MX2008007491A - Formulaciones de osteopontin bovino para la mejora del proceso de sanacion de heridas. - Google Patents

Abstract

Formulaciones tópicas que contienen osteopontin bovino para la sanación de heridas mejorada. La herida puede ser infectada o inflamada o puede ser herida diabética.

Description

FORMULACIONES DE OSTEOPONTIN BOVINO PARA LA MEJORA DEL PROCESO DE SANACIÓN DE HERIDAS Campo técnico de la invención La invención se relaciona a formulaciones de ungüentos, líquidos, emplastes y otros dispositivos para sanación de heridas que contienen osteopontin bovino a fin de mejorar el proceso de sanación de heridas para heridas de toda clase, que incluyen heridas difíciles de sanar, tales como heridas inflamadas o infectadas y especialmente heridas en pacientes diabéticos. Antecedentes de la invención Es conocido que los macrófagos, leucocitos nucleares polimorfos, células T y otras células presentes en el líquido linfático asociado con heridas abiertas secretan osteopontin. En ratones se ha mostrado que la expresión de osteopontin se regula hacia arriba tan temprano como 6 horas después de la herida. Los análisis de sanación de heridas en ratones que carecen de un gen de osteopontin funcional (ratones bloqueados) mostraron habilidad deteriorada de sanación de heridas. Estas heridas mostraron un nivel significantemente disminuido de desbridamiento, una desorganización de matriz, y una alteración de fibrilogonesis de colágeno que conducen a fibrillas de colágeno de diámetro más pequeño comparado a la herida en los ratones con un gen de osteopontin funcional. El quitosan está siendo utilizado como' un acelerador de sanación de heridas en medicina veterinaria. El mecanismo- exacto de acción no es conocido. Aunque, el quitosan se ha mostrado que aumenta las acciones inflamatorias de ciertas células inmunes involucradas en la sanación de heridas e induce la expresión de osteopontin mediante aquellas células. Estos descubrimientos sugirieron a los inventores a investigar el efecto de administrar una formulación tópica que contiene osteopontin purificado de leche bovina a diferentes modelos de heridas. Breve descripción de la invención Sorprendentemente se ha encontrado que el osteopontin bovino se puede utilizar para la mejora del proceso de sanación de heridas, si las heridas no están infectadas, infectadas o inflamadas o de pacientes diabéticos, sin ninguna de, las reacciones alérgicas a través de las especies. Descripción detallada de la invención La invención se relaciona a una formulación tópica de sanación de heridas que comprende osteopontin bovino y un adyuvante. El osteopontin bovino es el osteopontin de leche y se puede adquirir de Arla Foods Ingredients, Dinamarca o se puede obtener al pasar suero ácido a través de una resina aniónica fuertemente básica dirigida para la cromatografía similar a la Q Sepharose de Amersham, Reino Unido. El osteopontin se eluye de la columna utilizando NaCl 1 M.' El material eluido se ultrafiltra subsecuentemente y se seca finalmente, por ejemplo utilizando secado por congelación. El adyuvante es un adyuvante normal para formulación tópica, tal como un bálsamo portador para un ungüento . La formulación por ejemplo puede ser un ungüento, un líquido, un polvo o . un emplaste. El adyuvante será seleccionado de aquellos utilizados normalmente para tales formulaciones tópicas. Un ejemplo es carboximetilcelulosa para un ungüento. Un ungüento de la invención tendrá preferiblemente un nivel de osteopontin de 0.01% a 10%. Menor que 0.01% en muchos de los casos no dará el efecto deseado, .y más que 10% será superfluo. Niveles preferidos son 0.1% - 5%, 0.1 - 2%, 0.1 a 1.5 o 0.5% a 1%. La cantidad puede depender del tipo de herida a ser tratada. La invención también se relaciona al uso de osteopontin bovino para la preparación de un fármaco tópico para sanación de heridas mejorada, que incluye sanación de heridas inflamadas y heridas de pacientes diabéticos. Las formulaciones así se pueden utilizar en un método para sanación de heridas mejoradas que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de osteopontin bovino. El paciente puede ser un humano o un animal. En diferentes modelos de heridas de ratón se investigó el efecto del osteopontin bovino, especialmente unos modelos de ratones con diabetes con habilidad de sanación de heridas deteriorada, un modelo comprometido con infección y un modelo de tipo silvestre sano. Se encontró que el tiempo de sanación de heridas se redujo significantemente en todos los modelos por 1-3 días. Sin embargo, la dosis necesaria de osteopontin bovino vario con el modelo utilizado. Se necesitó dosis más baja para el modelo de ratón silvestre y la más alta para el modelo de ratón con infección. La formulación de ungüento se adicionó en cantidades variantes de osteopontin bovino, en el intervalo de 0.1 - 1.5%, para desempeño óptimo dependiendo del modelo. Sorprendentemente los inventores asi pueden establecer que el osteopontin bovino podría ser utilizado para el tratamiento de la mejora de sanación de heridas sin reacciones alérgicas a través de las especies. Resultados farmacéuticos Se han llevado a cabo tres estudios de prueba experimentales utilizando niveles diferentes de osteopontin. El osteopontin bovino se incorporó en un gel estándar que consiste esencialmente de carboximetilcelulosa . En las siguientes cifras de pruebas que se escriben f. ex. como "0,27" (como normal en Danés) debe haber sido correctamente f. ex. "0.27" (como normal en Inglés) . I . Sanación de heridas acelerada en un modelo de sanación de heridas deteriorada Introducción Obj etivo : El propósito del estudio fue probar la eficacia farmacológica del osteopontin sobre la sanación de heridas en un modelo de sanación de heridas reducida en ratones diabéticos de Tipo II. Resumen : 32 ratones db/db ( BKS . Cg-m+/+Leprdb) se dividieron en 4 grupos de 8. Estos ratones desarrollaron diabetes tipo 2 y como resultado tuvieron sanación de heridas reducida. La glucosa en la sangre fue entre 15-20 mM. Adicionalmente 8 ratones de tipo silvestre de la raza C57BLKS/j se utilizaron como controles de sanación de heridas normal . Todos los ratones se anestesiaron, se afeitaron y tuvieron una herida de 8 mm hecha sobre su espalda con un instrumento de biopsia de punción de 8 mm en el día 0. Desde el día 0 - 15 todos los animales se trataron con bálsamo portador o 0.1%, 1% o 10% de bálsamo de Osteopontin aplicado tópico al área herida. Desde el día 1 - 15 todos los animales se marcaron para la apariencia de la herida y tuvieron el diámetro de herida registrado. En los días 1, 4, 10 y 15 los ratones tuvieron su peso registrado. Durante el experimento total los animales se' trataron en el dolor con Rimaldyl como sea necesario. Los resultados mostraron que el tratamiento con Osteopontin trabajó claramente mejor que sin tratamiento en lo absoluto. La dosis al 1.0% de Osteopontin fue superior a las otras dosis de Osteopontin en acelerar la sanación de heridas en ratones diabéticos. La dosis al 0.1% de Osteopontin también fue muy exitosa en acelerar la sanación de heridas. Justificación: El ratón db/db diabético de, tipo II es conocido porque tiene sanación de heridas deteriorada y como tales son una raza obvia para los modelos de sanación de heridas. Calidad El estudio se 1 realizó de acuerdo con los Procedimientos de Operación Estándares, Pipeline Biotech A/S, (SOP's), a menos que de otra manera se establezca. Horario de estudio . Llegada de los animales 21.10.2004 Inicio de tratamiento 07.12.2004 Completacion de trabajo de animales vivos 22.12.2004 Sistema de prueba Artículo de Prueba: Articulo de prueba: Osteopontin, aplicación tópica, 0.1%, 1% y 10% Vehículo: Bálsamo portador Especies , raza y proveedor El estudio se realizó en 32 ratones DB (BKS.Cg-m+/+Leprdb) y 8 C57BLKS/j (considerados de tipo silvestre) de &B-Taconic . Los ratones fueron de 10-12 semanas en la llegada, pero alcanzaron 17-19 semanas de edad antes del inicio del experimento debido a un largo tiempo de espera por el envío de los artículos de prueba. Medio ambiente Los ratones se enjaularon 'individualmente en jaulas de Macrolon estándar de tipo 2. La cama fue papel de filtro. La cama se cambio una vez a la semana en una unidad de flujo laminar. La temperatura fue de 20°C 24°C, y se controló por la vía del sistema de ventilación ambiental en el laboratorio. El ciclo de luz fue de 12-horas de oscuridad y 12-horas de luz (luces sobre 06.00) . Dieta y agua La dieta fue dieta de Harían Teklad 2016.

El agua se esterilizó con UV y las botellas de agua se rellenaron cuando fue necesario durante la aclimatación y experimento. La dieta y el agua se administraron ad libitum. Salud y bienestar animal Los animales tuvieron estado de FELASA SPF y el sistema de alojamiento y cambio se diseñó para asegurar que el estado SPF se preservara durante el estudio. Personal educado bajo supervisión veterinaria manejó los animales. Los registros y decisiones diarias se hicieron con respecto al bienestar animal. Procedimientos pre-experinténtales Procedimientos de aclimatización y- salud Debido al tiempo; de espera para el envió de los artículos de prueba, los animales se aclimataron por tanto como 47 días. Procedimientos experimentales Agrupamiento Grupo animales Raza tratamiento 1 1-8 WT Vehículo 2 9-16 DB Vehículo 3 17-24 DB Osteopontín al 0,1% 4 25.32 DB Osteopontín al 1% 5 33-40 DB Osteopontin al 10% Analgesia Todos los ratones se sometieron a la analgesia mediante la administración de 5 mg/kg s.c. Rimaldyl 1 hora antes de los procedimientos de heridas y una vez al día como se necesitó durante el experimento. Heridas de introducción. Una hora después de la dosificación de Rimaldyl y aproximadamente 15 minutos después de la anestesia de hypnorm/dormicum/la herida se introdujo en cada ratón. La herida se introdujo en la piel dorsal de cada ratón mediante el siguiente procedimiento: 1. La espalda del ratón se afeitó en un área de 2x3 era. 2. ' El instrumento de biopsia de punción de 8 mm se utilizó para hacer un corte circular en el área central del área afeitada. 3. La pieza de piel se levantó un poco y se diseccionó cuidadosamente libre del ratón. 4. Los ratones se regresaron a la jaula. Tratamiento Todos los animal.es tuvieron ya se el vehículo (bálsamo portador) o el bálsamo de Osteopontin aplicado a la herida (0,05 mL) del día 0 (precisamente después de la creación de la herida) al 14 (día antes de la terminación) . La aplicación se realizó precisamente después del registro y medición. Observaciones y mediciones Ningunas mediciones se hicieron el primer día ya que las heridas necesitaron . consolidarse . Pero las heridas se marcaron y se midieron desde el día 1-15 Los diámetros de las heridas se midieron longitudinalmente (sobre la linea que corre sobre la cabeza a la cola) y se registraron cada día. La apariencia de las heridas se marcó y se registró cada día. El peso se registró en el día 1, 4, 10 y 15. Marcación de las heridas Las heridas se marcaron de acuer.do al siguiente sistema : 0: Completamente cicatrizada 1: Herida pequeña todavía detectada. 2: Sin costra pero todavía herida 3: Sin costra original pero nueva costra (la costra vieja se cayó pero la nueva costra se creó) 4: Costra original todavía sobre la herida. Terminación En la terminación los ratones se eutanizaron. Las heridas se diseccionaron bajo condiciones asépticas . Las heridas y aproximadamente el área de 0,5 cm que circunda la herida se colocaron en solución reguladora de formalina (Fluido de Lilly) para estudio adicional como sea necesario. Envío de las muestras al patrocinador Las muestras de heridas se retuvieron hasta aviso adicional del patrocinador. Vista general del estudio Dia Fecha -47 21.10.2004 Animales llegados a Pipeline Biotech 0 07.12.2004 Introducción de heridas , tratamiento 1 08.12.2004 Peso, Medición, marca y tratamiento 2 10.12.2004 Medición, marca y tratamiento 3 10.12.2004 Medición, marca y tratamiento 4 11.12.2004 Peso, Medición, marca y tratamiento 12.12.2004 Medición, marca y tratamiento 6 13.12.2004 Medición, marca y tratamiento 7 14.12.2004 Medición, marca y tratamiento 8 15.12.2004 Medición, marca y tratamiento 9 16.12.2004 Medición, marca y tratamiento 10 17.12.2004 Peso, Medición, marca y tratamiento 11. 18.12.2004 Medición, marca y tratamiento 12 19.12.2004 Medición, marca y tratamiento 13 20.12.2004 Medición, marca y tratamiento 14 21.12.2004 Medición, marca y tratamiento 15 22.12.2004 Peso, Medición y marca, terminación con conservación del área de la piel .

Resultados Las marcas de heridas promedio para cada grupo en el estudio se resumen en la tabla enseguida: Marcación: 0:Completamente cicatrizada 1 : Herida pequeña todavía detectada 2:Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra creada) 4:Costra original todavía sobre la herida Estos resultados se ilustran en la gráfica mostrada enseguida: Marcación : 0: Completamente cicatrizada 1: Herida pequeña todavía detectada. 2 : Sin costra pero todavía herida 3: Sin costra original pero nueva costra (la costra vieja se cayó pero la nueva costra se creó) 4: costra original todavía sobre la herida. Enseguida se muestran resultados de la prueba de suma de Clasificación emparejada Mann-Whitney (prueba de dos muestras Wilcoxon) sobre marcas de herida. Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo t O n.s.: no significante Conclusiones: Grupo 1 : WT; Vehículo Sin señal, diferente del Grupo 2.

Grupo 3: DB; Osteopontin al 0.1 % Sin señal, diferente del Grupo 2.

Grupo 4: DB; Osteopontin al 1 % Marcas significantes más bajas en el Día 9 y 10 que en el grupo 2. Grupo 5: DB; Osteopontin al 10% Sin señal, diferente del Grupo 2. o Mediciones de heridas promedio Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Estos resultados se ilustran gráfica mostrada enseguida.

Enseguida se muestran resultados de las pruebas F-y del Estudiante sobre los Diámetros de la Herida. Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo 2.

Grupo Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15 1 — ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 2 - - - - - - - - - - - - - - - 3 — ns ns ns ns ns ns <0,05 ns ns <0,01 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 4 — ns ns ns ns ns ns ns <0,05 <0,01 <0,01 <0,05 <0,05 ns ns — ns <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 ns ns ns ns ns ns ns ns n.s.: no significante Los resultados del análisis estadístico de AUC (Area Bajo la Curva) de los diámetros de la Herida son como sigue: (Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo 2).

Grupo 1 : <0.01 Grupo 3: <0.01 Grupo 4: <0.01 Grupo 5: <0.01 Conclusiones : Grupo 1; WT; Vehículo Generalmente señal. Diámetros más grandes que Gr.2 Grupo 3: DB; Osteopontin al 0.1% Generalmente señal. Diámetros más pequeños que Gr, 2. Grupo 4: DB; Osteopontin al 1% Generalmente señal. Diámetros más pequeños que Gr. 2 Grupo 5: DB; Osteopontin al 10% Generalmente señal. Diámetros más pequeños que Gr. 2 Áreas de heridas: Enseguida se muestran resultados de las pruebas t de F- y del Estudiante sobre Áreas de Heridas: Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo 2. n s.: no significante Los resultados del análisis estadístico de AUC (Area Bajo la Curva) de los diámetros de la Herida son como sigue. (Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo 2). Grupo 1 : <0.05 Grupo 3: No significante Grupo 4: No significante Grupo 5: No significante Conclusiones : Grupo 1; WT; Vehículo Generalmente señal áreas más grandes que Gr .2 Grupo 3: DB; Osteopontin al 0.1% señal áreas más pequeñas que Gr. 2 en los Días 8,11, 12 y 13. Grupo 4: DB; Osteopontin al 1% señal Áreas más' pequeñas que Gr . 2 en los Días 9, •10, 11, 12 y 13:. Grupo 5: DB; Osteopontin al 10% señal áreas más grandes que grandes que Gr . 2 en los Días 3, 4, 5, 6 y 7. Áreas de Heridas relativas al Día 1: Enseguida se muestran Los resultados de las pruebas t, F- y del estudiante sobre el área de Heridas relativas al Día 1. Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo 2.

Los resultados del análisis estadístico de AUC (Area Bajo la Curva) de los diámetros de la Herida son como sigue: (Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo 2).

Grupo 1 No significante Grupo 3 No significante . Grupo 4 No significante Grupo 5 No significante Conclusiones : Grupo 1; WT; Vehículo Areas de heridas significantemente más grandes que el Grupo 2 (DB, Vehículo) en el día 8, 11 y 12. Grupo 3: DB; Osteopontin al 0.1% No se desvían significantemente del Grupo 2. Grupo 4: DB; Osteopontin al 1% Áreas de heridas significantemente más pequeñas que el Grupo 2 (DB, Vehículo) en el 2, 9, 10, 11 y 12. Grupo 5: DB; Osteopontin al 10% Áreas de heridas significantemente más grandes que el Grupo 2 el día 7. Conclusión El bálsamo al 1.9% de Osteopontin fue mucho más exitoso en acelerar la sanáción de heridas en ratones diabéticos. Un efecto positivo claro se vio sobre tanto las marcas de heridas como el tamaño de herida. Un efecto positivo también se observó sobre el tamaño de la herida en animales tratados con Osteopontin al 0.1%. Archivo El reporte final asi como los datos básicos y Los resultados se mantienen en los archivos de Pipeline Biotech A/S durante un periodo de cinco (5) años desde a partir del final del estudio. o Tabla 1 : Marcas de heridas: Marcación: 0:Completamente cicatrizada 1.Herida pequeña todavía detectada 2:Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida. o Tabla 1 : Marcas de heridas ícontd.) Marcación: 0:Cormpletamente cicatrizada -.Herida pequeña todavía detectada 2:Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida. o Tabla 1 : Marcas de heridas (contd.) Marcación: 0:Completamente cicatrizada 1 :Herida pequeña todavía detectada 2:Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida. o Tabla 1 : Marcas de heridas (contd.) Marcación: 0:Completamente cicatrizada 1 :Herida pequeña todavía detectada 2: Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida. o Tabla 1 : Marcas de heridas (contcl.) Marcación: 0:Completamente cicatrizada 1 :Herida pequeña todavía detectada 2:Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida.

Tabla 2: Mediciones de heridas Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 2: Mediciones de heridas (Contd.l Todas las heridas se midieron sobre la linea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 2: Mediciones de heridas (Contd.) i Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 2: Mediciones de heridas íContd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 2: Mediciones de heridas fContd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 3: Areas de heridas Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 3: Areas de heridas (contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 3: Areas de heridas (contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 3: Areas de heridas (contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 3: Areas de heridas (contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 4:Areas de heridas relativas al Día 1 Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 4:Areas de heridas relativas al Día 1 (Contd.) Todas'las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 4:Areas de heridas relativas al Pía 1 (Corttd.) Todas las heridas se midieron sobre la linea que va de la cabeza aja cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 4:Areas de heridas relativas al Día 1 (Contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 4:Areas de heridas relativas al Día 1 ÍContd.) Todas las heridas se midieron sobre la linea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 5 : Pesos de animales II. Sanación de heridas acelerada en un modelo de infección de heridas Introducción Objetivo : El propósito del estudio fue para probar la eficacia farmacológica del Osteopontin sobre la sanación de heridas en un modelo de infección de heridas en ratones. Esta parte del reporte presenta datos y resultados para solo los ratones infectados. Resumen : 4 grupos de 8 ratones C57BL/6J se anestesiaron, se afeitaron y tuvieron una herida de 8 mm hecha sobre su espalda con un instrumento de biopsia de punción de 8 mm en el día 1. Los animales luego tuvieron sus heridas infectadas con PBS 50 µ? que contiene CFU lxlO5 de 'staphylococcus aureus.

Todas las heridas infectadas luego se cubrieron con moldes de burbujas "Compeel". Los moldes podrían ser abiertos para tratamiento con bálsamos. El tratamiento inició en el Día 1. Los grupos se trataron como sigue: Grupo 4: + infección; bálsamo vehículo. Grupo 5: + infección; bálsamo de OPN al 0.5%. Grupo 6: + infección; bálsamo de OPN al 1.0% Grupo 7: + infección; bálsamo de OPN al 1.5%. El tratamiento se repitió diariamente durante 15 días. Al mismo tiempo las heridas se marcaron y se midieron desde el Día 1 al Día 15. El tratamiento de heridas infectadas con osteopontin al 1.5% en el bálsamo tuvieron un efecto positivo claro sobre la sanación de heridas como se reflejo por las marcas de heridas reducidas heridas de sanación más rápidas. Ningunos efectos se observaron con 0.1 y 1.0% de osteopontin en los bálsamos. Justificación : Las heridas infectadas son comunes en hospitales después de la cirugía, heridas de quemaduras y las similares.-Es especialmente relevante tener opciones de tratamiento eficientes cuando se trata con pacientes inmunocomprometidos . " Articulo de prueba Descripción , identificación y almacenamiento . Artículo de prueba: Osteopontin, aplicación tópica, 0.5%, 1.0% y 1.5% Vehículo: Bálsamo portador Preparación: La solución de extracto y dosis preparada Pipeline de Osteopontin en bálsamo. La solución de extracto se hizo en el inicio del estudio. Las soluciones de dosis se almacenaron en el refrigerado . Análisis de formulación: No realizado Concentración y almacenamiento, estabilidad y homogeneidad : El polvo de Osteopontin se almacenó a temperatura ambiente . La solución de extracto de' Osteopontin se almacenó en refrigerador. Sistema de prueba Especies , raza proveedor El estudio se realizó en 32 ratones C57BL/6J hembras, 7-8 semanas, de &B-Taconic. Medio ambiente Los ratones se alojaron 4 en una jaula en jaulas' Macrolon estándares de tipo 2. La capa se cambió una vez a la semana en una unidad de flujo laminar. La temperatura fue de 20°C a 24°C, y se controló por la vía del sistema de ventilación ambiental en el laboratorio. El ciclo de luz fue de 12 horas en la oscuridad y 12 horas en la luz (luces en 06.00). Dieta y agua La dieta fue dieta de Altromin 1314. El agua se esterilizó con UV y las botellas se rellenaron cuando fue necesario durante la aclimatización y el experimento. La dieta y el agua se administraron ad libitum. Salud y bienestar del animal Los animales tuvieron estado de FELASA SPF y el sistema de alojamiento y cambio se designó para asegurar que el estado SPF se preservara durante el estudio. Personal adecuado bajo supervisión veterinaria manejó los animales. Los registros y decisiones diarias se hicieron concernientes al bienestar del animal. Procedimientos pre-experinténtales Procedimientos de aclimatización y salud Los animales se aclimataron durante aproximadamente 7 días. Cultivo bacteriano Staphylococcus aureus (raza de tipo silvestre Pipeline) . Concentración Bacteriana: 2xl06 cfu/mL Procedimientos experimentales Agrupamiento en el Día 1, los ratones se agruparon y se dosificaron de acuerdo al siguiente arreglo: Concentración bacteriana: 2xl06 cfu/mL Analgesia Todos los ratones se sometieron a analgesia mediante la administración de 5 mg/kg s.c. Rimadryl 1 hora antes de los procedimientos de heridas . Introducción de heridas Una hora después de la dosificación de Rimadryl y aproximadamente 15 minutos después de la anestesia quirúrgica se indujo, una herida se indujo sobre cada ratón. Una herida se introdujo sobre la piel dorsal de cada ratón mediante el siguiente procedimiento: 1. La espalda del ratón se afeitó en un área de 2x3 cm. 2. El instrumento de biopsia de punción de 8 mi se utilizó para hacer un corte circular en el área central del área afeitada. 3. La pieza de piel se levantó un poco y se diseccionó cuidadosamente libre del ratón. Esto se siguió mediante la inoculación de las heridas por Staph, aureus de acuerdo al siguiente procedimiento: 1. 50 µ? de PBS con el cultivo bacteriano se colocaron dentro del área de herida mediante una pipeta. 2. Todas las heridas se cubrieron con moldes de burbujas "Compeel". 3. Los ratones luego se alistaron para tratamiento. Tra tamiento El tratamiento inició en el Día 1. Una ventana se cortó en los moldes de "Compeel" de los ratones. Los bálsamos luego se aplicaron a todos los grupos de tratamiento como se describe en la sección 5.1. El . Grupo 4 se trató con el bálsamo portador, el Grupo 5 se trató con OPN al 0.5% en bálsamo, el Grupo 6 se trató con OPN al 1.0% en bálsamo y el Grupo 7 se trató con OPN al 1.5% en bálsamo. Los bálsamos se aplicaron cuidadosamente de manera tópica a las heridas. El tratamiento se repitió diariamente durante 15 días . Observaciones y mediciones • Las heridas se marcaron y se midieron a parir de los Días 1-15. Los' diámetros de las heridas se midieron longitudinalmente (sobre la linea corre desde la cabeza a la cola) y se registraron cada1 dia) . La apariencia de las heridas se marcó y se registro cada dia de acuerdo al siguiente sistema: 0: Complejamente cicatrizada 1: Medida pequeña1 detectada. 2 : Sin costra pero todavía herida 3: Sin costra original pero nueva costra (la costra vieja se costra se cayó pero la nueva costra se creó) 4: Costra original todavía sobre la herida. Los pesos corporales se registraron en los Días 1, 5, 8, 12 y 15. Terminación En la terminación los ratones se eutanizaron. Vista general del estudio Día Fecha -7 03.03.2005 Animales llegados a Pipeline Biotech Aclimatización 1 10.03.2005 Introducción de heridas . Inoculación de heridas con Staph. Aureus . Heridas cubiertas por moldes de "Compeel" Tratamiento, mediciones y marcación 2 Tratamiento, mediciones y marcación 3 Tratamiento, mediciones y marcación 4 Tratamiento, mediciones y marcación, pesos corporales 5 Tratamiento, mediciones y marcación 6 Tratamiento , mediciones y marcación 7 Tratamiento, mediciones y marcación, pesos corporales 8 Tratamiento , mediciones y marcación 9 Tratamiento, mediciones y marcación 10 Tratamiento, mediciones y marcación 11 Tratamiento, mediciones y marcación, pesos corporales 12 Tratamiento, mediciones y marcación 13 Tratamiento, mediciones y marcación 14 Tratamiento, mediciones y marcación 15 24.03.2004 Tratamiento , mediciones y marcación, pesos corporales Terminación Resultados Marcas de Heridas Los resultados se muestran en la Tabla 1 (apéndice) . Los datos se analizaron estadísticamente por la prueba de suma de Clasificación emparejada Mann-Whitney (prueba de dos muestras Wilcoxon) . Los resultados en los grupos de prueba se compararon al Grupo 4. Los resultados de los análisis estadísticos fueron como sigue: Grupo Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15 4 - - - - - - - - - - 5 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 6 ns ns ns ns ; ns ns ns 0.05 ns ns 7 ns 0.05 ns ns ns 0.02 0.05 0.01 ns 0.05 n . s . : no significante Conclusiones : Grupo 4: + infección; bálsamo vehículo. Grupo 5: + infección; bálsamo de OPN al 0.5%. No diferente del Gr. 4 Grupo 6: + infección; bálsamo de OPN al 1.0%. Marcas Significantemente más bajas que el Gr .4 en el día 13 Grupo 7: + infección; bálsamo de OPN al 1.5%. Marcas significantemente más bajas que el Gr.'4 en los días 7, 11, 12, 13 y 15 Diámetros de Heridas Los resultados se muestran en la Tabla 2 (apéndice) . Los datos se analizaron estadísticamente mediante las pruebas t, F y del estudiante. Los resultados en los grupos de prueba se compararon al Grupo . Los resultados de los análisis estadísticos fueron como sigue: (Area Bajo la Curva) de los diámetros de la Herida son como sigue: (Los resultados en los grupos de prueba se compararon al Grupo 4).

Grupo 5: No significante Grupo 6: No significante Grupo 7: No significante Conclusiones : Grupo 4: + infección; bálsamo vehículo. Grupo 5: + infección; bálsamo de OPN al 0.5%. Señal, diámetros más pequeños en el Día 13 que el Grupo 4. Pero generalmente nada de señal, diámetros más pequeños que el grupo 4. Grupo 6: + infección; bálsamo de OPN al 1.0%. Generalmente nada de señal, diámetros más pequeños que el Grupo 4. Grupo 7: + infección; bálsamo de OPN al 1.5%. Señal, diámetros más pequeños en los Días 8, 11, 12 13 y 15 que en el Grupo 4. Pero generalmente nada de señal, diámetros más pequeños que el grupo . Áreas de Heridas Los resultados se muestran en la Tabla 3 (apéndice) . Los datos se analizaron estadísticamente mediante las pruebas t de F- y de Estudiante. Los resultados en los grupos de prueba se compararon al Grupo 4 : Los resultados de los análisis estadísticos fueron como sigue: compararon ai Grupo 4).

Grupo 5: No significante Grupo 6: No significante Grupo 7: No significante Conclusiones: Grupo 4: + infección; bálsamo vehículo. Grupo 5: + infección; bálsamo de OPN al 0.5%. Generalmente nada de señal, áreas más pequeñas 'que el Grupo 4. Grupo 6: + infección; bálsamo de OPN al 1.0%. Generalmente nada de señal, áreas más pequeñas que el Grupo 4. Grupo 7:- + infección; bálsamo de OPN al 1.5%. Señal, diámetros más pequeños en los Días 8, 11, 12 y 13 que el Grupo 4. Pero generalmente nada de señal, áreas más pequeñas que el grupo . Áreas de Heridas relativas al Día 1 Los resultados se muestran en la Tabla 4 ( apéndice ) . Los datos se analizaron estadísticamente mediante las pruebas t de F- y de Estudiante. Los resultados en los grupos de prueba, se compararon al Grupo 4. Los resultados de los análisis estadísticos fueron como sigue: Grupo Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15 4 - - - -. - - - - - - - - - - - 5 - <0,05 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 6 - ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns 7 - ns ns ns ns ns ns <0,05 ns ns ns <0,05 ns ns ns Los resultados del análisis estadístico de AUC (Area Bajo la Curva) de los diámetros de la Herida son como sigue: (Los resultados en los grupos de prueba se compararon al Grupo 4).

Grupo 5: No significante Grupo 6: No significante Grupo 7: <0.05 Conclusiones : Grupo 4: + infección; bálsamo vehículo. Grupo 5: + infección; bálsamo de OPN al 0.5%. Generalmente nada de señal, áreas más pequeña que el Grupo 4. Grupo 6: + infección; bálsamo de OPN al 1.0%. Generalmente nada de señal, áreas más pequeñas que él Grupo 4. Grupo 7: + infección; bálsamo de OPN al 1.5%. Generalmente señal, áreas más pequeñas que el Grupo 4. Conclusión " El tratamiento con bálsamo de osteopont'in al 1.5% disminuyó claramente las marcas de heridas de las heridas infectadas durante la última semana del tratamiento. Asi, el bálsamo de osteopontin al 1.5% tuvo un efecto positivo sobre la sanación de estas heridas. El mismo efecto positivo se observó solamente en el Día 13 para animales tratados con bálsamo de osteopontin al 1;.0%. Ningún efecto se observó con el bálsamo de Osteopontin al 1.0%. El bálsamo de osteopontin al 1.5% también tuvo un efecto positivo marcado sobre el tamaño de la herida, como se refleja en los diámetros de; herida, áreas de heridas y área de heridas relativas. El mismo efecto positivo no se observó con las concentraciones más bajas de osteopontin en los bálsamos . Archivo El reporte final así como los datos básicos y Los resultados se mantienen en los archivos de Pipeline Biotech A/S durante un periodo de cinco (5) años desde el final del estudio . o Tabla 1 : Marcas de heridas: Marcación: O.Completamente cicatrizada 1 :Herida pequeña todavía detectada 2:Sin costra pero todavía herida 3. Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida. o Tabla 1 : Marcas de heridas (contd.) Marcación: 0:Completamente cicatrizada 1. Herida pequeña todavía detectada 2:Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida.

O Tabla 1 : Marcas de heridas (contd.) Marcación: 0:Completamente cicatrizada 1 .Herida pequeña todavía detectada 2:Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida.

O Tabla 2: Marcas de heridas (contd.) Marcación: 0:Completamente cicatrizada · 1 : Herida pequeña todavía detectada 2:Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida. o Tabla 2: Diámetros de heridas Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 2: Diámetros de heridas (Contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entré la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 2: Diámetros de heridas (Contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 2: Diámetros de heridas (Contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 3: Areas de heridas Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Tabla 3: Areas de heridas (Contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 3: Areas de heridas (Contd.) Todas las heridas se midieron sobre la linea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 3: Areas de heridas (Contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 4: Areas de heridas relativas o Tabla 4: Areas de heridas relativas (Contd.l Día de medición (Areas de heridas relativas al Día 1) ; Animal 1 2 3 4 "5 6 ,-7 · 8 9 ..¦ 10 11 12 13 14 15 33 1,00 0,93 0,75 0,94 0,88 0,73 0,85 0,93 0,1 0,16 0,19 0,09 0,14 0,13 0,03 34 1,00 0,88 1,02 1,15 1,19 0,87 0,39 0,28 0,15 0,17 0,17 0,04 0,01 0,00 0,00 1,00 1,31 1,35 1,26 1,67 1,62 1,59 1,44 0,42 0,31 0,35 0,29 0,04 0,00 0,00 36 1,00 0,58 0,50 1,05 0,58 0,77 0,71 0,19 0,21 0,16 0,15 0,03 0,00 0,00 0,00 37 1,00 0,78 0,66 0,63 0,70 0,59 0,22 0,24 0,25 0,15 0,10 0,03 0,01 0,01 0,05 38 1,00 1,17 0,76 0,95 0,96 0,76 0,39 0,48 0,39 0,39 0,31 0,06 0,06 0,04 0,00 39 1,00 0,90 0,75 0,51 0,52 0,75 0,71 0,70 0,51 0,65 0,22 0,10 0,02 0,01 0,01 40 .· 1,00 1,30 1,01 1,11 1,29 1,05 1,03 0,44 0,26 0,18 0,14 0,02 0,00 0,00 0,00 Medio 1,0 0,9 0,8 0,9 0,9 0,8 0,6 0,5 0,3 0,2 0,2 0,1 0,0 0,0 0,0 Dev. Est. 0,0 0,3 0,3 0,3 0,4 0,3 0,4 0,4 0,1 0,2 0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 o Tabla 4: Areas de heridas relativas (Contd.) 6 Día de medición (Areas de heridas relativas al Día 1) ¦,. .· ·'" , ' - Animal 1 2 4 5 r 6 ¦ 7 8 : 9 v 10 11 12 13 14 15 41 1,00 0,56 0,59 0,66 0,60 0,18 0,14 0,11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 42 V- 1,00 0,79 0,70 0,72 0,70 0,57 0,29 0,15 0,09 0,09 0,10 0,01 0,00 0,00 0,00 43 1,00 0,68 0,61 0,64 0,69 0,33 0,12 0,10 0,08 0,08 0,06 0,01 0,00 0,00 0,00 44 1,00 0,73 0,69 1,34 2,39 0,90 1,23 1,37 1,37 1,45 0,77 0,44 0,20 0,21 0,10 45 1,00 0,97 1,02 0,93 0,99 0,99 0,93 0,46 0,46 0,45 0,15 0,05 0,02 0,00 0,00 46 1,00 1,22 0,93 0,86 0,94 1,01 1,28 1,31 1,39 1,57 1,41 1,45 0,46 0,51 0,54 47 1,00 1,68 1,59 1,03 1,54 0,77 0,71 0,35 0,35 0,38 0,19 0,01 0,00 0,00 0,00 48 1,00 1,27 1,12 1,11 1,14. 1,10 0,33 0,33 0,33 0,17 0,08 0,00 0,00 0,00 0,00 Medio 1,0 0,9 0,9 0,9 1,0 0,7 0,5 0,4 0,3 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0 0,0 Dev. Est. 0,0 0,4 0,3 0,2 0,6 0,3 0,5 0,5 0,6 0,6 0,5 0,5 0,2 0,2 0,2 O Tabla 4: Areas de heridas relativas (Contd.i 7 Dia de medición (Areas de heridas relativas al Día 1) l„. " Animal 1 .,. 2 3 4 ¦· -.¾;. 5 6 7 9 .,.„ .. 10 11 12 13 14 15 49. •1 ,00 1 ,26 0,75 0,84 0,86 0,92 0,88 0,54 0,29 0,23 0,21 0,00 0,00 0,00 0,00 50 1 ,00 0,63 0,37 0,50 0,42 0,51 0,53 0,50 0,55 0,34 0,14 0,04 0,03 . 0,03 .0,00 51 1 ,00 1 ,06 0,88 1 ,57 0,88 1 ,34 1 ,56 0,61 0,60 0,38 0,38 0,04 0,00 0,00 0,00 52 1 ,00 0,85 0,63 0,84 0,89 0,83 0,16 0,15 0,08 0,05 0,03 0,00 0,00 0,00 0,00 53 1 ,00 0,78 0,98 0,79 0,89 0,87 0,14 0,14 0,14 0,07 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 54 1 ,00 0,49 0,37 0,56 0,48 0,49 0,12 0,13 0,04 0,11 0,04 0,01 0,00 0,00 0,00 55 1 ,00 0,74 0,55 0,77 0,55 0,57 0,34 0,08 0,02 0,02 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00 56 1 ,00 0,72 0,76 0,94 0,73 0,60 0,37 0,38 0,26 0,21 0,14 0,06 0,00 0,00 0,00 Medio 1,0 0,8 0,6 0,8 0,7 0,7 0,4 0,3 0,2 0,2 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 Dev. Est. 0,0 0,2 0,2 0,3 0,2 0,3 0,5 0,2 0,2 0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 Tabla 5 : Pesos de animales Día de medición (g) Grupo Animal 1 4 7 11 15 4 25 23,0 24,2 24,5 24,4 24,1 26 21,4 24,1 23,9 22,9 23,2 27 21,4 24,3 24,7 24,0 24,4 28 18,9 21,5 23,4 23,1 22,3 29 21,7 24,5 24,1 23,9 22,8 19,3 20,1 21,9 22,0 21,8 31 18,4 20,7 22,0 21,7 22,6 32 20,0 21,5 22,2 21,5 21,4 Medio 20,5 22,6 23,3 22,9 22,8 Dev. Est. 1,6 1,8 1,2 1,1 1,0 ¾ 33 . i 18,6 21,3 22,2 23,3 23,7 34 Ví 18,3 19,4 21,1 21,1 23,6 .» ¦¦?;? !S 35 21,5 23,8 25,0 23,2 23,8 36 ¾ 20,5 23,6 23,8 24,0 24,3 37 ,. ·" . 21,9 23,7 25,0 24,0 24,8 38 "'" 21,6 22,9 23,4 24,0 24,3 39 ¦ 18,2 20,6 21,6 21,5 21,9 40 :'.?í- 20,1 22,9 23,9 23,7 23,6 Medio 20,1 22,3 23,3 23,1 23,8 Dev. Est. 1,5 1,6 1,5 1,2 · 0,9 6 41 ¦.. 23,4 25,5 26,6 25,8 26,4 42 "'; ¦ -; 21,0 22,4 22,0 21,4 21,3 43 ¦-' 21,8 23,9 24,4 23,3 22,9 ;·44 : ··: *¦» 21,0 22,9 23,6 23,0 22,7 45 17,6 18,8 21,5 20,9 21,2 ,46 ;: . 1 ¦ 17,4 18,2 19,9 20,1 21,5 '¦·:. ' ' ¾¦ 47 - ¦ 20,5 22,8 22,7 20,1 22,9 t. · 48 £ 19,2 19,4 20,2 22,9 23,5 Medio 20,2 21,7 22,6 22,2 22,8 Dev. Est. 2,1 2,6 2,2 1,9 1,7 ,7 ¦; :;¦;· 49 23,6 23,8 24,5 24,2 24,2 50 19,9 22,5 22,7 22,0 23,1 51 19,8 22,5 22,7 22,1 21,9 52 19,9 21,9 22,3 21,9 23,1 53 22,6 24,5 24,7 23,8 23,8 54 21,9 24,2 23,6 24,3 25,0 55 23,3 24,4 24,6 24,6 24,8 56 19,4 20,6 21,0 21,2 21,8 Medio 21,3 23,1 23,3 23,0 23,5 Dev. Est. 1,7 1,4 1,3 1,3 1,2 Tabla 6: Pesos animales, relativos al día' 1 III. Sanación de heridas acelerada en ratones de tipo silvestre Introducción ; Obj etivo : El propósito del estudio fue para probar la eficacia farmacológica del Osteopontin sobre la sanación de heridas en ratones de tipo silvestre normales. Resumen: Tres grupos de 8 ratones C57BL/6J se anestesiaron, se afeitaron y tuvieron una herida de 8 · mm hecha de su espalda con un instrumento' de biopsia de punción de 8 mm en el Día 2. Los grupos se trataron con Osteopontin (OPN) en bálsamo como sigue: Grupo 1 : Bálsamo vehículo. Grupo 2: Bálsamo de OPN al 0.1% . Grupo 3: Bálsamo de OPN al 1.0%. El tratamiento se repitió diariamente durante 15 días. Al mismo tiempo las heridas se marcaron y se midieron desde el Día i al Día 15. El tratamiento de las heridas de los ratones con bálsamo de OPN al 0.1% parecieron que tiene un efecto positivo significante sobre la sanación de heridas en la última parte del proceso de sanación. Articulo de Prueba Descripción , identificación y almacenamiento : Articulo de prueba: Osteopontin, aplicación tópico, 0.1% y 1.0% Vehículo: Bálsamo portador Preparación: Solución de extracto y dosificación preparada de Pipeline de Osteopontin en bálsamo. La solución de extracto se hizo en el inicio del estudio.- Las soluciones de dosificación se almacenaron en el refrigerador . Análisis de formulación No realizado Concentración y almacenamiento, estabilidad y homogeneidad: El polvo de Osteopontin se almacenó a temperatura ambiente. La solución de extracto de Osteopontin se almacenó en el refrigerador. Sistema de prueba Especies , raza y proveedor El estudio realizó en 24 ratones C57BL/6J hembras,' 7-8 semanas de M&B-Taconic . Medio ambiente Los ratones se alojaron 4 en una jaula en jaulas Macrolon estándares de tipo 2.

La cama se cambio una vez a la semana en una unidad de flujo laminar. La temperatura fue de 20°C a 24°C, y se controló por la vía del sistema de ventilación ambiental en el laboratorio. El ciclo de luz fue de 12 horas en la oscuridad y 12 horas en la luz (luces en 06.00) . Dieta y Agua La dieta fue dieta de Altromin 1314. El agua se esterilizó con UV y las botellas de agua se rellenaron cuando fue necesario durante la aclimatización y experimento. La dieta y el agua se administraron ad libitum. Sanación y bienestar animal. Los animales tuvieron estado de FELASA SPF y el sistema de alojamiento y cambio se designó para asegurar que el estado de SPF se conservó durante el estudio. Personal educado bajo supervisión veterinaria manejó los animales. Los registros y decisiones diarios se hicieron concernientes al bienestar animal. Procedimientos pre-experimentales Procedimientos de aclimatización y sanación Los animales se aclimataron durante aproximadamente 7 días. Procedimientos experimentales Agrupamiento En el Día 2 los ratones se agruparon de acuerdo guíente arreglo: Analgesia Todos los ratones . se sometieron a la analgesia mediante la administración de 5 mg/kg s.c. Rimadryl 1 hora antes de los procedimientos de heridas. - Heridas de introducción Las heridas se introdujeron en los ratones en el Día 1. Una hora después de la dosificación del Rimadryl y aproximadamente 15 minutos después de la anestesia quirúrgica se indujo, una herida se indujo sobre cada ratón. La herida se introdujo sobre la piel dorsal de cada ratón mediante el siguiente procedimiento: 1. La espalda del ratón se afeitó en un área 3x3 cm 2. El instrumento de biopsia de punción de 8 mi se utilizó para hacer un corte circular en el' área central del área afectada. 3. La pieza de piel se levanto un poco y se diseccionó cuidadosamente libre del ratón.

Tra tamiento el tratamiento comenzó en el día 1. Los bálsamos luego se aplicaron a todos los grupos de tratamiento como sé describe en la sección 5.1. · El Grupo 1 se trató con bálsamo portador, el Grupo 2 se trató con 0.1% OPN al 0.1% en el bálsamo y el Grupo 3 se trató con OPN al 1.0% OPN en bálsamo. Los bálsamos se aplicaron cuidadosamente de manera tópica las heridas. El tratamiento se repitió diariamente durante 15 días. Observaciones y mediciones Las heridas se marcaron y se midieron a partir de los días 1-5. Los diámetros de las herida-s se midieron longitudinalmente (sobre la linea que corre desde la cabeza a la cola) y se registraron cada día. La apariencia de las heridas se marco y se registro cada día de acuerdo al siguiente sistema: 0: Completamente cicatrizada 1: Herida pequeña todavía detectada. 2: Ninguna costra pero todavía herida 3: Ninguna costra original pero nueva costra (la costras vieja pero la nueva costra se creó) 4: Costra origina todavía sobre la herida. Los pesos corporales se registraron en los Días 1, 5, 8, 12 y terminación En la terminación los ratones se eutanizaron. Vista general del estudio Dia Fecha -7 03.03.2005 Animales llegados a Pipeline Biotech Aclimatización 1 10.03.2005 Introducción de heridas . Tratamiento , mediciones y marcación 2 Tratamiento, mediciones y marcación 3 Tratamiento, mediciones y marcación 4 Tratamiento, mediciones y marcación, pesos corporales 5 Tratamiento, mediciones y marcación 6 Tratamiento, mediciones y marcación 7 Tratamiento, mediciones y marcación, pesos corporales 8 Tratamiento, mediciones y marcación 9 Tratamiento, mediciones y marcación 10 Tratamiento, mediciones y marcación 11 Tratamiento, mediciones y marcación, pesos corporales 12 Tratamiento, mediciones y marcación 13 Tratamiento, mediciones y marcación 14 Tratamiento, mediciones y marcación 15 24.03.2004 Tratamiento, mediciones y marcación, pesos corporales Terminación Resultados Marcas de Heridas Los resultados se muestran en la Tabla 1 (apéndice) . Los datos se analizaron estadísticamente mediante la prueba de suma de Clasificación emparejada Mann-Whitney (prueba de dos muestras Wilcoxon) . Los resultados en los grupos de prueba se compararon al Grupo 1. Los resultados del análisis estadístico fuero como sigue: n.s.: no significante Conclusiones : Grupo 1: bálsamo vehículo. Grupo 2: bálsamo de OP al 0.1%. Nada diferente del Gr. 1 Grupo 3: bálsamo de OP al 1.0%. Nada diferente del Gr . 1 Diámetros de Heridas Los resultados se muestran en la Tabla 2 ( apéndice ) . Los datos se analizaron estadísticamente mediante las pruebas t, F- y del Estudiantes emparejadas. Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo 1. Los resultados del análisis estadístico fueron como sigue. o n.s.: no significante Los resultados del análisis estadístico de AUC (Area Bajo la Curva) de los diámetros de la Herida son como sigue: (Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo 1). Grupo 2: p <0.05 Grupo 3: p <0.05 Conclusiones : Grupo 1. bálsamo' vehículo Grupo 2: bálsamo de OPN al 0.1%. Generalmente diámetros significantemente más bajos que -el Gr. 1 Grupo 3: bálsamo de OP al - 1.0%. Generalmente diámetros significantemente más bajos que el Gr. 1 Áreas de heridas Los resultados se muestran en la Tabla 3 (apéndice) . Los datos se analizaron estadísticamente mediante las pruebas t de F- y del Estudiante emparejadas. Los resultados de los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo 1. Los resultados del análisis estadístico fueron como sigue: o n.s.: no significante Los resultados del análisis estadístico de AUC (Area Bajo la Curva) de los diámetros de la Herida son como sigue: (Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al. Grupo 1).

Grupo 2: <0.05 Grupo 3: No significante Conclusiones : Grupo 1: bálsamo vehículo. Grupo 2: bálsamo de OP al 0.1%. Generalmente áreas significantemente más bajas que el Gr.. 1 Grupo 3: bálsamo de OP al 1.0%. áreas de heridas significantemente más bajas en los días 7 y 12. Áreas de heridas relativo al Día 1 Los resultados se muestran en la Tabla 4 (apéndice) . Los datos se analizaron estadísticamente mediante las pruebas t, F- y del estudiante emparejadas. Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo 1. Los resultados del análisis estadístico fueron como sigue: n s.: no significante Los resultados del análisis estadístico de AUC (Area Bajo la Curva) de los diámetros de la Herida son como sigue: (Los resultados en los grupos de control y de prueba se compararon al Grupo 1 ).

Grupo 2: No significante Grupo 3: No significante Conclusiones : Grupo 1. bálsamo vehículo Grupo 2: bálsamo de OPN al 0.1%. áreas de heridas relativas significantemente más bajos que el Gr. En los días 10, 11 y 12. Grupo 3: bálsamo de OP al 1.0%. Nada diferente del Grupo 1 Pesos corporales Los pesos corporales de los animales se muestran en la Tabla 5 y 6 (apéndice) . Nada de diferencias en los pesos corporales se observaron entre los grupos. Copiar Conclusión Nada de diferencia se observó en las marcas de heridas entre los tres grupos. Tanto el Grupo 2 (OPN al 0.1%) como el Grupo 3 (OPN al 1.0%) tuvieron diámetros de heridas significantemente más bajos que el Grupo 1 (vehículo) . Cuando las áreas de heridas se compararon, solo el Grupo 2 pareció que tiene una reducción significante general en las áreas de heridas. Las áreas de heridas del Grupo 3 fueron solo significantemente más pequeñas que el Grupo 1 en los días 7 12. Cuando las áreas de heridas fueron relativas al día 1, las áreas de heridas relativas del Grupo 2 fueron significantemente más pequeñas que el Grupo 1 en los días 10, 11 y 12. Nada de diferencia significante se encontraron entre los grupos 1 y 3. Asi el tratamiento de las heridas en los ratones de tipo silvestre con bálsamo de OPN al 0.1% parecieron que tienen un efecto positivo sobre la sanación de heridas en la parte final del proceso de sanación. Archivo El reporte final asi como los datos y resultados básicos se mantienen en los archivos de Pipeline Biotech A/S durante un periodo de cinco (5) años desde el final del estudio. o Tabla 1 : Marcas de heridas: Marcación: - 0. Completamente cicatrizada 1. Herida pequeña todavía detectada 2:Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida.

Marcas de heridas fcontd.) Marcación: O.Completamente cicatrizada 1 :Herida pequeña todavía detectada 2:Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida.

Marcas de heridas (contd.) Marcación: 0:Completamente cicatrizada 1. Herida pequeña todavía detectada 2. Sin costra pero todavía herida 3:Sin costra original pero nueva costra (costra vieja caída pero nueva costra crecida) 4:Costra original todavía sobre la herida. o Tabla 2: Diámetros de heridas Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Diámetros de heridas (Contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Diámetros de heridas (Contd.) Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Tabla 3: Areas de heridas Todas las heridas se midieron sobre la línea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) Areas de heridas (Contd.) Todas las heridas se midieron sobre la linea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) o Areas de heridas (Contd.) Todas las heridas se midieron sobre la linea que va de la cabeza a la cola. Todas las heridas se midieron desde el borde de la herida (entre la superficie de la herida y la piel normal) t O Tabla 4: Areas de heridas relativas 1 Día de medición (Areas de heridas relativas al Día 1) f " -/í Animal 1 2 - ·¦ 3 4 5 ¦¦ ¦ ·¦ 6 r . 8 9 10 11 12 13 14 15 1 1,00 0,68 0,59 0,57 0,55 0,88 0,83 0,90 0,77 0,67 0,70 0,51 0,47 0,47 0,37 2 1,00 0,81 0,92 0,92 0,87 0,87 0,70 0,69 0,66 0,63 0,25 0,13 0,05 0,05 0,02 3 1,00 0,58 0,69 0,60 0,62 0,89 0,70 0,60 0,57 0,36 0,28 0,27 0,08 0,08 0,09 4 1,00 1,71 2,18 2,41 2,35 1,71 1,53 0,35 0,37 0,37 0,31 0,19 0,00 0,00 0,00 1,00 1,44 1,48 1,10 1,19 1,79 1,06 0,42 0,41. 0,27 0,23 0,02 0,01 0,00 0,00 6 1,00 0,78 0,68 1,02 1,03 1,38 0,82 0,88 0,17 0,14 0,14 0,04 0,01 0,00 0,00 7 ¦; - 1,00 0,54 0,56 0,34 0,35 0,33 0,32 0,18 0,15 0,09 0,07 0,03 0,01 0,00 0,00 1,00 1,19 1,40 0,97 0,93 1,12 0,90 0,89 0,28 0,19 0,14 0,05 0,02 0,00 0,00 Medio 1,0 0,9 1,0 0,9 0,9 1,0 0,8 0,6 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0 0,0 Dev. Est. 0,0 0,4 0,6 0,6 0,6 0,5 0,3 0,3 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 Areas de heridas relativas (Contd.) 2 Día de medición (Areas de heridas relativas al Día 1) Animal 1 2 3 4 5 6 7 9, 10 1 12 13 14 15 9 1,00 1,44 0,82 1,47 1,51 0,64 0,57 0,69 0,25 0,31 0,21 0,03 0,00 0,00 0,00 1,00 0,73 0,51 0,68 0,56 0,62 0,44 0,28 0,10 0,08 0,08 0,01 0,00 0,00 . 0,00 11 - 1,00 0,66 0,59 0,54 0,41 0,60 0,40 0,40 0,11 0,07 0,07 0,02 0,01 0,00 0,00 12 1,00 0,73 0,54 0,71 0,96 0,90 0,88 0,40 0,40 0,29 0,24 0,05 0,07 0,00 0,00 13 1,00 1,36 1,64 1,66 1,72 1,77 1,21 1,04 0,28 0,19 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 14 1,00 0,86 0,72 1,12 1,09 0,96 0,70 0,79 0,79 0,14 0,12 0,01 0,01 0,00 0,00 1,00 2,74 2,00 1,69 1,79 2,26 1,47 0,88 0,00 0,00 0,00 0,02 0,00 0,00 0,00 16 1,00 0,89 0,68 0,48 0,46 0,73 0,70 0,58 0,40 0,16 0,04 0,00 0,01 0,01 0,00 Medio 1,0 1,0 0,8 0,9 0,9 0,9 0,7 0,6 0,2 0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 Dev. Est. 0,0 0,7 0,6 0,5 0,6 0,6 0,4 0,3 0,2 0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 Areas de heridas relativas (Contd. I 3 Dia de medición (Areas de heridas relativas al Día 1) ú- Animal 1 2 3 4 ¾ 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 17 1,00 0,55 0,70 0,61 0,60 0,78 0,74 0,75 0,73 0,21 0,12 0,02 0,00 0,00 0,00 18 1,00 1,50 1,17 1,09 1,10 1,10 1,05 0,46 0,50 0,36 0,24 0,03 0,02 0,00 0,00 19 y:r - "7. . 1,00 2,68 2,85 2,61 2,75 2,47 1,75 1,59 0,61 0,76 0,54 0,12 0,01 0,05 0,07 1,00 0,53 0,54 0,42 0,36 0,46 0,51 0,52 0,23 0,20 0,06 0,01 0,00 0,00 0,00 21 1,00 0,92 0,75 0,32 0,36 0,40 0,30 0,15 0,12 0,07 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 22 1,00 1,32 1,04 1,20 1,09 1,42 0,42 0,30 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 23 1,00 1,20 0,97 0,76 0,62 0,92 0,46 0,50 0,49 0,24 0,13 0,10 0,02 0,00 0,00 24 1,00 2,36 1,32 1,51 1,49 1,44 0,89 1,12 0,91 1,00 0,96 0,09 0,05 0,04 0,00 Medio 1,0 1,2 1,0 0,9 0,8 1,0 0,7 0,6. 0,4 0,3 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 Dev. Est. 0,0 0,8 0,7 0,7 0,8 0,7 0,5 0,5 0,3 0,3 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 Tabla 5 : Pesos de animales Día de medición (g) Grupo Animal 1 4 7 11 15 1 1 21,2 22,2 22,1 21,6 21,0 2 22,0 22,2 23,1 21,2 22,0 3 20,7 21,3 21,0 20,9 22,3 4 20,5 20,3 23,0 20,8 21,3 19,0 18,4 19,8 19,8 19,6 6 18,4 17,8 18,2 17,4 18,8 7 19,6 20,0 20,5 20,7 20,1 8 21,1 21,1 22,5 21,8 22,9 Medio 20,3 20,4 21,3 20,5 21,0 Dev. Est. 1,2 116 1,7 1,4 1,4 2 ,;, 21,3 21,5 21,9 21,1 20,8 23,3 24,2 24,9 23,7 23,6 11 -fe 20,4 21,8 23,3 22,3 22,3 12 · 20,7 20,9 21,2 21,5 21,5 .13 20,9 22,0 22,6 21,9 23,4 14. ; 23,1 24,2 24,7 24,2 24,2: :¾¾ 19,7 20,0 20,8 21,0 22,1 ,16 20,2 20,6 19,7 20,8 22,3 Medio 21,2 21,9 22,4 22,1 22,5 Dev. Est. 1,3 1;6 1,8, 1,3 1,1 17 22,7 23,9 23,9 22,8 23,0 - -'· . · 18 21,0 21,4 21,4 20,5 21,1 ¦ 19 : ;;: 22,3 22,1 22,8 22,6 23,5 21,8 22,2 23,9 22,2 22,6 21 , ?? . 19,6 20,5 20,8 21,0 20,4 22 ¦ ;ír 22,3 22,4 23,7 22,9 22,4 23 22,8 23,7 24,0 24,0 23,2 24 22,3 22,6 22,6 22,8 21,9 Medio 21,9 22,4 22,9 22,4 22,3 Dev. Est. 1,1 1,1 1,2 1,1 1 1, 11 Tabla 6 : Pesos de animales , relativos al día Conclusión Principal Los experimentos se llevaron a _cab'o sobre ratones sanos y diabéticos y también sobre animales sanos, infectados.

A fin de impactar la sanación en una herida aguda en un tejido normalmente perfusionado , el efecto de la sustancia de prueba examinada debe ser más bien fuerte. La prueba de osteopontin ha demostrado un efecto también sobre estos modelos, en part'icular en el final del proceso de sanación de heridas. Parece que existen algunas diferencias menores en lo que se refiere a las concentraciones de osteopontin a ser utilizadas, pero esto puede ser debido a la estructura de los diversos modelos de heridas. -El osteopontin bovino se observa que tiene un efecto sobre animales diabéticos asi como sobre una herida infectada que sana a pesar de las bacterias inducidas. Esto sustenta un efecto de sanación de heridas del osteopontin bovino. Es un efecto que también se puede observar sobre animales perfectamente sanos que apoyan esta suposición. Por lo tanto la conclusión principal seria que el osteopontin bovino tiene un efecto sobre la sanación de heridas agudas. Por consiguiente, también existe razón para creer que este efecto aplica a heridas no de sanación crónica también.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES 1. Una formulación tópica de sanación de heridas, caracterizada porque comprende osteopontin bovino y un adyuvante.
2. 2. Una formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación es un ungüento, un liquido, un polvo o un emplaste.
3. 3. Un ungüento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el nivel de osteopontin es 0.01% a 10%.
4. 4. Un ungüento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el nivel de osteopontin es 0.1% a 5%.
5. 5. Un ungüento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el nivel de osteopontin es 0.1% a 2%.
6. 6. Un ungüento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el nivel de osteopontin es 0.1% a 1.5%.
7. 7. Un ungüento de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el nivel de osteopontin es 0.5% a 1%.
8. 8. Uso de osteopontin bovino, caracterizado porque es para la preparación de una formulación de fármaco tópica para sanación de heridas mejorada.
9. 9. Uso de osteopontin bovino, caracterizado porque es para la preparación de una formulación de fármaco tópica para sanación mejorada de heridas infectadas o inflamadas .
10. 10. Uso de osteopontin bovino, caracterizado porque es para la preparación de una formulación de fármaco tópica para sanación mejorada de heridas diabéticas.
11. 11. Un método para sanación de heridas mejorada, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de osteopontin ¦ bovino.