", которые вырезаются из пре-мРНКтранскрипта с образованием одной или нескольких зрелых мРНК. Остальные (и, следовательно, транслируемые) области известны как "экзоны" и сплайсируются вместе с образованием непрерывной мРНКпоследовательности. Сайты сплайсинга мРНК, т.е. экзон-экзонные или интрон-экзонные стыки, могут быть также предпочтительными областями-мишенями и применимы, в частности, в ситуациях, в которых в заболевании предполагают участие аномального сплайсинга или в которых в заболевании предполагают участие сверхпродуцирования конкретного продукта сплайсинга мРНК. Аберрантные слитые стыки вследствие перегруппировок или делеций также являются предпочтительными мишенями. Нацеливание на конкретные экзоны в альтернативно сплайсированных мРНК может быть также предпочтительным. Было также обнаружено, что интроны могут быть также эффективными и, следовательно, предпочтительными областями-мишенями для антисмысловых соединений, нацеленных, например, на ДНК или пре-мРНК.

В контексте данного изобретения антисмысловой полинуклеотид может, например, гибридизоваться со всей или с частью мРНК коннексина. Обычно антисмысловой полинуклеотид гибридизуется с участком связывания рибосом или с кодирующим районом мРНК коннексина. Например, этот полинуклеотид может быть точным комплементом всей или части мРНК коннексина. Антисмысловой полинуклеотид может ингибировать транскрипцию и/или трансляцию коннексина. Предпочтительно этот полинуклеотид является специфическим ингибитором транскрипции и/или трансляции гена коннексина и не ингибирует транскрипцию и/или трансляцию других генов. Этот продукт может связываться с геном коннексина или мРНК или (ί) 5' (слева) относительно кодирующей последовательности, и/или (и) с кодирующей последовательностью, и/или (ίίί) 3' (справа) относительно кодирующей последовательности. Обычно антисмысловой полинуклеотид будет вызывать уменьшение экспрессии мРНК и/или белка коннексина в клетке. Антисмысловой полинуклеотид является обычно антисмысловым в отношении мРНК коннексина. Такой полинуклеотид может быть способен гибридизоваться с мРНК коннексина и может ингибировать экспрессию коннексина, подавляя один или несколько аспектов метаболизма мРНК коннексина, в том числе транскрипцию, процессинг мРНК, транспорт мРНК из ядра, трансляцию или деградацию мРНК. Антисмысловой полинуклеотид обычно гибридизуется с мРНК коннексина с образованием дуплекса, который может вызывать прямое ингибирование трансляции и/или дестабилизацию этой мРНК. Такой дуплекс может быть чувствительным к деградации нуклеазами.

Г ибридизация антисмысловых олигонуклеотидов с мРНК интерферирует с одной или несколькими из нормальных функций мРНК. Функции мРНК, которые должны подавляться, включают в себя все жизненно важные функции, такие как, например, транслокация этой РНК к сайту трансляции белка, трансляция белка из этой РНК, сплайсинг этой РНК с получением одной или нескольких разновидностей мРНК и каталитическая активность, которая может быть привлечена этой РНК. Связывание специфического белка (специфических белков) с этой РНК может быть также подавлено гибридизацией антисмыслового олигонуклеотида с этой РНК.

Общим эффектом интерференции с функцией мРНК является модуляция экспрессии коннексина. В контексте этого изобретения "модуляция" включает в себя либо ингибирование, либо стимуляцию, т.е. либо уменьшение, либо увеличение экспрессии. Эта модуляция может быть измерена способами, которые являются рутинными в данной области, например, нозерн-блот-анализом экспрессии мРНК или ПЦР с обратной транскриптазой, как описано в примерах данной заявки, или вестерн-блоттингом или анализом ЕЫБЛ экспрессии белка или анализом иммунопреципитации экспрессии белка. Могут быть также измерены действия на пролиферацию клеток или рост опухолевых клеток, как описано в примерах данной заявки. Ингибирование является в настоящее время предпочтительным.

После идентификации сайта-мишени или сайтов-мишеней выбирают олигонуклеотиды, которые являются достаточно комплементарными мишени, т.е. гибридизуются достаточно хорошо и с достаточной специфичностью с генерированием желаемой модуляции. Антисмысловые нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК, модифицированные нуклеиновые кислоты, аналоги и т.п.) могут быть получены с использованием любого подходящего способа получения нуклеиновой кислоты. Олигодезоксинуклеотиды, направленные на другие белки коннексина, могут быть отобраны в отношении их нуклеотидной последовательности с использованием любого общепринятого подхода, такого как, например, компьютерные программы МасУесЮг и ОйдоТесЬ (из Οΐίβοδ с1с. Еидепе, Огедоп, ИБЛ). В отношении общих способов, относящихся к антисмысловым полинуклеотидам, см. Лпйвепве ΚΝΆ апб ΌΝΆ, Ό.Ά. МеЙоп, Еб., Со1б Бргшд НагЪог ЬаЬога1о1у. Со1б Брппд НагЪог, ΝΥ (1988)). См. также Бад1е е1 а1., №с1ею Либв КевеагсЪ, 19: 1805 (1991). В отношении антисмысловой терапии, см., например, ИЫтапп е1 а1., СЬет. Реу1е^5, 90: 543-584 (1990). Обычно по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности известна для коннексинов, в случае которых желательным является ингибирование экспрессии. Предпочтительно антисмысловое соединение нацелено на один или более конкретных изотипов коннексинов. Конкретные изотипы коннексинов, на которые могут быть нацелены антисмысловые соединения, включают в себя, без огра- 15 029094

ничения, коннексины 43, 37, 31.1, 26 и другие, описанные здесь. Предпочтительно, но необязательно, коннексины-мишени являются коннексинами человека. Коннексин может, например, иметь последовательность нуклеотидов, выбранную из ЗЕС) ГО N0:12-31. В некоторых вариантах осуществления антисмысловые соединения нацелены по меньшей мере на 8 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидов, выбранную из ЗЕС) ГО N0:12-31.

В некоторых других вариантах осуществления второе антисмысловое соединение вводят в глаз субъекта, причем это второе антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на приблизительно 8 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидов, выбранную из ЗЕР ГО N0:12-31, причем указанное второе антисмысловое соединение нацелено на другой коннексин, чем коннексин, являющийся мишенью первого антисмыслового соединения.

Коннексины-мишени будут варьировать в зависимости от типа ткани, которая должна быть сконструирована или ремоделирована, и точная последовательность антисмыслового полинуклеотида, используемого в данном изобретении, будет зависеть от белка коннексина-мишени. Белок коннексин или белки коннексины, на которые нацелены эти олигонуклеотиды, будут зависеть от сайта, в котором должна быть осуществлена отрицательная регуляция. Это отражает неоднородное устройство щелевого контакта (щелевых контактов) между клетками в различных сайтах по всему телу в отношении субъединичного состава коннексинов. Однако некоторые белки коннексины являются более повсеместными, чем другие, в отношении распределения в ткани. Как описано здесь, связанные с роговицей коннексины, такие как коннексин 43, являются предпочтительными в некоторых вариантах осуществления. Таким образом, в контексте данного изобретения олигонуклеотиды либо отдельно, либо в комбинации были нацелены на коннексины 43, 26, 37, 30 и/или 31.1 (например, см. ЗЕС) ГО N0:1-11), которые являются подходящими для применения в конструировании или ремоделировании роговицы. В одном аспекте данного изобретения олигодезоксинуклеотидами могут быть немодифицированные фосфодиэфирные олигомеры. В другом аспекте данного изобретения эти полинуклеотиды могут быть одноцепочечными или двухцепочечными.

Предполагается также, что олигонуклеотиды, нацеленные на отдельные белки коннексины, могут быть использованы в комбинации (например, они могут быть нацелены на один, два, три, четыре или более разных коннексинов). Например, С)1Ж нацеленный на коннексин 43 и один или несколько других членов семейства коннексинов (такие как коннексин 26, 30, 31.1 и 43), могут быть использованы в комбинации. Предполагается также, что индивидуальные антисмысловые полинуклеотиды могут быть специфическими в отношении конкретного коннексина или могут быть нацелены на 1,2, 3 или более различных коннексинов. Специфические полинуклеотиды будут обычно нацелены на последовательности в гене или мРНК коннексина, которые не являются консервативными среди коннексинов, тогда как неспецифические полинуклеотиды будут нацелены на консервативные последовательности. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антисмысловые соединения нацелены по меньшей мере на 8 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин 26, коннексин 30, коннексин 31.1, коннексин 37, коннексин 43 человека, причем указанное антисмысловое соединение ингибирует экспрессию белка коннексина человека в клетках, ассоциированных с глазом указанного пациента.

В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие коннексин, имеют последовательность нуклеотидов, выбранную из ЗЕС) ГО N0:12-31. В некоторых вариантах осуществления эти композиции нацелены на два или более белков коннексина человека и ингибируют экспрессию двух или более белков коннексинов человека. В некоторых дополнительных вариантах осуществления антисмысловые соединения являются антисмысловыми олигонуклеотидами. Примеры антисмыслового олигонуклеотида в отношении выбранного коннексина 43 включают в себя

СТА АТТ ОСО ОСА АОА АСА АТТ ОТТ ТОТ ОТО (ЗЕф ГО N0:1); ОТА АТТ ОСО ОСА ОСА ООА АТТ ОТТ ТОТ ОТО (5Е(2 ГО N0:2); и ООО АЛО АОА САС САА АОА САС ТАС ОАО САТ (ЗЕО ГО N0:3).

Пример антисмыслового олигонуклеотида в отношении коннексина 26 имеет последовательность ТСС ТОА ОСА АТА ССТ ААС ОАА САА АТА (8Е<2 ГО N0:4).

Примеры антисмыслового олигонуклеотида в отношении выбранного коннексина 37 включают в

себя

5’ САТ СТС СТТ ООТ ОСТ САА СС 3’ (ЗЕС)

ГО N0:5) и 5’ СТО ААО ТОО АСТ ТОО СТТ 00 3’ (ЗЕ() ГО N0:6).

Примеры антисмыслового олигонуклеотида в отношении выбранного коннексина 30 включают в

себя

5’ СТС АОА ТАО ТОО ССА ОАА ТОО 3’ (8Е<3 ГО N0:7) и 5’ ТТО ТСС АОО ТОА

СТС САА ОО 3’ (8Е<2 ГО N0:8).

Примеры антисмыслового олигонуклеотида в отношении выбранного коннексина 31.1 включают в

себя

- 16 029094

5’ СОТ ССО АОС ССА ОАА АСА ТОА

СОТ С 3’ (8Е<2> ГО N0:9); 5’ ЛОА ООС ОСА СОТ ОАО АСА С 3’ (8Е<3 ГО N0:10) и 5’

ТОА АОА САА ТОА АОА ТОТ Т 3’ (5Е(} ГО N0:11).

В дополнительном варианте осуществления олигодезоксинуклеотиды, выбранные из следующих последовательностей, являются особенно подходящими для отрицательной регуляции экспрессии коннексина 43

5 ’ ОТА АТТ ОСО ОСА АОА АОА АТТ ОТТ ТСТ ОТС 3 ’ (5Е<2 ГО N0:1)

5’ ОТА АТТ ОСО ОСА ООА ООА АТТ ОТТ ТСТ ОТС 3’ (8Е<3 ГО N0:2)

5’ ООС ААО АОА САС САА АОА САС ТАС САО САТ 3’ (8Е<2 ГО N0:3)

Еще в одном варианте осуществления олигодезоксинуклеотиды, выбранные из группы следующих последовательностей, являются особенно подходящими для отрицательной регуляции экспрессии коннексинов 26, 37, 30 и 31.1

5’ ТСС ТОА ОСА АТА ССТ ААС ОАА САА АТА 3’ (коннексин 26) (5Е<2 ГО N0:4)

5’ САТ СТС СТТ ООТ ОСТ САА СС 3’ (коннексин 37) (8Е(} ГО N0:5)

5’ СТО ААО ТОО АСТ ТОО СТТ 00 3’ (коннексин 37) (ЗЕ<3 ГО N0:6)

5’ СТС АОА ТАО ТОО ССА ОАА ТОС 3’ (коннексин 30) (ЗЕ(3 ГО N0:7)

5’ ТТО ТСС АОО ТОА СТС САА 00 3’ (коннексин 30) (ЗЕ(} ГО N0:8)

5’ СОТ ССО АОС ССА ОАА АОА ТОА ООТ С 3’ (коннексин 31.1) (3Εζ) ГО N0:9)

5’ АОА ООС ОСА СОТ ОАО АСА С 3’ (коннексин 31.1) (ЗЕ(5 ГО N0:10)

5’ ТОА АОА САА ТОА АОА ТОТ Т 3’ (коннексин 31.1) (ЗЕ(2 ГО N0: 11)

Антисмысловые соединения, обеспеченные здесь, обычно содержат приблизительно 8приблизительно 40 нуклеотидных оснований (т.е. приблизительно 8-приблизительно 40 связанных нуклеозидов) и более обычно приблизительно 12 -приблизительно 40 нуклеотидных оснований и даже более обычно приблизительно 30 нуклеотидных оснований. Антисмысловые соединения, содержащие полинуклеотиды, могут иметь длину по меньшей мере приблизительно 40, например, по меньшей мере приблизительно 60 или по меньшей мере приблизительно 80 нуклеотидов и до 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 или 3000 или более нуклеотидов. Подходящие антисмысловые соединения включают в себя, например, 30-мерный 0ΏΝ.

В некоторых вариантах осуществления антисмысловые соединения нацелены по меньшей мере на приблизительно 8 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из 8Ер ГО N0:12-31. В других вариантах осуществления антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на приблизительно 10, по меньшей мере на приблизительно 12, по меньшей мере на приблизительно 14, по меньшей мере на приблизительно 16, по меньшей мере на приблизительно 18, по меньшей мере на приблизительно 20, по меньшей мере на приблизительно 25, по меньшей мере на приблизительно 30 и по меньшей мере на приблизительно 35 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из 8Ер ГО N0:12-31. Размер длины антисмысловых соединений, в том числе олигонуклеотидов, нацеленных по меньшей мере на 8-35 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин человека, может быть равен 8 нуклеотидным основаниям или более, 8-100 нуклеотидным основаниям, 8-50 нуклеотидным основаниям, 8-40 нуклеотидным основаниям, 10-50 нуклеотидным основаниям, 12-50 нуклеотидным основаниям, 14-50 нуклеотидным основаниям, 16-50 нуклеотидным основаниям, 18-50 нуклеотидным основаниям, 20-50 нуклеотидным основаниям, 25-50 нуклеотидным основаниям, 15-35 нуклеотидным основаниям и т.п. Другие антисмысловые соединения данного изобретения могут быть меньшими или большими по размеру, например имеющими длину, большую чем 100 нуклеотидных оснований.

Антисмысловые соединения включают в себя антисмысловые олигонуклеотиды (0ΏΝ), антисмысловые полинуклеотиды, дезоксирибозимы, морфолинолигонуклеотиды, молекулы интерференции РНК или их аналоги, короткие интерферирующие молекулы РНК (δίΚΝΆ) или их аналоги, молекулы РНК или их аналоги, ДНКзимы или их аналоги, мутированные по 5'-концу малые ядерные РНК И1-типа и их аналоги.

Как описано здесь, антисмысловое соединение может включать в себя использование олигодезоксинуклеотидов (0ΏΝ). 0Ι)Ν имеют обычно длину приблизительно 20 нуклеотидов и действуют посредством гибридизации с пре-мРНК и мРНК с образованием субстрата для рибонуклеазы Н (РНКазы Н), которая специфически деградирует РНК-цепь образованных РНК-ДНК-дуплексов. При модификации таким образом, чтобы предотвращать действие РНКазы Н, 0Ι)Ν могут ингибировать трансляцию мРНК посредством стерического несоответствия или ингибировать сплайсинг пре-мРНК. 0Ι)Ν и их модификации использовали для нацеливания на двухцепочечную ДНК (άδΏΝΆ) для ингибирования транскрипции посредством образования тройных спиралей. 0Ι)Ν могут быть получены известными в данной области способами автоматизированного синтеза, и получение 0Ι)Ν любой последовательности и блокирование экспрессии генов посредством антисмыслового спаривания оснований является относительно простым.

- 17 029094

В некоторых аспектах фосфодиэфирный скелет ΟΌΝ может быть модифицирован для увеличения эффективности в качестве мишень-специфических агентов для блокирования экспрессии генов. Эти модификации скелета были разработаны для улучшения стабильности ΟΌΝ и для усиления их поглощения клетками. Наиболее широко используемой модификацией является модификация, в которой не образующий мостиковую связь кислород заменен атомом серы с образованием фосфоротиоатных ΟΌΝ. По меньшей мере один фосфоротиоатный ΟΌΝ был одобрен РИА, и несколько других фосфоротиоатных антисмысловых ΟΌΝ находятся на ранних стадиях клинических испытаний в отношении различных раков и воспалительных заболеваний.

Механизмы действия ΟΌΝ в отношении блокирующей гены функции варьируют в зависимости от скелета ΟΌΝ (Вгаисй Α.Ό. Нера!о1оду 24, 1517-1529 (1996); Э1а5 Ν. апб 8!еш С.А. Мо1. Сапсег ТЬог. 1, 347-355 (2002); 81еш С.А. апб СоНеп 18., Сапсег Кек. 48, 2659-2668 (1988); 2оп С. Апп. Ν.Υ. Асаб 8с1., 616, 161-172 (1990). Отрицательно заряженные, в целом, ΟΌΝ, такие как фосфодиэфиры и фосфоротиоаты, индуцируют опосредованное РНКазой Н расщепление мРНК-мишени. Другие модификации скелета, которые не рекрутируют РНКазу Н, вследствие отсутствия у них заряда или типа спирали, образуемой с РНК-мишенью, могут быть классифицированы как ΟΌΝ стерического несоответствия. Предпочтительно используемые члены этой последней группы включают в себя содержащие морфолино, υ-Ο-метильные группы, 2"-О-аллильные группы, замкнутые нуклеиновые кислоты и пептиднуклеиновые кислоты (ПНК). Эти ΟΌΝ могут блокировать сплайсинг, трансляцию, транспорт ядро-цитоплазма и трансляцию среди других мишеней ингибирования.

В другом аспекте модуляция экспрессии коннексинов включает в себя использование рибозимов. Рибозимы являются РНК-молекулами, которые действует в качестве ферментов даже при полном отсутствии белков. Они имеют каталитическую активность разрывания и/или образования ковалентных связей с необычайной специфичностью, ускоряя посредством этого спонтанные скорости нацеленных реакций на много порядков величин.

Рибозимы связываются с РНК спариванием оснований по Уотсону-Крику и действуют, деградируя РНК-мишень посредством катализа гидролиза фосфодиэфирного скелета. Имеются несколько различных классов рибозимов, причем наиболее широко исследованным является "молотоголовый" рибозим. Как подразумевает его название, молотоголовый рибозим образует уникальную вторичную структуру при гибридизации с его мРНК-мишенью. Каталитически важные остатки внутри этого рибозима фланкированы мишень-комплементарными последовательностями, которые фланкируют сайт расщепления РНКмишени. Расщепление рибозимом требует двухвалентных ионов, таких как магний, и зависит также от структуры и доступности РНК-мишени. Ко-локализация рибозима с РНК-мишенью в клетке посредством использования сигналов локализации в значительной степени увеличивает их эффективность сайленсинга. Молотоголовые рибозимы являются достаточно короткими для возможности их химического синтеза или могут быть транскрибированы из векторов, позволяющих непрерывное продуцирование рибозимов в клетках.

Способность РНК служить в качестве катализатора была впервые продемонстрирована для интрона группы I с автономным сплайсингом ТеКайутепа (НегторНПа и РНК-части РНКазы. После обнаружения этих двух РНК-ферментов был обнаружен РНК-опосредованный катализ, ассоциированный с нитронами автономного сплайсинга группы II митохондрий дрожжей, грибов и растений (а также хлоропластов), одноцепочечными РНК вироидов и вирусоидов растений, вирусом гепатита дельта и сателлитной РНК из митохондрий №игокрога сгакка. Рибозимы встречаются в природе, но могут быть искусственно сконструированы для экспрессии и нацеливания на специфические последовательности в цис (на той же самой цепи нуклеиновой кислоты) или транс (нековалентно связанной нуклеиновой кислоте). Новые биохимические активности разрабатываются с использованием протоколов отбора ш уйго, а также генерирования новых мотивов рибозимов, которые действуют на субстраты, другие, чем РНК.

Интрон группы I Т. (НегторНПа был первым цис-расщепляющим рибозимом, который должен был быть превращен в транс-реагирующую форму, которую авторы данного изобретения называют интрон/рибозимом, делающую его применимым как в исследованиях генома, так и в качестве возможного терапевтического средства. В этой реакции транс-сплайсинга дефектный экзон мРНК-мишени может быть заменен правильным экзоном, который ковалентно присоединяется к интрон-рибозиму. Это осуществляется через реакцию сплайсинга, в которой экзон, присоединенный к интрону, помещают спариванием оснований в мРНК-мишень таким образом, что он может быть ковалентно присоединен к 5'-концу транскрипта-мишени в реакции переэтерификации. Эту реакцию использовали для транс-сплайсинга последовательностей дикого типа в транскриптах глобина серповидных клеток и мутантных транскриптах р53 и замены триплетов в 3'-иТК транскриптах протеинкиназы в аллеле миотонической дистрофии.

Эндонуклеаза РНКаза Р обнаружена в организмах в природе. Этот фермент имеет РНК-компонент и один или несколько белковых компонентов в зависимости от организма, из которого он выделен. Этот РНК-компонент из ферментов ЕксйегюЫа сой и ВасШик киЫШк может действовать в качестве агента сайт-специфического расщепления в отсутствие белка при определенных солевых и ионных условиях. Исследования требований в отношении субстратов для ферментов человека и бактерий показало, что минимальные субстраты для любого из этих ферментов похожи на сегмент молекулы транспортной РНК.

- 18 029094

Эта структура может быть имитирована уникально сконструированными антисмыеловыми РНК, которые спариваются с РНК-мишенью и служат в качестве субстратов для опосредованного РНКазой Р, сайтспецифического расщепления как в тест-пробирке, так и в клетках. Было также показано, что антисмысловой компонент может быть ковалентно присоединен к РНК РНКазы Р для направления этого фермента только на представляющую интерес РНК-мишень. Исследователи использовали преимущество этого свойства в конструировании антисмысловых РНК, которые спариваются с представляющими интерес мРНК-мишенями для стимуляции сайт-специфического расщепления мишени и для нацеленного ингибирования как вируса простого герпеса, так и цитомегаловируса в культуре клеток.

Ряд малых РНК, патогенных для растений (вироиды, сателлитные РНК и вирусоиды), транскрипт из митохендриальной ДНК-плазмиды N. сга55а и вирус гепатита дельта животных подвергаются реакции саморасщепления ίη νίίτο в отсутствие белка. Эти реакции требуют нейтрального рН и Мд²'. Эта реакция саморасщепления является интегральной частью механизма репликации ίη νίνο, называемого механизмом катящегося кольца. Эти саморасщепляющиеся РНК могут быть подразделены на группы в зависимости от последовательности и вторичной структуры, образуемой около сайта расщепления. Малые рибозимы были получены из мотива, обнаруженного в одноцепочечных РНК вироидов и вирусоидов растений. На основе общей вторичной структуры и консервативного набора нуклеотидов термин "молотоголовые" был дан одной группе этого домена саморасщепления. Молотоголовый рибозим состоит из 30 нуклеотидов. Простота молотоголового каталитического домена сделала его предпочтительным выбором в конструировании транс-действующих рибозимов. С использованием спаривания Уотсона-Крика может быть сконструирован молотоголовый рибозим для расщепления любой РНК-мишени. Требования к сайту расщепления являются относительно простыми, и фактически может производиться нацеливание на любой мотив иН-последовательности (где Н обозначает и, С или А).

Второй полученный из растений мотив саморасщепления, первоначально идентифицированный в отрицательной цепи сателлитной РНК кольцевой пятнистости табака, был назван "шпилькой" или "скрепкой для бумаг". Эти рибозимы-шпильки расщепляют РНК-субстраты в обратимой реакции, которая генерирует 2',3'-циклический фосфат и сконструированные по 5'-гидрокси-концам версии этого каталитического мотива также расщепляют и обновляют многочисленные копии различных мишеней ίη 1ган5. Требования к субстрату включают в себя СИС, причем расщепление происходит непосредственно слева от С. Этот рибозимы-шпилька катализирует также реакцию лигирования, хотя более часто его используют для реакций расщепления.

Имеются многочисленные применения как молотоголовых, так и шпилечных рибозимов в клетках для отрицательной регуляции специфических клеточных и вирусных мишеней. На5е1о£Т апб Сег1асй сконструировали молотоголовый мотив (На5е1оГГ апб Сет1асй; №Лиге. 1988 Аид 18; 334(6183):585-91), который может быть сконструирован расщеплением любой мишени модификацией плеч, которые спариваются по принципу спаривания оснований Уотсона-Крика с правильной мишенью. Ратет/аш еί а1. показали, что этот мотив молотоголового рибозима имел потенциальные терапевтические применения в исследовании, в котором наблюдали фактически полное ингибирование экспрессии и репликации вирусных генов, с использованием клеток, сконструированных для экспрессии рибозима дад против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (Рате/ат А. еί а1., Ргоп0ег5 ίη Вю5с1епсе 7:а, 29-36; 2002).

В другом аспекте модуляция экспрессии коннексина включает в себя использование каталитических ДНК (или ДНКзимов). Малые ДНК, способные сайт-специфически расщеплять РНК-мишени, были разработаны с использованием эволюции ίη νίίτο (так как неизвестно присутствие ДНК-ферментов в природе). Были идентифицированы два различных каталитических мотива с различными специфичностями в отношении сайта расщепления. Наиболее часто используемые 10-20 ферментов связываются с их РНК-субстратами посредством спаривания оснований по принципу Уотсона-Крика и сайт-специфически расщепляют РНК-мишень, как и молотоголовые и шпилечные рибозимы, приводя к 2',3'-циклическому фосфату и 5'-ОН-концам. Расщепление мРНК-мишеней приводит к их деструкции, а ДНКзимы рециклируют и расщепляют множество субстратов. Синтез каталитических ДНК является недорогим, и они имеют хорошие каталитические свойства, что делает их ценными заменителями либо антисмысловой ДНК, либо рибозимов.

Были опубликованы несколько применений ДНКзимов в культуре клеток, в том числе ингибирование мРНК νед Р и последующее предотвращение ангиогенеза и ингибирование экспрессии слитого транскрипта Ьст/аЫ, характерного для хронического миелогенного лейкоза. Каталитические ДНК могут доставляться экзогенно, и они могут иметь модифицированный скелет для оптимизации системной доставки в отсутствие носителя.

В другом аспекте данного изобретения модуляция конститутивного гена коннексина включает в себя использование олигонуклеотидов, имеющих структуры морфолино-скелета. ЗиттегЮн ТЕ. аий ^МеНег Ό.Ό. И.8. РаЬ Νο. 5034506.

В другом аспекте данного изобретения антисмысловые полинуклеотиды могут быть химически модифицированы для усиления их устойчивости к нуклеазам и увеличения эффективности вхождения в клетку. Например, могут быть использованы олигонуклеотиды со смешанным скелетом (МВО), содержащие сегменты фосфоротиоатных олигодезоксинуклеотидов и подходящим образом помещенные сег- 19 029094

менты модифицированных олигодезокси- или олигорибонуклеотидов. МВО имеют сегменты фосфоротиоатных связей и другие сегменты других модифицированных олигонуклеотидов, таких как метилфосфонаты, фосфорамидаты, фосфородитиоаты, Ы3'Р5'-фосфорамидаты и олигорибонуклеотидфосфоротиоаты и их 2'-О-алкил-аналоги и 2'-О-метилрибонуклеотид-метилфосфонаты, которые является неионными и очень устойчивы к нуклеазам, или 2'-О-алкилолигорибонуклеотиды.

Как известно в данной области, нуклеозид является комбинацией азотистое основание-сахар. Часть основания этого нуклеозида обычно является гетероциклическим основанием. Двумя наиболее обычными классами таких гетероциклических оснований являются пурины и пиримидины. Нуклеотиды являются нуклеозидами, которые дополнительно содержат фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью этого нуклеозида. Для тех нуклеозидов, которые включают в себя пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2'-, 3'- или 5'-гидроксильной частью этого сахара. При образовании олигонуклеотидов фосфатные группы ковалентно связывают соседние нуклеозиды друг с другом с образованием линейного полимерного соединения. В свою очередь, соответствующие концы этой линейной полимерной структуры могут быть дополнительно соединены с образованием кольцевой структуры, однако открытые линейные структуры обычно являются предпочтительными. В структуре олигонуклеотида фосфатные группы обычно называют образующими межнуклеозидный скелет олигонуклеотида. Обычной связью или скелетом РНК и ДНК является 3'-5'-фосфодиэфирная связь.

Антисмысловые соединения, применимые в данном изобретении, могут включать в себя олигонуклеотиды, содержащие модифицированные скелеты или неприродные межнуклеозидные связи. Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные скелеты, включают в себя олигонуклеотиды, которые сохраняют атом фосфора в скелете, и олигонуклеотиды, которые не имеют атома фосфора в скелете. В контексте данного изобретения модифицированные олигонуклеотиды, которые не имеют атома фосфора в их межнуклеозидном скелете, могут также рассматриваться как олигонуклеозиды.

Антисмысловые соединения с модифицированными олигонуклеотидными скелетами, применимые в данном изобретении, могут включать в себя, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другой алкил-фосфонаты, в том числе З'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, в том числе 3'аминофосфорамидаты и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5'-связи, их 2'-5'-связанные аналоги и аналоги, имеющие обращенную полярность, в которых соседние пары нуклеозидных единиц связаны 3'-5' с 5'-3' или 2'-5' с 5'-2'. Включены также различные соли, смешанные соли и формы свободной кислоты.

В одном аспекте рассматривается, что модифицированные скелеты олигонуклеотидов, которые не включают в себя атом фосфора, имеют скелеты, которые образованы короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают в себя скелеты, имеющие морфолино-связи (образованные частично из сахарной части нуклеозида); силоксановые скелеты; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые скелеты; формацетильные и тиоформацетильные скелеты; метиленформацетильные и тиоформацетильные скелеты; алкенсодержащие скелеты; сульфаматные скелеты; метиленимино- и метиленгидразмино-скелеты; сульфонатные и сульфонамидные скелеты; амидные скелеты и другие скелеты, имеющие смешанные Ν-,Ο-,δ- и СН₂-компоненты.

В одном аспекте предусмотрены олигонуклеотидные миметики, в которых как сахарная, так и межнуклеозидная связь, т.е. скелет нуклеотидных единиц, заменены новыми группами. Единицы азотистых оснований сохраняются для гибридизации с соответствующим соединением-мишенью нуклеиновой кислоты. Одно из таких олигомерных соединений, олигонуклеотидный миметик, который, как было показано, имеет превосходные свойства гибридизации, называют пептиднуклеиновой кислотой (ПНК). В ПНК-соединениях сахарный скелет олигонуклеотида заменен амидсодержащим скелетом, в частности аминоэтилглициновым скелетом. Нуклеотидные основания сохраняются и связываются прямо или опосредованно с аза-атомами азота амидной части этого скелета. Дополнительное описание ПНКсоединений может быть найдено в Μίβίδβη е! а1. (δοίβηοβ, 1991, 254, 1497-1500).

В одном аспекте рассматриваются олигонуклеотиды с фосфоротиоатными скелетами и олигонуклеозиды с гетероатомными скелетами и, в частности -СНШН-О-СН₂-. -СН-2ЖСН)₃-О-СН-2 [известными как метиленовый (метилимино) или ΜΜΙ-скелет], -СН₂-О-Л(СН)₃-СН₂-, -ί.Ή₂-Ν(ί.Ή₃)-Ν(ί.Ή₃)-ί.Ή₂- и -О-ЖСН₃)-СН₂-СН₂- [где природный фосфодиэфирный скелет представлен как -О-Р-О-СН₂-]. Еще в одном аспекте рассматриваются также олигонуклеотиды, имеющие морфолино- и амидные структуры скелета молекулы.

В другом аспекте предусмотрено, что модифицированные олигонуклеотиды могут также содержать один или несколько замещенных сахарных остатков. Например, олигонуклеотиды, содержащие один из следующих радикалов в положении 2': ОН, Р, О-, δ- или Ν-алкил, О-алкил-О-алкил, О-, δ- или Νалкенил, О-, δ- или Ν-алкинил, где эти алкил, алкенил и алкинил могут быть необязательно замещенными или замещены С₁-С₁₀ алкилом или С₂-С₃₀ алкенилом и алкинилом. Особенно предпочтительными яв- 20 029094

ляются О[(СН2)пО]_тСНз, О(СН2)пОСНз, О(СН_;)_;О\(СН_;)_;. О(С11+ΝΊI, ОЩЩЦСЩ, О(С1 РкОМ Р и О(СН₂)_пОЫ[(СН₂)_пСН₃)]₂, где п и т равны 1 - приблизительно 10. Другие предпочтительные олигонуклеотиды могут содержать один из следующих радикалов в положении 2': С₁-С₁₀ низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-арапкил, 8Н, 8СН₃, ОСЫ, С1, Вг, СЫ, СР₃, ОСР₃, 8ОСР₃, 8О₂СН₃, ОЫО₂, ЫО₂, Ν₃, ЫН₂, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, расщепляющую РНК группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида и другие заместители, имеющие сходные свойства. Предпочтительная модификация включает в себя 2'-метоксиэтокси (2'-О-СН₂СН₂ОСН₃, также известную как 2'-О(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Магйп е! а1., Не1у. СЫт. Ас1а 1995, 78, 486-504), т.е. алкоксиалкоксигруппу. Другая модификация включает в себя 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е. группу О(СН₂)₂ОЫ(СН₃)₂, также известную как 2'-ЭМАОЕ. и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (2'-ЭМАЕОЕ), т.е. 2'-О-СН₂-О-СН₂\(СН;),

Дополнительно предусмотрено, что модификации могут включать в себя 2'-метокси (2'-О-СН3), 2'аминопропокси (2'-ОСН₂СН₂ЫН₂) и 2'-фтор (2'-Р). Подобные модификации могут быть также произведены в других положениях на олигонуклеотиде, в частности 3'-положении сахара на 3'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных олигонуклеотидах и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды также могут иметь сахарные миметики, такие как циклобутильные радикалы вместо пентофуранозильного сахара.

В другом аспекте предусмотрено, что олигонуклеотиды могут также включать в себя модификации или замены нуклеотидного основания (часто называемого в данной области просто "основанием"). В данном контексте "немодифицированные" или "природные" нуклеотидные основания включают в себя пуриновые основания аденин (А) и гуанин (С) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (И). Модифицированные нуклеотидные основания включают в себя другие синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как 5-метилцитозин (5-те-С или т5с), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминкаденин, 6-метил- и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2пропил- и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5галогенурацил и -цитозин, 5-пропинилурацил и -цитозин, 6-азоурацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил, 8-гидроксил- и другие 8замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 8замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные нуклеотидные основания включают в себя нуклеотидные основания, описанные в патенте США с номером 3687808, нуклеотидные основания, описанные в Сопс1ке Епсус1орей1а О£ Ро1утег 8с1епсе Апй Епдтееппд 1990, радек 858-859, КгоксЫуй/ 1. 1ойп Айеу & 8опк, нуклеотидные основания, описанные Епдйксй е! а1. (Апде\уапй1е Сйет1е, 1п!егпа!юпа1 Еййгоп 1991, 30, 61'3-722), и нуклеотидные основания, описанные 8апдйу1 Υ.8., Сйар!ег 15, Апйкепке Кекеагсй апй Аррйсайопк 1993, радек 289-302, Сгооке 8.Т. апй ЬеЫеи В., ей., СКС Ргекк. Некоторые из этих нуклеотидных оснований являются особенно полезными для увеличения аффинности связывания олигомерных соединений. Они включают в себя 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и Ν-2-, Ν-6- и О-6-замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5пропинилцитозин. Было показано, что замещения 5-метилцитозин увеличивают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°С (8апдйу1 Υ.8., Сгооке 8.Т. апй ЬеЫеи В., ейк., Апйкепке Кекеагсй апй Аррйсайопк 1993, СК8 Ргекк, Воса Ка!оп, радек 276-378) и являются в настоящее время предпочтительными заменами оснований, еще более предпочтительно при комбинировании с 2'-О-метоксиэтильными модификациями сахара.

В другом аспекте предусмотрено, что модификация этих олигонуклеотидов включает в себя химическое связывание с этим олигонуклеотидом одного или нескольких радикалов или конъюгатов, которые усиливают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение данного олигонуклеотида. Такие радикалы включают в себя, но не ограничиваются ими, липидные молекулы, такие как радикал холестерина (ЬеЕшдег е! а1., Ргос. Ыа!1. Асай. 8сй И8А 1989, 86, 6553-6556), холевую кислоту (Мапойагап е! а1., Вюогд. Мей. Сйет. Ьей. 1994, 4, 1053-1059), простой тиоэфир, например гексил-8-тритилтиол (Мапойагап е! а1., Апп. Ν.Υ. Асай. 8сь 1992, 660, 306-309; Мапойагап е! а1., Вюогд. Мей. Сйет. Ье!!. 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (ОЬегйаикег е! а1., Ыис1. АсЫк Кек. 1992, 20, 533-538), алифатическую цепь, например остатки додекандиола или ундецила (8аЕоп-Вейтоагак е! а1., ЕМВО 1. 1991, 10, 1111-1118; КаЬапоу е! а1., РЕВ8 Ье!!. 1990, 259, 327-330; 8у1пагсйик е! а1., ВюсЫт1е 1993, 75, 49-54), фосфолипид, например дигексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3Н-фосфонат триэтиламмония (Мапойагап е! а1., Те!гайейгоп Ье!!. 1995, 36, 3651-3654; 8йеа е! а1., Ыис1. Ас1йк Кек. 1990, 18, 3777-3783), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Мапойагап е! а1., Ыис1еоыйек & Ыис1еоййек 1995, 14, 969-973) или адамантануксусную кислоту (Мапойагап е! а1., Те!гайейгоп Ье!!. 1995, 36, 3651-3654), пальмитильный радикал (МЕйга е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 1995, 1264, 229-237) или радикал октадециламина или гексиламинокарбонилоксихолестерина (Сгооке е! а1., 1. Рйагтасо1. Ехр. Тйег. 1996, 277, 923-937).

Предусмотрено также использование олигонуклеотидов, которые являются химерными олигонук- 21 029094

леотидами. "Химерные" олигонуклеотиды или "химеры" в контексте данного изобретения обозначают олигонуклеотиды, которые содержат два или более отличающихся районов, каждый из которых произведен из по меньшей мере одного нуклеотида. Эти олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере один район, в котором этот олигонуклеотид модифицирован таким образом, чтобы придать этому олигонуклеотиду увеличенную устойчивость к нуклеазной деградации, увеличенное клеточное поглощение и/или увеличенную аффинность связывания в отношении нуклеиновой кислоты-мишени. Дополнительный район этого олигонуклеотида может служить в качестве субстрата для фермента, способного расщеплять гибриды РНК:ДНК или РНК:РНК. Например, РНКаза Н является клеточной эндонуклеазой, которая отщепляет РНК-цепь дуплекса РНК:ДНК. Таким образом, активация РНКазы Н приводит к расщеплению РНК-мишени с увеличением в значительной степени эффективности антисмыслового ингибирования экспрессии гена. Расщепление РНК-мишени может рутинным образом детектироваться гельэлектрофорезом и, если необходимо, ассоциированными способами гибридизации нуклеиновых кислот, известными в данной области. РНКаза Н-модифицированное расщепление РНК-мишени отличается от применения рибозимов для расщепления нуклеиновых кислот.

Примеры химерных олигонуклеотидов включают в себя, но не ограничиваются ими, "гэпмеры", в которых присутствуют три различающихся района, обычно имеющие центральный район, фланкированный двумя районами, которые химически эквивалентны один другому, но отличаются от гэпа (центральной части). Предпочтительным вариантом гэпмера является олигонуклеотид, в котором центральная часть ("гэп") этого олигонуклеотида служит в качестве субстрата для РНКазы Н и предпочтительно состоит из 2'-дезоксинуклеотидов, тогда как фланкирующие части (5'- и 3'-"крылья") модифицированы таким образом, что они имеют более высокую аффинность в отношении РНК-молекулы-мишени, но не способны поддерживать нуклеазную активность (например, фтор- или 2'-О-метоксиэтилзамещенные). Химерные олигонуклеотиды не ограничиваются олигонуклеотидами, имеющими модификации по сахару, но могут также включать в себя олигонуклеозиды или олигонуклеотиды с модифицированными скелетами, например, с районами фосфоротиоатных (Р=§) и фосфодиэфирных (Р=О) модифицированных связей или с остатками ΜΜΙ- и Р=§ скелетных связей. Другие химеры включают в себя "вингмеры", также известные как "гемимеры", т.е. олигонуклеотиды с двумя отличающимися районами. В предпочтительном варианте "вингмера" 5'-часть этого олигонуклеотида служит в качестве субстрата для РНКазы Н и предпочтительно состоит из 2'-дезоксинуклеотидов, тогда как З'-часть модифицирована таким образом, что она имеет более высокую аффинность в отношении РНК-молекулы-мишени, но не способна поддерживать нуклеазную активность (например, является 2'-фтор- или 2'-О-метоксиэтилзамещенной) или наоборот. В одном варианте осуществления олигонуклеотиды данного изобретения содержат модификацию 2'-О-метоксиэтил (2'-О-СН₂СН₂ОСН₃) на сахарной части по меньшей мере одного нуклеотида. Было показано, что эта модификация увеличивает как аффинность этого олигонуклеотида в отношении его мишени, так и устойчивость к нуклеазам этого олигонуклеотида. Согласно данному изобретению одна субъединица, множество субъединиц или все нуклеотидные субъединицы этих олигонуклеотидов могут нести модификацию 2'-О-метоксиэтил (-О-СН₂СН₂ОСН₃). Олигонуклеотиды, содержащие множество нуклеотидных субъединиц, имеющих 2'-О-метоксиэтильную модификацию, могут иметь такую модификацию на любой из нуклеотидных субъединиц в этом олигонуклеотиде и могут быть химерными олигонуклеотидами. Кроме 2'-О-метоксиэтильной модификации или наряду с 2'-О-метоксиэтильной модификацией обсуждаются также олигонуклеотиды, содержащие другие модификации, которые усиливают антисмысловую эффективность, силу или аффинность в отношении мишени.

Данное изобретение обеспечивает также полинуклеотиды (например, ДНК, РНК, ПНК или т.п.), которые связываются с двухцепочечными или дуплексными нуклеиновыми кислотами коннексина (например, в уложенном районе РНК коннексина или в гене коннексина), образуя содержащую тройную спираль или "триплексную" нуклеиновую кислоту. Образование тройной спирали приводит к ингибированию экспрессии коннексина, например, предотвращением транскрипции гена коннексина, уменьшая или элиминируя, следовательно, активность коннексина в клетке. Не желая быть связанными каким-либо конкретным механизмом, авторы данного изобретения считают, что спаривание тройной спирали нарушает способность двойной спирали открываться достаточным образом для связывания полимераз, факторов транскрипции или связывания с регуляторными молекулами.

Триплексные олиго- и полинуклеотиды конструируют с использованием правил спаривания оснований образования тройной спирали (см., например, Сйеид е! а1., I. ΒίοΙ. Сйет. 263: 15110 (1988); Рети апй Сатепт-О1его, 8с1епсе 354:1494 (1991); Катйак е! а1., Ргос. ЫаИ. Асай. δα. И8А 83:9591 (1986)) и последовательности мРНК и/или гена коннексина. Обычно образующие триплекс олигонуклеотиды содержат специфическую последовательность из приблизительно 10-приблизительно 25 нуклеотидов или более длинную последовательность, "комплементарную" специфической последовательности в РНК или гене коннексина (т.е. достаточно большую для образования стабильной тройной спирали, но достаточно малую в зависимости от способа доставки для введения ίη νΐνο, если желательно). В этом контексте "комплементарные" обозначает "способные к образованию тройной спирали". В одном варианте осуществления олигонуклеотиды конструируют для специфического связывания с регуляторными районами гена коннексина (например, фланкирующей 5'-последовательностью, промоторами и энхансерами) или с

- 22 029094

сайтом инициации транскрипции (например, между -10 и +10 от сайта инициации транскрипции). В отношении недавних терапевтических достижений с использованием триплексной ДНК см. Оее с1 а1., ίη НиЬег αη6 Сагг, 1994, ΜοΡαιΟτ αη6 Ιιηιηιιηο1ο8Κ Аррт^-юНек, РиФга РиЬПкНтд Со, Μΐ Κίκοο ΝΥ и Κίηίηκ1αη6 е1 а1., 1997, Ргос. Ν;·ιΐ1. Аса6. 8сг И8А 94:5854.

Данное изобретение обеспечивает также рибозимы, применимые для ингибирования активности коннексина. Рибозимы связывают и специфически расщепляют и инактивируют мРНК коннексина. Применимые рибозимы могут содержать 5'- и 3'-концевые последовательности, комплементарные мРНК коннексина, и могут быть сконструированы специалистом в данной области на основе мРНКпоследовательности коннексина. Обсуждается, что обеспеченные здесь рибозимы включают в себя рибозимы, имеющие характеристики интронов-рибозимов группы I. (СНесН, В^οΐесЬиο1ο§у 13:323 (1995)), и характеристики молотоголовых рибозимов (Ε6§ίη§ίοη, В^οΐесЬηο1ο§у 10:256 (1992)).

Рибозимы включают в себя рибозимы, имеющие сайты расщепления, такие как ОИА, ОИИ и ОИС. Короткие РНК-олигонуклеотиды с длиной 15-20 рибонуклеотидов, соответствующие району гена коннексина-мишени, содержащему этот сайт расщепления, могут оцениваться в отношении вторичных структурных признаков, которые могут делать этот олигонуклеотид более желательным. Пригодность сайтов расщепления может быть оценена также испытанием доступности для гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами с использованием анализов рибонуклеазной защиты или испытанием ίη νίίτο рибозимной активности в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области.

Далее предусмотрены антисмысловые соединения, в которых антисмысловая и рибозимная функции могут быть объединены в едином олигонуклеотиде. Кроме того, рибозимы могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов или модифицированных связей между нуклеотидами, как описано выше в связи с описанием иллюстративных обеспеченных здесь антисмысловых олигонуклеотидов.

Данное изобретение обеспечивает также полинуклеотиды, применимые для ингибирования активности коннексина такими способами, как интерференция РНК (ΚΝΑί) (тип сайленсинга генов). Этот и другие способы супрессии генов хорошо известны в данной области. Обзор этого способа можно найти в Заемсе 288:1370-1372 (2000). ΚΝΑί действует на посттранскрипционном уровне и является последовательность-специфической. Этот способ предусматривает введение РНК с частично или полностью двухцепочечной природой или предшественников такой РНК или РНК, способной кодировать такую РНК, в клетку или во внеклеточную среду.

Как описано Р1ге е1 а1., И.8. Ра1еШ Νο 6506559, эта РНК может содержать одну или несколько цепей полимеризованного рибонуклеотида. Двухцепочечная структура может быть образована отдельной самокомплементарной цепью РНК или двумя комплементарными РНК-цепями. Эти РНК могут включать в себя модификации либо в отношении фосфат-сахарного скелета, либо в отношении нуклеозидов. Образование РНК-дуплекса может быть инициировано либо внутри, либо снаружи клетки.

Исследования продемонстрировали, что одна или несколько рибонуклеаз специфически связываются с двухцепочечной РНК и расщепляют двухцепочечную РНК на короткие фрагменты. Рибонуклеаза (рибонуклеазы) остаются связанными с этими фрагментами, которые, в свою очередь, специфически связываются с комплементарной мРНК, т.е. специфически связываются с цепью транскрибированной мРНК для гена коннексина. Эта мРНК для гена коннексина также деградируется рибонуклеазой (рибонуклеазами) на короткие фрагменты, с устранением посредством этого транскрипции и экспрессии гена коннексина и ингибированием, таким образом, активности коннексина. Кроме того, РНК-полимераза может действовать, облегчая синтез многочисленных копий этих коротких фрагментов, который экспоненциально увеличивает эффективность этой системы. Уникальным признаком этого пути супрессии генов является то, что сайленсинг не ограничен клетками, в которых он инициируется. Эффекты сайленсинга генов могут распространяться в другие части организма и даже переноситься через зародышевую линию в несколько поколений.

В одном аспекте зависимая от двухцепочечной РНК (6κΚΝΑ) специфическая посттранскрипционная стратегия интерференции РНК (ΚΝΑί) включает в себя использование коротких интерферирующих РНК (κίΚΝΑ). Использование общего ΚΝΑί-подхода подвержено определенным недостаткам, в том числе неспецифическому антивирусному механизму защиты в клетках млекопитающих, активируемых в ответ на длинные 6кКЫА-молекулы (ОИ ί, ЕкЮЬам Μ, "1п6ис1юп ο£ τιρορίοκίκ Ьу 1Не 65КУА-6срсп6сп1 ргоШикшаке (РКК): МесЬаткт ο£ ;κΙίοη". Αρορΐοκίκ 2000, 5:107-114). Прогресс в данной области был достигнут демонстрацией того, что синтетические дуплексы РНК из 21 нуклеотида могли опосредовать генспецифическую интерференцию РНК (ΚΝΑί) в клетках млекопитающих без индуцирования общих антивирусных механизмов защиты (Е1ЬакН|г 8., е1 а1., "Иир1ех ο£ 21-ηис1еοί^6е ΚΝΑκ те61а1е ΚΝΑ ^ηιе^Γе^еηсе ίη сийиге6 ιη;πηιη;·ι1ί;·ιη се11к". №1иге 2001, 411:494-498; СарРм Ν., е1 а1., Ргос. Ν;·ι11. Αса6. 8α 2001, 98:97429747). Таким образом, κίΚΝΑ все больше признаются в качестве мощных инструментов для генспецифической модуляции.

Как описано здесь, интерференция РНК (ΚΝΑί) включает в себя группу связанных с сайленсингом генов механизмов, имеющих многочисленные общие биохимические компоненты, в которых конечной

- 23 029094

эффекторной молекулой является, например, но не только, малая состоящая из 21-23 нуклеотидов антисмысловая РНК. Один механизм использует относительно длинный й5КЫА-''триггер", который процессируется клеточным ферментом Эюег на короткие, например, но не только, состоящие из 21-23 нуклеотидов йкКЫА, называемые κίΚΝΛ. Цепь κίΚΝΛ, комплементарная РНК-мишени, становится включенной в мультибелковый комплекс, называемый РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (К1ЗС), где она служит гидом для эндонуклеолитического расщепления цепи мРНК в сайте-мишени. Это приводит к деградации всей мРНК; затем эта антисмысловая 81ККА может рециклировать. В низших организмах РНК-зависимая РНК-полимераза также использует отожженную 81ККА-гида в качестве праймера, генерирующего больше й8КУА из мишени, которая, в свою очередь, служит в качестве субстрата Эюег, генерируя больше 8тККА и амплифицируя сигнал 81ККА. Этот путь обычно используется в качестве защитного механизма против вирусов в растениях.

Как описано здесь, 81ККА может состоять из двух отдельных отожженных отдельных цепей, например из 21-23 нуклеотидов, где концевые два 3'-нуклеотида являются неспаренными (3'-выступ). Альтернативно, эти 8ΪΚΝΆ могут быть в форме единой структуры стебель-петля, часто называемой короткой шпилечной РНК (8ЬККА). Обычно, но не всегда, эта антисмысловая цепь 8ЬККА является также полностью комплементарной смысловой цепи партнера 81/8ЬКНА.

В клетках млекопитающих длинные йδКNΆ (обычно имеющие длину, большую чем 30 нуклеотидов) запускают интерфероновый путь активацией протеинкиназы К и 2',5'-олигоаденилатсинтазы. Активация интерферонового пути может приводить к глобальной понижающей регуляции трансляции, а также к глобальной деградации РНК. Однако сообщалось, что более короткие ДРУА, экзогенно введенные в клетки млекопитающих, обходят этот интерфероновый путь.

Антисмысловой продукт 8тКУА может быть также получен из эндогенных микро-РНК. В клетках человека независимо от начальной формы (зЖУА или микро-РНК) или пути процессинга конечная зрелая, например, но не только) состоящая из 21-23 нуклеотидов антисмысловая РНК, которая является полностью гомологичной мРНК, будет управлять расщеплением мРНК. Обычно действие ошибочных оснований между 8тККА и сайтами-мишенями может варьироваться от почти нулевой до полной нейтрализации активности по причинам, которые являются только частично понимаемыми; однако по меньшей мере в одном случае частичная гомология приводила к ингибированию трансляции мРНК. Обычно 81КУА с ошибочными спариваниями, сконструированная для имитации прототипического взаимодействия микро-РНК/мишень, может опосредовать варьирующиеся степени трансляционного регресса в зависимости как от специфического взаимодействия, так и от числа сайтов-мишеней в данной мРНК. КУА1 может быть активирована либо экзогенной доставкой предобразованных 81КУА, либо через экспрессию на основе промотора 81КУА или 8ЬККА.

Короткие интерферирующие РНК (81КУА) могут быть синтезированы химически или генерированы системами векторов на основе ДНК. Обычно это включает в себя транскрипцию коротких шпилечных РНК (8ЬКУА), которые эффективно процессируются с образованием 81ККА в клетках (Райй18оп Р., Саий1 А., Нагтоп О.: З!аЬ1е 8иррте88юп оГдепе е.хрге88юп Ьу КУА1 ш таттаПап се118. Ргос. №И1. Асай. ЗсП ИЗА 2002, 99:1443-1448; Райй18оп Р., Саий1 А., Вегп8!еш Е., Наппоп О., СопИт Ό.: ЗПоП Наирт КЯА8 (81КУА) шйисе 8едиепсе-8рес1Йс 811епсшд ш таттаПап се118. Оепе8 & Эеу 2002, 16:948-958; Зш О, е! а1., Ргос. №!1. Асай. ЗсЕ ИЗА 2002, 8:5515-5520; Вгитте1катр Т., е! а1., Заепсе 2002, 296:550-553). Таким образом, в данном контексте 81ККА могут быть использованы в качестве эффективной стратегии для тканеспецифического нацеливания и модуляции экспрессии генов.

Олигонуклеотиды, используемые в соответствии с данным изобретением, могут быть получены удобным и рутинным образом с использованием хорошо известного способа твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продается несколькими продающими фирмами, известными в данной области. Могут быть использованы также любые другие способы; фактический синтез олигонуклеотидов хорошо известен в данной области. Хорошо известно использование сходных способов для получения олигонуклеотидов, таких как производные фосфоротиоата и 2'-алкокси- или 2'-алкоксиалкоксипроизводные, в том числе 2'-О-метоксиэтилолигонуклеотиды (Майш Р. Не1у. СЫт. Ас!а 1995, 78, 486504). Хорошо известно также использование сходных способов и коммерчески доступных модифицированных амидитов и стекла с контролируемым размером пор (СРО), таких как модифицированные биотином, флуоресцеином, акридином или псораленом амидиты и/или СРО (доступные из О1еп Ке8еатсЬ, З!ег1шд, Уа.), для синтеза флуоресцентно меченых, биотинилированных или других конъюгированных олигонуклеотидов.

Способы.

В другом аспекте данное изобретение включает в себя способы лечения субъекта (например, пациента) введением антисмысловых соединений этому субъекту. В общем, эти способы включают в себя способы конструирования ткани и способы уменьшения повреждения ткани, связанного с медицинскими процедурами, в том числе, но не только, с офтальмологическими процедурами.

Этот способ может предусматривать, например, введение антисмыслового соединения в глаз указанного субъекта в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина человека в глазу или в клетках, ассоциированных с глазом этого субъекта. Хотя предпочтительно, чтобы ингибиро- 24 029094

валась экспрессия белка коннексина человека, ожидается, что и другие белки могут быть мишенями для модуляции антисмысловыми соединениями либо отдельно, либо в комбинации с антисмысловыми соединениями, которые ингибируют экспрессию коннексинов человека.

В некоторых вариантах осуществления офтальмологической процедурой является офтальмологическая хирургия, в том числе, но не только, эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия, удаление катаракты, трансплантация роговицы, хирургия для коррекции рефракции (преломления), радиальная кератотомия, фильтрующая хирургия по поводу глаукомы, кератопластика, эксимерная лазерная фоторефрактивная кератэктомия, трансплантация роговицы, хирургия для коррекции рефракции (преломления), иссечение неоплазмы глазной поверхности, трансплантация конъюнктивы или амниотической оболочки, иссечение птеригия и пингвекулы, глазная пластическая хирургия, иссечение опухоли века, процедуры ремоделирования века для врожденных патологий, репарация эктропиона и энтропиона глазного века, хирургия по поводу страбизма (косоглазия) (глазной мышцы) или любой проникающей травмы глаза.

В некоторых вариантах осуществления обеспеченные здесь антисмысловые соединения вводят локальным или местным введением. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть также введены системно или внутриглазной инъекцией.

Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены субъекту в заранее определенное время, например, относительно образования раны, так как это имеет место в офтальмологической процедуре (например, хирургической). Например, антисмысловые соединения могут быть введены перед офтальмологической процедурой, во время офтальмологической процедуры или после офтальмологической процедуры. Например, антисмысловые соединения могут быть введены субъекту в пределах минут или часов до или после выполнения офтальмологической процедуры.

В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение вводят после выполнения офтальмологической процедуры и, например, антисмысловое соединение вводят в пределах приблизительно 4 ч этой процедуры, в пределах приблизительно 3 ч этой процедуры и более часто в пределах приблизительно 2 ч офтальмологической процедуры или в пределах приблизительно 1 ч офтальмологической процедуры, например в пределах 5, 10, 15, 20, 30, 45 мин офтальмологической процедуры.

В другом аспекте обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в способах для выполнения конструирования ткани. В этих вариантах осуществления и некоторых других обеспеченных здесь антисмысловые соединения обычно вводят на протяжении более продолжительных периодов времени, например на протяжении ряда дней, недель, месяцев или даже более длительных периодов, и антисмысловые соединения могут вводиться независимо от конкретной процедуры, выполняемой на пациенте, например процедуры, выполняемой на глазу.

Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены вместе со способом, который увеличивает толщину ткани роговицы в субъекте, в том числе в способах, которые не связаны с офтальмологической процедурой и в способах, в которых антисмысловые соединения вводят в связи с офтальмологической процедурой (например, хирургией). Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены вместе со способом, который стимулирует заживление или предотвращает повреждение ткани в клетках, ассоциированных с роговицей этого субъекта (например, роговичных клетках). Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в сочетании со способом, который уменьшает образование рубцов в глазу пациента.

Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут быть введены в сочетании со способом, который уменьшает помутнение в глазу субъекта. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который модулирует гиперцеллюлярность (повышенное содержание клеток), ассоциированную с дифференцировкой миофибробластов, ассоциированной с местом индуцированного лазером повреждения, предпочтительно в 24-48-часовом периоде после хирургии. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который модулирует стромальное ремоделирование и уменьшает помутнение зрения, связанное с местом индуцированного лазером повреждения, предпочтительно в 24-72-часовом периоде после хирургии. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который увеличивает движение эпителиальных клеток в глазу субъекта. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который приводит к увеличению движения эпителиальных клеток в пределах 12 ч введения антисмыслового соединения в глаз пациента. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который приводит к увеличению движения эпителиальных клеток в пределах 24 ч введения антисмыслового соединения в глаз субъекта. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который предотвращает увеличение плотности стромальных клеток. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который ингибирует стромальный отек, связанный с местом индуцированного лазером повреждения, в 24-72-часовом периоде после хирургии. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который уменьшает эпителиальную гиперплазию в 24-72-часовом периоде после хирургии. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который уменьшает активацию миофибробластов в периоде до 1 недели после хирургии. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в

- 25 029094

недели после хирургии. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который модулирует дифференцировку клеток, которая модифицирует внеклеточный матрикс. Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в сочетании со способом, который уменьшает пролиферацию клеток.

В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение уменьшает образование рубцов. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение уменьшает воспаление. В некоторых вариантах осуществления, например, антисмысловое соединение стимулирует заживление ран. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антисмысловое соединение используют вместе с хирургической процедурой имплантации. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антисмысловое соединение направлено на коннексин 43 и вводится для регуляции деления и роста эпителиальных базальных клеток. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение направлено на коннексин 31.1 и вводится для регуляции кератинизации наружного слоя.

В других вариантах осуществления этот способ стимулирует заживление или предотвращает повреждение ткани в клетках, ассоциированных с роговицей субъекта. Согласно определенному варианту осуществления антисмысловые соединения используют в способах, которые увеличивают толщину ткани роговицы в субъекте, или в способе, который приводит к уменьшению повреждения ткани в корнеальных клетках в субъекте, или в способе, который приводит к уменьшению повреждения ткани в клетках, связанных с роговицей субъекта, или в способе, выполняемом вместе с процедурой эксимерной лазерной фоторефрактивной кератэктомии в субъекте, или в способе, который модулирует гиперцеллюлярность (повышенное содержание клеток), ассоциированную с дифференцировкой миофибробластов, связанной с местом индуцированного лазером повреждения, предпочтительно в 24-48-часовом периоде после хирургии, или в способе, который модулирует стромальное ремоделирование и уменьшает помутнение зрения, ассоциированное с местом индуцированного лазером повреждения, предпочтительно в 2472-часовом периоде после хирургии, или в способе, который ингибирует стромальный отек, ассоциированный с местом индуцированного лазером повреждения, в 24-72-часовом периоде после хирургии, или в способе, который уменьшает эпителиальную гиперплазию, предпочтительно в 24-72-часовом периоде после хирургии, или в способе, который уменьшает активацию миофибробластов, в периоде до 1 недели после хирургии, или в способе, который модулирует дифференцировку клеток, которая модифицирует внеклеточный матрикс, или в способе, который уменьшает пролиферацию клеток.

В некоторых вариантах осуществления офтальмологической процедурой является удаление катаракты. В других вариантах осуществления офтальмологической процедурой является трансплантация роговицы. В других вариантах осуществления офтальмологической хирургической процедурой является радиальная кератотомия. В других вариантах осуществления офтальмологической процедурой является фильтрующая хирургия по поводу глаукомы. В других вариантах осуществления офтальмологической процедурой является кератопластика.

В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят локальным или местным введением. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят прямым нанесением в хирургическую рану. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят внутриглазной инъекцией. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят перед выполнением хирургической процедуры. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят во время хирургической процедуры. В некоторых неограничивающих вариантах осуществления антисмысловое соединение или композицию вводят в пределах приблизительно 15 мин перед выполнением офтальмологической процедуры или в пределах до приблизительно 2 ч после офтальмологической процедуры. В некоторых других вариантах осуществления, например при конструировании ткани, обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут вводиться в течение дней или даже месяцев.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления соединения и композиции используют для стимуляции заживления или для предотвращения повреждения ткани в клетках, ассоциированных с роговицей, где клетками, ассоциированными с роговицей, могут быть любые клетки в глазу, в том числе, но не только, корнеальные клетки. Обеспеченные здесь агенты, включающие в себя антисмысловые соединения, могут увеличивать толщину ткани роговицы в субъекте. В некоторых вариантах осуществления антисмысловое соединение используют в комбинации с другим соединением, применимым для уменьшения повреждения ткани или стимулирующим заживление. Например, антисмысловое соединение может вводиться совместно с фактором роста, цитокином или т.п., в том числе, но не только, РОР, ΝΟΡ, ΝΤ3, ΡΌΟΡ, ТОР, УБОР, ΒΌΟΡ, ЕОР, КОР, интегринами, интерлейкинами, плазмином и семафоринами.

В другом аспекте обеспечена фармацевтическая композиция для уменьшения повреждения ткани, ассоциированного с офтальмологической хирургией. Фармацевтическую композицию готовят подходящим образом для местного или локального введения в глаз субъекта, и она содержит антисмысловое соединение, присутствующее в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина человека в клетках, связанных с глазом этого субъекта. Это антисмысловое соединение нацелено предпочтительно, по меньшей мере, на приблизительно 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой

- 26 029094

кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из δΕΟ ΙΌ N0:12-31. В некоторых вариантах осуществления эти антисмысловые соединения находятся в форме фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель или переносчик, и агент или антисмысловое соединение присутствует в количестве, эффективном для стимуляции заживления раны в субъекте. В некоторых вариантах осуществления эти фармацевтические композиции могут находиться, например, в форме, подходящей для местного введения, в том числе в форме, подходящей для местного или локального введения в глаз субъекта. В некоторых дополнительных вариантах осуществления эти композиции и формы могут быть в форме геля, крема или любой из описанных здесь форм.

В другом аспекте обеспечены способы лечения повреждения центральной нервной системы. Этот способ предусматривает введение антисмыслового соединения в участок, проксимальный в отношении предсуществующей раны в центральной нервной системе, связанной с хирургической процедурой, выполняемой на пациенте для лечения указанного повреждения центральной нервной системы, где указанное антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на приблизительно 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из δΕΟ ΙΌ N0:12-31. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение вводят для уменьшения потери нейронов вследствие физической травмы спинного мозга. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение вводят в участок, смежный с раной, которая является результатом травмы. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение вводят в участок, смежный с раной, которая является результатом хирургии. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение вводят в участок, смежный с повреждением спинного мозга. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение нацелено на коннексин 43 и вводится для регуляции деления и роста эпителиальных базальных клеток. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение стимулирует заживление раны. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение уменьшает воспаление. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение уменьшает образование рубцов. В некоторых вариантах этого способа повреждением центральной нервной системы является повреждение спинного мозга. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение вводят пациенту при по меньшей мере приблизительно 24 ч после физической травмы спинного мозга. В некоторых вариантах этого способа антисмысловое соединение используют в сочетании с хирургической процедурой трансплантации. В некоторых дополнительных вариантах этого способа хирургическая процедура трансплантации связана с имплантатом, предобработанным антисмысловым соединением для ускорения заживления раны. В другом аспекте обеспечены антисмысловые соединения, способные стимулировать регенерацию нейронов в ассоциации с процедурой для лечения предсуществующей раны в пациенте, отличающейся потерей нейронов. В некоторых вариантах осуществления эти агенты являются антисмысловыми соединениями, имеющими длину 40 нуклеотидных оснований, которые нацелены по меньшей мере на 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин человека, в связи с процедурой для стимуляции регенерации нейронов для лечения предсуществующей раны в пациенте. Эта рана включает в себя раны, отличающиеся потерей нейронов. Коннексины, на которые может проводиться нацеливание, включают в себя коннексины, имеющие последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из δΕΟ ΙΌ N0:12-31. В этих вариантах осуществления антисмысловые соединения могут быть выедены пациенту при по меньшей мере 24 ч после физической травмы спинного мозга указанного пациента, которая привела к потере нейронов. Антисмысловые соединения могут вводиться пациенту при более чем 24 ч после физической травмы, которая привела к потере нейронов.

В некоторых вариантах фармацевтических композиций и способов антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на приблизительно 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин 30 человека или коннексин 37 человека. Предпочтительно антисмысловое соединение ингибирует экспрессию белка коннексина 30 или 37 человека в клетках, ассоциированных с глазом пациента. Другие фармацевтические композиции содержат антисмысловое соединение, нацеленное по меньшей мере на приблизительно 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин (например, человека), имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из δΕΟ ΙΌ N0:12-31, и предпочтительно это антисмысловое соединение ингибирует экспрессию коннексина человека в связи с процедурой для стимуляции регенерации нейронов для лечения предсуществующей раны в пациенте, которая отличается потерей нейронов.

Фармацевтические композиции.

В другом аспекте данное изобретение включает в себя фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения. В одном варианте осуществления обеспечена фармацевтическая композиция для уменьшения повреждения ткани, связанного с офтальмологической процедурой (например, хирургией), так что эту фармацевтическую композицию готовят для местного или локального введения в глаз субъекта, и она содержит антисмысловое соединение, присутствующее в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина человека в клетках, связанных с глазом этого субъекта. В некоторых вариантах осуществления это антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на 8

- 27 029094

нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин (например, человека), имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из 8ЕЦ ГО N0:12-31. В некоторых вариантах осуществления эта фармацевтическая композиция включает в себя фармацевтически приемлемый носитель, содержащий забуференный Плюроник (кислоту или гель), например до приблизительно 30% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе. Антисмысловая композиция может содержать различные количества Плюроника (кислоты или геля), в том числе, без ограничения, в количествах до приблизительно 5% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе, до приблизительно 10% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе, до приблизительно 15% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе, до приблизительно 20% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе, до приблизительно 25% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе, до приблизительно 30% Плюроника (кислоты) в забуференном фосфатом солевом растворе.

Обеспеченные здесь антисмысловые соединения могут также включать в себя биоэквивалентные соединения, в том числе фармацевтически приемлемые соли и пролекарства. Предполагается, что они включают в себя любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любое другое соединение, которое после введения животному, в том числе человеку, способно обеспечивать (прямо или опосредованно) биологически активный метаболит или его остаток. Таким образом, например, описаны также фармацевтически приемлемые соли нуклеиновых кислот и пролекарств таких нуклеиновых кислот. "Фармацевтически приемлемые соли" являются физиологически или фармацевтически приемлемыми солями обеспеченных здесь нуклеиновых кислот, т.е. соли, которые сохраняют желаемую биологическую активность исходного соединения и не сообщают ему нежелательных токсикологических эффектов (см., например, Вегде е1 а1., 1. οί РЬагта 8с1. 1977, 66, 1-19).

Для олигонуклеотидов примеры фармацевтически приемлемых солей включают в себя, но не ограничиваются ими, (а) соли, образованные с катионами, такими как натрий, калий, аммоний, магний, кальций, полиаминами, такими как спермин и спермидин, и т.д.; (Ь) кислотно-аддитивные соли, образованные с неорганическими кислотами, например хлористо-водородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и т.п.; (с) соли, образованные с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, танниновая кислота, пальмитиновая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, нафталиндисульфоновая кислота, и т.п.; и (й) соли, образованные из элементарных анионов, таких как хлор, бром и иод.

Обеспеченный здесь олигонуклеотид может быть приготовлен дополнительно или альтернативно для доставки в форме "пролекарства". Термин "пролекарство" обозначает, что терапевтический агент, который приготовлен в неактивной форме, превращается в активную форму (т.е. в лекарственное средство) в организме или его клетках под действием эндогенных ферментов или других химических соединений и/или условий. В частности, варианты пролекарств олигонуклеотидов могут быть получены в виде производных §АТЕ [(§-ацетил-2-тиоэтил)фосфата] в соответствии со способами, описанными в νθ 93/24510 ΐο О1ок5е1ш е! а1., риЬИкЬей Оес. 9, 1993.

Антисмысловые соединения могут быть составлены в фармацевтическую композицию, которая может включать в себя фармацевтически приемлемые носители, загустители, разбавители, буферы, консерванты, поверхностно-активные вещества, нейтральные или катионные липиды, липидные комплексы, липосомы, усилители проницаемости, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты и т.п., наряду с рассматриваемым олигонуклеотидом.

Фармацевтические композиции могут также включать в себя один или несколько активных ингредиентов, таких как интерфероны, антимикробные агенты, противовоспалительные агенты, анестетики и т.п. Формы для парентерального введения могут включать в себя стерильные растворы, которые могут также содержать буферы, липосомы, разбавители и другие подходящие добавки. Фармацевтические композиции, содержащие обеспеченные здесь олигонуклеотиды, могут включать в себя усилители проницаемости для ускорения доставки через пищеварительный тракт. Усилители проницаемости могут быть классифицированы как принадлежащие к одной из пяти широких категорий, а именно жирным кислотам, хелатообразующим агентам, поверхностно-активным веществам и агентам, не являющимся поверхностно-активными веществами (Ьее е! а1., Сййса1 Ке\'1е\У5 ίη ТЬегареийс Эгид Сатег §ук1етк 1991, 8, 91-192; МигаткЫ, СпИса1 Ке\ае\У5 ίη ТЬегареийс Эгид Сатег §ук1етк 1990, 7, 1-33). Могут быть включены один или более усилителей проницаемости из одной или нескольких из этих широких категорий.

Различные жирные кислоты и их производные, которые действуют в качестве усилителей проницаемости, включают в себя, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, рицинолеат, моноолеин (также называемый 1-моноолеоил-рацглицерином), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерил-1-монокапрат, 1додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, моно- и диглицериды и их физиологически

- 28 029094

приемлемые соли (т.е. олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.д.). Ьее е! а1., СгШса1 Ке\ае\У5 ш ТЬегареиЬс Эгид Сатег §уз!ет8 1991, раде 92; МигатзЫ, СгШса1 Ке\ае\уз ш ТЬегареиЬс Эгид Сатег §уз!етз 1990, 7,1; Е1Нагт е! а1., 1. РЬагт. РЬагтасо1. 1992 44, 651-654.

Физиологическая роль желчи включает в себя облегчение дисперсии и абсорбции липидов и жирорастворимых витаминов (Вгии!ои, СЬар!ег 38 1и: Соойтаи & СПтаи'з ТЬе РЬагтасо1од1са1 Ваз13 о£ ТЬегареиЬсз, 9* Ей., Нагйтаи е! а1., Мс Сгау-НШ, №\у Уогк, Ν.Υ., 1996, радез 934, 935). Различные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют в качестве усилителей проницаемости. Таким образом, термин "соль желчной кислоты" включает в себя любой из природно встречающихся компонентов желчи, а также любое из их синтетических производных.

Могут быть использованы комплексные составы, содержащие один или несколько усилителей проницаемости. Например, соли желчных кислот могут быть использованы в комбинации с жирными кислотами с получением комплексных форм. Хелатообразующие агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, динатрий-этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат, 5-метоксисалицилат и гомованилинат натрия), Ν-ацилпроизводные коллагена, 1аиге!Ь-9 и Νаминоацилпроизводные бета-дикетонов (енамины) [Ьее е! а1., СгШса1 Ке\ае\уз ш ТЬегареиЬса1 Эгид Сагпег §уз!етз 1990, 7, 1033; Вииг е! а1., 1. Сои!го1 Ке1. 1990, 14, 43-51]. Хелатообразующие агенты имеют дополнительное преимущество, служа также в качестве ингибиторов ДНКазы.

Поверхностно-активные вещества включают в себя, например, лаурилсульфат натрия, простой полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и простой полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (Ьее е! а1., СпЬса1 Кеν^еуз ш ТЬегареи!юа1 Эгид Сатег §уз!етз 1991, раде 92); и эмульсии перфторированных химических соединений, таких как РС-43 (ТакаЬазЫ е! а1., 1. РЬагт. РЬагтасо1. 1988., 40, 252-257). Не являющиеся поверхностно-активными веществами агенты включают в себя, например, ненасыщенные циклические мочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазациклоалканона (Ьее е! а1., СгШса1 Ке\ае\уз т ТЬегареиЬса1 Эгид Сатег §уз!етз 1991, раде 92); и нестероидные противовоспалительные агенты, такие как диклофенак-натрий, индометацин и фенилбутазон (УатазЬЬа е! а1., 1. РЬагт. РЬагтасо1. 1987, 39, 621-626).

В данном контексте "соединение-носитель" обозначает нуклеиновую кислоту или ее аналог, которые являются инертными (т.е. не обладают как таковые биологической активностью), но узнаются в качестве нуклеиновой кислоты процессами ш νί\Ό, которые уменьшают биодоступность нуклеиновой кислоты, имеющей биологическую активность, например деградацией биологически активной кислоты или усилением ее удаления из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, обычно с избытком последнего вещества, может приводить к существенному уменьшению количества нуклеиновой кислоты, извлекаемого в печени, почке или других находящихся вне кровотока резервуаров, предположительно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. В отличие от этого соединения-носителя "фармацевтически приемлемый носитель" (эксципиент) является фармацевтически приемлемым растворителем, суспендирующим агентом или любым другим фармакологически инертным носителем для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот животному. Фармацевтически приемлемый носитель может быть жидкостью или твердым веществом и может быть выбран в зависимости от планируемого способа введения таким образом, чтобы обеспечивать желаемую массу, консистенцию и т.д., при комбинировании с нуклеиновой кислотой и другими компонентами конкретной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтически приемлемые носители включают в себя, но не ограничиваются ими, связывающие агенты (например, предварительно желатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксиметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или гидрофосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, диоксид кремния, коллоидальный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); дезинтегрирующие агенты (например, крахмал, натриевый гликолят крахмала и т.д.) или смачивающие агенты (например, лаурилсульфат натрия и т.д.).

Обеспеченные здесь композиции могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, обычно используемые в фармацевтических композициях, при их установленных в данной области уровнях использования. Так, например, эти композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные материалы, такие как, например, противозудные агенты, вяжущие средства, локальные анестетики или противовоспалительные агенты, или могут содержать дополнительные материалы, применимые в физическом приготовлении различных дозированных форм композиции данного изобретения, такие как красители, вкусовые агенты, консерванты, антиоксиданты, вещества, делающие материал непрозрачным, загущающие агенты и стабилизаторы. Однако такие материалы при их добавлении не должны чрезмерно препятствовать биологической активности компонентов обеспеченных здесь композиций.

Независимо от способа, при помощи которого эти олигонуклеотиды вводят пациенту, могут быть использованы коллоидные дисперсионные системы в качестве доставляющих носителей для усиления стабильности ш νί\Ό этих олигонуклеотидов и/или для нацеливания этих олигонуклеотидов на конкретные орган, ткань или тип клеток. Коллоидные дисперсионные системы включают в себя, но не ограничи- 29 029094

ваются ими, макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включающие в себя эмульсии типа масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы, липосомы и комплексы липид:олигонуклеотид ^охарактеризованной структуры. Предпочтительной коллоидной дисперсионной системой является множество липосом. Липосомы являются микроскопическими сферами, имеющими водную центральную часть, окруженную одним или несколькими слоями, приготовленными из липидов, расположенных в бислойной конфигурации (см., в общем виде, СНонн с1 а1., Снггсн! 0р. Вю1ес1т 1995, 6, 698-708).

Антисмысловые полинуклеотиды могут присутствовать, по существу, в изолированной форме. Будет понятно, что этот продукт может быть смешан с носителями или разбавителями, которые не будут мешать предполагаемой цели этого продукта, и все еще рассматриваться как, по существу, изолированный продукт. Продукт может находиться также, по существу, в очищенной форме, и в этом случае он будет обычно содержать 90%, например, по меньшей мере приблизительно 95, 98 или 99% полинуклеотида или сухой массы препарата.

Антисмысловые полинуклеотиды могут вводиться местно (в участке, который должен лечиться). Предпочтительно антисмысловые полинуклеотиды объединены с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем для получения фармацевтической композиции. Подходящие носители и разбавители включают в себя изотонические солевые растворы, например забуференный фосфатом солевой раствор. Эта композиция может быть приготовлена для парентерального, внутримышечного, интрацеребрального, внутривенного, подкожного или трансдермального введения. Поглощение нуклеиновых кислот клетками млекопитающих усиливается несколькими известными способами трансфекции (переноса), например способами, которые используют агенты трансфекции (переноса). Готовая форма, которую вводят, может содержать такие агенты. Примеры этих агентов включают в себя катионные агенты (например, фосфат кальция и ДЭАЭ-декстран) и липофектанты (например, Липофектам™ и Трансфектам™).

В одном аспекте олигонуклеотиды могут требовать сайт-специфической доставки. Они требуют также доставки на протяжении пролонгированного периода времени. Хотя ясно, что период доставки будет зависеть как от участка, в котором должна быть индуцирована отрицательная регуляция, так и терапевтического эффекта, который является желательным, часто будет требоваться непрерывная доставка в течение 24 ч или более. В одном аспекте данного изобретения это достигается включением антисмысловых соединений в готовую форму вместе с фармацевтически приемлемым носителем или переносчиком, в частности, в форме композиции для местного введения. В частности, местные готовые формы, такие как кремы, капли и другие описанные здесь формы, могут быть использованы для регуляции деления и роста эпителиальных базальных клеток (использующие антисмысловые соединения, нацеленные на коннексин 43) и кератинизации наружного слоя (использующие антисмысловые соединения, нацеленные на коннексин 31.1).

Составы для местного введения могут включать в себя трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Могут быть необходимыми или желательными общепринятые фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и т.п. Могут также использоваться презервативы, перчатки с покрытием и т.п. Композиции для перорального введения включают в себя порошки или гранулы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, подушечки или таблетки. Могут быть желательными загустители, вкусовые агенты, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие агенты или связывающие агенты. Композиции для парентерального введения могут включать в себя стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. В некоторых случаях может быть эффективным лечение пациента олигонуклеотидом вместе с другими традиционными терапевтическими способами для увеличения эффективности программы лечения. В данном контексте термин "схема лечения" включает в себя терапевтическую, паллиативную и профилактическую направленности.

Считается, что составление терапевтических композиций и их последующее введение находятся в рамках квалификации специалиста в данной области. Дозировка зависит от тяжести и отвечаемости патологического состояния, подлежащего лечению, причем курс лечения длится от нескольких дней до нескольких месяцев или пока не происходит излечивание или не достигается ослабление этого патологического состояния. Оптимальные дозы и схемы введения могут быть рассчитаны из измерений накопления лекарственного средства в теле пациента. Средний специалист в данной области может легко определить оптимальные дозы, методологии введения доз и частоту повторения доз. Оптимальные дозы могут варьировать в зависимости от относительной эффективности индивидуальных олигонуклеотидов и могут быть обычно оценены на основе ЕС₅₀, обнаруживаемой в качестве эффективной ίη νίίτο и в моделях животных ίη νίνο. Обычно доза равна 0,01-100 мг/кг и может предоставляться один раз или несколько раз в день, в неделю, в месяц или год или даже один раз каждые 2-20 лет. Средний специалист в данной области может легко оценить частоту повторения для введения доз на основе измеренных периодов пребывания и концентраций лекарственного средства в жидкостях или тканях тела. После успешного лечения может быть желательным, чтобы пациент был подвергнут поддерживающей терапии для предупреждения рецидива этого патологического состояния, во время которой олигонуклеотид вводят в поддерживающих дозах в диапазоне 0,01-100 мг/кг массы тела от одного или нескольких раз в день до одно- 30 029094

го раза каждые 20 лет. В лечении или предупреждении состояний, которые требуют модуляции коннексина, подходящим уровнем дозы будет обычно доза приблизительно 0,001-100 мг на кг массы тела пациента, которая может вводиться в единственной дозе или множественных дозах. Предпочтительно этим уровнем дозы будет приблизительно 1-приблизительно 40 мг/кг в день.

Олигонуклеотиды данного изобретения могут быть использованы в диагностике, терапии, профилактике и в качестве реагентов и наборов для исследований. Поскольку олигонуклеотиды данного изобретения гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими коннексин, могут быть разработаны сэндвич-анализы, колориметрические и другие анализы, использующие этот факт. Обеспечение средств для детектирования гибридизации олигонуклеотида с генами или мРНК коннексина может выполняться рутинным образом. Такое обеспечение может включать в себя конъюгацию с ферментами, связывание радиоактивной метки или любые другие подходящие системы детектирования. Могут быть также приготовлены наборы для детектирования присутствия или отсутствия коннексина.

Олигонуклеотиды данного изобретения могут быть также использованы для исследовательских целей. Так, специфическая гибридизация, проявляемая этими олигонуклеотидами, может быть использована для анализов, очисток, получений клеточного продукта и в других методологиях, которые могут быть понятными лицам с обычной квалификаций в данной области.

Примеры коннексинов, на которые может производиться нацеливание в некоторых вариантах осуществления, описанных здесь, включают в себя, но не ограничиваются ими, следующие коннексины.

Коннексин 43 человека, α1 (δΕρ ΙΌ N0:12).

ΕΘΟυδ ΝΜ_000165 линейная мРНК 3088 п.н. ΡΚΙ 26-0СТ-2004.

Определение - белок щелевого контакта Ното §ар1еп§, альфа 1, 43 кДа (коннексин 43) (ΘΙΆ1), мРНК.

1 асаааааадс ХйХасдадд ХаХсадсасХ МХсХйсаХ Хадддддаад дсдХдаддаа

61 адХассааас адсадсддад ХйХааасХХ ХаааХадаса ддХсХдадХд ссХдаасХХд 121 ссййсаХХ ХХасйсаХс сХссааддад йсааХсасХ ХддсдХдасХХсасХасХЙ 181Хаадсаааад адХддХдссс аддсаасаХд ддХдасХдда дсдссХХадд сааасХссХХ 241 дасааддйс аадссХасХс аасХдсХдда дддааддХдХ ддсХдХсадХ асййсай 301 ХХссдааХсс ХдсХдсХддд дасадсддХХ дадХсадссХ ддддадаХда дсадХсХдсс 361 йХсдйдХа асасХсадса ассХддХХдХ дааааХдХс! дсХаХдасаа дХсХХХссса 421 аХсХсХсаХд ХдсдсХХсХд ддХссХдсад аХсаХаХХХд ХдХсХдХасс сасасХсйд 481 ХассХддсХс аХдХдХХсХа ХдХдаХдсда ааддаадада аасХдаасаа дааададдаа 541 даасХсаадд Йдсссааас ХдаХддХдХс ааХдХддаса ХдсасХХдаа дсадайдад 601 аХааадаадХХсаадХасдд Хайдаадад саХддХаадд ХдааааХдсд аддддддХХд 661 сХдсдаассХ асаХсаХсад ХаХссХсХХс аадХсХаХсХИдаддХддс сХХсХХдсХд 721 аХссадХддХ асаХсХаХдд аХХсадсйд адХдсХдХй асасйдсаа аададаХссс 781ХдсссасаХс аддХддасХд йхссХсХсХ сдссссасдд адаааассаХ сХХсаХсаХс 841 ХХсаХдсХдд ХддХдХссХХ ддХдХсосХд дссйдааХа ХсаХХдаасХ сХХсХаХдХХ 901 ХХсХХсаадд дсдХХаадда Хсдддйаад ддааададсд асссйасса ХдсдассадХ 961 ддХдсдсХда дсссХдссаа адасХдХддд ХсХсаааааХ аХдсйаХй сааХддсХдс 1021 ХссХсассаа ссдсХссссХ сХсдссХаХд ХсХссХссХд ддХасаадсХ ддйасХддс 1081 дасадаааса аХХсХХсйд ссдсааХХас аасаадсаад саадХдадса ааасХдддсХ 1141 ааХХасадХд садаасаааа ХсдааХдддд саддсдддаа дсассаХсХс ХаасХсссаХ 1201 дсасадссХХ ХХдаХХХссс сдаХдаХаас садааХХсХа ааааасХадс ХдсХддасаХ 1261 дааХХасадс сасХадссаХ ХдХддассад сдассХХсаа дсададссад садХсдХдсс 1321 адсадсадас сХсддссХда ХдассХддад а!с!ада1ас аддсХХдааа дсаХсаадаХ 1381 ХссасХсааХХдХддадаад ааааааддХд сХдХадааад ХдсассаддХ дйааХХХХд 1441 аХссддХдда ддХддХасХс аасадссйа ХХсаХдаддс йадааааса сааадасай 1501 адааХассХа ддйсасХдд дддХдХаХдд ддХадаХддд Хддададдда ддддаХаада 1561 даддХдсаХд ХХддХаХХХа аадХадХдда йсааадаае ХХадайаХа ааХаададй 1621 ссайаддХд аХасаХадаХ аадддсХХй ХсХссссдса аасассссХа адааХддйс 1681ХдХдХаХдХд ааХдадсддд ХддХаайдХ ддсХаааХаХ ХХйдХХйа ссаадааасХ 1741 даааХаайс Хддссаддаа ХаааХасйс сХдаасаХсХХаддХсйй саасаадааа 1801 аадасададд айдХссйа адХсссХдсХ аааасайсс айдйаааа ХйдсасХй 1861 дааддХаадс ХйсХаддсс ХдасссХсса ддХдХсаахд дасйдХдсХ асХаХайй 1921 ХйаХХсХХд дХаХсадХй аааайсада сааддсссас адааХаадаХ ХйссаХдса 1981 ХйдсаааХа сдХаХаЙсХ ХЙХссаХсс асйдсасаа ХаХсаХХасс аХсасХШХ 2041 саХсайссХ садсХасХас ХсасаХХсаХ йааХддХй сХдХааасаХ ХХХХаадаса 2101 дйдддаХдХ сасХХаасаХ ХййййХ ХдадсХааад ХсадддааХс аадссаХдсХ 2161 ХааХаХЙаа сааХсасХХа ХаХдХдХдХс даададйХд ййдХйдХ саХдХайдд 2221 Хасаадсада ХасадХаХаа асХеасааас асадаХХХда аааХааХдса саХаХддХдХ 2281 ХсааайХда ассХХХсХса ХддаХХХХХд ХддХдХдддс сааХаХддХд ХХХасаХХаХ 2341 аХаайссХд сХдХддсаад Хааадсасас ХХййХйс ХссХааааХд ййХсссХд 2401 ХдХаХссХаХ ХаХддаХасХ ддййдйа аХХаХдаХХс ХХХаХХНсХ сХссХХХЙХ 2461 ХаддаХаХад садХааХдс! аХХасХдааа ХдааХХХссХ хХйсХдааа ХдХааХсай 2521 даХдсХХдаа ХдаХадааХХ ХХадХасХдХ ааасаддсХХ ХадХсаХХаа ХдХдададас 2581 ХХадаааааа ХдсйададХ ддаеХаХХаа аХдХдссХаа аХдааХХХХд садХаасХдд 2641 Хайсйддд ХХЙссХасХ Хаахасасад ХааХХсадаа сХХдХаХХсХ аХХаХдадХХ 2701 ХадсадХсХХ ХХддадХдас садсаасХй даХдХйдса сХаадайй аХйддааХд 2761 саадададдХ Хдааададда ХХеадХадХа сасаХасаас ХааХйаХй даасХаХаХд 2821 ХХдаадасаХ сХассадХЙ сХссаааХдс сХХХХйааа асХсаХсаса даадаХХддХ 2881 дааааХдсХд адХаХдасас ХХйсйсй дсаХдсаХ^ садсХасаХа аасадХХХХд 2941 ХасааХдааа аХХасХааХХ ХдйХдасаХ ХссаХдХХаа асХасддХса Хдйсадсй 3001 сахХдеаХдХ ааХдХадасс ХадХссаХса даХсаХдХдХ ХсХддададХ дХХсХХХаХХ 3061 сааХааадХХ ХХааХХХадХ аХааасаХ

Коннексин 43 человека, α3 (δΕρ ΙΌ N0:13).

ЬОСШ ΝΜ_021954 линейная мРНК 1308 п.н. ΡΚΙ 27-0СТ-2004.

Определение - белок щелевого контакта Ното §ар1еп§, альфа 3, 46 кДа (коннексин 46) (ΘΙΆ3),

- 31 029094

мРНК.

1 а!дддсда<й ддадсШс! дддаадас1с Йадаааа1д сасаддадса сйсасддШ 61 айддсаадд Й1ддс1дас сд!дс1дйс аШйссдса 1сйдд1дс1 дддддссдсд 121 дсддаддасд 1д1ддддсда 1дадсад1са дасйсасс! дсаасассса дсадссдддс 1811дсдадаасд 1с1дс1асда садддссйс ссса!с1ссс асаХссдсЙ с!дддсдс!д 241 садайайй 1сд1д1ссас дсссасссй а!с1асс1дд дссасд1дс! дсаса!сд1д 301 сдсаТддаад адаадаадаа адададддад даддаддадс адсйдаадад адададсссс 361 адссссаадд адссассдса ддасааЬсс 1сд1сдс:ддд асдассдсдд саддд!дсдс 421 а!ддссдддд сдс!дс1дсд дасс1асд!с йсаасаЪса 1сйсаадас дс!дйсдад 481 д!дддсйса 1сдссддсса д1ас1йс1д 1асддсйсд адс!даадсс дс!с!ассдс 541(дсдассдс! ддссс!дссс саасасдд!д дас!дсйса ййссаддсс сасддадаад 601 асса!сйса 1са1сйса1 дс!ддсдд!д дссТдсдсд! ссс1дс1дс( сааса!дс!д 661 дадаШасс асс(дддс1д даадаадсй аадсадддсд 1дассадссд ссХсддсссд 721 дасдссйсд аддссссдс! ддддасадсс дайюсссдс ссс!дссссс садс!сссдд 781 ссдсссдссд Йдсса1сдд дйсссассс 1ас1а1дсдс асассдс!дс дсссс!ддда 841 саддсссдсд ссд!дддс!а ссосддддсс ссдссассад ссдсддасй сааас!дс1а 901 дсссйдассд аддсдсдсдд ааадддссад Кхдссаадс 1с1асаасдд ссассассас 961 с!дс1да1да йдадсадаа с!дддссаас саддсддссд адсддсадсс сссддсдс1с

1021 ааддсйасс сддсадсд1с сасдссЛдса дсссссадсс ссдйддсад садс!ссссд 1081 ссас!сдсдс асдаддс!да ддсдддсдсд дсдсссс!дс 1дс1дда1дд дадсддсадс 1141 адййддадд ддадсдссс! ддсадддасс сссдаддадд аддадсаддс сд!дассасс 1201 дсддсссада 1дсассадсс дсссйдссс сйддадасс садд!сдддс садсааддсс 1261 адсадддсса дсадсдддсд ддссадассд даддасйдд ссаййад

Коннексин 37 человека, α4 (8ЕЦ ΙΌ N0:14).

ЬОСиЗ ΝΜ 002060 линейная мРНК 1601 п.н. ΡΚΙ 26-0СТ-2004.

Определение - белок щелевого контакта Ното §ар1еп§, альфа 4, 37 кДа (коннексин 37) (ΟΙΆ4), мРНК.

1 с1ссддсса1 сдйсссасс 1ссасс!ддд ссдсссдсда ддсадсддас ддаддссддд 61 адссаГддд! дайддддс! 1сс1ддадаа дйдс!ддас садд!ссдад адсас1сдас 121 сд!дд1ддд1 аада!с1ддс 1дасдд1дс1 сйсаййс сдсайсйа 1сс1дддсс1 181 ддссддсдад 1сад1д1ддд дТдасдадса дЮадаШс дад!д1ааса сддсссадсс 241 аддсйдсасс аасдййдс! а!дассаддс сйссссай: йссасайс дс!ас1ддд!

301 дс!дсадйс с1сйсд!са дсасасссас сс!дд!с1ас о1дддсса!д 1сай1асс1 361 дййсддсда даададсддс 1ддсдсадаа ддадддддад йдсдддсас 1дссддссаа 421 ддасссасад д!ддадсддд сдйддссдд саШдадсй сада1ддсса адаййсдд!

481 ддсадаада! дд!сдсс!дс дсайссдсд адсас!да!д ддсассййд 1сдссад1д1 541 дсййдсаад ад!д£дс1ад аддсаддсй сс(с1а!ддс сад!ддсдсс 1д1асддс1д 601 дасса!ддад сссд1дй1д 1д1дссадсд адсасссйдс ссс!асс1сд 1§дас1дсй 661 1д1с1с1сдс сссасддада адасса1сй са1са£сйс а1дйдд!дд йддасйа!

721 с1ссс1дд!§ сйаасс!дс 1ддадйдд1 дсасс!дс1д 1д1сдс1дсс Юадссдддд 781 да!дадддса сддсааддсс аадасдсасс сссдасссад ддсассйс! садасссйа 841 сасддассад ддфсйсйс 1асс1ссссд гддссадддд сссйайсс сасса!дссс

901 сасс!асаа! дддсййса! ссад1дадса даас!дддсс аасс!дасса сададдадад 961 дс!ддсдйй йсаддсссс сййсйсе! ддасссассс сс1садаа1д дссааааасс 1021 сссаад1сд1 сссадсадс! с1дсйс!аа даадсадЛа! дййададдс с1д!ддсйа 10811д1сасссаа сададдддШ с!дадаад1с 1ддс1дсс1д дда!дссссс 1дссссс1сс 1141 1ддааддс1с 1дсадада1д ас!дддс1д§ ддаадсада! дсйдйддс са!ддадсс1 1201 сайдсаад! гдйсйдаа сасс1даддс сйсс1д!дд сссассаддс ас!асддсй 1261 ссййссада 1д1дсй1дс с!дадсасад асад!садса 1ддаа1дс1с Йддссаадд 1321 д1ас£ддддс сс!с1ддсс! Й1дсадс1д а!ссададда асссададсс аасйасссс 1381 аассйассс 1аХддаасад 1сасс1дйдс дсаддйдй: с!сааассс! с1сс1сасад 1441 дааааддсдд айдаддс!д с!ддд1садо сйдаЮдса садасададс йд!дссдда 1501 Й1ддссс1д (сааддддас 1дд1дссйд ййса!сас 1ссйсс1ад йс!ас1дй 1561 саадсйс!д ааайтасад дасйдаШа сааааааааа а

Коннексин 40 человека, α5 (8ЕЦ ΙΌ N0:15).

Ь0Си8 NΜ 005266 линейная мРНК 2574 п.н. ΡΚΙ 27-ОСТ-2004.

Определение - белок щелевого контакта Ното §ар1еп§, альфа 5, 40 кДа (коннексин 40) (ΟΙΆ5), вариант А транскрипта, мРНК.

1 дсааааадсд 1дддсадйд дадаадаадс адссададйд 1даадаадсс сасддаадда 61 аад!ссадд§ аддаддаааа даадсадаад ййддса!с 1дйссс1д§ с!д1дссаа§

121 а!дддсдай ддадсйсс! дддаааШс с!ддаддаад (аеаеаадса с1сдассд!д 181 дЛаддсаадд 1с1ддс1сас 1§1сс1сйс а1айсс§1а 1дс1сд1дс1 дддсасадс!

241 дс!да§1сй сс!дддддда [дадсаддс! даШссдд! д!да!асда1 Шадсйддс 3011дссадаа1д ййдсйюда ссаддсЙЮ сссаСс1ссс асайсдсЛа с1ддд1дс!§

361 сада1са1с1 Юдййссас дссс!с1с1д д!д1аса1:дд дссасдсса! дсасас1д£д 421 сдса1дса@д адаадсдсаа дсйюдддад дссдададдд ссааададд! ссддддсйй 481 ддс1сйасд адШсссдд! ддсададаад дсадаас£д! сс1дс1ддда ддаадддаа!

541 ддааддайд сссйсаддд сас1с1дс1с аасасс!а!д 1д1дсадса1 сс!да1ссдс

- 32 029094

601 ассассаТдд аддТдддсй сайд1дддс сад!асйса ййасддаа! сйсс!дасс 661 ассс!дса1д ййдссдсад дад1:ссс1д! ссссасссдд 1саас1дйа сдШсссдд 721 сссасадада адаа!д1сй сайЦсй! а!дс1ддс!д 1ддс1дсас1 §1ссс1сс1с 781 сйадсЛдд с!даас1с!а ссасЛдддс (ддаадаадайадасадсд аШдйааа 841 ссдсддсадс аса!ддс!аа д1дссадсй йЛддсссс! с1д1дддса! ад!ссададс 901 [дсасассас сссссдасй 1аа1сад1дс с!ддадаа!д дссс1ддддд аааайсйс 961 аайюсйса дсаа!аа!а1 д§сс!сссаа саааасасад асаасс1дд! сассдадсаа 1021 д(асдадд1с аддадсадас 1сс1ддддаа ддй1сайс аддйсдйа (ддссадаад 1081 сс!дадд1дс ссаа1ддад1 сйассадд! сассдсейс ссса!ддс!а 1са1ад1дас 1141 аадсдасдйс йадХааддс садсадсаад дсаадд!сад а(дассШс ад!д!дассс 1201 1ссй1а1дд дадда!садд ассадд!ддд аасаааддад дйсададаа дааадасд!д 1261 (сссййда айда!дсй 1с1сас1д1с айайдсй ддс1ссШд адссссддд!

1321 с!саа!дасд йдйсайа аййадааа сШаассад ддййддда ТадСаадада 1381 дд1дасаасс сасссадай дсадйссй ссссассйс 1асссад1а1 асдаадссй 1441 1садайай саХдааасад ддйдаддда аадаадддаа дса!ддсааа адс4ддсс(д 1501 дааддда!ад ссададдда! адааТдайс 1с1с1с1аса 1ассадсадс а!ассааа!д 1561 сдйййаа дйссТассх ссйдасйд айасссйс с!сс1ссаад даададсйа 1621 аадйсссад ссаа!адаса дса1даа!са аддаасйдс айаШд£д йсйдаа1с 1681 (дйдййсс а!ддассай сс!сддад1а д!дд!дада! ддссйддд! (дсссйддс

1741 Йс1сс1ссс Шайсадс сйааааадд дсйсйдда асШассад садсс1садс 1801 Шасааагд ссйддШд (асййддс аааХдсссса ссйдд!да£ дйдсаасй 1861 йссййдс 1аддд1д1ас асс!адсс1д 1дсадд[дгс адсссХдсХа дддад!сай 1921 дйсасасаа аййайдд аайсйдсс ааса!с1д1с ассс1дсадс йсШасад 1981 йсаагссаа 1да1адааас са&ссйсс йййссй 1ддйдйса сссадссай 2041 ссйдааддс сйассааса ддааШсса адаадйдй д(сссййс §аассс1дас 2101 сада(са1са дссайдадд ссад!ддаа{ йссссаддс сйдйаааа сааадааадс 2161 айдйсйс (садайссс сйд!ддааа аааааайй дйд1даада 1даааа1ааа 2221 аа!ддадада ааасайдда ааасШЙЙ сссйсйа! йасйссй (дйдайдс 2281 саасйадХд ссаададдад д!д1да1дас адсШддад дсссссада! с1с!с1с1сс 2341 1ддаддйй адсаддддса аддааа!ад! аддддаайТ ссадс!с!с11ддсадддсс 2401 ШаШааа дадсдсадад айсс!а1дХ сйсс1ад1д сссйаа!да дайдссаад 24611дддддс1д1 адаааадссйдссйсссс адддайддс йдд1йй§ 1айсайд§

2521 а!сса1аа1д ддйдс!дй дййдда!д аадд!ааасд йдсйддаа йдд

Коннексин 45 человека, α7 (ЗΕ^ ΙΌ ΝΟ:16).

ЬОСиЗ ΝΜ_005497 линейная мРНК 1191 п.н. РМ 23-ОСТ-2003.

Определение - белок щелевого контакта Нοтο барюнб. альфа 7, 45 кДа (коннексин 45) (О1А7), мРНК.

1 а1да§йдда дйййдас (сдсйдйа даддадайс асаассайс сасаЙ1д1д

61 дддаадайй ддс!сас1д1 1с1дайд1с йссдда!сд (ссйасадс 1д1аддадда 121 даайюайй айасда!да дсааадсааа Шд1д1дса асасадааса дссдддйд!

181 дадаа!дХй дйа!да!дс дШдсасй ййссса1д (асдсййд ддбдйссад 241 а!са1сйдд (ддсаайсс ййд!да!д 1асйдддй а!дйа1сса саадайдсс 301 аааа1ддадс асдд!даадс адасаадаад дсадс!сдда дсаадссйа 1дсаа1дсдс 361 (ддааасаас ассдддйй ддаадааасд даддаддаса асдаададда 1ссШда1д 421 1а1ссадада (ддадйада аа§1да(:аа§ даааа!ааад адсададсса асссааасй 481 аадса!да!д дсодасдасд дайсдддаа да!дддс1са 1даааа(йа 1д1дйдсад

541 йдйддсаа ддассд!дй 1дадд[ддд1 ШйдаТад ддсадййй 1йдййддс 601 йссаад!сс асссдййа 1д1д1дсадс адасйссй д1сйса!аа да1адас1дс 661 ШаШйа дасссайда ааадассай йссййда 1аа1д1а1дд (дйасаддс 721 ййдсйй 1дсйааса1 йдддада!д сйсаШад ддШдддас сайсдадас 781(сайаааса д1ааааддад ддаасйдад да(ссддд1д сйа!аайа ГссШсас!

8411ддаа1асас саййдйсс ссйддйа! аасайдйд йааассада йааайсад 901 Шсассдаас 1д1ссаа1дс СаадаСсдсс (асаадсааа асааддссаа сасадсссад 961 даасадсад! а!ддсадсса (даддадаас с!сссадс1д асйддаддс ййдсадсдд 1021 дада!садда (ддйсадда асдойдда! с!ддсадйс аддсйасад йассаааас 1081 аасссйа1д дСссссддда даадааддсс ааад1дддд£ ссааадйдд д!ссаасааа 1141 адсайдсса д!адсааа!с адддда!ддд аадааййд {йддайХа а

Коннексин 50 человека, α8 (ЗΕ^ ΙΌ ΝΟ:17).

ЬОСиЗ ΝΜ 005267 линейная мРНК 1362 п.н. РМ 26-ОСТ-2004.

Определение - белок щелевого контакта Нοтο барщин альфа 8, 50 кДа (коннексин 50) (О1А8), мРНК.

- 33 029094

1 адсдссаада дадааададс аса(аШсГ ссдГдддаса с!ссйд1а11дд1ддд1да

61 дааа!д§дсд ас1ддадй! сс!ддддаас а!сйддадд адд1даа!да дсасйхасс 121 д!са1сддса §ад!с1ддс1 сассдГдсй йса!сйсс дда!сс1са1 ссйддсасд 181 дссдсадад! 1сд1д1дддд ддафадсаа Юсдасйсд 1д1дсаасас ссадсадсс!

241 ддс!дсдада асд[с1дс1а сдасдаддсс Шсссайй сссасайсд сс!с1ддд!д 301 сфсадаГса 1сйсдКйс сассссдГсс с!да1д1асд 1ддд§сасдс дд!дсас!ас 361 дГссдсаГдд аддадаадсд саааадссдс дасдаддадс 1дддссадса ддсддддасг 421 аасддсддсс сддассаддд садсдТсаад аададсадсд дсадоааадд сас!аадаад 481 йссддсГдд аддддассс! дс!даддасс 1асаШдсс аса!са1сй саадасссБс 541 й1даад!дд дсйсаГсд! дддссасГас Йсс1д1асд ддйссдда! сс1дсс1с1д 6011ассдс1дса дссдд!ддсс с!дссссаа1 д!дд1дда.с1 дсйсд1д1с ссддсссасд 661 дадаааасса 1сйса1сс1 дйса!дйд 1с1д1ддсс1 с!д1д1ссс1 айсскаас 721 д!да1ддад! 1§адссасс1 дддссГдаад ддда!ссдд! с!дссйдаа даддсс!д1а 781 дадсадсссо 1дддддада11сс1дадааа 1ссс1ссас1 ссайдс!д! с!сс1сса1с 841 садааадсса адддс!а!са дсйсТадаа даададаааа ГсдШссса сГайХсссс 901 йдассдадд йдддаГдд! ддадассадс ссас1дсс;1д ссаадссй! сааШадйс 961 даддадаада (садсасадд асссс!дддд дасйдйсс ддддс!асса ададасас!д 1021 ссйсс!асд с!садд(ддд ддсасаадаа д!ддадддсд аддддссдсс Бдсададдад 1081 ддадссдаас ссдадд[ддд ададаадаад даддаадсад ададдс!дас сасддаддад 1141 саддадаадд 1ддссд1дсс ададддддад ааад1адада сссссддад! ддаБааддад 1201 ддГдааааад аададссдса д!сддадаад д!д!сааадс аадддс1дсс адсГдадаад 1261 асассйсас 1с1д1ссада дс!дасааса да!да1дсса дасссс!дад саддс!аадс 1321 ааадссадса дссдадссад дйадасда! с1аассд!а! да

Коннексин 36 человека, α9, γ1 (8Е^ ΙΌ NΟ: 18) ЬОСИ8 ΝΜ_020660 линейная мРНК 956 п.н. РК1 03-8ЕР-2004.

Определение - коннексин-36 Ното кар1епк (СХ36), мРНК.

1 аТдддддаа! §§асса1сД §да§а§дс!§ стадаадссд сддБдсадса §сас!ссас1

61 а1ед1с§даа д@а!сс1дй дас1@1д§1:§ а!да1сйсс дда1сс1са! 1д1§дссай 121 дГдддддада с§д1д!асда ГдаГдадсад ассаХдШд 1д1дсаасас ссйдсадссс 181 ддс!д!аасс аддссГдсБа 1дассдддсс йссссаЮ!: сссасагасд Йас1ддд1с 241 йссадаГса 1аа1дд1д1;д Басссссад! сЙХдсйса 1сасс1ас1с 1д1дсассад 301 Гссдссаадс адсдадаасд ссдсБасШ асадШсс 1адссс1дда сададасссс 361 ссХдадГсса 1аддадд1сс Бддаддаас! дддддБдддд дсад!дд!дд дддсааасда 421 даадаГаада адйдсаааа 1дс1айд1:д ааБддддГдс 1дсадаасас ададаасасс 481 ад!ааддада сададссада йдИадад дйааддадс 1дас1ссаса ссса!садд!

541 сТасдсасБд саГсааааЮ саадсйсада аддсаддаад дса!с1сссд сйс!асай 601 а!ссаад1дд Гдйссдааа 1дссс1ддаа айдддйсс Гддйддсса аГаййсю 6611а1ддсШа д!д!сссадд дйд!а!дад 1§1аассдс1 ассссБдса! сааддадд!д 721 дааБдШд 1д1сссддсс аас!дадаад ас1д1сГЙс 1ад1д«са1 дШдс1д1а 781 аетддсаШ д!дйд1дс1 саассГддс! даас!саасс асс!ддда1д дсдсаада(с 841 аадсхддсйд гдсдаддддс Бсаддсоаад адааад1саа юШдада! 1сд1аасаад 901 дассГдссаа ддд1сад1д! 1сссааШ1 §§саддас1с ад!ссад!да сййдссШ 961 д!д1да

Коннексин 59/58 человека, α10 (8Е^ ΙΌ NΟ:19).

I .ОП '8 ΝΜ_030772 линейная мРНК 1901 п.н. РК1 27-ОСТ-2004.

Определение - белок щелевого контакта Ното кар1епк, альфа 10, 59 кДа (О1А10), мРНК.

1 садддадйд Бддйдсаас ас!д1ас1сс адсс!дддса асададддад ас!с1д1с(с

61 аасааасааа сааасааада ааааасссса садс!а1:с1а дддааааад! ааадсаасса 121 дса!а1адаа §1§аса1ай дйаБайй сассаГадд! йдсШаад ааа1ад!дс1 181 сссйсадаа 1ддаадаай 1а1с1дсс1с йаШдаГд 1дда1садад с!аада!ддс 241 1дас1ааа1а ааса!ддддд ас1ддаа!с! ссйддада! ас!с!ддадд аадйсасаГ 301 ссасЮсасс а!дайддаа ада1с!ддс1 сассаГссБд йса1аШс даа!дсйдС 361 1с1ддд1д1а дсадс!даад а!дЫддаа 1да1дадсад ййддсйса 1с1дсаа1ас 421 адаасаасса ддсйдсадаа а!д!а1дс1а сдассаддсс 1йсс1а1с1 ссс1сайад 481 аТасгдддй с1дсадд!да 1аШд1д1с йсасса!сс с1дд!с1аса 1дддсса1дс 541 айдГассда сГдададйс Йдаддаада даддсааадд а!дааадс!с адйаадад!

601 адаасТддад даддШдад! йдааа!дсс 1аддда1сдд аддадайдд адоаададс!

661 йдСсадсБд дадаааадда аас!ааа1аа адс!ссас1с ададдаасс! ГдсШдсас 721 йа1д!да!а сасаййса с1сдс1с1д1 ддйдаадй ддаИса!да йддасадГа 781 ссййаШ ддайХсас! 1ададссдс1 аЮаадГдс саГддссасс сд1д1ссааа 841 1а1аа1сдас 1дййдйй саадассаас адаааадаса аШ1сс1а!1ай1а1дса 901 ай&йадсс ас1ай1сас ййсйааа сайсйдаа аййссасс Гаддййаа 961 ааадайааа ададддсШ §дддаааа!а саадйдаад ааддааса!а аБдаайсса

1021 Гдсааасаад дсаааасааа а!д!адссаа а!ассададс асаййдсаа айсасГдаа 1081 дсдасБссс! 1с1дсссс1д айаБаайй дйадГддаа аадсааасас асас!дсад!

1141 §1ассс1ад1 йааайса! сйсМай ссадссааа! сс1дасаа1с а1ад1д1ааа 1201 ГдаГдадааа Бдсаййдд аГдаасадда аас£д!асй 1с1аа1дада Шссасас!

1261 1ад1ас1ад11д1ад1сай йсаасаса! садйсааас ааГаасааад асас1са!аа 1321 ааГаШдда ааадаасйа аГдд/аасса §йаа!ддаа аааададааа с!дааддсаа 1381 адасадсааа аддаас1ас! асййададд Юассдйс! айссадд!д йдсШБада 14411дда@адаас аасаБдаддс ад!сасссса аасадПИс Юсйдссад с!аас!дсда 1501 йддааассд сдд!ддсйа §адс!аса1д дддйссйй асадаасаСд аааассдддд 1561 д1сасс1сс! ааадд!аасс 1саадддсса дйсадааад ддсасадЕа даасссйсс 1621 Кхйсасаа ддадайс1с ааБсасйда сайссааас ас!дс1даГ1 сЩдддадд 1681 дс1д1сс!й дадссаддд! 1дд1;садаас С1д1аа1аа1 сс1дШд!с с1ссааа!са 1741 сд!ад!д1сс сБаасдааса а1с1сайд§ 1аддсдддй сссасадаЮ Йсада1с1а 1801 аасадсддй ддсПйада сайаГаШ айахсадад аад!адсс1а д!дд1сд1дд 1861 ддсасадааа ааа!ада!ад дддсадсйД ааадассадс ΐ

Коннексин 46,6/47, α12 (8Е^ ΙΌ ^:20).

ЬОСИ8 ΛΥ285161 линейная мРНК 1311 п.н. РК1 19-ΜΛΥ-2003.

Определение - мРНК коннексина 47 Ното кар1епк, полная кодирующая последовательность.

- 34 029094

1 аХдадсХдда дсйссХдас дсддсХдсХд даддадаХсс асаассасХс сассйсдХд

61 ддсааддХдХ ддсХсасддХ дсХддХддХс йссдсаХсд ХдсХдасддс ХдХдддсддс 121 даддссаХсХ асХсддасда дсаддссаад йсасйдса асасдсддса дссаддсХдс 181 дасаасдХсХ дсХаХдасдс сйсдсдссс сХд1с§сасд ХдсдсйсХд ддХсйссад 241 айдХддХса ХсХссасдсс сХсддХсаХд ХассХдддсХ асдссдХдса ссдссХддсс 301 сдХдсдХсХд адсаддадсд дсдссдсдсс сХссдссдсс дсссддддсс асдссдсдсд 361 ссссдадсдс асс!§ссдсс сссдсасдсс ддсХддссХд адсссдссда ссХдддсдад 421 даддадссса 1§сСдд§ссХ дддсдаддад даддаддадд аддадасддд ддсадссдад 481 ддсдссддсд аддаадсдда ддаддсаддс дсддаддадд сдХдсасХаа ддсддХсддс 541 дсХдасддса аддсддсадд дассссдддс ссдассдддс аасасдаХдд дсддаддсдс

601 аХссадсддд адддссХдаХ дсдсдХдХас дХддсссадс ХддХддссад ддсадсХйс 661 даддХддсс! ХссХддХддд ссадХассХд с1дХасддс{ 1сдадд(.дсд ассдХХсйХ 721 сссХдсадсс дссадсссХд сссдсасдХд дХддасХдсХХсдхд1сдсд сссХасХдаа 781 аадасддХсХ ХссХдсХддХ СаХдХасдХд дХсадсХдсс ХдХдссХдсХ дсХсаассХс 841ХдХдадаХдд сссассХддд сйдддсадс дсдсаддасд сддХдсдсдд ссдссдсддс 901 сссссддссХ ссдсссссдс ссссдсдссд сддсссссдс ссХдсдссй сссХдсддсд 961 дссдеХддсХХддссХдссс дсссдасхас адссхддХдд Хдсдддсддс сдадсдсдсХ 1021 сдддсдсаХд ассадаассХ ддсааассХд доссХдсадд сдсХдсдсда сддддсадсд 1081 дсХддддасс дсдассддда садйсдссд ХдсдХсддсс ХсссХдсддс сХсссддддд 1141 ссссссадад саддсдсссс сдсдХсссдд асдддсадХд сХассХсХдс дддсасХдХс 1201 ддддадсадд дссддсссдд сасссасдад сддссаддад ссаадсссад ддсХддсХсс 1261 дадаадддса удссадсад садддасддд аадассассд ХдХддаХсХд а

Коннексин 32 человека, β31 (8Εβ ΙΌ Ν0:21).

Ь0СИ8 ВС039198 линейная мРНК 1588 п.н. ΡΚΙ 07-0СТ-2003.

Определение - белок щелевого контакта Ното §ар1еп§, бета 1, 32 кДа (коннексин 32, невропатия Шарко-Мари-Тута, Х-связанная) (ΟΙΆ7), мРНК (кДНК-клон МОС:22506 ΙΜΆΘΕ:4710239), полная кодирующая последовательность.

1 адасайсХс Хдддаааддд садсадсадс саддХдХддс адХдасаддд аддХдХдаа!

61 даддеаддаХ даасХддаса @дДХ§1аса ссйдсХсад ХддсдХдаас сддсайсХа 121 сХдссайдд ссдадХаХдд сХсХсддХса ХсйсаХсй садааХсаХд дХдсХддХдд 181ХддсХдсада £&&&$£% ддХдаХдада ааХсйссй саХсХдсаас асасХссадс 241 сХддсХдсаа садсдйХдс ХаХдассааХ ХсЙссссаХ сХсссаХдХд сддсХдХддХ 301 сссХдсадсХ саХссХадй Хссассссад сХсХссХсдХ ддссаХдсас дХддсХсасс 361 адсаасасаХ ададаадааа аХдсХасддс йдадддссаХддддасссс сХасассХдд

421 аддаддХдаа даддсасаад дХссасаХсХ садддасасХ дХддХддасс ХаХдХсаХса 481 дсдХддХдй ссддсхдйд Хйдаддссд ХсйсаХдХа ХдХсХхйаХ сХдсХсХасс 541 сХддсХаХдс саХддХдсдд сХддХсаадХ дсдасдХсХа ссссХдсссс аасасадХдд 601 асХдсйсдХ дХсссдсссс ассдадаааа ссдХсйсас сдХсЙсаХд сХадсХдссХ 661 сХддсаХсХд саХсаХссХс ааХдхддссд аддХддХдХа ссХсаХсаХс сдддссХдХд 721 сссдссдадс ссадсдссдс ХссааХссас сйсссдсаа дддсхсдддс йсддссасс 781 дссюхсасс ХдааХасаад садааХдада ХсаасаадсХ дсХдадХдад саддаХддсХ 841 сссХдааада саХасХдсдс сдсадсссХд дсассддддс ХдддсХддсХ даааададсд 901 ассдсХдсХс ддссХдсХда ХдссасаХас саддсаассХ сссаХсссас ссссдасссХ 961 дсссХдддсд адссссХссХ ХсХссссХдс сддХдсасад дссХсХдссХ дсХддддай 1021 асХсдаХсаа аассйссй ссс!ддс1ас йсссйссХ сссддддссХ Хссййдад 1081 дадсХддадд ддХддддадс Хададдссас сХаХдссадХ дсХсааддй асХдддадХд 1141 ХдддсХдссс йдйдссХд сасссйссс хсйсссХсХ сссХсХсХсХ дддассасХд 1201 ддХасаадад аХдддаХдсХ ссдасадсдХ сХссаайа! дааасХааХс йаасссХдХ 1261 дсХдХсадаХ асссХдХйс ХддадХсаса ХсадХдадда дддаХдХддд Хаададдадс 1321 ададддсадд ддХдсХдХдд асаХдХдддХ ддадааддда дддХддссад сасХадХааа 1381 ддаддааХад ХдсйдсХдд ссасааддаа ааддаддадд ХдХсХддддХ дадддадХХа 1441 дддададада адсаддсада Хаадйддад саддддйдд Хсааддссас сХсХдссХсХ 1501 адХссссаад дссХсХсХсХ дссХдаааХд ХХасасайа аасаддайХ Хасадсаааа 1561 аааааааааа аааааааааа аааааааа

Коннексин 26 человека, β2 (8Εβ ΙΌ Ν0:22).

Ь0Си8 ΝΜ_004004 линейная мРНК 2263 п.н. ΡΚΙ 28-0СТ-2004.

Определение - белок щелевого контакта Ното §ар1еп§, бета 2, 26 кДа (коннексин 26) (О1В2), мРНК.

- 35 029094

1 сддадсссс! сддсддсдсс сддсссадда сссдссХадд адсдсаддад ссссадсдса 61 дадассссаа сдссдадасс срсдссссдд ссссдссдсд сйсс£сссд асдсададса 121 аассдсссад ад!адаада£ ддайддддс асдсЛдсада сда!сс1ддд ддд!д£даас 181 аааеасйса ссадсайдд ааадаййдд с1сассд1сс ййсайй йдсайагд 241 айсГсдйд £ддс£дсааа ддадд£д!дд ддада!дадс аддссдасй £дййдсаас 301 ассс£дсадс саддс!дсаа дааед1д1дс 1ас§а1сас1 асйсссса! с!сссаса1с 361 сддс1а1д§д ссс£дсадс! даййсдХд Хссасдссад сдс!сс1а§1 ддсса!дсас 421 £1§§сс1асс ддадасаТда даадаададд аадйса!са адддддада! ааадад!даа 481 Шааддаса Гсдаддада! саааасссад ааддйсдса 1сдааддс1с сс1д!дд!дд 541 асс!асасаа дсадсайй сйссдддй а1сйсдаад ссдссйса! д£асд1сйс 6011а1д1са1д1 асдасддсй с1сса!дсад сддс!дд1да ад!дсаасдс сЛддссйд!

661 сссаасас!д 1ддас1дсй 1д1д1ессдд сесасддада адас!д!сй сасад£дйс 721 а£дайдсад 1д1с1ддаа1 йдса!сс!д с!даа1д1са с!даайд1д йаШдс!а 781 айадатай дйсТдддаа дТсаааааад ссадйТаас дсайдссса дйдйадаТ 841 ТаадаааТад асадсаТдад адддаТдадд саасссдТдс ТсадсТдТса аддсТсадТс 901 дссадсаШ сссаасасаа адайсТдас сйаааТдс-а аесаШдаа ассссТдТад 961 дссТсаддТд ааасТссада ТдссасааТд дадсТсТдсТ ссссТааадс сТсаааасаа

1021 аддссТаай сТаТдссТдТ сйааййс Щсасйаа дйадйсса сТдадасссс 1081 аддсТдйад дддйайдд ТдТааддТас йТсаТай!Тааасададд аТаТсддсаТ 1141 йдйййй сТсТдаддас аададааааа адссаддйс сасададдас асададаадд 1201 йТдддТдТс сТссТддддТ ТсТййдсс аасйХсссс асдйааадд Тдаасайдд 1261 йсйТсай ТдсйТддаа дййааТсТ сТаасадТдд асааадйас садТдссйа

1321 аасТсТдйа сасШйдд аадТдаааас ТйдТадТаТ даТаддйаТ йТдаТдТаа 1381 адаТдйеТд даТассайа ТаТдЙсссс сТдйТсада ддсТсадай дТааТаТдТа 1441 ааТддТаТдТ сайсдсТас ШдаМаа ЙТдаааТаТ ддТсййдд йаТдааТас 1501 Шдсадсас адсТдададд сТдййдйд 1айсайдТ ддТсаТадса ссТаасааса 1561 йдТадссТс ааТсдадТда дасадасТад аадйссТад ТдаТддсЙа ТдаШдсааа 1621ТддссТсаТд ТсаааТайТ адаГдТаай йдТдТаада ааТасадасТ ддаТдТасса 1681 ссаасТасТа ссТдТааТда саддссТдТс саасасаТсТ сссййсса ТдасТдТддТ 1741 адссадсаТс ддааадаасд сТдаШааа даддТсдсй дддааййа йдасасадТ 1801 ассаШааТ ддддаддаса аааТддддса ддддадддад аадТйсТдТ сдйааааас 1861 адаШддаа адасТддасТ сТаааЙсТд йдайааад аТдадсШд ТсТасйсаа 1921 аадШдШ дсйассссТ ТсадссТсса айййаад 1дааааТа1а ас1ааТааса 1981ТдТдаааада аТадаадсТа аддШадаТ ааа!айда§ садаТсТаТа ддаадайда 2041 ассТдааТаТ Тдссайа£д сЙдасаТдд Шссааааа а£ддТасТсс асаТасЙса 2101 дТдадддТаа §1аййес1 дйдТсаада аТадсайдТ аааадсаШ ТдТааТааТа 2161 аадааТадс! йааТдаТаТ дсйд1аас£ ааааТааШ ТдТаа1д1аТ саааТасай 2221 Таааасайа аааТаТааТс Тс1аТаа£аа аааааааааа ааа

Коннексин 31 человека, β3 (8Е^ ГО ΝΟ:23).

ШСи8 ΝΜ 024009 линейная мРНК 2220 п.н. РШ 28-ΟσΓ-2003.

Определение - белок щелевого контакта Ното §ар1еп§, бета 3, 31 кДа (коннексин 31) (С1В3), вариант 1 транскрипта, мРНК.

1 даасйсШ ссТддсасад дасТсас1§1 дссссйссс дс!д1ддд1а сааддййдс

61 сссссасссс адсТсТссаа адсссассдд сс1ссс!дда ддссдаддТс дасддсссд!

121 сдсассддда д§ддд§дс1с ссадддд!дс сссасдсасд дТсааддЮс сдсдссаадс 181 ддддассддд сТдддссдда адсдддсасд дТасЮдсдд сааасТадсд £дддсдадТс 241 стдайдсад ТсддассТдс сдссдсддса сйаасадй ТдсададСдс йссодсссс 301ТдаТс£сай ддадссйод дасадсссад сссаТддсса ссдаТдсссс сайХсасдс 361 сТдаддаадс ддаддс!сад асдддссасс адссссЮсд даддс£ддсс сдддадсдсс 421 ТддсадсдТс дддТсТадда дссддсТссс ТссТдсй:сс ТссТссдсдс сдсссддддТ 481 дХдсссдссд КЛдТдТдса ссас1дс!да дсссадс1:сс ддсдсссйд ссййдсТдТ 541 дддсоссддд дасдсдддд! саддссассд сдйддссад дссдсТдсад дТаддсасдд 601 сссссассад дсдссаТдда сТддаадаса сТссаддссс ТасТдадсдд ТдТдаасаад 661йкйссасад сдйсдддсд саййддсТд 1ссдТдд1д£ТсдТсйссд дд1дс£ддТа 721 1асдТдд1дд сТдсададсд сд£д£ддддд да£дадсада аддасШда Шдсаасасс 781 аадсадсссд дсТдсассаа сдййдсТас дасаасТас! ТссссаТсТс саасаТссдс 841 сййдддссс ТдсадсТсаТ сйсдШаса ТдссссТсдс ТдсТддТсаТ ссТдсасдТд 901 дссТассдТд аддадсддда дсдссддсас сдссадааас асддддасса дТдсдссаад 961 сТдТасдаса асдсаддсаа даадсасдда ддссТдТдд! ддассШссТ дйсадссТс 1021 аХсЙсаадс 1са1сайда дйссИсйс сШассХдс 1дсасасйй с£ддса£ддс 1081 йсаа!а!дс сдсдсс1дд! дсад{д1дсс аасдТддссс сс1дссссаа са!сд1ддас 11411дс1асайд сссдассйас сдадаадааа а!сйсасс! асйса!дд{ дддсдсс!сс 1201 дседййдса 1сд1ае1сас са!с(д1дад сйСдс!асе 1са1с(дсса саддд!сс£д 1261 сдаддсс^дс асааддасаа дсс!сдаддд ддйдеадсс сс1сд1сс1:с едссадссда 1321 дсйссасс! дссдс1дсса ссасаадсГд д!ддаддс!д дддадд!дда йсадассса 1381 ддсаа1ааса адс!§саддс йоадсаесс аасс1дасос ссаййдасс асадддсадд 1441 дд!ддддсаа са£дсдддс£ дссаа£ддда са!дсадддс ддХ^ддсад д!ддададд£

1501 сс!асаддд§ с£дад!дасс ссас1с£дад йсас£аад11а£дсаасЙ £сдййддс

1561 ада£аП1й £дасас£ддд аас£дддс£д ййадссддд 1а1адд1аас есасаддссс 1621 ад£дссадсс сТсаааддас а!адасй£д ааасаадсда айаасййс 1асдс1дсс£

1681 дсааддддсс асйадддса с1дс!адсад ддсйсаасс аддааддда! саасссадда 1741 аддда£да!с аддададдсХ 1ссс£дадда са1аа£д1д£ аадададд£д адаад£дс£с 1801 ссаадсадас асаасадсад сасададд1с £ддаддссас асааааад!д а£дс!сдссс 1861 1дддс1адсс 1садсадасс 1ааддса1с1 с£ас1ссс1с сададдадсс дсссадайс 1921 с£дсад!дда даддадд!с£ Юсадсадса дсадд£с£дд адддс!дада а£даасс1да 1981 с£ададдйс ХддадаШсс сададдйхс ссадд£са!с асйддс!са д!ддаадссс 2041 (сйХсссса аа£сс£ас!с сс1садсс£с аддсад£дд£ дсйзссайй £сс1ссссас 2101 аас£дг§с1с аддс!дд£дс садссйХса дассс£дс!с ссадддасй ддд£дда!дс 2161 §с£да!адаа са£сс!саа§ аса^Дйсс! 1дааа£саа1 ааа!ас£дхд ййа£аааа

Коннексин 30,3 человека, β4 (8Е^ ГО ΝΟ:24).

ШСи8 ΝΜ 153212 линейная мРНК 1243 п.н. РШ 27ГОСТ-2004.

Определение - белок щелевого контакта Ното §ар1еп§, бета 4, (коннексин 30,3) (С1В4), мРНК.

- 36 029094

1 сааддскссс ааддсскдад кдддсаддка дсасссаддк акадассйс сасдкдсадс 61 асссаддаса садссадсак дааскдддса йкскдсадд дсскдскдад кддсдкдаас 121 аадкасксса садкдскдад ссдсакскдд скдкскдкдд кдйсаксй ксдкдкдскд 181 дкдкасдкдд кддсадсдда ддаддкдкдд дасдакдадс адааддасй кдкскдсаас 241 ассаадсадс ссддскдссс саасдкскдс какдасдадк ксйссссдк дксесасдкд 301 сдсскскддд ссскасадск саксскддкс асдкдсссск саскдсксдк ддксакдсас

361 дкддсскасс дсдаддаасд сдадсдсаад сассасскда аасасдддсс саакдссссд 421кссскдкасд асаасскдад саадаадсдд ддсддаскдк ддкддасдка сйдскдадс 481 сксаксйса аддссдссдк ддакдскддс кксскскака ксккссассд сскскасаад 541 дайакдаса кдссссдсдк ддкддсскдс кссдкддадс сйдссссса саскдкддас 601кдйасакск сссддсссас ддадаадаад дкскксасск асйсакддк дассасадск 661 дссакскдса ксскдсксаа ссксадкдаа дксйскасс кддкдддсаа даддкдсакд 721 дадаксйсд дссссаддса ссддсддсск сддкдссддд аакдсскасс сдакасдкдс 781 ссассакакд ксскскссса дддадддсас сскдаддакд ддааскскдк сскаакдаад 841 дскдддксдд ссссадкдда кдсаддкддд какссакаас скдсдадакс адсадакаад 901 аксаасаддк сссссссаса кдаддссасс саддаааааа ддсаддддса дкддсаксск 961кдссдкадса дддкддкдад дадддкддск дкдддддскс аддаадсксд сссаддддсс 1021 аакдкдддад дйдддддка дйкддкссс кдддксскда дссксадддд адддаддйд 1081 акадскаскд дддаййдк акакддсаас адкакакдкс ааассксйа ккааакакда 1141 ййсссадк аааааааааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа 1201 аааааааааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа ааа

Коннексин 31.1 человека, β5 (8Е^ ΙΌ ΝΟ:25).

ЬОСИ8 ΝΜ_005268 линейная мРНК 1299 п.н. ΡΚΙ 23-АИС-2004.

Определение - белок щелевого контакта Ното §ар1еп§, бета 5, (коннексин 31.1) (С6В5), мРНК.

1 акдааайса адскдсйдс кдадксскаккдссддскдс кдддадссад дададссскд

61 аддадкадкс асксадкадс адскдасдсд кдддкссасс акдааскдда дкакскйда

121 дддасксскд адкддддкса асаадкаскс сасадссйк дддсдсакск ддс£дкскск 181 ддксйсакс йссдсдкдс кддкдкасск ддкдасддсс дадсдкдкдк ддадкдакда 241 ссасааддас Йсдаскдса акасксдсса дсссддскдс кссаасдкск дскйдакда 301 дйсйссск дкдксссакд кдсдсскскд ддссскдсад сйаксскдд кдасакдссс 361 сксаскдскс дкддксакдс асдкддсска ссдддаддй саддадаада ддсассдада 421 адсссакддд дадаасадкд ддсдсскска сскдаасссс ддсаадаадс ддддкдддск 481 скддкддаса какдкскдса дсскадкдй сааддсдадс дкддасаксд ссйкскска 541кдкдйссас ксайскасс ссааакакак ссксссксск дкддксаадк дссасдсада 601 кссакдкссс аакакадкдд аскдсйсак скссаадссс ксададаада асаййсас 661 ссксйсакд дкддссасад скдссакскд саксскдскс аассксдкдд адсксакска 721 сскддкдадс аададакдсс асдадкдсск ддсадсаадд ааадсксаад ссакдкдсас 781 аддксаксас ссссасддка ссассййс скдсааасаа дасдассксс йксдддкда 841 ссксаксйк скдддсксад асадксаксс кссксксйа ссадассдсс сссдадасса 901 кдкдаадааа ассаксйдк даддддскдс скддаскддк скддсаддй дддсскддак 961 ддддаддскс кадсаййек сакаддкдса асскдададк дддддадска адссакдадд 1021 каддддсадд саадададад дайсадасд скскдддадс садйсскад кссксааскс 1081 садссасскд ссссадсксд асддсаскдд дссадйссс сскскдскск дсадсксддк 1141 йссййск адаакддааа кадкдадддс саакдсссад ддйддаддд аддадддсдк 1201 ксакадаада асасасакдс дддсассйс аксдкдкдкд дсссаскдкс адаасйаак 1261 аааадксаас ксайкдскд дааааааааа ааааааааа

Коннексин 30 человека, β6 (8Е^ ΙΌ ΝΟ:26).

ЕОСИ8 ВС038934 линейная мРНК 1805 п.н. ΡΚΙ 30-6ϋΝ-2004.

Определение - белок щелевого контакта Ното §ар1еп§, бета 6, (коннексин 30), мРНК (кДНК-клон

МСС:45195 1МАСЕ:5196769), полная кодирующая последовательность.

1 скдддаадас дскддксадк ксасскдссс саскддйдк йкйаааса аайскдака

61 саддсдасак ссксаскдас сдадсааада йдасайсд каксаксаск дкдсассай 121 ддсйскадд саскссадкд дддкаддада аддаддкскд ааасссксдс ададддакск 181 кдсссксай сйкдддкск дааасаскдд садксдйдд ааасаддаск садддакааа 241 ссадсдсаак ддайддддд асдйдсаса сйксаксдд дддкдксаас ааасасксса 301 ссадсаксдд дааддкдкдд аксасадкса ксйкайй ссдадксакд акссксдкдд 361кддскдссса ддаадкдкдд ддкдасдадс аададдасй сдкскдсаас асаскдсаас 421 сдддакдсаа ааакдкдкдс какдассаск ййсссддк дксссасакс сддскдкддд 481 ссскссадск даксйсдкс кссассссад сдскдскддк ддссакдсак дкддсскаск 541 асаддсасда аассасксдс аадйсаддс даддададаа даддаакдак Йсааадаса 601 кададдасак кааааадсад ааддйсдда кададдддкс дскдкддкдд асдкасасса 661 дсадсаксй йкссдаакс аксйкдаад садссй£а£ д1а£д1дй£ 1асйссй1 721 асаа£ддд!а ссасс!дссс £ддд£дйда аа£д£ддда! £даоссс£дс сссаассйд 781 йдас1дсй 1ай1с1адд ссаасадада адассд£дй 1асса1йй а!даЮс1д 841 сд1с£д£да£ йдса£до£д сйаасд£дд сададйд£д с£асс1дс£д с£дааад£д1 901 дййаддад а£сааадада дсасадасдс ааааааайа ссссаа£са£ дсссЛааадд 961 ададкаадса даакдааакд аакдадскда ШсадаШд 1дд£саааак дсааксасад 1021 дШсссаад скааасаШ сааддкаааа £д£адс£дсд ксакааддад асйскдкск 1081 кскссадаад дсаакассаа сскдааадй ссйскдкад сскдаададк йдкааакда 1141 сйксакаак ааакадасас йдадйаас ййкдкадд акасйдскс сайсакаса 1201 саасдкаакс ааакакдкдд кссакскскд аааасаадад аскдсйдас аааддадсак 1261 кдсадксаск йдасаддй ссййаадк ддаскскскд асааадкддд каскйскда

1321 ааакйакак ааскдйдй дакааддаас айкакссад даайдакас ййайадд 1381 аааадакай йкакаддск кддакдккй кадйркдас кйдаакйа какааадкак 1441 ййакаакд аскддксйс сйасскдда аааасакдсд акдйадйк кадаайаса 1501 ссасаадкак скааайкдд аасйасааа дддкскакск кдкааакай дкйкдсай 1561 дкскдйддс ааакйдкда аскдксакда касдсйаад дкддааадкд йсайдсас 1621 аакакайй каскдскйс кдаакдкада сддаасадкд кддаадсада аддсйкйк 1681 аасксакссд кйдссааке айдсаааса аскдааакдк ддакдкдай дссксаакаа 1741 адсксдкссс сайдсйаа дссйсаааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа 1801 ааааа

- 37 029094

Коннексин 31,9 человека, с1 (8Ε^ ΙΌ N0:27).

Й0СИ8 NМ_152219 линейная мРНК 2094 п.н. РК1 23-АИС-2004.

Определение - белок щелевого контакта Нοтο 53р1сп5, сЫ 1, 31,9 кДа (коннексин 31,9) (С1С1), мРНК.

1 аааТдаааеа дддадсадда ддсдссдд!с ссадссасс! сссааддйс с!ддсйадс 61 ййдасассс сад!сссддс сссаддд!да ^8888^88 аддддсасса

121 ддддсд!д!д дддасс!д!д 1аад1д1ддд 8*8888*88* ййаддада 1д1ддаддс1 181 ддаддсасад даддссаддд аддадддада адсс!дд1дс сдсасйсса ссасдс1ддд 241 дйддадддс адддасасс! ссдасааадд ассс!д!дад а-§йа1дааа дсддадйдс 301 сЮдСасса дссссссасс йдададдад йсас!дсад гааааа1дд1 дададааа!д 361 д1дддссаад аааддад!дд 1с1сдс1дсс ЬЛдссасй ссасйсйс са1дддсасс 421 ааайдддй ГадсдСсйд ддйсдаддс йсасййс ссасадсаСс сйдасадс!

481 аадддсассд сГдддйХсс дсйссдааа ссаддсаад! саддддсЛдд йсадсТда!

541 сйсааддй сйссБаада ай1дддай 1ддаддайс садддйдаа сддадасддс

601 АадддддТд сддсйаааа! дсааакдддд да!сс!сссс адсасссай ддйссааад 661 адаадд1аас сса!адс1да дсд!сдсс(д с!сссс1сд§ дсссйссд! ддсссйсд!

721 Йса1ас1§д ййайдс! ааасссдддс сййсШсс йасдасйа ссс1даад1с 781 ададааддй саасддассс сассссдаГа ддсйддаад дддсадддд! сссГдасйд 841 ссссайссс (дасгссссд ссссдсдйс ссадсдсса! ддддда§1дд дсдйсс1дд 901 дсйдйдс! ддасдсс^д садйдсад! сдссдсйд! дддссдссй Хддс1дд1дд 961Юа1дс1да1 сйссдсай с!дд!дс1дд ссасддХддд сддсдссдйд йсдаддасд 1021 адсаададда дйсд!д1дс аасасдс1дс адссдддс1д йдссадасс 1дс1асдасс 1081 дсдссйссс ддййссас {ассдсйс! ддсййсса са!сс1дс1д сййддсдс 1141 ссссддХдс! дйсдйдй йсйса^с ассдёёсадд сааддаддсд ддсддсдс1д 1201 аддсддсддс дсад!дсдсс сссддас1дс ссдаддссса д!дсдсдссд 1дсдссс1дс 1261 дсдсссдссд сдсдсдссдс 1дс1асс1дс 1дадсд1ддс дс!дсдсс!д с!ддссдадс 1321 1дассйсс1 дддсддссад дсдсйдсй! асддсйссд с§1ддссссд сасЙсдсд!

1381 дсдссддйс дссс!дсссд сасасддйд ас!дсйсд{ дадссддссс ассдадаада 1441 ссдййсд! §с1сйс1а! йсдсдд!дд ддс1дс!д1с ддсдс!дсй адсд!адссд 1501 адс!дддсса сс!дс!с1дд аадддссдсс сдсдсдссдд §дадсд!дас аассдс1дса 1561 ассд!дсаса сдаададдсд садаадйдс йссдссдсс дссдссдсса есШЙдйд 1621 йасйддда адаааасада сассйсаад дададддсй ссс1дд!адс ссссасссса 1681 адасададс! дда1дсссс1 сдсйссд!а дддааадсас Ос1сс1.дса ддаБддсай 1741 дсйййсс сйсса!ддс асд!ад!а1д 1дсйад1аа а!а!д1дйд да1дадааас 1801 1даадд1д1с сссаддссй сассасДдсс а!дсссдаас ас!а1сса1д с1а{дд1ддд 1861 сассаШс! ЩдаГдасад Йс1дтд1сс асаасссада ссссйсаса сааасссада 1921 1ддддс1£1:д ссдс1дйй ссада(:д1а1 йайсааса аа!ай1д1а ддд!асс1ас

1981 1д1д1д1сад аада!дйса адайадса! сайсда!дд ааа!адса!а 1дадсса1д1 2041 а!д!адйй аадйййа йадссдса! 1аааааад1а аааддаааса аа!д

Коннексин 29/31,3 человека, е1 (8Ε^ ΙΌ N0:28).

ЬОСИ8 АР503615 линейная мРНК 840 п.н. РК1 07-АИС-2002.

Определение мРНК коннексина 31,3 Нοтο 53р1сп5, полная кодирующая последовательность.

1 а!д1д1ддса ддйсс!дсд дсддс1дс!д дсддаддада дссддсдсй сасссссд!д

61 дддсдссШ 1дсйсссд1 дс1сс!:ддда йссдссйд 1дс1дс1ддс 1дссад1ддд 121 сс!ддад1с1 а1дд!да1да дсадад^аа йсдйдСдй асасссадса дссдддс1дс 181 ааддсСдсс! дсйсдаТдс сйссасссс сййсссдс 1дс£йй1£ ддййссад 241 дйаййдд 1ддс1д1асс садсдсссй 1а1а1дддй 1сасй1д1а йасдХдай 3011§§сасх§ёё аайайадд аааддддаад даддаддада ссс1дайса дддасдддад 361 ддсаасасад а!дйссадд ддс!ддаадс сйаддсйдс й1дддсйа 1д1ддсйад 421 с!дддддсй ддсйдйс! ддадддддса дссс!дддд1 *§садйсса ссйд1а1ддд 481 йссадаТдс ссадсйсй 1дса1^сдс сдадаассй дссйддРад 1айасс1дс 541 аай!дйсс дссссй!да даадассай Йсс1ааада сса!дй1дд адйадсдд!

601 йс1дйй!1дй1асй1 Шддадсй д1дсйс1дд ёШддддад а!дд1ддадд 661 асс!ддаадс асаааййс сйййааа 1асйсс1аа сйсаёаёаё сассаёааёа 721 сасааёаааё саассдайд ссйссад1д д!ддааасса ааёаёсаай йаадаадса 781 дйссаёёаа даадсйадс ссаддааааа сааадассад йддасссад ада1дсс1да

Коннексин 25 человека (8Ε^ ΙΌ N0:29).

ЙОСИ8 Н8А414563 линейная мРНК 672 п.н. РК1 30-Ν0ν-2001.

Определение - ген коннексина 25 Нοтο 53р1сп5.

1 а!дадйдда Едйссйад адай!сс1д ад1ддад1аа а!ааа1ас!с сас!дддас1

61 дда!ддаШ ё8^88^ сд(:д1йд1с йссдШдс 1ддй1асаг дд!ддсадса 121 дадсасаБд! §саёааадад Шдад1дс^а асадБадаса дсссддйдс

' 181 ааааа!д1д! дййда!да сйсйсссс аШсссаад (садасШд ддссйасаа

241 с!да!аа1дд ййсасасс йсасйс1д д!ддййас а!д1адсс1а йагдаддд!

301 адададаааа ддсасадааа дааасйШ дйадсссад д!асаа!дда 1дддддсс1а 3611дд1асдсй аййайад ссйайдй аааас!ддй йдааайдд сйссйдй 421 йаййа!а адс!а!а1да 1ддсй1ад1 дйссс!асс Йа1ааад1д 1дай1даад 481 ссйдйсса асас1д1дда с!дсйсай йсааассса сХдадаадас даййсай 541 сййсйдд йайассй а1дсйд1д! айд1дйда аШсайда ас!дадйй 601 йддйсйа ад1дсШа! 1аад1дс1д1 сйсааааа! аШаааааа ассйаадй 661 Сйад1д1д1 да

Коннексин 40,1 человека (8Ε^ ΙΌ N0:30).

Й0СИ8 Н8А414564 линейная мРНК 1113 п.н. РК1 30^0У-2001.

Определение - мРНК коннексина 40,1 Нοтο 53р1сп5 (ген СХ40Д).

- 38 029094

1 аХддааддсд ХддасйдсХ адддХйсХс аХсаХсасаХ ХааасХдсаа сдХдассаХд 61 дХаддааадс ХсХддйсдХ ссХсасдаХд сХдсХдсдда ХдсХддХдаХ ХдХсЙддсд 121 дддсдасссд ХсХассадда сдадеаддад аддХйдХсХ дсаасасдсХ дсадссддда 181 ХдсдссааХд ХйдсХасда, сдХсйсХсс сссдХдХсХс ассХдсддй сХддсХдаХс 241 садддсдХдХ дсдХссХссХ ссссХссдсс дХсйсадсд ХсХаХдХссХ дсассдадда 301 дссасдсхсд ссдсдсХддд сссссдссдс Хдссссдасс сссдддадсс ддссХосддд 361 сададасдсХ дсссдсддсс айсддддад сдсддсддсс ХссаддХдсс сдасййсд 421 дссддсХаса ХсаХссассХ ссХссХссдд асссХдсХдд аддсадссй сддддссйд 481 сасХасХйс ХсХйддай ссХддссссд аадаадйсс сйдсасдсд сссХссдХдс 541 асдддсдХдд ХддасХдсХа сдХдХсдсдд сссасадада адХсссХдсХ даХдсХдйс 601 сХсХдддсдд ХсадсдсдсХ дХсййсХд сХдддссХсд ссдассХддХ сХдсадссХд 661 сддсддсддаХдсдсаддад дссдддассс сссасаадсс ссХссаХссд даадсададс 721 ддадссХсад дссасдсдда дддасдссдд асХдасдадд адддХдддсд ддаддаадад 781 ддддсассдд сдсссссддд Хдсасдсдсс ддаддддадд дддсХддсад ссссаддсдХ 841 асаХссаддд ХдХсадддса сасдаадай ссддаХдадд аХдададХда ддХдасаХсс 901 Хссдссадсд аааадсХддд садасадссс сддддсаддс сссассдада ддссдсссад 961 дассссаддд дсХсаддаХс сдаддадсад сссХсадсад сссссадссд ссХддссдсд 1021 сссссйссх дсадсадссХ дсадсссссХ дасссдссХд ссадсХссад ХддХдсХссс 1081 сассХдадад ссаддаадХс ХдадХдддХд Хда

Коннексин 62 человека (ЗЕ^ ΙΌ N0:31).

ЬОСИЗ НЗА414565 линейная мРНК 1632 п.н. ΡΡΙ 30-Ν0ν-2001.

Определение - ген коннексина 62 (СХ62) Нοтο 5ар1еи5.

1 аХдддддасХ ддаасйай дддХддсаХс сХададдаад йсасХссса сХсаассаХа 61 дХддддаааа ХсХддсХдас саХссХсХХс аХсйссдаа ХдсХддХасХ ХсдХдХддсХ 121 дсХдаддаХд ХсХдддаХда ХдаасадХса дсаХЙдссХ дсаасасссд дсадссаддХ 181 ХдсаасааХа ХсХдйаХда ХдаХдсаЙс ссХаХсХсй ХдаХсаддй сХдддййа 241 садаХсаХсХ ХХдХдХсйс ХссйсХХХд дХсХаХаХдд дссаХдсасХ ХХаХаддсХс 301 адддссХХХд адааадасад дсададдааа аадХсасасс йададссса даХддадааХ 361 ссадаХсйд асйддадда дсадеааада ахадаХаддд аасХдаддад дйададдад 421 садаададда ХссаХааадХ сссХсХдааа ддаХдХсХдс ХдсдХасйа ХдХсХХасас 481 аХсйдасса даХсХдХдсХ ддаадХадда ПсаХдаХад дссааХаХаХ ХсХсХаХддд 541 ХйсаааХдс асссссХХЬа саааХдсасХ саассХссй дссссааХдс ддХддаЙдс 601 ХйдхаХсса ддсссасХда даадасааХХ ЙсаХдсХй йаХдсасад саХХдсадсс 661 аХйссйдХ ХасХсааХаХ асХддаааХа ХйсаХсХад дсаСсадааа ааХХаХдадд 721 асасХйаХа адаааХссад садХдадддс айдаддаХд ааасаддссс ХссайссаХ 781 ЙдаадаааХ айсХдХддс ссадсадХдХ аХдаХйдсХ сйсайдсс ХдааадааХс 841 ХсХссасХХс аадсХаасаа Хсаасадсаа дХсайсдад йааХдХдсс ааадХсХааа 901 ассаХдХддс аааХсссаса дссааддсаа сйдаадХад асссйссаа Хдддааааад 961 дасХддХсХд адааддаХса дсаХадсдда садсХссаХд йсасадссс дХдХсссХдд 1021 дсХддсадХд сХддаааХса дсассХддда садсааХсад ассаХХссХс аХйддссХд 1081 садааХасаа ХдХсХсадХс сХддсХаддХ асаасХасдд оХссХадааа сХдХссаХсс 1141 ХйдсадХад даассХддда дсадХсссад дасссадаас ссХсаддХда дссХсХсаса 1201 даХсйсаХа дХсасХдсад адасадХдаа ддсадсаХда дадададХдд ддХсХддаХа 1261 дасадаХсХс дсссаддсад Хсдсааддсс адсХйсХдХ ссадайдй дХсХдаааад 1321 сдасаХсХдс асадХдасХс аддаадсХсХ ддйсХодда аХадсХссХд сйддаХХй 1381 ссХсасХддд аааасадссс сХсассХсХд ссйсадХса сХдддсасад аасаХсааХд 1441 дХаадасадд садсссХасс даХсаХддаа сХаХоасаад адсХдйсса ЙсХддаХдс

1501 йХсйХйс схйсйХсХ хссхддддхд хдХаХдХаХд ХйдХдХХда садададдса 1561 даХддадддд дадайаХй аХддададаХ аааайайс айсдаХаса йсадйааа 1621 ХХсаайсаХ аа

Различные аспекты данного изобретения будут теперь описаны со ссылкой на следующий экспериментальный раздел, который представлен, как это будет понятно, только в качестве иллюстрации и не является ограничением в отношении объема данного изобретения.

Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.

Пример I. Анализ ΐη νίνο.

Материалы и способы.

Лазерная обработка.

Самок крыс М151аг (32-34 дня) содержали при условиях, соответствующих ΑΡνΟ Ργ'5ο1ιιΐίοη οη 1Не И5е οΓ Аштак ΐη Ре5еагсЬ. Животных анестезировали введением смеси 1:1 I Ινρηοπη™ (10 мг/мл, ^аη5еη РЬагтасеиЛка, Ве1§шт) и Нурηονе1® (5 мг/мл, РнсЬе рпЛисГ Ι.Ιά. Νυαυ Ζеа1аηά) в дозе 0,083 мл/100 г массы тела в брюшину животного.

Эксимерную лазерную обработку выполняли через интактный эпителий с использованием эксимерного лазера ТесН^кз 217 Ζ (ВаисЬ & Ι.οιηΙο Зиг§юа1, ИЗА). Глаз центрировали по середине зрачка и удаление выполняли со следующими параметрами: зона обработки имела диаметр 2,5 мм и глубину 70 мкм. Это приводило к удалению небольшой толщины передней стромы и всего эпителия. Эксимерную лазерную обработку использовали преимущественно для получения воспроизводимых повреждений и исследования действий АЗ ΟΌΝ против коннексина 43 на ремоделирование и конструирование роговицы после травмы.

После хирургии всех животных помещали в индивидуальные клетки и внимательно наблюдали в отношении любого дискомфорта. Послехирургическую оценку ΐη νίνο выполняли с использованием биомикроскопа со щелевой лампой и/или щелевого сканирования с использованием конфокального микроскопа ΐη νίνο.

Конфокальная микроскопия для щелевого сканирования ΐη νίνο.

- 39 029094

До и после лазерной обработки роговицы каждое животное наблюдали клинически с использованием конфокального микроскопа для щелевого сканирования ίη νΐνο СоиГоксаи 2 (Ройиие ТесЬио1од1е5 Атепса. И8А). СоиГоксаи 2 является вариантом технологии щелевого сканирования с особым преимуществом прямого преобразования в цифровую форму изображений в момент получения данных. Животных анестезировали и каждое из них помещали на специально сконструированную платформу, которая была приспособлена на уровне линзы объектива ш уАо-конфокального микроскопа перед головкой получения изображения.

Конфокальный микроскоп для щелевого сканирования ш νί\Ό делает возможным оптическое разбиение живой роговицы на различных уровнях через всю толщину роговицы. Исследование начинается от эндотелия, и количество передне-задних срезов зависит от заданных пользователем установок. Технология щелевого сканирования использует линзу объектива, которая движется назад и вперед вдоль оси, перпендикулярной исследуемой зоне. Вкратце, аппаратура состоит из галогеновой лампы (100 Вт/12 В), двух щелей, двух цилиндрических линз, передней линзы объектива и высокочувствительной цифровой камеры (ССИ). Перед сканированием на кончик линзы объектива помещают каплю УЬсоЮаге (С1ВА VI5юи ОрЫйайшск) в качестве иммерсионного вещества. Во время сканирования глаз животного держат широко открытым и ориентированным таким образом, что плоскость роговицы всегда является перпендикулярной оптической оси увеличительной линзы (40х, Ы.А. 0,75). Время получения изображения равно приблизительно 14 с. Этот гель, но не линза объектива, контактирует с глазом все время. Для роговицы крысы получали до 250 последовательных цифровых изображений на одно испытание и сразу же сохраняли в накопителе на жестких дисках. Параметры получения изображений корректировали во время предварительных экспериментов и сохраняли постоянными в течение всех последующих экспериментов. Они были следующими: интенсивность света была уменьшена наполовину относительно интенсивности, обычно используемой для пациентов-людей, использовали четыре прогона (одним прогоном считается полное движение назад и вперед), и было выбрано рабочее расстояние 400 мкм. Для роговицы крысы центрирование облегчалось ясной визуализацией зрачка, которая обеспечивает очень хорошую топографическую воспроизводимость.

Конфокальные изображения ш νί\Ό.

Все изображения, полученные щелевым сканированием 1и νί\Ό в конфокальном микроскопе, хранили на накопителе на жестких дисках и затем анализировали с использованием патентованных программ ΝΛνΐδ (СоиГоксаи 2, №йек Со Ый).

Стромальные динамики оценивали в соответствии со стереологическими принципами. Количества клеток регистрировали в переднем и заднем положениях стромы. Основной стереологический компонент обеспечивали посредством самого конфокального микроскопа для исследований ш γί\Ό, так как он действует в качестве оптического диссектора (зонда, который берет пробы с равной вероятностью частиц в пространстве). Действительно, конфокальный микроскоп ш νί\Ό обеспечивает тонкие оптические срезы указанного объема, каждый из которых представляет собой образец рассекаемой ткани. В результате счет стромальных клеток состоит в выборе пары кадров (последовательных картин, регистрируемых ш у|уо-конфокальным микроскопом), причем один кадр имеет частицы (стромальные клетки) в фокусе, а другой кадр обнаруживает несфокусированное, но узнаваемое изображение тех же самых частиц (оптические тени). Количество клеток (и) регистрируют по самому резкому кадру на определенной площади А (мкм²). Расстояние й (мкм) между двумя кадрами также регистрируют. Количество клеток на единицу объема (V) равно V=количество клеток (и)/й (мкм)хА (мкм²).

Конфокальные изображения ех νί\Ό.

Подходящие среды роговицы иммуногистохимически окрашивали различными маркерами для различных целей. Окрашивание ядерным красителем Ноесйк! 33 258 использовали для оценки количества эпителиальных и стромальных клеток в центральной и периферической роговицах. Для этой цели с использованием программы Аиа^К® 3.2 (§ой 1тадшд §ук1ет, И8А) представляющую интерес зону сначала рисовали от руки на изображении файла в формате ΤΙΡΡ подходящего района роговицы, и величина этой площади автоматически давалась программой. Затем с использованием опции ручного счета клетки считали в пределах этой площади и выражали в величинах на единицу площади.

Нанесение антисмыслового соединения.

30% гель Плюроника (кислоты) (ВА8Р Согр) в забуференном фосфатом солевом растворе (в воде квалификации "для молекулярных исследований") использовали для доставки специфических антисмысловых О^N против немодифицированного коннексина α1 (коннексина 43) к субконъюнктиве анестезированных крыс после фоторефрактивной кератэктомии. В предварительном испытании с использованием Р1ТС-метки было показано, что эта композиция остается в передней камере глаза до 24 ч (не показано).

Антисмысловой молекулой, использованной в этих экспериментах, была молекула ΌΒ1 (СТА АТТ ОСО ССА ССА ССА АТТ СТТ ТСТ СТС) (ЗНС ГО ^:65). Добавление Р1ТС-метки к О^N ΌΒ1, наблюдаемое конфокальной лазерной сканирующей микроскопией, показало внутриклеточное проникновение этого зонда.

Этот О^N наносили при конечной концентрации 2 мкМ.

- 40 029094

Мониторинг эффектов конструирования или ремоделирования ткани.

После нанесения антисмыслового агента роговицы испытывали с использованием конфокального микроскопа для щелевого сканирования ΐη νίνο при 2, 12, 24, 48, 72 ч, 1 и 2 неделях после лазерной хирургии. Контрольные крысы получали только лазерную хирургию.

Табл. 1 суммирует количество роговиц, исследованных в каждой временной точке.

Таблица 1

Количество контрольных (С) и Αδ (ОО\)-обрабоганных роговиц, использованных в последующем наблюдении с использованием конфокальной микроскопии для щелевого сканирования ΐη νίνο

	в пределах 2 ч хирургии	12 ч после хирургии	24 ч после хирургии	48 ч после хирургии	72 ч после хирургии	1 нед. после хирургии	2 нед. после хирургии
Число	18С	юс	18С	юс	6С	4С	5 С
глаз (п)	18ΟΟΝ	ΙΟΟϋΝ	18ΟϋΝ	6ΟΏΝ	6 ΟΩΝ	4 ΟΟΝ	5 ΟϋΝ

(ΌΝ - обработанные антисмысловым (ΌΝ (Αδ (ΌΝ) глаза (единственное введение после лазерной хирургии).

Анализировали каждый клеточный слой роговицы и тип клеток, количество и внешний вид, сравнивали между контрольной группой и группой, обработанной ОО\.

Повторная эпителизация.

Обработка (ОЖ против коннексина 43 стимулировала восстановление эпителия. В 90% Αδ О1Жобработанных роговиц наблюдали скольжение эпителиальных клеток в пределах 12 ч после лазерной хирургии РКК в сравнении с его отсутствием в контролях (фиг. 1В). На этой стадии только статические эндотелиальные клетки присутствовали в 30% контрольных роговиц (фиг. 1А). При 24 ч эпителиальные клетки наблюдали во всех контролях и обработанных антисмысловым олигонуклеотидом роговицах, но 72% обработанных клеток против 61% контролей обнаруживали активно скользящие клетки. Это указывает на то, что повторная эпителизация протекает более быстро в обработанных коннексин 43специфическим Αδ (ОЖ роговицах, чем в контролях.

Плотности стромальных клеток.

С использованием ί-критерия парных проб с повторными измерениями для сравнения плотностей клеток в передней и задней стромах в каждой группе в виде функции времени и непараметрического статистического критерия Манна-Уитни для сравнения количеств стромальных клеток между контролями и (ОЖ-обработанными роговицами в выбранных временных точках, статистически значимые результаты были обнаружены только при 24 ч после лазерной хирургии (табл. 2). В этой временной точке в контрольных и (ОЖ-обработанных группах плотность стромальных клеток в передней строме значимо увеличивалась в сравнении с величинами перед хирургией (величина р<0,05). В задней строме контрольных роговиц плотность стромальных клеток также увеличивалась в сравнении с величиной перед хирургией (величина р<0,05), тогда как в задней строме (ОЖ-обработанных роговиц плотность стромальных клеток не является статистически значимо отличающейся от величины перед хирургией (величина р>0,05). При сравнении плотности стромальных клеток между передней и задней стромами (ОЖ-обработанные' роговицы всегда обнаруживали более низкие плотности стромальных клеток, чем контрольные роговицы (величина р<0,05). Это подтверждает идею, что небольшое количество клеток участвует в ремоделировании или конструировании стромальных клеток в (ОЖ-обработанных роговицах в сравнении с контрольными роговицами. Это сообщение является первым сообщением, показывающим, что нанесение (ОЖ против коннексина 43 уменьшает гиперцеллюлярность (повышенное содержание клеток) в участке хирургии. Гистохимический анализ ех νίνο (пример II) показывает, что гиперцеллюлярность (повышенное содержание клеток) ассоциирована с миофибробластами, которые индуцируют нежелательное ремоделирование стромального матрикса и образование рубцов.

Таблица 2

Количества стромальных клеток в контрольных и Αδ (ОЖ-обработанных роговицах до и после 24 ч после фоторефрактивной кераэктомии. Плотности клеток даны в виде средних величин с приведенными далее стандартными отклонениями

Обработка	Временные точки	Число клеток передней стромы (число клеток/мм3)	Число клеток задней стромы (число клеток/мм3)
Контроль	Перед хирургией	36469±11122 (п=17)	33909 + 8753 (п=17)
ΟϋΝ	Перед хирургией	36769 ± 10932 (п=17)	34382 ± 8667 (п—14)
Контроль	24 ч после хирургии	144643 ± 60989 (п=17)	46901 ±26964 (п= 17)
ΟϋΝ	24 ч после хирургии	93468 ±53548 (п=17)	33510 ± 11350 (п=14)

Пример II. Анализ ех νίνο.

Материалы и способы.

Гистология. Сбор и фиксация ткани.

Подходящие количества животных (крыс А'Ыар) брали в выбранных временных точках после фоторефрактивной кератэктомии, и вводили ΌΒ1 и (ОЖ против коннексина 43 анестезированным крысам, как описано в эксперименте 1 выше, и готовили срезы роговицы для гистологического анализа. Контрольные крысы получали только лазерную хирургию. Целые глаза и контрольные ткани промывали в ЗФР ((')χοκΐ) перед заделкой в 'Пззие-Тек® ОСТ (Аакига 1лие1ек, υδΑ) и замораживали в жидком азоте. При необходимости (для использования некоторых антител) замороженные ткани затем фиксировали в

- 41 029094

холодном (-20°С) ацетоне в течение 5 мин после получения срезов в замороженном состоянии.

Получение срезов тканей.

Процедура для криоизготовления срезов была следующей: замороженные блоки нефиксированной ткани вынимали из хранения при -80°С и помещали в криостат Ье1ка СМ 3050δ на 20 мин для уравновешивания до температуры криостата (т.е. -20°С). После достижения уравновешивания ткани образец помещали на диск для образца с использованием в ТНкие-Тек® 0СТ. Срезы с толщиной 12 мкм (для окрашивания Н/Ε) или толщиной 25 мкм (для иммуномечения) нарезали и помещали на предметные стекла δиρе^ί^о5ΐ® Р1ик (Меи/е1-С1е5ег. Оегтаиу). Сразу же после крионарезания блоки ткани помещали обратно для хранения при -80°С, а предметные стекла, несущие криосрезы, либо использовали немедленно, либо хранили при -80°С. Изготовление срезов происходило параллельно оптической оси глаза.

Окрашивание гематоксилином/эозином (Н/Ε) и ядерное окрашивание.

Предметные стекла помещали в стеклянные штативы для облегчения погружения в ряд различных красящих реагентов. Штативы встряхивали при помещении их в реагенты для разрушения поверхностного натяжения и для дренирования их между каждой заменой раствора. Перед окрашиванием гематоксилином/эозином по ОШ ΙΙ предметные стекла, которые хранили при -80°С, сначала нагревали до комнатной температуры в течение 1-2 мин, затем фиксировали сначала в холодном ацетоне и/или сразу же гидратировали быстрым погружением в водопроводную воду. Предметные стекла окрашивали гематоксилином по ОШ ΙΙ, после чего избыток красителя смывали водопроводной водой. Дифференциация красителя достигалась погружением в заместитель водопроводной воды Скотта (δΤ^Vδ) на 4 с. Затем выполняли промывание проточной водопроводной водой в течение 1 мин перед окрашиванием в 1%-ном эозине в течение 30 последовательных погружений. Наконец, срезы быстро промывали в водопроводной воде, дегидратировали 95, 100% ΕΐΟΗ, осветляли в ксилоле и заключали в среду ΌΡΧ для гистологических препаратов (δίβΐηα). Для ядерного окрашивания (параллельно с Н/Ε или иммуногистохимическим анализом) использовали Ноесйк! 33 258 (δίβΐηα). Измерение толщины роговицы проводили на Н/Εокрашенных срезах.

Иммуногистохимия.

Срезы иммунологически метили на коннексин 43 с использованием сайт-специфического моноклонального антитела, на миофибробласты с использованием антитела, узнающего альфа-актин гладких мышц, на отложение базальной пластины с использованием анти-ламинин-1-антитела. Кроме того, использовали антитела против винментина для отличения стромальных кератоцитов от миофибробластов, и антитело Κί-67 использовали для обнаружения пролиферации клеток.

Гистологический анализ ех νίνο.

Результаты показали, что повреждения, производимые эксимерным фотоудалением, закрывались спустя 24 ч после хирургии (фиг. 2). Типичная инвазия стромы моноядерными/мультиядерными и/или круглыми яйцевидными клетками на периферии и в центре роговицы наблюдалась в обеих группах, наиболее ярко выраженная спустя 24 ч после хирургии, но при этом обработанная антисмысловым Ο^N группа обнаруживала значимо меньшее количество этих клеток, чем контрольная группа (фиг. 2А, В, С). Это коррелирует с находками на ш νίνο-конфокальных микрофотографиях, показанных на фиг. 1. Толщина эпителия была вариабельной в контрольных роговицах, как видно на фиг. 2 в участке индуцированного лазером повреждения (фиг. А, В), а в строме ниже удаленной зоны (фиг. А, В) и в периферической строме (фиг. С) была интенсивная инвазия круглыми клетками (гиперцеллюлярность) в контрольных роговицах. Наблюдали также явно выраженный стромальный отек на фиг. В и С. В обработанных антисмысловым Ο^N роговицах эпителий был равномерной толщины (фиг. Ό, Е), и в центральном районе (фиг. Ό) и в периферической строме (фиг. Е) наблюдали лишь небольшой отек стромы. Кроме того, в строме присутствовало небольшое число круглых клеток. Масштабные метки на фиг. 2 представляют 20 мкм.

Изменения в толщине стромы после обработки Ο^N коннексина 43 после лазерной обработки показаны в табл. 3, которая сравнивает изменения в толщине стромы между контрольными и 0Б^ обработанными роговицами. Толщину стромы измеряли из соответствующих гистологически окрашенных срезов. Статистический анализ данных, полученных для 0И^обработанной группы с использованием ΐ-критерия парных проб, показали, что во всех трех исследованных временных точках (24, 48 и 72 ч после хирургии) толщина центральной стромы является статистически значимо меньшей, чем величина перед хирургией (величины р<0,05), а толщина периферической стромы не отличалась значимо от величин перед хирургией. В отличие от этого контрольные роговицы обнаруживают значимое опухание стромы (отек) (фиг. 2А, В, С) как в центральной, так и периферической роговице (где строма удваивается по величине в сравнении с величинами перед хирургией).

Роговица, которую подвергали хирургии, имела толщину центральной стромы 250 мкм, но эксимерную лазерную хирургию использовали для удаления 70 мкм корнеальной ткани (включающей в себя эпителий и часть стромы). Нормальный корнеальный эпителий имеет толщину 50 мкм (в среднем), и, следовательно, лазерной хирургией удаляли 20 мкм стромальной ткани. Таким образом, для статистического сравнения толщины центральной стромы при 24, 48 и 72 ч после образования раны с толщиной

- 42 029094

центральной стромы перед хирургией использовали корректированную потерю толщины и толщину центральной стромы 250-20=230 мкм перед хирургией.

Таблица 3

Изменения толщины стромы после эксимерной лазерной хирургии в контрольных и АЗ-обработанных роговицах

Обработка	Временные точки	Средняя толщина центральной стромы (мкм)	Средняя толщина периферической стромы (мкм)
Нормальные (без хирургии)	Перед хирургией	250 (п=6)*	110 (п=10)
Контроль ΟϋΝ-обработанные	24 ч после хирургии	318 (п=6) 190 (п=5)	290 (п=6) 132 (п=5)
Контроль ΟΟΝ-обработанные	48 ч после хирургии	307 (п=6) 158 (п=5)	206 (п=5) 105 (п=5)
Контроль ΟΟΝ-обработанные	72 ч после хирургии	292 (п—6) 142 (п=5)	201 (п=6) 99 (п=5)

Уменьшение экспрессии коннексина 43 связано с уменьшенной инвазией стромы и уменьшенной эпителиальной гиперплазией.

Микроскопические наблюдения показали уменьшенный уровень коннексина 43, присутствующего в ΟΌΝ-обработанных роговицах, в сравнении с контрольными роговицами. Фиг. 3 показывает объединенные микрофотографические изображения. Верхний ряд показывает контрольные роговицы, нижний ряд показывает ΟΌΝ-обработанные роговицы. Типичная инвазия стромы круглыми клетками была видна в обеих группах в пределах 24 ч в зоне лимба роговицы, периферической зоне и центральной зоне. Однако меньшая плотность круглых клеток была обнаружена в ΘΌΝ-обработанных роговицах. В лимбе роговицы в обеих группах анти-коннексин 43 был равномерно распределен по строме (3Α,Ό), но обработанные группы имели меньше метки в периферии (3Е) в сравнении с контролями (3В). В этой стадии уровни коннексина 43 возвращались к нормальным в эпителии обеих групп, но контроли обнаруживали подобную рубцу строму (3С) или гиперплазию (см. фиг. 4 ниже), тогда как в обработанных антисмысловым соединением роговицах был виден нормальный эпителий с нормальными уровнями коннексина 43 (3Р). Масштабные стержни Α, Ό, Е, Р представляют 10 мкм; масштабные стержни В и С представляют 20 мкм. На этих фигурах коннексин 43 виден в виде белого пятнистого мечения, причем ядра клеток кажутся серыми. Результаты, показанные на фиг. 3, предполагают, что уровни белка коннексина 43 уменьшаются после обработки ΘΌΝ против коннексина 43, и это приводит к меньшей степени рекрутинга клеток в строму. Кроме того, только 7% ΘΌΝ-обработанных роговиц (0% при 24 ч после хирургии, 0% при 48 ч после хирургии, 20% при 72 ч после хирургии) обнаруживают признаки эпителиальной гиперплазии в сравнении с 31% контрольных роговиц (25% при 24 ч после хирургии, 67% при 48 ч после хирургии, 0% при 72 ч после хирургии). Это оценивали на Н/Е-окрашенных и Κΐ-67-меченых срезах.

Мечение миофибробластов.

Мечение антителами против винментина показало, что увеличенные количества клеток в строме контрольных роговиц в сравнении с АЗ ΘΌΝ-обработанными роговицами не были клетками, происходящими из недифференцированных кератоцитов, и, следовательно, мечение проводили с антителами против альфа-актина гладких мышц. Это мечение показало, что контрольные роговицы имели более высокое число миофибробластов ниже участка хирургии, но также в окружающей периферической строме. Это увеличение количеств миофибробластов и пораженной зоны было очевидным при 24 ч и сохранялось на протяжении 48 и 72 ч до по меньшей мере одной недели после хирургии (табл. 4). Фиг. 4 показывает мечение миофибробластов (антитела против альфа-актина гладких мышц) спустя 1 неделю после лазерной хирургии. Фиг. 4А, В и С являются контролями, а фиг. 4Ό, Е и Р являются обработанными антисмысловым олигонуклеотидом роговицами. При одной неделе после образования раны в контрольных роговицах низкие-умеренные количества миофибробластов присутствуют в передней половине периферической стромы (4А), умеренные-плотные уровни присутствуют в средних периферических стромальных районах (4В) и умеренные уровни видны в передней половине стромы в центральных районах (4С). В противоположность этому в обработанных роговицах очень низкие количества миофибробластов присутствует в периферической (4Ό) или средней периферической (4Е) строме и умеренные-низкие количества присутствуют в цетральной строме (4Р). В некоторых случаях в центральной строме миофибробласты сконцентрированы в зоне, находящейся непосредственно под эпителием (не показано). Таким образом, увеличенные количества клеток, наблюдаемые в примере 1 (гиперцеллюлярность) и на фиг. 2 выше, по-видимому, обусловлены дифференцирокой и инвазией миофибробластов. Известно, что миофибробласты являются ответственными за отложение рубцовой ткани в строме с уменьшенным отложением кристаллических веществ и увеличенной секрецией раневого коллагена III (Λΐιιιιιΐίΐί Α.Ι. апб ДакоЫее Р.А.; 202; Ιηΐ ОрЫйа1то1 С1т. Зиттег; 42(3): 13-22).

- 43 029094

Таблица 4

Обобщение результатов мечения на альфа-актин гладких мышц для миофибробластов в контрольных и обработанных антисмысловым 0Р\ роговицах

Время	Местоположение	Контрольные роговицы	Обработанные Αδ ΟϋΝ роговицы
24 часа после хирургии	Периферия	80% ϋ во всей строме 20% Μ во всей строме	100% М в передней 1/3 стромы
Средняя периферия	100% ϋ во всей строме	100% М в передней 1/3 стромы
Центр	100% Ь в передней строме	80% Ь в передней 1/3 стромы 20% Ь ниже эпителия
48 часов после хирургии	Периферия	83% М во всей строме 17% Ь во всей строме	40% М в передней половине стромы 60% Ь в передней половине стромы
Средняя периферия	50% ϋ во всей строме 50% М во всей строме	100% ϋ в передней половине стромы
Центр	17% Ь под эпителием (гиперплазия) 50% ϋ во всей строме 33% М во всей строме	20% отсутствует 80% М в передних % стромы
72 часа после хирургии	Периферия	33% Ь во всей строме 67% М во всей строме	40% Ь в передней половине стромы 60% М в передней половине стромы
Средняя периферия	33% Ь во всей строме 67% ϋ во всей строме	20% Ь в передней половине стромы 80% М в передней половине стромы
Центр	17% отсутствует 50% ϋ во всей строме 33% М во всей строме	20% отсутствует 40% Ь в передней половине стромы 40% М в передних % стромы
1 неделя после хирургии	Периферия	60% М в передней половине стромы 40% Ь в передней половине стромы	100% Ь в передней 1/3 стромы
Средняя периферия	60% ϋ во всей строме 40% М во всей строме	100% Ь в передней половине стромы
Центр	60% М в передней половине стромы 40% Ъ в передней половине стромы	60% М в передней половине стромы 20% Ь в передней половине стромы 20% М под эпителием

Количества миофибробластов определяли количественно как плотные (Ώ), умеренные (М), низкие (Ь) или отсутствующие. Проценты относятся к доли животных с поражениями при указанных уровнях, δί - строма, ер1 - эпителий. Значимые различия между контрольными и обработанными антисмысловым 00\ роговицами выделены жирным шрифтом.

Отложение базальной пластинки.

После фоторефрактивной кератэктомии базальная пластинка повторно образуется вместе с повторно растущим эпителием. Мечение антителами против ламинина-1 показывает, что повторное образование базальной пластинки является прерывистым и имеет неправильное эпителиально-стромальное присоединение (фиг. 5). При 24 ч контроли имели малое и/или неравномерное отложение ламинина на краю удаленной зоны (фиг. 5А) и в более центральном местоположении (фиг. 5В), тогда как обработанные антисмысловым 01Ж роговицы показали более регулярное отложение ламинина на обоих из этих районов (фиг. 5С, 50). При 48 ч контроли все еще не имели непрерывного отложения ламинина (фиг. 5Е край удаленной зоны; фиг. 5Р - центральная зона), отложение было очень неравномерным (фиг. 5Е). Напротив, обработанные антисмысловым 00\ роговицы имели непрерывную и относительно однородную базальную пластинку на краю раны (фиг. 50) и в центральной части (фиг. 5Н). Все масштабные отметки на фиг. 5 представляют 20 мкм. Обработанные специфическим для коннексина 43 антисмысловым 00\ роговицы образовывали более плотную, более непрерывную базальную пластинку в пределах 24 ч с меньшей неоднородностью.

Неоднородность ламинина определяли количественно, как показано на фиг. 6. Жирная сплошная линия на фиг. 6 представляет отложение ламинина-1. Для каждого района измеряли дисперсию как различие между наивысшим положением и самой низшей частью (фиг. 6А, В, С, Ώ). Контрольные роговицы имели среднюю дисперсию 6,98 мкм в сравнении с 4,74 мкм в обработанных антисмысловым 00\ роговицах. Различие между двумя группами было статистически значимым (р<0,0001).

Пример III. Конструирование ткани ΐη νΐίΓο.

Роговицы помещали в модель культуры органа ех νίνο, и конкретный коннексин модулировали с использованием антисмыслового 01Ж. Два коннексина были мишенями в этих экспериментах, коннексин 43 и коннексин 31.1. Отрицательную регуляцию коннексина 43 использовали для демонстрации того, что коннексины могут регулироваться ΐη νΐίΓο, а коннексин 31.1 был мишенью, так как этот коннексин экспрессируется в наружных эпителиальных слоях роговицы в клетках, которые находятся непосредственно перед выходом из роговицы. Цель состояла в конструировании утолщения эпителиальной ткани уменьшением экспрессии коннексина 31.1.

Материалы и способы.

30-34-дневных крыс \\А(аг эвтанизировали нембуталом или диоксидом углерода, и целые глаза крыс иссекали. Глазную поверхность иссекали, дезинфицировали 0,1 мг/мл смеси пенициллинстрептомицин в течение 5 мин и промывали в стерильном ЗФР.

Затем целый глаз переносили на стерильный держатель в культуральной чашке 60 мм с роговицей, обращенной вверх. Глаза помещали таким образом, чтобы корнеальный эпителий был экспонирован на границе раздела воздух-среда и культивировали при 34°С в увлажненном термостате с 5% С0₂ в бессывороточной среде (0рй-МЕМ, ΙηνΐίΓο^η) в течение до 48 ч. 100 мкл среды добавляли по каплям на эту поверхность каждые 8-12 ч для увлажнения эпителия. Уровни среды поддерживали на уровне лимбаль- 44 029094

ной конъюнктивы.

Антисмысловые олигомеры смешивали с 30% (мас./мас.) гелем Плюроника Р127 (§1§та) на льду до конечной концентрации 2 мкМ, и 10 мкл наносили на эти роговицы. Каждая обработка имела размер проб 3-4 роговицы на один эксперимент. Предварительные эксперименты показали, что двойные обработки положительного контроля авторов, ΌΒ1, в течение 8 ч оказывали малое влияние на экспрессию белка коннексина 43 в корнеальной культуре авторов изобретения. Таким образом, роговицы культивировали в течение 24 ч, и конкретные олигомеры коннексинов наносили каждые 8 ч.

Иммуногистохимическое мечение проводили, как в эксперименте 2 выше, с использованием антител к коннексинам 43, 26 (контроль) и 31.1. Ткань также окрашивали Н/Ε, как описано выше. Ядра контрастировали 0,2 мкМ иодидом пропидия. Изображения собирали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Беюа ТС8 4Ό или ТС8 8Р2 с напряжением и другими установками, поддерживаемыми в экспериментальных группах для создания возможности получения количественных уровней коннексина. Для количественного определения четыре оптических среза через 3 мкм обрабатывали в единое оптическое изображение с расширенным фокусом с использованием опции топографической проекции центра массы на ТС8 4Ό. Метку коннексина определяли количественно с использованием ΝΙΗ 1таде (8αοη Согр. υ8Α) после установления порога при интенсивности 90-100 пикселов на изображении с 256-уровневой шкалой серого цвета.

В роговицах, которые не подвергались хирургии, скорости оборота коннексина ίη νίίτο были относительно низкими в сравнении с процессами ремоделирования ткани в удаленных эксимерным лазером роговицах, описанных здесь выше в примерах 1 и 2. Тем не менее, после трех обработок антисмысловым ΘΌΝ уровни коннексина уменьшались более чем на 50% в сравнении с контролями (фиг. 7А, В показывает уменьшение коннексина 43 в Α8 ΘΌΝ-обработанных роговицах в сравнении с контролями). Уровни коннексина 26 оставались постоянными при нанесении коннексин 43-специфических антисмысловых ΘΌΝ (что указывает на то, что уменьшение уровней коннексина было специфическим действием, а не побочным действием этой обработки). В этих изображениях коннексин 43 появляется в виде более плотных пятен на двух базальных слоях эпителия, коннексин 26 в виде более мелкого пятнистого мечения преимущественно в слоях 2-6. Антисмысловые ΘΌΝ против коннексина 31.1 уменьшали уровни коннексина 31.1, но предварительные результаты показали также, что толщина эпителия (количество слоев) увеличивалась в пределах 24 ч (фиг. 7С, Ό). Это увеличение толщины наблюдали с использованием Η/Εокрашивания (фиг. 7Ό) и в иммуногистохимически меченых (фиг. 7С) срезах.

Описанные с этой работе результаты образуют основу для использования коннексинспецифических антисмысловых ΘΌΝ в конструировании ткани, в том числе конкретно после эксимерной лазерной хирургии роговицы, или для культуры органов ίη νίΐτο для конструирования и трансплантации органов. Обеспеченные здесь экспериментальные результаты демонстрируют, что единственная обработка коннексин 43-специфическими антисмысловыми ΘΌΝ после эксимерной лазерной фоторефрактивной кератэктомии имеет многие выгодные применения, некоторые из которых описаны здесь ниже.

Введение коннексин-специфических антисмысловых ΘΌΝ стимулирует движение эпителиальных клеток. При 12 ч после хирургии 90% обработанных антисмысловым олигонуклеотидом роговиц, но не контрольные роговицы, обнаруживают присутствие скользящих эпителиальных клеток в участке индуцированного лазером повреждения. Эпителиальные клетки присутствовали в 30% контрольных роговиц, но были статическими/нескользящими. Таким образом, регуляция прямой коммуникации клетка-клетка коннексинов может быть использована для конструирования изменений в характере распределения эпителиальных клеток.

Введение коннексин-специфических антисмысловых ΘΌΝ стимулирует гиперцеллюлярность контролей, связанную с дифференцировкой миофибробластов в участке индуцированного лазером повреждения в периоде 24-48 ч после хирургии. Во время этого периода большее число контрольных роговиц (63%), чем обработанных антисмысловым ΘΌΝ роговиц (39%), обнаруживают интенсивное повышенное содержание паренхиматозных клеток во всей строме. Регуляция прямой коммуникации клетка-клетка может быть, следовательно, использована для модуляции дифференцировки клеток, ведущей к модификации внеклеточного матрикса.

Введение коннексин-специфических антисмысловых ΘΌΝ контролирует стромальное ремоделирование, уменьшая помутнение в участке индуцированного лазером повреждения в 24-72-часовом периоде после хирургии. В этом периоде большее число контрольных роговиц (64%), чем обработанных антисмысловым ΘΌΝ роговиц (39%), обнаруживают интенсивное помутнение во всей строме.

Введение коннексин-специфических антисмысловых ΘΌΝ ингибирует стромальный отек во время ранних стадий ремоделирования. Таким образом, регуляция прямой коммуникации клетка-клетка улучшает результаты лазерной хирургии.

Введение коннексин-специфических антисмысловых ΘΌΝ уменьшает пролиферацию клеток в ранних стадиях ремоделирования. Таким образом, регуляция прямой коммуникации клетка-клетка может быть использована для регуляции пролиферации клеток во время ремоделирования ткани.

Введение коннексин-специфических антисмысловых ΘΌΝ уменьшает эпителиальную гиперплазию на 78% (оцениваемую от 24 до 72 ч после хирургии), делая возможным конструирование однородного

- 45 029094

эпителия.

Введение коннексин-специфических антисмысловых 0ΌΝ уменьшает активацию миофибробластов до 1 недели после хирургии (и более раннюю потерю кератоцитов). Регуляция прямой коммуникации клетка-клетка делает возможным более точный контроль повреждения ткани во время хирургического ремоделирования, обеспечивающий улучшенную предсказуемость результата и меньшее число дефектов зрения.

Введение коннексин-специфических антисмысловых 0ΌΝ приводит к более равномерному и более плотному эпителиально-стромальному адгезионному матриксу во время ремоделирования ткани. Таким образом, регуляция прямой коммуникации клетка-клетка может быть использована для конструирования тканевых базальных пластинок.

Кроме того, модель корнеальной культуры ех νίνο, использованная здесь, показывает, что регуляция прямой коммуникации клетка-клетка может быть использована для построения ткани ίη νίίτο, например, с увеличением толщины эпителия с использованием коннексин 31.1-специфических антисмысловых 0ΌΝ. Эта обработка может быть также применена ίη νίνο, например, в построении более толстой роговицы для облегчения корнеальных заболеваний, таких как кератоконус (утоньшение эпителия).

Эти результаты показывают, что активные молекулы, которые препятствуют коммуникации клеткаклетка, могут быть использованы в конструировании и ремоделировании ткани. Конкретно показано, что антисмысловые дезоксинуклеотиды, нацеленные на белки коннексины, могут быть использованы в ремоделировании роговицы, в частности, после корректирующей лазерной хирургии, а также в конструировании ткани ίη νίνο и ίη νίίτο.

Антисмысловые соединения и способы, описанные здесь, имеют значительный потенциал для улучшения исхода хирургических вмешательств и ослабления процессов заболеваний в глазу и для конструирования ткани.

Пример IV. Модель культуры ех νίνο.

Нанесение антисмысловых олигодезоксинуклеотидов, специфических в отношении белка щелевого контакта коннексина 43, после повреждения головного мозга или спинного мозга в моделях взрослых животных блокирует распространение повреждения и уменьшает воспалительную реакцию и последующее образование рубцов. Авторы данного изобретения использовали их подход с антисмысловыми соединениями даже более широко и разработали модель культуры ех νίνο для сегментов спинного мозга и интактного спинного мозга для развития стратегий восстановления для установленных повреждений.

Спинной мозг вырезали из детенышей крыс Р7-Р14 и делили на каудальный, торакальный и ростральный сегменты. Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды наносили в геле Плюроника на срезанные концы сегментов спинного мозга во время помещения в культуру, что приводит к уменьшению уровней белка коннексина 43 в течение 24-48 ч, значимо уменьшая жизнеспособность этой ткани. Наиболее быстрое и заметное наблюдение состоит в том, что не происходит опухание (фиг. 8А-В, показывающая сегменты спинного мозга спустя 24 ч после помещения в культуру). Эта обработка блокирует распространение от срезанных концов спинного мозга. Увеличенное выживание нейронов в сером веществе обработанных проб является ясно очевидным в окрашенных толуидиновым синим красителем срезах полимера (фиг. 9А). В резком противоречии отек и вакуолизацию нейронов можно видеть по всей контрольной ткани (необработанная, только гель или гель со случайными олигодезоксинуклеотидами) на фиг. 9В.

Последующие мечение и иммуногистохимические исследования до дня 20 показывают, что нейроны в обработанных сегментах спинного мозга (мечение Nеи^οηа1-N) выживают в течение этого периода, тогда как малое количество остается жизнеспособными после всего лишь 3 дней в контрольных сегментах. Мечение изолектином-В4 показывает в сильной степени активированную (макрофагальный фенотип) микроглиальную инвазию контрольных сегментов в пределах пяти дней в культуре. В обработанных пробах активированные микроглиальные клетки приурочены к наружным краям (где ранее были нервные пучки аксонов, и в самих срезанных концах). Примечательно, что мечение МАР-2 маркером нейрональных отростков указывает на значительный потенциал для возобновления роста в обработанных сегментах спинного мозга в сравнении с контрольными сегментами, которые вообще не обнаруживают мечения МАР-2 (фиг. 10А-В).

Пример V. Трансплантация периферических нервов поперек повреждений спинного мозга.

Для трансплантации периферических нервов авторы повторно обрабатывают ткань коннексин 43специфическими антисмысловыми олигодезоксинуклеотидами в момент трансплантации для предотвращения распространения повреждения от участка трансплантации и микроглиальной активации, которая приводит к отделению трансплантата от невральной популяции ткани хозяина, ограничивая восстановление нейронов.

Трансплантаты периферических нервов.

Сегменты спинного мозга помещают на вкладыши для культуры (МПЬроге МШюе11) в чашках 35 мм, и уровень культуральной среды повышают, пока на этих сегментах не образуется мениск. Коннексин 43-специфические олигодезоксинуклеотиды (30-меры, концентрация 1 мкМ) в 30% геле Плюроника помещают непосредственно на ткань спинного мозга. Этот гель устанавливается при подогревании его до физиологических температур и обеспечивает пролонгированное высвобождение антисмысловых олиго- 46 029094

меров. Эта обработка будет уменьшать уровни белка коннексина 43 в течение 24-48 ч, с максимальным уменьшением при 6-8 ч после обработки. Такие сегменты спинного мозга, стабилизированные в культуре и затем повторно подвергнутые травме разрезанием, обнаруживают те же самые симптомы, что и симптомы при хирургическом вмешательстве ίπ У1уо, в том числе распространение повреждений и опухание ткани в зоне разреза. Этот эффект может быть предотвращен обработкой коннексин 43-специфическими антисмысловыми олигомерами во время разрезания; и, следовательно, края разрезов остаются четко определенными без видимых признаков отека или набухания ткани.

Эти сегменты помещают один за другим, но разделяют промежутком 1-5 мм. После периода стабилизации в культуре в течение одного-трех дней трансплантат седалищного нерва из детеныша крысы Р7Р14 помещают поперек этого промежутка. Предварительные исследования показали, что трансплантация седалищного нерва (или его ответвления, относящегося к подкожной вене ноги) (У1ск Γ\ν. е! а1., 1999, Ехр. №иго1. 159: 131-138; Адиауо Ай. е! а1., 1981, 1. Ехр. Вю1. 95: 231-240), как и межреберного нерва (Сйгепд Н., е! а1., 1996, Заепсе, 273: 510-513) имеет значительный потенциал в индукции удлинения аксонов и выживания нейронов.

Сразу же после трансплантации начинают повторную обработку коннексин 43-антисмысловыми олигомерами, сопровождающуюся оценкой поведения нейронов, на протяжении последующих дней. Поскольку культуральный период после трансплантации является относительно коротким (до 15 дней) в сравнении с исследованиями ш У1уо (15 дней - 7 месяцев после хирургии), используют различные маркеры для оценки реакции репарации, как подробно описано ниже ("Измерение результатов"). Эксперименты проводят с добавлением или без добавления экзогенных факторов роста (таких как кислотные РОР или УОР), которые могут играть роль в индуцировании пролиферации и/или миграции нейронов.

Пример VI. Вставление засеянных шванновскими клетками имплантатов между сегментами, помещенными один за другим.

Для имплантатов между обработанными сегментами были выбраны шванновские клетки, так как было показано, что они являются сильными активаторами регенерации аксонов (Хи Х.М. е! а1., 1999, I. №υΐΌ8€ί. 11: 1723-1740; Кеййеай Н.З. е! а1., 1999, Ехр. №ито1. 159:225-236).

Имлантированные клетки могут обеспечивать пермиссивную среду для регенерации аксонов центральной нервной системы, и было доказано, что они являются эффективными в отношении индукции повторного роста аксонов. Засеянные шванновскими клетками миниканальные имплантаты или матригель, помещенные между сегментами спинного мозга один за другим, должны быть использованы для этого применения. Принцип, используемый здесь, заключается в том, что для вмешательств с целью восстановления спинного мозга, в конечном счете, было бы желательным вырезание рубцовой ткани и заполнение этого пространства материалом имплантата. Используемые способы описаны Мот88еу е! а1., и Хи е! а1., (Мот88еу Т.К. е! а1., 1991, 1. №иго8ск 11: 2433-2442; Хи Х.М. е! а1., 1995, 1. Сотр. №ито1. 351: 145-160). В основном седалищные нервы получают из взрослых крыс, затем удаляют эпиневрий и соединительную ткань и эксплантаты длиной 1 мм помещают в культуру с модифицированной Дульбекко средой Игла (ИМЕМ-ОЛсо, ИЗА). Результатом роста мигрирующих клеток являются преимущественно фибробласты, и эти эксплантаты перемещают в новую чашку при достижении их конфлюентности. Это повторяют на протяжении трех-пяти пассажей, пока клетками, которые возникают, не станут первичные шванновские клетки. Их диссоциируют и выращивают для засева в проводящие каналы сополимера или матригеля (ЗсПний! С.Е. апй В;иег ЬеасЬ, I., 2003, Апп. Кеу. Вютей/ Епд. 5: 293-347). После приготовления материала имплантата у культивируемых сегментов срезают их концы для имитации иссечения рубцов и помещают их один за другим с материалом имплантатов, втиснутым между ними. Сразу же после трансплантации пробы повторно обрабатывают коннексин 43-специфическими антисмысловыми олигомерами и поведение нейронов подвергают мониторингу на протяжении последующих дней.

Измерение результатов.

Эксперименты с временным ходом проводили как для периферических трансплантатов, так и для имплантатов для установления, имеется ли немедленная, поздняя или непрерывная реакция на ткани трансплантата. Использовали несколько маркеров для оценки реакции нейронов и потенциала репарации (восстановления). Они включают в себя нейронные (антитела к №игопа1-№), нейрофиламентарные (антитела к МАР-2 и ЗМ1-31) и цитоплазматические маркеры (СМРИА) и мембранные красители (Όί-Ι или Ахоп дгеа8е-Мо1еси1аг РгоЬе8, Огедоп, ИЗА). Увеличенное разрастание нейронов, увеличенное расстояние миграции аксонов (отношение длины мостиков к расстоянию миграции) и увеличенные количества аксонов, растущих к трансплантату или через трансплантат, подвергают особому мониторингу. Используют клеткоспецифические маркеры (ОРАР для астроцитов, изолектин-В4 для микроглиальных клеток и З-100 для шванновских клеток). Оценивают распределение и плотность глиальных клеток и уровни миелинизации. Анти-СОКР (маркер периферических нервов) используют для различения между аксонами, происходящими из периферических нервов, и аксонами, регенерирующимися из сегментов спинного мозга. Анти-ОΆР-43-антитела (антитела к ассоциированному с ростом белку) используют для идентификации конусов роста нейронов. Окрашенные толуидиновым синим красителем полутонкие срезы и электронную микроскопию поперечных срезов трансплантатов используют для морфологического анализа.

Вторичные антитела конъюгируют с красителем Алекса. Для двойного или тройного мечения авто- 47 029094

ры используют зонды 2еиои (Мо1еси1аг РгоЬек, Огедои, И8А), когда это необходимо. Все содержащие антитела и красители метки анализируют с использованием конфокальных лазерных сканирующих микроскопов ТС8 4Ό и §Р2 ТЬе ишуегкйу о£ Аиск1аий'к Вютейюа1 1тадшд КекеагсЬ Ит! Ьека. Электронную микроскопию выполняют на электронном микроскопе НйасЫ Н-7000. Используют программы анализа изображений (Аиа1у818 или №Н 1таде ί) для количественного определения различий между контрольными и обработанными трансплантатами.

Пример 7. Конструирование антисмысловых олигодезоксинуклеотидов.

Материалы.

Используемые здесь материалы включают в себя общепризнанные в данной области антитела и плазмиды; такие как, например, плазмиды для коннексина 43 (Т7291) и коннексина 26 крыс; плазмиды для коннексина 43 и коннексина 26 мышей Диуйгодеи, И8А), мышиные антитела против коннексина 43 крысы и кроличьи антитела против коннексина 26 крысы из Яутей (51-2800); вторичные козьи антитела против мышиного иммуноглобулина А1еха 488 и вторичные козьи антитела против кроличьего иммуноглобулина А1еха 568 из Мо1еси1аг РгоЬек, Еидеие ОК. Ядра окрашивали при помощи красителя НоесЬк! 33258 (§1дта). Все дезоксирибозимы и олигодезоксинуклеотиды покупали от §1дта Сеиокук, АикйаНа, в виде обессоленных олигомеров. Меченые ТацМаи олигомеры покупали от Аррйей Вюкук!етк, И8А. Все олигодезоксинуклеотиды покупали в виде немодифицированных фосфодиэфирных олигодезоксинуклеотидов.

Конструирование дезоксирибозимов.

Конструирование и испытание дезоксирибозимов было сходным с конструированием и испытанием дезоксирибозимов, описанным в более ранних исследованиях (§аи!ого δ.ν. аий 1оусе С.Р. Ргос. №!1. Асай. §ск И8А, (1997), 94, 4262-4266 и Сайте М.1. е! а1. (1999) №·ιΙ. Вю!есЬ 17, 480-486). Вкратце, все сайты Аи и СИ в мРНК-последовательности коннексина-мишени были выбраны с 8 или 9 нуклеотидами на каждой стороне от А или С. Эти дезоксирибозимы являются комплементом этой смысловой кодирующей последовательности с "А" или "С", замененными "10-23" каталитической корпоследовательностью "ддс!адс!асаасда". Контрольные дезоксирибозимы имели дефектную каталитическую кор-последовательность "ддс!аАс!асаасда" с единственной точковой мутацией (д^А) (§аи!ого δ.ν. аий 1оусе С.Р. ВюсЬет 37, 13330-13342). Авторы изобретения сконструировали также СС- и АСспецифические дезоксирибозимы для охвата брешей, оставленных дезоксирибозимами Аи и СИ, не удовлетворяющими трем требованиям, описанным ниже. Каждый дезоксирибозим был назван в соответствии с положением нуклеотидов "А" или "С" относительно стартового кодона АТС. Дезоксирибозимы, выбранные для анализа ш уйго, должны были удовлетворять трем требованиям:

(1) термостабильность: выбранные дезоксирибозимы не должны образовывать стабильные вторичные структуры, шпилечные петли или гомодимеры. Любой дезоксирибозим с температурой плавления шпильки или гомодимера, большей чем 37°С, отбрасывали как предположительно не способный к связыванию последовательности-мишени при физиологических температурах;

(2) аффинность: общие величины АС обоих связывающих плечей не должны быть большими чем -30 ккал. Каждое индивидуальное связывающее плечо находится между -10 и -15 ккал. Это является компромиссом между отношением специфичность связывания/ошибочный прайминг (вследствие высокого содержания СС) и требованием эффективного отношения связывание/число оборотов для дезоксирибозимов. Длину связывающего плеча каждой стороны сайта расщепления корректируют для нахождения идеальной величины АС и стадию (1) повторяют для проверки;

(3) специфичность: все связывающие мишень последовательности подвергали поиску с использованием ВЬАЗТи в СеиВаик для проверки на специфичность (Ьйр://ууу.дсЬйи1т.тЬ.доу/ВРА§Т/). Дезоксирибозимы с гомологией в отношении генов других коннексинов или других известных генов грызунов отбрасывали.

Испытание дезоксирибозимов т уйго.

кДНК коннексина 43 и коннексина 26 мыши вырезали из вектора рОКР (1иуйгодеи) с использованием №о1 и Ше1 и субклонировали в плазмиду рСЕМ-Т (Рготеда) перед транскрипцией т уйго. Как полноразмерную кДНК коннексина 43 2,4 т.п.н. крысы, так и полную кодирующую кДНК коннексина 43 1,4 т.п.н. крысы, включающую в себя 200 нуклеотидов 5'-нетранслируемых районов, использовали для транскрипции ш уйго. Полноразмерную мРНК транскрибировали из линеаризованной ДНК плазмиды с использованием набора Рготеда КтЬоргоЬе. Полученную мРНК очищали с использованием центрифугируемой колонки для ПЦР (Ц1адеи). Концентрацию определяли спектрофотометрическим определением ОИ при 260 нм. Затем дезоксирибозимы (конечная концентрация 40 мкМ) и мРНК (0,01-0,05 мкг/мкл тотальной мРНК) уравновешивали по отдельности с 2х буфером для расщепления (100 мМ Трис 7,5; 20 мМ МдС1₂; 300 мМ №С1; 0,02% ДСН) в течение 5-10 мин при 37°С. Затем смесь мРНК и дезоксирибозима инкубировали в течение одного часа при 37°С, после чего добавляли 10х В1ие_)шсе Диуйгодеи) для остановки реакции расщепления, и эту смесь выдерживали на льду. Затем эту реакционную смесь наносили на предварительно прогнанный 4% полиакриламидный гель (отношение 19:1 акрил/бис, ВюКай) в 1х ТБЭ-буфере и 7М мочевине и выполняли электрофорез в течение периода времени до 2 ч. Гели окра- 48 029094

шивали разведением 1:10000 красителя 8УВК дгееп II (Мо1 РгоЬек, И8А) в ТБЭ-буфере, и получали изображение с использованием системы ВюКай Сйет1 Эос.

Конструирование антисмысловых олигомеров.

Выбирали антисмысловые последовательности на основе 20 нуклеотидных последовательностей связывающих плечей дезоксирибозимов, которые были успешными в расщеплении мРНК ш уйго. Выбранные последовательности отбирали для применения в конструировании 30-мерных олиго (Вгуксй А. (1999). Апйкепке Тесйпо1оду ш !йе Уеп!га1 Ыегуоик 8ук!ет, ей. Н.А. КоЬегЕоп; ОхГогй Итуегкйу Ргекк 2141) и (Аа1!оп 8., е! а1. (2002) Вюрйукюа1 1оигпа1 82, 366-377). Вкратце, избегали последовательностьассоциированных побочных эффектов, таких как частичная гомология последовательности 8-10 спариваний оснований СС с неродственными генами, мотивы СССС и СрС. Избегали также антисмысловых последовательностей с 3 '-концом, заканчивающимся тимидином, или имеющих более чем три С или С в последних пяти нуклеотидах, если это возможно, для предотвращения ошибочного прайминга. Олигомеры, которые образуют стабильные вторичные структуры, такие как гомодимеры, палиндромные мотивы или вторичные шпилечные структуры, будут препятствовать связыванию олигомеров с мРНК-мишенью. Контрольные олигомеры, в том числе смысловые, перетасованные, обращенные и имеющие ошибочные спаривания олигомеры, были также сконструированы для оценки возможных связанных с химией побочных эффектов, обусловленных перекрестной гибридизацией, неспецифическим связыванием белков и токсичностью.

Органная культура роговицы и обработка антисмысловыми олигонуклеотидами.

30-34-дневных крыс АЕ!аг эвтанизировали диоксидом углерода и иссекали целые глаза крыс. Глазную поверхность рассекали, дезинфицировали 0,1 мг/мл смеси пенициллин-стрептомицин в течение 5 мин и промывали в стерильном ЗФР. Затем целый глаз переносили на стерильный держатель в культуральной чашке 60 мм с роговицей, обращенной вверх. Глаза помещали таким образом, чтобы корнеальный эпителий был экспонирован на границе раздела воздух-среда, и культивировали при 34°С в увлажненном термостате с 5% СО₂ в бессывороточной среде (ОрН-МЕМ, 1пуйгодеп) в течение периода времени до 48 ч. 100 мкл среды добавляли по каплям на эту поверхность каждые 8-12 ч для увлажнения эпителия. Уровни среды поддерживали на уровне лимбальной конъюнктивы.

Антисмысловые олигомеры смешивали с 30% (мас./мас.) гелем Плюроника Р127 (81дта) на льду до конечной концентрации 2 мкМ и 10 мкл наносили на эти роговицы, как описано ранее (см. Вескег И.Ь., е! а1. (1999Ь) 1)е\. Сепе!. 24:33-42; Сгееп С.К., е! а1. (2001), Ме!йойк Мо1 Вю1 154, 175-185). Каждая обработка имела размер выборки 3-4 роговицы на один эксперимент. Предварительные эксперименты показали, что двойные обработки использованного положительного контроля ИВ1 в течение 8 ч оказывали малое влияние на экспрессию белка коннексина 43 в корнеальной культуре авторов изобретения. Таким образом, роговицы культивировали в течение 24 ч, и конкретные олигомеры коннексина 43 наносили каждые 8 ч. Однако авторы данного изобретения обнаружили, что на эндогенную экспрессию коннексина 43 оказывает влияние поддержание этой культуры в течение 24 ч. Таким образом, авторы изобретения уменьшили период культивирования для обработанных коннексин 26-специфическими олигомерами роговиц до 12 ч с нанесением антисмысловых олигомеров каждые 4 ч. Среду заменяли за 10 мин перед каждым повторным нанесением антисмысловых или контрольных олигомеров. В определенных временных точках роговицы промывали ЗФР, погружали в ОСТ (ТЕкие Тек, 1араи) и быстро замораживали в жидком азоте. Затем криосрезы с толщиной 25 мкм (для иммуномечения) нарезали с использованием Ьеюа сгуок!а! (СМ3050к) и помещали на предметные стекла 8ирегГгок! Р1ик (Меп/ек Сегтапу). Для анализа мРНК коннексина 43 (Сх43) и коннексина 26 (Сх26) роговицы собирали спустя 8 ч после единственной обработки антисмысловым олигомером.

Выделение РНК и ПЦР реального времени.

Тотальную РНК экстрагировали из выделенных роговиц крыс с использованием реагента ТК1/о1 (С1ВСО, 1пуйгодеп, И8А) в соответствии с протоколами изготовителя. Качество проб РНК оценивали электрофорезом с использованием окрашенных бромидом этидия агарозных гелей, и полосы рРНК 188 и 288 визуализировали освещением УФ. Выход удаления определяли количественно спектрофотометрически при 260 нм. Для ПЦР реального времени получали кДНК из 5 мкг тотальной РНК с использованием олиго йТ и РНКазы Н - обратной транскриптазы 8ирегкспр! II (ЫГе Тесйпо1од1ек, 1ЫУ1ТКОСЕК И8А) в конечном реакционном объеме 20 мкл. Количественную ПЦР-реакцию проводили в 96-луночных планшетах для оптической реакции с использованием кДНК-эквивалента 100 нг тотальной РНК для каждой пробы в объеме 50 мкл с использованием смеси ТадМап итуегка1 РСК Мак!ег М1х (АррНей Вюкук!етк, И8А) в соответствии с инструкциями изготовителя. ПЦР проявляли на приборе АБI РЫ8М 7700 8едпепсе Ие!ес!юп кук!ет (АррНей Вюкук!етк, И8А). Условия термоциклера предусматривали исходную температуру денатурации при 95°С и 1 мин отжига-элонгации при 60°С с использованием стандартного протокола изготовителя. Все эксперименты повторяли в трех повторностях. Мониторинг отрицательного контроля для каждой мишени показал отсутствие переноса.

Амплификацию рРНК 188 выполняли в качестве внутреннего стандарта, против которого могут быть нормализованы другие величины РНК. Если эффективности амплификации мишени и рРНК 188 были приблизительно равными, то использовали формулу 2^-ЛЛС! для расчета относительных уровней

- 49 029094

мРНК без необходимости стандартной кривой. Если эффективность амплификации мишени и рРНК 18δ были значимо различными, использовали способ кривой относительных стандартов для расчета абсолютных количеств мРНК и рРНК 18δ для каждого эксперимента из измеренной С!, и затем относительные уровни мРНК гена-мишени сравнивали с контролем, количественно определенным после нормализации относительно рРНК 18δ.

Все расчеты выполняли с использованием программы ΡΡΙδΜ 3.02 (ОгарйРай, δаи Б1едо). Статистическое различие определяли с использованием ΐ-критерия Стьюдента. Сравнение среди нескольких групп выполняли с использованием АNΟVА, и значимость рассчитывали с использованием критерия множественного сравнения Бшие!!. Оценка эффективности антисмысловых олигомеров в блокировании трансляции.

Су3- и Та₄Маи-(РАМ, ТАМРА)-меченые олигомеры использовали для оценки проникновения и стабильности. Су3-меченые олигомеры ^1дта Оеиокук) и Та₄Маи-(РАМ, ТАМРА)-меченые олигомеры (АррНей Вю5у5!етк) наносили с гелем Плюроника для измерения как стабильности, так и проникновения олигомеров в эпителий роговицы. Обработанные роговицы фиксировали в 4%-ном параформальдегиде в течение 20 мин, готовили препарат в 1%-ном агаре и наблюдали под 40х водным иммерсионным объективом в виде тотального препарата. Глубину проникновения олигомера измеряли с использованием Ζскан-опции на конфокальном микроскопе δΡ2 Ьека, и строили графики интенсивности как функции ζрасстояния. Распад ТадМаи-олигомеров измеряли с использованием ЬатЬйа-опции на конфокальном микроскопе. Резонансный перенос энергии флуоресценции (или ΓΡΕΓ) между молекулой РАМ (донором) и молекулой ТАМРА (рецептором) происходит на интактных 30-мерных олигомерах. Когда этот олигомер разрушается, РАМ и ТАМРА не находятся далее в тесной близости и РΡΕΤ больше не происходит.

Иммунофлуоресцентное мечение.

Иммуномечение коннексинов на срезах роговиц выполняли, как описано ранее. Вкратце, срезы блокировали в 10%-ной козьей сыворотке и инкубировали с первичным антителом при разведении 1:250 (мышиное антитело против крысиного коннексина 43) или 1:500 (кроличье антитело против крысиного коннексина 26) при 4°С в течение ночи. Затем эти срезы промывали ЗФР, инкубировали с разведением 1:400 меченого вторичного антитела А1еха 488 при комнатной температуре в течение 2 ч и затем фиксировали в 4%-ном параформальдегиде и контрастировали 0,2 мкМ иодидом пропидия или 1:50 разведением Ноесйк! 33258 в течение 10 мин. Срезы заключали в среду СШЙиот аиРГайе тейит (Лдаг5С1еШ|Пс БК). Все изображения получали с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Ьеюа ТСЪ-4Б или Ье1са δΡ2 и хранили в виде ТГР-файлов. Все изображения собирали с использованием поддерживаемого напряжения (520-540 В) и смещаемых (-2) параметров настройки. Напряжение и смещение устанавливали с использованием опции дисплея "д1о^-оуег-иийег" для максимизации шкалы яркости (шкалы уровней серого цвета) для изображений контрольной ткани. Затем те же самые параметры настройки использовали для всех проб в одном и том же эксперименте.

Для количественного определения четыре оптических среза через три микрометра обрабатывали в единственное оптическое изображение с расширенным фокусом с использованием центра опции топографической проекции большой емкости на ΤСδ 4Ό. Метку коннексина определяли количественно с использованием №Н Ийаде (Яшои Согр. ^А) после установления порогов при интенсивности 90-100 пикселов на изображении с 256-уровневой шкалой серого цвета. Измеряли также площадь корнеального эпителия и плотность коннексина на единицу площади. Использовали в среднем четыре изображения с расширенным фокусом для расчета плотности коннексина каждой роговицы. Затем это количество нормализовали с использованием средней плотности коннексина либо обработанных смысловым контролем, либо обработанных гелем роговиц. Авторы представили эти результаты в виде процента снижения при сравнении различных обработок. Дезоксирибозимы селективно расщепляют мРНК ш νίΙΐΌ.

66 дезоксирибозимов конструировали специфически против мРНК коннексина 43 грызунов (табл. 5). 22 из этих дезоксирибозимов конструировали для узнавания как мышиной, так и крысиной мРНК коннексина 43. Авторы изобретения покупали также два дефектных дезоксирибозима с единственной точковой мутацией в "10-23" каталитической кор-последовательности в качестве негативных контролей. Результаты расщепления дезоксирибозимами были сходными для мРНК с длиной 1,1 т.п.н. коннексина 43 крысы (не показаны) и мРНК с длиной 2,4 т.п.н. коннексина 43 крысы (фиг. 11А). Как крысиная (фиг. 11А), так и мышиная (фиг. 11В) мРНК коннексина 43 имеет, по-видимому, сходные районы, доступные для дезоксирибозимов. Эти результаты показывают четыре района на мРНК коннексина 43 грызунов, которые экспонированы и доступны для расщепления дезоксирибозимами. Эти районы находятся около оснований 367-466, 526-622, 783-885 и 1007-1076 от стартового кодона АТО. Два дефектных дезоксирибозима, а1йГ605 и а1йГ783, не обнаруживали расщепления мРНК коннексина 43 грызунов. Дезоксирибозимы, сконструированные против 5'-нетранслируемого района 200 п.н. мРНК коннексина 43 крысы, также не обнаруживали какой-либо активности расщепления.

- 50 029094

Таблица 5

Суммированные результаты для последовательностей дезоксирибозимов (й/) и антисмысловых (аз) олигодезоксинуклеотидов, обнаруживающих различные степени активности ш νίΐΐΌ и ш νί\Ό против коннексина 43 крысы

Название	Последовательность 5’- 3’ ΟΌΝ	ίη νίίτο	ίη νΐνο белок	ίη νΐνο мРНК
ЗЕО ГО N0:32 г43±Л4	ССААООСА £§с1а§с1:асаас£а ТССАОТСА	-
ЗЕО ГО N0:33 а1йг605	СССТОООА £§о(а§с1асаасца ОТОАОАОО	+
ЗЕО ГО N0:34 аШ605	СССТОООА §§с(аАсисаас£а ОТОАОАОО	-
ЗЕО ГО ΝΟ: 35 г43сП769	АОТСТТТТО £§с(а§с(асаас2а ТОООСТСА	-
ЗЕО ГО N0:36 η16ζ783	ТТТООАОА £§с1а£с1асаасда ССОСАОТС	++
ЗЕО ГО ΝΟ: 37 аШГ783	ΊΤΤΟΟΑΟΑ £§с(аАс1асаас§а ССОСАОТС	-
ЗЕО ГО N0:38 Γ43όζ885ϋΒ1	АСОАООАА £§с1а§с(асаас£а ТОТТТСТО	-НН-
ЗЕО ГО ΝΟ: 39 τ43άζ892	ТТОСООС £§с1а§с(асаас§а СОАООААТ	-
3Ε<3 ПЗ ΝΟ: 40 τ43άζ953	ССАТОСОА §§с1а§с1асаас§а ТТТОСТСТ	+++
5Ε<3ΠΟΝΟ:41 τ43άζ1076	ТТООТССА д§с1а0с(асаасда ОАТООСТА	+++
5Ε<3ΙϋΝΟ:42 ΌΒ1	ОТА АТТ ОСО ОСА ООА ООА АТТ ОТТ ТСТ	+	++
	ОТО
5ΕΡΠ3ΝΟ:43 ϋΒΙδ	ОАСАОАААСААТТССТССТОССОСААТТАС	-	-
5Ε0 Ιϋ ΝΟ: 44 г43аз14	ССААООСАСТССАОТСАС		-
ЗЕО ГО N0:45 а1азб05	ТССОТОООАСОТОАОАООА		++	++
ЗЕО ГО N0:46 г43аз769	АОТСТТТТОАТОООСТСА		ир	ир
ЗЕО Π> N0:47 а1аз783	ТТТТООАОАТССОСАОТСТ		+	++
ЗЕО ΓΟΝΟ: 48 г43аз885	САСОАООААТТОТТТСТОТ		+
ЗЕО ΠΟΝΟ: 49 г43аз892	ТТТОСООСАСОАООААТТ		-
ЗЕО ГО N0:50 а1аз953	СССАТОСОАТТТТОСТСТО		+
ЗЕО ГО ΝΟ: 51 а1аз1076	ОТГООТССАСОАТООСТАА		+

Табл. 5 показывает последовательности рибозимов и антисмысловые последовательности, выбранные на основании исследований расщепления рибозимами ш νίΐΐΌ для ш νί\Ό анализа (уровней мРНК и/или уровней белка), или когда дефектные контрольные рибозимы (δΕΡ II) ΝΘ:56 и 5ЕР II) ΝΘ:59) сравнивали с нормальными рибозимами.

Названия олигомеров имеют префикс г43, когда они являются специфическими только для коннексина 43 крыс; префикс α1 обозначает специфичность как против мыши, так и против крысы. Все последовательности олигомеров являются немодифицированными фосфодиэфирными олигодезоксинуклеотидами. "Сдс!адс!асаасда" представляет "10-23" каталитическую кор-последовательность дезоксирибозимов, а "ддс!аАс!асаасда" является дефектным мутантным контролем. ΏΒ1 является 30-мерным вариантом а§885 (показанным строчными буквами), а ΏΒ1δ является смысловым контролем последовательности ΏΒ1. Эффекты 1и νίΐΐΌ измеряли в виде процента расщепления мРНК индивидуальными дезоксирибозимами. Эффекты ш у1уо измеряли иммуномечением коннексина 43 в срезах роговицы (см. фиг. 15) или оценкой при помощи ПЦР реального времени уровней выживших мРНК (см. фиг. 16). +++ обозначает >75%, ++ обозначает 50-75%, + обозначает 25-50% и - обозначает 0-25% расщепление мРНК ш νίΐΐΌ или уменьшение экспрессии белка и экспрессии мРНК ш у1уо. ϋρ обозначает увеличение экспрессии белка коннексина 43 в сравнении с обработкой смысловой последовательностью ΏΒ1 или контролем с использованием только геля.

Авторы изобретения испытывали также 44 дезоксирибозима, сконструированных специфически против мРНК коннексина 26 крысы (табл. 6), из которых 17 дезоксирибозимов подходили как для мышиной, так и для крысиной мРНК коннексина 26. мРНК коннексина 26 крысы появлялась в виде двойной полосы на геле благодаря присутствию двух промоторов РНК-полимеразы Т7 на клонирующей плазмиде. Результаты расщепления показывают, что мРНК коннексина 26 имеет по меньшей мере два района, доступных дезоксирибозимам, в районах оснований 318-379 и 493-567 (фиг. 12А, 12В). Эти фигуры показывают, что наиболее стойко расщепляющим дезоксирибозимом является сх26й/330, который расщепляет оба вида мРНК в пределах одного часа. Два дефектных дезоксирибозима (Ъ2йГ351 и Ъ2йГ379) не обнаруживали расщепления мРНК коннексина 26 грызунов. Дезоксирибозимы сх26й/341, й/351, й/375, й/379 стойко расщепляют мРИК коннексина 26 крысы при более высокой скорости в сравнении с мРНК коннексина 26 мыши. С другой стороны, тс\26(1/153 и (1/567 являются, по-видимому, лучшими дезоксирибозимами коннексина 26 для мыши в сравнении с крысой.

- 51 029094

Таблица 6

Последовательности дезоксирибозимов (йг) и антисмысловых (аз) олигодезоксинуклеотидов, обнаруживающих различные степени активности ίη νίίτο и ίη νίνο против коннексина 26 грызунов

Название	Последовательность 5’-3> ΟΏΝ	ίη ίη νίνο νίίτο белок	1η νίνο мРНК
5Ε<3Π)ΝΟ:52 ηι26ί1ζ153	ОТТОСАОА ё2о1адс1ас£щсеа АААА'Г'ССО	+ 4-1-
5Е<5 ГО ΝΟ: 53 ЬЗйгЗЗО	ОТТС'ГТТА еейаесисаасеа СТСТСССТ	++-+
3Ε0Π?ΝΟ:54 Ь2±О41	ОТССТТАЛА еес1а§с1асаасеа ТСОТТСТТТ	4-++
8ΕΟΠ)ΝΟ:55 62όζ351	ТСТСТТСОА 8Есиг>с1асаасца ОТССТТАЛА	++-+
8Ε0ΙΟΝΟ:56 Ь2сИ351	ТСТСТТСОА еессаАсисаасеа ОТССТТАЛА	-
ЗЕф ГО ΝΟ: 57 Β2όζ375	САТАСООА 5ёСЫвс1асаас§а СТТСТООО	++ +
5Εφ©ΝΟ:58 ΒΜζ379	СТТССАТА ёес(аесСасаас§а СОАССТТС	4-(-+
ЗЕфЮМО:59 Ь2ао79	СТТССАТА еес1аЛс1асаас£а СОАССТТС	-
ЗЕф ГО ΝΟ: 60 πι26άζ567	СОТСААСА ёёйаесиоаасеа АСТСТТТТСТ	-Η—г
3ΕςΠ)ΝΟ:6! ь2аз330п	ССТТАААСТССТТСТТТАТСТСТСССТТСА	-	++
ЗЕф ГО ΝΟ: 62 ИгуЗЗОп	АСТТСССТСТСТАТТТСТТССТСАААТТСС	-	-
ЗЕф ГО ΝΟ: 63 г26аз375п	ТАСООАССТТСТОСОТТТТОАТСТСТТССА	-	+
8Б<3 ГО ΝΟ: 64 г26гу375п	АССГГСТСТАСТТТТСССТСТТССАСССАТ	-

Табл. 6 показывает последовательности рибозимов и антисмысловые последовательности, которые стойко расщепляют мРНК ίη νίίτο, выбранные на основании исследований расщепления рибозимами ίη νίίτο для ίη νίνο анализа (уровней мРНК и/или уровней белка), или когда их используют в качестве дефектных контрольных рибозимов. Названия олигомеров имеют префикс т26 или г26, когда они являются специфическими только для мРНК коннексина 26 крыс; и префикс Ь2 обозначает специфичность против обоих видов. Все последовательности олигомеров являются немодифицированными фосфодиэфирными олигодезоксинуклеотидами. "Одс!адс1асаасда" представляет "10-23" каталитическую корпоследовательность дезоксирибозимов, а "ддс!аЛс1асаасда" является дефектным мутантным контролем. Использовали также обращенный контроль (τν) для контроля на любые неспецифические эффекты антисмысловых олигомеров. Эффекты ίη νίνο измеряли иммуномечением коннексина 26 в срезах роговицы и ПЦР реальной экспрессии мРНК-мишени (см. фиг. 17). +++ обозначает >75%, ++ обозначает 50-75%, + обозначает 25-50% и - обозначает 0-25% расщепление мРНК ίη νίίτο или уменьшение экспрессии белка и экспрессии мРНК ίη νίνο.

Флуоресцентно меченые 0ΌΝ в геле Плюроника могут проникать в корнеальный эпителий.

Роговицы крыс поддерживают экспрессию как коннексина 43, так и коннексина 26 в культуре органа и легко доступны для доставки антисмысловых олигомеров с использованием геля Р1иготс Р-127. Таким образом, культура органа роговицы крысы была выбрана в качестве модельной системы для испытания эффективности конструкций антисмысловых олигодезоксинуклеотидов, полученных из этой модели ίη νίίτο. Авторы изобретения культивировали роговицы крыс и обнаружили, что эндотелий остается интактным. Однако периоды культивирования, более продолжительные чем 48 ч, по-видимому, влияли на непрозрачность роговиц, и, следовательно, их не использовали. Су3-меченые олигомеры использовали для определения степени проникновения этого олигонуклеотида в культивируемую роговицу. Конфокальные оптические срезы через интактную роговицу показывают, что флуоресцентный сигнал присутствует в случае Су3-меченых олигомеров. Фиг. 13А показывает флуоресцентный сигнал на глубине 10 мкм в культивируемой роговице спустя 1 ч после начальной обработки. ТацМап-зонды, конъюгированные с олигодезоксинуклеотидами, использовали для измерения и демонстрации доставки интактного олигодезоксинуклеотида с 30% гелем Плюроника в эпителий роговицы. Существенная доля олигомера оставалась интактной в течение одного часа после обработки (фиг. 13В, 13С). Пятнистый сигнал интактных олигомеров (РКЕТ, имеющий место на фиг. 13С) может быть виден как красный по длине волны (представленный на шкале уровней серого цвета), тогда как сигнал от деградированных олигомеров (без РКЕТ) появляется в зеленом спектре испускания (представленный на шкале уровней серого цвета) (фиг. 13В).

Анализ с использованием дезоксирибозимов предсказывает 0ΌΝ, которые могут вызывать нокдаун белка коннексина 43 в корнеальном эпителии.

В предварительном эксперименте авторы обрабатывали роговицы крыс единственным нанесением используемого ими положительного контроля, ΌΒ1, и не обнаружили значимых изменений в экспрессии белка коннексина 43 после 8 ч. Явное снижение белка при 24 ч наблюдали после трех нанесений с восьмичасовыми интервалами. На основе, отчасти, результатов из анализа расщепления дезоксирибозимами авторы испытывали некоторые антисмысловые олигомеры ίη νίνο (ΌΒ1, г43аз605, г43аз783, г43аз885, г43аз953 и г43аз1076), а также антисмысловые олигомеры, которые согласно предсказанию были нефункциональными (г43аз14, г43аз769 и г43аз892), и отрицательный контроль (смысловой ΌΒ1). Авторы обнаружили снижение уровней белка коннексина 43 после 24-часовой обработки в сравнении с контролями (фиг. 14А) со всеми антисмысловыми олигомерами, которые, как определили авторы, должны были

- 52 029094

быть положительными (фиг. 14С, 14Е, 14О). Все три из тех, которые должны были быть отрицательными, как было предсказано, и отрицательный контрольный олигомер не влияли на экспрессию коннексина 43 (фиг. 14В, 14Ό, 14Р, 14Н). ΌΒ1, 30-мерный вариант ак855, показал сходный процент снижения относительно более короткого ак885 (чуть ниже 50% снижения). Одним из лучших антисмысловых олигомеров, идентифицированных в этом эксперименте, является, по-видимому, ак605 с уменьшением 64% уровня белка. Суммирование этих количественных результатов представлено на фиг. 15.

Для испытания этого способа в отношении других коннексинов были сконструированы другие олигодезоксинуклеотиды и испытаны в отношении коннексина 26. Были сконструированы два 30-мерных антисмысловых олигодезоксинуклеотида, названные Γ26330Ν и 375Ν, вместе с их соответствующими обращенными контрольными олигодезоксинуклеотидами против коннексина 26 на основе районов в зонах расщепления Ь26ζ330 и Ь26ζ375. Однако авторы обнаружили, что эти антисмысловые олигодезоксинуклеотиды (-κ330Ν и ;·ικ375Ν) не приводили к значимому различию в уровнях экспрессии белка в пределах 12-часового периода времени для этих экспериментов, когда обработанные антисмысловыми олигомерами культуры сравнивали с обработанными обращенным контролем роговицами.

Антисмысловые ΘΌΝ приводят к уменьшению мРНК коннексина 43 и коннексина 26.

ПЦР реального времени использовали для определения действия антисмысловых олигодезоксинуклеотидов на уровни мРНК. Она подтвердила, что антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, которые снижают экспрессию белка коннексина 43 (ак605, ак885, ΌΒ1), имеют также более низкие уровни мРНК коннексина 42 в сравнении с контрольными роговицами в пределах 8 ч после обработки (фиг. 16). Процент уменьшения относительных уровней мРНК коннексина 43 хорошо коррелировал с уровнем уменьшения белка коннексина 43. Отрицательный антисмысловой олигомер (ак769) и отрицательные контроли (смысловой ΌΒ1, только гель) обнаруживали неизмененные уровни мРНК коннексина 43 в сравнении с контрольными роговицами.

Экспрессия мРНК коннексина 43 значимо уменьшалась ;·15330Ν и ;·ικ375Ν в пределах 8 ч антисмысловой обработки (фиг. 17). Контроль с обращенной последовательностью для ;·15330Ν и контроль, содержащий только гель, не обнаруживали действия на уровни мРНК.

Все патенты, публикации, научные статьи, веб-сайты и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, показывают уровни квалификации специалистов в области, к которой относится данное изобретение, и каждый из таких цитируемых документов и материалов включен здесь в качестве ссылки в такой степени, как если бы он был включен в качестве ссылки индивидуально или представлен здесь в его полном виде. Заявители резервируют за собой право физического включения в это описание любого из этих материалов и любой информации из таких патентов, публикаций, научных статей, веб-сайтов, электронной доступной информации и других цитируемых материалов или документов.

Конкретные способы и композиции, описанные здесь, являются репрезентативными предпочтительными вариантами осуществления и являются примерными и не предназначены для ограничений объема данного изобретения. Другие объекты, аспекты и варианты осуществления будут встречаться специалистам с квалификацией в данной области при рассмотрении этого описания, и они включены в рамки идеи данного изобретения, определенной объемом формулы изобретения. Специалистам с квалификацией в данной области будет вполне понятно, что варьирующие замены и модификации могут быть произведены в отношении описанного здесь изобретения без отклонения от объема и идеи данного изобретения. Данное изобретение, иллюстративно описанное здесь, может быть удобным образом использовано на практике в отсутствие какого-либо элемента или элементов, или ограничения или ограничений, которые не описаны здесь особо в качестве существенных элементов или ограничений. Так, например, в каждом случае здесь в вариантах осуществления или примерах данного изобретения любой из терминов "содержащий", "состоящий, по существу, из" и "состоящий из" может быть заменен любым из двух других терминов в данном описании. Термины "охватывающий", "включающий в себя", "содержащий" и т.д. также должны читаться расширенно и без ограничения. Способы и процессы, иллюстративно описанные здесь подходящим образом, могут применяться на практике в различных последовательностях стадий, и они необязательно ограничиваются порядком стадий, указанным здесь или в формуле изобретения. В данном контексте и в прилагаемой формуле изобретения формы в единственном числе "а", '/η" и "(Не" включают в себя и ссылку во множественном числе, если в контексте нет ясного другого указания. Ни при каких обстоятельствах этот патент не может интерпретироваться как являющийся ограниченным конкретными примерами или вариантами осуществления или способами, конкретно описанными здесь. Ни при каких обстоятельствах этот патент не может интерпретироваться как являющийся ограниченным любым утверждением, сделанным экспертом или любым другим чиновником или служащим Патентного ведомства, пока такое утверждение не будет специально и, безусловно, и безоговорочно специально принято в ответе в письменной форме заявителями.

Термины и выражения, которые использовались, применялись в качестве терминов описания, а не ограничения, и использование таких терминов и выражений не предполагает исключения любого эквивалента показанных и описанных признаков или их частей, и признается, что возможны различные модификации в объеме данного изобретения, заявленного в формуле изобретения. Таким образом, будет

- 53 029094

понятно, что, хотя данное изобретение было конкретно описано предпочтительными вариантами осуществления и возможными признаками, модификация и варьирование описанных здесь концепций могут быть использованы специалистами в данной области, и что предполагается, что такие модификации и вариации находятся в объеме этого изобретения, определенном прилагаемой формулой изобретения.

Данное изобретение было описано здесь в широком и общем виде. Каждый из более узких видовых признаков изобретения и подвидовых групп, входящих в общее описание, также образует часть данного изобретения. Это включает в себя общее описание данного изобретения при условии или негативном ограничении, удаляющем любой объект изобретения из этого общего описания, независимо от того, является или не является этот удаляемый материал конкретно перечисленным здесь.

Другие варианты осуществления находятся в следующей формуле изобретения. Кроме того, если признаки или аспекты данного изобретения описаны в понятиях групп Маркуша, специалисты с квалификацией в данной области поймут, что данное изобретение посредством этого описано также в понятиях любого индивидуального члена и подгруппы членов группы Маркуша.

Перечень последовательностей

<110> КОУДА ТЕРАПЬЮТИКС ЛТД

<120> АНТИСМЫСЛОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ,

ПРИМЕНЕНИЯ

<130> Е3697-00256

<140> 11513/230,744

<141> 2011-09-12

<150> 11510/581,813

<151> 2004-12-03

<150> РСТ/1В04/004431

<151> 2004-12-03

<150> ΝΖ 529936

<151> 2003-12-03

<160> 65

<170> Рагеппп Уег. 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> ДНК

<213> искуственная

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 1

дГааГГдсдд саадаадааг тдттгсгдгс

<210> 2

<211> 30

<212> ДНК

<213> искуственная

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

поеледовател ьность

<400> 2

дгааггдедд саддаддааг тдтттстдтс

НАЦЕЛЕННЫЕ НА КОННЕКСИНЫ, И СПОСОБЫ ИХ

<210> 3

<211> 30

<212> ДНК

<213> искуственная

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 3

ддсаададас ассааадаса сгассадсат

- 54 029094

<210> 4

<211> 27

<212> ДНК

<213> искуственная

<220>

<223> описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

поеледовател ьность

<400> 4

ТссТдадсаа ТассТаасда асаааТа

<210> 5

<211> 20

<212> ДНК

<213> искуственная

<220>

<223> описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 5

сатстссттд дтдстсаасс

<210> б

<211> 20

<212> ДНК

<213> искуственная

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> б

стдаадтсда сттддсттдд

20

<210> 7

<211> 21

<212> ДНК

<213> искуственная

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 7

стсадатадт ддссадаатд с

21

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> искуственная

<220>

<223> описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 8

ттдтссаддт дастссаадд

<210> 9

<211> 25

<212> ДНК

<213> искуственная

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

поеледовател ьность

<400> 9

сдтссдадсс садааадатд аддтс

20

<210> 10

<211> 19

<212> ДНК

<213> искуственная

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 10

ададдсдсас дтдадасас

<210> 11

<211> 19

<212> ДНК

<213> искуственная

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 11

тдаадасаат даадагдтт

<210> 12

<211> 3088

<212> ДНК

<213> ното зарп'епз

<400> 12

асаааааадс ттттасдадд ТагсадсасТ тттстттсат тадддддаад дедтдаддаа 60

адтассааас адсадсддад ттттааастт тааатадаса ддтстдадтд сстдаасттд 120

ссттттсатт ттасттсатс стссааддад ттсаатсаст тддсдтдаст тсастасттт 180

Таадсаааад адтддтдссс аддсаасатд ддтдастдда дсдссттадд сааастсстт 240

дасааддттс аадсстастс аастдстдда дддааддтдт ддстдтсадт асттттсатт 300

ттссдаатсс тдетдетддд дасадсддтт дадтсадсст ддддадатда дсадтстдсс 360

«тедттдта асастсадса асстддттдт даааатдтст дстатдасаа дтстттссса 420

атстстсатд тдсдстгстд ддтсстдсад атсататттд тдтстдтасс сасастстгд 480

тасстддстс атдтдттста ТдТдаТдсда ааддаадада аастдаасаа дааададдаа 540

даастсаадд ттдсссааас тдатддтдгс аатдгддаса тдсасттдаа дсадаттдад 600

атааадаадт тсаадтасдд Тагтдаадад сатддтаадд тдаааатдед аддддддттд 660

стдсдаасст асатсатсад татсстсттс аадтстатст ттдаддтддс сттсттдстд 720

атссадтддг асасстатдд аттсадсгтд адтдетдттт асасттдсаа аададатссс 780

тдсссасатс аддтддастд тттсстстст сдссссасдд адаааассат сттсатсатс 840

ттсатдстдд тддтдтсстт ддтдтсссгд дссттдаата тсаттдааст сттстатдтт 900

ттсттсаадд дедттаадда тедддттаад ддааададсд асссттасса тдсдассадт 960

ддтдсдстда дсссТдссаа адасГдтддд гстсааааат атдеттаттг саатддстдс 1020

тсстсассаа ссдстсссст стсдсстатд тстсстсстд ддтасаадст ддттастддс 1080

55 029094

дасадаааса аххсххсххд ссдсааххас аасаадсаад саадхдадса ааасхдддсх 1140 ааххасадхд садаасаааа хсдаахдддд саддсдддаа дсассахсхс хаасхсссах 1200 дсасадссхх ххдахххссс сдахдахаас садааххсха ааааасхадс хдсхддасах 1260 дааххасадс сасхадссах хдхддассад сдассХХсаа дсададссад садхсдхдсс 1320 адсадсадас схсддссхда хдассхддад ахсхадахас аддсххдааа дсахсаадах 1380 хссасхсаах хдхддадаад ааааааддхд схдхадааад хдсассаддх дххааххххд 1440 ахссддхдда ддхддхасхс аасадссхха ХХсаХдаддс ххадааааса сааадасахх 1500 адаахассха ддххсасхдд дддхдхахдд ддхадахддд хддададдда ддддахаада 1560 даддхдсахд ххддхаххха аадхадхдда ХХсааадаас ххадаххаха аахаададхх 1620 ссаххаддхд ахасахадах аадддсхххх хсхссссдса аасассссха адаахддххс 1680 хдхдхахдхд аахдадсддд хддхааххдх ддсхааахах ппдппа ссаадааасх 1740 дааахааххс Хддссаддаа хааахасххс схдаасахсх хаддхсхххх саасаадааа 1800 аадасададд аххдхссхха адхсссхдсх аааасаххсс аххдххаааа хххдсасххх 1860 дааддхаадс хххсхаддсс хдасссхсса ддхдхсаахд дасххдхдсх асхахахххх 1920 хххаххсххд дхахсадххх ааааххсада сааддсссас адаахаадах хххссахдса 1980 хххдсаааха сдхахаххсх ххххссахсс асххдсасаа хахсаххасс ахсасххххх 2040 сахсаххссх садсхасхас хсасаххсах ххаахддххх схдхааасах ххххаадаса 2100 дххдддахдх сасххаасах хххххххххх хдадсхааад хсадддаахс аадссахдсх 2160 хаахахххаа саахсасхха хахдхдхдхс даададхххд ххххдхххдх сахдхаххдд 2220 Хасаадсада хасадХаХаа асхсасааас асадахххда ааахаахдса сахахддхдх 2280 хсааахххда ассхххсхса хддахххххд хддхдхдддс саахахддхд хххасаххах 2340 ахааххссхд схдхддсаад хааадсасас хххххххххс хссхаааахд ХХХХХсссХд 2400 хдхахссхах хахддахасх ддххххдхха аххахдаххс хххаххххсх схссхххххх 2460 хаддахахад садхаахдсх аххасхдааа хдаахххссх ххххсхдааа хдхаахсахх 2520 дахдсххдаа хдахадаахх ххадхасхдх ааасаддсхх хадхсаххаа хдхдададас 2580 ххадаааааа хдсххададх ддасхаххаа ахдхдссхаа ахдааххххд садхаасхдд 2640 хаххсххддд ххххссхасх хаахасасад хааххсадаа сххдхаххсх аххахдадхх 2700 хадсадхсхх ххддадхдас садсаасххх дахдхххдса схаадахххх ахххддаахд 2760 саадададдх хдааададда ххсадхадха сасахасаас хаахххаххх даасхахахд 2820 ххдаадасах схассадххх схссааахдс сххххххааа асхсахсаса даадаххддх 2880 даааахдсхд адхахдасас ххххсххсхх дсахдсахдх садсхасаха аасадххххд 2940 ХасааХдааа аХХасХааХХ хдхххдасах ХссахдХХаа асхасддхса хдххсадсхх 3000 саххдсахдх аахдхадасс хадхссахса дахсахдхдх хсхддададх дххсхххахх 3060 саахааадхх ххаахххадх ахааасах 3088

<210> 13

<211> 1308

<212> ДНК

<213> ното зартепз

<400> 13

ахдддсдасх ддадсхххсх дддаадасхс ххадаааахд сасаддадса схссасддхс 60

ахсддсаадд хххддсхдас сдхдсхдххс ахсххссдса хсххддхдсх дддддссдсд 120

дсддаддасд хдхддддсда хдадсадхса дасххсассх дсаасассса дсадссдддс 180

хдсдадаасд хсхдсхасда садддссххс сссахсхссс асахссдсхх схдддсдсхд 240

садахсахсх хсдхдхссас дсссасссхс ахсхассхдд дссасдхдсх дсасахсдхд 300

сдсахддаад адаадаадаа адададддад даддаддадс адсхдаадад адададсссс 360

адссссаадд адссассдса ддасаахссс хсдхсдсддд асдассдсдд садддхдсдс 420

ахддссдддд сдсхдсхдсд дассхасдхс ххсаасахса хсххсаадас дсхдххсдад 480

дхдддсххса хсдссддсса дхасхххсхд хасддсххсд адсхдаадсс дсхсхассдс 540

хдсдассдсх ддсссхдссс саасасддхд дасхдсххса ХсХссаддсс сасддадаад 600

ассахсххса хсахсххсах дсхддсддхд дссхдсдсдх сссхдсхдсх саасахдсхд 660

дадахсхасс ассхдддсхд даадаадсхс аадсадддсд хдассадссд ссхсддсссд 720

дасдссхссд аддссссдсх ддддасадсс дахсссссдс сссхдссссс садсХсссдд 780

ссдсссдссд ХХдссаХсдд дххсссассс хасхахдсдс асассдсхдс дссссхддда 840

саддсссдсд ссдхдддсха ссссддддсс ссдссассад ссдсддасхх сааасхдсха 900

дсссхдассд аддсдсдсдд ааадддссад хссдссаадс хсхасаасдд ссассассас 960

схдсхдахда схдадсадаа схдддссаас саддсддссд адсддсадсс сссддсдсхс 1020

ааддсххасс сддсадсдхс сасдссхдса дсссссадсс ссдхсддсад садсХссссд 1080

ссасхсдсдс асдаддсхда ддсдддсдсд дсдссссхдс хдсхддахдд дадсддсадс 1140

адхсхддадд ддадсдсссх ддсадддасс сссдаддадд аддадсаддс сдхдассасс 1200

дсддсссада хдсассадсс дсссххдссс схсддадасс саддхсдддс садсааддсс 1260

адсадддсса дсадсдддсд ддссадассд даддасххдд ссахсхад 1308

<210> 14

<211> 1601

<212> ДНК

<213> ното зартепз

<400> 14

схссддссах сдхссссасс хссассхддд ссдсссдсда ддсадсддас ддаддссддд 60

адссахдддх дасхддддсх хссхддадаа дххдсхддас саддхссдад адсасхсдас 120

сдхддхдддх аадахсхддс хдасддхдсх сххсахсххс сдсахссхса хссхдддссх 180

ддссддсдад хсадхдхддд дхдасдадса дхсадахххс дадхдхааса сддсссадсс 240

аддсхдсасс аасдхсхдсх ахдассаддс сххссссахс хсссасахсс дсхасхдддх 300

дсхдсадххс схсххсдхса дсасасссас ссхддхсхас схдддссахд хсахххассх 360

дхсхсддсда даададсддс хддсдсадаа ддадддддад схдсдддсас хдссддссаа 420

ддасссасад дхддадсддд сдсхддссдд сахададсхх садахддсса адахсхсддх 480

ддсадаадах ддхсдссхдс дсаххссдсд адсасхдахд ддсассхахд хсдссадхдх 540

дсхсхдсаад адхдхдсхад аддсаддсхх ссхсхахддс садхддсдсс хдхасддсхд 600

дассахддад сссдхдхххд хдхдссадсд адсасссхдс сссхассхсд хддасхдсхх 660

хдхсхсхсдс сссасддада адассахсхх сахсахсххс ахдххддхдд ххддасхсах 720

схсссхддхд сххаассхдс хддадххддх дсассхдсхд хдхсдсхдсс Хсадссдддд 780

дахдадддса сддсааддсс аадасдсасс сссдасссад ддсассхссх садасссхха 840

сасддассад ддхсххсххс хассхссссд хддссадддд сссхсахссс сассахдссс 900

сассхасаах дддсхсхсах ссадхдадса даасхдддсс аассхдасса сададдадад 960

дсхддсдхсх хссаддсссс схсхсххссх ддасссассс ссхсадаахд дссааааасс 1020

сссаадхсдх сссадсадсх схдсххсхаа даадсадхах дхахададдс схдхддсхха 1080

хдхсасссаа сададдддхс схдадаадхс хддсхдссхд ддахдссссс Хдсссссхсс 1140

хддааддсхс хдсададахд асхдддсхдд ддаадсадах дсххдсхддс сахддадссх 1200

саххдсаадх хдххсххдаа сассХдаддс сххссхдхдд сссассаддс асхасддсхх 1260

ссхсхссада хдхдсхххдс схдадсасад асадхсадса хддаахдсхс ххддссаадд 1320

дхасхддддс ссхсхддссх хххдсадсхд ахссададда асссададсс аасххасссс 1380

аассхсассс хахддаасад хсассхдхдс дсаддххдхс схсааасссх схссхсасад 1440

дааааддсдд аххдаддсхд схдддхсадс сххдахсдса садасададс ххдхдссдда 1500

хххддсссхд хсааддддас хддхдссххд ххххсахсас хссххссхад ххсхасхдхх 1560

саадсххсхд ааахааасад дасххдахса сааааааааа а 1601

<210> 15

<211> 2574

<212> ДНК

<213> Ното зарлепз

<400> 15

дсааааадсд хдддсадххд дадаадаадс адссададхд хдаадаадсс сасддаадда 60

аадхссаддд аддаддаааа даадсадаад ххххддсахс хдххсссхдд схдхдссаад 120

ахдддсдахх ддадсххссх дддааахххс схддаддаад хасасаадса схсдассдхд 180

дхаддсаадд хсхддсхсас хдхссхсххс ахаххссдха хдсхсдхдсх дддсасадсх 240

дсхдадхсхх ссхдддддда хдадсаддсх дахххссддх дхдахасдах хсадссхддс 300

хдссадаахд хсхдсхасда ссаддсхххс сссахсхссс асаххсдсха схдддхдсхд 360

садахсахсх хсдхсхссас дсссхсхсхд дхдхасахдд дссасдссах дсасасхдхд 420

сдсахдсадд адаадсдсаа дсхасдддад дссдададдд ссааададдх ссддддсхсх 480

ддсхсххасд адхасссддх ддсададаад дсадаасХдХ ссхдсхддда ддаадддаах 540

ддааддаххд сссхссаддд сасхсхдсхс аасассхахд хдхдсадсах ссхдахссдс 600

ассассахдд аддхдддсхх саххдхдддс садхасххса хсхасддаах сххссхдасс 660

асссхдсахд хсхдссдсад дадхсссхдх ссссасссдд хсаасхдхха сдхахсссдд 720

сссасадада адаахдхсхх саххдхсххх ахдсхддсхд хддсхдсасх дхсссхссхс 780

сххадссхдд схдаасхсха ссассхдддс хддаадаада хсадасадсд ахххдхсааа 840

ссдсддсадс асахддсхаа дхдссадсхх хсхддссссх схдхдддсах адхссададс 900

хдсасассас сссссдасхх хаахсадхдс схддадаахд дсссхддддд ааааххсххс 960

аахсссххса дсаахаахах ддссхсссаа саааасасад асаассхддх сассдадсаа 1020

дхасдаддхс аддадсадас хссхддддаа ддхххсахсс аддххсдхха хддссадаад 1080

ссхдаддхдс ссаахддадх схсассаддх сассдссххс сссахддсха хсахадхдас 1140

аадсдасдхс ххадхааддс садсадсаад дсааддхсад ахдассхахс адхдхдассс 1200

хссхххахдд даддахсадд ассаддхддд аасаааддад дсхсададаа дааадасдхд 1260

хсссххсхда асхдахдсхх хсхсасхдхс ахсасхдсхх ддсхссхххд адссссдддх 1320

схсаахдасд ххдсхсахха аххсхадааа схахаассад ддсхсхддда хадхаадада 1380

ддхдасаасс сасссадасх дсадххсссх ссссасссхс хасссадхах асдаадссхх 1440

хсадаххасх сахдааасад ддхададдда аадаадддаа дсахддсааа адсхддссхд 1500

даадддахад ссададддах адаахдасхс хсхсхсхаса хассадсадс ахассааахд 1560

сдххсхсхаа дххссхассх ссххдассхд ахсасссхсс схссхссаад даададсхса 1620

аадххсссад ссаахадаса дсахдаахса аддаасххдс аххахахдхд схсххдаахс 1680

хдххдхсхсс ахддассахх ссхсддадха дхддхдадах ддссххдддх хдсссххддс 1740

- 56 029094

еесЕссессс ЕсЕасЕсадс сЕЕааааадд дсЕЕсЕЕдда асЕЕЕассад садссЕсадс 1800 ЕЕЕасаааЕд ссЕЕддЕаЕд ЕассЕсЕддс аааЕдсссса ссЕЕддЕдаЕ дЕЕдсаассЕ 1860 ЕЕссЕЕсЕдс ЕадддЕдЕас ассЕадссЕд ЕдсаддЕдЕс адсссЕдсЕа дддадЕсасЕ 1920 дЕасасасаа асЕсЕасЕдд ааЕЕссЕдсс аасаЕсЕдЕс асссЕдсадс ЕссЕЕЕасад 1980 ЕЕсааЕссаа ЕдаЕадааас саЕсссЕЕсс сееесесссЕ ЕддсЕдЕЕса сссадссаЕЕ 2040 сссЕдааддс сЕЕассааса ддааЕаЕсса адаадсЕдЕЕ дЕссссЕсЕс даасссЕдас 2100 садаЕсаЕса дссасЕдадд ссадЕддааЕ ЕЕссссаддс сЕЕдЕЕаааа сааадааадс 2160 аЕЕдЕассЕс ЕсадаЕЕссс сЕЕдЕддааа ааааааЕЕсЕ дсЕдЕдаада ЕдааааЕааа 2220 ааЕддадада ааасасЕдда ааасЕаЕЕЕЕ ссссЕссЕаЕ ЕЕасЕЕссЕЕ ЕдсЕдасЕдс 2280 саасЕЕадЕд ссаададдад дЕдЕдаЕдас адсЕаЕддад дсссссадаЕ сесесесесс 2340 ЕддаддсЕЕЕ адсаддддса аддаааЕадЕ аддддааЕсЕ ссадсЕсЕсЕ Еддсадддсс 2400 ЕЕЕаЕЕЕааа дадсдсадад аЕЕссЕагдЕ сЕсссЕадЕд ссссЕааЕда дасЕдссаад 2460 *дддддсгдг адаааадссЕ ЕдссЕЕсссс адддаЕЕддс сЕддЕсЕсЕд ЕаЕЕсасЕдд 2520 аЕссаЕааЕд ддЕЕдсЕдЕЕ дЕЕЕЕддаЕд ааддЕааасд аЕдсЕЕддаа ЕЕдд 2574

<210> 16

<211> 1191

<212> ДНК

<213> Ното зартепз

<400> 16

аЕдадЕЕдда дсЕЕЕсЕдас ЕсдссЕдсЕа даддадаЕЕс асаассаЕЕс сасаЕЕЕдЕд 60

дддаадаЕсЕ ддсЕсасЕдЕ ЕсЕдаЕЕдЕс ЕЕссддаЕсд ЕссЕЕасадс ЕдЕаддадда 120

дааЕссаЕсЕ аЕЕасдаЕда дсааадсааа ЕЕЕдЕдЕдса асасадааса дссдддсЕдЕ 180

дадааЕдЕсЕ дЕЕаЕдаЕдс дЕЕЕдсассЕ сЕсЕсссаЕд ЕасдсЕЕсЕд ддЕдЕЕссад 240

аЕсаЕссЕдд ЕддсаасЕсс сЕсЕдЕдаЕд ЕассЕдддсЕ аЕдсЕаЕсса саадапдсс 300

ааааЕддадс асддЕдаадс адасаадаад дсадсЕсдда дсаадсссЕа ЕдсааЕдсдс 360

Еддааасаас ассдддсЕсЕ ддаадааасд даддаддаса асдаадйдда ЕссЕаЕдаЕд 420

ЕаЕссадада ЕддадЕЕада аадЕдаЕаад дааааЕааад адсададсса асссааассЕ 480

аадсаЕдаЕд дссдасдасд даЕЕсдддаа даЕдддсЕса ЕдааааЕсЕа ЕдЕдсЕдсад 540

ЕЕдсЕддсаа ддассдЕдЕЕ ЕдаддЕдддЕ ЕЕЕсЕдаЕад ддсадЕаЕЕЕ ЕсЕдЕаЕддс 600

ЕЕссаадЕсс асссдЕЕЕЕа ЕдЕдЕдсадс адасЕЕссЕЕ дЕссЕсаЕаа даЕадасЕдс 660

ЕЕЕаЕЕЕсЕа дасссасЕда ааадассагс ЕЕссЕЕсЕда ЕааЕдЕаЕдд ЕдЕЕасаддс 720

сЕЕЕдссЕсЕ ЕдсЕЕаасаЕ ЕЕдддадаЕд сЕЕсаЕЕЕад ддЕЕЕдддас саЕЕсдадас 780

ЕсасЕаааса дЕааааддад ддаасЕЕдад даЕссдддЕд сЕЕаЕааЕЕа ЕссЕЕЕсасЕ 840

ЕддааЕасас саЕсЕдсЕсс сссЕддсЕаЕ аасаЕЕдсЕд Есааассада ЕсаааЕссад 900

Еасассдаас ЕдЕссааЕдс ЕаадаЕсдсс Еасаадсааа асааддссаа сасадсссад 960

даасадсадЕ аЕддсадсса Едаддадаас сЕсссадсЕд ассЕддаддс ЕсЕдсадсдд 1020

дадаЕсадда ЕддсЕсадда асдсЕЕддаЕ сЕддсадЕЕс аддссЕасад Есассаааас 1080

аасссЕсаЕд дЕссссддда даадааддсс ааадЕддддЕ ссааадсЕдд дЕссаасааа 1140

адсасЕдсса дЕадсаааЕс аддддаЕддд аадаасЕсЕд ЕсЕддаЕЕЕа а 1191

<210> 17

<211> 1362

<212> ДНК

<213> ното 5артеп5

<400> 17

адсдссаада дадааададс асаЕаЕЕЕсЕ ссдЕдддаса сЕссЕЕдЕаЕ ЕддЕдддЕда 60

даааЕдддсд асЕддадЕЕЕ ссЕддддаас аЕсЕЕддадд аддЕдааЕда дсасЕссасс 120

дЕсаЕсддса дадЕсЕддсЕ сассдЕдсЕЕ ЕЕсаЕсЕЕсс ддаЕссЕсаЕ ссЕЕддсасд 180

дссдсададЕ ЕсдЕдЕдддд ддаЕдадсаа ЕссдасЕЕсд ЕдЕдсаасас ссадсадссЕ 240

ддсЕдсдада асдЕсЕдсЕа сдасдаддсс ЕЕЕсссаЕсЕ сссасаЕЕсд ссЕсЕдддЕд 300

сЕдсадаЕса ЕсЕЕсдЕсЕс сассссдЕсс сЕдаЕдЕасд Еддддсасдс ддЕдсасЕас 360

дЕссдсаЕдд аддадаадсд саааадссдс дасдаддадс Едддссадса ддсддддасЕ 420

аасддсддсс сддассаддд садсдЕсаад аададсадсд дсадсааадд сасЕаадаад 480

ЕЕссддсЕдд аддддасссЕ дсЕдаддасс ЕасаЕсЕдсс асаЕсаЕсЕЕ саадасссЕс 540

ЕЕЕдаадЕдд дсЕЕсаЕсдЕ дддссасЕас ЕЕссЕдЕасд ддЕЕссддаЕ ссЕдссЕсЕд 600

ЕассдсЕдса дссддЕддсс сЕдссссааЕ дЕддЕддасЕ дсЕЕсдЕдЕс ссддсссасд 660

дадаааасса ЕсЕЕсаЕссЕ дЕЕсаЕдЕЕд ЕсЕдЕддссЕ сЕдЕдЕсссЕ аЕЕссЕсаас 720

дЕдаЕддадЕ ЕдадссассЕ дддссЕдаад дддаЕссддЕ сЕдссЕЕдаа даддссЕдЕа 780

дадсадсссс ЕдддддадаЕ ЕссЕдадааа ЕсссЕссасЕ ссаЕЕдсЕдЕ сЕссЕссаЕс 840

садааадсса адддсЕаЕса дсЕЕсЕадаа даададаааа ЕсдЕЕЕссса сЕаЕЕЕсссс 900

ЕЕдассдадд ЕЕдддаЕддЕ ддадассадс ссасЕдссЕд ссаадссЕЕЕ сааЕсадЕЕс 960

даддадаада Есадсасадд ассссЕдддд дасЕЕдЕссс ддддсЕасса ададасасЕд 1020

ссЕЕссЕасд сЕсаддЕддд ддсасаадаа дЕддадддсд аддддссдсс Едсададдад 1080

ддадссдаас ссдаддЕддд ададаадаад даддаадсад ададдсЕдас сасддаддад 1140

саддадаадд ЕддссдЕдсс ададддддад ааадЕадада сссссддадЕ ддаЕааддад 1200

ддЕдааааад аададссдса дЕсддадаад дЕдЕсааадс аадддсЕдсс адсЕдадаад 1260

асассЕЕсас ЕсЕдЕссада дсЕдасааса даЕдаЕдсса дассссЕдад саддсЕаадс 1320

ааадссадса дссдадссад дЕсадасдаЕ сЕаассдЕаЕ да 1362

<210> 18

<211> 966

<212> ДНК

<213> ното зартепз

<400> 18

аЕдддддааЕ ддассаЕсЕЕ ддададдсЕд сЕадаадссд сддЕдсадса дсасЕссасЕ 60

аЕдаЕсддаа ддаЕссЕдЕЕ дасЕдЕддЕд дЕдаЕсЕЕсс ддаЕссЕсаЕ ЕдЕддссаЕЕ 120

дгдддддада сддЕдЕасда ЕдаЕдадсад ассаЕдЕЕЕд ЕдЕдсаасас ссЕдсадссс 180

ддсЕдЕаасс аддссЕдсЕа Едассдддсс ЕЕссссаЕсЕ сссасаЕасд ЕЕасЕдддЕс 240

ЕЕссадаЕса ЕааЕддЕдЕд ЕасссссадЕ сЕЕЕдсЕЕса ЕсассЕасЕс ЕдЕдсассад 300

Ессдссаадс адсдадаасд ссдсЕасЕсЕ асадЕсЕЕсс ЕадсссЕдда сададасссс 360

ссЕдадЕсса ЕаддаддЕсс ЕддаддаасЕ дддддЕдддд дсадЕддЕдд дддсааасда 420

даадаЕаада адЕЕдсаааа ЕдсЕаЕЕдЕд ааЕддддЕдс Едсадаасас ададаасасс 480

адЕааддада сададссада ЕЕдЕЕЕадад дЕЕааддадс ЕдасЕссаса сссаЕсаддЕ 540

сЕасдсасЕд саЕсааааЕс саадсЕсада аддсаддаад дсаЕсЕсссд сЕЕсЕасаЕЕ 600

аЕссаадЕдд ЕдЕЕссдааа ЕдсссЕддаа аЕЕдддЕЕсс ЕддЕЕддсса аЕаЕЕЕЕсЕс 660

ЕаЕддсЕЕЕа дЕдЕсссадд дЕЕдЕаЕдад ЕдЕаассдсЕ ассссЕдсаЕ сааддаддЕд 720

дааЕдЕЕаЕд ЕдЕсссддсс аасЕдадаад асЕдЕсЕЕЕс ЕадЕдЕЕсаЕ дЕЕЕдсЕдЕа 780

адЕддсаЕсЕ дЕдЕЕдЕдсЕ саассЕддсЕ даасЕсаасс ассЕдддаЕд дсдсаадаЕс 840

аадсЕддсЕд Едсдаддддс Есаддссаад адааадЕсаа ЕсЕаЕдадаЕ ЕсдЕаасаад 900

дассЕдссаа дддЕсадЕдЕ ЕсссааЕЕЕЕ ддсаддасЕс адЕссадЕда сЕсЕдссЕаЕ 960

дЕдЕда 966

<210> 19

<211> 1901

<212> ДНК

<213> Ното зартепз

<400> 19

садддадЕЕд ЕддЕЕдсаас асЕдЕасЕсс адссЕдддса асададддад асЕсЕдЕсЕс 60

аасааасааа сааасааада ааааасссса садсЕаЕсЕа дддааааадЕ ааадсаасса 120

дсаЕаЕадаа дЕдасаЕаЕЕ дЕЕаЕаЕЕЕЕ сассаЕаддЕ ЕЕдсЕЕЕаад аааЕадЕдсЕ 180

сссЕЕсадаа ЕддаадааЕЕ ЕаЕсЕдссЕс ЕЕаЕЕЕдаЕд ЕддаЕсадад сЕаадаЕддс 240

ЕдасЕаааЕа аасаЕддддд асЕддааЕсЕ ссЕЕддадаЕ асЕСЕддадд аадЕЕсасаЕ 300

ссасЕссасс аЕдаЕЕддаа адаЕсЕддсЕ сассаЕссЕд ЕЕсаЕаЕЕЕс дааЕдсЕЕдЕ 360

ЕсЕдддЕдЕа дсадсЕдаад аЕдЕсЕддаа ЕдаЕдадсад ЕсЕддсЕЕса ЕсЕдсааЕас 420

адаасаасса ддсЕдсадаа аЕдЕаЕдсЕа сдассаддсс ЕЕЕссЕаЕсЕ сссЕсаЕЕад 480

аЕасЕдддЕЕ сЕдсаддЕда ЕаЕЕЕдЕдЕс ЕЕсассаЕсс сЕддЕсЕаса ЕдддссаЕдс 540

аЕЕдЕассда сЕдададЕЕс ЕЕдаддаада даддсааадд аЕдааадсЕс адЕЕаададЕ 600

адаасЕддад даддЕададЕ ЕЕдаааЕдсс ЕадддаЕсдд аддадаЕЕдд адсаададсЕ 660

ЕЕдЕсадсЕд дадаааадда аасЕаааЕаа адсЕссасЕс ададдаассЕ ЕдсЕЕЕдсас 720

ЕЕаЕдЕдаЕа сасаЕЕЕЕса сЕсдсЕсЕдЕ ддЕЕдаадЕЕ ддаЕЕсаЕда ЕЕддасадЕа 780

ссЕЕЕЕаЕаЕ ддаЕЕЕсасЕ ЕададссдсЕ аЕЕЕаадЕдс саЕддссасс сдЕдЕссааа 840

ЕаЕааЕсдас ЕдЕЕЕЕдЕсЕ саадассаас адаааадаса аЕаЕЕссЕаЕ ЕаЕЕЕаЕдса 900

аЕсЕаЕадсс асЕаЕЕЕсас ЕЕЕЕсЕЕааа саЕЕсЕЕдаа аЕЕЕЕссасс ЕаддЕЕЕЕаа 960

ааадаЕЕааа ададддсЕЕЕ ддддааааЕа саадЕЕдаад ааддаасаЕа аЕдааЕЕсса 1020

Едсааасаад дсаааасааа аЕдЕадссаа аЕассададс асаЕсЕдсаа аЕЕсасЕдаа 1080

дсдасЕсссЕ ЕсЕдссссЕд аЕЕаЕааЕсЕ дЕЕадЕддаа аадсааасас асасЕдсадЕ 1140

дЕасссЕадЕ ЕЕаааЕЕсаЕ сЕЕсЕдЕаЕЕ ссадссаааЕ ссЕдасааЕс аЕадЕдЕааа 1200

ЕдаЕдадааа ЕдсаЕЕЕЕдд аЕдаасадда аасЕдЕасЕЕ ЕсЕааЕдада ЕЕЕссасасЕ 1260

ЕадЕасЕадЕ ЕдЕадЕсаЕЕ ЕЕсаасасаЕ садЕЕсааас ааЕаасааад асасЕсаЕаа 1320

ааЕаЕЕЕдда ааадаасЕЕа аЕддЕаасса дЕЕааЕддаа аааададааа сЕдааддсаа 1380

адасадсааа аддаасЕасЕ асЕсЕададд ЕсассдЕЕсЕ аЕЕссаддЕд ЕЕдсЕаЕада 1440

Еддададаас аасаЕдаддс адЕсасссса аасадЕЕЕЕс ЕссЕЕдссад сЕаасЕдсда 1500

ЕЕддааассд сддЕддсЕЕа дадсЕасаЕд дддЕЕссЕсЕ асадаасаЕд аааассдддд 1560

дЕсассЕссЕ аааддЕаасс Есаадддсса дЕЕсадааад ддсасадЕса даасссЕЕсс 1620

ЕссЕЕсасаа ддадаЕЕсЕс ааЕсасЕЕда саЕЕссааас асЕдсЕдаЕЕ сЕЕЕдддадд 1680

дсЕдЕссЕЕЕ дадссадддЕ ЕддЕсадаас сЕдЕааЕааЕ ссЕдЕЕЕдЕс сЕссаааЕса 1740

сдЕадЕдЕсс сЕаасдааса аЕсЕсаЕЕдд ЕаддсдддЕЕ сссасадаЕс ЕЕсадаЕсЕа 1800

- 57 029094

аасадсддхх ддсххххада саххахахах аххахсадад аадхадссха дхддхсдхдд 1860 ддсасадааа ааахадахад дддсадсхсх ааадассадс ΐ 1901

<210> 20

<211> 1311

<212> ДНК

<213> Ното 5ар1вП5

<400> 20

ахдадсхдда дсххссхдас дсддсхдсхд даддадахсс асаассасхс сассххсдхд 60

ддсааддхдх ддсхсасддх дсхддхддхс ххссдсахсд Хдсхдасддс хдхдддсддс 120

даддссахсх асхсддасда дсаддссаад ххсасххдса асасдсддса дссаддсхдс 180

дасаасдхсх дсхахдасдс сххсдсдссс схдхсдсасд хдсдсххсхд ддхсххссад 240

аххдхддхса хсхссасдсс схсддхсахд хассхдддсх асдссдхдса ссдссхддсс 300

сдхдсдхсхд адсаддадсд дсдссдсдсс схссдссдсс дсссддддсс асдссдсдсд 360

ссссдадсдс ассхдссдсс сссдсасдсс ддсхддссхд адсссдссда ссхдддсдад 420

даддадссса хдсхдддссх дддсдаддад даддаддадд аддадасддд ддсадссдад 480

ддсдссддсд аддаадсдда ддаддсаддс дсддаддадд сдхдсасхаа ддсддхсддс 540

дсхдасддса аддсддсадд дассссдддс ссдассдддс аасасдахдд дсддаддсдс 600

ахссадсддд адддссхдах дсдсдхдхас дхддсссадс хддхддссад ддсадсхххс 660

даддхддссх хссхддхддд ссадхассхд схдхасддсх хсдаддхдсд ассдххсххх 720

сссхдсадсс дссадсссхд сссдсасдХд дхддасхдсх хсдхдхсдсд сссхасхдаа 780

аадасддхсх хссхдсхддх хахдхасдхд дхсадсхдсс хдхдссхдсх дсхсаассхс 840

хдхдадахдд сссассхддд сххдддсадс дсдсаддасд сддхдсдсдд ссдссдсддс 900

сссссддссх ссдсссссдс ссссдсдссд сддсссссдс ссхдсдссхх сссхдсддсд 960

дссдсхддсх хддссхдссс дсссдасхас адссхддхдд хдсдддсддс сдадсдсдсх 1020

сдддсдсахд ассадаассх ддсааассхд дсссхдсадд сдсхдсдсда сддддсадсд 1080

дсхддддасс дсдассддда садххсдссд хдсдхсддсс ХсссХдсддс схсссддддд 1140

ссссссадад саддсдсссс сдсдхсссдд асдддсадхд схассхсхдс дддсасхдхс 1200

ддддадсадд дссддсссдд сасссасдад сддссаддад ссаадсссад ддсхддсхсс 1260

дадаадддса дхдссадсад садддасддд аадассассд хдхддахсхд а 1311

<210> 21

<211> 1588

<212> ДНК

<213> Ното зартепз

<400> 21

адасаххсхс хдддаааддд садсадсадс саддхдхддс адхдасаддд аддхдхдаах 60

даддсаддах даасхддаса ддхххдхаса ссххдсхсад хддсдхдаас сддсаххсха 120

схдссаххдд ссдадхахдд схсхсддхса хсххсахсхх садаахсахд дхдсхддхдд 180

хддсхдсада дадхдхдхдд ддхдахдада аахсххссхх сахсхдсаас асасхссадс 240

схддсхдсаа садсдхххдс хахдассаах хсххссссах схсссахдхд сддсхдхддх 300

сссхдсадсх сахссхадхх хссассссад схсхссхсдх ддссахдсас дхддсхсасс 360

адсаасасах ададаадааа ахдсхасддс ххдадддсса хддддасссс схасассхдд 420

аддаддхдаа даддсасаад дхссасахсх садддасасх дхддхддасс хахдхсахса 480

дсдхддхдхх ссддсхдххд хххдаддссд хсххсахдха хдхсххххах схдсхсхасс 540

схддсхахдс сахддхдсдд схддхсаадх дсдасдхсха ссссхдсссс аасасадхдд 600

асхдсххсдх дхсссдсссс ассдадаааа ссдхсххсас сдхсххсахд схадсхдссх 660

схддсахсхд сахсахссхс аахдхддссд аддхддхдха ссхсахсахс сдддссхдхд 720

сссдссдадс ссадсдссдс хссаахссас сххсссдсаа дддсхсдддс ххсддссасс 780

дссхсхсасс хдаахасаад садаахдада хсаасаадсх дсхдадхдад саддахддсх 840

сссхдааада сахасхдсдс сдсадсссхд дсассддддс хдддсхддсх даааададсд 900

ассдсхдсхс ддссхдсхда хдссасахас саддсаассх сссахсссас ссссдасссх 960

дсссхдддсд адссссхссх хсхссссхдс сддхдсасад дссхсхдссх дсхддддахх 1020

асхсдахсаа аассххссхх сссхддсхас ххсссххссх сссддддссх хссххххдад 1080

дадсхддадд ддхддддадс хададдссас схахдссадх дсхсааддхх асхдддадхд 1140

хдддсхдссс ххдххдссхд сасссххссс хсххсссхсх сссхсхсхсх дддассасхд 1200

ддхасаадад ахдддахдсх ссдасадсдх схссааххах дааасхаахс ххаасссхдх 1260

дсхдхсадах асссхдхххс хддадхсаса хсадхдадда дддахдхддд хаададдадс 1320

ададддсадд ддхдсхдхдд асахдхдддх ддадааддда дддхддссад сасхадхааа 1380

ддаддаахад хдсххдсхдд ссасааддаа ааддаддадд хдхсхддддх дадддадхха 1440

дддададада адсаддсада хаадххддад саддддххдд хсааддссас схсхдссхсх 1500

адхссссаад дссхсхсхсх дссхдааахд ххасасахха аасаддаххх хасадсаааа 1560

аааааааааа аааааааааа аааааааа 1588

<210> 22

<211> 2263

<212> ДНК

<213> ното зартепз

<400> 22

сддадссссх сддсддсдсс сддсссадда сссдссхадд адсдсаддад ссссадсдса дадассссаа сдссдадасс сссдссссдд ссссдссдсд сххссхсссд асдсададса аассдсссад адхадаадах ддаххддддс асдсхдсада сдахссхддд дддхдхдаас ааасасхсса ссадсаххдд ааадахсхдд схсассдхсс хсххсахххх хсдсаххахд ахссхсдххд хддсхдсааа ддаддхдхдд ддадахдадс аддссдасхх хдхсхдсаас асссхдсадс саддсхдсаа даасдхдхдс хасдахсасх асххссссах схсссасахс сддсхахддд сссхдсадсх дахсххсдхд хссасдссад сдсхссхадх ддссахдсас дхддссхасс ддадасахда даадаададд аадххсахса адддддадах ааададхдаа хххааддаса Хсдаддадах саааасссад ааддхссдса хсдааддсхс ссхдхддхдд ассхасасаа дсадсахсхх сххссдддхс ахсххсдаад ссдссххсах дхасдхсххс хахдхсахдх асдасддсхх схссахдсад сддсхддхда адхдсаасдс схддссххдх сссаасасхд хддасхдсхх хдхдхсссдд сссасддада адасхдхсхх сасадхдххс ахдаххдсад хдхсхддаах ххдсахссхд схдаахдхса схдааххдхд ххахххдсха аххадахахх дххсхдддаа дхсаааааад ссадхххаас дсаххдссса дххдххадах хаадааахад асадсаХдад адддахдадд саасссдхдс хсадсхдхса аддсхсадхс дссадсаххх сссаасасаа адаххсхдас сххааахдса ассахххдаа ассссхдхад дссхсаддхд ааасхссада Хдссасаахд дадсхсхдсх ссссхааадс схсаааасаа аддссхаахх схахдссхдх сххааххххс хххсасххаа дххадххсса схдадасссс аддсхдххад дддххаххдд хдхааддхас хххсахаххх хааасададд ахахсддсах ххдхххсххх схсхдаддас аададааааа адссаддххс сасададдас асададаадд хххдддхдхс схссхддддх хсхххххдсс аасхххсссс асдххааадд хдаасаххдд ххсхххсахх хдсхххддаа дххххаахсх схаасадхдд асааадххас садхдссхха аасхсхдхха сасхххххдд аадхдаааас хххдхадхах дахаддххах хххдахдхаа адахдххсхд дахассахха хахдххсссс схдхххсада ддсхсадахх дхаахахдха ааХддхахдх саххсдсхас хахдахххаа хххдааахах ддхсххххдд ххахдаахас хххдсадсас адсхдададд схдхсхдххд хаххсаххдх ддхсахадса ссхаасааса ххдхадссхс аахсдадхда дасадасхад аадххссхад хдахддсхха хдахадсааа хддссхсахд хсааахаххх адахдхаахх ххдхдхаада аахасадасх ддахдхасса ссаасхасха ссхдхаахда саддссхдхс саасасахсх сссххххсса хдасхдхддх адссадсахс ддааадаасд схдахххааа даддхсдсхх дддаахххха ххдасасадх ассахххаах ддддаддаса ааахддддса ддддадддад аадхххсхдх сдххааааас адахххддаа адасхддасх схаааххсхд ххдаххааад ахдадсхххд хсхасххсаа аадхххдххх дсххассссх хсадссхсса аххххххаад хдаааахаха асхаахааса хдхдаааада ахадаадсха аддхххадах ааахаххдад садахсхаха ддаадаххда ассхдаахах хдссаххахд сххдасахдд хххссааааа ахддхасхсс асахасххса дхдадддхаа дхаххххссх дххдхсаада ахадсаххдх аааадсаххх хдхаахааха аадаахадсх ххаахдахах дсххдхаасх аааахааххх хдхаахдхах сааахасахх хаааасахха ааахахаахс хсхахаахаа аааааааааа ааа

<210> 23

<211> 2220

<212> ДНК

<213> ното зарлепз

<400> 23

даасххсххх ссхддсасад дасхсасхдх дссссххссс дсхдхдддха сааддхсхдс 60

сссссасссс адсхсхссаа адсссассдд ссхсссхдда ддссдаддхс дасддсссдх 120

сдсассддда дддддддсхс ссаддддхдс сссасдсасд дхсааддхсс сдсдссаадс 180

ддддассддд схдддссдда адсдддсасд дхасхсдсдд сааасхадсд хдддсдадхс 240

схдаххдсад хсддассхдс сдссдсддса сххаасадхх хдсададхдс ххсссдсссс 300

хдахсхсахх ддадссххсд дасадсссад сссахддсса ссдахдсссс сахххсасдс 360

схдаддаадс ддаддсхсад асдддссасс адссссхссд даддсхддсс сдддадсдсс 420

хддсадсдхс дддхсхадда дссддсхссс хссхдсхссс хссхссдсдс сдсссддддх 480

дхдсссдссд хсхдхдхдса ссасхдсхда дсссадсхсс ддсдсссхсд ссхсхдсхдх 540

дддссссддд дасдсддддх саддссассд сдххддссад дссдсхдсад дхаддсасдд 600

сссссассад дсдссахдда схддаадаса сХссаддссс Хасхдадсдд хдхдаасаад 660

хасхссасад сдххсдддсд сахсхддсхд хссдхддхдх хсдхсххссд ддхдсхддха 720

хасдхддхдд схдсададсд сдхдхддддд дахдадсада аддасхххда схдсаасасс 780

аадсадсссд дсхдсассаа сдхсхдсхас дасаасхасх хссссахсхс саасахссдс 840

схсхдддссс хдсадсхсах сххсдхсаса хдссссхсдс хдсхддхсах ссхдсасдхд 900

58 029094

дссгассдгд аддадсддда дсдссддсас сдссадааас асддддасса дгдсдссаад 960 сгдгасдаса асдсаддсаа даадсасдда ддссгдгддг ддассгассг дч:чхадссЧх 1020 ачхч:гсаадс гсагсаггда д«ссг:с«с сгсгассгдс гдсасасчхч: сгддсатддс 1080 Псаагагдс сдсдссгддг дсадгдгдсс аасдгддссс ссгдссссаа сагсдгддас 1140 гдсгасаггд сссдассгас сдадаадааа агсггсассг асггсагддг дддсдссчхс 1200 дссдгсгдса гсдгасгсас сачхгдгдад сгсгдсгасс гсагсгдсса садддгссгд 1260 сдаддссгдс асааддасаа дссгсдаддд ддггдсадсс ссчхдчхсчх сдссадссда 1320 дскгссассг дссдсгдсса ссасаадсгд дгддаддсгд дддаддгдда Тссадассса 1380 ддсаагааса адсгдсаддс ггсадсассс аассгдассс ссагсгдасс асадддсадд 1440 ддгддддсаа сагдсдддсс дссаагддда сагдсадддс ддЧ;дЧ:ддсад дгддададдг 1500 ссгасадддд сгдадгдасс ссасгсгдад «сасгаадг гагдсаасгг гсдггггддс 1560 адачгачпчт гдасасгддд аасгдддсгд чхгадссддд гагаддгаас ссасаддссс 1620 адгдссадсс сгсаааддас агадасгттд ааасаадсда аггаасгасс гасдсгдссг 1680 дсааддддсс асггадддса сгдсгадсад ддсПсаасс аддаадддаг саасссадда 1740 адддаЧ:даЧх аддададдсг гсссгдадда сагаагдгдг аадададдгд адаадгдстс 1800 ссаадсадас асаасадсад сасададдтс гддаддссас асааааадгд аЧ:дсч:сдссс 1860 гдддсгадес чхадсадасс гааддсагсг сгасчхсстс сададдадсс дсссадаггс 1920 сгдсадгдда даддаддгсг гссадсадса дсаддгсгдд адддсгдада агдаассгда 1980 сгададдггс гддадагасс сададдгссс ссаддчхачх асчхддсхса дгддаадссс 2040 чхчтгсссса аагссгасгс ссчхадссгс аддсадгддг дсчхссагсч: чхсчхсссас 2100 аасгдгдсгс аддсгддгдс садссгггса дасссгдссс ссадддасгг дддгддагдс 2160 дсгдагадаа сачхсчхаад асад«ч:ссх гдааачхааг ааагасгдгд ггпагаааа 2220

<210> 24

<211> 1243

<212> ДНК

<213> Ното зарчепз

<400> 24

сааддсгссс ааддссгдад гдддсаддга дсасссаддг агадассчис сасдгдсадс 60

асссаддаса садссадсач: даасгдддса тсгдсадд дссгдсгдад гддсдгдаас 120

аадгасчхса садгдсгдад ссдсагсхдд сгдгсгдгдд 1дггса1сгг гсдгдгдсгд 180

дгдгасдгдд гддсадсдда ддаддгдгдд дасдатдадс адааддасчх гдтсгдсаас 240

ассаадсадс ссддстдссс саасдгсгдс ТаГдасдадЧ: ГсШссссд! дгсссасдгд 300

сдссчхгддд сссгасадсг сагссгддгс асдгдссссг сасчгдсчхдч: ддгсагдсас 360

дгддссгасс дсдаддаасд сдадсдсаад сассассгда аасасдддсс саагдссссд 420

Есссгдгасд асаасстдад саадаадсдд ддсддасгд! ддтддасдга ссгдсгдадс 480

сгсагсггса аддссдссдг ддагдсгддс ггссгсгага гсиссассд ссгсгасаад 540

даггагдаса гдссссдсд! ддгддссгдс гссдгддадс счхдссссса састдгддас 600

гдггасачхч: сссддсссас ддадаадаад дчхггсассч: асгчхачгддч: дассасадсг 660

дссачхгдса чхсч:дсчхаа ссчхадЧ:даа дчхггсгасс гддгдддсаа даддгдсагд 720

дадагсггсд дссссаддса ссддсддссг сддгдссддд аагдссгасс сдагасдгдс 780

ссассагагд чхсчхчхсса дддадддсас ссгдаддагд ддаасгсгдг ссгаагдаад 840

дсгдддчхдд ссссадгдда 1дсадд1ддд Ч:ачхсач:аас сгдсдадагс адсадагаад 900

агсаасаддг сссссссаса Тдаддссасс саддаааааа ддсаддддса дгддсагссг 960

Гдссдгадса дддчгддгдад дадддгддсг дгдддддсгс аддаадсГсд сссаддддсс 1020

аагдгдддад дтдддддга дгггддгссс ч:дддчхсч:да дссчхадддд адддаддчгчгд 1080

агадсиасгд дддачхггдг агагддсаас адгагагдгс ааассгсгга чхааач:аЧ:да 1140

пггсссадг аааааааааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа 1200

аааааааааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа ааа 1243

<210> 25

<211> 1299

<212> ДНК

<213> ното зарчепз

<400> 25

агдаааггса адсгдстгдс гдадчхсгаг 1дссддсч:дс гдддадссад дададсссгд 60

аддадгадгс асгсадгадс адсгдасдсд гдддгссасс агдаасгдда дгагсгггда 120

дддасчхсгд адгддддгса асаадгасгс сасадсст дддсдсагсг ддсгдчхчхг 180

ддчхчгсачх гчхсдсдгдс гддгдгассг ддгдасддсс дадсдгдгдг ддадгдагда 240

ссасааддас гчхдасчгдса агасгсдсса дсссддсгдс ЧхсаасдгсЧ: дсгкгдагда 300

д«с«сссч: дгдгсссагд гдсдссгсгд ддсссгдсад сггахссгдд гдасагдссс 360

счхасЧ:дсчх дгддчхагдс асдгддссга ссдддаддЧТ саддадаада ддсассдада 420

адсссагддд дадаасадгд ддсдссгсса ссгдаасссс ддсаадаадс ддддгдддсг 480

сгддгддаса гагдгсгдса дссгадхдп сааддсдадс дгддасагсд ссгхгсгсха 540

гдгдггссас гсаггсгасс ссааагагаг ссгсссгссг дгддтсаадг дссасдсада 600

чхсач:дчхсс аагагадгдд асгдсггсаг сгссаадссс гсададаада асаггггсас 660

ссчхггсагд дгддссасад сгдссагсгд сагссгдсгс аассгсдгдд адсчхачхч:а 720

ссгддгдадс аададагдсс асдадгдссч: ддсадсаадд ааадсчхаад ссагдгдсас 780

аддтсагсас ссссасддга ссассгсггс сГдсааасаа дасдассгсс «гсдддгда 840

ссгсагсггг сгдддсгсад асадчхачхс гссчхгсгга ссадассдсс сссдадасса 900

гдгдаадааа ассагсггдг даддддстдс сгддасгддч: сгддсаддгч: дддссгддаг 960

ддддаддсгс гадсагсгсг саТаддгдса ассгдададг дддддадсга адссагдадд 1020

Гаддддсадд саадададад даггсадасд сгсгдддадс садггсслад чхсгсаасгс 1080

садссассгд ссссадсчхд асддсасгдд дссадггссс ссгсгдстсг дсадсгсддг 1140

ΐΐεεΐΐΐΐοΐ адаагддааа гадгдадддс саагдсссад ддхгддаддд аддадддсдг 1200

гсагадаада асасасагдс дддсассггс агсдгдгдгд дсссасгдгс адаасггааг 1260

аааадгсаас гсатггдсгд дааааааааа ааааааааа 1299

<210> 26

<211> 1805

<212> ДНК

<213> ното зарч'епз

<400> 26

сгдддаадас дсгддгсадг гсассгдссс сасгддггдг тгггаааса аапсгдага 60

саддсдаса! ссгсасгдас сдадсааада ггдасагчхд гагсагсас! дгдсассагс 120

ддссчхгадд сасГссад!д дддгаддада аддаддчхгд ааасссисдс ададддачхг 180

гдсссчхагг сгггдддгсг дааасасгдд садгсдггдд ааасаддасг садддагааа 240

ссадсдсааг ддаШддддд асдсгдсаса сгггсагсдд дддгдгсаас ааасасгсса 300

ссадсачхдд дааддгдгдд агсасадкса ΐοΐΐΐ3ΐΐΐΐ ссдадгсагд ачхсгсдТдд 360

Хддсгдссса ддаадгдгдд ддГдасдадс аададдас« сд!с!дсаас асасБдсаас 420

сдддагдсаа ааагдгдгдс гагдассасг тгсссдд! дгсссасачх сддсгдгддд 480

сссхссадсг датсггсдгс гссассссад сдсгдсгддг ддссагдсаг дгддссгаст 540

асаддсасда аассасгсдс аадггсаддс даддададаа даддаагда! хгсааадаса 600

гададдасах гааааадсад аадд-сссдда гададдддхс дсгдгддгдд асдгасасса 660

дсадсагсгг гггссдаагс агстгдаад садссгггаг дгагдгдгтг гасггссс« 720

асаагдддга ссассгдссс гдддгдггда аагдгдддаг гдассссгдс сссаассггд 780

«дасгдсчх гатссадд ссаасадада адассдгдгг гассаггтгт атдагггсгд 840

сд£с£д£да£ «дсагдсгд с££аасд£дд сададггдгд ссассгдсгд сгдааад1д1 900

дггггаддад агсааадада дсасадасдс ааааааагса ссссаатсаг дсссгааадд 960

ададгаадса даагдааагд аагдадсгда гггсадагад Гддгсааааг дсаачхасад 1020

дгисссаад сГааасат сааддгаааа гдгадсгдсд гсагааддад асч:ч:сч:дчхч: 1080

чхчхсадаад дсаагассаа ссчгдааадГЧ: ссггсЧ:дЧ:ад ссЧ:даададч: ч:ч:д1:аааЧ:да 1140

сч:Ч:ЧхаЧ:ааЧ: аааЧ:адасас ГЧгдадЧЦаас ХХХЧ:Ч:д-садд ач:асЧ:Ч:дсчх сачхсач:аса 1200

саасдч:ааЧх ааагаЧ:дЧ:дд ЧхсагхссЧ:д аааасаадад асч:дсЧ:Ч:дас аааддадсач: 1260

ч:дсадчхасЧ: ГГдасаддЧИ ссЧ:Ч:Ч:Ч:аадЧ: ддасгсчхгд асааадЧ;ддд Ч:асч:Ч:ЧхЧ:да 1320

аааЧ:1Ч:ач:ач: аасгдЧ:Ч;дч:ч: даЧ:ааддаас аБЧХачхсад даа!Ч:дагас ххххаххадд 1380

аааадач:агг ГЧ:Ч:агаддсЧ; гддаЧ:дч:ч:гг гадч:чхгдас хч:хдааххч:а ч:аЧ:ааадГаЧ: 1440

ххч:хахаахд асЧ:ддчхч:чх сЧ:Ч:ассЧ:дда аааасаЧ:дсд ахдххадххч: ч:адааЧ:Ч:аса 1500

ссасаадч:аЧ; счгааахххдд аасч:Ч:асааа дддгсгачхч: ч:дЧ:аааЧ:агг дч:ч:ч:Гдсач:ч: 1560

дЧхгдЧ:Ч:ддс аааЧ:Ч:Ч:дЧ:да асЧ:дчхаЧ:да гасдсЧ:Ч:аад дЧ:ддааадЧ:д ч:ЧхаЧ:Ч:дсас 1620

аахахахххх гасЧ:дсЧ:Ч:Чх Ч:дааЧ:дч:ада сддаасадЧ:д гддаадсада аддсЧ:Ч:Ч:Ч:гч: 1680

аасчхагссд Ч;Ч:ч:дссаачх ачхдсаааса асгдаааЧ:дЧ: ддаЧ;дЧ;дач:ч: дссчхааЧ:аа 1740

адсгсдчхсс саттдсххаа дсснгсаааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа 1800

ааааа 1805

<210> 27

<211> 2094

<212> ДНК

<213> Ното 5ар1еп5

<400> 27

аааЧ:дааада дддадсадда ддсдссддчх ссадссассг сссааддчхс стддсчхадс 60

чхч:дасассс садчхссддс сссадддч:да дЧ:ддддч:Гдд дхддсддгхх аддддсасса 120

ддддсдч:дч:д дддассч:дч:д ч:аадч:дч:ддд дч:ддддадда чхчхаддада ч:дч:ддаддсч: 180

ддаддсасад даддссаддд аддадддада адссЧ:ддч:дс сдсасчхсса ссасдсЧ:ддд 240

дЧ:аддадддс адддасассг ссдасааадд асссч:дЧ:дад адгч:агдааа дсддадчхдс 300

счхч:дч:асса дссссссасс сЧ:дададдад £Ч:сас£дсад ч:аааааЧ:ддч: дададааач:д 360

дЧ:дддссаад аааддадЧ:дд ч:счхдсч:дсс чхгдссасчх ссасчхсчхс сачздддсасс 420

ааач:ч:дддчх гадсдчхчхд ддгчхдаддс чхсасчхч^с ссасадсачх сгч:дасадсч: 480

- 59 029094

аадддсассд схдддхххсс дсххссдааа ссаддсаадх саддддсхдд хссадсхдах 540 схссааддхс сххссхаада ахсхдддахс хддаддахсс садддхсдаа сддадасддс 600 хсадддддхд сддсхаааах дсааахдддд дахссхсссс адсасссахс ддхсссааад 660 адааддхаас ссахадсхда дсдхсдссхд схссссхсдд дсссхсссдх ддсссхссдх 720 ХХсаХасхдд хсхсахсдсх ааасссдддс схсхссхасс хсасдасхса сссхдаадхс 780 ададааддХс саасддассс сассссдаха ддсххддаад дддсаддддх сссхдасххд 840 ссссахсссс хдасхссссд ссссдсдхсс ссадсдссах дддддадхдд дсдххссхдд 900 дсхсдсхдсх ддасдссдхд садсхдсадх сдссдсхсдх дддссдссхс хддсхддхдд 960 хсахдсхдах сххссдсахс схддхдсхдд ссасддхддд сддсдссдхд ХХсдаддасд 1020 адсаададда дххсдхдхдс аасасдсхдс адссдддсхд хсдссадасс ХдсХасдасс 1080 дсдссххссс ддхсхсссас хассдсххсх ддсхсххсса сахссхдсхд схсхсддсдс 1140 ссссддхдсх дххсдхсдхс хасхссахдс ассдддсадд сааддаддсд ддсддсдсхд 1200 аддсддсддс дсадХдсдсс сссддасхдс ссдаддссса дхдсдсдссд хдсдсссхдс 1260 дсдсссдссд сдсдсдссдс хдсхассхдс хдадсдхддс дсхдсдссхд схддссдадс 1320 хдассххссх дддсддссад дсдсхдсхсх асддсххссд сдхддссссд сасххсдсдх 1380 дсдссддхсс дсссхдсссд сасасддхсд асхдсххсдх дадссддссс ассдадаада 1440 ссдхсххсдх дсхсххсхах ххсдсддхдд ддсхдсхдхс ддсдсхдсхс адсдхадссд 1500 адсхдддсса ссхдсхсхдд аадддссдсс сдсдсдссдд ддадсдхдас аассдсхдса 1560 ассдхдсаса сдаададдсд садаадсхдс хсссдссдсс дссдссдсса ссхаххдххд 1620 хсасххддда адаааасада сассххсаад дададддсхс сссхддхадс ссссасссса 1680 адасададсх ддахдссссх сдсххссдха дддааадсас ХХсХссХдса ддахддсахх 1740 дсхсхсхссс сххссахддс асдхадхахд хдсхсадхаа ахахдхдххд дахдадааас 1800 ХдааддХдХс сссаддссха сассасхдсс ахдсссдаас асхахссахд схахддхддд 1860 сассахсхсх схдахдасад ххсхдхдхсс асаасссада ссссхссаса сааасссада 1920 хддддсхдхд ссдсхдхххх ссадахдхах хсаххсааса аахахххдха дддхассхас 1980 ХдХдХдХсад аадахдххса адахсадсах сахссдахдд ааахадсаха хдадссахдх 2040 ахдхадхххс аадхххххса ххадссдсах хаааааадха аааддаааса аахд 2094

<210> 28

<211> 840

<212> ДНК

<213> ното зартепз

<400> 28

ахдхдхддса ддххссхдсд дсддсхдсхд дсддаддада дссддсдсхс сасссссдхд 60

дддсдссхсх хдсххсссдх дсхссхддда ххссдссххд хдсхдсхддс хдссадхддд 120

ссхддадхсх ахддхдахда дсададхдаа ххсдхдхдхс асасссадса дссдддсхдс 180

ааддсхдссх дсххсдахдс сххссасссс схсхссссдс хдсдхххсхд ддхсххссад 240

дхсахсххдд хддсхдхасс садсдсссхс хахахдддхх хсасхсхдха хсасдхдахс 300

хддсасхддд ааххахсадд аааддддаад даддаддада сссхдахсса дддасдддад 360

ддсаасасад ахдхсссадд ддсхддаадс схсаддсхдс хсхдддсхха хдхддсхсад 420

схдддддсхс ддсххдхссх ддадддддса дсссхддддх хдсадхасса ссхдхахддд 480

ххссадахдс ссадсхссхх хдсахдхсдс сдадаассхх дссххддхад хахаассхдс 540

аахсхдхссс дссссхсхда даадассахх ххссхааада ссахдхххдд адхсадсддх 600

ххсхдхсхсх хдхххасххх хххддадсхх дхдсххсхдд дхххддддад ахддхддадд 660

ассхддаадс асааахсххс схсххсхааа хасххссхаа сххсададад сассадаада 720

сасаадааад саассдахад ссхсссадхд дхддааасса аададсаахх хсаадаадса 780

дххссаддаа даадсххадс ссаддааааа сааадассад ххддасссад адахдссхда 840

<210> 29

<211> 672

<212> ДНК

<213> ното 5ар1еп5

<400> 29

ахдадххдда хдххссхсад адахсхссхд адхддадхаа ахааахасхс сасхдддасх 60

ддахддаххх ддсхддсхдх сдхдхххдхс ххссдхххдс хддхсхасах ддхддсадса 120

дадсасахдх ддааадахда дсадааадад хххдадхдса асадхадаса дсссддххдс 180

ааааахдхдх дххххдахда сххсххсссс ахххсссаад хсадасхххд ддссххасаа 240

схдахаахдд хсхссасасс ххсасххсхд дхддххххас ахдхадссха хсахдадддх 300

адададаааа ддсасадааа дааасхсхах дхсадсссад дхасааХдда хдддддссха 360

хддхасдсхх ахсххахсад ссхсаххдхх аааасхддхх ххдаааххдд сххссххдхх 420

ххаххххаха адсхахахда хддсхххадх дххсссхасс ххахааадхд хдахххдаад 480

ссххдхссса асасхдхдда схдсххсахс хссааассса схдадаадас дахсххсахс 540

схсххсххдд хсаХсассХс аХдсХХдХдХ аххдхдххда аХХХсаХХда асхдадхххх 600

ххддххсхса адхдсхххах хаадхдсхдх схссааааах ахххаааааа ассхсаадхс 660

схсадхдхдх да 672

<210> 30

<211> 1113

<212> днк

<213> Ното 5ар1'еп5

<400> 30

ахддааддсд хддасххдсх адддхххсхс ахсахсасах хааасхдсаа сдхдассахд 60

дхаддааадс хсхддххсдх ссхсасдахд схдсхдсдда хдсхддхдах хдхсххддсд 120

дддсдасссд хсхассадда сдадсаддад аддхххдхсх дсаасасдсх дсадссддда 180

хдсдссаахд хххдсхасда сдхсххсхсс сссдхдхсхс ассхдсддхх схддсхдахс 240

садддсдхдх дсдхссхссх ссссхссдсс дхсххсадсд хсхахдхссх дсассдадда 300

дссасдсхсд ссдсдсхддд сссссдссдс Хдссссдасс сссдддадсс ддссхссддд 360

сададасдсх дсссдсддсс аххсддддад сдсддсддсс хссаддхдсс сдасххххсд 420

дссддсхаса хсахссассх ссхссхссдд асссхдсхдд аддсадссхх сддддссххд 480

сасхасхххс хсхххддахх ссхддссссд аадаадХХсс сххдсасдсд сссхссдхдс 540

асдддсдхдд хддасхдсха сдхдхсдсдд сссасадада адхсссхдсх дахдсхдххс 600

схсхдддсдд хсадсдсдсх дхсххххсхд схдддссхсд ссдассхддх схдсадссхд 660

сддсддсдда Хдсдсаддад дссдддассс сссасаадсс ссхссахссд даадсададс 720

ддадссхсад дссасдсдда дддасдссдд асХдасдадд адддхдддсд ддаддаадад 780

ддддсассдд сдсссссддд хдсасдсдсс ддаддддадд дддсХддсад ссссаддсдх 840

асахссаддд Хдхсадддса сасдаадахх ссддахдадд ахдададхда ддхдасахсс 900

Хссдссадсд аааадсХддд садасадссс сддддсаддс сссассдада ддссдсссад 960

дассссаддд дсхсаддахс сдаддадсад сссХсадсад сссссадссд ссхддссдсд 1020

сссссххссх дсадсадссх дсадсссссх дасссдссхд ссадсхссад хддхдсхссс 1080

сассхдадад ссаддаадхс хдадхдддхд хда 1113

<210> 31

<211> 1632

<212> ДНК

<213> Ното зартепз

<400> 31

ахдддддасх ддаасххахх дддхддсахс схададдаад ххсасхссса схсаассаха 60

дхддддаааа хсхддсхдас сахссхсххс ахсххссдаа хдсхддхасх хсдхдхддсх 120

дсхдаддахд хсхдддахда хдаасадхса дсахххдссх дсаасасссд дсадссаддх 180

хдсаасааха хсхдххахда хдахдсаххс ссхахсхсхх хдахсаддхх схдддхххха 240

садахсахсх ххдхдхсххс хссххсхххд дхсхахахдд дссахдсасх ххахаддсхс 300

адддссхххд адааадасад дсададдааа аадхсасасс ххададссса дахддадаах 360

ссадахсххд асххддадда дсадсааада ахадахаддд аасхдаддад дххададдад 420

садаададда хссахааадх сссхсхдааа ддахдхсхдс хдсдхасхха хдхсххасас 480

ахсххдасса дахсхдхдсх ддаадхадда ххсахдахад дссаахахах хсхсхахддд 540

хххсааахдс асссссххха сааахдсасх саассхссхх дссссаахдс ддхддаххдс 600

хххдхахсса ддсссасхда даадасаахх ххсахдсххх ххахдсасад саххдсадсс 660

ахххссххдх хасхсаахах асхддаааха хххсахсхад дсахсадааа ааххахдадд 720

асасхххаха адааахссад садхдадддс аххдаддахд ааасаддссс хссаххссах 780

ххдаадааах аххсхдхддс ссадсадхдх ахдахххдсх сххсаххдсс хдааадаахс 840

хсхссасххс аадсхаасаа хсаасадсаа дхсаххсдад ххаахдхдсс ааадхсхааа 900

ассахдхддс ааахсссаса дссааддсаа сххдаадхад асссххссаа хдддааааад 960

дасхддхсхд адааддахса дсахадсдда садсхссахд ххсасадссс дхдхсссхдд 1020

дсхддсадхд схддааахса дсассхддда садсаахсад ассаххссхс ахххддссхд 1080

садаахасаа хдхсхсадхс схддсхаддх асаасхасдд схссхадааа схдхссахсс 1140

хххдсадхад даассхддда дсадхсссад дасссадаас ссхсаддхда дссхсхсаса 1200

дахсххсаха дхсасхдсад адасадхдаа ддсадсахда дадададхдд ддхсхддаха 1260

дасадахсхс дсссаддсад Хсдсааддсс адсхххсхдх ссадаххдхх дхсхдаааад 1320

сдасахсхдс асадхдасхс аддаадсхсх ддххсхсдда ахадсхссхд сххддахххх 1380

ссхсасхддд аааасадссс схсассхсхд ссххсадхса схдддсасад аасахсаахд 1440

дхаадасадд садсссхасс дахсахддаа схахсасаад адсхдххсса ххсхддахдс 1500

хххсхххххс схххсхххсх хссхддддхд хдхахдхахд хххдхдххда садададдса 1560

дахддадддд дадаххаххх ахддададах ааааххаххс аххсдахаса ххсадххааа 1620

ххсааххсах аа 1632

<210> 32 <211> 31

- 60 029094

<212> ДНК ' - . .

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

поеледовател ьность

<400> 32

ссааддсадд ссадсгасаа сдагссадгс а 31

<210> 33

<211> 31

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

поеледовател ьность

<400> 33

ссдтдддадд стадстасаа сдадгдадад д 31

<210> 34

<211> 31

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 34

ссдгдддадд сгаасгасаа сдадсдадад д 31

<210> 35

<211> 32

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

поеледовател ьность

<400> 35

адгстттгдд дсгадстаса асдагдддсг са 32

<210> 36

<211> 31

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 36

ТТГддададд ссадсгасаа сдассдсадг с 31

<210> 37 <211> 31 <212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 37

гггддададд сгаасгасаа сдассдсадг с 31

<210> 38

<211> 31

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 38

асдаддаадд стадстасаа сдагдсттст д 31

<210> 39

<211> 30

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<22О>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 39

ггдсддсддс гадсгасаас дасдаддааг 30

<210> 40

<211> 31

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 40

ссагдсдадд сгадсгасаа сдатдстс ΐ 31

<210> 41

<211> 31

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 41

ттддтссадд стадссасаа сдадасддсг а 31

- 61 029094

30

<210> 42

<211> 30

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 42

дтааттдсдд саддаддааг гдтттсгдгс

<210> 43

<211> 30

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 43

дасадаааса аттсстсстд ссдсааттас

30

<210> 44

<211> 18

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 44

ссааддсасг ссадтсас

18

<210> 45

<211> 19

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<22О>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 45

тссдгдддас дтдададда

19

<210> 46

<211> 18

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность <220>

<223> Описание искуственной последовательности: олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 46 '

адгсггггда гдддсгса

синтетическая

18

<210> 47

<211> 19

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 47

гттгддадат ссдсадгс!

<210> 48

<211> 19

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 48

сасдаддааг гдгггстдт

19

<210> 49

<211> 18

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 49

ГГГдсддсас даддаагг

18

<210> 50

<211> 19

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 50

сссагдсдат ттгдстстд

<210> 51

<211> 19

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

- 62 029094

<400> 51

дттддтссас дасддстаа 19

<210> 52

<211> 31

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

поеледовател ьность

<400> 52

дттдеададд стадстасаа сдааааатсд д

31

<210> 53

<211> 31

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 53

дгтстгтадд сгадсгасаа сдасгсгссс ΐ

<210> 54

<211> 33

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 54

дгссссааад дссадстаса асдагсдтгс ссс

<210> 55

<211> 33

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 55

гстсгтсдад дсгадсгаса асдадссстг ааа

33

<210> 56

<211> 33

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 56

гсгсгссдад дстаасгаса асдадгсссг ааа

<210> 57

<211> 31

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 57

дасасддадд стадсгасаа сдасттстдд д

<210> 58

<211> 31

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 58

ссссдатадд стадстасаа сдаддасстт с

31

<210> 59

<211> 31

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 59

сггсдахадд ссаасгасаа сдаддассгг с

<210> 60

<211> 33

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<22О>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 60

ддтдаададд стадстасаа сдаадтст!! сст

<210> 61

<211> 30

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

33

- 63 029094

<22О>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 61

ссттааастс дттстттатс тстсссттса

<210> 62

<211> 30

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 62

асттссстст статттсттд стсаааттсс

<210> 63

<211> 30

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> Описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 63

тасддасстт стдддттттд атстсттсда

<210> 64

<211> 30

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 64

адсттстста дттттдддтс «ссаддсат

<210> 65

<211> 30

<212> ДНК

<213> искуственная последовательность

<220>

<223> описание искуственной последовательности: синтетическая олигодезоксирибонуклеотидная

последовательность

<400> 65

дтааттдсдд саддаддаат тдтттстдтс

30

30

Claims (73)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ уменьшения повреждения ткани, связанного с офтальмологической процедурой у субъекта, предусматривающий введение антисмыслового соединения в глаз указанного субъекта в сочетании с указанной процедурой в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина в глазу или в клетках, связанных с глазом, у указанного субъекта, где офтальмологической процедурой является офтальмологическая хирургия или лечение офтальмологического повреждения.
2. 2. Способ конструирования ткани в связи с офтальмологической процедурой, предусматривающий введение антисмыслового соединения в глаз субъекта в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина в глазу или в клетках, связанных с глазом, у указанного субъекта, и модуляции пролиферации, миграции или дифференцировки клеток в глазу или клеток, связанных с глазом указанного субъекта, где офтальмологической процедурой является офтальмологическая хирургия или лечение офтальмологического повреждения.
3. 3. Способ стимуляции накопления эпителиальных клеток в глазу или в ткани, связанной с глазом субъекта, подвергающегося офтальмологической хирургии или лечению офтальмологического повреждения, предусматривающий введение антисмыслового соединения в глаз субъекта в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина в глазу или в клетках, связанных с глазом указанного субъекта.
4. 4. Способ ингибирования гиперцеллюлярности (повышенного содержания клеток) в глазу или в ткани, связанной с глазом, у субъекта, подвергающегося офтальмологической хирургии или лечению офтальмологического повреждения, предусматривающий введение антисмыслового соединения в глаз субъекта в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии белка коннексина в глазу или в клетках, связанных с глазом, у указанного субъекта.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где указанное антисмысловое соединение выбрано из группы, состоящей из антисмысловых олигонуклеотидов, антисмысловых полинуклеотидов, дезоксирибозимов, морфолиноолигонуклеотидов, молекул интерферирующих РНК (ΐΚΝΑ), молекул коротких интерферирующих РНК (δΐΚΝΑ), молекул ПНК, ДНКзимов и мутированных по 5'-концу малых ядерных РНК υ1 и аналогов указанных молекул.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, который является офтальмологической хирургией, выбранной из эксимерной лазерной фоторефрактивной кератэктомии, удаления катаракты, трансплантации роговицы, хирургии для коррекции рефракции, хирургии для замены хрусталика, радиальной кератотомии, фильтрующей хирургии глаукомы, кератопластики, эксимерной лазерной фоторефрактивной кератэктомии,

   - 64 029094

   иссечения неоплазмы глазной поверхности, трансплантации конъюнктивы или амниотической оболочки, иссечения птеригия и пингвекулы, глазной пластической хирургии, иссечения опухоли века, процедуры ремоделирования века для врожденных патологий, репарации эктропиона и энтропиона глазного века, хирургии по поводу страбизма (косоглазия) (глазной мышцы).
7. 7. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение содержит последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из ЗЕф ΙΌ ΝΟ:1-11.
8. 8. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение нацелено на один или несколько из коннексинов 43, 26, 37, 30 и/или 31.1.
9. 9. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из ЗЕф ГО ΝΟ: 12-31.
10. 10. Способ по п.9, в котором в глаз указанного субъекта вводят второе антисмысловое соединение, где указанное второе антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на приблизительно 8 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из ЗЕф ГО ΝΟ:12-21, где указанное второе антисмысловое соединение нацелено на другой коннексин, чем антисмысловое соединение по любому из пп.1-4 или 6.
11. 11. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанным антисмысловым соединением является антисмысловой олигонуклеотид с длиной 15-35 нуклеотидных оснований.
12. 12. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на приблизительно 12 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из ЗЕф ГО ΝΟ:12-31.
13. 13. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на приблизительно 18 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из ЗЕф ГО ΝΟ:12-31.
14. 14. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение нацелено по меньшей мере на приблизительно 25 нуклеотидных оснований молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей коннексин, имеющей последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из ЗЕф ГО ΝΟ:12-31.
15. 15. Способ по п.3, где указанное антисмысловое соединение содержит последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из ЗЕф ГО ΝΟ:1-11.
16. 16. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение является антисмысловым олигонуклеотидом, содержащим природные нуклеотидные основания и немодифицированную межнуклеозидную связь.
17. 17. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение является антисмысловым олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.
18. 18. Способ по п.17, где указанной модифицированной межнуклеозидной связью является фосфоротиоатная связь.
19. 19. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанным антисмысловым соединением является олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один модифицированный остаток сахара.
20. 20. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанным антисмысловым соединением является олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере одно модифицированное нуклеотидное основание.
21. 21. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение вводят путем локального или местного введения.
22. 22. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение вводят прямым введением в хирургическую рану.
23. 23. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение вводят внутриглазной инъекцией.
24. 24. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение используют в комбинации со вторым соединением, полезным для уменьшения повреждения ткани или стимуляции заживления.
25. 25. Способ по п.24, где указанным вторым соединением является фактор роста или цитокин.
26. 26. Способ по п.25, где указанное второе соединение выбирают из фактора роста, цитокина или т.п., в том числе, но не только, РОР, NΟΡ, ΝΤ3, ΡΌΟΕ. ТОР, УЕОР, ΒΌΟΕ. ЕОР, КОР, интегринов, интерлейкинов, плазмина и семафоринов.
27. 27. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение вводят в заранее определенное время.
28. 28. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение вводят перед выполнением указанной офтальмологической хирургии или лечения офтальмологического повреждения.

    - 65 029094
29. 29. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение вводят во время указанной офтальмологической хирургии или лечения офтальмологического повреждения.
30. 30. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение вводят в пределах 2 ч после выполнения указанной офтальмологической хирургии или лечения офтальмологического повреждения.
31. 31. Способ по любому из пп.2, 3 или 4, который выполняют вместе с процедурой эксимерной лазерной фоторефрактивной кератэктомии в указанном субъекте.
32. 32. Способ по любому из пп.2, 3 или 4, где офтальмологической хирургией является удаление катаракты.
33. 33. Способ по любому из пп.2, 3 или 4, где офтальмологической хирургией является трансплантация роговицы.
34. 34. Способ по любому из пп.2, 3 или 4, где офтальмологической хирургией является хирургия для коррекции рефракции.
35. 35. Способ по любому из пп.2, 3 или 4, где офтальмологической хирургией является хирургия для коррекции рефракции, являющаяся радиальной кератотомией.
36. 36. Способ по любому из пп.2, 3 или 4, который стимулирует заживление или предотвращает повреждение ткани в клетках, связанных с роговицей указанного субъекта.
37. 37. Способ по любому из пп.2, 3 или 4, где офтальмологической процедурой является фильтрующая хирургия глаукомы.
38. 38. Способ по любому из пп.2, 3 или 4, где офтальмологической хирургией является кератопластика.
39. 39. Способ по любому из пп.2, 3 или 4, который увеличивает толщину ткани роговицы в указанном субъекте.
40. 40. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где повреждение ткани уменьшено в клетках роговицы указанного субъекта.
41. 41. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где повреждение ткани уменьшено в клетках, связанных с роговицей субъекта.
42. 42. Способ по любому из пп.1-4 или 6, который уменьшает помутнение в глазу указанного субъекта.
43. 43. Способ по любому из пп.1-4 или 6, который уменьшает образование рубцов в глазу указанного субъекта.
44. 44. Способ по любому из пп.1-4 или 6, который модулирует гиперцеллюлярность, ассоциированную с дифференцировкой миофибробластов, связанной с участком индуцированного лазером повреждения, в 24-48-часовом периоде после хирургии.
45. 45. Способ по любому из пп.1-4 или 6, который модулирует стромальное ремоделирование и уменьшает помутнение, связанное с участком индуцированного лазером повреждения, в 24-72-часовом периоде после хирургии.
46. 46. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанной офтальмологической процедурой является эксимерная лазерная процедура и указанный способ уменьшает гиперцеллюлярность стромальных клеток у указанного субъекта.
47. 47. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанной офтальмологической процедурой является эксимерная лазерная процедура и указанный способ стимулирует повторную эпителизацию в роговице указанного субъекта.
48. 48. Способ по любому из пп.1-4 или 6, который увеличивает движение эпителиальных клеток в глазу указанного субъекта.
49. 49. Способ по п.48, который приводит к увеличению движения эпителиальных клеток в пределах 12 ч от введения указанного антисмыслового соединения в глаз указанного субъекта.
50. 50. Способ по п.48, который приводит к увеличению движения эпителиальных клеток в пределах 24 ч от введения указанного антисмыслового соединения в глаз указанного субъекта.
51. 51. Способ по любому из пп.1-4 или 6, который приводит к увеличению стромальной плотности в передней строме без приведения к увеличению стромальной плотности задней стромы в глазу указанного проходящего лечение субъекта.
52. 52. Способ по любому из пп.1-4 или 6, который ингибирует отек стромы, ассоциированный с участком индуцированного лазером повреждения, в 24-72-часовом периоде после хирургии.
53. 53. Способ по любому из пп.1-4 или 6, который уменьшает эпителиальную гиперплазию в 24-72часовом периоде после хирургии.
54. 54. Способ по любому из пп.1-4 или 6, который уменьшает активацию миофибробластов в периоде до 1 недели после хирургии.
55. 55. Способ по любому из пп.1-4 или 6, который модулирует дифференцировку клеток, модифицирующую внеклеточный матрикс.
56. 56. Способ по любому из пп.1-4 или 6, который уменьшает пролиферацию клеток.
57. 57. Способ по любому из пп.1-4 или 6, где указанное антисмысловое соединение нацеливают на

    - 66 029094

    коннексин 31.1 и вводят для регуляции кератинизации наружного слоя.
58. 58. Применение антисмыслового соединения для получения лекарственного средства для уменьшения повреждения ткани, связанного с офтальмологической процедурой, где офтальмологической процедурой является офтальмологическая хирургия или лечение офтальмологического повреждения, где указанное антисмысловое соединение ингибирует экспрессию белка коннексина в глазу или в клетках, связанных с глазом, у субъекта.
59. 59. Применение антисмыслового соединения для получения лекарственного средства для конструирования ткани в связи с офтальмологической процедурой, где офтальмологической процедурой является офтальмологическая хирургия или лечение офтальмологического повреждения, где указанное антисмысловое соединение ингибирует экспрессию белка коннексина в глазу или в клетках, связанных с глазом, у субъекта.
60. 60. Способ по любому из пп.1-5, 7-30, 39-43, 48-51, 53-56, в котором указанным офтальмологическим повреждением является проникающая травма глаза.
61. 61. Способ по любому из пп.1-5, 7-30, 39-43, 48-51, 53-56 и 60, в котором указанное офтальмологическое повреждение характеризуется медленным заживанием роговицы.
62. 62. Способ по любому из пп.1-5, 7-30, 39-43, 48-51, 53-56 и 60, в котором указанное офтальмологическое повреждение характеризуется неполным заживлением.
63. 63. Способ по любому из пп.1-5, 7-30, 39-43, 48-51, 53-56 и 60, в котором указанное офтальмологическое повреждение характеризуется потерей остроты зрения.
64. 64. Способ по любому из пп.1-5, 7-30, 39-43, 48-51, 53-56 и 60, в котором указанное офтальмологическое повреждение характеризуется нестабильностью остроты зрения.
65. 65. Способ по любому из пп.1-5, 7-30, 39-43, 48-51, 53-56 и 60, в котором указанное офтальмологическое повреждение характеризуется сдвигом остроты зрения.
66. 66. Способ по любому из пп.1-56, 60-65, в котором коннексин является коннексином 43.
67. 67. Способ по любому из пп.1-56, 60-65, в котором коннексин является коннексином 26.
68. 68. Способ по любому из пп.1-56, 60-65, в котором коннексин является коннексином 30.
69. 69. Способ по любому из пп.1-56, 60-65, в котором коннексин является коннексином 37.
70. 70. Способ по любому из пп.1-57 и 60-69, в котором указанное антисмысловое соединение вводят путем непрерывного введения в течение 24 ч или более.
71. 71. Применение антисмыслового соединения для получения лекарственного средства для уменьшения гиперцеллюлярности в глазу или в ткани, связанной с глазом, у субъекта, подвергающегося офтальмологической хирургии или лечению офтальмологического повреждения, где указанное антисмысловое соединение ингибирует экспрессию белка коннексина в глазу или в клетках, связанных с глазом, у субъекта.
72. 72. Применение по п.71, в котором белок коннексина является коннексином 43.
73. 73. Применение по п.71, в котором белок коннексина является коннексином 26.