CN1922320A - 靶向连接蛋白的反义化合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于调节连接蛋白活性的方法以及组合物，包括例如，用于术后、外伤，或组织工程应用。这些化合物以及方法可在治疗上，例如，用来降低与疾病和病症有关的不良作用的严重性，其中直接细胞间通讯的局部破坏是所希望的。

Description

靶向连接蛋白的反义化合物及其使用方法
技术领域
本发明披露的内容涉及和描述利用化合物来调节间隙连接相关的蛋白质表达的试剂、组合物以及方法。这些试剂、组合物、以及方法可用于，例如，体内和体外组织工程，包括例如在皮肤中、角膜组织中、以及与眼有关的外科手术。
背景技术
由于生病或损伤引起的组织或器官衰竭是世界范围内的主要健康问题，除了进行器官或组织移植外，很少有完全康复的选择。但是，寻找合适供体的难题意味着这种选择对于大多数患者来说是不可利用的。目前正在研究用作替代的组织工程或重建，由此形成合成或半合成组织或器官仿制品，其是全功能性的或者生长为希望的功能性。
尤其是这种技术变得日益重要的一个领域是眼角膜。角膜移植是世界范围内进行的最常见形式的固体器官移植。仅在美国和英国每年就进行约80,000例。诸如屈光角膜切除术(PRK)和激光原位角膜磨削术(LASIK)的用来矫正近视的屈光性手术(refractivesurgery)的流行，导致了用于移植的合适角膜的短缺，这些角膜用于手术或疾病过程后的组织重建以及用于体内组织操作处理以设计变化(engineer change)。另外，大约5％有激光手术经历的患者体验到意外的结果。
角膜是透明的组织，其包括眼睛外膜的中部六分之一。其一致的结构和功能为眼睛提供了清晰的折射界面、抗张强度，并且保护眼睛免于外部因素。角膜由三个不同的主要细胞层构成：上皮、间质、以及内皮(Pepose，J.S.et al.，“The cornea；Adler’s Physiology ofthe eye：Clinical application”，9th ed.St.Louis：Mosby Year Book，1992，29-47；Spencer，W.H.，“The cornea；Ophthalmic Pathology：an atlasand textbook”，4th ed.，Philadelphia：W.B.Saunders Co.，1996，157-65)。另外，后弹性膜(Descemet’s membrane)、鲍曼层(Bowman’slayer)、以及基底膜是以一些方式来源于这些主要细胞层之一的结构。
角膜上皮是直接接触外部环境的层。它是一种分层鳞状、非角质化的结构，在鼠和人体中，厚度范围分别是40到100μm。其包括：通常由两到三层扁平鳞状细胞形成的表面区、由两或三层多面翼细胞(polyhedral wing cell)形成的中间区、以及由单排柱状细胞构成的基底区。层状角膜上皮的特征是作为“紧密”离子转运功能的合胞体(syncitium)，其用作眼表面的保护性屏障以及附属液体分泌层，该分泌层有助于角膜内皮对间质水合的调节，并因此有利于保持角膜的透明。已证实角膜上皮具有的独特和专一化性质对作为眼睛主要折射元件的角膜的运转(operation)来说是必需的。因此不管任何环境应力下保持其层状结构就很重要。
角膜表面的外伤特别普遍；例如，小擦伤、眼睛感染和疾病、化学或机械意外事故以及手术实施都会损伤角膜。角膜外伤伤口愈合后的一个主要并发症是由于组织重新形成(reorganization)而丧失视敏度。有眼愈合问题的危险的患者包括那些经过手术的人。这样的手术的实例包括但不限于有或没有晶状体置换的白内障摘除术、诸如穿透性角膜移植术(PKP)的角膜移植或其它穿透性手术、准分子激光屈光性角膜切除术、青光眼滤过术、放射状角膜切除术、以及用来矫正屈光或替换晶状体的其它类型手术。
角膜提供了外部光学平滑面(external optically smooth surface)，以将光传送到眼中。手术破坏了将角膜固定为其标准构型的力。对白内障患者，在边缘区进行全部厚度的手术切口。角膜在其愈合时收缩，从而引起组织的局部变形以及受影响区的视野内的伴随变形(散光)。
其它角膜中的手术伤口会引发伤口愈合过程，其引起角膜曲率的预定局部移动。这些技术中最为广泛知晓的是放射状角膜切开术(RK)，其中，产生了几个部分厚度切口而引起中心角膜扁平化。
但是，这种技术由于缺乏可预知的结果和视力上的显著波动(两者都与伤口愈合的性质和程度有关)而受限(Jester et al.，Cornea(1992)11：191)。例如，在大多数RK患者中观察到在初始视力提高中具有伴随的退化的角膜组织的外围隆起中的复位(reduction)(McDonnelland Schanzlin，Arch.Ophthalmol.(1998)，106：212)。
角膜中的伤口愈合也很缓慢，并且不完全愈合往往与视敏度的不稳定性有关(具有从早晨到夜晚视力上的波动，以及在超过几星期到几个月的时间发生飘动(drifting)视敏度)，这可能是34％或更多进行过放射状角膜切开术的患者手术后一年抱怨波动视力的原因(Waring et al.，Amer.J.Ophthalmol.(1991)111：133)。同样，如果角膜伤口未能彻底愈合，那么可能会发生伤口“裂开”，从而会导致渐进的远视作用。多达30％经过RK手术的患者遭受与伤口裂开有关的远视飘移之苦(Dietz et al.，Ophthalmology(1986)93：1284)。
外伤后的角膜再生较复杂并且还未很好地被理解。其涉及三种组织的再生：上皮、间质以及内皮。三种主要的细胞间发信号的途径被认为可以调节组织再生：一个通过生长因子(Baldwin，H.C.andMarshall，J.，Acta Ophthalmol.Scand.，(2002)80：238-47)、细胞因子(Ahmadi，A.J.and Jakobiec，F.A.，Int.Ophthalmol.Clinics，(2002)42(3)：13-22)以及趋化因子(chemokine)(Kurpakus-Wheater，M，etal.，Biotech.Histochem，(1999)74：146-59)来介导；另一种通过细胞基质相互作用来介导(Tanaka，T.，et al.，Jpn.J.Ophthalmol.，(1999)43：348-54)；以及另一种通过间隙连接和通道形成蛋白的连接蛋白家族来介导。
间隙连接是细胞膜结构，其有利于直接的细胞间通讯。间隙连接通道由两个连接子形成，每个连接子由六个连接蛋白亚单位组成。每个六聚体连接子与相对膜中的连接子对接以形成单个间隙连接。可在整个身体中发现间隙连接通道。诸如角膜上皮的组织，例如，具有六到八个细胞层，然而在不同层中表现不同的间隙连接通道，其中在基底层中为连接蛋白-43以及从基底层到中部翼细胞层为连接蛋白-26。总体来说，连接蛋白是一种蛋白质家族，通常根据它们的分子量来命名或基于种系发生分为α、β以及γ子类。到目前为止，确定了20个人类和19个鼠类同种型(isoform)(Willecke，K.et al.，Biol.Chem.，(2002)383，725-37)，这可能表示每个不同的连接蛋白可以进行功能专化。不同组织和细胞类型具有连接蛋白表达的特征模式并且已表明诸如角膜的组织在损伤或移植以后会改变连接蛋白的表达模式(Qui，C.et al.，(2003)Current Biology，13：1967-1703；Brander et al.，(2004)，J Invest Dermatol.122(5)：1310-20)。
外伤后角膜再生过程会导致角膜透明度的丧失并因此影响屈光手术的结果。目前对于损伤角膜的治疗通常包括角膜移植或试图将角膜细胞/组织用于重建。但是，在诸如准分子激光屈光角膜切除术的外科手术以后，对角膜和周围软组织的术后外伤经常会导致瘢痕形成，这是由于与细胞外基质的改变有关的细胞增多；包括在激光所致的损伤处的上皮细胞生长模式(patterning)、肌纤维母细胞分化、间质重建、以及上皮增生的变化。
在严重的脊髓损伤中，无论是通过横断、挫伤或加压而发生的病理变化，都共有一些与术后瘢痕形成和组织重建的相似性。在损伤后24-48小时内，损伤会扩展并显著增大受影响区域的尺寸。可能涉及间隙连接介导的副作用(bystander effect)(Lin，J.H.et al.，1998，Nature Neurosci.1：431-432)，通过该副作用间隙连接通道将神经毒素和钙波(calcium wave)从损伤位置扩展到其它健康组织。
这伴随着特征性的炎性肿胀。脊髓中的损伤区被腔或结缔组织瘢痕代替，这两者都阻碍轴突再生(McDonald，J.W.et al，(September1999)Scientific American.55-63；Ramer，M.S.et al.，Spinal Cord.(2000)38：449-472；Schmidt，C.E.and Baier Leach，J.；(2003)Ann.Rev.Biomed.Eng.5：293-347)。尽管用一些当前治疗方式取得了进步，但是对脊髓修复的主要限制仍然保持，这包括侵入性介入本身会进一步扩大损伤以及神经胶质瘢痕形成，这会阻碍修复过程以及冒进一步丧失神经功能的危险(Raisman，GJ.Royal Soc.Med.96：259-261)。
已利用反义技术来调节与病毒、真菌以及代谢病有关的基因表达。美国专利第5,166,195号提出了HIV的寡核苷酸抑制剂。美国专利第5,004,810号提出了用来杂交单纯疱疹病毒Vmw65mRNA并抑制复制的寡聚物。还参见Becker等于2000年1月27日提交的题为“Formulations Comprisng Antisense Nucleotides to Connexins”的专利申请WO 00/44409(其全部内容以引用方式并入本文)，该专利描述了利用反义(AS)寡聚脱氧核苷酸来下调连接蛋白的表达，以治疗大脑、脊髓或视神经中的局部神经元损伤，促进伤口愈合并减少在手术或烧伤以后的皮肤组织的瘢痕形成。但是，仍然需要克服许多难题。例如，经常是这种情形：在非靶细胞类型中的特定基因产物的下调可能是有害的。其它需要克服的难题包括这样的ODN(未修饰的磷酸二酯低聚物)的短暂半衰期通常具有仅20分钟的胞内半衰期，这是因为胞内核酸酶降解(Wagner 1994，见前)以及它们连贯且可靠地传递到靶组织。
因此，需要并且存在对于用于上述问题的化合物开发的许多可能优点。在此将描述并要求保护这样的化合物、相关组合物、以及它们的使用方法。
发明内容
在此描述并要求保护的本发明具有许多特性和实施例，包括但不限于在本发明内容中提出或描述或参照的那些特性和实施例。在此描述并要求保护的发明不限于或受限于在本发明内容中确定的特性或实施例，其仅用于说明而不是用于限制的目的。
本文提供了对组织工程很有用的化合物，包括反义化合物。还提供了反义化合物以及用来减少与眼科手术有关的组织损伤的方法。这些方法包括，例如，将足以抑制患者眼中或与患者眼有关的细胞中的连接蛋白表达的量的反义化合物给予患者的眼。虽然优选抑制连接蛋白的表达，但是可以想象到其它蛋白质可以是化合物(包括反义化合物)调节的靶，这些化合物单独使用或者和抑制人类连接蛋白表达的反义或其它化合物一起使用。
在一些实施例中，眼科操作是眼外科手术，包括但不限于准分子激光屈光角膜切除术、白内障摘除术、角膜移植、矫正屈光的手术、放射状角膜切开术、青光眼过滤术、角膜移植术、准分子激光屈光角膜切除术、角膜移植、矫正屈光的手术、眼表面瘤切除术、结膜或羊膜移植、翼状胬肉和睑裂斑切除术、眼整形手术、眼睑瘤切除术、用于先天性异常的重建眼睑手术、外翻和内翻眼睑修复、斜视手术(眼肌肉)、或任何穿透性眼外伤。
通常，至少部分核苷酸序列因连接蛋白而众所周知，其中抑制表达是所希望的。优选地，将反义化合物靶向一个或多个具体的连接蛋白同种型。反义化合物可以靶向的连接蛋白的具体同种型包括(不限于)43、37、31.1、以及26。优选但不要求靶向的连接蛋白是人类的。例如，连接蛋白(例如人类的)可以具有选自SEQ IDNO：12-31的核酸碱基序列(nucleobase sequence)。
在一些实施例中，反义化合物靶向核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中核酸分子编码具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白。
在一些其它实施例中，将第二反义化合物给予患者(例如眼)，其中一个或多个其它反义化合物靶向核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中核酸分子编码具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白(例如人类的)。至少第二反义化合物可以(例如)靶向不同于第一反义化合物靶向的连接蛋白。
可用于本发明各个方面的反义化合物类型的实例包括反义寡核苷酸、反义多核苷酸、脱氧核酶、吗啉代寡核苷酸、dsRNA、RNAi分子、siRNA分子、PNA分子、DNA酶、以及5’-端-突变的U1小核RNA、以及前述的类似物；以及本文提供的或本技术领域中知晓的其它化合物；包括但不限于(例如)非特定的解偶联剂，如辛醇、硝酸甘油(glycerhetinic acid)、以及庚醇。
在一些实施例中(例如)反义化合物是反义寡核苷酸，其包括天然存在的核酸碱基以及未修饰的核苷间键合(linkage)。在其它实施例中(例如)反义化合物是反义寡核苷酸，其包括至少一个修饰的核苷间键合(包括那些借助硫代偶磷酸酯键合的核苷间键合)。合适的反义化合物还包括(例如)寡核苷酸，其包括至少一个修饰的糖部分。合适的反义化合物还包括(例如)寡核苷酸，其包括至少一个修饰的核酸碱基。
在一些实施例中，将本文提供的反义化合物结合另一种化合物给予，例如可用于减少组织损伤、减少炎症、促进愈合、或一些具有其它所希望活性的化合物。
在另一个方面，本发明包括通过将反义化合物给予患者来治疗受治疗者(例如患者)的方法。
在一些实施例中，本文提供的反义化合物是通过局部或表面方式来给予。本文提供的反义化合物也可(例如)全身地或通过眼内注射方式给予。
可以将本文提供的反义化合物在预定时间给予患者，例如，相对于伤口的形成，如进行眼科操作(例如手术)的时间。例如，反义化合物可以在进行眼科操作之前、眼科操作期间、或眼科操作之后给予。反义化合物(例如)可在进行眼科操作之前或之后几分钟或几小时内给予受治疗者。在一些实施例中，反义化合物在进行眼科操作之后给予，以及例如反义化合物在操作的约4小时内、操作的约3小时内给予、以及更通常地在眼科操作的约2小时内、或眼科操作的约1小时内给予。
在另一方面，本文提供的反义化合物可用一定方法给予以影响组织工程。例如，本文提供的反义化合物可以结合增加患者角膜组织厚度的方法给予。这样的方法可能(可能不)与眼科操作(例如手术)有关。作为实例，本文提供的反义化合物可以结合一种方法来给予，该方法促进愈合或在与患者角膜有关的细胞(例如角膜细胞)中防止组织损伤。
在一些实施例中，例如，反义化合物减少瘢痕形成。在一些实施例中，例如，反义化合物减少炎症。在一些实施例中，例如，反义化合物促进伤口愈合。
在一些优选实施例中，例如，反义化合物结合外科移植手术一起使用。
在一些实施例中，例如，反义化合物靶向连接蛋白43并被给予用来调节上皮基细胞分化和生长。
在一些实施例中，例如，反义化合物靶向连接蛋白31.1并被给予用来调节外层角质化。
根据一些实施例，例如，眼科操作是白内障摘除术。在其它实施例中，例如，眼科操作是角膜移植。在其它实施例中，例如，眼外科手术是矫正屈光的外科手术。在另一些实施例中，例如，眼科操作是放射状角膜切开手术。在另一些实施例中，例如，眼科操作是青光眼滤过手术。在其它实施例中，例如，眼科操作是角膜移植术。在其它实施例中，例如，眼科操作是眼表面瘤切除术。在其它实施例中，例如，眼科操作是结膜或羊膜移植。在其它实施例中，例如，眼科操作是翼状胬肉和睑裂斑切除。在其它实施例中，例如，眼科操作是眼整形手术。在其它实施例中，例如，眼科操作是眼睑肿瘤切除。在其它实施例中，例如，眼科操作是用于先天性异常的重建眼睑手术。在其它实施例中，例如，眼科操作是外翻和内翻眼睑修复。在其它实施例中，例如，眼科操作是斜视手术(眼肌)。
在其它实施例中，例如，眼科操作是穿透性眼创伤。
在一些进一步实施例中，例如，利用化合物以及组合物来促进愈合或在与角膜有关的细胞中防止组织损伤，其中与角膜有关的细胞可以是眼中的任何细胞，包括但不限于角膜细胞。
本文提供的药剂(包括反义化合物)可增加患者角膜组织的厚度。在一些实施例中，例如，反义化合物结合另一种可用于减少组织损伤或促进愈合的化合物一起使用。例如，可将反义化合物结合生长因子、细胞因子、或类似物一起给予。
在另一方面，例如，提供了用于减少与眼科手术有关的组织损伤的药物组合物。适当配制药物组合物，例如，用于表面或局部给予患者的眼，该药物组合物包括足够量的反义化合物以在与患者眼有关的细胞中抑制人类连接蛋白的表达。反义化合物(例如)优选靶向核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中核酸分子编码具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白(例如人类的)。
在一些实施例中，例如，反义化合物是药物组合物的形式，该药物组合物包括药用载体或赋形剂，以及药剂或反义化合物的存在量可以有效促进患者伤口的愈合。在一些实施例中，药物组合物可以是，例如，适用于局部给药的形式，包括适用于表面或局部地给予患者眼的形式。在一些进一步实施例中，例如，组合物和制剂可以是凝胶、乳膏形式，或者本文描述的或本领域无论是目前或将来知道的任何形式。
在另一方面，本发明包括药物组合物，该药物组合物包括反义化合物。在一个实施例中，例如，提供的药物组合物用于减少与眼科操作(例如，手术)有关的组织损伤，使得制成的药物组合物用于表面或局部给予患者的眼，并且该药物组合物包括足够量的反义化合物以在与患者眼有关的细胞中抑制人类连接蛋白的表达。在一些实施例中，例如，反义化合物靶向核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中核酸分子编码具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白(例如人类的)。
在一些实施例中，例如，药物组合物包括药用载体，其包含缓冲的普卢兰尼克酸(pluronic acid)或凝胶。在一个具体实施例中，这包括例如，在磷酸缓冲盐溶液中高达约30％的普卢兰尼克酸。
在另一方面，提供了设计反义寡核苷酸的方法，其中反义寡核苷酸靶向一种或多种连接蛋白。该方法可包括所选参数的优化，如热稳定性、亲合力、以及特定寡核苷酸与所选择靶的特异性。该方法可用于选择和开发包含一个或多个特别希望的多核苷酸序列的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸的试验可结合该方法来进行，例如，用于它们剪切mRNA或阻断连接蛋白翻译的能力。
附图说明
图1示出了屈光角膜切除手术12小时后对照和经反义寡核苷酸处理的眼睛的角膜的体内共焦显微图像。
图2示出了准分子激光光切除术(excimer laser photoablation)后24小时对照(2A、2B、2C)和经反义寡脱氧核苷酸处理的鼠角膜(2D、2E)的角膜重建的组织检查。
图3提供了显微图像，示出了准分子激光切除术后24小时的连接蛋白43对照(3A、3B、3C)和经反义寡脱氧核苷酸处理的角膜(3D、3E、3F)的表达。结果表明了连接蛋白43的蛋白水平在用抗连接蛋白43ODN处理以后而降低并导致间质中更小程度的细胞募集(cell recruitment)。
图4示出了利用α平滑肌肌动蛋白抗体进行手术后1星期的成肌纤维细胞标记。图4A、4B、以及4C作为对照；而4D、4E以及4F是经反义(化合物)处理的角膜。
图5示出了屈光角膜切除手术24小时(5A-5D)以及48小时(5E-5H)后，对照(5A、5B)以及经连接蛋白43反义寡脱氧核苷酸处理的角膜的层粘连蛋白-1标记。在24小时时对照在切除区域(5A)的边缘处具有很少和/或不均匀的层粘连蛋白沉淀并且中部更多(5B)，而经反义化合物处理的角膜在这两个区(5C、5D)中均显示出层粘连蛋白更规则的沉淀。在48小时时对照仍然不具有连续的层粘连蛋白沉淀(5E-切除区的边缘；图5F-中心)并且其极不均匀(5E)。相反，经反义ODN处理的角膜在伤口边缘(5G)以及中心(5H)具有连续且相对均匀的基膜。
图6示出了层粘连蛋白-1不规则量化的示图。
图7示出了在对照培养物中(7A)和在用抗连接蛋白43寡脱氧核苷酸三次处理24小时以后(7B)、以及连接蛋白31.1特异性反义(化合物)处理以后(7C、7D)，连接蛋白26与43的免疫组织化学标记。
图8示出了来源于在放入培养基24小时后的P7幼鼠(rat pups)的脊髓节段。对照节段(1)是肿胀的(箭头)，伴随组织从切开端挤出。虚线表示最初切除。组织检查表明细胞有空泡和水肿(edemic)。第五天这些节段具有全部激活的小胶质细胞和很少存活的神经元。相反，相比于具有最小细胞水肿和空泡的对照(p＜0.001)，经反义处理的节段(2)具有显著减少的肿胀。即使在培养基中20天后，灰质中的神经元仍然有活力，其中激活的小胶质细胞限于外部边缘。
图9示出了来源于对照处理的节段(9A)和连接蛋白43反义处理的节段(9B)的神经元。对照节段中的神经元有空泡并且水肿，并且破坏周围组织，但在处理节段中的神经元显得健康并且有活力。
图10描述了放入培养基5天后在靠近培养的脊髓节段端部的MAP-2免疫标记。对照节段具有很少有活力的神经元和很少MAP-2标记(16％显示出任何(any)MAP-2标记)(10A)，而66％的处理节段的暴露于介质和/或接近残余白质物质的切开端具有MAP-2表达区域。
图11描述了脱氧核酶在体外选择性地剪切靶连接蛋白-43mRNA的特定区。在体外从质粒转录2.4kb大鼠连接蛋白-43mRNA(11A)和1.2kb小鼠连接蛋白-43mRNA(11B)并且用各种脱氧核酶培育1小时。大鼠mRNA(11A)的区896-953是不确定的，因为没有脱氧核酶设计用于小鼠相应的区。小鼠mRNA(11B)中的区367-466的脱氧核酶剪切并不匹配来自大鼠连接蛋白-43mRNA的结果，可能由于在大鼠mRNA中存在5’非翻译区的200个碱基对。具有单点突变的有缺陷对照脱氧核酶(df605以及df783)表明这样的分剪切是特异的。由小鼠dz1007和dz1028还观察到一些由脱氧核酶对小鼠mRNA的非特异错误启动。总的来说，靶向526-622、783-885、以及1007-1076碱基区的脱氧核酶在大鼠和小鼠mRNA物种中表现出显著的剪切。
图12描述了在体外脱氧核酶选择性地剪切靶连接蛋白-26mRNA的特定区。在体外从质粒转录0.7kb大鼠(12A)和小鼠(12B)连接蛋白-43mRNA并且用各种脱氧核酶培育1小时。剪切结果表明啮齿动物连接蛋白26mRNA在318-379和493-567碱基区中具有至少两个被脱氧核酶靶向的区。具有单点突变的有缺陷对照脱氧核酶(df351以及df379)表明这样的剪切是特异的。
图13示出了反义寡聚物穿透和在培养达1小时的角膜中的稳定性。Cy3标记的寡聚物显示出用普卢兰尼克凝胶传递1小时后的点状核和细胞质粒标记(13A)。在角膜上皮中1小时后，可见的Cy3穿透速度为10-15μm。Taqman标记寡聚物探针用来测量在上皮细胞中的反义寡聚物的稳定性，其中在每个面板显示出向红色的5nm光发射光谱的情况下使用λ扫描(13B)。完整的Taqman探针显示出荧光共振能量传递，其中TAMRA的红色荧光表示在灰度(13D)上，而断裂产物表示为如从FAM所期望的绿色荧光(也在灰度上示出(13C))。细胞中有效反义寡聚物浓度可以比通过荧光技术可检测的浓度更低。
图14描述了不同反义寡聚物对连接蛋白-43(明，灰度)和连接蛋白-26(暗，灰度)蛋白表达的作用通过体外脱氧核酶mRNA剪切显示出来。图14A示出了在基细胞中正常连接蛋白-43的蛋白表达(明，灰度)和在普卢兰尼克凝胶对照处理的角膜上皮的基细胞至中间细胞中连接蛋白-26的蛋白表达(暗，灰度)。as14(14B)、as769(14D)、as892(14F)(这三个在体外都不表现出脱氧核酶剪切)以及DB1有义对照(14H)寡聚物不影响活体外培养基中两种连接蛋白的表达。as605(14C)、as783(14E)以及DB1(14G)(这三个都表现出积极的体外脱氧核酶剪切)仅在处理的角膜的上皮细胞中表现出特异连接蛋白-43降低。
图15示出了连接蛋白-43反义寡聚物选择性地减少在大鼠角膜中的连接蛋白-43蛋白表达。每个点代表单个不同处理的角膜。实心点(黑色，DB1、as605、as783、as885、as953以及as1076)表示当与白色点(DB1有义、as14、as769以及as892)相比较时，连接蛋白-43表达平均减少36％到85％。通过脱氧核酶三次预测化验预测所有反义寡聚物具有很少或没有作用，表示平均85％到134％的正常连接蛋白-43表达。所有实验都用DB1有义处理的介质连接蛋白-43密度进行取准，并且结果是两个负寡聚物(as769和as892)表现出比DB1有义对照处理更大的连接蛋白-43密度。
图16描述了利用实时PCR评价的在用反义或有义寡聚物处理的大鼠角膜中连接蛋白-43mRNA水平的对比。将水平表达为仅普卢兰尼克凝胶处理的角膜的百分数。用体外化验预测为功能性的三种反义寡脱氧核苷酸DB1As、As605以及As783(黑色条)，将连接蛋白43mRNA表达分别减少到46.8％、44％以及25％的正常(仅凝胶，空白条)水平(**p＜0.001)。对DB1有义对照寡聚物(106％)看不到减少(空白条DB1有义)。在体外脱氧核酶三次预测化验中不表现出Cx43cRNA的任何剪切的As769用作阴性对照(148％)(空白条As769)。
图17描述了在用反义或有义(对照)寡聚物处理并利用实时PCR评价的大鼠角膜中连接蛋白26mRNA水平的对比。将水平表达为仅普卢兰尼克凝胶处理的角膜的百分数(仅凝胶空白条)。As330和As375分别将Cx26mRNA表达减少到33％和71％(**p＜0.001)(黑色条)。对于Rv330有义寡聚物观察不到减少(109％)(Rv330空白条)。
具体实施方式
本发明的实施可使用各种在本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学、以及免疫学的传统技术。这样的技术在文献中进行了全面的解释，并且包括但不限于(仅通过举例的方式)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，second edition(Sambrook et al.，1989)和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，third edition(Sambrook andRussel，2001)，在这里共同地和单独地称为“Sambrook”；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.，1987)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir &C.C.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller &M.P.Calos，eds.，1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，包括2001通过的增编)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis etal.，eds.，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)；The Immunoassay Handbook(D.Wild，ed.，Stockton PressNY，1994)；Bioconjugate Techniques(Greg T.Hermanson，ed.，Academic Press，1996)；Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.Albert，and N.A.Staines，eds.，Weinheim：VCHVerlags gesellschaft mbH，1993)，Harlow and Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York，以及Harlow and Lane(1999)Using Antibodies：A Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(在这里共同地和单独地称为Harlow and Lane)，Beaucage et al.eds.，CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley &Sons，Inc.，NewYork，2000)；以及Agrawal，ed.，Protocols for Oligonucleotides andAnalogs，Synthesis and Properties Humana Press Inc.，New Jersey，1993)。
定义
在进一步从总体上和用各种非限制性具体实施例来描述本发明之前，提出了在描述本发明的上下文中所使用的一些术语。除非另有说明，当在本文中和所附权利要求中使用时，以下术语具有下述含义。未在下面或说明书中其它地方定义的那些术语具有该技术领域公认的含义。
“反义化合物”包括不同类型的分子，这些分子的作用是抑制基因表达、翻译、或起作用，包括那些用于治疗应用的通过mRNA的序列特异靶向起作用的分子。
因此反义化合物包括，例如，主要的基于核酸的基因沉默(gene-silencing)分子，如化学修饰的反义寡脱氧核糖核酸(ODN)、核酶以及siRNA(Scherer，L.J.and Rossi，J.J.Nature Biotechnol.21：1457-1465(2003)。反义化合物还可包括反义分子如肽核酸(PNA)(Braasch，D.A.and Corey，D.R.，Biochemistry 41，4503-4510(2002))，吗啉代二氨基磷酸酯(morpholino phosphorodiamidate)(Heasman，J.，Dev.Biol.，243，209-214(2002)，DNA酶(Schubert，S.et al.，Nucleic Acids Res.31，5982-5992(2003)。Chakraborti，S.andBanerjea，A.C.，Mol.Ther.7，817-826(2003)，Santoro，S.W.and Joyce，G.F.Pro.Natl Acad.Sci.USA 94，4262-4266(1997)，以及最近开发的5’-端-突变的U1小核RNA(Fortes，P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100，8264-8269(2003))。
术语“反义序列”指的是具有反义化合物活性的多核苷酸并且包括但不限于(例如)与RNA序列互补或部分互补的序列。因此反义序列包括，例如，包括结合mRNA或其部分以通过核糖体阻断mRNA转录的核酸序列。反义方法通常在本领域中是熟知的。参见，例如，PCT公开WO94/12633、以及Nielsen et al.，1991，Science 254：1497；Oligonucleotides and Analogues，A Practical Approach，edited byF.Eckstein，IRL Press at Oxford University Press(1991)；AntisenseResearch and Applications(1993，CRC Press)。
如在本文中所使用的，“信使RNA”不仅包括利用三个字母遗传密码来编码蛋白的序列信息，而且包括相关的形成5’-非翻译区、3’-非翻译区、以及5’-帽区的核糖核苷酸序列，以及形成各种第二结构的核糖核苷酸序列。寡核苷酸可根据本发明来制成，这些寡核苷酸整个或部分靶向任何这些序列。
总之，核酸(包括寡核苷酸)可描述为“DNA类似物”(即，具有2’-脱氧糖和(通常)是T而不是U碱基)或“RNA类似物”(即，具有2’-羟基或2’-修饰糖和(通常)U而不是T碱基)。核酸螺旋可采用超过一种类型的结构，最通常是A-和B-型。通常认为具有B-型类似结构的寡核苷酸是“DNA类似物”并且那些具有A-型类似结构的寡核苷酸是“RNA类似物”。
术语“互补”通常指的是在容许的盐和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸的自然结合。例如，序列“A-G-T”结合互补序列“T-C-A”。在两个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，使得只有一些核酸结合，或可以是“完全的”，使得在单链分子之间存在整个互补性。在核酸分子之间的互补程度对它们之间杂交的效率和强度有显著影响。“可杂交”和“互补”是这样的术语，其用来表明足够程度的互补性以致在DNA或RNA靶标和寡核苷酸之间产生稳定的(和)结合。应该理解寡核苷酸不需要100％互补其靶核酸序列就可以杂交，并且还应该理解结合可以是靶标特异性的，或可以结合其它非靶标分子，只要非特异结合不显著或不希望地阻碍治疗的或其它的目标。寡核苷酸用来干扰靶标分子的正常功能，以引起活性丧失或减小(dimunition)，并且优选存在足够程度的互补性，以避免在希望特异结合的条件下，即，在体内化验或治疗处理的情形、或体外化验的情形中的生理条件下、在化验进行的条件下，寡核苷酸非特异或不希望地结合非靶标序列。在本发明一些实施例的范围内，不需要完全互补。通常优选具有足够互补性的多核苷酸以在生理条件下形成解链温度高于20℃、30℃、或40℃的双链体。
“病症”是得益于用本发明的分子或组合物进行治疗的任何状况，包括本文描述或要求的那些状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物易患所述病症的病理状况。
使寡核苷酸“靶向”选择的核酸靶标可以是多步过程。该过程可从识别其功能将要调节的核酸序列开始。这可以是(例如)细胞的基因(或由该基因形成的mRNA)，其表达与特殊疾病状态、或来源于感染物的外来核酸(RNA或DNA)有关。靶向过程还可包括在核酸序列内确定用于发生寡核苷酸相互作用的部位或多个部位，以产生所希望的效应，即，蛋白表达的抑制、减少的蛋白检出、或其它活性调节。一旦确定靶位或多个靶位，则选择反义化合物(例如，寡核苷酸)，这些化合物足够地或所希望地互补于靶标，即充分杂交并具有足够的或换句话说所希望的特异性，以产生所希望的调节。在本发明中，靶标包括编码一种或多种连接蛋白的核酸分子。靶向过程还可包括确定发生反义相互作用的部位或多个部位，以产生所希望的效应。优选的基因内部位例如是包括基因的开放阅读框(ORF)的翻译起始或终止密码子的区。翻译起始密码子通常是5’AUG(在转录的mRNA分子中；在相对应的DNA分子中的5’-ATG)，并且还可称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因具有含有RNA序列5’-GUG、5’-UUG或5’-CUG的翻译起始密码子，并且5’-AUA、5’-ACG和5’-CUG已显示出在体内起作用。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可包括许多密码子序列，即使在每种情况下起始氨基酸通常是蛋氨酸(真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(原核生物中)。在本领域中还已知真核生物基因和原核生物基因可具有两种或更多可选的起始密码子，在特定的细胞类型或组织中、或在一组特定条件下，起始密码子的任何一种可优选用于翻译起始。
术语“寡核苷酸”包括核苷酸或核苷单体的寡聚物或聚合物，其包括天然存在的碱基、糖以及糖内(主链)结合。术语“寡核苷酸”还包括包含非天然存在的单体、或其部分的寡聚物或聚合物，其功能类似。这样修饰或取代的寡核苷酸通常比天然形式更优选，这是由于诸如提高的细胞摄取、在有核酸酶存在的情况下增高的稳定性、或提高的靶亲合力的性能。已表明许多核苷酸和核苷修饰使得它们加入其中的寡核苷酸比天然寡脱氧核苷酸(ODN)更耐核酸酶消化作用。核酸酶抗性是通过用细胞提取物或分离的核酸酶溶液孵育寡核苷酸并且通常通过凝胶电泳测量经过一段时间残留的完整寡核苷酸的水平来常规地加以测量。为提高其核酸酶抗性而已修饰的寡核苷酸在比未修饰的寡核苷酸可在更长时间内完整存活。还表明许多修饰可增大寡核苷酸与其靶标的结合(亲合力)。寡核苷酸对其靶标的亲合力是通过测量寡核苷酸/靶标对的Tm(解链温度)来常规地加以确定，其中Tm是寡核苷酸和靶标分离的温度。分离是用分光光度法进行检测。Tm越大，寡核苷酸对靶标的亲合力就越大。在一些情形中，提高靶标结合亲合力的寡核苷酸修饰还能够提高核酸酶抗性。
“多核苷酸”意思是多个核苷酸。因此，术语“核苷酸序列”或“核酸”或“多核苷酸”或“寡核苷酸”或“寡脱氧核苷酸”都指的是核苷酸的杂聚物或这些核苷酸的序列。这些短语还指可以是单链或双链并且可代表有义或反义链的基因组的或合成起源的DNA或RNA，指肽核酸(PNA)或指任何DNA类似物或RNA类似物。
编码连接蛋白、连接蛋白片断、或连接蛋白变异体的多核苷酸包括这样的多核苷酸，其编码：天然发现的连接蛋白的成熟型；天然发现的连接蛋白及附加编码序列(例如，前导序列或信号序列或原蛋白(proprotein)序列)的成熟型；任一种前述和非编码序列(例如，用于天然发现的多肽的成熟型的编码序列的内含子或非编码序列5’和/或3’)；天然发现的连接蛋白的成熟型的片断；以及天然发现的连接蛋白的成熟型的变异体。因此，“编码连接蛋白的多核苷酸”及同类物包括只包含用于希望的连接蛋白、片断、或变异体的编码序列的多核苷酸，以及包含附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
术语“模拟肽(peptidomimetic)”或“模拟物”指的是合成化合物，其可具有大致与本文提供的反义多肽相同的结构和功能特性以及至少部分且在一定程度上模拟连接蛋白特异性的抑制活性。肽类似物通常在制药工业中用作非肽药，这些非肽药具有类似于模板肽药的性质。这些类型的非肽化合物称作“肽模拟物”或“模拟肽”(Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber and Freidinger；TINS；392(1985)；and Evans et al.，J.Med.Chem.30：1229(1987)；Beeley N.，Trends Biotechnol.1994Jun；12(6)：213-6.；Kieber-Emmons T，et al.；Curr Opin Biotechnol.1997Aug；8(4)：435-41)。与治疗有用的肽的结构类似的肽模拟物可用来产生等效或提高的治疗或预防作用。通常，模拟肽结构上类似于范例多肽(paradigm polypeptide)(即，具有生物学或药理学活性的多肽)，如反义多核苷酸，但具有一个或多个肽键，所述肽键可选地由选自由(例如)-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、以及-CH2SO-组成的组的键代替。该模拟物可以是全部由合成的、非天然的氨基酸的类似物组成，或者是部分天然肽氨基酸和部分氨基酸的非天然类似物的嵌合分子。该模拟物还可包括任何量的天然氨基酸的保守性置换，只要这样的置换还不会实质上改变该模拟物的结构和/或活性。例如，模拟组合物是在本发明的范围内，如果其能够下调连接蛋白的生物活性，如，间隙连接介导的细胞间通讯。
术语“组合物”用来包括包含一种或多种成分的产物。
术语连接蛋白活性的“调节子”和“调节”(如本文以其各种形式使用的)用来包括对连接蛋白的表达或活性的整体或部分抑制。这样的调节子包括连接蛋白功能或表达的小分子激动剂和拮抗剂、反义分子、核酶、三股螺旋分子(triplex molecule)、以及RNAi多核苷酸、基因治疗方法、以及其它。
短语“同一性百分数(percent identity)(％)”指的是在两个或更多序列的对比中发现的序列类似性的百分数。同一性百分数可利用任何合适的软件用电子仪器来确定。同样，在两个序列(或它们其中的一个或两个的一个或多个部分)之间的“类似性”是通过将一个序列的序列与第二个序列进行对比来确定。
通过“药学上可接受的(药用)”的意思是，例如，与配方的其它成分相容并且适合给予其接受体的载体、稀释剂或赋形剂。
通常，术语“蛋白质”指的是通过肽键连接的两个或多个单独的氨基酸(无论是否天然存在)的任何聚合物，当结合到一个氨基酸(或氨基酸残基)的α-碳的羧酸基团的羧基碳原子共价结合到氨基基团(其结合于相邻氨基酸的α-碳)的氨基氮原子时发生。这些肽键键合、以及包括它们的原子(即，α-碳原子、羧基碳原子(以及它们的取代基氧原子)、以及氨基氮原子(以及它们的取代基氢原子))形成蛋白质的“多肽主链”。另外，如在本文中所使用的，术语“蛋白质”应理解为包括术语“多肽”和“肽”(有时其可在本文中互换使用)。同样地，蛋白质片断、类似物、衍生物、以及变异体本文中可称为“蛋白质”，并且除非另有说明，应视为“蛋白质”。术语蛋白质的“片断”指的是包括比蛋白质的所有氨基酸残基更少的多肽。
如同将要理解的，蛋白质的“片断”可以是在氨基末端、羧基末端、和/或在其内部(如通过天然剪接)截短的蛋白质形式，并且还可以是变异体和/或衍生物。蛋白质的“域”也是片断，并且包括要求赋予相应于天然存在的蛋白质的生物化学活性的蛋白质的氨基酸残基。截短的分子，其是直链生物聚合物如核酸分子或多肽，可具有一个或多个从分子的其中一个末端的缺失和/或一个或多个从分子的非端区的缺失，其中这样的缺失可以是约1-1500个邻近核苷酸或氨基酸残基的缺失，优选约1-500个邻近核苷酸或氨基酸残基的缺失，并且更优选约1-300个邻近核苷酸或氨基酸残基的缺失，包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31-40、41-50、51-74、75-100、101-150、151-200、201-250或251-299个邻近核苷酸或氨基酸残基的缺失。
术语“严格条件”指的是允许多核苷酸之间杂交的条件。严格条件可通过盐浓度、有机溶剂(例如甲酰胺)的浓度、温度、以及其它本领域已知的条件来定义。严格性可通过减少盐的浓度、增大有机溶剂(例如甲酰胺)的浓度、或者升高杂交温度来提高。例如，严格的盐浓度通常低于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选低于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，并且最优选低于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可在没有有机溶剂(例如甲酰胺)存在的情况下实现，而高严格性杂交可在有机溶剂(例如，至少约35％甲酰胺，最优选至少约50％甲酰胺)存在的情况下实现。严格的温度条件通常包括至少约30℃的温度，更优选至少约37℃的温度，并且最优选至少约42℃的温度。变动其它参数，例如，杂交时间、去污剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))的浓度、以及包含或不包含载体DNA，对本领域技术人员来说是熟知的。严格性的各种水平是通过组合这些所需的各种条件来完成，并且在本领域技术人员已知的范围内。严格的杂交条件还可通过在低于靶标序列和对于该靶标具有精确或接近精确互补性的探针的解链温度(Tm)约5℃到约20℃或25℃范围内的条件来限定。如在本文中所使用的，解链温度是双链核酸分子群半解离成单链的温度。用于计算核酸的Tm的方法在本领域中是熟知的(参见，例如，Berger and Kimmel，1987，Methods In Enzymology，Vol.152：Guide ToMolecular Cloning Techniques，San Diego：Academic Press，Inc.andSambrook et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndEd.，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory)。如由标准参考文献表明的，当核酸在1M NaCl的水溶液中时，Tm值的简单估计可通过等式来计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)(参见，例如，Anderson andYoung，“Quantitative Filter Hybrization”in Nucleic AcidHybridization(1985))。杂交物的解链温度(并且由此的严格杂交的条件)受各种因素的影响，诸如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)以及靶标的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等)、以及盐和其它组分的浓度(例如，存在或缺少甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)。这些因素的影响在本领域中是熟知的并且在标准参考文献中进行了讨论，参见例如，Sambrook，见前，以及Ausubel，见前。通常，严格的杂交条件是：盐浓度低于约1.0M钠离子，通常在pH7.0到8.3时约0.01到1.0M钠离子，以及对于短探针(例如，10到50个核苷酸)温度至少约30℃而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)温度至少约60℃。正如所指出的那样，严格条件还可用诸如甲酰胺的去稳定剂的加入来实现，在该情形中可使用较低温度。在本发明中，多核苷酸可以是这样的多核苷酸，其在中等至较高的严格性的条件下如0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠、并在约50到约60℃摄氏度下杂交到连接蛋白mRNA。
术语“有效治疗量”意思是所讨论的(subject)化合物的量，其将引起所希望的反应，例如，组织、系统、动物或人类的生物或药物反应，而这是，例如，由研究人员、兽医、医生、或其它临床医生所寻找的。
“治疗”指的是治疗处理和预防或保护措施。那些需要治疗的患者包括那些已患有病症的患者以及那些需要防止病症的患者。
术语“载体”是指核酸分子扩增、复制、和/或表达载体，其形式为质粒、噬菌体、病毒、或其它系统(天然存在的或合成的)，用于将核酸传递到细胞，其中质粒、噬菌体、或病毒可以借助细菌、酵母菌、无脊椎动物、和/或哺乳动物宿主细胞起作用。载体可保持独立于宿主细胞基因组DNA的状态或可整体或部分地和基因组DNA结合起来。载体通常(但不需要)含有所有必要组分，以便在任何其相容的宿主细胞中起作用。“表达载体”是在适当条件下能够引导外源多核苷酸(例如编码连接域融合蛋白(binding domainfusion protein)的多核苷酸)表达的载体。
如在本文中所描述的，术语“同源和同源物”包括可以是连接蛋白多核苷酸中的序列的同源体的多核苷酸(例如，mRNA)。这样的多核苷酸通常与相关序列具有至少约70％的同源性，优选至少约80％、90％、95％、97％或99％的同源性，例如，超过(同源序列的)至少约15、20、30、40、50、100个更多相邻的核苷酸的区。
同源性可基于本领域的任何方法加以计算。例如，UWGCG包提供了可用来计算同源性(例如，根据默认设置使用)的BESTFIT程序(Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Research 12，p387-395)。PILEUP和BLAST算法可用来计算同源性或校正(line up)序列(通常基于其默认设置)，例如在Altschul S.F.(1993)；J Mol Evol 36：290-300；Altschul，S.F.et al.；(1990)；J Mol Biol 215：403-10中所描述的。用于进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心可公开获得(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/L)。该算法涉及首先通过在查询序列中确定短字长(word of length)W来确定高得分序列对，当在数据库序列中对准(align with)相同长度的字时，其匹配或满足某一正值阈值得分(score)T。T称为邻域字得分阈值(neighborhoodword score threshold)(Altschul et al.，见前)。这些初始邻域字命中(word hit)作为用来启动搜索以找到含有它们的HSPs的种子(seed)。字命中沿着每个序列向两个方向延伸直到可增加累积对准得分(alignment score)。字命中在每个方向的延伸会停止，当：累积对准得分从其最大获得值下降量X；累积得分趋于零或以下，这是由于一个或多个负得分残基排列的累积；或其中一个序列到达端点时。BLAST算法参数W、T以及X确定对准的灵敏度和速度。BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff andHenikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)对准(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝4、以及两种链的对比)作为默认。
BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；参见例如，Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小求和概率(P(N))，其提供概率读数，两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配通过该概率读数偶尔发生。例如，如果与第一个序列相比最小求和概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，那么就认为序列与另一个序列相似。
同源序列通常与相关序列相差至少(或不多于)约1、2、5、10、15、20或更多突变(其可以是替换、缺失或插入)。这些突变可通过任何上述与计算同源性有关的区来测量。同源序列通常以显著高于背景的水平选择性地杂交到初始序列。选择性的杂交通常利用中等到高度严格性条件(例如，约50℃到约60℃，0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠)来实现。但是，这样的杂交可在本领域已知的任何合适条件下进行(参见Sambrook et al.(1989)，MolecularCloning：A Laboratory Manual)。例如，如果需要高严格性，那么合适条件就包括在60℃下的0.2×SSC。如果需要较低严格性，那么合适条件就包括60℃下的2×SSC。
“细胞”意思是任何适用于所希望的应用的活细胞。细胞包括真核细胞和原核细胞。
术语“基因产物”指的是从基因转录的RNA分子、或由基因编码的或从RNA翻译的多肽。
术语“重组”是指：体外合成或以其它方式生成的多核苷酸(例如，“重组多核苷酸”)；利用重组多核苷酸来在细胞中或其它生物系统中生产基因产物的方法；或由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。因此，“重组的”多核苷酸通过其生产的方法或者其结构来定义。关于其生产方法，该过程指的是使用重组核酸技术，例如，涉及人为介入到核苷酸序列中，通常为选择或生成。可替换地，其可以是通过生成序列而形成的多核苷酸，该序列包括两个或多个不是相互天然邻接的片断的融合。因此，例如，包括通过用任何非天然存在的载体转化细胞而形成的产物，也包括包含利用任何合成寡核苷酸过程衍生的序列的多核苷酸。同样地，“重组的”多肽是从重组多核苷酸表达的一种。
“重组宿主细胞”是包含载体(例如，克隆载体或表达载体)的细胞、或通过重组技术用其它方法已加以操作以表达感兴趣的蛋白的细胞。
本发明包括利用化合物和组合物对用于伤口愈合(例如，手术相关的伤口愈合和/或组织重建应用)的间隙连接相关的蛋白表达进行部位特异性调节的方法。本发明可用于，例如，连同激光手术矫正视觉缺陷、体外角膜工程(engineering)、以及在希望进行角膜重建处直接眼处理，包括那些独立进行的眼处理或可选地，连同对眼进行的操作(例如，手术)的眼处理。直接细胞间通讯的反义调节优选通过直接地或间接地减少组织中细胞之间的偶连的分子加以介导。这样的分子包括诸如反义脱氧核苷酸的多核苷酸、吗啉代核苷酸、RNAi以及靶向特定连接蛋白同种型(isoform)的脱氧核酶，其导致减少的蛋白质同种型的翻译并且干扰细胞间隙连接的功能。
这些反义化合物的施加导致间隙连接介导的细胞间通讯在连接蛋白表达被下调的部位减少。
连接蛋白在间隙连接介导的细胞间信号传递中起重要作用。连接蛋白的过度表达与术后瘢痕形成和外伤后引起的组织重建(remodeling)有关。根据本发明的一些实施例，连接蛋白代表有用的靶，该靶用于与角膜外伤和术后组织重建有关的不良作用的处理；以及用于这样的疾病和病症，其中直接的细胞间通讯中局部破坏是希望的。尤其是，连接蛋白表达的调节可用于间隙连接相关的蛋白质表达(其用于组织重建/组织工程应用)的部位特异性调节。
本文提供的反义化合物可与眼科操作或手术(如，例如，白内障手术、眼内晶状体手术、角膜移植手术和一些类型的青光眼手术、以及其它在本文中描述的操作)结合，用于连接蛋白的调节。
在一些实施例中，连接蛋白的调节可用于影响后段(包括视网膜和晶状体)的眼科病症。在本发明的另一方面，连接蛋白的调节可用于影响前段(包括角膜、结膜以及巩膜)的眼科病症。在本发明的范围内，后段病症包括黄斑裂孔和变性、视网膜撕裂、糖尿病视网膜病变、玻璃体视网膜病变以及其它病症。还是在本发明的范围内，晶状体的病症可以包括白内障。在又一个方面，可以设想，角膜的病症是屈光病症，如放射状角膜切开术的后遗症、干眼症、病毒性结膜炎、溃疡性结膜炎和伤口愈合中的瘢痕形成，如，角膜上皮伤口，以及舍格伦综合症的后果。
本发明披露了反义化合物，尤其是寡核苷酸，用于调节编码连接蛋白的核酸分子的功能，最后调节产生的连接蛋白的量。这是通过提供特异性地与编码连接蛋白的核酸(优选mRNA)杂交的寡核苷酸来完成。
这种在诸如寡核苷酸的反义化合物和其互补核酸靶标(寡核苷酸与其杂交)之间的关系通常称为“反义”。如在本文中所描述的，寡核苷酸“靶向”选择的核酸靶标通常是多步过程。该过程通常从确定其功能需要调节的核酸序列开始。例如，这可以是其表达与具体疾病状态有关的细胞基因(或由该基因形成的mRNA)。在本发明中，靶标是编码连接蛋白的核酸；换句话说，编码连接蛋白的基因、或从连接蛋白基因表达的mRNA。编码连接蛋白的mRNA是当前优选的靶标。靶向过程还包括核酸序列内用于发生反义相互作用的部位或多个部位的确定，以便形成基因表达的调节。
在本发明的范围内，信使RNA不仅包括利用三个字母遗传密码编码蛋白质的信息，而且包括有关的核糖核苷酸，其形成技术人员已知的区，如5’-非翻译区、3’-非翻译区、5’-帽区，以及内含子/外显子连接核糖核苷酸。因此，寡核苷酸可根据本发明来制成，其整个或部分地靶向这些相关核糖核苷酸以及靶向信息核糖核苷酸。寡核苷酸因此可特异性地与转录起始部位区、翻译起始密码子区、5’帽区、内含子/外显子连接、编码序列、翻译终止密码子区或在5’-或3’-非翻译区中的序列杂交。由于翻译起始密码子通常是5’-AUG(在转录的mRNA分子中；在相对应的DNA分子中的5’-ATG)，翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少量基因具有含有RNA序列5’-GUG、5’-UUG或5’-CUG的翻译起始密码子，而5’-AUA、5’-ACG以及5’-CUG已表明在体内起作用。因此，术语“翻译起始密码予”和“起始密码子”可包括许多密码子序列，即使在每种情况下起始氨基酸通常是蛋氨酸(真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(原核生物中)。本领域中还已知真核生物基因和原核生物基因可具有两个或多个可替换的起始密码子，其中任何一个可优选用于特定的细胞类型或组织中、或在特定的一组条件下的翻译起始。在本发明的范围内，“起始密码子”和“翻译起始密码子”指的是密码子或多个密码子，这些密码子在体内用来引发转录自编码连接蛋白的基因的mRNA分子的翻译，而与这样的密码子的序列无关。本领域中还已知，基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可具有三个序列(即，5’-UAA、5’-UAG以及5’-UGA，其相对应的DNA序列分别是5’-TAA、5’-TAG以及5’-TGA)中的一个。术语“起始密码子区”、“AUG区”以及“翻译起始密码子区”指的是这样的mRNA或基因的一部分，其在自翻译起始密码子的每个方向(即，5’或3’)包括约25个到约50个相邻核苷酸。该区是优选的靶标区。同样地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”指的是这样的mRNA或基因的一部分，其在自翻译终止密码子的每个方向(即，5’或3’)包括约25个到约50个相邻核苷酸。该区是优选的靶标区。本领域已知的开放阅读框(ORF)或“编码区”指的是在翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区，其也是可以有效靶向的区。其它优选的靶标区包括本领域已知的5’非翻译区(5’UTR)，其指的是在5’方向上从翻译起始密码子开始的mRNA的部分，因此包括在mRNA的5’帽部位和翻译起始密码子之间的核苷酸或在基因上相对应的核苷酸，以及本领域已知的3’非翻译区(3’UTR)，其指的是在3’方向上从翻译终止密码子开始的mRNA的部分，因此包括在mRNA的翻译终止密码子和3’末端之间的核苷酸或在基因上相对应的核苷酸。mRNA的5’帽包括通过5’-5’三磷酸键(triphosphate linkage)连接到mRNA的5’-多数(most)残基的N7-甲基化的鸟嘌呤核苷残基。认为mRNA的5’帽区包括5’帽结构本身以及接近该帽的最初50个核苷酸。5’帽区也可以是优选的靶标区。
尽管一些真核细胞的mRNA转录物被直接翻译，但是许多含有一个或多个区(称为“内含子”)，其从mRNA前体转录物被切除而产生一个或多个成熟mRNA。残留的(并因此被翻译)区称为“外显子”，并且被剪接在一起而形成连续的mRNA序列。mRNA剪接部位(即，外显子之间或内含子-外显子的连接部)也可以是优选的靶标区，并且在下述情况下是特别有用的：在疾病中涉及异常剪接、或在疾病中涉及特定mRNA剪接产物的过度产生。起因于重排或缺失的异常融合连接也是优选的靶标。在可选的剪接的mRNA中靶向特定外显子也可以是优选的。还发现内含子也可以是有效的，并因此是优选的反义化合物靶向的靶标区，例如，靶向DNA或mRNA前体。
在本发明的范围内，反义多核苷酸可例如杂交到全部或部分的连接蛋白mRNA。通常，反义多核苷酸杂交到连接蛋白mRNA的核糖体结合区或编码区。多核苷酸可以互补于连接蛋白mRNA的全部或一个(或几个)区。例如，多核苷酸可以是连接蛋白mRNA的全部或部分的精确互补结构(complement)。反义多核苷酸可抑制连接蛋白的转录和/或翻译。优选地，该多核苷酸是连接蛋白基因的转录和/或翻译的特异性抑制剂，并且不会抑制其它基因的转录和/或翻译。该产物可结合到连接蛋白基因或mRNA或者(i)5’到编码序列，和/或(ii)到编码序列，和/或(iii)3’到编码序列。通常，反义多核苷酸会引起细胞中连接蛋白mRNA和/或蛋白的表达减少。反义多核苷酸对于连接蛋白mRNA通常是反义。这样的多核苷酸可以能够杂交到连接蛋白mRNA并且可通过干扰连接蛋白mRNA代谢(包括转录、mRNA加工、mRNA从细胞核的转运、翻译或mRNA降解)的一个或多个方面来抑制连接蛋白的表达。反义多核苷酸通常杂交到连接蛋白mRNA，以形成一种双链体，其可引起mRNA的翻译的直接抑制和/或去稳定化。这样的双链体可容易受到核酸酶降解的影响。
反义寡核苷酸与mRNA的杂交会干扰mRNA的一个或多个正常功能。要干扰的mRNA功能包括所有生命必需的功能，如，例如，mRNA移位到蛋白质翻译的部位、从RNA翻译蛋白质、RNA的剪接以产生一个或多个mRNA种类，以及可由RNA参加的催化活性。也可通过反义寡核苷酸杂交到RNA来干扰特定蛋白与RNA的结合。
对mRNA功能进行干扰的总体作用是调节连接蛋白的表达。
在本发明的范围内，“调节”包括抑制或者刺激；即，或者降低或者增加表达。这种调节可用本领域的常规方式加以测量，例如，通过mRNA表达的RNA印迹(Northern blot)实验、或反转录酶PCR(如在本申请的实施例中讲述的)、或通过蛋白质表达的蛋白质印迹实验或ELISA、或通过蛋白质表达的免疫沉淀实验。对细胞增殖或肿瘤细胞生长的影响也可以加以测量，如在本申请的实施例中讲述的。目前抑制是优选的。
一旦确定了靶位或多个靶位，则选择与靶标足够互补的寡核苷酸，即，足够良好地杂交并且具有足够的特异性，以获得所希望的调节。反义核酸(DNA、RNA、修饰的、类似物等)可利用任何适合用来产生核酸的方法来制成。靶向其它连接蛋白的寡脱氧核苷酸可根据它们的核苷酸序列并通过任何本领域公认的方法(如，例如，计算机程序Mac Vector和Oligo Tech(来自Oligos etc.Eugene，Oregon，USA))加以选择。用于这样的合成的装置可通过几个包括Mac Vector和Oligo Tech(来自Oligos etc.Eugene，Oregon，USA)的卖主获得。对于涉及反义多核苷酸的一般方法，参见Antisense RNAand DNA，D.A.Melton，Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1998)。还参见Dagle et al.，Nucleic Acids Research，19：1805(1991)。对于反义治疗，参见，例如，Uhlmann et al.，Chem.Reviews，90：543-584(1990)。通常，至少部分核苷酸序列对于连接蛋白是已知的，其中抑制表达是所希望的。优选地，反义化合物被靶向一个或多个特定连接蛋白同种型。可能由反义化合物靶向的连接蛋白的特定同种型包括但不限于43、37、31.1、26、以及在本文描述的其它连接蛋白的同种型。优选(但不必需)靶向的连接蛋白是人类的。连接蛋白可(例如)具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列。在一些实施例中，反义化合物靶向编码连接蛋白的核酸分子的至少8个核酸碱基，其中该核酸分子具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列。
在一些其它实施例中，将第二反义化合物给予患者的眼，其中第二反义化合物靶向编码连接蛋白的核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中该核酸分子具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列，其中所述第二反义化合物靶向不同于第一反义化合物靶向的连接蛋白。
连接蛋白靶标依赖于要设计或重建的组织类型而变化，并且本发明使用的反义多核苷酸的精确序列依赖于靶标连接蛋白。由寡核苷酸靶向的连接蛋白或多种连接蛋白依赖于要进行下调的部位。这反映了就连接蛋白亚单位组成而论在整个身体(body)的不同部位间隙连接具有不均匀的组成。但是依据在组织中的分布，一些连接蛋白比其它连接蛋白更加普遍存在。如本文所描述的，诸如连接蛋白-43的角膜相关连接蛋白在一些实施例中是优选的。因此，在本发明的范围内，寡核苷酸单独或者组合地靶向适合于角膜设计或重建应用的连接蛋白43、26、37、30和/或31.1(例如，参见SEQ.ID.NOS：1-11)。在本发明的一个方面，该寡脱氧核苷酸可以是未修饰的磷酸二酯寡聚物。在本发明的另一方面，该多核苷酸可以是单链或双链。
还设想靶向分开的连接蛋白的寡核苷酸可组合使用(例如，可以靶向一种、两种、三种、四种或更多不同的连接蛋白)。例如，可以组合使用靶向连接蛋白43、以及一种或多种连接蛋白家族的其它成员(如连接蛋白26、30、31.1、37以及43)的ODN。还设想单个反义多核苷酸对于特定连接蛋白可以是特异的，或可靶向1、2、3或更多不同的连接蛋白。特异多核苷酸通常将靶向连接蛋白基因或mRNA中的序列，其在连接蛋白之间不是保守的，而非特异多核苷酸将靶向保守序列。因此，在一些实施例中，反义化合物靶向核酸分子的至少8个核酸碱基，其中该核酸分子编码人类连接蛋白26、连接蛋白30、连接蛋白31.1、人类连接蛋白37、连接蛋白43，其中，所述反义化合物在与患者眼有关的细胞中抑制人类连接蛋白的表达。
在一些实施例中，编码连接蛋白的核酸分子具有选自SEQ IDNO：12-31的核酸碱基序列。在一些实施例中，该组合物靶向两种或多种人类连接蛋白并且抑制两种或多种人类连接蛋白的表达。在另外的一些实施例中，反义化合物是反义寡核苷酸。针对连接蛋白43选择的典型的反义寡核苷酸包括GTA ATT GCG GCA AGA AGAATT GTT TCT GTC(SEQ ID NO：1)；GTA ATT GCG GCA GGA GGAATT GTT TCT GTC(SEQ ID NO：2)；以及GGC AAG AGA CACCAA AGA CAC TAC CAG CAT(SEQ ID NO：3)。针对连接蛋白26的反义寡核苷酸的实例具有序列TCC TGA GCA ATA CCT AACGAA CAA ATA(SEQ ID NO：4)。针对连接蛋白37选择的典型的反义寡核苷酸包括5’CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC3’(SEQ IDNO：5)和5’CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG3’(SEQ ID NO：6)。针对连接蛋白30选择的典型的反义寡核苷酸包括5’CTC AGA TAGTGG CCA GAA TGC 3’(SEQ ID NO：7)和5’TTG TCC AGG TGACTC CAA GG3’(SEQ ID NO：8)。针对连接蛋白31.1选择的典型的反义寡核苷酸包括5’CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C3’(SEQ ID NO：9)；5’AGA GGC GCA CGT GAG ACA C3’(SEQ IDNO：10)；以及5’TGA AGA CAA TGA AGA TGT T3’(SEQ IDNO：11)。
在另外的实施例中，选自以下序列的寡脱氧核苷酸特别适合于下调连接蛋白43表达：
5’GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC 3’(SEQ ID NO：1)
5’GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC 3’(SEQ ID NO：2)；以及
5’GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT 3’(SEQ ID NO：3)
在又一个实施例中，选自以下序列组的寡脱氧核苷酸特别适合于连接蛋白26、37、30、以及31.1：
5’TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA 3’(连接蛋白26)(SEQ ID NO：4)
5’CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC3’(连接蛋白37)(SEQ IDNO：5)
5’CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG3’(连接蛋白37)(SEQ IDNO：6)
5’CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC 3’(连接蛋白30)(SEQID NO：7)
5’TTG TCC AGG TGA CTC CAA GG3’(连接蛋白30)(SEQ IDNO：8)
5’CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C3’(连接蛋白31.1)(SEQ ID NO：9)
5’AGA GGC GCA CGT GAG ACA C3’(连接蛋白31.1)(SEQID NO：10)
5’TGA AGA CAA TGA AGA TGT T3’(连接蛋白31.1)(SEQ IDNO：11)
本文提供的反义化合物通常包括约8到约40个核酸碱基(即，约8到约40个连接的核苷)，并且更典型地，包括约12到约40个核酸碱基，并且甚至更典型地，包括约30个核酸碱基。包含多核苷酸的反义化合物可以是至少约40，例如至少约60或至少约80个核苷酸的长度并且高达100、200、300、400、500、1000、2000或3000或更多个核苷酸的长度。适合的反义化合物包括，例如，30merODN。
在一些实施例中，反义化合物靶向编码连接蛋白的核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中核酸分子具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列。在其它实施例中，反义化合物靶向编码连接蛋白的核酸分子的至少约10、至少约12、至少约14、至少约16、至少约18、至少约20、至少约25、至少约30、以及至少约35个核酸碱基，其中核酸分子具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列。反义化合物(包括靶向编码人类连接蛋白的核酸分子的至少在约8个和35个核酸碱基之间的寡核苷酸)的大小可以是8个核酸碱基的长度或更长，在8个到100个核酸碱基之间、在8个到50个核酸碱基之间、在8个到40个核酸碱基之间、在10个到50个核酸碱基之间、在12个到50个核酸碱基之间、在14个到50个核酸碱基之间、在16个到50个核酸碱基之间、在18个到50个核酸碱基之间、在20个到50个核酸碱基之间、在25个到50个核酸碱基之间、在15个到35个核酸碱基之间等的长度。本发明的其它反义化合物可以是更短或更长的大小，例如，具有大于100个核酸碱基的长度。
反义化合物包括反义寡核苷酸(ODN)、反义多核苷酸、脱氧核酶、吗啉代寡核苷酸、RNAi分子或其类似物、siRNA分子或其类似物、PNA分子或其类似物、DNA酶或其类似物、5’-端-变突的U1小核RNA及其类似物。
如本文所提供的，反义化合物可以包括使用寡脱氧核苷酸(ODN)。ODN通常是约20个核苷酸的长度并且通过杂交到mRNA前体和mRNA来起作用，以产生核糖核酸酶H(RNA酶H)的底物，其特异性地降解形成的RNA-DNA双链体的RNA链。如果以一种阻止RNA酶H作用的方式进行修饰，那么ODN可通过位阻来抑制mRNA的翻译、或抑制mRNA前体的剪接。ODN及其修饰已用于靶向dsDNA以通过形成三股螺旋而抑制转录。ODN可通过本领域已知的自动合成的方法来获得并且其相对更直接地获得任何序列的ODN并通过反义碱基配对来阻断基因表达。
在一些方面，ODN的磷酸二酯主链可加以修饰以增加其作为用于阻断基因表达的靶标特异性试剂的效能。开发了这些主链修饰以提高ODN的稳定性并且提高它们的细胞摄取。最广泛使用的修饰是这样一种修饰，其中用硫原子代替非桥接氧，从而形成硫代磷酸酯(phosphorothioate)ODN。至少一种硫代磷酸酯ODN已由FDA批准，并且几种其它硫代磷酸酯反义ODN处于用于各种癌症和炎性疾病的临床试验的早期阶段。
ODN关于阻断基因功能的作用机制依赖于ODN的主链而变化(Branch，A.D.Hepatology 24，1517-1529(1996)；Dias，N.and Stein，C.A.Mol.Cancer Thor.1，347-355(2002)；Stein，C.A.and Cohen，J.S.，Cancer Res.48，2659-2668(1998)；Zon，G.Ann.N.Y Acad Sci.，616，161-172(1990))。净负电荷的ODN(如磷酸二酯和硫代磷酸酯)引起RNA酶H-介导的靶标mRNA的剪切。不补充(recruit)RNA酶H(因为其缺少电荷或与靶标RNA形成的螺旋的类型)的其它主链修饰可归类为位阻ODN。常用的这种后一组的成员包括吗啉代、U-O-甲基、2”-O-烯丙基、锁定的(locked)核酸和肽核酸(PNA)。在其它抑制靶标中，这些ODN可阻断剪接、翻译、核-细胞质传送和翻译。
在另一方面，连接蛋白表达的调节涉及核酶的使用。核酶是用作酶(即使完全缺少蛋白质)的RNA分子。它们具有特别专一的断裂和/或形成共价键的催化活性，从而加速靶向反应的自发速率达许多数量级。
核酶通过Watson-Crick碱基配对结合RNA并通过催化磷酸二酯主链的水解而用于降解靶标RNA。有几种不同类的核酶，其中‘锤头状’核酶研究得最为广泛。如同其名称所暗示的，当杂交到其靶标mRNA时，锤头状核酶形成独特的二级结构。核酶内的催化上重要的残基在靶标互补序列的侧面，该靶标互补序列在靶标RNA剪切部位的侧面。由核酶进行的剪切需要二价离子，如镁离子，并且也依赖于靶标RNA的结构和可接近性。通过利用定位信号将核酶协同定位到细胞内的靶标RNA可以在很大程度上增加它们的沉默效能。锤头状核酶足够短而可以被化学合成或可从载体进行转录，使得在细胞内可以连续产生核酶。
RNA用作催化剂的能力首先在四膜虫嗜热细菌(Tetrahymenathermophila)的自剪接I组内含子以及RNA酶的RNA部分得到证明。在发现这两种RNA酶之后，发现RNA介导的催化作用与酵母菌、真菌以及植物线粒体(以及叶绿体)单链植物类病毒和拟病毒RNA、δ型肝炎病毒以及来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)线粒体的卫星RNA的自剪接II组内含子有关。核酶天然存在，但也可进行人工设计用于顺式(在同一核酸链上)或反式(非共价连接的核酸)的特异序列的表达和靶向。利用体外选择方案正开发新生物化学活性以及产生在不同于RNA的底物上起作用的新核酶基序。
四膜虫嗜热细菌(T.thermophila)的I组内含子是被转化成反式反应形式的第一顺式剪切核酶(我们称其为内含子/核酶)，使其可用于基因组研究并且作为可能的治疗法。在反式剪接反应中，靶向的mRNA的缺陷型外显子可交换成正确的共价连接到内含子/核酶的外显子。这通过剪接反应发生，在剪接反应中，连接到内含子的外显子是通过碱基配对定位到靶标mRNA，以便在酯交换反应中其可共价结合到靶标转录物的5”端。这个反应已用于将野生型序列反式剪接到镰状细胞球蛋白转录物和突变型p53转录物中并替换在强直性肌营养不良等位基因中的蛋白激酶转录物的3”-UTR中的展开的三联体。
在整个自然界的有机体中发现了核糖核酸酶内切酶(endoribonuclease)RNA酶P。依赖于从其分离的有机体，这种酶具有RNA和一个或多个蛋白质组分。来源于大肠杆菌和枯草杆菌酶的RNA组分在缺少蛋白质并在(trader)一定盐和离子条件下可用作部位特异性剪切剂。对于人类和细菌酶的底物要求的研究已表明，用于任何一种酶的最小限度的底物类似转移RNA分子的片断。
这种结构可通过专门设计的与靶标RNA配对的反义RNA加以模拟，并在试管和细胞中用作RNA酶P-介导的、部位特异性剪切的底物。还表明，反义组分可共价结合到RNA酶P RNA，从而仅将酶引向感兴趣的靶标RNA。研究人员在反义RNA的设计中利用了这种性能，其中反义RNA与感兴趣的靶标mRNA配对以激发靶标的部位特异性剪切并在细胞培养中用于单纯疱疹病毒和巨细胞病毒的靶向抑制。
大量小植物病原RNA(类病毒、卫星RNA以及拟病毒)、来自粗糙脉孢菌(N.crassa)线粒体的DNA质粒的转录物以及动物δ型肝炎病毒在缺少蛋白质的情况下经历体外自剪切反应。该反应需要中性pH和Mg2+。自剪切反应是复制的体内滚环(rolling circle)机制的组成部分。这些自剪切RNA可根据剪切部位附近形成的序列和二级结构细分成若干组。小核酶来源于在单链植物类病毒和拟病毒RNA中发现的基序。基于共享的二级结构和保守的一组核苷酸，术语“锤头状”已指定给这种自剪切域的一个组。锤头状核酶包括30个核苷酸。锤头状催化域的简单性使其成为在反式作用核酶的设计中的常见选择。利用Watson-Crick碱基配对，可将锤头状核酶设计成能够剪切任何靶标RNA。在剪切部位的要求相对简单，并且实际上可靶向任何UH序列基序(这里H是U、C或A)。
第二种来自植物的、自剪切基序(在烟草环斑卫星RNA的负链中最初确定的)称为“发夹”或“纸夹”。发夹核酶在产生2”、Y-环状磷酸酯以及5”-羟基T1末端的可逆反应中剪切RNA底物-这种催化性基序的设计变型(engineered versions)也剪切并且翻转(turnover)各种反式靶标的多份复制。用于发夹的底物要求包括GUC，其中紧接着G的上游发生剪切。发夹核酶还催化连接反应，尽管其更经常用于剪切反应。
在细胞中锤头状和发夹状核酶都有大量的应用，用于下调特定的细胞和病毒靶标。Haseloff和Gerlach设计了锤头状基序(Haseloff and Gerlach；Nature.1988Aug 18；334(6183)：585-91)，该基序通过修饰具有正确靶标的碱基对的臂而可以用来剪切任何靶标。Ramemzani等证明了这种锤头状核酶基序在研究中具有潜在的治疗应用，其中，利用设计用来表达抗人类免疫缺陷病毒(HIV)gag核酶的细胞，实际上完全抑制病毒基因表达和复制(Ramezani A.et al.，Frontiers in Bioscience 7：a，29-36；2002)。
在另一方面，连接蛋白表达的调节涉及催化性DNA(或DNA酶)的使用。通过体外演变已开发了能够部位特异性地剪切RNA靶标的小DNA(因为没有已知的天然存在的DNA酶)。已确定了具有不同剪切部位特异性的两种不同的催化性基序。最通常使用的10-20种酶通过Watson-Crick碱基配对结合到其RNA底物并部位特异性地剪切靶标RNA，如同锤头状和发夹核酶所做的那样，这产生2；3”-环状磷酸酯和5”-OH末端。靶标mRNA的剪切导致其破坏和DNA酶再循环并且剪切多个底物。催化性DNA对于合成来说相对廉价并且具有优良催化性质，使其用于取代反义DNA或核酶。
已公布了在细胞培养中DNA酶的若干应用，包括Veg FmRNA的抑制和血管生成的后续预防、以及慢性髓细胞源性(myelogenous)白血病的特征的bcr/abl融合转录物的表达抑制。催化性DNA可以外源传递，并且它们可以加以主链修饰以便在缺少载体的情况下优化系统传递。
在本发明的另一方面，组成型连接蛋白基因的调节涉及具有吗啉代主链结构的寡核苷酸的使用。Summerton，J.E.和Weller，D.D的美国专利第5,034,506号。
在本发明的另一方面，反义多核苷酸可以加以化学修饰，以便提高其对核酸酶的抗性并增大细胞进入的效能。例如，可使用含有硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸片断以及适当放置的修饰寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸片断的混合主链寡核苷酸(MBO)。MBO具有硫代磷酸酯连接的片断和其它修饰寡核苷酸的其它片断，如甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、N3’P5’-氨基磷酸酯和寡核糖核苷酸硫代磷酸酯及其2’-O-烷基类似物和2’-O-甲基核糖核苷酸甲基膦酸酯，其是非离子的，并且极耐核酸酶或2’-O-烷基寡核糖核苷酸。
如本领域所已知的，核苷是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。这样的杂环碱基的两种最常见的类型是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包括磷酸酯基团的核苷，其中磷酸酯基团共价连接到核苷的糖部分。对于那些包括戊呋喃糖(pentofuranosyl)的核苷，磷酸酯基团可连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成寡核苷酸中，磷酸酯基团将邻近核苷相互共价连接，以形成直链聚合化合物。这种直链聚合结构的各端又可进一步连接以形成环形结构，然而，开放式线性结构通常是优选的。在寡核苷酸结构中，磷酸酯基团通常称为形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的正常键或主链是3’到5’磷酸二酯键。
在本发明中有用的反义化合物可包括含有修饰主链或非天然核苷间连接的寡核苷酸。具有修饰主链的寡核苷酸包括那些在主链中保留磷原子以及那些在主链中不具有磷原子的寡核苷酸。在本发明的范围内，在其核苷间主链中不具有磷原子的修饰寡核苷酸也可认为是寡核苷酸。
在本发明中有用的具有修饰寡核苷酸主链的反义化合物可包括(例如)硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基磷酸酯(包括3’-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯、次磷酸酯)、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯)、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、以及具有通常的3’-5’键合的硼代磷酸酯(boranophosphate)、这些硼代磷酸酯的2’-5’键合类似物、以及那些具有反向极性的反义化合物，其中，核苷单元的邻近对是键接的3’-5’到5’-3’或2’-5’到5’-2’。还包括各种盐、混合盐以及游离酸形式。
在一方面，可以设想，其中不包括磷原子的修饰寡核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子以及烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些主链包括那些具有吗啉代键(部分地由核苷的糖部分形成)的主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜以及砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫甲酰基主链；含烯烃主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和氨磺酰主链；酰胺主链；以及具有混合N、O、S和CH2组分的其它主链。
在一方面，可以设想，寡核苷酸模拟物，糖和核苷间键二者，即核苷酸单元的主链用新基团替换。保持碱基单元以与合适核酸靶标化合物进行杂交。一种这样的寡聚物，已表现出具有优良杂交性质的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链用含有酰胺的主链代替，尤其是用氨基乙基甘氨酸主链代替。保留核酸碱基并直接或间接结合到主链酰胺部分的氮杂氮原子。PNA化合物的进一步内容(teaching)可在Nielsen等(Science，1991，254，1497-1500)中找到。
在一方面，可以设想具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷、以及尤其--CH2--NH--O-CH2--、--CH2-N(CH3)--O--CH2-[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH3)--CH2-、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--以及--O--N(CH3)--CH2--CH2--[其中原有磷酸二酯主链表示为--O--P--O-CH2--]。在又一个方面，还可以设想具有吗啉代和酰胺主链结构的寡核苷酸。
在另一方面，可以设想，修饰寡核苷酸还可包含一个和多个取代的糖部分。例如，在2’位置包括以下之一的寡核苷酸：OH；F；O-、S-、或N-烷基，O-烷基-O-烷基，O-、S-、或N-链烯基，或O-、S-、或N-炔基，其中烷基、链烯基以及炔基可以是取代的或未取代的C1到C10烷基或C2到C10链烯基和炔基。特别优选的是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、以及O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m从1到约10。其它优选的寡核苷酸可包括在2’位置的以下一个基团：C1到C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA剪切基团、报道基团、嵌入剂、用于提高寡核苷酸的药物动力学性能的基团、或用于改善寡核苷酸的药理动力学性能的基团、以及其它具有类似性能的取代基。优选的修饰包括2’-甲氧乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧乙基)或2’-MOE)(Martin et al.Helv.Chim.Acta 1995，78，486-504)，即，烷氧烷氧基团。其它修饰包括2’-二甲基氨氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMAOE，以及2’-二甲基氨基乙氧乙氧基(2’-DMAEOE)，即，2’-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
可以进一步设想，这些修饰可包括2’-甲氧基(2’-O-CH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)以及2’-氟(2’-F)。类似的修饰还可在寡核苷酸的其它位置上进行，尤其是在3’终端核苷酸上或在2’-5’键合的寡核苷酸中的糖的3’位置以及5’终端核苷酸的5’位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物，如在戊呋喃糖位置中的环丁基部分。
在另一方面，可以设想，寡核苷酸还可包括核酸碱基(本领域中经常简称为“碱基”)修饰或取代。如在本文所使用的，“未修饰的”或“天然的”核酸碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰的核酸碱基包括其它合成和天然核酸碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-Me-C或m5c)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫羟、8-硫代烷基、8-羟基以及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代尤其是5-溴代、5-三氟甲基以及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。另外的核酸碱基包括那些在美国专利第3,687,808号中披露的核酸碱基、那些在Concise Encyclopedia OfPolymer Science And Engineering 1990，pages 858-859，Kroschwitz，J.John Wiley &Sons中披露的核酸碱基、那些由Englisch等披露的核酸碱基(Angewandte Chemie，International Edition 1991，30，613-722)、以及那些由Sanghvi，Y.S.(Chapter 15，Antisense Researchand Applications 1993，pages 289-302，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，ed.，CRC Press)披露的核酸碱基。一些这些核酸碱基对于增大寡聚物的结合亲合力特别有用。这些核酸碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已表明5-甲基胞嘧啶取代可增大0.6-1.2℃的核酸双链体稳定性(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.andLebleu，B.，eds.，Antisense Research and Applications 1993，CRC Press，Boca Raton，pages 276-278)，并且是目前优选的碱基取代，甚至更尤其是当其和2’-O-甲氧乙基糖修饰结合时。
在另一方面，可以设想，寡核苷酸的修饰涉及化学键合到寡核苷酸一个或多个部分或者轭合物，其提高寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。这样的部分包括但不限于类脂部分，如胆固醇部分(Letsinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，86，6553-6556)、胆酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.1994，4，1053-1059)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.1992，660，306-309；Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.1993，3，2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.1992，20，533-538)、脂肪族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.，EMBO J.1991，10，1111-1118；Kabanov etal.，FEBS Lett.1990，259，327-330；Svinarchuk et al.，Biochimie 1993，75，49-54)、磷脂，例如，双十六烷基-射碳-丙三醇或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-射碳-丙三醇-3-H-磷酸酯(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.1995，36，3651-3654；Shea et al.，Nucl.Acids Res.1990，18，3777-3783)、多胺或多聚乙二醇链(Manoharan et al.，Nucleosides &Nucleotides 1995，14，969-973)、或金刚烷乙酸(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.1995，36，3651-3654)、棕榈基部分(Mis小时a et al.，Biochim.Biophys.Acta 1995，1264，229-237)、或十八胺或己基氨基-羧基-氧胆固醇部分(Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.1996，277，923-937)。
还设想使用的寡核苷酸是嵌合的寡核苷酸。在本发明的范围内，“嵌合的”寡核苷酸或“嵌合体”是包含两个或多个化学上截然不同的区的寡核苷酸，其中每一个区由至少一个核苷酸形成。这些寡核苷酸通常包含至少一个区，在该区中对寡核苷酸进行修饰，以便赋予寡核苷酸增大的对核酸酶降解的抗性、增大的细胞摄取、和/或对靶核酸增大的结合亲合力。寡核苷酸的另外一个区可用作能够剪切RNA:DNA或RNA:RNA杂交物的酶的底物。通过举实的方式，RNA酶H是一种细胞核酸内切酶，其剪切RNA:DNA双链体的RNA链。因此，RNA酶H的活化导致RNA靶的剪切，从而很大程度上提高基因表达的反义抑制的效率。RNA靶的剪切可通过凝胶电泳进行常规检测，并且，如果必要，用本领域已知的有关核酸杂交技术进行检测。这种RNA靶的RNA酶H-介导的剪切不同于利用核酶来剪切核酸。
嵌合寡核苷酸的实例包括但不限于“多间隙体(gapmers)”，其中有三个不同的区，通常具有由两个区(化学上相互等同但区别于间隙(gap))侧面包围着的中心区。优选的多间隙体的实例是寡核苷酸，其中，寡核苷酸的中部(“间隙”)用作RNA酶H的底物并且优选由2’-脱氧核苷酸组成，而将侧面部分(5’和3’“翼(wing)”)被修饰以对靶RNA分子具有更大亲合力但不能支持核酸酶活性(例如，氟-或2’-O-甲氧基乙基-取代的)。嵌合寡核苷酸不限于那些在糖上具有修饰的嵌合寡核苷酸，但还可包括具有修饰主链的寡核苷或寡核苷酸，例如，具有硫代磷酸酯(P＝S)和磷酸二酯(P＝O)主链键的区或具有MMI和P＝S主链键的区。其它嵌合体包括“多翼物(wingmers)”，在本领域也称为“半聚物(hemimers)”，即，具有两个完全不同区的寡核苷酸。在多翼物的优选实例中，寡核苷酸的5’部分用作RNA酶H的底物并且优选由2’-脱氧核苷酸组成，而将3’部分用这样的方式加以修饰，以便对靶RNA分子具有更大亲合力但不能支持核酸酶活性(例如，氟-或2’-O-甲氧基乙基-取代的)，或反之亦然。在一个实施例中，本发明的寡核苷酸包含在至少一个核苷酸的糖部分的2’-O-甲氧基乙基(2’-O-CH2CH2OCH3)修饰。已表明这种修饰可增大寡核苷酸对其靶的亲合力和寡核苷酸的核酸酶抗性。根据本发明，寡核苷酸的一个、多个、或所有核苷酸亚单位可带有2’-O-甲氧基乙基(2’-O-CH2CH2OCH3)修饰。包括多个具有2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸亚单位的寡核苷酸可以在寡核苷酸内的任何核苷酸亚单位上具有这样的修饰，并且可以是嵌合寡核苷酸。除了或除开2’(21)-O-甲氧基乙基修饰之外，还可以设想包含其它修饰的寡核苷酸，这些修饰可提高反义效能、效力或靶亲合力。
本发明还提供多核苷酸(例如，DNA、RNA、PNA或类似物)，其结合到双链或双链体连接蛋白核酸(例如，在连接蛋白RNA的折叠区中或在连接蛋白基因中)，形成含有三股螺旋的核酸。三股螺旋形成导致连接蛋白表达的抑制，例如通过阻止连接蛋白基因的转录，因此降低或消除细胞中连接蛋白活性。不为任何特殊的机制所限制，相信三股螺旋配对会损害双螺旋为发生聚合酶、转录因子、或调节分子的结合而足够打开的能力。
三股螺旋寡-和多核苷酸是利用三股螺旋形成的碱基配对规则(参见，例如，Cheng et al.，J.Biol.Chem.263：15110(1988)；Ferrinand Camerini-Otero，Science 354：1494(1991)；Ramdas et al.，J.Biol.Chem.264：17395(1989)；Strobel et al.，Science 254：1639(1991)；andRigas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：9591(1986))以及连接蛋白mRNA和/或基因序列来构成。通常，形成三股螺旋的寡核苷酸包括从约10到约25个核苷酸或更长的与连接蛋白RNA或基因中的特定序列“互补”的特异序列(即，足够大以形成稳定的三股螺旋，但又充分小，其依赖于传递的模式，以体内给予，如果需要的话)。在本上下文中，“互补”意思是能够形成稳定的三股螺旋。在一个实施例中，寡核苷酸用来特异性地结合到连接蛋白基因的调节区(例如，连接蛋白5’-侧翼序列、启动子、以及增强子)或特异性地结合到转录起始部位(例如，在从转录起始部位的-10和+10之间)。为了回顾近来利用三股螺旋DNA所取得的治疗进展，参见Gee et al.，in Huber and Carr，1994，Molecular and Immunologic Approches，Futura Publishing Co，Mt Kisco NY and Rininsland et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：5854。
本发明还提供了可用于抑制连接蛋白活性的核酶。这些核酶结合并且特异性地剪切和钝化连接蛋白mRNA。有用的核酶可包括互补于连接蛋白mRNA的5’-和3’-末端序列并且可由技术人员基于连接蛋白mRNA序列加以设计。可以设想，本文提供的核酶包括那些具有I组内含子核酶的特性的核酶(Cech，Biotechnology 13：323(1995))和锤头状核酶的其它核酶(Edgington，Biotechnology 10：256(1992))。
核酶包括那些具有剪切部位的核酶，如GUA、GUU以及GUC。
长度在15和20个核糖核苷酸之间并且对应于包含剪切部位的靶连接蛋白基因的区的短RNA寡核苷酸可以用二级结构特性加以评价，这些二级结构特性可使寡核苷酸更合乎需要。剪切部位的适合性也可利用核糖核酸酶保护测定通过测试与互补寡核苷酸杂交的可接近性，或根据本领域已知的标准程序通过体外测试核酶活性来加以评价。
进一步设想这样的反义化合物，其中反义和核酶功能可结合在单个寡核苷酸中。而且，核酶可包括一个或多个修饰的核苷酸或核苷酸之间的修饰键合，如上述结合对本文提供的反义寡核苷酸的说明所描述的。
本发明还提供了通过诸如RNA干扰(RNAi)的方法对连接蛋白活性的抑制很有用的多核苷酸。这种以及其它基因抑制的技术在本领域是熟知的。这种技术的回顾在Science 288：1370-1372(2000)中可找到。RNAi在转录后水平起作用并且是序列特异的。该过程包括将具有部分或全部双链特征的RNA、或能够编码这样的RNA的前体物引入细胞或引入细胞外环境。
如由Fire等的美国专利第6,506,559号所描述的，RNA可包括聚合的核糖核苷酸的一链或多链。双链结构可由单个自身互补的RNA链或两个互补的RNA链形成。RNA可包括对磷酸酯-糖主链或核苷酸的修饰。RNA双链体的形成可在细胞内或细胞外启动。
研究表明一种或多种核糖核酸酶特异性地结合并将双链RNA剪切成短片断。核糖核酸酶保持与这些片断相关，其本身特异性地结合到互补mRNA，即，特异性地结合到用于连接蛋白基因的转录的mRNA链。用于连接蛋白基因的mRNA也通过核糖核酸酶降解成短片断，从而避免连接蛋白基因的翻译和表达，因此抑制连接蛋白活性。另外，RNA聚合酶可用于促进短片断的许多拷贝的合成，其指数性地增大系统的效率。这种基因抑制途径的独特性质在于沉默不限于其启动的细胞。基因沉默作用可散布到有机体的其它部分以及甚至通过种系传达到好几代。
在一个方面，RNAi的双链(ds)RNA依赖性基因特异后转录沉默策略包括使用短干扰RNA(siRNA)。常规RNAi方法的使用具有一些局限，包括在响应长dsRNA分子而活化的哺乳动物细胞中的非特异抗病毒防卫机制(Gil J，Esteban M，“Induction ofapoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase(PKR)：Mechanismsof action”.Apoptosis 2000，5：107-114)。在本领域中已作出了进展，其中证明了合成的21核苷酸RNA的双链体可介导哺乳动物细胞中的基因特异性RNAi而不引发一般的(generic)抗病毒防卫机制(Elbashir S，et al.，“Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells”.Nature 2001，411：494-498；Caplen N.et al.，Proc Natl Acad Sci 2001，98：9742-9747)。因此，siRNA正日益看作是基因特异调节的有效工具。
如在本文中所描述的，RNAi包括一组相关的基因沉默机制，这些机制共用许多普通的生化组分，其中终端效应物分子是例如但不限于小21-23-核苷酸反义RNA。一种机制利用相对较长的dsRNA触发子(trigger)；其被细胞酶Dicer处理成短的，例如但不限于21-23-核苷酸dsRNA，称为siRNA。siRNA互补于靶RNA的链并入称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的多蛋白复合物中，在这里，其用作靶位内mRNA链的核内水解(endonucleolytic)剪切的向导。这引起整个mRNA的降解；反义siRNA然后可以再循环。在低级有机体中，RNA依赖性的RNA聚合酶也利用退火的向导siRNA作为引物，从而产生更多的dsRNA前靶标(front the target)，其本身用作Dicer底物，从而产生更多siRNA并放大siRNA信号。这种途径在植物中通常用作病毒防卫机制。
如在本文中所描述的，siRNA可包括(例如但不限于)21-23核苷酸的两个分开的、退火的单链，其中终端两个3”-核苷酸是未成对的(3”悬突(overhang))。可替换地，siRNA可以是单茎环的形式，经常称为短发夹RNA(s小时NA)。通常，但不是总是，s小时NA的反义链也是完全互补于si/s小时NA的有义搭配链(partner strand)。
在哺乳动物细胞中，长dsRNA(长度通常大于30个核苷酸)触发干扰素途径，从而激活蛋白质激酶R和2；5”-寡腺苷酸合成酶(oligoadenylate synthetase)。干扰素途径的激活可引起翻译的全面下调以及全部RNA降解。但是，已报道外源引入哺乳动物细胞中的较短siRNA会绕过干扰素途径。
SiRNA反义产物还可来源于内源性微小RNA(microRNA)。在人类细胞中，不管最初形式(siRNA和微小RNA)或处理途径，最终成熟的(例如但不限于)完全同源于mRNA的21-23-核苷酸反义RNA将引导mRNA剪切。通常，siRNA和靶位之间的错配的影响可以从几乎没有到完全去除活性不等，其原因只是部分了解；但是，在至少一种情形下，部分同源性导致mRNA翻译抑制。通常，设计用来模拟原型微小RNA-靶干扰的具有靶错配的siRNA可介导不同程度的翻译抑制，其依赖于特定相互作用和mRNA中靶位的数量。RNAi可通过预先形成的siRNA的外源传递或通过siRNA或s小时NA的基于启动子的表达来激活。
短干扰RNA(siRNA)可以化学合成或通过基于DNA的载体系统来产生。通常，这涉及经有效处理而在细胞内形成siRNA的短发夹(sh)RNA的转录(Paddison P，Caudy A，Hannon G：Stablesuppression of gene expression by RNAi in mammalian cells.Proc NatlAcad Sci USA 2002，99：1443-1448；Paddison P，Caudy A，Bernstein E，Hannon G，Conklin D：Short hairpin RNAs(s小时NAs)inducesequence-specific silencing in mammalian cells.Genes &Dev 2002，16：948-958；Sui G，et al.，Proc Natl Acad Sci 2002，8：5515-5520；Brummelkamp T，et al.，Science 2002，296：550-553)。因此，在上下文中，siRNA可用作组织特异靶向以及基因表达调节的有效策略。
根据本发明使用的寡核苷酸可方便并常规地通过熟知的固相合成技术制备。用于这种合成的装置由几个本领域熟知的卖主销售。任何其它用于这种合成的方法也可采用；寡核苷酸的现行合成在本领域是公认的。熟知利用同样的技术来制备寡核苷酸，如硫代磷酸酯和2’-烷氧基或21-烷氧基烷氧基衍生物，包括2’-O-甲氧乙基寡核苷酸(Martin，P.Helv.Chim.Acta 1995，78，486-504)。还熟知利用同样的技术和工业上可获得的修饰酰胺化物(amidites)和可控多孔玻璃(controlled-pore glass)(CPG)产物如生物素、荧光素、吖啶或补骨脂素-修饰的酰胺化物和/或CPG(可从Glen Research，Sterling，Va.获得)来合成荧光标记的、生物素化(biotinylated)的或其它共轭的寡核苷酸。
方法
在另一方面，本发明包括通过将反义化合物给予受治疗者而治疗该受治疗者(例如，患者)的方法。通常，这些方法包括用于组织工程的方法以及用于减少与医学操作(包括但不限于，眼科操作)有关的组织损伤的方法。
方法可包括，例如，将反义化合物以足够抑制眼中或与受治疗者眼有关的细胞中的人类连接蛋白表达的量给予所述受治疗者的眼。尽管优选对人类连接蛋白质的表达进行抑制，但是可以预想到其它蛋白质可以是由反义化合物(单独或者联合抑制人类连接蛋白表达的反义化合物)进行调节的靶。
在一些实施例中，眼科操作是眼科手术，包括但不限于准分子激光屈光性角膜切除手术、白内障摘除术、角膜移植、矫正屈光的手术、放射状角膜切开手术、青光眼滤过手术、角膜移植手术、准分子激光屈光性角膜切除手术、角膜移植、矫正屈光的手术、眼表面瘤切除术、结膜或羊膜移植、翼状胬肉和睑裂斑切除术、眼整形手术、眼睑瘤切除术、用于先天性异常的重建眼睑手术、外翻和内翻眼睑修复、斜视手术(眼肌肉)、穿透性眼外伤。
在一些实施例中，本文提供的反义化合物是通过局部给予药来给药的。本文提供的反义化合物还可(例如)全身地或通过眼内注射来给予。
可以将本文提供的反义化合物在(例如)相对于伤口形成的预定时间给予受治疗者，如在眼科操作(例如手术)中发生。例如，反义化合物可以在进行眼科操作之前、眼科操作期间、或眼科操作之后给予。例如，反义化合物可在进行眼科操作之前或之后几分钟或几小时内给予受治疗者。
在一些实施例中，反义化合物在进行眼科操作之后给予，并且例如反义化合物在操作的约4小时内、操作的约3小时内给予、以及更通常地在眼科操作的约2小时内、或眼科操作的约1小时内给予。可替换地，反义化合物可在眼科操作的几分钟内给予，例如在眼科操作的5、10、15、20、30、45分钟内。反义化合物还可在眼科操作的4小时后给予。
在另一方面，本文提供的反义化合物可以用影响组织工程的方法给予。在这些实施例，以及本文提供的一些其它实施例中，反义化合物通常在更长时间内给予，例如在几天、几星期、几个月、或者甚至更长的时间内，并且可独立于对病人进行的特别操作(如对眼进行的操作)来给予。
本文提供的反义化合物可以结合增加受治疗者角膜组织厚度的方法来给予，包括以与眼科操作无关的方法给予，以及以与眼科操作(例如，手术)结合给予反义化合物的方法给予。本文提供的反义化合物可结合一种方法来给予，该方法可例如在与受治疗者角膜有关的细胞(例如角膜细胞)中促进愈合或防止组织损伤。本文提供的反义化合物可结合减少受治疗者眼中瘢痕的方法来给予。
本文提供的反义化合物可结合减少受治疗者眼中混浊(hazing)的方法来给予。本文提供的反义化合物可结合调节与成肌纤维细胞分化(与激光所致损伤的部位有关)有关的细胞过多的方法来给予，优选在术后24小时到48小时期间内。本文提供的反义化合物可结合调节间质重建并减少与激光所致损伤的部位有关的混浊的方法来给予，优选在术后24小时到72小时期间内。本文提供的反义化合物可结合增加受治疗者眼中上皮细胞运动的方法来给予。本文提供的反义化合物可结合在将反义化合物给予受治疗者眼的12小时内导致增大上皮细胞运动的方法来给予。本文提供的反义化合物可结合在将反义化合物给予受治疗者眼的24小时内导致增大上皮细胞运动的方法来给予。本文提供的反义化合物可结合阻止间质细胞密度增大的方法来给予。本文提供的反义化合物可结合抑制与激光所致损伤的部位有关的间质水肿的方法在术后24小时到72小时期间内给予。本文提供的反义化合物可结合减少上皮增生的方法在术后24小时到72小时期间内给予。本文提供的反义化合物可结合减少成肌纤维细胞活性长达术后1星期的方法来给予。本文提供的反义化合物可结合调节细胞分化的方法来给予，其中细胞分化会改善胞外基质。本文提供的反义化合物可结合减少细胞增殖的方法来给予。
在一些实施例中，反义化合物会减少瘢痕形成。在一些实施例中，反义化合物可减少炎症。在一些实施例中，反义化合物可促进伤口愈合。在一些优选实施例中，结合手术移植操作来使用反义化合物。在一些优选实施例中，反义化合物靶向连接蛋白43并给予以调节上皮基细胞分裂和生长。在一些实施例中，反义化合物靶向连接蛋白31.1并给予以调节外层角质化。
在其它实施例中，该方法促进愈合或防止与受治疗者角膜有关的细胞中的组织损伤。根据一些实施例，反义化合物用于增大受治疗者角膜组织厚度的方法中，或用于导致减少受治疗者角膜细胞中组织损伤的方法中，或用于导致减少与受治疗者角膜有关的细胞中组织损伤的方法中，或用于结合受治疗者的准分子激光屈光角膜切除手术进行的方法中，或用于调节与成肌纤维细胞分化(与激光所致损伤的部位有关)有关的细胞过多的方法中，优选在术后24小时到48小时期间内，或用于调节间质重建并减少与激光所致损伤的部位有关的混浊的方法中，优选在术后24小时到72小时期间内，或在术后24小时到72小时期间内用于抑制与激光所致损伤的部位有关的间质水肿的方法中，或用于减少上皮增生的方法中，优选在术后24小时到72小时期间内，或用于减少成肌纤维细胞活性长达术后1星期的方法中，或用于调节细胞分化(其改善胞外基质)的方法中，或用于减少细胞增殖的方法中。
在一些实施例中，眼科操作是白内障摘除术。在其它实施例中，眼科操作是角膜移植。在其它实施例中，眼外科手术是矫正屈光的手术。在其它实施例中，眼科操作是放射状角膜切开手术。在其它实施例中，眼科操作是青光眼滤过手术。在还有的其它实施例中，眼科操作是角膜移植手术。
在一些实施例中，反义化合物或组合物是通过局部给药方式来给予。在一些实施例中，反义化合物或组合物是通过直接涂敷到手术伤口来给予。在一些实施例中，反义化合物或组合物是通过眼内注射来给予。在一些实施例中，反义化合物或组合物是在进行外科手术之前给予。在一些实施例中，反义化合物或组合物是在外科手术过程中给予。在一些非限制性实施例中，反义化合物或组合物是在进行眼科操作之前约15分钟内或在进行眼科操作之后长达约2小时给予。在一些其它实施例中，例如对于组织工程，可以给予本文提供的反义化合物几天或甚至几个月。
在一些另外的实施例中，化合物和组合物用来促进愈合或阻止与角膜有关的细胞中的组织损伤，其中与角膜有关的细胞可以是眼中的任何细胞，其包括但不限于角膜细胞。本文提供的药剂，包括反义化合物，可增加受治疗者角膜组织的厚度。在一些实施例中，反义化合物结合另一种可用于减少组织损伤或促进愈合的化合物一起使用。例如，反义化合物可与生长因子、细胞因子、或类似因子一起给予，这些因子包括但不限于FGF、NGF、NT3、PDGF、TGF、VEGF、BDGF、EGF、KGF、整联蛋白、白细胞介素、纤溶酶、以及semaphorins。
在另一方面，提供了用于减少与眼科手术有关的组织损伤的药物组合物。药物组合物被适当配制，用于局部给予受治疗者的眼，该药物组合物包括足够量的反义化合物以抑制与受治疗者眼有关的细胞中的人类连接蛋白质的表达。反义化合物优选靶向核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中核酸分子编码具有选自SEQ IDNO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白。在一些实施例中，反义化合物是包括药用载体或赋形剂的药物组合物的形式，并且药剂或反义化合物以有效促进受治疗者伤口愈合的量存在。在一些实施例中，药物组合物可以是，例如，适合局部给药的形式，包括适合局部给予受治疗者眼的形式。在一些另外的实施例中，组合物以及剂型可以是凝胶剂、乳膏剂的形式，或任何本文描述的形式。
在另一方面，提供了治疗中枢神经系统的损伤的方法。方法包括结合为治疗所述中枢神经系统的损伤而给患者进行的外科手术，将反义化合物给予接近中枢神经系统的预先存在伤口的部位，其中，所述反义化合物靶向核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中核酸分子编码具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白。在方法的一些实施例中，给予反义化合物以减少起因于脊髓物理损伤的神经元损失。在方法的一些实施例中，将反义化合物给予接近由外伤引起的伤口的部位。在方法的一些实施例中，将反义化合物给予接近由手术引起的伤口的部位。在方法的一些实施例中，将反义化合物给予接近脊髓损伤的部位。在方法的一些实施例中，反义化合物指向连接蛋白43并给予以调节上皮基细胞分裂和生长。
在方法的一些实施例中，反义化合物促进伤口愈合。在方法的一些实施例中，反义化合物减少炎症。在方法的一些实施例中，反义化合物减少瘢痕形成。在方法的一些实施例中，中枢神经系统损伤是脊髓损伤。在方法的一些实施例中，在脊髓物理损伤后至少约24小时将反义化合物给予患者。在方法的一些实施例中，反义化合物结合外科移植手术一起使用。在方法的一些另外实施例中，外科移植手术结合用反义化合物进行的移植前处理以促进伤口愈合。在另一方面，提供了反义化合物，这些反义化合物结合用于治疗患者预先存在的特征在于神经元损失的伤口的操作能够促进神经元的再生。在一些实施例中，药剂是长度高达40个核酸碱基的反义化合物，其靶向编码人类连接蛋白的核酸分子的至少约8个核酸碱基，并且反义化合物结合促进用于治疗患者预先存在伤口的再生神经元的操作来抑制一种或多种人类连接蛋白表达。伤口包括那些特征在于神经元损失的伤口。可被靶向的连接蛋白包括具有选自SEQ IDNO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白。在这些实施例中，反义化合物可在所述患者的导致神经元损失的脊髓物理损伤后至少24小时给予患者。反义化合物可在脊髓物理损伤超过24小时后给予患者几星期、几个月，或在导致神经元损失的物理损伤几年后给予患者。
在药物组合物和方法的一些实施例中，反义化合物靶向编码人类连接蛋白30或人类连接蛋白37的核酸分子的至少约8个核酸碱基。优选地，反义化合物抑制与患者眼有关的细胞中的人类连接蛋白30或37的表达。其它药物组合物包括一种反义化合物，其靶向核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中核酸分子编码具有选自SEQID NO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白(例如，人类的)，并且优选地反义化合物结合一种操作来抑制人类连接蛋白的表达，从而为治疗患者预先存在的伤口(特征在于神经元损失)而促进再生神经元。
药物组合物
在另一方面，本发明包括包含反义化合物的药物组合物。在一个实施例中，提供的药物组合物用于减少与眼科操作(例如，手术)有关的组织损伤，使得制成的药物组合物用于局部给予患者的眼，并且它包括一定量的反义化合物，其足以抑制与患者眼有关的细胞中的人类连接蛋白质的表达。在一些实施例中，反义化合物靶向核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中核酸分子编码具有选自SEQ IDNO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白(例如，人类的)。在一些实施例中，该药物组合物包括药用载体，该载体包括缓冲普卢兰尼克酸(pluronic acid)或凝胶，例如在磷酸缓冲盐溶液中高达约30％的普卢兰尼克酸。反义组合物可包括不同量的普卢兰尼克酸或凝胶，其量包括但不限于在磷酸缓冲盐溶液中高达约5％的普卢兰尼克酸、在磷酸缓冲盐溶液中高达约10％的普卢兰尼克酸、在磷酸缓冲盐溶液中高达约15％的普卢兰尼克酸、在磷酸缓冲盐溶液中高达约20％的普卢兰尼克酸、在磷酸缓冲盐溶液中高达约25％的普卢兰尼克酸、以及在磷酸缓冲盐溶液中高达约30％的普卢兰尼克酸。
本文提供的反义化合物还可包括生物等效的化合物，包括药用盐和前药。这用来包括任何药用盐、酯、或这样酯的盐、或任何其它化合物，其给予包括人类的动物以后，能够提供(直接或间接地)生物活性代谢物或其残余物。因此，例如，披露内容还包括核酸的药用盐以及这样的核酸的前药。“药用盐”是生理上和药理上可接受的本文提供的核酸的盐：即，保留母体化合物的所希望的生物活性并且不赋予不希望的毒性作用的盐(参见，例如，Berge et al.，J.ofPharma Sci.1977，66，1-19)。
对于寡核苷酸，药用盐的实例包括但不限于(a)和诸如钠、钾、铵、镁、钙的阳离子，和诸如精胺和亚精胺等的多胺形成的盐；(b)和无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；(c)和有机酸，例如，醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、安息香酸、单宁酸、棕榈酸、海藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的盐；以及(d)和基本阴离子(elemental anion)如氯、溴、以及碘形成的盐。
本文提供的寡核苷酸可另外地或可选地加以制备以用“前药”形式加以递送。术语“前药”表示治疗剂，其制备成无活性形式并通过内源性酶或其它化学品和/或条件的作用在体内或细胞内转化成活性形式(即，药物)。尤其是，寡核苷酸的前药形式可以根据在1993年12月9日公布的Gosselin等的WO93/24510中披露的方法制成SATE[(S-乙酰基-2-硫乙基)磷酸酯]衍生物。
反义化合物可制成药物组合物，除了寡核苷酸之外，其可包括药用载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、脂质体、促渗剂、载体化合物以及其它药用载体或赋形剂等。
药物组合物还可包括一种或多种活性成分，如干扰素、抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。用于胃肠道外给药的剂型可包括无菌水溶液，该无菌水溶液也可包含缓冲剂、脂质体、稀释剂以及其它合适的添加剂。包括本文提供的寡核苷酸的药物组合物可包括促渗剂，以便提高寡核苷酸的消化递送(alimentary delivery)。促渗剂可分类为属于五个大类的一类，即脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、表面活性剂以及非表面活性剂(Lee et al.，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems 1991，8，91-192；Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 1990，7，1-33)。可包括来自一个或多个这些大类的一种或多种促渗剂。
用作促渗剂的各种脂肪酸及其衍生物包括，例如，油酸、月桂酸、癸酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、recinleate、一油精(a.k.a.l-甘油一油酸酯(monooleoyl-rac-glycerol))、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、单-甘油酯和二-甘油酯及其生理上可接受的盐(即，油酸盐(酯)、月桂酸盐(酯)、癸酸盐(酯)、豆蔻酸盐(酯)、棕榈酸盐(酯)、硬脂酸盐(酯)、亚油酸盐(酯)等)。(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems 1991，page 92；Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 1990，7，1；El-Hariri et al.，J.Pharm.Pharmacol.199244，651-654)。
胆汁的生理作用包括促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(Brunton，Chapter 38In：Goodman &Gilman’s The PharmacologicalBasis of Therapeutics，9th Ed.，Hardman et al.McGraw-Hill，New York，N.Y.，1996，pages 934-935)。各种天然的胆汁盐、及其合成衍生物用作促渗剂。因此，术语“胆汁盐”包括任何天然存在的胆汁成分以及任何其合成的衍生物。
可使用包括一种或多种促渗剂的复合剂型。例如，胆汁盐可结合脂肪酸使用以制成复合剂型。螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)二钠、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐以及高香草酸盐)、胶原的N-酰基衍生物、月桂基聚氧乙烯(9)醚(laureth-9)和β二酮(烯胺)的N-氨基酰基衍生物(Lee etal.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1991，page92；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems1990，7，1-33；Buur et al.，J.Control Rel.1990，14，43-51)。螯合剂具有也用作DNA酶抑制剂的附加优点。
表面活性剂包括，例如，十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-十二烷基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚(Lee et al.，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 1991，page 92)；以及全氟化合物的乳剂，如FC-43(Takahashi et al.，J.Pharm.Phamacol.1988，40，252-257)。非表面活性剂包括，例如，不饱和环脲、1-烷基-以及1-烯基氮杂环-烷酮(alkanone)衍生物(Lee et al.，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 1991，page 92)；以及非甾类消炎剂，如双氯芬酸钠、吲哚美辛(indomethacin)以及苯丁唑酮(phenylbutazone)(Yamashita et al.，J.Pharm.Pharmacol.1987，39，621-626)。
如在本文中所使用的，“载体化合物”指的是核酸、或其类似物，其是惰性的(即，本身不具有生物活性)，但通过体内过程被识别为核酸，其中体内过程通过(例如)降解生物活性核酸或促进其从循环中去除来降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物(通常具有过量的后者)的共同给予可导致在肝、肾或其它外循环储液囊回收的核酸量显著减少，大概由于在载体化合物和核酸之间对于共同受体的竞争。与载体化合物相反，“药用载体”(赋形剂)是药用溶剂、悬浮剂或任何其它用于将一种或多种核酸传递到动物的药理惰性赋形剂。当结合核酸和所给药物组合物的其它组分时，药用载体可以是液体或固体并且用脑中计划的给药方式进行选择，以便提供所希望的本体(bulk)和稠度等。通常的药用载体包括但不限于粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其它糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；滑润剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶态二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、醋酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉羟乙酸钠等)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠等)。
本文提供的组合物可另外包含在药物组合物中通常发现的其它附属组分，并且这些附属组分使用水平在本技术领域已确定。因此，例如，组合物可包含另外相容的药物活性物质如，止痒药、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎药，或可包含另外的物质，这些物质可用于物理配制本发明的组合物的各种剂型，如染料、增香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂、以及稳定剂。但是，当添加时，这样的物质不应过度干扰本文提供的组合物的组分的生物活性。
不管寡核苷酸通过什么方法引入患者，胶态分散系统可用作传递赋形剂，以提高寡核苷酸的体内稳定性和/或将寡核苷酸靶向特定器官、组织或细胞类型。胶态分散系统包括但不限于大分子复合物、微米囊、微球体、小珠以及基于脂类的体系，其包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体以及不典型结构的脂质：寡核苷酸复合物。优选的胶态分散系统是多种脂质体。这些脂质体是具有含水核(aqueous core)的微球体，该水合核由一个或多个由排列成双层构型的类脂形成的外层所围绕(参见，通常，Chonn et al.，Current Op.Biotech.1995，6，698-708)。
反义多核苷酸可以以基本上隔离的形式存在。应理解，产物可与载体或稀释剂混合，其不影响产物的预定目的并且仍认为是充分隔离的。产物还可以是基本中纯化的形式，在该情形下，其通常包括90％，例如至少约95％、98％或99％的多核苷酸或制剂的干质量。
反义多核苷酸可以局部给予(在要治疗的部位)。优选地反义多核苷酸和药用载体或稀释剂结合，以生成药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸缓冲盐溶液。组合物可加以配制，以用于胃肠道外、肌内、脑内、静脉内、皮下、或经皮给药。哺乳动物细胞对核酸的摄取可通过若干已知的转染技术，例如，那些使用转染剂的技术来提高。给予的剂型可包含这样的制剂。这些制剂的实例包括阳离子制剂(例如，磷酸钙和DEAE-右旋糖酐)和脂转染剂(lipofectants)(例如，脂转染剂TM和转染剂(transfectam)TM)。
在一方面，寡核苷酸可能需要部位特异性递送。它们还需要在延长时期内递送。尽管递送时间将明显依赖于要诱导下调的部位和所希望的治疗效果，但是经常需要连续递送24小时或更长时间。
在本发明的一方面，这是通过将反义化合物与药用载体或赋形剂一起包含在剂型中来实现，尤其是以用于局部给药的剂型形式。尤其，诸如乳膏剂、滴剂、以及其它本文描述的局部剂型可用来调节上皮基细胞分裂和生长(利用靶向连接蛋白43的反义化合物)以及外层角质化(利用靶向连接蛋白31.1的反义化合物)。
用于局部给药的剂型可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体制剂和散剂。传统药物载体，含水的、粉末或油基、增稠剂等可以是必要的或所希望的。涂层避孕套、手套等也是有用的。用于口服的组合物包括散剂或颗粒剂、在水或非含水介质中的混悬剂或溶液、胶囊剂、小药囊或片剂。增稠剂、增香剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是希望有的。用于胃肠道外给药的组合物可包括无菌水溶液，其也可包含缓冲剂、稀释剂以及其它合适的添加剂。在一些情形下，结合其它传统治疗方式用寡核苷酸来治疗患者可能是更有效的，从而增加治疗方案的效能。如在本文中所使用的，术语“治疗方案”意思是包括治疗的、减轻的以及预防的方式。
治疗组合物的剂型及其后来的给药认为是在本领域技术人员的知识范围内。剂量依赖于要治疗的疾病状态的严重性和反应性，具有从几天持续到几个月、或直至达到治愈或实现疾病状态的减少的治疗期。最佳给药方案可以根据患者体内药物累积的检测结果加以计算。普通技术人员可以很容易确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可依赖于单个寡核苷酸的相对效力而变化，并且通常可基于在体外和在体内动物模型中发现是有效的EC50来估计。通常，剂量为从0.01mg/kg到100mg/kg体重，并且每天、每星期、每月或每年可以给予一次或多次，或甚至每2到20年一次。本领域普通技术人员可以基于测得的体液或组织中药物的滞留时间和浓度容易地估计给药的重复率。在治疗成功以后，可能希望让患者进行维持治疗以防止疾病状态的复发，其中以维持剂量给予寡核苷酸，范围为从0.01mg/kg到100mg/kg体重，每天一次或多次到每20年一次。在需要连接蛋白调节的疾病的治疗或预防中，合适的剂量水平通常为约0.001到100mg/kg患者体重/天，其可以单剂量或多剂量进行给药。优选地，剂量水平将为约1到约40mg/kg/天。
本发明的寡核苷酸可用于诊断、治疗、预防、用作研究试剂以及用于试剂盒中。由于本发明的寡核苷酸可以杂交到编码连接蛋白的核酸，所以很容易构建夹层结构、量热以及其它测定来利用这个事实。用于检测寡核苷酸和连接蛋白基因或mRNA的杂交的方法的条件可常规地实现。这样的条件可包括酶接合、放射性同位素示踪或任何其它合适的检测系统。还可以制备用于检测连接蛋白存在或缺乏的试剂盒。
本发明的寡核苷酸还可用于研究目的。因此，由寡核苷酸表现出的特异性杂交可用于测定、纯化、细胞产物制备以及本领域普通技术人员已知的其它方法中。
在本文描述的一些实施例中可以被靶向的示例性连接蛋白包括但不限于以下连接蛋白。
人类Cx 43，α1(SEQ ID NO：12)
LOCUS NM_0001653088bp mRNA直链PRI26-OCT-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，α1，43kDa(连接蛋白43)(GJA1)，mRNA。
1   acaaaaaagc ttttacgagg tatcagcact tttctttcat tagggggaag gcgtgaggaa
61  agtaccaaac agcagcggag ttttaaactt taaatagaca ggtctgagtg cctgaacttg
121 ccttttcatt ttacttcatc ctccaaggag ttcaatcact tggcgtgact tcactacttt
181 taagcaaaag agtggtgccc aggcaacatg ggtgactgga gcgccttagg caaactcctt
241 gacaaggttc aagcctactc aactgctgga gggaaggtgt ggctgtcagt acttttcatt
301 ttccgaatcc tgctgctggg gacagcggtt gagtcagcct ggggagatga gcagtctgcc
361 tttcgttgta acactcagca acctggttgt gaaaatgtct gctatgacaa gtctttccca
421 atctctcatg tgcgcttctg ggtcctgcag atcatatttg tgtctgtacc cacactcttg
481 tacctggctc atgtgttcta tgtgatgcga aaggaagaga aactgaacaa gaaagaggaa
541 gaactcaagg ttgcccaaac tgatggtgtc aatgtggaca tgcacttgaa gcagattgag
601 ataaagaagt tcaagtacgg tattgaagag catggtaagg tgaaaatgcg aggggggttg
661 ctgcgaacct acatcatcag tatcctcttc aagtctatct ttgaggtggc cttcttgctg
721 atccagtggt acatctatgg attcagcttg agtgctgttt acacttgcaa aagagatccc
781 tgcccacatc aggtggactg tttcctctct cgccccacgg agaaaaccat cttcatcatc
841 ttcatgctgg tggtgtcctt ggtgtccctg gccttgaata tcattgaact cttctatgtt
901 ttcttcaagg gcgttaagga tcgggttaag ggaaagagcg acccttacca tgcgaccagt
961 ggtgcgctga gccctgccaa agactgtggg tctcaaaaat atgcttattt caatggctgc
1021tcctcaccaa ccgctcccct ctcgcctatg tctcctcctg ggtacaagct ggttactggc
1081gacagaaaca attcttcttg ccgcaattac aacaagcaag caagtgagca aaactgggct
1141aattacagtg cagaacaaaa tcgaatgggg caggcgggaa gcaccatctc taactcccat
1201gcacagcctt ttgatttccc cgatgataac cagaattcta aaaaactagc tgctggacat
1261gaattacagc cactagccat tgtggaccag cgaccttcaa gcagagccag cagtcgtgcc
1321agcagcagac ctcggcctga tgacctggag atctagatac aggcttgaaa gcatcaagat
1381tccactcaat tgtggagaag aaaaaaggtg ctgtagaaag tgcaccaggt gttaattttg
1441atccggtgga ggtggtactc aacagcctta ttcatgaggc ttagaaaaca caaagacatt
1501agaataccta ggttcactgg gggtgtatgg ggtagatggg tggagaggga ggggataaga
1561gaggtgcatg ttggtattta aagtagtgga ttcaaagaac ttagattata aataagagtt
1621ccattaggtg atacatagat aagggctttt tctccccgca aacaccccta agaatggttc
1681tgtgtatgtg aatgagcggg tggtaattgt ggctaaatat ttttgtttta ccaagaaact
1741gaaataattc tggccaggaa taaatacttc ctgaacatct taggtctttt caacaagaaa
1801aagacagagg attgtcctta agtccctgct aaaacattcc attgttaaaa tttgcacttt
1861gaaggtaagc tttctaggcc tgaccctcca ggtgtcaatg gacttgtgct actatatttt
1921tttattcttg gtatcagttt aaaattcaga caaggcccac agaataagat tttccatgca
1981tttgcaaata cgtatattct ttttccatcc acttgcacaa tatcattacc atcacttttt
2041catcattcct cagctactac tcacattcat ttaatggttt ctgtaaacat ttttaagaca
2101gttgggatgt cacttaacat tttttttttt tgagctaaag tcagggaatc aagccatgct
2161taatatttaa caatcactta tatgtgtgtc gaagagtttg ttttgtttgt catgtattgg
2221tacaagcaga tacagtataa actcacaaac acagatttga aaataatgca catatggtgt
2281tcaaatttga acctttctca tggatttttg tggtgtgggc caatatggtg tttacattat
2341ataattcctg ctgtggcaag taaagcacac tttttttttc tcctaaaatg tttttccctg
2401tgtatcctat tatggatact ggttttgtta attatgattc tttattttct ctcctttttt
2461taggatatag cagtaatgct attactgaaa tgaatttcct ttttctgaaa tgtaatcatt
2521gatgcttgaa tgatagaatt ttagtactgt aaacaggctt tagtcattaa tgtgagagac
2581ttagaaaaaa tgcttagagt ggactattaa atgtgcctaa atgaattttg cagtaactgg
2641tattcttggg ttttcctact taatacacag taattcagaa cttgtattct attatgagtt
2701tagcagtctt ttggagtgac cagcaacttt gatgtttgca ctaagatttt atttggaatg
2761caagagaggt tgaaagagga ttcagtagta cacatacaac taatttattt gaactatatg
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2881gaaaatgctg agtatgacac ttttcttctt gcatgcatgt cagctacata aacagttttg
2941tacaatgaaa attactaatt tgtttgacat tccatgttaa actacggtca tgttcagctt
3001cattgcatgt aatgtagacc tagtccatca gatcatgtgt tctggagagt gttctttatt
3061caataaagtt ttaatttagt ataaacat∥
人类Cx 46，α3(SEQ ID NO：13)
LOCUS NM_0219541308bp mRNA直链PRI27-OCT-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，α3，46kDa(连接蛋白46)(GJA3)，mRNA。
1   atgggcgact ggagctttct gggaagactc ttagaaaatg cacaggagca ctccacggtc
61  atcggcaagg tttggctgac cgtgctgttc atcttccgca tcttggtgct gggggccgcg
121 gcggaggacg tgtggggcga tgagcagtca gacttcacct gcaacaccca gcagccgggc
181 tgcgagaacg tctgctacga cagggccttc cccatctccc acatccgctt ctgggcgctg
241 cagatcatct tcgtgtccac gcccaccctc atctacctgg gccacgtgct gcacatcgtg
301 cgcatggaag agaagaagaa agagagggag gaggaggagc agctgaagag agagagcccc
361 agccccaagg agccaccgca ggacaatccc tcgtcgcggg acgaccgcgg cagggtgcgc
421 atggccgggg cgctgctgcg gacctacgtc ttcaacatca tcttcaagac gctgttcgag
481 gtgggcttca tcgccggcca gtactttctg tacggcttcg agctgaagcc gctctaccgc
541 tgcgaccgct ggccctgccc caacacggtg gactgcttca tctccaggcc cacggagaag
601 accatcttca tcatcttcat gctggcggtg gcctgcgcgt ccctgctgct caacatgctg
661 gagatctacc acctgggctg gaagaagctc aagcagggcg tgaccagccg cctcggcccg
721 gacgcctccg aggccccgct ggggacagcc gatcccccgc ccctgccccc cagctcccgg
781 ccgcccgccg ttgccatcgg gttcccaccc tactatgcgc acaccgctgc gcccctggga
841 caggcccgcg ccgtgggcta ccccggggcc ccgccaccag ccgcggactt caaactgcta
901 gccctgaccg aggcgcgcgg aaagggccag tccgccaagc tctacaacgg ccaccaccac
961 ctgctgatga ctgagcagaa ctgggccaac caggcggccg agcggcagcc cccggcgctc
1021aaggcttacc cggcagcgtc cacgcctgca gcccccagcc ccgtcggcag cagctccccg
1081ccactcgcgc acgaggctga ggcgggcgcg gcgcccctgc tgctggatgg gagcggcagc
1141agtctggagg ggagcgccct ggcagggacc cccgaggagg aggagcaggc cgtgaccacc
1201gcggcccaga tgcaccagcc gcccttgccc ctcggagacc caggtcgggc cagcaaggcc
1261agcagggcca gcagcgggcg ggccagaccg gaggacttgg ccatctag∥
人类Cx 37，α4(SEQ ID NO：14)
LOCUS NM_0020601601bp mRNA直链PRI26-OCT-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，α4，37kDa(连接蛋白37)(GJA4)，mRNA。
1   ctccggccat cgtccccacc tccacctggg ccgcccgcga ggcagcggac ggaggccggg
61  agccatgggt gactggggct tcctggagaa gttgctggac caggtccgag agcactcgac
121 cgtggtgggt aagatctggc tgacggtgct cttcatcttc cgcatcctca tcctgggcct
181 ggccggcgag tcagtgtggg gtgacgagca gtcagatttc gagtgtsaca cggcccagcc
241 aggctgcacc aacgtctgct atgaccaggc cttccccatc tcccacatcc gctactgggt
301 gctgcagttc ctcttcgtca gcacacccac cctggtctac ctgggccatg tcatttacct
361 gtctcggcga gaagagcggc tggcgcagaa ggagggggag ctgcgggcac tgccggccaa
421 ggacccacag gtggagcggg cgctggccgg catagagctt cagatggcca agatctcggt
481 ggcagaagat ggtcgcctgc gcattccgcg agcactgatg ggcacctatg tcgccagtgt
541 gctctgcaag agtgtgctag aggcaggctt cctctatggc cagtggcgcc tgtacggctg
601 gaccatggag cccgtgtttg tgtgccagcg agcaccctgc ccctacctcg tggactgctt
661 tgtctctcgc cccacggaga agaccatctt catcatcttc atgttggtgg ttggactcat
721 ctccctggtg cttaacctgc tggagttggt gcacctgctg tgtcgctgcc tcagccgggg
781 gatgagggca cggcaaggcc aagacgcacc cccgacccag ggcacctcct cagaccctta
841 cacggaccag ggtcttcttc tacctccccg tggccagggg ccctcatccc caccatgccc
901 cacctacaat gggctctcat ccagtgagca gaactgggcc aacctgacca cagaggagag
961 gctggcgtct tccaggcccc ctctcttcct ggacccaccc cctcagaatg gccaaaaacc
1021cccaagtcgt cccagcagct ctgcttctaa gaagcagtat gtatagaggc ctgtggctta
1081tgtcacccaa cagaggggtc ctgagaagtc tggctgcctg ggatgccccc tgccccctcc
1141tggaaggctc tgcagagatg actgggctgg ggaagcagat gcttgctggc catggagcct
1201cattgcaagt tgttcttgaa cacctgaggc cttcctgtgg cccaccaggc actacggctt
1261cctctccaga tgtgctttgc ctgagcacag acagtcagca tggaatgctc ttggccaagg
1321gtactggggc cctctggcct tttgcagctg atccagagga acccagagcc aacttacccc
1381aacctcaccc tatggaacag tcacctgtgc gcaggttgtc ctcaaaccct ctcctcacag
1441gaaaaggcgg attgaggctg ctgggtcagc cttgatcgca cagacagagc ttgtgccgga
1501tttggccctg tcaaggggac tggtgccttg ttttcatcac tccttcctag ttctactgtt
1561caagcttctg aaataaacag gacttgatca caaaaaaaaa a∥
人类Cx 40，α5(SEQ ID NO：15)
LOCUS NM_0052662574bp mRNA直链PRI27-OCT-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，α5，40kDa(连接蛋白40)(GJA5)，转录物变异体A，mRNA。
1   gcaaaaagcg tgggcagttg gagaagaagc agccagagtg tgaagaagcc cacggaagga
61  aagtccaggg aggaggaaaa gaagcagaag ttttggcatc tgttccctgg ctgtgccaag
121 atgggcgatt ggagcttcct gggaaatttc ctggaggaag tacacaagca ctcgaccgtg
181 gtaggcaagg tctggctcac tgtcctcttc atattccgta tgctcgtgct gggcacagct
241 gctgagtctt cctgggggga tgagcaggct gatttccggt gtgatacgat tcagcctggc
301 tgccagaatg tctgctacga ccaggctttc cccatctccc acattcgcta ctgggtgctg
361 cagatcatct tcgtctccac gccctctctg gtgtacatgg gccacgccat gcacactgtg
421 cgcatgcagg agaagcgcaa gctacgggag gccgagaggg ccaaagaggt ccggggctct
481 ggctcttacg agtacccggt ggcagagaag gcagaactgt cctgctggga ggaagggaat
541 ggaaggattg ccctccaggg cactctgctc aacacctatg tgtgcagcat cctgatccgc
601 accaccatgg aggtgggctt cattgtgggc cagtacttca tctacggaat cttcctgacc
661 accctgcatg tctgccgcag gagtccctgt ccccacccgg tcaactgtta cgtatcccgg
721 cccacagaga agaatgtctt cattgtcttt atgctggctg tggctgcact gtccctcctc
781 cttagcctgg ctgaactcta ccacctgggc tggaagaaga tcagacagcg atttgtcaaa
841 ccgcggcagc acatggctaa gtgccagctt tctggcccct ctgtgggcat agtccagagc
901 tgcacaccac cccccgactt taatcagtgc ctggagaatg gccctggggg aaaattcttc
961 aatcccttca gcaataatat ggcctcccaa caaaacacag acaacctggt caccgagcaa
1021gtacgaggtc aggagcagac tcctggggaa ggtttcatcc aggttcgtta tggccagaag
1081cctgaggtgc ccaatggagt ctcaccaggt caccgccttc cccatggcta tcatagtgac
1141aagcgacgtc ttagtaaggc cagcagcaag gcaaggtcag atgacctatc agtgtgaccc
1201tcctttatgg gaggatcagg accaggtggg aacaaaggag gctcagagaa gaaagacgtg
1261tcccttctga actgatgctt tctcactgtc atcactgctt ggctcctttg agccccgggt
1321ctcaatgacg ttgctcatta attctagaaa ctataaccag ggctctggga tagtaagaga
1381ggtgacaacc cacccagact gcagttccct ccccaccctc tacccagtat acgaagcctt
1441tcagattact catgaaacag ggtagaggga aagaagggaa gcatggcaaa agctggcctg
1501gaagggatag ccagagggat agaatgactc tctctctaca taccagcagc ataccaaatg
1561cgttctctaa gttcctacct ccttgacctg atcaccctcc ctcctccaag gaagagctca
1621aagttcccag ccaatagaca gcatgaatca aggaacttgc attatatgtg ctcttgaatc
1681tgttgtctcc atggaccatt cctcggagta gtggtgagat ggccttgggt tgcccttggc
1741ttctcctccc tctactcagc cttaaaaagg gcttcttgga actttaccag cagcctcagc
1801tttacaaatg ccttggtatg tacctctggc aaatgcccca ccttggtgat ggtgcaacct
1861ttccttctgc tagggtgtac acctagcctg tgcaggtgtc agccctgcta gggagtcact
1921gtacacacaa actctactgg aattcctgcc aacatctgtc accctgcagc tcctttacag
1981ttcaatccaa tgatagaaac catcccttcc ctttctccct tggctgttca cccagccatt
2041ccctgaaggc cttaccaaca ggaatatcca agaagctgtt gtcccctctc gaaccctgac
2101cagatcatca gccactgagg ccagtggaat ttccccaggc cttgttaaaa caaagaaagc
2161attgtacctc tcagattccc cttgtggaaa aaaaaattct gctgtgaaga tgaaaataaa
2221aatggagaga aaacactgga aaactatttt cccctcctat ttacttcctt tgctgactgc
2281caacttagtg ccaagaggag gtgtgatgac agctatggag gcccccagat ctctctctcc
2341tggaggcttt agcaggggca aggaaatagt aggggaatct ccagctctct tggcagggcc
2401tttatttaaa gagcgcagag attcctatgt ctccctagtg cccctaatga gactgccaag
2461tgggggctgt agaaaagcct tgccttcccc agggattggc ctggtctctg tattcactgg
2521atccataatg ggttgctgtt gttttggatg aaggtaaacg atgcttggaa ttgg//
人类Cx 45，α7(SEQ ID NO：16)
LOCUS NM_0054971191bp mRNA直链PRI23-DEC-2003
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，α7，45kDa(连接蛋白45)(GJA7)，mRNA。
1   atgagttgga gctttctgac tcgcctgcta gaggagattc acaaccattc cacatttgtg
61  gggaagatct ggctcactgt tctgattgtc ttccggatcg tccttacagc tgtaggagga
121 gaatccatct attacgatga gcaaagcaaa tttgtgtgca acacagaaca gccgggctgt
181 gagaatgtct gttatgatgc gtttgcacct ctctcccatg tacgcttctg ggtgttccag
241 atcatcctgg tggcaactcc ctctgtgatg tacctgggct atgctatcca caagattgcc
301 aaaatggagc acggtgaagc agacaagaag gcagctcgga gcaagcccta tgcaatgcgc
361 tggaaacaac accgggctct ggaagaaacg gaggaggaca acgaagagga tcctatgatg
421 tatccagaga tggagttaga aagtgataag gaaaataaag agcagagcca acccaaacct
481 aagcatgatg gccgacgacg gattcgggaa gatgggctca tgaaaatcta tgtgctgcag
541 ttgctggcaa ggaccgtgtt tgaggtgggt tttctgatag ggcagtattt tctgtatggc
601 ttccaagtcc acccgtttta tgtgtgcagc agacttcctt gtcctcataa gatagactgc
661 tttatttcta gacccactga aaagaccatc ttccttctga taatgtatgg tgttacaggc
721 ctttgcctct tgcttaacat ttgggagatg cttcatttag ggtttgggac cattcgagac
781 tcactaaaca gtaaaaggag ggaacttgag gatccgggtg cttataatta tcctttcact
841 tggaatacac catctgctcc ccctggctat aacattgctg tcaaaccaga tcaaatccag
901 tacaccgaac tgtccaatgc taagatcgcc tacaagcaaa acaaggccaa cacagcccag
961 gaacagcagt atggcagcca tgaggagaac ctcccagctg acctggaggc tctgcagcgg
1021gagatcagga tggctcagga acgcttggat ctggcagttc aggcctacag tcaccaaaac
1081aaccctcat ggtccccggga gaagaaggcc aaagtggggt ccaaagctgg gtccaacaaa
1141agcactgcca gtagcaaatc aggggatggg aagaactctg tctggattta a∥
人类Cx 50，α8(SEQ ID NO：17)
LOCUS NM_0052671362bp mRNA直链PRI26-OCT-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，α8，50kDa(连接蛋白50)(GJA8)，mRNA。
1   agcgccaaga gagaaagagc acatatttct ccgtgggaca ctccttgtat tggtgggtga
61  gaaatgggcg actggagttt cctggggaac atcttggagg aggtgaatga gcactccacc
121 gtcatcggca gagtctggct caccgtgctt ttcatcttcc ggatcctcat ccttggcacg
181 gccgcagagt tcgtgtgggg ggatgagcaa tccgacttcg tgtgcaacac ccagcagcct
241 ggctgcgaga acgtctgcta cgacgaggcc tttcccatct cccacattcg cctctgggtg
301 ctgcagatca tcttcgtctc caccccgtcc ctgatgtacg tggggcacgc ggtgcactac
361 gtccgcatgg aggagaagcg caaaagccgc gacgaggagc tgggccagca ggcggggact
421 aacggcggcc cggaccaggg cagcgtcaag aagagcagcg gcagcaaagg cactaagaag
481 ttccggctgg aggggaccct gctgaggacc tacatctgcc acatcatctt caagaccctc
541 tttgaagtgg gcttcatcgt gggccactac ttcctgtacg ggttccggat cctgcctctg
601 taccgctgca gccggtggcc ctgccccaat gtggtggact gcttcgtgtc ccggcccacg
661 gagaaaacca tcttcatcct gttcatgttg tctgtggcct ctgtgtccct attcctcaac
721 gtgatggagt tgagccacct gggcctgaag gggatccggt ctgccttgaa gaggcctgta
781 gagcagcccc tgggggagat tcctgagaaa tccctccact ccattgctgt ctcctccatc
841 cagaaagcca agggctatca gcttctagaa gaagagaaaa tcgtttccca ctatttcccc
901 ttgaccgagg ttgggatggt ggagaccagc ccactgcctg ccaagccttt caatcagttc
961 gaggagaaga tcagcacagg acccctgggg gacttgtccc ggggctacca agagacactg
1021ccttcctacg ctcaggtggg ggcacaagaa gtggagggcg aggggccgcc tgcagaggag
1081ggagccgaac ccgaggtggg agagaagaag gaggaagcag agaggctgac cacggaggag
1141caggagaagg tggccgtgcc agagggggag aaagtagaga cccccggagt ggataaggag
1201ggtgaaaaag aagagccgca gtcggagaag gtgtcaaagc aagggctgcc agctgagaag
1261acaccttcac tctgtccaga gctgacaaca gatgatgcca gacccctgag caggctaagc
1321aaagccagca gccgagccag gtcagacgat ctaaccgtat ga∥
人类Cx 36，α9，γ1(SEQ ID NO：18)
LOCUS  NM_020660966bp mRNA直链PRI03-SEP-2004
DEFINITION人类连接蛋白-36(CX36)，mRNA。
1   atgggggaat ggaccatctt ggagaggctg ctagaagccg cggtgcagca gcactccact
61  atgatcggaa ggatcctgtt gactgtggtg gtgatcttcc ggatcctcat tgtggccatt
121 gtgggggaga cggtgtacga tgatgagcag accatgtttg tgtgcaacac cctgcagccc
181 ggctgtaacc aggcctgcta tgaccgggcc ttccccatct cccacatacg ttactgggtc
241 ttccagatca taatggtgtg tacccccagt ctttgcttca tcacctactc tgtgcaccag
301 tccgccaagc agcgagaacg ccgctactct acagtcttcc tagccctgga cagagacccc
361 cctgagtcca taggaggtcc tggaggaact gggggtgggg gcagtggtgg gggcaaacga
421 gaagataaga agttgcaaaa tgctattgtg aatggggtgc tgcagaacac agagaacacc
481 agtaaggaga cagagccaga ttgtttagag gttaaggagc tgactccaca cccatcaggt
541 ctacgcactg catcaaaatc caagctcaga aggcaggaag gcatctcccg cttctacatt
601 atccaagtgg tgttccgaaa tgccctggaa attgggttcc tggttggcca atattttctc
661 tatggcttta gtgtcccagg gttgtatgag tgtaaccgct acccctgcat caaggaggtg
721 gaatgttatg tgtcccggcc aactgagaag actgtctttc tagtgttcat gtttgctgta
781 agtggcatct gtgttgtgct caacctggct gaactcaacc acctgggatg gcgcaagatc
841 aagctggctg tgcgaggggc tcaggccaag agaaagtcaa tctatgagat tcgtaacaag
901 gacctgccaa gggtcagtgt tcccaatttt ggcaggactc agtccagtga ctctgcctat
961 gtgtga//
人类Cx 59/58，α10(SEQ ID NO：19)
LOCUS  NM_0307721901bp mRNA直链PRI27-OCT-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，α10，59kDa(GJA10)，mRNA。
1   cagggagttg tggttgcaac actgtactcc agcctgggca acagagggag actctgtctc
61  aacaaacaaa caaacaaaga aaaaacccca cagctatcta gggaaaaagt aaagcaacca
121 gcatatagaa gtgacatatt gttatatttt caccataggt ttgctttaag aaatagtgct
181 cccttcagaa tggaagaatt tatctgcctc ttatttgatg tggatcagag ctaagatggc
241 tgactaaata aacatggggg actggaatct ccttggagat actctggagg aagttcacat
301 ccactccacc atgattggaa agatctggct caccatcctg ttcatatttc gaatgcttgt
361 tctgggtgta gcagctgaag atgtctggaa tgatgagcag tctggcttca tctgcaatac
421 agaacaacca ggctgcagaa atgtatgcta cgaccaggcc tttcctatct ccctcattag
481 atactgggtt ctgcaggtga tatttgtgtc ttcaccatcc ctggtctaca tgggccatgc
541 attgtaccga ctgagagttc ttgaggaaga gaggcaaagg atgaaagctc agttaagagt
601 agaactggag gaggtagagt ttgaaatgcc tagggatcgg aggagattgg agcaagagct
661 ttgtcagctg gagaaaagga aactaaataa agctccactc agaggaacct tgctttgcac
721 ttatgtgata cacattttca ctcgctctgt ggttgaagtt ggattcatga ttggacagta
781 ccttttatat ggatttcact tagagccgct atttaagtgc catggccacc cgtgtccaaa
841 tataatcgac tgttttgtct caagaccaac agaaaagaca atattcctat tatttatgca
901 atctatagcc actatttcac ttttcttaaa cattcttgaa attttccacc taggttttaa
961 aaagattaaa agagggcttt ggggaaaata caagttgaag aaggaacata atgaattcca
1021tgcaaacaag gcaaaacaaa atgtagccaa ataccagagc acatctgcaa attcactgaa
1081gcgactccct tctgcccctg attataatct gttagtggaa aagcaaacac acactgcagt
1141gtaccctagt ttaaattcat cttctgtatt ccagccaaat cctgacaatc atagtgtaaa
1201tgatgagaaa tgcattttgg atgaacagga aactgtactt tctaatgaga tttccacact
1261tagtactagt tgtagtcatt ttcaacacat cagttcaaac aataacaaag acactcataa
1321aatatttgga aaagaactta atggtaacca gttaatggaa aaaagagaaa ctgaaggcaa
1381agacagcaaa aggaactact actctagagg tcaccgttct attccaggtg ttgctataga
1441tggagagaac aacatgaggc agtcacccca aacagttttc tccttgccag ctaactgcga
1501ttggaaaccg cggtggctta gagctacatg gggttcctct acagaacatg aaaaccgggg
1561gtcacctcct aaaggtaacc tcaagggcca gttcagaaag ggcacagtca gaacccttcc
1621tccttcacaa ggagattctc aatcacttga cattccaaac actgctgatt ctttgggagg
1681gctgtccttt gagccagggt tggtcagaac ctgtaataat cctgtttgtc ctccaaatca
1741cgtagtgtcc ctaacgaaca atctcattgg taggcgggtt cccacagatc ttcagatcta
1801aacagcggtt ggcttttaga cattatatat attatcagag aagtagccta gtggtcgtgg
1861ggcacagaaa aaatagatag gggcagctct aaagaccagc t∥
人类Cx 46.6/47，α12(SEQ ID NO：20)
LOCUS AY2851611311bp mRNA直链PRI 19-MAY-2003
DEFINITION人类连接蛋白47，mRNA，完全cds。
1   atgagctgga gcttcctgac gcggctgctg gaggagatcc acaaccactc caccttcgtg
61  ggcaaggtgt ggctcacggt gctggtggtc ttccgcatcg tgctgacggc tgtgggcggc
121 gaggccatct actcggacga gcaggccaag ttcacttgca acacgcggca gccaggctgc
181 gacaacgtct gctatgacgc cttcgcgccc ctgtcgcacg tgcgcttctg ggtcttccag
241 attgtggtca tctccacgcc ctcggtcatg tacctgggct acgccgtgca ccgcctggcc
301 cgtgcgtctg agcaggagcg gcgccgcgcc ctccgccgcc gcccggggcc acgccgcgcg
361 ccccgagcgc acctgccgcc cccgcacgcc ggctggcctg agcccgccga cctgggcgag
421 gaggagccca tgctgggcct gggcgaggag gaggaggagg aggagacggg ggcagccgag
481 ggcgccggcg aggaagcgga ggaggcaggc gcggaggagg cgtgcactaa ggcggtcggc
541 gctgacggca aggcggcagg gaccccgggc ccgaccgggc aacacgatgg gcggaggcgc
601 atccagcggg agggcctgat gcgcgtgtac gtggcccagc tggtggccag ggcagctttc
661 gaggtggcct tcctggtggg ccagtacctg ctgtacggct tcgaggtgcg accgttcttt
721 ccctgcagcc gccagccctg cccgcacgtg gtggactgct tcgtgtcgcg ccctactgaa
781 aagacggtct tcctgctggt tatgtacgtg gtcagctgcc tgtgcctgct gctcaacctc
841 tgtgagatgg cccacctggg cttgggcagc gcgcaggacg cggtgcgcgg ccgccgcggc
901 cccccggcct ccgcccccgc ccccgcgccg cggcccccgc cctgcgcctt ccctgcggcg
961 gccgctggct tggcctgccc gcccgactac agcctggtgg tgcgggcggc cgagcgcgct
1021cgggcgcatg accagaacct ggcaaacctg gccctgcagg cgctgcgcga cggggcagcg
1081gctggggacc gcgaccggga cagttcgccg tgcgtcggcc tccctgcggc ctcccggggg
1141ccccccagag caggcgcccc cgcgtcccgg acgggcagtg ctacctctgc gggcactgtc
1201ggggagcagg gccggcccgg cacccacgag cggccaggag ccaagcccag ggctggctcc
1261gagaagggca gtgccagcag cagggacggg aagaccaccg tgtggatctg a//
人类Cx 32，β1(SEQ ID NO：21)
LOCUS BC0391981588bp mRNA直链PRI 07-OCT-2003
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，β1，32kDa(连接蛋白32，Charcot-Marie-Tooth神经病，X-连接的)，mRNA(cDNA克隆MGC：22506图像：4710239)，完全cds。
1   agacattctc tgggaaaggg cagcagcagc caggtgtggc agtgacaggg aggtgtgaat
61  gaggcaggat gaactggaca ggtttgtaca ccttgctcag tggcgtgaac cggcattcta
121 ctgccattgg ccgagtatgg ctctcggtca tcttcatctt cagaatcatg gtgctggtgg
181 tggctgcaga gagtgtgtgg ggtgatgaga aatcttcctt catctgcaac acactccagc
241 ctggctgcaa cagcgtttgc tatgaccaat tcttccccat ctcccatgtg cggctgtggt
301 ccctgcagct catcctagtt tccaccccag ctctcctcgt ggccatgcac gtggctcacc
361 agcaacacat agagaagaaa atgctacggc ttgagggcca tggggacccc ctacacctgg
421 aggaggtgaa gaggcacaag gtccacatct cagggacact gtggtggacc tatgtcatca
481 gcgtggtgtt ccggctgttg tttgaggccg tcttcatgta tgtcttttat ctgctctacc
541 ctggctatgc catggtgcgg ctggtcaagt gcgacgtcta cccctgcccc aacacagtgg
601 actgcttcgt gtcccgcccc accgagaaaa ccgtcttcac cgtcttcatg ctagctgcct
661 ctggcatctg catcatcctc aatgtggccg aggtggtgta cctcatcatc cgggcctgtg
721 cccgccgagc ccagcgccgc tccaatccac cttcccgcaa gggctcgggc ttcggccacc
781 gcctctcacc tgaatacaag cagaatgaga tcaacaagct gctgagtgag caggatggct
841 ccctgaaaga catactgcgc cgcagccctg gcaccggggc tgggctggct gaaaagagcg
901 accgctgctc ggcctgctga tgccacatac caggcaacct cccatcccac ccccgaccct
961 gccctgggcg agcccctcct tctcccctgc cggtgcacag gcctctgcct gctggggatt
1021actcgatcaa aaccttcctt ccctggctac ttcccttcct cccggggcct tccttttgag
1081gagctggagg ggtggggagc tagaggccac ctatgccagt gctcaaggtt actgggagtg
1141tgggctgccc ttgttgcctg cacccttccc tcttccctct ccctctctct gggaccactg
1201ggtacaagag atgggatgct ccgacagcgt ctccaattat gaaactaatc ttaaccctgt
1261gctgtcagat accctgtttc tggagtcaca tcagtgagga gggatgtggg taagaggagc
1321agagggcagg ggtgctgtgg acatgtgggt ggagaaggga gggtggccag cactagtaaa
1381ggaggaatag tgcttgctgg ccacaaggaa aaggaggagg tgtctggggt gagggagtta
1441gggagagaga agcaggcaga taagttggag caggggttgg tcaaggccac ctctgcctct
1501agtccccaag gcctctctct gcctgaaatg ttacacatta aacaggattt tacagcaaaa
1561aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa//
人类Cx 26，β2(SEQ ID NO：22)
LOCUS  NM_0040042263bp mRNA直链PRI 28-OCT-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，β2，26kDa(连接蛋白26)(GJB2)，mRNA。
1   cggagcccct cggcggcgcc cggcccagga cccgcctagg agcgcaggag ccccagcgca
61  gagaccccaa cgccgagacc cccgccccgg ccccgccgcg cttcctcccg acgcagagca
121 aaccgcccag agtagaagat ggattggggc acgctgcaga cgatcctggg gggtgtgaac
181 aaacactcca ccagcattgg aaagatctgg ctcaccgtcc tcttcatttt tcgcattatg
241 atcctcgttg tggctgcaaa ggaggtgtgg ggagatgagc aggccgactt tgtctgcaac
301 accctgcagc caggctgcaa gaacgtgtgc tacgatcact acttccccat ctcccacatc
361 cggctatggg ccctgcagct gatcttcgtg tccacgccag cgctcctagt ggccatgcac
421 gtggcctacc ggagacatga gaagaagagg aagttcatca agggggagat aaagagtgaa
481 tttaaggaca tcgaggagat caaaacccag aaggtccgca tcgaaggctc cctgtggtgg
541 acctacacaa gcagcatctt cttccgggtc atcttcgaag ccgccttcat gtacgtcttc
601 tatgtcatgt acgacggctt ctccatgcag cggctggtga agtgcaacgc ctggccttgt
661 cccaacactg tggactgctt tgtgtcccgg cccacggaga agactgtctt cacagtgttc
721 atgattgcag tgtctggaat ttgcatcctg ctgaatgtca ctgaattgtg ttatttgcta
781 attagatatt gttctgggaa gtcaaaaaag ccagtttaac gcattgccca gttgttagat
841 taagaaatag acagcatgag agggatgagg caacccgtgc tcagctgtca aggctcagtc
901 gccagcattt cccaacacaa agattctgac cttaaatgca accatttgaa acccctgtag
961 gcctcaggtg aaactccaga tgccacaatg gagctctgct cccctaaagc ctcaaaacaa
1021aggcctaatt ctatgcctgt cttaattttc tttcacttaa gttagttcca ctgagacccc
1081aggctgttag gggttattgg tgtaaggtac tttcatattt taaacagagg atatcggcat
1141ttgtttcttt ctctgaggac aagagaaaaa agccaggttc cacagaggac acagagaagg
1201tttgggtgtc ctcctggggt tctttttgcc aactttcccc acgttaaagg tgaacattgg
1261ttctttcatt tgctttggaa gttttaatct ctaacagtgg acaaagttac cagtgcctta
1321aactctgtta cactttttgg aagtgaaaac tttgtagtat gataggttat tttgatgtaa
1381agatgttctg gataccatta tatgttcccc ctgtttcaga ggctcagatt gtaatatgta
1441aatggtatgt cattcgctac tatgatttaa tttgaaatat ggtcttttgg ttatgaatac
1501tttgcagcac agctgagagg ctgtctgttg tattcattgt ggtcatagca cctaacaaca
1561ttgtagcctc aatcgagtga gacagactag aagttcctag tgatggctta tgatagcaaa
1621tggcctcatg tcaaatattt agatgtaatt ttgtgtaaga aatacagact ggatgtacca
1681ccaactacta cctgtaatga caggcctgtc caacacatct cccttttcca tgactgtggt
1741agccagcatc ggaaagaacg ctgatttaaa gaggtcgctt gggaatttta ttgacacagt
1801accatttaat ggggaggaca aaatggggca ggggagggag aagtttctgt cgttaaaaac
1861agatttggaa agactggact ctaaattctg ttgattaaag atgagctttg tctacttcaa
1921aagtttgttt gcttacccct tcagcctcca attttttaag tgaaaatata actaataaca
1981tgtgaaaaga atagaagcta aggtttagat aaatattgag cagatctata ggaagattga
2041acctgaatat tgccattatg cttgacatgg tttccaaaaa atggtactcc acatacttca
2101gtgagggtaa gtattttcct gttgtcaaga atagcattgt aaaagcattt tgtaataata
2161aagaatagct ttaatgatat gcttgtaact aaaataattt tgtaatgtat caaatacatt
2221taaaacatta aaatataatc tctataataa aaaaaaaaaa aaa∥
人类Cx 31，β3(SEQ ID NO：23)
LOCUS NM_0240092220bp mRNA直链PRI 28-OCT-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，β3，31kDa(连接蛋白31)(GJB3)，转录物变异体1，mRNA。
1   gaacttcttt cctggcacag gactcactgt gccccttccc gctgtgggta caaggtctgc
61  cccccacccc agctctccaa agcccaccgg cctccctgga ggccgaggtc gacggcccgt
121 cgcaccggga gggggggctc ccaggggtgc cccacgcacg gtcaaggtcc cgcgccaagc
181 ggggaccggg ctgggccgga agcgggcacg gtactcgcgg caaactagcg tgggcgagtc
241 ctgattgcag tcggacctgc cgccgcggca cttaacagtt tgcagagtgc ttcccgcccc
301 tgatctcatt ggagccttcg gacagcccag cccatggcca ccgatgcccc catttcacgc
361 ctgaggaagc ggaggctcag acgggccacc agcccctccg gaggctggcc cgggagcgcc
421 tggcagcgtc gggtctagga gccggctccc tcctgctccc tcctccgcgc cgcccggggt
481 gtgcccgccg tctgtgtgca ccactgctga gcccagctcc ggcgccctcg cctctgctgt
541 gggccccggg gacgcggggt caggccaccg cgttggccag gccgctgcag gtaggcacgg
601 cccccaccag gcgccatgga ctggaagaca ctccaggccc tactgagcgg tgtgaacaag
661 tactccacag cgttcgggcg catctggctg tccgtggtgt tcgtcttccg ggtgctggta
721 tacgtggtgg ctgcagagcg cgtgtggggg gatgagcaga aggactttga ctgcaacacc
781 aagcagcccg gctgcaccaa cgtctgctac gacaactact tccccatctc caacatccgc
841 ctctgggccc tgcagctcat cttcgtcaca tgcccctcgc tgctggtcat cctgcacgtg
901 gcctaccgtg aggagcggga gcgccggcac cgccagaaac acggggacca gtgcgccaag
961 ctgtacgaca acgcaggcaa gaagcacgga ggcctgtggt ggacctacct gttcagcctc
1021atcttcaagc tcatcattga gttcctcttc ctctacctgc tgcacactct ctggcatggc
1081ttcaatatgc cgcgcctggt gcagtgtgcc aacgtggccc cctgccccaa catcgtggac
1141tgctacattg cccgacctac cgagaagaaa atcttcacct acttcatggt gggcgcctcc
1201gccgtctgca tcgtactcac catctgtgag ctctgctacc tcatctgcca cagggtcctg
1261cgaggcctgc acaaggacaa gcctcgaggg ggttgcagcc cctcgtcctc cgccagccga
1321gcttccacct gccgctgcca ccacaagctg gtggaggctg gggaggtgga tccagaccca
1381ggcaataaca agctgcaggc ttcagcaccc aacctgaccc ccatctgacc acagggcagg
1441ggtggggcaa catgcgggct gccaatggga catgcagggc ggtgtggcag gtggagaggt
1501cctacagggg ctgagtgacc ccactctgag ttcactaagt tatgcaactt tcgttttggc
1561agatattttt tgacactggg aactgggctg tctagccggg tataggtaac ccacaggccc
1621agtgccagcc ctcaaaggac atagactttg aaacaagcga attaactatc tacgctgcct
1681gcaaggggcc acttagggca ctgctagcag ggcttcaacc aggaagggat caacccagga
1741agggatgatc aggagaggct tccctgagga cataatgtgt aagagaggtg agaagtgctc
1801ccaagcagac acaacagcag cacagaggtc tggaggccac acaaaaagtg atgctcgccc
1861tgggctagcc tcagcagacc taaggcatct ctactccctc cagaggagcc gcccagattc
1921ctgcagtgga gaggaggtct tccagcagca gcaggtctgg agggctgaga atgaacctga
1981ctagaggttc tggagatacc cagaggtccc ccaggtcatc acttggctca gtggaagccc
2041tctttcccca aatcctactc cctcagcctc aggcagtggt gctcccatct tcctccccac
2101aactgtgctc aggctggtgc cagcctttca gaccctgctc ccagggactt gggtggatgc
2161gctgatagaa catcctcaag acagtttcct tgaaatcaat aaatactgtg ttttataaaa∥
人类Cx 30.3，β4(SEQ ID NO：24)
LOCUS NM 1532121243bp mRNA直链PRI 27-OCT-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，β4，(连接蛋白30.3)(GJB4)，mRNA。
1   caaggctccc aaggcctgag tgggcaggta gcacccaggt atagaccttc cacgtgcagc
61  acccaggaca cagccagcat gaactgggca tttctgcagg gcctgctgag tggcgtgaac
121 aagtactcca cagtgctgag ccgcatctgg ctgtctgtgg tgttcatctt tcgtgtgctg
181 gtgtacgtgg tggcagcgga ggaggtgtgg gacgatgagc agaaggactt tgtctgcaac
241 accaagcagc ccggctgccc caacgtctgc tatgacgagt tcttccccgt gtcccacgtg
301 cgcctctggg ccctacagct catcctggtc acgtgcccct cactgctcgt ggtcatgcac
361 gtggcctacc gcgaggaacg cgagcgcaag caccacctga aacacgggcc caatgccccg
421 tccctgtacg acaacctgag caagaagcgg ggcggactgt ggtggacgta cttgctgagc
481 ctcatcttca aggccgccgt ggatgctggc ttcctctata tcttccaccg cctctacaag
541 gattatgaca tgccccgcgt ggtggcctgc tccgtggagc cttgccccca cactgtggac
601 tgttacatct cccggcccac ggagaagaag gtcttcacct acttcatggt gaccacagct
661 gccatctgca tcctgctcaa cctcagtgaa gtcttctacc tggtgggcaa gaggtgcatg
721 gagatcttcg gccccaggca ccggcggcct cggtgccggg aatgcctacc cgatacgtgc
781 ccaccatatg tcctctccca gggagggcac cctgaggatg ggaactctgt cctaatgaag
841 gctgghycgg ccccahygga tgcaghyggg tatccataac ctgcgagatc agcagataag
901 atcaacaggt cccccccaca tgaggccacc caggaaaaaa ggcaggggca gtggcatcct
961 tgccgtagca gggtggtgag gagggtggct gtgggggctc aggaagctcg cccaggggcc
1021aatgtgggag gttgggggta gtttggtccc tgggtcctga gcctcagggg agggaggttg
1081atagctactg gggattttgt atatggcaac agtatatgtc aaacctctta ttaaatatga
1141ttttcccagt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
1201aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa∥
人类Cx 31.1，β5(SEQ ID NO：25)
LOCUS NM_0052681299bp mRNA直链PRI 23-AUG-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，β5，(连接蛋白31.1)(GJB5)，mRNA。
1   atgaaattca agctgcttgc tgagtcctat tgccggctgc tgggagccag gagagccctg
61  aggagtagtc actcagtagc agctgacgcg tgggtccacc atgaactgga gtatctttga
121 gggactcctg agtggggtca acaagtactc cacagccttt gggcgcatct ggctgtctct
181 ggtcttcatc ttccgcgtgc tggtgtacct ggtgacggcc gagcgtgtgt ggagtgatga
241 ccacaaggac ttcgactgca atactcgcca gcccggctgc tccaacgtct gctttgatga
301 gttcttccct gtgtcccatg tgcgcctctg ggccctgcag cttatcctgg tgacatgccc
361 ctcactgctc gtggtcatgc acgtggccta ccgggaggtt caggagaaga ggcaccgaga
421 agcccatggg gagaacagtg ggcgcctcta cctgaacccc ggcaagaagc ggggtgggct
481 ctggtggaca tatgtctgca gcctagtgtt caaggcgagc gtggacatcg cctttctcta
541 tgtgttccac tcattctacc ccaaatatat cctccctcct gtggtcaagt gccacgcaga
601 tccatgtccc aatatagtgg actgcttcat ctccaagccc tcagagaaga acattttcac
661 cctcttcatg gtggccacag ctgccatctg catcctgctc aacctcgtgg agctcatcta
721 cctggtgagc aagagatgcc acgagtgcct ggcagcaagg aaagctcaag ccatgtgcac
781 aggtcatcac ccccacggta ccacctcttc ctgcaaacaa gacgacctcc tttcgggtga
841 cctcatcttt ctgggctcag acagtcatcc tcctctctta ccagaccgcc cccgagacca
901 tgtgaagaaa accatcttgt gaggggctgc ctggactggt ctggcaggtt gggcctggat
961 ggggaggctc tagcatctct cataggtgca acctgagagt gggggagcta agccatgagg
1021taggggcagg caagagagag gattcagacg ctctgggagc cagttcctag tcctcaactc
1081cagccacctg ccccagctcg acggcactgg gccagttccc cctctgctct gcagctcggt
1141ttccttttct agaatggaaa tagtgagggc caatgcccag ggttggaggg aggagggcgt
1201tcatagaaga acacacatgc gggcaccttc atcgtgtgtg gcccactgtc agaacttaat
1261aaaagtcaac tcatttgctg gaaaaaaaaa aaaaaaaaa∥
人类Cx 30，β6(SEQ ID NO：26)
LOCUS BC0389341805bp mRNA直链PRI 30-JUN-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，β6(连接蛋白30)，mRNA(cDNA克隆MGC：45195图像：5196769)，完全cds。
1   ctgggaagac gctggtcagt tcacctgccc cactggttgt tttttaaaca aattctgata
61  caggcgacat cctcactgac cgagcaaaga ttgacattcg tatcatcact gtgcaccatt
121 ggcttctagg cactccagtg gggtaggaga aggaggtctg aaaccctcgc agagggatct
181 tgccctcatt ctttgggtct gaaacactgg cagtcgttgg aaacaggact cagggataaa
241 ccagcgcaat ggattggggg acgctgcaca ctttcatcgg gggtgtcaac aaacactcca
301 ccagcatcgg gaaggtgtgg atcacagtca tctttatttt ccgagtcatg atcctcgtgg
361 tggctgccca ggaagtgtgg ggtgacgagc aagaggactt cgtctgcaac acactgcaac
421 cgggatgcaa aaatgtgtgc tatgaccact ttttcccggt gtcccacatc cggctgtggg
481 ccctccagct gatcttcgtc tccaccccag cgctgctggt ggccatgcat gtggcctact
541 acaggcacga aaccactcgc aagttcaggc gaggagagaa gaggaatgat ttcaaagaca
601 tagaggacat taaaaagcag aaggttcgga tagaggggtc gctgtggtgg acgtacacca
661 gcagcatctt tttccgaatc atctttgaag cagcctttat gtatgtgttt tacttccttt
721 acaatgggta ccacctgccc tgggtgttga aatgtgggat tgacccctgc cccaaccttg
781 ttgactgctt tatttctagg ccaacagaga agaccgtgtt taccattttt atgatttctg
841 cgtctgtgat ttgcatgctg cttaacgtgg cagagttgtg ctacctgctg ctgaaagtgt
901 gttttaggag atcaaagaga gcacagacgc aaaaaaatca ccccaatcat gccctaaagg
961 agagtaagca gaatgaaatg aatgagctga tttcagatag tggtcaaaat gcaatcacag
1021gtttcccaag ctaaacattt caaggtaaaa tgtagctgcg tcataaggag acttctgtct
1081tctccagaag gcaataccaa cctgaaagtt ccttctgtag cctgaagagt ttgtaaatga
1141ctttcataat aaatagacac ttgagttaac tttttgtagg atacttgctc cattcataca
1201caacgtaatc aaatatgtgg tccatctctg aaaacaagag actgcttgac aaaggagcat
1261tgcagtcact ttgacaggtt ccttttaagt ggactctctg acaaagtggg tactttctga
1321aaatttatat aactgttgtt gataaggaac atttatccag gaattgatac ttttattagg
1381aaaagatatt tttataggct tggatgtttt tagttctgac tttgaattta tataaagtat
1441ttttataatg actggtcttc cttacctgga aaaacatgcg atgttagttt tagaattaca
1501ccacaagtat ctaaatttgg aacttacaaa gggtctatct tgtaaatatt gttttgcatt
1561gtctgttggc aaatttgtga actgtcatga tacgcttaag gtggaaagtg ttcattgcac
1621aatatatttt tactgctttc tgaatgaga cggaacagtg tggaagcaga aggctttttt
1681aactcatccg tttgccaatc attgcaaaca actgaaatgt ggatgtgatt gcctcaataa
1741agctcgtccc cattgcttaa gccttcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
1801aaaaa//
人类Cx 31.9，c1(SEQ ID NO：27)
LOCUS NM_1522192094bp mRNA直链PRI 23-AUG-2004
DEFINITION人类间隙连接蛋白质，chi1，31.9kDa(连接蛋白31.9)(GJC1)，mRNA。
1   aaatgaaaga gggagcagga ggcgccggtc ccagccacct cccaaggtcc ctggctcagc
61  tctgacaccc cagtcccggc cccagggtga gtggggttgg gtggcggttt aggggcacca
121 ggggcgtgtg gggacctgtg taagtgtggg gtggggagga tctcaggaga tgtggaggct
181 ggaggcacag gaggccaggg aggagggaga agcctggtgc cgcactccca ccacgctggg
241 gtaggagggc agggacacct ccgacaaagg accctgtgag agttatgaaa gcggagttgc
301 ctctgtacca gccccccacc ctgagaggag ttcactgcag taaaaatggt gagagaaatg
361 gtgggccaag aaaggagtgg tctcgctgcc tctgccactc ccactcctcc catgggcacc
421 aaattgggtc tagcgtctcg ggttcgaggc tccactcttc ccacagcatc cttgacagct
481 aagggcaccg ctgggtttcc gcttccgaaa ccaggcaagt caggggctgg tccagctgat
541 ctccaaggtc cttcctaaga atctgggatc tggaggatcc cagggtcgaa cggagacggc
601 tcagggggtg cggctaaaat gcaaatgggg gatcctcccc agcacccatc ggtcccaaag
661 agaaggtaac ccatagctga gcgtcgcctg ctcccctcgg gccctcccgt ggccctccgt
721 ttcatactgg tctcatcgct aaacccgggc ctctcctacc tcacgactca ccctgaagtc
781 agagaaggtc caacggaccc caccccgata ggcttggaag gggcaggggt ccctgacttg
841 ccccatcccc tgactccccg ccccgcgtcc ccagcgccat gggggagtgg gcgttcctgg
901 gctcgctgct ggacgccgtg cagctgcagt cgccgctcgt gggccgcctc tggctggtgg
961 tcatgctgat cttccgcatc ctggtgctgg ccacggtggg cggcgccgtg ttcgaggacg
1021agcaagagga gttcgtgtgc aacacgctgc agccgggctg tcgccagacc tgctacgacc
1081gcgccttccc ggtctcccac taccgcttct ggctcttcca catcctgctg ctctcggcgc
1141ccccggtgct gttcgtcgtc tactccatgc accgggcagg caaggaggcg ggcggcgctg
1201aggcggcggc gcagtgcgcc cccggactgc ccgaggccca gtgcgcgccg tgcgccctgc
1261gcgcccgccg cgcgcgccgc tgctacctgc tgagcgtggc gctgcgcctg ctggccgagc
1321tgaccttcct gggcggccag gcgctgctct acggcttccg cgtggccccg cacttcgcgt
1381gcgccggtcc gccctgcccg cacacggtcg actgcttcgt gagccggccc accgagaaga
1441ccgtcttcgt gctcttctat ttcgcggtgg ggctgctgtc ggcgctgctc agcgtagccg
1501agctgggcca cctgctctgg aagggccgcc cgcgcgccgg ggagcgtgac aaccgctgca
1561accgtgcaca cgaagaggcg cagaagctgc tcccgccgcc gccgccgcca cctattgttg
1621tcacttggga agaaaacaga caccttcaag gagagggctc ccctggtagc ccccacccca
1681agacagagct ggatgcccct cgcttccgta gggaaagcac ttctcctgca ggatggcatt
1741gctctctccc cttccatggc acgtagtatg tgctcagtaa atatgtgttg gatgagaaac
1801tgaaggtgtc cccaggccta caccactgcc atgcccgaac actatccatg ctatggtggg
1861caccatctct ctgatgacag ttctgtgtcc acaacccaga cccctccaca caaacccaga
1921tggggctgtg ccgctgtttt ccagatgtat tcattcaaca aatatttgta gggtacctac
1981tgtgtgtcag aagatgttca agatcagcat catccgatgg aaatagcata tgagccatgt
2041atgtagtttc aagtttttca ttagccgcat taaaaaagta aaaggaaaca aatg//
人类Cx 29/31.3，e1(SEQ ID NO：28)
LOCUS AF503615840bp mRNA直链PRI07-AUG-2002
DEFINITION人类连接蛋白31.3mRNA，完全cds。
1   atgtgtggca ggttcctgcg gcggctgctg gcggaggaga gccggcgctc cacccccgtg
61  gggcgcctct tgcttcccgt gctcctggga ttccgccttg tgctgctggc tgccagtggg
121 cctggagtct atggtgatga gcagagtgaa ttcgtgtgtc acacccagca gccgggctgc
181 aaggctgcct gcttcgatgc cttccacccc ctctccccgc tgcgtttctg ggtcttccag
241 gtcatcttgg tggctgtacc cagcgccctc tatatgggtt tcactctgta tcacgtgatc
301 tggcactggg aattatcagg aaaggggaag gaggaggaga ccctgatcca gggacgggag
361 ggcaacacag atgtcccagg ggctggaagc ctcaggctgc tctgggctta tgtggctcag
421 ctgggggctc ggcttgtcct ggagggggca gccctggggt tgcagtacca cctgtatggg
481 ttccagatgc ccagctcctt tgcatgtcgc cgagaacctt gccttggtag tataacctgc
541 aatctgtccc gcccctctga gaagaccatt ttcctaaaga ccatgtttgg agtcagcggt
601 ttctgtctct tgtttacttt tttggagctt gtgcttctgg gtttggggag atggtggagg
661 acctggaagc acaaatcttc ctcttctaaa tacttcctaa cttcagagag caccagaaga
721 cacaagaaag caaccgatag cctcccagtg gtggaaacca aagagcaatt tcaagaagca
781 gttccaggaa gaagcttagc ccaggaaaaa caaagaccag ttggacccag agatgcctga∥
人类Cx 25(SEQ ID NO：29)
LOCUS HSA414563672bp DNA直链PRI30-NOV-2001DEFINITION用于连接蛋白25的人类CX25基因。
1   atgagttgga tgttcctcag agatctcctg agtggagtaa ataaatactc cactgggact
61  ggatggattt ggctggctgt cgtgtttgtc ttccgtttgc tggtctacat ggtggcagca
121 gagcacatgt ggaaagatga gcagaaagag tttgagtgca acagtagaca gcccggttgc
181 aaaaatgtgt gttttgatga cttcttcccc atttcccaag tcagactttg ggccttacaa
241 ctgataatgg tctccacacc ttcacttctg gtggttttac atgtagccta tcatgagggt
301 agagagaaaa ggcacagaaa gaaactctat gtcagcccag gtacaatgga tgggggccta
361 tggtacgctt atcttatcag cctcattgtt aaaactggtt ttgaaattgg cttccttgtt
421 ttattttata agctatatga tggctttagt gttccctacc ttataaagtg tgatttgaag
481 ccttgtccca acactgtgga ctgcttcatc tccaaaccca ctgagaagac gatcttcatc
541 ctcttcttgg tcatcacctc atgcttgtgt attgtgttga atttcattga actgagtttt
601 ttggttctca agtgctttat taagtgctgt ctccaaaaat atttaaaaaa acctcaagtc
661 ctcagtgtgt ga//
人类Cx 40.1(SEQ ID NO：30)
LOCUS HSA4145641113bp mRNA直链PRI 30-NOV-2001DEFINITION用于连接蛋白40.1的人类mRNA(CX40.1基因)。
1   atggaaggcg tggacttgct agggtttctc atcatcacat taaactgcaa cgtgaccatg
61  gtaggaaagc tctggttcgt cctcacgatg ctgctgcgga tgctggtgat tgtcttggcg
121 gggcgacccg tctaccagga cgagcaggag aggtttgtct gcaacacgct gcagccggga
181 tgcgccaatg tttgctacga cgtcttctcc cccgtgtctc acctgcggtt ctggctgatc
241 cagggcgtgt gcgtcctcct cccctccgcc gtcttcagcg tctatgtcct gcaccgagga
301 gccacgctcg ccgcgctggg cccccgccgc tgccccgacc cccgggagcc ggcctccggg
361 cagagacgct gcccgcggcc attcggggag cgcggcggcc tccaggtgcc cgacttttcg
421 gccggctaca tcatccacct cctcctccgg accctgctgg aggcagcctt cggggccttg
481 cactactttc tctttggatt cctggccccg aagaagttcc cttgcacgcg ccctccgtgc
541 acgggcgtgg tggactgcta cgtgtcgcgg cccacagaga agtccctgct gatgctgttc
601 ctctgggcgg tcagcgcgct gtcttttctg ctgggcctcg ccgacctggt ctgcagcctg
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721 ggagcctcag gccacgcgga gggacgccgg actgacgagg agggtgggcg ggaggaagag
781 ggggcaccgg cgcccccggg tgcacgcgcc ggaggggagg gggctggcag ccccaggcgt
841 acatccaggg tgtcagggca cacgaagatt ccggatgagg atgagagtga ggtgacatcc
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961 gaccccaggg gctcaggatc cgaggagcag ccctcagcag cccccagccg cctggccgcg
1021cccccttcct gcagcagcct gcagccccct gacccgcctg ccagctccag tggtgctccc
1081cacctgagag ccaggaagtc tgagtgggtg tga∥
人类Cx 62(SEQ ID NO：31)
LOCUS HSA4145651632bp DNA直链PRI30-NOV-2001DEFINITION用于连接蛋白62的人类CX62基因。
1   atgggggact ggaacttatt gggtggcatc ctagaggaag ttcactccca ctcaaccata
61  gtggggaaaa tctggctgac catcctcttc atcttccgaa tgctggtact tcgtgtggct
121 gctgaggatg tctgggatga tgaacagtca gcatttgcct gcaacacccg gcagccaggt
181 tgcaacaata tctgttatga tgatgcattc cctatctctt tgatcaggtt ctgggtttta
241 cagatcatct ttgtgtcttc tccttctttg gtctatatgg gccatgcact ttataggctc
301 agggcctttg agaaagacag gcagaggaaa aagtcacacc ttagagccca gatggagaat
361 ccagatcttg acttggagga gcagcaaaga atagataggg aactgaggag gttagaggag
421 cagaagagga tccataaagt ccctctgaaa ggatgtctgc tgcgtactta tgtcttacac
481 atcttgacca gatctgtgct ggaagtagga ttcatgatag gccaatatat tctctatggg
541 tttcaaatgc acccccttta caaatgcact caacctcctt gccccaatgc ggtggattgc
601 tttgtatcca ggcccactga gaagacaatt ttcatgcttt ttatgcacag cattgcagcc
661 atttccttgt tactcaatat actggaaata tttcatctag gcatcagaaa aattatgagg
721 acactttata agaaatccag cagtgagggc attgaggatg aaacaggccc tccattccat
781 ttgaagaaat attctgtggc ccagcagtgt atgatttgct cttcattgcc tgaaagaatc
841 tctccacttc aagctaacaa tcaacagcaa gtcattcgag ttaatgtgcc aaagtctaaa
901 accatgtggc aaatcccaca gccaaggcaa cttgaagtag acccttccaa tgggaaaaag
961 gactggtctg agaaggatca gcatagcgga cagctccatg ttcacagccc gtgtccctgg
1021gctggcagtg ctggaaatca gcacctggga cagcaatcag accattcctc atttggcctg
1081cagaatacaa tgtctcagtc ctggctaggtacaactacgg ctcctagaaa ctgtccatcc
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1561gatggagggg gagattattt atggagagat aaaattattc attcgataca ttcagttaaa
1621ttcaattcat aa∥
本发明的各个方面现在将参照以下实验部分来加以描述，其应理解为仅通过说明的方式来提供而不构成对本发明范围的限制。
以下实施例是通过说明的方式而不是通过限制的方式给出。
                           实例1：体内分析
材料和方法
激光治疗
雌性威斯塔大鼠(Wistar rat)(d32-34)在符合关于研究中动物的使用的ARVO决议的条件下进行饲养。通过将1∶1的HypnormTM(10mg/ml，Jansen Pharmaceutica，Belgium)和Hypnovel(5mg/ml，Roche products Ltd，New Zealand)混合物按0.083ml/100g体重的剂量给予动物腹膜中而将动物麻醉。
利用Technolas 217Z准分子激光器(Bausch &LombSurgical，USA)通过完整上皮而进行准分子激光治疗。将眼集中在瞳孔的中部并且在具有以下参数下进行切除：治疗区域为2.5mm的直径和70μm的深度。这导致较小厚度的前间质和整个上皮的去除。
准分子激光治疗优选用来产生可重复的损伤以及考察连接蛋白43AS ODN对损伤后角膜重建以及工程的影响。
在手术以后，将所有动物放入单个笼子并对任何不适进行密切监控。利用狭缝灯活组织显微镜和/或狭缝扫描体内共焦显微镜来实现术后体内评价。
狭缝扫描体内共焦显微镜方法
在角膜激光治疗之前、以及以后，利用Confoscan 2(FortuneTchnologies America，USA)狭缝扫描体内共焦显微镜来临床观察每个动物。Confoscan 2是狭缝扫描技术的变体，具有在采集时对图像直接进行数字化的独特优点。将动物进行麻醉并将它们每一个放到专门设计的平台上，调节该平台处于在采集头前面的体内共焦显微镜物镜的水平。
狭缝扫描体内共焦显微镜允许通过整个角膜厚度在不同程度光学切开活的角膜。检查从内皮开始并且前-后部分的数量依赖于定型设置。狭缝扫描技术利用沿着垂直于检查区域的轴前后移动的物镜。简单地说，硬件包括卤素灯(100W/12V)、两个狭缝、两个镜筒透镜、前物镜、以及高灵敏度数字(CCD)照相机。在扫描之前，将一滴Viscotears(CIBA Vision Ophthalmics)放到物镜末端作为沉浸物质。在扫描期间，动物的眼睛保持敝开的并定向，以便角膜面一直垂直于放大透镜(40x，N.A.0.75)的光轴。图像采集时间约14秒钟。在所有时间接触眼的是凝胶而不是物镜。对于大鼠角膜，每次检查获得多达250张连续数字图像，并且直接保存到硬盘驱动器。采集参数在初始实验过程中加以调节并且在所有后续实验中保持不变。它们设定如下：光强度下降到通常用于人类患者的强度的一半，使用了四个通道(passes)(一个通道看作是完全的往复运动)，并且选择400μm的工作距离。对于大鼠角膜，通过瞳孔的清晰显象有利于共轴性，瞳孔显象提供了极好的拓扑(topographical)可重复性。
体内共焦图像
所有用狭缝扫描体内共焦显微镜采集的图像都保存在硬盘驱动器上并且接着通过NAVIS专利软件(Confoscan 2，Nidek Co Ltd.)进行分析。
间质动力学是根据体视学原理加以评价。在前和后基质位置记录细胞计数。主要体视学组分由体内共焦显微镜本身来提供，因为它起光学析象管(借助空间中相等概率粒子进行采样的探测器)的作用。实际上，体内共焦显微镜提供了指定体积的薄光片，其每一个是切开的组织样品。因此，计数间质细胞包括选择一对帧(由体内共焦显微镜记录的连续照片)，一个帧具有在焦点的粒子(间质细胞)，并且共同帧示出散焦但可识别的同样粒子的图像(光阴影)。细胞的数量(n)从确定的面积A(μm2)内最清晰的帧加以记录。
也记录在两个帧之间的距离d(μm)。因此每单位体积(V)中细胞的数量等于：V＝细胞数(n)/d(μm)×A(μm2)。
体外共焦图像
针对不同目的用不同标记对合适的角膜切片进行免疫组织化学染色。利用核染色剂Hoechst 33258进行的染色用来估计在中心或周边角膜的上皮和间质细胞的数量。为此，利用AnalySIS3.2软件(Soft Imaging System，USA)，感兴趣的面积首先用手画到角膜合适区域的TIFF文档图像上并且面积的数值由软件自动给出。利用手工计数选项，然后在该面积内进行细胞计数并用每单位面积表示。
反义化合物应用
在光折射性角膜切削术以后，利用磷酸缓冲盐溶液(分子级水)中的30％普卢兰尼克酸凝胶(BASF Corp)将未修饰的α1连接蛋白(连接蛋白43)特异反义ODN传递到麻醉的大鼠的结膜下。在利用FITC标记的预试验中，这种剂型表现出在眼前房中保持长达24小时(未示出)。
用于这些实验的反义分子是DB1(GTA ATT GCG GCA GGAGGA ATT GTT TCT GTC)(SEQ ID NO：65)。将FITC标记加到DB1ODN，利用共焦激光扫描显微镜观察，证实了探测器的细胞内穿透。
ODN以2μM最终浓度使用。
监控组织工程或重建效果
在反义应用之后，利用狭缝扫描体内共焦显微镜在激光手术2h、12h、24h、48h、72小时、1星期以及2星期后对角膜进行检查。对照大鼠仅接受激光手术。
表1概括了在每个时间点考察的角膜的数量。
表1用于体内跟踪的对照(C)和AS(ODN)处理的角膜的数量，其中利用狭缝扫描体内共焦显微术。
ODN＝AS ODN处理的眼(在激光手术后单次给药)
  手术(后)2小时内   术后12小时   术后24小时   术后48小时   术后72小时   术后1星期   术后2星期
  眼的数量(n)   18C   10C   18C   10C   6C   4C   5C
  18ODN   10ODN   18ODN   6ODN   6ODN   4ODN   5ODN
对角膜的每个细胞层进行分析并且在对照和ODN处理的组之间比较细胞类型、数量以及外观。
上皮再形成：
用反义连接蛋白43ODN的处理促进上皮复原。在90％的ASODN处理的角膜中，在PRK激光手术后12小时内观察到对滑动上皮细胞，相比而言在对照中则没有(图1B)。在这个阶段，只有静态内皮细胞在30％对照角膜(图1A)中出现。在24小时以前在所有对照以及反义处理的角膜中观察到上皮细胞，但处理的72％对对照的61％表现为活性滑动细胞(actively sliding cell)。这表明上皮再形成在连接蛋白43特异AS ODN处理的角膜中比在对照中进行得更快。
间质细胞密度：
利用重复检测的成对的样品t检验，以对在每个组内的前和后基质中的细胞密度(作为时间的函数)参数进行比较，以及曼-惠非参数统计试验，以在所选时间点比较对照和ODN处理的角膜之间的间质细胞计数，仅在激光手术后24小时获得了统计显著的结果(表2)。在该时间点，在对照和ODN处理的组中在前角膜中的间质细胞密度相比于手术前的值显著增大(p值＜0.05)。在对照角膜的后间质中，间质细胞密度相比于手术前的值也增大(p值＜0.05)，虽然在ODN处理的角膜的后间质中，间质细胞密度并不是统计上显著不同于手术前的值(p值＞0.05)。当在两组之间在前和后间质处比较间质细胞密度时，ODN处理的角膜总是表现出比对照角膜更低的间质细胞密度(p值＜0.05)。这支持这样的观点：相比于对照角膜，在ODN处理的角膜中更少量的细胞涉及到间质重建或设计中。这是第一次报道，表明抗连接蛋白43ODN的使用可在手术部位减少细胞过多。体外组织化学分析(实施例II)表明这种细胞过多与诱导不希望的间质基质重建和瘢痕形成的成肌纤维细胞有关。
表2在光折射性角膜切削术之前和24小时以后，在对照和ASODN处理的角膜中的间质细胞计数。给出的细胞密度为平均值及标准偏差。
处理 时间点   前间质细胞计数(#细胞/mm3)   后间质细胞计数(#细胞/mm3)
  对照   手术前   36469±11122(n＝17)  33909±8753(n＝17)
  ODN   手术前   36769±10932(n＝17)  34382±8667(n＝14)
  对照   术后24小时   144643±60989(n＝17)  46901±26964(n＝17)
  ODN   术后24小时   93468±53548(n＝17)  33510±11350(n＝14)
                  实例II-体外分析
材料和方法
组织学：组织收集和固定
在光折射性角膜切削术以后在所选时间点终止适当数量的动物(威斯塔大鼠)，并且如在上述实验1中所述，将DB1抗连接蛋白43ODN给予麻醉的大鼠然后制备用于组织分析的角膜切片。对照大鼠仅接受激光手术。在包埋在Tissue-TekOCT(Sakura Finetek，USA)中并冷冻在液氮中之前，在Oxoid PBS中漂洗整个眼和对照组织。当需要(供一些抗体的使用)时，在低温切割(cryocut)后冷冻组织随后在冰冷(-20℃)丙酮中固定5min。
组织切割
用于低温切割的程序如下：冷冻的未固定组织块从-80℃保存中取出并在Leica CM 3050S低温控制器中放置约20min，以便平衡到和低温控制器相同的温度(即，-20℃)。当实现了组织平衡时，将样品装到具有Tissue TekOCT的样品盘上。切割12μm(用于H/E染色)或25μm厚(用于免疫标记)的切片并放到SuperfrostPlus载玻片上(Menzel-Gleser，Germany)。紧接着低温切割以后，将组织块放回到-80℃保存，并且支撑低温切片的载玻片或者马上使用或者保存在-80℃。切割是平行于眼的光轴进行。
苏木精/曙红(H/E)染色和核染色
将载玻片放在玻璃架中，以方便浸入一系列不同染色剂中。当将支架放入试剂中时摇动支架，以破坏表面张力并在每种溶液变化之间将它们排出。在进行Gill’s II苏木精/曙红染色之前，将保存在-80℃下的载玻片首先加热到室温保持1-2min，然后或者先固定载冰冷丙酮中和/或者马上在自来水中用快速浸渍进行水合。载玻片在Gill’s II苏木精中染色2min，然后在自来水中将过多染色剂漂洗掉。通过在Scott’s自来水代用品(STWS)中浸渍4sec就可实现染色区别。然后在30次连续浸渍1％曙红加以染色之前在连续自来水中漂洗1min。最后，将切片在自来水中迅速漂洗，通过95％、100％乙醇进行脱水，在二甲苯中去净，并用DPX封固剂(Sigma)进行安装。为了核复染色(平行于H/E或免疫组织化学分析)，使用了Hoechst 33258(Sigma)。在H/E染色切片上进行角膜厚独的测量。
免疫组织化学
对于连接蛋白43利用部位特异单克隆抗体对切片进行免疫标记，对于成肌纤维细胞则利用识别α平滑肌肌动蛋白的抗体，对于基膜沉淀则用抗层粘蛋白-1抗体。另外，抗波形蛋白抗体用来把间质角膜细胞和成肌纤维细胞区别开，而Ki-67抗体用来显示细胞增殖。
体外组织分析
结果表明，由准分子光切除术造成的损伤在术后24小时已经闭合(图2)。在两个组中都观察到间质通过在角膜外围以及中心的单核/多核和/或圆形、卵圆形细胞的典型侵入，是明显的是在术后24小时，但是用反义ODN处理的组比对照组表现出显著更少数量的这些细胞(图2A、B、C)。这相应于来自实施例I所示的体内共焦显微照片的结果。如在图2中所看到的，在激光所致损伤的部位，在对照角膜中上皮厚度是可变的(图A、B)，并且在对照角膜中在切除区域下方的间质(stoma)中(图A、B)以及在外围间质中(图C)，存在圆形细胞的广泛侵入(细胞过多)。在图B和图C中还观察到明显的间质水肿。在反义ODN处理的角膜中，上皮具有平均的厚度(图D、E)，并且在中心区中(图D)和外围间质中(图E)存在很少间质水肿的迹象。此外，在间质中，几乎没有圆形细胞存在。图2中的标度条(scales bars)表示20微米。
激光治疗后，用连接蛋白43ODN处理后的间质厚度的变化表示在表3中，其比较了在对照和ODN处理的角膜之间的间质厚度的变化。从适当组织染色的切片测量间质厚度。对ODN处理的组利用成对样品t检验所获得的数据的统计分析表明，在考察的所有三个时间点(术后24小时、48小时以及72小时)，中心间质厚度比术前值统计性地显著更薄(p值＜0.05)，并且外围间质厚度与术前值没有显著不同。相反，对照角膜在中心和外围角膜(其中与术前值相比间质厚度加倍)中都表现出显著的间质肿胀(水肿)(图2A、B、C)。
表3在准分子激光手术以后在对照和AS处理的角膜中间质厚度的变化。
未经受手术的角膜具有250μm的中心间质厚度，但准分子激光手术用来去除70μm的角膜组织(包括上皮和部分间质)。正常角膜上皮为50μm厚(平均)，因此激光手术去除了20μm的间质组织。因此，为了对伤后24小时、48小时、以及72小时的中心间质厚度和术前的中心间质厚度统计性地进行比较，使用了调整的厚度损失和中心术前250-20＝230μm的间质厚度。
处理 时间点   平均中心间质厚度(μm)   平均外围间质厚度(μm)
  标准(无手术)   术前   250(n＝6)*   110(n＝10)
对照ODN处理 术后24小时   318(n＝6)190(n＝5)   290(n＝6)132(n＝5)
对照ODN处理 术后48小时   307(n＝6)158(n＝5)   206(n＝5)105(n＝5)
对照ODN处理 术后72小时   292(n＝6)142(n＝5)   201(n＝6)99(n＝5)
连接蛋白43表达的降低与减少的间质侵入和减少的上皮增生有关
显微观察表明，与对照角膜相比，存在于ODN处理的角膜中的连接蛋白43具有降低的水平。图3示出了组合显微照片。上排示出了对照角膜，下排示出了反义ODN处理的角膜。在两组中24小时内、在边缘、外围以及中心区域都可看到间质由圆形细胞的典型侵入。但是，在ODN处理的角膜中展现出更小密度的圆形细胞。
在两组的边缘处，抗连接蛋白43均匀分布在整个间质中(3A、D)，但处理的组与对照(3B)相比，在外围(3E)中具有更少标记。通过这个阶段，在两组的上皮中，连接蛋白43水平已回到正常水平，但对照组呈现出伤痕样间质(3C)或增生(见以下图4)，而在反义处理的角膜中，可看到具有正常连接蛋白43水平的正常上皮(3F)。标度条A、D、E、F表示10微米；B和C表示20微米。
在这些图中，连接蛋白43表现为白色点状标记，其中细胞核呈现灰色。表示在图3中的结果说明，在用抗连接蛋白43ODN处理以后连接蛋白43蛋白质浓度降低，并且导致间质中更小程度的细胞补充。另外，相比于31％的对照角膜(术后24小时25％、术后48小时67％、术后72小时为0％)，只有7％的ODN处理的角膜(术后24小时0％、术后48小时0％、术后72小时20％)呈现出上皮增生的迹象。这是在H/E染色和Ki-67标记的切片上评定的。
成肌纤维细胞标记
用波形蛋白抗体的标记表明，与用AS ODN处理的角膜相比，在对照角膜的间质中增加的细胞数量不是未分化的角膜细胞源，因此用α平滑肌肌动蛋白抗体进行标记。这种标记表明对照角膜在手术部位的下面而且在周边外围间质中具有更高数量的成肌纤维细胞。这种成肌纤维细胞数量和受影响面积的增大在术后24小时是明显的，并持续到超过48以及72小时直到至少一个星期(表4)。
图4示出了术后1星期的成肌纤维细胞标记(抗α平滑肌肌动蛋白)。
图4A、B、以及C是对照；而图4D、E、以及F是反义处理的角膜。在伤后1星期以前，在对照角膜中，低至中等数目成肌纤维细胞存在于外围间质的前半部分(4A)，中等至致密水平存在于中部-外围(mid-peripheral)间质区(4B)，而在中心区的间质的前半部分看到中等水平(4C)。相反，在处理的角膜中，很少数目的成肌纤维细胞存在于外围(4D)或中部-外围(4E)的间质中，以及中等至低数目存在于中心间质(4F)中。在一些情形下，在中心间质中，成肌纤维细胞集中在正处于上皮下面的区域中(未示出)。
因此，在实施例1(细胞过多)以及上面的图2中看到的增加的细胞数量好像是起因于成肌纤维细胞分化和侵入。已知成肌纤维细胞对间质中的瘢痕组织沉积负责，具有减少的结晶沉淀和增多的伤口胶原III的分泌(Ahmadi A.J.and Jakobiec F.A.；2002；Int OphthalmolClin.Summer；42(3)：13-22)。
表4：在对照和反义ODN处理的角膜中用于成肌纤维细胞的α平滑肌肌动蛋白标记的概括。
  时间   位置   对照角膜   AS处理的角膜
术后24小时   外围   整个st中80％的D整个st中20％的M 前1/3st中100％的M
  中部-外围   整个st中100％的D   前1/3st中100％的M
中心 在前3/4st中100％的L   前1/3st中80％的Lepi下面20％的L
  术后48小时 外围   整个st中83％的M整个st中17％的L   前半部分st中40％的M前半部分st中60％的L
  中部-外围   整个st中50％的D整个st中50％的M   前半部分st中100％的D
中心   epi(增生)下17％的L整个st中50％的D整个st中33％的M   20％缺少前3/4st中80％的M
  术后72小时 外围   前半部分st中33％的L前半部分st中67％的M   前半部分st中40％的L前半部分st中60％的M
  中部-外围   整个st中33％的L整个st中67％的D   前半部分st中20％的L前半部分st中80％的M
中心   17％缺少整个st中50％的D整个st中33％的M   20％缺少前半部分st中40％的L前3/4st中40％的M
  术后1星期 外围   前半部分st中60％的M前半部分st中40％的L 前1/3st中100％的L
  中部-外围   整个st中60％的D整个st中40％的M 前半部分st中100％的L
中心   前半部分st中60％的M前半部分st中40％的L   前半部分st中60％的M前半部分st中20％的Lepi下面20％的M
成肌纤维细胞的数量量化为密集(D)、中等(M)、低(L)或缺少。百分数指的是在规定程度受影响的动物的比例。st＝间质、epi＝上皮。在对照和反义处理的角膜之间的显著区别以高亮黑体显示。
基膜沉淀
在光折射性角膜切削术以后，基膜沿着再生长上皮重新形成。
用抗体对层粘蛋白-1的标记表明，重新形成的基膜是不连续的并且具有不规则的上皮-间质附着(图5)。在24小时，对照在切除区域(图5A)的边缘处和更中心处(图5B)具有很少和/或不均匀层粘蛋白沉淀，而反义处理的角膜在这两个区(图5C、5D)表现出层粘蛋白的更规则的沉淀。在48小时，对照仍不具有连续的层粘蛋白沉积(图5E-切除区域的边缘；图5F-中心)并且非常不均匀(图5E)。相反，反义ODN处理的角膜在伤口边缘(图5G)和中心处(图5H)具有连续并且相对均匀的基膜。图5中所有标度条表示20微米。连接蛋白43反义处理的角膜在24小时内形成更密集的、更连续的基膜并具有较少的不规则性。
如图6所示，对层粘蛋白不规则性进行了量化。图6中黑色实体线表示层粘蛋白-1沉淀。对每个区，把偏差作为顶部和谷底之间的差来测量(图6A、B、C、D)。相比于反义ODN处理的角膜中的4.74微米的平均偏差，对照角膜具有6.98微米的平均偏差。在两组之间的差是统计显著的(p＜0.0001)。
            实施例III-外组织工程
将角膜放入体外器官培养模型中并且利用反义ODN调节特异连接蛋白。在这些实验中靶向两种连接蛋白，即连接蛋白43和连接蛋白31.1。连接蛋白43下调用来证实连接蛋白可在体外加以调节，并且靶向连接蛋白31.1，因为这种连接蛋白是在将要从角膜脱落的细胞中在角膜的外部上皮层中进行表达。设计的目标是通过减少连接蛋白31.1表达而加厚上皮组织。
材料与方法
用戊巴比妥钠或二氧化碳将30-34天老的威斯塔大鼠安乐死并将整个大鼠眼睛切开。将眼表面切开，用0.1mg/ml青霉素-链霉素消毒5分钟并在无菌PBS中进行漂洗。然后将整个眼睛转移到在60mm培养皿中的无菌支架上并使角膜朝上。固定眼睛并使角膜上皮暴露在空气-介质界面处并在34℃、加湿的5％CO2培养箱、无血清介质(Opti-MEM，Invitrogen)中培养长达48小时。将100μl的介质每8到12小时逐滴滴加到表面上使上皮变湿。介质水平保持在边缘结膜水平。
将反义寡聚物与冰上的30％(w/w)普卢兰尼克(Pluronic)F127凝胶(Sigma)混合直到最终的2μM浓度并将10μl施加到角膜上。
每个处理具有每个实验3到4个角膜的试样量。初步实验表明，我们的阳性对照、DB1的两次处理8小时对在我们的角膜培养物中的连接蛋白43蛋白质表达几乎没有作用。因此，将角膜培养24小时并且每8小时涂敷连接蛋白特异寡聚物。
如上述实验2中进行的，利用对连接蛋白43、26(对照)以及31.1的抗体进行免疫组织化学标记。也用上述的H/E将组织染色。用0.2μM碘化丙啶对核进行复染色。用莱卡(Leica)TCS 4D或TCSSP2共焦激光扫描显微镜收集图像，其中在实验组内保持电压和补偿设置(offset setting)以能够量化连接蛋白水平。为了量化，利用在TCS 4D上的质量形态投影选项(mass topographical projectionoption)的中心将通过3微米的四个光薄片加工成单个延伸焦距的光学图像。在256灰度级图像上利用NIH图像(Scion Corp.USA)在90-100象素密度取阈值之后量化连接蛋白标记。
与本文上述实施例1和2中所描述的准分子激光切除的角膜中的组织重建过程相比，在没有经过手术的角膜中，体外连接蛋白周转率(turnover rate)相对较低。但是，与对照相比，用反义ODN三次处理之后，连接蛋白水平降低超过50％(图7A、B示出了与对照相比，在AS ODN处理的角膜中连接蛋白43的降低)。当应用连接蛋白43特异性反义ODN时，连接蛋白26水平保持不变(表明连接蛋白水平的降低是特异的，而不是处理的副作用)。在这些图像中，连接蛋白43在上皮的底部两层中表现为更重的斑，连接蛋白26在2-6层中主要表现为更细的点状标记。连接蛋白31.1反义ODN降低了连接蛋白31.1的水平，但是初步结果也表明上皮厚度(层的数量)在24小时内增加(图7C、D)。利用H/E染色(图7D)和在免疫组织化学(图7C)标记的切片中可以观察到这种厚度的增加。
这项工作中所描述的结果形成用于组织工程(包括特定地在角膜的准分子激光手术之后)中连接蛋白特异反义ODN的应用基础，或用于组织工程和移植的体外器官培养。本文提供的实验结果证实了在准分子激光屈光性角膜切削术以后用连接蛋白43特异反义ODN的单一处理具有许多有用的用途，其中一部分将在下文进行描述。
连接蛋白特异反义ODN的给予可促进上皮细胞运动。在术后12小时，90％反义处理的角膜(但没有对照角膜)显示在激光所致损伤的部位存在滑动(sliding)上皮细胞。上皮细胞存在于30％的对照角膜中但处于静态/非滑动的。因此通过连接蛋白的直接细胞间通讯的调节可用来设计上皮细胞式样的变化。
连接蛋白特异性反义ODN的给予促进控制与术后24小时到48小时期间在激光所致损伤的部位的成肌纤维细胞分化有关的细胞过多。在这期间，比反义ODN处理角膜(39％)更多的对照角膜(63％)在整个间质中表现出强烈的细胞过多。因此直接细胞间通讯的调节可用来调节导致细胞外基质改善的细胞分化。
连接蛋白特异性反义ODN的给予可控制术后24小时到72小时期间在激光所致损伤的部位减少混浊的间质重建。在这期间，比反义处理角膜(39％)更多的对照角膜(64％)在整个间质中表现出强烈的混浊。
连接蛋白特异性反义ODN的给予可抑制重建早期期间的间质水肿。因此直接细胞间通讯的调节可改进激光手术的结果。
连接蛋白特异性反义ODN的给予可减少重建早期阶段的细胞增殖。因此直接细胞间通讯的调节可用来调节组织重建期间的细胞增殖。
连接蛋白特异性反义ODN的给予可减少78％的上皮增生(根据术后24小时到72小时进行评价)，使得能够设计均匀的上皮。
连接蛋白特异性反义ODN的给予可减少成肌纤维细胞活性长达术后1星期(以及角膜细胞的更早损失)。直接细胞间的调节使得能够更精确地控制手术重建期间的组织损伤，提供改进的结果可预见性以及更少的视觉缺陷。
连接蛋白特异性反义ODN的给予可在组织重建期间导致产生更规则和更密集的上皮-间质粘合基质。因此直接细胞间通讯的调节可用来设计组织基膜。
另外，在此使用的体外角膜培养模型表明直接细胞间通讯的调节可用来设计体外组织，例如利用连接蛋白31.1反义ODN来增加上皮厚度。这种处理在体内也有应用，例如，为了减少诸如圆锥角膜(上皮变薄)的角膜疾病用于设计更厚的角膜。
结果表明，干扰细胞间通讯的活性分子可用于组织工程和重建。特别是，已表明靶向连接蛋白的反义脱氧核苷酸尤其在矫正激光手术以后可用于角膜重建，以及用于体内和体外组织工程。
因此，本文描述的反义化合物和方法具有重大潜力，用来改善外科手术的结果和改善眼中的疾病处理，以及用于组织工程。
                     实施例IV
                    体外培养模型
在成熟动物模型中，在脑或脊髓损伤以后，应用对于间隙连接蛋白质连接蛋白43特异的反义寡脱氧核苷酸可阻断损伤扩大，并减少炎症反应和以后的瘢痕形成。我们甚至进一步采取我们的反义方法并开发了用于脊髓节段和完整脊髓的体外培养模式，以便精心设计用于已有损伤的修复策略。
切除P7-P14幼鼠的脊髓并分成尾侧、胸部以及向嘴侧的节段。
将普卢兰尼克(Pluronic)凝胶中的反义寡脱氧核苷酸在放入培养基的过程中施加到脊髓节段的切开端，这导致连接蛋白43蛋白质水平降低24-48小时，显著提高组织的存活力。最直接和明显的观察结果是不发生肿胀(图8A-B，示出了放入培养基24小时后的脊髓节段)。这种处理阻断从脊髓切开端的扩展。在处理样品的灰质中增加的神经元存活率在甲苯胺蓝染色的树脂切片中显然是明显的(图9A)。明显相反，在图9B中的整个对照组织(未处理的，只有凝胶或具有任意寡脱氧核苷酸的凝胶)都可以观察到神经元的水肿和空泡形成。
随后的标记和长达20天的免疫组织化学研究表明，在处理的脊髓节段(神经元-N标记)中的神经元在这个期间存活，而在对照节段中仅仅在3天以后，就几乎没有神经元仍然有活力。在培养物中5天内，同工凝集素-B4标记表现出对照节段的广泛激活的(巨噬细胞表型)小胶质细胞侵入。在处理的样品中，激活的小胶质细胞限定在外边缘(其中，白质轴突束是在前的，并且就在切开端)。
明显地，与表现出根本没有MAP-2标记的对照节段(图10A-B)相比，MAP-2标记(用于神经元过程的标记)表现出用于处理的脊髓节段中的再生长的重大潜力。
                    实施例V
横过脊髓损伤的外围神经移植
为了外围神经移植，我们将在移植时用连接蛋白43特异反义寡脱氧核苷酸再次处理组织，以阻止损伤从移植部位扩展以及导致移植物与宿主组织神经群隔离的小胶质细胞激活，从而限制神经元修复。
外围神经移植：
将脊髓节段放到35mm皿中的培养插入物(Millipore Millicell)上并且提高培养基的水平直至在节段上方形成miniscus。将在30％普卢兰尼克(Pluronic)凝胶中的连接蛋白43特异反义寡脱氧核苷酸(30mers，1μM浓度)直接置于脊髓组织上方。随着加热到生理温度，凝胶固定并且提供反义寡聚物的持续释放。这种处理将降低连接蛋白43蛋白质水平24至48小时，其中在处理后6-8小时具有最大的降低。这样的脊髓节段(稳定在培养基中，然后再次暴露于切除外伤)表现出与体内外科手术相同的症状，包括损伤扩展和组织肿胀到切开区域内。通过用连接蛋白43特异反义寡聚物在切开时进行处理可阻止这种作用；并且因此，切开边缘仍然是鲜明确定的，并且没有水肿或组织肿胀的明显迹象。
将节段端对端放置但用1-5mm的缝隙隔开。在培养基中1到3天的稳定期后，将来自P7-P14幼鼠的坐骨神经移植物越过缝隙放置。以前的研究表明，坐骨神经(或其隐静脉分支)(Yich，L.W.et al.，1999，Exp Neurol.159：131-138；Aguayo，A.J.et al.，1981，J.Exp.Biol.95：231-240)或肋间神经(Cheng，H.，et al.，1996，Science，273：510-513)移植具有相当大的诱导轴突伸长和神经元存活的潜力。
在移植之后紧接着就从连接蛋白43反义寡聚物开始处理，并在随后的几天伴随有神经元行为评价。与体内研究(术后15天到7个月)相比，由于移植后的培养期相对较短(长达15天)，所以使用了各种标记来评价如下面详述(检测结果)的修复反应。实验在有和没有添加在诱导神经元增殖和/或迁移中可能起重要作用的外源生长因子(如，酸性FGF或NGF)的情况下进行。
                实施例VI
在端对端放置的节段之间插入施万细胞接种的插入物
对于在处理的节段之间的插入物，已选择施万细胞(Schwanncell)，因为它们已表明是轴突再生的强启动子(Xu，X.M.et al.，1999，J.Neurosci.11：1723-1740；Keirstead，H.S.et al.，1999，Exp.Neurol.159：225-236)。
植入的细胞可以为中枢神经系统轴突再生提供宽容的环境，并且已证明可有效用于诱导轴突的再生长。在端对端放置的脊髓节段之间放置的施万细胞接种的(seeded)微通道植入物或基质胶(matrigel)将用于这种应用。这里的原则是，对于脊髓修复介入，最终希望切除瘢痕组织并用植入物质填补空间(space)。使用的方法由Morrissey等和Xu等描述(Morrissey，T.K.et al.，1991，J.Neurosci.11：2433-2442；Xu，X.M.et al.，1995，J.Comp.Neurol.351：145-160)。实际上，坐骨神经从成熟大鼠获得，然后将神经外膜和结缔组织去除并且将1mm长的外植体放入具有Dulbecco’s的改性Eagle介质(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM-Gibco，USA)的培养基中。游走细胞的外生长主要是成纤维细胞并且当其达到汇合时将外植体移到新培养皿。这要重复超过3到5代，直到形成的细胞主要是施万细胞。将这些细胞分离出来并长大，用于接种到共聚物或基质胶导向通道中(Schmidt，C.E.andBaier Leach，J.，2003，Ann.Rev.Biomed.Eng.5：293-347)。一旦准备了植入材料，那么培养的节段就会将其端再切割以模拟瘢痕切除，然后端对端放置，并使入植材料楔入其间。紧接着在移植后，用连接蛋白43反义寡聚物对样品再处理，并且在随后的几天里监测神经元行为。
检测结果
对外围移植物和插入物进行时程(time course)实验，以确定是否存在对移植组织的马上的、后来的或连续的反应。几个标记用来评价神经元反应和修复潜力。这些标记包括：神经元(神经元-N的抗体)、神经丝(MAP-2和SMI-31的抗体)以及细胞质标记(CMFDA)和膜染料(Di-I或Axon grease-Molecular Probes，Oregon，USA)。特别检测增加的神经生长(发芽)、增大的轴突迁移距离(桥长度与迁移距离比)以及朝向或横过移植物生长的轴突增多的数量。对细胞特异性(specific)标记(用于星形细胞的GFAP，用于小胶质细胞的同工凝集素-B4、以及用于施万细胞的S-100)、胶质细胞分布与密度、以及髓鞘形成的水平进行评价。与从脊髓节段再生的那些不同，抗CGRP(外围神经标记)用来区别外围神经源的轴突。利用GAP-43(生长相关蛋白质)抗体来鉴别神经元生长锥。甲苯胺蓝染色的半薄(semithin)切片和越过的切片移植物的电子显微镜术用于形态分析。
二级抗体与Alexa染料结合。对于双重或三重标记，在合适的的情况下我们使用Zenon探针(Molecular Probes，Oregon，USA)。
所有抗体和染料标记是利用奥克兰大学生物医药成像研究装置莱卡(Leica)TCS 4D和SP2(The University of Auckland’s BiomedicalImaging Research Unit LeicaTCS 4D and SP2)共焦激光扫描显微镜加以分析。电子显微镜方法是在Hitachi H-7000电子显微镜上进行。利用图像分析程序(AnalySIS或NIH ImageJ)来量化对照和处理的移植物之间的差别。
                实施例7-反义寡脱氧核苷酸设计
材料
在此使用的材料包括领域公认的抗体和质粒；如，质粒，用于大鼠连接蛋白43(T7291)，)和连接蛋白26；用于小鼠连接蛋白43和连接蛋白26的质粒(Invivogen，USA)，小鼠抗大鼠连接蛋白43和兔抗大鼠连接蛋白26，来自Zymed(51-2800)；以及来自MolecularProbes，Eugene OR的羊抗小鼠Alexa 488和羊抗兔Alexa 568二级抗体。利用Hoechst 33258染料(Sigma)对细胞核进行染色。所有脱氧核酶和寡脱氧核苷酸购买自Sigma Genosys，澳大利亚，作为脱盐寡聚物。TaqMan标记的寡聚物购买自Applied Biosystem，USA。所有寡脱氧核苷酸都以未修饰的磷酸二酯寡脱氧核苷酸购买。
脱氧核酶设计
脱氧核酶设计和测试与在前研究所述类似(Santoro，S.W.andJoyce，G.F.Proc.Natl Acad.Sci.USA，(1997)，94，4262-4266andCaims，M.J.et al.，(1999)Nat.Biotech 17，480-486)。简而言之，选择在靶连接蛋白的mRNA序列中的所有AU和GU部位，其中在A或G的每一边上具有8或9个核苷酸。脱氧核酶是这种有义编码序列的体补，其中“A”或“G”被“10-23”催化核心“ggctagctacaacga”替代。
对照脱氧核酶具有包括单点突变(g→A)的“ggctaActacaacga”的缺陷型催化核心(Santoro，S.W.and Joyce，G.F.Biochem 37，13330-13342)。我们还设计了GC和AC特异脱氧核酶以覆盖由不符合以下三个要求的AU和GU脱氧核酶留下的缝隙。每个脱氧核酶是根据离起始ATG密码子的“A”或“G”核苷酸的位置加以命名。那些选来用于体外测定的脱氧核酶必须满足三个要求：
(1)热稳定性：选择的脱氧核酶不应形成稳定二级结构，或者发夹环或者同种型二聚体。抛弃任何具有发夹或同种型二聚体的、解链温度大于37℃的脱氧核酶，因为据推测在生理温度不能结合到靶序列。
(2)亲合性：两个连接臂的总ΔG值不应大于-30Kcal。每个单个连接臂在-10到-15Kcal之间。这是结合/错引发(由于更高CG浓度)的特异性和对于脱氧核酶的有效结合/更新要求之间的折中。调整剪切部位任一边的连接臂长度以找到理想的ΔG值并且重复步骤(1)以进行检查。
(3)特异性：所有靶结合序列是用基因文库来搜索以检查特异性的BLASTn(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。抛弃具有与其它连接蛋白基因或其它已知啮齿动物基因同源的脱氧核酶。
体外脱氧核酶的测试
将小鼠连接蛋白43和连接蛋白26cDNA从具有NcoI和NheI的pORF载体(Invivogen)切除并在体外转录之前亚克隆到pGEM-T(Promega)。全部长度2.4kb的大鼠连接蛋白43cDNA和全部编码1.4kb大鼠连接蛋白43cDNA(包括200个5’-非翻译区的核苷酸)用于体外转录。利用Promega Riboprobe试剂盒，全部长度mRNA转录自直链化质粒DNA。所得mRNA用PCR旋转柱(Qiagen)进行提纯。用分光光度计在260nm处的OD读数来确定浓度。然后脱氧核酶(40μM的最终浓度)和mRNA(0.01到0.05μg/μl的总mRNA)用2x剪切缓冲液(100mM Tris 7.5；20mM的MgCl2；300mM的NaCl；0.02％的SDS)分别在37℃下预平衡5-10分钟。然后将mRNA和脱氧核酶混合物在37℃下孵育1小时，接着，加入10x Bluejuice(Invitrogen)以停止剪切反应并且将混合物保持在冰上。然后将反应混合物加载到预运行的在1xTBE缓冲液和7M脲中的4％聚丙烯酰胺凝胶(19∶1的丙烯酰基：双比率，BioRad)上并运行长达2小时。
用在TBE缓冲液中的1∶10,000稀释度的SYBR绿II(Mol Probes，USA)对凝胶进行染色并利用BioRad Chemi Doc系统进行成像。反义寡聚物的设计
基于在体外成功剪切mRNA的脱氧核酶连接臂的20个核苷酸序列来选取反义序列。所选的序列选取用于30寡聚合物的设计(Brysch，W.(1999).Antisense Technology in the Ventral NervousSystem，ed.H.A.Robertson；Oxford University Press 21-41)和(WaltonS.，et al.，(2002)Biophysical Journal 82，366-377)。简而言之，避免了序列相关副作用，诸如8-10个CG碱基配对与不相关基因、GGGG和CpG基序的部分序列同源性。也尽可能避免用在最后5个核苷酸中的胸苷或多余三个C或G结束的具有3’-端的反义序列，以阻止错启动(miss priming)。形成诸如同种型二聚体、回文基序或二级发夹结构的稳定二级结构的寡聚物将阻止寡聚物结合到靶mRNA。
也设计了包括有义、杂混、相反以及错配的寡聚物的对照寡聚物，以评价可能的化学相关的副作用，这些副作用起因于交叉杂交、非特异性蛋白结合、以及毒性。
角膜器官培养以及用反义寡核苷酸的处理
用二氧化碳将30-34天老的威斯塔大鼠安乐死并将整个大鼠眼睛切开。将眼表面切开，用0.1mg/ml青霉素-链霉素消毒5分钟并在无菌PBS中进行漂洗。然后将整个眼睛转移到在60mm培养皿中的无菌支架上并使角膜朝上。固定眼睛并使角膜上皮暴露在空气-介质界面处并在34℃、加湿的5％CO2培养箱、无血清介质(Opti-MEM，Invitrogen)中培养长达48小时。将100μl的介质每8到12小时逐滴加到表面上使上皮变湿。介质水平保持在边缘结膜水平。
如在前所述，将反义寡聚物与在冰上的30％(w/w)普卢兰尼克F127凝胶(Sigma)进行混合直到最终的2μM浓度并将10μl涂敷到角膜上(参见Becker，D.L.，et al.；(1999b)Dev.Genet.24：33-42；Green，C.R.et al.；(2001)，Methods Mol Biol 154，175-185)。每一个处理具有每个实验3到4个角膜的样品大小。初步实验表明，我们的阳性对照、DB1的两次处理8小时对在我们的角膜培养物中的连接蛋白43蛋白质表达几乎没有作用。因此，将角膜培养24小时并每8个小时涂敷连接蛋白43特异寡聚物。但是，我们发现如果保持培养24小时，则内源连接蛋白26的表达受到影响。因此，我们将连接蛋白26特异寡聚物处理的角膜的培养期缩短到12小时，并每4小时施用反义寡聚物。在每次重复涂敷反义或对照寡聚物之前10分钟改变培养基(medium)。在限定时间，角膜用PBS漂洗，浸入OCT中(Tissue Tek，Japan)并且迅速在液氮中冷冻。接着将25μm低温切片用莱卡(Leica)低温箱(CM3050s)切开并固定在SuperFrostPlus载玻片上(Menzel，Germany)。为了Cx43和Cx26mRNA分析，在单个反义处理之后8小时收集角膜。
RNA分离和实时PCR
整个RNA是根据制造商协议并利用TRIzol试剂(GIBCO，Invitrogen，USA)提取自分离的大鼠角膜。RNA样品的质量是借助经过溴乙锭染色的琼脂糖凝胶的电泳和在UV照射下可目测的18S与28S rRNA带，进行评价。在260nm处用分光光度法对提取产率进行量化。对于实时PCR，从5μg的总RNA通过利用寡dT和在最终反应体积为20μl中的转录(superscript)II RNA酶H-反转录酶(Life Technologies，Invitrogen，USA)来制备cDNA。在96孔的光反应板中，根据制造商说明利用TaqMan Universal PCR MasterMix(Applied Biosystem，USA)，在50μl体积中对每个样品利用100ng总RNA的cDNA等价物来进行定量PCR反应。在ABI PRISM 7700序列检测系统仪(Applied Biosystem，USA)上开发了PCR。热循环条件包括在95℃初始变性10分钟的步骤和50个两步PCR循环，包括在95℃的15秒变性和在60℃的1分钟退火伸长，其中利用生产商的标准协议。所有实验重复三次。对每个靶的阴性对照的检测表明缺少转移。
进行18S rRNA扩增作为内部参照，基于此，可以归一化其它RNA值。如果靶和18S rRNA扩增的效率大约相等，那么公式2-△△Ct用来计算mRNA的相对水平而不需要标准曲线。如果靶和18S rRNA扩增的效率显著不同，那么相对标准曲线方法用来从所测得的Ct计算每个实验的mRNA和18S rRNA的绝对数量，然后与对照相比，靶基因的相对mRNA浓度在归一化到18S rRNA之后进行量化。
所有计算是通过利用PRISM 3.02软件(GraphPad，San Diego)来进行。在组之间的统计性差别是通过利用t检验来确定。几个组之间的比较是通过ANOVA进行，并且显著性是通过利用Dunnett的多次互比检验来进行计算。
反义寡聚物对阻断翻译的效能的评价
利用Cy3和TaqMan(Fam，Tamra)标记的寡聚物来评价穿透性和稳定性。将Cy3标记的寡聚物(Sigma Genosys)和TaqMan(FAM，TAMRA)标记的寡聚物(Applied Biosystems)与普卢兰尼克凝胶一起使用，以测量进入角膜上皮内的寡聚物的稳定性和穿透性。处理的角膜在4％的低聚甲醛中固定20分钟，位于1％琼脂中并在作为整个支架的(as whole mount)40x水浸没透镜下进行观察。寡聚物穿透的深度是在莱卡(Leica)SP2共焦显微镜上利用Z-扫描选项进行测量并且测量强度对z-距离的曲线。TaqMan寡聚物的分解是在共焦显微镜上利用Lamdba扫描选项加以检测。在FAM(供体)和TAMRA(受体)分子之间的荧光共振能量传递(或FRET)发生在完整的30聚体的寡聚物中。当寡聚物分解时，FAM和TAMRA不再密切接近并且FRET不再发生。
免疫荧光标记
如前所述，进行角膜切片上的连接蛋白的免疫标记。简而言之，使切片封闭在10％羊血清中并用在1∶250(小鼠抗大鼠连接蛋白43)或1∶500(兔抗大鼠连接蛋白26)的主要抗体在4℃下孵育过夜。
然后用PBS洗涤切片，与1∶400稀释度(dilution)的Alexa 488标记的二级抗体在室温下孵育2小时，然后固定在4％的低聚甲醛中并用0.2μM碘化丙啶或1∶50稀释度的Hoechst 33258复染色10min。
将切片置于Citifluor不变色介质(Agarscientific UK)中。所有图像是利用或者莱卡(Leica)TCS-4D或者莱卡(Leica)SP2共焦激光扫描显微镜加以收集并保存为TIF文件。所有图像是利用稳定的电压(520-540V)和补偿(-2)设置加以收集。电压和补偿是利用辉光高低(glow-over-under)显示选项来设定，以将对照组织的图像的灰度最大化。然后在相同实验中对所有样品使用相同的设置。
为了量化，利用在TCS-4D上的质量形态投影选项的中心，将通过3微米的4个光薄片加工成单个延长聚焦光图像。在256灰级图像上，在90-100像素密度取阈值之后，利用NIH图像(Scion Corp.)计数连接蛋白标记的斑点。还测量角膜上皮的面积并且计算每单位面积的连接蛋白密度。利用四个延长聚焦图像的平均值来计算每个角膜的绝对连接蛋白密度。然后用或者有义对照处理或凝胶处理的角膜的介质连接蛋白密度将这个数值标准化。当比较不同处理时，我们将数据表示为百分数降低(percentage knock down)。
在体外脱氧核酶选择性地剪切mRNA
设计了66种脱氧核酶，其特异地抗啮齿动物连接蛋白43mRNA(表5)。这些脱氧核酶的22种用来识别小鼠和大鼠连接蛋白43mRNA。我们还购买了两种在“10-23”催化核心中具有单点突变的缺陷型脱氧核酶，作为阴性对照。脱氧核酶剪切结果对长度1.1kb的大鼠连接蛋白43mRNA(未示出)和长度2.4kb的大鼠连接蛋白43mRNA(图11A)来说是类似的。大鼠(图11A)和小鼠(图11B)连接蛋白43mRNA都表现出具有类似的脱氧核酶可接近的区。结果表明在啮齿动物连接蛋白43mRNA上的4个区是暴露的并且可用于脱氧核酶剪切。这些区是离起始ATG密码子大约367-466、526-622、783-885、以及1007-1076碱基。两种缺陷型脱氧核酶(aldf605和aldf783)表现出没有啮齿动物连接蛋白43mRNA的剪切。相对于大鼠连接蛋白43mRNA的200个碱基对5’非翻译区设计的脱氧核酶也没有表现出任何剪切活性。
表5对大鼠连接蛋白43表现出各种程度的体外和体内活性的脱氧核酶(dz)和反义(as)寡脱氧核苷酸序列的概括。
名称 ODN序列5’到3’ 体外   体内蛋白质   体内mRNA
  SEQ ID NO：32r43dz14SEQ ID NO：33a1dz605SEQ ID NO：34a1df605SEQ ID NO：35r43dz769SEQ ID NO：36a1dz783SEQ ID NO：37a1df783SEQ ID NO：38r43dz885DB1SEQ ID NO：39r43dz892SEQ ID NO：40r43dz953SEQ ID NO：41r43dz1076SEQ ID NO：42DB1SEQ ID NO：43DB1sSEQ ID NO：44r43as14SEQ ID NO：45a1as605SEQ ID NO：46r43as769SEQ ID NO：47a1as783SEQ ID NO：48r43as885SEQ ID NO：49r43as892SEQ ID NO：50a1as953SEQ ID NO：51a1as1076  CCAAGGCA ggctagctacaacga TCCAGTCACCGTGGGA ggctagctacaacga GTGAGAGGCCGTGGGA ggctaActacaacga GTGAGAGGAGTCTTTTG ggctagctacaacga TGGGCTCATTTGGAGA ggctagctacaacga CCGCAGTCTTTGGAGA ggctaActacaacga CCGCAGTCACGAGGAA ggctagctacaacga TGTTTCTGTTGCGGC ggctagctacaac CGACGAGGAATCCATGCGA ggctagctacaacga TTTGCTCTTTGGTCCA ggctagctacaacga GATGGCTAGTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCTGTCGACAGAAACAATTCCTCCTGCCGCAATTACCCAAGGCACTCCAGTCACTCCGTGGGACGTGAGAGGAAGTCTTTTGATGGGCTCATTTTGGAGATCCGCAGTCTCACGAGGAATTGTTTCTGTTTTGCGGCACGAGGAATTCCCATGCGATTTTGCTCTGGTTGGTCCACGATGGCTAA   -+--++-+++-++++++ +--++up++-++ ++-++up++
表5示出了那些基于体外核酶剪切研究所选择的核酶和反义序列，其用于体内分析(mRNA和/或蛋白质水平)或其中缺陷型核酶对照(SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：59)与正常核酶进行比较。
在寡聚物名称具有前缀r43的情况下，表示它们仅对大鼠连接蛋白43是特异的；前缀al表示对小鼠和大鼠二者的特异性。所有寡聚物序列是未修饰的磷酸二酯寡脱氧核苷酸。“ggctagctacaacga”表示脱氧核酶的“10-23”催化核心并且“ggctaActacaacga”是缺陷型突变对照。DB1是as885(在下面的(lower)情形中标记)的30-mer形式(version)并且DB1s是DB1序列的有义对照。体外作用通过单个脱氧核酶测量为百分数mRNA剪切。体内作用通过角膜切片中连接蛋白43的免疫标记(参照图15)或存活mRNA水平的实时PCR评价(参照图16)加以检测。在mRNA的体外剪切或蛋白质和mRNA表达的体内降低中，+++表示＞75％++表示在50％到75％之间，+表示在25％到50％之间，而-表示在0％到25％之间。向上(up)表示当与DB1有义或仅凝胶对照处理进行比较时，连接蛋白43蛋白质表达增加。
我们还测试了特定对啮齿动物连接蛋白26mRNA设计的44种脱氧核酶(表6)，其中17种脱氧核酶匹配小鼠和大鼠连接蛋白26mRNA。由于在克隆质粒上存在两种T7RNA聚合酶启动子，所以大鼠连接蛋白26mRNA表现为凝胶上的双重带。剪切结果表明，在318-379和493-567碱基区中连接蛋白26mRNA具有至少两个脱氧核酶可接近的区(图12A、12B)。这些附图表明，最一贯的剪切脱氧核酶是cx26dz330，其在1小时内剪切两种mRNA。两种缺陷型脱氧核酶(b2df351和b2df379)不表现出对啮齿动物连接蛋白26mRNA的剪切。与小鼠连接蛋白26mRNA相比，脱氧核酶cx26dz341、dz351、dz375、dz379一贯以较高速率剪切大鼠连接蛋白26mRNA。相反，当与大鼠进行比较时，mcx26dz153和dz567在小鼠中表现为高级连接蛋白26脱氧核酶。
表6对啮齿动物连接蛋白26表现出各种程度的体外和体内活性的脱氧核酶(dz)和反义(as)寡脱氧核苷酸序列。
  名称   ODN序列5’到3’   体外   体内蛋白质   体内mRNA
  SEQ ID NO：52m26dz153SEQ ID NO：53b2dz330SEQ ID NO：54b2dz341SEQ ID NO：55b2dz351SEQ ID NO：56b2df351SEQ ID NO：57b2dz375SEQ ID NO：58b2dz379SEQ ID NO：59b2df379SEQ ID NO：60m26dz567SEQ ID NO：61b2as330nSEQ ID NO：62b2rv330nSEQ ID NO：63r26as375nSEQ ID NO：64r26rv375n   GTTGCAGA ggctagctacaacga AAAATCGGGTTCTTTA ggctagctacaacga CTCTCCCTGTCCTTAAA ggctagctacaacga TCGTTCTTTTCTCTTCGA ggctagctacaacga GTCCTTAAATCTCTTCGA ggctaActacaacga GTCCTTAAAGATACGGA ggctagctacaacga CTTCTGGGCTTCGATA ggctagctacaacga GGACCTTCCTTCGATA ggctaActacaacga GGACCTTCGGTGAAGA ggctagctacaacga AGTCTTTTCTCCTTAAACTCGTTCTTTATCTCTCCCTTCAACTTCCCTCTCTATTTCTTGCTCAAATTCCTACGGACCTTCTGGGTTTTGATCTCTTCGAAGCTTCTCTAGTTTTGGGTCTTCCAGGCAT   ++++++++++++-++++++-+++ ---- ++-+
表6示出了那些基于体外核酶剪切研究所选择的在体外一贯剪切mRNA的核酶和反义序列，其用于体内分析(mRNA和/或蛋白质水平)或其中用作缺陷型核酶对照。在寡聚物名称具有前缀m26或r26的情况下，表示它们分别仅对小鼠或大鼠连接蛋白26mRNA是特异的，而前缀b2表示对两种的特异性。所有寡聚物序列是未修饰的磷酸二酯寡脱氧核苷酸。“ggctagctacaacga”表示脱氧核酶的“10-23”催化核心并且“ggctaActacaacga”是缺陷型突变对照。还使用了相反对照(rv)来对反义寡聚物的任何非特异作用进行对照。体内作用是通过角膜切片中连接蛋白26的免疫标记和靶mRNA表达的实时PCR(参照图17)加以检测。在mRNA的体外剪切或蛋白质和mRNA表达的体内降低中，+++表示＞75％，++表示在50％到75％之间，+表示在25％到50％之间，而-表示在0％到25％之间。在普卢兰尼克(Pluronic)凝胶中荧光标记的ODN可穿透角膜上皮
在器官培养中大鼠角膜保持连接蛋白43和连接蛋白26的表达并且通过30％的普卢兰尼克(Pluronic)F-127凝胶很容易达到反义寡聚物的传递。因此选择大鼠角膜器官培养作为模型系统，以检测来自体外模型的反义寡脱氧核苷酸设计的有效性。我们将大鼠角膜培养24小时并发现内皮保持完整。但是长于48小时的培养时间表现出影响角膜的不透明性，因此未使用。利用Cy3标记的寡聚物来确定寡聚物穿透入培养角膜的程度。向下通过(down through)完整角膜的共焦光薄片表明伴随CY3标记的寡聚物的荧光信号存在，如图13A所示，其示出了初始处理后1小时在培养角膜中的荧光信号深度为10μm。利用结合寡脱氧核苷酸的TaqMan探针来检测和证实借助30％普卢兰尼克(Pluronic)凝胶完整寡脱氧核苷酸传递进入角膜上皮中。大部分寡聚物在处理后1小时保持完整(图13B、13C)。尽管来自降解寡聚物的信号(没有FRET)在绿色(在灰度级上表示)发射光谱中出现(图13B)，但可以观察到完整寡聚物的点状信号(图13C中FRET发生)为红色(在灰度级上表示)波长。
脱氧核酶测定预示ODN可降低(knockdown)角膜上皮中的连接蛋白43蛋白质
在初步实验中，我们用我们的阳性对照、DB1的单个使用来处理大鼠角膜，并且发现8小时后连接蛋白43蛋白质表达没有显著变化。在每8小时间隔的3次使用之后，在24小时观察到明显的蛋白质降低。部分基于来自脱氧核酶剪切测定的结果，我们在体内测试了一些反义寡聚物(DB1、r43as605、r43as783、r43as885、r43as953以及r43as1076)，以及预计为无功能的反义寡聚物(r43as14、r43as769以及r43as892)，以及阴性对照(DB1有义)。与具有我们已确定应为阳性的(图14C、14E、14G)所有反义寡聚物的对照(图14A)相比，在处理后24小时我们发现了连接蛋白43蛋白质水平的降低(knowdown)。所有那些预计为阴性的三个、以及阴性对照寡聚物，不影响连接蛋白43表达(图14B、14D、14F、14H)。DB1(as885的30-mer形式)表现出与较短as885(正好在50％降低以下)类似的百分数降低。在这个实验中确定的较好的反义寡聚物之一似乎是as605，其减少64％的蛋白质水平。这些量化结果表示在图15中。
为了试验用于其它连接蛋白的技术，设计了另外的寡脱氧核苷酸并对连接蛋白26进行测试。基于b2dz330和b2dz375的剪切区域内的区，相对于连接蛋白26设计了称为r26as330N和375N的两种30聚体反义寡脱氧核苷酸、以及它们的适当反向对照寡脱氧核苷酸。然而，当反义寡聚物处理的培养物与相反对照处理的角膜相比较时，我们发现在这些实验的12小时期间内这些反义寡脱氧核苷酸(as330N和as375N)不会导致蛋白质表达水平的显著差异。
反义ODN导致连接蛋白43和连接蛋白26mRNA的降低
利用实时PCR来确定反义寡脱氧核苷酸对mRNA水平的作用。确定了与处理后8小时内的对照角膜(图16)相比，降低连接蛋白43蛋白质表达的反义寡脱氧核苷酸(as605、as885、DB1)还具有较低的连接蛋白43mRNA水平。在连接蛋白43mRNA的相对水平的降低百分数与连接蛋白43蛋白质降低的水平很好地相关。与对照角膜相比，负反义寡聚物(as769)和阴性对照(DB1有义、仅凝胶)表现出未改变的连接蛋白43mRNA的水平。
在反义处理的8小时内，as330N和as375N还显著降低连接蛋白26mRNA表达(图17)。用于as330N的相反序列对照和只有凝胶的对照对mRNA水平表现出没有作用。
本文参考或提到的所有专利、出版物、科学论文、网站、以及其它文献和材料是本发明所属领域技术人员水平的表示，并且每一个这样的参考文献和材料因此以引用方式结合于此作为参考。申请人保留物理地将来自任何这样的专利、出版物、科学论文、网站、电子地可利用的信息、以及其它参考材料或文献的任何和所有材料以及信息结合到本说明书的权利。
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已采用的术语和措词用作描述而不是限制的术语，并且在使用这样的术语和措词时并没有排除示出的和描述的特性的任何等效物或其部分，但承认在所要求的本发明范围内各种改变是可能的。
因此，应理解尽管本发明已通过优选实施例和可选的特性具体地加以披露，但是本文披露的构思的改变和变化会被本领域技术人员采用，并且认为这样的改变和变化在如由所附权利要求确定的本发明的范围内。
本文广泛地并且一般性地描述了本发明。每个较窄的种类和属于一般披露内容的亚类分组也形成本发明的组成部分。这包括本发明的一般描述，并具有从类中去除任何主题的限制性条款或否定的限制而不管删去的材料是否是本文特定地陈述的。
其它实施例是在下面的权利要求内。另外，在用马库什(Markush)组描述本发明的特性或方面的地方，本领域技术人员将承认，本发明同样因此可以用马库什组的任何单项或项的亚组加以描述。
序列表
<110>科达治疗(新西兰)有限公司
<120>靶向连接蛋白的反义化合物及其使用方法
<130>P8381DMS
<140>PCT/IB2004/004431
<141>2004-12-03
<150>NZ 529936
<151>2003-12-03
<160>65
<170>PatentIn Ver.3.3
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gaccatggag cccgtgtttg tgtgccagcg agcaccctgc ccctacctcg tggactgctt    660
tgtctctcgc cccacggaga agaccatctt catcatcttc atgttggtgg ttggactcat    720
ctccctggtg cttaacctgc tggagttggt gcacctgctg tgtcgctgcc tcagccgggg    780
gatgagggca cggcaaggcc aagacgcacc cccgacccag ggcacctcct cagaccctta    840
cacggaccag ggtcttcttc tacctccccg tggccagggg ccctcatccc caccatgccc    900
cacctacaat gggctctcat ccagtgagca gaactgggcc aacctgacca cagaggagag    960
gctggcgtct tccaggcccc ctctcttcct ggacccaccc cctcagaatg gccaaaaacc    1020
cccaagtcgt cccagcagct ctgcttctaa gaagcagtat gtatagaggc ctgtggctta    1080
tgtcacccaa cagaggggtc ctgagaagtc tggctgcctg ggatgccccc tgccccctcc    1140
tggaaggctc tgcagagatg actgggctgg ggaagcagat gcttgctggc catggagcct    1200
cattgcaagt tgttcttgaa cacctgaggc cttcctgtgg cccaccaggc actacggctt    1260
cctctccaga tgtgctttgc ctgagcacag acagtcagca tggaatgctc ttggccaagg    1320
gtactggggc cctctggcct tttgcagctg atccagagga acccagagcc aacttacccc    1380
aacctcaccc tatggaacag tcacctgtgc gcaggttgtc ctcaaaccct ctcctcacag    1440
gaaaaggcgg attgaggctg ctgggtcagc cttgatcgca cagacagagc ttgtgccgga    1500
tttggccctg tcaaggggac tggtgccttg ttttcatcac tccttcctag ttctactgtt    1560
caagcttctg aaataaacag gacttgatca caaaaaaaaa a                        1601
<210>15
<211>2574
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>15
gcaaaaagcg tgggcagttg gagaagaagc agccagagtg tgaagaagcc cacggaagga    60
aagtccaggg aggaggaaaa gaagcagaag ttttggcatc tgttccctgg ctgtgccaag    120
atgggcgatt ggagcttcct gggaaatttc ctggaggaag tacacaagca ctcgaccgtg    180
gtaggcaagg tctggctcac tgtcctcttc atattccgta tgctcgtgct gggcacagct    240
gctgagtctt cctgggggga tgagcaggct gatttccggt gtgatacgat tcagcctggc    300
tgccagaatg tctgctacga ccaggctttc cccatctccc acattcgcta ctgggtgctg    360
cagatcatct tcgtctccac gccctctctg gtgtacatgg gccacgccat gcacactgtg    420
cgcatgcagg agaagcgcaa gctacgggag gccgagaggg ccaaagaggt ccggggctct    480
ggctcttacg agtacccggt ggcagagaag gcagaactgt cctgctggga ggaagggaat    540
ggaaggattg ccctccaggg cactctgctc aacacctatg tgtgcagcat cctgatccgc    600
accaccatgg aggtgggctt cattgtgggc cagtacttca tctacggaat cttcctgacc    660
accctgcatg tctgccgcag gagtccctgt ccccacccgg tcaactgtta cgtatcccgg    720
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cttagcctgg ctgaactcta ccacctgggc tggaagaaga tcagacagcg atttgtcaaa    840
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gtacgaggtc aggagcagac tcctggggaa ggtttcatcc aggttcgtta tggccagaag    1080
cctgaggtgc ccaatggagt ctcaccaggt caccgccttc cccatggcta tcatagtgac    1140
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tcctttatgg gaggatcagg accaggtggg aacaaaggag gctcagagaa gaaagacgtg    1260
tcccttctga actgatgctt tctcactgtc atcactgctt ggctcctttg agccccgggt    1320
ctcaatgacg ttgctcatta attctagaaa ctataaccag ggctctggga tagtaagaga    1380
ggtgacaacc cacccagact gcagttccct ccccaccctc tacccagtat acgaagcctt    1440
tcagattact catgaaacag ggtagaggga aagaagggaa gcatggcaaa agctggcctg    1500
gaagggatag ccagagggat agaatgactc tctctctaca taccagcagc ataccaaatg    1560
cgttctctaa gttcctacct ccttgacctg atcaccctcc ctcctccaag gaagagctca    1620
aagttcccag ccaatagaca gcatgaatca aggaacttgc attatatgtg ctcttgaatc    1680
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ttcaatccaa tgatagaaac catcccttcc ctttctccct tggctgttca cccagccatt    2040
ccctgaaggc cttaccaaca ggaatatcca agaagctgtt gtcccctctc gaaccctgac    2100
cagatcatca gccactgagg ccagtggaat ttccccaggc cttgttaaaa caaagaaagc    2160
attgtacctc tcagattccc cttgtggaaa aaaaaattct gctgtgaaga tgaaaataaa    2220
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caacttagtg ccaagaggag gtgtgatgac agctatggag gcccccagat ctctctctcc    2340
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atccataatg ggttgctgtt gttttggatg aaggtaaacg atgcttggaa ttgg          2574
<210>16
<211>1191
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>16
atgagttgga gctttctgac tcgcctgcta gaggagattc acaaccattc cacatttgtg    60
gggaagatct ggctcactgt tctgattgtc ttccggatcg tccttacagc tgtaggagga    120
gaatccatct attacgatga gcaaagcaaa tttgtgtgca acacagaaca gccgggctgt    180
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<212>DNA
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<400>17
agcgccaaga gagaaagagc acatatttct ccgtgggaca ctccttgtat tggtgggtga    60
gaaatgggcg actggagttt cctggggaac atcttggagg aggtgaatga gcactccacc    120
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gtgatggagt tgagccacct gggcctgaag gggatccggt ctgccttgaa gaggcctgta    780
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<210>18
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<212>DNA
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<400>18
atgggggaat ggaccatctt ggagaggctg ctagaagccg cggtgcagca gcactccact    60
atgatcggaa ggatcctgtt gactgtggtg gtgatcttcc ggatcctcat tgtggccatt    120
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>19
cagggagttg tggttgcaac actgtactcc agcctgggca acagagggag actctgtctc    60
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<400>21
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cccgccgagc ccagcgccgc tccaatccac cttcccgcaa gggctcgggc ttcggccacc    780
gcctctcacc tgaatacaag cagaatgaga tcaacaagct gctgagtgag caggatggct    840
ccctgaaaga catactgcgc cgcagccctg gcaccggggc tgggctggct gaaaagagcg    900
accgctgctc ggcctgctga tgccacatac caggcaacct cccatcccac ccccgaccct    960
gccctgggcg agcccctcct tctcccctgc cggtgcacag gcctctgcct gctggggatt    1020
actcgatcaa aaccttcctt ccctggctac ttcccttcct cccggggcct tccttttgag    1080
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ggtacaagag atgggatgct ccgacagcgt ctccaattat gaaactaatc ttaaccctgt    1260
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<210>22
<211>2263
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>22
cggagcccct cggcggcgcc cggcccagga cccgcctagg agcgcaggag ccccagcgca    60
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tgtgaaaaga atagaagcta aggtttagat aaatattgag cagatctata ggaagattga    2040
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gtgagggtaa gtattttcct gttgtcaaga atagcattgt aaaagcattt tgtaataata    2160
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<210>23
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<212>DNA
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ctcagtgtgt ga                                                        672
<210>30
<211>1113
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>30
atggaaggcg tggacttgct agggtttctc atcatcacat taaactgcaa cgtgaccatg 60
gtaggaaagc tctggttcgt cctcacgatg ctgctgcgga tgctggtgat tgtcttggcg 120
gggcgacccg tctaccagga cgagcaggag aggtttgtct gcaacacgct gcagccggga 180
tgcgccaatg tttgctacga cgtcttctcc cccgtgtctc acctgcggtt ctggctgatc 240
cagggcgtgt gcgtcctcct cccctccgcc gtcttcagcg tctatgtcct gcaccgagga 300
gccacgctcg ccgcgctggg cccccgccgc tgccccgacc cccgggagcc ggcctccggg 360
cagagacgct gcccgcggcc attcggggag cgcggcggcc tccaggtgcc cgacttttcg 420
gccggctaca tcatccacct cctcctccgg accctgctgg aggcagcctt cggggccttg 480
cactactttc tctttggatt cctggccccg aagaagttcc cttgcacgcg ccctccgtgc 540
acgggcgtgg tggactgcta cgtgtcgcgg cccacagaga agtccctgct gatgctgttc 600
ctctgggcgg tcagcgcgct gtcttttctg ctgggcctcg ccgacctggt ctgcagcctg 660
cggcggcgga tgcgcaggag gccgggaccc cccacaagcc cctccatccg gaagcagagc 720
ggagcctcag gccacgcgga gggacgccgg actgacgagg agggtgggcg ggaggaagag 780
ggggcaccgg cgcccccggg tgcacgcgcc ggaggggagg gggctggcag ccccaggcgt 840
acatccaggg tgtcagggca cacgaagatt ccggatgagg atgagagtga ggtgacatcc 900
tccgccagcg aaaagctggg cagacagccc cggggcaggc cccaccgaga ggccgcccag 960
gaccccaggg gctcaggatc cgaggagcag ccctcagcag cccccagccg cctggccgcg 1020
cccccttcct gcagcagcct gcagccccct gacccgcctg ccagctccag tggtgctccc 1080
cacctgagag ccaggaagtc tgagtgggtg tga                              1113
<210>31
<211>1632
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>31
atgggggact ggaacttatt gggtggcatc ctagaggaag ttcactccca ctcaaccata 60
gtggggaaaa tctggctgac catcctcttc atcttccgaa tgctggtact tcgtgtggct 120
gctgaggatg tctgggatga tgaacagtca gcatttgcct gcaacacccg gcagccaggt 180
tgcaacaata tctgttatga tgatgcattc cctatctctt tgatcaggtt ctgggtttta 240
cagatcatct ttgtgtcttc tccttctttg gtctatatgg gccatgcact ttataggctc 300
agggcctttg agaaagacag gcagaggaaa aagtcacacc ttagagccca gatggagaat 360
ccagatcttg acttggagga gcagcaaaga atagataggg aactgaggag gttagaggag 420
cagaagagga tccataaagt ccctctgaaa ggatgtctgc tgcgtactta tgtcttacac 480
atcttgacca gatctgtgct ggaagtagga ttcatgatag gccaatatat tctctatggg 540
tttcaaatgc acccccttta caaatgcact caacctcctt gccccaatgc ggtggattgc 600
tttgtatcca ggcccactga gaagacaatt ttcatgcttt ttatgcacag cattgcagcc 660
atttccttgt tactcaatat actggaaata tttcatctag gcatcagaaa aattatgagg 720
acactttata agaaatccag cagtgagggc attgaggatg aaacaggccc tccattccat 780
ttgaagaaat attctgtggc ccagcagtgt atgatttgct cttcattgcc tgaaagaatc 840
tctccacttc aagctaacaa tcaacagcaa gtcattcgag ttaatgtgcc aaagtctaaa 900
accatgtggc aaatcccaca gccaaggcaa cttgaagtag acccttccaa tgggaaaaag 960
gactggtctg agaaggatca gcatagcgga cagctccatg ttcacagccc gtgtccctgg 1020
gctggcagtg ctggaaatca gcacctggga cagcaatcag accattcctc atttggcctg 1080
cagaatacaa tgtctcagtc ctggctaggt acaactacgg ctcctagaaa ctgtccatcc 1140
tttgcagtag gaacctggga gcagtcccag gacccagaac cctcaggtga gcctctcaca 1200
gatcttcata gtcactgcag agacagtgaa ggcagcatga gagagagtgg ggtctggata 1260
gacagatctc gcccaggcag tcgcaaggcc agctttctgt ccagattgtt gtctgaaaag 1320
cgacatctgc acagtgactc aggaagctct ggttctcgga atagctcctg cttggatttt 1380
cctcactggg aaaacagccc ctcacctctg ccttcagtca ctgggcacag aacatcaatg 1440
gtaagacagg cagccctacc gatcatggaa ctatcacaag agctgttcca ttctggatgc 1500
tttctttttc ctttctttct tcctggggtg tgtatgtatg tttgtgttga cagagaggca 1560
gatggagggg gagattattt atggagagat aaaattattc attcgataca ttcagttaaa 1620
ttcaattcat aa                                                     1632
<210>32
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>32
ccaaggcagg ctagctacaa cgatccagtc a                                   31
<210>33
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>33
ccgtgggagg ctagctacaa cgagtgagag g                                   31
<210>34
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>34
ccgtgggagg ctaactacaa cgagtgagag g                                   31
<210>35
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>35
agtcttttgg gctagctaca acgatgggct ca                                  32
<210>36
<211>31
<212>DNA
<213>Arficial Seauence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>36
tttggagagg ctagctacaa cgaccgcagt c                                   31
<210>37
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Seouence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
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<400>37
tttggagagg ctaactacaa cgaccgcagt c                                   31
<210>38
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>38
acgaggaagg ctagctacaa cgatgtttct g                                   31
<210>39
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>39
ttgcggcggc tagctacaac gacgaggaat                                     30
<210>40
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>40
ccatgcgagg ctagctacaa cgatttgctc t                                   31
<210>41
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Seauence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>41
ttggtccagg ctagctacaa cgagatggct a                                   31
<210>42
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
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<400>42
gtaattgcgg caggaggaat tgtttctgtc                                     30
<210>43
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>43
gacagaaaca attcctcctg ccgcaattac                                     30
<210>44
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>44
ccaaggcact ccagtcac                                                  18
<210>45
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>45
tccgtgggac gtgagagga                                                 19
<210>46
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>46
agtcttttga tgggctca                                                  18
<210>47
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>47
ttttggagat ccgcagtct                                                 19
<210>48
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>48
cacgaggaat tgtttctgt                                                 19
<210>49
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>49
tttgcggcac gaggaatt                                                  18
<210>50
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>50
cccatgcgat tttgctctg                                                 19
<210>51
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>51
gttggtccac gatggctaa                                                 19
<210>52
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>52
gttgcagagg ctagctacaa cgaaaaatcg g                                   31
<210>53
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>53
gttctttagg ctagctacaa cgactctccc t                                   31
<210>54
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>54
gtccttaaag gctagctaca acgatcgttc ttt                                 33
<210>55
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
sequence
<400>55
tctcttcgag gctagctaca acgagtcctt aaa                                 33
<210>56
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>56
tctcttcgag gctaactaca acgagtcctt aaa                                 33
<210>57
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>57
gatacggagg ctagctacaa cgacttctgg g                                    31
<210>58
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>58
cttcgatagg ctagctacaa cgaggacctt c                                   31
<210>59
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>59
cttcgatagg ctaactacaa cgaggacctt c                                   31
<210>60
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>60
ggtgaagagg ctagctacaa cgaagtcttt tct                                 33
<210>61
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>61
ccttaaactc gttctttatc tctcccttca                                     30
<210>62
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>62
acttccctct ctatttcttg ctcaaattcc                                     30
<210>63
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>63
tacggacctt ctgggttttg atctcttcga                                     30
<210>64
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
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<400>64
agcttctcta gttttgggtc ttccaggcat                                     30
<210>65
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic ODN
     sequence
<400>65
gtaattgcgg caggaggaat tgtttctgtc                                     30

Claims (68)

1.一种用于减少与受治疗者中眼科操作有关的组织损伤的方法，包括结合所述操作将反义化合物以足以在所述受治疗者的眼中或与所述眼有关的细胞中抑制连接蛋白表达的量给予所述受治疗者的眼睛。
2.一种结合眼科操作用于组织工程的方法，包括将反义化合物以足以在受治疗者的眼中或与所述眼有关的细胞中抑制连接蛋白表达的量给予所述受治疗者的眼睛，并且所述量足以在所述受治疗者眼中或与所述眼有关的细胞中调节细胞的增殖、迁移、或分化。
3.一种在受治疗者眼中或在与受治疗者眼有关的组织中促进上皮细胞累积的方法，包括将反义化合物以足以在所述受治疗者的眼中或与所述受治疗者眼有关的细胞中抑制连接蛋白表达的量给予受治疗者的眼。
4.一种在受治疗者的眼中或在与受治疗者眼有关的组织中抑制细胞过多的方法，包括将反义化合物以足以在所述受治疗者的眼中或与所述受治疗者眼有关的细胞中抑制连接蛋白表达的量给予所述受治疗者的眼。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述反义化合物是选自包括反义寡核苷酸、反义多核苷酸、脱氧核酶、吗啉代寡核苷酸、RNAi分子、siRNA分子、PNA分子、DNA酶、以及5’-端-突变的U1小核RNA、以及前述的类似物的组。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中眼科操作是选自准分子激光屈光性角膜切削术、白内障摘除术、角膜移植、矫正屈光的手术、替换晶状体的手术、放射状角膜切开术、青光眼滤过手术、角膜移植术、或者其它类型的矫正屈光或替换晶状体的手术的眼科手术。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物包括选自SEQ ID NO：1-11的核酸碱基序列。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物靶向一种或多种连接蛋白43、26、37、30和/或31.1。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物靶向核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中所述核酸分子编码具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，将第二反义化合物给予所述受治疗者的眼，其中所述第二反义化合物靶向核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中所述核酸分子编码具有选自SEQ IDNO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白，其中所述第二反义化合物靶向不同于权利要求4所述的反义化合物的连接蛋白。
11.根据权利要求3所述的方法，其中，所述反义化合物是长度在15和35个核酸碱基之间的反义寡核苷酸。
12.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物靶向核酸分子的至少约12个核酸碱基，其中所述核酸分子编码具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白。
13.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物靶向核酸分子的至少约18个核酸碱基，其中所述核酸分子编码具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白。
14.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物靶向核酸分子的至少约25个核酸碱基，其中所述核酸分子编码具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白。
15.根据权利要求3所述的方法，其中，所述反义化合物包括选自SEQ ID NO：1-11的核酸碱基序列。
16.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是包括天然存在的核酸碱基和未修饰的核苷间键的反义寡核苷酸。
17.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是包括至少一种修饰的核苷间键的反义寡核苷酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。
19.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是包括至少一种修饰的糖部分的寡核苷酸。
20.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是包括至少一种修饰的核酸碱基的寡核苷酸。
21.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是通过局部方式来给予。
22.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是通过直接涂敷到手术伤口来给予。
23.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是通过眼内注射来给予。
24.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是结合可用于减少组织损伤或促进愈合的第二化合物一起使用。
25.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第二化合物是生长因子或细胞因子。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述第二化合物是选自生长因子、细胞因子、或类似因子，包括但不限于FGF、NGF、NT3、PDGF、TGF、VEGF、BDGF、EGF、KGF、整联蛋白、白细胞介素、纤溶酶、以及semaphorins。
27.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是在预定时间给予。
28.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是在进行所述外科手术之前给予。
29.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是在所述外科手术期间给予。
30.根据权利要求6所述的方法，其中，所述反义化合物是在进行所述外科手术之后2小时内给予。
31.根据权利要求6所述的方法，其在所述受治疗者中结合准分子激光屈光性角膜切削手术进行。
32.根据权利要求6所述的方法，其中，所述眼科手术是白内障摘除术。
33.根据权利要求6所述的方法，其中，所述眼科手术是角膜移植。
34.根据权利要求6所述的方法，其中，所述眼科手术是矫正屈光的手术。
35.根据权利要求6所述的方法，其中，所述眼科手术是矫正屈光的放射状角膜切开术。
36.根据权利要求6所述的方法，其促进愈合或防止与所述受治疗者角膜有关的细胞中的组织损伤。
37.根据权利要求6所述的方法，其中，所述眼科手术是青光眼滤过手术。
38.根据权利要求6所述的方法，其中，所述眼科手术是角膜移植术。
39.根据权利要求6所述的方法，其增加所述受治疗者角膜组织的厚度。
40.根据权利要求6所述的方法，其中，组织损伤在所述受治疗者的角膜细胞中减少。
41.根据权利要求6所述的方法，其中，组织损伤在与受治疗者所述角膜有关的细胞中减少。
42.根据权利要求6所述的方法，其减少所述受治疗者眼中的混浊。
43.根据权利要求6所述的方法，其减少所述受治疗者眼中的瘢痕形成。
44.根据权利要求6所述的方法，其调节与有关术后24小时到48小时期间内激光所致损伤的部位的成肌纤维细胞分化有关的细胞过多。
45.根据权利要求6所述的方法，其调节间质重建并且减少与术后24小时到72小时期间内激光所致损伤的部位有关的混浊。
46.根据权利要求6所述的方法，其中，所述眼科操作是准分子激光手术并且所述方法减少所述受治疗者的间质细胞的细胞过多。
47.根据权利要求6所述的方法，其中，所述眼科操作是准分子激光手术并且所述方法促进所述受治疗者角膜中的上皮再形成。
48.根据权利要求6所述的方法，其增加所述受治疗者眼中的上皮细胞运动。
49.根据权利要求48所述的方法，其导致上皮细胞运动在将所述反义化合物给予所述受治疗者眼的12小时内增加。
50.根据权利要求48所述的方法，其导致上皮细胞运动在将所述反义化合物给予所述受治疗者眼的24小时内增加。
51.根据权利要求6所述的方法，其在所述经治疗的受治疗者眼中导致所述前间质中的间质密度增大而不导致所述后间质的间质密度增大。
52.根据权利要求6所述的方法，其抑制与术后24小时到72小时期间内激光所致损伤的部位有关的间质水肿。
53.根据权利要求6所述的方法，其在术后24小时到72小时内减少上皮增生。
54.根据权利要求6所述的方法，其减少成肌纤维细胞活化长达术后1星期。
55.根据权利要求6所述的方法，其调节调整所述细胞外基质的细胞分化。
56.根据权利要求6所述的方法，其减少细胞增殖。
57.一种治疗中枢神经系统损伤的方法，所述方法包括将反义化合物结合对受治疗者进行的外科手术一起给予接近所述中枢神经系统的预先存在的伤口的部位以治疗所述中枢神经系统损伤，其中所述反义化合物靶向核酸分子的至少约8个核酸碱基，其中所述核酸分子编码具有选自SEQ ID NO：12-31的核酸碱基序列的连接蛋白。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述中枢神经系统损伤是脊髓损伤。
59.根据权利要求57所述的方法，其中，所述反义化合物是在所述脊髓物理外伤后至少24小时给予受治疗者。
60.根据权利要求57所述的方法，其中，所述反义化合物是连同将神经组织移植到受治疗者的脊髓损伤区的操作一起使用。
61.根据权利要求57所述的方法，其中，所述反义化合物减少瘢痕形成。
62.根据权利要求57所述的方法，其中，所述反义化合物减少炎症。
63.根据权利要求57所述的方法，其中，所述反义化合物促进伤口愈合。
64.根据权利要求57所述的方法，其结合外科移植手术一起使用。
65.根据权利要求57所述的方法，其中，所述反义化合物靶向连接蛋白43并给予以调节上皮基细胞分裂和生长。
66.根据权利要求57所述的方法，其中，所述反义化合物靶向连接蛋白31.1并给予以调节外层角质化。
67.反义化合物在制备用于减少与眼科操作有关的组织损伤的药物中的应用，其中，所述反义化合物抑制受治疗者眼中或与受治疗者眼有关的细胞中的连接蛋白表达。
68.反义化合物结合眼科操作在制备用于组织工程的药物中的应用，其中所述反义化合物抑制受治疗者眼中或与受治疗者眼有关的细胞中的连接蛋白表达。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114126661A (zh) * 2019-02-08 2022-03-01 奥克兰服务有限公司 生物材料和其相关方法

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA029094B9 (ru) 2003-12-03 2018-04-30 Коуда Терапьютикс, Инк. Антисмысловые соединения, нацеленные на коннексины, и способы их применения
US9408381B2 (en) 2004-12-21 2016-08-09 Musc Foundation For Research Development Alpha Connexin c-Terminal (ACT) peptides for use in transplant
ES2620363T3 (es) 2004-12-21 2017-06-28 Musc Foundation For Research Development Composiciones y métodos para promover la cicatrización de heridas y la regeneración tisular
AU2016203204A1 (en) * 2005-02-03 2016-06-09 Coda Therapeutics Limited Anti-connexin compounds and uses thereof
JP5964538B2 (ja) 2005-02-03 2016-08-03 コーダ セラピューティクス， インコーポレイテッド 抗コネキシン化合物およびそれらの使用
WO2007055224A1 (ja) * 2005-11-08 2007-05-18 Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. 角膜疾患治療剤
AU2007319811A1 (en) * 2006-11-15 2008-05-22 Coda Therapeutics, Inc. Improved methods and compositions for wound healing
PT2101791E (pt) * 2006-12-11 2014-12-18 Coda Therapeutics Inc Polinucleótidos anti-conexina como composições para cicatrização dificultada de feridas
JP5552048B2 (ja) * 2007-06-21 2014-07-16 ムスク ファンデーション フォー リサーチ ディベロップメント 加齢性黄斑変性を治療するためのアルファコネキシンｃ末端（ａｃｔ）ペプチド
EP2245061A2 (en) * 2007-12-11 2010-11-03 Coda Therapeutics, Inc. Impaired wound healing compositions and treatments
EP2237786A2 (en) 2007-12-21 2010-10-13 Coda Therapeutics, Inc. Use of inhibitors of connexin43 for treatment of fibrotic conditions
AU2008343754A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Use of anti-connexin polynucleotides for the treatment of surgical adhesions
EP2234656A2 (en) 2007-12-21 2010-10-06 Coda Therapeutics, Inc. Improved medical devices
EP2237795A2 (en) * 2007-12-21 2010-10-13 Coda Therapeutics, Inc. Use of anti-connexin polypeptide agent in combination with anti-connexin polynucleotide agent for the treatment of fibrotic conditions
AU2008343758A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Use of anti-connexin 43 polynucleotides for the treatment of abnormal or excessive scars
US20110038920A1 (en) * 2008-01-07 2011-02-17 Ryoichi Mori Wound healing compositions and treatments
WO2009102931A1 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Alcon Research, Ltd. Rnai-mediated inhibition of connexin 43 for treatment of iop-related conditions
WO2009148552A2 (en) * 2008-06-02 2009-12-10 Kansas State University Research Foundation Methods and compositions for treating disease
EP3336188B1 (en) 2008-09-22 2020-05-06 Phio Pharmaceuticals Corp. Reduced size self-delivering rnai compounds
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2013131040A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Firststring Research, Inc. Topical gels containing alpha connexin c-terminal (act) peptides
GB201215857D0 (en) * 2012-09-05 2012-10-24 Sylentis Sau siRNA and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions
EP2971161B1 (en) 2013-03-15 2018-12-26 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
US9156896B2 (en) * 2013-03-15 2015-10-13 Coda Therapeutics, Inc. Wound healing compositions and treatments
WO2014152030A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Removal of dna fragments in mrna production process
US10590161B2 (en) 2013-03-15 2020-03-17 Modernatx, Inc. Ion exchange purification of mRNA
DK3019619T3 (da) 2013-07-11 2021-10-11 Modernatx Inc Sammensætninger, der omfatter syntetiske polynukleotider, som koder for crispr-beslægtede proteiner, og syntetiske sgrna'er, og anvendelsesfremgangsmåder
CN106659909B (zh) * 2013-08-21 2022-01-11 德克萨斯州大学系统董事会 用于靶向连接蛋白半通道的组合物和方法
WO2015051169A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
JP6883987B2 (ja) * 2013-12-04 2021-06-09 フィオ ファーマシューティカルズ コーポレーションＰｈｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ． 化学修飾されたオリゴヌクレオチドを利用する創傷治癒の処置のための方法
WO2015191795A1 (en) * 2014-06-12 2015-12-17 The Research Foundation For The State University Of New York Methods of using gap junctions as therapeutic targets for the treatment of degenerative disorders of the retina
WO2015196128A2 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
JP2017522028A (ja) 2014-07-16 2017-08-10 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 環状ポリヌクレオチド
CN114010788A (zh) * 2014-08-22 2022-02-08 奥克兰联合服务有限公司 通道调节剂
US10709726B2 (en) 2015-08-14 2020-07-14 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
US11434486B2 (en) 2015-09-17 2022-09-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
WO2017147561A1 (en) 2016-02-26 2017-08-31 The Board Of Regents Of The University Of Texas System CONNEXIN (Cx) 43 HEMICHANNEL-BINDING ANTIBODIES AND USES THEREOF
US11364259B2 (en) 2016-12-27 2022-06-21 The University Of Tokyo MRNA functionalization method
CN111201247A (zh) 2017-04-28 2020-05-26 奥克兰联合服务有限公司 治疗方法和新颖构建体

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5004810A (en) 1988-09-30 1991-04-02 Schering Corporation Antiviral oligomers
US5166195A (en) 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
FR2692265B1 (fr) 1992-05-25 1996-11-08 Centre Nat Rech Scient Composes biologiquement actifs de type phosphotriesters.
GB2273932A (en) 1992-11-24 1994-07-06 Stiefel Laboratories Stable oligonucleotides
GB9425930D0 (en) 1994-12-22 1995-02-22 Procter & Gamble Silicone compositions
CN1187774A (zh) * 1995-04-19 1998-07-15 阿科达治疗所 中枢神经系统轴突外延调节剂,以及包含和使用该调节剂的组合物,细胞和方法
CA2273203A1 (en) 1996-12-02 1998-06-11 Dyad Pharmaceutical Corporation Antisense inhibition of human adhesion molecules
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
CA2730386C (en) * 1999-01-27 2015-08-11 Colin R. Green Formulations comprising antisense nucleotides to connexins
CA2330022A1 (en) * 1999-04-06 2000-10-26 East Carolina University Low adenosine anti-sense oligonucleotide, compositions, kit and method for treatment of airway disorders associated with bronchoconstriction, lung inflammation, allergy(ies) and surfactant depletion
CN1347902A (zh) * 2000-10-11 2002-05-08 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人软骨连接蛋白14.19和编码这种多肽的多核苷酸
EA029094B9 (ru) 2003-12-03 2018-04-30 Коуда Терапьютикс, Инк. Антисмысловые соединения, нацеленные на коннексины, и способы их применения

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114126661A (zh) * 2019-02-08 2022-03-01 奥克兰服务有限公司 生物材料和其相关方法

Also Published As

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DK1699924T3 (da) 2019-10-21
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US10472632B2 (en) 2019-11-12
CA3059497A1 (en) 2005-06-16
WO2005053600A2 (en) 2005-06-16
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IL244085B (en) 2018-02-28
KR20070011260A (ko) 2007-01-24
US10787667B2 (en) 2020-09-29
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