KR20070011260A - 코넥신에 표적화된 안티센스 화합물 및 그의 사용 방법 - Google Patents

코넥신에 표적화된 안티센스 화합물 및 그의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 예를 들어 수술후에, 외상에 또는 조직 공학 분야에 사용하기 위한 방법 및 조성물을 비롯하여, 코넥신의 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 조성물 및 방법은, 예를 들어 직접적인 세포-세포 소통이 국부적으로 두절되는 것이 바람직한 질환 및 장애와 관련된 부작용의 중증도를 감소시키기 위해 치료용으로 사용될 수 있다.
안티센스 화합물, 코넥신, 안과 수술, 외상, 조직 손상

Description

코넥신에 표적화된 안티센스 화합물 및 그의 사용 방법{ANTISENSE COMPOUNDS TARGETED TO CONNEXINS AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 갭-정션(gap-junction)-연계된 단백질 발현을 조절하기 위한 화합물을 사용하는 제제, 조성물 및 방법에 관한 것으로 본원에서는 이들을 기재하고 있다. 상기 제제, 조성물 및 방법은, 예를 들면 피부에서, 각막 조직에서, 그리고 눈 수술 절차와 병행하는 것을 비롯한, 생체내 및 시험관내 조직 공학(tissue engineering)용으로 유용하다.
질병 또는 상해에 의한 조직 또는 기관의 기능이상은 완전한 회복을 위해 기관 또는 조직 이식 말고는 선택의 여지가 거의 없는 전세계적으로 중요한 건강 문제이다. 그러나, 이식은 적합한 기증자를 찾는데 문제가 있어 대부분의 환자는 이 방법을 이용할 수 없다. 최근에는, 완전하게 기능하거나 또는 원하는 기능을 갖도록 성장시킨 합성 또는 반-합성의 조직 또는 기관 조형물을 사용하는 조직 공학 또는 리모델링이 대체 방법으로 연구되고 있다.
특히 이러한 기술이 점점 중요해지고 있는 부분은 눈의 각막이다. 각막 이식은 전세계적으로 수행되는 가장 통상적인 형태의 고형 기관 이식이다. 해마다 미국과 영국에서만 80,000회 가까이 수행되고 있다. 근시 교정을 위한 굴절 수술, 예컨대 광굴절 각막절제술(PRK) 및 레이저 제자리 각막절삭성형술(LASIK)이 보급되어, 수술 또는 질환 처치후의 조직 복구 및 변화를 조작하기 위한 생체내 조직 조작에 사용하기 적합한 이식용 각막의 부족을 초래하였다. 또한, 레이저 수술을 받은 환자 중 대략 5％가 예상치 못한 부작용을 경험한다.
각막은 눈의 외부 피막의 가운데 6분의 1을 차지하는 투명한 조직이다. 그의 단일화된 구조 및 기능은 깨끗한 굴절 경계면 및 인장 강도를 갖고 외부 요인으로부터 보호되는 눈을 제공한다. 각막은 3가지 상이한 주요 세포층, 즉 상피, 간질(stroma) 및 내피로 구성되어 있다(문헌 [Pepose, J. S. et al., "The cornea; Adler's Physiology of the eye: Clinical application", 9th ed. St. Louis: Mosby Year Book, 1992, 29-47], [Spencer, W. H., "The cornea; Ophthalmic Pathology: an atlas and textbook", 4th ed., Philadelphia: W. B. Saunders Co., 1996, 157-65]). 또한, 데스메트(Descemet) 막, 보우만(Bowman) 층 및 기저막은 상기 주요 세포층들 중 하나로부터 몇가지 방법에 의해 유래된 구조이다.
각막 상피는 외부 환경과 직접 접촉하는 층이다. 이 층은 래트 및 인간에서 각각 40 내지 100 ㎛의 두께를 갖는, 각질이 형성되지 않은 중층(stratified) 편평 구조를 갖는다. 이는 보통 2 내지 3개의 편평 상피 세포층에 의해 형성된 표피 구역, 2 내지 3개의 다면체 윙세포(wing cell) 층에 의해 형성된 중앙 구역, 및 일렬의 원주형 세포로 이루어진 기저 구역으로 구성된다. 중층 각막 상피는 안구 표면에 대한 보호 장벽으로서 뿐만 아니라 간질의 수화를 조절할 때 각막 내피를 보조 하는 부속 액체 분비층으로 작용하여 각막 투명도 유지에 기여하는 "타이트(tight)"한 이온 수송 기능을 갖는 합포체(syncitium)로 특성화되어 있다. 이 각막 상피에 의해 제공되는 유일하게 특수화된 기능은 주요한 눈 굴절 요소로서 각막의 작용에 필수적인 것으로 입증되었다. 이에 따라, 그의 중층 구조를 어떠한 환경 스트레스에 대해서도 영향을 받지 않도록 유지하는 것이 중요하다.
각막 표면에 대한 외상이 매우 빈번하게 발생하고 있으며, 예를 들어 작은 파편, 안염 및 안질, 화학적 또는 물리적 힘에 의한 사고 및 수술 시행은 모두 각막을 손상시킬 수 있다. 각막-외상에 의한 창상을 치유한 후에 발생하는 한가지 주요한 합병증은 조직 재편성에 의한 시력 상실이다. 안과 치유 문제에 대한 위험성이 있는 환자는 수술을 받은 환자를 포함한다. 이러한 수술의 예로는, 수정체 교체를 수반하거나 수반하지 않는 백내장 적출술; 각막 이식 또는 다른 각막이식술 절차, 예컨대 전체층 각막이식술(PKP); 엑시머 레이저 광굴절 각막절제술; 녹내장 여과 수술; 방사상 각막절개술; 및 굴절을 교정하거나 수정체를 교체하는 다른 유형의 수술이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
각막은 시각적으로 매끄러운 외부 표면을 제공하여 눈으로 빛을 투과시킨다. 수술은 각막을 그의 정상적인 형상으로 고정시키는 힘을 파괴한다. 백내장 환자에서, 전체-두께 수술 절개는 가장자리 영역에서 수행한다. 각막 수축은 치료시에 조직의 국부적인 뒤틀림을 초래하며, 영향을 받는 영역의 시야 내에서의 뒤틀림도 동반한다(난시).
수술로 인한 각막의 다른 창상은 각막의 만곡에서 예정된 국부적인 이동을 발생시키는 창상 치유 과정을 개시할 수 있다. 이러한 기술 중 가장 널리 알려진 것은 방사상 각막절개술(RK)로, 이는 부분-두께 절개를 여러차례 반복하여 중앙 각막을 평평하게 하는 기술이다. 그러나, 이 기술은 창상 치유 특성 및 그의 정도와 관련된 예측가능한 결과의 부족 및 상당한 시력 변동으로 인해 그 사용이 제한되고 있다(문헌 [Jester et al., Cornea(1992) 11:191]). 예를 들어, 대부분의 RK 환자에서 초반 시력 개선의 퇴보와 연관된 각막 조직 주변 팽창의 감소가 관찰된다(문헌 [McDonnell and Schanzlin, Arch. Ophthalmol.(1988), 106:212]).
또한, 각막의 창상이 서서히 치유되면, 불완전환 치유로 인해 시력의 불안정성(오전부터 저녁까지의 시력 변동 및 수주 내지 수개월 동안 발생하는 시력 변화)과 연관되는 경향이 있다. 이는 방사상 각막절개술을 받은 환자 중 34％ 이상에서 발생할 수 있으며, 이들은 수술하고 1년 후에 변동되는 시력에 불만을 갖는다(문헌 [Waring et al., Amer. J. Ophthalmol.(1991) 111:133]). 각막 창상을 완전하게 치유하기 못한 경우에도, 창상 "게이프(gape)"가 발생하여 원시 효과를 점차 증가시킬 수 있다. RK 절차를 경험한 환자 중 30％ 이하가 창상 게이프와 연관된 원시로의 이행(hyperopic shift)으로 고통받고 있다(문헌 [Dietz et al., Ophthalmology(1986) 93:1284]).
외상 후의 각막 재생은 복잡하여 잘 이해되지 않는다. 이는 3가지 조직, 즉 상피, 간질 및 내피의 재생과 관련이 있다. 3가지 주요 세포내 신호전달 경로가 함께 조직 재생을 조정하는 것으로 생각되며, 이 중 하나는 성장 인자(문헌 [Baldwin, H. C. and Marshall, J., Acta Ophthalmol. Scand.,(2002) 80:238-47]), 사이토카인(문헌 [Ahmadi, A. J. and Jakobiec, F. A., Int. Ophthalmol. Clinics,(2002) 42(3):13-22]) 및 케모카인(문헌 [Kurpakus-Wheater, M, et al., Biotech. Histochem,(1999) 74:146-59])에 의해 매개되고; 또다른 하나는 세포-매트릭스 상호작용(문헌 [Tanaka, T., et al., Jpn. J. Ophthalmol.,(1999) 43:348-54])에 의해 매개되고; 나머지 하나는 갭-정션 및 채널 형성 단백질의 코넥신 군에 의해 매개된다.
갭-정션은 세포 막 구조로, 직접적인 세포-세포 소통을 원활하게 한다. 갭-정션 채널은 각각 6개의 코넥신 하위단위로 구성된 2개의 코넥손으로 형성된다. 6량체 코넥손은 각각 반대편 막에 있는 코넥손과 연결되어 단일 갭-정션을 형성한다. 갭-정션 채널은 전신에서 찾아볼 수 있다. 조직, 예컨대 각막 상피는, 예를 들어 6 내지 8개의 세포층을 갖는데, 이는 윙세포층의 기저층에서는 코넥신-43을 사용하고 기저로부터 중앙까지는 코넥신-26을 사용하여, 상이한 층에서 상이한 갭-정션 채널을 발현시킨다. 일반적으로, 코넥신은 통상 이들의 분자량에 따라 명명하거나 또는 계통발생적 기준을 근거로 α, β 및 γ 하위군으로 분류된 단백질 족이다. 현재까지, 20가지 인간 이소형(isoform) 및 19가지 뮤린(murine) 이소형이 동정되었으며(문헌 [Willecke, K. et al., Biol. Chem.,(2002) 383, 725-37]), 이는 각각의 상이한 코넥신 단백질이 기능적으로 분화될 수 있음을 나타내는 것일 수 있다. 상이한 조직 및 세포 유형은 특징적인 코넥신 단백질 발현 패턴을 나타내며, 조직, 예컨대 각막은 손상 또는 이식 후에 코넥신 단백질 발현을 변화시키는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Qui, C. et al.,(2003) Current Biology, 13:1967-1703]; [Brander et al.,(2004), J Invest Dermatol. 122(5):1310-20]).
외상후 각막 재생 과정은 각막 투명도를 저하시킬 수 있으며, 이에 따라 굴절 수술의 결과에 영향을 끼칠 수 있다. 현재 일반적으로 이용되는 손상된 각막 처치법은 각막 이식, 또는 재구성을 위해 각막 세포/조직을 사용하는 시도를 포함한다. 그러나, 수술 절차, 예컨대 예를 들어, 엑시머 레이저 광굴절 각막절제술에 수반되는 각막 및 주변 연부 조직에 대한 수술후 외상은 상피 세포 패턴화의 변화, 근섬유아세포 분화, 간질 리모델링, 및 레이저에 의해 유도된 손상 부위에서의 상피 비후를 비롯하여 세포외 매트릭스의 변형과 연관된 세포과다형성에 의한 반흔 형성을 초래하기도 한다.
심각한 척수 손상에서, 횡단 절개, 좌상 또는 압박에 의해 발생한 병리학적 변화는 수술후 반흔 형성 및 조직 리모델링과 몇몇 유사성을 공유한다. 손상이 발생하고 24 내지 48 시간 후에, 손상은 확산되어 손상된 영역의 크기를 상당히 크게 증가시킨다. 갭-정션 채널이 신경독소 및 칼슘 파동을 손상 부위로부터 다른 건강한 조직으로 확산시키는 갭-정션-매개된 방관자(bystander) 효과(문헌 [Lin, J. H. et al., 1998, Nature Neurosci. 1:431-432])가 관여할 수 있다. 이는 특징적인 염증의 팽창을 수반한다. 척수 손상 영역은 모두 축색의 재생을 방해하는 공동(cavity) 또는 결합 조직 반흔으로 대체된다(문헌 [McDonald, J. W. et al,(September 1999) Scientific American. 55-63]; [Ramer, M. S. et al., Spinal Cord.(2000) 38:449-472]; [Schmidt, C. E. and Baier Leach, J.;(2003) Ann. Rev. Biomed. Eng. 5:293-347]). 최근의 몇몇 치료 방식으로 진척이 이루어졌지만, 척 수 복구에 대해 중대한 제한이 여전히 남아있으며, 이러한 제한으로는 침윤 간섭 자체가 손상 부위를 확산시키고, 신경교세포 반흔을 형성하고, 복구 과정을 방해하며, 신경 기능을 추가로 손실시키는 것 등이 있다(문헌 [Raisman, GJ. Royal Soc. Med. 96:259-261]).
안티센스 기술은 바이러스, 진균 및 대사성 질환과 관련된 유전자 발현을 조절하는 데 사용되어 왔다. 미국 특허 제5,166,195호는 HIV의 올리고뉴클레오티드 억제제를 제안하고 있다. 미국 특허 제5,004,810호는 허피스 심플렉스 바이러스 Vmw65 mRNA에 대한 혼성화 및 복제 억제를 위한 올리고머를 제안하고 있다. 또한, 참고로 2000년 1월 27일에 출원된 베커(Becker) 등의 WO 00/44409(영문 명칭: "Formulations Comprising Antisense Nucleotides to Connexins"; 그 전문이 이 거명을 통해 본원에 포함됨)은, 창상 치유를 촉진하고 수술 또는 화상에 따른 피부 조직의 반흔 형성을 감소시킴에 있어, 뇌, 척수 또는 시신경에서의 국부적인 뉴런 손상을 치료하기 위해 코넥신 발현을 하향조절하는 안티센스(AS) 올리고데옥시뉴클레오티드를 사용하는 것을 기재하고 있다. 그러나, 많은 어려움들이 아직도 극복되어야 한다. 예를 들어, 비-표적 세포 유형에서 특정 유전자 생성물을 하향조절하는 것이 해로운 경우도 있다. 극복해야 하는 또다른 문제로는 상기 ODN(변형되지 않은 포스포디에스테르 올리고머)이 세포내 뉴클레아제 분해 때문에 통상적으로 세포내 반감기가 20 분 밖에 되지 않는다는 ODN의 짧은 반감기 문제(Wagner 1994, 상기 문헌), 및 이들이 표적 조직으로 지속적이고 신뢰성있게 전달되어야 하는 문제가 있다.
따라서, 상기 기재된 문제를 해결하기 위한 화합물이 요구되고 있으며 이러한 화합물의 개발에 대한 다수의 잠재적인 이점에 존재한다. 이러한 화합물, 관련 조성물 및 이들을 사용하는 방법은 본원에 기재 및 청구되어 있다.
<발명의 개요>
본원에 기재 및 청구된 발명은 본 <발명의 개요>에 나열되거나, 기재되거나 또는 언급된 것 등을 비롯한 많은 특징 및 실시양태를 포함한다. 본원에 기재 및 청구된 발명은 본 <발명의 개요>에서 확인되는 특징 또는 실시양태에 의해 제한되지 않는 것으로, 상기 특징 또는 실시양태는 설명의 목적을 위해 포함되었을 뿐 본 발명을 제한하지 않는다.
본 발명은 안티센스 화합물을 비롯하여 조직 공학에 유용한 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 안과 절차와 관련된 조직 손상을 감소시키기 위한 안티센스 화합물 및 방법을 제공한다. 이 방법은, 예를 들어 대상체의 눈 또는 눈과 관련된 세포에서 코넥신 단백질의 발현을 억제하기에 충분한 양의 안티센스 화합물을 상기 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함한다. 코넥신 단백질의 발현이 억제되는 것이 바람직하지만, 안티센스 화합물을 비롯한 상기 화합물은 단독으로 또는 인간 코넥신의 발현을 억제하는 안티센스 또는 다른 화합물과 함께 다른 단백질을 표적화하여 조절할 수 있을 것으로 예상된다.
특정 실시양태에서, 안과 절차는 엑시머 레이저 광굴절 각막절제술, 백내장 적출술, 각막 이식, 굴절 교정 수술, 방사상 각막절개술, 녹내장 여과 수술, 각막이식술, 엑시머 레이저 광굴절 각막절제술, 각막 이식, 굴절 교정 수술, 안구 표면 신생물 제거술, 결막 또는 양막 이식, 익상편 및 결막지방반 제거술, 안구 성형 수술, 눈꺼풀 종양 제거술, 선천성 이상을 위한 눈꺼풀 재건 절차, 안검외번 및 안검내번 눈꺼풀 복구, 사시 수술(안구 근육), 또는 임의의 눈 관통 외상 치료 등을 비롯한 안과 수술이다.
일반적으로, 발현의 억제가 바람직한 코넥신에 대한 뉴클레오티드 서열 중 적어도 일부는 공지되어 있다. 바람직하게는, 안티센스 화합물은 하나 이상의 특이적인 코넥신 이소형(isotype)에 표적화된다. 안티센스 화합물에 의해 표적화될 수 있는 코넥신의 특이적인 이소형으로는 코넥신 43, 37, 31.1 및 26이 있으나 이에 한정되지 않는다. 표적화된 코넥신은 인간 코넥신인 것인 바람직하지만, 반드시 요구되는 것은 아니다. 코넥신(예를 들어, 인간 코넥신)은, 예를 들어 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있다.
특정 다른 실시양태에서, 제2 안티센스 화합물이 대상체(예를 들어, 눈)에 투여되며, 이 때 하나 이상의 다른 안티센스 화합물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신(예를 들어, 인간 코넥신) 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있다. 적어도 제2 안티센스 화합물은, 예를 들어 제1 안티센스 화합물과 상이한 코넥신에 표적화될 수 있다.
본 발명의 다양한 측면에 사용될 수 있는 안티센스 화합물 유형의 예로는 안 티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 데옥시리보자임, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, dsRNA, RNAi 분자, siRNA 분자, PNA 분자, DNA자임(DNAzyme), 및 5'-말단-돌연변이유발된 U1 소핵 RNA, 이들의 유사체, 및 본원에 제공되거나 당업계에 공지되어 있는 다른 화합물, 예를 들어 비-특이적인 분리제, 예컨대 옥탄올, 글리세르헤틴산 및 헵탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 자연 발생 핵염기 및 변형되지 않은 뉴클레오시드 사이의 결합을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 포스포로티오에이트 결합을 비롯한 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 사이의 결합을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 또한, 적합한 안티센스 화합물은, 예를 들어 하나 이상의 변형된 당 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 적합한 안티센스 화합물은 예를 들어 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물은 다른 화합물, 예를 들어 조직 손상의 감소, 염증 감소, 치유 촉진, 또는 몇몇 다른 원하는 활성에 유용한 화합물과 함께 투여된다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상체에 안티센스 화합물을 투여함으로써 대상체(예를 들어, 환자)를 치료하는 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물은 국부 또는 국소 투여 방법에 의해 투여된다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 또한, 예를 들어 전신 투여 또는 안구내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본원에 제공된 안티센스 화합물은, 예를 들어 안과 절차(예를 들어, 수술)에서 발생하는 창상의 형성에 대해 미리 정해진 시간에 대상체에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 화합물은 안과 절차를 수행하기 전에, 중에 또는 후에 투여될 수 있다. 안티센스 화합물은, 예를 들어 안과 절차를 수행하기 몇 분 또는 몇 시간 전 또는 후에 대상체에게 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 안과 절차를 수행한 후에, 예를 들어 안과 절차를 수행하고 난 후 약 4 시간 이내에, 약 3시간 이내에, 보다 통상적으로는 약 2 시간 이내에, 또는 약 1 시간 이내에 투여된다.
다른 측면에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물은 조직 공학을 수행하는 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 안티센스 화합물은 대상체에서 각막 조직의 두께를 증가시키는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 이러한 방법은 안과 절차(예를 들어, 수술)와 관련되거나 또는 관련되지 않을 수 있다. 그 예로써, 본원에 제공된 안티센스 화합물은 대상체의 각막과 관련된 세포(예를 들어, 각막 세포)에서 치유를 촉진하거나 조직 손상을 예방하는 방법과 병행하여 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 반흔 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 염증을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 창상 치유를 촉진한다.
특정 바람직한 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 수술 이식 절차 와 연계되어 사용된다.
특정 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 코넥신 43에 대한 것으로, 이를 투여하어 상피 기저 세포의 분열 및 성장을 조절한다.
특정 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 코넥신 31.1에 대한 것으로, 이를 투여하여 외부층의 각질형성(keratinisation)을 조절한다.
특정 실시양태에 있어서, 예를 들어 안과 절차는 백내장 적출술이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 각막 이식이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 수술 절차는 굴절 교정 수술이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 방사상 각막절개술이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 녹내장 여과 수술이다. 또다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 각막이식술이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 안구 표면 신생물 제거술이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 결막 또는 양막 이식이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 익상편 및 결막지방반 제거술이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 안구 성형 수술이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 눈꺼풀 종양 제거술이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 선천성 이상을 위한 눈꺼풀 재건 절차이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 안검외번 및 안검내번 눈꺼풀 복구이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 사시 수술(안구 근육)이다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차는 눈 관통 외상 치료이다.
추가의 특정 실시양태에서, 예를 들어 화합물 및 조성물은 각막과 관련된 세 포에서 치유를 촉진하거나 조직 손상을 예방하는데 사용되며, 여기서 각막과 관련된 세포는 각막 세포 등을 비롯한 임의의 눈 세포일 수 있다.
안티센스 화합물을 포함하는 본원에 제공된 제제는 대상체에서 각막 조직의 두께를 증가시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 조직 손상 감소 또는 치유 촉진에 유용한 다른 화합물과 함께 사용된다. 예를 들어, 안티센스 화합물은 성장 인자, 사이토카인 등과 동시투여될 수 있다.
다른 측면에서, 예를 들어 안과 수술과 관련된 조직 손상을 감소시키기 위한 제약 조성물이 제공된다. 이 제약 조성물은, 대상체의 눈과 관련된 세포에서 인간 코넥신 단백질의 발현을 억제하기에 충분한 앙으로 존재하는 안티센스 화합물을 포함하는, 상기 대상체의 눈에 국소 또는 국부 투여하기 적합한 제제로 제제화될 수 있다. 안티센스 화합물은, 예를 들어 바람직하게는 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신(예를 들어, 인간 코넥신) 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있다.
특정 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 제약 조성물 형태이고, 제제 또는 안티센스 화합물은 대상체에서 창상 치유를 촉진하는데 유효한 양으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은, 예를 들어 대상체의 눈에 국소 또는 국부 투여하기에 적합한 형태를 비롯한 국소 투여에 적합한 형태일 수 있다. 추가의 특정 실시양태에서, 예를 들어 조성물 및 제제는 겔, 크림의 형태, 또는 본원에 기재되어 있어나 또는 현재 또는 미래에 당업계에 공지되어 있는 임의의 형태일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 안티센스 화합물을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 한 실시양태에서, 예를 들어 안과 절차(예를 들어, 수술)와 관련된 조직 손상을 감소시키기 위한 제약 조성물이 제공되며, 이 제약 조성물은 대상체의 눈에 국소 또는 국부 투여하기 위한 형태로 제제화되고, 대상체의 눈과 관련된 세포에서 인간 코넥신 단백질의 발현을 억제하기에 충분한 양으로 존재하는 안티센스 화합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신(예를 들어, 인간 코넥신) 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있다.
특정 실시양태에서, 예를 들어 제약 조성물은 완충된 플루론산 또는 겔을 포함하는 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 이는, 한 실시양태에서, 예를 들어 인산염 완충된 염수 중에 약 30％ 이하의 플루론산을 포함한다.
다른 측면에서, 하나 이상의 코넥신에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계하는 방법이 제공된다. 이 방법은 선택된 표적을 갖는 특정 올리고뉴클레오티드의 선택된 파라미터, 예컨대 열 안정성, 친화성 및 특이성을 최적화시키는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 하나 이상의 원하는 특정 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 선별하고 개발하는데 이용될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 이들이 코넥신 단백질의 mRNA를 절단하고 번역을 차단하는 능력에 대한 시험을 상기 방법과 함께 수행할 수 있다.
도 1은 대조군 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리된 눈에 광굴절 각막절 제술을 수행한 후 12 시간된 각막의 생체내 공초점 현미경 영상을 도시하고 있다.
도 2는 엑시머 레이저 광절개술을 수행하고 24 시간 후에 대조군(2A, 2B, 2C) 및 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 처리된 래트 각막(2D, 2E)에서 각막 리모델링을 조직학적으로 조사한 결과를 도시하고 있다.
도 3은 엑시머 레이저 광절개술을 수행한지 24 시간 후 대조군(3A, 3B, 3C) 및 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 처리된 각막(3D, 3E, 3F)에서의 코넥신 43 단백질의 발현을 보여주는 현미경 사진 영상을 제공한다. 이 결과는 항-코넥신 43 ODN을 처리한 후에 코넥신-43 단백질 수준이 감소하였으며, 간질에서 세포가 보다 적게 보충되었다는 것을 입증한다.
도 4는 알파 평활근 액틴 항체를 사용하여 수술한지 1 주일 후의 표지된 근섬유아세포를 도시하고 있다. 도 4A, 4B 및 4C는 대조군이고, 도 4D, 4E 및 4F는 안티센스 처리된 각막이다.
도 5는 광굴절 각막절제술을 수행한지 24 시간 후(5A 내지 5D) 및 48 시간 후(5E 내지 5H)에 라미닌-1 표지된 대조군(5A, 5B) 및 코넥신-43 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 처리된 각막을 도시하고 있다. 24 시간째에, 대조군에서는 라미닌이 절개된 영역의 모서리(5A)와 이보다 가운데에 위치한 영역(5B)에 거의 침착되지 않고(않거나) 표면이 고르지 않게 침착되지만, 안티센스 처리된 각막에서는 라미닌이 상기 두 영역(5C, 5D) 모두에서 보다 고르게 침착되는 것으로 나타났다. 48 시간째에, 대조군에서는 여전히 라미닌이 연속적으로 침착되지 않고(5E - 절개된 영역의 모서리; 5F - 중앙), 매우 울퉁불퉁하였다(5E). 이와는 달리, 안티센스 ODN 처리된 각막은 창상 부위의 모서리(5G)와 이보다 가운데에 위치한 영역(5H)에 연속적이고 비교적 평탄한 기저층을 갖는다.
도 6은 라미닌-1 불규칙도를 정량한 개략도를 도시하고 있다.
도 7은 대조군 배양액(7A)에서의 코넥신 26 및 43 및 이어서 24 시간 동안 항-코넥신 43 올리고데옥시뉴클레오티드로 3회 처리한 후의 코넥신 26 및 43(7B), 및 코넥신 31.1 특이적인 안티센스로 처리한 후의 코넥신 26 및 43(7C, 7D)에 대한 면역조직화학 표지 결과를 도시하고 있다.
도 8은 배양액에 넣은지 24 시간된 P7 래트 새끼로부터 얻은 척수 절편을 도시하고 있다. 대조군 절편(1)은 절단부 말단으로부터 돌출된 조직 때문에 팽창하였다(화살표로 표시함). 점선은 원래의 절개 부위를 표시한 것이다. 조직학적 조사 결과, 세포에 액포가 생켜 부풀어 오르는 것으로 나타났다. 5일째까지 상기 절편 전체에 걸쳐 활성화된 소교세포(microglia)가 존재하였으며, 생존 뉴런은 거의 존재하지 않았다. 이와는 달리, 안티센스 처리된 절편(2)은 세포가 부풀어 오르고 액포가 형성되는 것이 최소화되어 대조군에 비해 팽창이 유의하게 감소하였다(p < 0.001). 20 일 동안 배양시킨 후에도, 회색질의 뉴런은 외부 모서리에 제한적으로 분포된 활성화된 소교세포와 함께 생존해 있다.
도 9는 대조군 처리된 절편(9A) 및 코넥신 43 안티센스 처리된 절편(9B)으로부터의 뉴런을 도시하고 있다. 대조군 절편의 뉴런은 액포가 생기고 부풀어 올랐으며, 주변 조직이 파괴되었지만, 처리된 절편의 뉴런은 건강하게 생존해 있는 것으로 나타났다.
도 10은 배양액에 넣은지 5 일된 배양된 척수 절편의 말단 근처에서 MAP-2로 면역표지한 것을 보여준다. 대조군 절편에는 생존 뉴런이 거의 없고 MAP-2로 거의 표지되지 않았으나(16％가 임의의 MAP-2로 표지된 것을 나타남)(1OA), 처리된 절편의 66％에는 배지에 노출된 절단부 말단 및(또는) 남아있는 백색질과 인접한 곳에 MAP-2 발현 영역이 존재하였다.
도 11은 데옥시리보자임이 시험관내에서 표적 코넥신-43 mRNA의 특정 영역을 선택적으로 절단한다는 것을 보여준다. 2.4 kb 크기의 래트 코넥신-43 mRNA(11A) 및 1.2 kb 크기의 마우스 코넥신-43 mRNA(11B)를 플라스미드로부터 시험관내에서 전사시키고, 여러 데옥시리보자임과 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 래트 mRNA의 896 내지 953 영역(11A)은 마우스에서 이에 상응하는 영역에 대해 설계된 데옥시리보자임이 없어 확정하지 못하였다. 마우스 mRNA의 367 내지 466 영역을 데옥시리보자임으로 절단한 결과는 래트 코넥신-43 mRNA로부터의 결과와 일치하지 않았는데, 이는 아마도 래트 mRNA에는 비-번역 5'-영역에 200개의 염기쌍이 존재하기 때문일 것이다. 단일 점 돌연변이를 갖는 결손 대조군 데옥시리보자임인 df605 및 df783은 이러한 절단이 특이적이라는 것을 보여준다. 마우스 dz1007 및 dz1028에서 마우스 mRNA에 대한 데옥시리보자임에 의해 일부 프라이밍이 비-특이적으로 누락되는 것도 관찰되었다. 종합하면, 526 내지 622, 783 내지 885 및 1007 내지 1076 염기 영역을 표적으로 하는 데옥시리보자임은 래트 및 마우스 mRNA 종에서 유의하게 절단하는 것으로 나타났다.
도 12는 데옥시리보자임이 시험관내에서 표적 코넥신-26 mRNA의 특정 영역을 선택적으로 절단하는 것을 보여준다. 0.7 kb 크기의 래트(12A) 및 마우스(12B) 코넥신-43 mRNA를 플라스미드로부터 시험관내에서 전사시키고, 여러 데옥시리보자임과 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 절단 결과는 설치류 코넥신-26 mRNA가 318 내지 379 및 493 내지 567 염기 영역에 데옥시리보자임에 의해 표적화되는 2개 이상의 영역을 갖는 것을 보여준다. 단일 점 돌연변이를 갖는 결손 대조군 데옥시리보자임인 df351 및 df379는 이러한 절단이 특이적이라는 것을 보여준다.
도 13은 1 시간 이하 동안 배양된 각막에서의 안티센스 올리고머의 침투 및 안정성을 보여준다. Cy3 표지된 올리고머는 플루론산 겔과 함께 전달한지 1 시간 후에 핵과 세포질에서 반점으로 나타난다(13A). 가시적인 Cy3 침투 속도는 각막 상피에서 1 시간 후에 10 내지 15 ㎛/시였다(13B). Taqman 표지된 올리고머 프로브를 사용하고, 각 패널이 적색에 대해 5 nm 발광 스펙트럼을 나타내는 람다(Lambda) 주사를 이용하여 상피 세포 내 안티센스 올리고머의 안정성을 평가하였다(13B). 손상되지 않은 Taqman 프로브는, TAMRA의 적색 형광을 사용한 형광 공명 에너지 수송은 그레이-스케일(gray-scale)로 나타나지만(13D), 분해된 생성물은 FAM으로부터 예상된 바와 같이 녹색 형광(이 또한 그레이-스케일로 나타남)(13C)으로 나타난다는 것을 보여준다. 세포에서 유효한 안티센스 올리고머 농도는 형광 기술에 의해 검출될 수 있는 것보다 낮을 수 있다.
도 14는 상이한 안티센스 올리고머의 코넥신-43(밝은 부분, 그레이-스케일) 및 코넥신-26(어두운 부분, 그레이-스케일) 단백질 발현에 대한 효과가 시험관내 데옥시리보자임 mRNA 절단에 의해 나타난다는 것을 보여준다. 도 4A는 플루론산 겔 대조군 처리된 각막 상피의 기저 세포에서의 정상적인 코넥신-43 단백질 발현(밝은 부분, 그레이-스케일), 및 플루론산 겔 대조군 처리된 각막 상피의 기저부로부터 중앙에 존재하는 세포에서의 코넥신-26 단백질 발현(어두운 부분, 그레이-스케일)을 보여준다. as14(14B), as769(14D), as892(14F)(이들 셋 모두 시험관내 데옥시리보자임 절단을 나타내지 않음) 및 DB1 센스 대조군(14H) 올리고머는 생체외 배양액에서 2가지 코넥신 모두의 발현에 영향을 끼치지 않는다. as605(14C), as783(14E) 및 DB1(14G)(이들 셋 모두 양성 시험관내 데옥시리보자임 절단을 나타냄)는 처리된 각막의 상피에서 특이적인 코넥신-43 넉-다운(knock-down)만 나타낸다.
도 15는 코넥신-43 안티센스 올리고머가 래트 각막에서 코넥신-43 단백질 발현을 선택적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 각각의 스팟은 다르게 처리한 단일 각막을 나타낸다. 솔리드(solid) 스팟(검정색, DB1, as605, as783, as885, as953 및 as1076)은 백색 스팟(DB1 센스, as14, as769 및 as892)과 비교하였을 때 코넥신-43 발현이 평균 36％ 내지 85％ 감소한다는 것을 보여준다. 데옥시리보자임 3차 예측 분석에 의해 효과가 거의 또는 전혀 없는 것으로 예측된 모든 안티센스 올리고머는 정상적인 코넥신-43 발현 평균값의 85％ 내지 134％를 나타내었다. 모든 실험은 DB1 센스로 처리된 배지 코넥신-43 밀도로 표준화시켰으며, 그 결과 2개의 음성 올리고머(as769 및 as892)가 DB1 센스 대조군 처리보다 높은 코넥신-43 밀도를 나타내었다.
도 16은 안티센스 또는 센스 올리고머로 처리된 래트 각막에서의 코넥신-43 mRNA 수준을 비교하고 이를 실시간 PCR을 이용하여 평가한 결과를 보여준다. 상기 수준은 플루론산 겔로만 처리된 각막의 비율로 표현하였다. 시험관내 분석에 의해 기능성일 것으로 예측된 3가지 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드인 DB1As, As605 및 As783(검정색 막대)은 각각 코넥신-43 mRNA 발현을 정상(겔로만 처리된 경우: 흰색 막대) 수준의 46.8％, 44％ 및 25％ 만큼 감소시켰다(**p < 0.001). DB1 센스 대조군 올리고머의 경우에는 상기와 같은 발현 감소가 관찰되지 않았다(106％)(흰색 막대, DB1 센스). 시험관내 데옥시리보자임 3차 예측 분석에서 임의의 Cx43 cRNA 절단을 나타내지 않는 As769를 음성 대조군으로 사용하였다(148％)(흰색 막대, As769).
도 17은 안티센스 또는 센스(대조군) 올리고머로 처리된 래트 각막에서의 코넥신-26 mRNA 수준을 비교하고 이를 실시간 PCR을 이용하여 평가한 결과를 보여준다. 상기 수준은 플루론산 겔로만 처리된 각막의 비율(겔로만 처리된 경우: 흰색 막대)로 표현하였다. As330 및 As375는 각각 Cx26 mRNA 발현을 33％ 및 71％ 감소시켰다(**p < 0.001)(검정색 막대). Rv330 센스 올리고머의 경우에는 상기와 같은 발현 감소가 관찰되지 않았다(109％)(Rv330, 흰색 막대).
본 발명의 실시는 당업계의 기술에 속하는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학 및 면역학의 다양한 통상적인 기술을 이용할 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition(Sambrook et al., 1989)] 및 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition(Sambrook and Russel, 2001)](본원에서는 함께 또는 개별적으로 "Sambrook"으로 지칭함); [Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed., 1984)]; [Animal cell Cuture(R. I. Freshney, ed., 1987)]; [Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir ＆ C. C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller ＆ M. P. Calos, eds., 1987)]; [Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 2001년까지의 보충물 포함)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan et al., eds., 1991)]; [The Immunoassay Handbook(D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994)]; [Bioconjugate Techniquess(Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996)]; [Methods of Immunological Analysis(R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)], [Harlow and Lane(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, and Harlow and Lane(1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY](본원에서는 함께 또는 개별적으로 "Harlow and Lane"으로 지칭함), [Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley ＆ Sons, Inc., New York, 2000)]; 및 [Agrawal, ed., Protocols for Oligonucleotides and Analogues, Synthesis and Properties Humana Press Inc., New Jersey, 1993)] 등에 상세하게 설명되어 있다,
정의
일반적으로, 그리고 다양한 비제한적 특정 실시양태를 통해 본 발명의 보다 상세하게 기재하기 전에, 본 발명을 기재하는데 있어 본원에 사용된 특정 용어들을 설명한다. 달리 지시되지 않는 한, 하기 용어는 본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용될 때 하기 의미를 갖는다. 명세서에서 하기에 또는 어디에서든 정의하지 않은 용어는 당업계에 인식되어 있는 의미를 가져야 한다.
"안티센스 화합물"은 치료에 사용하였을 때 mRNA의 서열-특이적인 표적화에 의해 작용하는 것을 비롯한, 유전자의 발현, 번역 또는 기능을 억제하는 작용을 하는 상이한 유형의 분자를 포함한다.
따라서, 안티센스 화합물은, 예를 들어 주요 핵산 기재의 유전자-사일런싱(silencing) 분자, 예컨대 화학적으로 변형된 안티센스 올리고데옥시리보핵산(ODN), 리보자임 및 siRNA를 포함한다(문헌 [Scherer, L. J. and Rossi, J. J. Nature Biotechnol. 21:1457-1465(2003)]). 또한, 안티센스 화합물은 안티센스 분자, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA)(문헌 [Braasch, D. A. and Corey, D. R., Biochemistry 41, 4503-4510(2002)]), 모르폴리노 포스포로디아미데이트(문헌 [Heasman, J., Dev. Biol., 243, 209-214(2002)]), DNA자임(문헌 [Schubert, S. et al., Nucleic Acids Res. 31, 5982-5992(2003)], [Chakraborti, S. and Banerjea, A. C., Mol. Ther. 7, 817-826(2003)], [Santoro, S. W. and Joyce, G. F. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 4262-4266(1997)]), 및 최근 개발된 5'-말단-돌연변이유발된 U1 소핵 RNA(문헌 [Fortes, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 8264-8269(2003)])를 포함한다.
용어 "안티센스 서열"은 안티센스 화합물 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 나타내며, 예를 들어 RNA 서열에 대해 상보적이거나 또는 부분적으로 상보적인 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 안티센스 서열은, 예를 들어 RNA 또는 그의 부분에 결합하여 리보솜에 의한 mRNA의 전사를 차단하는 핵산 서열을 포함한다. 안티센스 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, PCT 공개 WO 94/12633, 및 문헌 [Nielsen et al., 1991, Science 254:1497; Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, edited by F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press(1991); Antisense Research and applications(1993), CRC Press] 참조).
본원에 사용된 "메신저(messenger) RNA"는 3개의 문자 유전자 코드를 이용하는 단백질 코딩에 대한 정보를 갖는 서열 및 비-번역 5'-영역, 비-번역 3'-영역 및 5-'캡 영역을 형성하는 관련 리보뉴클레오티드 서열, 및 다양한 2차 구조를 형성하는 리보뉴클레오티드 서열을 포함한다. 임의의 상기 서열에 전체적으로 또는 부분적으로 표적화된 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따라 제조할 수 있다.
일반적으로, 핵산(올리고뉴클레오티드 포함)은 "DNA-유사"(즉, 2'-데옥시 당을 갖고, 일반적으로 U 염기보다 T 염기를 가짐) 또는 "RNA-유사"(즉, 2'-히드록실 또는 2'-변형된 당을 갖고, 일반적으로 T 염기보다 U 염기를 가짐)로 기재할 수 있다. 핵산 나선(helix)는 1종이 넘는 구조 유형, 가장 통상적으로는 A-형 및 B-형을 채택할 수 있다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-유사"인 것으로 여겨지고, A-형-유사 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-유사"인 것으로 여겨진다.
용어 "상보적"은 일반적으로 허용되는 염 및 온도 조건하에서 염기쌍 형성에 의해 폴리뉴클레오티드가 자연적으로 결합함을 나타낸다. 예를 들어, 서열 "A-G-T"는 상보적 서열 "T-C-A"에 결합한다. 2개의 단일-가닥 분자 사이의 상보성은 "부분적"이어서 핵산의 일부만이 결합할 수 있거나, 또는 "완전"하여서 단일 가닥 분자 사이에 전체적인 상보성이 존재할 수 있다. 핵산 분자 사이의 상보성 정도는 이들 사이의 혼성화 효율 및 강도에 유의한 영향을 끼친다. "혼성화될 수 있는" 및 "상보적"은 DNA 또는 RNA 표적과 올리고뉴클레오티드 사이에 안정한 결합을 생성할 정도로 충분한 상보성 정도를 나타내는데 사용되는 용어이다. 올리고뉴클레오티드는 혼성화될 그의 표적 핵산 서열에 100％ 상보적일 필요는 없는 것으로 이해되며, 또한 상기 결합은 표적-특이적이거나 또는 비-특이적인 결합이 치료 목적 또는 다른 목적을 유의하게 또는 바람직하지 못하게 방해하지 않는 한 다른 비-표적 분자에 결합할 수도 있는 것으로 이해된다. 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적 분자의 정상적인 기능을 방해함으로써 활성을 손실 또는 감소시키며, 충분한 정도의 상보성이 존재하여 특정 결합이 바람직한 조건하에, 즉 생체내 분석 또는 치료적 처리의 경우에는 생리학적 조건하에, 또는 시험관내 분석의 경우에는 분석이 수행되는 조건하에 올리고뉴클레오티드가 비-표적 서열과 비-특이적이거나 원하지 않는 결합을 형성하는 것을 방지한다. 본 발명의 특정 실시양태의 문맥에서는, 절대적 상보성은 필요하지 않다. 폴리뉴클레오티드는 충분한 상보성이 있어 생리학적 조건하에 20 ℃, 30 ℃ 또는 40 ℃가 넘는 융점을 갖는 이중가닥을 형성하는 것이 일반적으로 바람직하다.
"장애"는 본원에 기재 또는 청구된 것을 비롯하여, 본 발명의 분자 또는 조성물로 처리하였을 때 유익해지는 임의의 증상이다. 이는 포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 증상을 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
올리고뉴클레오티드의 선택된 핵산 표적에 대한 "표적화"는 다단계 과정일 수 있다. 이 과정은 기능이 조절될 핵산 서열을 확인하는 것으로 시작할 수 있다. 이는, 예를 들어 발현이 특정 질환 상태와 관련된 세포내 유전자(또는 유전자로부터 만들어진 mRNA) 또는 감염성 제제로부터의 외래 핵산(RNA 또는 DNA)일 수 있다. 또한, 표적화 과정은 원하는 효과, 즉 단백질 발현의 억제, 감소된 단백질 검출 또는 다른 활성 조절이 나타나는 올리고뉴클레오티드 상호작용 생성을 위한 핵산 서열 내의 부위(들)을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일단 표적 부위(들)이 확인되면, 표적에 충분하거나 바람직하게 상보적인 것, 즉 충분하게 혼성화되고 적당한 또는 다른 원하는 특이성을 갖는 안티센스 화합물(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)을 선택하여 원하는 조절을 수득한다. 본 발명에서, 표적은 하나 이상의 코넥신을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 또한, 표적화 과정은 원하는 효과가 나타나는 안티센스 상호작용 생성을 위한 부위(들)을 결정하는 것을 포함할 수도 있다. 바람직한 유전자내 부위는, 예를 들어 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 번역 개시 또는 종결 코돈을 포함하는 영역이다. 번역 개시 코돈은 통상적으로 5'-AUG(전사된 mRNA 분자에서; 상응하는 DNA 분자에서는 5'-ATG)로 지칭되고, "AUG 코돈", "개시 코돈" 또는 "AUG 개시 코돈"으로 지칭될 수도 있다. 소수의 유전자는 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG을 갖는 번역 개시 코돈을 가지며, 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG는 생체내에서 기능하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 용어 "번역 개시 코돈" 및 "개시 코돈"은, 각각의 경우에 통상적인 개시자 아미노산이 메티오닌(진핵생물에서) 또는 포르밀메티오닌(원핵생물에서)이지만, 다수의 코돈 서열을 포함할 수도 있다. 진핵생물 및 원핵생물 유전자는 2가지 이상의 다른 개시 코돈을 가질 수 있으며, 이 중 어느 하나가 특정 세포 유형 또는 조직에서, 또는 특정 조건 세트하에 번역 개시에 우선적으로 사용될 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다.
용어 올리고뉴클레오티드"는 자연 발생 염기, 당 및 당내(백본; backbone) 결합으로 이루어진 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체의 올리고머 또는 중합체를 포함한다. 또한, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 유사한 기능을 갖는 비-자연 발생 단량체 또는 그의 일부를 포함하는 올리고머 또는 중합체를 포함한다. 상기 변형되거나 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 향상된 세포 흡수성, 뉴클레아제 존재하에서의 증가된 안정성, 또는 향상된 표적 친화성과 같은 특성 때문에 천연 형태보다 바람직하기도 하다. 다수의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 변형은 올리고뉴클레오티드가 천연 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)보다 뉴클레아제 분해에 대해 더 높은 내성을 갖도록 만드는 것으로 밝혀졌다. 뉴클레아제 내성은 통상적으로 올리고뉴클레오티드를 세포 추출물 또는 단리된 뉴클레아제 용액과 함께 인큐베이션하고, 보통 겔 전기영동에 의해 손상되지 않은 잔존 올리고뉴클레오티드의 정도를 시간에 따라 측정함으로써 결정한다. 뉴클레아제 내성이 향상되도록 변형된 올리고뉴클레오티드는 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드보다 더 오랜 시간 동안 손상되지 않은 상태로 생존할 수 있다. 또한, 다수의 변형이 올리고뉴클레오티드의 그의 표적에 대한 결합(친화성)을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 올리고뉴클레오티드의 그의 표적에 대한 친화성은 통상적으로 올리고뉴클레오티드와 표적이 분리되는 온도인 올리고뉴클레오티드/표적 쌍의 Tm(융점)을 측정함으로써 결정한다. 분리는 분광 광도계로 검출한다. Tm이 높을수록, 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성이 커진다. 몇몇 경우에는, 표적-결합 친화성을 향상시키는 올리고뉴클레오티드 변형이 뉴클레아제 내성도 향상시킬 수 있다.
"폴리뉴클레오티드"는 여러 개의 뉴클레오티드를 의미한다. 따라서, 용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고데옥시뉴클레오티드" 모두는 뉴클레오티드의 헤테로중합체 또는 이러한 뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 또한, 이들 어구는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으며, 펩티드 핵산(PNA) 또는 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질에 대한 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는, 게놈에서 유래하거나 합성된 DNA 또는 RNA를 나타낸다.
코넥신, 코넥신 단편 또는 코넥신 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로는, 자연에서 발견되는 코넥신의 성숙한 형태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 자연에서 발견되는 코넥신의 성숙한 형태를 코딩하는 서열과 추가의 코딩 서열, 예를 들어 리더(leader) 또는 신호 서열, 또는 전구단백질 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; 상기 서열 중 하나와 비-코딩 서열(예를 들어, 자연에서 발현되는 폴리펩티드의 성숙한 형태에 대한 코딩 서열의 인트론 또는 5' 및(또는) 3'의 비-코딩 서열)을 갖는 폴리뉴클레오티드; 자연에서 발견되는 코넥신의 성숙한 형태의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 자연에서 발견되는 코넥신의 성숙한 형태의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 있다. 따라서, "코넥신-코딩 폴리뉴클레오티드" 등은 원하는 코넥신, 단편 또는 변이체에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 추가의 코딩 및(또는) 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
용어 "펩티도모방물(peptidomimetic)" 및 "모방물"은 본원에 제공된 안티센스 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 구조 및 기능적 특성을 가질 수 있으며, 적어도 부분적으로나 어느 정도까지는 코넥신-특이적인 억제 활성을 흉내내는 합성 화합물을 나타낸다. 펩티드 유사체는 주형 펩티드와 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 제약 산업에 통상적으로 사용될 수 있다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물을 "펩티드 모방물" 또는 "펩티도모방물"로 지칭한다(문헌 [Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986)]; [Veber and Freidinger; TINS; 392(1985)]; [Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229(1987)]; [Beeley N., Trends Biotechnol. 1994 Jun; 12(6):213-6]; [Kieber-Emmons T, et al.; Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug; 8(4):435-41]). 치료상 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방물을 사용하여 동등하거나 향상된 치료 또는 예방 효과를 나타낼 수 있다. 일반적으로, 펩티도모방물은 이론적인 폴리펩티드(즉, 생물학적 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예컨대 안티센스 폴리뉴클레오티드와 구조적으로 유사하지만, 예를 들어 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로 이루어진 군으로부터 선택된 결합에 의해 임의로 치환될 수 있는 하나 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 모방물은 전체가 아미노산의 합성 비-천연 유사체로 구성될 수 있거나, 또는 일부는 천연 펩티드 아미노산으로 이루어지고 다른 일부는 아미노산의 비-천연 유사체로 이루어진 키메라 분자이다. 또한, 모방물은 천연 아미노산 보존적 치환이 모방물의 구조 및(또는) 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 한 임의의 양의 천연 아미노산 보존적 치환을 도입할 수도 있다. 예를 들어, 모방 조성물은 코넥신 단백질의 생물학적 활성, 예를 들어 갭-정션에 의해 매개된 세포-세포 소통을 하향조절할 수 있다면 본 발명의 범위에 포함된다.
용어 "조성물"은 하나 이상의 성분을 포함하는 생성물을 포함하는 것으로 간주된다.
다양한 형태로 본원에 사용된 용어 코넥신 활성의 "조절자" 및 "조절"은 코넥신의 발현 또는 활성을 전부 또는 부분적으로 억제하는 것을 포함하는 것으로 간주된다. 이러한 조절자는 코넥신 기능의 소분자 효능제 및 길항제, 안티센스 분자, 리보자임, 삼중가닥 분자, 및 RNAi 폴리뉴클레오티드, 유전자요법 등을 포함한다.
어구 "동일성 비율(％)"은 둘 이상의 서열을 비교하였을 때 발견되는 서열 유사성의 비율을 나타낸다. 동일성 비율(％)은 임의의 적합한 소프트웨어를 이용하여 전자적으로 결정할 수 있다. 이와 마찬가지로, 2가지 서열(또는 이들의 하나 이상의 부분 중 하나 또는 둘 모두) 사이의 "유사성"은 하나의 서열을 제2 서열에 대해 비교함으로써 결정된다.
"제약상 허용되는"은, 예를 들어 담체, 희석제 또는 부형제가 제제의 다른 성분과 상용가능하고 그의 수혜자에게 투여하기 적합하다는 것을 의미한다.
일반적으로, 용어 "단백질"은 펩티드 결합을 통해 연결된 둘 이상의 개별 아미노산(자연 발생 아미노산 또는 비자연 발생 아미노산)의 임의의 중합체를 나타내며, 상기 펩티드 결합은 한 아미노산(또는 아미노산 잔기)의 α-탄소에 결합된 카르복실산기의 카르복실 탄소 원자가 인접한 아미노산의 α-탄소에 결합된 아미노기의 아미노 질소 원자에 공유 결합하여 생성된다. 이러한 펩티드 결합, 및 여기에 포함되는 원자(즉, α-탄소 원자, 카르복실 탄소 원자(및 이들의 치환기 산소 원자), 및 아미노 질소 원자(및 이들의 치환기 수소 원자))는 단백질의 "폴리펩티드 백본"을 형성한다. 또한, 본원에 사용된 용어 "단백질"은 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"(본원에서 때때로 상호교환적으로 사용될 수 있음)를 포함하는 것으로 이해된다. 이와 마찬가지로, 단백질 단편, 유사체, 유도체 및 변이체는 본원에서 "단백질"로 지칭될 수 있으며, 달리 지시되지 않는 한 "단백질"로 간주되어야 한다. 용어 단백질의 "단편"은 단백질의 모든 아미노산 잔기보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 인식되는 바와 같이, 단백질의 "단편"은 아미노 말단, 카르복시 말단 및(또는) 내부에서(예컨대, 자연적인 스플라이싱(splicing)에 의해) 절단된 단백질 형태일 수 있으며, 변이체 및(또는) 유도체일 수도 있다. 단백질의 "도메인"은 또한 단편이며, 자연 발생 단백질에 상응하는 생화학적 활성을 부여하는데 필요한 단백질의 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 절단된 분자, 즉 선형 생물학적 중합체, 예컨대 핵산 분자 또는 폴리펩티드는 분자의 말단으로부터 하나 이상의 결실을 갖고(갖거나) 분자의 비-말단 영역으로부터 하나 이상의 결실을 가질 수 있으며, 이 때 상기 결실은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 내지 40, 41 내지 50, 51 내지 74, 75 내지 100, 101 내지 150, 151 내지 200, 201 내지 250 또는 251 내지 299개의 연결된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 결실을 비롯하여, 약 1 내지 1500개의 연결된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 1 내지 500개의 연결된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 약 1 내지 300개의 연결된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 결실일 수 있다.
용어 "엄격한 조건"은 폴리뉴클레오티드 사이의 혼성화를 허용하는 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 염 농도, 유기 용매(예를 들어, 포름아미드)의 농도, 온도, 및 당업계에 공지된 다른 조건에 의해 정해질 수 있다. 엄격도는 염의 농도를 감소시키거나, 유기 용매(예를 들어, 포름아미드)의 농도를 증가시키거나, 또는 혼성화 온도를 상승시킴으로써 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 엄격한 염 농도는 보통 약 750 mM 미만의 NaCl 및 75 mM 미만의 3나트륨 시트레이트, 바람직하게는 약 500 mM 미만의 NaCl 및 50 mM 미만의 3나트륨 시트레이트, 가장 바람직하게는 약 250 mM 미만의 NaCl 및 25 mM 미만의 3나트륨 시트레이트일 것이다. 낮은 엄격도의 혼성화는 유기 용매, 예를 들어 포름아미드의 부재하에 달성할 수 있는 반면, 높은 엄격도의 혼성화는 유기 용매(예를 들어, 약 35％ 이상의 포름아미드, 가장 바람직하게는 약 50％ 이상의 포름아미드)의 존재하에 달성될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 보통 약 30 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 약 37 ℃ 이상, 가장 바람직하게는 약 42 ℃ 이상의 온도를 포함할 것이다. 부가적인 가변 파라미터, 예를 들어 혼성화 시간, 디터전트(예를 들어, 나트륨 도데실 술페이트(SDS))의 농도, 및 담체 DNA의 도입 또는 배제 여부는 당업자에게 공지되어 있다. 다양한 수준의 엄격도는 요구되는 상기 다양한 조건들을 조합함으로써 달성되며, 이는 당업계 기술 범위에 속하는 것이다. 또한, 엄격한 혼성화 조건은 표적 서열의 융점(Tm) 미만의 온도, 즉 약 5 ℃ 내지 약 20 ℃ 또는 25 ℃ 범위의 온도, 및 표적과 정확하게 또는 거의 정확하게 상보적인 프로브에 의해 정해질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 융점은 이중 가닥 핵산 분자 집단 중 절반이 단일 가닥으로 분리되는 온도이다. 핵산의 Tm을 계산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Berger and Kimmel, 1987, Methods In Enzymology, Vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc.] 및 [Sambrook et al.,(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory] 참조). 표준 참고문헌에 나타난 바와 같이, Tm 값은 핵산이 1M NaCl의 수용액 중에 존재하는 경우에 식 Tm = 81.5 + 0.41(％ G + C)에 계산하여 간단하게 추정할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Anderson and Young, "Quantitative Filter Hybridization" in Nucleic Acid Hybridization(1985)] 참조). 하이브리드의 융점은(따라서, 엄격한 혼성화에 대한 조건은) 다양한 요인, 예컨대 프로브의 길이 및 성질(DNA, RNA, 염기 조성)과 표적(용액 중에 존재하거나 고정되어 있는 DNA, RNA, 염기 조성물 등)의 성질, 및 염 및 다른 성분의 농도(예를 들어, 포름아미드, 덱스트란 술페이트, 폴리에틸렌 글리콜이 존재하거나 부재함)에 의해 영향을 받는다. 이러한 요인의 효과는 공지되어 있으며, 당업계의 표준 참고문헌에 논의되어 있다(예를 들어, 삼브룩(Sambrook)의 상기 문헌 및 오수벨(Ausubel)의 상기 문헌 참조). 통상적으로, 엄격한 혼성화 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 나트륨 이온의 농도가 약 1.0 M 미만, 통상적으로는 약 0.01 내지 1.0 M인 염 농도, 및 짧은 프로브(예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)의 경우에는 약 30 ℃ 이상, 긴 프로브(예를 들어, 50개를 초과하는 뉴클레오티드)의 경우에는 약 60 ℃ 이상의 온도이다. 언급한 바와 같이, 엄격한 조건은 또한 보다 낮은 온도가 이용될 수 있는 경우에 탈안정화제, 예컨대 포름아미드를 첨가하여 달성할 수 있다. 본 발명에서, 폴리뉴클레오티드는 높은 엄격도를 갖는 매질의 조건, 예컨대 약 50 내지 약 60 ℃의 온도 및 0.03 M 나트륨 클로라이드 및 0.03 M 나트륨 시트레이트의 조건하에 코넥신 mRNA에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
용어 "치료상 유효량"은 대상 화합물이 원하는 반응, 예를 들어 연구원, 수의사, 의학 전문의 또는 다른 임상의에 의해 관찰되는 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도해내는 양이다.
"처치"는 치료 및 예방적 처치, 또는 예방적 측정을 나타낸다. 처치가 필요한 대상은 이미 장애를 갖고 있는 대상 뿐만 아니라 장애를 예방하고자 하는 대상을 포함한다.
용어 "벡터"는 플라스미드, 파지 또는 바이러스가 박테리아, 효모, 무척추 동물 및(또는) 포유동물 숙주 세포에서 기능할 수 있는 경우에 핵산을 세포에 전달하기 위한 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 다른 시스템(자연 발생 또는 합성임) 형태의 핵산 분자 증폭, 복제 및(또는) 발현용 비히클을 나타낸다. 벡터는 숙주 세포 게놈 DNA와는 별개로 잔류할 수 있거나 또는 게놈 DNA와 전부 또는 부분적으로 통합될 수 있다. 벡터는 일반적으로 그와 상용가능한 임의의 숙주 세포에서 기능할 수 있기 위해 필요한 모든 요소를 함유할 것이지만, 반드시 그럴 필요는 없다. "발현 벡터"는 적절한 조건하에 외생 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 결합 도메인 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 벡터이다.
본원에 기재된 용어 "상동성 및 상동적인"은 코넥신 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 서열과 상동적일 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 관련 서열과, 예를 들어 (상동적인 서열의) 약 15, 20, 30, 40, 50, 100개 이상의 연결된 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 통상적으로는 약 70％ 이상의 상동성, 바람직하게는 약 80％, 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 이상의 상동성을 갖는다.
상동성은 당업계의 임의의 방법에 기초하여 계산할 수 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는 상동성 계산에 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다(예를 들어, 디폴트(default) 세팅에서 사용됨)(문헌 [Devereux et al.(1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395]). PILEUP 및 BLAST 알고리즘을 이용하여(통상적으로는, 이들의 디폴트 세팅에서) 상동성 또는 정렬된 서열을 계산할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Altschul S. F.(1993); J Mol Evol 36:290-300]; [Altschul, S. F. et al.,(1990); J Mol Biol 215:403-10]에 기재되어 있음). BLAST 분석을 수행하는데 사용되는 소프트웨어는 생물기술 정보를 위한 국립 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 사용할 수 있다(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/L). 이 알고리즘은 우선, 데이타베이스 서열에서 동일한 길이의 워드(word)와 정렬하였을 때 상당한 양성값을 나타내는 역치 스코어(T)와 일치하거나 또는 이를 만족시키는 질의(query) 서열의 짧은 길이(W)의 워드를 식별함으로써 높은 스코어의 서열 쌍을 식별하는 것을 포함한다. T는 인접 워드 스코어 역치로 지칭된다(Altschul et al., 상기 문헌). 이들 초기 인접 워드 히트(hit)는 이들을 함유하는 HSP를 찾기 위한 검색을 시작할 때 사용하는 시드(seed)로서 작용한다. 워드 히트는 누적된 정렬 스코어가 증가할 수 있는 한 각각의 서열을 따라 두 방향 모두로 연장된다. 워드 히트의 각 방향으로의 연장은 누적된 정렬 스코어가 그의 최대 달성값으로부터 X만큼의 양이 감소하는 경우, 하나 이상의 음성-스코어 잔기 정렬의 축적에 의해 누적된 스코어가 0 이하가 되는 경우, 또는 어느 한 서열의 말단에 도달한 경우에 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터인 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 11의 워드 길이(W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌 [Henikoff and Henikoff(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919]) 정렬(B), 10의 기대값(E), M=5, N=4, 및 두 가닥의 비교를 이용한다.
BLAST 알고리즘은 2가지 서열 사이의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 하나의 유사성 측정은 최저 합계 확률(P(N))로, 2가지 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 우연히 서로 쌍을 이룰 확률의 기준을 제공한다. 예를 들어, 제1 서열의 비교에서 최저 합계 확률값이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 이 서열을 다른 서열과 유사한 것으로 간주한다.
상동성 서열은 통상적으로 적어도(즉, 이를 넘지 않는) 약 1, 2, 5, 10, 15, 20개 이상의 돌연변이(치환, 결실 또는 삽입 돌연변이일 수 있음)에 의해 관련 서열과 구분된다. 이들 돌연변이는 상동성 계산과 관련하여 상기 언급된 임의의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다. 상동성 서열은 통상적으로 배경보다 유의하게 높은 수준으로 원래 서열에 선택적으로 혼성화된다. 선택적인 혼성화는 통상적으로 높은 엄격도의 배지 조건(약 50 내지 약 60 ℃의 온도, 예를 들어 0.03M 나트륨 클로라이드 및 0.03M 나트륨 시트레이트) 이용하여 달성된다. 그러나, 이러한 혼성화는 당업계에 공지된 임의의 적합한 조건하에 수행될 수도 있다(문헌 [Sambrook et al.(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual]). 예를 들어, 높은 엄격도가 요구된다면, 적합한 조건은 60 ℃에서 0.2 x SSC를 포함한다. 보다 낮은 엄격도가 요구된다면, 적합한 조건은 60 ℃에서 2 x SSC를 포함한다.
"세포"는 원하는 용도에 적합한 임의의 생존 세포를 의미한다. 세포는 진핵생물 및 원핵생물 세포를 포함한다.
용어 "유전자 생성물"은 유전자로부터 전사된 RNA 분자, 또는 유전자에 의해 코딩되거나 RNA로부터 번역된 폴리펩티드를 나타낸다.
용어 "재조합"은 시험관내에서 합성되거나 달리 조작된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, "재조합 폴리뉴클레오티드"), 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하여 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 유전자 생성물을 제조하는 방법, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드("재조합 단백질")를 나타낸다. 따라서, "재조합" 폴리뉴클레오티드는 그의 제조 방법 또는 구조에 의해 정의된다. 그의 생성 방법과 관련하여, 이 과정은 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 인위적인 간섭, 통상적으로 선별 또는 생성을 포함하는 재조합 핵산 기술을 나타낸다. 별법으로, 이것은 서로 자연적으로 연결되어 있지 않은 2개 이상의 단편의 융합을 포함하는 서열을 생성함으로써 제조된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 따라서, 예를 들어 임의의 비-자연 발생 벡터로 세포를 형질전환시켜 제조한 생성물이, 임의의 합성 올리고뉴클레오티드 과정을 이용하여 유래된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서 포함된다. 이와 마찬가지로, "재조합" 폴리펩티드는 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 것이다.
"재조합 숙주 세포"는 벡터(예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 함유하는 세포, 또는 재조합 기줄에 의해 해당 단백질을 발현하도록 조작된 세포이다.
본 발명은 창상-치유, 예를 들어 수술 관련 창상 치유 및(또는) 조직 리모델링 응용을 위한 갭-정션-연계된 단백질 발현의 부위-특이적인 조절용 화합물 및 조성물의 사용 방법을 포함한다. 본 발명은 레이저 수술과 병행하는 시력 결손 교정, 시험관내 각막 공학, 및 각막의 리모델링이 바람직한 경우 직접 눈을 치료하는데 유용하다(눈에 수행된 절차(예를 들어, 수술)와 독립적으로 또는 별법으로 병행하여 수행된 절차도 포함함). 직접적인 세포-세포 소통의 안티센스 조절은 바람직하게는 조직에서 세포들 사이의 커플링을 직접 또는 간접적으로 감소시키는 분자에 의해 매개된다. 상기 분자는 단백질 이소형의 번역을 감소시키고 세포 갭-정션의 기능을 방해하는 특이적인 코넥신 이소형에 표적화된 폴리뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 데옥시뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, RNAi 및 데옥스리보자임을 포함한다. 이러한 안티센스 화합물을 투여하면 코넥신 발현이 하향조절되는 부위에서 갭-정션-매개된 세포-세포 소통이 감소한다.
코넥신은 갭-정션-매개된 세포-세포 신호전달에 중요한 역할을 한다. 코넥신의 과다발현은 수술후 반흔 형성 및 외상후-유도된 조직 리모델링과 연관되어 있다. 본 발명의 특정 실시양태에 있어서, 코넥신은 각막 외상 및 수술후 조직 리모델링 관련 부작용의 치료, 및 직접적인 세포-세포 소통을 국부적으로 단절시키는 것이 바람직한 질환 및 장애에 유용한 표적을 대표한다. 특히, 코넥신 발현의 조절은 조직 리모델링/조직 공학 분야를 위한 갭-정션-연계된 단백질 발현의 부위-특이적인 조절에 유용할 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 안과 절차 또는 수술, 예를 들어 백내장 수술, 안구내 수정체 삽입술, 각막 이식 수술 및 몇가지 유형의 녹내장 수술, 및 본원에 기재된 다른 절차와 연관된 코넥신 조절에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 코넥신의 조절은 망막 및 수정체를 포함하는 후방 절편에 영향을 끼치는 안과 장애에 적용될 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 코넥신의 조절은 각막, 결막 및 공막을 포함하는 전방 절편에 영향을 끼치는 안과 장애에 적용될 수 있다. 본원에서, 후방 절편 장애는 황반 원공 및 변성, 망막 눈물, 당뇨병성 망막증, 유리체망막증 및 기타 장애를 포함한다. 또한, 본원에서 수정체 장애는 백내장을 포함할 수 있다. 또다른 측면에서, 각막 장애는 굴절 장애, 예컨대 방사상 각막절개술의 후유증, 건조성 각막염, 바이러스성 결막염, 궤양성 결막염 및 창상(예를 들어, 각막 상피 창상) 치유시의 반흔 형성, 및 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome)의 증상이라는 것을 고려한다.
본 발명은 코넥신을 코딩하는 핵산 분자의 기능을 조절하여 생성된 코넥신의 양을 조절하는데 사용되는 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다. 이는 코넥신을 코딩하는 핵산, 바람직하게는 mRNA와 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드를 제공함으로써 달성된다.
이와 같은 혼성화되는 안티센스 화합물(예컨대, 올리고뉴클레오티드)과 그의 상보적 핵산 표적 사이의 관계는 통상적으로 "안티센스"로 나타낸다. 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드의 선택된 핵산 표적으로의 "표적화"는 통상적으로 다단계 과정이다. 이 과정은 보통 기능이 조절되는 핵산을 동정하는 것으로 시작한다. 이러한 핵산은 그 발현이 특정 질환 상태와 관련된 세포 유전자(또는 유전자로부터 만들어진 mRNA)일 수 있다. 본 발명에서, 표적은 코넥신을 코딩하는 핵산, 다른 표현으로는 코넥신을 코딩하는 유전자 또는 코넥신 유전자로부터 발현된 mRNA이다. 현재 코넥신을 코딩하는 mRNA가 바람직한 표적이다. 표적화 과정은 또한 유전자가 조절되도록 하는 안티센스 상호작용 발생에 사용되는 핵산 서열 내의 부위(들)을 결정하는 것을 포함한다.
본원에서, 메신저 RNA는 3문자 유전자 코드를 이용하는 단백질을 코딩하기 위한 정보 뿐만 아니라 비-번역 5'-영역, 비-번역 3'-영역, 5'-캡 영역 및 인트론/엑손 정션 리보뉴클레오티드로서 당업자에게 공지된 영역을 형성하는 관련 리보뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 상기 관련 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 정보 리보뉴클레오티드에 전체적으로 또는 부분적으로 표적화된 올리고뉴클레오티드를 본 발명에 따라 제제화할 수 있다. 이에 따라, 올리고뉴클레오티드는 전사 개시 부위 영역, 번역 개시 코돈 영역, 5'-캡 영역, 인트론/엑손 정션, 코딩 서열, 번역 종결 코돈 영역 또는 비-번역 5'-영역 또는 비-번역 3'-영역의 서열과 특이적으로 혼성화될 수 있다. 번역 개시 코돈은 통상적으로 5'-AUG(전사된 mRNA분자에서; 상응하는 DNA 분자에서는 5'-ATG)이기 때문에, 번역 개시 코돈은 또한 "AUG 코돈", "개시 코돈" 또는 "AUG 개시 코돈"으로 지칭될 수 있다. 소수의 유전자는 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG를 갖는 번역 개시 코돈을 가지며, 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG는 생체내에서 기능하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 용어 "번역 개시 코돈" 및 "개시 코돈"은, 각각의 경우에 통상적인 개시자 아미노산이 메티오닌(진핵생물에서) 또는 포르밀메티오닌(원핵생물에서)이지만, 다수의 코돈 서열을 포함할 수도 있다. 진핵생물 및 원핵생물 유전자는 2가지 이상의 다른 개시 코돈을 가질 수 있으며, 이 중 어느 하나가 특정 세포 유형 또는 조직에서, 또는 특정 조건 세트하에 번역 개시에 우선적으로 사용될 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 본원에서, "개시 코돈" 및 "번역 개시 코돈"은 상기 코돈의 서열과는 상관없이 코넥신을 코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA 분자의 번역을 개시하기 위해 생체내에서 사용되는 코돈(들)을 나타낸다. 유전자의 번역 종결 코돈(또는 "정지 코돈")은 3가지 서열, 즉 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA(상응하는 DNA 서열은 각각 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA임) 중 하나를 가질 수 있다는 것도 당업계에 공지되어 있다. 용어 "개시 코돈 영역", "AUG 영역" 및 "번역 개시 코돈 영역"은 번역 개시 코돈으로부터 어느 한 방향(즉, 5' 또는 3')으로 약 25 내지 50개의 연결된 뉴클레오티드를 포함하는 상기 mRNA 또는 유전자의 일부를 나타낸다. 이 영역은 바람직한 표적 영역이다. 이와 마찬가지로, 용어 "정지 코돈 영역" 및 "번역 종결 코돈 영역"은 번역 종결 코돈으로부터 어느 한 방향(즉, 5' 또는 3')으로 약 25 내지 50개의 연결된 뉴클레오티드를 포함하는 상기 mRNA 또는 유전자의 일부를 나타낸다. 이 영역은 바람직한 표적 영역이다. 번역 개시 코돈과 번역 종결 코돈 사이의 영역을 나타내는 것으로 당업계에 공지되어 있는 오픈 리딩 프레임(ORF) 또는 "코딩 영역"은 또한 효과적으로 표적화될 수 있는 영역이다. 다른 바람직한 표적 영역은, 번역 개시 코돈으로부터 5' 방향에 있는 mRNA의 일부를 나타내는 것으로 당업계에 공지되어 있는 비-번역 5'-영역(5'UTR)을 포함하고, 이에 따라 번역 종결 코돈으로부터 3' 방향에 있는 mRNA의 일부를 나타내는 것으로 당업계에 공지되어 있는 비-번역 3'-영역(3'UTR)과 유전자 상에서 mRNA 또는 상응하는 뉴클레오티드의 5'-캡 부위와 번역 개시 코돈 사이에 존재하는 뉴클레오티드를 포함하며, 따라서 상기 유전자 상에서 mRNA 또는 상응하는 뉴클레오티드의 번역 종결 코돈과 3'-말단 사이에 존재하는 뉴클레오티드를 포함한다. mRNA의 5'-캡은 5'-5' 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA의 5'-최말단 잔기에 결합된 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5'-캡 영역은 5'-캡 구조 자체 뿐만 아니라 캡에 바로 인접하고 있는 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 간주한다. 5'-캡 영역 또한 바람직한 표적 영역일 수 있다.
몇몇 진핵생물 mRNA 전사체는 직접 번역되지만, 다수의 전사체는 전-mRNA 전사체로부터 절단되어 하나 이상의 성숙한 mRNA를 제공하는 하나 이상의 영역("인트론"으로 공지되어 있음)을 함유한다. 나머지(이에 따라 번역되는) 영역은 "엑손"으로 공지되어 있으며, 이들은 함께 스플라이싱되어 연속적인 mRNA 서열을 형성한다. mRNA 스플라이싱 부위, 즉 엑손-엑손 또는 인트론-엑손 정션도 바람직한 표적 영역일 수 있으며, 이들은 특히 변종 스플라이싱이 질환과 연관되어 있거나, 또는 특정 mRNA 스플라이싱 생성물의 과다생성이 질환과 연관되어 있는 상황에 유용하다. 재배열 또는 결실에 의한 변종 융합 정션도 바람직한 표적이다. 다르게 스플라이싱된 mRNA에서 특정 엑손을 표적화하는 것도 바람직할 수 있다. 또한, 인트론도 효과적일 수 있으며, 이에 따라 예를 들어 DNA 또는 전-mRNA에 표적화된 안티센스 화합물에 대한 표적 영역일 수 있다는 것이 밝혀졌다.
본원에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 코넥신 mRNA 전부 또는 그의 일부에 혼성화될 수 있다. 통상적으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 코넥신 mRNA의 리보솜 결합 영역 또는 코딩 영역에 혼성화된다. 폴리뉴클레오티드는 코넥신 mRNA의 전체 또는 한 영역에 상보적일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 코넥신 mRNA 전체 또는 그의 일부의 정확한 상보체일 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 코넥신의 전사 및(또는) 번역을 억제할 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 코넥신 유전자의 전사 및(또는) 번역을 특이적으로 억제하는 억제제로, 다른 유전자의 전사 및(또는) 번역을 억제하지 않는다. 이 생성물은 (i) 코딩 서열에 대한 5', 및(또는) (ii) 코딩 서열, 및(또는) (iii) 코딩 서열에 대한 3'에서 코넥신 유전자 또는 mRNA와 결합할 수 있다. 일반적으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 감소될 세포에서 코넥신 mRNA 및(또는) 단백질의 발현을 유발할 것이다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 코넥신 mRNA에 대해 안티센스이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 코넥신 mRNA에 혼성화되어, 전사, mRNA 프로세싱, 핵으로부터의 mRNA 수송, 번역 또는 mRNA 분해를 비롯한 코넥신 mRNA 대사 중 하나 이상의 측면을 방해함으로써 코넥신의 발현을 억제할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 코넥신 mRNA에 혼성화되어 이중가닥을 형성하며, 이는 mRNA의 번역을 직접 억제하고(하거나) 탈안정화를 유발할 수 있다. 이러한 이중가닥은 뉴클레아제에 의해 분해될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드와 mRNA의 혼성화는 mRNA의 정상적인 기능 중 하나 이상을 방해한다. 방해되는 mRNA의 기능은 모든 생명유지 기능, 예를 들어 RNA의 단백질 번역 부위로의 전위, RNA로부터의 단백질 번역, 하나 이상의 mRNA 종을 생성하는 RNA의 스플라이싱, 및 RNA에 의해 보장될 수 있는 촉매 활성을 포함한다. 특이적인 단백질(들)의 RNA로의 결합도 안티센스 올리고뉴클레오티드와 RNA의 혼성화에 의해 방해받을 수 있다.
전체적인 mRNA 기능 방해 효과는 코넥신의 발현을 조절하는 것이다. 본원에서 "조절"은 억제 또는 자극, 즉 발현을 감소 또는 증가시키는 것을 포함한다. 이러한 조절은 당업계에 통상적인 방법, 예를 들어 mRNA 발현에 대한 노던 블랏 분석, 본 출원의 실시예에 교시된 역전사효소 PCR, 단백질 발현에 대한 웨스턴 블랏 또는 ELISA 분석, 또는 단백질 발현에 대한 면역침전 분석에 의해 측정될 수 있다. 세포 증식 또는 종양 세포 증식에 대한 효과도 본 출원의 실시예에 교시된 바와 같이 측정할 수 있다. 현재는 억제가 바람직하다.
일단 표적 부위(들)이 확인되면, 표적에 충분히 상보적인 올리고뉴클레오티드, 즉 충분히 혼성화되고 충분한 특이성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 선택하여 원하는 조절을 제공할 수 있다. 안티센스 핵산(DNA, RNA, 변형체, 유사체 등)은 핵산을 제조하는데 적합한 임의의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 다른 코넥신 단백질에 대한 올리고데옥시뉴클레오티드를 임의의 승인된 접근법, 예를 들어 컴퓨터 프로그램 MacVector 및 OligoTech(올리고스(Oligos) 등으로부터 입수함; 미국 오레곤주 유진)를 이용하여 이들의 뉴클레오티드 서열에 대해 선택할 수 있다. 이러한 합성에 사용되는 장치는 MacVector 및 OligoTech(올리고스 등으로부터 입수함; 미국 오레곤주 유진)를 비롯한 여러 판매사로부터 입수할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드에 대한 일반적인 방법은, 문헌 [Antisense RNA and DNA, D. A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1988)] 및 [Dagle et al., Nucleic Acids Research, 19:1805(1991)]를 참조한다. 안티센스 요법에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Uhlmann et al., Chem. Reviews, 90:543-584(1990)]를 참조한다. 통상적으로, 발현을 억제하는 것이 바람직한 코넥신에 대하여 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다. 바람직하게는, 안티센스 화합물은 하나 이상의 특이적인 코넥신 이소형에 표적화된다. 안티센스 화합물에 의해 표적화될 수 있는 코넥신의 특이적인 이소형으로는 코넥신 43, 37, 31.1, 26, 및 본원에 기재된 다른 것들이 있다. 표적화된 코넥신은 인간 코넥신인 것이 바람직하지만, 반드시 요구되는 것은 아니다. 코넥신은, 예를 들어 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있다.
특정 실시양태에서, 제2 안티센스 화합물을 대상체의 눈에 투여하며, 이 때 제2 안티센스 화합물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있고, 상기 제2 안티센스 화합물은 제1 안티센스 화합물과 상이한 코넥신에 표적화되어 있다.
코넥신 표적은 조작되거나 리모델링될 조직의 유형에 따라 달라질 것이며, 본 발명에 사용되는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 정확한 서열은 표적 코넥신 단백질에 따라 달라질 것이다. 코넥신 단백질 또는 올리고뉴클레오티드에 표적화된 단백질은 하향조절이 유도되는 위치에 의존할 것이다. 이는 전신에 걸친 상이한 부위에서의 코넥신 하위단위 조성물에 대한 갭-정션(들)의 불균일한 조성을 반영한다. 그러나, 몇몇 코넥신 단백질은 조직 분포의 면에서 다른 것들보다 더 편재되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 각막-연계된 코넥신, 예컨대 코넥신 43이 몇몇 실시양태에서 바람직하다. 따라서, 본원에서는, 올리고뉴클레오티드를 단독으로 또는 조합하여 각막 공학 또는 리모델링 분야에 적합한 코넥신 43, 26, 37, 30 및(또는) 31.1(예를 들어, 서열 1 내지 11)에 표적화시킨다. 본 발명의 한 측면에서, 올리고데옥시뉴클레오티드는 변형되지 않은 포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
별개의 코넥신 단백질에 표적화된 올리고뉴클레오티드를 함께 사용할 수 있다는 점도 고려된다(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 상이한 코넥신이 표적화될 수 있음). 예를 들어, 코넥신 43에 표적화된 ODN, 및 코넥신 족의 하나 이상의 다른 구성원(예컨대, 코넥신 26, 30, 31.1, 37 및 43)을 함께 사용할 수 있다. 개별 안티센스 폴리뉴클레오티드가 특정 코넥신에 대해 특이적일 수 있거나 1, 2, 3 또는 그 이상의 상이한 코넥신을 표적으로 할 수도 있다는 점도 고려된다. 특이적인 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 코넥신 사이에 보존되어 있지 않은 코넥신 유전자 또는 mRNA의 서열을 표적으로 하지만, 비-특이적인 폴리뉴클레오티드는 보존되어 있는 서열을 표적으로 할 것이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 인간 코넥신 26, 코넥신 30, 코넥신 31.1, 인간 코넥신 37, 코넥신 43 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있으며, 이 때 상기 안티센스 화합물은 상기 환자의 눈과 관련된 세포에서 인간 코넥신 단백질의 발현을 억제한다.
특정 실시양태에서, 코넥신을 코딩하는 핵산 분자는 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 조성물은 둘 이상의 인간 코넥신 단백질을 표적으로 하고, 둘 이상의 인간 코넥신 단백질의 발현을 억제한다. 추가의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 선택된 코넥신 43에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예로는 GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC(서열 1), GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC(서열 2) 및 GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT(서열 3)가 있다. 코넥신 26에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 서열 TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA(서열 4)를 갖는다. 선택된 코넥신 37에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예로는 5'-CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC-3'(서열 5) 및 5'-CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG-3'(서열 6)이 있다. 선택된 코넥신 30에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예로는 5'-CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC-3'(서열 7) 및 5'-TTG TCC AGG TGA CTC CAA GG-3'(서열 8)이 있다. 선택된 코넥신 31.1에 대한 안티센스 올리고 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예로는 5'-CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C-3'(서열 9), 5'-AGA GGC GCA CGT GAG ACA C-3'(서열 10) 및 5'-TGA AGA CAA TGA AGA TGT T-3'(서열 11)이 있다.
추가의 실시양태에서, 하기 서열로부터 선택된 올리고데옥시뉴클레오티드는 코넥신 43 발현을 하향조절하는 데 특히 적합하다.
5'-GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC-3'(서열 1),
5'-GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC-3'(서열 2), 및
5'-GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT-3'(서열 3)
또다른 실시양태에서, 하기 서열군으로부터 선택된 올리고데옥시뉴클레오티드가 코넥신 26, 37, 30 및 31.1에 대해 특히 적합하다.
5'-TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA-3'(코넥신 26)(서열 4)
5'-CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC-3'(코넥신 37)(서열 5)
5'-CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG-3'(코넥신 37)(서열 6)
5'-CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC-3'(코넥신 30)(서열 7)
5'-TTG TCC AGG TGA CTC CAA GG-3'(코넥신 30)(서열 8)
5'-CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C-3'(코넥신 31.1)(서열 9)
5'-AGA GGC GCA CGT GAG ACA C-3'(코넥신 31.1)(서열 10)
5'-TGA AGA CAA TGA AGA TGT T-3'(코넥신 31.1)(서열 11)
본원에 제공된 안티센스 화합물은 일반적으로 약 8 내지 약 40개의 핵염기(즉, 약 8 내지 약 40개의 결합된 뉴클레오시드), 보다 통상적으로는 약 12 내지 약 40개의 핵염기, 보다 더 통상적으로 약 30개의 핵염기를 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 화합물의 길이는 뉴클레오티드 약 40개 이상, 예를 들어 약 60개 이상 또는 약 80개 이상일 수 있고, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 또는 3000개 또는 그 이상까지일 수도 있다. 적합한 안티센스 화합물은, 예를 들어 30량체 ODN을 포함한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있다. 다른 실시양태에서, 안티센스 화합물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의, 약 10개 이상, 약 12개 이상, 약 14개 이상, 약 16개 이상, 약 18개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 약 30개 이상 및 약 35개 이상의 핵염기에 표적화되어 있다. 인간 코넥신을 코딩하는 핵산 분자의 약 8 내지 35개의 핵염기에 표적화된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 화합물의 크기는 그 길이가 핵염기 8개 이상, 핵염기 8 내지 100개, 핵염기 8 내지 50개, 핵염기 8 내지 40개, 핵염기 10 내지 50개, 핵염기 12 내지 50개, 핵염기 14 내지 50개, 핵염기 16 내지 50개, 핵염기 18 내지 50개, 핵염기 20 내지 50개, 핵염기 25 내지 50개, 핵염기 15 내지 35개 등일 수 있다. 본 발명의 다른 안티센스 화합물은 크기가 상기와 같거나, 보다 작거나 또는 보다 클 수 있으며, 예를 들어 그 길이가 핵염기 100개를 초과한다.
안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드(ODN), 안티센스 폴리뉴클레오티드, 데옥시리보자임, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, RNAi 분자 또는 그의 유사체, siRNA 분자 또는 그의 유사체, PNA 분자 또는 그의 유사체, DNA자임 또는 그의 유사체, 5'-말단-돌연변이유발된 U1 소핵 RNA 및 그의 유사체를 포함한다.
본원에 제공된 안티센스 화합물은 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)의 사용을 포함할 수 있다. ODN은 일반적으로 그 길이가 뉴클레오티드 약 20개이며, 전-mRNA 및 mRNA에 혼성화되어 리보뉴클레아제 H(RNase H)(형성된 RNA-DNA 이중가닥의 RNA 가닥을 특이적으로 분해함)에 대한 기질을 형성함으로써 작용한다. RNase H의 작용을 억제하는 방식으로 변형된 경우, ODN은 입체적 장애(steric hindrance)를 통해 mRNA의 번역을 억제하거나, 또는 전-mRNA의 스플라이싱을 억제할 수 있다. ODN 및 이들의 변형물은 삼중 나선의 형성에 의해 전사를 억제하는데 사용되는 dsDNA를 표적하는데 사용되어 왔다. ODN은 승인된 자동화 합성 방법에 의해 수득할 수 있으며, 이는 임의의 서열을 갖는 ODN을 수득하고 안티센스 염기쌍을 통해 유전자 발현을 차단하기가 비교적 수월하다.
특정 측면에서, ODN의 포스포디에스테르 백본은 변형되어 유전자 발현을 차단하기 위한 표적-특이적인 제제로서의 효능을 증가시킬 수 있다. 이러한 백본 변형물을 개발하여 ODN의 안정성을 개선시키고 이들의 세포 흡수성을 향상시켰다. 가장 널리 사용되는 변형물은 비가교 산소를 황 원자로 치환하여 포스포로티오에이트 ODN을 생성한 것이다. 하나 이상의 포스포로티오에이트 ODN이 FDA에 의해 승인되었으며, 여러 가지 다른 포스포로티오에이트 안티센스 ODN은 다양한 암 및 염증성 질환에 대한 초기 단계의 임상 시험이 진행 중이다.
유전자 기능 차단과 관련된 ODN의 작용 메카니즘은 ODN의 백본에 따라 달라진다(문헌 [Branch, A. D. Hepatology 24, 1517-1529(1996)]; [Dias, N. and Stein, C. A. Mol. Cancer Thor. 1, 347-355(2002)]; [Stein, C. A. and Cohen, J. S., Cancer Res. 48, 2659-2668(1988)]; [Zon, G. Ann. N. Y. Acad Sci., 616, 161-172(1990)]). 순 음성으로 하전된 ODN, 예컨대 포스포디에스테르 및 포르포로티오에이트는 표적 mRNA의 RNAse H-매개된 절단을 유도한다. RNAse H를 보충하지 않은 다른 백본 변형은 전하 또는 표적 RNA와 형성된 나선 유형의 부족 때문에 입체적 장애 ODN으로 분류될 수 있다. 일반적으로 사용되는 상기 입체적 장애 ODN 군의 구성원은 모르폴리노, U-O-메틸, 2"-O-알릴, 잠긴(locked) 핵산 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다. 상기 ODN은 다른 억제 표적에서 스플라이싱, 번역, 핵-세포질 수송 및 번역을 차단할 수 있다.
다른 측면에서, 코넥신 발현의 조절은 리보자임의 사용을 포함한다. 리보자임은 단백질의 완전한 부재하에서도 효소로서 작용하는 RNA 분자이다. 이들은 현저한 특이성을 갖는 공유 결합을 파괴하고(하거나) 형성하여 표적화된 반응의 자발적인 속도를 수십배 가속시키는 촉매 활성을 갖는다.
리보자임은 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 RNA에 결합하고, 포스포디에스테르 백본의 가수분해를 촉매함으로써 표적 RNA를 분해하는 작용을 한다. 여러 가지 상이한 군의 리보자임이 존재하며, 이 중 '해머헤드(hammerhead)' 리보자임이 가장 널리 연구되고 있다. 그의 명칭이 암시하는 바와 같이, 해머헤드 리보자임은 그의 표적 mRNA와 혼성화되었을 때 독특한 2차 구조를 형성한다. 리보자임에서 촉매적으로 중요한 잔기는 표적 RNA 절단 부위 측면에 존재하는 표적-상보적 서열의 측면에 위치한다. 리보자임에 의한 절단은 2가의 이온, 예컨대 마그네슘 이온을 필요로 하며, 표적 RNA의 구조 및 접근가능성에 의존한다. 세포 내에서 위치 신호를 사용하여 리보자임을 표적 RNA와 함께 국부화시키면 이들의 사일런싱 효율이 크게 증가한다. 해머헤드 리보자임은 화학적으로 합성되거나 벡터로부터 전사될 수 있을 정도로 충분히 짧아 세포 내에서 리보자임이 계속 생성되도록 한다.
촉매로서 작용하는 RNA의 능력은 처음 테트라히메나 테르모필라(Tetrahymena Thermophila)의 자가-스플라이싱 I군 인트론 및 RNAse의 RNA 잔기에 대해 입증되었다. 상기 2가지 RNA 효소가 발견된 후에, RNA-매개된 촉매작용은 효모, 진균 및 식물 미토콘드리아(및 엽록체) 단일-가닥 식물 비로이드(viroid) 및 바이러스양(virusoid) RNA, 델타 간염 바이러스 및 뉴로스포사 크라사(Neurospora crassa) 미토콘드리아의 위성 RNA의 자가-스플라이싱 II군 인트론과 관련된 것으로 밝혀졌다. 리보자임은 자연적으로 발생하지만, 시스(동일한 핵산 가닥 상) 또는 트랜스(비공유 결합 핵산)로 특정 서열을 발현 및 표적화하기 위해 인공적으로 조작될 수도 있다. 시험관내 선별 프로토콜을 이용하여 새로운 생화학적 활동이 개발되고 있을 뿐만 아니라, RNA보다는 기질 상에서 작용하는 새로운 리보자임 모티프가 생성되고 있다.
테트라히메나 트로소필라 I군 인트론은 우선 리보자임을 시스-절단하여 트랜스-반응 형태(본 발명자들은 인트론/리보자임으로 지칭함)로 전환시켜 게놈 연구 및 가능한 치료 둘 모두에 유용하게 만든다. 트랜스-스플라이싱 반응에서, 표적화된 mRNA에 결손된 엑손은 인트론/리보자임에 공유 결합에 의해 부착된 정확한 엑손으로 교환할 수 있다. 이는 스플라이싱 반응을 통해 일어나는데, 여기서 인트론에 부착된 엑손을 염기쌍 형성시켜 표적 mRNA에 위치시킴으로써 에스테르교환 반응에서 표적 전사체의 5" 말단에 공유 결합될 수 있도록 한다. 이 반응은 야생형 서열을 겸상적혈구 글로빈 전사체 및 돌연변이 p53 전사체로 트랜스-스플라이싱하고, 근긴장성이영양증 대립유전자 중 단백질 키나아제 전사체의 3"-UTR에서 확장된 3중 가닥을 교체하는데 사용되어 왔다.
엔도리보뉴클레아제 RNAse P는 자연 전체의 유기체에서 발견되었다. 이 효소는 RNA 및 자신이 단리되는 유기체에 따라 하나 이상의 단백질 성분을 갖는다. 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 효소로부터의 RNA 성분은 단백질 교환자인 특정 염 및 이온성 조건의 부재하에 부위-특이적인 절단제로서 작용할 수 있다. 인간 및 박테리아 효소에 필요한 기질에 대한 연구는 효소에 대한 최소 기질이 수송 RNA 분자의 절편과 유사하다는 것을 밝혀내었다. 이러한 구조는 표적 RNA와 쌍을 형성하는 독특하게 설계된 안티센스 RNA에 의해 모방할 수 있으며, 시험관 및 세포 둘 모두에서 RNAse P-매개된 부위-특이적인 절단에 대한 기질로 작용한다. 또한, 안티센스 성분이 RNAse P RNA에 공유 결합되어 효소만을 해당 표적 RNA로 향하게 할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 연구자들은 해당 표적 mRNA와 쌍을 형성하여 표적의 부위-특이적인 절단을 자극하고 세포 배양액에서 허피스 심플렉스 바이러스 및 사이토메갈로바이러스를 표적화시켜 억제하기 위한 안티센스 RNA의 설계에 상기 특성을 이용하였다.
다수의 작은 식물 병원성 RNA(비로이드, 위성 RNA 및 바이러스양 RNA), 뉴로소포라 크라사 미토콘드리아 DNA 플라스미드로부터의 전사체 및 동물 델타 간염 바이러스는 단백질의 부재하에 시험관내에서 자가-절단 반응을 수행한다. 이 반응은 중성 pH 및 Mg2 +를 필요로 한다. 자가-절단 반응 생체내 롤링-서클(rolling-circle) 복제 메카니즘의 필수 부분이다. 이러한 자가-절단 RNA는 서열 및 절단 부위 부근에 형성된 2차 구조에 따라 하위군으로 분류될 수 있다. 작은 리보자임은 단일-가닥 식물 비로이드 및 바이러스양 RNA에서 발견되는 모티프로부터 유래되었다. 공유된 2차 구조 및 뉴클레오티드의 보존된 세트에 기초하여, 용어 "해머헤드"가 상기 자가-절단 도메인 중 하나의 군에 주어졌다. 해머헤드 리보자임은 30개의 뉴클레오티드로 이루어져 있다. 해머헤드 촉매적 도메인은 그의 간단한 구조 때문에 트랜스-작용 리보자임 설계시 널리 선택된다. 왓슨-크릭 염기쌍을 사용하여, 해머헤드 리보자임은 임의의 표적 RNA를 절단하도록 설계될 수 있다. 절단 부위에 필요한 것은 상대적으로 간단하고, 사실상 임의의 UH 서열 모티프(H가 U, C 또는 A임)가 표적화될 수 있다.
제2의 식물-유래된 자가-절단 모티프(처음에 타바코 윤문병 위성 RNA의 음성 가닥에서 확인됨)는 "헤어핀(hairpin)" 또는 "페이퍼크립(paperclip)"으로 지칭한다. 헤어핀 리보자임은 가역 반응으로 RNA 기질을 절단하여 2"를 생성하고, 이 촉매적 모티프의 Y-시클릭 포스페이트 및 5"-히드록스T1 말단-조작된 형태도 다양한 표적의 다수 카피를 트랜스로 절단하여 턴오버(turn over)시킨다. 헤어핀에 대한 기질 요건은 GUC로, G의 바로 위 상류에서 절단이 일어난다. 헤어핀 리보자임은 절단 반응에 보다 자주 사용되기는 하지만 라이게이션 반응을 촉매하기도 한다.
해머헤드 및 헤어핀 리보자임 둘 모두는 세포에서 특이적인 세포 및 바이러스 표적을 하향조절하는데 널리 사용되어 왔다. 하셀로프(Haseloff) 및 겔라흐(Gerlach)는 염기쌍이 올바른 표적을 갖도록 아암(arm)을 변형시킴으로써 임의의 표적을 절단하도록 조작될 수 있는 해머헤드 모티프(문헌 [Haseloff and Gerlach; Nature. 1988 Aug 18; 334(6183):585-91])를 설계하였다. 라멤자니(Ramemzani) 등은 연구를 통해 상기 해머헤드 리보자임 모티프가 잠재적인 치료 용도를 갖는다는 것을 입증하였으며, 상기 연구에서는 항-인간 면역결핍 바이러스(HIV) gag 리보자임을 발현하도록 조작된 세포를 사용하여 바이러스 유전자의 발현 및 복제를 사실상 완전하게 억제하였다(문헌 [Ramezani A. et al., Frontiers in Bioscience 7:a, 29-36; 2002]).
다른 측면에서, 코넥신 발현의 조절은 촉매적 DNA(또는 DNA자임)의 사용을 포함한다. RNA 표적을 부위 특이적으로 절단할 수 있는 작은 DNA를 시험관내 시험 결과를 통해 개발하였다(공지되어 있는 자연 발생 DNA 효소가 없기 때문임). 상이한 절단 부위 특이성을 갖는 2가지 상이한 촉매적 모티프가 확인되었다. 가장 통상적으로 사용되는 10 내지 20개의 효소는, 해머헤드 및 헤어핀 리보자임과 마찬가지로 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 이들의 RNA 기질에 결합하고 표적 RNA를 부위 특이적으로 절단하여 2; 3"-시클릭 포스페이트 및 5"-OH 말단을 생성한다. 표적 mRNA는 절단되어 분해되고, DNA자임은 재순환되어 다수의 기질을 절단한다. 촉매적 DNA는 합성에 비용이 비교적 적게 들고 양호한 촉매 특성을 갖기 때문에 안티센스 DNA 또는 리보자임에 대한 대안으로 유용하다.
veg F mRNA의 억제 및 그의 결과로서의 혈관신생 방지, 및 만성 골수성 백혈병의 특징인 bcr/abl 융합 전사체 발현의 억제와 같은, 세포 배양액에서의 여러가지 DNA자임의 용도가 공개되어 있다. 촉매적 DNA는 외부에서 전달될 수 있으며, 이들은 담체의 부재하에 전신 전달에 가장 적합하도록 하기 위해 백본을 변형시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 구성적 코넥신 유전자의 조절은 모르폴리노 백본 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다(미국 특허 제5,034,506호(Summerton, J. E. and Weller, D. D.)).
본 발명의 다른 측면에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 내성을 증가시키고 세포 진입 효율을 증가시키기 위해 화학적으로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 포스포티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드의 절편 및 변형된 올리고데옥시 또는 올리고리보뉴클레오티드의 적절하게 위치한 절편을 포함하는 혼합된 백본 올리고뉴클레오티드(MBO)가 사용될 수 있다. MBO는 포스포로티오에이트 결합의 절편 및 다른 변형된 올리고뉴클레오티드의 다른 절편, 예컨대 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디티오에이트, N3'P5'-포스포르아미데이트 및 올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 및 이들의 2'-O-알킬 유사체, 및 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 메틸포스포네이트를 가질 수 있으며, 이들은 비-이온성이고 뉴클레아제 또는 2'-O-알킬올리고리보뉴클레오티드에 대한 내성이 높다.
당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 통상적으로는 헤테로시클릭 염기이다. 상기 헤테로시클릭 염기의 2가지 가장 공통적인 군은 퓨린 및 피리미딘이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유 결합된 포스페이트기를 더 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드의 경우, 포스페이트기는 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 잔기 중 하나에 결합할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 형성시, 포스페이트기는 인접한 뉴클레오시드와 서로 공유 결합하여 선형 중합체성 화합물을 형성한다. 이어서, 상기 선형 중합체 구조의 각 말단은 추가로 결합되어 고리형 구조를 형성할 수 있으나, 개방된 선형 구조가 일반적으로 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에서, 포스페이트기는 통상적으로 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 사이의 백본을 형성하는 것으로 지칭된다. RNA 및 DNA의 정상적인 결합 또는 백본은 3'-5' 포스포디에스테르 결합이다.
본 발명에 유용한 안티센스 화합물은 변형된 백본 또는 비-천연 뉴클레오시드 사이의 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 백본을 갖는 올리고뉴클레오티드는 백본에 인 원자를 보유하는 것과 백본에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 본원에서, 뉴클레오시드 사이의 백본에 인 원자를 갖지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드도 올리고뉴클레오시드로 간주될 수 있다.
본 발명에 유용한 변형된 올리고뉴클레오티드 백본을 갖는 안티센스 화합물은, 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트(3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트 포함), 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 비롯한 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 결합된 유사체, 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2' 결합되어 있는 전도된 극성을 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리산 형태도 포함된다.
한 측면에서, 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 백본이 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 사이의 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드 사이의 결합, 하나 이상의 단쇄헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드 사이의 결합에 의해 형성된 백본을 갖는다는 것이 고려된다. 이들은 모르폴리노 결합(뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨)을 갖는 백본; 실록산 백본; 술피드, 술폭시드 및 술폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 백본을 함유하는 알켄; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분부를 갖는 다른 백본을 포함한다.
한 측면에서, 올리고뉴클레오티드 모방물의 당과 뉴클레오시드 둘 사이의 결합, 즉 뉴클레오티드 단위 백본이 신규한 군으로 대체되는 것을 고려한다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지되었다. 올리고머 화합물이 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 나타난 상기 올리고뉴클레오티드 모방물은 펩티드 핵산(PNA)으로 지칭한다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-백본은 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본을 함유하는 아미드로 대체된다. 핵염기는 백본 아미드 부분의 아자 질소 원자를 보유하여 이에 직접 또는 간접적으로 결합한다. PNA 화합물에 대한 추가의 교시 내용은 문헌 [Nielsen et al.(Science, 1991, 254, 1497-1500)]에서 찾아볼 수 있다.
한 측면에서, 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 헤테로원자 백본을 갖는 올리고뉴클레오시드, 및 특히 --CH2--NH--O--CH2--, --CH--2N(CH)3--O--CH--2[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 공지되어 있음], --CH2--O--N(CH3)--CH2-, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --O--N(CH3)--CH2--CH2--[천연 포스포디에스테르 백본은 --O--P--O--CH2--로 나타냄]를 갖는 것이 고려된다. 또다른 측면에서, 모르폴리노 및 아미드 백본 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 고려한다.
다른 측면에서, 변형된 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 치환된 당 잔기를 함유할 수 있다는 것도 고려된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 OH; F; O--, S-- 또는 N-알킬, O-알킬-O-알킬, O--,S--, N-알케닐, 또는 O--, S-- 또는 N-알키닐(여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1-C10 알킬 또는 C2-C10 알케닐 및 알키닐임) 중 하나를 포함한다. O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)2ON(CH3)2, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2(여기서, n 및 m은 1 내지 약 10임)가 특히 바람직하다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 C1-C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 개재된 기(intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약물동력학 특성을 개선시키기 위한 기 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학 특성을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기 중 하나를 포함할 수 있다. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시(2'--O--CH2CH2OCH3, 2'--0--(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 공지되어 있음)(문헌 [Martin et al. Helv. Chim. Acta 1995, 78, 486-504]), 알콕시알콕시기일 수 있다. 다른 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉 O(CH2)2ON(CH3)2기(2'-DMAOE로도 공지되어 있음), 및 2'-디메틸아미노-에톡시에톡시(2'-DMAEOE), 즉 2'--O--CH2--O--CH2--N(CH2)2를 포함한다.
변형이 2'-메톡시(2'--O--CH3), 2'-아미노프로폭시(2'--OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 더 포함할 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 유사한 변형이 올리고뉴클레오티드의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상에 존재하는 당의 3' 위치, 또는 2'-5' 결합된 올리고뉴클레오티드 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 일어날 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 당 모방물, 예컨대 시클로부틸 잔기를 가질 수도 있다.
다른 측면에서, 핵염기(당업계에서 간단하게 "염기"라고도 지칭함)의 변형 또는 치환을 포함할 수 있다는 것이 고려된다. 본원에 사용된 "변형되지 않은" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신(5-me-C 또는 m5c), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티오-1,8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히, 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가의 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호, 문헌 [Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering 1990, pages 858-859, Kroschwitz, J. John Wiley ＆ Sons], [Englisch et al.(Angewandte Chemie, International Edition 1991, 30, 613-722)] 및 [Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications 1993, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press]에 개시된 것을 포함한다. 상기 핵염기 중 몇몇은 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 비롯한 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6 내지 1.2 ℃만큼 핵산 이중가닥 안정성을 증가시키는 것으로 나타났으며(문헌 [Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications 1993, CRC Press, Boca Raton, pages 276-278]), 현재는 염기 치환이 바람직하며, 보다 더 구체적으로는 이를 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합하는 것이 바람직하다.
다른 측면에서, 올리고뉴클레오티드의 변형이 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포내 분포 또는 세포내 흡수를 향상시키는 하나 이상의 잔기 또는 접합체를 올리고뉴클레오티드와 화학적으로 결합시키는 것을 포함한다는 것이 고려된다. 상기 잔기는 지질 잔기, 예컨대 콜레스테롤 잔기(문헌 [Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 6553-6556]), 콜산(문헌 [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 1053-1059]), 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올(문헌 [Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 1992, 660, 306-309]; [Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let. 1993, 3, 2765-2770]), 티오콜레스테롤(문헌 [Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533-538]), 지방족쇄, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기(문헌 [Saison-Behmoaras et al., EMBO J. 1991, 10, 1111-1118]; [Kabanov et al., FEBS Lett. 1990, 259, 327-330]; [Svinarchuk et al., Biochimie 1993, 75, 49-54]), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651-3654]; [Shea et al., Nucl. Acid Res. 1990, 18, 3777-3783]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜쇄(문헌 [Manoharan et al., Nucleosides ＆ Nucleotides 1995, 14, 969-973]), 아다만탄 아세트산(문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651-3654]), 팔미틸 잔기(문헌 [Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta 1995, 1264, 229-237]), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 잔기(문헌 [Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996, 277, 923-937])을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 키메라 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드의 사용이 고려된다. 본원의 "키메라" 올리고뉴클레오티드 또는 "키메라"는 각각 하나 이상의 뉴클레오티드를 구성하는 둘 이상의 화학적으로 별개인 영역을 함유하는 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는, 통상적으로 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제 분해에 대한 내성이 증가하고, 세포 흡수성이 증가하고(하거나) 표적 핵산에 대한 결합 친화성이 증가하도록 하기 위해 변형시키는 영역을 하나 이상 함유한다. 올리고뉴클레오티드의 부가적인 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 이중가닥의 RNA 가닥을 절단하는 세포내 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNase H가 활성화되면 RNA 표적을 절단하여 유전자 발현에 대한 안티센스 억제 효율을 현저하게 향상시킨다. RNA 표적의 절단은 통상적으로 겔 전기영동법, 및 필요한 경우에는 당업계에 공지된 관련 핵산 혼성화 기술에 의해 검출될 수 있다. 이러한 RNA 표적의 RNAse H-매개된 절단은 리보자임을 사용하여 핵산을 절단하는 것과는 명확하게 구별된다.
키메라 올리고뉴클레오티드의 예로는 3개의 구분된 영역에 존재하고, 정상적으로는 화학적으로 서로 동등하지만 갭과는 별개인 2개의 영역 측면에 위치하는 중앙 영역을 갖는 "갭머(gapmer)"가 있으나 이에 한정되지 않는다. 갭머의 바람직한 예는 올리고뉴클레오티드의 중앙 부분("갭")이 RNase H에 대한 기질로 작용하는 올리고뉴클레오티드이며, 바람직하게는 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 한편 측면에 위치하는 부분(5' 및 3' "윙(wing)")은 변형되어 보다 큰 표적 RNA 분자에 대한 친화성을 갖지만 뉴클레아제 활성(예를 들어, 플루오로- 또는 2'-O-메톡시에틸-치환됨)을 지지할 수는 없다. 키메라 올리고뉴클레오티드는 당 위에서 변형된 것들로만 한정되지 않으나, 변형된 백본, 예를 들어 포스포로티오에이트(P=S) 및 포스포디에스테르(P=O) 백본 결합 영역 또는 MMI 및 P=S 백본 결합 영역을 갖는 올리고뉴클레오시드를 포함할 수도 있다. 다른 키메라는 "윙머(wingmer)"를 포함하며, 이는 당업계에 "헤미머(hemimer)"로도 공지되어 있는 2개의 구분된 영역을 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 윙머의 바람직한 예에서, 올리고뉴클레오티드의 5' 부분은 RNase H에 대한 기질로서 작용하며 바람직하게는 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되어 있고, 3' 부분은 보다 큰 표적 RNA 분자에 대한 친화성을 갖도록 하는 방식으로 변형되지만 뉴클레아제 활성(예를 들어, 2'-플루오로- 또는 2'-O-메톡시에틸-치환됨)을 지지하기 못하거나, 또는 이와 반대일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드의 당 잔기 위에 2'-O-메톡시에틸(2'--O--CH2CH2OCH3) 변형을 함유한다. 이러한 변형은 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성 및 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성 둘 모두를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 하나의, 다수의 또는 모든 뉴클레오티드 하위단위가 2'-O-메톡시에틸(--O--CH2CH2OCH3) 변형을 보유할 수 있다. 2'-O-메톡시에틸 변형을 갖는 다수의 뉴클레오티드 하위단위를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 내에서 임의의 뉴클레오티드 하위단위 상에 상기 변형을 가질 수 있으며, 키메라 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 21-O-메톡시에틸 변형과는 별도로 또는 이에 더하여, 안티센스 효과, 효능 또는 표적 친화성을 향상시키는 다른 변형을 함유하는 올리고뉴클레오티드도 고려된다.
또한, 본 발명은 이중-가닥 또는 이중가닥 코넥신 핵산(예를 들어, 코넥신 RNA의 폴딩된 영역 또는 코넥신 유전자)에 결합하여 삼중 나선-함유, 또는 "삼중가닥" 핵산을 형성하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA, RNA, PNA 등)를 제공한다. 삼중 나선이 형성되면 예를 들어, 코넥신 유전자의 전사를 방지하여 세포에서 코넥신 활성을 감소시키거나 제거함으로써 코넥신 발현을 억제한다. 임의의 특정 메카니즘에 얽매이는 것은 아니지만, 삼중 나선 형성은 폴리머라제, 전사 인자 또는 조절 분자가 결합하기에 충분하게 개방되는 이중 나선의 능력을 손상시킨다.
삼중가닥 올리고- 및 폴리뉴클레오티드는 삼중 나선 형성에 대한 염기쌍 형성 규칙(예를 들어, 문헌 [Cheng et al., J. Biol. Chem. 263:15110(1988)]; [Ferrin and Camerini-Otero, Science 354:1494(1991)]; [Ramdas et al., J. Biol. Chem. 264:17395(1989)]; [Strobel et al., Science 254:1639(1991)]; 및 [Rigas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9591(1986)] 참조), 및 코넥신 mRNA 및(또는) 유전자 서열을 이용하여 제작하였다. 통상적으로, 삼중가닥-형성 올리고뉴클레오티드는 코넥신 RNA 또는 유전자의 특이적인 서열에 "상보적"인 약 10 내지 약 25개, 또는 이보다 긴(즉, 안정한 삼중 나선을 형성할 정도도 크고, 바람직한 경우에는 전달하는 방식에 따라 다르지만 생체내 투여하기에 충분할 정도로 갖음) 뉴클레오티드로부터의 특이적인 서열을 포함한다. 본원에서, "상보적"은 안정한 삼중 나선을 형성할 수 있는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드를 코넥신 유전자의 조절 영역(예를 들어, 코넥신 5'-측면에 위치한 서열, 프로모터 및 인헨서) 또는 전사 개시 부위(전사 개시 부위로부터 -10 내지 +10 영역)에 특이적으로 결합하도록 설계한다. 최근의 삼중가닥 DNA를 이용한 치료적 진보를 검토하기 위해, 문헌 [Gee et al., in Huber and Carr, 1994, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco NY] 및 [Rininsland et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :5854]를 참조한다.
또한, 본 발명은 코넥신 활성의 억제에 유용한 리보자임을 제공한다. 리보자임은 코넥신 mRNA에 결합하고 이를 특이적으로 절단하여 불활성화시킨다. 유용한 리보자임은 코넥신 mRNA에 상보적인 5'- 및 3'-말단 서열을 포함할 수 있으며, 코넥신 mRNA 서열에 기초하여 당업자에 의해 조작될 수 있다. I군 인트론 리보자임(문헌 [Cech, Biotechnology 13:323(1995)]) 및 다른 해머헤드 리보자임(문헌 [Edgington, Biotechnology 10:256(1992)])의 특성을 갖는 것을 포함한다는 것이 고려된다.
리보자임은 절단 부위, 예컨대 GUA, GUU 및 GUC를 갖는 것을 포함한다. 절단 부위를 함유하는 표적 코넥신 유전자의 영역에 상응하는 길이가 15 내지 20개 리보뉴클레오티드인 짧은 RNA 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드를 보다 바람직하게 할 수 있는 2차 구조 특성에 대해 평가할 수 있다. 또한, 절단 부위의 적합성은 리보뉴클레아제 보호 분석을 이용하여 상보적 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대한 접근가능성을 시험하거나, 공지된 표준 절차에 따라 시험관내 리보자임 활성에 대해 시험함으로써 평가할 수 있다.
안티센스 및 리보자임 기능이 단일 올리고뉴클레오티드에서 조합될 수 있는 안티센스 화합물이 추가로 고려된다. 또한, 리보자임은 본원에 제공된 예시적 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 기재와 함께 상기에 기재된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사이의 변형된 결합을 포함한다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭(RNAi)과 같은 방법에 의해 코넥신 활성을 억제하는데 유용한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 유전자를 억제시키는 상기 기술 및 다른 기술이 당업계에 공지되어 있다. 상기 기술에 대한 내용은 문헌 [Science 288 :1370-1372(2000)]에 기재되어있다. RNAi는 전사후 수준에서 작동하며, 서열 특이적이다. 상기 과정은 부분적이거나 완전한 이중-가닥 특성을 갖는 RNA, 상기 RNA의 전구체 또는 이를 코딩할 수 있는 전구체를 세포 또는 세포외 환경에 도입하는 것을 포함한다.
미국 특허 제6,506,559호(Fire et al.)에 기재된 바와 같이, RNA는 하나 이상의 중합체화된 리보뉴클레오티드 가닥을 포함할 수 있다. 이중-가닥 구조는 단일 자가-상보적 RNA 가닥 또는 2가지 상보적 RNA 가닥에 의해 형성될 수 있다. RNA는 포스페이트-당 백본 또는 뉴클레오시드 중 하나에 대한 변형을 포함한다. RNA 이중가닥 형성은 세포의 내부 또는 외부에서 개시될 수 있다.
몇몇 연구에서 하나 이상의 리보뉴클레아제가 이중-가닥 RNA에 특이적으로 결합하여 짧은 단편으로 절단한다는 것을 입증하였다. 리보뉴클레아제(들)은 상기 단편과 결합된 상태로 남아있고, 이어서 상보적 mRNA, 즉 코넥신 유전자에 대해 전사된 mRNA 가닥에 특이적으로 결합한다. 이 코넥신 유전자에 대한 mRNA는 또한 리보뉴클레아제(들)에 의해 짧은 가닥으로 분해되어 코넥신 유전자의 번역 및 발현을 방지함으로써 코넥신 활성을 억제한다. 또한, RNA 폴리머라제는 짧은 단편의 다수의 카피의 합성을 용이하게 하는 작용을 할 수 있고, 이로써 시스템의 효율이 기하급수적으로 증가한다. 이러한 유전자 억제 경로의 독특한 특성은 사일런싱이 이것이 개시되는 세포에만 한정되지 않는다는 것이다. 유전자-사일런싱 효과는 유기체의 다른 부분으로 전해질 수 있고 생식 계열을 통해 수 세대에 걸쳐 전달될 수도 있다.
한 측면에서, RNAi의 이중-가닥 (ds)RNA-의존성 유전자 특이적인 전사후 사일런싱 전략은 짧은 간섭(interfering) RNA(siRNA)의 사용을 포함한다. 일반적인 RNAi 접근법의 이용은 특정 용도, 예컨대 긴 dsRNA 분자에 대한 반응에서 활성화된 포유동물 세포에서의 비특이적인 항바이러스 방어 메카니즘 등으로 제한된다(문헌 [Gil J, Esteban M, "Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase(PKR): Mechanisms of action". Apoptosis 2000, 5:107-114]). 21개 뉴클레오티드 RNA의 합성 이중가닥이 일반적인 항바이러스 방어 메카니즘을 유발하지 않고 포유동물 세포에서 유전자 특이적인 RNAi를 매개할 수 있다는 것을 입증함으로써 본 발명의 분야가 진보하였다(문헌 [Elbashir S, et al., "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells". Nature 2001, 411:494-498]; [Caplen N. et al., Proc Natl Acad Sci 2001, 98:9742-9747]). 따라서, siRNA는 점점 유전자-특이적인 조절에 대한 강력한 도구로서 인정받고 있다.
본원에 기재된 바와 같이, RNAi는 말단 이펙터 분자가 예를 들어 작은 21 내지 23개-뉴클레오티드 안티센스 RNA 등인 다수의 공통적인 생화학적 성분을 공유하는 일종의 관련 유전자-사일런싱 메카니즘을 포함한다. 한 메카니즘은 상대적으로 긴 dsRNA 트리거(trigger)를 사용하며; 이는 세포내 효소 다이서(Dicer)에 의해, 짧은, 예를 들면 21 내지 23개-뉴클레오티드 dsRNA(siRNA로 지칭함)로 프로세싱된다. 표적 RNA에 상보적인 siRNA의 가닥은 다중-단백질 복합체(RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC)로 지칭함)로 혼입되며, 여기서 표적 부위 내에서의 mRNA의 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 대한 안내자로 작용한다. 이로써 전체 mRNA가 분해되고, 이어서 안티센스 siRNA가 재순환될 수 있다. 보다 하등한 유기체에서, RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 또한 프라이머로서 어닐링된 안내자 siRNA를 사용하고(표적 앞으로 보다 많은 dsRNA를 생성함), 이어서 다이서 기질로서 작용한다(보다 많은 siRNA를 생성하여 siRNA 신호를 증폭시킴). 이러한 경로는 통상적으로 식물에서 바이러스 방어 메카니즘으로 이용된다.
본원에 기재된 바와 같이, siRNA는 2가지 별개의 어닐링된 단일 가닥(예를 들어, 21 내지 23개 뉴클레오티드 등)으로 구성될 수 있으며, 여기서 2개의 말단 3"-뉴클레오티드는 분리되어 있다(3" 오버행(overhang)). 별법으로, siRNA는 단일 스템-루프(stem-loop) 형태일 수 있으며, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)로 지칭되기도 한다. 통상적으로는, shRNA의 안티센스 가닥도 si/shRNA의 센스 파트너 가닥에 대해 완전하게 상보적이지만, 항상 그런 것은 아니다.
포유동물 세포에서, 긴 dsRNA(보통, 길이가 뉴클레오티드 30개를 초과함)는 단백질 키나아제 R 및 2;5"-올리고아데닐레이트 신테타제를 활성화시키는 인터페론 경로를 촉진한다. 인터페론 경로의 활성화는 번역의 광범위한 하향조절 뿐만 아니라 광범위한 RNA 분해를 초래할 수 있다. 그러나, 포유동물 세포에 대해 외부에서 도입된 보다 짧은 siRNA가 인터페론 경로를 우회하는 것으로 보고되었다.
또한, siRNA 안티센스 생성물이 내생 미소RNA로부터 유래될 수 있다. 인간 세포에서는, 초기 형태(siRNA 및 미소RNA) 또는 프로세싱 경로와는 상관없이, mRNA와 완전하게 상동성인 성숙한 최종(예를 들어, 21 내지 23개-뉴클레오티드 등의) 안티센스 RNA가 mRNA를 직접 절단할 것이다. 일반적으로, siRNA와 표적 부위 사이의 미스매치(mismatch) 효과는 활성을 거의 없애지 않을수도 또는 활성을 완전하게 없앨 수도 있으며, 그 원인은 부분적으로만 이해되고 있으나 하나 이상의 경우에는 부분적인 상동성이 mRNA 번역을 억제하기 때문일 것이다. 일반적으로, 원형의 미소RNA-표적 상호작용을 흉내내도록 설계된 표적-미스매치 siRNA는 mRNA에서의 특이적인 상호작용 및 표적 부위의 수에 따라 달라지는 번역 억제 정도를 매개할 수 있다. RNAi는 미리 형성된 siRNA의 외부에서의 전달에 의해 또는 siRNA 또는 shRNA의 프로모터-기재의 발현을 통해 활성화될 수 있다.
짧은 간섭 RNA(siRNA)는 화학적으로 합성되거나 DNA-기재의 벡터 시스템에 의해 생성될 수 있다. 일반적으로, 이는 효율적으로 프로세싱되어 세포에서 siRNA를 형성하는 짧은 헤어핀 (sh)RNA의 전사를 포함한다(문헌 [Paddison P, Caudy A, Hannon G: Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99: 1443-1448]; [Paddison P, Caudy A, Bernstein E, Hannon G, Conklin D: Short hairpin RNAs(shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes ＆ Dev 2002, 16:948-958]; [Sui G, et al., Proc Natl Acad Sci 2002, 8:5515-5520]; [Brummelkamp T, et al., Science 2002, 296:550-553]). 따라서, 본원에서는, siRNA를 조직-특이적인 표적화 및 유전자 발현의 조절에 효과적인 전략으로 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 올리고뉴클레오티드는 보통 통상적으로 공지된 고상 합성 기술을 통해 제조될 수 있다. 상기 합성에 이용되는 장치는 당업계에 공지된 몇몇 판매자에 의해 시판되고 있다. 상기 합성에 사용되는 임의의 다른 수단도 사용될 수 있으며, 올리고뉴클레오티드의 실제 합성법은 당업계에 공지되어 있다. 2'-O-메톡시에틸 올리고뉴클레오티드를 비롯한 올리고뉴클레오티드, 예컨대 포스포로티오에이트 및 2'-알콕시 또는 21-알콕시알콕시 유도체를 제조하는데 유사한 기술을 사용하는 것도 공지되어 있다(문헌 [Martin, P. Helv. Chim. Acta 1995, 78, 486-504]). 형광 표지된, 바이오티닐화되거나 또는 다른 것이 접합된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해, 유사한 기술, 및 시판되는 개질된 아미디트 및 세공-제어된 유리(CPG) 생성물, 예컨대 바이오틴, 플루오레세인, 아크리딘 또는 프소랄렌-개질된 아미디트 및(또는) CPG(글렌 리서치사(Glen Research; 버지니아주, 스털링)로부터 시판됨)를 사용하는 것도 공지되어 있다.
방법
다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 안티센스 화합물을 투여함으로써 대상체(예를 들어, 환자)를 치료하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 이들 방법은 안과 절차 등을 비롯한 조직 공학 방법 및 의학적 절차와 관련된 조직 손상 감소 방법을 포함한다.
이 방법은, 예를 들어 대상체의 눈 또는 눈과 관련된 세포에서 인간 코넥신 단백질의 발현을 억제하기에 충분한 양의 안티센스 화합물을 상기 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함한다. 인간 코넥신 단백질의 발현이 억제되는 것이 바람직하지만, 상기 안티센스 화합물 단독에 의해, 또는 인간 코넥신의 발현을 억제하는 안티센스 화합물과의 병용에 의해 다른 단백질도 표적화되어 조절될 수 있을 것으로 예상된다.
특정 실시양태에서, 안과 절차는 엑시머 레이저 광굴절 각막절제술, 백내장 적출술, 각막 이식, 굴절 교정 수술, 방사상 각막절개술, 녹내장 여과 수술, 각막이식술, 엑시머 레이저 광굴절 각막절제술, 각막 이식, 굴절 교정을 위한 수술, 안구 표면 신생물 제거술, 결막 또는 양막 이식, 익상편 및 결막지방반 제거술, 안구 성형 수술, 눈꺼풀 종양 제거술, 선천성 이상을 위한 눈꺼풀 재건 절차, 안검외번 및 안검내번 눈꺼풀 복구, 사시 수술(안구 근육), 또는 임의의 눈 관통 외상 치료 등을 비롯한 안과 수술이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물은 국부 또는 국소 투여 방법에 의해 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 또한 예를 들어, 전신 투여 또는 안구내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본원에 제공된 안티센스 화합물은, 예를 들어 안과 절차(예를 들어, 수술)에서 발생하는 창상의 형성에 대해 미리 정해진 시간에 대상체에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 화합물은 안과 절차 수행 전에, 중에 또는 후에 투여될 수 있다. 안티센스 화합물은, 예를 들어 안과 절차를 수행하기 몇 분 또는 몇 시간 전 또는 후에 대상체에게 투여할 수 있다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 안과 절차를 수행한 후에, 예를 들어 안과 절차를 수행한 후 약 4 시간 이내에, 약 3시간 이내에, 보다 통상적으로는 약 2 시간 이내에, 또는 약 1 시간 이내에 투여된다. 별법으로, 안티센스 화합물은 안과 절차 후 몇 분 이내에, 예를 들어 5, 10, 15, 20, 30, 45 분 이내에 투여될 수 있다. 또한, 안티센스 화합물은 안과 절차 4 시간 후에 투여될 수 있다.
다른 측면에서, 본원에 제공된 안티센스 화합물은 조직 공항을 수행하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 실시양태 및 본원에 제공된 몇몇 다른 실시양태에서, 안티센스 화합물은 통상적으로 장기간에 걸쳐, 예를 들어 며칠, 몇 주, 몇 개월 또는 몇 년에 걸쳐 투여될 수 있으며, 환자에게 수행되는 특정 절차, 예컨대 눈에서 수행되는 절차와는 별개로 투여될 수 있다.
본원에 제공된 안티센스 화합물은, 안과 절차와 관련되지 않은 방법 및 안티센스 화합물을 안과 절차(예를 들어, 수술)와 병행하여 투여하는 방법을 비롯한, 대상체에서 각막 조직의 두께를 증가시키는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 치유를 촉진하거나 조직 손상을 예방하는 방법과 병행하여, 예를 들어 대상체의 각막과 관련된 세포(예를 들어, 각막 세포)에 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 대상체의 눈에서 반흔을 감소시키는 방법과 병행하여 투여될 수 있다.
본원에 제공된 안티센스 화합물은 대상체의 눈에서 혼탁을 감소시키는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 바람직하게는 수술후 24 내지 48 시간 내에 레이저-유도된 손상 부위와 관련된 근섬유아세포 분화와 관련이 있는 세포과다형성 조절 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 간질 리모델링을 조절하고 바람직하게는 수술후 24 내지 72 시간 내에 레이저-유도된 손상 부위와 관련된 혼탁을 감소시키는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 대상체의 눈에서 상피 세포 이동을 증가시키는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 대상체의 눈에 안티센스 화합물을 투여한지 12 시간 이내에 상피 세포 이동을 증가시키는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 대상체의 눈에 안티센스 화합물을 투여한지 24 시간 이내에 상피 세포 이동을 증가시키는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 간질 세포 밀도의 증가를 방지하는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 수술후 24 시간 내지 72 시간 내에 레이저-유도된 손상 부위와 관련된 간질 부종을 억제하는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 수술후 24 시간 내지 72 시간 내에 상피 세포과다형성을 감소시키는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 수술후 1 주일까지 근섬유아세포 활성화를 감소시키는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 세포외 매트릭스를 변형시키는 세포 분화를 조절하는 방법과 병행하여 투여될 수 있다. 본원에 제공된 안티센스 화합물은 세포 증식을 감소시키는 방법과 병행하여 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 반흔 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 염증을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 창상 치유를 촉진한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 안티센스 화합물은 수술 이식 절차과 연계되어 사용된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 안티센스 화합물은 코넥신 43에 대한 것으로, 이를 투여하여 상피 기저 세포의 분열 및 성장을 조절한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 코넥신 31.1에 대한 것으로, 이를 투여하여 외부층의 각질형성을 조절한다.
다른 실시양태에서, 이 방법은 대상체의 각막과 관련된 세포에서 치유를 촉진하거나 조직 손상을 예방한다. 특정 실시양태에 있어서, 안티센스 화합물은 대상체의 각막 조직의 두께를 증가시키는 방법 또는 대상체의 각막 세포에서 조직 손상을 감소시키는 방법, 대상체의 각막과 관련된 세포에서 조직 손상을 감소시키는 방법, 대상체에서 엑시머 레이저 광굴절 각막절제술 절차와 병행하여 수행되는 방법, 바람직하게는 수술후 24 내지 48 시간 내에 레이저-유도된 손상 부위와 관련된 근섬유아세포 분화와 관련이 있는 세포과다형성을 조절하는 방법, 간질 리모델링을 조절하고 바람직하게는 수술후 24 내지 72 시간 내에 레이저-유도된 손상 부위와 관련된 혼탁을 감소시키는 방법, 수술후 24 내지 72 시간 내에 레이저-유도된 손상 부위의 간질 부종을 억제하는 방법, 수술후 24 내지 72 시간 내에 상피 세포과다형성을 감소시키는 방법, 수술후 1 주일까지 근섬유아세포 활성화를 감소시키는 방법, 세포외 매트릭스를 변형시키는 세포 분화를 조절하는 방법, 또는 세포 증식을 감소시키는 방법에 사용된다.
특정 실시양태에서, 안과 절차는 백내장 적출술이다. 다른 실시양태에서, 안과 절차는 각막 이식이다. 다른 실시양태에서, 안과 수술 절차는 굴절 교정 수술이다. 다른 실시양태에서, 안과 절차는 방사상 각막절개술이다. 다른 실시양태에서, 안과 절차는 녹내장 여과 수술이다. 또다른 실시양태에서, 안과 절차는 각막이식술이다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 조성물은 국부 또는 국소 투여 방법에 의해 투여된다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 조성물은 수술로 인한 창상에 직접 투약함으로써 투여된다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 조성물은 안구내 주사에 의해 투여된다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 조성물은 수술 절차를 수행하기 전에 투여된다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 조성물은 수술 절차 동안 투여된다. 특정 비-제한적 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 조성물은 안과 절차를 수행하기 약 15 분 전 이내로부터 안과 절차를 수행하고 약 2 시간 후까지 투여된다. 다른 특정 실시양태에서, 예를 들어 조직 공학의 경우에 본원에 제공된 안티센스 화합물을 며칠 또는 몇 개월 동안 투여할 수 있다.
추가의 특정 실시양태에서, 화합물 및 조성물은 각막과 관련된 세포에서 치유를 촉진하거나 조직 손상을 예방하는 데 사용되며, 이 때 상기 각막과 관련된 세포는 각막 세포 등을 비롯한 임의의 눈 세포일 수 있다. 안티센스 화합물을 포함하는 본원에 제공된 제제는 대상체에서 각막 조직의 두께를 증가시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 조직 손상 감소 또는 치유 촉진에 유용한 다른 화합물과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 화합물은 FGF, NGF,NT3, PDGF, TGF, VEGF, BDGF, EGF, KGF, 인테그린, 인터루킨, 플라스민(plasmin) 및 세마포린(semaphorin) 등을 비롯한 성장 인자, 사이토카인 등과 함께 동시투여할 수 있다.
다른 측면에서, 안과 수술과 관련된 조직 손상을 감소시키기 위한 제약 조성물이 제공된다. 이 제약 조성물은 대상체의 눈과 관련된 세포에서 인간 코넥신 단백질의 발현을 억제하기에 충분한 앙으로 존재하는 안티센스 화합물을 포함하는, 상기 대상체의 눈에 국소 또는 국부 투여하기 적합하게 제제화될 수 있다. 안티센스 화합물은, 예를 들어 바람직하게는 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 제약상 허용되는 담체 또는 비히클, 및 제제를 포함하는 제약 조성물 형태이거나, 또는 안티센스 화합물은 대상체의 창상 치유 촉진에 유효한 양으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은, 예를 들어 대상체의 눈에 국소 또는 국부 투여하기에 적합한 형태를 비롯한 국소 투여에 적합한 형태이다. 추가의 특정 실시양태에서, 조성물 및 제제는 겔, 크림, 또는 본원에 기재된 임의의 형태의 제제일 수 있다.
다른 측면에서, 중추 신경계에 대한 손상을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 대상체에 수행된 수술 절차와 관련하여 중추 신경계에 이미 존재하는 창상에 인접한 부위에 안티센스 화합물을 투여하여 상기 중추 신경계에 대한 손상을 치료하는 것을 포함하며, 이 때 상기 안티센스 화합물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 척수에 대한 물리적 외상에 의한 뉴런 손실을 감소시키기 위해 투여된다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 외상의 결과인 창상에 인접한 부위에 투여된다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 수술의 결과인 창상에 인접한 부위에 투여된다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 척수 손상에 인접한 부위에 투여된다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 코넥신 43에 대한 것으로, 투여되면 상피 기저 세포의 분열 및 성장을 조절한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 창상 치유를 촉진한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 염증을 감소시킨다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 반흔 형성을 감소시킨다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 중추 신경계에 대한 손상은 척수 손상이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 척수에 대한 물리적 외상이 발생한 후 적어도 24 시간만에 환자에게 투여된다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 수술 이식 절차와 연계되어 사용된다. 상기 방법의 추가의 특정 실시양태에서, 수술 이식 절차는 이식편을 안티센스-화합물로 미리 처리하여 창상 치유를 촉진하는 것과 관련되어 있다. 다른 측면에서, 뉴런 손실을 특징으로 하는 환자에 이미 존재하는 창상을 치료하기 위한 절차와 관련하여 뉴런 재생을 촉진할 수 있는 안티센스 화합물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 제제는 인간 코넥신을 코딩하는 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화된, 길이가 40개 이하의 핵염기인 안티센스 화합물이고, 이 안티센스 화합물은 환자에 이미 존재하는 창상을 치료하기 위한 뉴런 재생 촉진 절차와 연계하여 하나 이상의 인간 코넥신의 발현을 억제한다. 창상은 뉴런 손실을 특징으로 하는 것도 포함한다. 표적화될 수 있는 코넥신은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신을 포함한다. 이들 실시양태에서, 안티센스 화합물은 뉴런 손실을 초래하는 상기 환자의 척수에 대한 물리적 외상이 발생한 후 적어도 24 시간만에 환자에게 투여될 수 있다. 안티센스 화합물은 척수에 대한 물리적 외상이 발생한지 24 시간이 초과한 시점에서 뉴런 손실을 초래하는 물리적 외상이 발생한 후 수 주, 몇 개월 또는 몇 해 동안 환자에게 투여될 수 있다.
제약 조성물 및 방법의 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 인간 코넥신 30 또는 인간 코넥신 37을 코딩하는 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있다. 바람직하게는, 안티센스 화합물은 환자의 눈과 관련된 세포에서 인간 코넥신 30 또는 37 단백질의 발현을 억제한다. 다른 제약 조성물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신(예를 들어, 인간 코넥신) 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화된 안티센스 화합물, 바람직하게는 뉴런 손실을 특징으로 하는 환자에 이미 존재하는 창상을 치료하기 위한 뉴런 재생 촉진 절차와 연계하여 인간 코넥신의 발현을 억제하는 안티센스 화합물을 포함한다.
제약 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 안티센스 화합물을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 예를 들어 안과 절차(예를 들어, 수술)와 관련된 조직 손상을 감소시키기 위한 제약 조성물이 제공되며, 이 제약 조성물은 대상체의 눈에 국소 또는 국부 투여하기 위한 형태로 제제화되고, 대상체의 눈과 관련된 인간 코넥신 단백질의 발현을 억제하기에 충분한 양으로 존재하는 안티센스 화합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 안티센스 화합물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신(예를 들어, 인간 코넥신) 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되어 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 제약 조성물은 완충된 플루론산 또는 겔을 포함하는 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 이는, 한 실시양태에서, 예를 들어 인산염 완충된 염수 중에 약 30％까지의 플루론산을 포함한다. 안티센스 조성물은 인산염 완충된 염수 중 약 5％ 이하의 플루론산, 인산염 완충된 염수 중 약 10％ 이하의 플루론산, 인산염 완충된 염수 중 약 15％ 이하의 플루론산, 인산염 완충된 염수 중 약 20％ 이하의 플루론산, 인산염 완충된 염수 중 약 25％ 이하의 플루론산 및 인산염 완충된 염수 중 약 30％ 이하의 플루론산의 양 등을 비롯한 상이한 양의 플루론산 또는 겔을 포함할 수 있다.
또한, 본원에 제공된 안티센스 화합물은 제약상 허용되는 염 및 전구약물을 비롯하여 생물학적으로 동등한 화합물을 포함할 수 있다. 이는 임의의 제약상 허용되는 염, 에스테르, 또는 상기 에스테르의 염, 또는 인간을 비롯한 동물에게 투여하였을 때 생물학적으로 활성인 대사물 또는 잔기를 (직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함하는 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들어 본 개시문은 핵산의 제약상 허용되는 염 및 상기 핵산의 전구약물도 포함한다. "제약상 허용되는 염"은 본원에 제공된 핵산의 생리학상 및 제약상 허용되는 염, 즉 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 있으나 이에 대해 원치않는 독소 효과를 나타내지 않는 염이다(예를 들어, 문헌 [Berge et al., J. of Pharma Sci. 1977, 66, 1-19] 참조).
올리고뉴클레오티드의 경우, 제약상 허용되는 염의 예로는 (a) 양이온, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 폴리아민, 예컨대 스퍼민 및 스퍼미딘과 형성된 염 등; (b) 무기 산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 형성된 산 부가염; (c) 유기 산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 타닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산 등과 형성된 염; 및 (d) 원소성 음이온, 예컨대 염소, 브롬 및 요오드로부터 형성된 염이 있으나 이에 한정되지 않는다.
본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 부가적으로 또는 별법으로 "전구약물" 형태로 전달되도록 제조될 수 있다. 용어 "전구약물"은 불활성 형태로 제조된 치료제를 나타내며, 이는 신체 또는 그의 세포에서 내생 효소 또는 다른 화합물 및(또는) 조건의 작용에 의해 활성인 형태(즉, 약물)로 전환된다. 특히, 올리고뉴클레오티드의 전구약물 형태는 1993년 12월 3일에 공개된 고셀린(Gosselin) 등의 WO 93/24510에 개시된 방법에 따라 SATE[(S-아세틸-2-티오에틸)포스페이트] 유도체로 제조될 수 있다.
안티센스 화합물은 제약 조성물로 제제화될 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오티드 이외에도 제약상 허용되는 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면활성제, 중성 또는 양이온성 지질, 지질 복합체, 리포좀, 침투 인헨서, 담체 화합물 및 다른 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 등을 포함할 수 있다.
제약 조성물은 또한 하나 이상의 활성인 성분, 예컨대 인터페론, 항미생물 제제, 소염제, 마취제 등을 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제제는 멸균 수용액을 함유할 수 있으며, 이는 완충액, 리포좀, 희석제 및 다른 적합한 첨가제도 함유할 수 있다. 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물은 올리고뉴클레오티드의 영양 전달을 향상시키기 위해 침투 인헨서를 포함할 수 있다. 침투 인헨서는 5가지 광범위한 범주, 즉 지방산, 담즙산염, 킬레이팅제, 계면활성제 및 비-계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991, 8, 91-192]; [Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1990, 7, 1-33]). 하나 이상의 상기 광범위한 범주로부터의 하나 이상의 침투 인헨서를 포함시킬 수 있다.
침투 인헨서로서 작용하는 다양한 지방산 및 이들의 유도체로는, 예를 들어 올레산, 라우르산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 레신레에이트, 모노올레인(a. k. a. 1-모노올레일-rac-글리세롤), 딜라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세릴 1-모로카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 모노- 및 디-글리세리드 및 이들의 생리학상 허용되는 염(즉, 올레에이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀레에이트 등)이 있다(문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991, page 92]; [Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1990, 7, 1]; [El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol. 199244, 651-654]).
담즙의 생리학적 역할은 지질 및 지용성 비타민의 분산 및 흡수를 용이하게 하는 것을 포함한다(문헌 [Brunton, Chapter 38 In: Goodman ＆ Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. McGraw-Hill, New York, N. Y., 1996, pages 934-935]). 다양한 천연 담즙산염 및 이들의 합성 유도체가 침투 인헨서로서 작용한다. 따라서, 용어 "담즙산염"은 담즙의 임의의 자연 발생 성분 뿐만 아니라 이들의 임의의 합성 유도체를 포함한다.
하나 이상의 침투 인헨서를 포함하는 복합체 제제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 담즙산염은 지방산과 함께 사용하여 복합체 제제를 제조할 수 있다. 킬레이팅제로는 디나트륨 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 시트르산, 살리실레이트(예를 들어, 나트륨 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, β-디케톤(엔아민)의 라우레트-9 및 N-아미노 아실 유도체가 있으나 이에 한정되지 않는다(문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991, page 92]; [Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1990, 7, 1-33]; [Buur et al., J. Control Rel. 1990, 14, 43-51]). 킬레이팅제는 DNase 억제제로서 사용할 수도 있는 추가 이점을 갖는다.
계면활성제로는, 예를 들어 나트륨 라우릴 술페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991, page 92]); 및 퍼플루오로 화합물 에멀젼, 예컨대 FC-43(문헌 [Takahashi et al., J. Pharm. Phamacol. 1988, 40, 252-257])이 있다. 비-계면활성제로는, 예를 들어 불포화 시클릭 우레아, 1-알킬- 및 1-알케닐아자시클로-알칸온 유도체(문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991, page 92]); 및 비-스테로이드성 소염제, 예컨대 디클로페낙 나트륨, 인도메타신 및 페닐부타존(문헌 [Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol. 1987, 39, 621-626])이 있다.
본원에 사용된 "담체 화합물"은 핵산 또는 그의 유사체를 나타내는 것으로, 불활성(즉, 생물학적 활성을 갖지 않음)이지만 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생체이용가능성을 감소시키는 생체내 과정, 예를 들어 생물학적으로 활성인 핵산을 분해하거나 순환으로부터 그의 제거를 촉진하는 생체내 과정에 의해 핵산으로 인식된다. 핵산과 담체 화합물을, 통상적으로는 담체 화합물을 과량으로 하여 동시투여하면 아마도 공통적인 수용체에 대한 담체 화합물과 핵산 사이의 경쟁에 의해 간, 신장 또는 다른 순환계외 저장소에 회수된 핵산의 양을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 담체 화합물과는 달리, "제약상 허용되는 담체"(부형제)는 동물에게 하나 이상의 핵산을 전달하기 위한 제약상 허용되는 용매, 현탁화제 또는 임의의 다른 약리학상 불활성 비히클이다. 제약상 허용되는 담체는 액체 또는 고체일 수 있으며, 핵산 및 주어진 제약 조성물의 다른 성분과 조합할 때 원하는 벌크, 밀도 등이 제공되도록 계획된 투여 방식에 따라 선택된다. 통상적인 제약상 허용되는 담체로는 결합제(예를 들어, 전호화(pregelatinized) 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 등); 충전재(예를 들어, 락토스 및 다른 당, 미정질 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 술페이트, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 수소 포스페이트 등); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 이산화규소, 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산, 금속성 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 등); 붕해제(예를 들어, 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 등); 또는 습윤제(예를 들어, 나트륨 라우릴 술페이트 등)가 있으나 이에 한정되지 않는다.
본원에 제공된 조성물은 또한 제약 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 부가 성분을 당업계에 확립된 사용량(art-established usage) 수준으로 함유할 수 있다. 따라서, 조성물은 예를 들어 부가적인 상용가능한 제약상-활성 물질, 예컨대 지양제, 수렴제, 국부 마취제 또는 소염제를 함유할 수 있거나, 본 발명 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화하는 데 유용한 부가적인 물질, 예컨대 염료, 향미제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 물질은 첨가되는 경우에 본원에 제공된 조성물 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안 된다.
올리고뉴클레오티드를 환자에게 도입하는 방법에 상관없이, 콜로이드성 분산 시스템을 전달 비히클로 사용하여 올리고뉴클레오티드의 생체내 안정성을 향상시키고(거나) 올리고뉴클레오티드가 특정 기관, 조직 또는 세포 유형을 표적으로 할 수 있도록 한다. 콜로이드성 분산 시스템으로는, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀, 리포좀 및 구조가 특성화되지 않은 지질:올리고뉴클레오티드 복합체를 비롯한 지질-기재 시스템이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 콜로이드성 분산 시스템은 다수의 리포좀이다. 리포좀은 2층 형태로 배열된 지질로 구성된 하나 이상의 외부층에 의해 둘러싸인 수성 코어를 갖는 미소구이다(일반적으로, 문헌 [Chonn et al., Current. Biotech. 1995, 6, 698-708] 참조).
안티센스 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 단리된 형태로 존재할 수 있다. 생성물은 그의 의도된 목적을 방해하지 않으면서 여전히 실질적으로 단리된 것으로 간주되는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 생성물은 또한 실질적으로 정제된 형태일 수 있으며, 이러한 경우에 상기 생성물은 일반적으로 90％, 예를 들어 약 95％, 98％ 또는 99％ 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 제제의 무수질량을 포함할 것이다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 (처치될 부위에) 국소 투여할 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 배합하여 제약 조성물을 제조한다. 적합한 담체 및 희석제로는 등장성 염수 용액, 예를 들어 인산염-완충된 염수가 있다. 조성물은 비경구, 근육내, 뇌내, 정맥내, 피하 또는 경피 투여용으로 제형화될 수 있다. 포유동물 세포에 의한 핵산의 흡수는 몇몇 공지된 형질감염 기술, 예를 들어 형질감염제를 사용하는 기술에 의해 향상된다. 투여되는 제형은 이러한 제제를 포함할 수 있다. 이들 제제의 예로는 양이온성 제제(예를 들어, 칼슘 포스페이트 및 DEAE-덱스트란) 및 리포펙턴트(ipofectant)(예를 들어, 리포펙탐(상표명) 및 트랜스펙탐(상표명))가 있다.
한 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 부위-특이적인 전달이 필요할 수 있다. 이들은 또한 장기간에 걸친 전달이 필요할 수 있다. 전달 기간은 하향조절이 유도되는 부위 및 원하는 치료 효과를 유도하는 부위에 따라 달라지는 것이 명백하지만, 24 시간 이상 동안 지속적인 전달이 필요할 수도 있다. 본 발명의 측면에서, 이는 제제, 특히 국소 투여용 제제 형태의 제제에 안티센스 화합물을 제약상 허용되는 담체 또는 비히클과 함께 포함시켜 달성된다. 특히, 국소용 제제, 예컨대 크림, 점안제, 및 본원에 기재된 다른 제제를 사용하여 상피 기저 세포의 분열 및 성장(코넥신 43에 표적화된 안티센스 화합물을 사용함) 및 외부층의 각질형성(코넥신 31.1에 표적화된 안티센스 화합물을 이용함)을 조절할 수 있다. 국소 투여용 제제는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 좌약, 스프레이, 액제 및 분제를 포함할 수 있다. 통상적인 제약 담체, 수성, 분말 또는 유성 염기, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등이 유용할 수도 있다. 경구 투여용 조성물은 분제 또는 과립제, 물 또는 비수성 매질 중 현탁액제 또는 용액제, 캡슐, 샤세 또는 정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 멸균 수용액을 함유할 수 있으며, 이는 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제도 함유할 수 있다. 몇몇 경우에는, 치료 처방의 효율을 증가시키기 위해 환자에게 올리고뉴클레오티드 처치와 다른 치료 방법을 병행하는 것이 보다 더 효과적일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치료 처방"은 치료, 경감 및 예방 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
치료 조성물의 제제화 및 이에 수반되는 투여 방법은 당업계의 기술에 속하는 것으로 여겨진다. 투여량은 치료 지속 기간이 며칠 내지 몇 개월이거나, 또는 치유 효과가 나타나거나 질환 상태의 경감이 달성될 때까지 치료될 질환 상태의 중증도 및 반응성에 따라 달라진다. 최적의 투여 계획은 환자의 체내에 축적되는 약물의 측정치로부터 계산될 수 있다. 당업자는 최적의 투여량, 투여 방법 및 반복 비율을 용이하게 결정할 수 있다. 최적의 투여량은 개별 올리고뉴클레오티드의 상대적인 효능에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC50에 기초하여 추정할 수 있다. 일반적으로, 투여량은 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg(체중)이며, 1일, 1주일, 1달 또는 1년, 또는 2 내지 20년마다 1회 이상 투여할 수 있다. 당업자는 체액 또는 조직에서 측정된 약물 체류 시간 및 농도에 기초하여 투여 반복 비율을 용이하게 추정할 수 있다. 성공적인 처치 후에, 환자는 지속적인 치료를 받아 질환 상태가 재발하는 것을 방지하는 것이 바람직할 수 있으며, 이 때 올리고뉴클레오티드는 1일 1회 이상에서 20년마다 1회까지 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg(체중) 범위의 지속적인 투여량으로 투여된다. 코넥신 조절이 필요한 증상의 처치 및 예방시, 적절한 투여량 수준은 일반적으로 1일 당 약 0.001 내지 100 mg/kg(환자 체중)일 것이며, 이는 단일 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여량 수준은 약 1 내지 약 40 mg/kg/일이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 진단, 치료, 예방, 및 연구 시약으로서, 및 키트에 사용될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 코넥신을 코딩하는 핵산에 혼성화되기 때문에, 샌드위치(sandwich) 분석, 열량주사 분석 및 다른 분석은 이러한 사실을 활용하여 용이하게 구축될 수 있다. 올리고뉴클레오티드와 코넥신 유전자 또는 mRNA의 혼성화를 검출하는데 사용되는 수단은 통상적으로 제공될 수 있다. 상기 수단의 제공은 효소 접합, 방사선표지 또는 다른 적합한 검출 시스템을 포함할 수 있다. 코넥신의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트도 제작될 수 있다.
또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 연구 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에 의해 나타나는 특이적인 혼성화는 분석, 정제, 세포 생성물 제조, 및 당업자에 의해 이해될 수 있는 다른 방법에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 특정 실시양태에서 표적화될 수 있는 코넥신의 예로는 다음과 같은 것들이 있으나 이에 한정되지 않는다.
인간 Cx 43, α1(서열 12)
Figure 112006047308013-PCT00001
Figure 112006047308013-PCT00002
인간 Cx 46, α3(서열 13)
Figure 112006047308013-PCT00003
인간 Cx 37, α4(서열 14)
Figure 112006047308013-PCT00004
인간 Cx 40, α5(서열 15)
Figure 112006047308013-PCT00005
인간 Cx 45, α7(서열 16)
Figure 112006047308013-PCT00006
인간 Cx 50, α8(서열 17)
Figure 112006047308013-PCT00007
인간 Cx 36, α9, γ1(서열 18)
Figure 112006047308013-PCT00008
인간 Cx 59/58, α1O(서열 19)
Figure 112006047308013-PCT00009
인간 Cx 46.6/47, α12(서열 20)
Figure 112006047308013-PCT00010
인간 Cx 32, β1(서열 21)
Figure 112006047308013-PCT00011
인간 Cx 26, β2(서열 22)
Figure 112006047308013-PCT00012
인간 Cx 31, β3(서열 23)
Figure 112006047308013-PCT00013
인간 Cx 30.3, β4(서열 24)
Figure 112006047308013-PCT00014
인간 Cx 31.1, β5(서열 25)
Figure 112006047308013-PCT00015
인간 Cx 30, β6(서열 26)
Figure 112006047308013-PCT00016
인간 Cx31.9, c1(서열 27)
Figure 112006047308013-PCT00017
인간 Cx 29/31.3, e1(서열 28)
Figure 112006047308013-PCT00018
인간 Cx 25(서열 29)
Figure 112006047308013-PCT00019
인간 Cx 40.1(서열 30)
Figure 112006047308013-PCT00020
인간 Cx 62(서열 31)
Figure 112006047308013-PCT00021
이제 본 발명의 다양한 측면을 하기 실시예 부분과 관련하여 기재할 것이며, 이는 단지 예시 방식으로 제공된 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다. 하기 실시예는 예로써 제공된 것으로 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1: 생체내 분석
물질 및 방법
레이저 처리
암컷 위스타(Wistar) 래트(생후 32 내지 34일)를 연구소내 동물 이용에 대한 ARVO 결의안과 일치하는 조건하에서 사육하였다. 동물을 하이프노름(Hypnorm; 상표명)(1O mg/ml, 얀센 파마슈티카(Jansen Pharmaceutica), 벨기에)과 하프노벨(Hypnovel)(5 mg/ml, 로쉬 프로덕츠 리미티드(Roche Products Ltd), 뉴질랜드)의 1:1 혼합물을 0.083 ml/100 g(체중)의 투여량으로 동물의 복막에 투여하여 동물을 마취시켰다.
엑시머 레이저 처리는 테크놀라스(Technolas) 217 Z 엑시머 레이저(바슈 앤 롬 서지칼(Bausch ＆ Lomb Surgical), 미국)를 이용하여 손상되지 않은 상피를 통해 수행하였다. 눈을 동공이 중앙으로 오도록 조정하고, 하기 파라미터에 따라 절제를 수행하였다 - 처리 영역: 2.5 mm의 직경 및 70 ㎛의 깊이. 이로써 얇은 두께의 전방 간질과 상피 전체가 제거되었다. 엑시머 레이저 처리를 우선적으로 이용하여 재현가능한 손상을 생성하고, 코넥신 43 AS ODN의 외상 후의 각막 리모델링과 공학에 대한 효과를 조사하였다.
수술 후에는 모든 동물을 개별 케이지에 넣고, 임의의 불편함에 대해 면밀히 모니터링하였다. 수술후 생체내 평가는 슬릿 램프 생체현미경 및(또는) 슬릿 주사 생체내 공초점 현미경을 이용하여 수행하였다.
슬릿 주사 생체내 공초점 현미경
각막 레이저 처리 전후에, 콘포스캔 2(Confoscan 2)(포쳔 테크놀로지스 아메리카(Fortune Technologies America), 미국) 슬릿 주사 생체내 공초점 현미경을 이 용하여 각각의 동물을 임상 관찰하였다. 상기 콘포스캔 2는 포착 순간에 영상을 바로 디지탈화시키는 뚜렷한 이점을 갖는 슬릿 주사 기술의 변형이다. 동물을 마취시키고, 이들을 각각 포착 헤드(acquisition head) 앞의 생체내 공초점 현미경 대물 렌즈와 수평으로 조정된 특별히 설계된 플랫폼 상에 올려 놓았다.
이 슬릿 주사 생체내 공초점 현미경은 전체 각막 두께를 통해 상이한 수준의 유효 각막의 광학적 절개를 가능하게 한다. 내피부터 조사하기 시작하였으며, 전후방 절편의 수는 설정된 세팅에 따라 달라진다. 슬릿 주사 기술은 조사될 영역에 대해 수직인 축을 따라 전후 방향으로 움직이는 대물 렌즈를 이용한다. 요컨대, 이 하드웨어는 할로겐 램프(100W/12V), 2개의 슬릿, 2개의 관 렌즈, 전방 대물 렌즈, 및 고도로 민감한 디지탈(CCD) 카메라로 구성되어 있다. 주사 전에, 비스코티어스(Viscotears)(시바비젼 오프탈믹스(CIBAVision Ophthalmics)) 한 방울을 침지 물질(immersion substance)로서 대물 렌즈의 끝에 떨어뜨렸다. 주사하는 동안에 동물의 눈을 넓게 개방된 상태로 유지하고, 각막 평면이 확대 렌즈(40x, N.A 0.75)의 광학 축에 대해 항상 수직이 되도록 배향시켰다. 영상 포착 시간은 대략 14 초였다. 대물 렌즈가 아닌 겔이 항상 눈과 접촉하게 하였다. 래트 각막에 대해서는 매번의 조사시마다 250개까지의 순차적인 디지탈 영상을 수득하여, 하드 디스크 드라이브에 바로 저장하였다. 예비 실험 동안 포착 파라미터를 조정하여 이후의 모든 실험 동안에 일정하게 유지시켰다. 이는 다음과 같았다: 빛의 강도는 인간 환자에게 일반적으로 사용되는 강도의 절반으로 감소시키고, 4회 통과(1회 통과를 완전한 전후 이동으로 간주함)를 사용하고, 400 ㎛의 작동 거리를 선택함. 래트 각 막의 경우에는 동공의 선명한 시각화에 의해 단일대상주의집중(centration)이 용이해져, 동공의 매우 양호한 국소해부 재현성을 제공한다.
생체내 공초점 영상
슬릿 주사 생체내 공초점 현미경으로 포착한 모든 영상을 하드 디스크 드라이브에 저장하고, 그 후에 NAVIS 독점 소프트웨어(콘포스캔 2, Nidek Co Ltd)에 의해 분석하였다.
간질 동력학을 하기하는 입체학 원리에 따라 평가하였다. 세포수를 전방 및 후방 간질 위치에서 기록하였다. 주요 입체 요소는 광학적 절개자(공간에서 동일 확률의 입자로 샘플링한 프로브)로서 기능하는 생체내 공초점 현미경 자체에 의해 제공된다. 또한, 생체내 공초점 현미경은 각각이 절개된 조직 샘플이 되는 특정 부피의 얇은 광학 슬라이스를 제공한다. 그 결과, 간질 세포의 계수는 초점이 맞는 입자(간질 세포)를 갖는 하나의 프레임과 동일한 입자의 초점은 흐리지만 인식할 수는 있는 영상(광학적 쉐도우)을 보여주는 보조-프레임 한 쌍을 선택하는 것으로 이루어진다(생체내 공초점 현미경에 의해 기록된 연속 사진). 규정된 면적 A(㎛2) 내의 가장 선명한 프레임으로부터 세포수(n)를 기록하였다. 두 프레임 사이의 거리 d(㎛)도 기록하였다. 이에 따라, 단위 부피 당 세포수(V)는 V = 세포수(n) /d(㎛) x A(㎛2)으로 계산된다.
생체외 공초점 영상
적절한 각막 절편을 상이한 목적을 위해 상이한 마커로 면역조직화학적으로 염색하였다. 핵 염색제인 훽스트(Hoechst) 33 258로 염색하여, 중추 또는 말초 각막에서의 상피 세포 및 간질 세포의 수를 추정하였다. 이 목적을 위해 애널러시스(AnalySIS) 3.2 소프트웨어(소프트 이미징 시스템(Soft Imaging System), 미국)를 사용하여, 관심 영역을 우선 적절 부위의 각막의 TIFF 파일 영상 위에 직접 끌어 내려서 상기 소프트웨어에 의해 면적 값이 자동으로 얻어지도록 했다. 이어서, 수동 계수 옵션을 이용하여 상기 영역 내의 세포를 계수하고, 단위 면적 당 계수값으로 표시하였다.
안티센스 화합물의 투여
인산염 완충 염수(분자생물학 연구 등급의 물) 중의 30％ 플루론산 겔(바스프 코포레이션(BASF Corp.))을 사용하여, 변형되지 않은 α1 코넥신(코넥신 43) 특이적인 안티센스 ODN을 광굴절 각막절제술 후에 마취시킨 래트의 결막 아래로 전달하였다. FITC 태그를 이용한 예비 실험에서, 상기 제제는 24 시간까지는 눈의 전방 영역에 남아있는 것으로 나타났다(도시하지 않음).
상기 실험에 사용된 안티센스 분자는 DB1(GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC)(서열 65)이었다. FITC 태그를 DB1 ODN에 첨가하고, 공초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하여 상기 프로브의 생체내 침투를 입증하였다.
ODN은 2 μM 최종 농도가 되도록 투여하였다.
조직 공학 또는 리모델링 효과의 모니터링
안티센스 화합물의 투여 후에, 레이저 수술후 2 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 1 주일 및 2 주일째에 슬릿 주사 생체내 공초점 현미경을 이용하여 각막을 조사하였다. 대조군 래트에게는 레이저 수술만을 실시하였다.
표 1은 각 시점에 조사한 각막 수를 요약한 것이다.
슬릿 주사 생체내 공초점 현미경을 이용하는 생체내 후처리에 사용된 대조군(C) 및 AS(ODN) 처리된 각막의 수 ODN= AS ODN 처리된 눈(레이저 수술 후에 단일 투여함)
수술후 2시간 이내 수술후 12시간 째 수술후 24시간 째 수술후 48시간 째 수술후 72시간 째 수술후 1주일째 수술후 2주일째
눈의 수(n) 18 C 18 ODN 10 C 10 ODN 18 C 18 ODN 10 C 6 ODN 6 C 6 ODN 4 C 4 ODN 5 C 5 ODN
각막의 각 세포층을 분석하고, 대조군과 ODN 처리군의 세포 유형, 세포 수 및 세포 외양을 비교하였다.
상피 재생:
항-코넥신 43 ODN 처리는 상피 회복을 촉진하였다. AS ODN을 처리한 각막의 90％에서는 PRK 레이저 수술 후 12 시간 이내에 활주 상피 세포가 관찰되었지만, 대조군의 경우에는 관찰되지 않았다(도 1B). 이 단계에서, 대조군 각막의 30％에서는 정지상 내피 세포만이 존재하였다(도 1A). 24 시간까지는 모든 대조군과 안티센스 화합물을 처리한 각막에서 상피 세포가 관찰되었으나, 처리군은 72％, 대조군은 61％만이 활동적인 활주 세포를 보여주었다. 이는 상피 재생이 대조군에서보다 코넥신 43 특이적인 AS ODN을 처리한 각막에서 더 빠르게 진행된다는 것을 지시한다.
간질 세포 밀도:
2벌의 샘플을 사용하여, 선택한 시점에서 대조군과 ODN 처리한 각막 사이에서 전방과 후방의 간질에서의 세포 밀도를 각 군 내에서 시간의 함수로서 비교하기 위해 반복 측정을 실시한 t-검정 및 간질 세포를 비교하기 위한 만 휘트니(Mann Whitney) 비모수(非母數) 통계 시험을 수행한 결과, 통계학적으로 유의한 결과는 오직 레이저 수술후 24 시간이 지난 시점에서만 발견되었다(표 2). 이 시점에, 대조군과 ODN 처리군에서 전방 간질의 간질 세포 밀도는 수술전 값에 비하여 상당히 증가되어 있었다(p 값 < 0.05). 대조군 각막의 경우에는 후방 간질에서의 간질 세포 밀도 역시 수술전 값에 비하여 증가되어 있었으나(p 값 < 0.05), ODN 처리된 각막의 후방 간질에서의 간질 세포 밀도는 수술전 값과 통계학적으로 유의할 정도로 다르지 않았다(p 값 > 0.05). 이들 2개 군 사이에서 전방 간질과 후방 간질의 간질 세포 밀도를 비교하면, ODN 처리된 각막의 간질 세포 밀도가 대조군 각막의 경우보다 항상 더 낮았다(p 값 < 0.05). 이것은, ODN 처리된 각막에서 간질 리모델링 또는 공학에 관여하는 세포의 수가 대조군 각막에 비하여 더 적다는 예상을 뒷받침하는 것이다. 이것은 항-코넥신 43 ODN의 투여가 수술 부위에서의 세포과다형성을 감소시킴을 보여주는 최초의 보고이다. 생체외 조직화학 분석(실시예 II)은, 이러한 세포과다형성이 원치않는 간질 매트릭스 리모델링 및 반흔 형성을 유도하는 근섬유아세포와 관련이 있음을 보여준다.
광굴절 각막절제술 전 및 24 시간 후의 대조군 및 AS ODN 처리된 각막에서의 간질 세포수. 세포 밀도는 평균 +/- 표준 편차로 표시하였다.
처리 시점 전방 간질 세포수 (#세포수/mm3) 후방 간질 세포수 (#세포수/mm3)
대조군 수술전 36469±11122(n=17) 33909±8753(n=17)
ODN 수술전 36769±10932(n=17) 34382±8667(n=14)
대조군 수술후 24 시간째 144643±60989(n=17) 46901±26964(n=17)
ODN 수술후 24 시간째 93468±53548(n=17) 33510±11350(n=14)
실시예 II - 생체외 분석
물질 및 방법
조직학: 조직 수집 및 고정
적절한 수의 동물(위스타 래트)을 광굴절 각막절제술 후에 선택된 시점에서 택하여 마취하여 이 마취된 래트에게 DB1 항-코넥신 43 ODN을 상기 실험 1에 기재된 바와 같이 투여하고, 조직 분석에 사용하기 위한 각막 절편을 제조하였다. 대조군 래트에게는 레이저 수술만을 실시하였다. 온전한 눈 및 대조군 조직을 옥소이드(Oxoid) PBS 중에서 세정한 후에 티슈-테크(Tissue-Tek)(등록상표)(사꾸라 피네테크(Sakura Finetek), 미국)에 매몰시키고 액체 질소에서 동결시켰다. 필요한 경우(몇가지 항체의 사용시)에는 상기 동결 조직을 저온에서 절단 후에 냉각(-20℃) 아세톤 중에서 5 분 동안 고정시켰다.
조직 절단
저온절편화 절차는 다음과 같았다: 고정되지 않은 조직의 동결된 블럭을 -80℃ 저장고에서 꺼내고, 레이카(Leica) CM 3050S 저온유지장치에 약 20 분 동안 넣어 두어 이 저온유치장치와 동일한 온도(즉 -20℃)로 평형화시켰다. 조직의 평형화가 달성되었을 때, 상기 표본을 티슈-테크(등록상표)에 매몰된 채로 표본 디스크 위에 탑재하였다. 절편을 12 ㎛ 두께(H/E 염색의 경우) 또는 25 ㎛ 두께(면역표지의 경우)로 절단하고 수퍼프로스트(Superfrost)(등록상표) 플러스(Plus) 슬라이드(멘젤-글레서(Menzel-Gleser), 독일) 위에 얹었다. 저온절단 직후에, 조직 블럭을 다시 -80℃ 저장고에 넣고, 저온절편을 지탱하고 있는 슬라이드를 즉시 사용하거나 -80℃에 보관하였다. 절편화는 눈의 광학 축에 평행하게 실시하였다.
헤마톡실린/에오신(H/E) 염색 및 핵 염색
슬라이드를 유리 선반 위에 얹어 일련의 여러가지 염색 시약 중에 침지시키기 용이하게 하였다. 슬라이드를 시약 중에 넣고 선반을 교반하여 표면 장력을 없앴으며 각각의 용액 교환 사이에는 꺼내었다. 길(Gill's) II 헤마톡실린/에오신 염색 이전에, -80℃에 보관했던 슬라이드를 먼저 1 내지 2 분 동안 실온으로 가온시킨 후에, 냉각 아세톤 중에서 우선 고정시키고(시키거나) 수돗물(tap water)에 신속하게 침지하여 즉시 수화시켰다. 슬라이드를 길 II 헤마톡실린 중에서 2분 동안 염색한 후에, 과량의 염색약을 수돗물에서 세정해 냈다. STWS(Scott's Tap Water Substitute) 중에 4 초 동안 침지하여 염색 정도를 차별화하였다. 이어서, 흐르는 수돗물 중에서 1분 동안 세정한 후에 1％ 에오신 중에 30 회 연속으로 침지하여 염색시켰다. 마지막으로, 절편들을 수돗물 중에서 신속하게 세정하고 95％, 100％ EtOH를 사용하여 탈수시키고, 크실렌 중에서 투명하게 하여 DPX 탑재 매질(시그마)을 사용하여 탑재하였다. 핵 계수용 염색제(H/E와 병행하거나 면역조직화학 분석시에 병용함)로는 훽스트 33 258(시그마)를 사용하였다. H/E 염색된 절편으로 각막 두께를 측정하였다.
면역조직화학
코넥신 43의 경우에는 부위-특이적 모노클로날 항체를 사용하고, 근섬유아세포 경우에는 알파 평활근 액틴을 인식하는 항체를 사용하고, 기저층 침전물의 경우에는 항-라미닌-1 항체를 사용하여 절편을 면역표지하였다. 또한, 항-비멘틴 항체를 사용하여 간질 각질세포를 근섬유아세포와 차별화하였고, Ki-67 항체를 사용하여 세포 증식을 확인하였다.
생체외 조직학적 분석
이 결과는 엑시머 광절개술에 의해 생긴 손상이 수술후 24 시간 만에 봉합된다는 것을 나타내었다(도 2). 각막의 주변부 및 중앙부에서 단핵/다핵 및(또는) 원형 알 형태 세포에 의한 간질의 전형적인 침윤이 상기 2개 군 모두에서 관찰되었고 가장 우세한 것은 수술후 24시간이 지난 후였지만, 안티센스 ODN 처리군에서는 이들 세포가 대조군보다 유의하게 더 적은 수로 나타났다(도 2A, B, C). 이것은, 실시예 1에 나타낸 생체내 공초점 현미경사진에서 발견된 것과 일치하는 것이다. 도 2에 나타낸 바와 같이 대조군 각막에서의 상피 두께는 레이저-유도된 손상 부위에서 다양하였고(도 A, B), 절개 영역 아래쪽의 간질(도 A, B) 및 주변 간질(도 C)에서 다양하였으며, 대조군 각막은 원형 세포에 의해 광범위하게 침윤되었다(세포과다형성). 또한, 도 B 및 도 C에서는 두드러진 간질 부종 역시 관찰되었다. 안티센스 ODN 처리된 각막에서는 상피의 두께가 균일(도 D 및 도 E)하였고 간질의 중앙 영역(도 D) 및 주변 영역(도 E)에서는 간질 부종의 징후가 거의 나타나지 않았다. 또한, 간질에는 원형 세포가 거의 존재하지 않았다. 도 2의 크기비교용 막대는 20 ㎛를 나타내다.
레이저 처리 및 코넥신 43 ODN 처리 후의 간질 두께 변화를 표 3에 나타내었으며, 이것은 대조군과 ODN 처리된 각막을 간질 두께의 변화에 대하여 비교한 것이다. 적절하게 조직학적 염색된 절편으로부터 간질 두께를 측정하였다.
2벌의 샘플을 사용한 t-검정을 이용하여 ODN 처리군에 대하여 얻은 데이타의 통계학적 분석은, 조사한 3가지 시점 모두(수술후 24 시간, 48 시간 및 72 시간)에서 중앙 간질 두께는 수술전 값보다 통계학적으로 유의하게 더 얇으며(p 값 < 0.05), 주변 간질 두께는 수술전 값과 유의하게 다르지 않다는 것을 보여주었다. 반대로, 대조군 각막은 중앙 및 주변 각막 모두에서 간질이 유의하게 팽창(부종)(도 2 A, B, C)(여기서, 간질의 두께는 수술전 값에 비해 2배임)하는 것으로 나타났다.
수술받지 않은 각막의 중앙 간질 두께는 250 ㎛이지만, 엑시머 레이저 수술을 이용하여 각막 조직(상피 및 간질의 일부 포함) 70 ㎛를 제거하였다. 정상적인 각막 상피의 두께는 50 ㎛(평균)이어서 간질 조직 20 ㎛를 레이저 수술로 제거하였다. 따라서, 창상후 24 시간, 48 시간 및 72 시간에서의 중앙 간질 두께를 수술전의 중앙 간질 두께와 통계학적으로 비교하기 위해, 조정된 두께 손실 및 수술전 중앙 간질 두께(250 - 20 = 230 ㎛)를 사용하였다.
대조군 및 AS 처리된 각막에서의 엑시머 레이저 수술후 간질 두께의 변화
처리 시점 평균 중앙 간질 두께(㎛) 평균 중앙 간질 두께(㎛)
정상(수술하지 않음) 수술전 250(n=6)* 110(n=10)
대조군 ODN 처리됨 수술후 24 시간째 318(n=6) 190(n=5) 290(n=6) 132(n=5)
대조군 ODN 처리됨 수술후 48 시간째 307(n=6) 158(n=5) 206(n=5) 105(n=5)
대조군 ODN 처리됨 수술후 72 시간째 292(n=6) 142(n=5) 201(n=6) 99(n=6)
코넥신 43 발현의 감소와 간질 침윤 감소 및 상피 세포과다형성 감소와의 연관성
현미경 관찰 결과, 대조군 각막에 비해 ODN 처리된 각막에서 코넥신 43의 존재 수준이 감소한 것으로 나타났다. 도 3은 조합형 현미경사진 화상을 보여주고 있다. 윗줄은 대조군 각막을 나타내고, 아랫줄은 안티센스 ODN 처리된 각막을 나타낸다. 원형 세포에 의한 통상적인 간질의 침윤이 가장자리, 주변부 및 중앙 영역에서 24 시간 이내에 2개 군 모두에서 관찰되었다. 그러나, ODN 처리된 각막에서는 원형 세포가 더 낮은 밀도로 나타났다. 2개 군 모두의 가장자리에서 항-코넥신 43은 간질 전체에 고르게 분포하였으나(3A 및 3D), 처리군(3E)은 대조군(3B)에 비해 주변부에서 더 적게 표지되었다. 이 단계에 의해, 코넥신 43 수준은 2개 군 모두의 상피에서 정상으로 돌아왔으나, 대조군은 반흔 유사 간질(3C) 또는 세포과다형성(하기 도 4 참조)을 나타낸 반면 안티센스 처리된 각막에서는 코넥신 43 수준이 정상인 정상적인 상피가 관찰되었다(3F). 크기비교용 막대 A, D, E, F는 10 ㎛를 나타내고; B 및 C는 20 ㎛를 나타낸다. 이들 도면에서, 코넥신 43은 회색으로 보이는 세포 핵으로 표지된 백색 반점으로 나타난다. 도 3에 도시된 결과는, 항-코넥신 43 ODN로 처리 후에는 코넥신 43 단백질 수준이 감소하여 간질에서의 세포 동원(動員) 수준이 더 낮아진다는 것을 시사한다. 또한, ODN 처리된 각막 중 7％만이(수술후 24 시간에서 0％, 수술후 48 시간에서 0％, 수술후 72 시간에서 20％) 대조군 각막(31％)에 비해 상피 세포과다형성 징후를 나타내었다(수술후 24 시간에서 25％, 수술후 48 시간에서 67％, 수술후 72 시간에서 0％). 이를 H/E로 염색하고 Ki-67 표지된 절편 상에서 평가하였다.
근섬유아세포 표지
비멘틴 항체로 표지하여 얻은 결과가 AS ODN 처리된 각막에 비해 대조군 각막의 간질에서 세포수가 증가한 것이 미분화 간질 세포에서 기원한 것이 아님을 지시하였기 때문에, α-평활근 액틴 항체를 사용하여 표지하였다. 이 표지는 대조군 각막이 수술 부위 아래쪽 뿐만이 아니라 그 근처의 간질 주변부에서도 더 많은 수의 근섬유아세포를 갖는 것을 보여주었다. 이와 같은 근섬유아세포의 수 및 영향을 받는 면적의 증가는 수술후 24 시간이 지났을 때 분명하였고, 수술후 48 시간 및 72 시간 내지 1 주일 이상까지 지속되었다(표 4). 도 4는 레이저 수술후 1 주일째의 근섬유아세포 표지(항-알파 평활근 액틴)를 나타낸다. 도 4A, B 및 C는 대조군이고, 도 4D, E 및 F는 안티센스 처리된 각막이다. 대조군 각막에서는, 창상후 1 주일 까지는 주변부 간질의 전방 절반에 낮거나 중간 정도의 수의 근섬유아세포가 존재하고(4A) 중간 내지 주변부 간질 영역에는 중간 내지는 치밀한 밀도 수준으로 존재하였으며(4B), 중앙 영역 간질의 전방 절반에는 중간 수준으로 관찰되었다(4C). 반대로, 처리된 각막에서는 주변부(4D) 또는 중간 주변부(4E)의 간질에 매우 적은 수의 근섬유아세포가 존재하였고, 중앙 간질에는 중간 내지 낮은 수의 근섬유아세포가 존재하였다(4F). 몇몇 경우, 중앙 간질에서는 근섬유아세포가 상피 바로 아래 영역에 집중되어 존재하였다(도시하지 않음). 따라서, 상기 실시예 1(세포과다형성) 및 도 2에서 관찰된 세포수 증가는 근섬유아세포 분화 및 침윤으로 인한 것이라고 여겨진다. 근섬유아세포는, 결정질 침착이 감소하고 창상 콜라겐 III의 분비가 증가하는 간질에서의 반흔 조직 침착을 담당한다고 알려져 있다(문헌 [Ahmadi A. J. and Jakobiec F. A.; 2002, Int Ophthalmol Clin. Summer; 42(3):13-22]).
대조군 및 안티센스 ODN 처리된 각막에서의 근섬유아세포에 대한 평활근 액틴 표지의 요약
시간 위치 대조군 각막 AS 처리된 각막
수술후 24 시간째 주변부 80％D (전체 st) 20％M (전체 st) 100％M(전방 1/3 st)
중앙-주변부 100％D(전체 st) 100％M(전방 1/3 st)
중앙부 100％L(전방 3/4 st) 80％L(전방 1/3 st) 20％L( epi 아래)
수술후 48 시간째 주변부 83％M(전체 st) 17％L(전체) 40％M(전방 1/2 st) 60％L(전방 1/2 st)
중앙-주변부 50％D(전체 st) 50％M(전체 st) 100％D(전방 1/2 st)
중앙부 17％L( epi 아래;비후) 50％D(전체 st) 33％M(전체 st) 20％(없음) 80％M(전방 3/4 st)
수술후 72 시간째 주변부 33％L(전방 1/2 st) 67％M(전방 1/2 st) 40％L(전방 1/2 st) 60％M(전방 1/2 st)
중앙-주변부 33％L(전체 st) 67％D(전체 st) 20％L(전방 1/2 st) 80％M(전방 1/2 st)
중앙부 17％(없음) 50％D(전체 st) 33％M(전체 st) 20％(없음) 40％L(전방 1/2 st) 40％M(전방 3/4 st)
수술후 1 주일째 주변부 60％M(전방 1/2 st) 40％L(전방 1/2 st) 100％L(전방 1/3 st)
중앙-주변부 60％D(전체 st) 40％M(전체 st) 100％L(전방 1/2 st)
중앙부 60％M(전방 1/2 st) 40％L(전방 1/2 st) 60％M(전방 1/2 st) 20％L(전방 1/2 st) 20％M(epi 아래)
근섬유아세포의 수를 밀집 수준(D), 중간 수준(M), 낮은 수준(L) 또는 없음으로 정량하였다. 백분율은 명시한 수준으로 영향을 받는 동물의 비율을 나타낸다. st = 간질, epi = 상피. 대조군과 안티센스 처리된 각막 사이의 유의차는 굵은 표시로 강조하였다.
기저층 침착
광굴절 각막절제술 후에는 기저층이 재성장하는 상피와 함께 다시 형성된다. 라미닌-1에 대한 항체로 표지한 결과, 재형성된 기저층이 불연속적이며 상피-간질 부착이 불규칙한 것으로 나타났다(도 5). 24 시간째에, 대조군에서는 절개된 면적의 가장자리에 라미닌 침착이 거의 없고(없거나) 불균일하고(도 5A) 중앙부쪽으로 편중(도5B)된 반면, 안티센스 처리된 각막에서는 이들 2개 영역 모두에서 더 규칙적인 라미닌 침착이 나타났다(도 5C, 도 5D). 48 시간째에, 대조군에서는 여전히 연속적인 라미닌 침착이 없었고(도 5E - 절개된 영역의 가장자리; 도 5F - 중앙부) 매우 불균일하였다(도 5E). 반대로, 안티센스 ODN 처리된 각막에서는 창상 가장자리(도 5G) 및 중앙부(도 5H)에 연속적이면서 규칙적으로 일관적인 기저층이 존재하였다. 도 5에서의 모든 크기비교용 막대는 20 ㎛를 나타낸다. 코넥신 43 안티센스 처리된 각막은 24시간 이내에 더욱 밀집되고 더욱 연속적이면서 불규칙도가 덜한 기저층을 형성하였다.
라미닌 불규칙도를 도 6에 나타낸 바와 같이 정량하였다. 도 6의 검정색 직선은 라미닌-1 침착을 나타낸다. 각각의 영역에 대한 편차를 언덕형 꼭대기와 계곡형 바닥부 사이의 차이로 측정하였다(도 6A, B, C, D). 안티센스 ODN 처리된 각막의 평균 편차는 4.74 ㎛인 데 비해 대조군 각막의 평균 편차는 6.98 ㎛이었다. 2개 군 사이의 차이는 통계학적으로 유의하였다(p < O.0001).
실시예 III - 생체외 조직 공학
각막을 생체외 기관 배양 모델에 넣고, 안티센스 ODN을 이용하여 특이적인 코넥신을 조절하였다. 이 실험에서는 2개의 코넥신, 즉 코넥신 43 및 코넥신 31.1을 표적으로 하였다. 코넥신 43 하향조절은 코넥신이 시험관내에서 조절될 수 있음을 입증하는 데 이용하였으며, 코넥신 31.1은 각막으로부터 분비되는 세포 주변 각막의 외부 상피층에서 발현되기 때문에 이 코넥신을 표적으로 하였다. 목적은 코넥신 31.1 발현을 감소시켜 상피 조직의 비후를 조작하는 것이다.
물질 및 방법
생후 30 내지 34일 된 위스타 래트를 넴부탈(Nembutal) 또는 이산화탄소로 안락사시키고, 래트 눈 전체를 절개하였다. 안구 표면을 절개하고, O.1 mg/ml 페니실린-스트렙타마이신으로 5 분 동안 소독하고, 멸균 PBS에서 세정하였다. 이어서, 눈 전체를 각막이 위로 향하게 하여 60 mm 배양접시 중의 멸균 홀더(holder)로 옮겼다. 눈을 각막 상피가 공기-배지 경계면에 노출되도록 탑재하고, 습윤된 5 ％ CO2 인큐베이터에서 혈청 무함유 배지(Opti-MEM, 인비트로젠) 중에 48 시간까지 34 ℃에서 배양하였다. 배지 100 ㎛를 매 8 내지 12시간 마다 표면에 적가하여 상피를 적셨다. 배지 수준을 가장자리 결막 수준으로 유지시켰다.
안티센스 올리고머를 얼음 상에서 30％(중량/중량) 플루론산 F127 겔(시그마)과 최종 2 μM 농도로 혼합하여, 10 ㎕를 각막에 투약하였다. 각 처리시 샘플의 크기는 실험 당 3 내지 4개의 각막이었다. 예비 실험은 본 발명의 양성 대조군인 DB1을 8 시간 동안 이중 처리하는 것이 본 발명의 각막 배양액에서의 코넥신 43 단백질 발현에 거의 영향을 끼치지 않는다는 것을 보여준다. 이에 따라, 각막을 24 시간 동안 배양하고, 코넥신 특이적인 올리고머를 8 시간 마다 투약하였다.
면역조직화학적 표지를, 코넥신 43, 26(대조군) 및 31.1에 대한 항체를 사용하여 상기 실험 2에서와 같이 수행하였다. 또한, 조직을 상기와 같이 H/E로 염색하였다. 핵을 0.2 μM 프로피듐 요오다이드로 대조염색시켰다. 실험군내에 유지된 전압 및 오프셋(offset) 세팅에서 레이카 TCS 4D 또는 TCS SP2 공초점 레이저 주사 현미경으로 영상을 수집하여 코넥신 수준을 정량하였다. 정량을 위해, 3 ㎛를 관통하는 4개의 광학 슬라이스를 TCS 4D 상에서 질량 분포 투영 옵션(mass topographical projection option)의 센터를 이용하여 단일 확장된 초점 광학 영상으로 프로세싱하였다. 코넥신 표지를, 256 그레이 스케일 영상에서 90 내지 100 화소 강도를 역치로 한 후에 NIH 영상(사이온 코포레이션(Scion Corp.), 미국)을 이용하여 정량하였다.
수술하지 않은 각막에서, 시험관내 코넥신 턴오버 속도는 상기 실시예 1 및 2에 기재된 엑시머 레이저 절개된 각막에서의 조직 리모델링 과정에 비해 상대적으로 낮았다. 그럼에도 불구하고, 안티센스 ODN으로 3회 처리한 후의 코넥신 수준은 대조군에 비해 50％ 넘게 감소하였다(도 7A, B는 AS ODN 처리된 각막에서 코넥신 43이 대조군에 비해 감소하였음을 나타냄). 코넥신 43 특이적인 안티센스 ODN을 투약하였을 때 코넥신 26 수준은 일정하게 유지되었으며, 이는 코넥신 수준의 감소가 특이적이며 처리 부작용은 아니라는 것을 나타낸다. 이러한 영상에서, 코넥신 43은 상피의 2개의 기처층에서 보다 진한 스팟으로 나타났으며, 코넥신 26은 우선적으로 층 2 내지 6에서 보다 미세한 반점 표지로 나타났다. 코넥신 31.1 안티센스 ODN은 코넥신 31.1의 수준을 감소시켰으나, 예비 결과는 또한 상피 두께(층수)가 24 시간 이내에 증가하였음을 보여준다(도 7 C, D). 이와 같은 두께의 증가는 H/E 염색(도 7D) 및 면역조직화학적으로(도 7C) 표지된 절편에서 관찰되었다.
이러한 작업에 기재된 결과는, 특히 각막 엑시머 레이저 수술 후를 비롯한 조직-공학에서 코넥신 특이적인 안티센스의 사용에 대한 기초, 또는 조직 공학 및 이식을 위한 시험관내 기관 배양에 대한 기초를 형성한다. 본원에 제공된 실험 결과는 엑시머 레이저 광굴절 각막절제술 후에 코넥신 43 특이적인 안티센스 ODN을 단일 처리하는 것이 다양한 용도로 유익하게 사용될 수 있으며, 이들 중 일부를 하기에 기재하고 있다.
코넥신 특이적인 안티센스 ODN의 투여는 상피 세포 이동을 촉진한다. 수술 12시간 후에 90％ 안티센스 처리된 각막은 레이저-유도된 손상 부위에서 활주 상피 세포의 존재가 확인되었다(대조군 각막에서는 나타나지 않음). 상피 세포는 대조군 각막의 30％에 존재하였지만, 정지상/비-활주 상태였다. 따라서, 코넥신에 의한 세포-세포 직접 소통의 조절을 이용하여 상피 세포 패턴 변화를 조작할 수 있다.
코넥신 특이적인 안티센스 ODN의 투여는 수술후 24 내지 48 시간 내에 레이저-유도된 손상 부위에서 근섬유아세포 분화와 관련된 세포과다형성 제어를 촉진한다. 이 기간 동안, 안티센스 ODN 처리된 각막(39％)보다 많은 대조군 각막(63％)이 전체 간질에서 집중적인 세포과다형성을 나타내었다. 따라서, 직접적인 세포-세포 소통의 조절을 이용하여 세포외 매트릭스의 변형을 유도하는 세포 분화를 조절할 수 있다.
코넥신 특이적인 안티센스 ODN의 투여는 수술후 24 내지 72 시간 내에 레이저-유도된 손상 부위의 혼탁을 감소시키는 간질 리모델링을 제어한다. 이 기간 동안, 안티센스 처리된 각막(39％)보다 많은 대조군 각막(64％)이 전체 간질에서 집중적인 혼탁을 나타내었다.
코넥신 특이적인 안티센스 ODN의 투여는 리모델링 초기에 간질 부종을 억제한다. 따라서, 직접적인 세포-세포 소통의 조절은 레이저 수술 결과를 개선시킨다.
코넥신 특이적인 안티센스 ODN의 투여는 리모델링 초기에 세포 증식을 감소시킨다. 따라서, 직접적인 세포-세포 소통의 조절을 이용하여 조직 리모델링 동안 세포 증식을 조절할 수 있다.
코넥신 특이적인 안티센스 ODN의 투여는 상피 비후를 78％(수술후 24 내지 72시간에 평가됨) 감소시켜 평탄한 상피의 조작을 가능하게 하였다.
코넥신 특이적인 안티센스 ODN의 투여는 수술후 1 주일까지 근섬유아세포 활성화를 감소시킨다(각질세포가 초기에 손실됨). 직접적인 세포-세포 소통의 조절은 수술 리모델링 동안 조직 손상을 보다 정확하게 제어하여 결과의 예측가능성을 개선시키고 시력 손상을 감소시킬 수 있다.
코넥신 특이적인 안티센스 ODN의 투여는 조직 리모델링 동안 보다 규칙적이고 조밀한 상피-간질 부착 매트릭스를 생성한다. 따라서, 직접적인 세포-세포 소통의 조절을 이용하여 조직 기저층을 조작할 수 있다.
또한, 본원에 이용된 생체외 각막 배양 모델은 직접적인 세포-세포 소통의 조절을 이용하여 시험관내에서 조직을 조작할 수 있다는 것, 예를 들어 코넥신 31.1 안티센스 ODN을 사용하여 상피 두께를 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 처리는 또한 생체내 조작, 예를 들어 각막 질환, 예컨대 원추각막(상피가 얇아짐)의 경감을 위해 보다 두꺼운 각막을 조작하는 것과 관련이 있다.
이러한 결과는 세포-세포 소통을 방해하는 활성이 있는 분자가 조직 공학 및 리모델링에 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 구체적으로, 코넥신 단백질에 표적화된 안티센스 데옥시뉴클레오티드를 특히 교정 레이저 수술 후의 각막 리모델링에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 생체내 및 시험관내 조직 공학에 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본원에 기재된 안티센스 화합물 및 방법은 수술 중재 결과를 개선시키고 눈의 질환 과정을 개선시키는 것, 및 조직 공학에 상당한 잠재성을 나타낸다.
실시예 IV
생체외 배양액 모델
성체 동물 모델에서 뇌 또는 척수 손상 후에 갭-정션 단백질인 코넥신 43에 특이적인 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드를 적용하는 것은 손상의 확산을 차단하고 염증성 반응 및 이후의 반흔 형성을 감소시킨다. 본 발명자들은 본 발명의 안티센스 접근법을 이용하여 확립된 손상에 대한 복구 전략을 정교하게 하기 위해 척수 절편 및 손상되지 않은 척수에 대한 생체외 배양액 모델을 추가로 개발하였다.
척수를 P7-P14 래트 새끼로부터 절개하고, 꼬리, 가슴 및 주둥이 절편으로 나누었다. 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드를 플루론산 겔에 넣고 배양액에 넣어 둔 동안 척수 절편의 말단을 절단하였으며, 그 결과 24 내지 48 시간 동안 코넥신 43 단백질 수준이 감소하였으며 조직 이용가능성이 유의하게 개선되었다. 팽창이 발생하지 않는다는 것이 가장 즉각적이고 두드러지게 관찰되었다(도8 A 내지 B, 배양액에 넣은지 24시간 후의 척수 절편을 나타냄). 이러한 처리는 말단이 절단된 척수로부터의 확장을 차단한다. 처리된 샘플의 회색질에서 뉴런의 생존이 증가한 것은, 톨루이딘 블루-염색 수지 절편에서 명백하게 입증되었다(도 9A). 이와는 반대로, 도 9B에서는 대조군 조직(아무것도 처리하지 않은 조직, 겔만 처리한 조직 또는 겔과 무작위적인 올리고데옥시뉴클레오티드를 처리한 조직) 전체에서 뉴런의 부종 및 액포 형성이 관찰되었다.
20일까지의 후속 표지 및 면역조직화학 연구는 처리된 척수 절편(뉴런-N 표지)의 뉴런이 이 기간 동안 생존하는 반면, 대조군 절편에서는 최소 3일 후에도 거의 남아있지 않다는 것을 보여준다. 이소렉틴(Isolectin)-B4 표지는 배양액에서 5일 이내에 발생한 대조군 절편의 광범위하게 활성화(대식세포 형질)된 소교세포의 침윤을 보여준다. 처리된 샘플에서, 활성화된 소교세포는 외부 모서리로 한정된다(백색질 축색관이 이미 최첨단에서 절단되어 있음). 그 중에서도, 뉴런 프로세싱에 대한 마커인 MAP-2 표지는, MAP-2 표지를 전혀 나타내지 않은 대조군 절편에 비해 처리된 절편에서의 유의한 재생 잠재성을 나타낸다(도10 A 내지 B).
실시예 V
척수 손상부를 가로지르는 말초 신경 이식
말초 신경 이식을 위해, 본 발명자들은 이식하는 시점에 조직을 코넥신 43 특이적인 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드로 다시 처리하여 이식 부위로부터 손상의 확산을 예방하고, 숙주 조직 뉴런 집단으로부터의 이식편 단리를 유도하는 소교세포 활성화(뉴런 복구를 제한함)를 예방한다.
말초 신경 이식:
척수 절편을 35 mm 접시의 배양 삽입물(밀리포어 밀리셀; Millipore Millicell) 상에 놓고, 배양 배지의 수준을 절편에 미니스커스(miniscus)가 형성될 때까지 상승시켰다. 30％ 플루로닉 겔 중의 코넥신 43 특이적인 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(30량체, 1 μM 농도)를 척수 조직 바로 위에 놓았다. 상기 겔을 생리학적 온도로 가온되고 안티센스 올리고머를 지속 방출하도록 세팅하였다. 이러한 처리는 24 내지 48 시간 동안 코넥신 43 단백질 수준을 감소(최대 감소 시간: 처리후 6 내지 8시간)시켰다. 배양액에서 안정화시킨 후에 절개 외상에 다시 노출시킨 상기 척수 절편은, 손상부 확장 및 절단된 영역으로의 조직 팽창을 비롯한 생체내 수술 중재에서와 동일한 징후를 나타낸다. 이 효과는 절개시 코넥신 43 특이적인 안티센스 올리고머로 처리함으로써 예방될 수 있고, 이에 따라 절단된 모서리는 명백한 부종 또는 조직 팽창 징후없이 뚜렷한 윤곽으로 남아 있다.
절편을 말단과 말단 사이에 1 내지 5 mm 갭을 두고 분리시켜 올려 놓았다. 배양액에서 1 내지 3일 동안 안정화시킨 후에, P7-P14 래트 새끼로부터의 좌골 신경 이식편을 상기 갭 상에 가로질러 놓았다. 선행 연구는 좌골 신경(또는 그의 복재 분지)(문헌 [Yick, L. W. et al., 1999, Exp Neurol. 159:131-138]; [Aguayo, A. J. et al., 1981, J. Exp. Biol. 95:231-240]) 또는 늑간 신경(문헌 [Cheng, H., et al., 1996, Science, 273:510-513]) 이식 둘 모두가 축색 신장 및 뉴런의 생존을 유도하는데 상당히 효과가 있음을 나타내었다.
이식 바로 후에, 코넥신 43 안티센스 올리고머로의 재처리를 개시하고, 이후 며칠에 걸쳐 뉴런 거동의 평가를 수반한다. 이식 후의 배양 기간은 생체내 연구(수술후 15 일 내지 7 개월)에 비해 상대적으로 단기간(15일 이하)이기 때문에, 하기에 상세히 설명하는 (결과 측정) 다양한 복구 반응 평가용 마커를 사용한다. 실험은, 뉴런 증식 및(또는) 이동을 유도하는 작용을 할 수 이는 외생 성장 인자(예컨대, 산성 FGF 또는 NGF)를 첨가하거나 첨가하지 않고 수행한다.
실시예 VI
말단 대 말단으로 위치한 절편들 사이로 슈반 -세포- 시딩된 이식편의 삽입
처리된 절편들 사이의 이식편에 대해, 축색 재생의 강력한 촉진인자임이 밝혀진 슈반(Schwann) 세포를 선별하였다 (문헌 [Xu, X. M. et al., 1999, J. Neurosci. 11:1723-1740]; [Keirstead, H. S. et al., 1999, Exp. Neurol. 159:225-236]).
이식된 세포는 중추 신경계 축색 재생을 허용하는 환경을 제공할 수 있고, 축색의 재생을 유도하는 데 효과적임이 입증되었다. 말단 대 말단으로 위치한 척수 절편들 사이에 있는 슈반-세포-시딩된 미니-채널 이식편 또는 마트리겔(matrigel)을 본 출원에서 사용한다. 본원에서의 원리는, 척수 복구 중재를 위해 반흔 조직을 절개하고 그 공간을 이식물로 채워 넣는 것을 궁극적으로 원한다는 것이다. 사용된 방법은 문헌 [Morrissey, T. K. et al., 1991, J. Neurosci. 11:2433-2442] 및 [Xu, X. M. et al., 1995, J. Comp. Neurol. 351:145-160]에 기재되어 있다. 본질적으로, 좌골 신경은 성체 래트로부터 얻고, 이후에 신경상막(epineurium) 및 연결 조직을 분리하여 1 mm 길이의 이식체를 둘벨코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM-Gibco, 미국)와 함께 배양액에 넣는다. 이주 세포의 성장물은 주로 섬유아세포이고, 이식체는 이들이 전면생장(confluency)에 도달할 때 새로운 접시로 옮긴다. 나타나는 세포가 주로 슈반 세포가 될 때까지 3회 내지 5회 계대에 걸쳐 상기 과정을 반복한다. 이들을 해리시키고, 공중합체 또는 마트리겔 안내 채널로 시딩하기 위해 성장시킨다 (Schmidt, C. E. and Baier Leach, J., 2003, Ann. Rev. Biomed. Eng. 5:293-347). 일단 이식물이 제조되면, 배양된 절편은 말단이 다시 절단되어 반흔 절개를 흉내낼 것이며, 이를 그 사이에 이식물을 끼워 넣어 말단 대 말단으로 위치시킨다. 이식 바로 후에, 샘플을 코넥신 43 안티센스 올리고머로 재처리하고, 이후 며칠에 걸쳐 뉴런 거동을 모니터링한다.
측정 결과
말초 이식편 및 이식체 둘 모두에 대해 시간 경과에 따른 실험을 수행하여 이식 조직에 대한 즉각적인, 후속적인 또는 연속적인 반응이 있는지 결정하였다. 몇가지 마커를 사용하여 뉴런 반응 및 복구 잠재성을 평가하였다. 이는 뉴런(뉴런-N에 대한 항체), 신경섬유(MAP-2 및 SMI-31에 대한 항체) 및 세포질 마커(CMFDA), 및 막 염료(Di-I 또는 축색 그리스 - Molecular Probes, 미국 오레곤)를 포함한다. 뉴런 증식의 증가, 축색 이동 거리(결합 길이 대 이동 거리의 비율)의 증가, 및 이식편을 향하거나 이를 가로질러 성장하는 축색 수의 증가를 특별히 모니터링하였다. 세포 특이적인 마커(성상세포의 경우에는 GFAP, 소교세포의 경우에는 이소렉틴-B4, 및 슈반 세포의 경우에는 S-100). 신경교세포 분포 및 밀도, 및 수초화 수준을 평가하였다. 항-CGRP(말초 신경 마커)를 사용하여 척수 절편으로부터 재생된 것과 마주보는 말초 신경 기원의 축색들을 구별하였다. GAP-43(성장 관련 단백질) 항체를 사용하여 뉴런 성장 추상체를 확인하였다. 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 염색된 세미틴(semithin) 절편 및 이식 절단면의 전자 현미경 관찰을 형태학 분석에 이용하였다.
2차 항체를 알렉사(Alexa) 염료와 접합시켰다. 이중 또는 삼중 표지를 위해, 본 발명자들은 적절한 경우에 제논(Zenon) 프로브(Molecular Probes, 미국 오레곤주)를 사용하였다. 모든 항체 및 염료 표지는 오클랜드대학 생의학 영상화 연구 유닛(The University of Auckland's Biomedical Imaging Research Unit)의 레이카 TCS 4D 및 SP2 공초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 분석하였다. 전자 현미경 관찰은 히타치(Hitachi) H-7000 전자 현미경 상에서 수행하였다. 영상 분석 프로그램(AnalySIS 또는 NIH Image J)을 이용하여 대조군과 처리된 이식편 사이의 차이를 정량하였다.
실시예 7 - 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 설계
물질
본원에 사용된 물질은 당업계에서 인식되고 있는 항체 및 플라스미드, 예를 들어 래트 코넥신 43(T7291) 및 코넥신 26에 대한 플라스미드; 마우스 코넥신 43 및 코넥신 26에 대한 플라스미드(인비보겐, 미국), 마우스 항-래트 코넥신 43 및 토끼 항-래트 코넥신 26(Zymed; 51-2800); 및 염소 항-마우스 알렉사(Alexa) 488 및 염소 항-토끼 알렉사 568 2차 항체(몰레큘라 프로브스, 오레곤주 유진)를 포함한다. 핵을 훽스트 33258 염료(시그마)를 사용하여 염색하였다. 모든 데옥시리보자임 및 올리고데옥시뉴클레오티드는 탈염된 올리고머로서 시그마 제노시스(호주)로부터 구입하였다. TaqMan 표지된 올리고머는 미국의 어플라이드 바이오시스템즈사로부터 구입하였다. 모든 올리고데옥시뉴클레오티드는 변형되지 않은 포스포디에스테르 올리고데옥시뉴클레오티드로 구입하였다.
데옥시리보자임 설계
데옥시리보자임 설계 및 시험 방법은 선행 연구에 기재된 방법과 유사하였다(문헌 [Santoro, S. W. and Joyce, G. F. Proc. NatlAcad. Sci. USA,(1997), 94, 4262-4266] 및 [Cairns, M. J. et al.,(1999) Nat. Biotech 17, 480-486]). 요컨대, 표적 코넥신 mRNA 서열 내의 모든 AU 및 GU 부위를 각 측면의 A 또는 G 상에서 8 또는 9개의 뉴클레오티드로 선별하였다. 데옥시리보자임은 "A" 또는 "G"가 "10-23" 촉매적 중심 "ggctagctacaacga"로 교체된 상기 센스 코딩 서열의 상보체이다. 대조군 데옥시리보자임은 단일 점 돌연변이유발(g→A)된 결손 촉매적 중심 "ggctaActacaacga"를 갖는다(문헌 [Santoro, S. W. and Joyce, G. F. Biochem 37, 13330-13342]). 또한, 본 발명자들은 하기 3가지 요구사항을 만족시키지 않는 AU 및 GU 데옥시리보자임에 의해 남겨진 갭을 채우기 위한 GC 및 AC 특이적인 데옥시리보자임을 설계하였다. 각각의 데옥시리보자임은 개시 ATG 코돈으로부터의 "A" 또는 "G" 뉴클레오티드의 위치에 따라 명명하였다. 시험관내 분석을 위해 선별된 데옥시리보자임은 하기 3가지 요구사항을 충족시켜야 한다:
(1) 열 안정성: 선택된 데옥시리보자임은 안정한 2차 구조인 헤어핀 루핑 또는 동종이량체를 형성하지 말아야 한다. 37 ℃를 초과하는 융점에서 헤어핀 또는 동종이량체가 형성되는 임의의 데옥시리보자임은 생리학적 온도에서 표적 서열에 결합하지 못하는 것으로 간주하여 배제하였다.
(2) 친화성: 결합 아암 둘 모두의 총 AG 값은 -30 Kcal를 넘지 말아야 한다. 각각의 개별 결합 아암은 -10 내지 -15 kcal이다. 결합/누락 프라이밍(보다 높은 CG 함량에 의함)의 특이성과 데옥시리보자임에 대한 효과적인 결합/턴오버 속도 사이에는 상반 관계가 있다. 절단 부위의 측면 결합 아암 길이를 조정하여 이상적인 ΔG 값을 찾고, 단계(1)을 반복하여 이를 확인하였다.
(3) 특이성: 모든 표적 결합 서열은 특이성 확인을 위해 진 뱅크에서 BLASTn 검색을 수행하였다(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/). 다른 코넥신 유전자 또는 다른 공지된 설치류 유전자에 대해 상동성을 갖는 데옥시리보자임은 배재하였다.
데옥시리보자임의 시험관내 시험
마우스 코넥신 43 및 코넥신 26 cDNA를 pORF 벡터(인비보겐)로부터 NcoI 및 NheI으로 절단하여, pGEM-T(프로메가)에 서브클로닝한 후에 시험관내 전사시켰다. 전장 2.4 kb 래트 코넥신 43 cDNA, 및 5' 비-번역 영역의 200개의 뉴클레오티드를 포함하는 전체 코딩 1.4 kb 래트 코넥신 43 cDNA를 사용하여 시험관내 전사시켰다. 전장 mRNA를 프로메가 리보프로브 키트를 이용하여 선형화된 플라스미드 DNA로부터 전사시켰다. 생성된 mRNA를 PCR 스핀 컬럼(키아젠)으로 정제하였다. 260 nm에서의 OD를 판독하는 분광광도계에 의해 농도를 측정하였다. 이어서, 데옥시리보자임(40 μM 최종 농도) 및 mRNA(0.01 내지 0.05 ㎍/㎕ 총 mRNA)를 개별적으로 37 ℃에서 5 내지 10 분 동안 2x 절단 완충액(100 mM Tris 7.5; 20 mM MgCl2; 300 mM NaCl; 0.02％ SDS)을 사용하여 미리 평형화시켰다. 이어서, mRNA 및 데옥시리보자임 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후에 1Ox 블루주스(Bluejuice; 인비트로젠)를 첨가하여 절단 반응을 중단시키고, 혼합물을 얼음 위에 놓았다. 이어서, 반응 혼합물을 1x TBE 완충액 및 7M 우레아 중에서 미리-작동시킨 4％ 폴리아크릴아미드 겔(19:1 아크릴:비스 비율, 바이오라드(BioRad))에 로딩하고, 2 시간까지 작동시켰다. 겔을 TBE 완충액 중 SYBR 그린 II(몰레큘라 프로브스, 미국)의 1:10 000 희석액으로 염색하고, 바이오레드 케미 닥(BioRad Chemi Doc) 시스템을 이용하여 영상화하였다.
안티센스 올리고머의 설계
안티센스 서열을 시험관내 mRNA 절단에 성공한 데옥시리보자임 결합 아암의 20개의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 선택하였다. 선별된 서열을 30량체 올리고의 설계에 사용하기 위해 선택하였다(문헌 [Brysch, W.(1999). Antisense Technology in the Ventral Nervous System, ed. H. A. Robertson; Oxford University Press 21-41] 및 [Walton S., et al., (2002) Biophysical Journal 82, 366-377]). 요컨대, 서열 관련 부작용, 예컨대 관련되지 않은 유전자에 대한 8 내지 10개의 CG 염기쌍의 부분적인 서열 상동성, 즉 GGGG 및 CpG 모티프를 방지하였다. 가능하다면, 프라이밍 누락을 방지하기 위해 마지막 5개의 뉴클레오티드 중에 티미딘 또는 3개 초과의 C 또는 G로 끝나는 3'-말단을 갖는 안티센스 서열도 피하였다. 안정한 2차 구조, 예컨대 동종이량체, 양쪽대칭(palindrome) 모티프 또는 2차 헤어핀 구조를 형성하는 올리고머는 표적 mRNA에 대한 올리고머의 결합을 방해할 것이다. 또한, 센스, 무작위적으로 혼합된(scrambled), 역 및 미스매치 올리고머를 비롯한 대조군 올리고머를 설계하여 교차 혼성화, 비특이적인 단백질 결합 및 독성에 의한 가능한 화학 관련 부작용을 평가하였다.
각막 기관 배양 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리
생후 30 내지 34일 된 위스타 래트를 이산화탄소로 안락사시키고, 래트 눈 전체를 절개하였다. 안구 표면을 절개하고, O.1 mg/ml 페니실린-스트렙타마이신으로 5 분 동안 소독하고, 멸균 PBS에서 세정하였다. 이어서, 눈 전체를 각막이 위로 향하게 하여 60 mm 배양접시 중의 멸균 홀더로 옮겼다. 눈을 각막 상피가 공기-배지 경계면에 노출되도록 탑재하고, 습윤된 5％ CO2 인큐베이터에서 혈청 무함유 배지(Opti-MEM, 인비트로젠) 중에 48 시간까지 34 ℃에서 배양하였다. 배지 100 ㎕를 매 8 내지 12시간 마다 표면에 적가하여 상피를 적셨다. 배지 수준을 가장자리 결막 수준으로 유지시켰다.
안티센스 올리고머를 얼음 상에서 30％(중량/중량) 플루론산 F127 겔(시그마)과 최종 2 μM 농도로 혼합하여, 10 ㎕를 앞서 기재한 바와 같이 각막에 투약하였다(문헌 [Becker, D. L., et al.,(1999b) Dev. Genet. 24:33-42]; [Green, C. R., et al.,(2001), Methods Mol Biol 154, 175-185] 참조). 각 처리시 샘플의 크기는 실험 당 3 내지 4개의 각막이었다. 예비 실험은 본 발명의 양성 대조군인 DB1을 8 시간 동안 이중 처리하는 것이 본 발명의 각막 배양액에서의 코넥신 43 단백질 발현에 거의 영향을 끼치지 않는다는 것을 보여준다. 이에 따라, 각막을 24 시간 동안 배양하고, 코넥신 43 특이적인 올리고머를 8 시간 마다 투약하였다. 그러나, 본 발명자들은 24 시간 동안 계속 배양하면 내생 코넥신 26의 발현이 영향을 받는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 코넥신 26 특이적인 올리고머 처리된 각막에 대한 배양 시간을 12 시간으로 감소시키고, 4 시간 마다 안티센스 올리고머를 투약하였다. 배지는 안티센스 또는 대조군 올리고머를 다시 투약할 때마다 그 10 분 전에 교체하였다. 정해진 시간에서, 각막을 PBS로 세정하고, OCT(Tissue Tek, 일본)에 침치시키고, 액체 질소에서 순간-동결시켰다. 그 후에 25 ㎛의 동결된 절편을 레이카 저온유지장치(CM3050)로 절단하고, 슈퍼프로스트 플러스(SuperFrost Plus) 슬라이드(멘젤(Menzel), 독일) 위에 올렸다. Cx43 및 Cx26 mRNA 둘 모두를 분석하기 위해, 단일 안티센스 처리 8 시간 후에 각막을 수집하였다.
RNA 단리 및 실시간 PCR
전체 RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약(GIBCO, 인비트로젠, 미국)을 사용하여 단리된 래트 각막으로부터 추출하였다. RNA 샘플의 특성을 에티듐 브로마이드 염색된 아가로스 겔을 통한 전기영동에 의해 평가하고, UV를 조사하여 18S 및 28S rRNA 밴드를 가시화시켰다. 추출 수율을 260 nm에서 분광광도계로 정량하였다. 실시간 PCR을 위해, 20㎕의 최종 반응 부피에서 올리고 dT 및 수퍼스크립트(superscript) II Rnase H-역전사효소(라이프 테크놀로지스, 인비트로젠, 미국)를 사용하여 총 5 ㎍의 RNA로부터 cDNA를 제조하였다. 정량적 PCR 반응은 TaqMan 유니버셜 PCR 마스터 믹스(Universal PCR Master Mix; 어플라이드 바이오시스템즈, 미국)를 제조자의 지시에 따라 이용하여 50 ㎕ 부피로 각각의 샘플에 대해 RNA 총 100 ㎍의 cDNA 동등물을 사용하여 96-웰 광학 반응 플레이트에서 수행하였다. PCR을 ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템 기기(어플라이드 바이오시스템즈, 미국)에서 진행하였다. 열 순환 조건은 제조자의 표준 프로토콜을 이용하여 95 ℃에서 10 분 동안 초기 변성시키는 단계, 및 95 ℃에서 15초 동안 변성시키고 60 ℃에서 1 분 동안 어닐링-신장시키는 2-단계 PCR을 50회 반복하는 것을 포함한다. 모든 실험은 3회 반복하였다. 각각의 표적에 대한 음성 대조군을 모니터링한 결과 잔류물을 없는 것으로 나타났다.
18S rRNA의 증폭을 표준화될 수 있는 다른 RNA 값에 대한 내부 기준으로 사용하였다. 표적 및 18S rRNA의 증폭 효율이 대략 동일하다면, 표준 곡선이 필요없는 표준 2-ΔΔCt를 이용하여 mRNA의 상대적인 수준을 계산하였다. 표적 및 18S rRNA의 증폭 효율이 유의하게 상이하다면, 상대적인 표준 곡선 방법을 이용하여 측정된 Ct로부터 각 실험에 있어서 mRNA 및 18S rRNA의 절대량을 계산하고, 이어서 18S rRNA에 대해 표준화시킨 후에 표적 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 정량된 대조군과 비교하였다.
모든 계산은 프리즘(PRISM) 3.02 소프트웨어(GraphPad, 샌 디에고)를 이용하여 계산하였다. 처리군 사이의 통계학적인 차이를 스투던트 t 시험을 이용하여 측정하였다. 여러개 처리 사이의 비교를 ANOVA에 의해 수행하고, 그 유의성을 던네트(Dunnett) 다중 비교 시험을 이용하여 계산하였다.
안티센스 올리고머의 번역 차단에 대한 효율 평가
Cy3 및 TaqMan(Fam, Tamra) 표지된 올리고머를 사용하여 침투 및 안정성을 평가하였다. Cy3-표지된 올리고머(시그마 제노시스) 및 TaqMan(FAM, TAMRA) 표지된 올리고머(어플라이드 바이오시스템즈)를 플루론산 겔과 함께 적용하여 안정성 및 올리고머의 각막 상피로의 침투 둘 모두를 측정하였다. 처리된 각막을 4％ 파라포름알데히드에서 20 분 동안 고정시키고, 1％ 아가에 탑재하고, 40x 수침 렌즈 하에서 전체를 관찰하였다. 올리고머의 침투 깊이를 레이카 SP2 공초점 현미경 상에서 Z-주사 옵션, 및 측정된 z-거리 대 강도의 플롯을 이용하여 측정하였다. TaqMan 올리고머의 분해를 공초점 상에서 람다 주사 옵션을 이용하여 측정하였다. FAM(공여자) 및 TAMRA(수용체) 분자 사이의 형광 공명 에너지 수송(FRET)이 손상되지 않은 30량체 올리고머에서 발생하였다. 올리고머가 분해되면 FAM 및 TAMRA가 더이상 근접해있지 않고 FRET도 더이상 발생하지 않았다.
면역형광 표지
각막 절편 상에서의 코넥신 면역표지를 앞서 기재한 바와 같이 수행하였다. 요컨대, 절편을 10％ 염소 혈청에서 차단시키고, 1:250(마우스 항-래트 코넥신 43) 또는 1:500(토끼 항-래트 코넥신 26)의 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 절편을 PBS로 세척하고, 실온에서 2 시간 동안 알렉사 488 표지된 2차 항체의 1:400 희석액과 함께 인큐베이션한 후에 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.2 μM 프로피듐 요오다이드 또는 훽스트 33258의 1:50 희석액으로 10 분 동안 대조염색시켰다. 절편을 시티플루오르 안티페이드(Citifluor antifade) 배지(아가사이언티픽 유케이; Agarscientific UK)에 탑재하였다. 레이카 TCS-4D 또는 레이카 SP2 공초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 모든 영상을 수집하고, TIF 파일로 보관하였다. 일정한 전압(520 내지 540V) 및 오프셋(-2) 세팅을 이용하여 모든 영상을 수집하였다. 전압과 오프셋은 대조군 조직의 영상에 대한 그레이 스케일이 최대가 되도록 글로-오버-언더 디스플레이 옵션(glow-over-under display option)을 이용하여 세팅하였다. 이어서, 동일한 실험에서 모든 샘플에 동일한 셋팅을 사용하였다.
정량을 위해, 3 ㎛를 관통하는 4개의 광학 슬라이스를 TCS 4D 상에서 질량 분포 투영 옵션 센터를 이용하여 단일 확장된 초점 광학 영상으로 프로세싱하였다. 코넥신 표지의 스팟을, 256 그레이 스케일 영상에서 90 내지 100 화소 강도를 역치로 한 후에 NIH 영상(사이온 코포레이션)을 이용하여 계수하였다. 또한, 각막 상피 면적도 측정하고, 단위 면적 당 코넥신 밀도를 계산하였다. 4개의 확장된 초점 영상의 평균을 사용하여 각 각막의 절대 코넥신 밀도를 계산하였다. 이어서, 이 수치를 값을 센스 대조군 처리된 각막 또는 겔 처리된 각막의 중간 코넥신 밀도로 표준화하였다. 본 발명자들은 상기 데이터를 상이한 처리와 비교하였을 때의 넉-다운 비율로 나타내었다.
데옥시리보자임의 선택적인 시험관내 mRNA 절단
66개의 데옥시리보자임을 특히 설치류 코넥신 43 mRNA에 대해 설계하였다(표 5). 상기 데옥시리보자임 중 22개는 마우스 및 래트 코넥신 43 mRNA 둘 모두를 인식하도록 설계하였다. 또한, 본 발명자들은 음성 대조군으로서 "10-23" 촉매적 중심에서 단일 점 돌연변이유발된 2가지 결손 데옥시리보자임을 구입하였다. 데옥시리보자임 절단 결과는 1.1 Kb 길이의 래트 코넥신 43 mRNA(도시하지 않음) 및 2.4 Kb 길이의 래트 코넥신 43 mRNA(도 11A)의 경우와 유사하였다. 래트(도 11A) 및 마우스(도 11B) 코넥신 43 mRNA 둘 모두는 데옥시리보자임이 용이하게 접근할 수 있는 유사한 영역을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 데옥시리보자임 절단에 대해 노출되고 용이하게 이용가능한 설치류 코넥신 43 mRNA 상의 4개의 영역을 나타낸다. 이들 영역은 개시 ATG 코돈으로부터 367 내지 466, 526 내지 622, 783 내지 885 및 1007 내지 1076번째 염기 주위에 존재한다. 2가지 결손 데옥시리보자임인 aldf605 및 aldf783은 설치류 코넥신 43 mRNA를 절단하지 않는 것으로 나타났다. 래트 코넥신 43 mRNA의 5' 비-번역 영역의 200개의 염기쌍에 대해 설계된 데옥시리보자임 또한 임의의 절단 활성을 나타내지 않았다.
Figure 112006047308013-PCT00022
표 5는 생체내 분석(mRNA 및(또는) 단백질 수준)을 위한 시험관내 리보자임 절단 연구 또는 결손 리보자임 대조군(서열 56 및 서열 59)을 정상 리보자임과 비교하는 시험관내 리보자임 절단 연구에 기초하여 선별된 리보자임 및 안티센스 서열을 보여준다.
올리고머 명칭이 접두어 r43을 포함하면 이들은 래트 코넥신 43에만 특이적인 것임을 나타내며, 접두어 al은 마우스와 래트 둘 모두에 대해 특이적임을 나타낸다. 모든 올리고머 서열은 변형되지 않은 포스포디에스테르올리고데옥시뉴클레오티드이다. "ggctagctacaacga"는 데옥시리보자임의 "10-23" 촉매 중심을 나타내며, "ggctaActacaacga"는 결손 돌연변이 대조군이다. DB1은 as885의 30량체 형태이며(소문자로 표시함), DB1s는 DB1 서열의 센스 대조군이다. 시험관내 효과를 개별 데옥시리보자임에 의한 mRNA 절단 비율로 측정하였다. 생체내 효과를 각막 절편에서의 코넥신 43의 면역표지(도 15 참조) 또는 유효 mRNA 수준의 실시간 PCR 평가(도 16 참조)에 의해 측정하였다. +++는 75％ 초과, ++는 50％ 내지 75％, +는 25％ 내지 50％, -는 0％ 내지 25％의 mRNA의 시험관내 절단 또는 단백질 및 mRNA 발현의 생체내 감소를 의미한다. up은 DB1 센스 또는 겔만의 대조군 처리에 비해 코넥신 43 단백질 발현이 증가했음을 의미한다.
또한, 본 발명자들은 설치류 코넥신26 mRNA에 대해 특이적으로 설계된 44개의 데옥시리보자임을 시험하였으며(표 6), 이 중 17개의 데옥시리보자임이 마우스 및 래트 코넥신 26 mRNA 둘 모두와 일치하였다. 래트 코넥신 26 mRNA는 클로닝 플라스미드 상에 2가지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터가 존재하기 때문에 이중 밴드로 나타난다. 절단 결과는 코넥신 26 mRNA가 318 내지 379 및 493 내지 567 염기 영역에 데옥시리보자임에 접근하기 쉬운 영역을 둘 이상 갖는다는 것을 보여준다(도 12A, 12B). 상기 도면은 가장 일관적으로 절단하는 데옥시리보자임이 cx26dz330이라는 것을 보여주며, 이는 1시간 이내에 mRNA의 두가지 종을 모두 절단한다. 2가지 결손 데옥시리보자임(b2df351 및 b2df379)은 설치류 코넥신 26 mRNA를 절단하지 않는다. 데옥시리보자임 cx26dz341, dz351, dz375, dz379는 마우스 코넥신 26 mRNA에 비해 보다 높은 비율로 래트 코넥신 26 mRNA를 일관적으로 절단한다. 한편, mcx26dz153 및 dz567은 래트와 비교하였을 때 마우스에서 보다 우수한 코넥신 26 데옥시리보자임인 것으로 나타났다.
Figure 112006047308013-PCT00023
표 6은 생체내 분석(mRNA 및(또는) 단백질 수준)을 위한 시험관내 리보자임 절단 연구 또는 결손 리보자임 대조군으로 이용되는 시험관내 리보자임 절단 연구에 기초하여 선별된 시험관내에서 mRNA를 일관적으로 절단하는 상기 리보자임 및 안티센스 서열은 보여준다. 올리고머 명칭은 이들이 각각 마우스 또는 래트 코넥신 26 mRNA에만 특이적인 경우에는 접두어 m26 또는 r26을 갖고, 접두어 b2는 이 두 종 모두에 대한 특이성을 나타낸다. 모든 올리고머 서열은 변형되지 않은 포스포디에스테르올리고데옥시뉴클레오티드이다. "ggctagctacaacga"는 데옥시리보자임의 "10-23" 촉매적 중심을 나타내고, "ggctaActacaacga"는 결손 돌연변이 대조군이다. 또한, 역 대조군(rv)을 이용하여 안티센스 올리고머의 임의의 비-특이적인 효과를 제어하였다. 생체내 효과를 각막 절편에서의 코넥신 26의 면역표지 및 표적 mRNA 발현의 실시간 PCR에 의해 측정하였다(도 17 참조). +++는 75％ 초과, ++는 50％ 내지 75％, +는 25％ 내지 50％, 및 -는 0％ 내지 25％의 시험관내 mRNA 절단 또는 단백질 및 RNA 발현의 생체내 감소를 의미한다.
각막 상피를 침투할 수 있는 플루론산 겔에서 형광 표지된 ODN
래트 각막은 기관 배양액에서 코넥신 43 및 코넥신 26 둘 모두를 발현시키며, 30％ 플루로닉 F-127 겔에 의한 안티센스 올리고머의 전달에 용이하게 이용할 수 있다. 이에 따라, 래트 각막 기관 배양액을 모델 시스템으로 선택하여 시험관내 모델로부터 유래된 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 설계의 유효성을 시험한다. 본 발명자들은 래트 각막을 24 시간 동안 배양하고, 내피가 그대로 유지되는 것을 발견하였다. 그러나, 배양 시간이 48 시간보다 길어지면 각막이 불투명해지는 것으로 나타나 48시간이 넘는 배양 시간을 이용하지 않고 있다. Cy3 표지된 올리고머를 사용하여 올리고머의 배양된 각막으로의 침투 정도를 측정하였다. 도 13A에서의 형광 신호가 CY3 표지된 올리고머에 존재함으로 보여주는 손상되지 않은 각막을 통한 공초점 광학 슬라이스 저하는 처음 처리한지 1 시간 후에 배양된 각막의 10 ㎛ 깊이에서 형광 신호를 나타내었다. 올리고데옥시뉴클레오티드에 접합된 TaqMan 프로브를 사용하여 30％ 플루론산 겔을 갖는 손상되지 않은 올리고데옥시뉴클레오티드의 각막 상피로의 전달을 측정하고 입증하였다. 유의한 비율의 올리고머가 처리 1 시간 후에 손상되지 않은 상태로 남아있었다(도 13B, 13C). 손상되지 않은 올리고머의 반점 신호(도 13℃에서 FRET가 발생함)는 적색(그레이-스케일로 나타냄) 파장으로 관찰될 수 있고, 분해되는 올리고머로부터의 신호는 녹색(그레이-스케일로 나타냄) 방출 스펙트럼(도 13B)으로 나타난다.
각막 상피에서 코넥신 43 단백질을 넉-다운시킬 수 있는 ODN 을 예측하는 데 옥시리보자임 분석
예비 실험에서, 본 발명자들은 양성 대조군 DB1을 단일 투여하여 래트 각막을 처리하였으며, 8 시간 후에 코넥신 43 단백질 발현에 유의한 변화가 나타나지 않음을 알게 되었다. 8 시간 간격으로 3회 투여한 후에 24 시간에서 명백한 단백질 넉-다운이 관찰되었다. 일부는 데옥시리보자임 절단 분석으로부터의 결과에 기초하여, 본 발명자들은 특정 안티센스 올리고머(DB1, r43as605, r43as783, r43as885, r43as953 및 r43as1O76)와 안티센스 올리고머(비-기능성일 것으로 예상됨; r43as14, r43as769 및 r43as892), 및 음성 대조군(DB1 센스)에 대한 생체내 시험을 수행하였다. 본 발명자들은 양성인 것으로 결정된 모든 안티센스 올리고머(도 14C, 14E, 14G)가 처리한지 24 시간 후에 대조군(도 14A)에 비해 코넥신 43 단백질 수준이 넉-다운된 것을 발견하였다. 음성일 것으로 예상된 상기 3가지 올리고머 모두와 음성 대조군 올리고머는 코넥신 43 발현에 영향을 끼치지 않는다(도 14B, 14D, 4F, 4H). DB1(as885의 30량체 형태)은 유사한 비율(50％ 넉-다운 바로 아래)로 보다 짧은 as885로 넉-다운되는 것으로 나타났다. 이 실험에서 확인된 보다 양호한 안티센스 올리고머 중 하나는 단백질 수준이 64％ 감소한 as605로 나타났다. 상기 정량된 결과를 요약하여 도 15에 나타내었다.
다른 코넥신에 대한 기술을 시험하기 위해, 추가의 올리고데옥시뉴클레오티드를 설계하여 코넥신 26에 대해 시험하였다. r26as330N 및 375N으로 설계된 2개의 30량체 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드를 이들의 적절한 역 대조군 올리고데옥시뉴클레오티드와 함께 b2dz330 및 b2dz375의 절단 면적 내 영역 상의 코넥신 26 염기에 대해 설계하였다. 본 발명자들은 그러나 상기 실험에서 안티센스 올리고머 처리된 배양액을 역 대조군 처리된 각막과 비교하였을 때 상기 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(as330N 및 as375N)가 12 시간 이내에 단백질 발현에 있어 유의한 차이가 나타내지 않았다.
안티센스 ODNS 에 의한 코넥신 43 및 코넥신 26 mRNA 의 감소
실시간 PCR을 이용하여 mRNA 수준에 대한 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드의 효과를 측정하였다. 코넥신 43 단백질 발현을 넉-다운시키는 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(as605, as885, DB1)는 또한 처리후 8 시간 이내에 대조군 각막에 비해 보다 낮은 코넥신 43 mRNA 수준을 갖는 것으로 확인되었다(도 16). 코넥신 43 mRNA의 상대적인 수준의 감소 비율은 코넥신 43 단백질의 감소 수준과 서로 관련이 있다. 음성 안티센스 올리고머(as769) 및 음성 대조군(DB1 센스, 겔 단독)은 대조군 각막에 비해 코넥신 43 mRNA의 수준을 변화시키지 않는 것으로 나타났다.
또한, 코넥신 26 mRNA 발현은 안티센스 처리 후 8 시간 이내에 as330N 및 as375N에 의해 유의하게 감소하였다(도 17). as330N에 대한 역 서열 대조군 및 겔 단독 대조군은 mRNA 수준에 영향을 끼치지 않는 것으로 나타났다.
모든 특허문헌, 간행물, 과학 논문, 웹 사이트, 및 본원에서 언급하거나 기술한 기타 문헌과 자료는 본 발명에 속하는 분야의 당업자의 기술 수준을 지시하는 것이며, 이러한 참고 문헌 및 자료 각각은 그 전문이 각각 본원에 포함되거나 그 전문을 본원에 기재하여 도입되는 것과 같은 정도로 본원에 포함된다. 출원인은 이러한 임의의 특허문헌, 간행물, 과학 논문, 웹 사이트 및 전자적으로 이용가능한 정보 및 언급하거나 기술한 자료와 문헌으로부터의 임의의 모든 자료 및 정보를 실제로 본 명세서에 도입할 권리를 갖는다.
본원에 기재된 특정 방법 및 조성물은 대표적인 바람직한 실시양태이며, 이들은 단지 예를 든 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하지는 않는다. 본 명세서를 검토한 당업자에게는 다른 목적, 측면 및 실시양태가 명백할 것이며, 청구범위에서 한정하는 본 발명의 사상에 포함된다. 본 발명의 범위 및 사상에서 벗어나지 않으면서도 본원에 개시된 본 발명에 다양한 변화와 변형을 가할 수 있다는 것이 당업자에게는 매우 명백할 것이다. 본원에 예시적으로 기재된 본 발명은, 본원에서 필수적이라고 특별히 개시하지 않은 임의의 요소(들) 또는 제한(들)없이 적합하게 실시할 수 있다. 따라서, 예를 들어 본원의 각각의 경우에서 본 발명의 실시양태 또는 실시예에 "포함하는", "필수적으로 ~로 구성된" 및 "~로 구성된"이라는 용어 중 어느 것이 사용되었는지 간에, 본 명세서에서는 나머지 2개 용어 중 어느 하나가 그것을 대신할 수 있다. 또한, 용어 "포함하는(comprising)", "비롯한(including)", "함유하는(containing)" 등은 포괄적이고 제한이 없는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 예시적으로 기재한 방법 및 과정은 단계의 순서를 바꾸어도 적합하게 실시할 수 있으며, 이들 단계를 반드시 본원이나 청구범위에 기재한 순서대로 실시하는 것으로 한정되지 않는다. 또한, 본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥상으로 명백하게 지시되는 경우가 아니라면 복수의 개념을 포함하는 것이다. 어떠한 상황에서도 본 특허 출원서가 본원에 구체적으로 개시한 특별한 예 또는 실시양태 또는 방법으로만 한정된다고 해석해서는 안된다. 특허청 및 상표 관리청의 임의의 심사관 또는 임의의 다른 직원 또는 고용인이 무엇이라고 언급하였든지 간에, 출원인이 의견서를 작성하면서 명확하게 조건부나 유보조건 없이 적용된다고 특별히 채택한 것이 아니라면 어떠한 상황에서도 본 특허 출원서가 그렇게 언급된 바대로 한정된다고 해석해서는 안된다.
사용된 용어와 표현은 설명을 위한 것이지 그에 의해 제한되는 용어가 아니며, 그러한 용어와 표현의 사용을 통해 본원에 나타내고 기재한 특징 또는 그의 일부에 대한 임의의 균등물을 배제하려는 의도가 있는 것은 아니지만, 본 발명의 청구범위 내에서 다양한 변형이 가해질 수 있음을 인식해야 한다. 따라서, 본 발명을 바람직한 실시양태를 들어 구체적으로 개시하였지만 본원에 개시한 개념의 임의의 특징, 변형 및 변화는 당업자에게 통상적인 것일 수 있으며 이러한 변형 및 변화는 첨부하는 청구범위에서 한정하고 있는 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주되어야 함을 이해해야 한다.
본원은 본 발명을 포괄적이고 일반적으로 기재하였다. 총괄적인 개시 내용에 속하는 더 좁은 개념과 하위개념 각각도 본 발명의 일부를 이룬다. 이것은, 유사개념에서 임의의 대상을 제외하는 단서조항 또는 부정적인 예외사항을 병기한 본 발명의 총괄적인 기재를 포함하며, 이때 상기한 제외 대상을 본원에서 구체적으로 언급하였는지 여부와는 무관하다.
다른 실시양태를 하기 특허청구범위에 포함된다. 또한, 당업자는 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠시(Markush) 군의 용어로 기재되어 있는 경우에는 본 발명이 그 마쿠시 군의 구성요소 중 임의의 개별 요소 또는 그의 하위군에 해당하는 용어로 기재된 것과 마찬가지임을 인식할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CODA THERAPEUTICS LTD <120> ANTISENSE COMPOUNDS TARGETED TO CONNEXINS AND METHODS OF USE THEREOF <130> E3697-00004 <140> PCT/IB04/004431 <141> 2004-12-03 <150> NZ 529936 <151> 2003-12-03 <160> 65 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtaattgcgg caagaagaat tgtttctgtc 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtaattgcgg caggaggaat tgtttctgtc 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggcaagagac accaaagaca ctaccagcat 30 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tcctgagcaa tacctaacga acaaata 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 catctccttg gtgctcaacc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ctgaagtcga cttggcttgg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ctcagatagt ggccagaatg c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ttgtccaggt gactccaagg 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cgtccgagcc cagaaagatg aggtc 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Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 42 gtaattgcgg caggaggaat tgtttctgtc 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 43 gacagaaaca attcctcctg ccgcaattac 30 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 44 ccaaggcact ccagtcac 18 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 45 tccgtgggac gtgagagga 19 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 46 agtcttttga tgggctca 18 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 47 ttttggagat ccgcagtct 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 48 cacgaggaat tgtttctgt 19 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 49 tttgcggcac gaggaatt 18 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 50 cccatgcgat tttgctctg 19 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 51 gttggtccac gatggctaa 19 <210> 52 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 52 gttgcagagg ctagctacaa cgaaaaatcg g 31 <210> 53 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 53 gttctttagg ctagctacaa cgactctccc t 31 <210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 54 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Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 60 ggtgaagagg ctagctacaa cgaagtcttt tct 33 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 61 ccttaaactc gttctttatc tctcccttca 30 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 62 acttccctct ctatttcttg ctcaaattcc 30 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 63 tacggacctt ctgggttttg atctcttcga 30 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 64 agcttctcta gttttgggtc ttccaggcat 30 <210> 65 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic ODN sequence <400> 65 gtaattgcgg caggaggaat tgtttctgtc 30

Claims (68)

  1. 안과 절차와 병행하여 대상체의 눈 또는 눈과 관련된 세포에서 코넥신(connexin) 단백질의 발현을 억제하기에 충분한 양의 안티센스 화합물을 상기 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 상기 안과 절차와 관련된 조직 손상을 감소시키는 방법.
  2. 대상체의 눈 또는 눈과 관련된 세포에서 코넥신 단백질의 발현을 억제하고 상기 대상체의 눈 또는 눈과 관련된 세포 상에서 세포의 증식, 이동 또는 분화를 조절하기에 충분한 양의 안티센스 화합물을 상기 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, 안과 절차와 관련된 조직 공학(tissue engineering) 방법.
  3. 대상체의 눈 또는 눈과 관련된 세포에서 코넥신 단백질의 발현을 억제하기에 충분한 양의 안티센스 화합물을 상기 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 눈 또는 눈과 관련된 조직에서 상피 세포의 축적을 촉진하는 방법.
  4. 대상체의 눈 또는 눈과 관련된 세포에서 코넥신 단백질의 발현을 억제하기에 충분한 양의 안티센스 화합물을 상기 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 눈 또는 눈과 관련된 조직에서 세포과다형성(hypercellularity)을 억제하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 데옥시리보자임, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, RNAi 분자, siRNA 분자, PNA 분자, DNA자임(DNAzyme) 및 5'-말단-돌연변이유발된 U1 소핵 RNA, 및 이들의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 안과 절차가 엑시머 레이저 광굴절 각막절제술, 백내장 적출술, 각막 이식, 굴절 교정 수술, 수정체 교체 수술, 방사상 각막절개술, 녹내장 여과 수술, 각막이식술, 또는 굴절 교정 또는 수정체 교체를 위한 다른 유형의 수술로부터 선택된 안과 수술인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 서열 1 내지 11로부터 선택된 핵염기 서열을 포함하는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 코넥신 43, 26, 37, 30 및(또는) 31.1 중 하나 이상에 표적화된 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화된 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제2 안티센스 화합물이 상기 대상체의 눈에 투여되며, 여기서 상기 제2 안티센스 화합물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화되고, 상기 제2 안티센스 화합물이 상기 제4항의 안티센스 화합물과 상이한 코넥신에 표적화되는 것인 방법.
  11. 제3항에 있어서, 상기 안티센스 화합물 화합물이 핵염기 15 내지 35개 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 약 12개 이상의 핵염기에 표적화된 것인 방법.
  13. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 약 18개 이상의 핵염기에 표적화된 것인 방법.
  14. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 약 25개 이상의 핵염기에 표적화된 것 인 방법.
  15. 제3항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 서열 1 내지 11로부터 선택된 핵염기 서열을 포함하는 것인 방법.
  16. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 자연 발생 핵염기 및 변형되지 않은 뉴클레오시드 사이의 결합을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  17. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 사이의 결합을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오시드 사이의 결합이 포스포로티오에이트 결합인 방법.
  19. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 하나 이상의 변형된 당 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드인 방법.
  20. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드인 방법.
  21. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물을 국부 또는 국소 투여 방법에 의해 투여하는 방법.
  22. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물을 수술로 인한 창상 부위에 직접 투약함으로써 투여하는 방법.
  23. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물을 안구내 주사에 의해 투여하는 방법.
  24. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물을, 조직 손상을 감소시키거나 치유를 촉진하는 데 유용한 제2 화합물과 함께 사용하는 방법.
  25. 제6항에 있어서, 상기 제2 화합물이 성장 인자 또는 사이토카인인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제2 화합물이 FGF, NGF, NT3, PDGF, TGF, VEGF, BDGF, EGF, KGF, 인테그린, 인터루킨, 플라스민(plasmin) 및 세마포린(semaphorin) 등을 비롯한 성장 인자, 사이토카인 등으로부터 선택된 것인 방법.
  27. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물을 미리 결정된 시간에 투여하는 방법.
  28. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물을 상기 수술 절차를 수행하기 전에 투여하는 방법.
  29. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물을 상기 수술 절차를 수행하는 동안에 투여하는 방법.
  30. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 화합물을 상기 수술 절차를 수행한지 2 시간 후에 투여하는 방법.
  31. 제6항에 있어서, 상기 대상체에서 엑시머 레이저 광굴절 각막절제술 절차와 병행하여 수행되는 것인 방법.
  32. 제6항에 있어서, 안과 수술이 백내장 적출술인 방법.
  33. 제6항에 있어서, 안과 수술이 각막 이식인 방법.
  34. 제6항에 있어서, 안과 수술이 굴절 교정 수술인 방법.
  35. 제6항에 있어서, 안과 수술이 방사상 각막절개술인 방법.
  36. 제6항에 있어서, 대상체의 각막과 관련된 세포에서 치유를 촉진하거나 조직 손상을 예방하는 방법.
  37. 제6항에 있어서, 안과 수술이 녹내장 여과 수술인 방법.
  38. 제6항에 있어서, 안과 수술이 각막이식술인 방법.
  39. 제6항에 있어서, 상기 대상체에서 각막 조직의 두께를 증가시키는 방법.
  40. 제6항에 있어서, 조직 손상이 상기 대상체의 각막 세포에서 감소되는 것인 방법.
  41. 제6항에 있어서, 조직 손상이 대상체의 각막과 관련된 세포에서 감소되는 것인 방법.
  42. 제6항에 있어서, 상기 대상체의 눈에서 혼탁을 감소시키는 방법.
  43. 제6항에 있어서, 상기 대상체의 눈에서 반흔 형성을 감소시키는 방법.
  44. 제6항에 있어서, 수술후 24 내지 48 시간 내에 레이저-유도된 손상 부위와 관련된 근섬유아세포 분화와 관련이 있는 세포과다형성을 조절하는 방법.
  45. 제6항에 있어서, 수술후 24 내지 72 시간 내에 레이저-유도된 손상 부위와 관련된 혼탁을 감소시키고 간질 리모델링(stromal remodeling)을 조절하는 방법.
  46. 제6항에 있어서, 상기 안과 절차가 엑시머 레이저 절차이며, 상기 대상체에서 간질 세포(stromal cell)의 세포과다형성을 감소시키는 방법.
  47. 제6항에 있어서, 상기 안과 절차가 엑시머 레이저 절차이며, 상기 대상체의 각막에서 상피 재생을 촉진하는 방법.
  48. 제6항에 있어서, 상기 대상체의 눈에서 상피 세포 이동을 증가시키는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 대상체의 눈에 상기 안티센스 화합물을 투여한지 12 시간 내에 상피 세포 이동이 증가하는 것인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 대상체의 눈에 상기 안티센스 화합물을 투여한지 24 시간 내에 상피 세포 이동이 증가하는 것인 방법.
  51. 제6항에 있어서, 상기 처치된 대상체의 눈에서 후방 간질의 간질 밀도가 증가하지 않으면서 전방 간질의 간질 밀도가 증가하는 것인 방법.
  52. 제6항에 있어서, 수술후 24 내지 72 시간 내에 레이저-유도된 손상 부위와 관련된 간질 부종을 억제하는 방법.
  53. 제6항에 있어서, 수술후 24 내지 72 시간 내에 상피세포 과다형성을 감소시키는 방법.
  54. 제6항에 있어서, 수술후 1 주일까지 근섬유아세포 활성화를 감소시키는 방법.
  55. 제6항에 있어서, 세포외 매트릭스를 변형시키는 세포 분화를 조절하는 방법.
  56. 제6항에 있어서, 세포 증식을 감소시키는 방법.
  57. 중추 신경계에 대한 손상을 치료하기 위해 대상체에게 수행된 수술 절차와 병행하여 중추 신경계에 이미 존재하는 창상에 인접한 부위에 안티센스 화합물을 투여하는 것을 포함하며, 이 때 상기 안티센스 화합물은 서열 12 내지 31로부터 선택된 핵염기 서열을 갖는 코넥신 코딩 핵산 분자의 약 8개 이상의 핵염기에 표적화 된 것인, 중추 신경계에 대한 손상을 치료하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 중추 신경계에 대한 손상이 척수 손상인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 척수에 대한 물리적 외상이 발생한지 적어도 24 시간 후에 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  60. 제57항에 있어서, 신경 조직을 대상체의 척수 손상 영역에 이식하는 절차와 함께 상기 안티센스 화합물을 투여하는 방법.
  61. 제57항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 반흔 형성을 감소시키는 것인 방법.
  62. 제57항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 염증을 감소시키는 것인 방법.
  63. 제57항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 창상 치유를 촉진하는 것인 방법.
  64. 제57항에 있어서, 수술 이식 절차와 병행하여 사용하는 방법.
  65. 제57항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 코넥신 43에 대한 것이며, 이를 투여하여 상피 기저 세포의 분열 및 성장을 조절하는 방법.
  66. 제57항에 있어서, 상기 안티센스 화합물이 코넥신 31.1에 대한 것이며, 이를 투여하여 외부층의 각질형성(keratinisation)을 조절하는 방법.
  67. 대상체의 눈 또는 눈과 관련된 세포에서 코넥신 단백질의 발현을 억제하는 안티센스 화합물의, 안과 절차와 관련된 조직 손상을 감소시키기 위한 의약 제조에 있어서의 용도.
  68. 대상체의 눈 또는 눈과 관련된 세포에서 코넥신 단백질의 발현을 억제하는 안티센스 화합물의, 안과 절차와 관련된 조직 공학용 의약 제조에 있어서의 용도.
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