KR102259447B1 - mRNA 의 기능화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, mRNA 와, mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머를 포함하는 2 본쇄 RNA 를 포함하는, 기능화 mRNA 를 제공한다. 이로써, 기능화 mRNA 가 제공된다.

Description

mRNA 의 기능화 방법
본 발명은, mRNA 의 기능화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, mRNA 수송 담체의 안정화 방법, mRNA 백신 등에 관한 것이다.
mRNA 송달은, 치료용 단백질을 안전하고 또한 지속적으로 공급하기 위한 수법으로서 주목을 모으고 있다. 한편으로 mRNA 가 생체 내에서 신속하게 효소 분해를 받아 버리는 것이 큰 과제이다. 이에 대하여, mRNA 수송 담체를 사용하여 mRNA 를 분해로부터 보호하는 방법, 및 mRNA 분자 자체를 개량하는 방법이 검토되고 있지만, 생체 내에서의 RNA 분해 효소가 매우 강하기 때문에, 추가적인 기술 혁신이 요구되고 있다.
mRNA 분자 자체를 개량하는 방법에 대해, mRNA 염기의 일부를 화학 수식한 것으로 치환하는 방법이 검토되고 있다 (예를 들어, 비특허문헌 1). 지금까지 여러 가지 화학 수식 염기가 망라적으로 검토되었지만, mRNA 의 효소 내성을 대폭 향상시킬 수 있는 것은 아직 보고되어 있지 않다. 또, 수식을 실시함으로서 종종 mRNA 로부터의 단백질 번역 효율이 크게 저하해 버리는 점에서, 자유로운 화학 수식은 곤란하였다.
여기서, 특허문헌 1 에는, 폴리카티온성 폴리머와 mRNA 의 폴리이온 컴플렉스가 기재되고, 이것을 mRNA 의 송달에 사용하는 것이 기재되어 있다. 또, 비특허문헌 2 에는, 고분자 미셀형 mRNA 수송 담체의 안정성, 효소 분해의 평가, 및 폴리머에 콜레스테롤 수식을 실시하는 효과에 대해 기재되어 있다. 그러나, 이들 문헌에는, 생체 내에 있어서, mRNA 로부터의 단백질 번역 효율을 크게 저하시키는 일 없이, mRNA 의 효소 내성을 향상시킬 수 있는, mRNA 수송 담체의 안정화 방법은 기재되어 있지 않다.
또, 병원체의 병원성을 약화시켜 사용하는 종래의 생백신은 병원성의 복귀에 의해 부작용이 생길 우려가 있다. 또, 병원체의 병원성을 없애서 사용하는 종래의 불활화 백신은 감염 세포가 출현하지 않기 때문에 세포성 면역을 유도하기 어렵다는 문제가 있다.
DNA 백신, mRNA 백신 등의 핵산 백신에서는, 항원 단백질을 제시하기 위해서 핵산을 사용한다. 즉, 핵산 백신은, 투여한 핵산을 항원 제시 세포의 핵내 또는 세포질로 이행시켜 항원 단백질을 발현시키고, 항원 단백질을 제시시킴으로써 면역을 부활화시킨다. 핵산 백신은, 병원성의 복귀의 문제가 없기 때문에 생백신과 비교하여 안전성이 높다고 생각되고 있다. 또, 핵산 백신에서는 항원 제시 세포가 항원 단백질을 제시하기 때문에 세포성 면역을 유도하는 것이 가능하고, 이 때문에, 핵산 백신은, 암이나 만성 감염증에의 전개가 가능하다. 또한, 핵산 백신에서는 서열을 변경하는 것만으로 비교적 자유로운 핵산의 설계가 가능하고, 이 때문에, 핵산 백신에는, 암의 개별화 치료에 사용할 수 있는 것, 바이러스 변이에도 신속히 대응 가능한 점에서 판데믹에의 빠른 대응이 가능한 것 등의 이점도 있다.
이 중 DNA 백신에서는, 호스트 게놈에의 랜덤의 삽입에 의한 변이 유발의 리스크가 있다고 생각되고 있다. 그 한편으로, 항원 단백질을 제시하기 위해서 mRNA 를 사용하는 mRNA 백신은, 호스트 게놈에의 변이 유발의 리스크가 없다고 생각되고 있어, 최근 주목을 모으고 있다.
mRNA 백신에 의해 면역 유도 효과를 얻기 위해서는, 항원 단백질을 발현시킴과 동시에, 염증 반응을 야기할 필요가 있다. 그러나, mRNA 자체는 면역원성이 낮기 때문에 염증 반응을 야기하기 어렵다. 그래서 종래, mRNA 와는 별도로 염증 반응을 야기하기 위한 아쥬반트를 동시에 투여할 필요가 있었다 (예를 들어, 특허문헌 2).
이와 같은 종래의 mRNA 백신에는, 이하의 3 가지 문제가 있다. 1 번째의 문제는, 외래 물질을 아쥬반트로서 사용하는 경우에는 그 안전성에 상당한 주의를 기울일 필요가 생기는 것이다. 2 번째의 문제는, 투여한 mRNA 와 아쥬반트의 조직 분포가 상이하면, 항원 단백질을 발현하는 세포에 충분한 염증 반응이 야기되지 않을 가능성이 있는 것이다. 3 번째의 문제는, mRNA 를 생체에 투여할 때, mRNA 를 효소 분해로부터 보호하기 위해서 종종 수송 담체가 필요로 되지만, 아쥬반트가 수송 담체의 기능에 영향을 줄 가능성이 있는 것이다.
여기서, 비특허문헌 3 에는, mRNA 백신으로서, mRNA 를 아쥬반트 성분인 프로타민과 일체화한 것이 기재되어 있다.
WO2015/121924A 일본 공표특허공보 2012-502074호
Meis, J. E. and Chen, F. (2002) EPICENTRE Forum 9(1), 10 Uchida, S., et al., Biomaterials (2016) 82, p.221 - 228. Karl-Josef Kallen et al., Human Vaccines ＆ Immunotherapeutics (2013)9 : 10, p.2263 - 2276
이와 같은 상황하, 기능화 mRNA 가 요구되고 있었다.
본 발명의 제 1 양태는, mRNA 수송 담체의 새로운 안정화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 제 2 및 제 3 양태는, 효율적인 단백질 발현 및 면역 유도를 가능하게 하는 새로운 mRNA 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 예의 검토를 거듭한 결과, mRNA 와 상보적인 서열을 가지는 RNA 올리고머를 mRNA 에 하이브리다이즈시킴으로써 mRNA 를 기능화할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
또, 본 발명자들은, mRNA 와 상보적인 서열을 가지는 RNA 올리고머에 화학 수식을 실시하고, 그것을 mRNA 에 하이브리다이즈시킴으로써 mRNA 의 화학 수식을 실시할 수 있고, 이로써 그 mRNA 를 안정화할 수 있는 것, 혹은 그 mRNA 를 수송 담체에 탑재함으로써 수송 담체를 안정화할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명의 제 1 양태를 완성하기에 이르렀다.
또, 본 발명자들은, 항원을 코드하는 mRNA 의 poly A 서열과 상보적인 서열을 가지는 RNA 올리고머를 mRNA 에 하이브리다이즈시킴으로써, mRNA 로부터의 효율적인 단백질 발현 및 면역 유도의 양방을 달성할 수 있는 것 등을 알아내어, 본 발명의 제 2 양태를 완성하기에 이르렀다.
또한, 본 발명자들은, 항원을 코드하는 mRNA 의 서열과 상보적인 서열을 가지는 제 1 RNA 올리고머를 mRNA 에 하이브리다이즈시키고, 또한 제 1 RNA 올리고머와 상보적인 서열을 가지는 제 2 RNA 올리고머를 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈시킴으로써, mRNA 로부터의 효율적인 단백질 발현 및 면역 유도의 양방을 달성할 수 있는 것 등을 알아내어, 본 발명의 제 3 양태를 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 이하와 같다.
mRNA 와, mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 수식된 RNA 올리고머를 포함하는 2 본쇄 RNA 를 포함하는, 기능화 mRNA.
본 발명의 제 1 양태는 이하와 같다.
[1-1] 목적 유전자를 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머를 내포한 상기 mRNA 의 수송 담체로서,
RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 RNA 서열, 또는
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 RNA 서열
을 포함하고, 또한 화학 수식되어 있는, 수송 담체.
[1-1A] 목적 유전자를 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머를 내포한 상기 mRNA 의 수송 담체로서,
RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 RNA 서열, 또는
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 RNA 서열
을 포함하고, 또한 화학 수식되어 있지 않거나 또는 화학 수식되어 있는, 수송 담체.
[1-2] 상기 RNA 서열이 15 ∼ 23 염기의 서열로 이루어지는, 상기 [1-1] 또는 [1-1A] 에 기재된 수송 담체.
[1-3] 상기 RNA 서열이 17 염기의 서열로 이루어지는, 상기 [1-2] 에 기재된 수송 담체.
[1-4] 상기 화학 수식은, 1 ∼ 5 염기의 오버행 서열을 개재하여 RNA 올리고머의 서열의 5' 말단 또는 3' 말단으로 된 것인, 상기 [1-1] ∼ [1-3] 중 어느 1 항에 기재된 수송 담체.
[1-5] 상기 오버행 서열이 2 염기의 서열인, 상기 [1-4] 에 기재된 수송 담체.
[1-6] 상기 화학 수식이 소수성기에 의한 수식인, 상기 [1-1] ∼ [1-5] 중 어느 1 항에 기재된 수송 담체.
[1-7] 상기 소수성기에 의한 수식이 콜레스테롤 수식인, 상기 [1-6] 에 기재된 수송 담체.
[1-8] 상기 화학 수식이 폴리에틸렌글리콜 수식인, 상기 [1-1] ∼ [1-5] 중 어느 1 항에 기재된 수송 담체.
[1-9] 상기 수송 담체가, 고분자 미셀 또는 지질성 mRNA 캐리어인, 상기 [1-1] ∼ [1-8] 중 어느 1 항에 기재된 수송 담체.
[1-10] 상기 [1-1] ∼ [1-9] 중 어느 1 항에 기재된 수송 담체를 함유하는, 의약 조성물.
[1-11] 목적 유전자를 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머를 수송 담체에 내포시키는 것을 포함하고,
RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 RNA 서열, 또는
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 RNA 서열
을 포함하고, 또한 화학 수식되어 있는, 수송 담체의 안정화 방법.
[1-11A] 목적 유전자를 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머를 수송 담체에 내포시키는 것을 포함하고,
RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 RNA 서열, 또는
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 RNA 서열
을 포함하고, 또한 화학 수식되어 있지 않거나 또는 화학 수식되어 있는, 수송 담체의 안정화 방법.
[1-12] 목적 유전자를 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머를 포함하는 2 본쇄 RNA 로서,
RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 RNA 서열, 또는
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 RNA 서열
을 포함하고, 또한 화학 수식되어 있지 않거나 또는 화학 수식되어 있는, 2 본쇄 RNA.
[1-13] 상기 RNA 서열이 15 ∼ 23 염기의 서열로 이루어지는, 상기 [1-12] 에 기재된 2 본쇄 RNA.
[1-14] 상기 RNA 서열이 17 염기의 서열로 이루어지는, 상기 [1-13] 에 기재된 2 본쇄 RNA.
[1-15] 상기 화학 수식은, 1 ∼ 5 염기의 오버행 서열을 개재하여 RNA 올리고머의 서열의 5' 말단 또는 3' 말단으로 된 것인, 상기 [1-12] ∼ [1-14] 중 어느 1 항에 기재된 2 본쇄 RNA.
[1-16] 상기 오버행 서열이 2 염기의 서열인, 상기 [1-15] 에 기재된 2 본쇄 RNA.
[1-17] 상기 화학 수식이 소수성기에 의한 수식인, 상기 [1-12] ∼ [1-16] 중 어느 1 항에 기재된 2 본쇄 RNA.
[1-18] 상기 소수성기에 의한 수식이 콜레스테롤 수식인, 상기 [1-17] 에 기재된 2 본쇄 RNA.
[1-19] 상기 화학 수식이 폴리에틸렌글리콜 수식인, 상기 [1-12] ∼ [1-16] 중 어느 1 항에 기재된 2 본쇄 RNA.
[1-20] 상기 [1-12] ∼ [1-19] 중 어느 1 항에 기재된 2 본쇄 RNA 가 수송 담체에 내포되어 있는, mRNA 수송 담체.
[1-21] 상기 수송 담체가, 고분자 미셀 또는 지질성 mRNA 캐리어인, 상기 [1-20] 에 기재된 수송 담체.
[1-22] 상기 [1-20] 또는 [1-21] 중 어느 1 항에 기재된 수송 담체를 함유하는, 의약 조성물.
본 발명의 제 2 양태는 이하와 같다.
[2-1] 항원을 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 의 적어도 poly A 서열에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머로 이루어지는 2 본쇄 RNA 를 포함하고, 상기 적어도 1 개의 RNA 올리고머는 화학 수식되어 있지 않은, mRNA 백신.
[2-1A] 항원을 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 의 적어도 poly A 서열에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머로 이루어지는 2 본쇄 RNA 를 포함하고, 상기 적어도 1 개의 RNA 올리고머는 화학 수식되어 있지 않거나 또는 화학 수식되어 있는, mRNA 백신.
[2-2] RNA 올리고머는, 10 ∼ 500 염기 서열로 이루어지는, 상기 [2-1] 또는 [2-1A] 에 기재된 mRNA 백신.
[2-3] RNA 올리고머는, 5' 말단에 트리인산 구조를 갖는, 상기 [2-1] ∼ [2-2] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
[2-4] 2 본쇄 RNA 는, mRNA 의 적어도 poly A 서열에 1 개의 RNA 올리고머가 하이브리다이즈한 것인, 상기 [2-1] ∼ [2-3] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
[2-5] 2 본쇄 RNA 가 네이키드의 형태인, 상기 [2-1] ∼ [2-4] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
[2-6] 아쥬반트와 함께 사용하지 않는, 상기 [2-1] ∼ [2-5] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
[2-7] 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에 있어서 당해 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 상기 [2-1] ∼ [2-6] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
[2-8] 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에, 상기 [2-1] ∼ [2-6] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신을 투여하는 것을 포함하는, 질환의 예방 또는 치료 방법.
본 발명의 제 3 양태는 이하와 같다.
[3-1] 항원을 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 제 1 RNA 올리고머와, 당해 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈한 제 2 RNA 올리고머로 이루어지는 2 본쇄 RNA 를 포함하고,
제 1 RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 제 1 RNA 서열과, 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열로 이루어지는 제 2 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열,
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 제 1 RNA 서열과, 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 제 2 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하는 제 2 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열,
(c) 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열로 이루어지는 제 2 RNA 서열과, mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 제 1 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열, 또는
(d) 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 제 2 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하는 제 2 RNA 서열과, mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 제 1 RNA 서열과, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열
을 포함하는, mRNA 백신.
[3-2] 제 1 RNA 올리고머는, 22 ∼ 240 염기의 서열로 이루어지는, 상기 [3-1] 에 기재된 mRNA 백신.
[3-3] 1 개의 mRNA 에 하이브리다이즈시키는 제 1 RNA 올리고머의 수가, 1 ∼ 50 개인, 상기 [3-1] 또는 [3-2] 에 기재된 mRNA 백신.
[3-4] 제 1 RNA 올리고머는, 상기 (a) 의 RNA 서열 또는 상기 (b) 의 RNA 서열을 포함하고, 제 2 RNA 올리고머는, 5' 말단에 트리인산 구조를 갖는, 상기 [3-1] ∼ [3-3] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
[3-5] 제 1 RNA 올리고머는, 상기 (c) 의 RNA 서열 또는 상기 (d) 의 RNA 서열을 포함하고, 제 1 RNA 올리고머는, 5' 말단에 트리인산 구조를 갖는, 상기 [3-1] ∼ [3-3] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
[3-6] 제 2 RNA 올리고머가 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하고 있는 측의 2 본쇄 RNA 의 말단이, 평활 말단인, 상기 [3-1] ∼ [3-5] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
[3-7] 제 2 RNA 올리고머는 10 ∼ 200 염기의 서열을 포함하는, 상기 [3-1] ∼ [3-6] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
[3-8] 2 본쇄 RNA 가 네이키드의 형태인, 상기 [3-1] ∼ [3-7] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
[3-9] 아쥬반트와 함께 사용하지 않는, 상기 [3-1] ∼ [3-8] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
[3-10] 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에 있어서 당해 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 상기 [3-1] ∼ [3-9] 중 어느 1 항에 기재된 mRNA 백신.
본 발명은, 기능화 mRNA 를 제공할 수 있다.
본 발명의 제 1 양태는, mRNA, 또는 mRNA 수송 담체의 새로운 안정화 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 제 1 양태는, 생체 내에 있어서, mRNA 로부터의 단백질 번역 효율을 유지한 채, 비교적 자유로운 mRNA 수식을 실현할 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 제 1 양태는, 생체 내에서의 mRNA 의 효소 분해를 억제할 수 있다.
본 발명의 제 2 및 제 3 양태는, 효율이 양호한 단백질 발현 및 면역 유도를 가능하게 하는 새로운 mRNA 백신을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 제 2 및 제 3 양태의 mRNA 백신은, 아쥬반트를 동시 투여하지 않아도, 항원 제시 및 면역 유도가 가능하다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 제 2 및 제 3 양태의 mRNA 백신은, 보다 강한 세포성 면역을 유도할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 제 2 및 제 3 mRNA 백신은, mRNA 단독으로 투여하는 것보다 강한 액성 면역을 유도할 수 있다.
도 1 은 RNA 올리고머가 mRNA 에 하이브리다이즈한 것을 나타내는 전기 영동 화상이다. (1) overhang 2base(1) 만 ; (2) overhang 2base(1) 을 하이브리다이즈시킨 mRNA ; (3) overhang 2base(1) 을 하이브리다이즈하고 있지 않은 mRNA.
도 2 는 RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈에 의한 영향을 나타내는 도면이다. (A) 배양 세포에의 mRNA 도입 효율 ; (B) 무세포계에서의 단백질 번역 효율.
도 3 은 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 를 내포한 고분자 미셀의 물리화학적 성질을 나타내는 도면이다. (A) PEG-PAsp(DET)＋RNA 올리고(-) ; (B) PEG-PAsp(DET)-Chol＋RNA 올리고(-) ; (C) PEG-PAsp(DET)＋미수식 RNA 올리고 ; (D) PEG-PAsp(DET)-Chol＋미수식 RNA 올리고 ; (E) PEG-PAsp(DET)＋Chol-RNA 올리고 ; (F) PEG-PAsp(DET)-Chol＋Chol-RNA 올리고.
도 4a 는 Chol 수식 RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈에 의한 안정성에의 영향을 나타내는 도면이다. (A) PEG-PAsp(DET)-Chol ; (B) PEG-PAsp(DET) ; (C) PEG-PAsp(DET)-Chol ; (D) PEG-PAsp(DET) ; (E) PEG-PAsp(DET)-Chol.
도 4b 는 상기와 같다.
도 5 는 Chol 수식 RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈에 의한 안정성에의 영향을 나타내는 도면이다. (A) PEG-PAsp(DET)-Chol＋올리고(-) ; (B) PEG-PAsp(DET)-Chol＋Chol 올리고 ; (C) PEG-PAsp(DET)＋올리고(-) ; (D) PEG-PAsp(DET)＋Chol 올리고.
도 6 은 복수의 Chol 수식 RNA 올리고머를 mRNA 에 하이브리다이즈시킨 것에 의한 안정성에의 영향을 나타내는 도면이다. 10 v/v％ 의 FBS 조건.
도 7 은 복수의 Chol 수식 RNA 올리고머를 mRNA 에 하이브리다이즈시킨 것에 의한, 세포에 도입했을 때의 단백질 번역 효율에의 영향을 나타내는 도면이다. 10 v/v％ 의 FBS 조건.
도 8 은 올리고머에의 Chol 수식을 3' 측에서 실시한 경우와, 5' 측에서 실시한 경우를 비교하는 도면이다. (A) 안정성에의 영향, (B) 세포에 도입했을 때의 단백질 번역 효율.
도 9 는 Chol 수식 RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈에 의한 무세포계에서의 단백질 번역 효율에의 영향을 나타내는 도면이다.
도 10 은 Chol 수식 RNA 올리고머의 내인성 유전자 발현에 대한 영향을 나타내는 도면이다.
도 11 은 Chol 수식 RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈에 의한 안정성에의 영향을 나타내는 도면이다. (A) 겔 전기 영동 (PEG-PLys＋올리고(-)) ; (B) 겔 전기 영동 (PEG-PLys＋Chol 올리고) ; (C) 번역 효율.
도 12 는 마우스를 사용한 혈중 안정성 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 13 은 Chol 수식 RNA 올리고머를 폐에 투여한 결과를 나타내는 도면이다. (A) 단백질 발현 효율 ; (B) mRNA 량.
도 14 는 실시예에서 제작한 가우시아루시페라아제 (Gluc) 의 mRNA 의 서열이다 (서열 번호 1). 밑줄부가 오픈 리딩 프레임 (open reading frame) 이다.
도 15 는 실시예에서 사용한 가우시아루시페라아제 (Gluc) 의 코드 서열이다 (서열 번호 32).
도 16 은 실시예에서 사용한 Luc 의 mRNA 의 서열이다 (서열 번호 33). 밑줄부가 오픈 리딩 프레임이다.
도 17 은 mRNA 수송 담체의 안정화의 개념도이다.
도 18 은 PEG 수식 RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈에 의한 번역 효율의 변화를 나타내는 도면이다.
도 19 는 PEG 수식 RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈에 의한 안정화 효과의 변화를 나타내는 도면이다. (A) 실험 순서, (B) 안정성에의 영향.
도 20 은 PEG 화 mRNA 의 발현 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 21 은 가우시아루시페라아제 (Gluc 또는 Luc) mRNA 의 센스 사슬 및 안티센스 사슬을 나타내는 도면이다. (A) Gluc 센스 사슬, (B) Gluc 안티센스 사슬 (poly U 포함), (C) Gluc 안티센스 사슬 (poly U 없음), 및 (D) poly U.
도 22 는 2 본쇄 RNA 를 나타내는 도면이다. (A) mRNA : RNA, (B) mRNA : RNA poly U(-), (C) mRNA : poly U, 및 (D) mRNA : poly U ppp(-).
도 23 은 2 본쇄 RNA 를 수상 세포주 (DC2.4) 에 도입한 결과를 나타내는 도면이다. (A) 인터페론 β 발현량, 및 (B) Luc 발현량.
도 24 는 2 본쇄 RNA 를 마우스에 투여한 결과를 나타내는 도면이다. (A) Luc 발현량, (B) 인터페론 β 발현량, 및 (C) 인터류킨 6 발현량.
도 25 는 2 본쇄 RNA 를 마우스에 투여한 결과를 나타내는 도면이다. (A) 투여부터 세포수 정량까지의 순서, 및 (B) IFN-γ 산생 세포수.
도 26 은 2 본쇄 RNA 를 마우스에 투여한 결과를 나타내는 도면이다. (A) 투여부터 항OVA IgG 의 혈청 중 농도 정량까지의 순서, 및 (B) 항OVA IgG 의 혈청 중 농도.
도 27 은 실시예에서 제작한 Gluc 센스 사슬의 서열이다 (서열 번호 51). 밑줄부가 오픈 리딩 프레임이다.
도 28 은 실시예에서 제작한 Gluc 안티센스 사슬 (poly U 포함) 의 서열이다 (서열 번호 52).
도 29 는 실시예에서 제작한 Gluc 안티센스 사슬 (poly U 없음) 의 서열이다 (서열 번호 53).
도 30 은 실시예에서 제작한 poly U 의 서열이다 (서열 번호 54).
도 31 은 실시예에서 제작한 OVA 센스 사슬 의 서열이다 (서열 번호 55). 밑줄부가 오픈 리딩 프레임이다.
도 32 는 실시예에서 제작한 poly U 의 서열이다 (서열 번호 56).
도 33 은 실시예에서 사용한 가우시아루시페라아제 (Gluc) 의 코드 서열이다 (서열 번호 57).
도 34 는 실시예에서 사용한 난백 알부민 (OVA) 의 코드 서열이다 (서열 번호 58).
도 35 는 2 본쇄 RNA 를 수상 세포주 (DC2.4) 에 도입하고, 루시페라아제 발현량을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 36 은 실시예에서 제작한 3 개의 poly U 의 서열이다. (A) 각 poly U 의 제작 방법, 및 (B) 각 poly U 의 서열 (각각, 서열 번호 56, 54 및 59).
도 37 은 2 본쇄 RNA 를 나타내는 도면이다.
도 38 은 2 본쇄 RNA 를 수상 세포주 (DC2.4) 에 도입한 결과를 나타내는 도면이다. 미투여에 대한 인터페론 β 의 상대 발현량.
도 39 는 2 본쇄 RNA 를 수상 세포주 (DC2.4) 에 도입한 결과를 나타내는 도면이다. 미투여에 대한 인터류킨 6 의 상대 발현량.
도 40 은 2 본쇄 RNA 를 수상 세포주 (DC2.4) 에 도입한 결과를 나타내는 도면이다. 1 본쇄 RNA 에 대한 Luc 의 상대 발현량.
도 41 은 실시예에서 사용한 벡터의 서열이다 (서열 번호 65).
이하, 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이하의 실시형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시이고, 본 발명은 그 요지를 일탈하지 않는 한 다양한 형태로 실시할 수 있다. 또, 본 명세서에 있어서 인용한 모든 간행물, 예를 들어, 선행 기술 문헌 및 공개 공보, 특허 공보, 기타 특허문헌은, 그 전체가 본 명세서에 있어서 참조로서 받아들여진다. 또, 본 명세서는, 본원의 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허 출원인 일본 특허출원 2016-252487호 (2016년 12월 27일 출원) 및 일본 특허출원 2016-252488호 (2016년 12월 27일 출원) 의 특허 청구 범위, 명세서, 및 도면의 개시 내용을 참조하여 받아들이는 것으로 한다.
여기서는, mRNA 와, mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 수식된 RNA 올리고머를 포함하는 2 본쇄 RNA 를 포함하는, 기능화 mRNA 가 제공된다. 이하, 기능화 mRNA 의 각 양태에 대해 설명한다.
1. 본 발명의 제 1 양태
1.1. 본 발명의 제 1 양태의 개요
mRNA 의 염기 수식에서는, 종래에는, 자유로운 화학 수식의 설계가 곤란하였다. 그래서, 본 발명자들은, mRNA 와 상보적인 서열을 가지는 RNA 올리고머에 화학 수식을 실시하고, 그것을 mRNA 에 하이브리다이즈시킴으로써, mRNA 의 화학 수식을 실시할 수 없을까 생각하였다 (도 1). 이 경우, mRNA 자체는 천연의 것이기 때문에, 번역의 과정은 장애를 받지 않아, 자유로운 화학 수식이 가능하게 되는 것이 기대되었다. 한편으로 하이브리다이즈를 실시하는 것에 의한 번역 과정의 장애도 염려되었기 때문에, 먼저, 여러 가지 사슬 길이의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈시켜, 번역 효율에의 영향을 조사하였다. 그러자, RNA 올리고머 사슬 길이를 길게 하면 할수록 번역 효율이 저하해 가는 경향이 있는 것이 분명해졌다. 한편으로, 17 ∼ 40 염기의 RNA 올리고머에서는, 하이브리다이즈에 수반하는 발현의 저하를 충분히 방지할 수 있는 것을 알 수 있었다 (도 2). 특히, 17 염기의 올리고머에서는, 하이브리다이즈에 수반하는 발현의 저하가 거의 보이지 않았다 (도 2). 이들 점에서, 12 ∼ 40 염기의 RNA 올리고머를 사용함으로써, 번역 효율을 충분히 유지할 수 있는 것을 알 수 있었다.
다음으로, 화학 수식의 1 예로서, 콜레스테롤 (Chol) 수식 RNA 올리고머의 하이브리다이즈를 검토하였다 (도 17). Chol 수식을 실시하면 mRNA 수송 담체에 mRNA 를 탑재했을 때, 수송 담체가 소수성 상호작용에 의해 안정화되고, 결과적으로 mRNA 의 효소 분해를 방지할 수 있는 것이 기대되었다 (도 17). mRNA 수송 담체로서, 생체 적합성 폴리머, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 로 덮인 고분자 미셀을 사용하였다 (도 3, 도 17). 이 고분자 미셀은, 특히 in vivo 환경에서 높은 안전성 및 mRNA 도입 효율을 나타내는 것이 분명하게 되어 있다.
Chol 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 를 탑재한 고분자 미셀의 혈청 중에서의 효소 내성을 조사한 바, 하이브리다이즈에 의해 효소 내성이 현저하게 향상되는 것이 분명해졌다 (도 4). 결과적으로, 배양 세포에 대한 mRNA 의 도입 효율을 유의하게 향상시키는 것에 성공하였다 (도 7). 또, 생체 내는, 폴리아니온이 풍부하게 존재하는 점에서, 폴리아니온 존재하에서의 고분자 미셀의 안정성은 중요하지만, 실제로 본 기술에 의해 폴리아니온 존재하에서 미셀의 붕괴가 억제되었다 (도 5). 또한, 마우스의 경기도 폐 투여에 있어서, mRNA 도입 효율을 비교한 바, 여기서도 하이브리다이즈에 의한 도입 효율 향상 효과가 얻어졌다 (도 13). 이상의 점에서, 본 발명의 제 1 양태에 의해, mRNA 탑재 수송 담체 (예를 들어, 고분자 미셀) 가 안정화되고, 결과적으로 mRNA 효소 분해를 다양한 환경하에서 억제할 수 있는 것이 분명해졌다. 또, 이와 같은 Chol 수식 올리고머에 의한 안정화 효과는, 복수의 고분자 미셀의 조성에 있어서 얻어지고 있어 (도 11), mRNA 의 효소 내성을 향상시키기 위한 범용성이 높은 플랫폼이라고 할 수 있다.
RNA 올리고머에 관해서, Chol 기를 5' 및 3' 의 어느 쪽의 말단에 수식해도, 안정성 및 mRNA 로부터의 단백질 발현 효율에 크게 영향을 주지 않았다 (도 8). 또, RNA 올리고머의 상보 서열과 Chol 기 간에 하이브리다이즈하지 않는 오버행 서열을 삽입할 수도 있다. 예를 들어, Chol 이 수식된 블록 공중합체를 사용한 경우, 오버행 서열이 없는 경우와 비교해, 2 염기의 오버행 서열이 있는 경우에서 보다 높은 안정화 효과가 얻어지는 경향이 있었다 (도 4(A) 및 (C)). 한편으로, Chol 이 수식되어 있지 않은 블록 공중합체를 사용한 경우에는, 오버행 서열이 없어도 보다 우수한 안정화 효과가 얻어졌다 (도 4(B) 및 (D)).
하이브리다이즈하는 Chol 수식 RNA 올리고머의 수에 관해서, 1 개만으로도 매우 높은 안정성 향상 효과가 얻어졌지만, 수를 증가시킴에 따라, 안정성은 더욱 향상되었다 (도 6, 11). 한편으로, 수를 크게 증가시키면 과도한 안정화에 의한, mRNA 번역의 저해 경향이 보였다 (도 9). 투여 시스템에 따라 요구되는 안정성은 상이하므로, 그것에 따른 Chol 수식 올리고머의 최적의 수도 상이하다고 상정된다.
RNA 올리고머에 화학 수식을 실시하고, 그것을 mRNA 에 하이브리다이즈시킴으로써, mRNA 를 자유롭게 화학 수식할 수 있다고 생각된다. 그러나, 하이브리다이즈함으로써, mRNA 로부터의 번역 효율이 저하해 버리는 것이 염려되기 때문에, 화학 수식한 mRNA 를 하이브리다이즈하여 mRNA 의 효소 분해의 억제에 사용한다는 검토는 실시되지 않았다.
본 발명자들은, 다양한 사슬 길이의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈시켜 검토를 실시한 바, 안정적인 하이브리다이즈를 형성할 수 있는 사슬 길이를 갖고, 번역 효율에 영향을 주지 않는 조성으로서 12 ∼ 40 염기의 상보 서열을 가지는 것이 좋다는 것을 알아냈다. 또, 화학 수식 RNA 올리고머의 하이브리다이즈를 사용한 고분자 미셀의 안정화에 있어서, 화학 수식 위치에 관해서 5' 말단이어도 3' 말단이어도 되는 것을 알아냈다 (도 8). 또, RNA 올리고머의 상보 서열과 Chol 기 사이에, 오버행 서열이 없어도 되고, 혹은 1 ∼ 5 염기의 오버행 서열이 있어도 되는 것을 알아냈다. 이들 특징을 가지는 화학 수식 RNA 올리고머를 사용함으로써, 비교적 높은 효소 분해 억제 효과가 얻어지는 것은, 종래의 생물학적 지견으로부터는 예상되지 않는 결과이다.
또한 본 발명의 제 1 양태는, mRNA 자체, 또는 여러 가지 수송 담체 (예를 들어, 고분자 미셀) 에 있어서 mRNA 의 효소 분해를 억제할 수 있는 범용성이 있는 기술이다.
1.2. 2 본쇄 RNA 및 수송 담체
본 발명의 제 1 양태는, 목적 유전자를 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머를 포함하는 2 본쇄 RNA 로서,
RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 RNA 서열, 또는
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 RNA 서열
을 포함하고, 또한 화학 수식되어 있지 않거나 또는 화학 수식되어 있는, 2 본쇄 RNA 를 제공한다.
2 본쇄 RNA 는, 수송 담체에 내포되어 있어도 된다. 혹은, 2 본쇄 RNA 는 수송 담체에 내포되어 있지 않아도 되고, 즉 네이키드의 형태여도 된다. 전자의 본 발명의 제 1 양태는, 목적 유전자를 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머를 내포한 상기 mRNA 의 수송 담체로서,
RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 RNA 서열, 또는
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 RNA 서열
을 포함하고, 또한 화학 수식되어 있지 않거나 또는 화학 수식되어 있는, 수송 담체를 제공한다.
수송 담체는, 핵산을 내포하고, 대상의 체내의 바람직한 지점에 송달할 수 있는 것이면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 수송 담체는, 예를 들어, 고분자 미셀, 지질성 mRNA 캐리어, 또는 카티온성 폴리머 복합체이고, 보다 바람직하게는, 고분자 미셀 또는 지질성 mRNA 캐리어이다.
고분자 미셀은, 응축한 핵산과 카티온성 폴리머로 형성되는 내핵과 친수성 폴리머로 형성되는 외각의 2 층 구조를 가지고 있다. 카티온성 폴리머는, 예를 들어, 폴리아미노산 유도체이다. 친수성 폴리머는, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (「PEG」) 이다. 내핵은, mRNA 를 물리적 또는 화학적으로 봉입한다. 외각은, 그 물리화학적인 성질에 의해, 내각에 봉입된 mRNA 를 소정의 조직에 송달한다. 고분자 미셀은, 엔도사이토시스에 의해 세포 내에 들어갈 수 있다. 고분자 미셀은, 예를 들어, 블록 폴리머 상의 폴리카티온과 핵산의 상호작용 (폴리이온 컴플렉스 (「PIC」)) 을 이용할 수도 있는 외에, 그것과 무기 분자의 하이브리드 미셀을 이용할 수도 있다. PIC 형 고분자 미셀로는, 예를 들어, PEG-PAsp(DET)-Chol, PEG-PAsp(DET), PEG-PLys 와 mRNA 의 다분자 회합에 의해 형성되는 PIC 미셀 (후술하는 실시예를 참조) 이나, PAsp(TET), PAsp(TEP) 와 같은 다른 폴리카티온을 블록 공중합체에 사용한 것 (Uchida, S., et al., Biomaterials (2016) 82, p.221 - 228) 및 트리 블록 공중합체를 사용한 것 (Osawa, S., et al. Biomacromolecules 17, p354 - 361 (2016)) 을 들 수 있다. 무기 분자와의 하이브리드 미셀로는, 예를 들어, PEG 화 인산칼슘 (CaP) 입자 (Pittela, et al., Biomaterials (2011) 32, p.3106 - 3114), PEG 화 실리카 입자 (Miyata, K., et al. Biomaterials (2010) 31, p4764 - 4770) 를 들 수 있다.
지질성 mRNA 캐리어는, 리피드 또는 카티오닉 리피드를 캐리어로 하여 형성되고, 그리고 mRNA 가 내포 혹은 결합된 형태에 있다. 예를 들어, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTMA), 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카르복시아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미늄트리플루오로아세트산 (DOSPA), 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모늄)프로판 (DOTAP), N-[1-(2,3-디미리스틸옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)암모늄브로마이드 (DMRIE) 또는 DC-Cholesterol (DC-콜레스테롤) 과 같은 카티온성 지질 ; 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC) 또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE) 과 같은 중성 인지질 ; PEG 화 지질 ; 및 콜레스테롤로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 복수로 이루어지고, 그것과 mRNA 를 혼합하여 얻어지는 것이다.
카티온성 폴리머 복합체는, 예를 들어, 직사슬형 혹은 분지형 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리아르기닌, 키토산 유도체, 폴리메타크릴산 유도체와 mRNA 의 혼합물이다.
이들 수송 담체는, 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로 조제할 수 있다.
몇 개의 양태에서는, 수송 담체에 내포시키는 mRNA 의 양은, 수송 담체 중의 카티온 전하 (＋) 와 mRNA 의 아니온 전하 (-) 의 비 (＋/- 비) 에 있어서, 예를 들어, 0.5 ∼ 200 이고, 바람직하게는 1 ∼ 50 이며, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 이다.
목적 유전자는, 당업자이면 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 목적 유전자는, 예를 들어, 리포터 유전자, 성장 인자 유전자, 세포 증식 인자 유전자, 세포 증식 억제 인자 유전자, 세포사 촉진 인자 유전자, 세포사 억제 인자 유전자, 암 억제 유전자, 전사 인자 유전자, 게놈 편집 유전자 또는 백신 항원 유전자이다. 예를 들어, 특정 세포를 증식시키는 것이 필요한 대상에 대해 그 특정 세포의 증식 인자 유전자를 코드하는 mRNA 를 내포하는 수송 담체를 투여함으로써, 그 대상에 있어서의 질환이나 상태를 처치할 수 있다.
리포터로는, 예를 들어, 발광 단백질, 및 형광 단백질을 들 수 있다.
성장 인자로는, 예를 들어, 상피 성장 인자 (EGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 신경 성장 인자 (NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), 혈관 내피 세포 증식 인자 (VEGF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 에리스로포이에틴 (EPO), 트롬보포이에틴 (TPO), 염기성 섬유아세포 증식 인자 (bFGF 또는 FGF-2) 및 간세포 증식 인자 (HGF) 를 들 수 있다.
세포 증식 억제 인자로는, 예를 들어, p21, p17, p16 및 p53 을 들 수 있다.
세포사 촉진 인자로는, 예를 들어, Smac/Diablo, 아포토시스 유도 인자 (AIF), HtrA2, Bad, Bim, Bax, p53, 카스파아제 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 (예를 들어, 카스파아제 2, 3, 6, 7, 8, 9 및 10, 바람직하게는 카스파아제 3, 6 및 7), Fas 리간드 (FasL), 종양 괴사 인자 관련 아포토시스 유도 리간드 (TRAIL) 그리고 FoxO1 을 들 수 있다.
세포사 억제 인자로는, 예를 들어, 항아포토시스 인자 (예를 들어, FLIP, Mcl-1, Xiap, crmA, Bcl-2 및 Bcl-xL) 를 들 수 있다.
암 억제 유전자로는, 예를 들어, p53, 망막아세포종 유전자 (Rb), 대장 선종증 유전자 (APC), 신경섬유종증 1 형 유전자 (NF1), 신경섬유종증 2 형 유전자 (NF2), WT1, VHL, BRCA1, BRCA2, CHEK2, 마스핀, p73, Smad4, MSH2, MLH1, PMS2, DCC, 포스파타아제 텐신 호몰로그 (PTEN), SDHD, p16, p57 Kip2, PTC, TSC1, TSC2, EXT1 및 EXT2 를 들 수 있다.
전사 인자로는, 예를 들어, Runt 관련 전사 인자 1 (Runx1), p53, c-fos, c-Jun, CREB, C/EBP, MyoD, c-Myc, c-Myb, Oct3/4, NF-κB, NF-AT, Mef-2 및 세포외 시그널 응답 인자 (SRF) 를 들 수 있다.
게놈 편집 유전자로는, 예를 들어, zinc finger nuclease (ZNF), transcription activator like effector nuclease (TALEN) 및 clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9 유전자를 들 수 있다.
백신 항원 유전자로는, 예를 들어, 병원체 항원 및 종양 특이적 항원을 들 수 있다.
mRNA 는, 메신저 RNA 를 의미하고, 통상, 5' 비번역 영역 (5'UTR) 과 코드 영역과 3' 비번역 영역 (3'UTR) 을 포함한다. mRNA 는, 또한, 통상, 5' 말단의 캡 구조 (5'Cap) 와 3' 말단의 poly A 서열을 포함한다.
여기서 사용하는 mRNA 는, 다음 중 어느 것이어도 된다.
(1) 5'Cap, 5'UTR, 코드 영역, 3'UTR, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
(2) 5'Cap, 5'UTR, 코드 영역, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
(3) 5'UTR, 코드 영역, 3'UTR, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
(4) 5'UTR, 코드 영역, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
(5) 5'Cap, 5'UTR, 코드 영역, 및 3'UTR 을 이 순서로 포함하는 mRNA.
(6) 5'Cap, 5'UTR, 코드 영역을 이 순서로 포함하는 mRNA.
(7) 5'UTR, 코드 영역, 및 3'UTR 을 이 순서로 포함하는 mRNA.
(8) 5'UTR, 코드 영역을 이 순서로 포함하는 mRNA.
목적 유전자를 코드하는 mRNA 는, 공지된 방법에 따라, 목적 유전자를 코드하는 템플릿 DNA 를 in vitro 환경하에서 전사함으로써 제작할 수 있다. 예를 들어, Blood 108(13) (2006) 4009 - 17 에 기재된 방법에 따라, 제작할 수 있다. 구체적으로는, 단백질 코드 서열의 하류에 poly A/T 사슬이 삽입된 주형 DNA 를 poly A/T 사슬의 바로 하류에서 절단하고, 번역 효소, 뉴클레오시드, 5' 캡 아날로그를 포함하는 버퍼 용액 중에서 in vitro 전사를 실시하고, 그 후, mRNA 를 정제함으로써 제작할 수 있다. mRNA 의 보다 구체적인 조제 방법은 후술하는 실시예에 기재한 바와 같다.
몇 개의 양태에서는, mRNA 자체의 염기의 화학 수식은 실시하지 않는다. 이 경우, mRNA 자체는 천연의 것이기 때문에, 번역의 과정은 거의 장애를 받지 않는 것을 기대할 수 있다. 다른 몇 개의 양태에서는, mRNA 자체의 염기의 화학 수식을 실시한다. mRNA 자체의 염기의 화학 수식은, 예를 들어, mRNA 의 효소 내성을 향상시키는 것이나 면역원성을 경감할 수 있는 것이 알려져 있는 것이다. 그러한 mRNA 자체의 화학 수식 염기는, 예를 들어, 메틸화 염기 (예를 들어, 5-메틸시토신), 황 수식 염기 (예를 들어, 2-티오우리딘), 슈도우리딘, N1 메틸슈도우리딘 및 5 메톡시우리딘을 들 수 있다.
RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 RNA 서열, 또는
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 RNA 서열
을 포함하는 RNA 사슬이다.
「90 ％ 이상의 동일성을 갖는 RNA 서열」에 있어서의 「90 ％ 이상」의 범위는, 예를 들어, 90 ％ 이상, 91 ％ 이상, 92 ％ 이상, 93 ％ 이상, 94 ％ 이상, 95 ％ 이상, 96 ％ 이상, 97 ％ 이상, 98 ％ 이상, 99 ％ 이상, 99.1 ％ 이상, 99.2 ％ 이상, 99.3 ％ 이상, 99.4 ％ 이상, 99.5 ％ 이상, 99.6 ％ 이상, 99.7 ％ 이상, 99.8 ％ 이상, 또는 99.9 ％ 이상이다. 상기 동일성의 수치는, 일반적으로 클수록 바람직하다. 또한, RNA 서열의 동일성은, BLAST (예를 들어, Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990) 참조) 등의 해석 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. BLAST 를 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다.
「mRNA 에 하이브리다이즈한다」란, 후술하는 하이브리다이즈 조건으로, RNA 올리고머가 mRNA 에 하이브리다이즈하는 것을 의미한다.
RNA 올리고머는, mRNA 의 연속하는 12 ∼ 40 염기의 서열에 하이브리다이즈하도록 설계되어 있다. 몇 개의 양태에서는, RNA 올리고머의 서열은, mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 30 염기의 서열로 이루어진다. 보다 바람직하게는, RNA 올리고머의 서열은, mRNA 의 서열에 상보적인 15 ∼ 23 염기의 서열로 이루어지는 것이다. 더욱 바람직하게는, RNA 올리고머의 서열은, mRNA 의 서열에 상보적인 17 염기의 서열로 이루어지는 것이다.
RNA 올리고머를 하이브리다이즈시키는 mRNA 중의 위치는, 5'UTR, 코드 영역, 3'UTR, 및 poly A 서열 중 어느 위치여도 된다. RNA 올리고머는, mRNA 의 2 차 구조를 예측하고, mRNA 사슬이 2 차 구조를 가지지 않는 부분에 대해 하이브리다이즈하도록 RNA 올리고머를 설계하는 것이 바람직하다. 즉, RNA 올리고머는, mRNA 전체 서열 중 2 차 구조를 가지지 않는 부분에 대해 하이브리다이즈하도록 설계하는 것이 바람직하다. mRNA 의 2 차 구조를 예측하는 소프트웨어로는, 예를 들어, 후술하는 실시예에 기재된 것을 들 수 있다.
몇 개의 양태에서는, RNA 올리고머는, mRNA 의 폴리 A 의 서열에 하이브리다이즈하도록 설계한다.
올리고 RNA 의 화학 수식은, 오버행 서열을 개재하지 않고 실시해도 되고, 혹은, 오버행 서열을 개재하여 실시해도 된다. 여기서, 「오버행 서열」은, mRNA 에 하이브리다이즈하지 않는 서열이다.
화학 수식은, 오버행 서열을 개재하지 않고 실시하는 경우, 올리고 RNA 는, 바람직하게는, 상기 (a) 또는 (b) 의 RNA 서열만으로 이루어진다. 이 경우, 화학 수식은, RNA 올리고머의 서열의 예를 들어 5' 말단 또는 3' 말단에 실시한다. 몇 개의 양태에서는, 수송 담체가, 소수성기에 의해 수식되어 있지 않은 수송 담체 (예를 들어, 소수성기에 의해 수식되어 있지 않은 블록 공중합체) 일 때에, 올리고 RNA 의 화학 수식은 오버행 서열을 개재하지 않고 실시한다.
한편, 화학 수식은, 오버행 서열을 개재하여 실시하는 경우, 올리고 RNA 는, 바람직하게는, 상기 (a) 또는 (b) 의 RNA 서열과 오버행 서열로 이루어진다. 이 경우, 화학 수식은, RNA 올리고머의 상기 (a) 또는 (b) 의 RNA 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에, 1 ∼ 5 염기의 오버행 서열을 개재하여 실시한다. 화학 수식을 오버행 서열을 개재하여 실시하는 경우, 오버행 서열의 사슬 길이는, 바람직하게는, 1 ∼ 4 염기이고, 보다 바람직하게는, 1 ∼ 3 염기이며, 더욱 바람직하게는, 2 염기이다. 오버행 서열의 사슬 길이가 1 ∼ 5 염기 있으면, 비교적 높은 mRNA 안정화 효과를 기대할 수 있다. 몇 개의 양태에서는, 수송 담체가, 소수성기에 의해 수식된 수송 담체 (예를 들어, 소수성기에 의해 수식된 블록 공중합체) 일 때에, 올리고 RNA 의 화학 수식은, 1 ∼ 5 염기의 오버행 서열을 개재하여 RNA 올리고머의 상기 (a) 또는 (b) 의 RNA 서열의 5' 말단 또는 3' 말단으로 된다.
RNA 올리고머에 관해서, 오버행 서열을 개재하여 상기 (a) 또는 (b) 의 RNA 서열의 5' 말단 및 3' 말단의 어느 쪽의 말단을 화학 수식해도 된다. 여기서는, 오버행 서열을 개재하여 화학 수식한 RNA 올리고머를, 「화학 수식 올리고머」라고 하는 경우가 있다.
화학 수식은, 예를 들어, 네이키드의 2 본쇄 RNA 또는 mRNA 수송 담체를 안정화시킬 수 있는 수식이다. 그러한 화학 수식으로는, 예를 들어, 소수성기에 의한 수식, 폴리에틸렌글리콜에 의한 수식을 들 수 있다. 소수성기에 의한 수식으로는, 콜레스테롤 수식, 및 토코페롤 수식을 들 수 있다. 소수성기에 의한 수식을 실시하면 mRNA 수송 담체에 mRNA 를 탑재했을 때, 수송 담체가 소수성 상호작용에 의해 안정화되고, 결과적으로 mRNA 의 효소 분해를 방지할 수 있는 것을 기대할 수 있다. 몇 개의 양태에서는, 소수성기에 의한 수식은, 콜레스테롤 수식이다. 소수성기에 의한 수식은, 예를 들어, (S. L. Beaucage, et al., Tetrahedron Letters (1981) 22, p.1859 - 1862) 에 기재된 포스포르아미다이트법 또는 그것에 준하는 방법으로 실시할 수 있다. 소수성기에 의한 수식은, 예를 들어, 다음과 같이 하여 실시할 수 있다. RNA 올리고머를 합성한 후, 아미다이트화한 소수성기와 RNA 올리고머의 5' 말단 OH 기를 반응시킴으로써, 5' 말단에 소수성기를 도입한 RNA 올리고머를 얻을 수 있다. 또, OH 기 말단의 소수성기로부터 포스포르아미다이트법에 의해 RNA 합성을 실시함으로써, 3' 말단에 소수성기를 도입한 RNA 올리고머를 얻을 수 있다.
또한, 「화학 수식」의 정의에는, 5' 말단의 트리인산 구조는 포함되지 않는다.
폴리에틸렌글리콜 (PEG) 에 의한 수식을 실시하면, mRNA 수송 담체에 mRNA 를 탑재했을 때, 수송 담체가 폴리에틸렌글리콜 사슬에 의해 덮이고, 그 스텔스성에 의해 안정화되는 것에 추가하여, 폴리에틸렌글리콜 사슬의 쉴딩 효과에 의해 표면 전위가 감소하여, 카티온성 단백질인 분해 효소로부터의 인식을 억제할 수 있다. 그 결과, mRNA 의 효소 분해를 방지할 수 있는 것을 기대할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜에 의한 수식은, 예를 들어, 문헌 M. Oishi, et al., ChemBioChem 6(4), 2005, 718 - 725 에 기재된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로 실시할 수 있다. 보다 구체적으로는, DMS(O)MT-AMINO-MODIFIER(GLENRESERCH) 등의 개시제를 사용하여 RNA 올리고머를 합성하고, 탈보호함으로써 5' 말단 아미노화 RNA 올리고머를 얻는다. 이 5' 말단 아미노화 RNA 올리고와 예를 들어 PEG-N-하이드록시숙신이미드 (PEG-N-hydroxysuccinimide) 를 반응시킴으로써 PEG 화 RNA 올리고머를 얻을 수 있다. 사용하는 폴리에틸렌글리콜로는, 예를 들어, 중량 평균 분자량 1,000 ∼ 80,000 의 직사슬형의 PEG 나, 동일 분자량의 2 분기형, 4 분기형, 8 분기형 등의 분기상의 PEG 등을 들 수 있다.
mRNA 에 하이브리다이즈시키는 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머의 수는, 적어도 1 개이고, 바람직하게는 1 ∼ 50 개이며, 보다 바람직하게는 1 ∼ 15 개이고, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 개이다. RNA 올리고머의 수를 증가시킴에 따라, mRNA 의 안정성은 더욱 향상된다. RNA 올리고머의 수가 1 ∼ 50 개의 범위이면, mRNA 의 번역 효율을 비교적 높은 레벨로 유지할 수 있다.
복수의 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머를 mRNA 에 하이브리다이즈시키는 경우, 몇 개의 양태에서는, 각각의 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머가 mRNA 상에서 겹치지 않도록 RNA 올리고머를 설계한다.
RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈는, 공지된 방법 및 조건에 따라 실시할 수 있다. 하이브리다이즈에서는, 가온하고, 일정 시간 정치한 후, 서서히 온도를 저하시킨다. 가온은, mRNA 나 올리고머의 분자 내, 분자 간에 미리 존재하는 상보적 결합을 품으로써, mRNA 와 올리고머를 보다 효율적으로 결합시키는 것을 목적으로 하여 실시한다. 적절한 하이브리다이즈가 보증된다면, 그 온도 시간은 적절히 조정 가능하다. 온도 저하는 완만한 편이 하이브리다이즈의 특이성이 증가한다. 또, 올리고머 사슬 길이는, 하이브리다이즈의 조건 설정에 크게 영향을 주지 않는다. 하이브리다이즈 효율을 평가하면서, 적절히 조건을 설정해야 한다. 예를 들어, 후술하는 실시예에 기재된 방법 및 조건을 들 수 있다.
또, 본 발명의 제 1 양태는, 목적 유전자를 코드하는 mRNA 에, 적어도 1 개의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈시켜 2 본쇄 RNA 를 얻는 것을 포함하고,
RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 RNA 서열, 또는
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 RNA 서열
을 포함하고, 또한 화학 수식되어 있지 않거나 또는 화학 수식되어 있는, mRNA 의 안정화 방법을 제공한다.
안정화 방법에 있어서, 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 는, 수송 담체에 내포되어 있어도 된다. 혹은, 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 는 수송 담체에 내포되어 있지 않아도 되고, 즉 네이키드의 형태여도 된다. 바람직하게는, 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 는, 수송 담체에 내포되어 있어도 있다. 전자의 본 발명의 제 1 양태는, 목적 유전자를 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머를 수송 담체에 내포시키는 것을 포함하고, RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 RNA 서열, 또는
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 RNA 서열
을 포함하고, 또한 화학 수식되어 있지 않거나 또는 화학 수식되어 있는, 수송 담체의 안정화 방법도 제공한다.
안정화 방법에 사용하는, mRNA, RNA 올리고머, 수송 담체, 화학 수식 등은, 상기 수송 담체에 관한 설명에서 기재한 바와 같다.
1.3. 의약 조성물
본 발명의 제 1 양태는, 상기 2 본쇄 RNA 또는 수송 담체를 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 의약 조성물은, mRNA, 또는 mRNA 를 내포하는 수송 담체를, 대상의 체내에 송달하는 것에 사용된다.
「대상」은, 인간, 또는 인간 이외의 생물, 예를 들어, 조류 및 비인간 포유 동물 (예를 들어, 소, 원숭이, 고양이, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 돼지, 개, 토끼, 양, 및 말) 이다.
의약 조성물은, 대상에 대해, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 경구 투여, 조직 내 투여 (예를 들어, 방광 내 투여, 흉강 내 투여, 복강 내 투여, 안 내 투여, 뇌 내 투여), 경피 투여, 경점막 투여, 경폐 투여 또는 경직장 투여할 수 있다. 특히 정맥 내 투여, 경피 투여, 경점막 투여가 바람직하다. 이들 투여에 적절한 제형, 예를 들어, 각종 주사제, 경구제, 점적제, 흡입제, 점안제, 연고제, 로션제, 좌제로 투여된다. 투여량, 투여 횟수 및 투여 기간 등의 각 조건은, mRNA 의 종류, 제형, 연령이나 체중 등 대상의 상태, 투여 경로, 질환의 성질이나 정도를 고려한 후에, 당업자이면 적절히 설정할 수 있다.
의약 조성물은, 각종 질환의 원인이 되는 세포에 원하는 유전자를 코드하는 mRNA 를 도입하는 치료에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제 1 양태는, 의약 조성물을, 각종 질환의 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 각종 질환의 치료 방법을 제공할 수도 있다. 또한, 투여량, 투여 횟수 및 투여 기간 등의 각 조건은 상기와 동일하다.
치료하는 각종 질환은, 예를 들어, 암, 바이러스성 질환, 대사성 질환, 순환기 질환, 신경 질환, 신장비뇨기 질환, 혈액학적 악성 질환, 아포토시스의 촉진 또는 억제가 소망되는 질환, 교원병, 호흡기 질환 및 소화기 질환을 들 수 있다.
의약 조성물에 대해서는, 약제 제조상 일반적으로 사용되는 부형재, 충전재, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕괴제, 윤활제, 계면 활성제, 분산제, 완충제, 보존제, 용해 보조제, 방부제, 교미교취제, 무통화제, 안정화제 및 등장화제 등을 적절히 선택하여 사용하고, 통상적인 방법에 의해 조제할 수 있다. 정맥내 주사제 (점적을 포함한다) 로 하는 경우, 예를 들어, 단위 투여량 앰플 또는 다투여량 용기의 상태 등으로 제공된다.
몇 개의 양태에서는, mRNA 의 투여량은, mRNA 의 종류, 제형, 연령이나 체중 등 대상의 상태, 투여 경로, 질환의 성질이나 정도를 고려한 후에, 예를 들어, 성인에 대해, 1 일당 0.1 mg ∼ 5 g/인간의 범위 내가, 바람직하게는 1 mg ∼ 2 g 의 범위 내가 일반적이다. 이 투여량은, 표적으로 하는 질환의 종류, 투여 형태, 표적 분자에 따라서도 상이한 경우가 있다. 따라서, 경우에 따라서는 이것 이하여도 충분하고, 또 반대로 이것 이상의 용량을 필요로 할 때도 있다. 또 1 일 1 회 내지 수회의 투여 또는 1 일 내지 수일간의 간격으로 투여할 수 있다.
1.4. mRNA 송달용 키트
본 발명의 제 1 양태의 mRNA 송달용 키트는, 상기 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 를 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다. 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 는, 수송 담체에 내포되어 있어도 된다. 혹은, 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 는 수송 담체에 내포되어 있지 않아도 되고, 즉 네이키드의 형태여도 된다. 바람직하게는, 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 는, 수송 담체에 내포되어 있다. 전자의 본 발명의 제 1 양태의 mRNA 송달용 키트는, 수송 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다. 당해 키트는, 예를 들어, 상기 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 또는 수송 담체를 사용한 각종 질환의 치료 방법에 바람직하게 사용할 수 있다.
키트에 있어서, 상기 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 또는 수송 담체의 보존 상태는, 한정은 되지 않고, 그 안정성 (보존성) 및 사용 용이성 등을 고려하여 용액상 또는 분말상 등의 상태를 선택할 수 있다.
키트는, 상기 화학 수식되어 있지 않은 RNA 올리고머 또는 화학 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 또는 수송 담체 이외에, 다른 구성 요소를 포함하고 있어도 된다. 다른 구성 요소로는, 예를 들어, 각종 버퍼 및 사용 설명서 (사용 매뉴얼) 를 들 수 있다.
2. 본 발명의 제 2 양태
2.1. 본 발명의 제 2 양태의 개요
mRNA 자체는 면역원성이 낮기 때문에 염증 반응을 야기하기 어렵다. 그 때문에, 종래의 1 본쇄의 mRNA 를 사용한 백신은, 효과적으로 염증 반응을 야기하기 위한 아쥬반트 병용이 회피되지 않았다.
여기서, RNA 를 2 본쇄로 하면 보다 강한 염증 반응이 유도되는 것이 알려져 있다. 그래서, 본 발명자들은, 항원 단백질을 코드하는 1 본쇄의 mRNA 에 대해, 그 mRNA 에 상보적인 서열을 가지는 RNA 사슬 (「상보 사슬 RNA」) 을 하이브리다이즈시켜 2 본쇄 RNA 로서 투여하는 것에 착상하였다. 상보 사슬 RNA 로부터의 단백질 발현이 일어나지 않는 제어를 가함으로써, 2 본쇄 RNA 가 목적으로 하는 단백질 발현을 얻으면서, 충분한 면역 유도를 동시에 달성하는 것을 기대할 수 있다. 또, RNA 분자 자체는 생체 내에 존재하고, 외래 물질을 사용하는 것이 아니기 때문에, 2 본쇄 RNA 를 사용하는 경우, 비교적 높은 안전성이 담보된다고 생각된다.
mRNA 의 전체 길이에 대해 상보 사슬 RNA 를 하이브리다이즈시킨 경우, 하이브리다이즈시키고 있지 않은 mRNA 와 비교해, 매우 강한 염증 반응이 보였지만 (도 23(A)), mRNA 로부터의 단백질 발현 효율이 1/100 이하로 저하하였다 (도 23(B)). 그래서, 본 발명자들은, 보다 짧은 상보 사슬을 부분적으로 하이브리다이즈시키는 것에 착상하였다. 2 본쇄를 형성시키는 부위로서 코드 서열에 하이브리다이즈시킨 경우에는, 단백질 발현 효율이 저하했지만, 3' 말단에 부가되는 poly A 서열에 상보 사슬 (poly U) 을 주로 하이브리다이즈시키면, 단백질 발현 효율을 거의 저하시키는 일 없이 (도 23(B)), 강한 염증 반응을 야기하는 것을 알 수 있었다 (도 23(A)).
그래서, 본 발명의 제 2 양태는, 항원을 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 의 적어도 poly A 서열에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머로 이루어지는 2 본쇄 RNA 를 포함하고, 상기 적어도 1 개의 RNA 올리고머는 화학 수식되어 있지 않거나 또는 화학 수식되어 있는, mRNA 백신을 제공한다. 본 발명의 제 2 양태의 mRNA 백신은, 효율적인 단백질 발현 및 면역 유도능을 함께 달성할 수 있다.
본 발명의 제 2 양태의 mRNA 백신을 사용하여, 실제로 백신의 효과를 향상시킬 수 있는지에 대해, 마우스에 있어서의 면역 유도능을 세포성 면역에 주목해 평가하였다 (도 25(A)). 여기서는, 모델 항원으로서 난백 알부민 (OVA) 을 이용하고, OVA 발현 mRNA 를 마우스의 서혜 림프절에 투여하였다. 계속해서, 그 1 주간 후의 비장의 세포를 회수하고, 그 중에서 OVA 에 특이적으로 반응하는 세포의 수를 ELISPOT 법으로 평가하였다. 그러자, 림프절에 투여한 경우에, poly A 서열에 상보 사슬 RNA (poly U) 를 하이브리다이즈시킨 mRNA 가, 하이브리다이즈하고 있지 않은 mRNA 와 비교해, 유의하게 강하게 항원 특이적인 세포성 면역을 유도하고 있는 것이 분명해졌다 (도 25(B)). 이와 같이, 본 발명의 제 2 양태의 mRNA 백신을 사용함으로써, 세포성 면역 유도 효과가 향상되는 것이, 실증되었다.
또한, 본 발명의 제 2 양태의 mRNA 백신을 사용하여 마우스에 있어서의 면역 유도능을 액성 면역에 대해 평가한 바 (도 26(A)), poly A 서열에 상보 사슬 RNA (poly U) 를 하이브리다이즈시킨 mRNA 가, 하이브리다이즈하고 있지 않은 mRNA 와 비교해, 유의하게 강하게 항원 특이적인 액성 면역을 유도하고 있는 것이 분명해졌다 (도 26(B)).
poly A 서열에 poly U 를 하이브리다이즈시킨 mRNA 가 염증 반응을 야기하는 메커니즘에 관한 검증도 실시하였다. 2 본쇄 RNA 인식에 있어서 세포 내 수용체인 RIG-I 가 중요한 역할을 담당하는 것이 알려져 있다. 그리고, RIG-I 와 2 본쇄 RNA 의 결합에 있어서, 편방의 RNA 사슬의 5' 말단이 트리인산화되어 있는 것이 중요하다는 보고도 있다. 5' 말단이 트리인산화된 상보 사슬 RNA (poly U) 를 poly A 서열에 하이브리다이즈한 mRNA 를 사용한 경우, 5' 말단이 트리인산화되어 있지 않은 상보 사슬 RNA (RNA ppp(-)) 를 poly A 서열에 하이브리다이즈한 mRNA 를 사용한 경우와 비교해, 보다 강한 염증 반응이 야기되는 것을 알 수 있었다 (도 23(A)). 따라서, RIG-I 가 poly A 서열을 하이브리다이즈시킨 mRNA 에 대한 염증 반응에 강하게 관계되어 있는 것이 시사되었다.
여기서, poly U 를 하이브리다이즈시켰을 때는 염증 반응이 야기된 한편으로, 단백질 코드 서열에 대한 상보 사슬을 하이브리다이즈시켰을 때는 그다지 염증이 일어나지 않았다 (도 23(A)). 사용하는 상보 사슬에 의존하여 RIG-I 에 의한 트리인산 인식이 상이한 것이 강하게 시사되지만, poly U 의 경우, 5' 말단이 mRNA 말단에 노출되어, 트리인산이 입체적으로 RIG-I 에 인식되기 쉬워졌을 가능성, 트리인산 주위의 서열에 U 를 많이 포함하지만, AU 결합이 약하기 때문에 트리인산의 운동성이 높아져, 인식되기 쉬워졌을 가능성 등이 상정된다. 이와 같이 상보 사슬의 선택이 RIG-I 를 개재한 자연 면역 응답에 중요한 가능성이 강하게 시사되었다.
일반적으로 2 본쇄 RNA 는 세포 내에 도입되면 강한 염증 반응이 야기되는 것은 알려져 있다. 그러나, mRNA 에 대해 전체 길이의 상보 사슬을 결합시키면, mRNA 로부터의 단백질 발현을 저해해 버리는 것을 알 수 있었다. 본 발명의 제 2 양태에서는, poly A 서열을 중심으로, 상보 사슬을 부위 특이적으로 하이브리다이즈시킴으로써, mRNA 로부터의 단백질 발현을 유지한 채 염증 반응을 야기할 수 있다.
2.2. mRNA 백신
본 발명의 제 2 양태는, 항원을 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 의 적어도 poly A 서열에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 RNA 올리고머로 이루어지는 2 본쇄 RNA 를 포함하고, 상기 적어도 1 개의 RNA 올리고머는 화학 수식되어 있지 않거나 또는 화학 수식되어 있는, mRNA 백신을 제공한다.
2.2.1. mRNA
mRNA 는, 메신저 RNA 를 의미하고, 통상, 5' 비번역 영역 (5'UTR) 과 코드 영역과 3' 비번역 영역 (3'UTR) 을 포함한다. mRNA 는, 또한, 통상, 5' 말단의 캡 구조 (5'Cap) 와 3' 말단의 poly A 서열을 포함한다.
mRNA 백신에 사용하는 mRNA 는, 다음 중 어느 것이어도 된다.
(1) 5'Cap, 5'UTR, 코드 영역, 3'UTR, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
(2) 5'Cap, 5'UTR, 코드 영역, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
(3) 5'UTR, 코드 영역, 3'UTR, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
(4) 5'UTR, 코드 영역, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
mRNA 백신에 사용하는 mRNA 는, 공지된 방법에 의해, 목적 유전자를 코드하는 템플릿 DNA 를 in vitro 환경하에서 전사함으로써 제작할 수 있다. 예를 들어, Blood 108(13)(2006) 4009 - 17 에 기재된 방법에 따라, 제작할 수 있다. 구체적으로는, 단백질 코드 서열의 하류에 poly A/T 사슬이 삽입된 주형 DNA 를 poly A/T 사슬의 바로 하류에서 절단하고, 번역 효소, 뉴클레오시드, 5' 캡 아날로그를 포함하는 버퍼 용액 중에서 in vitro 전사를 실시하고, 그 후, mRNA 를 정제함으로써 제작한다. mRNA 의 보다 구체적인 조제 방법은, 후술하는 실시예에 기재된 바와 같다.
mRNA 의 코드 영역에 의해 코드되는 항원으로는, 면역 응답을 유발하는 데에 바람직한 공지된 항원으로부터 임의로 선택할 수 있다. 항원으로는, 보다 구체적으로는, 종양 항원, 바이러스 유래 항원, 세균 유래 항원, 진균 유래 항원, 원생 생물 유래 항원, 동물 유래 항원, 식물 유래 항원, 자기면역질환의 자기 항원 등을 들 수 있다. mRNA 에 코드되는 항원은, 1 개의 항원이어도 되고, 혹은, 2 개 이상 (예를 들어, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이상) 의 동일 또는 상이한 항원이어도 된다. 본 발명의 제 2 양태의 몇 개의 양태에서는, mRNA 의 코드되는 항원은, 1 개의 항원이다.
mRNA 의 poly A 서열의 길이는, 예를 들어, 10 ∼ 500 염기이고, 바람직하게는, 30 ∼ 300 염기이며, 보다 바람직하게는, 60 ∼ 250 염기이다.
mRNA 의 5'UTR 과 3'UTR 의 서열은, 천연으로 생기는 서열과 100 ％ 의 서열 동일성을 갖는 것으로 해도 되고, 혹은, 부분적 또는 그 전체를 다른 5'UTR 및/또는 3'UTR 의 서열로 치환해도 된다. 다른 5'UTR 및/또는 3'UTR 의 서열로는, 예를 들어, 글로빈, 하이드록시스테로이드(17-β)디하이드로게나제 4 (hydroxysteroid(17-β)dehydrogenase 4), 또는 알부민을 코드하는 mRNA 의 5'UTR 및/또는 3'UTR 의 서열을 들 수 있다.
몇 개의 양태에서는, mRNA 는 수식되어 있지 않다. 이 경우, mRNA 자체는 천연의 것이기 때문에 번역의 과정은 거의 장애를 받지 않는 것을 기대할 수 있다.
다른 몇 개의 양태에서는, mRNA 를 더욱 안정화시키기 위해서 mRNA 는 수식되어 있다. mRNA 의 수식으로는, mRNA 의 염기의 화학 수식, mRNA 의 코드 영역의 G/C 함량의 수식, mRNA 의 Cap 구조의 수식 등을 들 수 있다.
mRNA 의 염기의 화학 수식은, 예를 들어, mRNA 의 효소 내성을 향상시키는 것이 알려져 있는 것이다. 그러한 mRNA 자체의 화학 수식 염기는, 예를 들어, 메틸화염기 (예를 들어, 5-메틸시토신), 황 수식 염기 (예를 들어, 2-티오우리딘), 슈도우리딘, N1 메틸슈도우리딘 및 5-메톡시우리딘을 들 수 있다.
mRNA 의 코드 영역의 G/C 함량의 수식은, G (구아닌)/C (시토신) 의 함유량이 많아지도록 수식하는 것이고, 이로써, 보다 안정적인 mRNA 로 할 수 있다.
mRNA 의 Cap 구조의 수식은, 5' 측의 1 번째 혹은 2 번째의 리보스의 2 위치를 메톡시기로 하는 것이고, 이로써, 발현 효율이 향상되는 것도 알려져 있다.
mRNA 의 조제 및 수식은, 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
2.2.2. RNA 올리고머
본 발명의 제 2 양태에서는, mRNA 의 적어도 poly A 서열에 적어도 1 개의 RNA 올리고머가 하이브리다이즈하고 있다. 또, 당해 RNA 올리고머는, 화학 수식을 포함하지 않는 것이다.
1 개의 RNA 올리고머가 하이브리다이즈하는 mRNA 의 서열은, 예를 들어, 다음 중 어느 서열이다.
(1) mRNA 의 poly A 서열 중의 연속하는 서열.
(2) mRNA 의 3'UTR 과 poly A 서열 중의 연속하는 서열.
(3) mRNA 의 코드 영역과 poly A 서열 중의 연속하는 서열.
(1) mRNA 의 poly A 서열 중의 연속하는 서열의 경우, poly A 서열의 전체 (100 ％) 또는 일부에는 1 개의 RNA 올리고머가 하이브리다이즈하지만, 그 직전의 서열 (즉, 3'UTR 또는 코드 영역) 에는 당해 RNA 올리고머는 하이브리다이즈하지 않도록, RNA 올리고머를 설계한다. 여기서, poly A 서열의 일부는, poly A 서열의 전체 길이의 0 ％ 보다 크고 100 ％ 미만의 염기 길이, 또한, 예를 들어 10 염기 길이 이상의 염기 길이 (바람직하게는 17 염기 길이 이상의 염기 길이) 의 서열이다. mRNA 의 poly A 서열 부분에는, RNA 올리고머가 하이브리다이즈하는 17 염기 이상의 상보 서열이 있는 것이 바람직하다.
mRNA 를, poly A 서열의 직전에 3'UTR 서열을 포함하는 설계로 하는 경우에는, 1 개의 RNA 올리고머가 하이브리다이즈하는 서열이, (2) mRNA 의 3'UTR 과 poly A 서열 중의 연속하는 서열이어도 된다. 이 경우, poly A 서열의 전체 (100 ％) 또는 일부와 그 직전의 3'UTR 서열의 일부의 연속하는 서열에 1 개의 RNA 올리고머가 하이브리다이즈하도록, RNA 올리고머를 설계한다. 이 경우, 1 개의 RNA 올리고머는, 예를 들어, poly A 서열의 전체 길이의 0 ％ 보다 크고 100 ％ 미만의 염기 길이, 또한, 예를 들어 10 염기 길이 이상의 염기 길이 (예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17 염기 길이 이상의 염기 길이, 바람직하게는 17 염기 길이 이상의 염기 길이) 의 서열과 그 직전의 3'UTR 서열의 전체 길이의 0 ％ 보다 크고 100 ％ 미만의 염기 길이의 서열에 하이브리다이즈하도록 설계된다. mRNA 의 poly A 서열 부분과 3'UTR 서열 부분에는, RNA 올리고머가 하이브리다이즈하는, 합쳐서 17 염기 이상의 상보 서열이 있는 것이 바람직하다. RNA 올리고머가 하이브리다이즈하는 mRNA 의 3'UTR 서열 부분은 짧으면 짧을수록 바람직하고, 예를 들어, 1 ∼ 30 염기 길이이고, 바람직하게는, 1 ∼ 25 염기 길이이며, 보다 바람직하게는, 1 ∼ 2 염기 길이이다.
mRNA 를, poly A 서열의 직전에 코드 서열을 포함하는 설계로 하는 경우에는, 1 개의 RNA 올리고머가 하이브리다이즈하는 서열이, (3) mRNA 의 코드 서열과 poly A 서열 중의 연속하는 서열이어도 된다. 이 경우, poly A 서열의 전체 (100 ％) 또는 일부와 그 직전의 코드 서열의 일부의 연속하는 서열에 1 개의 RNA 올리고머가 하이브리다이즈하도록, RNA 올리고머를 설계한다. 이 경우, 1 개의 RNA 올리고머는, 예를 들어, poly A 서열의 전체 길이의 0 ％ 보다 크고 100 ％ 미만의 염기 길이, 또한, 예를 들어 10 염기 길이 이상의 염기 길이 (예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17 염기 길이 이상의 염기 길이, 바람직하게는 17 염기 길이 이상의 염기 길이) 와 그 직전의 코드 서열의 전체 길이의 0 ％ 보다 크고 100 ％ 미만인 염기 길이의 서열에 하이브리다이즈하도록 설계된다. mRNA 의 polyA 서열 부분과 코드 서열 부분에는, RNA 올리고머가 하이브리다이즈하는, 합쳐서 17 염기 이상의 상보 서열이 있는 것이 바람직하다. RNA 올리고머가 하이브리다이즈하는 mRNA 의 코드 서열 부분은 짧으면 짧을수록 바람직하고, 예를 들어, 1 ∼ 30 염기 길이이고, 바람직하게는, 1 ∼ 25 염기 길이이며, 보다 바람직하게는, 1 ∼ 2 염기 길이이다.
RNA 올리고머는, 구체적으로는, 이하의 것을 들 수 있다.
(a) 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 것의 연속하는 서열에 상보적인 서열을 갖는 RNA 올리고머, 또는,
(b) 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 것의 연속하는 서열에 상보적인 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖는 RNA 서열을 갖고, 또한, mRNA 에 하이브리다이즈하는 RNA 올리고머.
「90 ％ 이상의 동일성을 갖는 RNA 서열」에 있어서의 「90 ％ 이상」의 범위는, 예를 들어, 90 ％ 이상, 91 ％ 이상, 92 ％ 이상, 93 ％ 이상, 94 ％ 이상, 95 ％ 이상, 96 ％ 이상, 97 ％ 이상, 98 ％ 이상, 99 ％ 이상, 99.1 ％ 이상, 99.2 ％ 이상, 99.3 ％ 이상, 99.4 ％ 이상, 99.5 ％ 이상, 99.6 ％ 이상, 99.7 ％ 이상, 99.8 ％ 이상, 또는 99.9 ％ 이상이다. 상기 동일성의 수치는, 일반적으로 클수록 바람직하다. 또한, RNA 서열의 동일성은, BLAST (예를 들어, Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403(1990) 참조) 등의 해석 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. BLAST 를 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다.
「mRNA 에 하이브리다이즈한다」란, 후술하는 하이브리다이즈 조건으로, RNA 올리고머가 mRNA 에 하이브리다이즈하는 것을 의미한다.
RNA 올리고머는, 또한, 다른 서열을 포함하도록 해도 되고, 혹은, 다른 서열을 포함하지 않도록 해도 된다. 「다른 서열」은, 예를 들어, RNA 올리고머를 제작할 때에 남은 프로모터 서열, 제한 효소 서열, 그 외, RNA 올리고머 설계 시 부득이하게 남는 서열, 또는 그 일부이다. 「다른 서열」을 포함하는 경우, 「다른 서열」의 염기 길이는, 예를 들어, 1 ∼ 30 염기이고, 바람직하게는, 1 ∼ 25 염기이며, 보다 바람직하게는, 1 ∼ 2 염기이다.
RNA 올리고머는, 바람직하게는, 적어도 10 염기의 서열로 이루어지고, 보다 바람직하게는, 적어도 17 염기의 서열로 이루어지고, 더욱 바람직하게는, 적어도 30 염기의 서열로 이루어지고, 특히 바람직하게는 적어도 60 염기의 서열로 이루어진다. 또, 몇 개의 양태에서는, RNA 올리고머는, 바람직하게는, 10 ∼ 500 염기의 서열로 이루어지고, 보다 바람직하게는, 17 염기 ∼ 500 염기의 서열로 이루어지며, 더욱 바람직하게는, 30 ∼ 300 염기의 서열로 이루어지고, 특히 바람직하게는, 60 ∼ 250 염기의 서열로 이루어진다. RNA 올리고머의 염기 길이는, mRNA 의 poly A 서열의 길이 등을 고려하여 적절히 설계할 수 있다.
몇 개의 양태의 RNA 올리고머는, 화학 수식을 포함하지 않는 것이다. 다른 몇 개의 양태의 RNA 올리고머는, 화학 수식을 포함하는 것이다. 화학 수식은, 예를 들어, 소수성기에 의한 수식을 들 수 있다. 소수성기에 의한 수식으로는, 콜레스테롤 수식, 및 토코페롤 수식을 들 수 있다. 또, 화학 수식으로는, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 수식도 들 수 있다.
또한, 「화학 수식」의 정의에는, 5' 말단의 트리인산 구조는 포함되지 않는다.
RNA 올리고머의 조제는, 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해 실시할 수 있다. RNA 올리고머는, 템플릿 DNA 로부터 in vitro 전사로 제작된다. 원리상, RNA 올리고머의 조제는, 전술한 mRNA 의 제작과 대략 동일하게 하여 실시할 수 있지만, mRNA 는 전사 시에 5' 캡 아날로그를 첨가하고 있는 것에 대해, RNA 올리고머의 제작 시에는 캡 아날로그를 첨가하지 않고 제작한다. 이와 같이 생물학적으로 RNA 올리고머를 조제한 경우, 5' 말단에 트리인산 구조를 갖는 것으로 할 수 있다. 트리인산의 제거 방법은, 후술과 같다.
2.2.3. 2 본쇄 RNA
2 본쇄 RNA 는, 전술한 mRNA 에 적어도 1 개의 전술한 RNA 올리고머가 하이브리다이즈한 것이다.
2 본쇄 RNA 는, mRNA 와 RNA 올리고머의 하이브리다이제이션에 의해 조제할 수 있다. 하이브리다이제이션은, 보다 구체적으로는, 후술하는 실시예에 기재된 조건 또는 그것에 준하는 조건으로 실시할 수 있다. 1 개의 mRNA 에 하이브리다이즈시키는 RNA 올리고머의 수는, 적어도 1 개이고, 바람직하게는 1 ∼ 5 개이며, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개이고, 더욱 바람직하게는, 1 ∼ 2 개이며, 특히 바람직하게는, 1 개이다.
RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈는, 공지된 방법 및 조건에 의해 실시할 수 있다. 보다 구체적으로는, 하이브리다이즈에서는, 가온하고, 일정 시간 정치한 후, 서서히 온도를 저하시킨다. 가온은, mRNA 나 올리고머의 분자 내, 분자 간에 미리 존재하는 상보적 결합을 품으로써, mRNA 와 올리고머를 보다 효율적으로 결합시키는 것을 목적으로 하여 실시한다. 적절한 하이브리다이즈가 보증된다면, 그 온도 시간은 적절히 조정 가능하다. 특히 poly A 나 poly U 는 미리 다른 서열과 결합하고 있을 가능성은 낮아, 보다 온화한 가온 조건의 설정이 가능하다. 온도 저하는 완만한 편이 하이브리다이즈의 특이성이 증가한다. 또, 올리고머 사슬 길이는, 하이브리다이즈의 조건 설정에 크게 영향을 주지 않는다. 하이브리다이즈 효율을 평가하면서, 적절히 조건을 설정해야 한다. 예를 들어, 후술하는 실시예에 기재된 방법 및 조건을 들 수 있다.
몇 개의 양태에서는, 2 본쇄 RNA 는, RNA 올리고머의 5' 말단의 트리인산 구조를 갖는다. RNA 올리고머의 5' 말단의 트리인산 구조를 갖는 것으로 함으로써, 보다 강한 염증 반응을 야기할 수 있다.
다른 몇 개의 양태에서는, 2 본쇄 RNA 는, RNA 올리고머의 5' 말단의 트리인산 구조를 갖지 않다. 트리인산화를 제거하는 방법은, 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로 실시할 수 있다. 트리인산화를 제거하는 방법으로는, 예를 들어, 후술하는 실시예와 같이, Antarctic 포스파타아제 (New England Biolabs, cat. no. M0289S) 를 사용하는 방법을 들 수 있다.
몇 개의 양태에서는, 2 본쇄 RNA 는, 네이키드의 형태이다. 즉, 2 본쇄 RNA 는, 수송 담체를 수반하지 않는다.
다른 몇 개의 양태에서는, 2 본쇄 RNA 는, 수송 담체에 내포되는 형태이다. 수송 담체는, 2 본쇄 mRNA 를 내포하여, 대상의 체내의 바람직한 지점에 송달할 수 있는 것이면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 수송 담체는 지질성 mRNA 캐리어, 또는 카티온성 폴리머 복합체이고, 보다 바람직하게는, 고분자 미셀 또는 지질성 mRNA 캐리어이다.
고분자 미셀은, 응축한 핵산과 카티온성 폴리머로 형성되는 내핵과 친수성 폴리머로 형성되는 외각의 2 층 구조를 가지고 있다. 카티온성 폴리머는, 예를 들어, 폴리아미노산 유도체이다. 친수성 폴리머는, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (「PEG」) 이다. 내핵은, mRNA 를 물리적 또는 화학적으로 봉입한다. 외각은, 그 물리화학적인 성질에 의해, 내각에 봉입된 mRNA 를 소정의 조직에 송달한다. 고분자 미셀은, 엔도사이토시스에 의해 세포 내로 들어갈 수 있다. 고분자 미셀은, 예를 들어, 블록 폴리머 상의 폴리카티온과 핵산의 종합 작용 (폴리이온 컴플렉스 (「PIC」)) 을 이용할 수도 있는 외에, 그것과 무기 분자의 하이브리드 미셀을 이용할 수도 있다. PIC 형 고분자 미셀로는, 예를 들어, PEG-PAsp(DET)-Chol, PEG-PAsp(DET), PEG-PLys 와 mRNA 의 다분자 회합에 의해 형성되는 PIC 미셀이나, PAsp(TET), PAsp(TEP) 와 같은 다른 폴리카티온을 블록 공중합체에 사용한 것 (Uchida, S., et al., Biomaterials (2016) 82, p.221 - 228) 및 트리 블록 공중합체를 사용한 것 (Osawa, S., et al.Biomacromolecules 17, p354 - 361 (2016)) 을 들 수 있다. 무기 입자와의 하이브리드형 고분자 미셀로는, 예를 들어, PEG 화 인산칼슘 (CaP) 입자 (Pittela, et al., Biomaterials (2011) 32, p.3106 - 3114), PEG 화 실리카 입자 (Miyata, K., et al. Biomaterials (2010) 31, p4764 - 4770) 를 들 수 있다.
지질성 mRNA 캐리어는, 리피드 또는 카티오닉 리피드를 캐리어로 하여 형성되고, 그리고 mRNA 가 내포 혹은 결합된 형태에 있다. 예를 들어, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTMA), 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카르복시아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미늄트리플루오로아세트산 (DOSPA), 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모늄)프로판 (DOTAP), N-[1-(2,3-디미리스틸옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)암모늄브로마이드 (DMRIE) 또는 DC-콜레스테롤과 같은 카티온성 지질 ; 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC) 또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE) 과 같은 중성 인지질 ; PEG 화 지질 ; 및 콜레스테롤로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 복수로 이루어지고, 그것과 mRNA 를 혼합하여 얻어지는 것이다.
카티온성 폴리머 복합체는, 예를 들어, 직사슬형 혹은 분지형 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리아르기닌, 키토산 유도체, 폴리메타크릴산 유도체와 mRNA 의 혼합물이다.
이들 수송 담체는, 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로 조제할 수 있다.
2.2.4. 아쥬반트
몇 개의 바람직한 양태에서는, RNA 백신은, 아쥬반트와 함께는 사용하지 않는다.
다른 몇 개의 양태에서는, RNA 백신은, 아쥬반트와 함께 사용한다. 아쥬반트와 함께 사용하는 경우, RNA 백신은, 아쥬반트와 함께 제제화되어도 된다. 아쥬반트는, 면역 반응을 증강하는 데에 바람직한 임의의 화합물이다. 그러한 아쥬반트는 공지이고, 당업자이면, 임의의 아쥬반트 중에서 적절한 것을 선택할 수 있다.
2.3. 질환의 예방 또는 치료
mRNA 백신은, 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에 있어서 당해 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
예방 또는 치료하는 질환은, 예를 들어, 암, 바이러스성 감염증, 세균성 감염증, 진균 감염증, 원생 생물 감염증, 및 자기면역질환을 들 수 있다. 전술한 mRNA 의 코드 영역이 코드하는 항원을, 예방 또는 치료하는 질환에 따라 적절히 선택함으로써, 당해 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
「대상」은, 인간, 또는 인간 이외의 생물, 예를 들어, 조류 및 비인간 포유 동물 (예를 들어, 소, 원숭이, 고양이, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 돼지, 개, 토끼, 양, 및 말) 이다.
mRNA 백신은, 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있다. 몇 개의 양태에서는, mRNA 백신은, 의약적으로 허용되는 첨가제를 포함한다. 의약적으로 허용되는 첨가제로는, 물, 의약적으로 허용되는 유기 용제, 콜라겐, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐 폴리머, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 잔탄검, 아라비아고무, 카세인, 한천, 폴리에틸렌글리콜, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 의약적으로 허용되는 계면 활성제 등을 들 수 있다.
상기 첨가제는, mRNA 백신의 제형에 따라 상기 중에서 단독으로 또는 적절히 조합하여 선택된다. 예를 들어, 주사용 제제로서 사용하는 경우, 정제된 2 본쇄 RNA 를 용제 (예를 들어 생리 식염수, 완충액, 포도당 용액 등) 에 용해하고, 이것에 Tween80, Tween20, 젤라틴, 인간 혈청 알부민 등을 첨가한 것을 사용할 수 있다. 혹은, 사용 전에 용해하는 제형으로 하기 위해서 동결건조한 것이어도 된다. 동결건조용 부형제로는, 예를 들어 만니톨, 포도당, 락토오스, 수크로오스, 소르비톨 등의 당류, 옥수수, 밀, 벼, 감자 또는 다른 식물 유래의 전분 등의 전분, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 등의 셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스고무 등의 고무, 젤라틴, 콜라겐 등등을 들 수 있다.
mRNA 백신의 투여량은, 대상의 연령, 성별, 증상, 투여 경로, 투여 횟수, 제형 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. mRNA 백신의 유효 투여량은, 질환의 징조 또는 상태를 경감하는 백신의 양이다. 이와 같은 mRNA 백신의 치료 효과 및 독성은, 세포 배양 또는 실험 동물에 있어서의 표준적인 약학적 순서, 예를 들어, ED50 (집단의 50 ％ 에 있어서 치료적으로 유효한 용량), 및 LD50 (집단의 50 ％ 에 대해 치사적인 용량) 에 의해 결정할 수 있다. 몇 개의 양태에서는, mRNA 백신의 투여량은, 성인에 대해, 1 일당 10 ng ∼ 1 g, 100 ng ∼ 100 mg, 1 ㎍ ∼ 10 ㎍, 또는 30 ㎍ ∼ 300 ㎍ 의 mRNA 의 범위로 한다.
mRNA 백신의 투여 경로는 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어, 경피, 비강 내, 경기관지, 근 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 직장 내, 및 질 내의 경로를 포함하지만, 이들 경로로 한정되는 것은 아니다.
mRNA 백신의 투여 횟수는, 1 회, 또는 부작용이 임상상 허용되는 범위 내인 한 복수회로 할 수 있다.
몇 개의 양태에서는, mRNA 백신 투여에 있어서의 항체가 또는 세포성 면역 활성을 측정한다. 예를 들어, 항체가는, 생체로부터 혈액을 채취하고, 혈청 중의 IgG 를 정량함으로써 평가할 수 있다. 세포성 면역 활성은, 생체로부터 림프구를 분리 및 배양하고, 3H-티미딘의 흡수를 측정함으로써 평가할 수 있다.
2.4. 키트
본 발명의 제 2 양태의 키트는, 상기 mRNA 백신을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다. 당해 키트는, 예를 들어, 상기 RNA 백신을 사용한 상기 각종 질환의 치료 방법에 바람직하게 사용할 수 있다.
키트에 있어서, 상기 mRNA 백신의 보존 상태는, 한정은 되지 않고, 그 안정성 (보존성) 및 사용 용이성 등을 고려하여 용액상 또는 분말상 등의 상태를 선택할 수 있다.
키트는, 상기 mRNA 백신 이외에, 다른 구성 요소를 포함하고 있어도 된다. 다른 구성 요소로는, 예를 들어, 각종 버퍼 및 사용 설명서 (사용 매뉴얼) 를 들 수 있다. 키트에는, 아쥬반트를 포함해도 되고, 포함하지 않아도 된다. 바람직하게는, 키트는, 아쥬반트를 포함하지 않는다.
3. 본 발명의 제 3 양태
3.1. 본 발명의 제 3 양태의 개요
2 본쇄 RNA 인식에 있어서 세포 내 수용체인 RIG-I 가 중요한 역할을 담당하는 것이 알려져 있다. 그리고, RIG-I 와 2 본쇄 RNA 의 결합에 있어서, 편방의 RNA 사슬의 5' 말단이 트리인산화되어 있는 것이 중요하다는 보고도 있다. 5' 말단이 트리인산화된 제 2 RNA 올리고머를 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하고, 이것을 mRNA 에 하이브리다이즈한 2 본쇄 mRNA 를 제작하였다. 도 37 의 2 본쇄 mRNA 는, 1 개의 mRNA 에 대해, 5 개의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈시킨 것을 예시하고 있다. 한편, 후술하는 실시예에서는, 1 개의 mRNA 에 대해, 1 ∼ 3 개의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈시킨 것을 사용하였다. 이들 2 본쇄 mRNA 를 사용한 경우, 하이브리다이즈시키고 있지 않은 mRNA 와 비교해, 면역 부활화 작용이 향상되고 (도 38 및 39), 또, mRNA 의 발현 효율은 유지되었다 (도 40). 이때, 면역 부활화 작용은, mRNA 에 하이브리다이즈하는 2 본쇄 RNA 올리고머의 개수가 증가함에 따라 향상되었다 (도 38 및 39). 따라서, RIG-I 가 RNA 올리고머를 하이브리다이즈시킨 mRNA 에 대한 염증 반응에 강하게 관계되어 있는 것이 시사되었다.
본 발명의 제 2 양태의 특정 mRNA 백신은 단백질 발현 효율이 약간 저하했지만 (도 40 의 「mRNA : pU」), 상기 2 본쇄 mRNA 를 사용한 경우, 번역 활성이 충분히 유지되었다 (도 40 의 「1 개」, 「2 개」 및 「3 개」). 또한, 하이브리다이즈하는 RNA 올리고머수를 조정함으로써, 면역 응답의 강도를 조정할 수 있었다 (도 38 및 39 의 「1 개」, 「2 개」 및 「3 개」). 과도한 염증은 부작용의 원인으로도 되는 외에, 백신 효과를 얻는 데에 있어서도 바람직하지 않을 가능성이 있다. RNA 올리고머의 수를 변경함으로써, 금회의 면역 응답의 강도를 조정할 수 있었던 점은, 백신 효과를 얻는 데에 적당한 강도의 염증 반응을 얻는 데에 있어서 매우 중요해진다.
또, 본 발명의 제 3 양태의 mRNA 백신은, 제 2 양태의 mRNA 백신과 비교해, RIG-I 인식에 필요한 평활 5' 말단 트리인산화 구조를 구축하는 것이 용이하다.
또한, 본 발명의 제 3 양태의 mRNA 백신은, in vitro 전사로 제 2 RNA 사슬을 조제할 때에 부산물로서 목적 RNA 의 상보 사슬 RNA 가 전사되지만, 제 2 양태의 특정 mRNA 백신과 비교해, 그 부산물의 산생을 용이하게 회피할 수 있다.
3.2. mRNA 백신
본 발명의 제 3 양태는, 항원을 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 제 1 RNA 올리고머와, 당해 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈한 제 2 RNA 올리고머로 이루어지는 2 본쇄 RNA 를 포함하고,
제 1 RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 제 1 RNA 서열과, 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열로 이루어지는 제 2 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열,
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 제 1 RNA 서열과, 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 제 2 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하는 제 2 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열,
(c) 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열로 이루어지는 제 2 RNA 서열과, mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 제 1 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열, 또는
(d) 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 제 2 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하는 제 2 RNA 서열과, mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 제 1 RNA 서열과, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열
을 포함하는, mRNA 백신을 제공한다.
3.2.1. mRNA
mRNA 는, 메신저 RNA 를 의미하고, 통상, 5' 비번역 영역 (5'UTR) 과 코드 영역과 3' 비번역 영역 (3'UTR) 을 포함한다. mRNA 는, 또한, 통상, 5' 말단의 캡 구조 (5'Cap) 와 3' 말단의 poly A 서열을 포함한다.
mRNA 백신에 사용하는 mRNA 는, 다음 중 어느 것이어도 된다.
(1) 5'Cap, 5'UTR, 코드 영역, 3'UTR, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
(2) 5'Cap, 5'UTR, 코드 영역, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
(3) 5'UTR, 코드 영역, 3'UTR, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
(4) 5'UTR, 코드 영역, 및 poly A 를 이 순서로 포함하는 mRNA.
mRNA 백신에 사용하는 mRNA 는, 공지된 방법에 의해, 목적 유전자를 코드하는 템플릿 DNA 를 in vitro 환경하에서 전사함으로써 제작할 수 있다. 예를 들어, Blood 108(13) (2006) 4009 - 17 에 기재된 방법에 따라, 제작할 수 있다. 구체적으로는, 단백질 코드 서열의 하류에 poly A/T 사슬이 삽입된 주형 DNA 를 poly A/T 사슬의 바로 하류에서 절단하고, 번역 효소, 뉴클레오시드, 5' 캡 아날로그를 포함하는 버퍼 용액 중에서 in vitro 전사를 실시하고, 그 후, mRNA 를 정제함으로써 제작한다. mRNA 의 보다 구체적인 조제 방법은, 후술하는 실시예에 기재된 바와 같다.
mRNA 의 코드 영역에 의해 코드되는 항원으로는, 면역 응답을 유발하는 데에 바람직한 공지된 항원으로부터 임의로 선택할 수 있다. 항원으로는, 보다 구체적으로는, 종양 항원, 바이러스 유래 항원, 세균 유래 항원, 진균 유래 항원, 원생 생물 유래 항원, 동물 유래 항원, 식물 유래 항원, 자기면역질환의 자기 항원 등을 들 수 있다. mRNA 에 코드되는 항원은, 1 개의 항원이어도 되고, 혹은, 2 개 이상 (예를 들어, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이상) 의 동일 또는 상이한 항원이어도 된다. 본 발명의 제 3 양태의 몇 개의 양태에서는, mRNA 의 코드되는 항원은, 1 개의 항원이다.
mRNA 의 poly A 서열의 길이는, 예를 들어, 10 ∼ 500 염기이고, 바람직하게는, 30 ∼ 300 염기이며, 보다 바람직하게는, 60 ∼ 250 염기이다.
mRNA 의 5'UTR 과 3'UTR 의 서열은, 천연으로 생기는 서열과 100 ％ 의 서열 동일성을 갖는 것으로 해도 되고, 혹은, 부분적 또는 그 전체를 다른 5'UTR 및/또는 3'UTR 의 서열로 치환해도 된다. 다른 5'UTR 및/또는 3'UTR 의 서열로는, 예를 들어, 글로빈, 하이드록시스테로이드(17-β)디하이드로게나제 4 (hydroxysteroid(17-β)dehydrogenase 4), 또는 알부민을 코드하는 mRNA 의 5'UTR 및/또는 3'UTR 의 서열을 들 수 있다.
몇 개의 양태에서는, mRNA 는 수식되어 있지 않다. 이 경우, mRNA 자체는 천연의 것이기 때문에 번역의 과정은 거의 장애를 받지 않는 것을 기대할 수 있다.
다른 몇 개의 양태에서는, mRNA 를 더욱 안정화시키기 위해서 mRNA 는 수식되어 있다. mRNA 의 수식으로는, mRNA 의 염기의 화학 수식, mRNA 의 코드 영역의 G/C 함량의 수식, mRNA 의 Cap 구조의 수식 등을 들 수 있다.
mRNA 의 염기의 화학 수식은, 예를 들어, mRNA 의 효소 내성을 향상시키는 것이 알려져 있는 것이다. 그러한 mRNA 자체의 화학 수식 염기는, 예를 들어, 메틸화염기 (예를 들어, 5-메틸시토신), 황 수식 염기 (예를 들어, 2-티오우리딘), 슈도우리딘, N1 메틸슈도우리딘 및 5-메톡시우리딘을 들 수 있다.
mRNA 의 코드 영역의 G/C 함량의 수식은, G (구아닌)/C (시토신) 의 함유량이 많아지도록 수식하는 것이고, 이로써, 보다 안정적인 mRNA 로 할 수 있다.
mRNA 의 Cap 구조의 수식은, 5' 측의 1 번째 혹은 2 번째의 리보스의 2 위치를 메톡시기로 하는 것이고, 이로써, 발현 효율이 향상되는 것도 알려져 있다.
mRNA 의 조제 및 수식은, 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
3.2.2. RNA 올리고머
본 발명의 제 3 양태에서는, 적어도 1 개의 제 1 RNA 올리고머가 mRNA 에 하이브리다이즈한다. 또, 추가로 제 2 RNA 올리고머가 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하고 있다.
제 1 RNA 올리고머는,
(a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 제 1 RNA 서열과, 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열로 이루어지는 제 2 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열,
(b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 제 1 RNA 서열과, 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 제 2 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하는 제 2 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열,
(c) 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열로 이루어지는 제 2 RNA 서열과, mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 제 1 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열, 또는
(d) 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 제 2 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하는 제 2 RNA 서열과, mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 제 1 RNA 서열과, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열
을 포함하는 RNA 사슬이다.
「90 ％ 이상의 동일성을 갖는 RNA 서열」에 있어서의 「90 ％ 이상」의 범위는, 예를 들어, 90 ％ 이상, 91 ％ 이상, 92 ％ 이상, 93 ％ 이상, 94 ％ 이상, 95 ％ 이상, 96 ％ 이상, 97 ％ 이상, 98 ％ 이상, 99 ％ 이상, 99.1 ％ 이상, 99.2 ％ 이상, 99.3 ％ 이상, 99.4 ％ 이상, 99.5 ％ 이상, 99.6 ％ 이상, 99.7 ％ 이상, 99.8 ％ 이상, 또는 99.9 ％ 이상이다. 상기 동일성의 수치는, 일반적으로 클수록 바람직하다. 또한, RNA 서열의 동일성은, BLAST (예를 들어, Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990) 참조) 등의 해석 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. BLAST 를 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다.
「mRNA 에 하이브리다이즈한다」란, 후술하는 하이브리다이즈 조건으로, RNA 올리고머가 mRNA 에 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. 「제 1 RNA 에 하이브리다이즈한다」란, 후술하는 하이브리다이즈 조건으로, 제 2 RNA 올리고머가 제 1 RNA 에 하이브리다이즈하는 것을 의미한다.
제 1 RNA 올리고머의 제 1 RNA 서열은, mRNA 의 연속하는 12 ∼ 40 염기의 서열에 하이브리다이즈하도록 설계되어 있다. 몇 개의 양태에서는, 제 1 RNA 올리고머의 제 1 RNA 서열은, mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 30 염기의 서열로 이루어진다. 보다 바람직하게는, 제 1 RNA 올리고머의 제 1 RNA 서열은, mRNA 의 서열에 상보적인 15 ∼ 23 염기의 서열로 이루어지는 것이다. 더욱 바람직하게는, 제 1 RNA 올리고머의 서열의 제 1 RNA 서열은, mRNA 의 서열에 상보적인 17 염기의 서열로 이루어지는 것이다.
RNA 올리고머를 하이브리다이즈시키는 mRNA 중의 위치는, 5'UTR, 코드 영역, 3'UTR, 및 poly A 서열 중 어느 위치여도 된다. RNA 올리고머는, mRNA 의 2 차 구조를 예측하고, mRNA 사슬이 2 차 구조를 가지지 않는 부분에 대해 하이브리다이즈하도록 RNA 올리고머를 설계하는 것이 바람직하다. 즉, RNA 올리고머는, mRNA 전체 서열 중 2 차 구조를 가지지 않는 부분에 대해 하이브리다이즈하도록 설계하는 것이 바람직하다. mRNA 의 2 차 구조를 예측하는 소프트웨어로는, 예를 들어, 후술하는 실시예에 기재된 것을 들 수 있다. 몇 개의 양태에서는, RNA 올리고머는, mRNA 의 5'UTR, 코드 영역 및 3'UTR 의 적어도 1 개의 서열에 하이브리다이즈하도록 설계한다.
제 1 RNA 올리고머의 제 2 RNA 서열은, 제 1 RNA 서열이 상기 각 염기 길이인 것에 추가하여, 제 2 RNA 올리고머의 연속하는 10 ∼ 200 염기의 서열에 하이브리다이즈하도록 설계되어 있다. 몇 개의 양태에서는, 제 1 RNA 올리고머의 제 2 RNA 서열은, 제 1 RNA 서열이 상기 각 염기 길이인 것에 추가하여, 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 15 ∼ 150 염기의 서열로 이루어진다. 보다 바람직하게는, 제 1 RNA 올리고머의 제 2 RNA 서열은, 제 1 RNA 서열이 상기 각 염기 길이인 것에 추가하여, 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 20 ∼ 100 염기의 서열로 이루어지는 것이다. 더욱 바람직하게는, 제 1 RNA 올리고머의 서열의 제 2 RNA 서열은, 제 1 RNA 서열이 상기 각 염기 길이인 것에 추가하여, 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 20 ∼ 80 염기의 서열로 이루어지는 것이다.
제 1 RNA 올리고머의 제 2 RNA 서열은, 예를 들어, 다음과 같이 설계한다. 즉, 이하의 (i) ∼ (iv) 의 적어도 1 개를 만족하도록, 보다 바람직하게는, 2 개, 3 개, 또는 4 개를 만족하도록 설계한다. 몇 개의 바람직한 양태에서는, 제 1 RNA 올리고머의 제 2 RNA 서열은, 적어도 이하의 (i) 및 (ii) 를 만족하도록, 보다 바람직하게는, 또한 이하의 (iii) 및 (iv) 의 적어도 1 개를 만족하도록 설계한다.
(i) 템플릿 DNA 를 in vitro 환경하에서 전사함으로써 5' 말단 트리인산화를 포함하는 제 2 RNA 올리고머를 조제할 때에, 목적 RNA 올리고머에 대한 상보 사슬 RNA (부산물) 가 형성되지 않도록 하는 것,
(ii) 제 2 RNA 올리고머가 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하고 있는 측의 2 본쇄 RNA 의 말단이, 5' 말단 트리인산화 구조, 바람직하게는 평활 5' 말단 트리인산화 구조를 취하도록 하는 것,
(iii) 제 2 RNA 서열 및 제 2 RNA 올리고머가 mRNA 상의 서열에 하이브리다이즈하지 않는 것, 및
(iv) 제 1 및 제 2 RNA 올리고머가 2 차 구조를 만들지 않는 것.
여기서, 「(i) 템플릿 DNA 를 in vitro 환경하에서 전사함으로써 5' 말단 트리인산화를 포함하는 제 2 RNA 올리고머를 조제할 때에, 목적 RNA 올리고머에 대한 상보 사슬 RNA (부산물) 가 형성되지 않도록 한다」를 위해서는, 예를 들어, 다음과 같이 설계한다. 즉, 상보 사슬 RNA 의 전사에 필요한 염기를 제거하고 제 2 RNA 올리고머를 조제한다. 그래서, 그 염기를 제거해도, 목적으로 하는 제 2 RNA 올리고머가 전사되도록, 템플릿 DNA 를 설계한다. 예를 들어, 서열 GUGUGUGUGU (서열 번호 67) 를, in vitro 전사할 때, 서열 ACACACACAC (서열 번호 68) 가 부산물로서 생길 수 있지만, A 를 제거하고 in vitro 전사함으로써 이 부산물의 생성은 회피된다. 그리고, 이와 같은 제 2 RNA 올리고머를 조제할 수 있도록, 제 1 RNA 올리고머의 제 2 RNA 서열을 설계한다.
또, 「(ii) 제 2 RNA 올리고머가 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하고 있는 측의 2 본쇄 RNA 의 말단이, 5' 말단 트리인산화 구조, 바람직하게는 평활 5' 말단 트리인산화 구조를 취하도록 한다」를 위해서는 다음과 같이 설계한다.
즉, 제 1 RNA 올리고머가 상기 (a) 의 RNA 서열 또는 상기 (b) 의 RNA 서열일 때는, 5' 말단에 트리인산화 구조를 갖는 제 2 RNA 올리고머를 in vitro 전사시킴으로써 제 2 올리고머를 조제한다. 바람직하게는, 이때, 제 2 올리고머의 5' 말단과, 제 1 올리고머의 3' 말단이 하이브리다이즈했을 때에 평활 말단이 되도록 제 1 올리고머를 조제한다. 그리고, 이와 같은 제 1 및 제 2 RNA 올리고머를 조제할 수 있도록, 제 1 RNA 올리고머의 제 2 RNA 서열을 설계한다.
한편, 제 1 RNA 올리고머가 상기 (c) 의 RNA 서열 또는 상기 (d) 의 RNA 서열일 때는, 제 1 RNA 올리고머를 in vitro 전사시킴으로써 제 1 RNA 올리고머를 조제한다. 바람직하게는, 이때, 제 1 RNA 올리고머의 5' 말단과, 제 2 RNA 올리고머의 3' 말단이 하이브리다이즈했을 때에 평활 말단이 되도록 제 2 올리고머를 조제한다. 그리고, 이와 같은 제 1 및 제 2 RNA 올리고머를 조제할 수 있도록, 제 1 RNA 올리고머의 제 2 RNA 서열을 설계한다.
「(iii) 제 2 RNA 서열 및 제 2 RNA 올리고머가 mRNA 상의 서열에 하이브리다이즈하지 않는다」와 같게 하기 위해서는, 설계 후의 2 차 구조를, 복수의 RNA 사슬의 2 차 구조를 예측할 수 있는 소프트 (NUPACK, http://www.nupack.org) 등으로 검증한다.
「(iv) 제 1 및 제 2 RNA 올리고머가 2 차 구조를 만들지 않는다」와 같이 하기 위해서는, 설계 후의 2 차 구조를, 복수의 RNA 사슬의 2 차 구조를 예측할 수 있는 소프트 (NUPACK, http://www.nupack.org) 등으로 검증한다.
제 1 RNA 올리고머의 제 1 RNA 서열과 제 2 RNA 서열 사이에는, 링커 서열이 포함되어 있어도 되고, 포함되어 있지 않아도 된다. 몇 개의 양태에서는, 링커 서열이 포함된다. 링커 서열의 염기 길이는, 제 1 RNA 서열과 제 2 RNA 서열이 상기 각 염기 길이인 것에 추가하여, 바람직하게는 1 ∼ 100 염기이고, 보다 바람직하게는 2 ∼ 30 염기이며, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 20 염기이다. 링커 서열은, 구체적으로는, mRNA 나 RNA 올리고머의 다른 부위와 하이브리다이즈하지 않도록, 또는 하이브리다이즈하기 어렵도록 설계한다. 몇 개의 양태에서는, 링커 서열은, mRNA 에 하이브리다이즈하기 어렵도록, 아데닌 (A) 이나 우라실 (U) 을 사용한 링커를 설계한다. 이때, U 를 사용한 링커는 일정 이상 길어지면 poly A 와 결합할 가능성이 있으므로, 원칙적으로 A 를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 링커 서열은, 상기 염기 길이의 올리고아데닌 서열이다. 단, 링커 서열의 그 위치에 대응하는 mRNA 가 우라실 (U) 이면, 그 위치의 염기를 아데닌 (A) 으로 하면 mRNA 에 하이브리다이즈되어 버린다. 이 경우, 그 위치의 염기를 우라실 (U) 로 변경하는 것이 바람직하다.
제 1 RNA 올리고머는, 또한, 다른 서열을 포함하도록 해도 되고, 혹은, 다른 서열을 포함하지 않도록 해도 된다. 몇 개의 양태에서는, 다른 서열이 포함된다. 「다른 서열」은, 예를 들어, RNA 올리고머를 제작할 때에 남은 프로모터 서열, 제한 효소 서열, 그 외 RNA 올리고머 설계 시 부득이하게 남는 서열, 또는 그 일부이다. 「다른 서열」을 포함하는 경우, 「다른 서열」의 염기 길이는, 예를 들어, 1 ∼ 30 염기이고, 바람직하게는, 1 ∼ 25 염기이며, 보다 바람직하게는, 1 ∼ 2 염기이다.
제 2 RNA 올리고머는, 제 1 RNA 올리고머의 제 2 RNA 서열에 하이브리다이즈하는 예를 들어 10 ∼ 200 염기의 서열을 포함하고, 바람직하게는 15 ∼ 150 염기의 서열을 포함하며, 보다 바람직하게는 20 ∼ 100 염기의 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 24 염기의 서열을 포함한다. 제 2 RNA 올리고머의 설계 방법은, 상기 제 1 RNA 올리고머의 제 2 RNA 서열에서 설명한 바와 같다.
제 2 RNA 올리고머는, 또한 다른 서열을 포함하도록 해도 되고, 혹은, 다른 서열을 포함하지 않도록 해도 된다. 「다른 서열」은, 예를 들어, RNA 올리고머를 제작할 때에 남은 프로모터 서열, 제한 효소 서열, 그 외 RNA 올리고머 설계 시 부득이하게 남는 서열, 또는 그 일부이다. 「다른 서열」을 포함하는 경우, 「다른 서열」의 염기 길이는, 예를 들어, 1 ∼ 30 염기이고, 바람직하게는, 1 ∼ 25 염기이며, 보다 바람직하게는, 1 ∼ 2 염기이다.
몇 개의 양태에서는, 제 1 및 제 2 RNA 올리고머는, 화학 수식을 포함하지 않는 것이다. 다른 몇 개의 양태의 제 1 및 제 2 RNA 올리고머는, 화학 수식을 포함하는 것이다. 화학 수식은, 예를 들어, 소수성기에 의한 수식을 들 수 있다. 소수성기에 의한 수식으로는, 콜레스테롤 수식, 및 토코페롤 수식을 들 수 있다. 또, 화학 수식으로는, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 수식도 들 수 있다.
또한, 「화학 수식」의 정의에는, 5' 말단의 트리인산 구조는 포함되지 않는다.
제 1 및 제 2 RNA 올리고머의 조제는, 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해 실시할 수 있다. 구체적으로는, 제 1 및 제 2 RNA 올리고머는, 예를 들어, 템플릿 DNA 로부터 in vitro 전사로 제작된다. 원리상, 제 1 및 제 2 RNA 올리고머의 조제는, 전술한 mRNA 의 제작과 대략 동일하게 하여 실시할 수 있지만, mRNA 는 전사 시에 5' 캡 아날로그를 첨가하고 있는 것에 대해, 제 1 및 제 2 RNA 올리고머의 제작 시에는 캡 아날로그를 첨가하지 않고 제작한다. 이와 같이 생물학적으로 제 1 및 제 2 RNA 올리고머를 조제한 경우, 5' 말단에 트리인산 구조를 갖는 것으로 할 수 있다. 트리인산의 제거 방법은, 후술과 같다. 5' 말단에 트리인산 구조를 갖지 않는 쪽의 RNA 올리고머에 관해서는, 화학 합성할 수 있다.
3.2.3. 2 본쇄 RNA
여기서, 「2 본쇄 RNA」는, 전술한 mRNA 에 적어도 1 개의 전술한 제 1 RNA 올리고머가 하이브리다이즈하고, 또한 제 1 RNA 올리고머에 제 2 RNA 올리고머가 하이브리다이즈한 것이다. 또, 제 1 RNA 올리고머와, 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈한 제 2 RNA 올리고머로 이루어지는 것을, 「2 본쇄 RNA 올리고머」라고 하는 경우가 있다.
2 본쇄 RNA 는, mRNA 와 제 1 RNA 올리고머의 하이브리다이제이션 및 제 1 RNA 올리고머와 제 2 RNA 올리고머의 하이브리다이제이션에 의해 조제할 수 있다. 하이브리다이제이션은, 보다 구체적으로는, 후술하는 실시예에 기재된 조건 또는 그것에 준하는 조건으로 실시할 수 있다.
1 개의 mRNA 에 하이브리다이즈시키는 제 1 RNA 올리고머의 수는, 적어도 1 개이고, 바람직하게는 1 ∼ 50 개이며, 보다 바람직하게는 1 ∼ 15 개이고, 더욱 바람직하게는, 1 ∼ 5 개이다. 제 1 RNA 올리고머의 수가 1 ∼ 50 개의 범위이면, mRNA 의 번역 효율을 비교적 높은 레벨로 유지할 수 있다. 또, 1 개의 mRNA 에 하이브리다이즈시키는 제 1 RNA 올리고머와 제 2 RNA 올리고머로 이루어지는 2 본쇄 RNA 올리고머의 개수가 증가하면, 면역 부활 작용이 향상된다. 이 때문에, 1 개의 mRNA 에 하이브리다이즈시키는 제 1 RNA 올리고머와 제 2 RNA 올리고머로 이루어지는 2 본쇄 RNA 올리고머의 개수를 조절함으로써, 면역 반응을 조절할 수 있다.
그래서, 여기서는, 1 개의 mRNA 에 하이브리다이즈시키는 2 본쇄 RNA 올리고머의 개수를 조절하는 것을 포함하는, 면역 반응을 조절하는 방법이 제공된다.
또, 1 개의 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈시키는 제 2 RNA 올리고머의 수는 1 개이다.
RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈는, 공지된 방법 및 조건에 의해 실시할 수 있다. 보다 구체적으로는, 하이브리다이즈에서는, 가온하고, 일정 시간 정치한 후, 서서히 온도를 저하시킨다. 가온은, mRNA 나 올리고머의 분자 내, 분자 간에 미리 존재하는 상보적 결합을 품으로써, mRNA 와 올리고머를 보다 효율적으로 결합시키는 것을 목적으로 하여 실시한다. 적절한 하이브리다이즈가 보증된다면, 그 온도 시간은 적절히 조정 가능하다. 특히 poly A 나 poly U 는 미리 다른 서열과 결합하고 있을 가능성은 낮아, 보다 온화한 가온 조건의 설정이 가능하다. 온도 저하는 완만한 편이 하이브리다이즈의 특이성이 증가한다. 또, 올리고머 사슬 길이는, 하이브리다이즈의 조건 설정에 크게 영향을 주지 않는다. 하이브리다이즈 효율을 평가하면서, 적절히 조건을 설정해야 한다. 예를 들어, 후술하는 실시예에 기재된 방법 및 조건을 들 수 있다.
몇 개의 양태에서는, 2 본쇄 RNA 는, RNA 올리고머의 5' 말단의 트리인산 구조를 갖는다. RNA 올리고머의 5' 말단의 트리인산 구조를 갖는 것으로 함으로써, 보다 강한 염증 반응을 야기할 수 있다.
다른 몇 개의 양태에서는, 2 본쇄 RNA 는, RNA 올리고머의 5' 말단의 트리인산 구조를 갖지 않다. 트리인산화를 제거하는 방법은, 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로 실시할 수 있다. 트리인산화를 제거하는 방법으로는, 예를 들어, 후술하는 실시예와 같이, Antarctic 포스파타아제 (New England Biolabs, cat. no. M0289S) 를 사용하는 방법을 들 수 있다.
몇 개의 양태에서는, 2 본쇄 RNA 는, 제 2 RNA 올리고머가 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하고 있는 측의 말단이, 평활 말단이다. 평활 말단의 5' 에 트리인산화 구조가 있을 때에 RIG-I 를 개재한, 면역 유도가 향상되는 것이 알려져 있다. in vitro 전사에 의해 5' 말단 트리인산화를 포함하는 RNA 를 전사할 때, 목적 RNA 에 대한 상보 사슬 RNA 가 형성되지 않도록 설계한다. 여기서는, 상보 사슬 RNA 의 전사에 필요한 염기를 제거하고 RNA 를 조제한다. 그래서, 그 염기를 제거해도, 목적으로 하는 RNA 가 전사되도록 설계한다. 예를 들어, 서열 GUGUGUGUGU (서열 번호 67) 를, in vitro 전사할 때, 서열 ACACACACAC (서열 번호 68) 가 부산물로서 생길 수 있지만, A 를 제거하고 in vitro 전사함으로써 이 부산물의 생성은 회피된다.
몇 개의 양태에서는, 2 본쇄 RNA 는, 네이키드의 형태이다. 즉, 2 본쇄 RNA 는, 수송 담체를 수반하지 않는다.
다른 몇 개의 양태에서는, 2 본쇄 RNA 는, 수송 담체에 내포되는 형태이다. 수송 담체는, 2 본쇄 mRNA 를 내포하여, 대상의 체내의 바람직한 지점에 송달할 수 있는 것이면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 수송 담체는 지질성 mRNA 캐리어, 또는 카티온성 폴리머 복합체이고, 보다 바람직하게는, 고분자 미셀 또는 지질성 mRNA 캐리어이다.
고분자 미셀은, 응축한 핵산과 카티온성 폴리머로 형성되는 내핵과 친수성 폴리머로 형성되는 외각의 2 층 구조를 가지고 있다. 카티온성 폴리머는, 예를 들어, 폴리아미노산 유도체이다. 친수성 폴리머는, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (「PEG」) 이다. 내핵은, mRNA 를 물리적 또는 화학적으로 봉입한다. 외각은, 그 물리화학적인 성질에 의해, 내각에 봉입된 mRNA 를 소정의 조직에 송달한다. 고분자 미셀은, 엔도사이토시스에 의해 세포 내로 들어갈 수 있다. 고분자 미셀은, 예를 들어, 블록 폴리머 상의 폴리카티온과 핵산의 종합 작용 (폴리이온 컴플렉스 (「PIC」)) 을 이용할 수도 있는 외에, 그것과 무기 분자의 하이브리드 미셀을 이용할 수도 있다. PIC 형 고분자 미셀로는, 예를 들어, PEG-PAsp(DET)-Chol, PEG-PAsp(DET), PEG-PLys 와 mRNA 의 다분자 회합에 의해 형성되는 PIC 미셀이나, PAsp(TET), PAsp(TEP) 와 같은 다른 폴리카티온을 블록 공중합체에 사용한 것 (Uchida, S., et al., Biomaterials (2016) 82, p.221 - 228) 및 트리 블록 공중합체를 사용한 것 (Osawa, S., et al., Biomacromolecules 17, p354 - 361 (2016)) 을 들 수 있다. 무기 입자와의 하이브리드형 고분자 미셀로는, 예를 들어, PEG 화 인산칼슘 (CaP) 입자 (Pittela, et al., Biomaterials (2011) 32, p.3106 - 3114), PEG 화 실리카 입자 (Miyata, K., et al., Biomaterials (2010) 31, p4764 - 4770) 를 들 수 있다.
지질성 mRNA 캐리어는, 리피드 또는 카티오닉 리피드를 캐리어로 하여 형성되고, 그리고 mRNA 가 내포 혹은 결합된 형태에 있다. 예를 들어, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTMA), 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스페르민카르복시아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미늄트리플루오로아세트산 (DOSPA), 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모늄)프로판 (DOTAP), N-[1-(2,3-디미리스틸옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)암모늄브로마이드 (DMRIE) 또는 DC-콜레스테롤과 같은 카티온성 지질 ; 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC) 또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE) 과 같은 중성 인지질 ; PEG 화 지질 ; 및 콜레스테롤로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 복수로 이루어지고, 그것과 mRNA 를 혼합하여 얻어지는 것이다.
카티온성 폴리머 복합체는, 예를 들어, 직사슬형 혹은 분지형 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리아르기닌, 키토산 유도체, 폴리메타크릴산 유도체와 mRNA 의 혼합물이다.
이들 수송 담체는, 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로 조제할 수 있다.
3.2.4. 아쥬반트
몇 개의 바람직한 양태에서는, RNA 백신은, 아쥬반트와 함께는 사용하지 않는다.
다른 몇 개의 양태에서는, RNA 백신은, 아쥬반트와 함께 사용한다. 아쥬반트와 함께 사용하는 경우, RNA 백신은, 아쥬반트와 함께 제제화되어도 된다. 아쥬반트는, 면역 반응을 증강하는 데에 바람직한 임의의 화합물이다. 그러한 아쥬반트는 공지이고, 당업자이면, 임의의 아쥬반트 중에서 적절한 것을 선택할 수 있다.
3.3. 질환의 예방 또는 치료
mRNA 백신은, 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에 있어서 당해 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
예방 또는 치료하는 질환은, 예를 들어, 암, 바이러스성 감염증, 세균성 감염증, 진균 감염증, 원생 생물 감염증, 및 자기면역질환을 들 수 있다. 전술한 mRNA 의 코드 영역이 코드하는 항원을, 예방 또는 치료하는 질환에 따라 적절히 선택함으로써, 당해 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
「대상」은, 인간, 또는 인간 이외의 생물, 예를 들어, 조류 및 비인간 포유 동물 (예를 들어, 소, 원숭이, 고양이, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 돼지, 개, 토끼, 양, 및 말) 이다.
mRNA 백신은, 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있다. 몇 개의 양태에서는, mRNA 백신은, 의약적으로 허용되는 첨가제를 포함한다. 의약적으로 허용되는 첨가제로는, 물, 의약적으로 허용되는 유기 용제, 콜라겐, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐 폴리머, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 잔탄검, 아라비아고무, 카세인, 한천, 폴리에틸렌글리콜, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 의약적으로 허용되는 계면 활성제 등을 들 수 있다.
상기 첨가제는, mRNA 백신의 제형에 따라 상기 중에서 단독으로 또는 적절히 조합하여 선택된다. 예를 들어, 주사용 제제로서 사용하는 경우, 정제된 2 본쇄 RNA 를 용제 (예를 들어 생리 식염수, 완충액, 포도당 용액 등) 에 용해하고, 이것에 Tween80, Tween20, 젤라틴, 인간 혈청 알부민 등을 첨가한 것을 사용할 수 있다. 혹은, 사용 전에 용해하는 제형으로 하기 위해서 동결건조한 것이어도 된다. 동결건조용 부형제로는, 예를 들어 만니톨, 포도당, 락토오스, 수크로오스, 소르비톨 등의 당류, 옥수수, 밀, 벼, 감자 또는 다른 식물 유래의 전분 등의 전분, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 등의 셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스고무 등의 고무, 젤라틴, 콜라겐 등등을 들 수 있다.
mRNA 백신의 투여량은, 대상의 연령, 성별, 증상, 투여 경로, 투여 횟수, 제형 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. mRNA 백신의 유효 투여량은, 질환의 징조 또는 상태를 경감하는 백신의 양이다. 이와 같은 mRNA 백신의 치료 효과 및 독성은, 세포 배양 또는 실험 동물에 있어서의 표준적인 약학적 순서, 예를 들어, ED50 (집단의 50 ％ 에 있어서 치료적으로 유효한 용량), 및 LD50 (집단의 50 ％ 에 대해 치사적인 용량) 에 의해 결정할 수 있다. 몇 개의 양태에서는, mRNA 백신의 투여량은, 성인에 대해, 1 일당 10 ng ∼ 1 g, 100 ng ∼ 100 mg, 1 ㎍ ∼ 10 ㎍, 또는 30 ㎍ ∼ 300 ㎍ 의 mRNA 의 범위로 한다.
mRNA 백신의 투여 경로는 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어, 경피, 비강 내, 경기관지, 근 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 직장 내, 및 질 내의 경로를 포함하지만, 이들 경로로 한정되는 것은 아니다.
mRNA 백신의 투여 횟수는, 1 회, 또는 부작용이 임상상 허용되는 범위 내인 한 복수회로 할 수 있다.
몇 개의 양태에서는, mRNA 백신 투여에 있어서의 항체가 또는 세포성 면역 활성을 측정한다. 예를 들어, 항체가는, 생체로부터 혈액을 채취하고, 혈청 중의 IgG 를 정량함으로써 평가할 수 있다. 세포성 면역 활성은, 생체로부터 림프구를 분리 및 배양하고, 3H-티미딘의 흡수를 측정함으로써 평가할 수 있다.
3.4. 키트
본 발명의 제 3 양태의 키트는, 상기 mRNA 백신을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다. 당해 키트는, 예를 들어, 상기 RNA 백신을 사용한 상기 각종 질환의 치료 방법에 바람직하게 사용할 수 있다.
키트에 있어서, 상기 mRNA 백신의 보존 상태는, 한정은 되지 않고, 그 안정성 (보존성) 및 사용 용이성 등을 고려하여 용액상 또는 분말상 등의 상태를 선택할 수 있다.
키트는, 상기 mRNA 백신 이외에, 다른 구성 요소를 포함하고 있어도 된다. 다른 구성 요소로는, 예를 들어, 각종 버퍼 및 사용 설명서 (사용 매뉴얼) 를 들 수 있다. 키트에는, 아쥬반트를 포함해도 되고, 포함하지 않아도 된다. 바람직하게는, 키트는, 아쥬반트를 포함하지 않는다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 서술하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정하여 이해되어야 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1-1 : 각종 블록 공중합체의 합성
1.1. PEG-PAsp(DET)-Chol 의 합성
PEG-PAsp(DET)-Chol 은 기보에 따라 합성하였다 (Oba, M., et al., Biomaterials (2011) 32, p.652 - 663) (스킴 1). 합성 스킴은 이하와 같다.
스킴 1
[화학식 1]
Figure 112019077274450-pct00001
먼저, α-메톡시-ω-아미노-폴리에틸렌글리콜 (MeO-PEG-NH2, PEG 의 Mw : 12kDa) 을 개시제로 한 β-벤질-L-아스파르테이트-N-카르복실산 무수물 (NCA-BLA) 의 개환 중합에 의해, PEG-poly(β-벤질 L-아스파르테이트 (β-benzyl L-aspartate))(PEG-PBLA) 를 합성하였다. MeO-PEG-NH2 를 505 mg 취하고, 벤젠에 용해시켜 하룻밤 동결건조시켰다. 동결건조 후, Ar 분위기하에 있어서 디메틸포름아미드 (DMF) : 디클로로메탄 (DCM) = 1 : 10 혼합 용매에 MeO-PEG-NH2 및 NCA-BLA 를 완전히 용해시켰다. NCA-BLA 용액을 MeO-PEG-NH2 용액에 첨가하고, 25 ℃ 에서 3 일간 교반하였다. 반응 용액을 n-헥산/아세트산에틸 (3 : 2) 혼합 용액에 재침전시키고, PEG-PBLA 를 회수하였다. 그 후, PEG-PBLA 를 진공 건조시켜, 백색 분말을 얻었다. PBLA 의 중합도는 68 (n = 68) 이었다. 또한, 상기 식 중, m = 293 이었다.
다음으로, 합성한 PEG-PBLA 의 ω 말단에 콜레스테롤기를 도입하였다. DCM (4 mL) 에 용해시킨 PEG-PBLA (200 mg) 에, 11 v/v％ 트리에틸아민 (TEA)/DCM 혼합 용액 (200 μL) 에 용해시킨 콜레스테롤 클로로포르메이트 (Cholesterol chloroformate) (328 mg) 를 천천히 첨가하고, 실온에서 24 시간 교반하였다. 반응 용액을 디에틸에테르에 재침전시키고, PEG-PBLA-콜레스테롤 (Chol) 을 회수하였다.
회수한 PEG-PBLA-Chol 의 아미놀리시스 반응에 의해 PEG-PAsp(DET)-Chol 을 합성하였다. PEG-PBLA-Chol (100 mg) 을 벤젠에 용해시켜 동결건조하고, 건조한 PEG-PBLA-Chol 및 Dry 디에틸렌트리아민 (DET) (PBLA 에 대해 50 당량) 을 0.5 M 티오우레아로 한 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 에 용해시켰다. 이들 용액을 10 ℃ 로 냉각하고, PEG-PBLA-Chol 용액을 천천히 DET 용액에 적하하고, 1 시간 교반하였다. 반응 후, 용액 온도를 10 도 이하로 유지한 채 반응 용액을 5 N HCl 수용액으로 중화하고, 0.01 N HCl 수용액으로 4 ℃ 에서 1 일 투석을 실시하였다. 그 후, 이온 교환수로 4 ℃ 에서 또 1 일 투석을 실시하였다. 투석 후, 용액을 동결건조함으로써 PEG-PAsp(DET)-Chol 백색 분말을 얻었다.
1.2. PEG-PAsp(DET) 의 합성
또, 동일한 PEG-PBLA 의 아미놀리시스 반응에 의해 PEG-PAsp(DET) 를 합성하였다 (스킴 2).
스킴 2
[화학식 2]
Figure 112019077274450-pct00002
PEG-PBLA (200 mg) 를 벤젠에 용해시켜 동결건조하고, 건조한 PEG-PBLA 및 Dry 디에틸렌트리아민 (DET) (PBLA 에 대해 50 당량) 을 0.5 M 티오우레아로 한 NMP 에 용해시켰다. 이들 용액을 10 ℃ 로 냉각하고, PEG-PBLA 용액을 천천히 DET 용액에 적하하고, 1 시간 교반하였다. 반응 후, 용액 온도를 10 도 이하로 유지한 채 반응 용액을 5 N HCl 수용액으로 중화하고, 0.01 N HCl 수용액으로 4 ℃ 에서 1 일 투석을 실시하였다. 그 후, 이온 교환수로 4 ℃ 에서 또 1 일 투석을 실시하였다. 투석 후, 용액을 동결건조함으로써 PEG-PAsp(DET) 백색 분말을 얻었다. 또한, 상기 식 중, n = 68 이고, m = 293 이었다.
실시예 1-2 : mRNA 의 조제
mRNA 는 주형 DNA 로부터 in vitro 전사에 의해 조제하지만, 여기서 주형 DNA 는 이하와 같이 제작하였다. 먼저, T7-Gluc 플라스미드는, pCMV-Gluc 컨트롤 플라스미드 (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) 로부터 Gluc 코드 서열 (도 15 및 서열 번호 32) 을 pSP73 벡터 (Promega) 의 HindIII, Xba1 사이트에 삽입함으로써 제작하였다. 그 후, T7-Gluc poly A120 플라스미드를, T7-Gluc 플라스미드의 EcoR1-Bgl2 사이트에 A120- (BsmBI 절단 부위) 를 삽입함으로써 제작하였다. 그 후, BsmBI 로 절단한 후, T4 DNA Polymerase (다카라 바이오) 로 말단의 평활화를 이용하여, 이하의 in vitro 전사에 사용하였다.
mRNA 는, mMESSAGE mMACHINE (상품명) T7 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 가우시아루시페라아제 (Gluc) 를 코드한 상기 서술한 제한 효소 처리를 실시하고, 평활화한 템플릿 DNA (T7-Gluc poly A120 플라스미드) 를 in vitro 환경하에서 전사함으로써 제작하였다. 전사된 mRNA 는 RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 를 사용하여 정제, 회수하였다. 회수한 mRNA 농도는 NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) 에 의해 측정하였다. 또, Agilent 2100 바이오 애널라이저 (Agilent technologies) 를 사용한 전기 영동법에 의해 목적의 mRNA 가 작성되어 있는 것을 확인하였다.
NanoDrop 에 의해, 500 ∼ 1,000 ng/μL 라는 높은 농도로, 260 nm 와 280 nm 의 흡광도비가 2.0 ∼ 2.2 라는 고순도의 mRNA 의 제작이 확인되었다. 또, 바이오 애널라이저의 해석으로, 의도한 크기의 mRNA 의 제작이 확인되었다.
제작한 mRNA 의 서열을, 도 14 및 서열 번호 1 에 나타낸다. 도 14 의 서열에 있어서, 밑줄 부분이 오픈 리딩 프레임 (open reading frame (ORF)) 이고, ORF 의 상류가 5'UTR (54 염기) 이고, ORF 의 하류에 3'UTR (52 염기) 이 있고, 더 그 하류의 120A 가 poly A 서열이다.
여기서, Poly A 의 수에 대해, 이론상은 주형 DNA 에 120 bp 에 삽입되고, mRNA 에서는 119 염기이다. 그러나, DNA 증폭이나, mRNA 조제의 단계에서 그 수는 증감할 수 있다.
실시예 1-3 : RNA 올리고머의 하이브리다이제이션
RNA 올리고머를 다음과 같이 하여 설계하고, 조제하였다. RNA 2 차 구조 예측 소프트웨어 (http://rtips.dna.bio.keio.ac.jp/ipknot/) 로, Gluc mRNA 의 2 차 구조를 예측하고, RNA 사슬이 2 차 구조를 가지지 않는 부분에 대해 RNA 올리고머를 설계하였다. RNA 올리고머는, 5' 말단 또는 3' 말단의 콜레스테롤 수식을 포함하고, 홋카이도 시스템 사이언스사에서, 의뢰 합성하였다. 또한, 하기 RNA 올리고머의 서열 중의 밑줄부는 오버행 서열을 나타낸다. 또, 미스매치 Chol-RNA 올리고는, mRNA 와 하이브리다이즈하지 않는 19 mer 의 Chol 수식 폴리 A 이다. 「Chol-overhang」은, RNA 올리고머의 5' 말단이 콜레스테롤 수식되어 있는 것을 나타내고, 「Chol-overhang 3'」는 RNA 올리고머의 3' 말단이 콜레스테롤 수식되어 있는 것을 나타낸다.
RNA 올리고머
17 mer(1) (서열 번호 2) : UCUUUGAGCACCUCCAG
17 mer(2) (서열 번호 3) : CUCUAGAUGCAUGCUCG
17 mer(3) (서열 번호 4) : CUCGGCCACAGCGAUGC
17 mer(4) (서열 번호 5) : GCGGCAGCCACUUCUUG
17 mer(5) (서열 번호 6) : AUCUCAGGAAUGUCGAC
23 mer (서열 번호 7) : UCCAUCUCUUUGAGCACCUCCAG
40 mer (서열 번호 8) : CUUUCCGGGCAUUGGCUUCCAUCUCUUUGAGCACCUCCAG
60 mer (서열 번호 9) : ACAGCCCCUGGUGCAGCCAGCUUUCCGGGCAUUGGCUUCCAUCUCUUUGAGCACCUCCAG
overhang 2base(1) (서열 번호 10) : AAUCUUUGAGCACCUCCAG
Chol-overhang 0(1) (17 mer(1) ; 서열 번호 2) : UCUUUGAGCACCUCCAG
Chol-overhang 2base(1) (서열 번호 10) : AAUCUUUGAGCACCUCCAG
Chol-overhang 5base(1) (서열 번호 11) : AAUAAUCUUUGAGCACCUCCAG
Chol-overhang 0(2) (17 mer(2) ; 서열 번호 3) : CUCUAGAUGCAUGCUCG
Chol-overhang 2base(2) (서열 번호 12) : AACUCUAGAUGCAUGCUCG
Chol-overhang 5base(2) (서열 번호 13) : AAUAACUCUAGAUGCAUGCUCG
Chol-overhang 2base(3) (서열 번호 14) : AACUCGGCCACAGCGAUGC
Chol-overhang 2base(4) (서열 번호 15) : AAGCGGCAGCCACUUCUUG
Chol-overhang 2base(5) (서열 번호 16) : AUAUCUCAGGAAUGUCGAC
Chol-overhang 2base(6) (서열 번호 17) : AAGCAGCCAGCUUUCCCGG
Chol-overhang 2base(7) (서열 번호 18) : AAACUCUUUGUCGCCUUCG
Chol-overhang 2base(8) (서열 번호 19) : AAUUGAGGCAGCCAGUUGU
Chol-overhang 2base(9) (서열 번호 20) : UAGUGGGACAGGCAGAUCA
Chol-overhang 2base(10) (서열 번호 21) : AAUUGAAGUCUUCGUUGUU
Chol-overhang 2base(11) (서열 번호 22) : AAUUUUUUUUUUUUUUUUU
Chol-overhang 3' 2base(1) (서열 번호 23) : UCUUUGAGCACCUCCAGAU
미스매치 Chol-RNA 올리고 (서열 번호 24) : AAAAAAAAAAAAAAAAAAA
mRNA 에 대해 1 당량의 RNA 올리고머 (overhang 2base(1)) 를, 65 ℃ 에서 5 분 가열하고, 10 분에 걸쳐 30 ℃ 까지 냉각함으로써, 하이브리다이제이션을 실시하였다. 조제한 RNA 올리고머 수식 mRNA 의 평가는 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 실시하였다. mRNA 용액 (1 × TBE 버퍼) 에 최종 농도가 5 wt％ 가 되도록 글리세롤 용액을 첨가하고, 100 V, 800 mA, 200 W, 30 분의 조건으로 전기 영동을 실시하였다.
그 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1(2) 및 (3) 에서는 각각 Chol 수식하고 있지 않은 RNA 올리고머 (overhang 2base(1)), 하이브리다이즈하고 있지 않은 mRNA 의 전기 영동을 실시하였다. 도 1(1) 에서는, 도 1(2) 에서 하이브리다이즈한 양의 1/16 양의 RNA 올리고머 (overhang 2base(1)) 만을 전기 영동하였다. 도 1(2) 에서 하이브리다이즈가 일어나 있지 않으면, 도 1(1) 과 동일한 위치에 RNA 올리고머 유래의 밴드가 보일 것이지만, 실제 거의 보이지 않았다. 즉 대다수의 RNA 올리고머가 하이브리다이즈하고 있는 것이 확인되었다.
이와 같이, 본 실시예에서는, RNA 올리고머가 하이브리다이즈하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 1-4 : 배양 세포 및 무세포 (Cell-free) 계에 있어서의 mRNA 발현능 평가
배양 세포를 사용한 평가에서는, RAW 264.7 세포를 12 웰 플레이트에 300,000 세포/웰이 되도록 파종하고, 10 v/v％ 소 태아 혈청 (FBS) 을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 중에서 24h 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, DMEM 을 Opti-MEM (상품명) (Thermo Fisher Scientific) 으로 치환하고, 실시예 1-2 에서 조제한 Gluc mRNA 또는 실시예 1-3 에서 조제한 RNA 올리고머 (17 mer(1), 23 mer, 40 mer 또는 60 mer) 를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 가 1 ㎍/웰이 되도록 Lipofectamine (상품명) LTX (Thermo Fisher Scientific) 와 mRNA 로 이루어지는 컴플렉스를 첨가하였다. 트랜스펙션으로부터 4h 후, 배지를 회수하고, 거기에 포함되는 Gluc 의 양을 루미노미터로 평가하였다.
무세포 (Cell-free) 계에서의 평가에서는, Rabbit Reticulocyte Lysate 시스템 (Promega) 을 사용하여, 실시예 1-2 에서 조제한 mRNA 또는 실시예 1-3 에서 조제한 RNA 올리고머 (17 mer(1), 23 mer, 40 mer 또는 60 mer) 를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 의 발현능을 평가하였다. 프로토콜에 따라, mRNA 를 포함하는 혼합 용액을 조제한 후, 30 ℃ 에서 90 분 인큐베이트하였다. 발현한 Gluc 는 루미노미터를 사용하여 발광 강도를 측정함으로써 평가하였다.
그 결과를 도 2 에 나타낸다. 도 2(A) 에 나타내는 바와 같이, 배양 세포에의 mRNA 도입 효율을 검토한 바, 23 mer 이상의 사슬 길이의 올리고머를 하이브리다이즈한 경우 (23 mer, 40 mer, 60 mer), 하이브리다이즈하고 있지 않은 mRNA 를 사용한 경우 (올리고(-)) 와 비교해 유의하게 Gluc 발현량이 저하하여 있었다. 한편으로, 17 mer 의 올리고머를 수식한 경우의 발현량은 하이브리다이즈하고 있지 않은 mRNA 를 사용한 경우와 대략 동등하였다. 한편으로, 도 2(B) 에 나타내는 바와 같이, 무세포계에서의 단백질 번역 효율은, RNA 올리고머의 사슬 길이에 의하지 않고 일정하고, 하이브리다이즈하고 있지 않은 mRNA 와 대략 동일한 정도였다. 즉, 무세포계에서는 하이브리다이즈에 의한 번역 효율의 저하는 보이지 않았다. 이상의 실험으로부터, 세포 내의 어떠한 기구에 의해 장사슬 길이를 하이브리다이즈한 경우에 발현이 약간 저하하는 것을 알 수 있었다. 이들 점에서, RNA 올리고머의 사슬 길이는 12 ∼ 40 mer 로 하는 것이 바람직한 것이 분명해졌다.
여기서 도 2 중, 「**」 및 「***」는 올리고 수식하고 있지 않은 경우와 비교한 경우, p ＜ 0.01, p ＜ 0.001 이라는 통계학적 유의차가 있는 것을 나타낸다. 통계 처리는 ANOVA 검정 후, 올리고 수식하고 있지 않은 경우를 컨트롤로 한 Dunnett 검정을 실시하였다.
이와 같이, 본 실시예에서는, 배양 세포에의 mRNA 의 도입 효율을 확인한 결과, 장사슬 길이 RNA 올리고머는 발현이 약간 저하하지만, 17 mer 의 RNA 올리고머에서는 발현을 대략 유지할 수 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 2(A)). 한편, 무세포계에서의 단백질 번역 효율은, RNA 올리고머의 사슬 길이에 의하지 않고 일정한 것을 확인할 수 있었다 (도 2(B)).
실시예 1-5 : mRNA 내포 PMs 의 조제
여기서는 실시예 1-2 에서 조제한 Gluc mRNA 또는 실시예 1-3 에서 조제한 RNA 올리고머 (overhang 2base(1) 또는 Chol-overhang 2base(1)) 를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 를 사용하였다.
PEG-PAsp(DET)-Chol 과 Gluc mRNA 는 각각 독립적으로 10 mM HEPES 버퍼 (pH 7.4) 에 용해시켰다. PEG-PAsp(DET)-Chol 의 농도는, pH 7.4 에 있어서 ((PAsp(DET) 의 정전하수)/(mRNA 의 부전하수)) (N＋/P- 비) 가 1.5 가 되도록 조정하였다. mRNA 최종 농도가 33.3 ㎍/mL 가 되도록 PEG-PAsp(DET)-Chol 용액을 mRNA 용액에 첨가하여, 고분자 미셀 (PMs) 을 조제하였다. PMs 의 입경 및 다분산도는 ZetasizerNano (Malvern Instruments) 에 의해 평가하였다. 또, 투과형 전자현미경 (TEM) 을 사용하여 조제한 PMs 를 관찰하였다. PEG-PAsp(DET) 로 이루어지는 PMs 에 관해서도 동일한 방법으로 조제하였다.
그 결과를, 표 1 및 2, 도 3 에 나타낸다.
Figure 112019077274450-pct00003
Figure 112019077274450-pct00004
실시예 1-6 : 혈청 중에서의 효소 내성 시험
여기서는 실시예 1-2 에서 조제한 Gluc mRNA 또는 실시예 1-3 에서 조제한 이하의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 를 사용하였다.
도 4(A) 및 (B) 의 실험에서 사용한 RNA 올리고머
Chol-overhang 0(1)
Chol-overhang 2base(1)
Chol-overhang 5base(1)
미스매치 Chol-RNA 올리고
도 4(C) 및 (D) 의 실험에서 사용한 RNA 올리고머
Chol-overhang 0(2)
Chol-overhang 2base(2)
Chol-overhang 5base(2)
미스매치 Chol-RNA 올리고
도 4(E) 에서 사용한 RNA 올리고머
Chol-overhang 2base(11)
각 PMs 는 실시예 5 와 동일한 조건으로 조제하였다. 또한, 도 4(A)(C)(E) 의 실험에서는 PEG-PAsp(DET)-Chol 을 사용하고, 도 4(B) 및 (D) 의 실험에서는 PEG-PAsp(DET) 를 사용하였다.
소 태아 혈청 (FBS) 을 10 mM HEPES 버퍼 (pH 7.4) 로 소정의 농도가 되도록 희석하고, 거기에 PM 용액을 첨가한 후, 37 ℃ 에서 15 분 정치하였다. 그 후, RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 를 사용하여 용액으로부터 RNA 를 추출하였다. 추출한 RNA 를 컴플리멘터리 DNA (cDNA) 에 역전사한 후, qRT-PCR 에 의해 잔존하고 있는 cDNA 를 정량 평가하였다. FBS 존재하에서 37 ℃ 정치를 실시하지 않은 경우의 mRNA 량을 100 ％ 로 하여, 상대값을 나타냈다.
그 결과를, 도 4 에 나타낸다. 도 4(A) 에 나타내는 바와 같이, PEG-PAsp(DET)-Chol 을 사용한 경우, 2 염기의 오버행을 가지는 올리고머를 하이브리다이즈한 군에서, 하이브리다이즈를 실시하지 않은 군과 비교하여, 유의한 혈청 중에서의 안정성의 향상을 확인하였다. 또한, 오버행이 없는 경우에는 안정성이 향상되는 경향이 보였지만 유의차는 얻어지지 않았다. 5 염기의 경우에서는 안정화 효과는 확인되지 않았다. 한편으로, PEG-PAsp(DET) 를 사용한 경우, 오버행이 없는 경우, 및 2 염기의 오버행이 있는 경우에, 안정성의 향상을 확인하였다 (도 4(B)). 이상의 데이터는, 하이브리다이즈하는 장소가 상이한 다른 올리고를 사용한 경우도 재현되었다 (도 4(C) : PEG-PAsp(DET)-Chol, 도 4(D) : PEG-PAsp(DET)). 또한, 미스매치 Chol-RNA 올리고는, mRNA 와 하이브리다이즈하지 않는 19 mer 의 Chol 수식 폴리 A 를 mRNA 와 혼합하여, PM 을 형성한 것이지만, 이 경우 혈청 중에서의 효소 내성은 향상되어 있지 않고, 효과를 얻으려면 하이브리다이즈할 필요가 있는 것이 나타났다.
또, 폴리 A 서열에 대해 2 염기의 오버행을 가지는 Chol 수식 올리고를 하이브리다이즈시킨 mRNA 와 PEG-PAsp(DET)-Chol 로 이루어지는 PM 에 관해서도, 하이브리다이즈에 의한 안정화 작용을 확인하였다 (도 4(E)).
이와 같이, PEG-PAsp(DET)-Chol 을 사용한 경우, 2 염기의 오버행이 있고, 또한 콜레스테롤 수식한 올리고머에서 특히 높은 안정성을 나타내는 것을 알 수 있었다 (도 4(A) 및 (C)). 한편으로, PEG-PAsp(DET) 를 사용한 경우, 오버행이 없는 경우 및 2 염기의 오버행이 있는 경우의 양방에서 안정성의 향상을 확인하였다 (도 4(B) 및 (D)). 또, 하이브리다이즈의 위치에 관해서, 단백질 코드 서열뿐만 아니라, 폴리 A 부분에 하이브리다이즈한 경우도 안정성이 향상되는 것이 분명해졌다 (도 4(E)).
실시예 1-7 : 아가로오스 겔 전기 영동
여기서는 실시예 1-2 에서 조제한 Gluc mRNA 또는 실시예 1-3 에서 조제한 RNA 올리고머 (Chol-overhang 2base(1)) 를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 를 사용하였다.
각 PMs 는 실시예 5 와 동일한 조건으로 조제하였다.
Tris 40 mM, 아세트산 20 mM, 에틸렌디아민 4 아세트산 (EDTA)·2 Na 1 mM 이 되도록 1 × TAE 버퍼 (트리스-아세트산-EDTA 버퍼) 를 조제하고, 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH 7.4 로 조정한 것을 전기 영동용 버퍼로 하였다. 0.9 중량％ 아가로오스 겔을 작성하고, PM 용액 15 μL 에 A/P 비 (폴리아니온의 부전하수/mRNA 의 인산기수) 에 따른 덱스트란황산 5 μL 와 750 mM NaCl 용액 5 μL 를 첨가한 후, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 로딩 버퍼를 2.5 μL 첨가하여 100 V 로 60 분간 전기 영동을 실시하여, mRNA 의 방출 유무를 확인하였다.
그 결과를, 도 5 에 나타낸다.
도 5(A) ∼ (D) 에서는 모두 가장 좌측의 열에 벌거벗은 (naked) mRNA 를 두었지만, 미셀로부터 mRNA 가 방출되면, 벌거벗은 mRNA 와 동일한 위치에 밴드가 보인다. Chol 수식 올리고머를 하이브리다이즈하고 있지 않은 경우, 즉, 도 5(A) 의 PEG-PAsp(DET)-Chol 을 사용한 경우와, 도 5(C) 의 PEG-PAsp(DET) 를 사용한 경우에는, A/P 비 1.5 내지 2 에서 미셀로부터의 다량의 mRNA 의 방출이 보였다. 한편으로 Chol 수식 올리고머를 하이브리다이즈한 경우, 어느 폴리머를 사용한 경우도, A/P 비 2 에서도 그다지 mRNA 의 방출은 보이지 않았다 (도 5(B) 및 (D)).
이와 같이, Chol 올리고에 의해 mRNA 의 방출이 억제되는 것을 알 수 있었다 (도 5(B) 및 (D)).
실시예 1-8 : 하이브리다이즈하는 올리고의 수를 증가시켰을 때의 혈청 중에서의 효소 내성 시험
여기서는, 여기서는 실시예 1-2 에서 조제한 Gluc mRNA 또는 실시예 1-3 에서 조제한 이하의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 를 사용하였다.
Chol-overhang 2base(1)
Chol-overhang 2base(2)
Chol-overhang 2base(3)
Chol-overhang 2base(4)
Chol-overhang 2base(5)
각 PMs 는 실시예 1-5 와 동일한 조건으로 PEG-PAsp(DET)-Chol 을 사용하여 조제하였다.
1 지점 또는 5 지점에 Chol 수식 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 를 사용하고, 실시예 1-6 과 동일한 방법으로 실험을 실시하였다. 또한, 비수식 올리고 (Unmodified Oligo) 로는, overhang 2base(1) 을 사용하였다. Chol 수식 올리고머 1 개의 실험 (Chol 올리고 X1) 에서는, Chol-overhang 2base(1) 을 사용하였다. 또, Chol 수식 올리고머 5 개의 실험 (Chol 올리고 X5) 에서는, Chol-overhang 2base(1) ∼ (5) 를 사용하였다.
그 결과를 도 6 나타낸다. 하이브리다이즈하고 있지 않은 것과 비교해, 1 지점에 수식한 경우 (Chol 올리고 X1) 안정성이 향상되고, 또, 5 지점에 수식한 경우 (Chol 올리고 X5) 1 지점에 수식한 경우 (Chol 올리고 X1) 와 비교해, 더욱 높은 안정성을 나타냈다.
실시예 1-9 : PMs 의 루시페라아제 발현 시험
여기서는 실시예 1-2 에서 조제한 Gluc mRNA 또는 실시예 1-3 에서 조제한 이하의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 를 사용하였다.
Chol-overhang 2base(1)
Chol-overhang 2base(2)
Chol-overhang 2base(3)
Chol-overhang 2base(4)
Chol-overhang 2base(5)
17 mer(1)
각 PMs 는 실시예 5 와 동일한 조건으로 PEG-PAsp(DET)-Chol 을 사용하여 조제하였다.
Huh-7 세포 (5,000 세포/웰) 를 96 웰 플레이트에 파종하고, 10 v/v％ FBS 를 포함하는 DMEM (100 μL) 중에서 24 시간 인큐베이션하였다. 배지를 10 v/v％ FBS 를 포함하는 새로운 것으로 교체한 후, 250 ng 의 mRNA 를 포함하는 PMs 용액을 7.5 μL 첨가하였다. 24 시간의 인큐베이션 후, DMEM 의 상청을 10 μL 회수하고, 루미노미터를 사용하여 Gluc 의 발광 강도를 측정하였다.
1 지점 또는 5 지점에 Chol 수식 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 를 사용하였다. 또한, Chol 수식 올리고머 1 개의 실험 (Chol 올리고 X1) 에서는, Chol-overhang 2base(1) 을 사용하였다. 또, Chol 수식 올리고머 5 개의 실험 (Chol 올리고 X5) 에서는, Chol-overhang 2base(1) ∼ (5) 를 사용하였다. 또한, 비수식 올리고머의 실험 (Unmodified Oligo) 에서는, overhang 2base(1) 17 mer(1) 을 사용하였다.
그 결과를, 도 7 에 나타낸다. Chol 올리고머로 1 개 혹은 5 개 수식한 mRNA 를 도입한 군 (Chol 올리고 X1 혹은 Chol 올리고 X5) 에서, 올리고머를 하이브리다이즈하고 있지 않은 mRNA 를 도입한 군 (하이브리(-)) 혹은 Chol 수식이 없는 올리고머로 수식한 mRNA 를 도입한 군 (비수식 올리고 (Unmodified Oligo)) 과 비교해, 높은 mRNA 로부터의 루시페라아제 발현 효율을 나타냈다.
이와 같이, Chol 올리고 수식에 의해, 발현이 상승하는 것을 알 수 있었다. 또, 올리고의 개수에서 차는 보이지 않았다.
실시예 1-10 : Chol 을 5' 측에 수식한 경우와 3' 측에 수식한 경우의 비교
여기서는 실시예 1-2 에서 조제한 Gluc mRNA, 실시예 1-3 에서 조제한 이하의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA, 또는 그것과 동일한 장소에 설계하고 3' 측에 2 염기의 오버행 (overhang) 서열을 가지는 이하의 서열의 올리고머를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 를 사용하였다.
Chol-overhang 2base(1)
Chol-overhang 3' 2 base(1)
각 PMs 는 실시예 5 와 동일한 조건으로, PEG-PAsp(DET)-Chol 을 사용하여 조제하였다. 실시예 1-8 과 동일한 방법으로 혈청 내성 시험을 실시하고, 실시예 1-9 와 동일한 방법으로 PM 을 HuH-7 세포에 도입하여, Gluc 발현량을 평가하였다.
혈청 내성 시험의 결과를 도 8(A) 에, Gluc 발현량의 결과를 도 8(B) 에 나타낸다. 어느 평가에 있어서도, Chol 의 수식 위치가 3' 인 경우와 5' 인 경우에서 큰 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 1-11 : 무세포계에서의 Chol 수식 mRNA 로부터의 번역 효율의 평가
여기서는 실시예 1-2 에서 조제한 Gluc mRNA 또는 실시예 1-3 에서 조제한 이하의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 를 사용하였다.
Chol-overhang 2base(1)
Chol-overhang 2base(2)
Chol-overhang 2base(3)
Chol-overhang 2base(4)
Chol-overhang 2base(5)
이 평가에서는, mRNA 는 PM 에 내포하지 않고, 단체로 사용하였다.
무세포 (Cell-free) 계에서의 평가에서는, Rabbit Reticulocyte Lysate 시스템 (Promega) 을 사용하여, Chol-RNA 올리고머를 수식한 mRNA 의 발현능을 평가하였다. 프로토콜에 따라, mRNA 를 포함하는 혼합 용액을 조제한 후, 30 ℃ 에서 90 분 인큐베이트하였다. 발현한 Gluc 는 루미노미터를 사용하여 발광 강도를 측정함으로써 평가하였다.
그 결과를 도 9 에 나타낸다. Chol-RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 의 무세포계에서의 단백질 번역 효율은, Chol-RNA 올리고머수의 증가에 수반하여 감소해 가는 것이 확인되었다. 즉, 복수의 Chol 기는 mRNA 의 번역 효율을 저하시키는 것이 분명해졌다.
여기서, Chol-RNA 올리고머수가 1 개인 실험에서는 Chol-overhang 2base(1) 을 사용하였다. Chol-RNA 올리고머수가 2 개인 실험에서는 Chol-overhang 2base(1) 과 (3) 을 사용하였다. Chol-RNA 올리고머수가 3 개인 실험에서는 Chol-overhang 2base(1) ∼ (3) 을 사용하였다. Chol-RNA 올리고머수가 4 개인 실험에서는 Chol-overhang 2base(1) ∼ (4) 를 사용하였다. Chol-RNA 올리고머수가 5 개인 실험에서는 Chol-overhang 2base(1) ∼ (5) 를 사용하였다.
실시예 1-12 : 내인성 유전자 발현에의 영향
여기서는 실시예 1-3 과 마찬가지로 설계하고, 조제한 이하의 RNA 올리고, 또는 후술과 같이 조제한 이하의 siRNA 를 사용하였다. 「Chol-」는, RNA 올리고머의 5' 말단이 콜레스테롤 수식되어 있는 것을 나타낸다.
여기서, RNA 올리고머의 설계에 사용한 Luc mRNA 의 서열을 도 16 및 서열 번호 33 에 나타낸다.
luc 올리고 (서열 번호 25) : UCGAAGUACUCAGCGUA
Chol-올리고 luc (서열 번호 26) : AAUCGAAGUACUCAGCGUA
올리고 Scr (서열 번호 27) : UCUUUGAGCACCUCCAG
Chol-올리고 Scr (서열 번호 27) : UCUUUGAGCACCUCCAG
siLuc (센스 가닥) (서열 번호 28) : CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT
siLuc (안티센스 가닥) (서열 번호 29) : UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT
siScramble (siScr) (센스 가닥) (서열 번호 30) : UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT
siScr (안티센스 가닥) (서열 번호 31) : ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT
여기서, siRNA 는 홋카이도 시스템 사이언스사에 의뢰 합성하고, 그대로 사용하였다.
Luc 를 항상 발현하고 있는 Hela-luc 세포 (Caliper LifeScience 사) (5,000 세포/웰) 를 96 웰 플레이트에 파종하고, 10 v/v％ FBS 를 포함하는 DMEM (100 μL) 중에서 24 시간 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 무혈청 배지 (Opti-MEM (상품명) (Thermo Fisher Scientific)) (100 μL) 로 교체하고, Lipofectamine RNAiMax (Thermo Fisher Scientific) 와 RNA 올리고 또는 siRNA 로 이루어지는 컴플렉스를 세포에 첨가하였다. 4 시간 인큐베이션한 후, 첨가한 각 컴플렉스를 제거하였다. 트랜스펙션으로부터 24 시간 후, Cell lysate 버퍼를 사용하여 세포를 용해하고, 루미노미터를 사용하여 10 μL 세포 용해액 중의 루시페라아제 발현량을 평가하였다.
그 결과를 도 10 에 나타낸다. 여기서, siLuc, Luc 올리고 (Luc Oligo) 및 Chol 올리고 Luc (Chol Oligo Luc) 은 각각 Luc 서열을 타겟으로 한 siRNA, 미수식 RNA 올리고 (RNA Oligo) 및 Chol 수식 RNA 올리고를 나타내고, siScr, Oligo Scr, Chol 올리고 Scr 은 Gluc 서열과 상동성이 없는 서열의 siRNA, 미수식 RNA 올리고 및 Chol 수식 RNA 올리고를 나타내고 있다. 도 2 및 7 에 나타내는 바와 같은 배양 세포에의 트랜스펙션 (transfection) 실험에서는, 8 nM 의 농도의 oligo 를 사용하고 있지만, 그 농도에서는 내인성 유전자 발현은 감소하지 않았다. siRNA 와 비교하여 1,000 배라는 고농도가 아니면, 내인성 유전자 발현의 감소는 보이지 않았던 점에서, 내인성 유전자에 대한 영향은 매우 경미한 것이라고 상정된다. 도 10 에 나타내는 바와 같이, siRNA 의 안티센스 사슬과 동일 서열의 RNA 올리고머 및 다른 서열 RNA 올리고머군은 siRNA 와 비교해, 내인성 유전자를 녹다운하지 않는 것이 확인되었다. 이상의 결과로부터, RNA 올리고머는 내인성 유전자를 저해하는 일 없이 mRNA 를 기능화하는 것이 확인되었다.
실시예 1-13 : PEG-Plys 에 의한 검토
PEG-PLys 는 기보에 따라 합성하였다 (K. Osada et al., Biomaterials 33, 325 - 332, (2012)) (스킴 3). 합성 스킴은 이하와 같다.
스킴 3
[화학식 3]
Figure 112019077274450-pct00005
MeO-PEG-NH2 를 400 mg 취하고, 벤젠에 용해시켜 하룻밤 동결건조시켰다. 동결건조 후, Ar 분위기하에 있어서 0.5 M 디메틸포름아미드 (DMF) 용매에 MeO-PEG-NH2 및 NCA-Lys(TFA) 를 완전히 용해시켰다. NCA-Lys(TFA) 용액을 MeO-PEG-NH2 용액에 첨가하고, 25 ℃ 에서 3 일간 교반하였다. 반응 용액을 n-헥산/아세트산에틸 (3 : 2) 혼합 용액에 재침전시키고, PEG-PLys(TFA) 를 회수하였다. 그 후, PEG-PLys(TFA) 를 진공 건조시켜, 백색 분말을 얻었다. 그 후, 0.1 N NaOH 를 포함하는 메탄올 혼합 용매 중에 있어서 35 ℃ 에서 6 시간 반응시켜, TFA 기를 탈보호하였다. 투석에 의한 정제 후, PEG-PLys 백색 분말을 얻었다. 1H-NMR 분석으로부터, 회수한 PEG-PLys 의 PLys 중합도는 69 였다.
여기서는, 여기서는 실시예 1-2 에서 조제한 Gluc mRNA 또는 실시예 1-3 에서 조제한 이하의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 를 사용하였다.
Chol-overhang 2base(1)
Chol-overhang 2base(2)
Chol-overhang 2base(3)
Chol-overhang 2base(4)
Chol-overhang 2base(5)
PM 의 제작에서는, PEG-PLys 와 mRNA 는 각각 독립적으로 10 mM HEPES 버퍼 (pH 7.4) 에 용해시켰다. PEG-PLys 의 농도는, pH 7.4 에 있어서 ((PLys 의 정전하수)/(mRNA 의 부전하수)) (N＋/P- 비) 가 2 가 되도록 조정하였다. mRNA 최종 농도가 33.3 ㎍/mL 가 되도록, PEG-PLys 용액을 mRNA 용액에 첨가하여, PMs 를 조제하였다.
합성한 PEG-PLys 를 사용하여, 실시예 1-7 에 있어서의 PEG-PAsp(DET)-Chol 과 마찬가지로 겔 전기 영동을 실시하였다. 또, 실시예 1-9 에 있어서의 PEG-PAsp(DET)-Chol 과 마찬가지로 루시페라아제 발현 시험을 실시하였다.
겔 전기 영동의 실험에서는, 1 지점에 Chol 수식 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 를 사용하고, 루시페라아제 발현 실험에서는 1 지점 또는 5 지점에 Chol 수식 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 를 사용하였다. 이때, Chol 수식 올리고머 1 개의 실험 (Chol 올리고 X1) 에서는, Chol-overhang 2base(1) 을 사용하였다. 또, Chol 수식 올리고머 5 개의 실험 (Chol 올리고 X5) 에서는, Chol-overhang 2base(1) ∼ (5) 를 사용하였다.
그 결과를 도 11 에 나타낸다. PEG-PAsp(DET) 나 PEG-PAsp(DET)-Chol 로 이루어지는 PMs 와 마찬가지로 (도 5) PEG-PLys 로 이루어지는 PMs 에 있어서도, Chol-RNA 올리고머 (Chol-overhang 2base(1)) 를 사용함으로써, 폴리아니온을 첨가했을 때의 mRNA 의 방출이 억제된 외 (도 11(B)), 세포에 도입했을 때의 mRNA 로부터의 단백질 발현 효율이 향상되었다 (도 11(C)). 한편, Chol-RNA 올리고머를 사용하지 않은 경우에는, A/P 비 1.5 내지 2 에서 미셀로부터의 다량의 mRNA 의 방출이 보였다 (도 11(A)). 따라서, 여러 가지 조성의 폴리카티온에 있어서, Chol 수식 올리고의 하이브리다이즈가 그 안정화에 유효한 것이 분명해졌다.
실시예 1-14 : 마우스를 사용한 혈중 안정성 시험
여기서는 실시예 1-2 에서 조제한 Gluc mRNA 또는 실시예 1-3 에서 조제한 이하의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 를 사용하였다.
Chol-overhang 2base(1)
Chol-overhang 2base(2)
Chol-overhang 2base(3)
Chol-overhang 2base(4)
Chol-overhang 2base(5)
Chol-overhang 2base(6)
Chol-overhang 2base(7)
Chol-overhang 2base(8)
Chol-overhang 2base(9)
Chol-overhang 2base(10)
PEG-PAsp(DET)-Chol 과 mRNA 는 각각 독립적으로 10 mM HEPES 버퍼 (pH 7.4) 에 용해시켰다. PEG-PAsp(DET)-Chol 의 농도는, pH 7.4 에 있어서 ((PAsp(DET) 의 정전하수)/(mRNA 의 부전하수)) (N＋/P- 비) 가 1.5 가 되도록 조정하였다. mRNA 최종 농도가 200 ㎍/mL 가 되도록 PEG-PAsp(DET)-Chol 용액을 mRNA 용액에 첨가하여, PMs 를 조제하였다.
Balb/C 마우스 (암컷, 6 주령) 의 꼬리 정맥으로부터, 40 ㎍ 의 mRNA 를 포함하는 PMs 용액을 200 μL 투여하였다. 2.5, 5, 10 분 후에 꼬리 정맥으로부터 2 μL 의 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액으로부터, RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 를 사용하여 mRNA 를 추출하고, 추출한 mRNA 를 cDNA 에 역전사한 후, qRT-PCR 에 의해 잔존하고 있는 cDNA 를 정량 평가하였다. 통계학적 처리는, Student 의 t 검정에 의해 실시하였다.
그 결과를, 도 12 에 나타낸다. 도 12 에 나타내는 바와 같이, Chol 수식 올리고를 10 개 하이브리다이즈함으로써, 혈중 체류성이 향상되는 경향이 보였다.
실시예 1-15 : 마우스를 사용한 PMs 의 폐에의 국소 투여
여기서는 실시예 1-2 에서 조제한 Gluc mRNA 또는 실시예 1-3 에서 조제한 이하의 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 Gluc mRNA 를 사용하였다.
Chol-overhang 2base(1)
Chol-overhang 2base(2)
Chol-overhang 2base(3)
Chol-overhang 2base(4)
Chol-overhang 2base(5)
각 PMs 는 실시예 5 와 동일한 방법으로 PEG-PAsp(DET)-Chol 을 사용하여 조제하였다.
Balb/C 마우스 (암컷, 6 주령) 의 기관을 절개하고, 1.67 ㎍ 의 mRNA 를 포함하는 PMs 용액 50 μL 를 분무기에 의해 직접 폐에 투여하였다. 24 시간 후, 마우스의 폐를 적출하고, 호모게나이즈한 후에, 거기에 포함되는 Gluc 단백질량을 루미노미터로 정량하였다. 또, 투여 4 시간 후의 폐를 사용하여, 폐에 있어서 잔존하고 있는 Gluc mRNA 량을 정량할 목적으로, RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 를 사용하여 mRNA 를 추출하고, 추출한 RNA 를 cDNA 에 역전사한 후, qRT-PCR 에 의해 잔존하고 있는 cDNA 를 정량 평가하였다. 이때, 조직에 포함된 액틴의 양을 기초로 mRNA 발현량을 규격화하였다.
그 결과를, 도 13 에 나타낸다. 도 13(A) 에 나타내는 바와 같이, Chol 수식 올리고머를 5 개 하이브리다이즈한 mRNA 에서, 하이브리다이즈하고 있지 않은 mRNA 와 비교해, 유의하게 높은 mRNA 로부터의 단백질 발현 효율이 얻어졌다. 또, 도 13(B) 에 나타내는 바와 같이, 폐 조직에 분해되지 않고 잔존한 mRNA 량도, Chol 수식 올리고머를 5 개 하이브리다이즈함으로써, 유의하게 증가하는 점에서, 생체 내에서의 안정성이 향상된 것이 분명해졌다. 또 안전성에 관해서, 투여 후의 폐 조직에서의 (c) 인터페론 β, (d) 인터류킨 6 의 발현량은, 하이브리다이즈하고 있지 않은 mRNA 와 Chol 수식 올리고머를 5 개 하이브리다이즈한 것에서 유의한 변화는 없고, 낮은 값에 머무른 점에서, 안전성은 담보된 것이라고 생각되었다.
이와 같이, 안정성이 향상된 결과 (도 13(B)), 발현이 향상되는 것을 알 수 있었다 (도 13(A)). 이 점에서, in vivo 에서도 유효한 것을 알 수 있다.
실시예 1-15 : 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 화 mRNA 의 제작
PEG 화 mRNA 를, 이하와 같이 제작하였다. RNA 2 차 구조 예측 소프트웨어 (http://rtips.dna.bio.keio.ac.jp/ipknot/) 로, Gluc mRNA 의 2 차 구조를 예측하고, RNA 사슬이 2 차 구조를 가지지 않는 부분에 대해 RNA 올리고머를 설계하였다. RNA 올리고머는, 5' 말단의 PEG 수식을 포함하여, 진 디자인사에서, 의뢰 합성하였다. 여기서, 중량 평균 분자량 12,000 의 직사슬 PEG 를 사용하였다. 그리고, 이하의 5' 말단 PEG 수식 RNA 올리고머를 진 디자인사로부터 구입하였다.
서열 p1 (서열 번호 34) : 5'-PEG-ACUCUUUGUCGCCUUCG-3'
서열 p2 (서열 번호 35) : 5'-PEG-CUCGGCCACAGCGAUGC-3'
서열 p3 (서열 번호 36) : 5'-PEG-UCUUUGAGCACCUCCAG-3'
서열 p4 (서열 번호 37) : 5'-PEG-CUCUAGAUGCAUGCUCG-3'
서열 p5 (서열 번호 38) : 5'-PEG-GCGGCAGCCACUUCUUG-3'
서열 p6 (서열 번호 39) : 5'-PEG-AUCUCAGGAAUGUCGAC-3'
서열 p7 (서열 번호 40) : 5'-PEG-GCAGCCAGCUUUCCGGG-3'
서열 p8 (서열 번호 41) : 5'-PEG-UUGAGGCAGCCAGUUGU-3'
서열 p9 (서열 번호 42) : 5'-PEG-UGAUCUUGUCCACCUGG-3'
서열 p10 (서열 번호 43) : 5'-PEG-GAUGAACUUCUUCAUCU-3'
서열 p11 (서열 번호 44) : 5'-PEG-GUGGGACAGGCAGAUCA-3'
서열 p12 (서열 번호 45) : 5'-PEG-UUGAAGUCUUCGUUGUU-3'
서열 p13 (서열 번호 46) : 5'-PEG-GGGCAACUUCCCGCGGU-3'
서열 p14 (서열 번호 47) : 5'-PEG-CUGCUCCAUGGGCUCCA-3'
서열 p15 (서열 번호 48) : 5'-PEG-CUUGCUGGCAAAGGUCG-3'
이하의 실시예 1-16 ∼ 18 에서는, mRNA 로서 실시예 1-3 에서 조제한 것을 사용하였다. mRNA 에 대해 1 당량의 RNA 올리고머를 첨가하고, 65 ℃ 에서 5 분 가열하고, 10 분에 걸쳐 30 ℃ 까지 냉각함으로써, 하이브리다이제이션을 실시하였다. 이로써, PEG 화 mRNA 를 제작하였다.
실시예 1-16 : PEG 수식 RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈에 의한 번역 효율의 변화
1 지점, 5 지점, 10 지점, 또는 15 지점에 PEG 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 를 사용하였다. 또한, PEG 수식 RNA 올리고머 1 개, 5 개, 10 개, 및 15 개의 각 실험에서는, 실시예 1-15 에서 제작한 이하의 PEG 수식 RNA 올리고머를 사용하였다.
PEG 수식 RNA 올리고머 1 개의 실험 : 서열 p1
PEG 수식 RNA 올리고머 5 개의 실험 : 서열 p1 ∼ p5
PEG 수식 RNA 올리고머 10 개의 실험 : 서열 p1 ∼ p10
PEG 수식 RNA 올리고머 15 개의 실험 : 서열 p1 ∼ p15
또한, PEG 수식 RNA 올리고머 0 개의 실험에서는, mRNA 만을 65 ℃ 에서 5 분 가열하고, 10 분에 걸쳐 30 ℃ 까지 냉각한 것을 사용하였다.
실험은, 각각 3 회 실시하였다.
조제한 mRNA 샘플의 무세포계에서의 단백질 번역 효율은, Rabbit Reticulocyte Lysate 시스템, 뉴클레아제 처리된 (Promega Co., Madison, WI) 을 사용하여 평가하였다. 300 ng 의 GLuc mRNA 를 포함하는 샘플 용액을 토끼 망상적혈구 용해물 (Rabbit reticulocyte lysate) 에 첨가하고, 30 ℃ 에서 90 분 인큐베이트한 후, 반응 용액 10 μL 의 발광 강도를 Renilla Luciferase assay kit (Promega) 를 사용하여 정량하였다. 측정에는 Mithras LB 940 (Berthold technologies Co.) 을 사용하였다.
그 결과를, 도 18 에 나타낸다. PEG 량의 증가에 수반하는, 약간의 번역 활성의 저하를 확인했지만, 15 개의 PEG 수식 RNA 올리고머를 사용하여 mRNA 를 수식해도, 미수식인 것과 비교하여 64 ％ 정도의 번역 활성은 얻어졌다.
여기서, 도 18 중, 「*」는 올리고 수식하고 있지 않은 경우와 비교한 경우, p ＜ 0.05 라는 통계학적 유의차가 있는 것을 나타낸다. 통계 처리는 ANOVA 검정 후, 올리고 수식하고 있지 않은 경우를 컨트롤로 한 Dunnett 검정을 실시하였다.
실시예 1-17 : PEG 수식 RNA 올리고머의 mRNA 에의 하이브리다이즈에 의한 안정화 효과
1 지점, 5 지점, 10 지점, 또는 15 지점에 PEG 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 를 사용하였다. 또한, PEG 수식 올리고머 1 개, 5개, 10 개, 및 15 개의 각 실험에서는, 실시예 1-15 에서 제작한 이하의 PEG 수식 올리고머를 사용하였다.
PEG 수식 올리고머 1 개의 실험 : 서열 p1
PEG 수식 올리고머 5 개의 실험 : 서열 p1 ∼ p5
PEG 수식 올리고머 10 개의 실험 : 서열 p1 ∼ p10
PEG 수식 올리고머 15 개의 실험 : 서열 p1 ∼ p15
또한, PEG 수식 올리고머 0 개의 실험에서는, mRNA 만을 65 ℃ 에서 5 분 가열하고, 10 분에 걸쳐 30 ℃ 까지 냉각한 것을 사용하였다.
실험은, 각각 3 회 실시하였다.
FBS 에 대한 안정성을 확인하는 시험의 순서는 도 19(A) 에 나타내는 바와 같다. 100 ng 의 GLuc mRNA 를 포함하는 샘플을 0.5 ％ 소 태아 혈청 (Fetal Bovine Serum (FBS, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd., Osaka, Japan)) 용액 중에서 37 ℃, 15 분 인큐베이트하였다. 그 후, 1 v/v％ 2-메르캅토에탄올을 포함하는 RLT 완충액 (Quiage, Hilden, Germany) 350 μL 를 첨가하고, 65 ℃ 에서 5 분간 인큐베이트한 후, 빙상에서 급랭함으로써, PEG-RNA 올리고머를 디네이쳐 (denature) 하였다. mRNA 를 RNeasy Mini Kit (Quiagen) 를 사용하여 정제한 후, ReverTra Ace (상품명) qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBOCO., Ltd., Osaka, Japan) 를 사용하여 컴플리멘터리 DNA (cDNA) 에 역전사하였다. 역전사한 cDNA 를 정량 RT-PCR (qRT-PCR) 에 의해 정량 평가하였다. 여기서, qRT-PCR 측정에는 하기 서열의 프라이머를 사용하였다.
포워드 (서열 번호 49) : TGAGATTCCTGGGTTCAAGG
리버스 (서열 번호 50) : GTCAGAACACTGCACGTTGG
그 결과를 도 19(B) 에 나타낸다. PEG 수식 올리고머에 의해 분해 효소 내성이 향상되는 것이 시사되었다. 또, 분해 효소 내성은 수식되는 PEG 올리고의 수가 많을수록 향상되는 경향이 있었다.
실시예 1-18 : PEG 화 mRNA 의 발현 시험
15 지점에 PEG 수식 RNA 올리고머를 하이브리다이즈한 mRNA 를 사용하였다. 또한, PEG 수식 올리고머 15 개의 실험에서는, 실시예 1-15 에서 제작한 이하의 PEG 수식 올리고머를 사용하였다.
PEG 수식 올리고머 15 개의 실험 : 서열 p1 ∼ p15
또한, PEG 수식 올리고머 0 개의 실험에서는, mRNA 만을 65 ℃ 에서 5 분 가열하고, 10 분에 걸쳐 30 ℃ 까지 냉각한 것을 사용하였다.
실험은, 각각 3 회 실시하였다.
배양 세포 (HuH-7 세포) 에 대한 mRNA 발현 시험을 다음과 같이 실시하였다. 인간 간암 세포 (HuH-7 세포) 를 96-웰 플레이트에 5,000 세포/웰로 파종하고, 37 ℃ 에 있어서의 5 ％ CO2 의 습기 있는 환경하에서 24 시간 인큐베이트하였다. 혈청 배지를 제거한 후, 무혈청 배지 (Opti-MEM, Thermo Fisher ScientificInc., Waltham, MA) 100 μL 로 치환하고, 250 ng 의 Gluc mRNA 를 포함하는 샘플 용액을 첨가하였다. 4 시간 후, Renilla Luciferase assay kit (Promega) 를 사용하여 10 μL 의 상청 중의 발광 강도를 정량하였다. 측정에는 Mithras LB 940 (Berthold technologies Co.) 을 사용하였다.
그 결과를, 도 20 에 나타낸다. 배양 세포에 있어서 PEG 수식 mRNA 는 미수식의 것과 비교하여 유의하게 높은 발현을 나타냈다. 이것은 PEG 수식 mRNA 의 안정화 효과에 의한 것이라고 생각된다.
실시예 2-1 : 여러 가지 2 본쇄 RNA 의 제작
T7-Gluc 플라스미드는, pCMV-Gluc 컨트롤 플라스미드 (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) 로부터 Gluc 코드 서열 (서열 번호 57 및 도 33) 을 pSP73 벡터 (Promega) 의 HindIII, Xba1 사이트에 삽입함으로써 제작하였다.
T7-Gluc poly A120 플라스미드는, T7-Gluc 플라스미드의 EcoR1-Bgl2 사이트에 A120- (BsmB1 절단 부위) 를 삽입함으로써 제작하였다.
도 21(A) 에 나타낸 바와 같이, Gluc 센스 사슬은, T7-Gluc poly A120 플라스미드를 BsmBI 로 절단하고, mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Thermo Fisher Scientific) 로 T7 프로모터로부터 전사함으로써 제작하였다. 이 키트로 RNA 를 작성한 경우, 5' 말단은 Cap 수식된다.
도 21(B) 에 나타낸 바와 같이, Gluc 안티센스 사슬 (poly U 포함) 은 T7-Gluc poly A120 플라스미드를 HindIII 로 절단하고, MEGAscript (등록상표) SP6 Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific) 로 Sp6 프로모터로부터 전사함으로써 제작하였다. 여기서는 Cap 아날로그를 첨가하지 않고 RNA 를 제작하고 있으므로, 5' 말단은 Cap 수식되지 않고, 트리인산기가 결합한 상태가 된다.
도 21(C) 에 나타낸 바와 같이, Gluc 안티센스 사슬 (poly U 없음) 은 T7-Gluc 플라스미드를 HindIII 로 절단하고, MEGAscript (등록상표) SP6 Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific) 로 Sp6 프로모터로부터 전사함으로써 제작하였다.
도 21(D) 에 나타낸 바와 같이, poly U 는 T7-Gluc poly A120 플라스미드를 SmaI 로 절단하고, MEGAscript (등록상표) SP6 Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific) 로 Sp6 프로모터로부터 전사함으로써 제작하였다. poly U 는, poly A 전체의 서열에 상보적인 서열 (120 염기) 과, 그 하류에, mRNA 의 3'UTR 의 일부 (즉, 3'UTR 의 약 37 ％ 의 염기 길이의 서열) 에 상보적인 서열 (19 염기) 을 포함한다. 또한, poly U 는, 상류에, SP6 프로모터 내의 서열, 및, 클로닝에 사용한 제한 효소 서열을 다른 서열 (17 염기) 로서 추가로 포함한다. 즉, 여기서 사용한 poly U 는, 156 염기 길이의 서열을 갖는다. 또, 5' 말단에 트리인산 구조를 갖는다.
이하에, 제작한 센스 사슬, 안티센스 사슬, 및 poly U 의 염기 서열을 나타낸다.
Gluc 센스 사슬 (서열 번호 51 및 도 27)
Gluc 안티센스 사슬 (poly U 포함) (서열 번호 52 및 도 28)
Gluc 안티센스 사슬 (poly U 없음) (서열 번호 53 및 도 29)
poly U (서열 번호 54 및 도 30)
여기서, 도 27 의 서열에 있어서, 밑줄 부분이 오픈 리딩 프레임 (open reading frame (ORF)) 이고, ORF 의 상류가 5'UTR (54 염기 길이) 이고, ORF 의 하류에 3'UTR (52 염기 길이) 이 있고, 더 그 하류의 119A 가 poly A 서열이다.
여기서, Poly A 의 수에 대해, 이론상은 주형 DNA 에 120 bp 에 삽입되고, T7 프로모터로부터 전사한 mRNA 는 119 염기의 A 를, Sp6 프로모터로부터 전사한 RNA 는 120 염기의 U 를 각각 갖는다. 그러나, DNA 증폭이나, mRNA 조제의 단계에서 그 수는 증감할 수 있다.
제작한 센스 사슬, 안티센스 사슬, 및 poly U 를 사용하여, 다음과 같이, 2 본쇄 RNA 를 제작하였다. 먼저, 10 mM Hepes 버퍼 중에 센스 사슬, 안티센스 사슬 또는 poly U 가 등몰량 포함되고, RNA 농도가 300 ㎍/ml 가 되는 용액을 조제하였다. 그 용액을 65 ℃ 에서 5 분 유지한 후, 10 분에 걸쳐 30 ℃ 로 낮춤으로써 하이브리다이즈를 실시하였다.
트리인산화를 제거할 때는, Antarctic 포스파타아제 (New England Biolabs, cat. no. M0289S) 를 사용하였다.
여기서, 도 22 에, 제작한 2 본쇄 RNA 의 모식도를 나타낸다. 도 22(A) 가 mRNA : RNA 이고, 도 22(B) 가 mRNA : RNA poly U(-) 이고, 도 22(C) 가 mRNA : poly U 이고, 도 22(D) 가 mRNA : poly U ppp(-) 이다.
또한, 도 22 중, mRNA 의 단백질 코드 서열의 상류에는 5'UTR 이 있고, 하류에는 3'UTR 이 존재한다.
실시예 2-2 : 수상 세포주를 사용한 2 본쇄 RNA 백신의 최적화
DC2.4 세포를 6 웰 플레이트에 1,000,000/웰 파종하고, 24h 후에 배지를 교환하고, 무혈청 배지 Opti-MEM (상품명) (Thermo Fisher Scientific) 로 치환한 후, Lipofectamine (상품명) LTX (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 mRNA 를 2.5 ㎍/웰 투여하였다. 4 시간 후, 세포로부터 RNeasy mini kit (QIAGEN) 로 RNA 를 정제하고, ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) 로 상보적 DNA (cDNA) 로 한 후, taqman gene expression assay (Applied Biosystems) 를 사용하여, 인터페론 β 의 발현량을 조사하였다. 이때, 액틴 b (actin b) 의 발현량으로 표준화하였다. 또 배지에 포함되는 Gluc 단백질량을 Renilla Luciferase Assay 시스템 (Promega) 으로 정량하였다.
그 결과를 도 23 에 나타낸다. 전체 길이에 하이브리다이즈한 mRNA : RNA 에서는 강한 염증 반응을 야기할 수 있었지만 (도 23(A)), mRNA 로부터의 Gluc 단백질 발현량은, 1 본쇄 mRNA 와 비교하여 100 배 정도 저하하였다 (도 23(B)). 한편으로, mRNA : RNA poly U(-) 에서는, mRNA : RNA 와 비교하여 염증 반응이 분명하게 저하한 데에 추가하여 (도 23(A)), Gluc 발현량도 mRNA : RNA 와 동일한 정도였다 (도 23(B)). 그에 대해, 주로 poly U 부분만 하이브리다이즈한 것에서는, mRNA : RNA 와 동등하게 강한 염증 반응이 보인 데에 추가하여 (도 23(A)), mRNA 로부터의 단백질 발현량도, 1 본쇄 mRNA 와 대략 동일한 정도의 레벨로 유지되었다 (도 23(B)). 또한, 여기서 안티센스 사슬 RNA 의 5' 말단은 트리인산화된 상태이지만, 이것은 세포 내 핵산 수용체인 RIG-I 에 인식되어, 강한 염증 반응을 야기하는 것이 알려져 있다. 그래서, 트리인산과 염증 반응의 관계를 조사하기 위해서, 트리인산을 제거한 poly U 를 하이브리다이즈시킨 mRNA 를 도입한 바, 염증 반응은 트리인산화 poly U 의 경우와 비교하여 약간 저하하였다. 따라서, RNA 올리고머가 5' 말단 트리인산을 가짐으로써, 보다 강한 염증 반응이 야기되는 것이 분명해졌다.
mRNA : RNA poly U(-) 에서는 그다지 염증이 일어나지 않은 점에서, 사용하는 상보 사슬에 의존하여 RIG-I 에 의한 트리인산 인식이 상이한 것이 강하게 시사된다. poly U 의 경우, 5' 말단이 mRNA 말단에 노출되어, 트리인산이 입체적으로 RIG-I 에 인식되기 쉬워진 가능성, 트리인산 주위의 서열에 U 를 많이 포함하지만, AU 결합이 약하기 때문에 트리인산의 운동성이 높아져, 인식되기 쉬워진 가능성 등이 상정된다. 이와 같이 상보 사슬의 선택이 RIG-I 를 개재한 자연 면역 응답에 중요한 가능성이 강하게 시사되었다.
이와 같이, mRNA 의 3' 말단에 부가되는 poly A 사슬의 부분에 상보 사슬 (poly U) 을 주로 하이브리다이즈시킨 경우, 단백질 발현 효율을 거의 저하시키는 일 없이, 강한 염증 반응을 야기하는 것을 알 수 있었다.
실시예 2-3 : poly U 하이브리다이즈 mRNA 의 림프절 내 투여
mRNA : poly U 는 실시예 2-2 와 마찬가지로 제작하였다. Gluc mRNA 3 ㎍ 을 포함하는 10 μL 의 10 mM Hepes 용액을 C57BL6N 마우스의 서혜 림프절에 투여하였다. 4 시간 후, 서혜 림프절을 회수하고, Passive 용해 버퍼 (Promega) 로 용해하고, Luc 발현량을 Renilla Luciferase Assay 시스템 (Promega) 으로 정량하였다. 또, RNA 를 RNeasy mini kit (QIAGEN) 로 추출하고, ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) 로 상보적 DNA (complementary DNA (cDNA)) 로 한 후, taqman gene expression assay (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여, 인터페론 β 및 인터류킨 6 의 발현량을 조사하였다. 이때, 액틴 b 의 발현량으로 표준화하였다.
그 결과를 도 24 에 나타낸다. 그러자, 도 23 의 배양 세포를 사용한 해석과 마찬가지로, poly U 를 하이브리다이즈시킨 것만으로, 염증 반응은 1 본쇄 mRNA 와 비교하여 분명하게 향상되고 (도 24(B) 및 (C)), 또한 mRNA 로부터의 Gluc 발현 효율은, 대략 1 본쇄 mRNA 와 동일한 정도였다 (도 24(A)).
이와 같이, in vivo 에 있어서도 poly U 하이브리다이즈 mRNA 는, 번역 효율을 크게 저해하는 일 없이, 강한 염증 반응을 야기하는 것을 알 수 있었다.
실시예 2-4 : poly U 하이브리다이즈 mRNA 에 의한 세포성 면역의 유도
T7-OVA poly A120 플라스미드는, Genscript 사에서 코돈 최적화를 실시한 OVA 코드 서열 (서열 번호 58 및 도 34) 을 pSP73 벡터 (Promega) 의 XhoI, EcoR1 사이트에 삽입함으로써 작성하였다. OVA 센스 사슬은, T7-OVA poly A120 플라스미드를 BsmBI 로 절단하고, mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Thermo Fisher Scientific) 로 T7 프로모터로부터 전사함으로써 제작하였다. poly U 는 T7-Gluc poly A120 플라스미드를 EcoRI 로 절단하고, MEGAscript (등록상표) SP6 Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific) 로 Sp6 프로모터로부터 전사함으로써 제작하였다.
여기서, poly U 는, poly A 전체의 서열에 상보적인 서열 (120 염기) 과, 그 하류에, mRNA 의 3'UTR 의 일부 (즉, 3'UTR 의 약 83 ％ 의 염기 길이의 서열) 에 상보적인 서열 (5 염기) 을 포함한다. 또한, 여기서 사용한 poly U 는, SP6 프로모터 내의 서열, 및, 클로닝에 사용한 제한 효소 서열을 다른 서열 (17 염기) 로서 추가로 포함한다. 즉, 여기서 사용한 poly U 는, 142 염기 길이의 서열을 갖는다. 또, 5' 말단에 트리인산 구조를 갖는다.
이하에, 제작한 센스 사슬, 및 poly U 의 염기 서열을 나타낸다.
OVA 센스 사슬 (서열 번호 55 및 도 31)
poly U (서열 번호 56 및 도 32)
또한, 도 31 의 서열에 있어서, 밑줄 부분이 오픈 리딩 프레임 (ORF) 이고, ORF 의 상류가 5'UTR (16 염기) 이고, ORF 의 하류에 3'UTR (6 염기) 이 있고, 더 그 하류의 119A 가 poly A 서열이다.
A 나 U 의 수에 관해서는, 실시예 2-1 의 경우와 동일하고, T7 프로모터로부터 전사한 mRNA 는 119 염기의 A 를, Sp6 프로모터로부터 전사한 RNA 는 120 염기의 U 를 각각 갖는다. 그러나, DNA 증폭이나, mRNA 조제의 단계에서 그 수는 증감할 수 있다.
poly U 를 하이브리다이즈시킨 OVA 발현 mRNA (mRNA : poly U) 는, 실시예 2-2 와 마찬가지로 제작하였다. 구체적으로는, 10 mM Hepes 버퍼 중에 센스 사슬, 안티센스 사슬, 또는 poly U 가 등몰량 포함되고, RNA 농도가 300 ㎍/ml 가 되는 용액을 조제하였다. 그 용액을 65 ℃ 에서 5 분 유지한 후, 10 분에 걸쳐 30 ℃ 로 낮추는 것 하이브리다이즈를 실시하였다.
도 25(A) 에 이하의 실험의 순서를 나타낸다. 먼저, OVA mRNA 3 ㎍ 을 포함하는 10 μL 의 10 mM Hepes 용액을 C57BL6N 마우스의 서혜 림프절에 투여하였다. 7 일 후, 비장 세포를 회수하고, IFN-γ ELISpot PLUS, 마우스(-) HRP 키트 (MABTECH 사) 로 Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISPOT) 어세이를 실시하였다. 여기서는, 96 웰 플레이트에 250,000 세포/웰 파종하였다. 최종 OVA 농도 10 ㎍/mL 로 24 시간 배양한 후, IFN-γ 산생 세포수를 계측하였다.
그 결과를 도 25(B) 에 나타낸다. 도 25(B) 의 세로축은, OVA 에 반응하여 IFN-γ 를 산생한 비장 세포의 수를 나타내고, 세포성 면역의 지표가 된다. 도 25(B) 에 나타나 있는 바와 같이, 1 본쇄의 OVA mRNA 에서는, 세포성 면역을 거의 유도할 수 없었는데 대해, poly U 를 하이브리다이즈시킨 OVA mRNA (mRNA : poly U) 에서는, 유의한 세포성 면역 반응이 관찰되었다.
이와 같이, poly U 하이브리다이즈에 의해, 보다 강한 세포성 면역을 유도할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 2-5 : poly U 하이브리다이즈 mRNA 에 의한 액성 면역의 유도
실시예 2-4 와 동일한 방법으로 OVA mRNA 를 C57BL6N 마우스에 투여하고, 7 일 후에 혈액을 채취하였다 (도 26(A)). 혈청 중의 항OVA IgG 를 마우스 Anti-OVA IgG Antibody Assay Kit (콘드렉스사) 로 정량하였다.
그 결과를 도 26(B) 에 나타낸다. 1 본쇄 mRNA 에서는 OVA 반응성 IgG 값은 컨트롤군에 비해 상승하지 않았는데 대해, poly U 를 하이브리다이즈시킨 OVA mRNA (mRNA : poly U) 에서는, IgG 값의 유의한 상승이 관찰되었다.
이와 같이, poly U 하이브리다이즈에 의해, 보다 강한 액성 면역을 유도할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 2-6 : 수상 세포를 사용한 2 본쇄 RNA 백신의 최적화
실시예 2-2 와 동일한 방법으로, 수상 세포 (D.C.2.4 세포) 에 있어서의 mRNA 로부터의 단백질 발현량 (즉 루시페라아제 발현량) 을 정량하였다.
단, D.C.2.4 세포를 96 웰 플레이트에 40,000/웰 파종하여 실험을 실시하였다. 또, RNA 올리고머로서, 이하의 3 개를 사용하였다.
poly U (3'UTR 과 상보적인 서열의 사슬 길이 : 5 염기) (서열 번호 56, 도 36(B))
poly U (3'UTR 과 상보적인 서열의 사슬 길이 : 19 염기) (서열 번호 54, 도 36(B))
poly U (3'UTR 과 상보적인 서열의 사슬 길이 : 50 염기) (서열 번호 59, 도 36(B))
「poly U (3'UTR 과 상보적인 서열의 사슬 길이 : 5 염기) (서열 번호 56)」T7-Gluc poly A120 플라스미드를 EcoRI 로 절단하고, MEGAscript (등록상표) SP6 Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific) 로 Sp6 프로모터로부터 전사함으로써 제작하였다 (도 36(A)).
「poly U (3'UTR 과 상보적인 서열의 사슬 길이 : 19 염기) (서열 번호 54)」T7-Gluc poly A120 플라스미드를 SmaI 로 절단하고, MEGAscript (등록상표) SP6 Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific) 로 Sp6 프로모터로부터 전사함으로써 제작하였다 (도 36(A)).
또한, 「poly U (3'UTR 과 상보적인 서열의 사슬 길이 : 5 염기) (서열 번호 56)」는, mRNA 의 3'UTR 의 일부 (즉, 3'UTR (52 염기 길이) 의 약 10 ％ 의 염기 길이의 서열) 에 상보적인 서열 (5 염기) 을 포함한다.
또, poly U (3'UTR 과 상보적인 서열의 사슬 길이 : 19 염기) 는, mRNA 의 3'UTR 의 일부 (즉, 3'UTR (52 염기 길이) 의 약 36 ％ 의 염기 길이의 서열) 에 상보적인 서열 (19 염기) 을 포함한다.
「poly U (3'UTR 과 상보적인 서열의 사슬 길이 : 50 염기)」는, T7-Gluc poly A120 플라스미드를 NotI 로 절단하고, MEGAscript (등록상표) SP6 Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific) 로 Sp6 프로모터보다 전사함으로써 제작하였다 (도 36(A)).
여기서, poly U 는, poly A 전체의 서열에 상보적인 서열 (120 염기) 과, 그 하류에, mRNA 의 3'UTR 의 일부 (즉, 3'UTR (52 염기 길이) 의 약 96 ％ 의 염기 길이의 서열) 에 상보적인 서열 (50 염기) 을 포함한다. 또한, 여기서 사용한 poly U 는, SP6 프로모터 내의 서열, 및, 클로닝에 사용한 제한 효소 서열을 다른 서열 (17 염기) 로서 추가로 포함한다. 즉, 여기서 사용한 poly U 는, 187 염기 길이의 서열을 갖는다. 또, 5' 말단에 트리인산 구조를 갖는다.
그 결과를, 도 35 에 나타낸다. 도 35 에 나타내는 바와 같이, 각 poly U 의 3'UTR 과 상보적인 서열의 사슬 길이는, 짧으면 짧을수록, mRNA 로부터의 단백질 발현을 유지하는 데에 있어서 바람직한 것을 알 수 있다.
실시예 3-1 : RNA 올리고머의 하이브리다이제이션
합성 RNA 올리고머를 이하와 같이 제작하였다. 먼저, Gluc mRNA 에 상보적인 제 1 서열에 대해서는, RNA 2 차 구조 예측 소프트웨어 (http://rtips.dna.bio.keio.ac.jp/ipknot/) 로, Gluc mRNA 의 2 차 구조를 예측하고, RNA 사슬이 2 차 구조를 가지지 않는 부분에 대해 RNA 올리고머를 설계하였다. overhang 서열에 대해서는, 가능한 한 mRNA 사슬과 하이브리다이즈하지 않도록 A 또는 U 를 사용하여 설계하였다. 5'ppp-RNA 올리고머와 상보적인 제 2 서열에 대해서는, 먼저, 5'ppp-RNA 올리고머의 서열을 설계하고, 그 서열에 상보적인 제 2 서열을 얻었다. 5'ppp-RNA 올리고머에서는 GU 의 반복 서열을 사용했지만, 이것은, ATP 를 포함하지 않는 계에서 in vitro 전사를 함으로써, 상보 사슬의 부산물의 생성이 억제되는 외에, GU 반복 서열은 그 RNA 자체로 2 차 구조를 형성하지 않는 것이 특징이다. 이 5'ppp-RNA 올리고머에 상보적인 서열로서 제 2 서열을 얻었지만, 이때, 5'ppp-RNA 올리고머의 트리인산화된 5' 말단이 평활하게 되도록 서열 설계를 실시하고 있다.
그와 같이 설계한 합성 RNA 올리고머의 합성을 의뢰하고, 5' 측으로부터, Gluc mRNA 에 상보적인 17 염기의 서열, 2 염기의 오버행 (overhang) 서열, 5'ppp-RNA 올리고머와 상보적인 24 염기의 서열로 이루어지는 이하의 합성 RNA 올리고머를 구입하였다.
합성 RNA 올리고머는 홋카이도 시스템 사이언스로부터 구입하였다.
합성 RNA 올리고머 서열 1 (서열 번호 60) : CAGCCAGCUUUCCGGGCUACACACACACACACACACACACACC
합성 RNA 올리고머 서열 2 (서열 번호 61) : ACUCUUUGUCGCCUUCGAUCACACACACACACACACACACACC
합성 RNA 올리고머 서열 3 (서열 번호 62) : GCGGCAGCCACUUCUUGUACACACACACACACACACACACACC
5'ppp-RNA 올리고머는 다음과 같이 제작하였다. 먼저, DR274 벡터 (addgene) 를 BsaI 로 절단하고, 이하의 2 종류의 올리고머를 하이브리다이즈시킨 것을 거기에 삽입하였다.
DNA 올리고머 (서열 번호 63) : TAGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGGCCC
DNA 올리고머 (서열 번호 64) : AAACGGGCCCACACACACACACACACACACA
이로써 도 41 에 나타낸 염기 서열 (서열 번호 65) 의 벡터를 제작하였다. 다음으로, 5'ppp-RNA 올리고머는, 도 41 에 나타낸 염기 서열 (서열 번호 65) 의 벡터를 ApaI 와 SnaBI 로 절단하여 in vitro 전사에 의해 조제하였다. in vitro 전사 시, ATP 를 포함하지 않는 반응액을 사용함으로써 목적 서열의 상보 사슬 RNA 의 전사를 억제하였다. 이로써 5' 가 트리인산화된 이하의 5'ppp-RNA 올리고머가 조제되었다.
5'ppp-RNA 올리고머 (서열 번호 66) : GGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUG
합성 RNA 올리고머 서열 1 ∼ 3 과 5'ppp-RNA 올리고머의 하이브리다이즈에 의해, 이들이 하이브리다이즈하는 측에 평활 5' 말단 트리인산화 구조가 얻어지는 것이 기대되었다.
24nt 1 개 : 5'ppp-RNA 올리고머, 합성 RNA 올리고머 서열 1, Gluc mRNA 를 몰비 1 : 1 : 1 로 혼합하여, 하이브리다이즈시킨 것이다.
24nt 2 개 : 5'ppp-RNA 올리고머, 합성 RNA 올리고머 서열 1 및 2, Gluc mRNA 를 몰비 1 : 1 : 1 : 1 로 혼합하여, 하이브리다이즈시킨 것이다.
24nt 3 개 : 5'ppp-RNA 올리고머, 합성 RNA 올리고머 서열 1, 2 및 3, Gluc mRNA 를 몰비 1 : 1 : 1 : 1 : 1 로 혼합하여, 이하의 조건으로 하이브리다이즈시킨 것이다.
이하의 실시예 3-2 및 3-3 에서는, Gluc mRNA 로서 실시예 1-3 에서 조제한 것을 사용하였다. 하이브리다이제이션은, 65 ℃ 에서 5 분 가열하고, 10 분에 걸쳐 30 ℃ 까지 냉각함으로써 실시하였다.
또, 실시예 3-3 에서는, 「mRNA : pU」로서, 실시예 2-1 에서 조제한 「mRNA : polyU」를 사용하였다.
실시예 3-2 : 면역 부활화
DC2.4 세포를 12 웰 플레이트에 400,000/웰 파종하고, 24h 후에 배지를 교환하고, 무혈청 배지 Opti-MEM (상품명) (Thermo Fisher Scientific) 으로 치환한 후, Lipofectamine (상품명) LTX (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 mRNA 를 2.5 ㎍/웰 투여하였다. 4 시간 후, 세포로부터 RNeasy mini kit (QIAGEN) 로 RNA 를 정제하고, ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) 로 상보적 DNA (complementary DNA (cDNA)) 로 한 후, taqman gene expression assay (Applied Biosystems) 를 사용하여, 인터페론 β 및 인터류킨 6 의 발현량을 조사하였다. 이때, 액틴 b 의 발현량으로 표준화하였다.
그 결과를 도 38 및 도 39 에 나타낸다. 5'ppp-RNA 올리고머와 합성 RNA 올리고머로 이루어지는 2 본쇄 구조의 증가에 따라, 인터페론 β 및 인터류킨 6 의 발현량이 증가하여 있었다. 그것으로부터, 2 본쇄 구조의 증가에 따라, 면역 부활화 효과가 상승한 것이 분명해졌다.
실시예 3-3 : 단백질 번역
DC2.4 세포를 96 웰 플레이트에 40,000/웰 파종하고, 24h 후에 배지를 교환하고, 무혈청 배지 Opti-MEM (상품명) (Thermo Fisher Scientific) 으로 치환한 후, Lipofectamine (상품명) LTX (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 mRNA 를 0.25 ㎍/웰 투여하였다. 4 시간 후 Gluc 단백질량을 Renilla Luciferase Assay 시스템 (Promega) 으로 정량하였다.
그 결과를 도 40 에 나타낸다. 5'ppp-RNA 올리고머와 합성 RNA 올리고머로 이루어지는 2 본쇄 구조의 증가에 따라, 약간의 번역 활성의 저하를 확인했지만, 3 개 결합한 경우여도 1 본쇄 RNA 와 비교하여, 70 ％ 정도의 번역 활성이 유지되었다. 양태 2 의 mRNA : pU 와 비교하여, 우수한 번역 활성이 얻어졌다.
여기서 도 38 ∼ 40 의 P 값은, 통계 처리로서 ANOVA 검정 후, Tukey 검정을 실시했을 때의 통계학적 유의차를 나타낸다.
산업상 이용가능성
mRNA 송달은, 치료용 단백질을 안전하고 또한 지속적으로 공급하기 위한 수법으로서, 그 의료에의 응용이 기대되고 있다. 헌편으로, mRNA 가 생체 내에서 신속하게 효소 분해를 받아 버리는 것이 큰 과제가 되어 있었다. 이에 대하여, 본 발명의 제 1 양태에서는, mRNA 분자 자체를 화학 수식함으로써, 고분자 미셀에 내포했을 때의 mRNA 의 효소 분해를 현저하게 억제하여, mRNA 도입 효율을 높이는 것에 성공하였다. 여기서 사용한 mRNA 내포 고분자 미셀은, 중추 신경 질환, 운동 감각기 질환, 간 질환, 악성 종양 등 다양한 질환의 모델 동물에 대한 치료 실험에 있어서, 우수한 효과를 나타내고 있어, 장래의 임상 응용을 확신한 연구가 진행되고 있다. 고분자 미셀의 조성은, 표적 장기, 투여법에 따라 상이하지만, 본 발명의 제 1 양태의 기술은 다양한 조성의 미셀을 안정화할 수 있는 점에서, 폭넓게 응용할 수 있다.
mRNA 백신은, 종래의 백신과는 완전히 상이한 구조에 의한 의약품으로서 자리매김된다. 특징으로서, 발현시키는 항원 단백질을 자유롭게 구축할 수 있는 점, 세포성 면역을 유도할 수 있는 점을 들 수 있다. 또, 동종의 핵산 백신으로서 DNA 백신의 연구예는 있지만, DNA 는 호스트 게놈에의 랜덤의 삽입에 의한 변이 유발 리스크가 있어, 실용화의 장애가 되는데 대해, mRNA 는 그 위험성이 없다.
종래의 1 본쇄의 mRNA 를 사용한 백신 개발은 미국, 독일을 중심으로 진행되고 있지만, 효과적으로 염증 반응을 야기하기 위한 아쥬반트 병용이 회피되지 않았다. 본 발명의 제 2 및 제 3 양태의 mRNA 백신은, 아쥬반트가 반드시 필요하지 않고, mRNA 만으로 효과적으로 염증 반응을 야기하는 것이 가능하고, 또, 항원 제시와 동시 또한 동소적으로 염증 반응을 야기할 수 있다.
mRNA 백신은, 투여 경로 (피하 투여, 근육 내 투여, 경점막 투여 등), 수송 담체 등을 가리지 않고, 용도나 목적에 따른 유연한 적응이 가능하다. 또, mRNA 백신으로 사용하는 mRNA 는 화학 반응을 베이스로 정제되고, 염기 서열을 변경하는 것만으로 모든 단백질에 대응 가능하기 때문에, 스케일 메리트에 의한 대폭적인 비용 다운이 예상된다. 이들 점은, 종래의 백신과는 명백하게 상이한 장점이다. 본 발명의 제 2 및 제 3 양태의 백신은, 새로운 백신 시스템으로서, 암 등의 개별화 치료, 바이러스 변이에 신속히 대응 가능한 감염증 백신 등, 광범위한 시장이 기대된다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1 ∼ 27 : 합성 RNA
서열 번호 28 ∼ 31 : 합성 DNA/RNA
서열 번호 32 : 합성 DNA
서열 번호 33 : 합성 RNA
서열 번호 34 ∼ 48 : 합성 RNA
서열 번호 49 및 50 : 합성 DNA
서열 번호 51 ∼ 56 : 합성 RNA
서열 번호 57 및 58 : 합성 DNA
서열 번호 59 : 합성 RNA
서열 번호 60 ∼ 62 : 합성 RNA
서열 번호 63 ∼ 65 : 합성 DNA
서열 번호 66 ∼ 68 : 합성 RNA
SEQUENCE LISTING <110> The University of Tokyo <120> Method of functionalizing mRNA <130> G1576WO <150> JP2016-252487 <151> 2016-12-27 <150> JP2016-252488 <151> 2016-12-27 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 783 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 1 gggagaccgg ccucgagcag cugaagcuug guaccgagcu cggauccagc caccauggga 60 gucaaaguuc uguuugcccu gaucugcauc gcuguggccg aggccaagcc caccgagaac 120 aacgaagacu ucaacaucgu ggccguggcc agcaacuucg cgaccacgga ucucgaugcu 180 gaccgcggga aguugcccgg caagaagcug ccgcuggagg ugcucaaaga gauggaagcc 240 aaugcccgga aagcuggcug caccaggggc ugucugaucu gccuguccca caucaagugc 300 acgcccaaga ugaagaaguu caucccagga cgcugccaca ccuacgaagg cgacaaagag 360 uccgcacagg gcggcauagg cgaggcgauc gucgacauuc cugagauucc uggguucaag 420 gacuuggagc ccauggagca guucaucgca caggucgauc ugugugugga cugcacaacu 480 ggcugccuca aagggcuugc caacgugcag uguucugacc ugcucaagaa guggcugccg 540 caacgcugug cgaccuuugc cagcaagauc cagggccagg uggacaagau caagggggcc 600 gguggugacu aagcggccgc ucgagcaugc aucuagagga uccccgggua ccgagcucga 660 auucaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaa 783 <210> 2 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 2 ucuuugagca ccuccag 17 <210> 3 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 3 cucuagaugc augcucg 17 <210> 4 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 4 cucggccaca gcgaugc 17 <210> 5 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 5 gcggcagcca cuucuug 17 <210> 6 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 6 aucucaggaa ugucgac 17 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 7 uccaucucuu ugagcaccuc cag 23 <210> 8 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 8 cuuuccgggc auuggcuucc aucucuuuga 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gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgactaa 558 <210> 33 <211> 1653 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 33 auggaagacg ccaaaaacau aaagaaaggc ccggcgccau ucuauccgcu ggaagaugga 60 accgcuggag agcaacugca uaaggcuaug aagagauacg cccugguucc uggaacaauu 120 gcuuuuacag augcacauau cgagguggac aucacuuacg cugaguacuu cgaaaugucc 180 guucgguugg cagaagcuau gaaacgauau gggcugaaua caaaucacag aaucgucgua 240 ugcagugaaa acucucuuca auucuuuaug ccgguguugg gcgcguuauu uaucggaguu 300 gcaguugcgc ccgcgaacga cauuuauaau gaacgugaau ugcucaacag uaugggcauu 360 ucgcagccua ccgugguguu cguuuccaaa aagggguugc aaaaaauuuu gaacgugcaa 420 aaaaagcucc caaucaucca aaaaauuauu aucauggauu cuaaaacgga uuaccaggga 480 uuucagucga uguacacguu cgucacaucu caucuaccuc ccgguuuuaa ugaauacgau 540 uuugugccag aguccuucga uagggacaag acaauugcac ugaucaugaa cuccucugga 600 ucuacugguc ugccuaaagg ugucgcucug ccucauagaa cugccugcgu gagauucucg 660 caugccagag auccuauuuu uggcaaucaa aucauuccgg auacugcgau uuuaaguguu 720 guuccauucc aucacgguuu uggaauguuu acuacacucg gauauuugau auguggauuu 780 cgagucgucu uaauguauag auuugaagaa gagcuguuuc ugaggagccu ucaggauuac 840 aagauucaaa gugcgcugcu ggugccaacc cuauucuccu ucuucgccaa aagcacucug 900 auugacaaau acgauuuauc uaauuuacac gaaauugcuu cugguggcgc uccccucucu 960 aaggaagucg gggaagcggu ugccaagagg uuccaucugc cagguaucag gcaaggauau 1020 gggcucacug agacuacauc agcuauucug auuacacccg agggggauga uaaaccgggc 1080 gcggucggua aaguuguucc auuuuuugaa gcgaagguug uggaucugga uaccgggaaa 1140 acgcugggcg uuaaucaaag aggcgaacug ugugugagag guccuaugau uauguccggu 1200 uauguaaaca auccggaagc gaccaacgcc uugauugaca aggauggaug gcuacauucu 1260 ggagacauag cuuacuggga cgaagacgaa cacuucuuca ucguugaccg ccugaagucu 1320 cugauuaagu acaaaggcua ucagguggcu cccgcugaau uggaauccau cuugcuccaa 1380 caccccaaca ucuucgacgc aggugucgca ggucuucccg acgaugacgc cggugaacuu 1440 cccgccgccg uuguuguuuu ggagcacgga aagacgauga cggaaaaaga gaucguggau 1500 uacgucgcca gucaaguaac aaccgcgaaa aaguugcgcg gaggaguugu guuuguggac 1560 gaaguaccga aaggucuuac cggaaaacuc gacgcaagaa aaaucagaga gauccucaua 1620 aaggccaaga agggcggaaa gaucgccgug uaa 1653 <210> 34 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 34 acucuuuguc gccuucg 17 <210> 35 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 35 cucggccaca gcgaugc 17 <210> 36 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 36 ucuuugagca ccuccag 17 <210> 37 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 37 cucuagaugc augcucg 17 <210> 38 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> 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caggucgauc ugugugugga cugcacaacu 480 ggcugccuca aagggcuugc caacgugcag uguucugacc ugcucaagaa guggcugccg 540 caacgcugug cgaccuuugc cagcaagauc cagggccagg uggacaagau caagggggcc 600 gguggugacu aagcggccgc ucgagcaugc aucuagagga uccccgggua ccgagcucga 660 auucaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaa 783 <210> 52 <211> 777 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 52 gaaccagauc ucgucucuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 60 uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 120 uuuuuuuuuu uuuuuuugaa uucgagcucg guacccgggg auccucuaga ugcaugcucg 180 agcggccgcu uagucaccac cggcccccuu gaucuugucc accuggcccu ggaucuugcu 240 ggcaaagguc gcacagcguu gcggcagcca cuucuugagc aggucagaac acugcacguu 300 ggcaagcccu uugaggcagc caguugugca guccacacac agaucgaccu gugcgaugaa 360 cugcuccaug ggcuccaagu ccuugaaccc aggaaucuca ggaaugucga cgaucgccuc 420 gccuaugccg cccugugcgg acucuuuguc gccuucguag guguggcagc guccugggau 480 gaacuucuuc aucuugggcg ugcacuugau gugggacagg cagaucagac agccccuggu 540 gcagccagcu uuccgggcau uggcuuccau cucuuugagc accuccagcg gcagcuucuu 600 gccgggcaac uucccgcggu cagcaucgag auccgugguc gcgaaguugc uggccacggc 660 cacgauguug aagucuucgu uguucucggu gggcuuggcc ucggccacag cgaugcagau 720 cagggcaaac agaacuuuga cucccauggu ggcuggaucc gagcucggua ccaagcu 777 <210> 53 <211> 663 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 53 gaaccagauc ugauaucauc gaugaauucg agcucgguac ccggggaucc ucuagaugca 60 ugcucgagcg gccgcuuagu caccaccggc ccccuugauc uuguccaccu ggcccuggau 120 cuugcuggca aaggucgcac agcguugcgg cagccacuuc uugagcaggu cagaacacug 180 cacguuggca agcccuuuga ggcagccagu ugugcagucc acacacagau cgaccugugc 240 gaugaacugc uccaugggcu ccaaguccuu gaacccagga aucucaggaa ugucgacgau 300 cgccucgccu augccgcccu gugcggacuc uuugucgccu ucguaggugu ggcagcgucc 360 ugggaugaac uucuucaucu ugggcgugca cuugaugugg gacaggcaga ucagacagcc 420 ccuggugcag ccagcuuucc gggcauuggc uuccaucucu uugagcaccu ccagcggcag 480 cuucuugccg ggcaacuucc cgcggucagc aucgagaucc guggucgcga aguugcuggc 540 cacggccacg auguugaagu cuucguuguu cucggugggc uuggccucgg ccacagcgau 600 gcagaucagg gcaaacagaa cuuugacucc caugguggcu ggauccgagc ucgguaccaa 660 gcu 663 <210> 54 <211> 156 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 54 gaaccagauc ucgucucuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 60 uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 120 uuuuuuuuuu uuuuuuugaa uucgagcucg guaccc 156 <210> 55 <211> 1303 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 55 gggagaccgg ccucgagaug ggcagcaucg gggcagcaag cauggaguuu uguuuugacg 60 uguuuaagga acugaaagug caucacgcua augagaauau cuucuacugc cccaucgcca 120 uuaugucugc ccuggcuaug guguaucugg gagcuaagga caguaccaga acacagauca 180 acaagguggu ccgcuucgac aaacugcccg gguuuggcga cagcauugag gcucagugug 240 gcacuuccgu gaauguccac agcucccuga gggacauccu gaaccagauu accaagccua 300 augacgugua cuccuucucu cuggccuccc ggcuguacgc ugaggaaagg uaucccaucc 360 ugccugagua ccugcagugc gugaaagaac uguauagggg cggacuggag ccaaucaacu 420 uucagacagc cgcugaccag gccagagaac ugauuaauuc uuggguggag agucagacua 480 acgguaucau ucgcaaugug cugcagcccu cuagugucga uagccagacc gcuauggugc 540 uggucaacgc aaucguguuc aagggccugu gggagaagac cuucaaggac gaagauacuc 600 aggcaaugcc auuccgagug acagagcagg aaagcaaacc cguccagaug auguaucaga 660 ucggccuguu cagaguggcu agcauggcau ccgagaagau gaaaauucug gaacugccuu 720 uugccucagg aaccaugagc augcuggugc ugcugccaga cgaggucagu gggcuggagc 780 agcuggaauc aaucauuaac uucgagaagc ugacugaaug gaccucaagc aaugugaugg 840 aggaacgaaa gaucaaaguc uaccugccuc ggaugaagau ggaggaaaaa uauaaccuga 900 ccuccgugcu gauggcuaug gguauuacag augucuuuuc cucuagugcc aaucugucug 960 gcaucucaag cgccgagucc cugaagauuu cucaggcagu gcacgcagcc caugcagaga 1020 ucaaugaagc cggccgcgag guggucggau cugcagaagc cgggguggac gcugcaagug 1080 ucucagagga guuccgggcc gaucauccau uucuguucug uaucaaacau auugccacaa 1140 augccgugcu guucuucggu agaugcgugu caccaugaga auucaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1303 <210> 56 <211> 142 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 56 gaaccagauc ucgucucuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 60 uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 120 uuuuuuuuuu uuuuuuugaa uu 142 <210> 57 <211> 558 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 57 atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120 gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180 gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240 aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300 aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360 ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420 acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480 ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540 ggggccggtg gtgactaa 558 <210> 58 <211> 1161 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 58 atgggcagca tcggggcagc aagcatggag ttttgttttg acgtgtttaa ggaactgaaa 60 gtgcatcacg ctaatgagaa tatcttctac tgccccatcg ccattatgtc tgccctggct 120 atggtgtatc tgggagctaa ggacagtacc agaacacaga tcaacaaggt ggtccgcttc 180 gacaaactgc ccgggtttgg cgacagcatt gaggctcagt gtggcacttc cgtgaatgtc 240 cacagctccc tgagggacat cctgaaccag attaccaagc ctaatgacgt gtactccttc 300 tctctggcct cccggctgta cgctgaggaa aggtatccca tcctgcctga gtacctgcag 360 tgcgtgaaag aactgtatag gggcggactg gagccaatca actttcagac agccgctgac 420 caggccagag aactgattaa ttcttgggtg gagagtcaga ctaacggtat cattcgcaat 480 gtgctgcagc cctctagtgt cgatagccag accgctatgg tgctggtcaa cgcaatcgtg 540 ttcaagggcc tgtgggagaa gaccttcaag gacgaagata ctcaggcaat gccattccga 600 gtgacagagc aggaaagcaa acccgtccag atgatgtatc 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synthetic RNA <400> 60 cagccagcuu uccgggcuac acacacacac acacacacac acc 43 <210> 61 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 61 acucuuuguc gccuucgauc acacacacac acacacacac acc 43 <210> 62 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 62 gcggcagcca cuucuuguac acacacacac acacacacac acc 43 <210> 63 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 63 taggtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgggcc c 31 <210> 64 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 64 aaacgggccc acacacacac acacacacac a 31 <210> 65 <211> 2153 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 65 tgggcctttc ttcggtagaa aatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 60 atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 120 gagctaccaa ctctttttcc gaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 180 ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 240 acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 300 ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 360 gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 420 gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 480 gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 540 tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagca tcgatttttg tgatgctcgt 600 caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcaga aaggcccacc cgaaggtgag 660 ccaggtgatt acatttaggt cctcattaga aaaactcatc gagcatcaag tgaaactgca 720 atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag 780 gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc 840 cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa 900 gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaagagt ttatgcattt 960 ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcaccaa 1020 ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga tcgccgttaa 1080 aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc agcgcatcaa 1140 caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt ttccctggga 1200 tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg atggtcggaa 1260 gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagcc tgaccatctc atctgtaaca tcattggcaa 1320 cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca tacaatcgat 1380 agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca tataaatcag 1440 catccatgtt ggaatttaat cgcggcttca agcaagacgt ttcccgttga atatggctca 1500 ttttagcttc cttagctcct gaaaatctcg ataactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc 1560 ttatttcatt atggtgaaag ttggaacctc ttacgtgccg atcaagtcaa aagcctccgg 1620 tcggaggctt ttgactttct gctatggagg tcaggtatga tttaaatggt cagtattgag 1680 cctcaggaaa cagctatgac atcaagctga ctagataatc tagctgatcg tggaccgatc 1740 atacgtataa tgccgtaaga tcacgggtcg cagcacagct cgcggtccag tagtgatcga 1800 cactgctcga tccgctcgca ccgctagcta atacgactca ctataggtgt gtgtgtgtgt 1860 gtgtgtgtgg gcccgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat 1920 caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc ttttaaaaag cttggatcga cgagagcagc 1980 gcgactggat ctgtcgcccg tctcaaacgc aaccctccgg cggtcgcata tcattcagga 2040 cgagcctcag actccagcgt aactggactg caatcaactc actggctcac cttccggtcc 2100 acgatcagct agaatcaagc tgactagata aactggccgt cgttttacac ggg 2153 <210> 66 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 66 ggugugugug ugugugugug ugug 24 <210> 67 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 67 gugugugugu 10 <210> 68 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic RNA <400> 68 acacacacac 10

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  21. 항원을 코드하는 mRNA 와, 당해 mRNA 에 하이브리다이즈한 적어도 1 개의 제 1 RNA 올리고머와, 당해 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈한 제 2 RNA 올리고머로 이루어지는 2 본쇄 RNA 를 포함하고,
    제 1 RNA 올리고머는,
    (a) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 제 1 RNA 서열과, 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열로 이루어지는 제 2 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열,
    (b) mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 제 1 RNA 서열과, 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 제 2 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하는 제 2 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열,
    (c) 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열로 이루어지는 제 2 RNA 서열과, mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열로 이루어지는 제 1 RNA 서열을, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열, 또는
    (d) 제 2 RNA 올리고머의 서열에 상보적인 10 ∼ 200 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 제 2 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하는 제 2 RNA 서열과, mRNA 의 서열에 상보적인 12 ∼ 40 염기의 서열과 90 ％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 mRNA 에 하이브리다이즈하는 제 1 RNA 서열과, 5' 말단으로부터 이 순서로 포함하는 RNA 서열
    을 포함하는, mRNA 백신.
  22. 제 21 항에 있어서,
    제 1 RNA 올리고머는, 22 ∼ 240 염기의 서열로 이루어지는, mRNA 백신.
  23. 제 21 항에 있어서,
    1 개의 mRNA 에 하이브리다이즈시키는 제 1 RNA 올리고머의 수가, 1 ∼ 50 개인, mRNA 백신.
  24. 제 21 항에 있어서,
    제 1 RNA 올리고머는, 상기 (a) 의 RNA 서열 또는 상기 (b) 의 RNA 서열을 포함하고, 제 2 RNA 올리고머는, 5' 말단에 트리인산 구조를 갖는, mRNA 백신.
  25. 제 21 항에 있어서,
    제 1 RNA 올리고머는, 상기 (c) 의 RNA 서열 또는 상기 (d) 의 RNA 서열을 포함하고, 제 1 RNA 올리고머는, 5' 말단에 트리인산 구조를 갖는, mRNA 백신.
  26. 제 21 항에 있어서,
    제 2 RNA 올리고머가 제 1 RNA 올리고머에 하이브리다이즈하고 있는 측의 2 본쇄 RNA 의 말단이, 평활 말단인, mRNA 백신.
  27. 제 21 항에 있어서,
    제 2 RNA 올리고머는 10 ∼ 200 염기의 서열을 포함하는, mRNA 백신.
  28. 제 21 항에 있어서,
    2 본쇄 RNA 가 네이키드의 형태인, mRNA 백신.
  29. 제 21 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트와 함께 사용하지 않는, mRNA 백신.
  30. 제 21 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에 있어서 당해 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, mRNA 백신.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200347385A1 (en) * 2017-11-09 2020-11-05 The University Of Tokyo METHOD FOR mRNA STABILIZATION
CA3139032A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Robert Alexander WESSELHOEFT Circular rna compositions and methods
MX2022006854A (es) 2019-12-04 2022-11-30 Orna Therapeutics Inc Composiciones y metodos de arn circular.
CA3179423A1 (en) * 2020-05-19 2021-11-25 Robert Alexander WESSELHOEFT Circular rna compositions and methods
WO2022004765A1 (ja) * 2020-06-30 2022-01-06 公益財団法人川崎市産業振興財団 ゲノム編集用組成物

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040253723A1 (en) * 2003-02-28 2004-12-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US20110033416A1 (en) * 2007-09-28 2011-02-10 Biomay Ag RNA Vaccines
US20130317087A1 (en) * 2011-02-09 2013-11-28 University Of Rochester Methods and compositions related to staufen 1 binding sites formed by duplexing alu elements
US20150267192A1 (en) * 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9096636B2 (en) * 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
WO2002070739A2 (en) 2001-03-08 2002-09-12 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd Assay for identifying inhibitors of the rna dependent rna polymerase (ns5b) of hcv
US8796436B2 (en) * 2003-04-17 2014-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
KR101350837B1 (ko) * 2003-12-03 2014-01-14 코다 테라퓨틱스, 인크. 코넥신에 표적화된 안티센스 화합물 및 그의 사용 방법
DE502006007749D1 (de) 2005-07-25 2010-10-07 Riboxx Gmbh Verfahren und Kit zur Amplifikation von heteropolymerer oder poly(C)- RNA
JP5761911B2 (ja) * 2006-04-07 2015-08-12 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＩｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｔｌｒ７およびｔｌｒ８に対する安定化免疫調節ｒｎａ（ｓｉｍｒａ）化合物
WO2009154804A2 (en) * 2008-06-20 2009-12-23 Thomas Jefferson University Twin fluorophore peptide nucleic acid hybridization probes
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
EP2280081A1 (en) 2009-07-31 2011-02-02 Qiagen GmbH Method of normalized quantification of RNA
JP5826174B2 (ja) * 2010-07-09 2015-12-02 国立大学法人 東京大学 核酸送達用組成物及び担体組成物、それを用いた医薬組成物、並びに核酸送達方法
CA2925129C (en) * 2013-10-04 2023-04-04 Novartis Ag 3' end caps for rnai agents for use in rna interference
CN105899192B (zh) * 2013-11-22 2019-08-13 国立大学法人东京大学 药物递送用载体、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们的施予方法
US10232054B2 (en) 2014-02-12 2019-03-19 Accurna, Inc. Composition for mRNA delivery

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040253723A1 (en) * 2003-02-28 2004-12-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US20110033416A1 (en) * 2007-09-28 2011-02-10 Biomay Ag RNA Vaccines
US20130317087A1 (en) * 2011-02-09 2013-11-28 University Of Rochester Methods and compositions related to staufen 1 binding sites formed by duplexing alu elements
US20150267192A1 (en) * 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof

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