WO2007088712A1 - 神経細胞の細胞死阻害剤及びスクリーニング方法 - Google Patents

神経細胞の細胞死阻害剤及びスクリーニング方法 Download PDF

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microglia
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Hideyuki Takeuchi
Akio Suzumura
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • Neuronal cell death inhibitor and screening method are provided.
  • the present invention relates to a cell death inhibitor capable of suppressing or avoiding neuronal cell death caused by glutamic acid.
  • the present inventors considered that it is difficult to obtain the intended effect due to the non-specificity of inhibitors targeting glutamate receptors and activated microglia.
  • a drug that specifically suppresses neuropathic microglia or an agent that can suppress the production and release of excess glutamate neuronal cell death is suppressed. It came to think that it can be controlled. So far, details of the mechanism of glutamate production and release from microglia have not been clarified. There are no known drugs that attempt to suppress cell death by inhibiting the production or release of glutamate.
  • an object of the present invention is to provide a drug that suppresses or avoids neuronal cell death caused by glutamic acid, and a method for screening the drug.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a drug that suppresses the production and release of neuropathic activated microglia or glutamic acid.
  • the inventors of the present invention are not limited to conventional viewpoints such as inhibition of N-methyl-D-aspartate-type glutamate receptor (NMDA receptor) or inhibition of all activated microdalias, but production of glutamate in microdalias Focusing on the release mechanism, various studies were conducted on factors related to the amount of glutamic acid released by microglia. At the same time, various studies were conducted on the relationship between glutamate release, neurite bead degeneration, and neuronal cell death. As a result, by inhibiting the production and Z or release of microglia, that is, inhibition of dullaminase in microglia, inhibition of gap junctions, and inhibition of microglia activation by tumor necrosis factor (TNF-s), etc.
  • TNF-s tumor necrosis factor
  • the present inventors have found that the production of glutamic acid can be suppressed or released, and that neurite bead-like degeneration and neuronal cell death are effectively suppressed, and the present invention has been completed. That is, according to the present invention, the following means are provided.
  • a neuronal cell death inhibitor comprising a compound having an inhibitory activity that inhibits the production and Z or release of glutamate in microglia.
  • the compound has an activity of inhibiting the production and Z or release of glutamic acid in activated microglia.
  • the compound can be a dartaminase inhibitor, for example, (S) -2-amino-6-diazo-5-oxocabronic acid or a salt thereof.
  • the compound can be a gap junction inhibitor, for example, rubenoxolone disodium.
  • the compound can be a tumor necrosis factor inhibitor or a tumor necrosis factor receptor inhibitor. Specifically, it is a TNF_Qf inhibitor or a TNFR inhibitor.
  • the tumor necrosis factor inhibitor includes an anti-TNF-Of antibody or a soluble TNF_Qf receptor, and tumor necrosis factor receptor inhibition.
  • Agents include anti-TNFR 1 receptor antibodies and TNF-Q?
  • Such a compound preferably has an inhibitory activity to inhibit glutamic acid production and Z or release in activated microglia within a range that maintains the amount of glutamic acid produced when microdaria is inactivated.
  • the cell death inhibitor of the present invention can be a cell death inhibitor caused by excitatory neuropathy caused by glutamic acid.
  • the cell death inhibitor of the present invention is preferably a prophylactic or therapeutic agent for nervous system diseases, and the nervous system disease is selected from ischemic disorders, inflammatory neurological diseases, and neurodegenerative diseases. Can do.
  • the ischemic injury include stroke, cerebral hemorrhage, cerebral infarction and cerebrovascular dementia.
  • the inflammatory neurological disease include encephalitis sequelae, acute disseminated encephalomyelitis, bacterial meningitis, tuberculous myelitis. Meningitis, fungal meningitis, viral meningitis and vaccine meningitis.
  • the neurodegenerative disease can be selected from Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, multiple system atrophy, and multiple sclerosis.
  • compositions for preventing or treating a disease associated with neuronal cell death comprising the cell death inhibitor according to any of the above, and a pharmaceutically acceptable formulation component.
  • a composition is provided.
  • a screening method for a neuronal cell death inhibitor which evaluates the effect of a neuronal cell death inhibitor using as an index the action of a test compound on glutamate production and release pathway in microglia.
  • a screening method is provided. This screening method is used for the prevention and treatment of nervous system diseases. It can be used as a screening method for agents.
  • the action is preferably an action of inhibiting the production or release of glutamic acid of the test compound with respect to activated microdales.
  • the action can be a dalutaminase inhibitory action of the test compound, a Gap function inhibitory action of the test compound on microdaria, or an inhibitory action of microdalia activation of the test compound on microdalia. Any of these may have an inhibitory action, preferably a dalutaminase inhibitory action, and a gap junction inhibitory action.
  • This screening method comprises the steps of supplying a test compound to activated microglia in the presence of glutamine, obtaining the indicator regarding the microglia, and comparing the indicator when the test compound is not supplied. A step of determining that the test compound has a neuronal cell death inhibitory activity when the neuronal cell death inhibitory activity is significantly changed to an affirmative level.
  • this screening method further includes the following (a) to (a) to (b) in nerve cells in the presence of activated microglia or a culture supernatant thereof and a test compound.
  • the effect of a neuronal cell death inhibitor may be evaluated using the action of the test compound on one or more selected from the above as an index.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of glutamate production ⁇ release pathway and its inhibition method.
  • FIG. 2 is a graph showing the number (%) of neurite-beaded degeneration-positive neurons in neurons cultured with microdaria culture supernatant activated by various cytokines.
  • the white bar indicates the group that stimulated the site force in directly to the nerve cells (direct stimulation group), and the black bar represents the microdari activated by the site force in.
  • the group in which the culture supernatant was administered to the nerve cells (indirect stimulation group) is shown (*, p, 0.05 vs. control, **, p ⁇ 0.01 vs. control, ⁇ , p ⁇ 0.001 vs.
  • LPS polysaccharide
  • TNF-stimulated microglia culture supernatants TNF-stimulated lipo Nerve cells cultured in polysaccharide (LPS) or TNF-stimulated microglia culture supernatants
  • FIG. 3 is a graph showing the number of dead cells (%) of neurons cultured with microdaria culture supernatant activated by various cytokines and the like.
  • FIG. 4 is a diagram showing a phase contrast microscopic image, a is unstimulated microglia, b is LPS-stimulated microglia, c is TNF-stimulated microglia, d is a neuron cell administered with unstimulated microglia culture supernatant, e represents a nerve cell administered with LPS-stimulated microglia culture supernatant, and f represents a neuron cell administered with TNF_Qf-stimulated microglia culture supernatant (scale bar is 10 m).
  • FIG. 5 is a graph showing the measurement results of glutamate concentration in a neuronal culture medium cultured with the culture supernatant of microdaria activated by various cytokines and the like.
  • the white bar shows the group that stimulated the site force in directly to the nerve cells (direct stimulation group)
  • the black bar shows the group that administered the microglia culture supernatant stimulated with the site force in to the nerve cells (indirect stimulation group).
  • LPS lipopolysaccharide
  • FIG. 6 is a graph showing the measurement results of intracellular ATP concentration of neurons cultured with the culture supernatant of microdaria activated by various cytokines and the like.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of MTS assay of nerve cells cultured with the culture supernatant of microdaria activated by various cytokines.
  • FIG. 8 Nerve cells cultured with activated microdaria culture supernatant and various antibodies. It is a graph showing the measurement results of glutamate concentration in the cyst medium (*, p 0.05 0.05 vs control, **, p ⁇ 0.01 vs control, ⁇ , p ⁇ 0.05 vs lipopolysaccharide (L PS) or TN F_Qf stimulated microglia culture) Neurons cultured in supernatant These data were analyzed by one-way analysis of variance and Tukey-Kramer boss “Hocktest” Each bar represents the mean and standard deviation of 6 independent individual data Hereinafter, it is the same in FIG. 9 and FIG.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of counting the number of neurite bead-like degeneration cells in neurons cultured with activated microdaria culture supernatant and various antibodies.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of counting the number of dead cells of neurons cultured with activated microdaria culture supernatant and various antibodies.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of measurement of glutamate concentration in nerve cell culture medium cultured with activated microglia culture supernatant and various drugs (*, P ⁇ 0.05, control vs. ⁇ , p ⁇ 0.05) Nerve cells cultured in lipopolysaccharide (LPS) or TN F_stimulated microglia culture supernatants These data were analyzed by one-way analysis of variance and Tukey-Kramer boss Hocktests. This is expressed as the mean and standard deviation of individual individual data, which is the same in Figures 12 and 13 below.
  • FIG. 12 is a graph showing the measurement results of the number of neurite bead-shaped degeneration-positive cells of neurons cultured with activated microglia culture supernatant and various drugs.
  • FIG. 13 is a graph showing measurement results of the number of dead cells of neurons cultured with activated microglia culture supernatant and various drugs.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of analysis by a flow cytometer of cell surface expression of connexin-1 32 (C X 32), which is a major component of gap junctions in activated microglia.
  • FIG. 15 Effects of carbenoxolone (CBX), a gap junction inhibitor, and 6_diazo_5_oxo1L-norleucine (DON), a dalataminease inhibitor, on delayed neuronal death due to ischemia
  • CBX carbenoxolone
  • DON 6_diazo_5_oxo1L-norleucine
  • FIG. A to H A microscopic image (scale bar: 1 OO zm) of the gerbil hippocampus CA 1 region is shown.
  • A is normal group
  • B is PBS-treated ischemia group
  • C is CBXO.
  • CBX 1 Z100 2 mgZ body weight kg ischemia group
  • D is CBX 2 mgZ body weight kg ischemia group (CBX 1 Z10)
  • E is CBX 20 ⁇ 1 g body weight ischemic group (CBX 1)
  • F is DON 0. 016 £ 1 g body weight ischemic group (DON 1 Z100)
  • G is DON 0.16 £ 1 g body weight ischemic group (DON 1Z10)
  • H indicate the ischemia group (DON 1) administered with D ON 1.6 mgZ body weight kg.
  • FIG. 16 is a graph comparing the number of remaining neurons per 100 Zm in the gerbil hippocampal CA 1 region of A to H in FIG. *, p ⁇ 0.001 vs. PBS, ⁇ , p ⁇ 0.001 ⁇ These data were analyzed by one-way analysis of variance and Tukey-Kramer post-hoc test. Each bar represents the mean and standard deviation of three independent individual data.
  • FIG. 17 shows the effects of carbenoxolone (CBX) and 6_diazo_5_oxo1L-norleucine (DON) on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).
  • CBX carbenoxolone
  • DON 6_diazo_5_oxo1L-norleucine
  • A is a graph showing the course of EA clinical score in the CBX administration group
  • B is a graph showing the course of AE clinical score in the DON administration group.
  • FIG. 18 is a graph showing the onset of each administration group obtained from the course of E A E clinical scores shown in A and B of FIG.
  • FIG. 19 is a graph showing the number of days of severe epilepsy (clinical score of 4 or more) in each administration group obtained from the course of EA clinical score shown in A and B of FIG.
  • FIG. 20 is a graph showing the most severe score of each administration group obtained from the course of the EA clinical score shown in A and B of FIG. *, P 0.05 vs PBS administration group. These data were analyzed by one-way analysis of variance and Tukey-Kramer boss “Hocktest”. Each bar represents the mean and standard deviation of 5 independent individual data.
  • the present invention inhibits the production and Z or release of glutamate in microglia.
  • the present invention relates to a neuronal cell death inhibitor comprising a compound having a harmful inhibitory activity.
  • the inventors of the present invention have found that the increase in the number of dead cells by the culture supernatant of microglia activated by TNF-s increases the amount of glutamate released from the activated microglia as well as the mitochondrial damage of nerve cells.
  • TNF neutralizing antibody and TNF receptor neutralizing antibody suppress the amount of glutamate released by microglia and the number of dead cells of nerve cells, glutamine deficiency in the medium, glutaminase inhibitor and It has been found that the amount of glutamic acid released and the number of cell deaths of activated microdaria are suppressed by a gap junction inhibitor. Furthermore, in the microglia activated by TNF-Q? Etc., there is also a finding that the exposure of the gap is increased by expressing a lot of gaps and increasing migration and diluting cell-cell adhesion. It has gained.
  • the cell death inhibitor of the present invention contains a compound having an inhibitory activity that inhibits glutamate production and Z or release in Microdaria (hereinafter simply referred to as a glutamate release inhibitor).
  • Neuronal cell death in the present invention includes both necrosis and apoptosis.
  • Necrosis means death that occurs in a group of cells in a pathological state such as ischemia, and includes destruction of cells and autolysis due to various external factors.
  • apoptosis is the activation of a mechanism by which cells spontaneously kill themselves due to various causes, such as when cells turn over in healthy animal tissues and when unnecessary cells are removed during the development of various organs. It means a state of dying.
  • the glutamate release inhibitor in the present invention is preferably one that can inhibit the production and Z or release of glutamate in activated microglia, and the compound of such an embodiment is at least a daltinase inhibitor And gap junction inhibitors and microglia activation inhibitors. According to these glutamate release inhibitors, glutamate production and Z or release in activated microglia can be inhibited within a range that maintains the amount of glutamate produced when microglia is inactivated.
  • the cell death inhibitor of the present invention may contain one or more of these various glutamate release inhibitors.
  • the glutaminase inhibitor may be a compound that inhibits glutaminase, which is an enzyme that generates glutamic acid from glutamine.
  • the mode of inhibition is not particularly limited.
  • the dalutaminase inhibitor is not particularly limited, and a known glutaminase inhibitor can be used.
  • 6-diazo-5-oxo-L-norleucine ((S) -2-amino-6-diazo-5-oxoproic acid or a salt thereof (DON)
  • JP-A-7-1 8 8 1 8 1 The imidazole derivative of a certain kind described in No. etc. is mentioned.
  • Dal A taminase inhibitor is preferable as the glutamate release inhibitor of the present invention because it can suppress the production of excess glutamate in activated microglia.
  • the gearup binding inhibitor may be a compound that inhibits cell-to-cell communication such as migration and exchange of low-molecular-weight compounds through the pores of the gearup binding channel.
  • a known gap bond inhibitor can be used.
  • various fatty acid primary amide compounds such as oleamide and arachidonamide, certain oleamide agonis (for example, JP 2001-523695), salts such as carbenoxolone or carbenoxolone disodium, 1 8 -Daricylic acid or its salt, 1 2-0-tetradecanol fopol
  • TPA 1 3-acetate
  • connexin 40 such as 43 GAP27 peptide (SRPTEKT IFII), 4 ° GAP27 peptide (SRPTEKNVF IV), 43 agonis ⁇ , certain c AM P and Z or c AM described in JP-T 2005-509621 P phosphodiesterase inhibitors, and certain glycosaminodarlicans described in JP-A No. 2004-21 7594 are also included.
  • a gap junction inhibitor is preferable as the glutamate release inhibitor of the present invention because it can suppress the release of daltamic acid during the production of excess glutamate in activated microglia.
  • a compound that suppresses stimulation transmission by cytokines that activate glutamate production and release by microdalia is preferable.
  • a receptor inhibitor that inhibits the binding of TN F—Q? At this receptor can be mentioned.
  • Such inhibitors include compounds that inhibit the binding of TN F_Of to the receptor, targeting the TN F —H or TNF—Q? Type 1 receptor (TN FR 1).
  • TNF such as QY and antagonis
  • These inhibitors can inhibit not only microglia activation by TNF-spider but also LPS activation.
  • These various glutamate release inhibitors can be converted into various salt forms as necessary depending on the acidic group or basic group form of the compound.
  • a salt form can be constituted using hydrochloric acid or a base usually used in the pharmaceutical field or the like.
  • the cell death inhibitor of the present invention includes a glutamate production release inhibitor, it is preferably used as a cell death inhibitor due to excitatory neuropathy caused by glutamate. Further, it is preferably used as a prophylactic / therapeutic agent for nervous system diseases of non-human animals such as humans and domestic animals, which are related to neuronal cell death due to such excitatory neuropathy. Examples of the nervous system disease include ischemic injury, inflammatory neurological disease, and neurodegenerative disease.
  • Examples of the ischemic injury include stroke, cerebral hemorrhage, cerebral infarction and cerebrovascular dementia.
  • inflammatory neurological diseases include encephalitis sequelae, acute disseminated encephalomyelitis, bacterial meningitis, tuberculous meningitis, fungal meningitis, viral meningitis, vaccine meningitis, etc.
  • Examples include inflammatory neurological diseases of the central nervous system.
  • neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease, head trauma, cerebral palsy, Huntington's disease, Pick's disease, Down's syndrome, Parkinson's disease, AIDS encephalopathy, multiple system atrophy, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis , Spinocerebellar ataxia and the like.
  • the cell death inhibitor of the present invention when used as a prophylactic / therapeutic agent for the above nervous system diseases associated with neuronal cell death in rabbits and non-human rabbits, it can be used as such or as appropriate. It can be mixed with pharmaceutically acceptable pharmaceutical ingredients such as excipients, diluents, etc. to form a composition (formulation) such as a tablet, capsule, granule, powder or syrup. That is, the inhibitor of nerve cell death of the present invention is effective A composition for preventing / treating a nervous system disease as a component is provided.
  • the present composition can contain a pharmaceutically acceptable formulation component in addition to the active ingredient depending on the formulation form to be obtained.
  • the preventive and therapeutic composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • excipients eg, sugar derivatives such as lactose, sucrose, sucrose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, Of starch, dextrin; cellulose such as crystalline cellulose. Derivatives; gum arabic; dextran; organic modifiers such as pullulan: and silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate, meta magnesium aluminate; calcium hydrogen phosphate, etc.
  • excipients eg, sugar derivatives such as lactose, sucrose, sucrose, mannitol, sorbitol
  • starch derivatives such as corn starch, potato starch, Of starch, dextrin
  • cellulose such as crystalline cellulose. Derivatives
  • gum arabic dextran
  • organic modifiers such as pullulan
  • silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate, meta magnesium
  • Inorganic fillers such as phosphates; carbonates such as calcium carbonates; sulfates such as calcium sulfates), lubricants (eg stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate) Metal stearates such as talc, colloidal Lika; Bigam, Gays, etc .; Boric acid; Adipic acid; Sulfate such as sodium sulfate; Glycol; Fumaric acid; Sodium benzoate; DL leucine; Fatty acid sodium salt; Sodium lauryl sulfate, Magnesium lauryl sulfate And silicates such as silicic anhydride and silicic acid hydrate; and the above-mentioned starch derivatives.), Binders (for example, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone) , Macrogol, and the same compounds as the above-mentioned excipients.), Disintegrating agents (for example
  • the amount used varies depending on symptoms, age, etc., and is determined as appropriate.
  • the lower limit of 1 mg per dose is 0.1 mg (preferably 1 mg)
  • the upper limit is 1 000 mg (preferably 500 mg)
  • 1 dose per dose ⁇
  • Lower limit 0.0 1 mg (preferably 0.1 mg) and upper limit 500 mg (preferably 200 mg) can be administered to adults in one or several divided doses per day according to symptoms it can.
  • the screening method for a neuronal cell death inhibitor evaluates the effect of a neuronal cell death inhibitor using as an index the action of a test compound on glutamate production and release pathway in microglia. As already explained, it has been found that neuronal cell death can be effectively inhibited by glutamate release inhibitors. According to the screening method of the present invention, various effects intended by a glutamate release inhibitor can be used as an index, and as a result, the effect as a cell death inhibitor can be evaluated.
  • the action serving as an index of the effect as a cell death inhibitor includes the action of inhibiting the production or release of glutamic acid of the test compound against activated microglia, and specifically, the test compound, dalutaminase. Inhibitory action, Gap function inhibitory action of test compound on microglia, and inhibitory action of microglia activation of test compound on microglia.
  • Daltaminase inhibitory action can be obtained, for example, by measuring the concentration of glutamic acid released into the culture supernatant of microdaria when the test compound is supplied to activated microglia.
  • the glutamic acid concentration in the culture supernatant can be measured by a known glutamic acid colorimetric method, a sensor or the like.
  • the test compound is not particularly limited, and an analog of a known glutaminase inhibitor can be used.
  • test compound when the test compound is supplied to activated microglia, the glutamic acid concentration in the culture supernatant is measured, or the amount of connexin that is a constituent protein of gap junction in microglia is measured. It can be obtained by measuring with a flow cytometer.
  • the test compound is not particularly limited, but an analog of a known gap junction inhibitor can be used.
  • Inhibition of microdaria activation is based on the observation of the morphology of the microdaria when the test compound is supplied to the activated microdaria (observation of the degree of activation of the microdalia) and the supply of the test compound to the activated microglia. It can be obtained by measuring the concentration of glutamic acid in the culture supernatant.
  • the test compound is not particularly limited, and analogs such as a known TNF-Q? Antagonist, anti-TNF-Q? Antibody, and soluble TNF receptor can be used.
  • a test compound is supplied to activated microglia in the presence of glutamine in the medium, and any one or two or more of the above-mentioned indicators concerning microglia are obtained. . Then, it can be determined that the test compound has a neuronal cell death inhibitory activity when the obtained index changes significantly to the extent that the neuronal cell death inhibitory activity can be affirmed as compared to when the test compound is not supplied. For example, when a significant decrease in glutamic acid concentration in the microglia culture supernatant and a significant decrease in the degree of microdaria activation by morphological observation are obtained, it can be determined that the test compound has neuronal cell death inhibitory activity.
  • the action of a test compound relating to nerve cells obtained via microglia may be used as an indicator.
  • the neuronal cells in the neuronal cells in the presence of the activated culture supernatant supplied with the test compound or the neuronal cell death in the neuronal cells co-cultured with such microglia are used as an index.
  • the effects of death inhibitors can be evaluated. Ie, get It can be determined that the test compound has a neuronal cell death inhibitory activity when the indicator changes significantly to the extent that the neuronal cell death inhibitory activity can be affirmed as compared to when the test compound is not supplied.
  • Indicators of the effect as a cell death inhibitor in nerve cells include nerve cell damage such as neurite bead degeneration, cell death, intracellular ATP concentration and mitochondrial damage. One or more of these may be combined as an indicator.
  • Neurite bead degeneration is an early sign of cell death caused by activated microglia and is mediated by the N-methyl-D-aspartate glutamate receptor (NMDA receptor) (H Takeuchi et al., J.
  • the nerve cells may be observed under a microscope or a phase contrast microscope, and the number of positive cells showing neurite bead-like degeneration or the ratio to the total number of cells may be obtained. For example, when the neurite bead-shaped denatured cells show a significant increase due to microglia activated by the test compound, it can be determined that the test compound has neuronal cell death inhibitory activity.
  • Cell death can be measured by a conventionally known method. For example, observation under a microscope and various staining methods, for example, a method of staining dead cells using iodide iodide, I NST (in situ nick trans I at ion) method, TU N EL (terminal
  • the deoxynuc iot i dy I transferase-mediated UTP end labeling) method can be used as appropriate. For example, when the number of dead cells of a neuron is significantly increased by a microdari activated by the test compound, it can be determined that the test compound has a neuronal cell death inhibitory activity.
  • the concentration of ATP in the nerve cell is, for example, AposSENSOR Cel I Viabi Iity Assay Kit (Bio
  • Mitochondrial damage is proportional to mitochondrial membrane potential
  • M is a coloration method using oTracker Red CMXRos (Molecular Probes) or 3- (4,5-dimethy I th i azo I-2-y I) -5- (3-carboxymethoxy I pheny I) -2- (4- su I fopheny I) -2H-tetrazo I i urn (MTS) staining method
  • Etc. can be used. For example, when a microglia activated by a test compound shows a significant decrease in ATP concentration or a significant increase in mitochondrial damage level in nerve cells, it can be determined that the test compound has neuronal cell death inhibitory activity. .
  • the screening method of the present invention screens a neuronal cell death inhibitor, and is a particularly preferable method for screening a prophylactic / therapeutic agent for a nervous system disease. It is possible to screen for preventive and therapeutic agents, in particular, prophylactic / therapeutic agents for nervous system diseases that are highly selective for neuropathic microglia.
  • Example 1 Induction of neurite bead-like degeneration and neuronal cell death through microglial activation by cytoforce in
  • neurite bead degeneration and neuronal cell death were observed in neurons when microglia culture supernatants administered with various cytokines were administered to neuronal cells.
  • the experimental method was as follows.
  • Mouse primary cultured microglia were isolated from primary mixed glial cells prepared from the newborn cerebrum of C57 BLZ6 mice.
  • L PS, I L_ 1 S, I L_6, I L_ 10, IF N_r and TN F-Ol are added to the microglia culture solution (about 5 X 10 4 ce II s / we I
  • LPS was added to 1 g Zm I
  • other cytokines were added to 100 ng Zm I, and the humidity was 100%. Incubation was carried out for 24 hours at 37 ° C under 5% CO 2. Microglia were cultured in the same manner except that no cyto-in was added as a control.
  • L PS is 1 gZm
  • other cytokines are 100 n gZm I-containing neuronal medium 500 I, and neurons in a 24-well plate (5x l 0 4 cel I sZwe l I).
  • only 500 I medium was administered to nerve cells in the same manner as a direct stimulation group control.
  • Neuronal cells prepared in this way were cultured in 100% humidity and 5% C0 2 under 37 ° C.
  • the number of neurite bead-shaped degeneration-positive cells and the number of dead cells were counted for the neurons in each well.
  • the number of neurite bead-like degeneration-positive cells was measured by using a phase contrast microscope to measure the ratio of the number of neurite bead-like degeneration positive cells in all neurons.
  • the measurement for two nerve cells where each culture supernatant was administered was repeated three times.
  • a dye exclusion method using propidium iodide (PI) was used for the number of dead cells.
  • the cells were cultured in a medium containing 2mgZm IPI for 15 minutes at 37 ° C, and fluorescence characteristic of dead cells was observed with a fluorescence microscope. And the number of dead cells was counted.
  • the number of dead cells is the terminal deoxynuc I eot i dy I transf erase-med i ated UTP end I abe I i ng
  • the number of neurite bead-shaped degeneration-positive cells and the number of dead cells were measured three times for two nerve cell wells administered with the same culture supernatant.
  • the dead cell rate is the ratio of the number of dead cells to the total number of cells.
  • Fig. 2 shows the results of measurement of neurite bead-shaped degeneration-positive cells
  • Fig. 3 shows the number of cell death.
  • Fig. 4 shows phase contrast microscopic images of various microglia at the time of administration to the nerve cells and the nerve cells at the time of measurement of the number of cell deaths.
  • neurons treated with LPS and TNF-linked microglia showed almost 100% neurite bead-shaped degeneration-positive cell ratio (%), compared to the control. Significantly decreased (p ⁇ 0. 01) did.
  • degeneration was remarkably suppressed in the presence of MK801, an NMD A receptor antagonist.
  • the other indirect administration groups and all direct administration groups had positive rates almost the same as the controls.
  • the same tendency as the neurite bead-like degeneration-positive cell rate was observed in the neuronal cell death rate (p ⁇ 0.01 vs. control).
  • the microglia to which LPS and TN F_Qf (Figs. 4 (b) and (c)) were added was larger than the unstimulated microglia (Fig. 4 (a)). It was in an amoeba-like form, active in migration, and very activated.
  • nerve cells (Fig. 4 (e) and (f)) to which LPS and TN F_stimulated microglia culture supernatants were administered were treated with neurons to which unstimulated microglia culture supernatant was administered (Fig. 4 (d Many beads were observed compared to)). TUNEL-positive cells were not observed, confirming that cell death was not due to apoptosis.
  • Example 2 Increase in glutamate release amount through activation of various cytokines, increase in intracellular ATP concentration, induction of increase in mitochondrial damage
  • microglia administered with various cytokines The amount of glutamate released, the intracellular ATP concentration in the neuron when the culture supernatant was administered to the neuron, and mitochondrial damage were measured.
  • the experimental method was the same as in Example 1, except that microglia preparation, nerve cell preparation, microglia activation and nerve cell stimulation transmission (except for the absence of MK801) were used for evaluation. The following method was used.
  • the glutamic acid concentration released in the medium in each well was measured.
  • the glutamic acid was quantified by measuring the absorbance at 600 nm using a glutamic acid measurement kit (Yamasa Soy Sauce Co., Ltd.) and following the protocol, using a multiplate reader. The measurement was repeated 6 times. The results are shown in FIG.
  • glutamate was significantly increased only in nerve cells containing the culture supernatant of LPS or TNF-activated microglia (p ⁇ 0.01 vs LPS or TNF-s).
  • the nerve cells cultured in the activated microdaria culture supernatant were high in concentration. This was considered to reflect the glutamic acid concentration contained in the activated microglia culture supernatant. That is, it was considered that glutamic acid production and release by microglia activated by LPS or the like was promoted, resulting in an increase in glutamic acid concentration in the culture supernatant, which was reflected in the nerve cell culture medium.
  • the intracellular ATP concentration of neurons was significantly (p ⁇ 0) only in neurons that received culture supernatant of LPS or TNF-activated microglia.
  • the degree of mitochondrial damage was significantly increased only in nerve cells to which LPS or TNF-activated microdiarrhea culture supernatant was administered (p ⁇ 0.001 vs. LPS). Or, nerve cells cultured in TNF_ activated microdialysis culture supernatant).
  • Example 3 Inhibition of dartamic acid release by TN F_Qf neutralizing antibody and TN F_o type receptor neutralizing antibody
  • the prepared various types of neurons were cultured for 24 hours, and the glutamate concentration, the number of neurite bead-shaped degeneration-positive cells and the number of dead cells were measured for the neurons in each well.
  • Glutamate was quantified in the same manner as in Example 2, and the number of neurite bead-like degeneration-positive cells and dead cells was measured in the same manner as in Example 1.
  • the results for glutamic acid are shown in FIG. 8, the results for neurite bead degeneration are shown in FIG. 9, and the results for cell death are shown in FIG.
  • Example 4 Inhibition of glutamic acid production induced by TNF-Qf by glutamine removal from media, glutaminase inhibitor and gap binding inhibitor
  • activated microglia and various Glutamate release from microglia when a drug was applied to nerve cells was measured, and neurite bead-like degeneration and cell death were observed.
  • the experimental method was the same as in Example 1 for the preparation of microglia and the preparation of nerve cells, and the others were as follows.
  • microdaria broth (about 5 X 10 4 ce
  • Nerve cell culture medium (Sumitomo Beichi Cryo Co., Ltd.)) at a final concentration of 1 ⁇ gZm I 1_ ⁇ 5 or 100 n gZm I TN F_Q? It was performed for 24 hours at% and 5% C0 2 under 37 ° C. As a control, microdaria was cultured in the same manner except that no cytodynamic force was added.
  • nerve cells (GI n -free) containing activated microglia culture supernatant but not containing glutamine in the medium were also prepared.
  • the nerve cells administered with the TNF_diamond-activated microglia culture supernatant alone and the neurons administered with the non-activated microglia culture supernatant were used as TNF and control, respectively.
  • the these neurons were cultured in humidity 1 100% and under 5% CO 2 37 ° C.
  • CBX gap junction inhibitor carbenoxolone disodium (CBX) 100 U M
  • the measuring method etc. used the method as described in Example 1 and Example 2.
  • the measurement result of glutamate concentration is shown in Fig. 11.
  • the measurement result of the number of neurodeveloping bead-modified cells is shown in Fig. 12.
  • the measurement result of the number of dead cells is shown in Fig. 13.
  • Fig. 11 cultured cells were cultured with activated glial cell culture supernatants and cultured with nerve cells and glutamine-free media that were cultured with gap junction inhibitor (CBX) and dartaminase inhibitor (DON).
  • the glutamate concentration of the neurons was similar to that of the control and significantly (p ⁇ 0. 05) less than the neurons without the drug (TN F).
  • TN F gap junction inhibitor
  • Fig. 12 and Fig. 13 a significant (p ⁇ 0. 05) inhibitory effect was confirmed on the number of positive cells and the number of dead cells in the nerve projection bead-like degeneration as well as the amount of glutamate. It was.
  • a delayed neuronal cell death model due to ischemia was constructed, and the effects of a gearup binding inhibitor and a dartaminase inhibitor on neuronal cell death were evaluated.
  • the following experiments were conducted with the approval of the Nagoya University Animal Experiment Committee. Note that the animal model in this example corresponds to a model of ischemic injury, which is a kind of neurological disease.
  • the gap junction inhibitor carbenoxolone (CBX) was administered in the following three groups. That is, the doses were 2 OmgZ body weight kg (CBX 1), 2 mgZ body weight g (CBX 1 Z1 0), and 0.2 £ body weight 1 g (CBX 1 Z1 00), and the administration method was intraperitoneal administration every other day from the day of ischemia. did. In addition, administration of glutaminase inhibitor 6_diazo_5_oxo-1L norleucine (DON) The following three groups were conducted.
  • the dosage is 1.6 mgZ body weight kg (DON 1), 0.16 £ body weight 1 g (DON 1/1 0), and 0.016 mgZ body weight kg (DON 1/100). From that day, intraperitoneal administration was performed every other day. As a control, an equal volume of phosphate buffered saline (PBS) was administered in the same manner.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the neuronal cell death inhibitor of the present invention is effective for the prevention and treatment of ischemic disorders such as cerebral hemorrhage and cerebral infarction and the aftereffects of ischemic disorders such as cerebral vascular dementia.
  • a myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) -induced experimental autoimmune performance myelitis (EAE) model was constructed, and the effects of gap junction inhibitors and glutaminase inhibitors in the EAE clinical course. Evaluated.
  • the following experiments were conducted with the approval of the Animal Research Committee of Nagoya University. Note that the animal model of this example corresponds to a model of inflammatory neurological disease that is a kind of neurological disease.
  • C57 BLZ6 J mice (Japan SLC) were used as experimental animals.
  • MOG 35 _ 55 peptide manufactured by Operon, Inc.
  • incomplete Freund command adjuvant Sigma
  • Mycobacterium tuberculosis dead bacteria H37 Ra Difco
  • one hundred ⁇ toxin List Co.
  • gap junction inhibitors The drug carbenoxolone (CBX) (Sigma) and the daltaminase inhibitor 6_diazo_5_oxo-norleucine (DON) (Sigma) were used.
  • MOG-induced EAE is described in Kato et al. (Kato, H., I to, A., Kawanokuch i, J., Jin, S., Mi zuno, T., Oj i ka, K., Ueda, R., Suzumura
  • PACAP Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide
  • Gap junction inhibitor carbenoxolone was administered in the following three groups. That is, the doses were 2 OmgZ body weight kg (CBX 1), 2 mgZ body weight g (CBX 1 Z1 0), and 0.2 £ body weight 1 g (CBX 1 Z1 00), and the administration method was intraperitoneal administration every other day from the first day of immunization. did. In addition, administration of glutaminase inhibitor 6_diazo_5_oxo-1L norleucine (DON) The following three groups were conducted.
  • the dosage is 1.6 mgZ body weight kg (DON 1), 0.16 £ 1 body weight 1 g (DON 1/1 0) and 0.016 mgZ body weight kg (DON 1/100). It was intraperitoneally administered every other day from the first day. As a control, an equal volume of phosphate buffered saline (PBS) was administered in the same manner. As a control, an equal amount of phosphate buffered saline (PBS) was administered in the same manner.
  • PBS phosphate buffered saline
  • mice were evaluated on a daily basis based on the following internationally used EAE clinical evaluation scores.
  • the clinical course of EA in each treatment group is shown in Fig. 17, and the results of the onset, the number of days of severe illness and the highest severity score are shown in Figs.

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Abstract

【課題】グルタミン酸による神経細胞死を抑制又は回避する薬剤を提供する。 【解決手段】ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生及び／又は放出を阻害する阻害活性を有する化合物を含有する神経細胞の細胞死阻害剤とする。ミクログリアの産生及び／又は放出を阻害することにより、神経突起ビーズ状変性や神経細胞死を抑制することができる。

Description

明 細 書
神経細胞の細胞死阻害剤及びスクリーニング方法
技術分野
[0001 ] 本発明は、 グルタミン酸による神経細胞死を抑制又は回避できる細胞死阻 害剤に関する。
背景技術
[0002] アルツハイマー病、 パーキンソン病、 筋萎縮性側索硬化症、 脊髄小脳変性 症、 多発性硬化症などに代表される神経変性疾患の予防及び治療について種 々の検討が行われてきている。 これら神経変性疾患の病態には、 活性化ミク 口ダリァ由来のグルタミン酸による興奮性神経障害機序も関与していること がわかってきている （B l ock et aに， Prog. Nuerob i o l . 76, 77-98 (2005) ) 。 こうしたことから、 グルタミン酸による神経細胞障害に着目して、 グルタ ミン酸受容体阻害剤が神経変性疾患の治療剤として使用が試みられている （P arsons et a l . , Neuropharmaco l ogy. 38, 735-767 (1999) ) 。 また、 ミクロ グリアの活性化抑制を意図した阻害剤治療も検討されている （Demercq et a l ■， Trends. Pharmaco l . Sc i . 25, 609-612 (2004) ) 。
発明の開示
[0003] しかしながら、 グルタミン酸受容体阻害剤は、 過剰な興奮毒性の抑制のみ ならず正常な生命活動に必須な神経伝導まで抑制してしまうことによる重篤 な副作用が報告されている。 また、 活性化ミクログリアの阻害剤は、 活性化 ミクロダリァ全体を抑制するが、 活性化ミクロダリァは神経障害のみならず 神経保護作用を有するものも存在するため、 こうした抑制では治療効果に乏 しいものとなるおそれがあった。
[0004] 本発明者らは、 グルタミン酸受容体や活性化ミクログリアをターゲットと する阻害剤では、 その非特異性ゆえに意図する効果を得ることは困難である と考えた。 さらに、 神経障害的ミクログリアを特異的に抑制する薬剤又は過 剰なグルタミン酸の産生■放出を抑制できる薬剤があれば、 神経細胞死を抑 制できると考えるに至った。 ここで、 現在までのところ、 ミクログリアから のグルタミン酸の産生■放出の機序の詳細は明らかになっていない。 グルタ ミン酸の産生や放出の阻害によって細胞死を抑制しょうとする薬剤は知られ ていない。
[0005] そこで、 本発明は、 グルタミン酸による神経細胞死を抑制又は回避する薬 剤ゃ該薬剤のスクリ一二ング方法を提供することを一つの目的とする。 また 、 本発明は、 神経障害的な活性化ミクログリア又はグルタミン酸の産生 -放 出を抑制する薬剤ゃ該薬剤のスクリ一二ング方法を提供することを他の一つ の目的とする。
[0006] 本発明者らは、 N -メチル - D-ァスパラギン酸型グルタミン酸受容体 （N M D A受容体） の阻害や活性化したミクロダリァ全体の阻害といった従来の着 眼点ではなく、 ミクロダリァにおけるグルタミン酸産生■放出機序に着目し 、 ミクログリアのグルタミン酸放出量に関連する要因について種々の検討を 行った。 また、 同時に、 グルタミン酸放出と神経突起ビーズ状変性と神経細 胞死との関連について種々の検討を行った。 その結果、 ミクログリアの産生 及び Z又は放出を阻害すること、 すなわち、 ミクログリアにおけるダルタミ ナーゼの阻害、 ギャップ結合の阻害、 及び腫瘍壊死因子 （T N F—ひ） 等に よるミクログリア活性化の阻害のいずれによっても、 グルタミン酸の産生の 抑制又はその放出量を低下させることができ、 かつ有効に神経突起ビーズ状 変性や神経細胞死を抑制することを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明によれば以下の手段が提供される。
[0007] 本発明によれば、 ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生及び Z又は放 出を阻害する阻害活性を有する化合物を含有する、 神経細胞の細胞死阻害剤 が提供される。
[0008] この細胞死阻害剤においては、 前記化合物は、 活性化ミクログリアにおけ るグルタミン酸の産生及び Z又は放出の阻害活性を有することが好ましい態 様である。 前記化合物は、 ダルタミナーゼ阻害剤とすることができ、 例えば 、 (S) -2-ァミノ -6-ジァゾ -5-ォキソカブロン酸又はその塩とすることができ る。
[0009] また、 前記化合物は、 ギャップ結合阻害剤とすることができ、 例えば、 力 ルべノキソロン 2ナトリウムとすることができる。
[0010] さらに、 前記化合物は、 腫瘍壊死因子阻害剤又は腫瘍壊死因子受容体阻害 剤とすることができる。 具体的には、 T N F _ Qf阻害剤又は T N F R阻害剤 であり、 例えば、 前記腫瘍壊死因子阻害剤は抗 T N F— Of抗体又は可溶性 T N F _ Qf受容体が挙げられ、 また、 腫瘍壊死因子受容体阻害剤としては、 抗 T N F R 1受容体抗体や T N F— Q?アンタゴニス卜が挙げられる。
[0011 ] こうした化合物は、 ミクロダリァの非活性化時におけるグルタミン酸産生 量を維持する範囲で活性化ミクログリアにおけるグルタミン酸産生及び Z又 は放出を阻害する阻害活性を有することが好ましい。
[0012] 本発明の細胞死阻害剤は、 グルタミン酸による興奮性神経障害による細胞 死阻害剤とすることができる。 また、 本発明の細胞死阻害剤は、 神経系疾患 の予防，治療剤であることが好ましい態様であり、 神経系疾患としては、 虚 血障害、 炎症性神経疾患及び神経変性疾患から選択することができる。 前記 虚血障害としては、 脳卒中、 脳出血、 脳梗塞及び脳血管性認知症が挙げられ 、 前記炎症性神経疾患としては、 脳炎後遺症、 急性散在性脳脊髄炎、 細菌性 髄膜炎、 結核性髄膜炎、 真菌性髄膜炎、 ウィルス性髄膜炎及びワクチン性髄 膜炎が挙げられる。 さらに、 前記神経変性疾患としては、 アルツハイマー病 、 パーキンソン病、 筋萎縮性側索硬化症、 脊髄小脳変性症、 多系統萎縮症及 び多発性硬化症から選択することができる。
[0013] 本発明によれば、 神経細胞死に関連する疾患の予防，治療用組成物であって 、 上記いずれかに記載の細胞死阻害剤と、 薬学的に許容される製剤成分と、 を含有する組成物が提供される。
[0014] 本発明によれば、 神経細胞の細胞死阻害剤のスクリーニング方法であって 、 ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生■放出経路に対する被験化合物 の作用を指標として神経細胞の細胞死阻害剤の効果を評価する、 スクリー二 ング方法が提供される。 本スクリーニング方法は、 神経系疾患の予防，治療 剤のスクリーニング方法とすることができる。
[0015] このスクリーニング方法において、 前記作用は、 活性化されたミクロダリ ァに対する前記被験化合物のグルタミン酸の産生又は放出の阻害作用とする ことが好ましい。 前記作用は、 前記被験化合物のダルタミナーゼ阻害作用、 ミクロダリァに対する前記被験化合物のギヤップ機能阻害作用、 ミクロダリ ァに対する前記被験化合物のミクロダリァ活性化の阻害作用とすることがで きる。 これらのうちいずれかの阻害作用を有していればよいが、 好ましくは 、 ダルタミナーゼ阻害作用であり、 また、 ギャップ結合阻害作用である。 こ のスクリーニング方法は、 グルタミンの存在下、 活性化されたミクログリア に被験化合物を供給する工程と、 前記ミクログリアに関して前記指標を取得 する工程と、 前記指標が前記被験化合物の非供給時に比較して前記神経細胞 死阻害活性を肯定できる程度に有意に変化したとき、 前記被験化合物が神経 細胞死阻害活性を有すると判定する工程と、 を備えることができる。
[0016] また、 このスクリーニング方法は、 さらに、 活性化されたミクログリア又 はその培養上清と被験化合物との存在下の神経細胞における以下の （a ) 〜
( d ) ：
( a ) 神経突起ビーズ状変性
( b ) 細胞死
( c ) 細胞内 A T P濃度
( d ) ミトコンドリア損傷
から選択される 1種又は 2種以上に対する被験化合物の作用を指標として神 経細胞の細胞死阻害剤の効果を評価するようにしてもよい。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1 ]グルタミン酸産生■放出経路とその阻害方法の概要を示す図である。
[図 2]各種のサイトカイン等によリ活性化されたミクロダリァ培養上清ととも に培養した神経細胞の神経突起ビーズ状変性陽性神経細胞数 （%) を示すダラ フである。 ただし、 白いバーは、 サイト力インを神経細胞へ直接刺激した群 (直接刺激群） を示し、 黒いバーは、 サイト力インで活性化したミクロダリ ァ培養上清を神経細胞へ投与した群 （間接刺激群） を示す （*, pく 0. 05対コ ントロール、 **, p〈 0. 01対コントロール、 †, p〈 0. 01対リポ多糖 （L P S ) 又は T N F _ひ刺激ミクログリア培養上清で培養した神経細胞。 これら のデータは、 一元配置分散解析及び Tukey-Kramerボス卜ホックテス卜によつ て解析された。 各バーは、 6個の独立した個別データの平均値及び標準偏差で 表す。 以下、 図 3において同じ。 ） 。
[図 3]各種のサイトカイン等によリ活性化されたミクロダリァ培養上清ととも に培養した神経細胞の死細胞数 （％) を示す図である。
[図 4]位相差顕微鏡像を示す図であり、 aは無刺激ミクログリア、 bは L P S 刺激ミクログリア、 cは T N F—ひ刺激ミクログリア、 dは無刺激ミクログ リァ培養上清を投与された神経細胞、 eは L P S刺激ミクログリァ培養上清 を投与された神経細胞、 f は T N F _ Qf刺激ミクログリア培養上清を投与さ れた神経細胞を示す （スケールバーは 1 0 mである。 ） 。
[図 5]各種のサイトカイン等によリ活性化されたミクロダリァの培養上清とと もに培養した神経細胞培地中のグルタミン酸濃度の測定結果を示すグラフで ある。 ただし、 白いバーは、 サイト力インを神経細胞へ直接刺激した群 （直 接刺激群） を示し、 黒いバーは、 サイト力イン刺激したミクログリア培養上 清を神経細胞へ投与した群 （間接刺激群） を示す （*, pく 0. 05対コントロー ル、 **, p〈 0. 01対コントロール、 †, p〈 0. 01対リポ多糖 （L P S ) 又は T N F _ Qf刺激ミクログリア培養上清で培養した神経細胞。 これらのデータ は、 一元配置分散解析及び Tukey-Kramerボス卜ホックテス卜によって解析さ れた。 各バーは、 6個の独立した個別データの平均値及び標準偏差で表す。 以 下、 図 6及び 7について同じ。 ） 。
[図 6]各種のサイトカイン等によリ活性化されたミクロダリァの培養上清とと もに培養した神経細胞の細胞内 ATP濃度の測定結果を示すグラフである。
[図 7]各種のサイトカイン等によリ活性化されたミクロダリァの培養上清とと もに培養した神経細胞の MTSアツセィの結果を示すグラフである。
[図 8]活性化されたミクロダリァ培養上清と各種抗体とともに培養した神経細 胞培地中のグルタミン酸濃度の測定結果を示すグラフである （*, pく 0.05対 コントロール、 **, p〈 0.01対コントロール、 †, p〈 0.05対リポ多糖 （L PS) 又は TN F_Qf刺激ミクログリア培養上清で培養した神経細胞。 これ らのデータは、 一元配置分散解析及び Tukey-Kramerボス卜ホックテス卜によ つて解析された。 各バーは、 6個の独立した個別データの平均値及び標準偏差 で表す。 以下、 図 9及び図 1 0において同じ） 。
[図 9]活性化されたミクロダリァ培養上清と各種抗体とともに培養した神経細 胞の神経突起ビーズ状変性陽性細胞数の計測結果を示すグラフである。
[図 10]活性化されたミクロダリァ培養上清と各種抗体とともに培養した神経 細胞の死細胞数の計測結果を示すグラフである。
[図 11 ]活性化されたミクログリァの培養上清と各種薬剤とともに培養された 神経細胞培地中のグルタミン酸濃度測定結果を示すグラフである （*, P < 0. 05対コントロール、 †, p〈 0.05対リポ多糖 （LPS) 又は TN F_ひ刺激 ミクログリア培養上清で培養した神経細胞。 これらのデータは、 一元配置分 散解析及び Tukey-Kramerボス卜ホックテス卜によって解析された。 各バーは 、 6個の独立した個別データの平均値及び標準偏差で表す。 以下図 1 2及び図 1 3において同じ。 ） 。
[図 12]活性化されたミクログリァの培養上清と各種薬剤とともに培養された 神経細胞の神経突起ビーズ状変性陽性細胞数の計測結果を示すグラフである
[図 13]活性化されたミクログリァの培養上清と各種薬剤とともに培養された 神経細胞の死細胞数の計測結果を示すグラフである。
[図 14]活性化ミクログリアにおけるギャップ結合の主要構成因子であるコネ キシン一32 (C X 32) の細胞表面発現のフローサイトメーターによる解 析結果を示す図である。
[図 15]虚血による遅発性神経細胞死に対するギャップ結合阻害剤であるカル べノキソロン （CBX) 及びダルタミナーゼ阻害剤である 6 _ジァゾ _ 5 _ ォキソ一L—ノルロイシン （DON) の効果を示す図である。 A〜Hは、 ス ナネズミ海馬 C A 1領域の顕微鏡画像 （スケールバー： 1 OO zm) を示す 。 Aは正常群、 Bは PBS投与虚血群、 Cは CBXO. 2mgZ体重 k g投 与虚血群 （CBX 1 Z100) 、 Dは CBX 2mgZ体重 k g投与虚血群 （ CBX 1 Z10) 、 Eは CBX 20 § 体重1 g投与虚血群 （CBX 1 ) 、 Fは DON 0. 016 £ 体重1 g投与虚血群 （DON 1 Z100) 、 Gは DON 0. 16 £ 体重1 g投与虚血群 （DON 1Z10) 、 Hは D ON 1. 6mgZ体重 k g投与虚血群 （DON 1 ) をそれぞれ示す。
[図 16]図 15の A〜Hのスナネズミ海馬 CA 1領域 100 Zm当たりの残存 ニューロン数を比較したグラフ図である。 *, p〈 0.001対 PBS投与群、 †, p < 0.001ο これらのデータは、 一元配置分散解析及び Tukey-Kramerポストホッ クテストによって解析された。 各バーは、 3個の独立した個別データの平均値 及び標準偏差で表す。
[図 17]実験的自己免疫性脳脊髄炎 （EAE) に対するカルべノキソロン （C BX) および 6_ジァゾ _5_ォキソ一L—ノルロイシン （DON) の効果 を示す図である。 Aは、 CBX投与群の E A E臨床スコア経過を示すグラフ 図であり、 Bは、 DON投与群の E A E臨床スコア経過を示すグラフ図であ る。
[図 18]図 17の A及び Bに示す E A E臨床スコア経過から得られる各投与群 の発症曰を示すグラフ図である。
[図 19]図 17の A及び Bに示す E A E臨床スコア経過から得られる各投与群 の重症曰 （臨床スコアが 4以上） の日数を示すグラフ図である。
[図 20]図 17の A及び Bに示す E A E臨床スコア経過から得られる各投与群 の最重症スコアを示すグラフ図である。 *, Pく 0.05対 PBS投与群。 これらの データは、 一元配置分散解析及び Tukey-Kramerボス卜ホックテス卜によって 解析された。 各バーは、 5個の独立した個別データの平均値及び標準偏差で表 す。
発明を実施するための最良の実施形態
本発明は、 ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生及び Z又は放出を阻 害する阻害活性を有する化合物を含有する、 神経細胞の細胞死阻害剤に関し ている。 本発明者らは、 T N F—ひによって活性化されたミクログリアの培 養上清による死細胞数の増大等は、 同様に活性化されたミクログリアからの グルタミン酸放出量の増大、 神経細胞のミトコンドリア障害の増大に関連付 けられること、 T N F中和抗体や T N F受容体中和抗体によりミクログリア のグルタミン酸放出量及び神経細胞の死細胞数等が抑制されること並びに培 地中におけるグルタミン欠乏、 グルタミナーゼ阻害剤及びギャップ結合阻害 剤によリ活性化ミクロダリァのグルタミン酸放出量及び細胞死数等が抑制さ れるという知見を得ている。 さらに、 T N F— Q?等によって活性化されたミ クロダリァにおいてはギヤップ結合が多く発現されるとともに遊走性が増大 し細胞間接着が希薄化されることでギヤップ結合の露出が増大するという知 見も得ている。
[0019] こうした知見によれば、 図 1に示すような活性化されたミクロダリァによ るグルタミン酸産生■放出のスキーム及びこのスキームの阻害方法を想定す ることができる。 すなわち、 T N F—ひや L P Sによってミクログリア内の グルタミナーゼが活性化され、 それによつてミクログリア外のグルタミンを 基質としてグルタミン酸が産生され、 このグルタミン酸は、 ギャップ結合を 介してミクログリア外へと放出される、 グルタミン酸産生■放出経路が誘導 され、 こうして放出されたグルタミン酸は、 神経細胞の N M D A受容体に結 合して神経細胞内のミトコンドリァ阻害による A T P枯渴を介して神経細胞 死を誘導するものと推論される。 また、 T N F— Q?は、 T N F— Q?の放出を 促進するように作用することも推定できる。
[0020] 本発明者らによれば、 こうしたグルタミン酸産生，放出経路を阻害するこ とにより、 活性化ミクロダリァにおける過剰なグルタミン酸産生■放出を選 択的に阻害できることがわかっている。 こうした選択的な阻害によれば、 定 常的なグルタミン酸産生を阻害しないため、 正常なグルタミン酸作用を妨げ ることなく細胞死を抑制できることが期待できる。
[0021 ] 以下、 本発明の実施形態である、 神経細胞の細胞死阻害剤、 その用途及び 細胞死阻害剤のスクリーニング方法について説明する。
[0022] (神経細胞の細胞死阻害剤）
本発明の細胞死阻害剤は、 ミクロダリァにおけるグルタミン酸産生及び Z 又は放出を阻害する阻害活性を有する化合物 （以下、 単にグルタミン酸放出 阻害剤という。 ） を含有している。
[0023] 本発明における 「神経細胞死」 には、 ネクローシスとアポトーシスの双方 を含んでいる。 ネクローシスとは、 虚血などのように病的状態で一団の細胞 に生じる死を意味しておリ、 様々な外的要因によリ細胞の崩壊及び自己融解 が挙げられる。 また、 アポトーシスとは、 動物の健常組織における細胞のタ ーンオーバーや種々の臓器の発生段階において不要な細胞を除去する際など 、 様々な原因により細胞が自発的に自分自身を殺す機構を活性化して死んで いく状態を意味している。
[0024] 本発明におけるグルタミン酸放出阻害剤としては、 好ましくは活性化され たミクログリアにおけるグルタミン酸産生及び Z又は放出を阻害できるもの であることが好ましく、 こうした態様の化合物としては、 少なくとも、 ダル タミナーゼ阻害剤、 ギャップ結合阻害剤及びミクログリア活性化阻害剤が挙 げられる。 これらのグルタミン酸放出阻害剤によれば、 ミクログリアの非活 性化時におけるグルタミン酸産生量を維持する範囲で活性化ミクログリアに おけるグルタミン酸産生及び Z又は放出を阻害することができる。 本発明の 細胞死阻害剤は、 こうした各種のグルタミン酸放出阻害剤を 1種又は 2種以 上を組み合わせて含有することができる。
[0025] ( 1 ) ダルタミナーゼ阻害剤
グルタミナーゼ阻害剤は、 グルタミンからグルタミン酸を生成する酵素で あるグルタミナーゼを阻害する化合物であればよい。 阻害態様は特に限定さ れない。 ダルタミナーゼ阻害剤としては、 特に限定されないで公知のグルタ ミナーゼ阻害剤を使用できる。 例えば、 6-ジァゾ -5-ォキソ -L-ノルロイシン ( (S) -2-ァミノ -6-ジァゾ -5-ォキソ力プロン酸又はその塩 (DON) )ゃ特開平 7 - 1 8 8 1 8 1号等に記載のある種のイミダゾール誘導体が挙げられる。 ダル タミナーゼ阻害剤は、 活性化されたミクログリアにおける過剰なグルタミン 酸の産生を抑制できることから本発明のグルタミン酸放出阻害剤として好ま しい。
[0026] (2) ギャップ結合阻害剤
ギヤップ結合阻害剤は、 ギヤップ結合のチャンネルの小孔を介した低分子 化合物などの移動■交換など細胞間連絡を阻害する化合物であればよい。 ギ ヤップ結合阻害剤としては、 公知のギャップ結合阻害剤を利用できる。 例え ば、 ォレアミド、 ァラキドンアミドなどの各種の脂肪酸第 1級アミド化合物 、 ある種のォレアミドアゴニス卜 （例えば、 特表 2001—523695号 ) 、 カルべノキソロン又はカルべノキソロン 2ナトリウムなどの塩、 1 8ひ —ダリチルリチン酸又はその塩、 1 2—0—テトラデカノィルフォポール一
1 3—アセテート （TPA) 、 ォクタノール、 リンダンが挙げられる。 また 、 43GAP27ペプチド （SRPTEKT I F I I ) 、 4°GAP27ぺプチ ド （SRPTEKNVF I V) などのコネキシン 40、 43のァゴニス卜、 特表 2005-509621号に記載のある種の c AM P及び Z又は c AM Pホスホジエステラーゼ阻害剤、 特開 2004— 21 7594号に記載のあ る種のグリコサミノダリカンなども挙げられる。 ギャップ結合阻害剤は、 活 性化されたミクログリアにおける過剰なグルタミン酸の産生時におけるダル タミン酸放出を抑制できることから本発明のグルタミン酸放出阻害剤として 好ましい。
[0027] (3) ミクログリア活性化阻害剤
ミクロダリァ活性化阻害剤としては、 ミクロダリァによるグルタミン酸産 生 ·放出を活性化するサイトカインによる刺激伝達を抑制する化合物が好ま しい。 例えば、 TN F— Q?の阻害剤又はこの受容体における TN F— Q?の結 合を阻害する受容体阻害剤が挙げられる。 こうした阻害剤としては、 TN F —ひ又は T N F— Q? 1型レセプター （TN FR 1 ) をターゲットとして TN F_ Ofとレセプターとの結合を阻害する化合物が挙げられる。 具体的には、 抗 T N F— Q?抗体、 可溶性の T N F R 1受容体、 抗 T N F R 1抗体、 WP 9 Q Yなどの T N F—ひアンタゴニス卜、 など各種の公知の化合物が挙げられ る。 なお、 これらの阻害剤は、 T N F—ひによるミクログリア活性化のみな らず L P Sによる活性化も阻害することができる。
[0028] また、 1_卩5阻害剤でぁる1_卩5受容体でぁる1"01卜 1<6-1^0印1：0「4 (TLR 4) の拮抗阻害剤 （E5531、 E5564) や T L R 4中和抗体を用いることもできる
[0029] こうした各種グルタミン酸放出阻害剤は、 その化合物の酸性基や塩基性基 の形態により、 必要に応じ各種の塩の形態とすることができる。 こうした塩 の形態は、 医薬分野等において通常用いられる塩酸や塩基を用いて構成する ことができる。
[0030] 本発明の細胞死阻害剤は、 グルタミン酸産生放出阻害剤を含むことから、 グルタミン酸による興奮性神経障害による細胞死阻害剤として用いることが 好ましい。 また、 こうした興奮性神経障害による神経細胞死が関連するヒト 及び家畜ゃぺッ卜などの非ヒ卜動物の神経系疾患の予防■治療剤として用い ることが好ましい。 神経系疾患としては、 例えば、 虚血障害、 炎症性神経疾 患及び神経変性疾患等が挙げられる。
[0031 ] 虚血傷害としては、 例えば、 脳卒中、 脳出血、 脳梗塞及び脳血管性認知症 が挙げられる。 炎症性神経疾患としては、 例えば、 脳炎後遺症、 急性散在性 脳脊髄炎、 細菌性髄膜炎、 結核性髄膜炎、 真菌性髄膜炎、 ウィルス性髄膜炎 、 ワクチン性髄膜炎等の中枢神経系炎症性神経疾患が挙げられる。 神経変性 疾患としては、 例えば、 アルツハイマー病、 頭部外傷、 脳性麻痺、 ハンチン トン病、 ピック病、 ダウン症、 パーキンソン病、 エイズ脳症、 多系統萎縮症 、 多発性硬化症、 筋萎縮性側索硬化症、 脊髄小脳失調症等が挙げられる。
[0032] 本発明の細胞死阻害剤をヒ卜及び非ヒ卜動物の神経細胞死が関連する上記 のような神経系疾患の予防■治療剤として用いる場合には、 それ自体あるい は適宜の薬学的に許容される、 賦形剤、 希釈剤等などの製剤成分と混合し、 例えば、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤若しくはシロップ剤等の組成物 （ 製剤） とすることができる。 すなわち、 本発明の神経細胞死の阻害剤を有効 成分とする神経系疾患の予防 ·治療用組成物が提供される。 本組成物は、 得 ようとする製剤形態に応じて、 有効成分のほか薬学的に許容される製剤成分 を含有することができる。 本発明の予防，治療用組成物は、 経口的又は非経 口的に投与することができる。
これらの製剤は、 賦形剤 （例えば、 乳糖、 白糖、 葡萄糖、 マンニトール、 ソルビトールのような糖誘導体； トウモロコシデンプン、 バレイショデンプ ン、 Of澱粉、 デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセ ルロース誘導体； アラビアゴム；デキス卜ラン； プルランのような有機系賦 形剤：及び、 軽質無水珪酸、 合成珪酸アルミニウム、 珪酸カルシウム、 メタ 珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムの ような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫 酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。 ） 、 滑沢剤 （例えば、 ステア リン酸、 ステアリン酸カルシウム、 ステアリン酸マグネシウムのようなステ アリン酸金属塩； タルク ； コロイドシリカ ； ビーガム、 ゲイ蝌のようなヮッ クス類；硼酸； アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩； グリコール； フマル酸；安息香酸ナトリウム； D Lロイシン；脂肪酸ナトリウム塩； ラウ リル硫酸ナトリウム、 ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩； 無水珪酸、 珪酸水和物のような珪酸類；及び、 上記澱粉誘導体を挙げること ができる。 ） 、 結合剤 （例えば、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ヒドロキ シプロピルメチルセルロース、 ポリビニルピロリ ドン、 マクロゴール、 及び 、 前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。 ） 、 崩壊剤 （例えば、 低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、 カルボキシメチルセルロース、 力 ルポキシメチルセルロースカルシウム、 内部架橋カルボキシメチルセルロー スナトリウムのようなセルロース誘導体； カルボキシメチルスターチ、 カル ポキシメチルスターチナトリウム、 架橋ポリビニルピロリ ドンのような化学 修飾されたデンプン，セルロース類を挙げることができる。 ） 、 安定剤 （メ チルパラベン、 プロピルパラベンのようなパラォキシ安息香酸エステル類； クロロブタノール、 ベンジルアルコール、 フエニルエチルアルコールのよう なアルコール類；塩化ベンザルコニゥム； フエノール、 クレゾールのような フエノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、 ソルビン酸を挙げるこ とができる。 ） 、 矯味矯臭剤 （例えば、 通常使用される、 甘味料、 酸味料、 香料等を挙げることができる。 ） 、 希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で 製造される。
[0034] その使用量は、 症状、 年齢等により異なり、 適宜決定される。 たとえば、 経口投与の場合には、 1回当り 1曰下限 0. 1 mg (好ましくは、 1 mg) 、 上限 1 000mg (好ましくは、 500mg) を、 静脈内投与の場合には 、 1回当り 1曰下限 0. 0 1 mg (好ましくは、 0. 1 mg) 、 上限 500 mg (好ましくは、 200mg) を成人に対して、 1日当り 1または数回に 分けて、 症状に応じて投与することができる。
[0035] (スクリーニング方法）
本発明の神経細胞の細胞死阻害剤のスクリーニング方法は、 ミクログリア におけるグルタミン酸の産生■放出経路に対する被験化合物の作用を指標と して神経細胞の細胞死阻害剤の効果を評価するものである。 既に説明したよ うに、 神経細胞の細胞死は、 グルタミン酸放出阻害剤により有効に阻害でき ることがわかっている。 本発明のスクリーニング方法によれば、 グルタミン 酸放出阻害剤の意図する各種作用を指標として、 結果として細胞死阻害剤と しての効果を評価することができる。
[0036] 細胞死阻害剤としての効果の指標となる作用としては、 活性化されたミク ログリアに対する前記被験化合物のグルタミン酸の産生又は放出の阻害作用 が挙げられ、 具体的には、 被験化合物のダルタミナーゼ阻害作用、 ミクログ リァに対する被験化合物のギヤップ機能阻害作用、 ミクロダリァに対する被 験化合物のミクログリア活性化の阻害作用が挙げられる。
[0037] ダルタミナーゼ阻害作用は、 例えば、 活性化されたミクログリアに被験化 合物を供給したときミクロダリァの培養上清に放出されるグルタミン酸濃度 を測定することによって取得することができる。 培養上清のグルタミン酸濃 度は、 公知のグルタミン酸の比色法やセンサ等にて測定することができる。 被験化合物は、 特に限定されないが公知のグルタミナーゼ阻害剤の類似体な どを用いることができる。
[0038] ギャップ機能阻害作用は、 例えば、 活性化されたミクログリアに被験化合 物を供給したとき、 培養上清のグルタミン酸濃度を測定したり、 あるいはミ クログリアにおけるギャップ結合の構成タンパク質であるコネキシン量をフ ローサイトメ一ターによって測定することにより取得できる。 被験化合物は 特に限定されないが、 公知のギャップ結合阻害剤の類似体を用いることがで さる。
[0039] ミクロダリァの活性化阻害作用は、 活性化されたミクロダリァに被験化合 物を供給したときのミクロダリァの形態観察 （ミクロダリァの活性化程度の 観察） や、 活性化されたミクログリアに被験化合物を供給したときの培養上 清のグルタミン酸濃度を測定することにより取得できる。 被験化合物は特に 限定されないが、 公知の T N F— Q?アンタゴニスト、 抗 T N F— Q?抗体、 可 溶性 T N F受容体などの類似体を用いることができる。
[0040] 本発明のスクリーニング方法を実施するには、 培地中にグルタミンの存在 下、 活性化されたミクログリアに被験化合物を供給し、 ミクログリアに関し て上記したいずれかあるいは 2種類以上の指標を取得する。 そして、 取得し た指標が被験化合物の非供給時に比較して神経細胞死阻害活性を肯定できる 程度に有意に変化したとき、 被験化合物が神経細胞死阻害活性を有すると判 定すればよい。 例えば、 ミクログリア培養上清のグルタミン酸濃度の有意な 低下及び形態観察によるミクロダリァの活性化程度の有意な低下が得られた とき、 被験化合物が神経細胞死阻害活性を有すると判定することができる。
[0041 ] また、 本発明のスクリーニング方法においては、 ミクログリアに関する指 標のほか、 ミクログリアを介して得られる神経細胞に関する被験化合物の作 用を指標としてもよい。 すなわち、 活性化され被験化合物が供給されたミク ログリァの培養上清の存在下における神経細胞又はこうしたミクログリアと 共培養した神経細胞における神経細胞死に対する被験化合物の作用を指標と して神経細胞の細胞死阻害剤の効果を評価することができる。 すなわち、 得 られた指標が被験化合物の非供給時に比較して神経細胞死阻害活性を肯定で きる程度に有意に変化したとき、 被験化合物が神経細胞死阻害活性を有する と判定できる。
[0042] 神経細胞における細胞死阻害剤としての効果の指標としては、 神経突起ビ ーズ状変性、 細胞死、 細胞内 A TP濃度及びミトコンドリア損傷などの神経 細胞傷害が挙げられる。 指標としてはこれらの 1種又は 2種以上を組み合わ せてもよい。
[0043] 神経突起ビーズ状変性は、 活性化されたミクログリアによって引き起こさ れる細胞死の初期の徴候であり、 N-メチル -D-ァスパラギン酸型グルタミン酸 受容体 （NMDA受容体） によって媒介される （H. Takeuchi et al. , J.
Biol. Chem. Vol. 280, No.11, pp.10444-10454, 2005) 。 したがって、 神経 細胞死の好適な指標となりうる。 具体的には、 神経細胞を顕微鏡又は位相差 顕微鏡下において観察して、 神経突起ビーズ状変性を示す陽性細胞数又は全 細胞数に対する比率を求めればよい。 例えば、 被験化合物によって活性化さ れたミクログリアによリ神経突起ビーズ状変性細胞が有意な増加を示すとき 、 被験化合物が神経細胞死阻害活性を有すると判定できる。
[0044] また、 細胞死は、 従来公知の方法によって測定することができる。 例えば 、 顕微鏡下における観察やさらに各種の染色法、 例えば、 ヨウ化プロビディ ゥムなどを用いて死細胞を染色する方法、 I NST(in situ nick trans I at i on)法、 T U N E L (terminal
deoxynuc I eot i dy I transferase -mediated UTP end labeling) 法などを適宜 用いることができる。 例えば、 被験化合物によって活性化されたミクロダリ ァによリ神経細胞の死細胞数が有意な増加を示すとき、 被験化合物が神経細 胞死阻害活性を有すると判定できる。
[0045] 神経細胞内の A T P濃度は、 例えば、 AposSENSOR Cel I Viabi I ity Assay K it (Bio
Vision社製） などによる光学的方法など従来公知の方法によって測定するこ とができる。 また、 ミトコンドリア損傷は、 ミトコンドリアの膜電位に比例 した呈色を示す Mは oTracker Red CMXRos (Molecular Probes社製）を用いた染 色法や 3- (4, 5-d i mety I th i azo I -2-y I ) -5- (3-carboxymethoxy I pheny I ) -2- (4- su I fopheny I ) -2H-tetrazo I i urn (MTS)を用いた染色法
などを用いることができる。 例えば、 被験化合物によって活性化されたミク ログリアによリ神経細胞内の A T P濃度の有意な低下やミトコンドリァ損傷 レベルの有意な増加を示すとき、 被験化合物が神経細胞死阻害活性を有する と判定できる。
[0046] こうした本発明のスクリーニング方法は、 神経細胞の細胞死阻害剤をスク リーニングするが、 特に神経系疾患の予防■治療剤をスクリーニングするの に好ましい方法であり、 上記した各種神経系疾患の予防，治療剤、 特に、 神 経傷害的なミクログリアに選択性が高い神経系疾患の予防■治療剤をスクリ 一二ングすることができる。 実施例
[0047] 以下、 本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、 本発明は以下の実施 例に限定されるものではない。
[0048] (実施例 1 ：サイト力インによるミクログリアの活性化を介した神経突起ビ ーズ状変性及び神経細胞死の誘導）
本実施例では、 各種サイトカインを投与したミクログリアの培養上清を神 経細胞に投与したときの神経細胞における神経突起ビーズ状変性及び神経細 胞死を観察した。 実験方法は以下の通りであった。
[0049] (1)ミクログリアの調製
マウス初代培養ミクログリアは、 C57 BLZ6マウス新生仔大脳から作 成した初代混合グリァ細胞よリ培養 1 4曰目以降に振盪法によつて分離した
(Suzumura, A. et aに MHC antigen expression on bulk isolated macrophage-microglia from newborn mouse brain: induction of la ant i ge n
expression by gamma- interferon. J. Neuroimmunol.15, 263-278 (1987))
[0050] (2) 神経細胞の調製 また、 マウス大脳皮質初代神経細胞は、 C57BL/6マウス第 17曰胎仔大脳皮質 より作成し、 ポリエチレンィミン （poly-ethyleneimine, PEI) コートのカバ 一ガラス上で培養後 1 0日から 1 3日において使用した （Takeuchi, H. et a に Neur itic beading induced by activated microglia
is an early feature of neuronal dysfunction toward neuronal death by inhibition
of mitochondr ial respiration and axona I transport. J. Biol. Chem. 280
10444-10454 (2005) ) 。
[0051] (3) 各種サイト力インによるミクログリアの活性化
各種サイト力イン等 （L PS、 I L_ 1 )S、 I L_6、 I L_ 1 0、 I F N_r及び TN F- Ol) を、 ミクログリアの培養液 （約 5 X 1 04 c e I I s /we I し 神経細胞培地 （住友べ一クライ卜株式会社製） に対して、 それ ぞれ、 L P Sは 1 g Zm I、 その他のサイトカインは 1 00 n g Zm I と なるように添加し、 湿度 1 00 %かつ 5 %C O 2下 37 °Cで 24時間ィンキュ ベー卜した。 なお、 対照としてサイト力インを添加しない以外は同様にして ミクログリアを培養した。
[0052] (4) 神経細胞への刺激伝達
(a) 活性化されたミクログリアの培養上清の神経細胞への投与 （間接刺激 群）
活性化したミクログリアの培養上清の 500 I を 24穴プレー卜中の神 経細胞 （5 x l 04 c e l I sZwe l I ) に投与した。 また、 活性化してい ないミクログリアの培養上清も同様に神経細胞に投与して間接刺激群のコン トロールとした。 さらに、 神経細胞の一部には、 NMD A受容体のアンタゴ ニス卜である MK 80 1を最終濃度が 1 0 Mとなるように添加した。 こう して調製した神経細胞を湿度 1 00 %かつ 5 %C O 2下 37 °Cで培養した。
[0053] (b) サイトカインの神経細胞への投与 （直接刺激群）
上記各種サイト力イン L PS、 I L_ 1 )S、 I L_6、 I L_ 1 0、 I F N_r及び TN F_Q?) をそれぞれ、 L PSは 1 gZmし その他のサイ トカインは 100 n gZm I含有する神経細胞培地 500 Iを、 24穴プ レート中の神経細胞 （5x l 04c e l I sZwe l I ) に投与した。 また、 培地 500 Iのみを同様に神経細胞に投与して直接刺激群のコントロール とした。 こうして調製した神経細胞を湿度 100%かつ 5%C02下 37°Cで 培養した。
[0054] (5) 神経突起ビーズ状変性陽性細胞数と死細胞数の評価
得られた各種の神経細胞を 24時間培養後、 各ゥエル中の神経細胞につい て神経突起ビーズ状変性陽性細胞数と死細胞数とを計測した。 神経突起ビー ズ状変性陽性細胞数は、 位相差顕微鏡を用いて、 全神経細胞中における神経 突起ビーズ状変性陽性細胞数の比率を計測した。 なお、 それぞれの培養上清 が投与された 2つの神経細胞ゥエルについての計測を 3回反復して行った。 また、 死細胞数は、 ヨウ化プロピディウム （P I) を用いる色素排除法を利 用し、 培養後に 2mgZm I P I含有培地で 15分間 37 °Cで培養して死細 胞に特徴的な蛍光を蛍光顕微鏡にて検出し、 死細胞数を計測した。 また、 死 細胞数は、 the terminal deoxynuc I eot i dy I transf erase-med i ated UTP end I abe I i ng
(TUNED 染色でも評価した。
[0055] 神経突起ビーズ状変性陽性細胞数及び死細胞数の計測にあたっては、 同一 の培養上清が投与された 2つの神経細胞ゥエルについて 3回反復して行った 。 なお、 死細胞率は、 全細胞数に対する死細胞数の比率である。 神経突起ビ ーズ状変性陽性細胞数の測定結果を図 2に示し、 細胞死数を図 3に示す。 ま た、 神経細胞に投与した時点の各種ミクログリアと細胞死数等の計測した時 点での神経細胞との位相差顕微鏡像を図 4に示す。
[0056] (6) 結果
図 2に示すように、 LPSと TN F—ひにより活性化ミクログリアが投与 された神経細胞 （間接投与群） はほぼ 100%の神経突起ビーズ状変性陽性 細胞比率 （％) を示し、 コントロールに対して有意 （p<0. 01) に低下 した。 また、 NMD A受容体アンタゴニストである MK801の併存下では 変性は著しく抑制されていた。 これに対し、 他のサイト力インの間接投与群 及び全ての直接投与群は、 コントロールとほぼ同程度の陽性率であった。 ま た、 図 3に示すように、 神経細胞死率についても神経突起ビーズ状変性陽性 細胞率と同様の傾向が認められた （p<0. 01対コントロール） 。
[0057] 図 4に示すように、 LPS及び TN F_Qf (図 4 (b) 及び （c) ) が添 加されたミクログリアは無刺激のミクログリア （図 4 (a) ) に比較して、 より大きなアメーバ状の形態をとリ、 遊走性も活発で、 極めて活性化された 状態であった。 また、 LPS及び TN F_ひ刺激ミクログリア培養上清が投 与された神経細胞 （図 4 (e) 及び （f ) ) は、 無刺激ミクログリア培養上 清が投与された神経細胞 （図 4 (d) ) に比較して多数のビーズが観察され た。 なお、 TUNEL陽性細胞は観察されず、 アポトーシスによる細胞死ではない ことが確認された。
[0058] 以上のことから、 各種サイト力インのうち LPSまたは TN F—ひにより、 直 接的でなくミクログリアの活性化を介した間接的刺激によって、 神経突起ビ ーズ状変性 neu tic beadingおよび神経細胞死が生じることがわかった。 ま た、 こうした現象が MK801によって阻害されることから、 NMDA受容 体を介したグルタミン酸刺激によるものであることがわかった。
[0059] (実施例 2 ：各種サイトカインの活性化を介したグルタミン酸放出量の増加 、 神経細胞内 A TP濃度の増加、 ミトコンドリア損傷の増加の誘導） 本実施例では、 各種サイトカインを投与したミクログリアのグルタミン酸 放出量、 培養上清を神経細胞に投与したときの神経細胞における細胞内 AT P濃度、 ミトコンドリア損傷を計測した。 実験方法は、 ミクログリアの調製 、 神経細胞の調製、 ミクログリアの活性化及び神経細胞への刺激伝達 （MK 801を使用しない点を除いては） は、 実施例 1と同様にして行い、 評価の み以下の方法で行った。
[0060] (1 ) グルタミン酸濃度の測定
得られた各種の神経細胞を 24時間培養後、 活性化されたミクログリアか ら放出されて各ゥエル中の培地に存在するグルタミン酸濃度を測定した。 グ ルタミン酸の定量は、 グルタミン酸測定キット （ャマサ醤油株式会社製） を 用い、 そのプロ卜コールに従い、 マルチプレートリーダーにおいて 600 n mの吸光度を測定することにより行った。 なお、 測定は 6回反復して行った 。 結果を図 5に示す。
[0061] (2) 神経細胞内 A TP濃度の測定
得られた各種の神経細胞を 24時間培養後、 各ゥエル中の神経細胞内の A TPの定量は、 ApoSENSOR細胞活性測定キット（BioVisions社製）を用い、 その プロ卜コールに従って、 発色法によって行った。 A TP濃度は、 コントロー ルに対する％で表示した。 結果を図 6に示す。
[0062] (3) ミトコンドリァ損傷の測定
得られた各種の神経細胞を 24時間培養後、 各ゥエル中の神経細胞内のミ 卜コンドリアの損傷程度の定量は、 Cel ITiter96 Aqueous one solution assa y (Promega社製）を用い、 プロ卜コールに従って、 MTS法を実施し、 マルチ プレートリーダーにおいて 490 nmの吸光度を測定することにより行った 。 なお、 測定は 6回反復して行った。 結果を図 7に示す。
[0063] (4) 結果
図 5に示すように、 LPS又は TN F—ひにより活性化されたミクロダリ ァの培養上清を含む神経細胞ゥ Iルでのみグルタミン酸が有意に （ p < 0. 01対 LPS又は TN F—ひ活性化ミクロダリァ培養上清で培養した神経細 胞） 高濃度であった。 これは、 活性化ミクログリア培養上清に含まれていた グルタミン酸濃度を反映しているものと考えられた。 すなわち、 LPS等に よって活性化されたミクログリアによるグルタミン酸産生及び放出が促進さ れた結果、 培養上清中のグルタミン酸濃度が上昇し、 該グルタミン酸濃度が 神経細胞培養液に反映されたと考えられた。 また、 図 6に示すように、 神経 細胞の細胞内 A TP濃度は、 LPS又は TN F—ひ活性化ミクログリアの培 養上清が投与された神経細胞ゥ Iルにおいてのみ有意に （p<0. 01対1_ PS又は TN F_ひ活性化ミクログリア培養上清で培養した神経細胞） 低か つた。 さらに、 図 7に示すように、 ミトコンドリアの損傷程度は、 L P S又 は T N F—ひ活性化ミクロダリァの培養上清が投与された神経細胞ゥエルに おいてのみ有意に （p <0. 0 1対 L P S又は T N F_ひ活性化ミクロダリ ァ培養上清で培養した神経細胞） 低かった。
[0064] 以上のように、 本実施例では、 L P S又は T N F—ひによるミクログリア によるグルタミン酸放出量の増加、 細胞内 AT P濃度および MT Sレベルの 減少が誘導されることがわかった。 また、 実施例 1と実施例 2との結果から 、 L P S又は T N F—ひによるミクログリアを介した間接的刺激、 すなわち 、 活性化されたミクログリアが放出するグルタミン酸によって、 神経細胞死 又はそれに関連する各種シグナルが誘導されることがわかった。
[0065] (実施例 3 ： TN F_Qf中和抗体、 TN F_o 型受容体中和抗体によるダル タミン酸放出の阻害）
本実施例では、 T N F— Q?中和抗体、 T N F— 0?1型受容体中和抗体の存在 下、 活性化されたミクロダリァ培養上清が投与されたときの神経細胞におけ る神経突起ビーズ状変性及び神経細胞死を観察した。 実験方法は、 ミクログ リアの調製、 神経細胞の調製については実施例 1と同様にして行い、 ミクロ グリアの活性化、 神経細胞への刺激伝達及び評価は以下の通りとした。
[0066] ( 1 ) L P S又は T N F—ひによるミクログリアの活性化
L P S又はT N F— Q?を、 ミクログリアの培養液 （約 5 X 1 04 e I I sZ w e I し 神経細胞培地 （住友ベークライト株式会社製） に対して、 L P S は 1 g Zmし T N F—ひは 1 n g Zmし 1 0 n g Zm I及び 1 00 η gZm Iとなるように添加して、 湿度 1 00%かつ 5%C02下 37°Cで 24 時間インキュベートした。
[0067] (2) 神経細胞への刺激伝達
活性化したミクログリアの培養上清の 500 Iを 24穴プレー卜中の神 経細胞 （5 x l 04 c e l I sZw e l I ) に投与した。 また、 活性化したミ クログリアの培養上清の 500 U \ (T N F—ひについては 1 00 gZm I投与群のみ） と以下の表に示す中和抗体を表記載の最終濃度となるように 24穴プレート中の神経細胞 （5 x l 04c e l I sZwe l I ) に投与した 。 なお、 活性化していないミクログリアの培養上清も同様に神経細胞に投与 してコントロールとした。 こうして調製した神経細胞を湿度 1 00%かつ 5 % C O 2下 37 °Cで培養した。
[0068] [表 1]
Figure imgf000023_0001
[0069] (3) 評価
調製した各種の神経細胞を 24時間培養後、 各ゥエル中の神経細胞につい てグルタミン酸濃度、 神経突起ビーズ状変性陽性細胞数及び死細胞数を計測 した。 グルタミン酸の定量は実施例 2と同様に行い、 神経突起ビーズ状変性 陽性細胞数及び死細胞数の計測は実施例 1と同様に行った。 グルタミン酸に ついての結果を図 8に示し、 神経突起ビーズ状変性についての結果を図 9に 示し、 細胞死についての結果を図 1 0に示す。
[0070] (4) 結果
図 8に示すように、 T N F _ Q?中和抗体及び T N F-Q? 1型受容体中和抗 体が活性化ミクログリアとともに神経細胞培地中に存在する場合にはグルタ ミン酸が他の神経細胞培地よりも有意に （p<0. 05対 LPS又は TN F _Qf活性化ミクログリア培養上清で培養した神経細胞） 少なかった。 これは 、 ミクログリア培養上清に含まれていたグルタミン酸濃度を反映しているも のと考えられた。 すなわち、 中和抗体の存在下で TN F—ひによるミクログ リアの活性化が抑制された結果、 ミクログリアによるグルタミン酸産生が抑 制され培養上清中のグルタミン酸濃度が低下し、 該グルタミン酸濃度が神経 細胞培養液に反映されたと考えられた。 図 9及び図 1 0に示すように、 ダル タミン酸量についてと同様に、 神経突起ビーズ状変性陽性細胞数及び死細胞 数についても有意な抑制作用が確認された （p<0. 05対 LPS又は TN F _ Of刺激ミクログリァ培養上清で培養した神経細胞） 。 [0071 ] 以上のことから、 活性化されたミクログリァからのグルタミン酸放出は、
TN F-Qf中和抗体もしくは TN F_Q 型受容体中和抗体によリ阻害される とともに、 神経突起ビーズ状変性や細胞死も阻害されることがわかつた。
[0072] (実施例 4 ：培地からのグルタミン除去、 グルタミナーゼ阻害剤及びギヤッ プ結合阻害剤による T N F-Qfに誘導されたグルタミン酸産生の阻害） 本実施例では、 活性化されたミクログリアと種々の薬剤とを神経細胞に投 与したときのミクログリアからのグルタミン酸放出を測定し、 神経突起ビー ズ状変性及び細胞死を観察した。 実験方法は、 ミクログリアの調製、 神経細 胞の調製については、 実施例 1と同様に行い、 他は以下のとおりであった。
[0073] ( 1 ) ミクロダリァの活性化には、 ミクロダリァの培養液 （約 5 X 1 04 c e
I I s/we I し 神経細胞培地 （住友べ一クライ卜株式会社製） ） に対し て、 最終濃度で 1 μ gZm I 1_卩5又は1 00 n gZm I TN F_Q?を用い 、 湿度 1 00%かつ 5%C02下 37°Cで 24時間インキュベートして行った 。 なお、 対照としてサイト力インを添加しない以外は同様にしてミクロダリ ァを培養した。
[0074] (2) 神経細胞への刺激伝達
刺激後 24時間培養後のミクログリア培養上清 500 Iを以下の表に示 す各種薬剤 （最終濃度で記載） とともに 24穴ゥエルプレートに準備した神 経細胞 （5 x l 04c e l I sZwe l I ) に投与した。 また、 活性化ミクロ グリア培養上清を含むがグルタミンを培地中に含有しない神経細胞 （G I n - f r e e) も用意した。 さらに、 T N F _ひで活性化したミクログリア培 養上清単独が投与された神経細胞及び活性化していないミクログリアの培養 上清が投与された神経細胞を、 それぞれ TN F及びコントロールとした。 こ れらの神経細胞を湿度 1 00 %かつ 5 % C O 2下 37 °Cで培養した。
[0075] [表 2] 記号 種類 化合物名称 濂度 a-p38 p38 MAPK inhibitor SB203580 lQuM a-MEK MEK inhibitor PD98059 lQuM a-JNK JNK inhibitor lQuM a-IKK IKB kinase inhibitor; 100 g/ml
THA glutamate transporter inhibitor DL-threo- -hydroxyaspartic acid 100 U M
CBX gap junction inhibitor carbenoxolone disodium(CBX) 100 U M
DON glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine(DON) 1 Π Μ
[0076] (3) 評価
24時間培養後、 培地中のグルタミン酸濃度を測定し、 神経突起ビーズ状 変性陽性細胞数、 死細胞数を計測した。 測定方法等は、 実施例 1及び実施例 2に記載の方法を用いた。 グルタミン酸濃度の測定結果を図 1 1に示し、 神 経突起ビーズ状変性陽性細胞数の計測結果を図 1 2に示し、 死細胞数の計測 結果を図 1 3に示す。
[0077] (4) 結果
図 1 1に示すように、 活性化されたグリア細胞培養上清とともにギャップ 結合阻害剤 （CBX) 及びダルタミナーゼ阻害剤 （DON) が投与されて培 養された神経細胞及びグルタミン不含の培地で培養された神経細胞のグルタ ミン酸濃度は、 コントロールと同程度であつて薬剤が添加されていない神経 細胞 （TN F) よりも有意に （p<0. 05) 少なかった。 ダルタミナーゼ 阻害剤及びギャップ結合阻害剤については、 これらの存在下ではミクロダリ ァによるグルタミン酸産生やその放出が抑制されグルタミン酸濃度が低下し 、 該グルタミン酸濃度が神経細胞培養液に反映されたと考えられた。 また、 図 1 2及び図 1 3に示すように、 グルタミン酸量についてと同様に、 神経突 起ビーズ状変性陽性細胞数及び死細胞数についても有意な （p<0. 05) 抑制作用が確認された。
[0078] 以上のことから、 培地からのグルタミン除去、 ダルタミナーゼ阻害剤及び ギヤップ結合阻害剤は、 定常レベルの細胞内グルタミン酸産生を阻害するこ となく、 TN F—ひに誘導された余剰分のグルタミン酸産生のみを完全に阻 害することがわかった。 [0079] (実施例 5 ：ギヤップ結合の発現解析）
本実施例では、 ミクログリアを TN F—ひ又は LPSで活性化したときの ギャップ結合の主要構成因子であるコネキシン _32 (Cx 32) の細胞表 面発現のフローサイトメ一ターによる解析を行った。 ミクログリアの調製は 実施例 1と同様に行い、 ミクログリア活性化は実施例 4と同様に行った。 C X 32の検出は、 抗マウス C X 32抗体 （Chemicon社製） を用いた。 結果を 図 1 4に示す。
[0080] 図 1 4に示すように、 LPS又は TN F—ひによってミクログリアの細胞 表面へのギヤップ結合の発現が増大することがわかった。
[0081] (実施例 6)
本実施例では、 虚血による遅発性神経細胞死モデルを構築してギヤップ結 合阻害剤及びダルタミナーゼ阻害剤の神経細胞死に対する効果を評価した。 なお、 以下の実験は、 名古屋大学動物実験委員会の承認を得て施行された。 なお、 本実施例における動物モデルは、 神経疾患の一種である虚血障害のモ デルに相当する。
[0082] 今井らの文献 （Imai F, Sawada M, Suzuki H,
Zlokovic BV, Koj ima J, Kuno S, Nagatsu T, Nitator i T, Uch i yama Y, Kan no T. ,
Exogenous microglia enter the brain and migrate into ischaemic hippoc ampal
lesions. Neuroscience Letter. 272(2) :127-130. 1999) に基づいて、 1 0 〜 1 2週齢の雄のスナネズミ （体重約 70 g) をハロセン吸入麻酔下かつ直 腸温 37°C維持下に、 総頸動脈を動脈瘤用クリップにて 5分間阻血した。
[0083] ギャップ結合阻害剤のカルべノキソロン （CBX) の投与は、 以下の 3群 で行った。 すなわち、 投与量は 2 OmgZ体重 k g (CBX 1 ) 、 2mgZ 体重 g (CBX 1 Z1 0) 及び 0. 2 £ 体重1 g (CBX 1 Z1 00 ) とし、 投与方法は阻血当日から隔日腹腔内投与とした。 また、 グルタミナ ーゼ阻害剤 6_ジァゾ _5_ォキソ一Lノルロイシン （DON) の投与は、 以下の 3群で行った。 すなわち、 投与量は 1. 6mgZ体重 k g (DON 1 ) 、 0. 1 6 £ 体重1 g (DON 1/1 0) 及び 0. 01 6mgZ体重 k g (DON 1/1 00) とし、 投与方法は阻血当日から隔日腹腔内投与と した。 なお、 コントロールとしては等量のリン酸緩衝生理食塩水 （PBS) を同様に投与した。
[0084] 阻血 7日後に、 スナネズミを麻酔下に 4%パラホルムアルデヒドにて灌流 固定後、 大脳を取り出し、 OCTコンパウンド （サクラファインテック社製 ) へ包埋後に液体窒素にて凍結した。 クリオスタツ卜にて凍結切片を作成し (8 m厚） 、 スライドグラスへ貼付後に HE染色を行った。 各投与群にお ける顕微鏡像を図 1 5に示す。 また、 薬剤効果の判定については、 顕微鏡下 で海馬 CA 1領域の 1 00 Zm当たりの残存ニューロン数をカウントした。 各投与群についてのカウント結果を図 1 6に示す。
[0085] 図 1 5に示すように、 虚血による遅発性神経細胞死モデルにおいては、 ギ ャップ結合阻害剤及びグルタミナーゼ阻害剤の投与によつて遅発性の神経細 胞死が抑制されることが明らかであった。 また、 図 1 6に示すように、 スナ ネズミ海馬 CA I領域の単位面積当たりの残存ニューロン数は、 CBX及び DONの全ての投与群においてコントロールに対して有意に （p<0. 00 1 ) 神経細胞死を抑制していることが明らかであった。 また、 それぞれの薬 剤について濃度依存的に神経細胞死抑制効果が認められた。
[0086] 以上のことから、 ギャップ結合阻害剤及びグルタミナーゼ阻害剤はいずれ も神経細胞死、 特に中枢神経系の神経細胞死を抑制できることがわかった。 また、 本発明の神経細胞死阻害剤は、 脳出血や脳梗塞などの虚血障害や脳血 管性認知症などの虚血障害の後遺症の予防■治療に有効であることがわかつ
(実施例 7)
本実施例では、 ミエリン稀突起膠細胞糖タンパク質 （MOG) 誘導性の実 験的自己免疫性能脊髄炎 （EAE) モデルを構築し、 E A E臨床経過におけ るギャップ結合阻害剤及びグルタミナーゼ阻害剤の効果を評価した。 なお、 以下の実験は、 名古屋大学動物実験委員会の承認を得て施行された。 なお、 本実施例の動物モデルは、 神経疾患の一種である炎症性神経疾患のモデルに 相当する。
[0088] 実験動物としては、 C57 BLZ6 Jマウス （日本 S LC社） を用いた。
また、 試薬としては、 MOG35_55ペプチド （オペロン社製） 、 不完全フロイ ンドアジュバント （シグマ社） 、 結核菌死菌 H37 Ra (ディフコ社） 、 百 曰咳毒素 （リスト社） 、 ギャップ結合阻害剤カルべノキソロン （CBX) ( シグマ社） 、 ダルタミナーゼ阻害剤 6_ジァゾ _5_ォキソ一ノルロイシン (DON) (シグマ社） を用いた。
[0089] MOG誘導性の E A Eは、 加藤らの文献 (Kato, H. , I to, A. , Kawanokuch i, J. , Jin, S. , Mi zuno, T. , Oj i ka, K. , Ueda, R. , Suzumura
A. , Pituitary adenylate cyclase - activating polypeptide (PACAP) amel ior ates
experimental autoimmune encepha I omye litis by suppressing the function s of
antigen presenting cells. Multiple Sclerosis. 10, 651-659. 2004)に基 づき、 以下のように作製した。 まず、 200 gの MOG35_55 ペプチドを 1 00 Iの生理食塩水へ溶解した。 また、 300 gの結核菌死菌 H 37 Raを 1 00 Iの不完全フロインドアジュバントへ懸濁した。 次いで、 両 者を混合して角が立つまで泡立てることでェマルジョン化させた後、 6〜 8 週齢の C 57 B LZ6 Jマウスの背尾部に数力所に分けて皮下注射した （2 00 I Zマウス） 。 さらに、 200 n gの百日咳毒素を初日、 2日目に腹 腔内注射した。
[0090] ギャップ結合阻害剤のカルべノキソロン （CBX) の投与は、 以下の 3群 で行った。 すなわち、 投与量は 2 OmgZ体重 k g (CBX 1 ) 、 2mgZ 体重 g (CBX 1 Z1 0) 及び 0. 2 £ 体重1 g (CBX 1 Z1 00 ) とし、 投与方法は免疫初日から隔日腹腔内投与とした。 また、 グルタミナ ーゼ阻害剤 6_ジァゾ _5_ォキソ一Lノルロイシン （DON) の投与は、 以下の 3群で行った。 すなわち、 投与量は 1. 6mgZ体重 k g (DON 1 ) 、 0. 1 6 £ 体重1 g (DON 1/1 0) 及び 0. 01 6mgZ体重 k g (DON 1/1 00) とし、 投与方法は免疫初日から隔日腹腔内投与と した。 なお、 コントロールとしては等量のリン酸緩衝生理食塩水 （PBS) を同様に投与した。 コントロールとしては等量のリン酸緩衝生理食塩水 （P BS) を同様に投与した。
[0091] マウスは、 国際的に使用されている以下の EAE臨床評価スコアに基づいて毎 曰評価した。 各投与群の E A E臨床経過を図 1 7に示し、 発症、 重症病日数 及び最重症スコアについてまとめた結果を図 1 8〜図 20に示す。
E A E臨床評価スコア
0 ：正常
1 ：尾の引きずり又は軽い後肢の脱力
2 ：中程度の後肢の脱力又は中程度の運動失調
3 ：中程度から重症の後肢の脱力
4 ：重症の後肢の脱力、 中程度の前肢の脱力又は中程度の運動失調
5 ：中程度の前肢の脱力を伴う対麻痺
6 ：重症の前肢の脱力、 重症の運動失調を伴う対麻痺又は瀕死
[0092] 図 1 7に示すように、 ギャップ結合阻害剤及びグルタミナーゼ阻害剤の投 与によって E A E臨床評価スコアが抑制されることがわかった。 また、 図 1 8に示すように、 図 1 7に示す臨床経過によれば、 EAEの発症日 （臨床評 価スコアが 1以上となるとき） は、 投与群 CBX 1 Z1 0及び投与群 DON 1において、 有意に （p<0. 05) 発症曰が遅延することがわかった。 ま た、 図 1 9に示すように、 E A E臨床評価スコアが 4以上の重症病曰が投与 群 CBX 1 Z1 0及び投与群 DON 1において有意に （p<0. 05) 減少 していることがわかった。 さらにまた、 図 20に示すように、 最重症スコア が投与群において低下していることがわかった。 以上の結果から、 ギャップ 結合阻害剤及びグルタミナーゼ阻害剤はいずれも神経細胞死、 特に中枢神経 系の神経細胞死を抑制できることがわかつた。

Claims

請求の範囲
[I ] ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生及び Z又は放出を阻害する阻害 活性を有する化合物を含有する、 神経細胞の細胞死阻害剤。
[2] 前記化合物は、 活性化ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生及び Z又 は放出の阻害活性を有する、 請求項 1に記載の細胞死阻害剤。
[3] 前記化合物は、 ダルタミナーゼ阻害剤である、 請求項 1又は 2に記載の細 胞死阻害剤。
[4] 前記化合物は （S ) _ 2—ァミノ _ 6 _ジァゾ _ 5 _ォキソカブロン酸又 はその塩である、 請求項 3に記載の細胞死阻害剤。
[5] 前記化合物は、 ギャップ結合阻害剤である、 請求項 1又は 2に記載の細胞 死阻害剤。
[6] 前記ギャップ結合阻害剤はカルべノキソロン 2ナトリウムである、 請求項
5に記載の細胞死阻害剤。
[7] 前記化合物は、 腫瘍壊死因子阻害剤又は腫瘍壊死因子受容体阻害剤である
、 請求項 1又は 2に記載の細胞死阻害剤。
[8] 前記腫瘍壊死因子阻害剤は抗 T N F一 Of抗体又は可溶性 T N F R 1受容体 である、 請求項 7に記載の細胞死阻害剤。
[9] 前記腫瘍壊死因子受容体阻害剤は、 抗 T N F R 1受容体抗体又は T N F -
Qfアンタゴニストである、 請求項 7に記載の細胞死阻害剤。
[10] 前記化合物は、 ミクログリアの非活性化時におけるグルタミン酸産生量を 維持する範囲で活性化ミクログリアにおけるグルタミン酸産生及び Z又は放 出を阻害する阻害活性を有する、 請求項 1〜 9のいずれかに記載の細胞死阻 害剤。
[I I ] グルタミン酸による興奮性神経障害による細胞死阻害剤である、 請求項 1 〜 1 0のいずれかに記載の細胞死阻害剤。
[12] 神経系疾患の予防■治療剤である、 請求項 1〜 1 1のいずれかに記載の細 胞死阻害剤。
[13] 前記神経系疾患は、 虚血障害、 炎症性神経疾患及び神経変性疾患から選択 される、 請求項 1 2に記載の細胞死阻害剤。
[14] 前記虚血障害は、 脳卒中、 脳出血、 脳梗塞及び脳血管性認知症から選択され る、 請求項 1 3に記載の細胞死阻害剤。
[15] 前記炎症性神経疾患は、 脳炎後遺症、 急性散在性脳脊髄炎、 細菌性髄膜炎、 結核性髄膜炎、 真菌性髄膜炎、 ウィルス性髄膜炎及びワクチン性髄膜炎から 選択される、 請求項 1 3に記載の細胞死阻害剤。
[16] 前記神経変性疾患は、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 筋萎縮性側索 硬化症、 脊髄小脳変性症、 多系統萎縮症及び多発性硬化症から選択される、 請求項 1 3に記載の細胞死阻害剤。
[17] 神経細胞死に関連する疾患の予防 ·治療用組成物であって、
請求項 1〜 1 6のいずれかに記載の細胞死阻害剤と、
薬学的に許容される製剤成分と、
を含有する組成物。
[18] 神経細胞の細胞死阻害剤のスクリーニング方法であって、
ミクログリアにおけるグルタミン酸の産生■放出経路に対する被験化合物 の作用を指標として神経細胞の細胞死阻害剤の効果を評価する、 スクリー二 ング方法。
[19] 前記作用は、 活性化されたミクログリアに対する前記被験化合物のグルタ ミン酸の産生又は放出の阻害作用である、 請求項 1 8に記載のスクリーニン グ方法。
[20] 前記作用は、 前記被験化合物のダルタミナーゼ阻害作用である、 請求項 1
8に記載のスクリーニング方法。
[21 ] 前記作用は、 ミクログリアに対する前記被験化合物のギャップ機能阻害作 用である、 請求項 1 8に記載のスクリーニング方法。
[22] 前記作用は、 ミクログリアに対する前記被験化合物のミクログリア活性化 の阻害作用である、 請求項 1 8に記載のスクリーニング方法。
[23] グルタミンの存在下、 活性化されたミクログリアに被験化合物を供給する 工程と、 前記ミクログリアに関して前記指標を取得する工程と、
前記指標が前記被験化合物の非供給時に比較して前記神経細胞死阻害活性 を肯定できる程度に有意に変化したとき、 前記被験化合物が神経細胞死阻害 活性を有すると判定する工程と、
を備える、 請求項 1 8〜 22のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[24] さらに、 活性化されたミクログリア又はその培養上清と被験化合物との存 在下の神経細胞における以下の （a) 〜 （d) ：
(a) 神経突起ビーズ状変性
(b) 細胞死
(c) 細胞内 A TP濃度
(d) ミトコンドリア損傷
から選択される 1種又は 2種以上に対する被験化合物の作用を指標として神 経細胞の細胞死阻害剤の効果を評価する、 請求項 1 8〜 23のいずれかに記 載のスクリーニング方法。
[25] 前記細胞死阻害剤は、 神経系疾患の予防■治療剤である、 請求項 1 8〜 2 4のいずれかに記載のスクリーニング方法。
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