JP2005509621A - ギャップ結合ならびにedhf - Google Patents
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Abstract
本発明はギャップ結合の透過性に関するものであり、詳細にはこの透過性を調節する物質に関するものである。本発明では、ギャップ結合を介した流れを促進するうえでのcAMP及び/またはcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤の使用ならびにギャップ結合を介した流れを減衰する各種の合成ペプチドについて開示する。
Description
本発明は、内皮由来過分極因子(EDHF)の調節に対して応答性を有する、ヒトなどの動物における疾患や障害の治療における、環状アデノシン一リン酸(cAMP)、またはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはcAMPホスホジエステラーゼ(PDE)阻害剤またはこれらの薬学的に許容される誘導体及び塩の用途、ならびにこれらのcAMP、アデニル酸シクラーゼ活性化剤やcAMP PDE阻害剤を含む医薬製剤に関するものである。本発明は更に、細胞間のギャップ結合を介した連絡を阻害もしくは低減する合成ペプチド、及び医薬組成物の製造におけるその用途に関するものである。本発明は更に、特定の治療物質の適用部位から細胞内への移送を補助、促進すべく当該物質とcAMP、アデニル酸シクラーゼ活性化剤またはcAMP PDE阻害剤とを組み合わせて使用することに関するものである。本発明は更に、治療物質を細胞膜透過性とするように設計された部分に治療物質が結合した医薬組成物であって、当該部分が治療物質から切断されることによって治療物質が1以上の細胞間ギャップ結合を介して組織中に移動可能となる医薬組成物に関するものである。
動脈が狭窄または機能不全となると主要臓器への酸素や栄養の供給が低下する場合があり、最もよく知られている例として心臓では狭心症や心筋梗塞の原因となり、脳では脳卒中を引き起こす。正常な生理の完全な理解によってのみ新たな治療法の開発が可能となることから、血管障害の予防には動脈を調節する機構の解明が不可欠である。
動脈は筋肉の管を内皮細胞の単層が内張りした構造となっている。この筋層は他の筋肉と同様、収縮及び弛緩が可能である。重要な点として、筋弛緩を促進して血流を増大させる強力な物質が内皮で合成されていることが明らかとなった。こうした物質の1つに一酸化窒素ガスがあり、これは内皮によって放出された後、血管壁内に自由拡散する。この機構には近年多大な関心が寄せられている。血管壁の筋細胞を弛緩させる別の経路として、細胞膜の電位の変化をともなうものがある。この変化はいわゆる内皮由来過分極因子(EDHF)によって引き起こされるという仮説が立てられている。実際、EDHF型の応答は小血管において著明であり、これら2つの経路は補完的に作用し合っている(4,17)ことからNO活性が抑制された障害においては特に重要な役割を担っている可能性がある。
一酸化窒素と大きく異なる点として、本発明者等の研究によれば、EDHFは細胞外空間ではなく、ギャップ結合を介した細胞同士の直接的な連絡によって内皮から筋肉へと優先的に移送される可能性が示唆された。ギャップ結合は、細胞膜を貫通して連結細胞同士を繋留するとともに電流や小さなシグナル分子が通過可能な小孔を細胞間に形成するコネクシン(Cx)タンパク質からなる膜構造である。内皮及び動脈筋細胞には、コネクシンの3つの主要なサブタイプ(分子量に基づきCx37,40及び43に分類される)が存在し、最大で数百個の個々のギャップ結合のクラスターが細胞の接点にプラーク状に分布している。本発明者等はコネクシンの特定のサブタイプをターゲットとする各種の合成ペプチドを開発し(33)、これらのペプチドが従来EDHFによるものとされていた筋弛緩応答を阻害することを示した。内皮細胞と筋細胞を連結するギャップ結合を通過する信号が電気的であるか化学的な性質のものであるかは未だ解明されていない。しかしながら本発明者等の研究は、EDHF応答には環状AMPとして知られる化学シグナルメッセンジャーの筋細胞内での生成がともなうことを示唆している(27)。これは、環状GMPと呼ばれる同様の化学メッセンジャーの合成を引き起こす一酸化窒素の作用とよく対応している。
本発明者等はウサギ腸骨動脈でアセチルコリン(ACh)及びCa2+イオノフォアA23187によって引き起こされるEDHF型筋弛緩に寄与する機構の比較を行った。両化合物に対する弛緩応答では、平滑筋のcAMP濃度が〜1.5倍上昇しており、この応答はアデニル酸シクラーゼ阻害剤である2’,5’−ジデオキシアデノシン(2’,5’−DDA)によって低減し、cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤である3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX)によって増大した。機械的応答は、IBMXの存在下及び非存在下において、KCaチャネルブロッカーであるアパミンとカリブドトキシンの同時投与によって阻害されたが、グリベンクラミドでKATPチャネルをブロックした場合には影響されなかった。Achによる弛緩及びcAMP濃度の上昇は、ギャップ結合のプラークを破壊する18αグリチルレチン酸によって消失したのに対し、A23187に対する応答はこの物質によって影響されなかった。これに符合して、「サンドウィッチ」バイオアッセイ実験において、2’,5’−DDAにより阻害され、IBMXによって増強された弛緩を引き起こした因子のA23187による細胞外放出が認められたがAChでは認められなかった。本発明者等は、ACh及びA23187によるウサギ腸骨動脈のEDHF型弛緩は平滑筋内のcAMPの蓄積に依存するが、それぞれ筋内皮ギャップ結合及び細胞外空間を介したシグナリングを要するとの結論を得た。
ギャップ結合の透過性がcAMPによって影響されるという本発明者等の発見は明らかに重要であり、本発明に関しては、これらに限定されるものではないが血管、皮膚及び気管支樹において特に重要であると考える。これらの組織の疾患や障害の治療に医薬品が用いられる場合、細胞層を通過しなければならない医薬品、特にギャップ結合を通過する医薬品の通過がcAMPの存在によって促進されることは明らかである。これは、直接または間接に、その浸透または活性の一次的または二次的な結果として環状AMPの濃度を低下させる医薬品に特に当てはまるものである。こうした医薬品のよい例として抗ウイルス剤が挙げられる。多様な抗ウイルス剤が存在するがこれらは一般にヌクレオシド類似化合物である。これらの類似化合物の中には酵素アデニル酸シクラーゼを阻害してcAMPの濃度を低下させるものがある。ヌクレオシド類似体は抗ウイルス剤として一般に使用されているが、これらの薬剤の環状AMP阻害剤としての使用は一般には思い至らないことからこの発見は偶然のものであった。換言すれば、ウイルス分野の研究者は、DNA鎖の伸長停止によってウイルスの逆転写酵素を阻害する阻害剤としてヌクレオシド類似体を見ているのである。同様に、細胞のシグナリング機構を研究対象とする細胞生物学者は、ジデオキシアデノシン(DDA)を使用してアデニル酸シクラーゼの阻害が可能であるという認識はあるものの、この分野の研究者はこの物質と抗ウイルス活性を結びつけて考えることがない。したがって本発明者等の研究がこれら2つの分野が重なる領域に本発明者等を導いたことはまったくの偶然であり、これによって、抗ウイルス剤は最初に投与された場合、cAMPを低減させる効果に基づきギャップ結合を閉鎖させることによって標的組織への抗ウイルス剤自体の浸透を実際に阻害することを発見するに到ったのである。したがってこの「自己阻害」は、cAMP及び/またはアデニル酸シクラーゼ及び/またはcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤の同時投与によって矯正することが可能である。
発明の概要
本発明の一局面によれば、内皮由来過分極因子(EDHF)の調節に対して応答性を有する、ヒトなどの動物における状態、疾患、障害の治療または予防処置に有効な医薬組成物の製造におけるcAMP(環状アデノシン一リン酸)、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、cAMP PDE(ホスホジエステラーゼ)阻害剤、または薬学的に許容されるこれらの誘導体または塩の用途が提供される。
本発明の一局面によれば、内皮由来過分極因子(EDHF)の調節に対して応答性を有する、ヒトなどの動物における状態、疾患、障害の治療または予防処置に有効な医薬組成物の製造におけるcAMP(環状アデノシン一リン酸)、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、cAMP PDE(ホスホジエステラーゼ)阻害剤、または薬学的に許容されるこれらの誘導体または塩の用途が提供される。
アデニル酸シクラーゼ活性化剤としては一般にサルブタモールなどの外因性または合成活性化剤を使用することが可能である。
PDE阻害剤としては一般にIBMX(イソブチルメチルキサンチン)、ロリプラムやミルリノンなどの外因性または合成cAMP PDE阻害剤を使用することが可能であるがこれらに限定されない。またcAMP PDE阻害剤としては好適な単離された内因性cAMP PDE阻害剤を使用することも可能である。
本発明の好ましい一局面では、cAMP、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、またはcAMP ホスホジエステラーゼ阻害剤の用途は抗ウイルス組成物の製造にある。本発明のこの局面はその最も単純な形態では、cAMP及び/またはアデニル酸シクラーゼ活性化剤及び/またはcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤と抗ウイルス剤の組み合わせからなる。この組み合わせとしては、前記組成物の構成成分間の結合、接合、あるいは、好ましくは組成物中における薬学的な有効濃度での成分の共存が含まれる。前記組成物に好ましく使用することが可能な抗ウイルス剤としてはこれらに限定されるものではないが以下のものが挙げられる。ジデオキシアデノシン、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、ガンシクロビル、フォスカルネット、シドフォビル、ロデノシン、アシクロビル、またはこれらのすべての薬学的に有効な類似体。
例として抗ウイルス剤である2’,3’−ジデオキシアデノシンについて述べる。この親油性抗ウイルス剤は細胞膜を通過すると極性の三リン酸エステルとなりその極性状態では細胞レベル下の層を活性型として通過することが可能である。より親油性すなわちより疎水性の抗ウイルス剤の誘導体を使用することがより好ましい。こうした誘導体は当業者には一般に知られるものであり、そのうちの幾つかについては参照文献32に詳細に述べられている。
後述する本発明者等の研究は、EDHF応答に際して平滑筋中のcAMP濃度が上昇することを初めて示したものである。本発明者等は、この生化学的応答の誘導には拡散可能な因子が関与しているものと考える。
本発明者等の研究によれば、細胞間のギャップ結合をブロックまたは阻害することによってEDHF応答が調節もしくは低下することが更に示された。更に、細胞間ギャップ結合の連絡の阻害または低下に応答する多くの疾患や障害が存在する。
したがって本発明の更なる一局面では、細胞間ギャップ結合の連絡の阻害または低下に対して応答性を有する、ヒトなどの動物における状態、疾患、障害の治療または予防処置に有効な医薬組成物の製造における、1以上のコネクシンタンパク質の各部分と相同な1以上の合成ペプチドであって細胞間ギャップ結合を阻害または低下させるうえで有効な合成ペプチドの用途が提供される。
これらのcAMP、アデニル酸シクラーゼ活性化剤またはcAMP PDE阻害剤及び合成ペプチドは、多くの疾患や障害の治療、またはこうした治療のための組成物の調製に使用することが可能である。こうした疾患や障害の例としては、
血管系の疾患または障害、
NO濃度が抑制される疾患または障害状態、
高血圧症、
好中球やマクロファージが関与する疾患(例、アテローム)や扁桃中の白血球が関与する疾患などの免疫系の疾患または障害、
心臓系の疾患または障害、
肝臓の疾患または障害、
膵臓の疾患または障害、
神経系の疾患または障害、特に、シャルコー−マリー−ツース病や遺伝性感音性難聴などのコネクシンの突然変異が関係するすべての疾患、
平滑筋細胞内部への薬剤の内皮通過を促進することが望ましい喘息などの肺脈管構造や筋組織の疾患または障害、
尿細管機能に関連した腎障害など、泌尿生殖器系の疾患または障害、
新生物や腫瘍の治療または予防処置、
血圧低下をともなう敗血症性ショックなどの状態、
免疫系の疾患または障害、
皮膚の疾患または障害、特に、帯状疱疹の治療用の抗ウイルス剤など、薬剤の高い浸透性が特に有効な疾患、
特にウイルス性肺炎や喘息における気管支樹の疾患または障害、
これらに限られないが特に微小循環及び/または抗ウイルス剤や抗癌剤が血管壁を通過して組織に高濃度で浸透することが望ましい場合などの血管の疾患や障害。このアプローチは血液脳関門によってしばしば薬剤の送達が妨げられる神経組織において特に有用である。
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高血圧症、
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血圧低下をともなう敗血症性ショックなどの状態、
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特にウイルス性肺炎や喘息における気管支樹の疾患または障害、
これらに限られないが特に微小循環及び/または抗ウイルス剤や抗癌剤が血管壁を通過して組織に高濃度で浸透することが望ましい場合などの血管の疾患や障害。このアプローチは血液脳関門によってしばしば薬剤の送達が妨げられる神経組織において特に有用である。
本発明の合成ペプチドはコネクシンタンパク質のギャップ26及び27細胞外ループ部分の1以上に対してそれぞれ相同であることが好ましい。
一局面において、合成ペプチドは、VCYDQAFPISHIR、VCYDKSFPISHVR、SRPTEKTIFII、またはSRPTEKNVFIVである。
特に好ましい合成ペプチドとしては、RVDCFLSRPTEK、PVNCYVSRPTEK、及びIVDCYVSRPTEKが挙げられ、特定の用途では合成ペプチドSRPTEKTが用いられる。
2種以上の合成ペプチドが用いられる場合、組み合わせにはコネクシン37、40及び43をターゲットとする3種のペプチドの組み合わせが含まれることが望ましい。本発明者等はこの組み合わせを用いて、ラットの肝動脈ではEDHF型弛緩は個々のペプチドによっては影響されないが、この3種ペプチドの組み合わせの使用によって消失することを見出した。
EDHF現象の重要性は血管径が小さくなるほど増すことはよく知られており、本発明者等は、コネクシン模倣ペプチドを用いた実験に基づいて、ウサギの耳から得た小径の遠位動脈において見られる、中心動脈と比較して2倍大きなEDHF応答は、ギャップ結合または連絡の差異に特に帰因するものであることを示した。このことは、内皮と平滑筋の直接的な結合は微小循環においては特に機能的重要性を有する可能性を示唆するものであり、遠位血管では筋内皮プラークが無数に近く存在するという形態学的所見(25)と一致する。実際、血管壁の長さ方向に沿った局所的応答の伝播も、下流部位から到達する刺激の強度や性質を反映することによって、細動脈網の協同的機能に寄与している可能性がある。したがってギャップ結合は、局所的拡張と筋応答の両者の電気緊張性伝播を可能とするものである。実際、内皮で発生した電位は殆ど低下することなく伝播し、免疫染色や電子ミオスクロスコピー(myoscroscopy)によって明らかであるように内皮間ギャップ結合プラークが高率で存在することと機能的相関を示すものである。したがって、電気緊張性電位は整流作用のない単純なオーム抵抗器として働く筋内皮ギャップ結合を通じて伝導可能であることから、内皮は多数の平滑筋細胞を接続する重要な低抵抗経路として機能している可能性がある。
本発明の更なる一局面によれば、血管障害の治療または予防処置において有効な医薬組成物の製造におけるcAMPまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはcAMP PDE阻害剤、または薬学的に許容されるこれらの誘導体または塩の用途が提供される。
本発明の好ましい一局面では、前記血管障害は微小循環の障害である。
本発明の更なる一局面によれば、血管障害の治療または予防処置において有効な医薬組成物の製造における、1以上のコネクシンタンパク質の各部分と相同な1以上の合成ペプチドであって細胞間ギャップ結合を阻害または減衰させるうえで有効な合成ペプチドの用途が提供される。
本発明の好ましい一局面では、前記血管障害は微小循環の障害である。
重要な点として、これらの合成ペプチドによる治療の利点の1つは、これらのペプチドは一定期間の後、洗い流されて分解されるか血液循環から排出されるという意味で非永続性であることである。
別の一局面において本発明は、ヒトなどの動物の体内もしくは体表の所定表面と接触させることによって前記動物の体内もしくは体表に投与される医薬組成物であって、治療物質または複数の治療物質の組み合わせと、cAMPまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはcAMP PDE阻害剤とからなり、該組成物が前記表面と接触する際に、前記cAMPまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはcAMP PDE阻害剤によって、1以上の細胞間ギャップ結合を介した、隣接する細胞組織内への前記表面を通じた前記物質の移送が開始もしくは促進されることを特徴とする医薬組成物を提供する。
本発明の好ましい一局面では、前記治療物質は抗ウイルス剤を含む。該抗ウイルス剤は、以下の従来のウイルス剤または適宜修飾されたこれらの類似体の1以上からなる。すなわち、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、ガンシクロビル、フォスカルネット、シドフォビル、ロデノシン、ジデオキシアデノシン、アシクロビル。
例として抗ウイルス剤である2’,3’−ジデオキシアデノシンについて述べる。この親油性抗ウイルス剤は細胞膜を通過すると極性の三リン酸エステルとなりその極性状態では細胞レベル下の層を活性型として通過することが可能である。より親油性すなわちより疎水性の抗ウイルス剤の誘導体を使用することがより好ましい。こうした誘導体は当業者には一般に知られるものであり、そのうちの幾つかについては参照文献32に詳細に述べられている。
更なる別の一局面によれば本発明は、ヒトなどの動物の体内もしくは体表の所定表面と接触させることによって前記動物の体内もしくは体表に投与される医薬組成物であって、治療物質を細胞膜透過性とするように設計された部分に結合もしくは接合した治療物質を含み、該組成物が前記表面と接触する際に、細胞内への細胞膜を通じた前記治療物質の移送を前記部分が開始もしくは促進し、細胞内で前記部分は前記物質から切断されることによって該物質が1以上の細胞間ギャップ結合を介して隣接する細胞組織中に移動可能となる医薬組成物を提供する。
本発明のこの局面は、明細書中に述べるダイ・トランスファー実験によって視覚的に説明される。本発明者等はこれらの実験において、極性色素であるカルセインの内皮から平滑筋へのギャップ結合を介した拡散において、親油性の前駆体であるカルセインAMの内皮による取込みとエステラーゼによるカルセイン(色素の極性型)への細胞内切断が起こることを示した。同様に2’,3’−DDAを用いた実験では、この親油性薬剤が細胞酵素によって、カルセインと同様にギャップ結合を通じて拡散可能である活性化型で抗ウイルス性の極性三リン酸エステルに転換されることが示された。
この局面では、医薬組成物が更にcAMPまたはcAMP PDE阻害剤を含むことにより前記物質の移送を補助することが可能である。この局面においては好ましくは前記医薬組成物の前記治療物質は抗ウイルス剤である。このウイルス剤としては以下の抗ウイルス剤またはその好適な誘導体の1以上のものであることが理想的である。すなわち、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、ガンシクロビル、フォスカルネット、シドフォビル、ロデノシン、ジデオキシアデノシン、アシクロビル。
最も好ましくは、抗ウイルス剤は、ウイルス剤が細胞膜を通過した時点でその親油性部分が切断されて、極性部分が活性化型として遊離して組織内に更に浸透するような親油性薬剤である。
上記の局面において、前記表面としては、内皮の所定領域や上皮の所定領域が含まれる。すなわち典型的な例としては、皮膚、動脈壁、血管系、及び血液脳関門が挙げられる。上皮領域としては、肺、直腸または腸管の内膜や、上記に特定したような皮膚や粘膜が挙げられる。
これらの局面では、上述の部分の存在下または非存在下に、cAMP、及び/またはアデニル酸シクラーゼ活性化剤、及び/またはcAMP PDE阻害剤は単独で用いるか、あるいはこれらを共に用いることによって、前記治療物質を細胞膜透過性とすることが可能である。粘膜に対するこれらの合成ペプチドの更なる可能な用途は、枯草熱に対して血管収縮を起こさせることである。
別の一局面において本発明は、ヒトなどの動物の体の選択された領域または臓器の血管を構成する細胞内部のギャップ結合の連絡を選択的に阻害し、可逆的にその弛緩を阻害することによって体内の他の部位における血流を促進する1以上の合成ペプチドからなる医薬組成物を提供する。
ヒトもしくは動物体内の標的部位。上述したようにこれらの合成ペプチドは非永続性のものであって、短い期間の後に洗い流されて排出されるか不活性状態に分解される。
ヒトもしくは動物体内の標的部位。上述したようにこれらの合成ペプチドは非永続性のものであって、短い期間の後に洗い流されて排出されるか不活性状態に分解される。
本発明には更に以下の合成ペプチドが含まれる。すなわち、
VCYDQAFPISHIR
VCYDKSFPISHVR
SRPTEKTIFII
SRPTEKNVFIV
RVDCFLSRPTEK
PVNCYVSRPTEK
IVDCYVSRPTEK
SRPTEKT
本発明には更に、上述したようなcAMP、アデニル酸シクラーゼ活性化剤またはcAMP PDE阻害剤または合成ペプチドを用いた疾患、障害または状態の治療方法が含まれる。
VCYDQAFPISHIR
VCYDKSFPISHVR
SRPTEKTIFII
SRPTEKNVFIV
RVDCFLSRPTEK
PVNCYVSRPTEK
IVDCYVSRPTEK
SRPTEKT
本発明には更に、上述したようなcAMP、アデニル酸シクラーゼ活性化剤またはcAMP PDE阻害剤または合成ペプチドを用いた疾患、障害または状態の治療方法が含まれる。
以上本発明を述べてきたが、本発明は明細書の残りの部分に記載される特徴のいかなる新規な組み合わせをも包含するものである。
発明の詳細な説明
アセチルコリン(ACh)など、内皮を介して作用するアゴニストは、一次内皮過分極によってもたらされ、NO及びプロスタノイド合成とは無関係な平滑筋の過分極及び弛緩を引き起こす(11)。内皮と媒質とは、コネクシン(Cx)タンパク質からなる個別のギャップ結合の局所的クラスターから構成される筋内皮ギャップ結合のプラークを介して電気的に結合されていることから、受動的電気緊張性機構が平滑筋応答に寄与している可能性がある(6,25)。実際、細動脈では、AChによって誘導したか1個の内皮細胞に電流を流すことによって誘導したかによらず、内皮の過分極を平滑筋において同期的に検出することが可能である(12)。これに比して、壁厚の大きな血管では、内皮は過分極電流の主要な発生源としては機能し得ないとの指摘があるが、これはこの単層のマスと媒質との大きな差のために電気的ミスマッチが生じることによるとされる(3)。したがって、内皮由来過分極因子(EDHF)が細胞外空間に放出されることにより平滑筋のK+チャンネルが活性化されて弛緩が起こるという別の仮説も立てられている(7,14,24)。
アセチルコリン(ACh)など、内皮を介して作用するアゴニストは、一次内皮過分極によってもたらされ、NO及びプロスタノイド合成とは無関係な平滑筋の過分極及び弛緩を引き起こす(11)。内皮と媒質とは、コネクシン(Cx)タンパク質からなる個別のギャップ結合の局所的クラスターから構成される筋内皮ギャップ結合のプラークを介して電気的に結合されていることから、受動的電気緊張性機構が平滑筋応答に寄与している可能性がある(6,25)。実際、細動脈では、AChによって誘導したか1個の内皮細胞に電流を流すことによって誘導したかによらず、内皮の過分極を平滑筋において同期的に検出することが可能である(12)。これに比して、壁厚の大きな血管では、内皮は過分極電流の主要な発生源としては機能し得ないとの指摘があるが、これはこの単層のマスと媒質との大きな差のために電気的ミスマッチが生じることによるとされる(3)。したがって、内皮由来過分極因子(EDHF)が細胞外空間に放出されることにより平滑筋のK+チャンネルが活性化されて弛緩が起こるという別の仮説も立てられている(7,14,24)。
にも関わらず、ギャップ結合を介した細胞間の直接的な連絡が導脈管におけるEDHF応答に寄与していることの証左が存在する。細胞間の連絡をコネクシン特異的に妨害する、コネクシンタンパク質の第1番目及び第2番目の細胞外ループのギャップ26または27ドメインに相同な合成ペプチド、及び、ギャップ結合プラークを破壊する親油性アグリコンである18α−グリチルレチン酸(18α−GA)は、特定のウサギ動脈及び静脈においてAChによって引き起こされるEDHF型応答を阻害する(4,8,10,15,17,26)。更に、供与側組織の内皮と検出側組織の平滑筋との間にギャップ結合による連絡がないウサギ腸管膜動脈の「サンドウィッチ」組織標本では、AChによる弛緩はすべてNOの介在によって起きる(8,17)。これに比して、サンドウィッチ実験によって、ウサギ大腿及び腸管膜動脈へのCa2+イオノフォアA23187の投与後に細胞外空間を介して拡散する、NO及びプロスタノイドとは異なる因子の放出を示す証拠が与えられた(17,23)。更に、ウサギ腸骨動脈においてAChによって引き起こされるEDHF型弛緩が、平滑筋のcAMP濃度の上昇とタンパク質キナーゼA(PKA)が媒介するリン酸化反応に依存するという観察は、しかしながらこうした応答が単に受動的電気緊張性機構によって媒介されるものではない可能性を示している(27)。ギャップ結合による連絡をコネクシン模倣ペプチドや18α−GAによって妨害することによってcAMPの蓄積が抑制されることから、AChに対する応答には化学的シグナリングが寄与している可能性がある。これはギャップ結合によって電気的連続性が与えられる以外に連結された細胞間の1kDaよりも小さなサイズのシグナリング分子の直接的移送が可能であるためである。本発明者等はこの研究でcAMPが、異細胞連絡とは無関係であるにも関わらず、A23187に対するEDHF応答を同様に補助することを証明し、これにより、弛緩が基本的に異なるシグナリング経路で起こる場合であっても同様な生化学的イベントがEDHF現象を補助する可能性を示す証拠を示した。
材料及び方法
単離リング状組織標本.雄のニュージーランド白色種のウサギ(2〜2.5kg)をペントバルビタールナトリウム(120mg/kg;静脈内投与)によって薬殺し、腸骨動脈を取り出して次の組成(mM)の冷却したHolman’s緩衝液に移した。すなわち、120 NaCl、5 KCl、2.5 CaCl2、1.3 NaH2PO4、25 NaHCO3、11 グルコース、及び10 スクロース。血管から付着組織を剥離して2〜3mm幅のリングを切り取り、37℃の気化緩衝剤(95% O2、5% CO2、pH7.4)の入ったオーガンチャンバ内に懸垂した。張力をおよそ0.25gに設定し、1時間の平衡時間の間、組織を新鮮な緩衝液で繰り返し洗浄し、緊張を緩和した後に張力を再調節した。内皮を剥離していないリングをNG−ニトロ−L−アルギニンメチルエステル(L−NAME、300μM)及びインドメタシン(10μM)で40分インキュベートし、フェニルフリン(PE)による収縮の後、AChまたはA23187に対する累積濃度−弛緩率曲線を構築した。一部の組織標本を、2’,5’−ジデオキシアデノシン(2’,5’−DDA,200μM)、3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX,20μM)、18α−GA(100μM)、グリベンクラミド(10μM)、カリブドトキシン(100nM)及びアパミン(300nM)の組み合わせ、またはカリブドトキシン(100nM)、アパミン(300nM)及びIBMX(20μM)の組み合わせのいずれかで40分プレインキュベートした。内皮を剥離したリングについてもIBMX(20μM)の非存在下/存在下でACh及びA23187に対する濃度応答曲線を構築した。IBMXを用いた実験では、緊張の誘導に使用したPEの濃度を1〜3μMに増大させた。試薬はすべて英国シグマ社(Sigma,U.K.)より入手した。
単離リング状組織標本.雄のニュージーランド白色種のウサギ(2〜2.5kg)をペントバルビタールナトリウム(120mg/kg;静脈内投与)によって薬殺し、腸骨動脈を取り出して次の組成(mM)の冷却したHolman’s緩衝液に移した。すなわち、120 NaCl、5 KCl、2.5 CaCl2、1.3 NaH2PO4、25 NaHCO3、11 グルコース、及び10 スクロース。血管から付着組織を剥離して2〜3mm幅のリングを切り取り、37℃の気化緩衝剤(95% O2、5% CO2、pH7.4)の入ったオーガンチャンバ内に懸垂した。張力をおよそ0.25gに設定し、1時間の平衡時間の間、組織を新鮮な緩衝液で繰り返し洗浄し、緊張を緩和した後に張力を再調節した。内皮を剥離していないリングをNG−ニトロ−L−アルギニンメチルエステル(L−NAME、300μM)及びインドメタシン(10μM)で40分インキュベートし、フェニルフリン(PE)による収縮の後、AChまたはA23187に対する累積濃度−弛緩率曲線を構築した。一部の組織標本を、2’,5’−ジデオキシアデノシン(2’,5’−DDA,200μM)、3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX,20μM)、18α−GA(100μM)、グリベンクラミド(10μM)、カリブドトキシン(100nM)及びアパミン(300nM)の組み合わせ、またはカリブドトキシン(100nM)、アパミン(300nM)及びIBMX(20μM)の組み合わせのいずれかで40分プレインキュベートした。内皮を剥離したリングについてもIBMX(20μM)の非存在下/存在下でACh及びA23187に対する濃度応答曲線を構築した。IBMXを用いた実験では、緊張の誘導に使用したPEの濃度を1〜3μMに増大させた。試薬はすべて英国シグマ社(Sigma,U.K.)より入手した。
「サンドウィッチ」組織標本.2〜3mm幅の腸骨動脈のリングから内皮を剥離し、短冊状の小片に切断した後、モノジェクト針(0.9mmx40mm)を用いて両端から約2mmの位置に穿孔した。これらの小片を4〜5mm幅の内皮を有する腸骨動脈のリングの内腔に導入して組織同士を縫合した。次いでこれらの複合組織標本を、穿孔した内皮剥離細片を大血管マウントにひっかけてMulvany Multi ミオグラフ(Danish Myo Technology)に装着した。張力を最初約0.25gに設定し、1時間の平衡時間の間に再調整した。次いでこれらの組織標本をL−NAME(300μM)及びインドメタシン(10μM)にて40分インキュベートし、PE(1または3μM)にて収縮し、IBMX(20μM)の存在下/非存在下でAChに対して、またIBMX(20μM)または2’,5’−DDA(200μM)の存在下/非存在下でA23187に対して、濃度−応答曲線を構築した。
ラジオイムノアッセイ.同じ動脈から得た複数のリングを、L−NAME(300μM)及びインドメタシン(10μM)を含む酸素化したHolmans緩衝液中、18α−GA(100μM)の存在下または非存在下で37℃にて40分インキュベートした。AChまたはA23187を加えた後、リングを最大で180秒間までの異なる時点で液体窒素中で凍結し、6%トリクロロ酢酸中でcAMPまたはcGMPの抽出を行うまで−70℃で保存した。その後、水で飽和したジエチルエーテルで中和し、ラジオイムノアッセイ((アマシャム)Amersham 英国)を行った。最初のコントロールポイントの3分前にPE(1μM)を加え、内皮を剥離したリングで対照実験を行った。ヌクレオチド濃度はタンパク質含量に対して表した(27)。
膜電位実験.腸骨動脈小片の外膜を下にして、酸素化した(95%O2、5%CO2)オーガンチャンバー内で、300μM L−NAME及び10μM インドメタシンを含んだHolmans溶液で灌流した(37℃で2ml/分)Harpスライスグリッド(ALA Scientific Instruments,米国)で固定した。ガラスキャピラリー微小電極(先端部抵抗60〜110M、3M KClにて充填し、SEC−10LX増幅器のヘッドステージに接続したもの(NPI Electronic,ドイツ))にて膜間電位を記録した。ベースラインからの電位の−方向への急激な低下と少なくとも2分間の安定した信号の後、良好な穿刺を得た。記録が平滑筋細胞から確実に得られるように、このようなマイナスの変動が2〜3回生ずるまでPCS−5000マイクロマニピュレーター(Burleigh Instruments,英国)を用いて微小電極を内膜中に進めた。無流条件下でのオーガンチャンバー内への直接投与によって最初にAChに対するコントロール応答を得た後、動脈小片を新鮮な緩衝液で洗ってから200μM 2’,3’−DDA単独、または200μM 2’,3’−DDAと30μM IBMXの組合わせとともにインキュベートし、AChに繰り返し曝露した。
ダイ・トランスファー.大腿動脈をLiving Systems 灌流ミオグラフ(Living Systems Instrumentation,バーモント州バーリントン)に装填し、25mmHgの一定圧力下、0.1ml/分の流速で酸素化したHolmans緩衝液(35℃)で灌流した。この血管を30分平衡化してから300μM L−NAME及び10μM インドメタシンで60分間、更に、600μM ギャップ27、20μM IBMX、1mM 8−ブロモ−cAMP、または1mM 8−ブロモ−cGMPのいずれかで30分間灌流した。これらの組織標本を室温に戻し、内腔に10μM カルセインAM(Molecular Probes)を30分間灌流してから、35℃の無色素緩衝液で30分洗い流した。対照実験では、膜透過性を有さない10μM カルセインで動脈を灌流した。次いで血管をミオグラフから取り外して0.2%グルタルアルデヒド及び2%ホルマリンを含む0.1M PBS中で90分間固定した後、液体窒素で冷却したOCTコンパウンド(Agar Scientific,Stanstead,英国)中で凍結保存した。輪切りにしたリングの凍結切片(厚さ10μm)を調製し、Fluorsave(Calbiochem)下、ポリ−L−リジンでコーティングしたスライド上に固定して、フィルターを490nm励起光及び525nm放射光に設定したTCS4次元共焦点レーザースキャニングシステム(ライカ)にてイメージングを行った。各試料について0.5μm刻みの数枚のイメージを得た後、ライカSCANWAREソフトウェアを用いた画像処理を行って最大投影像を得た。次いでMATLABソフトウェアで血管壁を横断するピクセル強度プロファイルを得て、単一指数関数的に近似して、中間蛍光の崩壊を示す空間定数を内膜からの距離、すなわち蛍光が1/eすなわち約63%減衰する距離の関数として得た。
統計的分析.データは、nが各データポイントについて調べた動物の数を示すものとしてすべて平均値±SEMとして与えられ、データは適宜ペアまたはペアとしないデータについてスチューデントのt検定によって比較を行った。P<0.05を有意とした。濃度−応答曲線は一元配置分散分析(ANOVA)の後にBonferroni多重比較検定を行って評価した。
結果
単離したウサギ腸骨動脈リング.ACh及びA23187に対する最大のEDHF型弛緩率は、約3μMの濃度のPEにより誘導された緊張の約40%に相当した(図1及び2)。内皮を剥離しないリングでは、この応答はIBMX(20μM)によってAChを用いた場合では36.0±5.0%から65.5±4.5%に(P<0.05,n=14及び10;図1A)、A23187を用いた場合では50.2±5.6%から73.0±8.5%に(P<0.05,n=18及び9;図1B)増強され、これにともなってEC50値は555±121nMから119±21nM、及び328±123nMから196±139nMへとそれぞれ左方にシフトした(それぞれP<0.05)。アデニル酸シクラーゼ阻害剤である2’,5’−DDA(200μm)とのインキュベートによってAChによる弛緩応答はほとんど消失し、最大応答が11.0±1.9%に低下した(P<0.05,n=4;図1A)のに対して、A23187に対する最大応答はPEによって誘導された緊張の40.3±8.3%に低下し(P<0.05,n=9;図1B)、EC50値は644±221nMにまでシフトした(P<0.05)。内皮剥離によってACh及びA23187に対する弛緩応答はいずれも消失した(それぞれn=8及び5;図1A及びB)。内皮を剥離したリングをIBMX(20μM)とともにインキュベートした場合、AChに対する弛緩応答が明らかではなかったのに対して(n=4;図1A)、A23187によってPEにより誘導された緊張の21.7±3.6%に相当する弛緩応答が誘導された(P<0.05,n=6;図1B)。カリブドトキシン(100μM)とアパミン(300nM)の組合わせによってAChにより誘導される弛緩応答は消失し(P<0.05,n=5;図1C)、A23187に対する応答は顕著に減衰して最大弛緩率はPEにより誘導される緊張の50.0±5.8%〜14.6±5.7%に低下した(P<0.05,n=3;図1D)。これにともないEC50値は291±128nMから784±417nMへと右方にシフトした(P<0.05)。IBMX(20μM)の添加によってアパミンとカリブドトキシンの組合わせの有効性は低減し、ACh及びA23187に対する最大応答はPEにより誘導される緊張のそれぞれ16.4±2.6%及び22.0±5.9%に低下した(それぞれn=4及び3;図1C及びD)。グリベンクラミド(10μM)とのインキュベーションによってAChまたはA23187によるEDHF型弛緩応答に大きな変化は見られなかった(それぞれn=5及び9;図1C及びD)。
単離したウサギ腸骨動脈リング.ACh及びA23187に対する最大のEDHF型弛緩率は、約3μMの濃度のPEにより誘導された緊張の約40%に相当した(図1及び2)。内皮を剥離しないリングでは、この応答はIBMX(20μM)によってAChを用いた場合では36.0±5.0%から65.5±4.5%に(P<0.05,n=14及び10;図1A)、A23187を用いた場合では50.2±5.6%から73.0±8.5%に(P<0.05,n=18及び9;図1B)増強され、これにともなってEC50値は555±121nMから119±21nM、及び328±123nMから196±139nMへとそれぞれ左方にシフトした(それぞれP<0.05)。アデニル酸シクラーゼ阻害剤である2’,5’−DDA(200μm)とのインキュベートによってAChによる弛緩応答はほとんど消失し、最大応答が11.0±1.9%に低下した(P<0.05,n=4;図1A)のに対して、A23187に対する最大応答はPEによって誘導された緊張の40.3±8.3%に低下し(P<0.05,n=9;図1B)、EC50値は644±221nMにまでシフトした(P<0.05)。内皮剥離によってACh及びA23187に対する弛緩応答はいずれも消失した(それぞれn=8及び5;図1A及びB)。内皮を剥離したリングをIBMX(20μM)とともにインキュベートした場合、AChに対する弛緩応答が明らかではなかったのに対して(n=4;図1A)、A23187によってPEにより誘導された緊張の21.7±3.6%に相当する弛緩応答が誘導された(P<0.05,n=6;図1B)。カリブドトキシン(100μM)とアパミン(300nM)の組合わせによってAChにより誘導される弛緩応答は消失し(P<0.05,n=5;図1C)、A23187に対する応答は顕著に減衰して最大弛緩率はPEにより誘導される緊張の50.0±5.8%〜14.6±5.7%に低下した(P<0.05,n=3;図1D)。これにともないEC50値は291±128nMから784±417nMへと右方にシフトした(P<0.05)。IBMX(20μM)の添加によってアパミンとカリブドトキシンの組合わせの有効性は低減し、ACh及びA23187に対する最大応答はPEにより誘導される緊張のそれぞれ16.4±2.6%及び22.0±5.9%に低下した(それぞれn=4及び3;図1C及びD)。グリベンクラミド(10μM)とのインキュベーションによってAChまたはA23187によるEDHF型弛緩応答に大きな変化は見られなかった(それぞれn=5及び9;図1C及びD)。
L−NAME(300μM)及びインドメタシン(10μM)の存在下では、1μMのPEによる収縮は2.0±0.1gであった(内皮剥離していないすべての実験からデータを集めた)。内皮剥離、または2’,5’−DDA(200μM)、グリベンクラミド(10μM)あるいはカリブドトキシン(100nM)とアパミン(300nM)の組合わせとのインキュベーションによって収縮率は影響されなかった。IBMX(20μM)とのインキュベーションを行った実験では、初期の張力は3μMのPEによるコントロールのレベル(1.8±0.1g、これらの実験すべてからデータを集めた)に保たれた。
弛緩応答及びcAMP蓄積度に対する18α-GAの影響.ギャップ結合阻害剤18α-GA(100μM)によってAChによるEDHF型弛緩応答は効果的に消失した(n=5;図2A及びC)が、A23187による弛緩応答に対しては影響が見られなかった(n=8;図2B及びD)。同様に、18α-GA(100μM)によってAChによるcAMP濃度の一過的上昇(3μM,n=5;図2E)は防止されたが、A23187によるヌクレオチドの蓄積に対して大きな影響は見られなかった(3μM,n=6;図2F)。内皮剥離した組織標本ではcAMPの基底濃度は3.97±0.49pmol/mg(タンパク質)であり、AChまたはA23187への曝露後にも大きな上昇は見られなかった(それぞれn=4;図2E及びF)。内皮を剥離していない組織標本では、cAMPの基底濃度は4.56±0.4pmol/mg(タンパク質)であり、L−NAME(300μM)及びインドメタシン(10μM)とのインキュベート後にも大きな変化は見られなかったのに対し、cGMPの基底濃度は1.84±0.66から0.3±0.07pmol/mg(タンパク質)へと低下した(P<0.05,それぞれn=3及び8)。L−NAME及びインドメタシンの存在下では、ACh及びA23187のいずれもcGMP濃度を有意に上昇させなかった(それぞれn=4;図2E及びF)。
サンドウィッチ組織標本.AChは、IBMXの存在下または非存在下のいずれの場合にもEDHF型弛緩応答を引き起こさなかった(20μM,それぞれn=5;図3A及びB)。これに比して、A23187によって弛緩応答が刺激され、PEにより誘導される緊張の52.0±8.0%の最大応答と、240±40nMのEC50値を得た(n=5:図2A及びC)。A23187に対する応答は2’,5’−DDA(200μM)によって減衰し、最大応答はPEによる緊張の18.5±9.2%に低下し、EC50値は1250±240nMへと右方にシフトした(P<0.05,n=5:図2A及びC)。A23187に対する応答はIBMX(20μM)によって増強され、最大応答は70.0±6.50%であり、EC50値は120±80nMへと左方にシフトした(p<0.05,n=5:図2A及びC)。
膜電位実験.尖鋭電極電気生理法によって筋内皮ギャップ結合の調節におけるcAMPの役割を調べた。アデニル酸シクラーゼ阻害剤である2’,3’−DDAは200μMの濃度で内皮膜電位における電気的変化の内膜下平滑筋細胞内への伝達を約75%低減させた(図4)。この阻害作用は続くcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤IBMX(30μM)とのインキュベーションによって完全に逆転した。
ダイ・トランスファー.カルセインAMによる管腔内灌流後に血管壁内に色素が検出されたが、カルセインによる管腔内灌流後では検出されなかった(図5)。コントロール条件下では中間蛍光は8.54±0.39μm(n=3)の空間定数にて崩壊したのに対し、色素は600μMのギャップ27で灌流した動脈ではほぼ内皮にのみ局在した。20μMのIBMXまたは1mMの8−ブロモcAMPの灌流によって空間定数はそれぞれ11.50±0.80及び12.50±0.95μmへと大幅に増大した(n=6及び5,P<0.05)のに対し、1mMの8−ブロモ−cGMPで灌流した動脈ではその値は8.39±0.44μm(n=4)でありコントロールと大差なかった。
考察
この研究によって、ウサギ腸骨動脈においてACh及びCa2+イオノフォアであるA23187によって引き起こされるEDHF型弛緩応答に寄与する機構の類似点ならびに相違点が明確に示された。主要な発見としては、内皮は平滑筋のcAMP濃度の上昇によって両物質に対するNO及びプロスタノイド依存型弛緩応答を媒介し、その背後にあるシグナリング経路には、AChの場合では筋内皮ギャップ結合が関与し、A23187の場合では細胞外空間を介した拡散可能な因子の移動が関与していることである。
考察
この研究によって、ウサギ腸骨動脈においてACh及びCa2+イオノフォアであるA23187によって引き起こされるEDHF型弛緩応答に寄与する機構の類似点ならびに相違点が明確に示された。主要な発見としては、内皮は平滑筋のcAMP濃度の上昇によって両物質に対するNO及びプロスタノイド依存型弛緩応答を媒介し、その背後にあるシグナリング経路には、AChの場合では筋内皮ギャップ結合が関与し、A23187の場合では細胞外空間を介した拡散可能な因子の移動が関与していることである。
内皮を剥離していないリングを用いた実験では、ACh及びA23187のいずれによってもEDHF型弛緩応答が引き起こされ、この応答はP部位のアゴニストである2’,5’−DDAによるアデニル酸シクラーゼの阻害によって減衰し、IBMXによるcAMPの加水分解の阻害によって増強された。L−NAMEの投与によってcGMPの基底濃度は大幅に低下し、AChまたはA23187の投与後にこのヌクレオチドの濃度の上昇は検出されなかった。このことは、NOシンターゼのほぼ完全な阻害を示すものであり、cGMP及びcAMPの双方を加水分解するホスホジエステラーゼ(21)を阻害するIBMXが、残留NO活性の生化学的影響の増幅(9)によって弛緩応答を増強しなかったことを証明するものである。ACh及びA23187に対する応答はIBMXによって弛緩応答が増強されている場合でもアパミンとカリブドトキシンの組合わせによって阻害された。これはEDHF現象の特徴であり、内皮に存在するアパミン感受性の小伝導率チャンネル(SKCa)及びカリブドトキシン感受性の大及び中伝導率チャンネル(BKCa及びIKCa)(11)が開放していることを反映している。グリベンクラミドを用いた実験により、AChまたはA23187によって引き起こされるEDHF型弛緩応答におけるKATPチャンネルのcAMP依存活性化に対する役割は否定された。
ラジオイムノアッセイによって機械的弛緩応答は平滑筋のcAMP濃度の上昇に依存していることが確認された。L−NAME及びインドメタシンとインキュベートしたリングでは、同程度の最大弛緩応答(誘導した緊張の40%程度)を引き起こしたAChまたはA23187の濃度は、cAMP濃度が内皮依存的に約1.5倍上昇することと関連していた。この濃度はほぼ最大の生物学的応答を引き起こすのに充分である(13)。いずれの物質も適用後3分以内にヌクレオチド濃度は基底濃度に戻ったが、A23187ではcAMP濃度はより長時間にわたって高値に保たれ(15〜30秒に対して40〜50秒)、ウサギ腸管膜動脈において以前に報告されているA23187で得られたAChと比較してより遅いEDHF型弛緩応答の結果(17)と一致した。しかしながらこれらの物質によって活性化されるシグナリング経路は異なっており、18α−GAによってACh誘導弛緩応答及びこれにともなうcAMPの蓄積は消失したのに対し、A23187による対応する応答は影響されなかった。ウサギ上腸管膜動脈において行った同様な機械的観察では、ギャップ結合の連絡を阻害するコネクシン模倣ペプチド(17)によってAChに対するEDHF型弛緩応答が阻害されたがA23187に対する弛緩応答は阻害されなかった。A23187についてのこの知見は、18α−GAはcAMPの合成を非特異的に阻害するものではないことを更に示している。内皮細胞の単層のcAMP絶対含量は小量であり、内皮を剥離していないリングでのヌクレオチド測定に対する寄与は無視できることの確証は、18α−GAとインキュベートした内皮を剥離していないリングではcAMP濃度はAChによって上昇しないという観察によって与えられた。
サンドウィッチ組織標本を用いたバイオアッセイ実験によって、NOシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ阻害を組み合わせた条件下でのA23187による内皮の刺激後に、内因性の血管拡張物質が細胞外空間を移動することが示された。A23187に対する弛緩応答が2’,5’−DDAによって阻害され、IBMXによって増強されるという観察によって、内皮を剥離していないリングにおけるような関連する機械的応答がcAMPによって媒介されることが確認される。自由拡散可能な媒介物質の閾値下の放出の機能的影響を顕在化させることが期待されるIBMXの存在下であっても、AChの投与後に移動可能な因子は検出されなかった。A23187はEDHFの細胞外放出を促進させるとの仮説を支持する電気生理学的な根拠が、A23187及びサブスタンスPによって引き起こされるブタ冠状動脈におけるEDHF型弛緩応答の比較によって与えられている(28)。サブスタンスPによって引き起こされる機械的弛緩ならびに内皮及び平滑筋の過分極がSKCaチャンネルをブロックするd−ツボクラリンによって阻害されたのに対し、0.5μMのA23187によって引き起こされる内皮の過分極は消失したが、弛緩応答及び平滑筋の過分極は影響されなかった(28)。
これらの発見の説明の一つとして、内皮で合成された化学的媒介物質が、AChによる刺激の後にギャップ結合を介して平滑筋に選択的に移動するのに対して、A23187は同じ因子の「過剰放出」を誘導し、これにより細胞外経路を介して平滑筋のcAMP濃度が上昇することが考えられる。こうした因子は更に内皮でのcAMPの生成を促進することが考えられ、緩衝液で灌流したウサギ耳朶及びウサギ腸管膜組織標本からの流出液からAChまたはA23187の投与後に検出される内皮からのcAMPの顕著な細胞外放出に寄与している可能性がある(1,27)。AChの場合では、内皮から媒質中へのギャップ結合を介したcAMPの拡散が、平滑筋のヌクレオチド濃度の上昇に少なくとも部分的に寄与している可能性がある(15)。しかしながらA23187に対する弛緩応答を媒介する因子は、内皮由来のcAMPであるとは単純には考えにくい。これは、AChによって引き起こされるこのヌクレオチドの流出は、単離したウサギ耳組織標本においてギャップ結合による連絡が18α−GAによって阻害されている場合には灌流圧を調節せず、これは細胞外血管弛緩物質としての低い効率を恐らく反映していると考えられる(27)ためである。本発明者等は先に、AChまたはA23187によって引き起こされるウサギ動脈のEDHF型弛緩応答には、Ca2+依存型ホスホリパーゼA2によるアラキドン酸の可動化が必要であることの証左を示した(17)。理論上はこのことは、アラキドン酸のエポキシエイコサトリエン酸(EET)代謝物質が自由拡散可能なEDHFとして機能するという仮説と符合する(7)。実際、これらの化合物は内皮で合成され、過分極性平滑筋K+チャンネルを活性化し、心筋細胞及び単核細胞のcAMP濃度を上昇させる(7,29,30)。しかしながら、ウサギ腸管膜動脈では、ポリペプチドであるメリチンによるホスホリパーゼA2の直接活性化によって引き起こされるEDHF型弛緩応答はギャップ結合を介して媒介される(18)。更に、5,6−EETによって、内皮依存型でギャップ結合依存型かつcAMP依存型である点でAChと同様の性質を有する弛緩応答が引き起こされるが、他のEETの位置異性体は不活性である(17,27)。これらの観察は、内皮におけるアラキドネートの代謝はウサギ動脈でのEDHF現象において重要な開始段階である可能性を示すものであるが、A23187によって放出される因子がEETであるという考え方の根拠を与えるものではない。ジヒドロキシエイコサトリエン酸(DHET)などの別の過分極性アラキドン酸塩産物が、ウサギ動脈のEDHF型弛緩応答において果たす役割は依然解明されていない(20)。
ギャップ結合を介した内皮−平滑筋結合の中心的関与は、内皮の剥離及びコネクシン模倣ペプチドであるギャップ27とのインキュベーションによって弛緩応答とcAMPの蓄積がいずれも消失するという観察によって立証された。cAMPはギャップ結合の分子透過性と電気伝導率を高めることから、本発明者等はcAMPが血管壁での色素の移動を調節する能力について研究を行った。本発明者等は、大腿動脈の一部の内皮全体に管腔内灌流によって細胞透過性の色素カルセインAMを選択的に適用し(31)、カルセインへの加水分解後に共焦点顕微鏡によって媒質中での蛍光の評価を行った。内皮から隣接する平滑筋細胞へのカルセインの移動はIBMX及び8−ブロモ−cAMPによって同程度に促進され、定量的画像解析によって導かれる拡散の空間定数は、それぞれ8から12μmへと増大した。8−ブロモ−cGMPとのインキュベーション後には同様の効果は見られなかったことから、色素移動の促進はcAMP/8−ブロモ−cAMPに特異的であるようである。媒質へのカルセインの浸透を大きく抑制するギャップ27を用いた実験によって筋内皮のギャップ結合の役割は確認されたが、IBMXまたは8−ブロモ−cAMPとインキュベートした組織標本では平滑筋の蛍光が大幅に増大していたことから、平滑筋細胞同士を連結するギャップ結合を介したカルセインのその後の拡散はcAMPによっても調節されている。
筋内皮ギャップ結合のcAMP依存性調節の重要性を実証するため、本発明者等は更に、内膜表面から電極穿刺した動脈小片において平滑筋膜電位に対するAChの影響を調べた。内皮を剥離していない組織標本では、3μMのAChによって基準値より約20mV低い値を保つ内膜下過分極を生じた。アデニル酸シクラーゼ阻害剤である2’,3’−DDAによってこれらの電気的変化は大きく減衰し、この阻害作用は低濃度のIBMXによって完全に逆転した。ギャップ結合を介した細胞同士の電気的及び化学的結合は一般に同等であることから、この観察は、2’,3’−DDAはそれ自身の極性ヌクレオシド三リン酸エステル分解生成物の細胞内拡散を阻害するが、その効果はIBMXによって逆転されることを示すものである。
結論として、ACh及びA23187によって引き起こされるEDHF型弛緩応答は、いずれも平滑筋へのcAMP蓄積に依存するが、関与する細胞間連絡経路は異なっていることを本発明者等は立証したものである。cAMPの細胞での異なる作用には、KCaチャンネル及びNa+−K+ATPアーゼを介した過分極などの文献に報告されているEDHF現象の多様な性質が含まれる(11)が、ACh及びA23187に対する応答に通常の化学シグナルが関与しているかは解明されていない。実際、cAMPは理論上ギャップ結合の電気伝導率を増大させることによって弛緩を促進することが可能であり(2)、これによって媒質への内皮過分極の電気緊張性伝播を促進することから、AChの場合では化学的シグナリング機構と電気緊張性シグナリング機構の間には複雑な相互作用が存在する可能性がある。伝導した内皮過分極はそれ自体AChによる平滑筋へのcAMP蓄積に寄与している可能性がある。EDHF型弛緩応答には、電位作動型Ca2+チャンネルの閉鎖がともなう。これによって平滑筋の[Ca2+]iは大きく低下し(5)、L−型Ca2+チャンネルに密接に結合していて血管平滑筋内で発現している(19,22)Ca2+阻害性V型及びVI型アデニル酸シクラーゼアイソフォームが活性化されることが考えられる。あるいは、[Ca2+]iの低下によって、Ca2+によって刺激されるI型ホスホジエステラーゼが抑制され、これによりcAMPの加水分解が低減してcAMP濃度が上昇するとも考えられる(16)。
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ギャップ結合及びコネクシンの詳細な構造
ギャップ結合ならびにコネクシンの詳細な構造を図6及び7に示した。コネクシン37、40及び43のアミノ酸配列のリストを各図に示したようにヒト及び他の生物種について図8、9及び10に示した。
ギャップ結合ならびにコネクシンの詳細な構造を図6及び7に示した。コネクシン37、40及び43のアミノ酸配列のリストを各図に示したようにヒト及び他の生物種について図8、9及び10に示した。
Claims (16)
- 内皮由来過分極因子(EDHF)の調節に対して応答性を有する、ヒトなどの動物における状態、疾患、障害の治療または予防処置に有効な医薬組成物の製造におけるcAMP、またはアデニル酸シクラーゼ活性化剤、またはcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤、または薬学的に許容されるこれらの誘導体または塩の用途。
- ヒトなどの動物の体内または体表の所定表面と接触させることによって前記動物の体内または体表に投与される医薬組成物であって、治療物質または複数の治療物質の組み合わせと、cAMPまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはcAMP ホスホジエステラーゼ阻害剤とからなり、該組成物が前記表面と接触する際に、前記cAMPまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤またはcAMP ホスホジエステラーゼ阻害剤によって、1以上の細胞間ギャップ結合を介した、隣接する細胞組織内への前記表面を通じた前記物質の移送が開始もしくは促進されることを特徴とする医薬組成物。
- ヒトなどの動物の体内または体表の所定表面と接触させることによって前記動物の体内もしくは体表に投与される医薬組成物であって、治療物質を細胞膜透過性とするように設計された部分に結合もしくは接合した治療物質を含み、該組成物が前記表面と接触する際に、細胞内への細胞膜を通じた前記治療物質の移送を前記部分が開始もしくは促進し、細胞内で前記部分は前記物質から切断されることによって該物質が1以上の細胞間ギャップ結合を介して隣接する細胞組織中に移動可能となる医薬組成物。
- 前記アデニル酸シクラーゼ活性化剤は外因性または合成されたものである請求項1に記載の用途または請求項2または3に記載の医薬組成物。
- 前記アデニル酸シクラーゼ活性化剤はサルブタモールである請求項4に記載の用途または医薬組成物。
- 前記cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤は外因性または合成されたものである請求項1乃至5のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記阻害剤は以下の阻害剤すなわちIBMX、ロリプラムまたはミルリノンのいずれか1以上である請求項6に記載の用途または医薬組成物。
- 前記cAMPは外因性または合成されたものである請求項1乃至7のいずれかに記載の用途または医薬組成物。
- 前記医薬組成物は抗ウイルス剤を含む請求項1乃至8のいずれかに記載の用途または医薬組成物。
- 前記抗ウイルス剤は親油性または疎水性である請求項9に記載の用途または医薬組成物。
- 前記抗ウイルス剤は、以下の抗ウイルス剤すなわち、ジデオキシアデノシン、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、ガンシクロビル、フォスカルネット、シドフォビル、ロデノシン、アシクロビルのいずれか1以上である請求項9または10に記載の用途または医薬組成物。
- 前記状態は、血管系、または免疫系、または心臓系、または肝臓、または膵臓、または神経系、または呼吸器系、または泌尿生殖器系、または皮膚、または脳、または新生物の疾患または障害を含む請求項1乃至11のいずれかに記載の用途または医薬組成物。
- 前記状態は微小血管系の疾患である請求項12に記載の用途または医薬組成物。
- 細胞間ギャップ結合連絡の阻害または減衰に対する応答性を有する、ヒトなどの動物の状態、疾患または障害の治療または予防措置において有効な医薬組成物の製造における、1以上のコネクシンタンパク質の各部分と相同な1以上の合成ペプチドであって細胞間ギャップ結合を阻害または減衰させるうえで有効な合成ペプチドの用途。
- ヒトなどの動物の体の選択された領域または臓器の血管を構成する細胞内部のギャップ結合の連絡を選択的に阻害して、可逆的にその弛緩を阻害することによって体内の他の部位における血流を促進する1以上の合成ペプチドからなる医薬組成物。
- 以下のペプチドすなわち、
VCYDQAFPISHIR
VCYDKSFPISHVR
SRPTEKTIFII
SRPTEKNVFIV
RVDCFLSRPTEK
PVNCYVSRPTEK
IVDCYVSRPTEK
SRPTEKT
のいずれか1以上を前記合成ペプチドは含む請求項14に記載の用途または請求項15に記載の医薬組成物。
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