CN102362856B - 重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子的外用溶液及其制备方法。在本发明的方案中，每15毫升所述外用溶液中包含的组分及用量为：重组牛碱性成纤维细胞生长因子40000-120000IU、蛋白保护剂1-10mg、PH缓冲剂适量、加注射用水至15mL；其中，所述的蛋白保护剂为人血白蛋白，所述外用溶液的pH值为6.5-7.5。本发明的外用溶液避免了配伍禁忌和辅料可能给人体带来的危害，且能快速、持久、有效地促进创面愈合，增加了病人的顺应性，并能实现了活性多肽在溶液状态下的低温保存，使用方便。另外，本发明的制备方法操作简单，且能保证外用溶液中重组牛碱性成纤维细胞生长因子的活性。

Description

重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液

技术领域

本发明涉及生物制品领域。特别是涉及一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液及其制备方法。

背景技术

皮肤是机体避免遭受感染和脱水的重要屏障，严重创伤、烧烫伤以及某些疾病例如糖尿病引起的皮肤溃疡会给患者带来身体和精神上的巨大影响。因此，对皮肤创面的修复是医药领域十分关注的问题。

自上世纪末开始，已对创伤后的组织修复过程、发生机制和治疗等进行了多种研究，其中，分子生物学的迅速发展以及各学科之间的相互交叉影响，使创伤修复与组织再生等水平得到不断提升。目前，已构建了多种促进肉芽组织生长、血管化和再上皮化的基因，例如表皮细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子等。

已发现碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，简写为bFGF)在体内可参与多种组织的创伤修复过程，是重要的创伤愈合因子之一，它能诱导微血管的形成、发育和分化，同时直接刺激成纤维细胞和细胞外基质的蛋白合成，以形成胶原纤维，增加创面的抗张力强度，并促进真皮细胞的移行、分裂、分化，以完成皮肤的修复过程，并能促进皮肤软骨组织、骨组织和神经组织损伤修复和肢体再生。大量基础研究和临床试验证实，bFGF对烧伤、外伤及各种慢性难愈合创面具有显著的促修复作用，并且安全、有效、无不良反应。

重组牛碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant bovine basic fibroblast growth factor，简写为rb-bFGF)是由含有高效表达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后得到的活性因子。rb-bFGF可促进创面愈合，用于烧伤创面(包括浅II度、深II度、肉芽创面)、慢性创面(包括体表慢性溃疡等)和新鲜创面(包括外伤、供皮区创面、手术伤等)。

创伤愈合是复杂而又高度协调的过程，基本上可以分为局部炎症反应、细胞增殖分化和组织修复重建三个既有区别又相互交错的阶段。这一过程涉及多种生长因子和细胞因子的相互作用、相互影响，共同调控细胞迁移、增生、分化、血管生成、基质沉积和组织塑型等。

在传统的创伤修复治疗中，均以抗感染和增强机体营养及创面局部保护等措施使创面自然愈合，是一个被动的愈合过程。一般愈合时间较长，而且容易留下疲痕和导致色素沉着，同时对受损伤的皮肤附属功能器官的功能恢复也不是十分有效。

目前陆续发现了多种生长因子，对其生理功能、作用机制和基因调控等的研究逐渐深入，它们在创伤修复中起着举足轻重的作用，调控着创伤修复的各个阶段。随着细胞生长因子类药物的出现，在不排除传统治疗方法的情况下，为创面愈合的治疗带来一条全新的思路，即将创面修复由被动修复变为主动修复。

研究发现重组牛碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant bovine basic fibroblast growthfactor，简写为rb-bFGF)能刺激创面愈合过程中几乎所有的细胞反应，已有大量的实验证明其对烧烫伤创面愈合，特别是对那些用传统方法无效的难愈性的慢性溃疡，有很好的治疗作用。其作用机制是促进创面的主动修复愈合，与传统的被动修复药物在作用机理上有原则上的区别。rb-bFGF是由含有高效表达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后得到的活性因子。rb-bFGF可促进创面愈合，用于烧伤创面(包括浅II度、深II度、肉芽创面)、慢性创面(包括体表慢性溃疡等)和新鲜创面(包括外伤、供皮区创面、手术伤等)。另外，rb-bFGF与传统的创面修复药物有协同作用，可能获得比传统药物更好的愈合质量。因此，rb-bFGF将成为治疗创面愈合的一种新型药物。但此类活性蛋白物质包括酶、疫苗、生长因子等的保存条件一直是此类物质应用的瓶颈，也是目前蛋白技术研究的重点。现在的活性蛋白类物质保存一般用冻干后呈固体状态低温保存，生产成本高且使用不方便。

为此，现有技术中也公开了一些适合在低温条件下保存的rb-bFGF外用溶液剂型，中国专利申请200510036641.3公开了一种重组人碱性成纤维细胞生长因子外用溶液，其采用肝素钠保护剂，实现了活性多肽溶液状态低温保存。但是，在该方案中并未公开外用溶液中的主要有效成分rb-bFGF的活性指标，同时，肝素钠可能存在的一些对患者的排异性和过敏反应也是难以避免的，因此仍然无法满足rb-bFGF溶液作为外用药的实际要求。

因此，开发一种含rb-bFGF的外用溶液，克服上述现有技术中存在的缺陷是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题对现有的含重组牛碱性成纤维细胞生长因子的外用溶液，避免了配伍禁忌和辅料可能给人体带来的危害，且能快速、持久、有效地促进创面愈合，增加了病人的顺应性，并能实现了活性多肽在溶液状态下的低温保存，使用方便。

本发明通过如下技术方案解决上述技术问题：

一种含重组牛碱性成纤维细胞生长因子的外用溶液，每15毫升所述外用溶液中包含的组分及用量为：

重组牛碱性成纤维细胞生长因子40000-120000IU、

蛋白保护剂1-10mg、

PH缓冲剂适量、

加注射用水至15mL

其中，所述的蛋白保护剂为人血白蛋白，所述外用溶液的pH值为6.5-7.5。

优选地，所述PH缓冲剂为Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲剂，每15毫升所述外用溶液中包含Na₂HPO₄70-110，NaH₂PO₄40-60mg。

在本发明的一种优选的实施方式中，重组牛碱性成纤维细胞生长因子的外用溶液中，每15毫升所述外用溶液中包含的组分及用量为：

重组牛碱性成纤维细胞生长因子63000IU、

蛋白保护剂5mg、

Na₂HPO₄90mg

NaH₂PO₄50mg

加注射用水至15mL

其中，所述的蛋白保护剂为人血白蛋白，所述外用溶液的pH值为7.0。

优选地，该外用溶液还包括溶液保护剂，所述溶液保护剂为甘露醇和聚乙二醇中的一种或者二者的组合。

另一方面，本发明所解决的技术问题还在于提供一种上述含重组牛碱性成纤维细胞生长因子的外用溶液的制备方法，包含以下步骤：

包括如下步骤：

一、将处方量的重组牛碱性成纤维细胞生长因子原液、蛋白保护剂和PH缓冲剂溶于注射用水中，保证每15mL溶液中含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子40000-120000IU；

二、除菌过滤1-3次，收集滤液；

三、在无菌条件下按照规格分装；

上述步骤必须在严格的无菌条件下操作。

优选地，所述除菌过滤包括至少一次0.22μm除菌过滤。

相比于现有技术，本发明的技术方案至少具有以下的优点和效果：

本发明外用溶液中的以人血白蛋白作为rb-bFGF的蛋白保护剂，能够保证rb-bFGF在溶液状态下低温保存时的性能和疗效，并且该蛋白保护剂的使用还能有效避免配伍禁忌和辅料可能给人体带来的危害，且能快速、持久、有效地促进创面愈合，增加了病人的顺应性。

另外，本发明的外用溶液还详细公开了其中含有的rb-bFGF的活性指标，且在该活性范围内能保证外用溶液能快速、持久、有效地促进创面愈合，具有良好的疗效。

具体实施方式

下面结合本发明较佳的实施例做进一步的说明，这些实施例应理解为不会限制本发明的实施范围，其变型及等同方式均被涵盖在本发明的保护范围内。

实施例1：rb-bFGF外用溶液的制备一

处方：

重组牛碱性成纤维细胞生长因子4000×10⁴IU；

人血白蛋白3g；

Na₂HPO₄70g；

NaH₂PO₄40g

注射用水加至15000ml；

共制    1000支

具体制备方法如下：

一、将上述处方中的重组牛碱性成纤维细胞生长因子原液、蛋白保护剂和PH缓冲剂溶于注射用水中，并保证每15mL溶液中含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子40000IU；此过程中需对溶液的pH进行控制，保证外用溶液的pH为6.8，调节pH采用1M的盐酸溶液/氢氧化钠溶液进行调整。

二、用0.22μm滤膜过滤除菌，收集滤液；

三、在无菌条件下按照规格分装。

需要注意是，上述步骤必须在严格的无菌条件下操作。

实施例2：rb-bFGF外用溶液的制备二

处方：

重组牛碱性成纤维细胞生长因子6300×10⁴IU；

人血白蛋白5g；

Na₂HPO₄90g；

NaH₂PO₄50g

注射用水加至15000ml；

共制    1000支

具体制备方法为：

具体制备方法如下：

一、将上述处方中的重组牛碱性成纤维细胞生长因子原液、蛋白保护剂和PH缓冲剂溶于注射用水中，并保证每15mL溶液中含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子63000IU；此过程中需对溶液的pH进行控制，保证外用溶液的pH为7.2，调节pH采用1M的盐酸溶液/氢氧化钠溶液进行调整。

二、用0.22μm滤膜过滤除菌，收集滤液；

三、在无菌条件下按照规格分装。

需要注意是，上述步骤必须在严格的无菌条件下操作。

实施例3：rb-bFGF外用溶液的制备三

处方：

重组牛碱性成纤维细胞生长因子8000×10⁴IU；

人血白蛋白7g；

Na₂HPO₄110g；

NaH₂PO₄60g

注射用水加至15000ml；

共制        1000支

具体制备方法为：

具体制备方法如下：

一、将上述处方中的重组牛碱性成纤维细胞生长因子原液、蛋白保护剂和PH缓冲剂溶于注射用水中，并保证每15mL溶液中含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子80000IU；此过程中需对溶液的pH进行控制，保证外用溶液的pH为7.2调节pH采用1M的盐酸溶液/氢氧化钠溶液进行调整。

二、用0.22μm滤膜过滤除菌，收集滤液；

三、在无菌条件下按照规格分装。

需要注意是，上述步骤必须在严格的无菌条件下操作。

实施例4：rb-bFGF外用溶液促进表皮细胞生长及烧伤创面愈合的实验研究

1、试剂及仪器：rb-bFGF；细胞培养箱；流式细胞仪；电脑图象分析系统。

2、动物烧伤创面模型：选20-25kg白色小猪5只，在实验的前一天用刀片给动物的背部去毛。制成直径为2.5厘米的圆形深II°度烧伤创面18个(烧伤深度由病理切片和免疫组化分析证实)。每3个创面为一平行组，以不含rb-bFGF的生理盐水用于创面作为阴性对照组，直接在创面涂1％的磺胺嘧啶银霜作为阳性对照组。

3、给药方式：创面清创后，阳性对照组的创面直接涂1％的磺胺嘧啶银。其余各组的实验均按双盲法进行，创面在清创后，以平行试验的方式，分别涂抹实施例1、2和3中所得的外用溶液。以后10天每天以同样的方法换药一次。

4、创面愈合指标：在每次换药时照相，照片经电脑图象分析系统灰度积分来比较分析创面愈合的程度，创面面积越小，表明愈合效果越好。

5、结果：

表1、各样品涂抹前和涂抹48小时后的平均创面面积(cm²)

从表1可以看出，当分别涂抹本发明组、阳性对照组和阴性对照组样品48小时后，在倒置显微镜下可观察到，含rb-bFGF的本发明组的平均创面面积小于不含rb-bFGF的对照组。

表2、涂抹各样品后不同时间的平均创面面积(cm²)

从表2可以看出，本发明组连续应用于猪的深II°烧伤创面2天后，与对照组之间外观有较明显的区别。

用电脑图象分析技术分别计算伤后第0、2、4、6、9、13天时的创面面积，实验结果显示在创面愈合过程中应用含rb-bFGF的本发明组的烧伤创面的愈合速率明显大于对照组。

试验例5：稳定性研究

1、高温高湿试验：

将实施例1的外用溶液灌装于塑料喷瓶中，密封置于40℃、相对湿度75％条件下进行加速实验，分别于1、5、10天检测外用溶液的含量、pH、外观、无菌和离心试验(300r/min)。结果如下表：

表3、高温高湿结果

1天

5天

10天

含量	100.02％	99.96％	99.86％
				pH	7.0	7.0	7.0
外观	无色澄明	无色澄明	无色澄明
				无菌	合格	合格	合格
离心试验	无分层	无分层	无分层

结果表明，本发明的外用溶液在高温高湿试验中质量稳定。

2、低温试验：

将实施例1的外用溶液灌装于塑料喷瓶中，密封置于4℃下进行实验，分别于1、3、6月检测外用溶液的含量、pH、外观、无菌和离心试验(300r/min)。结果如下表：

表4、低温试验结果

	1个月	3个月	6个月
				含量	99.96％	100.01％	99.94％
pH	7.0	7.0	7.0
				外观	无色透明	无色透明	无色透明
无菌	合格	合格	合格
				离心试验	无分层	无分层	无分层

结果表明，本发明的外用溶液在低温试验中质量稳定。

Claims (1)

1.一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子的皮肤外用溶液，其特征在于其组分及用量为：

重组牛碱性成纤维细胞生长因子6300 ×

10⁴IU；

人血白蛋白 5g

Na₂HPO₄ 90g

NaH₂PO₄ 50g

注射用水加至15000mL

共制 1000支

具体制备方法为：

一、将上述处方中的重组牛碱性成纤维细胞生长因子原液、蛋白保护剂和pH缓冲剂溶于注射用水中，并保证每15ml溶液中含有重组牛碱性成纤维细胞生长因子63000IU；此过程中需对溶液的pH进行控制，保证外用溶液的pH为7.2，调节pH采用1M的盐酸溶液/氢氧化钠溶液进行调整；

二、用0.22μm滤膜过滤除菌，收集滤液；

三、在无菌条件下按照规格分装。