KR20230005314A - 수포성 표피박리증의 치료에 사용하기 위한 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수포성 표피박리증의 치료에 사용하기 위한 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체 및 상응하는 치료 방법에 관한 것이다. 새로운 귀소 펩티드를 사용하면 전신 투여를 통해 생체 내 피부 및 피부 상처에 대한 접합체의 표적 특이적 귀소를 가능하게 한다.

Description

수포성 표피박리증의 치료에 사용하기 위한 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체
본 발명은 일반적으로 분자 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa)의 치료에 사용하기 위한 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체(homing peptide-guided decorin conjugate) 및 상응하는 치료 방법에 관한 것이다.
인체의 가장 큰 기관인 피부는 효율적인 약물 전달에 대한 고유한 도전과제를 제시한다. 국소, 즉 경피 약물 전달과 관련된 주요 도전과제는 거대 분자가 피부로 잘 침투하지 못한다는 것이다. 세포간 지질을 통한 확산은 경피 전달 옵션을 제공하지만 작은 친유성 분자에 대해서만 제한된다. 따라서, 전신적으로 투여되지만 피부 특이적 치료제는 피부 질환, 특히 연약하고 물집이 생기는 피부를 유발하는 희귀 유전 질환의 그룹인 수포성 표피박리증과 같이 전체 피부에 영향을 미치는 피부 질환의 치료를 위한 실질적인 치료적 발전이 될 것이다.
열성 이영양성 수포성 표피박리증(RDEB)은 유형 VII 콜라겐(C7)을 인코딩하는 COL7A1 유전자의 돌연변이로 인해 유발된다. 임상 징후에는 피부 침식 및 물질, 반흔 절단, 가성합지증 및 공격적이고 빠르게 전이되는 피부 편평 세포 암종(cSCC)의 높은 위험이 포함된다. 일부 유전자, 세포 및 단백질 기반 요법이 유형 VII 콜라겐을 피부에 전달하는 유망한 결과를 보여주었지만 여전히 도전과제가 남아 있으며 RDEB에 대한 치료법은 아직 없다.
전환 성장 인자 (TGFβ) 신호전달은 RDEB에서 섬유증의 발달과 악성 종양의 진행에 필수적인 역할을 하는 것으로 입증되었다. 일찍이 TGFβ 신호전달이 col7a1 -/- 마우스에서 출생 후 일주일 만에 활성화된다는 것이 입증되었다(Liao 등, 2018, Stem Cells 36: 1839-1850). 따라서 TGFβ 신호전달의 활성화에 대한 조기 개입은 RDEB의 질환 부담을 줄이는 데 유익할 수 있다. TGFβ 신호전달은 또한 동일한 COL7A1 돌연변이를 가진 일란성 쌍생아에서 표현형 조절인자인 것으로 제안되었다(Odorisio 등, 2014, Hum Mol Genet 23: 3907-3922). 더욱이, 천연 TGFβ 억제제인 프로테오글리칸 데코린(DCN)의 발현 수준은 덜 영향을 받은 쌍둥이에서 유의하게 더 높았다. DCN은 세포외 기질(ECM)의 구조적 성분이며 Dcn -/- 마우스는 불규칙한 콜라겐 피브릴 형성을 나타내고 피부에서 상당히 감소된 인장 강도를 나타낸다(Reed 및 Iozzo, 2002, Glycoconj J 19: 249-255). 또한, DCN은 TGFβ에 대한 억제 작용을 비롯한 여러 성장 인자의 활성을 조절함으로써 항섬유화 및 항종양 기능을 가지고 있다(
Figure pct00001
및 Prince, 2015, Biomed Res Int 2015: 654765;
Figure pct00002
및 Ruoslahti, 2019, Br J Pharmacol 176:16-25). 최근에는 col7a1 -/- 마우스에서 제대혈 유래 무제한 체세포 줄기세포(USSC)의 효과에 대한 작용 메커니즘 중 하나로서 DCN 발현의 상향조절이 입증되었다(Liao 등, 2018, 앞에서 언급한 것). RDEB에 대한 잠재적인 치료적 질병 수정 분자로서 DCN의 역할을 지원하면서, Cianfarani 등 (2019, Matrix Biol 81: 3-16)는 최근 인간 DCN의 발현을 유도하는 렌티바이러스의 전신 투여가 유형 VII 콜라겐의 잔여 수준을 발현하는 C7-하이포모르픽 RDEB 마우스 모델(C7-하이포모르픽 마우스)에서 TGFβ 유도된 섬유증을 약화시켰다고 보고하였다.
더욱이, DCN은 결합 조직 성장 인자(CTGF/CCN2)에 결합하고 중화하는데, 이는 TGFβ의 섬유성 신호전달의 하류 매개체이며 반흔 예방의 치료 표적으로 제안되었다(Vial 등 2011, J Biol Chem 286: 24242-24252; Daniels 등 2003, Am J Pathol 163: 2043-2052). TGFβ와 CTGF/CCN2의 결합 부위는 DCN의 서로 다른 부분에 있기 때문에, 이론적으로 DCN은 두 섬유증 매개체를 동시에 차단할 수 있다. 실제로, TGFβ 유발 흉터 형성 억제에 대한 DCN의 역할은 RDEB 외에도 신장, 폐 및 간 섬유증과 같은 수많은 질환 모델과 피부 상처 치유에서 잘 확립되었다(Odorisio 등, 2014, 앞에서 언급한 것; Liao 등, 2018, 앞에서 언급한 것; Cianfarani 등, 2019, 앞에서 언급한 것). 그러나 전임상 연구에서 수많은 긍정적인 항암 및 섬유증 결과에도 불구하고 DCN은 전신 요법으로 임상에 도달하지 못하였다. 지금까지, 유일하게 보고된 DCN의 임상적 적용은 눈 천공 손상이 있는 12명의 환자에 대한 것이었고 200 또는 400 μg 인간 재조합 DCN 유리체내 주사의 단일 용량은 안구 부작용 없이 잘 용인되는 것으로 나타났다(Abdullatif 등, 2018, Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 256: 2473-2481).
전신 의약품 전달의 일반적인 한계는 약물의 작은 부분만이 원하는 위치에 도달하고 다른 기관에서 전신 부작용이 발생한다는 것이다. 따라서 현대 약물 개발의 중요한 목표는 신체의 다른 부분에 미치는 부작용을 최소화하면서 표적 기관에 특정한 약물을 생성하는 것이다. 이 목표는 병든 기관에서 발현되는 특정 에피토프를 인식하는 약물을 개발함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 약물은 주어진 기관의 혈관에서 조직 또는 표적 특이적 분자 특징을 인식하는 혈관 귀소 펩티드와 같은 친화성 리간드와의 접합에 의해 표적 특이적으로 전환될 수 있다.
파아지 펩티드 라이브러리의 생체 내 스크리닝은 혈관 귀소 펩티드와 같은 전신 투여된 친화성 리간드에 의해 혈관(혈관 우편번호(zip code))의 이러한 조직 또는 질환 특이적 분자 특징이 표적이 될 수 있음을 확인하였다. 이러한 연구는 근본적으로 다른 조직의 맥관구조에 장기 또는 질환 특이적 분자 표지가 존재한다는 사실을 확립하여 전신으로 투여된 치료제의 표적 특이적 전달을 위한 우편 번호 시스템(혈관 우편번호)을 가능하게 하였다 (Ruoslahti 등, 2010, J Cell Biol 188: 759-768; Ruoslahti, 2017, Adv Drug Deliv Rev 110-111: 3-12; Ruoslahti, 2004, Biochem Soc Trans 32: 397-402; Pasqualini 및 Ruoslahti, 1996, Nature 380(6572):364-366). 종양 특이적 귀소 및 세포/조직 침투를 위한 가장 효율적인 혈관 귀소 펩티드는 C-말단에 아르기닌(또는 드물게 라이신) 잔기가 있는 공통 모티프 R/KXXR/K(서열번호 3)를 함유하고, C-말단 규칙(CendR) 서열이라고 한다(Ruoslahti, 2017, J Clin Invest 127: 1622-1624; Teesalu 등, 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106: 16157-16162; Sugahara 등, 2009, Cancer Cell 16: 510-520; Sugahara 등, 2010, Science 328: 1031-1035). CendR-서열은 뉴로필린-1(NRP-1)에 결합하여 종양 조직의 실질에 페이로드와 함께 펩티드를 전달하는 혈관외유출 및 조직 침투 경로를 활성화한다 (Ruoslahti, 2017, Adv Drug Deliv Rev 110-111: 3-12; Ruoslahti, 2017, J Clin Invest 127: 1622-1624; Teesalu 등, 2009, PNAS 106(38):16157-16162). 숨겨진 CendR을 함유하는 펩티드는 종양 특이적 발현 패턴을 갖는 일차 수용체에 대한 결합의 조합 및 표적 기관에서 CendR 서열을 노출시키기 위한 종양에서의 단백질 분해 활성화로 인해 그들의 표적 선택성이 있다. NRP-1은 모든 조직의 내피 세포에서 발현되기 때문에(Ruoslahti, 2017, Adv Drug Deliv Rev 110-111: 3-12) NRP-1을 통한 혈관외 유출 및 조직 침투는 암성 조직에만 국한되지 않고 다른 병든 또는 건강한 조직에서도 발생한다.
생체 내 파아지 디스플레이 스크린은 또한 피부 상처에서 혈관신생 혈관에 있는 펩티드 패널을 확인하였다(
Figure pct00003
및 Ruoslahti, 2007, Am J Pathol 171: 702-711). 가장 유망한 두 가지 펩티드인, CAR(CARSKNKDC; 서열번호 5) 및 CRK(CRKDKC; 서열번호 3)로 명명된 사이클릭 펩티드는 표적 선택적 방식으로 상이한 치료 분자를 전달하는 데 이용되었다 (
Figure pct00004
등, 2017, ACS Biomaterials Science & Engineering 3: 1273-1282). 흥미롭게도, CRK 펩티드가 숨겨진 CendR-서열인 RKDK(서열번호 1)을 함유하지만, 혈관 귀소 CendR 펩타이드 중 세포와 조직에 침투할 수 없는 유일한 펩티드이다.
Figure pct00005
Ruoslahti, 2007, Am J Pathol 171: 702-711; Agemy 등, 2010, Blood 116: 2847-2856).
WO 2008/136869는 데코린을 피부 상처로 표적 전달하기 위한 특정 귀소 요소로서 CRK 펩티드를 개시하고 있다. 개시된 CRK-데코린 융합체는 상처가 나지 않은 피부로 귀소하지 않는다.
따라서, 전신적으로 투여되지만 피부 특이적 치료제는 수포성 표피박리증과 같은 피부 질환의 치료를 위한 실질적인 치료적 진보가 될 것이다.
수포성 표피박리증의 치료에 사용하기 위한 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체가 본 명세서에 제공된다. 접합체는 데코린 세그먼트 및 귀소 펩티드를 포함하고, 귀소 펩티드의 C-말단은 아미노산 서열 RKDK (서열번호 1) 또는 CRKDK (서열번호 2)로 이루어진다.
또한, 데코린 세그먼트 및 귀소 펩티드를 포함하는 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체의 유효량을 투여함으로써 필요로 하는 대상체에서 수포성 표피박리증을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 귀소 펩티드의 C-말단은 아미노산 서열 RKDK (서열번호 1) 또는 CRKDK (서열번호 2)로 이루어진다.
귀소 펩티드로 인해, 접합체는 생체 내 피부 및 피부 상처에 선택적으로 귀소하고 침투한다.
상기 양태의 구현예 및 세부 사항은 다음 도면, 상세한 설명, 실시예 및 종속항에 기재되어 있다.
첨부된 도면은 개시된 요지의 여러 구현예를 예시하고, 설명과 함께 개시된 조성물 및 방법의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1a 내지 1C는 예시적인 재조합 DCN-tCRK 단백질의 구조 및 뉴로필린-1에 대한 그의 결합을 예시한다. 도 1a는 DCN-tCRK의 구조를 개략적 표현이다. 천연 DCN의 신호- 및 프로펩티드를 정제를 위해 6XHis-태그(I)로 대체하였다. His 태그는 성숙한 DCN 프로테오글리칸의 아미노 말단(II), 코어 단백질(III) 및 카복실 말단(IV)이 뒤따른다. tCRK 펩티드(V)는 단백질의 카복실 말단에 클로닝되었다. 도 1b는 시험관 내에서 DCN-tCRK와 뉴로필린-1(NRP-1)과의 시험관 내 결합을 보여준다. DCN-tCRK(좌측 패널) 및 펩티드 대조군(우측 패널, 양성 펩티드: RPARPAR(서열번호 25) 및 음성 펩티드: RPARPARA(서열번호 26))을 ELISA 플레이트에 고정시켰다. 소 혈청 알부민(BSA)은 DCN-tCRK 및 펩티드에 대한 비특이적 단백질 대조군으로 포함되었다. WT 및 돌연변이체 NRP1을 FAM으로 표지하고 고정화 플레이트에 첨가하였다. NRP1의 결합은 형광 강도를 기준으로 측정되었다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 삼중 샘플 **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, 스튜던트쌍을 이루지 않은 t-테스트로 실험을 반복하였다. 도 1c는 NRP-1 양성 세포에서 DCN-tCRK의 내재화를 보여준다. FAM-표지된 DCN-tCRK는 각각 NRP-1 발현에 대해 양성 및 음성인 PC3 및 M21 세포와 함께 인큐베이션되었다. DCN-tCRK는 항-FAM 면역염색으로 검출되었다. 핵은 DAPI로 카운터 염색되었다. 3개의 독립적으로 연구된 실험의 대표 이미지. 스케일 바 20 μm.
도 2a 내지 2d는 예시적인 DCN-tCRK의 재조합 단백질 생산 및 특성화를 예시한다. 도 2a는 하나의 큰 피크가 있는
Figure pct00006
에서 HisTrap HP 컬럼 단계 후 정제 크로마토그램의 예를 보여주고, 이 중 모든 피크 분획은 추가 처리에 사용되었다. 도 2b에서, 정제된 DCN-tCRK의 쿠마시 염색된 환원된 SDS-Page 겔(상부 패널) 및 웨스턴 블롯(하부 패널)이 선행 기술의 DCN과 함께 도시되어 있다. SDS 겔 상에 2와 1μg의 단백질을 로딩하고; 웨스턴 블롯 분석을 위해 1과 0.5μg의 단백질을 적용하였다. 단백질의 단량체 형태와 GAG 측쇄를 포함한 형태를 볼 수 있다. 도 2c는 DCN-tCRK의 유체역학적 직경에 대한 동적 광산란(DLS) 측정(n = 3)을 보여준다. 도 2d는 DCN-tCRK의 용융 온도에 대한 시차 주사 열량측정(DSC) 곡선을 보여준다.
도 3은 DCN과 비교한 DCN-tCRK의 약동학을 예시한다. 5 mg/kg의 DCN-tCRK 또는 DCN을 건강한 Balb/c 마우스에서 i.v. 주사하였다. 혈액 샘플을 수집하고 8개의 시점에서 인간 DCN에 대한 표준 ELISA로 분석하였다. 그룹당 n = 4.
도 4a 내지 4d는 DCN-tCRK가 col7a1 -/- 마우스의 생존을 개선하고및 피부로 귀환함을 입증한다. 도 4A는 DCN-tCRK(중간 수명: 11일, n = 21), DCN(중간 수명: 7일, n = 17) 및 PBS(중간 수명: 2일, n = 24) 투여를 받은 col7a1 -/- 마우스의 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 생존 분석을 보여준다. 도 4b는 간내 투여 후 1주, 2주 및 3주에 수령체 col7a1-/- 마우스의 피부에서 인간 데코린 ELISA 키트를 사용하여 결정된 DCN 및 DCN-tCRK의 수준에 대한 정량을 보여준다(시점당 n=3). DCN 투여 후 그 시점까지 생존한 마우스가 없었기 때문에 3-주 시점에서 DCN 수준에 대한 정량화는 없었다. *p < 0.05, **p < 0.01. 도 4c는 col7a1 -/- 마우스의 발과 등쪽 피부 모두에 항히스티딘 항체(항-his)를 사용한 면역조직화학 염색이 제시됨을 보여준다. 핵은 DAPI로 카운터 염색되었다. 스케일 바: 20 μm. 도 4D는 항히스티딘 태그 및 항NRP-1의 대표적인 이중 염색을 보여주고 DCN-tCRK, DCN 및 처리되지 않은 RDEB 피부의 병합된 이미지(DAPI 대조염색 포함)가 제시된다. 스케일 바: 25 μm.
도 5는 덱스트란/인간 혈청 알부민 (D/HSA; 중앙 수명: 3 일; n = 29; 이력 데이터 Liao 등 2018, 줄기 세포 Transl Med, 7:530-542) 투여 후의 이력 생존을 DCN-tCRK (중앙 수명: 11 일; n = 21) 및 DCN (중앙 수명: 7 일; n = 17) 및 PBS (중앙 수명: 2 일; n = 24) 투여 후의 생존과 비교하는 col7a1 -/- 마우스의 카플란-마이어 생존 분석을 보여준다
도 6은 DCN-tCRK가 RDEB에서 섬유증 유전자 시그니처를 정상화한다는 것을 예시한다. 도 6a는 WT와 비교하여 처리되지 않은 RDEB 피부에서 발현이 >1.5배 증가한 유전자에 대한 클러스터그램에서의 상대적인 유전자 발현을 보여준다. 도 6b는 WT에 비해 비히클, DCN 및 DCN-tCRK 처리된 col7a1 -/- 마우스 피부에서 유전자 발현의 log2 배 변화 및 -log10 p 값에 대한 화산 플롯을 보여준다.
도 7은 DCN-tCRK 투여가 col7a1 -/- 마우스에서 섬유증의 발달을 억제했음을 보여준다. 도 7a는 DCN-tCRK 처리 유무에 관계없이 1주 및 2주령의 WT 및 col7a1 -/- 마우스에서 CTGF/CCN2의 대표적인 면역조직화학 염색을 보여준다. 스케일 바 50 μm 상부 패널 및 25 μm 하부 패널. 도 7b는 DCN-tCRK 처리 유무에 관계없이 1주 및 2주령의 WT 및 col7a1 -/- 마우스의 발 피부의 피크로시리우스 레드 염색을 보여준다. 피크로사이리우스 레드 이미지는 편광을 사용하여 획득하였다. 스케일 바 25 μm. 도 7c는 20x 대물렌즈로 획득한 필드당 피크로사이리우스 레드 평균 강도의 정량화를 보여준다. 섹션당 8개 이상의 필드를 획득하고 생검당 적어도 4개의 섹션을 분석하였다. 스케일 바 25μm. *p < 0.05, **p < 0.01. 도 7d는 2주째 RDEB 및 WT 피부에서 콜라겐 I형(COLI) 발현(COL1 첫 번째 열), 및 DCN-tCRK 처리 유무에 관계없이 2주령의 WT 및 col7a1 -/- 마우스에서 α-평활근 액틴(αSMA 두 번째 열) 및 혈관(CD31 세 번째 열)의 이중 면역형광 염색의 대표적인 사진을 보여준다. 핵은 DAPI로 카운터 염색되었다. 병합된 이미지는 네 번째 열에 표시된다. 스케일 바 25 μm. 도 7e는 피부 섹션에서 COLI 및 αSMA 발현에 대한 평균 면역염색 강도의 정량화를 보여준다(각 처리 그룹에서 N=3). *, ** 및 ***는 각각 p ≤ 0.05,.01 및 0.001을 나타낸다.
도 8은 시험관 내 콜라겐 격자 수축 검정의 결과를 보여준다. 상부, 75 nM의 최종 농도에서 DCN 및 DCN-tCRK를 첨가하거나 첨가하지 않은 상태에서 콜라겐 겔에 시딩한 지 48시간 후 인간 정상 섬유아세포 및 RDEB 환자 유래 섬유아세포의 대표적인 이미지. 하단, 초기 면적과 비교하여 수축률로 계산된 콜라겐 겔의 수축. 데이터(n = 3)는 평균 ± SEM으로 표시된다. * p < 0.05, ** p < 0.001.
본 발명은 임의의 특정 방법론, 프로토콜, 시약 및 기재된 제형에 제한되지 않으며, 그 자체는 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용되는 단수 표현 "a", "an" 및 "the"는 하나 이상을 의미한다. 따라서 단수 명사는 달리 명시하지 않는 한 대응하는 복수 명사의 의미도 수반한다.
본 발명은 귀소 펩티드 유도된 데코린 접합체의 치료적 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 수포성 표피박리증의 치료에 사용하기 위한 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체 및 필요로 하는 대상체에게 유효량의 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체를 투여함으로써 대상체에서 수포 표피 박리증을 치료하는 방법을 제공한다.
수포성 표피박리증은 연약하고 물집이 생기는 피부를 유발하는 희귀 질환군이다. 열, 문지름, 긁힘 또는 접착 테이프로 인한 경미한 손상에 대한 반응으로 물집이 나타날 수 있다. 심각한 사례에서, 입 안이나 위장과 같은 신체 내부에 물집이 생길 수 있다. 수포 표피박리증은 후천성 및 선천성 형태를 포함하여 다양한 형태로 존재하며, 후자는 열성 또는 우성일 수 있다. 수포성 표피박리증의 비제한적 예는 후천성 수포성 표피박리증(acquired epidermolysis bullosa), 접합 수포성 표피박리증(junctional epidermolysis bullosa), 단순 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa simplex), 킨들러(Kindler) 증후군, 및 우성 이영양성 수포성 표피박리증(dominant dystrophic epidermolysis bullosa) 및 열성 이영양성 수포성 표피박리증(recessive dystrophic epidermolysis bullosa), 예컨대 역성 열성 이영양성 수포성 표피박리증(recessive dystrophic epidermolysis bullosa inversa)을 포함하는 이영양성 수포성 표피박리증(dystrophic epidermolysis bullosa)을 포함한다. 상기 예의 모든 하위유형도 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 동물 대상체, 바람직하게는 포유동물 대상체, 보다 바람직하게는 인간 대상체를 지칭한다. 여기서 용어 "환자"는 인간 대상체를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 수포성 표피박리증을 개선, 경감, 억제 또는 치료하는 것을 포함할 수 있는 목적을 위해 접합체 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 수포성 표피박리증의 유해한 영향이 최소한으로 개선되는 양을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "데코린"(DCN)은 작은 류신-풍부 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 임의의 동형을 지칭한다. 예를 들어 콜라겐 피브릴 형성을 조절하고, 조직 섬유화를 예방하고, 조직 재생을 촉진하고, TGF-β의 길항제 역할을 하는 다기능 프로테오글리칸이다. 일부 구현예에서, 데코린은 N-말단 신호 서열 및/또는 프로펩티드를 포함하거나 포함하지 않는 데코린 동형 A, B, C, D 또는 E의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인간 데코린이다. 일부 구현예에서, 데코린은 서열번호 6-20 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 상기 데코린 종의 보존적 서열 변이체 및 펩티드모사체가 또한 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "데코린 세그먼트"는 데코린을 포함하거나 이로 이루어진 본 접합체의 일부를 지칭한다.
일부 구현예에서, 데코린 세그먼트는 서열번호 6-20의 아미노산 서열과 적어도 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 80%, 70%, 또는 60% 서열 동일성, 또는 그 사이의 임의의 백분율을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 단, 데코린의 생물학적 특성은 크게 변경되지 않는다. 그러한 데코린 변이체는 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실 및/또는 치환으로부터 발생할 수 있다. 데코린이 생물학적 특성을 유지했는지 여부를 결정하기 위한 수단 및 방법은 당업계에서 쉽게 이용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 2개의 서열 사이의 서열 동일성의 백분율은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 % = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100). 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 백분율의 결정은 당업계에서 이용가능한 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "귀소 펩티드(homing peptide)"는 다른 세포 또는 조직에 우선하여 생체내 특정 세포 또는 조직에 선택적으로 귀소 하는, 즉 표적으로 하는 임의의 펩티드를 광범위하게 지칭한다. 따라서 귀소 펩티드는 표적화 전달 비히클로 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체는 적어도 이용된 귀소 펩티드와 관련하여 WO 2008/136869에 개시된 공지된 데코린 융합 단백질과 상이하다. 선행 기술의 데코린 융합 단백질은 공지된 CRK 펩티드(CRKDKC; 서열번호 3)를 포함하는 반면, 본 발명에서 사용되는 신규 귀소 펩티드의 C-말단은 아미노산 서열 RKDK(서열번호 1)로 이루어진다. 일부 구현예에서, 본 발명에서 이용되는 신규 귀소의 C-말단은 CRKDK(서열번호 2)로 이루어진다.
공지된 CRK 펩티드(CRKDKC; 서열번호 3)의 C-말단 시스테인의 말단절단이 펩티드의 귀소 특이성을 변화시킨다는 것이 놀랍게도 이제 발견되었다. CRK 펩타이드는 피부 상처에 선택적으로 귀환하는 반면, 이하 tCRK(RKDK, 서열번호 1; 또는 CRKDK, 서열번호 2)로 표시되는 말단절단된 CKR은 피부 상처에 귀환하는 능력을 유지하면서 펩타이드에 상처가 없는 피부에 귀환하고 침투하는 능력을 부여한다. 즉, CRK 펩티드는 피부 상처에만 선택적으로 침투하는 반면, tCRK 펩티드는 피부 상처와 상처가 없는 피부 모두에 선택적으로 귀한하고 침투한다.
CRK 펩타이드의 C-말단 시스테인의 말단절단은 숨겨진 CendR(C-말단 규칙) 서열 R/KXXR/K(서열번호 4), 즉 본 tCRK 펩타이드에서 RKDK(서열번호 1)를 노출시킨다. 어떤 이론에 국한되지 않고, tCRK 펩티드는 세포 표면에 NRP-1을 발현하는 진피 미세혈관 내피 세포에 의한 내재화를 통해 피부 조직에 침투할 수 있다. 흥미롭게도, 숨겨진 CendR-모티프를 함유하는 CRK 펩티드는 세포와 조직에 침투할 수 없다(
Figure pct00007
및 Ruoslahti, 2007, Am J Pathol 171: 702-711; Agemy 등, 2010, Blood 116: 2847-2856).
따라서, 본 접합체에 사용된 귀소 펩티드는 귀소 펩티드의 C-말단에 tCRK 요소를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "C-말단"(카복실-말단, 카복시-말단, C-말단 또는 COOH-말단으로도 알려져 있음)은 자유 카복실 기(-COOH)에 의해 종결된 아미노산 사슬의 말단을 지칭한다. 여기서 "C-말단"과 "C-말단"이라는 용어는 서로 바꿔서 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "N-말단"(아미노-말단, 아민-말단, N-말단 또는 NH2-말단으로도 알려짐)은 아미노산 사슬의 시작을 의미한다. 아미노산 사슬의 첫 번째 아미노산은 유리 아민 그룹(-NH2)을 함유한다. 여기서 "N-말단"과 "N-말단"이라는 용어는 서로 바꿔서 사용할 수 있다. 펩티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로 기록된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "tCRK 요소"는 생체 내에서 피부 및 피부 상처를 선택적으로 귀환하고 피부 조직을 침투할 수 있는 아미노산 서열 RKDK(서열번호 1) 또는 CRKDK(서열번호 2)를 갖는 펩티드를 지칭한다. 용어 "tCRK 요소" 및 "tCRK 펩티드"는 상호 교환 가능하다.
본 발명에 따르면, tCRK 요소는 본 명세서에 사용된 귀소 펩티드의 C-말단에 위치한다. 보다 구체적으로, tCRK 요소는 귀소 펩티드의 C-말단에 위치하며 말단 카복실기를 포함한다. 즉, 귀소 펩타이드의 C-말단은 아미노산 서열 RKDK(서열번호 1) 또는 CRKDK(서열번호 2)로 이루어진다. 따라서, tCRK 요소를 포함하는 귀소 펩티드는 아미노산 서열 RKDK(서열번호 1) 또는 CRKDK(서열번호 2)로 끝난다.
일부 구현예에서, 본 발명에 사용된 귀소 펩티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진다. 일부 다른 구현예에서, 귀소 펩티드는 서열번호1 또는 서열번호2를 포함한다. 후자의 경우 귀소 펩티드는 tCRK 요소의 N-말단에 부착된 추가 아미노산을 포함한다. 그러나, 그러한 더 긴 귀소 펩티드의 C-말단은 여전히 tCRK 요소로 이루어진다. 일부 구현예에서, 귀소 펩티드는 100개까지의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 귀소 펩티드는 50개까지의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 귀소 펩티드는 20개까지의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 귀소은 10개까지의 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 귀소 펩티드는 고리형 구조의 일부일 수 있고, 예를 들어 이황화 결합을 통해 고리화될 수 있고, 그 후 프로테아제에 의해 절단되어 tCRK 서열을 귀소 펩티드의 C-말단에서 CendR 펩티드로서 노출시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 표현 "tCRK 유도 데코린"은 그의 표적화된 전달 또는 귀소이 본 명세서에 개시된 구현예 중 임의의 하나에 따른 tCRK 귀소 펩티드에 의해 달성되는 임의의 데코린 접합체를 지칭한다. 그러한 접합체의 비제한적 예는 데코린 세그먼트가 서열번호 6-20 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고 서열번호 23 또는 24와 같은 개재 링커가 있거나 없는 서열번호 1 또는 2의 tCRK 요소의 C-말단에서 N-말단으로 부착된다. 추가 예는 서열번호 21 또는 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 접합체를 포함한다. 또 다른 예는 상기 서열 뿐만 아니라 그것의 보존적 서열 변이체 및 펩티드모사체에 대해 적어도 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 80%, 70%, 또는 60% 서열 동일성을 갖는 서열 변이체를 포함하고, 단, 귀소 특이성 및 tCRK 요소의 침투 능력 및 데코린의 생물학적 활성은 본질적으로 변경되지 않은 상태로 유지된다.
일부 구현예에서, tCRK 유도 데코린 접합체는 융합 단백질 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 일부 구현예에서, 접합체는 천연 또는 비천연 아미노산 또는 펩티드모사체로 구성되거나 포함할 수 있는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 세그먼트와 같은 하나 이상의 추가 아미노 세그먼트가 있거나 없이 본 명세서에 개시된 귀소 펩티드의 N-말단에, 바람직하게는 데코린 세그먼트의 C-말단으로부터 융합되거나 연결된 데코린 세그먼트를 포함하는 "융합 단백질"이다. 이러한 하나 이상의 추가 아미노산 세그먼트는 데코린 세그먼트의 N-말단에 융합되거나 연결될 수 있고/있거나 데코린 세그먼트의 C-말단과 귀소 펩티드의 N-말단 사이에 융합되거나 연결될 수 있다. 상기 추가 아미노산 세그먼트는 치료 활성을 가질 수 있거나, 예를 들어 진단, 이미징 또는 시각화 목적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드"는 아미노산 서열을 형성하기 위해 인접 아미노산의 알파-아미노 및 카보닐 기 사이의 전형적으로 펩티드(아미드) 결합에 의해 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기를 지칭한다. 전통적으로 펩티드는 2 내지 100, 예를 들어 2 내지 50개의 아미노산로 이루어진 분자로 정의된다. 그러나 펩티드는 적은 아미노산 (예를 들어, 2 내지 20개)을 갖는 올리고펩티드 및 많은 아미노산(예를 들어, 20 내지 100개 또는 20 내지 50개)을 갖는 폴리펩티드로 세분할 수 있다. 단백질은 본질적으로 일반적으로 50개 초과 또는 100개 초과의 아미노산으로 이루어진 큰 펩티드이다. 따라서, 표현의 단순함을 위해, 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "펩티드"는 천연(L-) 및/또는 비-천연(D-) 아미노산 잔기의 임의의 펩티드-결합 시리즈를 포함하고, "올리고펩티드", "폴리펩티드", "단백질"및 그의 단편와 상호 교환 가능하다. 펩티드의 펩티드모사체 형태도 포함된다.
본 발명에서 사용하기 위한 융합 단백질은 임의의 적합한 길이, 예를 들어 최대 300, 350, 400, 500, 1000 또는 2000개의 잔기를 가질 수 있거나, 상기 정수를 포함하거나 그 사이에 임의의 수의 잔기를 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "잔기"는 아미노산 또는 아미노산 유사체를 의미한다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 융합 단백질은 예를 들어 정제, 단리 및/또는 검출을 용이하게 하는 작은 펩티드 태그를 포함할 수 있다. 정제 목적에 적합한 친화성 태그의 비제한적 예는 폴리히스티딘 태그(His-태그), 혈구응집소 태그(HA-태그), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 태그(GST-태그), 바이오틴 태그, 아비딘 태그 및 스트렙타비딘 태그를 포함한다. 적합한 검출 태그는 GFP와 같은 형광 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
그들의 길이에 따라, 본 발명에서 사용하기 위한 융합 단백질은 당업계에서 이용 가능한 임의의 적절한 수단, 방법 또는 기술, 예를 들어 자동화된 펩티드 합성기에 의해 생성되거나 유전 공학 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 데코린을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 tCRK 귀소 펩티드를 포함하는 발현 벡터는 유전공학에 의해 제조된 후 융합 단백질을 발현하기 위해 숙주 세포로 형질감염될 수 있다. 적합한 숙주 세포의 비제한적 예는 원핵 숙주 예컨대 박테리아 (예를 들어 E. 콜라이, 바실러스), 효모 (예를 들어 피치아 포스토리스 , 사카로마이세스 세레비사에), 및 진균 (예를 들어 사상균), 뿐만 아니라 진핵 숙주 예컨대 곤충 세포 (예를 들어 Sf9), 및 포유동물 세포 (예를 들어 CHO 세포, HEK 세포)를 포함한다. 발현 벡터는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 다양한 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있고, 상기 기술은 전기천공, 뉴클레오펙션, 초음파천공, 마그네토펙션, 열 충격, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 매우 다양한 발현 벡터가 당업계에서 쉽게 입수가능하고, 당업계의 숙련자들은 사용될 숙주 세포와 같은 상이한 변수에 따라 적합한 것을 쉽게 선택할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 융합 단백질은 또한 시험관내 번역, 무세포 단백질 발현, 무세포 번역 또는 무세포 단백질 합성으로도 알려진 시험관내 단백질 발현에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 박테리아, 토끼 망상적혈구, CHO 또는 인간 용해물에 기초한 여러 무세포 발현 시스템이 당업계에서 상업적으로 이용 가능한다. 시험관 내 단백질 발현은 회분식 반응 또는 투석 모드로 수행할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 융합 단백질의 융합 파트너는 서로 직접 연결되거나 링커를 통해 연결될 수 있다. 링커는 펩티드 링커 또는 비펩티드 링커일 수 있다. 링커가 펩티드 링커인 경우 하나 이상의 아미노산으로 구성될 수 있다. 펩티드 링커의 비제한적인 예는 서열번호 23 또는 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
또한, 귀소 펩티드는 SpyTag/SpyCatcher와 같은 시스템을 통해 본 접합체 또는 조성물에 포함된 데코린 또는 임의의 다른 치료 단백질에 커플링될 수 있다.
상기에 따라, 본 발명에서 사용하기 위한 융합 단백질은 일부 구현예에서 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 그들이 인코딩하는 융합 단백질의 재조합 생산뿐만 아니라 당업계에서 이용 가능한 수단 및 방법을 통한 유전자 치료에도 사용될 수 있다.
천연(L-) 및/또는 비천연(D-) 아미노산 및/또는 융합 단백질의 펩티드모사체를 포함하는 보존적 서열 변이체는 또한 수포성 표피박리증의 치료에 사용하기 위해 구상된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 서열 변이체"는 문제의 단백질 또는 펩티드의 생물학적 특성을 크게 변경하지 않는 아미노산 서열 변형을 의미한다. 보존적 서열 변이체는 당업계에 널리 공지된 유사한 아미노산(예를 들어, 유사한 크기 또는 유사한 전하 특성을 갖는 아미노산)으로 하나 이상의 아미노산 치환으로부터 발생하는 변이체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드모사체(peptidomimetic)"는 귀소 특이성과 같은 활성을 변경하지 않고 주어진 단백질 또는 펩티드를 모방하도록 설계된 펩티드 유사 분자를 의미한다. 펩티드모사체의 비제한적인 예는 화학적으로 변형된 펩티드, D-펩티드 펩티드모사체, 비-자연 발생 아미노산을 포함하는 펩티드 유사 분자, 펩토이드 및 β-펩티드를 포함한다. 또한 펩티드와 유사하지만 천연 펩티드 결합을 통해 연결되지 않은 분자도 이 용어에 포함된다. 펩티드모사체를 생산하기 위한 수단 및 방법은 당업계에서 쉽게 입수할 수 있다.
수포성 표피박리증의 치료에 사용하기 위한 tCRK 유도 데코린 접합체는 접합체의 치료 활성이 유지되는 한, 필요에 따라 공유적으로(직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로) 또는 비공유적으로 연결된 추가 모이어티를 하나 이상 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 추가 모이어티는 그 자체의 치료적 활성, 예컨대 항염증성 활성, 항-혈관신생 활성, 재생 활성, 혈관신생유도 활성, 세포독성 활성, 세포자멸유도 활성, 항균 활성 (예를 들어 항박테리아 활성, 항-바이러스 활성, 항진균 활성 또는 항-원생동물 활성), 항-섬유 활성, 항-주름 활성, 항-가려움 활성, 항- 또는 전달유도 (예컨대 히스타민) 활성 또는 사이토카인 활성을 가질 수 있거나, 잠재적인 생물학적 활성 또는 치료적 모이어티의 치료 효과의 일부 비제한적 예를 언급하기 위해, 이는 사이토카인 억제제(예를 들어, 길항제, 가용성 수용체, 사이토카인-결합 분자 또는 다른 사이토카인을 차단하는 사이토카인)일 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 추가 모이어티는 항히스타민제, 항생제, 레티노이드, 벤조일 과산화물, 포도필로톡신, 세포독성 약물, 및 면역 조절제 예컨대 코르티코스테로이드 유도체, 칼시뉴린 억제제 및 이미퀴모드로부터 선택된 것과 같은 소분자일 수 있다. 또한, 추가 모이어티는 단백질 모이어티, 예컨대 항-섬유 TGF-β3, 임의의 재생 또는 항염증성 성장 인자 또는 사이토카인 예컨대 인터류킨-10 (IL-10), 임의의 혈관신생 성장 인자 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 임의의 항-세포자멸적 단백질 예컨대 bit1, 임의의 염증 억제 효소 예컨대 CD73, 또는 임의의 콜라겐 예컨대 유형 VII 콜라겐일 수 있다.
일부 구현예에서, tCRK 유도 데코린 접합체의 검출을 용이하게 하기 위해 추가 모이어티가 사용될 수 있다. 따라서, 접합체는 검출가능한 제제를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "검출가능한 제제"는 바람직하게는 비침습적 및/또는 생체내 시각화 기술에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 개시된 접합체에 사용하기에 적합한 검출가능한 제제의 비제한적 예는 광학 제제 예컨대 다양한 유기 및/또는 무기 소분자 및 다양한 형광 단백질 및 그의 유도체를 포함하는 형광 제제, 인광 제제, 발광성 제제 예컨대 화학발광 제제, 및 발색 제제; 방사선표지 예컨대 감마선, 양전자, 베타 또는 알파 입자, 또는 X-선을 방출하는 방사선핵종; 비-방사선 동위원소 예컨대 가돌리늄 (Gd); 이온성 및 비-이온성 콘트라스팅 제제 예컨대 요오드 기반 콘트라스팅 제제; 전자기 제제 예컨대 자성, 강자성, 상자성, 및/또는 초상자성 제제; 업컨버팅 나노입자 (UCNP), 공명 입자, 양자점, 및 금 입자를 포함한다. 추가의 적합한 검출가능한 제제가 당업계에서 이용가능하다. 당업자는 접합체에 사용되는 검출 가능한 제제의 유형 및 종에 따라 적절한 이미징 기술을 쉽게 선택할 수 있다. 이러한 기술에는 방사선학적 기술, 동위원소 기술 예컨대 양전자 배출 단층촬영, 초음파 영상화 및 자기 공명 영상 (MRI)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
검출가능한 제제는 예를 들어 공유 결합을 통해 데코린 접합체에 직접적으로 부착되거나, 또는 예를 들어 결합제, 링커, 또는 킬레이트화제 예컨대 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N-,N',N",N'"-테트라아세트산 (DOTA) 및/또는 메탈로티오네인를 통해 데코린 접합체에 간접적으로 부착될 수 있다. 검출가능한 제제를 펩티드 또는 단백질 접합체에 접합시키거나 결합시키는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 형광 단백질(예를 들어, GFP)과 같은 검출 가능한 단백질을 포함하는 접합체는 재조합 기술에 의해 융합 단백질로 생성될 수 있다.
개시된 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체, 보다 구체적으로 tCRK 유도 데코린 접합체는 자연에 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, 표피 수포증의 치료에 사용하기 위한 tCRK 유도 데코린 접합체는 접합체 및 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 제공되어 생체내 투여가 가능하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 하나 이상의 활성 성분 및 생리학적으로 적합한 성분, 예를 들어 담체, 보조제 및/또는 부형제의 제제를 광범위하게 지칭한다. 약제학적 조성물의 목적은 대상체 또는 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "활성 성분"은 항염증(anti-inflammatory) 효과, 항-혈관신생(anti-angiogenic) 효과, 재생(regenerative) 효과, 혈관신생유도(pro-angiogenic) 효과, 세포독성(cytotoxic) 효과, 세포자멸유도(pro-apoptotic) 효과, 항균 효과 (예를 들어 항균 효과, 항-바이러스 효과, 항진균 효과 또는 항-원생동물 효과), 항-섬유(anti-fibrotic) 효과, 항-가려움(anti-itch) 효과, 전달방지(anti-transmitter) 효과, 전달유도(pro-transmitter) 효과 (예를 들어 히스타민), 사이토카인 유도(cytokine-induced ) 효과 또는 사이토카인 억제(cytokine inhibition)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 생물학적 효과에 책임이 있는 물질을 광범위하게 지칭한다. 본 개시내용의 맥락에서, "활성 성분"이라는 용어는 특히 tCRK 유도 데코린을 지칭하지만, 조성물 및/또는 접합체는 상기 기재된 바와 같은 추가 활성제를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 예를 들어 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분말화, 에멀젼화, 캡슐화, 포획, 동결건조 또는 유사한 공정에 의해 당업계에서 쉽게 이용가능한 수단 및 방법을 사용하여 예를 들어 반고체 또는 고체 제제, 용액, 분산액 또는 현탁액으로서 원하는 대로 제형화될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한" 및 "생리학적으로 허용되는"은 상호 교환 가능하며 과도한 유해한 부작용 예컨대 독성, 상당한 자극 및/또는 알러지성 반응 없이 대상체 또는 유기체에 투여하기에 적합한 물질을 지칭한다. 즉, 이익/위해 비율은 합리적이어야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분이 투여를 용이하게 하기 위해 조합되고 수령체에게 생리학적으로 허용되는 담체 물질 또는 희석제를 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업계에서 쉽게 입수할 수 있으며, 의도하는 투여 경로에 따라 연장 방출 제형을 위해 경피 담체, 경점막 담체, 장관 담체, 비경구 담체, 및 담체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 선택된 담체는 활성 성분의 생물학적 활성 및 특성을 폐기하지 않아야 하지만 수령체에 대한 불리한 부작용을 최소화할 뿐만 아니라 활성 성분의 분해를 최소화해야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 바람직하게는 활성 성분의 투여를 추가로 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다. 상이한 유형의 부형제의 전형적인 예는 제한 없이 안정제, 보존제, pH 조절제, 충전제, 증점제, 점도 조절제, 윤활제, 가용화제, 계면활성제, 감미제, 맛 차폐제, 등을 포함한다.
유용한 안정화 부형제는 계면활성제 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 407; 폴리머 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 및 포비돈; 탄수화물 예컨대 수크로스, 만니톨, 글루코스 및 락토스; 당 알코올 예컨대 소르비톨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜; 단백질 예컨대 알부민; 아미노산 예컨대 글리신 및 글루탐산; 지방산 예컨대 에탄올아민; 항산화제 예컨대 아스코르브산; 킬레이트화제 예컨대 EDTA 염; 및 금속 이온 예컨대 Ca, Ni, Mg 및 Mn 을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유용한 보존제 중에는 제한 없이 벤질 알코올, 클로르부탄올, 벤즈알코늄 클로라이드 및 아마도 파라벤이 있다. 유용한 완충 부형제 중에는 제한 없이 표적 pH 범위에 따른 인산나트륨 및 인산칼륨, 시트레이트, 아세테이트 및 카보네이트 또는 글리신 완충액이 있다. 등장성 조정제로서 염화나트륨을 사용하는 것도 유용하다. 추가 부형제 물질의 비제한적 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당 및 유형의 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 당업자에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 주어진 부형제는 하나 이상의 기능을 수행할 수 있다.
약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 여부 및 치료될 영역에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 예를 들어 비경구, 장관 또는 국소일 수 있다.
사용되는 경우 조성물의 비경구 투여는 일반적으로 주사, 예를 들어 정맥내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여에 의해 적용된다. 비경구 투여를 위한 제제는 전형적으로 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼이지만, 제제는 또한 농축 형태 또는 필요에 따라 재구성되는 분말 형태로 제공될 수 있다. 느린 방출 또는 지속 방출 제형이 또한 고려된다. 비경구 투여를 위한 제제를 제형화하기 위한 수단 및 방법은 당업계에서 용이하게 이용가능하고, 당업자는 제제의 원하는 특성에 따라 적절한 생리학적으로 적합한 담체, 보조제 및/또는 부형제를 쉽게 선택할 수 있다.
비경구 및 다른 약제학적 제제용 수성 담체의 비제한적 예에는 멸균수, 물-알코올 용액, 식염수 및 생리학적 pH의 완충 용액이 포함된다. 비경구 비히클에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스 용액, 덱스트로스 + 염화나트륨 용액, 락토스 함유 링거 용액 또는 고정 오일이 포함된다. 정맥 주사 비히클은 유체 및 영양 보충제, 링거 덱스트로스 용액에 기초한 것과 같은 전해질 보충제 등을 포함한다.
비경구 및 다른 약제학적 제제를 위한 비수성 담체의 비제한적 예는 용매 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일, 어유, 및 주사가능 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다.
비경구 제제가 농축액 또는 분산액 또는 분말로 제공되는 경우, 상기 언급된 수성 또는 비수성 담체를 재구성에 사용할 수 있다. 재구성을 위한 용액은 농축액 또는 분말과 동일한 패키지로 제공될 수 있다. 분말을 제조하기 위해 동결건조가 사용되는 경우, 폴리머 (예를 들어 포비돈, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란), 당 (예를 들어 수크로스, 글루코스, 락토스), 아미노산 (예를 들어 글리신, 아르기닌, 글루탐산) 및 알부민을 제한 없이 포함하는 동결보호제를 사용하는 것이 유익할 수 있다.
조성물의 장관 투여는 사용되는 경우 예를 들어 경구 투여 또는 경피 내시경 위루술(PEG)을 통한 투여를 통해 적용될 수 있다. 경구 투여용 조성물은 제한 없이 분말, 과립, 캡슐, 샤세트, 정제 및 수성 또는 비-수용액 및 현탁액을 포함한다. 장관 투여를 위한 제제를 제형화하기 위한 수단 및 방법은 당업계에서 용이하게 이용가능하고, 당업자는 제제의 원하는 특성에 따라 적절한 생리학적으로 적합한 담체, 보조제 및/또는 부형제를 쉽게 선택할 수 있다.
조성물의 국소 투여가 사용되는 경우, 예를 들어 경피 투여, 경점막 투여, 표피 투여, 비강내 투여, 직장 투여, 질 투여 및 흡입제 투여를 통해 적용될 수 있다. 투여 경로에 따라, 국소 투여를 위한 제형은 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌약, 스프레이, 액체, 분말 및 느린 방출 또는 지속 방출제형 또는 고체 물체를 포함할 수 있다. 국소 투여를 위한 제제를 제형화하기 위한 수단 및 방법은 당업계에서 용이하게 이용가능하고, 당업자는 제제의 원하는 특성에 따라 적절한 생리학적으로 적합한 담체, 보조제 및/또는 부형제를 쉽게 선택할 수 있다.
일부 조성물은 무기 산 예컨대 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 및 인산, 및 유기 산 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 석신산, 말레산, 및 푸마르산과의 반응에 의해, 또는 무기 염기 예컨대 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 및 유기 염기 예컨대 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민 및 치환된 에탄올아민과의 반응에 의해 형성된 약제학적으로 허용가능한 산- 또는 염기- 부가 염으로서 투여될 수 있다.
본 명세서에 개시된 접합체 또는 약제학적 조성물의 투여를 위한 양 및 레지멘은 피부 질환 및 병태, 특히 수포성 표피박리증을 치료하는 임상 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로 투여는 다음과 같은 고려사항에 따라 달라질 것이다: 치료 대상체의 연령, 성별 및 일반 건강; 동시 치료의 종류(있는 경우) 치료 빈도 및 원하는 효과의 특성; 문제의 수포성 표피박리증의 중증도 및 유형; 및 개별 의사에 의해 조정될 다른 변수. 원하는 결과를 얻기 위해 원하는 용량을 하나 이상의 적용으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 단일 1일 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 총 1일 투여량은 예를 들어 매일 2, 3 또는 4회의 분할 용량으로 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 예를 들어 단위 투여 형태 또는 연장 방출 제형으로 제공될 수 있다.
실험적 파트
물질 및 방법
데코린 융합 단백질의 클로닝
천연 신호 및 프로펩티드 서열이 없는 인간 데코린(DCN) cDNA(Krusius 및 Ruoslahti, 1986, PNAS 83:7683-787)를 포유동물 발현 벡터 pEFIRES-P에 클로닝하였다(Hobbs 등, 1998, Biochem Biophys Res Commun 252:368-372). tCRK 상처 귀소 펩티드 cDNA는 정지 코돈에 측접된 데코린의 C-말단에 클로닝되었다. 6XHis-태그는 데코린보다 앞서 N-말단에 클로닝되었다. 작제물은 PIPE 방법을 사용하여 조립되었다(Klock 및 Lesley, 2009, Methods Mol Biol 498:91-103). 형질전환을 위해 NEB 5-알파 적격 E. 콜라이(고효율) 세포를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다(C2987H; New England Biolabs Ipswich, MA). 플라스미드 정제(Mini-Prep), PCR 정제 및 아가로스 겔 정제를 위해 Qiagen(Hilden, Germany)의 키트를 사용하였다. DCN은 자연적으로 이량체를 형성한다(Scott 등, 2004, PNAS 101:15633-15638). 단량체 6XHistag-DCN-tCRK 융합 단백질의 단백질 서열은 다음과 같다:
Figure pct00008
실험 파트에 사용된 DCN-tCRK 융합 단백질의 도식적인 맵은 도 1a에 나와 있다. 상세한 설명에서 명확하게 제시된 바와 같이, 도 1a의 DCN-tCRK 융합 단백질은 본 발명에 사용하기에 적합한 tCRK 유도 데코린 접합체의 비제한적 예이다.
재조합 단백질 생산
pEFIRES-P 발현 벡터의 작제물을 리포펙션(FuGene 6, Promega, Madison, WI)을 통해 HEK293F 세포에 형질감염시켰다. 양성 클론은 5-160μg/ml 퓨로마이신(HyClone, Thermo Fisher Scientific)의 존재에서 DMEM Hi-글루코스(4.5 g/l) + 2mM L-알라닐-L-글루타민, 100 IU/ml 페니실린(모두 Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 및 10% FBS(Gibco, Grand Island, NY)로 이루어진 배양 배지에서 선택되었다. 확립된 세포주는 10 μg/ml 퓨로마이신을 함유하는 배양액에서 유지되었다.
그 다음 검증된 세포를 2mM L-알라닐-L-글루타민(Sigma)이 보충된 무혈청 OptiCHO 배지(Gibco)에 재현탁하고 회전 진탕기에 장착된 정사각형 모양의 유리병에서 37℃에서 5% CO2 분위기에서 배양하였다. 세포가 1-2 x 106개 세포/ml의 밀도에 도달한 후, 재조합 단백질 발현 및 배양 배지로의 분비를 위해 33℃에서 4일 동안 더 배양하였다. 단백질은
Figure pct00009
크로마토그래피 시스템(GE Healthcare, Munich, Germany)에서 2단계 HisTrap 정제 프로토콜을 통해 배양 배지에서 정제되었다.
재조합 단백질 정제
세포 배양 상청액을 여과하고 0.45 μm 필터 장치(Corning #430514, Corning, NY)를 통해 얼음 위에서 탈기시켰다. 6XHis 태깅된 단백질은 제조업체의 지침에 따라 4℃ 냉장 캐비닛에서 먼저 HisTrap Excel 컬럼에 이어
Figure pct00010
크로마토그래피 시스템(GE Healthcare, Munich, Germany)에서 HisTrap HP 컬럼을 사용하는 2단계 정제 프로토콜을 통해 Ni-NTA-IMAC에 의해 정제되었다. 완충액을 His Buffer Kit(GE Healthcare/VWR(11-0034-00))로부터 준비하였다. 모든 완충액을 여과하고 탈기시켰다.
HisTrap Excel 컬럼 용출액을 0.5 M NaCl을 포함하는 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에서 30 mM의 최종 이미다졸 농도로 희석한 다음, HisTrap HP 컬럼에서 35 mM 이미다졸 세척 및 300 mM 이미다졸까지의 구배 용리로 추가로 정제하였다 (도 2a에는 이러한 정제 크로마토그램의 예가 포함됨). 피크 분획을 SDS NuPAGE 4-12% 구배 겔(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 분석하고 PageBlue 단백질 염색 용액(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 통해 시각화하였다.
선택된 피크 분획을 모으고 50 kDa MWCO Float-A-Lyzers(Fisher Scientific/Spectrum Labs)를 사용하여 차가운 TBS 완충액(pH 7.6)에 대해 투석한 후, 10 kDa MWCO VivaSpin 6 튜브(GE Healthcare)를 통해 농축하였다. 샘플을 필터 멸균(Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter 0.22 μm, Millipore, Burlington, MA)하고 Nanodrop(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)하고 A280 nm에서 단백질 농도를 측정하였다. 모든 단계는 4℃ 또는 얼음 위에서 수행되었다. 멸균 Tween-20을 최종 농도 0.05%로 첨가하여 응집을 방지한 후, 분취량을 -80℃에서 빠르게 냉동하였다.
재조합 단백질을 SDS Page와 Western blotting으로 검증하였다. BioRad의 습식 탱크 Mini-PROTEAN Trans-Blot Cell 시스템을 사용하였다(제조업체의 지침에 따름). 제조업체의 프로토콜에 따라 인간 데코린(MAB143, R&D Systems, Minneapolis, MN)에 대한 일차 쥣과 항체로 PVDF 멤브레인을 조사하였다. Cell Signaling Technology의 이차 서양고추냉이 과산화효소 커플링 항-마우스 항체를 사용하였다. 화학발광 블롯 이미지는 ImageQuant LAS 4000 mini(GE Healthcare)를 통해 캡처되었다.
생물물리학적 단백질 분석
Zetasizer Nano ZS 기기(Malvern Instruments Ltd, Worchestershire, UK)를 사용하여 동적 광 산란 (DLS)로 유체역학적 직경을 측정하였다. DCN-tCRK 단백질 샘플을 TBS 완충액에 1:5로 희석하였다. 3개의 10X10초 측정이 25℃에서 수행되었다. Zetasizer 소프트웨어 v7.11(Malvern Instruments Ltd.)을 사용하여 단백질 분석 모델(L-큐브가 뒤따르는 음이 아닌 최소 제곱 분석) 및 부피별 크기 분포를 통해 데이터가 분석되었다.
DCN-tCRK의 언폴딩 온도는 0.2 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 TBS 완충액(50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, pH 7.5)에서 VP-모세관 DSC(시차 주사 열량계) 기기(GE Healthcare, Microcal Inc./Malvern Instruments Ltd.)를 사용하여 결정되었다. 모든 용액을 탈기시켰다. 샘플을 2℃/분의 스캐닝 속도로 20℃에서 130℃로 가열하였다. 피드백 모드는 '낮음'으로 설정되었고 필터 기간은 5초였다. 용융 온도 Tm(전이 중간점)은 Origin 7.0 DSC 소프트웨어 제품군(Microcal Inc.)을 사용하여 비-2-상태 피팅 모델로 계산되었다.
발현된 재조합 DCN-tCRK 단백질은 Sciex 고속 TripleTOFTM 5600+ 질량 분광계와 커플링된 Eksigent 425 NanoLC를 사용하여 단량체 겔 밴드로부터 확인되었다. 문헌[
Figure pct00011
등, 2018]에 상술된 바와 같이 겔 밴드와 쿠마시 얼룩 제거 단백질을 단리한 후, 환원(TCEP, 25 mM), 알킬화(요오도아세트아미드, 0.5M) 및 트립신 소화를 거쳤다. 트립신 소화 펩티드를 14 μl의 샘플 완충액(2% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)로 희석한 후, 1 μl의 샘플을 삼중 TOF 질량 분광분석에 주입하였다.
시험관 내 결합 분석
NRP-1에 대한 DCN-tCRK 및 펩티드의 시험관내 결합을 ELISA 분석을 사용하여 분석하였다. 96-웰, 검은색 FLUOTRACTM 600, 고 결합 플레이트(
Figure pct00012
오스트리아)를 PBS에서 100 μL/웰의 100 μg/ml DCN-tCRK로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 10 μg/웰 RPARPAR(서열번호 25) 및 RPAPRARA(서열번호 26) 펩티드를 각각 양성 및 음성 대조군으로서 병렬로 코팅하였다. 고정화 대조군으로 BSA를 사용하였다. 플레이트를 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척하고 300 μl의 차단 용액(1XPBS, 1% BSA, 0.1% Tween-20)으로 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. His 태깅된 뉴로필린-1 b1b2 도메인(NRP-1 WT) 및 삼중 돌연변이체 NS346A-E348A-T349A 뉴로필린-1 b1b2 도메인(NRP-1 돌연변이체)은 이전에 기재된 바와 같이 Protein Production and Analysis Facility at the Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute (La Jolla, CA)에서 단백질 생산 및 분석 시설에서 발현 및 정제되었다 (Teesalu 등, 2009, PNAS 106:16157-16162). 재조합 단백질 NRP1 WT, NRP1 돌연변이체, 및 DCN-tCRK는 1:10 비율의 아민 반응성 FAM 염료(DMSO 최종 농도 0.2%로 희석) 및 단백질을 혼합하여 표지된 FAM (5-(및-6)-카복시플루오레세인, #90024, Biotium Inc, CA, USA)였다. 혼합물 반응물을 실온에서 2시간 동안 어두운 곳에서 인큐베이션한 후, PBS로 한외여과/투석하여 단백질로부터 유리 염료를 분리하였다. 차단 용액 중의 100 μl의 FAM 표지된 NRP1 WT 또는 NRP1 돌연변이체 단백질을 각 웰에 첨가하고(20 μg/웰), 실온에서 4-6시간 동안 실온 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 차단 용액으로 3회 세척하였다. 각 웰에 100 μl의 PBS를 첨가한 후, 형광 판독기(Flex Station II, Molecular Devices; 피크 여기 = 485 nm, 피크 방출 = 530 nm, 컷오프 = 515)를 사용하여 상단 판독 모드로 플레이트를 즉시 판독하였다.
시험관 내에서 FAM-DCN-tCRK를 NRP-1 양성 전립선 암종-3(PC-3) 세포(Ruoslahti laboratory at Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute, La Jolla, CA 제공) 및 음성 흑색종(M21) 세포(David Cheresh Lab at University of California San Diego, La Jolla, CA 제공)에 결합시키기 위해, 세포는 먼저 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 DMEM 고혈당 배지에서 10% 우태 혈청(FBS)으로 이루어진 성장 배지에서 배양되었다. 실험을 위해, 배지를 흡인하고, 세포를 따뜻한 배지로 2회 세척하고, 신선한 배지를 10 μg FAM 표지된 DCN-tCRK 재조합 단백질과 함께 첨가하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 Lightning-Link 플루오레세인 키트(Expedon Ltd, UK)를 사용하여 DCN-tCRK 재조합 단백질을 플루오레세인에 직접 결합하여 라벨링을 수행하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고; 배지를 흡인하고 세포를 세척하고 -20 ℃ 메탄올로 고정하였다. 세포를 PBS로 세척하고 RT에서 30분 동안 차단(PBS, 1% BSA, 1% FBS, 1% 염소 혈청, 0.05% Tween-20)한 다음, RT에서 1시간 동안 1차 항-FITC(Invitrogen, CA, USA. 카탈로그 # A-889)를 수행하였다. 세포를 세척하고, 2차 항체 Alexa Fluor 488 염소 항-토끼 IgG(Invitrogen, USA)를 실온에서 암실에서 1시간 동안 적용하였다. 세포핵을 DAPI로 염색하였다. 커버슬립을 Fluoromount-G(Electron Microscopy Sciences, PA, USA)를 사용하여 유리 슬라이드에 장착하고 공초점 현미경검사(Olympus FV1200MPE, Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지화하고 FV10-ASW4.2 뷰어를 사용하여 분석하였다.
마우스 및 연구 승인
BALB/cJRj 마우스(Janvier Labs, Le-Genest-Saint-Isle, France)를 약동학에 사용하였다. 마우스에게 표준 실험실 펠릿과 물을 선택적으로 공급하였다. Balb/cJRj 마우스를 사용한 모든 동물 실험은 National Animal Ethics Committee of Finland (ESAVI/6422/04.10.07/2017)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다.
열성 이영양성 수포성 표피박리증(RDEB)의 동물 모델, 즉 col7a1 -/- RDEB 마우스를 사용하여 DCN-tCRK의 피부 귀소 및 치료 기능을 연구하였다. col7a1 -/- RDEB 마우스는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 결정된 유전자형을 갖는 C57BL6/J col7a1 +/- 마우스를 번식시킴으로써 생성되었다. Thomas Jefferson University의 Jouni Uitto 박사가 친절하게 제공한 C57BL6/J col7a1 +/- 마우스는 프레임 외 결실을 통해 col7a1 유전자의 표적 제거에 의해 개발되었다. col7a1 -/- RDEB를 사용한 모든 동물 연구는 New York Medical College Institutional Animal Care & Use Committee(IACUC)에서 승인한 프로토콜을 사용하여 수행되었다.
재조합 단백질 약동학
재조합 단백질 DCN-tCRK 또는 DCN을 0.05% Tween-20을 함유하는 Tris 완충 식염수(TBS)에 희석하였다. DCN-tCRK 및 DCN의 약동학은 8주령 Balb/c 수컷 마우스로 연구되었다. 5 mg/kg DCN-tCRK 또는 DCN을 이소플루란 마취 하에 꼬리 정맥에 주사하였다. 뚜렷한 꼬리 정맥의 혈액 샘플을 주사 후 15분, 30분, 60분, 2시간, 4시간 및 16시간에 수집하였다. 주사 후 8시간 또는 24시간에, 마우스를 메데토미딘-케타민 마취 하에 희생시키고 쇄골하 정맥으로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 샘플을 1 M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 혼합하고 실온에서 10분 동안 2000 g을 원심분리한 다음, 분석을 위해 혈장을 보관하였다. 제조자가 제공한 지침에 따라 Human Decorin DuoSet ELISA 키트(#DY143, R&D Systems)를 사용하여 혈장 샘플에서 인간 유래 데코린의 농도를 측정하였다. 주입되지 않은 마우스의 정맥혈 샘플을 각 플레이트에 사용하여 일차 항체의 특이성을 확인하였다.
col7a1 -/- 마우스에서 DCN-tCRK 및 DCN의 투여
임신한 col7a1 +/- 마우스를 개별적으로 수용하고 분만 전에 매일 모니터링하였다. 신생 마우스의 정맥 주사는 기술적으로 어렵고 종종 일관성 없는 결과를 낳기 때문에, 발명자들은 col7a1 -/- 마우스의 간으로 DCN-tCRK 및 DCN(~5 mg/kg에 해당하는 15 μl PBS 중 5 μg)의 첫 번째 용량을 출생 24시간 이내에 주사하기로 선택한 것은, 간이 태아 및 신생아 마우스에서 조혈의 원발 부위이며 인간 세포는 간내 주사 후 빠르게 순환계로 들어가는 것으로 나타났기 때문이다(Liao 등, 2015, Stem Cells 33). :1807-1817; Liao 등, 2018, Steml Cells Transl Med 7:530-542). 이 첫 번째 용량 후, 마우스가 14일령(최대 7회 용량)에 도달할 때까지 격일로 단백질을 반복적으로 복강내(i.p.) 투여하고 마우스가 1주령이 되었을 때 용량을 10μg으로 늘렸다. 마우스를 매일 모니터링하였다. 모든 실험적 col7a1 -/- 마우스는 샘플 수집 시점에 유전자형이 분석되었다.
col7a1 -/- 마우스의 조직학적 및 면역조직화학적 염색 및 hDCN 정량
등쪽 피부와 발(전방 및 후방)을 선택한 마우스에서 잘라내어 Tissue-Tec OCT Compound (Sakura Finetek, Torrance, CA)에 포매하고 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 각 표본에 대해 6 μm 연속 절편을 절단하였다. Picrosirius Red 염색 및 CTGF(#ab6992, Abcam, Cambridge, UK) 면역조직화학적 염색은 New York Medical College의 Core Histology Lab에서 수행되었다. his 태그의 면역화학적 염색을 위해, 절편을 4% 파라포름알데히드로 고정하고 M.O.M. 차단 시약(Vector Laboratories, Burlingame, CA)(마우스에서 생성된 항체용)(Vector Laboratories, Burlingame, CA) 또는 10% 말 혈청(GIBCO, Grand Island, NY) 및 0.1% Triton(Sigma, St. Louis, MO)으로 차단하였다. 그 다음 슬라이드를 항-Col1A(#R1038, Acris, Rockville, MD), 항-αSMA(#14968, Cell signaling Technology, Danvers, MA), 항-6x-His 태그(#R930-25, Thermofisher Scientific, Carlsbad, CA) 및 항-NRP-1(#AF566-SP, R&D Systems, Minneapolis, MN), 이어서 상응하는 Alexa Fluor 488 이차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 포함한 각각의 일차 항체와 함께 배양하였다. 그 다음 슬라이드를 DAPI(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 함유하는 Vectashield 장착 매체에 장착하였다. 각 실험 세트에서 서로 다른 그룹 간에 동일한 설정을 사용하여 Nikon 90i Eclipse 현미경(Nikon Instrument Inc., NY)을 사용하여 이미지를 획득하였다. 사용자 가이드에 따라 NIS-Elements AR 소프트웨어를 사용하여 필드당 면역염색 강도를 측정하였다. RGB 이미지는 피크로시리우스 레드 염색의 정량화에 사용되었으며 역치는 이미지 내에서 기준점을 선택하여 정의되었다.
col7a1 -/- 마우스 중 DCN-tCRK 및 DCN의 피부로의 귀소은 제조업체의 권장 사항에 따라 Human Decorin DuoSet ELISA 키트(#DY143, R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 결정되었다. 조직 생검을 액체 질소에서 급속 냉동하고 미리 냉각된 막자로 갈아서 용해 완충액(1% Tween 20, 프로테아제 억제제 칵테일, PBS의 DNase 및 RNase)으로 균질화하였다. 4℃에서 10분 동안 12,000 g에서 원심분리한 후, 상청액을 수집하고 BioRad DC 단백질 검정(BioRad, Hercule, CA)을 사용하여 총 단백질 농도에 대해 정량화하였다. DCN-tCRK 또는 DCN 투여 유무에 관계없이 col7a1 -/- 마우스의 혈청을 검정에 적용하기 전에 샘플 희석액에 1:20으로 희석하였다.
RT 2 프로파일러 PCR 상처 치유 경로 분석
RT2 프로파일러 PCR 어레이(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 마우스 상처 치유 경로에 관여하는 유전자의 발현을 연구하였다. RT2 프로파일러 어레이는 96웰 플레이트에 게놈 DNA, 역전사 및 PCR 양성 대조군이 있는 84개의 상처 치유 유전자 및 5개의 하우스키핑 유전자용 프라이머를 함유한다. 7일째에 WT, RDEB 및 DCN 또는 DCN-tCRK 주입된 col7a1 -/- 마우스(각 그룹에서 3마리의 마우스)의 전체 앞발로부터 총 RNA를 단리하였다. RNA의 품질과 농도는 NanoDrop 200C(ThermoScientific, Waltham, MA)로 결정하였다. RNA는 게놈 DNA 제거 믹스(QIAGEN)로 처리되었다. RT2 First Strand 키트(QIAGEN)를 사용하여 각 샘플의 총 RNA 500 ng을 역전사에 적용하였다. cDNA 합성 반응을 2 x RT2 SYBR Green Master 믹스와 조합하고 이 칵테일 25 μl를 96-웰 플레이트의 각 웰에 분배하였다. Q-PCR은 QuantStudio5 Real-Time PCR 기기(Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 실행되었다. CT 값을 Excel 파일로 내보내었다. 생성된 원시 데이터는 GeneGlobe 데이터 분석 센터(https://www.qiagen.com/us/geneglobe)의 PCR 어레이 데이터 분석 템플릿을 사용하여 분석되었다. ΔΔCT 방법을 사용하여 유전자 발현을 계산하였다. 1.5의 배수 변화 유전자 발현 역치 및 0.05의 p-값 역치를 사용하여 WT 강아지와 처리되지 않은/처리된 강아지 사이의 데이터를 분석하였다.
콜라겐 격자 수축 검정
인간 정상 섬유아세포 및 RDEB 환자 유래 섬유아세포는 이전에 기술된 바와 같이 10% FBS가 보충된 DMEM에서 배양되었다(Liao 등, 2018, Stem Cells 36:1839-1850). 세포 현탁액을 중화된 랫트 꼬리 콜라주 I형(Advance BioMatrix, Carlsbad, CA)과 혼합하여 콜라겐 격자를 준비하였다. 콜라겐의 최종 농도는 2.1 x 105개 세포/ml의 세포 밀도를 갖는 2.4 mg/ml이었다. 500 μl의 세포/콜라겐 현탁액을 24-웰 플레이트의 단일 웰에 분주하고 실온에서 30분 동안 응고시켰다. 콜라겐 중합 후 각 웰에 5% FBS가 보충된 0.5 ml의 DMEM을 첨가하고 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 12시간 인큐베이션, 후, 얇은 피펫 팁으로 각 웰의 겔을 부드럽게 방출하고 DCN 또는 DCN-CRK를 각각 최종 농도 75 μM(조건당 n=3)로 첨가하였다. 각각 12시간(초기 영역) 및 48시간(수축 영역)에 이미지를 획득하고 이미지 J를 사용하여 겔의 영역을 정량화하였다.
통계
중간 수명을 결정하기 위해 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석을 적용했고, 서로 다른 실험 그룹 간의 생존을 비교하기 위해 로그 순위(Mantel-Cox) 테스트를 사용하였다(GraphPad Prism 6). 스튜던트 쌍을 이루지 않은 t-테스트는 NRP-1에 대한 DCN-tCRK 결합을 연구하는 데 사용되었다. 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주되었다.
결과
다기능, 재조합 DCN-tCRK 융합 단백질의 생성
본 발명자들은 DCN의 C-말단에 tCRK 펩티드를 위치시킴으로써 DCN-tCRK 융합 단백질을 조작하였다(도 1a). DCN-tCRK와 천연 DCN 모두 포유동물 세포에서 발현되었고 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다(도 2a). 두 재조합 단백질 모두 SDS 겔 전기영동에서 밴드 위의 스미어와 함께 약 55 kDa에서 날카로운 밴드로 이동했고 웨스턴 블롯 분석에 의해 DCN으로 검출되었다(도 2b). 날카로운 밴드는 코어 단백질에 해당하며 스미어는 DCN 코어에 부착된 글리코사미노글리칸 설페이트 사슬(주로 콘드로이틴)의 이종성으로 인해 발생한다. 질량 분광분석은 DCN과 C-말단 tCRK 서열의 동일성을 확인하였다(표 1). 유체역학적 크기는 DCN-tCRK가 보고된 DCN의 이량체와 일치하는 직경을 가진 균질하고 응집되지 않은 거대분자로 존재함을 나타낸다(Scott 등, 2003, J Biol Chem 278:18353)(도 2c). 시차 주사 열량측정은 49 ℃의 용융 온도(Tm)으로 날카로운 피크를 생성했으며, 이는 tCRK-DCN이 생리학적 조건에서 안정적인 3차 구조를 유지할 것임을 시사한다(도 2d).
Figure pct00013
DCN-tCRK는 시험관 내에서 NRP-1과 상호 작용한다
발명자들은 다음으로 DCN에 융합된 tCRK 펩티드가 NRP-1과 상호작용하는 능력을 유지하는지 여부를 조사하였다. DCN-tCRK는 ELISA 플레이트에 고정되었고 야생형(WT) 또는 돌연변이 NRP-1에 대한 결합을 테스트했으며, 여기서 CendR 결합 포켓은 삼중 돌연변이에 의해 비활성화되었다. (Teesalu 등, 2009, PNAS 106:16157-16162) DCN-tCRK는 대조군 소 혈청 알부민(BSA)보다 상당히 높은 수준으로 WT NRP-1에 효과적으로 결합하는 반면(p < 0.01), 돌연변이체 NRP-1에 유의한 결합을 나타내지 않았다 (p > 0.05)(도 1b). 또한, 합성 RPARPAR(서열번호 25) 펩티드, 프로토타입 CendR 펩티드 및 RPARPARA(서열번호 26), C-말단에 캡핑된 CendR-서열을 갖고 NRP-1와 상호작용할 수 없는 대조 펩티드를 사용한 병렬 연구는 결합이 CendR-서열에 의존한다는 것을 강화하는 데 사용되었다(도 1b). 본 발명자들은 DCN-tCRK가 NRP-1을 발현하는 세포, 즉 인간 PC3 전립선 암종 세포에 결합하는지 여부를 추가로 결정하였다. NRP-1을 발현하지 않는 M21 흑색종 세포도 검정에 포함되었다. NRP-1 의존성 세포 결합 및 침투 특성을 뒷받침하는 DCN-tCRK의 내재화는 NRP-1 양성 PC3 세포에서만 관찰되었지만 NRP-1 음성 M21 세포에서는 관찰되지 않았다(도 1c).
DCN-tCRK 및 DCN은 생체 내에서 유사한 약동학을 나타내었다
tCRK 펩티드의 첨가가 DCN의 순환 반감기에 어떤 영향을 미치는지 결정하기 위해, DCN-tCRK 및 DCN을 건강한 Balb/c 마우스에 병렬로 정맥 주사하고 투여 24시간 이내에 다른 시점에서 말초 혈액의 양은 ELISA에 의해 정량화되었다. 혈중 DCN-tCRK의 반감기는 30분으로 DCN과 크게 다르지 않았다(도 3). 약동학 연구는 작은 혈관 귀소 펩티드로 DCN을 변형해도 DCN의 약동학에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
DCN-tCRK 투여로 col7a1 -/- 마우스의 생존율을 개선한다
RDEB의 동물 모델인 col7a1 -/- 마우스에서 DCN 및 DCN-tCRK의 치료 기능 및 피부 귀소 특성을 평가하였다. 이 마우스는 이형접합 한배새끼의 번식에 의해 생성되며, col7a1 -/- 마우스는 출생 시 피부의 출혈성 수포의 발현을 기준으로 확인할 수 있다. 신생 col7a1 -/- 마우스를 무작위로 나누어 DCN, DCN-tCRK 또는 PBS(음성 대조군) 간내 투여를 받았다. 각 그룹 내 생존 마우스에 대해 첫 번째 용량 후 14일까지 격일로 반복 복강 투여를 수행하였다. 여기서, col7a1 -/- 마우스의 중앙 수명은 PBS 주입 후 2일이었고 DCN 투여 후 7일로 유의하게 연장되었다(p < 0.0001)(도 4a). 그러나, DCN 투여 후 col7a1 -/- 마우스의 생존은 덱스트란/인간 혈청 알부민(D/HSA)의 이력 투여와 비교하여 통계적으로 유의하지 않았고, 이는 줄기 세포 투여를 위한 비히클로 사용되었으며 체액 균형을 조정하여 산발적으로 일부 col7a1 -/- 수령체 마우스의 생존을 증가시켰다 (도 5). 더욱이 DCN 주사는 수령체의 생존 기간을 2주 이상 연장하지 못하였다. 중요하게도, DCN-tCRK 처리 후 마우스의 중앙 수명은 11일로 추가 연장되었으며, 이는 PBS(p < 0.0001) 또는 이력 D/HSA 투여(p < 0.001) 후보다 훨씬 더 우수하였다(도 4a 및 5). 또한, DCN-tCRK 처리된 마우스의 85%는 7일 생존에 도달했고 이들 마우스의 20%는 3주령 이후 생존했으며 이후 피부 분석을 위해 희생되었다.
DCN-tCRK는 col7a1 -/- 마우스 피부에 귀환한다
ELISA 검정을 이용하여 1주, 2주 및 3주에 수령체 RDEB 마우스의 피부에서 인간 DCN 및 DCN-tCRK를 정량화하였다(모든 시점에서 n = 3)(도 4b). 1-주 시점에서 DCN-tCRK와 DCN 치료 피부 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 그러나 2-주 시점에서 DCN-tCRK 수준은 DCN보다 유의하게 높았다(3.6배, p < 0.05)(도 4b). 또한 DCN-tCRK의 마지막 i.p. 투여는 14일째에 수행됨에 따랄, 3-주 피부(19.47 ± 12.80 pg/ml)에서 DCN-tCRK의 확인은 적어도 7일 동안 생체 내 안정성을 매우 암시한다.
RDEB 피부에서 DCN-tCRK 또는 DCN의 해부학적 분포를 분석하기 위해 히스티딘-태그의 발현에 기초한 면역조직화학적 염색도 수행하였다. DCN-tCRK는 1주, 2주 및 3주째에 RDEB 마우스의 발과 등쪽 피부 모두의 진피에서 검출되었다(도 4c). 또한, 수령체 RDEB 마우스의 위장관(GI) 염색은 항-his 항체와의 반응성을 나타내지 않았으며(데이터는 표시되지 않음), 이는 DCN-tCRK의 피부 특이적 표적화를 암시한다. 대조적으로, ELISA가 피부 용해물에 DCN의 존재를 입증했지만, DCN 처리된 RDEB 피부에 대한 항-his 면역염색은 1-주 시점으로 표시되며, 단지 비특이적(확산)으로 나타났다(도 4c). DCN-tCRK의 귀소이 NRP-1 의존성 세포 및 조직 침투에 의해 제공된다는 본 발명자들의 비제한적 가설을 추가로 뒷받침하는 항-his 및 -NRP-1 이중 염색은 DCN-tCRK의 신호는 RDEB 피부에서 NRP-1에 대해 양성인 세포 내에 있거나 근접해 있었음을 입증하였다 (도 4d)
DCN-tCRK 요법은 RDEB 마우스의 섬유화 반응을 억제한다
본 발명자들에 의한 최근 연구는 col7a1 -/- 마우스에서 빠르면 생후 1주일에 발의 교대배치형 폴드에서 시작하는 TGFβ 신호전달의 현저한 상승을 입증하였다. 따라서 이 연구에서는 WT와 비히클(D/HSA), DCN 또는 DCN-tCRK 처리된 RDEB 피부 사이의 상처 치유 반응 및 섬유증 형성에 중요한 84개 유전자의 발현을 비교하기 위해 이 시점의 피부 생검을 선택하였다 (그룹당 n = 3)(표 2). WT에 비해, 유전자의 절반 이상이 도 6a의 클러스터그램에서 입증된 바와 같이 비히클-주입된 RDEB 피부에서 >1.5배의 발현 증가를 보였다. 유전자 발현의 상대적 배수 변화(log2)와 p 값(-log10)은 또한 화산 플롯으로 표시되며 유의하게(p < 0.05) 조절되지 않는 유전자는 각 플롯에서 흰색으로 표시된다(도 6b). 비히클 RDEB 피부에서 크게 상향 조절된 유전자는 TGFβ 신호전달 (즉, Tgfb1 , Tgfbr3 , Ctgf), WNT 신호전달 (Ctnnb1), MAPK1/MAPK3 신호전달 (Mapk3) 및 표피 성장 인자 수용체 신호전달 (Egfr), ECM 리모델링 (Ctsg , Plaur), 세포 부착 (Itgb3 , Itgb5) 및 염증 (Il4, Cxcl3 , Tnfα)에 관여한다. WT와 비교하여 비히클 RDEB 피부에는 현저하게 하향 조절된 유전자가 없었다. DCN 처리된 RDEB 마우스 피부에서 전체 유전자 발현 프로필은 비히클 RDEB 피부와 유사하였다(도 6b). Tgfb1의 발현이 더 이상 유의미하게 비정상적이지는 않았지만 Tgfbr3 및 Ctgf의 발현은 DCN 처리된 RDEB 피부에서 여전히 유의미하게 상향 조절되었다. Il4 , Cxcl3 , Tnfα와 같은 일부 유전자는 비히클 대조군보다 DCN 처리된 RDEB 피부에서 더 크게 상향조절되었다(도 6b 및 표 2).
중요하게, DCN-tCRK 처리된 RDEB 피부의 발현 프로파일이 비히클 및 DCN 처리된 RDEB 피부의 발현 프로파일과 현저하게 다르며 WT 피부와 유사하다는 것이다(도 6a). 일부 유전자의 발현에 개별 변이가 있었지만 WT와 비교할 때 DCN-tCRK 처리 RDEB 피부에서 어레이의 유전자 중 어느 것도 크게 조절되지 않았다(도 6 및 표 2).
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
치료되지 않은 RDEB 피부에서 TGFβ1 매개 섬유증의 발달과 DCN-tCRK 치료에 의한 억제를 뒷받침하는 CTGF/CCN2의 강한 발현이 비히클 주사된 RDEB 피부에서 관찰되었고 발현 수준은 DCN-tCRK로 치료한 후 현저하게 감소하였다(도 7a). 더욱이 전체 콜라겐 침착은 피크로사이리우스 레드 염색에 의해 입증된 바와 같이 비히클 주입된 RDEB 피부에서 시간이 지남에 따라 증가했지만 DCN-tCRK 처리된 마우스 피부에서는 상당히 감소하였다(도 7b 및 7c). 면역염색은 2-주 시점에서 비히클 처리된 피부에서 유형 I 콜라겐(COL1)의 발현의 실질적인 증가 및 DCN-tCRK 처리된 피부에서 감쇠된 발현을 입증하였다(도 7d 및 7e). 유사한 결과가 근섬유아세포, 즉 α-평활근 액틴(αSMA, 도 7d 및 도 7e)의 면역염색으로 얻어졌다. 또한 WT의 대부분의 αSMA + 세포와 DCN-tCRK 처리된 RDEB 피부는 혈관과 함께 국소화(CD31 염색)되어 혈관 평활근 세포 및 혈관 주위 세포로서의 정체성을 나타내는 반면, 비히클 처리된 RDEB 피부에서 αSMA + 세포는 혈관 밖에 있었으며, 즉 근섬유아세포임을 나타낸다(도 7d).
DCN-tCRK의 항섬유화 기능을 직접 입증하기 위해, 정상 및 RDEB 유래 섬유아세포를 사용하여 시험관 내에서 콜라겐 겔 수축을 억제하는 DCN 및 DCN-tCRK의 능력을 비교하였다. DCN이 콜라겐 수축에 큰 영향을 미치지 않는 저농도(75μM)에서, DCN-tCRK는 정상(p<0.05) 및 RDEB 유래(p<0.01) 섬유아세포 모두에서 콜라겐 겔 수축을 억제하였다(도 8).
논의
상처 귀소 펩티드에서 CendR 서열의 C-말단 노출이 정상 및 상처 피부에서 펩티드의 새로운 조직 투과 기능을 제공한다는 것이 본 명세서에서 입증된다. tCRK 펩티드와 DCN과의 접합은 RDEB의 쥣과 모델에서 항섬유화 효과를 발휘하고 생존율을 개선하는 치료용 융합 단백질의 피부 선택적 표적화를 촉진한다.
실험은 DCN-tCRK 재조합 단백질의 전신 투여가 변형되지 않은 DCN보다 col7a1 -/- 마우스의 생존율을 향상시키는데 더 효과적이라는 것을 입증하였다. 정확한 분자 메커니즘은 알려져 있지 않지만 이론에 국한되지 않고 여러 다른 메커니즘이 생존율 향상에 기여할 수 있다고 가정한다. DCN은 항염증 및 항섬유화 분자이다. TGFβ 신호전달의 활성화에 대한 본 발명자들의 이전 발견과 일관되게, 출생 후 1주일에 이르면 섬유증 형성과 관련된 유전자의 절반 이상의 발현이 1-주 시점에 처리되지 않은 RDEB 마우스 피부에서 상향조절되었다. 어떤 이론에 국한되지 않고, DCN-tCRK 투여에 의한 RDEB 마우스의 개선된 생존은 치료용 단백질의 항섬유증 및 항염증 효과와 관련이 있는 것 같다.
TGFβ 신호전달에 직접 관여하는 유전자가 DCN-tCRK(그러나 DCN에서는 아님) 처리된 RDEB 피부에서 정상화되었을 뿐만 아니라 β-카테닌 및 EGFR과 같은 다른 신호전달 경로와 관련된 유전자도 DCN-tCRK 투여에 의해 정상화되었다. Wnt/β-카테닌 및 EGFR 신호전달은 둘 다 독립적인 섬유화 촉진 메커니즘을 통해 또는 TGFβ 신호전달과 혼선을 통해 여러 섬유화 질환에서 섬유화에 기여하는 것으로 입증되었다. 예를 들어, EGFR 활성화는 TGFβ 및 CCN2 매개 섬유아세포 증식 및 근섬유아세포 전환분화의 전섬유화 기능에 필요하다. DCN은 EGFR 및 HGF 수용체 Met에 결합하고 이를 하향 조절할 수 있다(β-카테닌의 발현을 억제하기 위해). DCN-tCRK 투여 후 col7a1 -/- 마우스 피부에서 이들 유전자의 정규화된 발현은 RDEB에서 DCN-tCRK의 다중 치료 기능을 시사한다. DCN 처리된 RDEB 피부에서 전-염증 유전자의 상향 조절은 차례로 천연 DCN의 투여에 의해 지속되지 않는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
요약하면, 숨겨진 CendR 서열의 노출은 상처 표적화 펩티드의 새로운 특징을 상처 입은 피부에 더하여 정상 피부로 유도하고 또한 진피 조직 침투를 제공한다는 것이 본원에서 입증된다. 또한 이 펩티드(tCRK)는 전신 진피 질환, 특히 수포성 표피박리증의 치료에서 데코린 및 다른 치료 분자를 전달하기 위한 비히클 역할을 할 수 있음이 입증되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Tampere University Foundation sr <120> HOMING PEPTIDE-GUIDED DECORIN CONJUGATES FOR USE IN TREATING EPIDERMOLYSIS BULLOSA <130> DCN-tCRK <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Lys Asp Lys 1 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Cys Arg Lys Asp Lys 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Arg Lys Asp Lys Cys 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Arg or Lys <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Cys Ala Arg Ser Lys Asn Lys Asp Cys 1 5 <210> 6 <211> 358 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 20 25 30 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 35 40 45 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 50 55 60 Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro 65 70 75 80 Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile 85 90 95 Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu 100 105 110 Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu 115 120 125 Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu 130 135 140 Pro Glu Lys Met Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu 145 150 155 160 Ile Thr Lys Val Arg Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile 165 170 175 Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu Asn 180 185 190 Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp 195 200 205 Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu 210 215 220 Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu 225 230 235 240 Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile 245 250 255 Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu 260 265 270 Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala 275 280 285 Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser 290 295 300 Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys 305 310 315 320 Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp 325 330 335 Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile 340 345 350 Gln Leu Gly Asn Tyr Lys 355 <210> 7 <211> 342 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 1 5 10 15 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 20 25 30 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 35 40 45 Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro 50 55 60 Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile 65 70 75 80 Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu 85 90 95 Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu 100 105 110 Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu 115 120 125 Pro Glu Lys Met Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu 130 135 140 Ile Thr Lys Val Arg Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile 145 150 155 160 Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu Asn 165 170 175 Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp 180 185 190 Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu 195 200 205 Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu 210 215 220 Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile 225 230 235 240 Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu 245 250 255 Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala 260 265 270 Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser 275 280 285 Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys 290 295 300 Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp 305 310 315 320 Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile 325 330 335 Gln Leu Gly Asn Tyr Lys 340 <210> 8 <211> 312 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu 1 5 10 15 Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp 20 25 30 Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr 35 40 45 Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu 50 55 60 Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr 65 70 75 80 Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys 85 90 95 Glu Leu Pro Glu Lys Met Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu 100 105 110 Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln 115 120 125 Met Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile 130 135 140 Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile 145 150 155 160 Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu 165 170 175 Thr Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala 180 185 190 Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn 195 200 205 Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu 210 215 220 Arg Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly 225 230 235 240 Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn 245 250 255 Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr 260 265 270 Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln 275 280 285 Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser 290 295 300 Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys 305 310 <210> 9 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 20 25 30 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 35 40 45 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 50 55 60 Val Gln Cys Ser Asp Leu Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser 65 70 75 80 Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile 85 90 95 Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro 100 105 110 Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp 115 120 125 Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser 130 135 140 Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro 145 150 155 160 His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro 165 170 175 Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn 180 185 190 Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His 195 200 205 Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro 210 215 220 Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val 225 230 235 240 Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys 245 250 <210> 10 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 1 5 10 15 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 20 25 30 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 35 40 45 Val Gln Cys Ser Asp Leu Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser 50 55 60 Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile 65 70 75 80 Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro 85 90 95 Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp 100 105 110 Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser 115 120 125 Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro 130 135 140 His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro 145 150 155 160 Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn 165 170 175 Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His 180 185 190 Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro 195 200 205 Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val 210 215 220 Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys 225 230 <210> 11 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu 1 5 10 15 Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys 20 25 30 Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser 35 40 45 Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu 50 55 60 Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg 65 70 75 80 Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly 85 90 95 Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn 100 105 110 Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg 115 120 125 Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu 130 135 140 His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro 145 150 155 160 Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser 165 170 175 Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val 180 185 190 Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys 195 200 <210> 12 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 20 25 30 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 35 40 45 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 50 55 60 Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His 65 70 75 80 Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly 85 90 95 Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala 100 105 110 Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His 115 120 125 Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His 130 135 140 Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser 165 170 175 Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile 180 185 190 Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu 195 200 205 Gly Asn Tyr Lys 210 <210> 13 <211> 196 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 1 5 10 15 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 20 25 30 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 35 40 45 Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His 50 55 60 Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly 65 70 75 80 Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala 85 90 95 Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His 100 105 110 Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His 115 120 125 Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val 130 135 140 Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser 145 150 155 160 Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile 165 170 175 Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu 180 185 190 Gly Asn Tyr Lys 195 <210> 14 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu 1 5 10 15 Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu 20 25 30 Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu 35 40 45 Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile 50 55 60 Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu 65 70 75 80 Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala 85 90 95 Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser 100 105 110 Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys 115 120 125 Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp 130 135 140 Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile 145 150 155 160 Gln Leu Gly Asn Tyr Lys 165 <210> 15 <211> 172 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 20 25 30 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 35 40 45 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 50 55 60 Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro 65 70 75 80 Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile 85 90 95 Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Val Val Tyr Leu 100 105 110 His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro 115 120 125 Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser 130 135 140 Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val 145 150 155 160 Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys 165 170 <210> 16 <211> 156 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 1 5 10 15 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 20 25 30 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 35 40 45 Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro 50 55 60 Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile 65 70 75 80 Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Val Val Tyr Leu 85 90 95 His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro 100 105 110 Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser 115 120 125 Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val 130 135 140 Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys 145 150 155 <210> 17 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu 1 5 10 15 Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp 20 25 30 Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr 35 40 45 Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Val Val 50 55 60 Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys 65 70 75 80 Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu 85 90 95 Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg 100 105 110 Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys 115 120 125 <210> 18 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 20 25 30 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 35 40 45 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 50 55 60 Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Cys Leu Pro Ser 65 70 75 <210> 19 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 1 5 10 15 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 20 25 30 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 35 40 45 Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Cys Leu Pro Ser 50 55 <210> 20 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu 1 5 10 15 Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Cys Leu Pro Ser 20 25 <210> 21 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Decorin-tCRK fusion <400> 21 Gly His His His His His His Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu 1 5 10 15 Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro 20 25 30 Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly 35 40 45 Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp 50 55 60 Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn 65 70 75 80 Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys 85 90 95 Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr 100 105 110 Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr 115 120 125 Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys 130 135 140 Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr 145 150 155 160 Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met 165 170 175 Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile 180 185 190 Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly Asn 195 200 205 Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu 210 215 220 Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly 225 230 235 240 Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn Asn 245 250 255 Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln 260 265 270 Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser Asp 275 280 285 Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val 290 295 300 Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr 305 310 315 320 Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys 325 330 335 Gly Ser Glu Phe Cys Arg Lys Asp Lys 340 345 <210> 22 <211> 368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Decorin-tCRK fusion <400> 22 Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu 20 25 30 Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro 35 40 45 Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val 50 55 60 Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro 65 70 75 80 Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile 85 90 95 Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu 100 105 110 Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu 115 120 125 Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu 130 135 140 Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn 145 150 155 160 Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met 165 170 175 Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu 180 185 190 Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala 195 200 205 Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr 210 215 220 Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser 225 230 235 240 Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser 245 250 255 Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg 260 265 270 Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu 275 280 285 Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile 290 295 300 Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys 305 310 315 320 Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr 325 330 335 Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala 340 345 350 Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys Gly Ser Glu Phe Cys Arg Lys Asp Lys 355 360 365 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 23 Gly Ser Glu Phe 1 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 24 Gly Ser Glu Phe Cys 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 25 Arg Pro Ala Arg Pro Ala Arg 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 26 Arg Pro Ala Arg Pro Ala Arg Ala 1 5

Claims (13)

  1. 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa)의 치료에 사용하기 위한 귀소 펩티드 유도 데코린 접합체(homing peptide-guided decorin conjugate)로서,
    상기 접합체는 데코린 세그먼트 및 귀소 펩티드를 포함하고,
    상기 귀소 펩티드의 C-말단은 아미노산 서열 RKDK (서열번호 1) 또는 CRKDK (서열번호 2)로 구성되는, 접합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 접합체는 피부 및 피부 상처로 선택적으로 귀환하는, 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    데코린 세그먼트는 귀소 펩티드의 N-말단에 부착되는, 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    데코린 세그먼트는 서열번호 6-20 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 데코린의 생물학적 특성이 유지된다면, 상기 데코린 세그먼트의 보존적 서열 변이체 또는 펩티드모사체(peptidomimetic)인, 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 융합 단백질 또는 이의 펩티드모사체인, 접합체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열번호 21 또는 22를 포함하거나 이로 이루어진 것인, 접합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 접합체에 부착된 하나 이상의 추가 모이어티를 추가로 포함하는, 접합체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 하나 이상의 추가 모이어티는 치료제를 포함하는, 접합체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 치료제는 항염증제(anti-inflammatory agent), 항혈관신생제(anti-angiogenic agent), 재생제(regenerative agent), 혈관신생유도제(pro-angiogenic agent), 세포독성제(cytotoxic agent), 세포자멸유도제(pro-apoptotic agent), 항미생물제(antimicrobial agent), 항섬유제(anti-fibrotic agent), 주름방지제(anti-wrinkle agent), 가려움 방지제(anti-itch agent), 전달방지제(anti-transmitter agent), 전달유도제(pro-transmitter agent), 사이토카인(cytokine), 또는 사이토카인 억제제(cytokine inhibitor)인, 접합체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 치료제는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 소분자인, 접합체.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 하나 이상의 추가 모이어티는 검출가능한 제제를 포함하는, 접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 접합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물 중에 제공되는 것인, 접합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    수포성 표피박리증은 후천성 수포성 표피박리증(acquired epidermolysis bullosa), 접합 수포성 표피박리증(junctional epidermolysis bullosa), 단순 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa simplex), 이영양성 수포성 표피박리증(dystrophic epidermolysis bullosa), 우성 이영양성 수포성 표피박리증(dominant dystrophic epidermolysis bullosa), 열성 이영양성 수포성 표피박리증(recessive dystrophic epidermolysis bullosa), 역성 열성 이영양성 수포성 표피박리증(recessive dystrophic epidermolysis bullosa inversa), 킨들러(Kindler) 증후군 또는 그의 임의의 하위유형인, 접합체.
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