CN111201247A - 治疗方法和新颖构建体 - Google Patents

治疗方法和新颖构建体 Download PDF

Info

Publication number
CN111201247A
CN111201247A CN201880042800.6A CN201880042800A CN111201247A CN 111201247 A CN111201247 A CN 111201247A CN 201880042800 A CN201880042800 A CN 201880042800A CN 111201247 A CN111201247 A CN 111201247A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
peptide
construct
cells
interacting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880042800.6A
Other languages
English (en)
Inventor
科林·理查德·格林
弗雷泽·保罗·科蒂尼奥
伊尔瓦·达纳·鲁彭塔尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Auckland Uniservices Ltd
Original Assignee
Auckland Uniservices Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Auckland Uniservices Ltd filed Critical Auckland Uniservices Ltd
Publication of CN111201247A publication Critical patent/CN111201247A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供了将化合物靶向递送到缺氧细胞的新颖方法，例如治疗与缺氧相关的疾病和病症，所述方法包括施用构建体，所述构建体包括用于递送到缺氧细胞的靶向载体肽和化合物。本发明还提供了用于通过施用新颖构建体、对新颖构建体进行编码的核酸和/或包括对新颖构建体进行编码的核酸的核酸载体来治疗眼部疾病或病症的新颖方法。本发明进一步提供了新颖构建体、对此些构建体进行编码的核酸和/或包括对此些构建体进行编码的核酸的核酸载体。

Description

治疗方法和新颖构建体
技术领域
本发明涉及用于将化合物靶向缺氧细胞的新颖方法以及用于此用途的构建体，所述新颖方法包含涉及所述化合物的治疗方法。本发明进一步涉及用于治疗眼部病症和/或疾病的新颖方法以及用于此用途的构建体。
背景技术
许多疾病和病症与缺氧细胞和/或组织相关。例如，年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病性视网膜病变两者都与视网膜缺血相关，从而使得视网膜色素上皮细胞死亡。通过进一步举例，肿瘤(如癌症)的血管供应较差并且缺氧和/或具有缺氧的部分或区域，从而导致组织中的氧气水平降低。在肿瘤的情况下，持续缺血可以促进耐缺氧肿瘤细胞的存活率高于正常细胞。肿瘤血管中的结构异常可能影响对治疗的治疗应答。
通过进一步举例，许多疾病和病症都与导致缺氧的灌注不足相关，包含中风和短暂性缺血发作、心脏缺血、缺血性结肠炎(大肠缺血)、败血症、急性肢体缺血、皮肤缺血、多发性硬化症、血管性痴呆和阿尔茨海默氏病。
尽管存在可用于与缺氧相关的某些疾病的一些治疗方法，但这些方法并非没有问题。
例如，急性缺血的当前治疗选择通常针对缺血原因(例如，血栓形成)，并且包含注射抗凝剂、溶栓、栓塞切除、外科手术血管重建或截肢。另一种选择是降低身体或器官的温度以试图降低受影响的细胞的有氧代谢率，从而减少缺氧的即时影响。然而，缺血组织在此些治疗之后继续退化。例如，败血症与灌注不足的发展相关。治疗方法然后转向尝试限制缺血性损伤的后续影响。然而，这些方法经常与脱靶效应和副作用相关。
类似地，当前用于治疗与慢性缺血相关的疾病和病症的方法与脱靶效应和副作用相关。例如，目前主要通过玻璃体内注射抗VEGF药剂(包含例如VEGF-Trap)来治疗AMD和糖尿病性视网膜病变两者。最近已经认识到，在许多情况下(1-3)，长期治疗可能导致抗VEGF的抗性，其中经过五年治疗后最佳矫正视力低于基线。另外，过度使用抗VEGF药剂可能对良好血管造成损失，从而加剧组织缺血(24)。
在肿瘤的情况下，化学疗法的副作用已得到充分证明。这些副作用通常由于治疗癌症使用的治疗剂以非特异性方式被细胞摄取的事实而造成，并且对正常细胞产生毒性作用。
先前已示出，连接蛋白通道阻滞剂可以减少慢性炎症并促进血管完整性(18，29，30)。某些连接蛋白通道阻滞剂(例如，Gap19)需要进入细胞以与连接蛋白的细胞质结构域结合。例如，Gap19与连接蛋白Cx43的细胞质尾结合。真核细胞的质膜对许多化学化合物的渗透性差，从而显著降低其例如作为治疗剂或实验试剂的功效，尤其是当其需要到达细胞质才能有效。由于如Gap19等连接蛋白通道阻滞剂的渗透性差，先前已使用高浓度来达到功效(6、7)。然而，以高浓度施用Gap19可能产生不期望的副作用，如脱靶效应或未经请求的免疫应答。
已经开发出改善化学化合物的细胞渗透性的技术，所述技术包含使用基于脂质、聚阳离子、纳米颗粒和肽的方法。然而，这些技术并非没有问题。例如，细胞可渗透的载体肽可能很大且制造昂贵，从而使其在商业上不可行。载体肽也可能干扰其所携带的分子的构象，从而降低那些化合物的功效。载体肽也可能缺乏对靶组织或细胞的特异性，从而导致可能不期望的脱靶效应。许多载体肽是高度阳离子的。例如，其可以含有高浓度的氨基酸精氨酸。由于诱导的膜渗漏，此些载体肽可能在较高浓度下呈毒性(31)。
以上实例表明需要用于递送到缺氧细胞的替代性治疗选择以及用于递送细胞内作用的连接通道阻滞剂的替代性选择。
在本说明书的结尾处收集了所引用出版物的书目详细信息。
发明目的
本发明的目的是提供将化合物靶向递送到缺氧细胞的方法、治疗与缺氧相关的疾病或病症的方法、治疗眼部疾病或病症的方法、构建体的用途、核酸的用途、包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体的用途、增加化合物的摄取的方法、制备用于增加化合物的摄取的药物的方法、减少治疗剂脱靶效应的方法、构建体、对构建体进行编码的核酸和/或对克服或改善了现有技术的缺点的构建体进行编码的核酸载体。本发明的另外的替代性目的是为公众提供有用的选择。
发明内容
本发明提供了一种将化合物靶向递送到缺氧细胞的新颖方法，例如治疗与缺氧相关的疾病和病症，所述方法包括施用构建体，所述构建体包括用于递送到缺氧细胞的靶向载体肽和化合物。
本发明还提供了一种用于通过施用新颖构建体、对新颖构建体进行编码的核酸和/或包括对新颖构建体进行编码的核酸的核酸载体来治疗眼部疾病或病症的新颖方法。
本发明进一步提供了新颖构建体、对此些构建体进行编码的核酸和/或包括对此些构建体进行编码的核酸的核酸载体。
因此，在第一广泛方面，本发明提供了一种将化合物靶向递送到受试者中的缺氧细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用构建体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述化合物。
在第二广泛方面，本发明提供了一种将肽化合物靶向递送到受试者中的缺氧细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用对构建体进行编码的核酸，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述肽化合物。
在第三广泛方面，本发明提供了一种将肽化合物靶向递送到受试者中的缺氧细胞的方法，所述方法包括：向所述受试者施用包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述肽化合物。
在第四广泛方面，本发明提供了一种治疗与缺氧相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用构建体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)用于治疗所述疾病或病症的治疗剂。
在第五广泛方面，本发明提供了一种治疗眼部疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用构建体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第六广泛方面，本发明提供了一种治疗与缺氧相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用对构建体进行编码的核酸，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)用于治疗所述疾病或病症的肽治疗剂。
在第七广泛方面，本发明提供了一种治疗眼部疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用对构建体进行编码的核酸，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第八广泛方面，本发明提供了一种治疗与缺氧相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)用于治疗所述疾病或病症的肽治疗剂。
在第九广泛方面，本发明提供了一种治疗眼部疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第十广泛方面，本发明提供了一种治疗与缺氧相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用与一或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂组合的包括构建体的组合物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)用于治疗所述疾病或病症的治疗剂。
在第十一广泛方面，本发明提供了一种治疗眼部疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用与一或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂组合的包括构建体的组合物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第十二广泛方面，本发明提供了一种治疗与缺氧相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用与一或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂组合的包括对构建体进行编码的核酸的组合物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)用于治疗所述疾病或病症的肽治疗剂。
在第十三广泛方面，本发明提供了一种治疗眼部疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用与一或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂组合的包括对构建体进行编码的核酸的组合物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第十四广泛方面，本发明提供了一种治疗与缺氧相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用与一或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂组合的包括核酸载体的组合物，所述核酸载体包括对构建体进行编码的核酸，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)用于治疗所述疾病或病症的肽治疗剂。
在第十五广泛方面，本发明提供了一种治疗眼部疾病或病症的方法，所述方法包括：向受试者施用与一或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂组合的包括核酸载体的组合物，所述核酸载体包括对构建体进行编码的核酸，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第十六广泛方面，本发明提供了一种构建体的用途，其用于制备用于治疗与缺氧相关的疾病或病症的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)治疗剂。
在第十七广泛方面，本发明提供了一种构建体的用途，其用于制备用于治疗眼部疾病或病症的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第十八广泛方面，本发明提供了一种对构建体进行编码的核酸的用途，其用于制备用于治疗与缺氧相关的疾病或病症的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)肽治疗剂。
在第十九广泛方面，本发明提供了一种对构建体进行编码的核酸的用途，其用于制备用于治疗眼部疾病或病症的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第二十广泛方面，本发明提供了一种包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体的用途，其用于制备用于治疗与缺氧相关的疾病或病症的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)肽治疗剂。
在第二十一广泛方面，本发明提供了一种包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体的用途，其用于制备用于治疗眼部疾病或疾病的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第二十二广泛方面，本发明提供了一种构建体的用途，其用于治疗与缺氧相关的疾病或病症，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)治疗剂。
在第二十三广泛方面，本发明提供了一种构建体的用途，其用于治疗眼部疾病或病症，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第二十四广泛方面，本发明提供了一种对构建体进行编码的核酸的用途，其用于治疗与缺氧相关的疾病或病症，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)肽治疗剂。
在第二十五广泛方面，本发明提供了一种对构建体进行编码的核酸的用途，其用于治疗眼部疾病或病症，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第二十六广泛方面，本发明提供了一种包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体的用途，其用于治疗与缺氧相关的疾病或病症，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)肽治疗剂。
在第二十七广泛方面，本发明提供了一种包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体的用途，其用于治疗眼部疾病或病症，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第二十八广泛方面，本发明提供了一种将化合物靶向递送到缺氧细胞的方法，所述方法包括：使构建体与缺氧细胞群接触，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述化合物。
在第二十九广泛方面，本发明提供了一种将化合物靶向递送到缺氧和非缺氧细胞混合群中的缺氧细胞的方法，所述方法包括：使构建体与细胞混合群或包括细胞混合群的组合物接触，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述化合物。
在第三十广泛方面，本发明提供了一种将肽化合物靶向递送到缺氧细胞的方法，所述方法包括：使对构建体进行编码的核酸与缺氧细胞群接触，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述肽化合物。
在第三十一广泛方面，本发明提供了一种将肽化合物靶向递送到缺氧和非缺氧细胞混合群中的缺氧细胞的方法，所述方法包括：使对构建体进行编码的核酸与细胞混合群或包括细胞混合群的组合物接触，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述化合物。
在第三十二广泛方面，本发明提供了一种将肽化合物靶向递送到缺氧细胞的方法，所述方法包括：使包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体与缺氧细胞群接触，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述肽化合物。
在第三十三广泛方面，本发明提供了一种将肽化合物靶向递送到缺氧和非缺氧细胞混合群中的缺氧细胞的方法，所述方法包括：使包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体与细胞混合群或包括细胞混合群的组合物接触，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述化合物。
在第三十四广泛方面，本发明提供了一种增加一或多个缺氧细胞对化合物(包含治疗剂)的摄取的方法，所述方法包括将所述化合物与源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽连接。
在第三十五广泛方面，本发明提供了一种增加一或多个缺氧细胞对肽化合物(包含治疗剂)的摄取的方法，所述方法包括将对所述肽化合物进行编码的核酸与对源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽进行编码的核酸连接。
在第三十六广泛方面，本发明提供了一种制备用于增加化合物(包含治疗剂)的摄取的药物的方法，所述方法包括将所述化合物与源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽连接。
在第三十七广泛方面，本发明提供了一种制备用于增加肽化合物(包含治疗剂)的摄取的药物的方法，所述方法包括将对所述肽化合物进行编码的核酸与对源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽进行编码的核酸连接。
在第三十八方面，本发明提供了一种减少治疗剂的脱靶效应的方法，所述方法包括将所述治疗剂与源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽连接，其中所述治疗剂用于递送到一或多个缺氧细胞。
在第三十九广泛方面，本发明提供了一种减少肽治疗剂的脱靶效应的方法，所述方法包括将对所述肽治疗剂进行编码的核酸与对源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽进行编码的核酸连接。
在第四十广泛方面，本发明提供了一种构建体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第四十一广泛方面，本发明提供了一种与一或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂组合的包括构建体的组合物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第四十二广泛方面，本发明提供了一种对构建体进行编码的核酸，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第四十三广泛方面，本发明提供了一种与一或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂组合的包括对构建体进行编码的核酸的组合物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第四十四广泛方面，本发明提供了一种包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在第四十五广泛方面，本发明提供了一种与一或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂组合的包括对构建体进行编码的核酸的组合物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
本发明也可以广义地说是在于本申请的说明书中单独或共同提及或指明的部分、元件以及特征，其呈所述部分、元件或特征中的两个或两个以上的任何组合或全部组合的形式，并且当在此提到具有本发明所涉及的领域中的已知等效物的特定整体时，此些已知等效物被视为就像单独地列出一样而被合并在此。
附图说明
参考附图，通过以下仅通过举例给出的描述，本发明在其所有的新颖方面应当考虑的这些和其它方面将变得显而易见。
许多附图示出了被标记或染色为不同颜色的细胞或细胞核。当以黑白再现时，除非另有说明，否则根据所使用的标记或染色剂，这些图中可见的所有点均表示细胞或细胞核。在某些情况下，当以黑白再现附图时，颜色会变得非常暗淡或不可见，因此对比度和亮度会增加。进行了这些更改以如实地再现彩色照片。
图1.hRMEC对Gap19和XG19的摄取。用XG19(10、20或50μM)或Gap19(10、20、50或100μM)处理hRMEC细胞或不对其进行处理(无肽)作为对照物。肽是FITC标记的，并且因此通过使细胞质中的FITC水平可视化(FITC图中的白色区域)来观察摄取，并且通过DAPI染色使细胞核可视化(DAPI图中的白色区域)。合并图示出针对每种处理的DAPI和FITC图的重叠。此图示出了在低至10μM的浓度下摄取到内皮细胞中的有效XG19，而甚至在50μM下，也检测不到所述细胞内的单独Gap19。
图2.ARPE-19对Gap19和XG19的摄取。用XG19(10、20或50μM)、Gap19(10、20、50或100μM)处理ARPE-19细胞或不对其进行处理(无肽)作为对照物。肽是FITC标记的，并且因此通过使细胞质中的FITC水平可视化(FITC图中的白色区域)来观察摄取，并且通过DAPI染色使细胞核可视化(DAPI图中的白色区域)。合并图示出针对每种处理的DAPI和FITC图的重叠。此图示出了在低至10μM浓度下摄取到ARPE-19细胞中的有效XG19，而甚至在100μM下，也检测不到所述细胞内的单独Gap19。
图3.摄取到ARPE-19细胞中的TAT-Gap19和XG19。用XG19(10、20或50μM)或TAT-Gap19(10、20、50μM)、Gap19(100μM)处理ARPE-19细胞或不对其进行处理(无肽)作为对照物。肽是FITC标记的，并且因此通过使细胞质中的FITC水平可视化(FITC图中的白色区域)来观察摄取，并且通过DAPI染色使细胞核可视化(DAPI图中的白色区域)。合并图示出针对每种处理的DAPI和FITC图的重叠。尽管在此放大倍数下，TAT-Gap19似乎具有比XG19更高的细胞摄取，但TAT-Gap19主要累积到细胞核中(参见图4和4A)。
图4.ARPE-19细胞对TAT-Gap19的核摄取。观察并比较TAT-GAP19(右)和XG19(左)在ARPE19细胞中的核摄取。肽是FITC标记的，并且因此通过使FITC水平可视化(FITC图中的白色区域)来观察摄取，并且通过DAPI染色使细胞核可视化(DAPI图中的白色区域)。合并图示出针对每种处理的DAPI和FITC图的重叠。尽管TAT-Gap19似乎具有更高的摄取，但仍累积到细胞核中。这可能对核功能有害，并且意味着所连接的Gap19不能用于阻断半通道开放。
图4A.ARPE-19细胞对TAT-Gap19的核摄取。这与图4相同，但以灰度而不是黑白再现。观察并比较TAT-GAP19(右)和XG19(左)在ARPE19细胞中的核摄取。肽是FITC标记的，并且因此通过使FITC水平可视化(FITC图中的白色点和灰色区域)来观察摄取，并且通过DAPI染色使细胞核可视化(DAPI图中的灰色区域)。合并图示出针对每种处理的DAPI和FITC图的重叠。尽管TAT-Gap19似乎具有更高的摄取，但如FITC通道中看到的核区域中存在白点所示，其被累积到细胞核中，这用XG19摄取看不到。这可能对核功能有害，并且意味着Gap19不能用于阻断半通道开放。
图5.XG19不示出细胞毒性。对暴露于增加浓度的XG19(5μM(竖直条带)、10μM(格子图案)或20μM(水平条带))的ARPE-19细胞进行MTT细胞毒性测定，持续1小时或24小时，并将其与未经处理的作为对照物(黑色)的细胞进行比较。在任何浓度或测试时间点，与经过XG19处理的细胞相比，未经处理的细胞的细胞活力无显著差异。这表明XG19在短时间间隔和长时间间隔对细胞均无毒性。使用邓尼特(Dunnett)多重比较测试通过双向ANOVA和事后比较进行统计分析。
图6.半通道介导的EthD-1摄取。仅用低钙溶液处理ARPE-19细胞以允许半通道开放(左上)，用高钙溶液进行处理以阻断半通道开放(右上)，用含5μM XG19(左下)或5μMFITC-XG19(右下)的低钙溶液进行处理，并通过共聚焦显微镜观察EthD-1(白色区域)摄取。用5μM XG19(或FITC偶联的XG19)处理的细胞示出EthD-1摄取减少，这表明Gap19抑制了半通道开放(表明FITC标记对功能没有影响)。通过测量每种处理四个区域中的平均EthD-1荧光强度来定量图像，并绘制在图表上(右)(n＝4；平均值+SD)。用事后邓尼特试验进行单向ANOVA，并且显著性表示为与低钙对照的差异(***p<0.001，****p<0.0001)。
图7.半通道介导的ATP释放。在用低钙溶液处理细胞持续25-45分钟(打开半通道)(实心黑色)之前，将5μM XG19(条带)、100μM肽5(Pep5)(菱形)和100μM羧苄酮(CBX)(砖形)施加于ARPE-19细胞持续1小时。收集溶液并通过发光测定来测量ATP(n＝3；平均值+SD)。低浓度的XG19(甚至低至5μM)在降低ATP释放方面与较高浓度的细胞外作用Pep5一样有效。使用邓尼特多重比较测试通过双向ANOVA和事后比较进行统计分析。将显著性与每个时间点的低钙对照进行相比(p*<0.05，p***<0.001，p*****<0.0001)。
图8.XG19在摄取后1小时和2小时抑制Cx43半通道介导的ATP释放。在细胞摄取增加浓度的XG19(5μM(竖直条带)、10μM(格子图案)或20μM(水平条带))后1小时或24小时，通过ATP释放测定评估ARPE-19细胞中的半通道功能，并且将其与未经处理的细胞(黑色)进行比较。与未经处理的细胞相比，经过XG19处理的细胞在1小时和24小时时间点示出明显更少的ATP释放。这表明细胞摄取后24小时可以保持XG19功能。因此，摄取后24小时，XG19呈生物可用和功能性形式。使用Sidak多重比较测试通过双向ANOVA和事后比较进行统计分析。将显著性与每个时间点的未经处理的对照物进行比较(p**<0.01，p***<0.001，p****<0.0001)。
图9.ARPE-19细胞中的染料刮擦/负载间隙连接测定。未刮擦的ARPE-19细胞(左上)没有摄取荧光黄染料(所有图中的白色区域)。刮擦的细胞(白色虚线)在受伤部位处摄取了染料，所述染料通过开放的间隙连接转移到相邻的细胞上(右上)。已知的间隙连接阻滞剂羧苄酮(CBX)抑制了间隙连接通讯，并且因此使染料扩散(左下)。在用XG19处理的细胞中可见到染料扩散，从而示出功能性间隙连接(右下)。在先前示出阻断半通道开放的剂量下，XG19对间隙连接偶联没有影响。
图10.正常与高血糖症和发炎ARPE-19细胞中的多配体聚糖-4表达。将ARPE-19细胞暴露于正常培养基或高血糖症和炎症溶液中，持续1小时、3小时、6小时或24小时。将细胞标记用于多配体聚糖-4，并通过Alexa Fluor 488(AF488)检测(AF488图中的白色区域)，并通过DAPI染色使细胞核可视化(DAPI图中的白色区域)。合并图示出针对每种处理的AF488和DAPI图的重叠。通过测量针对每种处理的三个区域中的AF488平均荧光强度来定量多配体聚糖-4表达，并绘制在图表上(底部)(n＝3；平均值+SD)。用事后Sidak测试进行双向ANOVA，并且显著性表示为每个时间点与正常细胞的表达差异(**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。高血糖症和发炎细胞中的多配体聚糖-4水平升高。
图11.正常与高血糖症和发炎ARPE-19细胞中的XG19和Gap19的摄取。在正常(培养基)以及高血糖症和发炎ARPE-19细胞中研究XG19和Gap19的摄取，并将其与无肽对照物进行比较。肽是FITC标记的，并且因此通过使细胞质中的FITC水平可视化(FITC图中的白色区域)来观察摄取，并且通过DAPI染色使细胞核可视化(DAPI图中的白色区域)。合并图示出针对每种处理的DAPI和FITC图的重叠。高血糖症和发炎细胞中的XG19摄取增加，而单独Gap19的摄取没有变化。
图12.正常与缺氧ARPE-19细胞中的多配体聚糖-4表达。将ARPE-19细胞暴露于培养基或缺氧溶液中以诱导缺氧，持续1小时、3小时、6小时或24小时。将细胞标记用于多配体聚糖-4，并通过Alexa Fluor 488(AF488)检测(AF488图中的白色区域)，并通过DAPI染色使细胞核可视化(DAPI图中的白色区域)。合并图示出针对每种处理的AF488和DAPI图的重叠。通过测量针对每种处理的四个区域中的AF488平均荧光强度来定量多配体聚糖-4表达，并绘制在图表上(底部)(n＝4；平均值+SD)。用事后Sidak测试进行双向ANOVA，并且显著性表示为每个时间点与正常细胞的表达差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。与正常条件相比，缺氧细胞中的多配体聚糖-4水平在每个时间点均增加。
图13.缺氧与正常ARPE-19细胞中的XG19和Gap19的摄取。在正常(培养基)和缺氧ARPE-19细胞中研究XG19和Gap19的摄取，并将其与无肽对照物进行比较。肽是FITC标记的，并且因此通过使细胞质中的FITC水平可视化(FITC图中的白色区域)来观察摄取，并且通过DAPI染色使细胞核可视化(DAPI图中的白色区域)。合并图示出针对每种处理的DAPI和FITC图的重叠。缺氧细胞中的XG19的摄取显著增加，而单独Gap19的摄取没有变化。因此，缺氧细胞对Gap19的摄取增加取决于包含靶向载体肽。
图14.XG19在缺氧期间维持细胞活力。在通过应用HAIR溶液使细胞缺氧之前，先用5μM(竖直条带)或20μM(水平条带)的XG19处理细胞，或不对其进行处理(交叉线)。通过MTT测定评估细胞活力，并将其与作为对照物的正常培养基(黑色)中的细胞进行比较。经过XG19处理的细胞的细胞活力与正常培养基中的未经处理的细胞不存在显著差异。与正常培养基中的未经处理的细胞相比，HAIR中的未经处理的细胞示出显著较低的活力。这表明XG19能够在缺氧期间维持细胞活力。用事后邓尼特测试进行单向ANOVA，并且显著性表示为与正常培养基对照物中的未经处理的细胞的差异(***p<0.001)。
图15.XG19抑制HAIR溶液中的Cx43半通道介导的ATP释放。在应用HAIR溶液以诱导缺氧之前，用5μM(竖直条带)、10μM(格子图案)或20μM(水平条带)的XG19处理细胞，或不对其进行处理(黑色)，然后通过ATP释放测定评估半通道功能。与未经处理的细胞相比，所有经过XG19处理的细胞产生的ATP释放显著减少。因此，XG19通过具体抑制Cx43半通道显著减少了缺氧损伤期间的ATP释放。用事后邓尼特测试进行单向ANOVA，并且显著性表示为与HAIR溶液中的未经处理的细胞的差异(***p<0.001，****p<0.0001)。
图16.激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)小鼠模型的眼底测量。根据从激光诱导后1天和7天获取的眼底图像测量病变区域，并平均到每只眼睛。在第1天，盐水(n＝8只眼睛)、低剂量(n＝8只眼睛)或高剂量XG19(n＝7只眼睛)组之间没有差异。在第7天，盐水处理组产生最大的病变区域，而高剂量XG19组产生最小的病变区域。这表明XG19能够以剂量依赖性方式减少病变区域。
图17.激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)小鼠模型的椭球体积测量。测量并定量激光诱导后7天获取的光学相干断层扫描(OCT)图像，以产生CNV区域的椭球体积测量值，并平均到每只眼睛。与单独用盐水处理的小鼠(n＝8只眼睛)相比，用低剂量XG19(n＝8只眼睛)或高剂量XG19(n＝7只眼睛)处理的小鼠产生的椭球体积显著更小。用事后邓尼特测试进行单向ANOVA，并且显著性表示为与盐水组的差异(**p<0.01，平均值+SD)。此图表明，XG19治疗减少了CNV病变体积。
图18.CNV激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)小鼠模型组织中的多配体聚糖-4和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。将来自注射有盐水、低剂量XG19或高剂量XG19的小鼠的眼组织标记用于多配体聚糖-4，并用DAPI对GFAP和细胞核进行染色。合并图示出，小鼠视网膜中的细胞核的GFAP、多配体聚糖-4和DAPI染色的标记定向为神经节细胞层(GCL)处于每个图像的顶部，内核层(INL)处于中间并且外核层(ONL)处于底部。多配体聚糖-4图示出在从GCL层向下延伸到ONL的盐水注射组中看到最大量的多配体聚糖-4标记。如GFAP图所示，在所有组中均可看到GFAP标记，但是盐水注射组中的GFAP标记比XG19注射组中的更强烈。在注射盐水的小鼠中看到的多配体聚糖-4和GFAP表达升高表明这些小鼠正在经历视网膜炎症和局部缺血。如通过多配体聚糖-4和GFAP表达的降低表明，注射XG19的小鼠视网膜炎症和局部缺血减轻，并且因此示出XG19促进CNV小鼠模型的愈合。
图19.人视网膜切片中的多配体聚糖-4表达。来自人供体组织的视网膜切片被标记用于多配体聚糖-4表达(左)或未对其进行标记(右)作为抗体对照物。通过AlexaFluor488(AF488)(AF488图中的白色区域)检测多配体聚糖-4，并通过DAPI染色使细胞核可视化(DAPI图中的白色区域)。所述图像聚焦在外视网膜层；外核层(ONL)、视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜上。此图表明，多配体聚糖-4存在于XG19靶向的眼组织中，具体地血管周围。
图20.人供体组织的黄斑区域中的多配体聚糖-4和GFAP表达。合并图示出正常或糖尿病性视网膜病变(DR)人供体组织中的细胞核的GFAP、多配体聚糖-4和DAPI染色的标记。与正常组织相比，多配体聚糖-4图示出DR组织中的标记增加。在神经节细胞层(GCL)中(特别是在Müller细胞端)以及所述切片上部部分可见的血管周围，多配体聚糖-4标记均升高。DR组织还具有保存良好的内界膜(ILM)，所述ILM示出强大的多配体聚糖-4标记。GFAP图还示出，与组织上部部分中的GCL中的正常情况相比，DR组织中的标记增加。这指示组织损伤和视网膜炎症，因为GFAP标记活化了星形胶质细胞和Müller细胞。DR中的多配体聚糖-4和GFAP表达上调，并且表明组织损伤。因此，XG19可以用于靶向这些组织中的多配体聚糖-4，以减少视网膜炎症和局部缺血。
图21.人供体组织的旁黄斑区域中的多配体聚糖-4和GFAP表达。合并图示出正常或糖尿病性视网膜病变(DR)人供体组织中的细胞核的GFAP、多配体聚糖-4和DAPI染色的标记。与正常组织相比，多配体聚糖-4图示出DR组织中的标记增加。GCL与INL之间的组织上部部分中的多配体聚糖-4标记升高，从而导致下视网膜层失调，这表明了此区域中的血管生长渗漏。GFAP图还示出，与组织上部部分中的GCL中的正常情况相比，DR组织中的标记增加。这指示组织损伤和视网膜炎症。DR中的多配体聚糖-4和GFAP表达上调，并且表明组织损伤。因此，XG19可以用于靶向这些组织中的多配体聚糖-4，以减少视网膜炎症和局部缺血。
图22.大鼠败血症模型的肺组织中的多配体聚糖-4表达。合并图示出来自败血症模型的大鼠肺组织中的细胞核的多配体聚糖-4和DAPI染色的标记，并将其与假手术组织进行比较。在多配体聚糖-4图中看到的多配体聚糖-4表达在假手术组织中比在败血症组织中低。假手术组织在细支气管和肺泡周围具有不同的多配体聚糖-4表达，其余组织中的多配体聚糖-4标记较弱。败血症组织在整个切片中均具有强烈的多配体聚糖-4表达，在细支气管和肺泡周围的表达升高。这表明由败血症引起的整体炎症已经导致肺组织损伤，这由增加的多配体聚糖-4表达指示。
图23.大鼠急性胰腺炎模型的肺组织中的多配体聚糖-4表达。合并图示出来自急性胰腺炎(AP)模型的大鼠肺组织中的细胞核的多配体聚糖-4和DAPI染色的标记，并将其与假手术对照物进行比较。在多配体聚糖-4图中看到的多配体聚糖-4表达在假手术组织中比在AP组织中低。假手术组织在细支气管和肺泡周围具有不同的多配体聚糖-4表达，其余组织中的多配体聚糖-4标记较弱。AP组织在整个切片中均具有强烈的多配体聚糖-4表达，在细支气管和肺泡周围的表达升高。这表明AP导致肺中的多配体聚糖-4上调。
图24.正常窦和慢性鼻窦炎(CRS)人组织的多配体聚糖-4标记。正常窦(上图)和慢性鼻窦炎(下图)的人组织切片的共聚焦图像标记用于多配体聚糖-4(左图)并用DAPI对细胞核进行染色(中图)。合并的图像示出在右图中。图像代表在每组中分析的三种单独的组织。通过测量每个图像的平均荧光强度来定量这些组织的多配体聚糖-4表达(对于CRS样品和3个正常样品中的每一个，n＝3；平均值+SD)。此图示出与正常相比，CRS组织中的多配体聚糖-4表达升高。
图25.小鼠神经胶质瘤模型中的多配体聚糖-4和GFAP表达。合并图示出在小鼠脑组织出现肿瘤的部位处细胞核的GFAP、多配体聚糖-4和DAPI染色的标记。多配体聚糖-4图示出，相对于正常的邻近脑组织(下三分之二)，肿瘤组织中的多配体聚糖-4的标记升高(上三分之一)。由于肿瘤细胞浸润大脑并引起周围组织发炎，因此脑组织中也存在不同的多配体聚糖-4升高区域。GFAP图仅在脑组织中(下三分之二)中和与肿瘤交界处示出经过活化的星形胶质细胞的标记。肿瘤(上三分之一)不表达GFAP，因为其不包含星形胶质细胞。脑组织中的浸润肿瘤细胞被升高的GFAP表达所包围，这类似于在大脑与肿瘤组织交界处所见，表明这些部位处存在炎症和局部缺血。
图25A.小鼠神经胶质瘤模型中的血管中的多配体聚糖-4和GFAP表达。合并图示出肿瘤半球和邻近半球中的细胞核的GFAP、多配体聚糖-4和DAPI染色的标记。邻近半球示出沿血管的GFAP和单个细长细胞核的标记。沿血管和周围组织存在较弱的多配体聚糖-4标记。在肿瘤半球中，沿血管和周围组织中存在强烈的多配体聚糖-4标记。GFAP标记在组织中和沿血管也增加，这表明此组织严重发炎。此外，所述血管包含靠近的多个细胞核，这表明所述血管包含血管内的增殖细胞。这表明，多配体聚糖-4在发炎的缺氧组织中的血管周围上调，并且此外在血脑屏障(BBB)中高度表达。这表明，本发明的构建体可以用于靶向递送针对脑损伤的治疗剂。
图26.小鼠侧腹中的皮下人A431肿瘤的多配体聚糖-4表达。将在小鼠侧腹皮下生长的人A431(表皮癌)肿瘤组织的切片标记用于多配体聚糖-4，并对细胞核进行DAPI染色。在4倍、10倍、20倍和60倍下拍摄的图像示出肿瘤的中心区域表达了很高水平的多配体聚糖-4。在有核细胞簇中可见到高水平的多配体聚糖-4标记。
图27.SKOV3肿瘤的多配体聚糖-4表达。将在小鼠侧腹皮下生长的人SKOV3肿瘤组织的切片标记用于多配体聚糖-4，并对细胞核进行DAPI染色。以4倍、10倍和20倍拍摄的图像示出高水平的多配体聚糖-4标记的区域。在细胞簇以及周围组织中均可见到多配体聚糖-4标记。
具体实施方式
以下是以一般含义给出的本发明的说明，包含其多个优选实施例。本发明进一步根据以下在标题“实例”下给出的公开来阐明，所述公开提供支持本发明的实验数据、本发明的各个方面的具体实例以及执行本发明的装置。
发明人惊奇地发现，包括源自乙型肝炎病毒(HBV)的X蛋白的载体肽的构建体可以用于将化合物有效地递送到细胞的细胞质。
发明人还惊奇地发现，所述构建体在缺氧细胞中的摄取高于非缺氧细胞。因此，使用源自乙型肝炎病毒的X蛋白的载体肽将有利地使缺氧细胞和组织优先摄取化合物(包含治疗剂)，即靶向缺氧细胞。这将减少所需的有效药物剂量，同时使任何潜在的脱靶效应最小化，从而改进功效和安全性。
发明人已经出乎意料地发现，源自乙型肝炎病毒(HBV)的X蛋白的载体肽可以用作靶向载体肽，以通过包括所述靶向载体肽和化合物的构建体将所述化合物(例如，治疗剂)靶向缺氧细胞。如本文概述，此些构建体已经在许多应用中用于研究应用和治疗。在一个实例中，此类构建体用于治疗眼部疾病和病症，并且具体地与炎症、缺氧、局部缺血、出血和/或新生血管相关的眼部疾病和病症。此类疾病和病症包含：炎性眼部疾病，随后有血管消退和/或渗漏，包含视网膜静脉和/或分支静脉闭塞、视网膜动脉闭塞或视网膜中风、糖尿病性黄斑水肿、葡萄膜炎、睑缘炎、重度干眼综合征以及视神经炎。
此外，发明人发现，发炎和缺氧脑组织中的血管内皮周围的多配体聚糖-4表达增加，在血脑屏障(BBB)中具有高水平的表达。BBB常常是将药物递送到中枢神经系统的障碍。因此，本发明的构建体可以用于有利地靶向递送治疗剂，从而要求跨血脑屏障传递以治疗中枢神经系统的疾病和病症。
可以理解，血液视网膜屏障类似于血脑屏障。
除了在缺氧和炎性条件下BBB中的多配体聚糖-4表达的增加外，发明人还发现视网膜内界膜(ILM)中的多配体聚糖-4表达增加，这在缺氧和炎性条件下在视网膜与玻璃体液之间形成屏障。ILM通常用作将药物从玻璃体液递送到所述视网膜的屏障。然而，因为细胞跨越整个视网膜(32)，所以ILM处的经过活化的Müller细胞具有改善药物到外部视网膜的递送的潜力。例如，如纳米颗粒等药物递送系统可以在内界膜处被内吞到Müller细胞中，在其细胞内空间内扩散，并且然后从外界膜处的Müller细胞胞吐并进入光感受器基质中(33)。因此，ILM中的多配体聚糖-4上调意味着本发明的构建体可以有效地递送到视网膜。此外，多配体聚糖-4在脉络膜和视网膜的内皮细胞中上调，这意味着本发明的构建体将被这些组织摄取，从而有利于跨血视网膜屏障传递。
对于本领域技术人员显而易见的是，除非上下文另有明确要求，否则本文提及的“构建体”包含根据本发明的第四十方面到第四十五方面的构建体以及在本发明的第一方面到第三十三方面中使用的构建体。
包括源自HBV病毒的X蛋白的靶向载体肽的构建体的用途适用于眼部和其它器官中的与缺氧相关的疾病和病症。具体地，通过非限制性实例，此些构建体的用途适用于与AMD和/或糖尿病性视网膜病具有相似病因的疾病和病症。也就是说，例如由炎症、导致出血和/或局部缺血的血管渗漏引起的疾病或病症。通过非限制性实例，所述构建体的用途适用于如心脏病发作、中风、癌症、短暂性脑缺血发作、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、血管性痴呆、心脏缺血、缺血性结肠炎、急性肢体缺血、皮肤缺血、AMD、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉和/或分支闭塞、视网膜动脉闭塞、视网膜中风、黄斑水肿、葡萄膜炎、睑缘炎、重度干眼综合征或视神经炎等病症和疾病。通过本文的描述，本发明适用的其它疾病和病症将是显而易见的。
在一个特定实例中，发明人已经发现，包括Gap19(能够与连接蛋白43的细胞内结构域相互作用的肽)和源自乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白的载体肽的构建体可以用于将Gap19有效递送到人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)和原代人视网膜微血管内皮细胞(hMREC)的细胞质。发明人发现，所述构建体维持了Gap19在抑制连接蛋白43(Cx43)半通道开放中的功能，并且具有出乎意料的到细胞中的高摄取率、高功效和低毒性。此外，缺氧人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)和缺氧原代人视网膜微血管内皮细胞(hMREC)的摄取增加。不希望受理论的束缚，发明人惊奇地发现，这种靶向载体功能似乎通过缺氧组织中的多配体聚糖-4上调促进。
眼部的许多病症或疾病是炎症、导致出血的血管渗漏、局部缺血和/或缺氧的结果或由其造成。具体地，眼后腔的许多病症或疾病是炎症、导致出血的血管渗漏、局部缺血和/或缺氧的结果或由其造成。本发明的构建体可用于治疗具有相似病因的AMD、糖尿病性神经病以及其它眼部疾病和病症(包含例如视网膜静脉和/或分支静脉闭塞、视网膜动脉闭塞或视网膜中风、糖尿病性黄斑水肿、葡萄膜炎、睑缘炎、重度干眼综合征或视神经炎)。
此外，其它器官和器官系统的许多病症或疾病(具体地慢性病症或疾病)是炎症、导致出血的血管渗漏、局部缺血和/或缺氧的结果或由其造成。具体地，这些疾病或病症包含许多癌症(一般包含例如脑胶质瘤、卵巢癌、缺氧性肿瘤)、脑中风、心血管疾病(包含心脏缺血、心包炎、心肌梗塞、缺血性瓣膜疾病)、败血症(包含急性胰腺炎、结肠炎、自身免疫性疾病、腹腔疾病、肾小球肾炎、肝炎、炎性肠病、灌注前损伤和移植排斥)。
由发明人提出并在其研究中使用的特定构建体具有氨基酸序列lclrpvGGKQIEIKKFK(SEQ ID NO:1)，其中小写字母代表D-异构体。此构建体包括靶向载体肽LCLRPV(SEQ ID NO:2)和能够与通过GG连接子连接的Cx43半通道KQIEIKKFK(SEQ ID NO:3)的细胞内结构域相互作用的肽(又名Gap19)。为了便于参考，将SEQ ID NO:1的肽称为XG19。
如上文和本文其它地方所述，包括源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽的变体的构建体也用于本发明的方法中。如上文和本文其它地方所述，包括用于递送到缺氧细胞的替代性化合物的构建体也用于本发明的方法中。例如，如上文和本文其它地方所述，包括能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的变体和替代性肽的构建体用于治疗眼部疾病和病症。
因此，本发明包括此些源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽的用途，其用于将化合物(包含治疗剂)靶向递送到缺氧细胞。例如，出于研究目的，肽用于将治疗剂靶向递送到受试者中的缺氧细胞(组织)以及将化合物靶向递送到缺氧细胞。
包括源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和化合物(包含治疗剂)的构建体的用途将意味着所述化合物将能够以比例如天然化合物更低的剂量施用，从而减少副作用。此外，将化合物靶向缺氧细胞将减少脱靶效应，并意味着更多的化合物可用于靶细胞。
此外，如上文和本文其它地方所述，对此些构建体进行编码的核酸和包括对此些构建体进行编码的核酸的核酸载体用于本发明的方法中。
技术人员将容易理解，如本文所述，将化合物递送到细胞包含递送到细胞表面或在细胞内递送。
如将理解的，“载体肽”或“细胞穿透肽”是通过使膜易位、充当分子递送媒剂并用于将“货物”递送到细胞而促进细胞摄入或摄取各种货物的肽。
如本文中所使用的，“跨细胞膜移动”、“携带货物跨细胞膜”、“细胞膜移位”等类似短语应被广义地理解为涵盖将载体肽、递送到细胞的化合物和/或包括载体肽和化合物的构建体从细胞外部运送到细胞内部。这些短语等不应被理解为暗示跨过或穿过细胞膜的特定运送方式或机制。
如本文所用，短语“靶向载体肽”等应被广义地理解为涵盖能够靶向处于特定生理或病理生理状态的一或多个细胞的载体肽。在这种背景下，术语“靶向”不应理解为靶向特定细胞类型或细胞系。在本发明的一个优选实施例中，靶向细胞处于缺氧状态，并且载体肽可以被称为“缺氧靶向载体肽”或“缺氧细胞靶向肽”。
此外，将理解的是，能够用作载体肽的靶向肽也可以用于将货物递送到细胞表面。
如本文所用，术语“靶向(target)”和“靶向(targeting)”等应理解为与指定的一或多个细胞优先进行相互作用、结合或摄取，而不应要求100％的特异性。
如本文详述，本发明提供了将化合物靶向递送到缺氧细胞的方法。在某些实施例中，本发明提供了将化合物靶向递送到缺氧和非缺氧细胞混合群中的缺氧细胞的方法。
如本文所用，“缺氧细胞”是指已经暴露于不足以满足细胞氧气需求的氧气递送浓度的细胞。例如，氧气的浓度显著低于健康充分灌注的组织中的氧气的正常生理浓度。所述短语应被广义地解释为包含存在氧气递送减少的情况以及完全缺乏氧气递送的情况。优选地，缺氧细胞由于缺氧而表现出多配体聚糖-4上调。引发多配体聚糖-4上调的缺氧可能是暂时性的并且不需要持续或特定水平的缺氧。除非上下文另有明确要求，否则短语“缺氧细胞”应被理解为包含单数，即“一个缺氧细胞”。
本领域技术人员将理解，“缺氧细胞”可以构成组织或组织的一部分或区域。例如，缺氧细胞可以构成具有不同程度或不同区域的氧气灌注的组织。应当理解，组织可以由正常组织、患病组织(例如，肿瘤组织或发炎组织)或两者的混合物构成。应当理解，由于疾病进程，组织可能具有不同程度或不同区域的氧气灌注，但这不是必须的情况。
取决于递送需求的目的，构建体、核酸和/或包括核酸的载体的递送可以在体内或体外发生。此些方法可以用于研究目的或治疗疾病。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、治疗(treating)或“治疗(treated)”等应以其最广泛的含义来理解。这些术语不一定意味着对受试者进行治疗直到完全康复为止。因此，“治疗”广义地包含例如预防、改善或管理疾病或病症的一或多种症状和一或多种症状的严重程度以及预防或以其它方式减少发生继发性并发症的风险。
应当理解，本发明的方法可以包括向受试者施用对本发明的构建体进行编码的核酸和/或向受试者施用包括对本发明的构建体进行编码的核酸的载体。同样，应当理解，本发明的方法可以包括使对本发明的构建体进行编码的核酸与细胞群接触和/或使包括对本发明的构建体进行编码的核酸的载体与细胞群接触。
如本领域技术人员将容易理解的，可以通过多种不同的方式将构建体(或核酸或对其进行编码的载体)递送到细胞。然而，通过举例，体外方法可以包括使构建体(或核酸或对其进行编码的载体)与一或多个细胞或包括一或多个细胞的组合物接触，例如使所述构建体或肽(或核酸或对其进行编码的载体)与包含一或多个细胞的样品、组合物或培养基接触(如将本发明的组合物与包含一或多个细胞的液体样品混合)。在另一个实施例中，本发明的方法包括向受试者施用构建体(或核酸或对其进行编码的载体)。
在本文描述的本发明的任何方面的一个实施例中，所述靶向载体肽包括氨基酸序列LCL(SEQ ID NO:4)。
在本文描述的本发明的任何方面的某些实施例中，所述靶向载体肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：LCLRP(SEQ ID NO:5)、LCLRPV(SEQ ID NO:2)、LCLRPVG(SEQ IDNO:6)、LCLRPVGAE(SEQ ID NO:7)、LCLRPVGAESR(SEQ ID NO:8)、LCLRPVGAESRGRPV(SEQ IDNO:9)或LCLRPVGAESRGRPVSGPFG(SEQ ID NO:10)以及其功能等效变体。
本发明的这些实施例的靶向载体肽可以进一步包括C端处、N端处或这两端处的一或多个氨基酸。C端处的另外的氨基酸可以包括一或多个对应于天然HBV X蛋白的氨基酸1到15的氨基酸，使得肽序列对应于来自天然HBV X蛋白的连续氨基酸的区域。N端处的另外的氨基酸可以包括一或多个对应于天然HBV X蛋白的氨基酸21到35的氨基酸，使得肽序列对应于来自天然HBV X蛋白的连续氨基酸的区域。C端和/或N端处的另外的氨基酸也可以包括异源氨基酸，使得另外的氨基酸的肽序列不对应于来自天然HBV X蛋白的连续氨基酸的区域。
在本文描述的本发明的任何方面的一个实施例中，所述靶向载体肽由氨基酸序列LCL(SEQ ID NO:4)组成。
在本文描述的本发明的任何方面的某些实施例中，所述靶向载体肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：LCLRP(SEQ ID NO:5)、LCLRPV(SEQ ID NO:2)、LCLRPVG(SEQ ID NO:6)、LCLRPVGAE(SEQ ID NO:7)、LCLRPVGAESR(SEQ ID NO:8)、LCLRPVGAESRGRPV(SEQ ID NO:9)或LCLRPVGAESRGRPVSGPFG(SEQ ID NO:10)以及其功能等效变体。
在本文描述的本发明的任何方面的某些实施例中，所述靶向载体肽由氨基酸序列LCLX(SEQ ID NO:11)、XLCL(SEQ ID NO:12)或XLCLX(SEQ ID NO:13)组成，其中X是任何氨基酸。
如上所述，在某些实施例中，X可以是任何氨基酸，包含天然和非天然存在的氨基酸。在序列表中，X是任何天然存在的氨基酸，但是本发明不应解释为以此方式进行限制。仅通过举例，X可以选自G、A、V、L、I、S、C、T、M、F、Y、W、P、H、K、R、D、E、N、Q、牛磺酸、鸟氨酸、5-羟基赖氨酸、e-N-甲基赖氨酸和3-甲基组氨酸。X也可以包括经过修饰的氨基酸，包含硒代半胱氨酸、羟基脯氨酸、硒代蛋氨酸、羟丁赖氨酸(hypusine)和羧化谷氨酸。伯胺基和伯羧基可以被修饰成包含亲核加成、胺基的酰胺键形成和亚胺形成、以及羧酸基的酯化、酰胺键形成和脱羧。某些氨基酸残基可能已添加疏水基以用于膜定位或内体释放，或已经历肉豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化或异戊烯化、法呢基化、香叶基香叶基化、糖基化、脂酰化、黄素部分(FMN或FAD)的附着、磷酸泛亚乙基化、乙醇胺磷酸甘油附着、酰化、N-酰化(酰胺)、S-酰化(硫酯)、乙酰化、烷基化(甲基、乙基)、甲基化、酰胺化、聚谷氨酰化、丁酰化、糖基化、糖化、聚唾液酸化、丙二酰化、羟基化、碘化、核苷酸加成(例如，ADP-核糖基化)、氧化、磷酸酯(O-连接)或氨基磷酸酯(N-连接)形成、磷酸化、组氨酸(N-连接)腺苷酸化、丙酰化、焦谷氨酸形成、S-谷胱甘肽化、S-亚硝基化、琥珀酰化加成、硬脂酰化、硫酸化、亚硒化、生物素化、聚乙二醇化、瓜氨酸化、脱氨基化或氨基甲酰化。
在本文描述的本发明的任何方面的某些实施例中，所述靶向载体肽包括氨基酸序列LCLK(SEQ ID NO:14)、LCLH(SEQ ID NO:15)、LCLR(SEQ ID NO:16)、LCLE(SEQ ID NO:17)、LCLN(SEQ ID NO:18)、LCLQ(SEQ ID NO:19)、VLCLR(SEQ ID NO:20)或LCLD(SEQ IDNO:21)。在一个特定实施例中，所述靶向载体肽包括LCLK(SEQ ID NO:14)、LCLH(SEQ IDNO:15)、LCLR(SEQ ID NO:16)、LCLE(SEQ ID NO:17)、LCLN(SEQ ID NO:18)、LCLQ(SEQ IDNO:19)或LCLD(SEQ ID NO:21)的L-异构体。在一个特定实施例中，所述靶向载体肽包括VLCLR(SEQ ID NO:20)的D-异构体。
本发明的这些实施例的靶向载体肽可以进一步包括C端处、N端处或这两端处的一或多个氨基酸。C端处的另外的氨基酸可以包括一或多个对应于天然HBV X蛋白的氨基酸1到15的氨基酸，使得另外的氨基酸的肽序列对应于来自天然HBV X蛋白的连续氨基酸的区域。N端处的另外的氨基酸可以包括一或多个对应于天然HBV X蛋白的氨基酸21到35的氨基酸，使得另外的氨基酸的肽序列对应于来自天然HBV X蛋白的连续氨基酸的区域。C端和/或N端处的另外的氨基酸也可以包括异源氨基酸，使得另外的氨基酸的肽序列不对应于来自天然HBV X蛋白的连续氨基酸的区域。
在本文描述的本发明的任何方面的某些实施例中，所述靶向载体肽由氨基酸序列LCLK(SEQ ID NO:14)、LCLH(SEQ ID NO:15)、LCLR(SEQ ID NO:16)、LCLE(SEQ ID NO:17)、LCLN(SEQ ID NO:18)、LCLQ(SEQ ID NO:19)、VLCLR(SEQ ID NO:20)或LCLD(SEQ ID NO:21)组成。在一个特定实施例中，所述靶向载体肽由LCLK(SEQ ID NO:14)、LCLH(SEQ ID NO:15)、LCLR(SEQ ID NO:16)、LCLE(SEQ ID NO:17)、LCLN(SEQ ID NO:18)、LCLQ(SEQ ID NO:19)或LCLD(SEQ ID NO:21)的L-异构体组成。在一个特定实施例中，所述靶向载体肽由VLCLR(SEQ ID NO:20)的D-异构体组成。
在本文描述的本发明的任何方面的某些实施例中，所述靶向载体肽包括氨基酸序列XCXR(SEQ ID NO:22)，其中X是任何疏水性氨基酸。在一个实施例中，所述靶向载体肽包括序列ICIR(SEQ ID NO:23)或VCVR(SEQ ID NO:24)。
本发明的这些实施例的靶向载体肽可以进一步包括C端处、N端处或这两端处的一或多个氨基酸。C端处的另外的氨基酸可以包括一或多个对应于天然HBV X蛋白的氨基酸1到15的氨基酸，使得肽序列对应于来自天然HBV X蛋白的连续氨基酸的区域。N端处的另外的氨基酸可以包括一或多个对应于天然HBV X蛋白的氨基酸21到35的氨基酸，使得肽序列对应于来自天然HBV X蛋白的连续氨基酸的区域。C端和/或N端处的另外的氨基酸也可以包括异源氨基酸，使得另外的氨基酸的肽序列不对应于来自天然HBV X蛋白的连续氨基酸的区域。
在本文描述的本发明的任何方面的某些实施例中，所述靶向载体肽由氨基酸序列XCXR(SEQ ID NO:22)组成，其中X是任何疏水性氨基酸。在一个实施例中，所述靶向载体肽由氨基酸序列ICIR(SEQ ID NO:23)或VCVR(SEQ ID NO:24)组成。
本发明的此实施例的疏水性氨基酸可以是天然或非天然存在的，或可以包括经过修饰的氨基酸(例如，如上所述修饰的)。仅通过举例，所述疏水性氨基酸可以选自L、V、I、M、F和W。
除非本文另有说明，否则用于本发明的肽和本发明的构建体可以由L-氨基酸、D-氨基酸或其混合物构成，并且可以包含非天然存在的氨基酸。
考虑到本文中的信息和其它公开的序列信息，技术人员将容易理解天然X蛋白的1-35位氨基酸。举例而言，参见GenBank登录号Y18857也提供了示范性序列信息，并且读者通过引用明确地指向此数据库，并且所述条目包含在本文的本发明的一般描述中。另外，Günther S(冈瑟S)、Fischer L(费舍尔L)、Pult I(普特I)、Sterneck M(思德涅克M)和Will H(威尔H),乙型肝炎病毒的天然存在变体(Naturally occurring variants of hepatitisB virus),先进病毒研究(Adv Virus Res.),1999；52:25-137提供了许多X蛋白的序列信息。进一步地，下表1中提供了有用序列信息的实例。
表1：
Figure GDA0002448045650000211
Figure GDA0002448045650000221
关于本发明中使用的靶向载体肽的另外信息可以在WO 2011/155853和WO 2013/165262中找到，其公开内容通过引用并入本文中。本领域的读者将理解，在这些出版物中对非载体用途的肽的引用是不相关的。
如上所述，本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面、第二十七方面、第四十方面、第四十一方面、第四十二方面、第四十三方面、第四十四方面和/或第四十五方面提供了包括能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽的构建体、对此些构建体进行编码的核酸、包括对此些构建体进行编码的核酸的核酸载体、包括构建体的组合物、构建体在治疗方法中的用途、构建体在药物制备方法中的用途和/或构建体在治疗疾病或病症中的用途。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面、第二十七方面、第四十方面、第四十一方面、第四十一方面、第四十二方面、第四十三方面、第四十四方面和/或第四十五方面的一个实施例中，所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽能够与Cx43的细胞内C端尾相互作用。在一个实施例中，所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽能够与Cx43的细胞内环相互作用。在一个实施例中，所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽能够与Cx43的细胞内N端尾相互作用。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面、第二十七方面、第四十方面、第四十一方面、第四十二方面、第四十三方面、第四十四方面和/或第四十五方面的一个实施例中，所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽能够抑制Cx43的细胞内C端尾与Cx43的细胞内环相互作用。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面、第二十七方面、第四十方面、第四十一方面、第四十二方面、第四十三方面、第四十四方面和/或第四十五方面的一个实施例中，所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽能够优选地在不阻断间隙连接的情况下抑制Cx43半通道开放。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面、第二十七方面、第四十方面、第四十一方面、第四十二方面、第四十三方面、第四十四方面和/或第四十五方面的一个实施例中，所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
KQIEIKKFK(SEQ ID NO:3；Gap-19)；
DGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:67)；
DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:68)；
RPSSRASSRASSRPRPDDLEI(SEQ ID NO:69)；
RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI(SEQ ID NO:70)；
RPRPDDLEI(SEQ ID NO:71)；
SRPRPDDLEI(SEQ ID NO:72)；
以及其功能等效变体。
本发明的此些实施例的能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽可以进一步包括C端处、N端处或这两端处的一或多个氨基酸。C端和/或N端处的另外的氨基酸可以包括一或多个对应于天然Cx43蛋白氨基酸的氨基酸，使得肽序列对应于来自天然Cx43蛋白的连续氨基酸的区域。C端和/或N端处的另外的氨基酸也可以包括异源氨基酸，使得另外的氨基酸的肽序列不对应于来自天然Cx43蛋白的连续氨基酸的区域。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面、第二十七方面、第四十方面、第四十一方面、第四十二方面、第四十三方面、第四十四方面和/或第四十五方面的一个实施例中，所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：
KQIEIKKFK(SEQ ID NO:3)；
DGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:67)；
DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:68)；
RPSSRASSRASSRPRPDDLEI(SEQ ID NO:69)；
RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI(SEQ ID NO:70)；
RPRPDDLEI(SEQ ID NO:71)；
SRPRPDDLEI(SEQ ID NO:72)；
以及其功能等效变体。
考虑到本文中的信息和其它公开的序列信息，技术人员将容易理解天然Cx43蛋白的氨基酸。举例而言，http://www.uniprot.org/uniprot/P17302也提供了示范性序列信息，并且读者通过引用明确地指向此数据库，并且所述条目包含在本文的本发明的一般描述中。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面、第二十七方面、第四十方面、第四十一方面、第四十二方面、第四十三方面、第四十四方面和/或第四十五方面的一个实施例中，所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽是能够促进间隙连接偶联和/或增加间隙连接电导的肽。本领域技术人员将能够容易地识别此些肽。通过非限制性实例，能够与Cx43的细胞内结构域相互作用并且能够促进间隙连接偶联和/或增加间隙连接电导的肽包含罗替加肽(Rotigaptide)(ZP-123；N-乙酰基-D-酪氨酰基-D-脯氨酰基-(4S)-4-羟基-D-脯氨酰基甘氨酰基-D-丙氨酰基甘氨酰胺；Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2)以及其二肽类似物达那加肽(Danegaptide)(ZP-1609；(2S,4R)-1-(2-氨基乙酰基)-4-苯甲酰胺基吡咯烷-2-羧酸；又名GAP-134)。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面、第二十七方面、第四十方面、第四十一方面、第四十二方面、第四十三方面、第四十四方面和/或第四十五方面的一个特定实施例中，所述靶向载体肽是LCLRPV(SEQ ID NO:2)，并且所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽是KQIEIKKFK(SEQ ID NO:3)。
然而，应当理解，本文所述的靶向载体肽和本文所述的能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽可以以任何合适的组合用于本发明的构建体中。
如本文所用，“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”、“抑制(inhibition)”、“抑制剂(inhibitor)”、“阻断(block)”，“阻断(blocking)”、“阻断剂(blocker)”和类似术语应广义地理解为指功能或活性减少。其不应被视为暗示完全抑制或阻断功能或活性。本领域技术人员将容易理解可以用于评估功能和活性的方法。然而，通过举例，可以使用“实例”部分中描述的方法。
在本发明的其它方面，源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽用于递送治疗剂，所述治疗剂减少血管出血、炎症和损伤扩散和/或促进血管重建。此些治疗可以包含例如用于减少间隙连接半通道开放的治疗剂(4)。如发明人的研究中使用的靶向连接蛋白43的治疗剂(如Gap19)是针对此策略的合适治疗剂。这种性质的策略适用于肿瘤，其中提出完整性差而不是新生血管本身是肿瘤缺氧的根本原因(5)。
因此，在本发明的第一广泛方面、第二广泛方面、第三广泛方面、第四广泛方面、第六广泛方面、第八广泛方面、第十广泛方面、第十二广泛方面、第十四广泛方面、第十六广泛方面、第十八广泛方面、第二十广泛方面、第二十二广泛方面、第二十四广泛方面、第二十六广泛方面、第二十八广泛方面、第二十九广泛方面、第三十广泛方面、第三十一广泛方面、第三十二广泛方面、第三十三广泛方面、第三十四广泛方面、第三十六广泛方面、第三十七广泛方面、第三十八广泛方面和/或第三十九广泛方面的某些实施例中，所述化合物或治疗剂是能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
根据上述内容，对于本领域技术人员而言显而易见的是，除非上下文另有明确要求，否则本文中提到的“一或多种化合物”和“一或多种治疗剂”将涵盖能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
如上所述，本发明的第一方面、第二方面、第三方面、第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面、第二十六方面、第二十八方面、第二十九方面、第三十方面、第三十一方面、第三十二方面、第三十三方面、第三十四方面、第三十六方面、第三十七方面、第三十八方面和/或第三十九方面提供将化合物靶向递送到受试者中的缺氧细胞的方法、治疗与缺氧相关的疾病或病症的方法、构建体、核酸和核酸载体在药物制备中的用途、构建体、核酸和核酸载体在治疗与缺氧相关的疾病或病症的用途、将化合物靶向递送到缺氧细胞的方法、增加化合物摄取的方法、制备用于增加一或多个缺氧细胞对化合物摄取的药物的方法以及减少涉及化合物的治疗剂或治疗剂的脱靶效应的方法。
所述化合物可以是根据本发明的用于靶向递送到缺氧细胞的任何化合物。将理解的是，本文中提及的“缺氧细胞”应被理解为包含对多个“缺氧细胞”的提及。将理解的是，这也应被理解为包含提及一或多个缺氧组织。
在本发明的第一方面、第二方面、第三方面、第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面、第二十六方面、第二十八方面、第二十九方面、第三十方面、第三十一方面、第三十二方面、第三十三方面、第三十四方面、第三十六方面、第三十七方面、第三十八方面和/或第三十九方面的某些实施例中，所述化合物可以是用于治疗与缺氧相关的疾病或病症的治疗剂或对与缺氧相关的疾病或病症有益的治疗剂。在某些实施例中，所述化合物可以为与缺氧相关的疾病或病症提供诊断益处。在某些实施例中，所述化合物可以是用于研究目的化合物。
在本发明的第一方面、第二方面、第三方面、第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面、第二十六方面、第二十八方面、第二十九方面、第三十方面、第三十一方面、第三十二方面、第三十三方面、第三十四方面、第三十六方面、第三十七方面、第三十八方面和/或第三十九方面的某些实施例中，所述化合物可以是核酸、肽核酸、多肽(包含例如融合蛋白)、碳水化合物、拟肽、小分子抑制剂、化疗药物、抗炎药、抗体、单链Fv片段(SCFV)、脂质、蛋白聚糖、糖脂、脂蛋白、拟糖蛋白、天然产品或融合蛋白。当所述化合物是核酸时，其可以是DNA、RNA、cDNA、双链、单链、正义、反义或环状，例如包含脱氧核酶、iRNA、siRNA、miRNA、piRNA、lcRNA和核酶、噬菌粒、适配体。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，在某些情况下，某些化合物(包含治疗剂和诊断剂)将期望递送到缺氧细胞。例如，对于涉及治疗与缺氧相关的病症或疾病的方法，所述化合物可以是用于治疗所述疾病的治疗剂，其中将所述药剂靶向缺氧细胞将是期望的。通过另外的实例，对于涉及治疗与缺氧相关的病症或疾病的方法，所述化合物本身可以是用于治疗缺氧的治疗剂。
例如，源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽可以用于递送治疗剂，所述治疗剂减少血管出血、炎症和损伤扩散和/或促进血管重建。此些治疗可以包含例如用于减少间隙连接半通道开放的治疗剂(4)。如发明人的研究中使用的靶向连接蛋白43的治疗剂(如Gap19)将是针对此策略的合适治疗剂。这种性质的策略可能适用于肿瘤，其中提出完整性差而不是新生血管本身是肿瘤缺氧的根本原因(5)。
如上文所概述的，在本发明的第一方面、第二方面、第三方面、第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面、第二十六方面、第二十八方面、第二十九方面、第三十方面、第三十一方面、第三十二方面、第三十三方面、第三十四方面、第三十六方面、第三十七方面、第三十八方面和/或第三十九方面的某些实施例中，所述化合物或治疗剂可以是如本文其它地方所述的能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。具体地，在所述化合物或治疗剂是能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽的实施例中，所述化合物或治疗剂可以能够：
●与Cx43的细胞内C端尾相互作用；
●与Cx43的细胞内环相互作用；
●与Cx43的细胞内N端尾相互作用；
●抑制Cx43的细胞内C端尾与Cx43的细胞内环相互作用；和/或
●优选地在不阻断间隙连接的情况下抑制Cx43半通道开放。
在本发明的第一方面、第二方面、第三方面、第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面、第二十六方面、第二十八方面、第二十九方面、第三十方面、第三十一方面、第三十二方面、第三十三方面、第三十四方面、第三十六方面、第三十七方面、第三十八方面和/或第三十九方面的某些实施例中，所述化合物或治疗剂可以是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽，所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
KQIEIKKFK(SEQ ID NO:3；Gap-19)；
DGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:67)；
DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:68)；
RPSSRASSRASSRPRPDDLEI(SEQ ID NO:69)；
RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI(SEQ ID NO:70)；
RPRPDDLEI(SEQ ID NO:71)；以及
SRPRPDDLEI(SEQ ID NO:72)；
以及其功能等效变体。
本发明的实施例的能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽可以进一步包括C端处、N端处或这两端处的一或多个氨基酸。C端和/或N端处的另外的氨基酸可以包括一或多个对应于天然Cx43蛋白氨基酸的氨基酸，使得肽序列对应于来自天然Cx43蛋白的连续氨基酸的区域。C端和/或N端处的另外的氨基酸也可以包括异源氨基酸，使得另外的氨基酸的肽序列不对应于来自天然Cx43蛋白的连续氨基酸的区域。
在本发明的第一方面、第二方面、第三方面、第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面、第二十六方面、第二十八方面、第二十九方面、第三十方面、第三十一方面、第三十二方面、第三十三方面、第三十四方面、第三十六方面、第三十七方面、第三十八方面和/或第三十九方面的某些实施例中，所述化合物或治疗剂可以是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽，所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的所述肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：
KQIEIKKFK(SEQ ID NO:3；Gap-19)；
DGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:67)；
DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:68)；
RPSSRASSRASSRPRPDDLEI(SEQ ID NO:69)；
RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI(SEQ ID NO:70)；
RPRPDDLEI(SEQ ID NO:71)；以及
SRPRPDDLEI(SEQ ID NO:72)；
以及其功能等效变体。
在本发明的第一方面、第二方面、第三方面、第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面、第二十六方面、第二十八方面、第二十九方面、第三十方面、第三十一方面、第三十二方面、第三十三方面、第三十四方面、第三十六方面、第三十七方面、第三十八方面和/或第三十九方面的其它实施例中，所述化合物是能够促进间隙连接偶联和/或增加间隙连接电导的肽。通过非限制性实例，能够促进间隙连接偶联和/或增加间隙连接电导的肽包含罗替加肽(ZP-123；N-乙酰基-D-酪氨酰基-D-脯氨酰基-(4S)-4-羟基-D-脯氨酰基甘氨酰基-D-丙氨酰基甘氨酰胺；Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2)以及其二肽类似物达那加肽(ZP-1609；(2S,4R)-1-(2-氨基乙酰基)-4-苯甲酰胺基吡咯烷-2-羧酸；又名GAP-134)。
通过另外的实例，根据本发明的第一方面、第二方面、第三方面、第四方面、第二十八方面或第二十九方面，源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽用于优先将例如用于治疗肿瘤的细胞毒素递送到缺氧(癌性)细胞，从而减少正常的非癌细胞暴露并且因此减少副作用。因此，将能够施用更有效的治疗剂或更高的剂量而不会出现副作用。可替代地，将较低剂量更有效地递送到靶组织，从而减少副作用和脱靶效应。
例如，对于涉及癌症治疗的方法，所述化合物(或治疗剂)可以是用于靶向缺氧肿瘤细胞的表面作用或细胞质作用毒素。例如，表面作用毒素包含鱼毒素pardoxin(或其活性部分)、脂质代谢酶(PLA2、PLC)、那些具有膜离子通道功能的物质(如α-蝎毒素或树突毒素或其活性部分)、或作用于酪氨酸激酶受体的物质(如α-金黄色葡萄球菌或其活性部分)。例如，细胞质作用毒素可以包含靶向线粒体呼吸系统(鱼藤酮)、核酸(霉菌毒素或其活性部分)、囊泡释放(破伤风杆菌或其活性部分)的核糖体(白喉或其活性部分)的毒素。
在涉及癌症治疗的方法中使用的化合物的具体实例包含：
●用于治疗脑癌的替莫唑胺(烷化剂)；用于星形细胞瘤的二线治疗和用于多形性胶质母细胞瘤(脑胶质瘤)的一线治疗；
●用于乳腺癌的多西他赛；
●用于乳腺癌、胃癌和结肠直肠癌的5-氟尿嘧啶；
●用于乳腺癌、肺癌、膀胱癌或霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的阿霉素。
技术人员将理解，可以组合使用上述化合物中的一或多种。通过非限制性实例，可以使用表2中识别的化合物的组合。
表2：组合化疗
Figure GDA0002448045650000291
本领域技术人员将能够容易地识别适用于涉及癌症治疗的方法的另外的化合物或治疗剂。
除了递送将对本发明的构建体特别有用的活性化合物外，应当理解，本发明的化合物(或治疗剂)可以是前药或可活化药物。例如，源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽可以用于靶向缺氧活化的前药以治疗肿瘤，从而将所述前药聚集到缺氧组织以允许降低剂量。此些前药包含如艾伏磷酰胺(evofosfamide)、他索替尼、PR-104或硝基CBI等芳香族硝基缺氧活化的前药以及如替拉扎明或SN30000等N-氧化物缺氧活化的前药。这些药物“在肿瘤中通过酶一电子还原反应以产生前药自由基阴离子的过程活化”(25)。
在另一个实例中，根据本发明的第四方面、第六方面和/或第八方面，包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽的构建体用于治疗癌症，具体地用于阻断肿瘤生长。肿瘤(如癌症)的血管供应较差并且是缺氧的和/或具有缺氧的部分或区域，从而导致组织中的氧气水平降低。在肿瘤的情况下，持续缺血可以促进耐缺氧肿瘤细胞的存活率高于正常细胞。肿瘤血管中的结构异常可能影响对治疗的治疗应答。
在不希望受理论束缚，认为使用本发明的构建体的连接蛋白43半通道的暂时性阻断减少血管渗漏、促进正常血管形成、保护、维持和/或恢复脉管系统，并且阻断肿瘤生长并促进组织恢复。进一步地，这些结果将改善用细胞毒性化学治疗剂和/或放射疗法进行的治疗的结果。
因此，在一个实施例中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向受试者施用构建体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向受试者施用对构建体进行编码的核酸，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向受试者施用包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在其它实施例中，本发明还提供了治疗癌症的方法，所述方法包括施用如所述的与一或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂组合的组合物，所述组合物包括构建体、核酸或核酸载体。
因此，在另一个实施例中，本发明提供了一种构建体的用途，其用于制备用于治疗癌症的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种对构建体进行编码的核酸的用途，其用于制备用于治疗癌症的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体的用途，其用于制备用于治疗癌症的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
因此，在另一个实施例中，本发明提供了一种构建体的用途，其用于治疗癌症，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种对构建体进行编码的核酸的用途，其用于治疗癌症，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体的用途，其用于治疗癌症，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在某些实施例中，所述癌症是脑神经胶质瘤(胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、卵巢癌、表皮癌、乳腺癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、结肠直肠癌、肺癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤。
在某些实施例中，所述癌症的治疗涉及减少肿瘤生长。在其它实施例中，所述癌症的治疗涉及减少血管渗漏。在其它实施例中，所述癌症的治疗涉及促进正常血管形成。在其它实施例中，所述癌症的治疗涉及保护、维持和/或恢复脉管系统。
在另一个实例中，根据本发明的第四方面、第六方面和/或第八方面，源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽可以用于治疗由缺氧病状引起的“继发性”疾病进程。例如，优先将保护剂递送到缺氧细胞以预防或改善另外的细胞损伤。使用能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽化合物是此策略的一个实例。
通过非限制性实例，根据本发明的第四方面、第六方面和/或第八方面，中风时可以使用神经保护剂。在本发明中使用的神经保护剂的实例包含靶向兴奋性毒性的化合物(如NMDA拮抗剂)、抗氧化剂、自由基清除剂、减少神经胶质的炎性应答的药剂和增强神经胶质的抗炎性应答的药剂。
通过另外的非限制性实例，神经修复剂可以用于中风、肌肉营养不良、多发性硬化症、淀粉样蛋白侧索硬化症的情况。
在另一个实例中，对于根据本发明的第四方面、第六方面和/或第八方面的涉及治疗中风的方法，所述化合物(或治疗剂)可以是组织纤溶酶原活化剂(tPA)或重组组织纤溶酶原活化剂(rtPA)。例如，rtPA可以是阿替普酶(Activase、Actilyse)、瑞替普酶(Retavase、Rapilysin)、替奈普酶(TNKase)或去氨普酶。
通过另外的非限制性实例，对于根据本发明的第四方面、第六方面和/或第八方面的涉及治疗心肌梗塞中风的方法，所述化合物(或治疗剂)可以是组织纤溶酶原活化剂(tPA)或重组组织纤溶酶原活化剂(rtPA)。例如，rtPA可以是阿替普酶(Activase、Actilyse)、瑞替普酶(Retavase、Rapilysin)、替奈普酶(TNKase)或去氨普酶。
根据本发明靶向缺氧细胞将减少对正常(非缺氧)细胞和组织的副作用和脱靶效应。因此，可以施用更有效的治疗剂或更高的剂量而不会出现副作用。可替代地，将较低剂量更有效地递送到靶组织，从而减少副作用和脱靶效应。
在另一个实例中，包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽的构建体用于治疗中风，具体地缺血性中风，并且更具体地在中风后促进神经元存活。
在不希望受理论束缚，可以理解，连接蛋白43半通道的暂时性阻断通过预防病变扩散和血管破裂而在缺血性中风后减少血管渗漏并促进神经元存活，从而使再灌注损伤最小化并增强功能恢复。如本文所述，发明人惊奇地发现，本发明的构建体优先递送到缺氧细胞，并且不会被循环血细胞隔离。这将使快速靶向递送到缺氧细胞，这是有利的，因为中风治疗的时间至关重要。这是如本文其它地方所述对有益地降低脱靶效应的补充。发明人观察到针对视网膜的成功施用。这将转化为跨血脑屏障的有效递送。此外，如上文所概述的，发明人观察到发炎和缺氧脑组织中的血管内皮周围的多配体聚糖-4表达增加，在血脑屏障中具有高水平的表达。因此，本发明的构建体可以用于将药物靶向递送到中枢神经系统。
因此，在一个实施例中，本发明提供了一种治疗中风的方法，所述方法包括：向受试者施用构建体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种治疗中风的方法，所述方法包括：向受试者施用对构建体进行编码的核酸，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种治疗中风的方法，所述方法包括：向受试者施用包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在其它实施例中，本发明还提供了治疗中风的方法，其包括施用如所述的与一或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂组合的组合物，所述组合物包括构建体、核酸或核酸载体。
因此，在另一个实施例中，本发明提供了一种构建体的用途，其用于制备用于治疗中风的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种对构建体进行编码的核酸的用途，其用于制备用于治疗中风的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体的用途，其用于制备用于治疗中风的药物，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
因此，在另一个实施例中，本发明提供了一种构建体的用途，其用于治疗中风，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种对构建体进行编码的核酸的用途，其用于治疗中风，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。在另外的实施例中，本发明提供了一种包括对构建体进行编码的核酸的核酸载体的用途，其用于治疗中风，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
在某些实例中，所述中风是缺血性中风。在其它实例中，中风治疗促进中风特别是缺血性中风后神经元的存活。
在另一个实例中，将tPA与根据本发明第四方面的包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽的构建体共同施用。施用包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽的构建体可以通过减少血管渗漏以预防病变扩散和血管破裂来扩展tPA的治疗窗。
通过另外的非限制性实例，败血症与灌注不足相关，并且本发明提供了源自X蛋白的靶向载体肽可以用于在感染部位向缺氧(灌注不足的)细胞递送抗菌或抗真菌剂。
根据本发明靶向缺氧细胞将减少对正常(非缺氧)细胞和组织的副作用和脱靶效应。因此，将能够施用更有效的治疗剂或更高的剂量而不会出现副作用。可替代地，将较低剂量更有效地递送到靶组织，从而减少副作用和脱靶效应。
技术人员可以容易地理解根据本发明使用的化合物(包含治疗剂)的另外的实例。
如上所述，本发明包含在本发明中使用的肽的功能等效变体，例如靶向载体肽和/或能够与连接蛋白43的细胞内结构域相互作用的肽的功能等效变体。如本文所使用的短语“功能等效变体”包含其中已经进行了一或多个保守氨基酸取代同时基本上保留了肽的期望功能的那些肽。如本文所使用的，肽的“功能等效变体”旨在包含其中删除或添加了一或多个氨基酸的肽片段或肽变体，只要此些变体至少保留了它们作为其变体的蛋白质或肽的期望活性的水平。
通过举例，在靶向载体肽的情况下，所述肽以及其功能等效变体将具有以下能力：(a)穿过细胞膜进入细胞，优选地携带能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的化合物或治疗剂或肽穿过细胞膜，以及(b)靶向特定生理或病理生理状态下的一或多个细胞，优选地处于缺氧状态的细胞的能力。
此外，将理解的是，能够用作载体肽的靶向肽也可以用于将货物递送到细胞表面。
在本发明中使用的一或多种肽以及其一或多个功能等效变体在本文中可以统称为“一或多种肽”。因此，在没有特别提及的地方，在本发明中提到使用的一或多种“肽”应被理解为包含其功能等效变体。
应当理解，“功能等效变体”可以具有比其作为变体的肽更高或更低的活性水平。在本发明的各个实施例中，功能等效变体具有其作为变体的肽的活性水平的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。
基于本文所包含的信息并使用本领域已知的技术，技术人员将容易地理解期望的功能并且能够评估功能并确定肽或其功能等效变体的活性水平。
通过举例，在靶向载体肽的情况下，所述肽或变体将具有以下能力：(a)穿过细胞膜进入细胞，优选地携带化合物穿过细胞膜，以及(b)靶向特定生理或病理生理状态下的一或多个细胞，优选地处于缺氧状态的细胞的能力。例如，可以使用“实例”部分中描述的技术基于将变体(优选地，包括所述变体的构建体)摄入细胞来评估此功能和活性水平。
通过举例，在能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽的情况下，所述肽以及其功能等效变体将具有与连接蛋白43的细胞内结构域相互作用的能力。在能够抑制Cx43的细胞内C端尾与Cx43的细胞内环相互作用的肽的情况下，所述肽以及其功能等效变体将具有抑制Cx43的细胞内C端尾与Cx43的细胞内环相互作用的能力。在能够抑制Cx43半通道开放的肽的情况下，所述肽以及其功能等效变体将具有抑制Cx43半通道开放的能力。例如，可以使用“实例”部分中描述的技术来评估此功能和活性水平。
如本文所使用的，“一或多个保守氨基酸取代”应广义地理解为具有相似生化特性的氨基酸的取代。本领域技术人员将理解，基于不同氨基酸之间的相对相似性进行适当的保守氨基酸取代，包含氨基酸侧链取代基的相似性(例如，它们的大小、电荷、亲水性、疏水性等)。通过举例，保守取代包含：一个脂肪族氨基酸被另一个脂肪族氨基酸取代、一个具有含羟基或含硫的侧链的氨基酸被另一个具有含羟基或含硫的侧链的氨基酸取代、一个芳香族氨基酸被另一个芳香族氨基酸取代、一个碱性氨基酸被另一个碱性氨基酸取代、或一个酸性氨基酸被另一个氨基酸取代。通过另外的实例，“一或多个保守氨基酸取代”包含：
-甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的相互取代；
-丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸或蛋氨酸的相互取代；
-苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的相互取代；
-组氨酸、赖氨酸或精氨酸的相互取代；以及
-天门冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的相互取代。
根据本发明的含有氨基酸取代的功能等效变体将优选地保留与原始肽至少70％、80％、90％、95％或99％的氨基酸序列相似性。在一个实施例中，所述功能等效变体与原始肽具有至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性。
本发明中使用的肽(包含功能等效变体)和本发明的构建体可以由L-氨基酸、D-氨基酸或其混合物构成，并且可以包含非天然存在的氨基酸。具体地，可以通过化学肽合成来产生根据本发明使用的肽的D-异构形式。在本发明的某些实施例中，可以优选靶向载体肽和/或能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的D-异构形式。例如，可以优选D-异构体，因为它们对蛋白酶更具抗性。在本发明的其它实施例中，可以优选靶向载体肽和/或能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的L-异构形式。例如，可以优选L-异构体，因为它们更紧密地模拟天然存在的肽。本领域技术人员将容易认识到D-异构体和L-异构体的适当使用。
应当理解，本发明使用的肽或本发明的作为融合肽的构建体(包含功能等效变体)是“分离的”或“纯化的”肽。“分离的”或“纯化的”肽是已经从其天然存在的环境中鉴别并分离出的或人工合成的肽。应当理解，这些术语并不反映所述肽已经从其天然存在的环境中纯化或分离的程度。
本发明使用的肽或本发明的作为融合肽的构建体可以从天然源分离，或优选地通过化学合成(例如，以下所述的fmoc固相肽合成：菲尔兹GB(Fields GB),劳埃尔-菲尔兹JL(Lauer-Fields JL),利乌RQ(Liu RQ)和巴拉尼G(Barany G)(2002)《固相肽合成的原理和实践(Principles and Practice of Solid-Phase peptide Synthesis)》；格兰特G(GrantG)(2002)《合成产物评估之合成肽，用户指南(Evaluation of the SyntheticProduct.Synthetic Peptides,A User's Guide)》,格兰特GA(Grant GA),第二版,93-219；220-291,纽约牛津大学出版社)或基因表达技术衍生，其方法在本发明涉及的领域中是众所周知的。标准重组DNA和分子克隆技术描述于例如：萨姆布鲁克(Sambrook)和马尼亚蒂斯(Maniatis),《分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第二版,纽约冷泉港冷泉港实验室出版社,(1989)；希尔哈维(Silhavy)等人,《基因融合实验(Experiments with Gene Fusions)》,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社,(1984)；以及奥苏贝尔(Ausubel)等人,《分子生物学实验指南(Current Protocols in MolecularBiology)》,由格林出版协会和威利国际科学出版社(1987)。本发明的肽的产生也可以通过合适的转基因动物、微生物或植物来实现。
所述靶向载体肽和所述化合物(包含治疗剂并且包含能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽)可以通过任何方式彼此“连接”，所述方式允许所述靶向载体肽携带所述化合物(或治疗剂)穿过细胞膜进入细胞中，同时至少保留所述化合物(或治疗剂)的功能和结构水平。词语“连接”或类似术语应被广义地理解为涵盖所述靶向载体肽与所述化合物或治疗剂之间的任何形式的连接、键合、融合或关联(例如但不限于，共价键合、离子键合、氢键合、芳香族堆积相互作用、酰胺键、二硫键合、螯合)，并且不应被视为暗示特定的连接强度。所述靶向载体肽和所述化合物(或治疗剂)可以以不可逆或可逆的方式连接，使得一旦进入细胞，所述化合物就会从所述靶向载体肽中释放出来。
所述化合物(或治疗剂)可以在其N端、C端或任何其它位置与所述靶向载体肽连接。在一个特定实施例中，所述化合物(或治疗剂)在其N端与所述靶向载体肽连接。在另一个特定实施例中，所述化合物(或治疗剂)在其C端与所述靶向载体肽连接。所述化合物(或治疗剂)可以如上所述与所述靶向载体肽连接。如本文所述，所述化合物(或治疗剂)可以与所述靶向载体肽直接或间接连接。
应当理解，尽管所述靶向载体肽和所述化合物(包含治疗剂并且包含能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽)可以彼此直接连接，本发明中使用的构建体也可以利用连接所述靶向载体肽和所述化合物的连接子分子(包含治疗剂并且包含能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽)。技术人员将理解在本发明中使用的合适的连接子分子。然而，通过举例，所述连接子分子可以是肽，例如柔性肽连接子、刚性肽连接子或可裂解的肽连接子。在WO 91/09958、WO 03/064459、WO 00/29427和WO 01/13957中也提供了合适的连接子分子的实例。连接子的实例包含甘氨酸连接子和聚谷氨酰胺连接子。可能使用的连接子设计工具实例包含阿姆斯特丹自由大学综合生物信息学中心VU的连接子数据库(http:// www.ibi.vu.nl/programs/linkerdbwww/)。
在一个实施例中，所述构建体进一步包括连接所述靶向载体肽和所述化合物(或治疗剂)的连接子。
在一个实施例中，所述化合物(或治疗剂)是肽。在一个实施例中，所述化合物(或治疗剂)是肽，并且所述构建体是融合肽。
通过举例，当所述化合物(或治疗剂)是肽时，可以使用已知的重组表达或化学合成技术(如本文所述)产生所述构建体；例如，所述构建体包括能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽。所述靶向载体肽和所述肽化合物(或治疗剂)也可以分开制备，然后彼此连接。例如，可以使用已知的重组表达或化学合成技术(如本文所述)产生所述靶向载体肽，然后再与重组表达或化学合成的肽化合物(例如，能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽)连接。
仅通过举例，WO 91/09958、WO 03/064459、WO 00/29427、WO 01/13957中描述的方法可用于制备本发明的各种构建体。
根据本发明的第三十四方面、第三十六方面和/或第三十八方面，本发明的某些方法包括将化合物或治疗剂与源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽连接。如本文其它地方所述，本发明的这些方面使用靶向载体肽。在某些实施例中，如本文所述，所述化合物或治疗剂是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽。然而，技术人员将容易理解在本发明的这些方面中使用的其它化合物。如本文其它地方所述，可以制备和连接所述化合物/治疗剂和靶向载体肽。
根据本发明的第三十五方面、第三十七方面和/或第三十八方面，本发明的某些方法包括将编码肽化合物或肽治疗剂的核酸与编码源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽的核酸连接。如本文其它地方所述，本发明的这些方面使用靶向载体肽。在某些实施例中，如本文所述，所述肽化合物或肽治疗剂是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽。然而，技术人员将容易理解在本发明的这些方面中使用的其它肽化合物。如本文其它地方所述，可以制备和连接编码肽化合物/治疗剂的核酸和编码靶向载体肽的核酸。
在本文描述的本发明的任何方面的某些实施例中，除了能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的第一化合物/治疗剂/肽之外，所述构建体还包括至少一种另外的化合物，例如用于递送到缺氧细胞。
如前所述，对于本领域技术人员显而易见的是，除非上下文另有明确要求，否则本文提及的“构建体”包含根据本发明的第四十方面到第四十五方面的构建体以及在本发明的第一方面到第三十三方面中使用的构建体。
所述至少一种另外的化合物可以是任何化合物，例如期望递送到缺氧细胞的化合物，包含可以提供治疗或诊断益处的化合物以及用于研究目的的化合物。在某些实施例中，所述化合物选自：核酸、肽核酸、肽、多肽(包含例如融合蛋白)、蛋白、碳水化合物、模拟肽、小分子抑制剂、化学化合物、药物、治疗化合物或治疗剂、化疗药物、抗炎药、抗体、单链Fv片段(SCFV)、脂质、蛋白聚糖、糖脂、脂蛋白、脂质体、拟糖物、天然产物、放射性同位素、树状聚合物、胶束、纳米颗粒、纳米管、聚合物颗粒、显像剂(例如顺磁离子)和分子或融合蛋白。当所述化合物是核酸时，其可以是DNA、RNA、cDNA、双链、单链、正义、反义或环状，例如包含脱氧核酶、iRNA、siRNA、miRNA、piRNA、lcRNA和核酶、噬菌粒、适配体。技术人员可以容易地理解根据本发明的此实施例的化合物的另外的实例。
所述靶向载体肽和至少一种用于递送到缺氧细胞的另外的化合物可以通过任何方式彼此“连接”，所述方式允许所述靶向载体肽携带所述至少一种另外的化合物穿过细胞膜进入细胞中，同时至少保留所述化合物的功能和结构水平。单词“连接”或类似术语应被广义地理解为涵盖所述靶向载体肽与所述至少一种化合物之间的任何形式的连接、键合、融合或关联(例如但不限于，共价键合、离子键合、氢键合、芳香族堆积相互作用、酰胺键、二硫键合、螯合)，并且不应被视为暗示特定的连接强度。所述靶向载体肽和所述至少一种另外的化合物可以以不可逆或可逆的方式连接，使得一旦进入细胞，所述化合物就会从所述靶向载体肽中释放出来。
所述至少一种另外的化合物可以在其N端、C端或任何其它位置与所述靶向载体肽连接。在一个特定实施例中，所述化合物在其N端与所述靶向载体肽连接。在另一个特定实施例中，所述化合物在其C端与所述靶向载体肽连接。所述化合物可以如上所述与所述靶向载体肽连接。
应当理解，尽管所述至少一种另外的化合物可以与所述靶向载体肽直接连接，但是本发明的构建体也可以利用将所述至少一种另外的化合物与所述靶向载体肽连接的连接子分子。例如如上所述，技术人员将理解在本发明中使用的合适的连接子分子。
应当理解，所述至少一种另外的化合物可以通过另一种化合物与所述靶向载体肽间接连接，例如但不一定通过所述化合物/治疗剂(包含例如能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽)。在一个特定实施例中，所述化合物/治疗剂是肽，并且所述至少一种另外的化合物可以在其N端连接。在另一个特定实施例中，所述化合物/治疗剂是肽，并且所述至少一种另外的化合物可以在其C端连接。所述至少一种另外的化合物可以如上所述与所述肽化合物连接。
考虑到所述靶向载体肽和所述化合物(包含治疗剂并且包含能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽)以及任选地包含在所述构建体中的一或多种另外的化合物的性质，本领域技术人员将容易理解本发明中使用的用于制备构建体的方法。此些方法包含分别制备所述肽和一或多种化合物(或一或多种治疗剂)，然后将它们连接，对所述构建体进行化学合成，对所述构建体进行重组表达等。
例如，可以使用已知技术(如液相和固相合成，例如Fmoc或Boc固相肽合成)通过化学肽合成来产生根据本发明使用的肽或本发明的构建体。具体地，可以通过化学肽合成来产生根据本发明使用的肽的D-异构形式。在本发明的某些实施例中，可以优选靶向载体肽和/或肽化合物(包含治疗剂并且包含能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽)的D-异构形式。例如，可以优选D-异构体，因为它们对蛋白酶更具抗性。在本发明的其它实施例中，可以优选靶向载体肽和/或肽化合物(包含治疗剂并且包含能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽)的L-异构形式。例如，可以优选L-异构体，因为它们更紧密地模拟天然存在的肽。本领域技术人员将容易认识到D-异构体和L-异构体的适当使用。
通过举例，在本发明的实施例中，当所述化合物或治疗剂或至少一种另外的化合物是肽时，可以使用本文所述的已知的重组表达或化学合成技术以融合肽的形式产生所述构建体。所述靶向载体肽和所述一或多种肽化合物也可以分开制备，并且然后彼此连接。可替代地，可以使用已知的重组表达或化学合成技术(如本文所述)以分开的融合肽的形式产生所述构建体的部分，并且然后彼此连接。通过举例，可以产生包括靶向载体肽和肽化合物的融合肽，例如能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽，并且然后将其与另外的肽化合物连接以递送到缺氧细胞。通过另外的实例，可以产生包括两个或两个以上肽化合物的融合肽，并且然后将其与靶向载体肽连接。
通过另外的实例，当所述化合物或治疗剂或至少一种另外的化合物是核酸时，可以分开制备所述靶向载体肽和所述核酸化合物(例如，使用化学合成或重组技术)，并且然后通过多种已知的技术之一进行连接。例如，在某些实施例中，可以产生包括靶向载体肽和能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的融合肽，并且然后将其与核酸化合物连接以递送到细胞。
通过另外的实例，在本发明的实施例中，当所述化合物是碳水化合物时，可以分开制备所述靶向载体肽和所述碳水化合物，并且然后通过多种已知的技术之一进行连接。例如，在某些实施例中，可以产生包括靶向载体肽和能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的融合肽，并且然后将其与碳水化合物连接以递送到细胞。
通过另外的实例，在本发明的实施例中，当所述化合物是脂质时，可以分开制备所述靶向载体肽和用于递送到细胞的所述脂质化合物，并且然后通过多种已知的技术之一进行连接。例如，在某些实施例中，可以产生包括靶向载体肽和能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的融合肽，并且然后将其与脂质化合物连接以递送到细胞。
仅通过举例，WO 91/09958、WO 03/064459、WO 00/29427、WO 01/13957中描述的方法可用于制备本发明的各种构建体。
尽管所述方法对于实施本发明不是必需的，但是在一个实施例中，根据本发明的第四十方面到第四十五方面或本发明的第一方面到第三十三方面中使用的构建体可以进一步包括至少一个另外的异源分子。仅通过举例，所述异源分子可以是可以有助于构建体的活性(例如，靶向载体肽、化合物或其组合的活性)、有助于从内体释放肽(例如，融合脂质和破坏膜的肽或聚合物)、能够靶向特定的细胞内区室或细胞器、保护构建体免于降解或以其它方式增加构建体的半衰期、在制备过程中有助于分离和纯化构建体、或有助于货物结合的分子。
在一个实施例中，所述另外的异源分子可以是his-标签、c-myc标签、GST标签或生物素，所述分子可能有助于分离重组表达的构建体。
在另一个实施例中，所述另外的异源分子可以是可以有助于将构建体靶向特定的细胞类型的分子。当在本文中使用时，“将构建体靶向特定的细胞类型”、“特异性地靶向期望的细胞”和类似的短语不应被认为需要100％的特异性，尽管这可能是优选的。当在本文中使用时，“将构建体靶向特定的分子靶标”、“特异性地靶向期望的分子”和类似的短语不应被认为需要100％的特异性，尽管这可能是优选的。例如，在与眼部疾病或病症有关的某些实施例中，所述另外的异源分子可以有助于靶向内皮细胞或视网膜色素上皮细胞。本领域技术人员将能够容易地鉴别合适的异源分子，所述合适的异源分子可以有助于将构建体靶向特定的细胞类型。
本领域技术人员将能够容易地鉴别所关注的细胞类型，以用于靶向例如针对所治疗的疾病或病症。然而，通过举例，在本发明的某些方面和实施例中使用的构建体可以靶向血管内皮细胞、肿瘤细胞、神经元细胞、星形胶质细胞、炎性细胞、视网膜色素上皮细胞或心肌细胞。例如，可能希望靶向星形胶质细胞以维持用于神经元保护的功能性星形细胞合胞体。本领域技术人员将能够容易地鉴别合适的异源分子，所述合适的异源分子可以有助于将构建体靶向特定的细胞类型。
在另一个实施例中，所述分子是核酸结合肽，所述核酸结合肽可以有助于将RNA/DNA/核酸递送到细胞。
应当理解，两种或两种以上不同的异源分子的组合可以用于本发明的构建体中。
考虑到所述异源分子的化学性质，可以使用任何合适的方式(如上所述)将所述异源分子与所述靶向载体肽或化合物连接，或作为所述构建体的一部分合成。在一个实施例中，所述异源分子是基于肽的。然而，与本发明有关的本领域技术人员将容易地识别可以与本发明的构建体连接或并入本发明的构建体中的具有替代性质的分子。例如在WO 91/09958、WO 03/064459、WO 00/29427和WO 01/13957中提供了替代性分子的实例。
如上所述，根据第十到第十五方面，本发明还提供了治疗方法，所述治疗方法包括施用组合物，所述组合物包括(a)本发明的构建体、(b)编码本发明的构建体的核酸、和(c)核酸载体，所述核酸载体包括编码本发明的构建体的核酸，所述组合物与一或多种稀释剂、载体和/或赋形剂和/或另外的成分相关。参考本文提供的描述，本领域技术人员将理解本发明中使用的载体、赋形剂、稀释剂和/或另外的治疗剂。
如上所述，根据第四十一方面、第四十三方面和第四十五方面，本发明还提供了组合物，所述组合物包括(a)本发明的构建体、(b)编码本发明的构建体的核酸、和/或(c)核酸载体，所述核酸载体包括编码本发明的构建体的核酸，所述组合物与一或多种稀释剂、载体和/或赋形剂和/或另外的成分相关。参考本文提供的描述，本领域技术人员将理解本发明中使用的载体、赋形剂、稀释剂和/或另外的治疗剂。
在这种程度上，应理解，本文中提及的施用本发明的构建体、核酸和/或核酸载体应包含提及对包括本发明的构建体、核酸和/或核酸载体的组合物的递送或施用。例如，在本发明的第一到第三广泛方面，施用构建体、核酸和/或核酸载体应被视为包含施用包括构建体、核酸和/或核酸载体的组合物。
在本发明的第十到第十五方面、第四十一方面、第四十三方面和第四十五方面的一个实施例中，所述一或多种稀释剂、载剂和/或赋形剂适于在体外使用。在另一个实施例中，所述一或多种稀释剂、载剂和/或赋形剂适于在体内使用(在此情况下，所述一或多种稀释剂、载剂和/或赋形剂可被称为“药学上可接受的”)。将理解，如本发明的第十方面到第十五方面、第四十一方面、第四十三方面和第四十五方面所描述的组合物将适于根据本发明的第十六到第二十一方面所述的用于制造药物。还将理解，如本发明的第十到第十五方面、第四十一方面、第四十三方面和第四十五方面所描述的组合物将适于根据本发明的第二十二到第二十七方面所述的用于治疗。将进一步理解，本发明的第四十方面、第四十二方面和第四十四方面描述的构建体、核酸和核酸载体以及本发明的第十方面到第十五方面、第四十一方面、第四十三方面和第四十五方面描述的组合物将适于用于根据本发明的第一方面到第三方面和第二十八方面到第三十三方面所述的将肽化合物靶向递送到缺氧细胞的方法中。
“药学上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂”旨在包含可用于制备药物组合物、可以与本发明的构建体或对构建体进行编码的核酸共同施用的同时允许其执行自身的预期功能并且通常安全无毒且既不在生物上不合希望，也不以其它方式不合希望的物质。药学上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂包含适于兽用以及人类药用的那些。药学上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂的实例包含溶液、溶剂、分散介质、延迟剂、乳剂等。
除了标准稀释剂、载剂和/或赋形剂之外，根据本发明使用的组合物可以用一或多个另外的组分来调配或者以此方式调配，以便例如增强构建体、对构建体进行编码的核酸和/或用于递送到细胞的化合物的活性、帮助保护此些药剂的完整性或增加其半衰期或货架期或者提供其它合乎期望的益处。举例来说，组合物可以进一步包括在施用于受试者后针对蛋白水解降解提供保护、提高生物可利用度、降低抗原性或实现缓释的成分。例如，缓释媒剂包含大分子单体、聚(乙二醇)、透明质酸、聚(乙烯吡咯烷酮)或水凝胶。进一步举例来说，组合物还可以包含防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、包衣剂、缓冲剂等。本发明所涉及领域的技术人员将容易鉴别出出于特定目的可能合乎期望的另外的添加剂。
此外，虽然对本发明的实施不是必需的，但是通过调配组合物，可以增加或促进构建体、对构建体进行编码的核酸和/或化合物的细胞渗透性。例如，本发明的构建体、对构建体进行编码的核酸和/或化合物可以被调配成脂质体。WO 91/09958、WO 03/064459、WO 00/29427和WO 01/13957中提供了另外的实例。
另外，根据本发明的药物组合物可以用对尤其是特定疾病和病症的情况可能有益的另外的活性成分来调配。本发明所涉及领域的普通技术人员在考虑到本文中对本发明的描述和需要化合物和/或构建体的目的(包含例如，任何待治疗疾病的性质和进展)的情况下将容易理解适合的另外的活性成分。
作为一般实例，可以使用用于治疗年龄相关性黄斑变性和/或糖尿病性视网膜病变的药剂，如用于减少炎症或补体途径中蛋白质(如Ang2、Tie2、整联蛋白或Cx43)的产生的反义寡核苷酸或干扰任何VEGF或PDGF或其受体的产生的反义寡核苷酸。另外的实例是使用抗VEGF和/或抗PDGF反义寡核苷酸来减少年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变或癌症中的新生血管。
本发明的组合物可以调配成任何惯用形式，如溶液、可口服施用液体、可注射液体、可注射溶液、片剂、包衣片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、栓剂、透皮贴剂、混悬剂、乳剂、缓释调配物、凝胶、气溶胶、粉末、可注射胶体系统(如纳米颗粒、脂质体和微乳剂)、水凝胶和固体植入物(包含可生物降解的植入物，如基于聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的那些植入物)。另外，可以利用缓释调配物。所选定的形式将反映组合物预期的目的和递送或施用于样品(例如细胞群)或受试者的模式。
例如，本发明的组合物可以调配成用于眼部递送的惯用形式，例如可注射液体、可注射溶液、可注射胶体系统(如纳米颗粒、脂质体和微乳剂)、可注射水凝胶和固体植入物。
技术人员将容易识别出适合的调配方法。然而，举例来说，某些调配组合物的方法可以在热纳罗(Gennaro AR):雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science andPractice of Pharmacy),第20版,利平科特、威廉斯与威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins),2000中找到。
本发明所涉及领域的一般技术人员在考虑到本发明的性质和本文报告的结果的情况下将容易理解本发明适用于各种不同的动物。相应地，“受试者”包含任何感兴趣的动物。然而，在一个特定实施例中，“受试者”是哺乳动物，更具体地说是人类。
在第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面和/或第二十六方面，本发明涉及治疗与缺氧相关的疾病或病症的方法、用于治疗与缺氧相关的疾病或病症的药物的制造以及用于治疗与缺氧相关的疾病或病症的构建体的用途。
如本文所使用的，短语“与缺氧相关的疾病或病症”等应被广义地解释为包含原发性疾病或病症以及继发于身体损伤的疾病或病症。所述短语应被解释为包含结构性和/或功能性疾病和病症。所述短语应被视为包含综合征。所述短语应被广义地解释为包含与普遍性、局部性或细胞性缺氧的关联、联系或相关性并且包含急性缺氧和慢性缺氧。如技术人员将理解的，缺氧是指组织所暴露的氧气浓度显著低于健康的灌注良好的组织中氧气的正常生理浓度。所述短语应被广义地解释为包含存在氧气递送减少的情况以及完全缺乏氧气递送的情况。优选地，一或多个缺氧组织或组织内的一或多个缺氧细胞由于缺氧而表现出多配体聚糖-4上调。引发多配体聚糖-4上调的缺氧可能是暂时性的并且不需要持续或特定水平的缺氧。
在本发明的第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面和/或第二十六方面的一个实施例中，所述疾病或病症与缺血相关。在另一个实施例中，所述疾病或病症与出血相关。在另一个实施例中，所述疾病或病症与新生血管相关。在一个实施例中，所述疾病或病症与灌注不足相关。
在本发明的第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面和/或第二十六方面的另一个实施例中，所述疾病或病症涉及炎症。在特定实施例中，所述疾病或病症涉及慢性炎症。
将会理解，所述疾病或病症可能与上述两种或两种以上相关。
如本文所使用的，短语“与缺血相关”或“与缺血性缺氧相关”应被广义地解释为包含与到组织或器官的血流不足相关的关联、联系或相关性。例如，如本领域技术人员将理解的，缺血性缺氧可能是栓塞、动脉瘤、心脏病发作、外伤或继发于病理生理过程的血流不足(包含毛细血管血流不足)的结果。缺血性缺氧应被视为包含急性缺血和慢性缺血。缺血性缺氧应被视为包含部分缺血和总缺血。
如本文所使用的，术语“与出血相关”应被广义地解释为包含动脉、静脉和毛细血管出血。所述术语应被视为包含原发性出血和继发性出血以及外部出血和内部出血。
如本文所使用的，术语“与新生血管相关”应被广义地解释为包含与能够通过红细胞灌注的新血管(包含微血管网络)的形成的关联、联系或相关性。所述术语应被视为包含正常新生血管和异常新生血管。
如本文所使用的，术语“涉及炎症的疾病或病症”等应被视为包含涉及与急性炎症和/或慢性炎症相关的炎症过程的疾病或病症。所述术语应被视为包含一系列严重程度的炎症反应。
如本文所使用的，术语“与灌注不足相关”应被广义地解释为包含与局部或全身灌注不足的关联、联系或相关性。所述术语应被视为包含急性灌注不足和慢性灌注不足。所述术语不应被视为指示特定程度的灌注不足。
将会理解，与缺氧相关的疾病或病症可能影响身体的任何器官或器官系统。例如，疾病或病症可能影响表皮系统、肌肉骨骼系统、神经系统(包含例如中枢神经系统、外周神经系统和感觉神经系统)、心血管系统、淋巴系统、呼吸系统、内分泌系统、泌尿系统、消化系统或生殖系统。
本领域普通技术人员将能够容易地鉴别出与缺氧相关的疾病或病症，包含与缺血性缺氧、出血和/或新生血管相关的那些疾病或病症，以及涉及炎症的那些疾病或病症。
在本发明的第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面和/或第二十六方面的一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是癌症。在一个实施例中，所述癌症是脑胶质瘤，例如星形细胞瘤、室管膜瘤和少突胶质细胞瘤。在另一个实施例中，所述癌症是表皮癌。在另一个实施例中，所述癌症是卵巢癌。
在本发明的第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面和/或第二十六方面的一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是中风。在一个实施例中，所述疾病或病症是短暂性脑缺血发作。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是阿尔茨海默病。在一个实施例中，所述疾病或病症是帕金森病。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是多发性硬化症。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是血管性痴呆。
在本发明的第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面和/或第二十六方面的一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是心肌缺血。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是缺血性结肠炎。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是急性肢体缺血。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是皮肤缺血。
在本发明的第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面和/或第二十六方面的一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是脓毒症。例如，继发于任何器官系统的细菌、真菌和/或病毒感染的脓毒症。通过非限制性实例的方式，感染可以是肺炎、阑尾炎、腹膜炎、尿路感染、胆囊炎、胆管炎、蜂窝组织炎、脑膜炎或脑炎。通过非限制性实例的方式，脓毒症可能继发于急性胰腺炎、结肠炎、自身免疫性疾病、乳糜泻、肾小球肾炎、肝炎、炎症性肠病、灌注前损伤和移植排斥。
在本发明的第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面和/或第二十六方面的一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是眼部疾病或病症。短语“眼部疾病或病症”应当如本文其它地方所述的广义地解释。在一个实施例中，所述疾病或病症是眼部后腔的疾病或病症。在一个实施例中，所述疾病或病症是眼部前腔的疾病或病症。
在本发明的第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面和/或第二十六方面的一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是AMD(包含湿性AMD和/或干性AMD)。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是糖尿病性视网膜病变。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是视网膜静脉和/或分支阻塞、视网膜动脉阻塞或视网膜中风。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是黄班水肿。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是葡萄膜炎。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是睑缘炎。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是重度干眼综合征。在一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症是视神经炎。
在本发明的第四方面、第六方面、第八方面、第十方面、第十二方面、第十四方面、第十六方面、第十八方面、第二十方面、第二十二方面、第二十四方面和/或第二十六方面的一个实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症与一或多种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)(例如多配体聚糖或磷脂酰肌醇聚糖)的上调相关。在一个特定实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症与多配体聚糖-1、多配体聚糖-2、多配体聚糖-3、多配体聚糖-4或磷脂酰肌醇聚糖-4的上调相关。在一个特定实施例中，所述与缺氧相关的疾病或病症与多配体聚糖-4的上调相关。
本领域的普通技术人员将能够容易地鉴别出与缺氧相关的疾病或病症，所述疾病或病症还与一或多种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的上调相关。
在第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面和第二十七方面，本发明涉及治疗眼部疾病或病症的方法、用于治疗眼部疾病或病症的药物的制造以及用于治疗眼部疾病或病症的构建体的用途。
如本文所使用的，术语“眼部疾病或病症”等应被广义地解释为包含直接或主要为眼部的疾病或病症(包含继发于物理性损伤的那些疾病或病症)和继发于直接或主要影响另一个器官或器官系统的疾病的疾病或病症。所述短语应被解释为包含结构性和/或功能性疾病和病症。所述短语应被视为包含综合征。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面和第二十七方面的一个实施例中，所述疾病或病症是眼部后腔的疾病或病症。在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面和第二十七方面的一个实施例中，所述疾病或病症是眼部前腔的疾病或病症。
如本文所使用的，“眼部后腔”(等)是指在晶状体后面的眼部部分，包含前透明膜、玻璃体、视网膜、脉络膜和视神经。
如本文所使用的，“眼部前腔”(等)是指在晶状体前面的眼部部分，包含晶状体、虹膜、结膜、小梁网、眼泪腺、眼睑和角膜。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面和第二十七方面的一个实施例中，所述眼部疾病或病症与缺氧相关。在一个实施例中，所述眼部疾病或病症与缺血性缺氧相关。在另一个实施例中，所述眼部疾病或病症与出血相关。在另一个实施例中，所述眼部疾病或病症与新生血管相关。术语“与缺氧相关”等应当如本文其它地方所描述的那样看待。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面和第二十七方面的一个实施例中，所述眼部疾病或病症是涉及炎症的疾病或病症。在特定实施例中，所述疾病或病症是涉及慢性炎症的疾病或病症。在另一个特定实施例中，所述疾病或病症是涉及急性炎症的疾病或病症。例如，急性炎症可能在急性视网膜静脉或分支静脉阻塞时发生。术语“炎症”等应当如本文其它地方所描述的那样看待。
将会理解，眼部疾病或病症可能与上述两种或两种以上相关。
本领域普通技术人员将能够容易地鉴别出与缺氧、灌注不足、缺血性缺氧、出血和/或新生血管相关的眼部疾病或病症。仅举例来说，与缺氧相关的眼部疾病或病症包含AMD、糖尿病性视网膜病变、青光眼、视网膜静脉和/或分支静脉阻塞、视网膜动脉阻塞或视网膜中风和糖尿病性黄斑水肿。仅举例来说，与灌注不足相关的眼部疾病或病症包含AMD、糖尿病性视网膜病变、青光眼、视网膜静脉和/或分支静脉阻塞、视网膜动脉阻塞或视网膜中风和糖尿病性黄斑水肿、葡萄膜炎、睑缘炎、重度干眼综合征、糖尿病性周围神经病以及视神经炎。仅举例来说，与缺血性缺氧相关的眼部疾病或病症包含AMD、糖尿病性视网膜病变、青光眼、视网膜静脉和/或分支静脉阻塞、视网膜动脉阻塞或视网膜中风和糖尿病性黄斑水肿。仅举例来说，与出血相关的眼部疾病或病症包含AMD、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉和/或分支静脉阻塞、视网膜动脉阻塞或视网膜中风、糖尿病性黄斑水肿、葡萄膜炎、睑缘炎、重度干眼综合症、糖尿病性周围神经病和视神经炎。仅举例来说，与新生血管相关的眼部疾病或病症包含AMD、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉和/或分支静脉阻塞和糖尿病性黄斑水肿。仅举例来说，涉及炎症的眼部疾病或病症包含AMD、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉和/或分支静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、睑缘炎、重度干眼综合症、糖尿病性周围神经病和视神经炎。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面和第二十七方面的一个实施例中，所述眼部疾病或病症与连接蛋白43半通道功能障碍相关。在一个实施例中，所述眼部疾病或病症与不受控制的病理性连接蛋白43半通道开放相关。
本领域普通技术人员将能够容易地鉴别出与连接蛋白43半通道功能障碍相关的眼部疾病或病症。仅举例来说，与连接蛋白43半通道功能障碍相关的疾病包含AMD、糖尿病性视网膜病变、青光眼、视网膜静脉和/或分支静脉阻塞、视网膜动脉阻塞或视网膜中风、糖尿病性黄斑水肿、葡萄膜炎、睑缘炎、重度干眼综合征、糖尿病性周围神经病和视神经炎。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面和第二十七方面的一个实施例中，所述眼部疾病或病症与一或多种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)(例如多配体聚糖或磷脂酰肌醇聚糖)的上调相关。在一个特定实施例中，所述眼部疾病或病症与多配体聚糖-1、多配体聚糖-2、多配体聚糖-3、多配体聚糖-4或磷脂酰肌醇聚糖-4的上调相关。在一个特定实施例中，所述眼部疾病或病症与多配体聚糖-4的上调相关。
本领域普通技术人员将能够容易地鉴别出与一或多种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的上调相关的眼部疾病或病症。仅举例来说，与一或多种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的上调相关的眼部疾病或病症包含AMD、糖尿病性视网膜病变、青光眼、视网膜静脉和/或分支静脉阻塞、视网膜动脉阻塞或视网膜中风和糖尿病性黄斑水肿、葡萄膜炎、睑缘炎、重度干眼综合征以及视神经炎。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面、第十五方面、第十七方面、第十九方面、第二十一方面、第二十三方面、第二十五方面和第二十七方面的一个实施例中，所述眼部疾病或病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)，包含湿性AMD和/或干性AMD。在一个实施例中，所述眼部疾病或病症是糖尿病性视网膜病变。在一个实施例中，所述眼部疾病或病症是视网膜静脉和/或分支静脉阻塞。在一个实施例中，所述眼部疾病或病症是视网膜动脉阻塞。在一个实施例中，所述眼部疾病或病症是视网膜中风。在一个实施例中，所述眼部疾病或病症是糖尿病性黄班水肿。在一个实施例中，所述疾病或病症是葡萄膜炎。在一个实施例中，所述眼部疾病或病症是睑缘炎。在一个实施例中，所述眼部疾病或病症是重度干眼综合征。在一个实施例中，所述眼部疾病或病症是视神经炎。在一个实施例中，所述眼部疾病或病症是糖尿病性周围神经病。
在本发明的第一到第十五方面的一个实施例中，构建体、核酸或核酸载体或包括所述构建体、核酸或核酸载体的组合物全身性地施用。在一个实施例中，施用是肠内施用，例如口服或通过栓剂。在一个实施例中，施用是肠胃外施用，例如通过静脉注射、皮下注射或肌内注射。
在本发明的第一到第十五方面的一个实施例中，构建体、核酸或核酸载体或包括所述构建体、核酸或核酸载体的组合物局部地施用。例如，可以通过乳膏、软膏、凝胶、滴眼剂、滴耳剂或吸入剂的方式施用。例如，可以通过局部装置(如透皮装置、软性隐形眼镜或外部眼用插入物)的方式施用。
在本发明的第一到第十五方面的一个实施例中，构建体或包括所述构建体的组合物可以局部地施用。例如，可以通过眼周注射(例如结膜下注射或筋膜囊下注射)或眼内注射(例如前房内注射、玻璃体内注射或脉络膜上注射)的方式施用。在一个实施例中，可以通过局部植入物或装置(如例如眼内插入物或植入物或者阴道环装置)的方式施用。眼内植入物的实例包含可生物降解的聚合物，如PLGA(如用于
Figure GDA0002448045650000491
的)、自组装聚合颗粒、产生药物构建体的基于细胞的植入物或包裹在半透膜中的小粒(如用于
Figure GDA0002448045650000492
或
Figure GDA0002448045650000493
的)。
例如，可以通过以下方式施用：化学渗透增强剂，如
表面活性剂(如I.索姆(Som I.)、K.巴蒂亚(Bhatia K.)、M.亚西尔(Yasir M.),2012表面活性剂作为渗透增强剂在透皮药物递送中的状态(Status of surfactants aspenetration enhancers in transdermal drug delivery)药学与生命科学杂志(J.Pharm.Bioallied Sci.)4,2-9所描述的)、萜烯(例如，如M.阿齐尔(Aqil M.)、A.阿哈德(Ahad A.)、Y.苏丹娜(Sultana Y.)、A.阿里(Ali A.),2007萜烯作为皮肤渗透增强剂的状态(Status of terpenes as skin penetration enhancers)今日药物发现(DrugDiscov.Today)12,1061-1067所描述的)；或物理方法，如微针、热消融、微磨皮、电穿孔和空化超声(例如，如马克R.普劳斯尼茨(Mark R.Prausnitz)和罗伯特·兰格(Robert Langer)透皮药物递送(Transdermal drug delivery)自然生物技术(Nat Biotechnol.)2008 26(11):1261-1268以及J.J.埃斯科瓦尔-查韦斯(Escobar-Chavez,J.J.)、D.博尼拉-马丁内斯(Bonilla-Martinez,D.)、M.A.维列加斯-冈萨雷斯(Villegas-Gonzalez,M.A.)、A.L.里维拉-瓦兹奎(Revilla-Vazquez,A.L.),2009电穿孔作为有效的物理增强剂用于皮肤药物递送(Electroporation as an efficient physical enhancer for skin drugdelivery)临床药理学杂志(J.Clin.Pharmacol.)49,1262-1283中所述)；以及离子电渗，包含脉冲去极化(PDP)离子电渗(例如，如Y.荒巻(Aramaki,Y.)、H.阿里马(Arima,H.)、M.高桥(Takahashi,M.)、E.宫崎(Miyazaki,E.)、T.坂本(Sakamoto,T.)、S.津田(Tsuchiya,S.),2003通过脉冲去极化离子电渗系统皮内递送反义寡核苷酸(Intradermal delivery ofantisense oligonucleotides by the pulse depolarization iontophoretic system)生物制药公报(Biol.Pharm.Bull.)26,1461-1466以及T.坂本(Sakamoto,T.)、宫崎(Miyazaki,E.)、Y.荒巻(Aramaki,Y.)、H.阿里马(Arima,H.)、M.高桥(Takahashi,M.)、Y.加藤(Kato,Y.)、M.古贺(Koga,M.)、S.土山(Tsuchiya,S.),2004通过在NC/Nga小鼠中离子电渗递送白细胞介素-10的反义寡核苷酸改善皮炎(Improvement of dermatitis byiontophoretically delivered antisense oligonucleotides for interleukin-10 inNC/Nga mice)基因疗法(Gene Ther.)11,317-324中所述)。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面和/或第十五方面的一个实施例中，构建体、核酸或核酸载体或包括所述构建体、核酸或核酸载体的组合物通过眼周注射施用。例如，可以通过结膜下注射或筋膜囊下注射施用。
在本发明的第五方面、第七方面、第九方面、第十一方面、第十三方面和/或第十五方面的一个实施例中，构建体、核酸或核酸载体或包括所述构建体、核酸或核酸载体的组合物通过眼内注射施用。例如，可以通过前房内注射、玻璃体内注射或脉络膜上注射施用。在一个实施例中，通过眼内插入物或植入物的方式施用。眼内插入物或植入物的范围可以是适合的。例如，眼内植入物可以包含可生物降解的聚合物，如PLGA(如用于
Figure GDA0002448045650000501
的)、自组装聚合颗粒、产生药物构建体的基于细胞的植入物或包裹在半透膜中的小粒(如用于
Figure GDA0002448045650000502
或
Figure GDA0002448045650000503
的)。
技术人员可以鉴别出用于本发明的方法的其它适合的施用模式。
在本发明的第十六到第二十一方面的一个实施例中，所述药物被调配用于全身施用。在一个实施例中，所述药物被调配用于肠内施用，例如口服或通过栓剂。在一个实施例中，所述药物被调配用于肠胃外施用，例如通过静脉注射、皮下注射或肌内注射。
在本发明的第十六到第二十一方面的一个实施例中，所述药物被调配用于局部施用。例如，可以将所述药物调配用于通过乳膏、软膏、凝胶、滴眼剂、滴耳剂或吸入剂的方式施用。例如，可以将所述药物调配用于通过局部装置(如透皮装置、软性隐形眼镜或外部眼用插入物)的方式施用。
在本发明的第十六到第二十一方面的一个实施例中，构建体或包括所述构建体的组合物调配用于局部施用。例如，所述药物可以调配用于通过眼周注射(例如结膜下注射或筋膜囊下注射)或眼内注射(例如前房内注射、玻璃体内注射或脉络膜上注射)的方式施用。在一个实施例中，可以将所述药物调配用于通过局部植入物或装置(如例如眼内植入物或阴道环装置)的方式施用。
在本发明的第十七方面、第十九方面和/或第二十一方面的一个实施例中，所述药物被调配用于通过眼周注射施用。例如，可以将所述药物调配用于通过结膜下注射或筋膜囊下注射施用。
在本发明的第十七方面、第十九方面和/或第二十一方面的一个实施例中，所述药物被调配用于通过眼内注射施用。例如，可以将所述药物调配用于通过前房内注射、玻璃体内注射或脉络膜上注射施用。在一个实施例中，将所述药物调配用于通过眼内插入物或植入物的方式施用。
在本发明的第二十二到第二十七方面的一个实施例中，所述用途是通过全身施用完成的。在一个实施例中，所述用途是通过肠内施用(例如口服或通过栓剂)完成的。在一个实施例中，所述用途是通过肠胃外施用(例如通过静脉注射、皮下注射或肌内注射)完成的。
在本发明的第二十二到第二十七方面的一个实施例中，所述用途是通过局部施用完成的。例如，所述用途可以是通过施用乳膏、软膏、凝胶、滴眼剂、滴耳剂或可吸入调配物完成的。例如，所述用途可以是通过经由局部装置(如透皮装置、软性隐形眼镜或外部眼用插入物)施用的方式完成的。
在本发明的第二十二到第二十七方面的一个实施例中，所述用途是通过局部施用完成的。例如，所述用途可以是通过施用眼周注射(例如结膜下注射或筋膜囊下注射)或眼内注射(例如前房内注射、玻璃体内注射或脉络膜上注射)完成的。在一个实施例中，所述用途可以是通过经由局部植入物或装置(如例如眼内植入物或阴道环装置)施用完成的。
在本发明的第二十三方面、第二十五方面和/或第二十七方面的一个实施例中，用于治疗眼部疾病或病症的所述用途是通过眼周注射完成的。例如，所述用途可以是通过结膜下注射或筋膜囊下注射完成的。
在本发明的第二十三方面、第二十五方面和/或第二十七方面的一个实施例中，用于治疗眼部疾病或病症的所述用途可以是通过眼内注射完成的。例如，所述用途可以是通过前房内注射、玻璃体内注射或脉络膜上注射完成的。在一个实施例中，所述用途可以是通过借助于眼内插入物或植入物的方式施用完成的。
当提及包括构建体、核酸或核酸载体的药物时，将会理解，所述药物可以包括包含构建体、核酸或核酸载体的组合物。
如将理解的，根据本发明的第四到第十五方面的施用剂量、施用周期和总体施用方案可以在受试者之间有所不同，这取决于如包括构建体的化合物或治疗剂、正在治疗的特定疾病或病症、待治疗的受试者的任何症状的严重程度、所选定的施用模式以及受试者的年龄、性别和/或总体健康状况等变量。
应理解，施用可以每天进行并且可以包含单次日剂量、大量离散分次剂量的施用或者连续施用，视情况而定。例如，连续施用可以使用外部或内部装置或植入物(如例如外部眼用装置或眼内装置)来实现。
应理解，相比于每天，施用可以不那么频繁地进行，例如可以通过初始剂量的方式施用，以每周一次、每两周一次、每月一次、每两月一次等方式再次施用，这取决于施用的调配物和模式。此外，应理解，给药方案可以涉及初始时期相对频繁的加载剂量，之后频率较低的维持剂量。例如，在玻璃体内注射的情况下，可以大约每月一次地施用大量加载剂量，之后大约每两月一次地施用维持剂量。仅举例来说，施用可以包括2个、3个、4个、5个或6个加载剂量。
举例来说，可以每天一次或多于一次地施用单位剂量，例如每天1次、2次、3次、4次、5次或6次，以达到期望的总日剂量。举例来说，可以按单次日剂量或大量离散剂量或连续地施用单位剂量的本发明的构建体。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第四到第十五方面的实施例中，可以每天一次或多于一次地施用全身单位剂量，例如每天1次、2次、3次、4次、5次或6次，以达到期望的总日剂量。举例来说，可以按单次日剂量或大量离散剂量或连续地施用单位剂量的本发明的构建体，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的日剂量达到大约70mg到大约1,750mg。
举例来说，全身单位剂量的本发明的构建体可以每天施用一次或多于一次(例如1次、2次、3次、4次、5次或6次，通常每天1次到4次)，使得总日剂量在大约70mg到大约1,750mg的范围内(对于70kg成人)，即在能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的大约1毫克/千克/天到大约25毫克/千克/天的范围内。
进一步举例来说，本发明的构建体可以每天全身施用一次或多于一次，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的剂量达到大约1mg/kg体重/天到大约2mg/kg体重/天或大约5mg/kg体重/天到大约25mg/kg体重/天。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第四到第十五方面的实施例中，可以全身施用本发明的构建体，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的循环浓度的范围达到大约5微摩尔到大约20微摩尔。在另一个实例中，可以施用本发明的构建体，以达到大约5微摩尔的循环浓度。在另一个实例中，可以全身施用本发明的构建体，以达到大约10微摩尔的循环浓度。在另一个实例中，可以全身施用本发明的构建体，以达到大约15微摩尔的循环浓度。在另一个实例中，可以全身施用本发明的构建体，以达到大约20微摩尔的循环浓度。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第四到第十五方面的实施例中，可以通过全身输注以足以维持能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的循环浓度为大约2.5微摩尔到大约250微摩尔的浓度施用本发明的构建体期望的时间。在另一个实例中，可以通过全身输注以足以维持能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的循环浓度为大约2.5微摩尔到大约100微摩尔的浓度施用本发明的构建体。在另一个实例中，可以通过全身输注以足以维持大约10微摩尔到大约100微摩尔的循环浓度的浓度施用本发明的构建体期望的时间。在另一个实例中，可以通过全身输注以足以维持大约100微摩尔到大约250微摩尔的循环浓度的浓度施用本发明的构建体期望的时间。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第四到第十五方面的实施例中，可以局部施用本发明的构建体，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的组织浓度的范围达到大约1微摩尔到大约100微摩尔。在另一个实例中，可以玻璃体内施用本发明的构建体，以达到1微摩尔、2微摩尔、3微摩尔、4微摩尔或5微摩尔的组织浓度。在另一个实例中，可以玻璃体内施用本发明的构建体，以达到大约10微摩尔、15微摩尔或20微摩尔的组织浓度。在另一个实例中，可以玻璃体内施用本发明的构建体，以达到大约30微摩尔、40微摩尔、50微摩尔、60微摩尔、70微摩尔、80微摩尔、90微摩尔或100微摩尔的组织浓度。在另一个实例中，可以玻璃体内施用本发明的构建体，以达到在大约1微摩尔到大约20微摩尔的范围内的组织浓度。在另一个实例中，可以玻璃体内施用本发明的构建体，以达到在大约1微摩尔到大约5微摩尔的范围内或在大约5微摩尔到大约10微摩尔的范围内或在大约10微摩尔到大约20微摩尔的范围内的组织浓度。
应理解，局部施用可以适于例如用于治疗眼部前腔的疾病或病症，如例如重度干眼症或睑缘炎。还应理解，局部施用可以适于例如治疗皮肤或粘膜(例如口腔粘膜、鼻粘膜、阴道粘膜)的疾病或病症，例如癌症。
本领域技术人员将能够基于上述变量容易地确定适合的剂量，尤其是在考虑到构成构建体的化合物或治疗剂的情况下。
可以使用从细胞培养测定和动物研究获得的数据来调配用于人类的剂量范围。所述剂量可以根据剂型和施用途径在该范围内变化。最初可以依据细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在细胞培养物或动物模型中调配剂量，以达到如细胞培养时确定的包含IC50(即测试化合物的达到症状的半最大抑制的浓度)的细胞浓度范围。此信息可以用于更准确地确定在人类中有用的剂量。精确的调配、施用途径和剂量可以由个体医师根据患者的病况来选择(参见例如，傅英格尔(Fingl)等人,1975,治疗学的药理学基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics),第1章,第1页)。
施用可以在待治疗的疾病或病症进展期间或者在疾病或病症发展之前或之后的任何时间进行。
在本发明的第一到第九方面的一个实施例中，每天在延长的时间段内施用本发明的构建体或包括本发明的构建体的组合物，以协助持续管理疾病或病症的症状。在本发明的第一到第九方面的另一个实施例中，每天在延长的时间段内或贯穿受试者的生命期施用本发明的构建体或包括本发明的构建体的组合物，以预防或延迟疾病或病症的发展。
将会理解，本发明的第十六到第二十一方面的药物可以调配用于根据上述内容以适合的剂量施用。
将会理解，本发明的第二十二到第二十七方面的治疗用途可以涉及根据上述内容以适合的剂量施用。
应理解，本发明的第一到第九方面的方法可以进一步包括另外的步骤，如向受试者递送另外的药剂或组合物。
在本发明的第一到第九方面的一个实施例中，所述构建体、核酸或核酸载体与一或多个另外的治疗剂并行施用。在本发明的第一到第九方面的一个实施例中，所述构建体、核酸或核酸载体与一或多个另外的治疗剂顺序地施用。
在本发明的第十到第十五方面的一个实施例中，所述组合物包括一或多个另外的治疗剂。
在本发明的第十六到第二十一方面的一个实施例中，所述药物包括一或多个另外的治疗剂。
在本发明的第十六到第二十一方面的一个实施例中，所述药物被调配用于与一或多个另外的治疗剂并行施用。在本发明的第十六到第二十一方面的另一个实施例中，所述药物被调配用于与一或多个另外的治疗剂顺序地施用。
在本发明的第二十二到第二十七方面的一个实施例中，所述治疗用途包括与一或多个另外的治疗剂同时施用。在本发明的第二十二到第二十七方面的另一个实施例中，所述治疗用途包括与一或多个另外的治疗剂并行施用。在本发明的第二十二到第二十七方面的另一个实施例中，所述治疗用途包括与一或多个另外的治疗剂顺序地施用。
如本文所使用的，“治疗剂”从被广义地视为包含认为对治疗与缺氧相关的靶疾病或病症或对治疗眼部的靶疾病或病症有用或有价值的那些药剂或药物。“治疗剂”包含例如化疗药物、免疫治疗药物、靶向治疗药物(包含例如小分子或单克隆抗体)、疫苗和基因疗法。此些药物可以缓解、减少、改善或预防与和缺氧相关的靶疾病或病症或眼部的靶疾病或病症相关的临床症状或诊断标志物中的一或多种。
例如，在特定实施例中，本发明提供了治疗中风的方法，所述方法包括结合组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或重组组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)向受试者施用构建体，所述构建体包括(a)源自乙肝病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。例如，rtPA可以是阿替普酶(Activase、Actilyse)、瑞替普酶(Retavase、Rapilysin)、替奈普酶(TNKase)或去氨普酶。
在另一个实例中，在特定实施例中，本发明提供了治疗心肌梗死的方法，所述方法包括结合组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或重组组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)向受试者施用构建体，所述构建体包括(a)源自乙肝病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。例如，rtPA可以是阿替普酶(Activase、Actilyse)、瑞替普酶(Retavase、Rapilysin)、替奈普酶(TNKase)或去氨普酶。
在另一个实例中，在特定实施例中，本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包括结合用于治疗癌症使用的治疗剂向受试者施用构建体，所述构建体包括(a)源自乙肝病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。例如，治疗剂可以是替莫唑胺、多西他赛、5-氟尿嘧啶、阿霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、博莱霉素、长春碱、达卡巴嗪、氮芥、长春新碱、丙卡巴肼、泼尼松龙、依托泊苷、顺铂、表阿霉素、卡培他滨、亚叶酸、奥沙利铂或其组合。本领域技术人员在考虑到本文的待治疗癌症和本公开的情况下将能够容易地鉴别出适合的治疗剂和组合物。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的第一到第九方面的某些实施例中，可以局部施用本发明的构建体，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的最终组织浓度的范围达到大约1微摩尔到大约100微摩尔。例如，可以局部施用本发明的构建体，以达到1微摩尔、2微摩尔、3微摩尔、4微摩尔或5微摩尔的最终组织浓度。在另一个实例中，可以局部施用本发明的构建体，以达到大约10微摩尔、15微摩尔或20微摩尔的最终组织浓度。在另一个实例中，可以局部施用本发明的构建体，以达到大约30微摩尔、40微摩尔、50微摩尔、60微摩尔、70微摩尔、80微摩尔、90微摩尔或100微摩尔的最终组织浓度。在另一个实例中，可以局部施用本发明的构建体，以达到在大约1微摩尔到大约20微摩尔的范围内的最终组织浓度。在另一个实例中，可以局部施用本发明的构建体，以达到在大约1微摩尔到大约5微摩尔的范围内、或在大约5微摩尔到大约10微摩尔的范围内、或在大约10微摩尔到大约20微摩尔的范围内的最终组织浓度。
例如，在肺部疾病或病症(如例如肺癌、石棉沉滞症、哮喘、支气管扩张症、支气管炎、慢性咳嗽、哮吼、囊性纤维化、汉坦病毒、特发性肺纤维化、流感、大流行性流感、百日咳、胸膜炎、肺炎、肺栓塞、肺动脉高压、呼吸道合胞体病毒、肉样瘤病或肺结核)的情况下，施用可以通过气溶胶递送。例如，在影响脊髓的疾病或病症(如脊髓肿瘤)的情况下，可以通过鞘内药物递送系统施用。例如，在眼部疾病或病症的情况下，可以通过眼周注射、眼内注射或眼内插入物或植入物施用。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第一方面、第四方面和/或第五方面的特定实施例中，可以玻璃体内施用本发明的构建体，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的最终眼内浓度的范围达到大约1微摩尔到大约100微摩尔。例如，可以玻璃体内施用本发明的构建体，以达到1微摩尔、2微摩尔、3微摩尔、4微摩尔或5微摩尔的最终眼内浓度。在另一个实例中，可以玻璃体内施用本发明的构建体，以达到大约10微摩尔、15微摩尔或20微摩尔的最终浓度。在另一个实例中，可以玻璃体内施用本发明的构建体，以达到大约30微摩尔、40微摩尔、50微摩尔、60微摩尔、70微摩尔、80微摩尔、90微摩尔或100微摩尔的最终眼内浓度。在另一个实例中，可以玻璃体内施用本发明的构建体，以达到在大约1微摩尔到大约20微摩尔的范围内的最终眼内浓度。在另一个实例中，可以玻璃体内施用本发明的构建体，以达到在大约1微摩尔到大约5微摩尔的范围内、或在大约5微摩尔到大约10微摩尔的范围内、或在大约10微摩尔到大约20微摩尔的范围内的最终眼内浓度。
在本发明的第一方面、第四方面和/或第五方面的特定实施例中，可以按在大约0.04mg到大约5mg的范围内的剂量玻璃体内施用本发明的构建体。例如，可以按大约0.04mg到2.5mg的剂量玻璃体内施用本发明的构建体。例如，可以按大约0.04mg到1mg的剂量玻璃体内施用本发明的构建体。例如，可以按大约1mg到大约2.5mg的剂量施用本发明的构建体。例如，可以按大约2.5mg到大约5mg的剂量施用本发明的构建体。
在涉及癌症治疗并且其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第一和/或第四方面的特定实施例中，可以瘤内施用本发明的构建体，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的最终组织浓度的范围达到大约1微摩尔到大约100微摩尔。例如，可以瘤内施用本发明的构建体，以达到1微摩尔、2微摩尔、3微摩尔、4微摩尔或5微摩尔的最终组织浓度。在另一个实例中，可以瘤内施用本发明的构建体，以达到大约10微摩尔、15微摩尔或20微摩尔的最终组织浓度。在另一个实例中，可以瘤内施用本发明的构建体，以达到大约30微摩尔、40微摩尔、50微摩尔、60微摩尔、70微摩尔、80微摩尔、90微摩尔或100微摩尔的最终组织浓度。在另一个实例中，可以瘤内施用本发明的构建体，以达到在大约1微摩尔到大约20微摩尔的范围内的最终组织浓度。在另一个实例中，可以瘤内施用本发明的构建体，以达到在大约1微摩尔到大约5微摩尔的范围内、或在大约5微摩尔到大约10微摩尔的范围内、或在大约10微摩尔到大约20微摩尔的范围内的最终组织浓度。
在涉及癌症治疗并且其中化合物是能够与Cx43的胞内机构域相互作用的肽的本发明的第一和/或第四方面的特定实施例中，可以按在大约0.04mg到大约5mg的范围内的剂量瘤内施用本发明的构建体。例如，可以按大约0.04mg到2.5mg的剂量玻璃体内施用本发明的构建体。例如，可以按大约0.04mg到1mg的剂量玻璃体内施用本发明的构建体。例如，可以按大约1mg到大约2.5mg的剂量施用本发明的构建体。例如，可以按大约2.5mg到大约5mg的剂量施用本发明的构建体。
在本发明的第二方面、第三方面、第六方面、第七方面、第八方面和/或第九方面的涉及对能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽进行编码的核酸的某些实施例中，可以施用核酸和/或核酸载体以实现经过表达的构建体，从而使得能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的组织浓度在大约1微摩尔到大约250微摩尔的范围内。在另一个实例中，以达到1微摩尔、2微摩尔、3微摩尔、4微摩尔或5微摩尔的组织浓度。在另一个实例中，以达到大约10微摩尔、15微摩尔或20微摩尔的组织浓度。在另一个实例中，以达到大约30微摩尔、40微摩尔、50微摩尔、60微摩尔、70微摩尔、80微摩尔、90微摩尔或100微摩尔的组织浓度。在另一个实例中，以达到在大约1微摩尔到大约20微摩尔的范围内的组织浓度。在另一个实例中，以达到在大约1微摩尔到大约5微摩尔的范围内、或在大约5微摩尔到大约10微摩尔的范围内、或在大约10微摩尔到大约20微摩尔的范围内的组织浓度。
可以使用从细胞培养测定和动物研究获得的数据来调配用于人类的剂量范围。所述剂量可以根据剂型和施用途径在该范围内变化。最初可以依据细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在细胞培养物或动物模型中调配剂量，以达到如细胞培养时确定的包含IC50(即测试化合物的达到症状的半最大抑制的浓度)的细胞浓度范围。此信息可以用于更准确地确定在人类中有用的剂量。精确的调配、施用途径和剂量可以由个体医师根据患者的病况来选择(参见例如，傅英格尔等人,1975,治疗学的药理学基础,第1章,第1页)。
施用可以在考虑到正在治疗的特定疾病或病症的情况下在待治疗的疾病或病症进展期间或者在疾病或病症发展之前或之后的任何时间进行。例如，当所述疾病或病症是AMD时，施用可以在AMD初期、中期和/或后期进行。例如，当所述疾病或病症是糖尿病性视网膜病变时，施用可以在存在轻度非增殖性视网膜病变时、在存在中度非增殖性视网膜病变时和/或在存在增殖性糖尿病性视网膜病变时进行。例如，当所述疾病或病症是中风时，施用可以在再灌注之前、再灌注期间或再灌注之后进行并且可以结合凝块分解化合物(如例如组织型纤溶酶原激活剂、阿替普酶、链激酶、替奈普酶或瑞替普酶)或通过外科手段进行凝块收回；具体地但非排他地，其中正在施用的构建体包括能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽。施用可以在用凝块分解化合物(如例如组织型纤溶酶原激活剂、阿替普酶、链激酶、替奈普酶或瑞替普酶)治疗之后或在通过外科手段进行凝块收回之后进行；具体地但非排他地，其中正在施用的构建体包括能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽。例如，当所述疾病或病症是癌症时，施用可以在任何阶段进行，如当通过肿瘤淋巴结转移(TNM)分级系统判断时，其中T是指主要肿瘤的大小和程度，N是指具有癌症的附近的淋巴结并且M是指癌症是否已经转移。当存在异常细胞但未扩散到附近组织时，可以在第O阶段施用，或者当存在癌症(并且数量越高，癌症越大并且扩散到附近组织的癌症就越多)时，可以在第1级、第II级或第II级施用，或者当癌症已经扩散到身体远处部位时，可以在第IV阶段施用。
在本发明的第四到第九方面的一个实施例中，每天在延长的时间段内施用本发明的构建体、核酸或核酸载体或包括本发明的构建体、核酸或核酸载体的组合物，以协助持续管理疾病或病症的症状。在本发明的第四到第九方面的另一个实施例中，每天在延长的时间段内或贯穿受试者的生命期施用本发明的构建体、核酸或核酸载体或包括本发明的构建体、核酸或核酸载体的组合物，以预防或延迟疾病或病症的发展。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第十七方面或本发明的第十六方面的一个实施例中，所述药物被调配用于全身施用剂量在大约70mg到1,750mg的范围内的能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第十七方面或本发明的第十六方面的一个实施例中，所述药物被调配用于全身施用一定剂量，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的循环浓度的范围达到大约5微摩尔到20微摩尔。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第十七方面或本发明的第十六方面的一个实施例中，所述药物被调配用于通过全身输注来施用一定剂量，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的循环浓度的范围达到大约2.5微摩尔到250微摩尔。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第十七方面或本发明的第十六方面的一个实施例中，所述药物被调配用于局部施用一定剂量，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的组织浓度的范围达到大约1微摩尔到100微摩尔。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第十六方面的一个实施例中，所述药物被调配用于局部施用一定剂量，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的组织浓度的范围达到大约1微摩尔到100微摩尔。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第十七方面或本发明的第十六方面的一个实施例中，所述药物被调配用于玻璃体内施用一定剂量，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的组织浓度的范围达到大约1微摩尔到100微摩尔。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第十六方面的一个实施例中，所述药物被调配用于玻璃体内施用一定剂量，以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的组织浓度的范围达到大约1微摩尔到100微摩尔。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第十六方面的一个实施例中，所述药物被调配用于局部施用在大约0.04mg到大约5mg的范围内的剂量。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第十七方面或本发明的第十六方面的一个实施例中，所述药物被调配用于玻璃体内施用在大约0.04mg到大约5mg的范围内的剂量。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第十六方面的一个实施例中，所述药物被调配用于玻璃体内施用在大约0.04mg到大约5mg的范围内的剂量。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第二十三方面或本发明的第二十二方面的一个实施例中，所述用途是通过施用在大约70mg到1,750mg的范围内的剂量的能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽来完成的。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第二十三方面或本发明的第二十二方面的一个实施例中，所述用途是通过全身施用在大约70mg到1,750mg的范围内的剂量的能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽来完成的。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第二十三方面或本发明的第二十二方面的一个实施例中，所述用途是通过施用一定剂量以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的循环浓度的范围达到大约2.5微摩尔到250微摩尔来完成的。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第二十三方面或本发明的第二十二方面的一个实施例中，所述用途是通过施用一定剂量以使能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的组织浓度的范围达到大约1微摩尔到100微摩尔来完成的。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第二十二方面的一个实施例中，所述用途是通过局部施用在大约0.04mg到大约5mg范围内的剂量来完成的。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的本发明的第二十三方面或本发明的第二十二方面的肽的一个实施例中，所述用途是通过玻璃体内施用在大约0.04mg到大约5mg范围内的剂量来完成的。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第二十二方面的一个实施例中，所述用途是通过玻璃体内施用在大约0.04mg到大约5mg范围内的剂量来完成的。
在其中化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的本发明的第十九和/或第二十一方面或本发明的第十八和/或第二十方面的一个实施例中，所述药物被调配用于按一定剂量施用核酸和/或核酸载体，以实现经过表达的构建体，从而使得能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的组织浓度在大约1微摩尔到大约250微摩尔的范围内。
在本发明的第十九和/或第二十一方面或在本发明的第十八和/或第二十方面的其中所述化合物是能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的一个实施例中，所述用途是通过施用一定剂量以实现经过表达的构建体从而使得能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽的组织浓度在大约1微摩尔到大约250微摩尔的范围内来完成的。
就根据本发明使用的肽或本发明的构建体(例如，源自乙肝病毒的X蛋白的靶向载体肽或能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽)可以通过重组技术产生的程度而言，本发明提供了：对本发明中使用的肽进行编码的核酸、对本发明的构建体进行编码的核酸、包括对本发明中使用的肽进行编码的核酸的载体以及包括对本发明的构建体进行编码的核酸的载体，所述核酸和所述载体可以有助于肽的克隆和表达。
另外，应理解，可以使用(包含治疗性地使用)对本发明的构建体和本发明中使用的构建体进行编码的核酸，和/或包括对本发明的构建体和本发明中使用的构建体进行编码的核酸的核酸载体；例如，根据如本文详细描述的第二、第三、第六、第七、第八、第九、第十二到第十五和/或第二十四到第二十七方面。
例如，对构建体进行编码的核酸/表达载体可以施用于受试者或与细胞或细胞群接触，随后表达肽/构建体。相应地，本发明包含适于这些目的的核酸和核酸载体。
应理解，本发明或根据本发明使用的核酸是“分离的”或“纯化的”核酸。“分离的”或“纯化的”核酸是已经从其天然存在的环境中鉴别并分离出的或人工合成的核酸。应理解，这些术语并不反映核酸已经从其天然存在的环境中纯化或分离的程度。本发明或根据本发明使用的核酸可以从天然来源中分离或者优选地通过将容易被本领域技术人员知晓的化学合成或重组技术得到。
本发明所涉及领域的一般技术人员将能够容易根据本文提供的氨基酸序列、其中的遗传密码和所理解的简并性以及公布的核酸序列鉴别出对本发明中使用的肽和功能等效变体(例如，源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽或能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽)和本发明的构建体进行编码的各种核酸(参见例如，郭亚兵(Guo,Y.)和侯金林(Hou,J.)乙型肝炎病毒中国株全基因参照序列的初步建立(Establishment of theconsensus sequence of hepatitis B virus prevailing in the mainland of China)微生物及免疫学杂志(Wei Sheng Wu Ji Mian Yi Xue Za Zhi)19:189-2000,1999)。
然而，举例来说，对于源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽，以下核酸是适合的：
-ctt tgt cta cgt ccc(包括LCLRP的肽)(SEQ ID NO:73)
-ctt tgt cta cgt ccc gtc ggc(包括LCLRPVG的肽)(SEQ ID NO:74)
-ctt tgt cta cgt ccc gtc ggc gct gaa(包括LCLRPVGAE的肽)(SEQ ID NO:75)
-ctt tgt cta cgt ccc gtc ggc gct gaa tcc cgc(包括LCLRPVGAESR的肽)(SEQID NO:76)
-ctt tgt cta cgt ccc gtc ggc gct gaa tcc cgc gga cga ccc gtc tcg gggccg ttt ggg(包括LCLRPVGAESRGRPVSGPFG的肽)(SEQ ID NO:77)
-gtc ctt tgt cta cgt(包括VLCLR的肽)(SEQ ID NO:78)
-ctt tgt cta cgt(包括LCLR的肽)(SEQ ID NO:79)
进一步举例来说，技术人员将能够容易地参考公布的序列信息(例如，可从https://www.ncbi.nlm.nih.gov获得的GenBank登记号U64573.1)得到针对能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽进行编码的核酸序列，并且读者通过参考的方式被明确地引导到该数据库，并且所述条目包含在本文中对本发明的一般描述中。
核酸载体和/或核酸构建体通常将含有异源核酸序列。即，核酸载体和/或核酸构建体在针对本发明中使用的肽所源自的天然蛋白/肽进行编码的核酸中含有与对本发明中使用的肽进行编码的序列不相邻的核酸序列。核酸载体和/或核酸构建体还可以含有本身不针对构建体进行编码的核酸序列。例如，核酸载体和/或核酸构建体可以含有调节序列，如启动子、操作子、阻遏子、增强子、终止序列、复制起点和如本领域已知的其它适合的调节序列。进一步地，核酸载体和/或核酸构建体可以含有分泌序列，以使经过表达的蛋白质能够从其宿主细胞中分泌出来。另外，核酸表达构建体可以含有融合序列(如对异源氨基酸序列进行编码的序列)，所述融合序列导致本发明的插入的核酸序列表达为融合蛋白或肽。
使用的异源核酸序列可以包含例如对氨基酸序列进行编码的那些序列，所述氨基酸序列可以协助肽(例如，泛素、his-标签、c-myc标签、GST标签或生物素)的后续分离和纯化。异源核酸序列还可以包含对肽连接子进行编码的那些序列，所述肽连接子协助肽与另一种化合物连接以形成本发明的构建体，如上所述。
核酸构建体或核酸载体可以是RNA或DNA，原核的或真核的并且通常是病毒或质粒。适合的核酸构建体被优选地适配成将本发明的核酸递送到宿主细胞中并且能够或不能够在此细胞中复制。包括本发明的核酸的重组核酸构建体可以例如用于本发明的核酸序列的克隆、测序和表达。
本发明所涉及领域的技术人员将识别出适于在本发明中使用的多种核酸构建体。然而，如pUC和pBluescript等克隆载体和如pCDM8、腺相关病毒(AAV)或慢病毒等表达载体的使用是特别有用的。
根据本发明，核酸载体向宿主细胞的转化可以通过可以将核酸序列插入细胞中的任何方法来完成。例如，转化技术包含转染、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附、细胞穿透性载体肽递送和基因枪轰击。
如将理解的，本发明的经过转化的核酸序列可以保持在染色体外或可以以保留其被表达的能力的方式整合到宿主细胞的染色体内的一或多个位点。
本领域已知的任何数量的宿主细胞可以用于克隆和表达本发明中使用的核酸序列和/或本发明的核酸序列。例如，这些包含但不限于微生物，如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；使用pEE14质粒系统的动物细胞系统，如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或用重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统。
根据本发明使用的重组肽或本发明的重组肽构建体可以在使用本领域的各种标准技术表达后从经过转化的宿主细胞或培养基中回收。例如，洗涤剂提取、超声处理、溶解、渗透休克处理和包涵体纯化。可以使用如亲和色谱法、离子交换色谱法、过滤、电泳、疏水相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法和色谱聚焦等技术进一步纯化蛋白质。
用于重组表达本发明的肽的另外的或替代性方法可以例如从萨姆布鲁克和马尼亚蒂斯分子克隆：实验室手册,第二版,纽约冷泉港冷泉港实验室出版社，(1989)中获得。
在本发明的涉及治疗眼部疾病和/或病症(如年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、眼部肿瘤和/或视网膜中风)的方面中使用的肽治疗剂的实例包含用于减少炎症或补体途径中蛋白质(如Ang2、Tie2、整联蛋白或Cx43)的产生的反义寡核苷酸，或者可以使用干扰任何VEGF或PDGF或其受体的产生的反义寡核苷酸。另外的实例是使用抗VEGF和/或抗PDGF反义寡核苷酸来减少年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变或癌症中的新生血管。
本发明的构建体可以使用重组克隆和表达技术产生，并且相应地，本发明应被视为包含对构建体进行编码的核酸和包括此些核酸的载体。
技术人员在考虑到本文先前描述的靶向载体肽的核酸和肽序列以及待递送到细胞的肽化合物的性质的情况下将容易理解对本发明的构建体进行编码的核酸序列。类似地，技术人员将容易理解用于克隆和表达构建体的适合的载体。然而，举例来说，可以使用本文其它地方详细描述的核酸载体(例如pUC载体、腺相关病毒、慢病毒)和技术(包含例如WO 91/09958、WO 03/064459、WO 00/29427和WO 01/13957中描述的那些)。
某些术语在本文中可以以复数形式引用；例如，“细胞”、“化合物”、“药剂”。除非上下文另有要求，否则这应被视为包含对单数的引用。
实例
材料和方法
肽序列
Gap19(KQIEIKKFK[SEQ ID NO:3])、命名为XG19(lclrpvGGKQIEIKKFK[SEQ ID NO:1])的融合肽和融合肽TAT-Gap19(YGRKKRRQRRRKQIEIKKFK[SEQ ID NO:80])以及FITC标记肽全部从中国肽有限公司(ChinaPeptide Co Ltd)获得，纯度为95％。肽5(VDCFLSRPTEKT[SEQ ID NO:81])购自Auspep。将肽重新悬浮于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中，并储存在-20℃下。
细胞培养和维持
除非另有说明，否则所有细胞培养试剂购自
Figure GDA0002448045650000631
或InvitrogenTM(生命技术公司(Life Technologies))。ARPE-19细胞来自于购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的人视网膜色素上皮细胞系，并且在37℃下在5％CO2下维持在DMEM/F12(DMEM/F-12，含有10％热灭活胎牛血清(FBS)和1％抗生素-抗真菌药(西格玛(Sigma))的GlutaMAXTM培养基)的T25烧瓶中。
在37℃下在5％CO2下，培养原发性人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC；Neuromics)并将其维持在含有内皮基础培养基(EBM-2；龙沙(Lonza))和EGM-2 SingleQuotsTM(龙沙)的补充有10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌药(西格玛)的EGM-2TM BulletKitTM培养基的T25烧瓶中。将VEGF排除在EGM-2培养基之外。
细胞生长达到70-80％汇合，每周分裂一次或两次，并维持少于三十代。对于实验，用TrypLETM Express采集细胞，以1500rpm离心7分钟，重新悬浮于培养基中，并使用台盼蓝和纽鲍尔(Neubauer)血球计进行计数。平板接种所需浓度的细胞，并生长过夜以允许其附着到孔的底部。
高血糖症和炎症溶液
高血糖症和炎症溶液通过将葡萄糖加入DMEM/F12(GlutaMAXTM)以达到32.5mM的最终葡萄糖浓度而产生。加入炎性细胞因子TNFα和Il-1β(派普泰克(PeproTech))以达到各自10ng/ml的最终浓度。向溶液中加入抗生素-抗真菌药，以达到1％的浓度。在施加到细胞之前，新鲜制备所述溶液。
图像获取和分析
使用奥林巴斯(Olympus)BX-10共聚焦显微镜，通过FV-1000激光扫描共聚焦系统使细胞和组织可视化。使用奥林巴斯FV-10软件获取图像，并使用ImageJ进行面积测量。使用Graphpad Prism 7软件进行所有统计分析。
细胞摄取
采集ARPE-19或hRMEC细胞，并以2×105细胞/毫升的密度将其接种于0.4ml的DMEM/F12或EGM-2TM BulletKitTM培养基中的8孔室载玻片中，并且在37℃下在5％CO2下温育经2夜。在37℃下在5％CO2下，将肽或控制通道阻断剂(即羧苄酮(CBX)(西格玛)或氯化镧(LaCl3；西格玛))以适当的浓度与DMEM/F12或EGM-2TM BulletKitTM培养基混合，并将其施加到细胞上，持续1小时。对于缺氧条件下的细胞摄取，在37℃下在5％CO2下，将肽递送在缺氧、酸性离子移位的林格氏(HAIR)溶液(13)中，持续1小时。对于高血糖症和炎症条件下的细胞摄取，在37℃下在5％CO2下，将肽递送在高血糖症和炎症溶液中，持续24小时。除去溶液，并且在PBS中洗涤细胞，并在用DAPI复染细胞核的情况下，将细胞固定在4％甲醛PBS中。将盖玻片安装在抗褪色介质(CitifluorTM AF1)中，并通过共聚焦显微镜使细胞可视化。
MTT测定
将ARPE-19细胞暴露于DMEM/F12(正常培养基)或HAIR溶液中，持续1小时。在37℃下在5％CO2下，将XG19在DMEM/F12或HAIR溶液中混合，并以0、5、10或20μM的浓度施加于ARPE-19细胞，持续1或24小时。在温育期之后，除去每个孔中的溶液，并用含0.5mg/mL MTT(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))的PBS替换并在37℃下和5％CO2下温育4小时。然后除去MTT/PBS溶液，并用HCl-异丙醇溶液(0.04M))替换，以溶解形成的甲臜。在650nm下校正干扰的情况下，通过在570nm下测量吸光度来定量紫色的强度(BioTekSynergy HT)。
EthD-1摄取
如前所述，将肽施加于细胞上以供摄取。从细胞中除去肽溶液，在37℃下在5％CO2下将所述细胞暴露于含2μM乙锭同二聚体-1(EthD-1)的用于打开半通道的汉克氏缓冲盐溶液(137mM NaCl、5.4mM KCl、0.25mM Na2HPO4、0.1g葡萄糖、0.44mM KH2PO4、1.0mM MgSO4和4.2mM NaHCO3)+EGTA(5mM)(低钙溶液)或高钙(Ca2+)溶液(汉克氏缓冲盐溶液+1.3mMCaCl2)中，持续30分钟。除去溶液并在PBS中洗涤细胞，并且在用DAPI复染细胞核之前将所述细胞固定在4％甲醛PBS中。将盖玻片安装在抗褪色介质(CitifluorTM AF1)中，并且对载玻片进行成像。
ATP释放测定
如前所述，将肽施加于细胞上以供摄取研究。从细胞中除去肽溶液，然后在37℃下在5％CO2下将所述细胞暴露于低钙(Ca2+)溶液或HAIR溶液以打开半通道或暴露于高钙溶液以关闭半通道，持续30分钟。将溶液转移到黑色96孔板中，并根据ATP发光试剂盒(西格玛)的说明并使用Victor X Light发光板读取器(珀金埃尔默(Perkin Elmer)2030)进行ATP测量。
间隙连接测定
如前所述，将肽施加于细胞上以供摄取。从细胞中除去肽溶液，并将细胞暴露于0.1％荧光黄/PBS染料(LY)。使用移液管尖端在细胞单层中产生竖直和水平刮擦。然后在室温下将细胞温育15分钟。除去LY染料溶液并在PBS中洗涤细胞，并在用DAPI复染细胞核时将所述细胞固定在4％甲醛PBS中。将盖玻片安装在抗褪色介质(CitifluorTM AF1)中，并且对载玻片进行成像。
ARPE-19细胞的多配体聚糖-4标记
在PBS中洗涤细胞并在室温下固定在4％甲醛/PBS中持续10分钟之前，用DMEM/F-12、高血糖症和炎症溶液或HAIR溶液处理ARPE-19细胞，持续1小时。用PBS洗涤掉甲醛溶液并用一抗(抗多配体聚糖-4(R&D系统公司(R&D Systems)))标记细胞过夜。然后，在RT下在潮湿的箱内在PBS中施加二抗(驴抗山羊488)和DAPI持续1小时之前，用PBS洗涤掉一抗。将盖玻片安装在抗褪色介质(CitifluorTM AF1)中，并且对载玻片进行成像。
激光诱导的脉络膜新生血管小鼠模型
一般程序
从奥克兰大学弗农詹森单位(Vernon Jansen Unit)(VJU)获取雌性C57BL/6小鼠，并且在实验的第0天，所述小鼠为6周龄。研究期间，所有动物均被圈养在VJU中，并可以随意取用食物和水。所有动物程序均获奥克兰大学动物伦理委员会批准，并符合视觉和眼科研究协会(ARVO)关于在眼科和视觉研究指南中使用动物的声明(https://www.arvo.org/about/policies/statement-for-the-use-of-animals-in-ophthalmic-and-vision-research/)。在通过腹膜内注射氯胺酮(50mg/kg)/domitor(0.5mg/kg)混合物麻醉小鼠之前对所述小鼠进行称重，并将其置于小鼠阶段以进行激光光凝或眼部估计(眼底成像和光学相干断层扫描(OCT))。加热小鼠阶段以维持小鼠体温并防止白内障形成。用1％托平卡胺扩张眼药水扩张瞳孔，以增加视网膜的可视化。将润滑聚凝胶施加于每只眼睛上以充当Micron IV目镜(菲尼克斯研究实验室(Phoenix Research Labs))与眼睛表面之间的偶联介质。在激光光凝或眼部估计完成之后，用盐水洗涤掉润滑凝胶，并将抗生素溶液施加于两只眼睛上以防止感染。然后，通过腹膜内注射阿替美唑(5mg/kg)唤醒小鼠，并允许其在35℃加温垫上恢复。第8天，通过CO2窒息和颈脱位法处死所有动物。摘除眼睛，在切片到载玻片上以进行免疫组织化学分析之前，将其固定在含4％多聚甲醛的PBS中，冷冻在最佳切割温度化合物中并储存在-80℃下。
激光光凝
将激光器注射器附接到微米IV，并按照制造商的指南组装激光器。使用明视场实时眼底图像观察小鼠视网膜，并按照由龚(Gong)等人2015(34)使用的方法对视盘进行集中。在使用脉冲为532nm、固定直径为50μm、持续时间为70毫秒且功率为240mW的绿色氩激光器产生距视盘等距离(2盘直径)的四个顺序激光灼伤之前，在眼底图像上使激光瞄准光束可视化。在产生激光灼伤时避开了主要血管。在激光光凝之后立即拍摄长达60秒的眼底图像以观察视网膜下气泡形成和病变生长。
眼底成像与测量
按照制造商的指南将眼底/OCT目镜附接到Micron IV。在第0天(激光光凝之前和之后)、第1天和第7天拍摄明视场眼底图像。用ImageJ软件进行横截面面积测量。
光学相干断层扫描(OCT)
按照制造商的指南(菲尼克斯研究实验室)将眼底/OCT目镜附接到Micron IV。使用明视场实时眼底图像对OCT参考臂进行定向，并使用Micron OCT软件获取OCT扫描。在每个病变上从上至下进行了若干次OCT扫描。通过观察典型的脉络膜新生血管体征(如第0天布鲁赫氏膜(Bruch's membrane)破裂(RPE/脉络膜层的低反射区)、第1天蝶状病变和第7天病变部位处的视网膜层的高反射率增加)对OCT图像进行定量估计。通过苏莱曼(Sulaiman)等人2015(35)描述的方法，使用ImageJ软件获取第7天病变的椭球测量。
CNV小鼠模型研究
如上所述，以五个为一组在三周内获取并维持十五只小鼠。麻醉小鼠并进行激光光凝，并获取如上所述的眼底图像。紧随两眼进行激光光凝后，在获取眼底和OCT图像之前，小鼠接受腹膜内注射浓度为25μM(低剂量)或250μM(高剂量)的含XG19的盐水或单独的盐水。在第1天和第7天获取如上所述的眼底和OCT图像。第8天，处死动物，并且切除并处理眼部组织以用于如上所述的免疫组织化学分析。
大鼠败血症与急性胰腺炎模型
此动物研究获奥克兰大学动物伦理委员会的批准，并遵守了“动物研究：体内实验报告(Animal Research:Reporting of In Vivo Experiments)(阿里夫(ARRIVE)；https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines)指南”中概述的标准。用18％的蛋白质啮齿动物饮食喂养雄性斯普拉-道来(Sprague Dawley)大鼠(约450g)，并且允许其在手术前随意取用食物和水。在2升/分钟下用3-4％异氟烷和O2诱导全身麻醉，并且在2升/分钟下用1.5-2.5％异氟烷与O2维持。将大鼠放置在加温板上以使体温保持在36-38℃下，并通过直肠探针监测其温度。将14G改良静脉留置针插入到气管中并连接到小动物机械呼吸机。所施用的吸入的O2/空气浓度为40-45％，并且呼吸速率和峰值吸气压力分别设定为60-80次呼吸/分钟和14-18cmH2O。呼气末CO2维持在35-45ml/L并且由二氧化碳分析仪监测。将维持液(0.9％NaCl)施用到右股静脉中，并且将2F压力转换器插入到右股动脉中，以监测平均动脉压。
对于中度严重性急性胰腺炎(AP)模型，暂时闭塞胆管，并使用24G静脉留置针对主要胰管进行插管，并以0.1毫升/分钟缓慢输注5％牛磺胆酸钠溶液，直到达到1ml/kg重量为止。输注后10分钟取出静脉留置针，胆管开放，并绑扎胰管以防止流出物。
对于败血症模型，盲肠切口取0.5cm，并且粪便扩散至腹部的所有四象限。使肠管回到腹腔。AP和败血症的诱导花费10-15分钟。假手术大鼠经历与疾病模型相同的麻醉和腹部横切口方案，但无任何特异性疾病诱导。假手术大鼠的总持续时间与AP和败血症模型相匹配，以控制麻醉作用。向大鼠持续施用维持液，但其输注速率取决于大鼠模型：对于AP模型，选择最小6毫升/千克/小时以给出轻度-中度疾病严重程度，而对于败血症模型，给出最小18毫升/千克/小时以使大鼠充分复苏，从而保证大鼠在5小时实验期间存活。每个模型的死亡率为：败血症为15％，并且AP和假手术分别是0％。
在5小时疾病进展期间，使用LabChart 5持续监测术中平均动脉压、心率和体温。在5小时疾病进展结束时，从下腔静脉采集血液进入K2EDTA真空采血管中。在将12μm切片并安装到载玻片上以进行免疫组织化学分析之前，切除肺部并将其安装在最佳切割温度化合物中并冷冻在-80℃下。
人鼻窦组织
在接受功能性内窥镜鼻窦手术(FESS)治疗慢性鼻窦炎(CRS)的三个患者中，从中鼻道中获取粘膜活检。对照组由患有梗阻但鼻窦炎未接受鼻中隔成形术治疗的三例患者组成。在将12μm切片并安装到载玻片上以进行免疫组织化学分析之前，将活检安装在最佳切割温度化合物中，并在液氮中快速冷冻。
神经胶质瘤小鼠模型
在头皮上进行小切口之后，通过冠状缝将同基因SMA560神经胶质瘤细胞(1×105个SMA560神经胶质瘤细胞)通过10μl颅内注射(27号针)插入到麻醉VmDK小鼠的脑部中。在肿瘤细胞植入之后14天出现神经症状之前，处死小鼠。除去脑部，用解剖刀片通过注射部位进行切割并且将其放置在中性缓冲福尔马林中以进行组织学处理，然后在切割前包埋在石蜡中并且将12μm切片安装到载玻片上以进行免疫组织化学分析。
A431和SKOV3肿瘤组织
人肿瘤细胞A431和SKOV3经皮下注射施用到免疫受损裸鼠的侧腹中。在切片到载玻片上以进行免疫组织化学分析之前，采集肿瘤并在最佳切割温度化合物中进行冷冻并且储存在-80℃下。
组织切片的免疫组织化学
在开始对来自小鼠神经胶质瘤模型的石蜡包埋脑组织切片(12μm)进行免疫组织化学标记前，在通过在流动的冷水中冲洗来再水合载玻片之前，通过在二甲苯中洗涤二次持续三分钟、以二甲苯1:1用100％乙醇洗涤持续三分钟、在100％乙醇中洗涤两次持续三分钟、在95％乙醇中洗涤持续三分钟、在70％乙醇中洗涤持续三分钟、在50％乙醇中洗涤持续三分钟来使切片脱石蜡。通过将柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠，0.05％吐温20，pH 6.0)施加在高压锅中持续1小时来回收抗原。然后将载玻片在室温下封闭在1％牛血清白蛋白(BSA)/PBS中，持续1小时。
将来自人供体视网膜(正常和糖尿病性视网膜病变)的冷冻组织(安装在最佳切割温度化合物中)切片(12μm)、人鼻窦组织(正常和CRS)、小鼠眼组织(激光诱导的CNV小鼠模型)和大鼠肺组织(AP和败血症模型)和肿瘤组织(A431和SKOV3)在室温下干燥过夜，并且然后在通风橱中在室温下将其固定在25％无水乙醇和75％丙酮的混合物中，持续10分钟。在室温下在1％牛血清白蛋白(BSA)/PBS中封闭1小时之前，将切片在室温下干燥10分钟。
引出封闭溶液，并且在潮湿的箱内在室温下用含20μg/ml多配体聚糖-4抗体(R&D系统公司)的1％BSA/PBS覆盖切片过夜。仅在1％BSA/PBS中处理对照切片。使用0.05％吐温20/PBS洗涤掉抗体，并且在潮湿的箱内在室温下将组织覆盖在含有二抗(驴抗山羊488)和含DAPI的1％BSA/PBS的溶液中，持续2小时。在0.05％吐温20/PBS中洗涤切片。将盖玻片安装在抗褪色介质(CitifluorTM AF1)中，并且对载玻片进行成像。
结果
实例1
摄取到hRMEC和ARPE-19细胞中的XG19比单独的Gap19更有效
使用原发性hRMEC(图1)以及永生化ARPE-19细胞(图2)在体外测试XG19的摄取情况。将XG19与Gap19的细胞摄取进行比较，以观察LCLRPV序列的添加是否改善了细胞摄取。
如通过增加FITC荧光(图1中的FITC图中的白色区域)观察到的，随着XG19浓度的增加由hRMEC细胞进行的XG19摄取以剂量依赖性方式发生。在本测定中，即使在XG19的最低浓度(10μM)下，也可观察到摄取。因为没有观察到荧光，所以检测不到甚至高达50μM的Gap19摄取，并且其与无肽对照物相当(如由相应处理的FITC图中不存在白色区域所指示的，图1)。在100μM Gap19下观察到一些摄取，然而这仍低于10μM XG19。因此，将LCLRPV添加到Gap19中提高了到hRMEC细胞中的Gap19的摄取效率。此测定示出，XG19可以穿透hRMEC，并将LCLRPV添加到Gap19中改善了这些细胞中的摄取。
如通过增加FITC荧光(图2中的FITC图中的白色区域)观察到的，随着XG19浓度的增加，到ARPE-19细胞中的XG19的细胞摄取以剂量依赖性方式发生。在细胞内检测不到高达100μM的单独的Gap19，这与无肽对照物类似(如由Gap19处理和无肽处理的FITC图中不存在白色区域所指示的)。因此，将LCLRPV添加到Gap19中提高了到ARPE-19细胞中的Gap19的摄取效率，因为在较低的Gap19浓度下在细胞内递送了更大量的XG19。
由于ARPE19是永生化细胞系，所以其更易于培养并且可以多次传代存活，而原发性细胞仅对非常有限量的传代是可靠的。为此，使用ARPE-19细胞进行剩余实验。
实例2
摄取到ARPE-19细胞中的TAT-Gap19比单独的XG19或Gap19更有效，然而XG19不定位到细胞核
通过将Gap19与TAT肽组合以产生TAT-Gap19(6，7)，先前已经改进了Gap19的摄取效率。将XG19与Gap19和TAT-Gap19在ARPE-19细胞中的摄取效率进行比较(图3)。如通过增加FITC荧光(图3中的FITC图中的白色区域)观察到的，随着TAT-Gap19浓度的增加，由ARPE-19细胞进行的TAT-Gap19摄取以剂量依赖性方式发生。甚至在TAT-Gap19的最低浓度(10μM)下也观察到摄取，并且用20μM下的TAT-Gap19饱和细胞。检测不到甚至高达100μM的Gap19摄取(如由图3中的FITC图中不存在白色区域所指示的)，这与无肽对照物相当。
当检测到XG19摄取低至10μM时，在所有被测浓度下，增加多达50μM的TAT-GAP19的总体摄取远大于XG19的摄取(如由图3中的FITC图中的增加的白色区域所指示的)。这可能是由于两种肽之间的摄取机制的差异而造成的。TAT主要通过其它机制(8，9)中的巨胞饮作用进入细胞，而LCLRPV以多配体聚糖-4特异性方式(10，11)进入细胞。因此，当由于其多重摄取机制，在此测定中TAT-Gap19的摄取比XG19更有效时，这强调了其在靶向某些细胞类型方面的非特异性，因为摄取不受单一因素的限制，而XG19排除在非多配体聚糖-4表达性细胞(如红细胞和非粘附单核细胞(10，11))之外。
仔细观察肽摄取(图4和图4A)，发现，虽然两个肽都由细胞摄取，但是XG19仅在细胞质(XG19的FITC图中的灰色区域，图4A)中可视化，而TAT-Gap19在细胞质(TAT-Gap19的FITC图中的灰色区域，图4A)以及细胞核(TAT-Gap19的FITC图中的白色点，图4A)中可视化，这在XG19处理中不可见。因此，虽然TAT-Gap19的摄取大于XG19，但从长远来看，转运到细胞核可能对细胞的功能和活力产生不期望的影响。TAT先前已经用于将其它肽和分子转运到细胞核(12，13)；然而，因为将较少肽递送到其作用位点，所以将Gap19递送到细胞核可能导致功效降低。转运到细胞核也可能具有潜在毒性。
实例3
摄取到ARPE-19细胞中的XG19不会导致细胞毒性
在进行MTT细胞毒性测定之前，将增加浓度的XG19(5、10或20μM)施加到ARPE-19细胞，持续一小时或二十四小时。未经处理的细胞被用作阳性活力对照物。这是为了评估XG19在体外在短持续时间和长持续时间两者内的毒性。如图5所示，当与未经处理的细胞相比时，经过XG19处理的细胞在一小时和二十四小时时间点示出的活力无显著差异。这表明XG19进入细胞中的初始摄取过程没有毒性。此外，一旦在细胞内部，XG19甚至在二十四小时内保持无毒。这表明施用的XG19无毒，因为细胞内的肽的摄取或储存没有导致细胞毒性。这与先前关于毒性(10，11)的文献一致。
实例4
XG19抑制Cx43半通道介导的Eth-D1染料摄取
可以在体外(14)刺激半通道开口，并且因此如乙锭同二聚体(EthD-1)染料等小分子的进入可以用于观察半通道功能。使用EthD-1摄取测定(图6)观察XG19抑制细胞摄取后半通道开口的能力。还对用于细胞摄取实验中的FITC标记的XG19进行测试，以观察FITC标记是否将干扰肽功能。
暴露于低钙溶液的细胞引起对EthD-1的摄取增加，由于低钙刺激半通道开口从而允许染料进入到细胞中(图6中左上图)。EthD-1染料只有在细胞质中在低浓度下时才有浅荧光，当其与细胞核结合时，在较高浓度下变成超荧光。
高钙溶液关闭Cx43半通道，并且因此抑制EthD-1染料摄取(图6中右上图)。XG19和FITC-XG19两者能够抑制EthD-1染料摄取，因为观察到的荧光与高钙对照物(图6中分别的底图)类似。因此，XG19和FITC-XG19两者在细胞摄取后呈生物可用的形式，并且能够作为半通道阻断剂发挥作用。此外，FITC标记不干扰XG19功能。
通过测量每次处理的四个区域中的平均EthD-1荧光强度(n＝4；平均值±SD)来定量半通道抑制并将其绘制在图表中(图6，右侧)。使用邓尼特多重比较测试进行的单向ANOVA事后比较表明，与低钙处理相比，高钙(****p<0.0001)、XG19和FITC-XG19(***p<0.001)全部引起平均荧光强度显著降低，因此抑制半通道功能。
这证实XG19作为Cx43半通道阻断剂发挥作用，其中肽的Gap19组分在LCLRPV介导的摄取后呈生物可用的形式。此外，FITC偶联后所保留的XG19功能的鉴定具有使此肽用于未来体外或体内测定的潜力，在所述测定中，可能需要对肽进行可视化。
在类似测定中观察溴化乙锭摄取的先前实验表明，高达172μM的Gap19对Cx43半通道抑制没有影响，只有当浓度增加至344-688μM的Gap19(6)时，功效才得以改善。已经表明，由于此融合肽的摄取效率提高，即使5μM XG19也能够在此测定中有效。
实例5
XG19抑制Cx43半通道介导的ATP释放
在损伤期间，开放的Cx43半通道允许释放小分子(如ATP)进入细胞外环境中，从而提供信号以刺激产生炎性因子，因此使炎性病状(15，16)持续。ATP释放的体外测量可以用于评估Cx43半通道开口(17)。使用ATP释放测定评估通过抑制Cx43半通道开口抑制ATP释放的XG19能力，并将其与已知的Cx43半通道阻断剂肽5(Pep5)以及非特异性半通道和间隙连接阻断剂羧苄酮(CBX)进行比较。肽5靶向Cx43的细胞外结构域。
用低钙溶液处理ARPE-19细胞导致随发光测量的时间依赖性ATP释放(图7)。使用邓尼特多重比较测试通过双向ANOVA和事后比较进行的统计分析表明，用XG19处理25分钟可以减少ATP释放，但与低钙对照物相比不显著，而与用Pep5(***p<0.001)和CBX(****p<0.0001)进行的处理相比具有显著差异。
在用XG19(*p<0.05)温育30分钟后，与低钙相比，用Pep5和CBX(****p<0.0001)进行的全部处理均降低了ATP释放。在35和40分钟时，与低钙对照物相比，所有处理显著降低(****p<0.0001)ATP释放。来自Pep5和XG19处理组的ATP释放低于来自低钙组的ATP释放，两者均大于CBX的ATP释放。这很可能是由于Pep5和XG19的特异性阻断性质仅阻断了Cx43半通道，而CBX非特异性阻断了多种类型的通道，从而导致ATP释放较低。Pep5已被证明在多个测定中抑制Cx43半通道功能，从而改善细胞存活率(18，19，20)。因此，本测定中Pep5的功能验证了XG19作为Cx43半通道阻断剂，并进一步证实XG19的Gap19组分在LCLRVP介导的摄取后呈生物可用的形式。此外，与浓度低20倍的Pep5相比，用XG19实现的类似作用进一步增加了XG19作为治疗剂的潜力。
实例6
摄取后24小时维持XG19功能
通过测量XG19摄取后一小时和二十四小时的细胞的ATP释放来评估半通道功能。观察XG19在摄取后延长时间点的功能。如图8所示，与未经处理的细胞相比，Cx43半通道的XG19抑制导致1小时和24小时时间点处ATP释放显著降低。使用Sidak多重比较测试通过双向ANOVA和事后比较进行统计分析。将显著性与每个时间点的未经处理的对照物(p**<0.01，p***<0.001，p****<0.0001)进行比较。这表明摄取24小时后，XG19是生物可用的且功能性的。这表明XG19在细胞内稳定长达24小时，并且在损伤期间表现出对ATP释放的功能阻滞。因此，XG19在摄取后即刻和24小时均起作用。
实例7
XG19不抑制间隙连接功能
通过间隙连接进行的细胞间通讯对于生理通讯是必不可少的，而间隙连接通讯的长期阻断可能对细胞(21)有害。可以在荧光黄(LY)染料刮擦/负载测定(22)中评估间隙接合功能。剩下未刮擦(图9，左上图)的细胞不占用LY染料，而当单层被刮擦(图9，右上图)时，刮擦部位处的细胞允许LY染料进入细胞中，所述LY染料然后通过开放间隙连接传递到相邻的细胞上。
用非特异性半通道和间隙连接阻断剂CBX(图9，左下图)处理的细胞占用LY进入与刮擦紧密相邻的细胞中；然而，由于阻断的间隙连接，染料未被进一步转运到任何相邻的细胞。
用5μM XG19处理的细胞导致刮擦部位处的染料摄取类似于未经处理的对照物，所述染料摄取通过间隙连接转移到相邻细胞(图9，右下图)。这表明，当XG19阻断半通道时，其维持了维持正常生理细胞到细胞通讯所需的间隙连接功能。先前的实验表明Gap19在摄取后维持间隙连接功能的能力(6)。XG19维持间隙连接功能的能力表明LCLRPV并不干扰XG19摄取后间隙连接功能的Gap19维持。
实例8
高血糖症和发炎细胞增加多配体聚糖-4表达
随着时间的推移，在正常细胞和高血糖症和发炎ARPE-19细胞中观察多配体聚糖-4表达(图10)。在正常培养基中，多配体聚糖-4表达随时间推移相对不变，而暴露于高血糖症和炎症溶液中的细胞示出多配体聚糖-4表达从1小时增加到3小时，在6小时和24小时略有下降。高血糖症和炎症溶液中的细胞的多配体聚糖-4表达在每个时间点均高于正常培养基中的细胞，如增强的荧光(图10中的AF488图中的白色区域)所示。通过测量暴露于培养基或高血糖症和炎症溶液1小时、3小时、6小时或24小时的细胞中针对每种处理(n＝3)的四个区域的FITC的平均荧光强度来评估多配体聚糖-4表达，并将其绘制在图表上(图10底部)。使用Sidak测试进行的双向ANOVA和事后比较表明，与正常培养基相比，多配体聚糖-4表达在3小时(****p<0.0001)、6小时(**p<0.01)和24小时(***p<0.001)在高血糖症和炎症溶液中显著增加，而在1小时无显著增加。这表明，ARPE-19细胞响应于高血糖症和炎症上调了多配体聚糖-4表达。由于多配体聚糖-4是由XG19使用的用于细胞摄取的靶配体，因此高血糖症和发炎细胞中增加的多配体聚糖-4表达可以允许将肽更有针对性地具体递送到患病细胞。
实例9
高血糖症和发炎细胞中XG19摄取增加
观察高血糖症和发炎细胞中对XG19的细胞摄取是否发生改变；将XG19施用于正常细胞和高血糖症和发炎细胞，并将细胞摄取与Gap19进行比较(图11)。在培养基以及高血糖症和炎症溶液中观察到XG19摄取。在任一种条件下检测不到Gap19摄取(图11中的FITC图中不存在白色区域)。高血糖症和炎症溶液中的XG19的摄取大于正常培养基中的摄取，如由高血糖症和炎症溶液中更强的荧光(图11中FITC图中的白色区域)所指示。这表明高血糖症和发炎细胞中的XG19摄取增加，发明人假设这是由于APRE-19细胞中的多配体聚糖-4响应于高血糖症和炎症而过表达所导致的。此外，高血糖症和发炎细胞对Gap19的摄取增加是LCLRPV依赖性的，因为这些细胞中的天然Gap19摄取没有增加。发明人发现高血糖症和发炎细胞对XG19的摄取增加以及其在RPE和脉络膜中发现多配体聚糖-4表达使XG19成为治疗AMD的候选治疗剂，因为其有可能更容易被受疾病影响最严重的细胞所摄取并且因此可以改善治疗功效。
实例10
缺氧细胞增加多配体聚糖-4表达
在AMD中，视网膜色素上皮细胞由于局部缺血而变得缺氧。缺氧可以改变如多配体聚糖-4(23)等细胞表面蛋白的表达。随着时间的推移，在缺氧和正常细胞中观察多配体聚糖-4表达(图12)。在正常培养基中，多配体聚糖-4表达随时间推移相对不变，而暴露于缺氧溶液的细胞表现出多配体聚糖-4表达从1小时增加到3小时并从3小时增加到6小时，在24小时略有下降，这可能是由于过度暴露于缺氧溶液而引起的一些细胞死亡，因此降低了细胞密度和多配体聚糖-4表达。缺氧溶液中的细胞的多配体聚糖-4表达在每个时间点均高于正常培养基中的细胞，如增强的荧光(图12中的AF488图中的白色区域)所示。通过测量暴露于培养基或缺氧溶液1小时、3小时、6小时或24小时的细胞中针对每种处理(n＝4)的四个区域的FITC的平均荧光强度来评估多配体聚糖-4表达，并将其绘制在图表上(图12底部)。使用Sidak测试进行的双向ANOVA和事后比较表面，与正常培养基相比，多配体聚糖-4表达在1小时(**p<0.01)、3小时(***p<0.001)、6小时(****p<0.0001)和24小时(*p<0.05)在缺氧溶液中显著增加。这表明，ARPE-19细胞响应于缺氧反应上调了多配体聚糖-4表达。由于多配体聚糖-4是由XG19使用的用于细胞摄取的靶配体，因此缺氧细胞中增加的多配体聚糖-4表达可以允许将肽更有针对性地具体递送到患病细胞。
实例11
缺氧细胞中XG19摄取增加
观察缺氧条件下细胞对XG19的摄取是否发生改变；将XG19施用于正常细胞和缺氧细胞，并将细胞摄取与Gap19进行比较(图13)。在两种培养基中以及在缺氧溶液中观察到XG19摄取，而在任一种条件下检测不到Gap19摄取(图13中的FITC图中不存在白色区域)。缺氧溶液中的XG19的摄取大于正常培养基中的摄取，如由缺氧溶液中更强的荧光(图13中的FITC图中的白色区域)所指示。这表明缺氧细胞中的XG19摄取得到改善，发明人假设这可能是由于APRE-19细胞中的多配体聚糖-4响应于缺氧而过表达所导致的。此外，缺氧细胞对Gap19的摄取增加是LCLRPV依赖性的，因为缺氧细胞中的天然Gap19摄取没有增加。发明人发现缺氧细胞对XG19的摄取增加以及其在RPE和脉络膜中发现多配体聚糖-4表达使XG19成为治疗AMD的候选治疗剂，因为其有可能更容易被受疾病影响最严重的细胞所摄取并且因此可以改善治疗功效。
实例12
XG19在缺氧损伤期间保持细胞活力
在MTT测定中，通过将HAIR溶液施用于未经处理和经过XG19处理的细胞中来评估缺氧细胞中的细胞活力，并且将其与正常培养基中的细胞进行比较。这是为了观察XG19是否能够防止在缺氧期间发生的细胞活力降低。如图14所示，与正常培养基中的细胞相比，缺氧细胞的活力显著降低，这表明缺氧细胞正在经历损伤和死亡。与正常培养基中的未经处理的细胞相比，经过XG19处理的细胞未见显著差异。这表明经过XG19处理的细胞可以防止缺氧介导的损伤期间的细胞死亡。用事后邓尼特测试进行单向ANOVA，并且显著性表示为与正常培养基对照物中的未经处理的细胞的差异(***p<0.001)。因此，XG19可以提高细胞存活率并防止缺氧期间损伤的影响。
实例13
XG19在缺氧期间抑制Cx43半通道介导的ATP释放
通过将HAIR溶液施用于未经处理或经过XG19处理的细胞来诱导缺氧，并对ATP释放进行测量。如图15所示，与HAIR溶液中未经处理的细胞相比，经过XG19处理的细胞的ATP释放显著减少。用事后邓尼特测试进行单向ANOVA分析，并且显著性表现为与HAIR溶液中未经处理的细胞的差异(***p<0.001，****p<0.0001)。这表明缺氧会导致通过Cx43半通道进行ATP释放。XG19能够在这种缺氧损伤期间抑制半通道开口，从而导致ATP释放减少。因此，XG19能够减少缺氧损伤期间的ATP释放，这促进损伤期间的细胞存活率。
实例14
XG19减少激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)小鼠模型的病变面积
如先前在方法中描述的，在第0天在C57BL6小鼠中产生激光诱导的病变。在第1天和第7天获取眼底图像，并且使用ImageJ软件测量病变面积。如图16中所示，在第1天，未在盐水组(n＝8只眼睛)、低剂量XG19组(n＝8只眼睛)或高剂量XG19组(n＝7只眼睛)之间观察到病变面积差异。在第7天，盐水组的病变面积与第1天相比没有变化，而两个经过XG19处理的组的病变面积在第7天都比第1天小。此外，经过高剂量XG19处理的小鼠产生最小的病变面积测量结果，而经过盐水处理的小鼠产生最大的病变面积测量结果。这些结果表明，XG19对病变面积的减小具有剂量依赖性影响，从而减少了损伤的扩散。
实例15
在激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)小鼠模型中，经过XG19处理的小鼠产生显著更小的病变体积
通过OCT根据实例14中描述的CNV模型使视网膜层在小鼠中可视化。使用ImageJ软件，用在第7天获取的OCT图像测量CNV病变的椭球体积。如图17中所示，经过盐水处理的小鼠(n＝8只眼睛)产生最大体积测量结果，而用低剂量XG19(n＝8只眼睛)或高剂量XG19(n＝7只眼睛)处理的小鼠产生显著更小的体积测量结果，如用事后邓尼特测试进行的单向ANOVA所测定的，并且显著性表现为与盐水组(**p<0.01，平均值+SD)的差异。这表明，与盐水处理相比，XG19处理能够显著减小CNV病变体积。此外，低剂量XG19组与高剂量XG19组之间无显著差异，这表明用较低XG19剂量可以实现有效的治疗浓度。已经示出，椭球体积测量与用于评估CNV病变(35)的脉络膜铺片的典型离体技术相当。使用脉络膜铺片的先前文献已经示出，CNV病变生长是由于血管生长、视网膜下积液和组织的凋亡(35-38)而造成的。因此，在我们的结果中看到的CNV体积减小指示RPE脉络膜复合体的组织愈合和正常化。
实例16
在激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)小鼠模型中，经过XG19处理的小鼠中的多配体聚糖-4和GFAP表达降低
在第8天处死来自实例14和实例15所描述的CNV模型的小鼠，并将眼睛摘除、切片并标记以用于多配体聚糖-4和GFAP表达。与XG19注射的小鼠相比，盐水注射的小鼠示出多配体聚糖-4和GFAP表达升高(图18)。我们的体外数据示出，多配体聚糖-4在炎症和缺氧期间增加(实例8和10)，而离体DR组织也示出患病组织中的多配体聚糖-4增加(实例18)。已经示出，由于病变部位处的炎症和局部缺血，CNV小鼠模型中的GFAP表达升高(38)。这表明XG19减少了小鼠视网膜的炎症和缺血，并且因此XG19促进了CNV的此小鼠模型愈合。
实例17
人视网膜切片中的多配体聚糖-4表达
XG19对细胞表面蛋白多配体聚糖-4具有高亲和力，从而促进细胞摄取。将人视网膜供体组织切片并标记以用于多配体聚糖-4表达(图19)。由于这些细胞中存在自荧光色素，因此用作抗体对照物的未标记的切片示出RPE层中的一些背景荧光(图19中的AF488图)。这也可以在标记为多配体聚糖-4的切片中看到(多配体聚糖-4标记的切片的AF488图的白色区域，图10)；然而，覆盖整个RPE的标记更突出，这表明真正的多配体聚糖-4标记。此外，还在脉络膜中观察到多配体聚糖-4标记，特别是在血管周围的内皮细胞中(多配体聚糖-4标记的切片的AF488图的白色区域，图19)。RPE和脉络膜大部分受AMD影响，并且因此是XG19的优选靶位点。在这些组织中发现了多配体聚糖-4的表达意味着XG19将专门靶向这些细胞，从而潜在地改善治疗功效并减少任何潜在的副作用。
实例18
多配体聚糖-4和GFAP表达在人糖尿病性视网膜病变组织中增加
对来自患有糖尿病性视网膜病变(DR)和不患有糖尿病性视网膜病变(正常)的患者的人供体组织切片进行标记以用于多配体聚糖-4、GFAP，并且用DAPI对细胞核进行染色。切片取自黄斑区域和旁黄斑区域(分别为图20和21)。在旁黄斑切片和黄斑切片两者中，与正常组织相比，DR组织中的多配体聚糖-4标记增加。血管和组织部分中的标记也增加了，这示出由于血管生长而导致的调节异常。DR中的血管生长调控不良并且导致渗漏血管形成，从而使组织缺血和缺氧。在这些部位处看到的多配体聚糖-4表达增加指示此区域缺氧。黄斑区域和旁黄斑区域两者中的DR组织中的GFAP表达也增加了。DR组织中的GFAP和多配体聚糖-4表达的组合表明此组织正在经受炎症并受到损伤。在ILM中也看到了所关注的多配体聚糖-4标记(图20)，因为ILM常常可以用作药物递送的屏障。已经提出，在这个部位处活化的Müller细胞具有通过将药物分子从ILM转运到外视网膜来改善药物递送的潜力(32)。ILM处的摄取将为药物递送提供优点。因此，此组织中的多配体聚糖-4的上调可以通过XG19靶向，以减少此区域的炎症。
实例19
急性胰腺炎和败血症大鼠模型中的多配体聚糖-4表达增加
标记来自急性胰腺炎(AP)和败血症大鼠模型的肺组织用于多配体聚糖-4，并将其与假手术动物进行比较。这两种疾病模型都会导致整体炎症。与假手术动物相比，败血症组织和AP组织(分别为图22和23)的多配体聚糖-4表达升高。在支气管和肺泡中，多配体聚糖-4表达增加，这表明疾病影响气道。已知，AP引起肺部并发症和缺氧(27)，而严重的败血症可能导致继发性并发症，如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(28)。这些组织中的多配体聚糖-4的上调为这些疾病状态期间优先摄取提供了靶标。因此，本发明的构建体可以用于在败血症和AP期间递送治疗剂以解决继发性呼吸并发症。
实例20
慢性鼻窦炎组织中的多配体聚糖-4表达升高
慢性鼻窦炎(CRS)是一种影响鼻窦的炎症病状。由炎症、过敏或肿胀引起的鼻窦堵塞可能导致此组织变得缺氧并使病状恶化(26)。发明人观察到在这些条件下眼组织中的多配体聚糖-4升高，因此正常的鼻窦和CRS人类组织切片被标记用于多配体聚糖-4表达。如图24所示，正常鼻窦组织示出中度多配体聚糖-4标记，其中腺体周围轻度隆起。CRS组织中的多配体聚糖-4标记示出腺体周围标记升高，并且广泛分布于整个组织。通过测量来自三个正常组织和三个CRS组织(n＝3)的成像区域的平均荧光强度来定量多配体聚糖-4表达。这表明CRS组织与正常的鼻窦组织相比具有升高的多配体聚糖-4表达。这表明眼外发炎或缺氧组织也有较高的多配体聚糖-4表达，从而证实所述组织是使用本发明的构建体进行药物递送的潜在靶标。
实例21
小鼠神经胶质瘤模型中的多配体聚糖-4表达
将来自神经胶质瘤(肿瘤)小鼠模型的切片标记用于多配体聚糖-4，用DAPI对GFAP细胞核进行染色(图25和图25A)。在图25中，小鼠脑组织由于大量活化的星形胶质细胞而表达升高量的GFAP，这表明此区域有炎症。脑组织遇到肿瘤的情况增加，并且可以清楚地看到肿瘤没有表达GFAP(图25)。这是因为肿瘤已经完全浸润了脑组织的这个区域，从而杀死了这个区域中的任何星形胶质细胞并且因此缺乏GFAP表达。不同组的细胞周围的GFAP由于脑组织中的肿瘤的扩展也升高。在多配体聚糖-4图中，这个不同组的细胞提高了多配体聚糖-4表达，这与在肿瘤和脑组织的交界面处以及在肿瘤主体内所看到的类似。这表明脑组织中的不同组的具有升高的多配体聚糖-4的细胞是肿瘤的扩展。这些细胞周围的GFAP升高表明浸润性肿瘤细胞正在损伤脑组织并引起炎症。肿瘤边缘处和肿瘤浸润部位处的升高的多配体聚糖-4表达使肿瘤成为摄取本发明的构建体的理想靶标。
在图25A中，我们可以看到，肿瘤半球血管与邻近半球相比示出升高的多配体聚糖-4和GFAP标记。邻近半球中的血管具有正常的沿着血管找到的拉长的细胞核，而肿瘤半球中的血管含有许多紧邻的细胞核，这表明血管增殖不受调节。这表明肿瘤半球中的血管形成不良。在肿瘤半球中，血管和周围组织示出GFAP和多配体聚糖-4标记升高，这表明此区域高度炎症。这也表明多配体聚糖-4存在于血脑屏障(BBB)中，特别是在损伤期间，并且因此本发明的构建体可以递送用于脑损伤的治疗剂，因为在这些部位处构建体将更容易被摄取。
实例22
缺氧A341肿瘤表达多配体聚糖-4
对小鼠侧腹中皮下生长的人A431肿瘤进行切片，并标记用于多配体聚糖-4，并用DAPI对细胞核进行染色。这种肿瘤模型产生缺氧肿瘤。如图26中所示，在整个肿瘤组织中可见多配体聚糖-4表达。不同细胞簇中出现的肿瘤的中心区域中存在多配体聚糖-4升高的区域。考虑到这是一个肿瘤缺氧模型，这些部位处的多配体聚糖-4表达可能指示肿瘤组织的缺氧区域。
实例23
缺氧SKOV3肿瘤表达多配体聚糖-4
对裸鼠侧腹皮下生长的用于形成异种移植物的人SKOV3肿瘤进行切片并标记用于多配体聚糖-4，并用DAPI对细胞核进行染色。SKOV3是一种常用于肿瘤药物研发模型的人卵巢癌细胞系。这种肿瘤模型产生缺氧肿瘤。如图27中所示，在整个肿瘤组织中可见低水平的多配体聚糖-4表达。肿瘤中存在多配体聚糖-4升高的区域，这些区域要么出现在不同的细胞簇中，要么出现在簇周围的区域中。鉴于已知这些肿瘤是缺氧的，这些部位处的多配体聚糖-4表达很可能指示这些肿瘤中存在升高的缺氧区域。
本发明参考某些优选实施例在此进行描述，以使读者能够在不过度实验的情况下实践本发明。然而，本领域的普通技术人员将很容易地认识到，在不偏离本发明的范围的情况下，许多组分和参数可以在一定程度上进行更改或修改或替代已知的等效物。应该理解的是，此些修改和等效物在此并入，就像单独列出一样。本发明还包含在本说明书中单独地或共同地提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物以及所述步骤或特征中的任何两个或两个以上的任何和所有组合。
此外，提供题目、标题等被以增强读者对本文档的理解，并且不应被视为限制了本发明的范围。
上文和下文中引用的所有申请、专利和公开的全部公开内容(如果有的话)通过引用并入本文中。
在本说明书中对任何现有技术的引用不是、并且不应当被当做是承认或任何形式的暗示，即承认或暗示所述现有技术形成了普遍公知常识的一部分。
除上下文另有要求，否则贯穿本说明书，词语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”等应被解释为包容性意义，而不是排他性意义，也就是说，在“包含但不限于”的意义上。
参考文献
1.年龄相关性黄斑变性治疗试验研究比较(Comparison of Age-relatedMacular Degeneration Treatments Trials Research)G,马奎尔MG(G,Maguire MG)、马丁DF(Martin DF)、应GS(Ying GS)、杰夫GJ(Jaffe GJ)、丹尼尔E(Daniel E)等人,抗血管内皮生长因子治疗新生血管年龄相关性黄斑变性五年结果：年龄相关性黄斑变性治疗试验比较(Five-Year Outcomes with Anti-Vascular Endothelial Growth Factor Treatment ofNeovascular Age-Related Macular Degeneration:The Comparison of Age-RelatedMacular Degeneration Treatments Trials),眼科学(Ophthalmology)2016年8月；123(8):1751-61。
2.年龄相关性黄斑变性治疗试验研究比较G,马丁DF(G,Martin DF)、马奎尔MG(Maguire MG)、法恩SL(Fine SL)、应GS、杰夫GJ等人,雷珠单抗和贝伐珠单抗治疗新生血管年龄相关性黄斑变性：两年结果(Ranibizumab and bevacizumab for treatment ofneovascular age-related macular degeneration:two-year results)眼科学2012年7月；119(7):1388-98。
3.海尔JS(Heier JS)、布朗DM(Brown DM)、庄V(Chong V)、科罗贝尔尼克JF(Korobelnik JF)、凯撒PK(Kaiser PK)、阮QD(Nguyen QD)等人,玻璃体内阿柏西普(VEGF眼科溶液)在湿性年龄相关性黄斑变性中的应用(Intravitreal aflibercept(VEGF trap-eye)in wet age-related macular degeneration)眼科学2012年12月；119(12):2537-48。
4.达什-迈耶HV(Danesh-Meyer HV)、张J(Zhang J)、阿科斯塔ML(Acosta ML)、罗森塔尔ID(Rupenthal ID)和格林CR(Green CR),连接蛋白43在视网膜损伤和疾病中的应用(Connexin43 in retinal injury and disease)视网膜与眼科研究进展(Prog Retin EyeRes.),2016；51:41-68。
5.张J、奥卡罗尔SJ(O'Carroll SJ)、亨纳尔K(Henare K)、程L-M(Ching L-M)、奥蒙德S(Ormonde S)、尼科尔森LFB(Nicholson LFB)、达什-迈耶HV(Danesh-Meyer HV)和格林CR,连接蛋白半通道诱导的血管渗漏表明了一种新的癌症治疗范式(Connexinhemichannel induced vascular leak suggests a new paradigm for cancer therapy)欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)2014；588:1365-1371。
6.阿布达拉,V(Abudara,V.)等人，连接蛋白43模拟肽Gap19抑制半通道而不改变星形胶质细胞中的间隙连接通信(The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibitshemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes)细胞神经科学的前沿(Front Cell Neurosci),2014.8:第306页。
7.邦萨尔茨,R.(Ponsaerts,R.)等人,分子内环/尾相互作用对于连接蛋白43-半通道活性是必需的(Intramolecular loop/tail interactions are essential forconnexin 43-hemichannel activity)美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J),2010.24(11):第4378-95页。
8.瓦迪亚,J.S.(Wadia,J.S.)、R.V.斯坦(R.V.Stan)和S.F.道迪(S.F.Dowdy),可转导TAT-HA融合肽增强脂筏巨胞饮后TAT-融合蛋白的逸出(Transducible TAT-HAfusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raftmacropinocytosis)自然医学(Nat Med),2004.10(3):第310-5页。
9.卡普兰,I.M.(Kaplan,I.M.)、J.S.瓦迪亚和S.F.道迪,阳离子TAT肽转导结构域通过巨胞饮作用进入细胞(Cationic TAT peptide transduction domain enters cellsby macropinocytosis)控制释放杂志(J Control Release),2005.102(1):第247-53页。
10.蒙特罗斯,K.(Montrose,K.)、Y.杨(Y.Yang)和G.W.克里斯桑森(G.W.Krissansen),载体肽Xentry的四肽核心是细胞穿透的：Xentry的新颖可活化形式(The tetrapeptide core of the carrier peptide Xentry is cell-penetrating:novel activatable forms of Xentry)科技报告(Sci Rep),2014.4:第4900页。
11.蒙特罗斯,K.等人,Xentry是一类新的独特地配备用于药物递送的细胞穿透肽(Xentry,a new class of cell-penetrating peptide uniquely equipped fordelivery of drugs)科技报告(Sci Rep),2013.3:第1661页。
12.格林,M.(Green,M.).和P.M.罗文斯登(P.M.Loewenstein),化学合成的人免疫缺陷病毒tat反式活化蛋白的自主功能结构域(Autonomous functional domains ofchemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activatorprotein)细胞学(Cell),1988.55(6):第1179-88页。
13.维卫斯,E.(Vives,E.)、P.布罗丁(P.Brodin)和B.勒布鲁(B.Lebleu),截短的HIV-1Tat蛋白碱基结构域迅速通过质膜转运并在细胞核内累积(A truncated HIV-1 Tatprotein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane andaccumulates in the cell nucleus)生物化学杂志(J Biol Chem),1997.272(25):第16010-7页。
14.斯托特,C.E.(Stout,C.E.)等人,星形胶质细胞中的细胞间钙信号传导通过连接蛋白半通道进行ATP释放(Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATPrelease through connexin hemichannels)生物化学杂志,2002.277(12):第10482-8页。
15.雷塔马尔,M.A.(Retamal,M.A.)等人,星形胶质细胞中的Cx43半通道和间隙连接通道相对地受由活化的小神经胶质细胞释放的促炎性细胞因子的调节(Cx43hemichannels and gap junction channels in astrocytes are regulatedoppositely by proinflammatory cytokines released from activated microglia)神经科学杂志(J Neurosci),2007.27(50):第13781-92页。
16.洛曼,A.W.(Lohman,A.W.)和B.E.艾萨克森(B.E.Isakson),区分细胞ATP释放中的连接蛋白半通道和泛连接蛋白通道(Differentiating connexin hemichannels andpannexin channels in cellular ATP release)欧洲生化学会联合会快报,2014.588(8):第1379-88页。
17.菲格罗亚,X.F.(Figueroa,X.F.)和B.R.杜林(B.R.Duling),受血管功能控制的间隙连接(Gap junctions in the control of vascular function)抗氧化剂与氧化还原信号(Antioxid Redox Signal),2009.11(2):第251-66页。
18.达什-迈耶,H.V.等人,连接蛋白43模拟肽在视网膜缺血后减少血管渗漏和视网膜神经节细胞死亡(Connexin43 mimetic peptide reduces vascular leak andretinal ganglion cell death following retinal ischaemia)大脑(Brain),2012.135(第2部分):第506-20页。
19.金姆,Y.(Kim,Y.)等人,表征细胞外连接蛋白43通道在体外缺血损伤模型中阻断模拟肽的作用模式(Characterizing the mode of action of extracellularConnexin43 channel blocking mimetic peptides in an in vitro ischemia injurymodel)生物嵌合和生物物理行为-生物膜(Biochim Biophys Acta),2017.1861(2):第68-78页。
20.米姆,W.(Meme,W.)等人,从小神经胶质细胞释放的促炎性细胞因子抑制星形胶质细胞的间隙连接：β-淀粉样蛋白的增强作用(Proinflammatory cytokines releasedfrom microglia inhibit gap junctions in astrocytes:potentiation by beta-amyloid)美国实验生物学学会联合会杂志,2006.20(3):第494-6页。
21.藤田昌久,N.(Fujita,N.)等人,多配体聚糖4在髓核细胞中的HIF-1-PHD2轴对照表达(HIF-1-PHD2 axis controls expression of syndecan 4in nucleus pulposuscells)美国实验生物学学会联合会杂志,2014.28(6):第2455-65页。
22.川口,Y.(Kawaguchi,Y.)等人,多配体聚糖-4是富精氨酸的细胞穿透肽的网格蛋白介导的内吞作用的受体(Syndecan-4 Is a Receptor for Clathrin-MediatedEndocytosis of Arginine-Rich Cell-Penetrating Peptides)生物共轭化学(BioconjugChem),2016.27(4):第1119-30页。
23.德罗西,D.(Derossi,D.)等人,触角足同源结构域的第三螺旋体易位穿过生物膜(The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates throughbiological membranes)生物化学杂志,1994.269(14):第10444-50页。
24.眼科学2012年7月；119(7):1388-98.doi:10.1016/j.ophtha.2012.03.053.电子版2012年5月1日雷珠单抗和贝伐珠单抗治疗新生血管年龄相关性黄斑变性：两年结果年龄相关性黄斑变性治疗试验(CATT)研究小组的比较,马丁DF、马奎尔MG、法恩SL、应GS、杰夫GJ、格伦瓦尔德JE(Grunwald JE)、托特C(Toth C)、雷德福德M(Redford M)、费里斯FL(Ferris FL),第3版。
25.弗朗西斯·W·亨特(Francis W Hunter)、布拉德利·G·沃特斯(Bradly GWouters)和威廉·R·威尔逊(William R Wilson),缺氧活化前药：个性化医学时代的前进之路(Hypoxia-activated prodrugs:paths forward in the era of personalisedmedicine)英国癌症杂志(British Journal of Cancer)(2016)114,1071-1077。
26.马斯图恩S(Mastune S)等人,伴有或不伴有鼻过敏并发症的慢性鼻旁窦鼻窦炎缺氧(Hypoxia in paranasal sinuses of pateitns with chronic sinusitis withor without the complication of nasal allergy)耳鼻喉科学报(Acta Otolaryngol.)2013年5月；123(4):519-23。
27.乔治·W·布朗(George W Browne)和CS马库蒙(CS Pitumoni),急性胰腺炎肺并发症的病理生理学(Pathophysiology of pulmonary complications of acutepancreatitis)世界胃肠病学杂志(World J Gastroenterol.)2006年11月28日；12(44):7087-7096
28.金万永(Won-Young Kim)和洪布桑(Sang-Bum Hong),败血症和急性呼吸窘迫综合征：近期更新(Sepsis and Acute Respiratory Distress Syndrome:Recent Update)结核和呼吸疾病杂志(首尔)(Tuberc Respir Dis(Seoul))2016年4月；79(2):53–57。
29.威尔莱布罗兹J(Willebrords J)、克雷斯波·亚古拉斯S(Crespo YanguasS)、梅斯M(Maes M)、德洛克E(Decrock E)、王N(Wang N)、莱巴尔特L(Leybaert L)、夸克BR(Kwak BR)、格林CR、科利亚蒂B(Cogliati B)、温肯M(Vinken M),连接蛋白和其在炎症中的通道(Connexins and their channels in inflammation)生物化学与分子生物学重要评论(Crit Rev Biochem Mol Biol.)2016 7:1-27。
30.金姆Y(Kim Y)、戴维森JO(Davidson JO)、冈恩KC(Gunn KC)、菲利普斯AR(Phillips AR)、格林CR和冈恩AJ(Gunn AJ),半通道在CNS炎症和炎症小体通路中的作用(Role of hemichannels in CNS inflammation and the inflammasome pathway)蛋白质化学与结构生物学进展(Adv Protein Chem Struct Biol.)2016；104:1-37。
31.图内曼G(Tünnemann G)、卡多索MC(Cardoso MC)、卡桑霍M.(Castanho M.),细胞穿透肽-摄取、毒性和应用(Cell-Penetrating Peptides—Uptake,Toxicity,andApplications)膜活性肽：结构和功能的方法与结果(Membrane Active Peptides:Methodsand Results on Structure and Function.)2009；9。
32.黄迪(Di Huang)、陈英山(Ying-Shan Chen)、科林·R·格林(ColinR.Green)、伊尔瓦·D·鲁彭塔尔(Ilva D.Rupenthal),透明质酸包被白蛋白纳米颗粒用于靶向肽在视网膜缺血治疗中的递送(Hyaluronic acid coated albumin nanoparticlesfor targeted peptide delivery in the treatment of retinal ischaemia)生物材料(Biomaterials)2018.168:10-23。
33.H.古(H.Koo)、H.莫恩(H.Moon)、H.韩(H.Han)、J.H.娜(J.H.Na)、M.S.胡(M.S.Huh)、J.H.帕克(J.H.Park)、S.J.吴(S.J.Woo)、K.H.帕克(K.H.Park)、I.C.权(I.C.Kwon)、K.金姆(K.Kim)、H.金姆(H.Kim),玻璃体内注射后自组装的两亲性聚合物纳米颗粒在玻璃体和视网膜上的运动(The movement of self-assembled amphiphilicpolymeric nanoparticles in the vitreous and retina after intravitrealinjection)生物材料2012.33(12):3485-93。
34.龚Y(Gong Y)、李J(Li J)、孙Y(Sun Y)、傅Z(Fu Z)、刘C-H(Liu C-H)和伊万斯L(Evans L)等人,(2015),图像引导激光诱导的脉络膜新生血管模型在小鼠中的优化(Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal NeovascularizationModel in Mice)公共科学图书馆综合(PLoS ONE)10(7):e0132643.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0132643。
35.苏莱曼(Sulaiman)等人,一种简单的脉络膜新生血管光学相干层析定量方法(A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for ChoroidalNeovascularization)眼科药物疗法杂志(J Ocul Pharmacol Ther.)2015年10月1日；31(8):447-454。
36.兰伯特V(Lambert V)等人,用于研究小鼠年龄相关性黄斑变性的激光诱导的脉络膜新生血管模型(Laser-induced choroidal neovascularization model to studyage-related macular degeneration in mice)自然实验手册(Nature Protocols),第8卷,第2197-2211页(2013)。
37.沙赫RS(Shah RS)等人,激光诱导的脉络膜新生血管的小鼠模型(A MouseModel for Laser-induced Choroidal Neovascularization)可视实验杂志(J Vis Exp.)2015；(106):53502。
38.贾尼科洛A(Giani A)等人,使用谱域光学相干断层扫描在体内评估激光诱导的脉络膜新生血管(In Vivo Evaluation of Laser-Induced ChoroidalNeovascularization Using Spectral-Domain Optical Coherence Tomography)眼科学研究和视觉科学(Investigative Ophthalmology&Visual Science)2011年5月,第52卷,3880-3887.doi:10.1167/iovs.10-6266。
序列表
<110> 奥克兰联合服务有限公司(Auckland UniServices Limited)
<120> 治疗方法和新颖构建体
<130> 512647PCTPR
<150> NZ 731353
<151> 2017-04-28
<150> NZ 731364
<151> 2017-04-28
<160> 81
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 1
Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Gly Lys Gln Ile Glu Ile Lys Lys Phe
1 5 10 15
Lys
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 2
Leu Cys Leu Arg Pro Val
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Lys Gln Ile Glu Ile Lys Lys Phe Lys
1 5
<210> 4
<211> 3
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 4
Leu Cys Leu
1
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 5
Leu Cys Leu Arg Pro
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 6
Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 7
Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu
1 5
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 8
Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 9
Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Val
1 5 10 15
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 10
Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Val Ser
1 5 10 15
Gly Pro Phe Gly
20
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 11
Leu Cys Leu Xaa
1
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 12
Xaa Leu Cys Leu
1
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 13
Xaa Leu Cys Leu Xaa
1 5
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 14
Leu Cys Leu Lys
1
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 15
Leu Cys Leu His
1
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 16
Leu Cys Leu Arg
1
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 17
Leu Cys Leu Glu
1
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 18
Leu Cys Leu Asn
1
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 19
Leu Cys Leu Gln
1
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 20
Val Leu Cys Leu Arg
1 5
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 21
Leu Cys Leu Asp
1
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 22
Xaa Cys Xaa Arg
1
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 23
Ile Cys Ile Arg
1
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 24
Val Cys Val Arg
1
<210> 25
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 25
Met Ala Ala Arg Val Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Val Ser Gly
20 25 30
Pro Phe Gly
35
<210> 26
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 26
Met Ala Ala Arg Met Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Val Ser Gly
20 25 30
Pro Phe Gly
35
<210> 27
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 27
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Pro Phe Gly
35
<210> 28
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 28
Met Ala Ala Arg Val Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Val Ser Arg
20 25 30
Pro Phe Gly
35
<210> 29
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 29
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 30
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 30
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 31
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 31
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Thr Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Val Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 32
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 32
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 33
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 33
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 34
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 34
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ser Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 35
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 35
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Val Ser Gly
20 25 30
Ser Leu Gly
35
<210> 36
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 36
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 37
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 37
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 38
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 38
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 39
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 39
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 40
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 40
Met Ala Thr Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ser Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 41
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 41
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 42
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 42
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Ser Leu Gly
35
<210> 43
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 43
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Phe Pro Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 44
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 44
Met Ala Ala Arg Met Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 45
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 45
Met Ala Ala Arg Val Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 46
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 46
Met Ala Ala Arg Leu Tyr Cys Gln Leu Asp Pro Ser Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 47
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 47
Met Ala Ala Arg Leu Tyr Cys Gln Leu Asp Pro Ser Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 48
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 48
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ser Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Ser Ala Glu Ser Ser Gly Arg Pro Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Phe Gly
35
<210> 49
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 49
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Thr Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 50
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 50
Met Ala Ala Arg Met Cys Cys Lys Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Ile Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 51
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 51
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Cys Gly Arg Pro Val Ser Gly
20 25 30
Ser Leu Gly
35
<210> 52
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 52
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Ser Leu Ser Gly
20 25 30
Ser Leu Gly
35
<210> 53
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 53
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Thr Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Ser Val Gly
35
<210> 54
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 54
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Ser Ala Glu Ser Cys Gly Arg Pro Val Ser Gly
20 25 30
Ser Leu Gly
35
<210> 55
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 55
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Ser Ala Glu Ser Cys Gly Arg Pro Val Ser Gly
20 25 30
Ser Leu Gly
35
<210> 56
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 56
Met Ala Ala Arg Leu Tyr Cys Gln Leu Asp Ser Ser Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 57
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 57
Met Ala Ala Arg Leu Tyr Cys Gln Leu Asp Ser Ser Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Ala Gly
20 25 30
Pro Leu Gly
35
<210> 58
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 58
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Cys Gly Arg Pro Leu Ser Trp
20 25 30
Ser Leu Gly
35
<210> 59
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 59
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Ser Ala Glu Ser Cys Gly Arg Ser Val Ser Gly
20 25 30
Ser Leu Gly
35
<210> 60
<211> 34
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 60
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Thr Ser Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Cys Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Pro Leu
<210> 61
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 61
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Ser Gly Arg Thr Leu Pro Gly
20 25 30
Ser Leu Gly
35
<210> 62
<211> 31
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 62
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Cys Gly Arg Pro Leu Ser
20 25 30
<210> 63
<211> 31
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 63
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Cys Gly Arg Pro Leu Ser
20 25 30
<210> 64
<211> 29
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 64
Met Ala Ala Arg Met Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ser Gln Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro
20 25
<210> 65
<211> 32
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 65
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Pro Cys Arg Arg Pro Val Ser Gly
20 25 30
<210> 66
<211> 35
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<400> 66
Met Ala Ala Arg Leu Tyr Cys Gln Leu Asp Ser Ser Arg Asn Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Cys Gly Arg Pro Leu Ser Gly
20 25 30
Pro Val Gly
35
<210> 67
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Asp Gly Val Asn Val Glu Met His Leu Lys Gln Ile Glu Ile Lys Lys
1 5 10 15
Phe Lys Tyr Gly Ile Glu Glu His Gly Lys
20 25
<210> 68
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Asp Gly Ala Asn Val Asp Met His Leu Lys Gln Ile Glu Ile Lys Lys
1 5 10 15
Phe Lys Tyr Gly Ile Glu Glu His Gly Lys
20 25
<210> 69
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Arg Pro Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Ser Arg Pro Arg Pro
1 5 10 15
Asp Asp Leu Glu Ile
20
<210> 70
<211> 25
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 70
Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys
1 5 10 15
Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
20 25
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 71
Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
1 5
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Ser Arg Pro Arg Pro Asp Asp Leu Glu Ile
1 5 10
<210> 73
<211> 15
<212> DNA
<213> B型肝炎病毒
<400> 73
ctttgtctac gtccc 15
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> B型肝炎病毒
<400> 74
ctttgtctac gtcccgtcgg c 21
<210> 75
<211> 27
<212> DNA
<213> B型肝炎病毒
<400> 75
ctttgtctac gtcccgtcgg cgctgaa 27
<210> 76
<211> 33
<212> DNA
<213> B型肝炎病毒
<400> 76
ctttgtctac gtcccgtcgg cgctgaatcc cgc 33
<210> 77
<211> 60
<212> DNA
<213> B型肝炎病毒
<400> 77
ctttgtctac gtcccgtcgg cgctgaatcc cgcggacgac ccgtctcggg gccgtttggg 60
<210> 78
<211> 15
<212> DNA
<213> B型肝炎病毒
<400> 78
gtcctttgtc tacgt 15
<210> 79
<211> 12
<212> DNA
<213> B型肝炎病毒
<400> 79
ctttgtctac gt 12
<210> 80
<211> 20
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 80
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Gln Ile Glu Ile
1 5 10 15
Lys Lys Phe Lys
20
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Val Asp Cys Phe Leu Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr
1 5 10

Claims (34)

1.一种将化合物靶向递送到受试者中的缺氧细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用构建体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述化合物。
2.一种将化合物靶向递送到缺氧细胞的方法，所述方法包括使构建体与缺氧细胞群接触，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述化合物。
3.一种将化合物靶向递送到缺氧和非缺氧细胞混合群中的缺氧细胞的方法，所述方法包括使构建体与细胞混合群或包括细胞混合群的组合物接触，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)所述化合物。
4.一种治疗与缺氧相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用构建体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)用于治疗所述疾病或病症的治疗剂。
5.一种治疗眼部疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用构建体，所述构建体包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述靶向载体肽包括氨基酸序列LCL(SEQ ID NO:4)。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述靶向载体肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
LCLRP(SEQ ID NO:5)；
LCLRPV(SEQ ID NO:2)；
LCLRPVG(SEQ ID NO:6)；
LCLRPVGAE(SEQ ID NO:7)；
LCLRPVGAESR(SEQ ID NO:8)；
LCLRPVGAESRGRPV(SEQ ID NO:9)；
LCLRPVGAESRGRPVSGPFG(SEQ ID NO:10)；
以及其功能等效变体。
8.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述靶向载体肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：
LCL(SEQ ID NO:4)；
LCLRP(SEQ ID NO:5)；
LCLRPV(SEQ ID NO:2)；
LCLRPVG(SEQ ID NO:6)；
LCLRPVGAE(SEQ ID NO:7)；
LCLRPVGAESR(SEQ ID NO:8)；
LCLRPVGAESRGRPV(SEQ ID NO:9)；
LCLRPVGAESRGRPVSGPFG(SEQ ID NO:10)；
以及其功能等效变体。
9.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述靶向载体肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：
LCLX(SEQ ID NO:11)；
XLCL(SEQ ID NO:12)；
XLCLX(SEQ ID NO:13)；
LCLK(SEQ ID NO:14)；
LCLH(SEQ ID NO:15)；
LCLR(SEQ ID NO:16)；
LCLE(SEQ ID NO:17)；
LCLN(SEQ ID NO:18)；
LCLQ(SEQ ID NO:19)；
VLCLR(SEQ ID NO:20)；或
LCLD(SEQ ID NO:21)；
其中X为任何氨基酸。
10.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述靶向载体肽包括选自由以下组成的组的氨基酸：
XCXR(SEQ ID NO:22)；
ICIR(SEQ ID NO:23)；或
VCVR(SEQ ID NO:24)，
其中X为任何疏水性氨基酸。
11.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述靶向载体肽由氨基酸组成，所述氨基酸选自由以下组成的组：
XCXR(SEQ ID NO:22)；
ICIR(SEQ ID NO:23)；或
VCVR(SEQ ID NO:24)，
其中X为任何疏水性氨基酸。
12.根据权利要求1到4或6到11中任一权利要求所述的方法，其中所述化合物或治疗剂是能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
13.根据权利要求5或权利要求12所述的方法，其中所述能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽能够抑制Cx43的细胞内C端尾与Cx43的细胞内环相互作用。
14.根据权利要求5、12或13中任一权利要求所述的方法，其中所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽能够优选地在不阻断间隙连接的情况下抑制Cx43半通道开放。
15.根据权利要求5或12到14中任一权利要求所述的方法，其中所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
KQIEIKKFK(SEQ ID NO:3)；
DGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:67)；
DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:68)；
RPSSRASSRASSRPRPDDLEI(SEQ ID NO:69)；
RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI(SEQ ID NO:70)；
RPRPDDLEI(SEQ ID NO:71)；
SRPRPDDLEI(SEQ ID NO:72)；
以及其功能等效变体。
16.根据权利要求5或12到14中任一权利要求所述的方法，其中所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：
KQIEIKKFK(SEQ ID NO:3)；
DGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:67)；
DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:68)；
RPSSRASSRASSRPRPDDLEI(SEQ ID NO:69)；
RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI(SEQ ID NO:70)；
RPRPDDLEI(SEQ ID NO:71)；
SRPRPDDLEI(SEQ ID NO:72)；
以及其功能等效变体。
17.根据权利要求4或6到16中任一权利要求所述的方法，其中所述与缺氧相关的疾病或病症为癌症。
18.根据权利要求4或6到16中任一权利要求所述的方法，其中所述与缺氧相关的疾病或病症为中风。
19.根据权利要求4或6到16中任一权利要求所述的方法，其中所述疾病或病症为心血管疾病。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述心血管疾病选自由以下组成的组：心脏缺血、心包炎、心肌梗塞和缺血性瓣膜疾病。
21.根据权利要求3到16中任一权利要求所述的方法，其中所述眼部疾病或病症选自由以下组成的组：AMD(包含湿性和/或干性AMD)、糖尿病性视网膜病变、青光眼、视网膜静脉和/或分支闭塞、视网膜动脉闭塞、视网膜中风、黄斑水肿、葡萄膜炎、睑缘炎、重度干眼综合征、糖尿病性周围神经病变和视神经炎。
22.一种构建体，其包括(a)源自乙型肝炎病毒的X蛋白的靶向载体肽和(b)能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽。
23.根据权利要求22所述的构建体，其中所述靶向载体肽包括氨基酸序列LCL(SEQIDNO:4)。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的构建体，其中所述靶向载体肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
LCLRP(SEQ ID NO:5)；
LCLRPV(SEQ ID NO:2)；
LCLRPVG(SEQ ID NO:6)；
LCLRPVGAE(SEQ ID NO:7)；
LCLRPVGAESR(SEQ ID NO:8)；
LCLRPVGAESRGRPV(SEQ ID NO:9)；
LCLRPVGAESRGRPVSGPFG(SEQ ID NO:10)；
以及其功能等效变体。
25.根据权利要求22或权利要求23所述的构建体，其中所述靶向载体肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：
LCL(SEQ ID NO:4)；
LCLRP(SEQ ID NO:5)；
LCLRPV(SEQ ID NO:2)；
LCLRPVG(SEQ ID NO:6)；
LCLRPVGAE(SEQ ID NO:7)；
LCLRPVGAESR(SEQ ID NO:8)；
LCLRPVGAESRGRPV(SEQ ID NO:9)；
LCLRPVGAESRGRPVSGPFG(SEQ ID NO:10)；
以及其功能等效变体。
26.根据权利要求22或权利要求23所述的构建体，其中所述靶向载体肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：
LCLX(SEQ ID NO:11)；
XLCL(SEQ ID NO:12)；
XLCLX(SEQ ID NO:13)；
LCLK(SEQ ID NO:14)；
LCLH(SEQ ID NO:15)；
LCLR(SEQ ID NO:16)；
LCLE(SEQ ID NO:17)；
LCLN(SEQ ID NO:18)；
LCLQ(SEQ ID NO:19)；
VLCLR(SEQ ID NO:20)；或
LCLD(SEQ ID NO:21)；
其中X为任何氨基酸。
27.根据权利要求22所述的构建体，其中所述靶向载体肽包括选自由以下组成的组的氨基酸：
XCXR(SEQ ID NO:22)；
ICIR(SEQ ID NO:23)；或
VCVR(SEQ ID NO:24)，
其中X为任何疏水性氨基酸。
28.根据权利要求23所述的构建体，其中所述靶向载体肽由氨基酸组成，所述氨基酸选自由以下组成的组：
XCXR(SEQ ID NO:22)；
ICIR(SEQ ID NO:23)；或
VCVR(SEQ ID NO:24)，
其中X为任何疏水性氨基酸。
29.根据权利要求22到28中任一权利要求所述的构建体，其中所述能够与连接蛋白43(Cx43)的细胞内结构域相互作用的肽能够抑制Cx43的细胞内C端尾与Cx43的细胞内环相互作用。
30.根据权利要求22到29中任一权利要求所述的构建体，其中所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽能够优选地在不阻断间隙连接的情况下抑制Cx43半通道开放。
31.根据权利要求22到30中任一权利要求所述的构建体，其中所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
KQIEIKKFK(SEQ ID NO:3)；
DGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:67)；
DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:68)；
RPSSRASSRASSRPRPDDLEI(SEQ ID NO:69)；
RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI(SEQ ID NO:70)；
RPRPDDLEI(SEQ ID NO:71)；
SRPRPDDLEI(SEQ ID NO:72)；
以及其功能等效变体。
32.根据权利要求22到31中任一权利要求所述的构建体，其中所述能够与Cx43的细胞内结构域相互作用的肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：
KQIEIKKFK(SEQ ID NO:3)；
DGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:67)；
DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK(SEQ ID NO:68)；
RPSSRASSRASSRPRPDDLEI(SEQ ID NO:69)；
RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI(SEQ ID NO:70)；
RPRPDDLEI(SEQ ID NO:71)；
SRPRPDDLEI(SEQ ID NO:72)；
以及其功能等效变体。
33.一种核酸，其对根据权利要求22到32中任一权利要求所述的构建体进行编码。
34.一种核酸载体，其包括对根据权利要求22到32中任一权利要求所述的构建体进行编码的核酸。
CN201880042800.6A 2017-04-28 2018-04-30 治疗方法和新颖构建体 Pending CN111201247A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NZ731364 2017-04-28
NZ731353 2017-04-28
NZ73135317 2017-04-28
NZ73136417 2017-04-28
PCT/NZ2018/050059 WO2018199777A1 (en) 2017-04-28 2018-04-30 Methods of treatment and novel constructs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111201247A true CN111201247A (zh) 2020-05-26

Family

ID=63918624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880042800.6A Pending CN111201247A (zh) 2017-04-28 2018-04-30 治疗方法和新颖构建体

Country Status (6)

Country Link
US (2) US11466069B2 (zh)
EP (1) EP3615575A4 (zh)
JP (2) JP7495230B2 (zh)
CN (1) CN111201247A (zh)
CA (1) CA3061738A1 (zh)
WO (1) WO2018199777A1 (zh)

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
CA1322714C (en) 1986-11-14 1993-10-05 Harry N. Antoniades Wound healing and bone regeneration
JPH0539594Y2 (zh) 1988-08-05 1993-10-07
WO1991009958A2 (en) 1989-12-21 1991-07-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Method of delivering molecules into eukaryotic cells
US5166195A (en) 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
GB2273932A (en) 1992-11-24 1994-07-06 Stiefel Laboratories Stable oligonucleotides
US20030148968A1 (en) 1995-02-28 2003-08-07 Hammond H. Kirk Techniques and compositions for treating cardiovascular disease by in vivo gene delivery
US6752987B1 (en) 1995-02-28 2004-06-22 The Regents Of The University Of California Adenovirus encoding human adenylylcyclase (AC) VI
CA2273203A1 (en) 1996-12-02 1998-06-11 Dyad Pharmaceutical Corporation Antisense inhibition of human adhesion molecules
AU9016898A (en) 1997-08-07 1999-03-01 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Methods and compositions for treatment of restenosis
JP4404479B2 (ja) 1997-12-09 2010-01-27 チルドレンズ・メディカル・センター・コーポレイション 血管内皮増殖因子の可溶性インヒビターおよびその使用
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
HUP0204199A3 (en) 1998-11-13 2005-09-28 Cyclacel Ltd Transport vectors
WO2000044409A1 (en) 1999-01-27 2000-08-03 University College London Formulations comprising antisense nucleotides to connexins
US5998148A (en) 1999-04-08 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression
US6593292B1 (en) 1999-08-24 2003-07-15 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
US20060105013A1 (en) 2000-10-18 2006-05-18 Samy Ashkar Osteopontin-coated surfaces and methods of use
US20050119211A1 (en) 2001-05-18 2005-06-02 Sirna Therapeutics, Inc. RNA mediated inhibition connexin gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
JP2005509621A (ja) 2001-10-17 2005-04-14 ユニバーシティ オブ ウェールズ カレッジ オブ メディスン ギャップ結合ならびにｅｄｈｆ
KR100468316B1 (ko) 2002-01-29 2005-01-27 주식회사 웰진 Ｄｎａ의 세포 또는 조직 내 전달 효율을 높이는 펩타이드
CN1638790A (zh) 2002-01-29 2005-07-13 Wyeth公司 用于调节连接蛋白半通道的组合物和方法
JP2003238441A (ja) 2002-02-08 2003-08-27 英行 ▲高▼野 血管新生抑制剤
WO2003096981A2 (en) 2002-05-15 2003-11-27 Seul, Kyung, Hwan Method of modulating angiogenesis
AU2003265866A1 (en) 2002-09-03 2004-03-29 Vit Lauermann Targeted release
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
EP1514929A1 (en) 2003-09-12 2005-03-16 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Antisense oligonucleotides for prevention of metastasis formation of cancer cells
EA015670B9 (ru) 2003-12-03 2012-01-30 Коуда Терапьютикс (Нз) Лтд. Антисмысловые соединения, нацеленные на коннексины, и способы их применения
DE102004027422A1 (de) 2004-06-04 2005-12-29 Boehringer Ingelheim Microparts Gmbh Vorrichtung zur Aufnahme von Blut und Abtrennung von Blutbestandteilen
EP1827480B1 (en) 2004-12-21 2016-11-09 MUSC Foundation For Research Development Compositions and methods for promoting wound healing and tissue regeneration
US9248141B2 (en) 2005-02-03 2016-02-02 Coda Therapeutics, Inc. Methods of treatment by administering anti-connexin proteins and mimetics
MX2008007491A (es) 2005-12-16 2008-12-12 Arla Foods Amba Formulaciones de osteopontin bovino para la mejora del proceso de sanacion de heridas.
KR20100027091A (ko) 2006-11-15 2010-03-10 코다 테라퓨틱스, 인크. 상처 치유를 위한 개선 방법 및 조성물
DK2101791T3 (en) 2006-12-11 2015-01-05 Coda Therapeutics Inc ANTICONNEXIN POLYNUCLEOTIDES AS COMPOSITIONS AGAINST DEGRADED HEALTH
EP2114422A1 (en) 2007-03-02 2009-11-11 National University of Ireland, Galway Osteopontin for the prediction and treatment of cardiovascular diseases
CN103961315A (zh) 2007-05-31 2014-08-06 安特里奥公司 核酸纳米粒子和其用途
WO2009075881A2 (en) 2007-12-11 2009-06-18 Coda Therapeutics, Inc. Impaired wound healing compositions and treatments
US20100279921A1 (en) 2007-12-11 2010-11-04 Coda Therapeutics, Inc. Impaired wound healing compositions and treatments
US20110245184A1 (en) 2007-12-21 2011-10-06 Bradford James Duft Treatment of surgical adhesions
WO2009085277A2 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Treatment of abnormal or excessive scars
WO2009085269A2 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Use of anti-connexin polynucleotides, peptides or antibodies for the treatment of orthopedic conditions
CA2710386A1 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Improved medical devices
CA2710380A1 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Use of anti-connexin 43 poly nucleotide for the treatment of fibrotic conditions
AU2008343754A1 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Coda Therapeutics, Inc. Use of anti-connexin polynucleotides for the treatment of surgical adhesions
JP2011507861A (ja) 2007-12-21 2011-03-10 コーダ セラピューティクス， インコーポレイテッド 線維症性の状態の治療のための抗コネキシンポリヌクレオチド剤と組み合わせた抗コネキシンポリペプチド剤の使用
US20110243964A1 (en) 2007-12-21 2011-10-06 Bradford James Duft Treatment of orthopedic conditions
EP2252320A2 (en) 2007-12-21 2010-11-24 Coda Therapeutics, Inc. Use of anti-connexin polynucleotides and peptides for the treatment of abnormal or excessive scars
US20110038920A1 (en) 2008-01-07 2011-02-17 Ryoichi Mori Wound healing compositions and treatments
AU2009255619A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Coda Therapeutics, Inc. Treatment of pain with gap junction modulation compounds
NZ586074A (en) 2010-06-10 2013-07-26 Auckland Uniservices Ltd LCLRP peptides, constructs and uses thereof
WO2013165262A1 (en) 2012-04-30 2013-11-07 Auckland Uniservices Limited Peptides, constructs and uses therefor
EA201790434A1 (ru) 2014-08-22 2017-07-31 Окленд Юнисервисиз Лимитед Модуляторы каналов

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRISTOPHER MONTROSE ET AL: "The tetrapeptide core of the carrier peptide Xentry is cell-penetrating: novel activatable forms of Xentry", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
KRISTOPHER MONTROSE ET AL: "Xentry, a new class of cell-penetrating Peptide uniquely equipped for delivery of drugs", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
RAF PONSAERTS ET AL: "Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity", 《THE FASEB JOURNAL》 *
TETSUHITO KOJIMA ET AL: "Plasma Levels of Syndecan-4 (Ryudocan) Are Elevated in Patients with Acute Myocardial Infarction", 《THROMB HAEMOST》 *
VERÓNICA ABUDARA ET AL: "The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes", 《FRONTIERS IN CELLULAR NEUROSCIENCE》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018199777A1 (en) 2018-11-01
JP2024059834A (ja) 2024-05-01
US20210107963A1 (en) 2021-04-15
US20230123615A1 (en) 2023-04-20
EP3615575A1 (en) 2020-03-04
JP7495230B2 (ja) 2024-06-04
JP2020517714A (ja) 2020-06-18
US11466069B2 (en) 2022-10-11
EP3615575A4 (en) 2021-01-13
CA3061738A1 (en) 2018-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2011244107B2 (en) Peptide derivatives, preparation thereof and uses thereof as vectors
Wang et al. Cell‐penetrating peptide TAT‐mediated delivery of acidic FGF to retina and protection against ischemia–reperfusion injury in rats
ES2525649T3 (es) Derivados peptídicos y su uso como vectores de moléculas en forma de conjugados
CN107106651B (zh) 用于治疗眼病的肽和包含所述肽的用于治疗眼病的组合物
ES2644016T3 (es) Péptidos para su uso en el tratamiento tópico de enfermedades neurodegenerativas retinianas, en particular en estadios tempranos de retinopatía diabética y otras enfermedades retinianas en las que la neurodegeneración desempeña un papel esencial
EP3278810A1 (en) Pharmaceutical composition for preventing and treating eye diseases, containing, as active ingredient, fusion protein in which tissue-penetrating peptide and anti-vascular endothelial growth factor preparation are fused
Sheibani et al. Novel anti-angiogenic PEDF-derived small peptides mitigate choroidal neovascularization
Yi et al. Sequentially targeting cancer‐associated fibroblast and mitochondria alleviates tumor hypoxia and inhibits cancer metastasis by preventing “soil” formation and “seed” dissemination
EP3672641B1 (en) Composition comprising vegf antagonists and a cationic peptide and uses thereof
CN107629114B (zh) 多肽、其衍生物及其在制备抗肺纤维化的药物中的应用
AU2017433643B2 (en) Peptide composition for treating excitatory neurotoxicity related injuries
US20190002517A1 (en) Neuropeptide y-derived peptides
KR20170122762A (ko) 혈관신생 억제용 펩타이드
JP6989864B2 (ja) ギャップ結合細胞間コミュニケーションモジュレータ及び糖尿病性眼疾患の治療のためのそれらの使用
JP7269649B2 (ja) Ｋｉｆ１３ｂ由来ペプチドおよび血管新生阻害方法
US20230123615A1 (en) Methods of treatment and novel constructs
US20220257711A1 (en) PEPTOID-PEPTIDE HYBRID, NMEG-aCGRP, AND ITS USE IN CARDIOVASCULAR DISEASES
KR20200107842A (ko) 트레일 트라이머와 암표적 펩타이드를 멀티디스플레이하는 페리틴 나노케이지 및 이의 항암제로서의 용도
AU2022412618A1 (en) Composition for treating macular degeneration comprising novel peptide
KR20230005314A (ko) 수포성 표피박리증의 치료에 사용하기 위한 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40030406

Country of ref document: HK