JP7269649B2 - Ｋｉｆ１３ｂ由来ペプチドおよび血管新生阻害方法 - Google Patents

Description

本発明は、キネシン由来血管新生阻害剤ペプチドおよび１以上の担体部分および／または安定化部分から構成される構造物に関し、さらに、それによって血管新生を阻害し、過剰な血管分布を特徴とする疾患または病気を処置するための方法に関する。
導入
本出願は、米国仮特許出願番号６２／３８３，０７０、２０１６年９月２日出願および６２／５１０，５３６、２０１７年５月２４日出願に対する優先権の利益を主張し、その内容はそれらの全部を参照によって本明細書に組み込まれる。

本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＨＬ０６０６７８、Ｒ０１ ＨＬ０４５６３８、Ｐ０１ ＨＬ０７７８０６、Ｒ０１ ＨＬ０９０１５２、Ｒ０１ ＨＬ１１８０６８およびＲ０１ ＨＬ１２５３５０の下での政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、新しい血管の形成に続いて栄養血液供給を増加させることによってがんの転移および増殖において重要な役割を果たす。ＶＥＧＦは、内皮細胞（ＥＣ）表面局在化高親和性チロシンキナーゼ受容体ＶＥＧＦＲ２（別名、Ｆｌｋ－１）の活性化を介してシグナル伝達する。血管の成長および維持が不十分であると、心筋梗塞、脳卒中、ならびに神経変性および肥満に関連した障害において虚血が引き起こされるのに対して、過剰な血管成長は、がんの転移および成長、炎症性障害、ならびに糖尿病および黄斑変性に関連する網膜血管疾患に不可欠である。したがって、血管新生はこれらの疾患に対する重要な治療標的である。抗ＶＥＧＦ抗体およびキナーゼ阻害剤は、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達およびＥＣ移動を妨げる。ＶＥＧＦ遮断はまた、がん患者における単独療法または併用療法における生存を延長する。しかしながら、反応はさまざまであり、一部の患者は難治性であるか、または耐性を早晩獲得する。

ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ^１６５の結合は、ＶＥＧＦＲ２のホモ二量体化、自己リン酸化、およびＶＥＧＦＲ２の内在化を誘発する。内在化ＶＥＧＦＲ２は、リソソーム中でユビキチン化および分解される。ＶＥＧＦは、受容体を連結することに加えて、ゴルジ（Ｇｏｌｇｉ）装置から原形質膜への新たに合成されたＶＥＧＦＲ２の分極輸送をシグナル伝達して、次のラウンドのＶＥＧＦ結合および受容体活性化サイクルのために細胞表面受容体プールを連続的に回復させる。これは、ＶＥＧＦＲ２輸送の阻害が、マウスの耳におけるＶＥＧＦ媒介新血管形成およびインビボでのＭＡＴＲＩＧＥＬプラグにおける血管形成を妨げるという知見によって明らかである。ＥＣ表面へのＶＥＧＦＲ２の輸送の要件は、血管が外向きに成長するにつれて糸状仮足を形成し、一方で先端細胞のすぐ下の柄付きＥＣがＶＥＧＦに応答して増加した増殖を受ける外向き出芽先端ＥＣにおいて特に重要である。したがって、先端細胞におけるＶＥＧＦＲ２局在化は、新たに形成される血管におけるＥＣの指向性移動に不可欠である。これに関して、ＫＩＦ１３Ｂ（キネシンファミリーメンバー１３Ｂ）は、ＶＥＧＦに応答して微小管に沿ってＶＥＧＦＲ２を一方向に輸送することが示されている（Yamada, et al. (2014) J. Cell Sci. 127:4518-30）。さらに、ＫＩＦ１３Ｂの枯渇によるＶＥＧＦＲ２輸送の阻害は、ＥＣ移動および出芽血管新生を無効にする。しかしながら、ＥＣの生存および増殖は影響されない（Yamada, et al. (2014) J. Cell Sci. 127:4518-30）。ＫＩＦ１３Ｂの尾部はカーゴ結合のための複数のドメインを有する。ＶＥＧＦＲ２の他に、ＫＩＦ１３ＢはＰＩＰ３などの極性決定因子を輸送する。これらのカーゴは、Ｃｅｎｔａｕｒｉｎ-αなどの架橋タンパク質によってしばしばＫＩＦ１３Ｂの異なる領域に結合する。

内皮内の血液網膜関門の喪失ならびにその結果生じる黄斑浮腫および損傷は、高齢者における眼障害および失明の主な原因である。現在のところ、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）としても知られているこれらの病気は不治である。さらに、ＡＭＤの新生血管形態は、脈絡膜からの血管の成長を特徴とし、それはブルッフ（Ｂｒｕｃｈ）膜を通って網膜下領域へと浸透する。血管新生ＡＭＤの一般的な根底にある原因をとらえるためのいくつかの効果的な治療法は、脈絡膜に生じる新しい血管を破壊することによって視力喪失を妨げることを目的として制限されている。コルチコステロイドおよび抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射による現在の処置は、眼疾患の進行を遅らせるのに有効であるが、それらは失明の危険性を完全に排除するものではない。したがって、眼の障害を処置し視力喪失を予防するための新規でより強力な療法または併用療法のアプローチが必要とされている。

本発明は、（ａ）１つ以上の担体部分、（ｂ）１つ以上の安定化部分、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の組合せに作動可能に連結されているアミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｘａａ_３－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｘａａ_４－Ｘａａ_５－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｘａａ_６－Ａｒｇ－Ｘａａ_７－Ｘａａ_８－Ｖａｌ－Ｘａａ_９（配列番号１）を有する１６～６５個のアミノ酸ペプチドからなるコンストラクト、ここで、Ｘａａ_１はＰｒｏ、ＡｌａまたはＧｌｕ、Ｘａａ_２はＶａｌ、ＡｌａまたはＳｅｒ、Ｘａａ_３はＡｓｐまたはＡｓｎ、Ｘａａ_４はＬｅｕまたはＶａｌ、Ｘａａ_５はＰｈｅまたはＴｙｒ、Ｘａａ_６はＬｅｕまたはＶａｌ、Ｘａａ_７はＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ、Ｘａａ_８はＴｈｒまたはＡｌａ、ならびにＸａａ_９はＧｌｎまたはＡｒｇである、を提供する。いくつかの態様において、１つ以上の担体部分は、細胞透過性ペプチド（例えば、配列番号４～６０のペプチド）、脂質、ビタミンＢ_１２、またはそれらの組み合わせを含む。他の態様において、１つ以上の安定化部分は、ペプチド、翻訳後修飾（例えば、Ｎ末端アセチル化および／またはＣ末端アミド化）、非天然アミノ酸残基（例えば、Ｄアミノ酸残基）、巨大分子（例えば、ポリエチレングリコール、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン、アルブミンまたは免疫グロブリン断片）またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、コンストラクトはアミノ酸配列ＴＰＶＤＥＲＬＦＬＩＶＲＶＴＶＱ（配列番号３）を含む。例示的なコンストラクトは、ＳＲＧＴＰＶＤＥＲＬＦＬＩＶＲＶＴＶＱＬＳＨＰ－ＮＨ_２（配列番号１１３）である。ペプチドを含有する医薬組成物、および過剰な血管分布（例えば、炎症性疾患、がん、または網膜血管症）を特徴とする対象における血管新生を阻害し、疾患または病気を処置するための方法も提供される。

図１は、使用されたＫＩＦ１３Ｂのドメインおよび切断されたドメインの概略図を示す。機能未知ドメイン（ＤＵＦ）Ｃ１［１２０２－１２４０アミノ酸（ａａ）］、Ｃ２（１２２１－１２６０ａａ）、Ｃ３（１２４１－１２８１ａａ）、Ｃ４（１２２６－１２５１ａａ）、Ｃ５（１２３８－１２６０ａａ）、Ｃ６（１２３８－１２５４ａａ）、Ｃ７（１２６１－１２８１ａａ）、Ｃ８（１２５１－１２６８ａａ）、およびＣ９（１２３５－１２５２ａａ）を遺伝子組み換えタンパク質として細菌内で発現させ、プルダウンアッセイによって血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）への結合について試験した。Ｏ、Ｘ、および三角はそれぞれ、結合、非結合、および部分的または不安定な結合を示す。結合領域は破線ボックスとして示されている。

図２は、ＫＩＦ１３Ｂ由来のペプチドが血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）誘発性血管新生を阻害することを示す。ＭＡＴＲＩＧＥＬプラグのヘマトキシリンおよびエオシン染色に、４．４ｎｍｏｌ／ＬのＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子、６０Ｕのヘパリン、および０．８×１０８ＩＦＵのレンチウイルス（ベクター対照、ＤＵＦ２、またはＤＵＦ２Ｃ５、またはＣ_Ｔ）を補い、Ｃ５７ＢＬ６マウスに皮下注射した。データは平均値±ＳＥＭとして表されている。ベクトル制御、ＤＵＦ２、ＤＵＦ２Ｃ５、Ｃ_Ｔに対してそれぞれＮ＝４、４、５および５であった。*Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析）。Ｃ_Ｔは、ＫＩＦ１３Ｂの残基１５２８～１８２６であった。

図３は、ＤＵＦ２Ｃ５が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）誘発内皮細胞（ＥＣ）移動を阻害することを示す。ＤＵＦ２Ｃ５の阻害効果の特異性は、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ移動アッセイにおいて異なる刺激によって誘発されたＥＣ移動によって決定された。２．２ｎｍｏｌ／ＬのＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、または１μｍｏｌ／Ｌのスフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）に向かって移動したＨＵＶＥＣをヘマトキシリン染色によって可視化し、移動細胞の数をカウントした。データは平均値±ＳＥＭとして表す。Ｎ＝３。*Ｐ＜０．０５（一元配置分散分析およびボンフェリーニ多重比較試験）。

図４Ａおよび図４Ｂは、ＤＵＦ２Ｃ５がインビボで血管新生および腫瘍増殖を阻害することを示す。図４Ａは、重度の複合免疫不全症を伴うマウスにおけるヒト肺癌Ｈ４６０異種移植片の研究である。マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＤＵＦ２Ｃ５（Ｃ末端アミド化を伴う）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、尾静脈経由で、１週間に３回静脈内処置し、腫瘍の大きさがグラフに表示される。図４Ｂは、ＰＢＳ処置対照およびペプチド処置腫瘍における腫瘍内の血管数を示す。データは平均値±ＳＥＭとして表される。各群においてＮ＝８。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１（ｔ試験）

図５Ａおよび図５Ｂは、レーザー誘発ＣＮＶに対するＤＵＦ２Ｃ５処置の効果を示す。図５Ａは、ＤＵＦ２Ｃ５の投与量依存的効果が、レーザー光凝固術後の０．５μｇ、２μｇ、および１０μｇのＤＵＦ２Ｃ５の硝子体内注射によって試験された。血管新生をＩＬＢ４染色の面積によって評価し、グラフにプロットした（各群においてＮ＝５マウス、および各マウスにおいて４回のレーザー熱傷が誘発された）。アスタリスクは、ｐ＜０．０５、一元配置分散分析を示す。図５Ｂにおいて、点眼剤としてのＤＵＦ２Ｃ５の効果がＣＮＶモデルにおいて試験された。レーザー光凝固術後、マウスが２週間、対照ペプチド（２μｇ／片目）またはＤＵＦ２Ｃ５（２μｇ／片目）のいずれかで毎日処置された。血管新生をＩＬＢ４染色面積によって評価し、グラフにプロットした（各群においてＮ＝７マウス、および各マウスにおいて４回のレーザーによる熱傷が誘発された）。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す、ｔ試験。

内皮細胞膜へのＶＥＧＦＲ２の送達は血管新生の重要な決定因子である。ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達の有効性は内皮細胞の表面におけるその局在化に依存する。これは、ゴルジ体からＶＥＧＦＲ２の細胞表面プールへのＶＥＧＦＲ２の連続的な循環が存在する出芽先端細胞において明らかである。細胞表面へのＶＥＧＦＲ２の輸送は、したがって、ＶＥＧＦによる各回のライゲーションにとって必要である。分子モーターキネシンＫＩＦ１３ＢはＶＥＧＦＲ２を細胞表面に輸送することが示されている（Yamada, et al. (2014) J. Cell Sci. 127:4518-30）。キネシン由来血管新生阻害剤（ＫＡＩ）ペプチド（例中ではＤＵＦ２Ｃ５と命名されている）が今や見出されており、これは欠陥のある血管新生をドミナントネガティブに阻害する。ＫＡＩは、ＳＩＰまたはｂＦＧＦによって誘発される内皮細胞移動に影響を及ぼさなかったので、ＫＡＩペプチドは、ＶＥＧＦＲ２の細胞表面への輸送、すなわちＶＥＧＦ誘発内皮細胞の出芽に特異的な特徴を防止する。さらに、ＫＡＩペプチドは、インビトロでのＶＥＧＦ誘発性の毛細血管網形成およびインビボでの新血管新生を阻害する。有利なことには、ＫＡＩペプチドは、そのアミノ酸組成に基づいてカチオン性であり、水溶性（＞１０ｍｇ／ｍＬ）であり、およびそのカチオン性のために細胞透過性である。さらに、ＫＡＩペプチドはそれ自体は内皮細胞に対して毒性ではなく、ペプチドで静脈内処置されたマウスは望まない効果を経験していない。

したがって、本発明は、ＫＡＩペプチドを含有するペプチドコンストラクト、およびがんおよび糖尿病性網膜症などの血管新生関連疾患の処置のためのこのコンストラクトの使用方法を提供する。本発明の目的のために、用語「コンストラクト」は、本明細書中では、組換え、化学的および／または酵素的技術によって、ペプチドの吸収、安定性および／または溶解性を増強する１以上の部分を含むように修飾されたＫＡＩペプチドを指すために使用される。特に、１つ以上の部分のうちの少なくとも１つは、ＫＡＩペプチドと自然に会合されていない。理想的には、本発明のコンストラクトは、１、２、３、４またはそれ以上の担体部分に作動可能に連結された配列番号１のアミノ酸配列を有するＫＡＩペプチドである。あるいは、本発明のコンストラクトは、１、２、３、４またはそれ以上の安定化部分に作動可能に連結された配列番号１のアミノ酸配列を有するＫＡＩペプチドである。さらに、本発明のコンストラクトは、１つ以上の担体部分および１つ以上の安定化部分に作動可能に連結された配列番号１のアミノ酸配列を有するＫＡＩペプチドである。いくつかの態様において、単一の修飾（例えば、Ｎ－アセチル化）は、担体部分および安定化部分の両方として機能し得る。

本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって一緒に連結された２つ以上のアミノ酸の配列を広く言う。この用語は特定の長さのアミノ酸ポリマーを意味するものではなく、ペプチドが遺伝子組換え技術、化学的または酵素的合成を用いて製造されるのか、または天然に発生するのかを暗示または区別することも意図されていないと理解すべきである。本発明のコンストラクトのＫＡＩペプチドは少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５～６５個のアミノ酸残基から構成され、その中に誘導可能な全ての範囲を含む。ＶＥＧＦＲ２受容体への結合が保持されているという条件で、６～１６個のアミノ酸残基の範囲のより短いペプチドもまた考慮される。理想的には、ＫＡＩペプチドは、ＶＥＧＦＲ２輸送のための最小結合部位を提供し、他の受容体チロシンキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＥＧＦＲ）に対して有意な親和性を示さない。特に、ＫＡＩペプチドは、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｘａａ_３－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｘａａ_４－Ｘａａ_５－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｘａａ_６－Ａｒｇ－Ｘａａ_７－Ｘａａ_８－Ｖａｌ－Ｘａａ_９（配列番号１）を含むかまたはそれからなり、ここで、Ｘａａ_１はＰｒｏ、ＡｌａまたはＧｌｕ、Ｘａａ_２はＶａｌ、ＡｌａまたはＳｅｒ、Ｘａａ_３はＡｓｐまたはＡｓｎ、Ｘａａ_４はＬｅｕまたはＶａｌ、Ｘａａ_５はＰｈｅまたはＴｙｒ、Ｘａａ_６はＬｅｕまたはＶａｌ、Ｘａａ_７はＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ、Ｘａａ_８はＴｈｒまたはＡｌａ、ならびにＸａａ_９はＧｌｎまたはＡｒｇである。より好ましくは、ＫＡＩペプチドは、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ_１－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｘａａ_２－Ｘａａ_３－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｘａａ_４－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｘａａ_５－Ｖａｌ－Ｘａａ_６（配列番号２）を含むかまたはそれからなり、ここで、Ｘａａ_１は、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＳｅｒ、Ｘａａ_２はＬｅｕまたはＶａｌ、Ｘａａ_３はＰｈｅまたはＴｙｒ、Ｘａａ_４はＬｅｕまたはＶａｌ、Ｘａａ_５はＴｈｒまたはＡｌａ、Ｘａａ_６は、ＧｌｎまたはＡｒｇである。本発明の例示的なＫＡＩペプチドは、本明細書に配列番号３および配列番号８０～９３に規定されている（表４参照）。最も好ましくは、ＫＡＩペプチドは、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ（本明細書においてもＴＰＶＤＥＲＬＦＬＩＶＲＶＴＶＱ（配列番号３）として従来の一文字略語を使用して言及される）を含むかまたはそれからなる。

本明細書中で使用される場合、「担体部分」とは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜を通過するのを容易にするポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機分子をいう。別の分子に結合された担体部分は、例えば細胞外空間から細胞内空間へ、またはオルガネラ内への細胞質ゾルへと移動する分子が膜を通過するのを容易にする。場合によっては、担体部分は血液脳関門を通過するのを容易にする。いくつかの態様において、担体部分はＫＡＩペプチドのアミノ末端に共有結合している。他の態様において、担体部分はＫＡＩペプチドのカルボキシル末端に共有結合している。理想的には、担体部分は細胞透過性ペプチド、脂質、ビタミンＢ_１２、またはそれらの組み合わせである。

ペプチド伝達ドメイン（ＰＴＤ）としても知られる細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、細胞膜を通過することが報告されている多様なクラスのペプチドである。転写のトランス活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドおよびペネトラチンなどのこのファミリーの代表的なメンバーは、当初、膜透過性が提案されている自然に発生するタンパク質内のセグメントとして同定された。場合によっては、担体部分は、ＫＡＩペプチドに共有結合または融合している細胞透過性ペプチドである。いくつかの態様において、共有結合はペプチド結合である。例えば、細胞透過性ペプチドは、約５から約５０個のアミノ酸、例えば約５から約１０個のアミノ酸、約１０から約１５個のアミノ酸、約１５から約２０個のアミノ酸、約２０から約２５個のアミノ酸、約２５から約３０個のアミノ酸、約３０から約４０個のアミノ酸、または約４０から約５０個のアミノ酸の長さを有するペプチドであり得る。

細胞透過性ペプチドは当技術分野において周知であり、例えば、Bechara & Sagan (2013) FEBS Lett. 587:1693-1702; Copolovici, et al. (2014) ACS Nano 8(3):1972-94; and Guidotti, et al. (2017) Trends Pharmacol. Sci. 38(4):406-24に記載されている。本発明において使用される例示的な細胞透過性ペプチドとしては、表１に列挙されるペプチドを含むが、これらに限定されない。

例６に記載されているように、ＤＵＦ２Ｃ５ペプチド自体が細胞膜を通過することができる。ＤＵＦ２Ｃ５ペプチドの増強された細胞浸透は、３つのＮ末端アミノ酸残基、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ（配列番号５８）に起因していた。したがって、場合によっては、細胞透過性ペプチドは、天然のＫＩＦ１３Ｂタンパク質配列に由来する。ＫＩＦ１３Ｂ配列由来の細胞透過性ペプチドは、好ましくはアミノ酸配列Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｘａａ_３（配列番号５９）を有し、ここでＸａａ_１はＳｅｒまたはＡｓｎであり、Ｘａａ_２はＬｙｓまたはＡｒｇであり、Ｘａａ_３はＧｌｙまたはＶａｌである。より好ましくは、細胞透過性ペプチドは、アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ｘａａ_１－Ｇｌｙ（配列番号６０）を有し、ここでＸａａ_１はＬｙｓまたはＡｒｇである。最も好ましくは、細胞透過性ペプチドは、アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ（配列番号５８）を有する。

代わりに、またはそれに加えて、ＫＡＩペプチドは細胞浸透を促進するために脂質を包含し得る。本明細書で使用されるように、脂質は一般に有機溶媒に可溶な水不溶性分子を言う。いくつかの態様において、脂質は脂肪酸であり、これはアシル基を有する脂肪族炭化水素鎖を包含し、ここで脂肪族鎖は飽和または１つ以上の二重結合を有する不飽和アルキルのいずれかである。典型的な脂肪酸としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸を含むが、これらに限定されない。脂肪酸は、グリセロール、スフィンゴシン、コレステロールなどのアシル基担体に連結しているかまたは連結し得る。

脂質はまた、それらの極性に基づいて異なる脂質クラスに分類され得る。脂質は、非極性または極性脂質であり得る。かかる非極性脂質の例は、モノ、ジまたはトリアシルグリセロール（グリセリド）、脂肪酸のアルキルエステル、および脂肪族アルコールである。極性脂質は、脂肪族アミン、ホスファチジン酸（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンなど）、リン脂質、糖脂質グリコシルホスファチジルイノシトールなどの極性頭基を有し、表面活性を示す。特定の形態において、脂質は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、タンパク質、または糖類に結合または連結している。ＫＡＩペプチドに結合させることができる例示的な脂質には、Ｎ－ミリストイル、パルミトイル、およびグリコホスファチジルイノシトールを含む（例えば、Thompson & Okuyama (2000) Prog. Lipid Res. 39:19-39; Bauman & Menon (2002) In, 脂質、リポタンパク質および膜の生化学、第４版、pp. 37-54, Nance & Vance Ed., Elsevier, Amsterdam参照）。好ましくは、ＫＡＩペプチドは、Ｎ末端アミノ酸残基においてミリスチル化、ステアリル化またはパルミトイル化されている。より好ましくは、ＫＡＩペプチドはＮ末端アミノ酸残基においてミリスチル化されている。

本明細書中で使用されるように、脂質はまた、ステロイド、Ｃ－１０、Ｃ－１３およびＣ－１７炭素原子に置換基を有する水素化１，２シクロペンテノフェナントレンに基づく四環式化合物であり得る。典型的なステロイドとしては、コール酸、デスオキシコール酸、ケノデスオキシコール酸、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、アンドロステロン、ノルエチンドロン、コレステロール、ジゴキシンなどを含むが、これらに限定されない。本明細書に記載のステロイドまたはステロールは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、タンパク質、糖類、オリゴ糖類、多糖類、および他の脂質に結合またはそれらで修飾されることができる。

さらに、脂質は、イソプレン単位Ｃ_５Ｈ_８からなるイソプレノイドも包含し得る。イソプレノイドには、さまざまな天然に存在するテルペンおよび合成テルペンが包含され、それらは線状、またはより典型的には二環式、三環式および多環式を含む環式のいずれでもよい。例示的なイソプレノイドとしては、例として、ゲラニオール、シトロネラル、ジンギベレン、β－サンタノール、β－カジエン、マトリカリン、コパエン、カンフェン、タキソール、カロテノイド、ステロイドなどを含む。イソプレノイドは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、タンパク質、糖類、オリゴ糖類、および多糖類を含むがこれらに限定されない他の分子に結合されていてもよい。例として、プレニル化ペプチドは、ＫＡＩペプチドのカルボキシル末端またはその近傍のシステインチオエーテル結合を介して、イソプレノイド脂質単位、ファルネシル（Ｃ_１５）またはゲラニルゲラニル（Ｃ_２０）を結合させることによって調製することができる。可逆的水性脂質化技術（ＲＥＡＬ）の使用もまた企図される。Mahajan, et al. (2014) Indian J. Pharmaceut. Ed. Res. 48:34-47を参照されたい。

特定の摂取機構は、食物分子の摂取のために消化管に存在する。ビタミンＢ_１２の場合、特異的結合タンパク質が腸の内腔でそのリガンドに結合する腸に放出される。哺乳動物は、内因性因子として知られる天然に存在する輸送タンパク質との複合体形成に依存する比較的大きなビタミンＢ_１２分子の吸収および細胞取り込みのための輸送機構を有する。この輸送機構を利用して、ビタミンＢ_１２は、酸加水分解プロピオンアミド側鎖のカルボキシル基を介して黄体形成ホルモン放出ホルモンのＤ－Ｌｙｓ－６類似体に結合され、黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体を血液中に送達することが示された（米国特許第５，４２８，０２３号および米国特許第５，８０７，８３２号参照）。同様に、米国特許第５，５７４，０１８号は、ビタミンＢ_１２のリボース部分の第一級ヒドロキシル部位での共有結合により、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子およびコンセンサスインターフェロンに接合されたビタミンＢ_１２を教示している。さらに、米国特許公開２０１１／００９２４１６は、ビタミンＢ_１２をインスリン、ペプチド チロシン－チロシン（ＰＹＹ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）およびグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）のような治療的に活性なポリペプチドに結合することを教示しており、ここで、ポリペプチドはビタミンＢ_１２のリボース部分の第一級（５’）ヒドロキシル基のジカルボン酸誘導体に共有結合している。さらに、ＷＯ２０１６／１８７５１２は、ＧＬＰ－１の１２位でのビタミンＢ_１２のアジドリシンへの接合およびそれに続く内因性因子との複合体形成が、このペプチドをプロテアーゼ分解から保護することを教示している。したがって、特定の態様において、ＫＡＩペプチドはビタミンＢ_１２に接合されている。

あるいは、ＫＡＩペプチドは、細胞取り込みを容易にするための他の修飾を包含し得る。例えば、所与のペプチドを環化することおよび／または選択アミド結合窒素をメチル化することは、その膜透過性および／または生物学的利用能を改善し得る。かかる修飾は、賢明に行われると、膜内部の低誘電環境に応答して分子内水素結合の形成を促進すると考えられている（Bockus, et al. (2013) Curr. Top. Med. Chem. 13:821-836; Rezai, et al. (2006) J. Am. Chem. Soc. 128:14073-14080; White, et al. (2011) Nat. Chem. Biol. 7:810-817）。透過性に加えて、環化は安定性を高めることができる。実際、ＤＵＦ２Ｃ５の環状型は安定であり、ＶＥＧＦＲ２に結合することが見出されたが、一方で対照環状ペプチドは結合しなかった。したがって、特定の態様において、本発明のＫＡＩペプチドは環化されている。ＫＡＩペプチドは、環化した頭－尾、頭／尾－側鎖、または側鎖－側鎖であり得る。環化は一般にラクタム化、ラクトン化、およびスルフィド系架橋を介して達成される。

シリカ、カーボンナノチューブ、量子ドット、および金ナノ粒子を含むタンパク質カーゴを移動させるためのさまざまな無機材料も提案されている（Du, et al. (2012) Curr. Drug Metab. 13:82-92; Malmsten (2013) Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 18:468-480）。さらに、Ｎ－メチル化は水素結合能を低下させるために使用することができる。

本明細書中で使用される場合、「安定化部分」とは、タンパク質分解を減少させ、腎クリアランスを減少させ、経口生物学的利用能を増加させ、ＶＥＧＦＲ２への結合を増加させ、および／またはＫＡＩペプチドの半減期を延長するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機分子をいう。いくつかの態様において、安定化部分は、ＫＡＩペプチドのアミノ末端に共有結合している。他の態様において、安定化部分は、ＫＡＩペプチドのカルボキシル末端に共有結合している。理想的には、安定化部分は、ペプチド、翻訳後修飾、非天然アミノ酸残基、巨大分子またはそれらの組み合わせである。

いくつかの態様において、安定化部分は、天然のＫＩＦ１３Ｂタンパク質配列に由来するペプチドであり得る。ＫＩＦ１３Ｂ配列に由来する安定化部分は、好ましくは例えば、アミノ酸配列Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ（配列番号６１）またはＬｅｕ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ａｓｐ（配列番号６２）を有する。

血液／血漿、肝臓または腎臓中の多くのタンパク質分解酵素は、Ｎ末端および／またはＣ末端からペプチド配列を分解する。Ｎ末端または／およびＣ末端の翻訳後修飾は、ペプチドの安定性をしばしば向上し得る。例えば、Ｎ－アセチル化およびＣ－アミド化はタンパク質分解に対する耐性を増大させることができる。例えば、Ｎ末端アセチル化ソマトスタチン類似体は、天然ペプチドよりもはるかに安定であると報告されている（Adessi & Soto (2002) Curr. Med. Chem. 9(9):963-78）。同様に、Ｎ－アセチル化７－３４型のＧＬＰ－１は、保護されていないペプチドよりもはるかに安定であることが示されていた（John, et al. (2008) Eur. J. Med. Res. 13(2):73-8）。さらに、アミノ酸置換と組み合わせて適用すると、Ｎ－アセチル化およびＣ－アミド化はＥＦＫ１７ペプチドのエンドペプチダーゼ消化に対する耐性を向上する（Stroemstedt, et al. (2009) Antimicrob. Agents Chemother. 53(2):593-602）。さらに、Ｎ末端チロシン残基に結合したヘキセノイル基を有するテサモレリンは、天然の成長ホルモン放出ホルモンよりもはるかに長い半減期を有する（Ferdinandi, et al. (2007) Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 100(1):49-58）。ある態様において、ＫＡＩペプチドは、安定化部分としてＮ－アセチル化および／またはＣ－アミド化を含む。

天然アミノ酸残基を非天然残基で置換すると、タンパク質分解酵素の基質認識および結合親和性が低下し、安定性が増加し得る。例えば、バソプレシンのＬ－ＡｒｇをＤ－Ａｒｇの例と置き換えると、このペプチドの半減期は、ヒトにおける１０～３５分から健康なヒトの有志における３．７時間に増加した（Agerso et al. (2004) Br. J. Clin. Pharmacol. 58(4):352-8）。同様に、Ｌ－アミノ酸をＤ－アミノ酸で置換すると、ソマトスタチンのインビボ半減期が数分から１．５時間に向上する（Harris (1994) Gut 35(3):S1-4）。天然アミノ酸の修飾はまた立体障害を導入することによりペプチドの安定性を向上することができる。例えば、性腺刺激ホルモン放出ホルモンは非常に短い半減期（分）を有するが、一方のＧｌｙはｔ－ブチル－ｄ－Ｓｅｒに置換され、もう一方のＧｌｙはエチルアミドに置換されるブセレリンははるかに長いヒトの半減期を有する。ペンタペプチドであるイパモレリンは、Ｄ配置に２’－ナフチルアラニンおよびフェニルアラニンを有し、Ｃ－末端のＬ－アラニンが２－アミノイソ酪酸で置換されているため、ヒトにおいて約２時間の末端半減期に改善される（Raun, et al. (1998) Eur. J. Endocrinol. 139(5):552-61; Gobburu, et al. (1999) Pharm. Res. 16(9):1412-6）。

巨大分子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはアルブミン）への接合化は、ペプチドの安定性を向上し、腎臓クリアランスを減少させるための有効な戦略である。例えば、アルブミン結合小分子をペプチドに共有結合させることは、糸球体濾過を低減し、タンパク質分解安定性を改善し、そして高度に結合した小分子を介してアルブミンと間接的に相互作用することにより半減期を延長し得る。リラグルチドは、γ－１－グルタミルスペーサーを介して１６－炭素脂肪酸残基に連結しているＧＬＰ－１類似体である。リポペプチドはアルブミンに結合し、それによってタンパク質分解および腎臓クリアランスを減少させ、半減期を数分から８時間までに増加させる（Hou, et al. (2012) J. Cereb. Blood Flow Metab. 32(12):2201-10; Levy Odile, et al. (2014) PLoS One 9(2):e87704; Lindgren, et al. (2014) Biopolymers 102(3):252-9）。

大きな合成または天然のポリマーまたは炭水化物へのペプチドの接合は、それらの分子量および流体力学的容量を増大させることができ、したがってそれらの腎クリアランスを減少させる。ペプチド接合に使用される一般的なポリマーは、ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。一例は、ペジネサチド、すなわち健康な有志において１８．９時間の排出半減期を有するＰＥＧ化合成ペプチドである（Bronson, et al. (2013) Annu. Rep. Med. Chem. 48:471-546）。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、一般式Ｈ－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－ＯＨのポリエーテル化合物である。ＰＥＧは、それらの分子量に応じて、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られており、ＰＥＯ、ＰＥＥ、またはＰＯＧは、本明細書で使用される場合、エチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーをいう。３つの名称は化学的に同義であるが、ＰＥＧは２０，０００Ｄａ未満の分子量を持つオリゴマーとポリマー、ＰＥＯは２０，０００Ｄａを超える分子量を持つポリマー、ＰＯＥは任意の分子量のポリマーをいう傾向がある。ポリマー部分は、好ましくは水溶性（両親媒性または親水性）、無毒性、および薬学的に不活性である。安定化部分として使用するのに適したポリマー分子には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧのホモポリマーまたはコポリマー、ＰＥＧのモノメチル置換ポリマー（ｍＰＥＧ）、またはポリオキシエチレングリセロール（ＰＯＧ）を含む。半減期延長を目的として調製されるＰＥＧ、例えば、モノメトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）などのモノ活性化アルコキシ末端ポリアルキレンオキシド（ＰＯＡ）も含まれる。ビス活性化ポリエチレンオキシド（グリコール）または他のＰＥＧ誘導体もまた企図される。適切なポリマーは、約２００Ｄａから約４０，０００Ｄａまで、または約２００Ｄａから約６０，０００Ｄａまでの範囲の重量によって実質的に変化し、本発明の目的のために通常選択される。特定の態様では、２００～２，０００または２００～５００の分子量を有するＰＥＧが使用される。

ＰＥＧは、異なる幾何学的形状でも利用可能である。分枝状ＰＥＧは、中心コア基から発する３～１０本のＰＥＧ鎖を有する。星形ＰＥＧは、中心コア基から発する１０～１００個のＰＥＧ鎖を有する。くし型ＰＥＧは、通常ポリマー骨格にグラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。ＰＥＧもまた直鎖状であり得る。ＰＥＧの名前にしばしば含まれる数字はそれらの平均分子量を示す（例えば、ｎ＝９のＰＥＧは約４００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ４００と表示されるであろう）。本明細書中で使用される場合、「ＰＥＧ化」は、ＰＥＧ構造を本発明のＫＡＩペプチドに共有結合させる行為であり、これは、その後、「ＰＥＧ化ＫＡＩペプチド」という。特定の態様において、ＰＥＧ化側鎖のＰＥＧは、約２００から約４０，０００の分子量を有するＰＥＧである。

アルブミンや免疫グロブリン（ＩｇＧ）断片などの血漿タンパク質は、ヒトでは１９～２１日という長い半減期を有する（Pollaro & Heinis (2010) Med. Chem. Comm. 1(5):319-24）。高いＭＷ（６７～１５０ｋＤａ）のため、これらのタンパク質は腎クリアランスが低く、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）と結合すると血管上皮による飲作用による排泄が減少する。アルブミンまたはＩｇＧ断片へのＫＡＩペプチドの共有結合は、腎臓クリアランスを減少させ、半減期を延長することができる。例として、アルブミン－エキセンディン－４－接合（ＣＪＣ－１１３４－ＰＣ）は、ヒトにおいて約８日の半減期を有し、ＦＤＡ承認薬であるアルビグルチドは、ヒトアルブミンと融合したＤＰＰＩＶ耐性ＧＬＰ－１二量体であり、これは、６～７日の半減期を有し、それによって２型糖尿病患者の処置のための毎週の投薬を可能にする（Pratley, et al. (2014) Lancet Diabetes Endocrinol. 2(4):289-97）。

担体部分および／または安定化部分がペプチドである場合、前記ペプチドはペプチド結合を介してＫＡＩペプチドに直接容易に結合または接合することができる。しかしながら、担体部分および／または安定化部分がペプチドではない場合、前記担体部分および／または安定化部分は、ジスルフィド、アミド、オキシム、チアゾリジン、尿素およびカルボニル結合、またはDiels-AlderまたはHuisgen１，３－双極子環化付加反応などの他の従来の結合によってＫＡＩペプチドに結合され得る（Lu, et al. (2010) Bioconjug. Chem. 21:187-202; Roberts, et al. (2002) Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-76; WO 2008/101017）。

あるいは、本発明のコンストラクトは、担体部分および／または安定化部分をＫＡＩペプチドに結合または連結するためのリンカーを含み得る。本発明の目的のために、リンカーは任意のさまざまなアミノ酸配列を有するペプチドである。スペーサーペプチドであるリンカーは、他の化学結合は排除されないが、柔軟な性質のものであり得る。リンカーペプチドは、約１～約４０個のアミノ酸、例えば、約１～約５個のアミノ酸、約５～約１０個のアミノ酸、約１０～約２０個のアミノ酸、約２０～約３０個のアミノ酸の長さを有することができる。これらのリンカーは、タンパク質を連結するための合成のリンカーエンコードするオリゴヌクレオチドを用いて製造することができる。ある程度の柔軟性を有するペプチドリンカーを使用することができる。連結ペプチドは、実質的に任意のアミノ酸配列を有してもよく、いくつかの態様において、リンカーペプチドは、概して柔軟なペプチドをもたらす配列を有するであろう。グリシンおよびアラニンなどの小さなアミノ酸の使用は、柔軟なペプチドを作るのに有用である。かかる配列の創出は当業者には日常的である。さまざまなリンカーが市販されており、使用に適していると考えられる。

担体部分および／または安定化部分をＫＡＩペプチドに結合または連結するために使用することができる例示的な柔軟性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ（例えば、ｎは１～約２０の整数）を含む；グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）_ｎ、ＧＳＧＧＳ_ｎ（配列番号６３）およびＧＧＧＳ_ｎ（配列番号６４）を含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当該技術分野で公知の他の柔軟性リンカーを含む。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーは、これらのアミノ酸の両方が比較的構造化されておらず、したがって成分間の中性のつなぎ鎖として役立ち得るので興味深い。グリシンポリマーはいくつかの態様において使用される。Scheraga (1992) Rev. Computational Chem. 11173-142を参照されたい。例示的な柔軟性リンカーとしては、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧ（配列番号６５）、ＧＧＳＧＧ（配列番号６６）、ＧＳＧＳＧ（配列番号６７）、ＧＳＧＧＧ（配列番号６８）、ＧＧＧＳＧ（配列番号６９）、ＧＳＳＳＧ（配列番号７０）などを含むが、これらに限定されない。

非ペプチドリンカー部分もまた、担体部分および／または安定化部分をＫＡＩペプチドに結合または連結するために使用され得る。リンカー分子は一般に約６～５０原子長である。リンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、２～１０個のモノマー単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであり得る。本開示に照らして、ペプチドに結合することができる他のリンカー分子を使用することができる。

１つ以上の担体部分および／または１つ以上の安定化部分に作動可能に連結、接合または結合したＫＡＩペプチドを含む例示的なコンストラクトが本明細書に提供される。例えば、例７～８および配列番号９４～１３８を参照されたい。しかしながら、本発明の範囲から逸脱することなく、コンストラクトはまた、ペプチドの少なくとも１つの機能的特性を保持する、配列番号１のＫＡＩペプチドにおける１つ以上の欠落、付加、および／または置換を有するＫＡＩペプチドを含む。例えば、配列番号１のＫＡＩペプチドは、アミノ酸配列が１つ以上の保存されたアミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠落、カルボキシ末端切断、またはアミノ末端切断を有するという点で修飾され得る。特定の態様において、当業者は、活性にとって重要であると考えられていない領域を標的とすることによって活性を破壊することなく変化し得るＫＡＩペプチドの適切な領域を同定し得る。さらなる態様において、生物学的活性または構造にとって重要なアミノ酸残基でさえ、その生物学的活性を破壊することなく、またはペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に付すことができる。例えば、Ａｒｇは、Ｌｙｓによって置き換えられてもよく、および／またはＴｈｒは、１回以上の出現でＳｅｒによって置き換えられてもよい。一態様において、変異体ＫＡＩペプチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。一般に、変異体ＫＡＩペプチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３のＫＡＩペプチドと実質的に同じまたはそれ以上の結合親和性、例えば少なくとも０．７５倍、０．８倍、０．９倍、１．０倍、１．２５倍または１．５倍の結合親和性を示す。特定の態様において、ＫＡＩペプチドまたはその変異体は、約１０ｐＭから約１μＭ、またはより好ましくは約１０ｐＭから約１００ｎＭ、または最も好ましくは約１０ｐＭから約１０ｎＭの範囲のＫ_Ｄ値を有する。

特定の態様において、ペプチドはグリコシル化、リン酸化、硫酸化、アミノ化、カルボキシル化、またはアセチル化されている。例えば、Ｃ末端は、アミド化、ペプチドアルコールおよびアルデヒドの付加、エステルの付加、ｐ－ニトロアニリンの付加およびチオエステルで修飾することができる。Ｎ末端およびアミノ酸側鎖は、ＰＥＧ化、アセチル化、ホルミル化、脂肪酸の付加、ベンゾイルの付加、ブロモアセチルの付加、ピログルタミルの付加、スクシニル化、テトラブチルオキシカルボニルの付加および３－メルカプトプロピルの付加、アシル化、ビオチン化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、マレイミド基の導入、キレート部分、発色団および蛍光団によって修飾することができる。

ＫＡＩペプチドおよびコンストラクトは、遺伝子組換えＤＮＡ技術を用いて組換え的に合成することができる。したがって、別の側面において、本発明は、本発明のＫＡＩペプチドまたはコンストラクトをコード化するポリヌクレオチドを提供する。関連する側面において、本発明は、ベクター、特にＫＡＩペプチドまたはコンストラクトをコード化するポリヌクレオチドをかくまう発現ベクターを提供する。特定の態様において、ベクターは、真核細胞または原核細胞におけるＫＡＩペプチドまたはコンストラクトの組換え合成を容易にする複製、転写および／または翻訳調節配列を提供する。したがって、本発明はまた、ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトの組換え発現のための宿主細胞、ならびに宿主細胞によって産生されたＫＡＩペプチドまたはコンストラクトを採取および精製する方法を提供する。組換えポリペプチドの産生および精製は、当業者にとって日常的な慣習である。ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトは、ゲル濾過および親和性精製による精製を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって精製することができる。本発明のＫＡＩペプチドまたはコンストラクトが融合タンパク質の形態で産生される場合、さらなる分析の前に、融合部分（またはエピトープタグ）を場合によりプロテアーゼを用いて切断することができる。

あるいは、本発明のＫＡＩペプチドまたはコンストラクトは、当該技術分野で公知の任意の化学合成技術、特に固相合成技術によって、例えば市販の自動ペプチド合成機を使用して有利に合成され得る。例えば、Stewart and Young, 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co.; Tarn, et al. (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:6442; Merrifield (1986) Science 232:341-347; および米国特許第５，４２４，３９８号を参照されたい。さらに、組み換え技術と化学合成技術の組み合わせも考えられる。

ＫＡＩペプチドおよびコンストラクトに加えて、本発明はまた、結合剤、例えば、配列番号１のＫＡＩペプチド、配列番号２のペプチドまたは配列番号３のペプチドに特異的に結合し、類似のまたは関連するタンパク質、例えばＶＥＧＦＲ１には結合しない抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーを包含する。「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は最も広い意味で交換可能に使用され、それらがモノクローナル抗体（例えば完全長または無傷モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多特異性抗体（例えば所望の生物学的活性を示す限り二重特異性抗体を含む。）を含み、および特定の抗体フラグメントを含み得る。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体および／または親和性成熟抗体であり得る。「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部のみを含み、ここでその部分は、無傷の抗体中に存在する場合、特にＫＡＩペプチドへの結合において、その部分に通常関連する機能の少なくとも１つ、好ましくは大部分または全部を保持する。

ＫＡＩペプチド結合剤は、任意の適切な従来の方法によって製造することができる。例えば、結合剤が抗体である場合、本発明のＫＡＩペプチドは、例えば、マウスまたはウサギを免疫するために使用され、モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、日常的なプロトコルによって生成される。かかる抗体のフラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、二重特異性ｓｃＦｖフラグメント、ＦｄフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントもまた生成され得、ＫＡＩペプチド結合剤として使用され得る。ＫＡＩペプチド結合剤は、疾患の処置のための免疫療法アプローチならびにＫＡＩペプチドの検出および精製に用途がある。

多くの疾患（「血管新生疾患」として特徴付けられる）は、過剰な血管分布をもたらす、持続的な調節されないまたは異常な血管新生によって引き起こされる。例えば、眼の血管新生は失明の最も一般的な原因として関係している。関節炎などの特定の既存の状態では、新しく形成された毛細血管が関節に侵入して軟骨を破壊する。糖尿病では、網膜に形成された新しい毛細血管が硝子体に侵入し、出血し、失明を引き起こす。固形腫瘍の増殖および転移もまた血管新生依存性である（Folkman (1986) Cancer Res. 46:467-473; Folkman (1989) J. Natl. Cancer Inst. 82:4-6）。例えば、２ｍｍを超えて拡大する腫瘍はそれら自身の血液供給を得なければならず、新しい毛細血管の成長を誘発することによってそうしなければならないことが示されている。これらの新しい血管が腫瘍に埋め込まれると、それらは腫瘍細胞が循環系に入りそして肝臓、肺および骨のような離れた部位に転移するための手段を提供する（Weidner, et. Al. (1991) N. Engl. J. Med. 324(1):1-8）。

血管新生は、毛細血管の一次細胞である内皮細胞の増殖を刺激し阻害する分子の複雑な相互作用に関与すると考えられている。通常の条件下では、これらの分子は微小血管系を長期間にわたって静止状態（すなわち、毛細管成長がない状態の一つ）に維持するように見える。しかしながら、必要な場合（創傷修復中など）、これらの細胞は短期間で急速な増殖および代謝回転を受け得る。血管新生は通常の条件下では高度に調節された過程であるが、多くの状態（「血管新生疾患」として特徴付けられる）は持続的な調節されない血管新生によって引き起こされる。別の言い方をすれば、調節されない血管新生は、特定の病理学的状態を直接引き起こすかまたは既存の病理学的状態を悪化させ得る。

本明細書に示されるように、ＫＡＩペプチドを含有するコンストラクトは抗血管新生活性を有する。血管新生阻害剤として、かかるペプチドおよびコンストラクトは、血管新生を阻害し、過剰な血管分布によって特徴付けされる対象における疾患または病気に対処する方法において有用である。特に、本発明のＫＡＩペプチドおよびコンストラクトは、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、口腔咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、および胆管癌、小腸、尿路（腎臓、膀胱、尿路上皮を含む）、女性の生殖管（子宮頸部、子宮、卵巣、絨毛癌、妊娠性絨毛性疾患を含む）、男性の生殖管（前立腺、精嚢、精巣、胚細胞腫瘍を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎、脳下垂体を含む）、皮膚、血管腫、黒色腫、肉腫（骨や軟部組織、カポジ肉腫など）、脳腫瘍、神経、眼、および髄膜（星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫、および髄膜腫を含む）を含む原発性および転移固体腫の処置に有用である。かかるペプチドおよびコンストラクトはまた、白血病などの造血系悪性腫瘍（すなわち、クロローマ、形質細胞腫、および菌状息肉腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫／白血病のプラークと腫瘍）から生じる固形腫瘍およびリンパ腫（ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫の両方）の処置においても有用である。さらに、ＫＡＩペプチドおよびコンストラクトは、単独でまたは放射線療法および／または他の化学療法剤と組み合わせて使用される場合のいずれかで、上記の腫瘍からの転移の予防において有用である。

ＫＡＩペプチドおよびコンストラクトのさらなる用途としては、慢性関節リウマチ、免疫性および変性性関節炎、乾癬などの皮膚病、血腫などの血管疾患、およびアテローム硬化性プラーク内の毛細血管増殖、肺線維症、オスラーウェバー症候群、心筋血管新生、喘息、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、眼疾患と創傷の顆粒形成などの自己免疫疾患の治療および予防を含む。他の用途には、腸管癒着、クローン病、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および肥厚性瘢痕、すなわちケロイドを含むがこれらに限定されない、内皮細胞の過剰または異常な刺激を特徴とする疾患の処置を含む。別の用途は、排卵および胎盤の定着を阻害することによる避妊薬としての使用である。本発明のＫＡＩペプチドおよびコンストラクトはまた、ネコスクラッチ病（Rochele Minalia quintosa）および潰瘍（Helicobacter pylori）などの病理学的結果として血管新生を有する疾患の処置にも有用である。本発明のＫＡＩペプチドおよびコンストラクトはまた、特に切除可能な腫瘍の処置のために、手術前の投与による出血を減らすのにも有用である。

本発明による処置方法は、過剰なまたは異常な血管分布を特徴とする疾患または病気を有する対象に、有効量のＫＡＩペプチド、コンストラクトまたはそれを含む医薬組成物を投与することによって行われる。本明細書で使用されるとき、用語「投与」または「投与すること」は、薬剤を患者に送達するプロセスをいう。投与方法は、１つの薬剤、または複数の薬剤、および所望の効果によって変化し得る。投与は、治療剤に適した任意の手段、例えば経口、非経口、粘膜、肺、局所、カテーテルベース、直腸、頭蓋内、脳室内、脳内、膣内または子宮内送達によって達成することができる。非経口送達は、例えば、皮下静脈内、筋肉内、動脈内、および臓器の組織、特に腫瘍組織への注射を含み得る。粘膜送達は、例えば鼻腔内送達を含み得る。経口または鼻腔内送達は推進剤の投与を含み得る。肺送達は薬剤の吸入を含み得る。カテーテルベースの送達は、イオン導入カテーテルベースの送達による送達を含み得る。経口送達は、コーティングされたピルの送達、または口による液体の投与を含み得る。投与は、一般に、例えば、緩衝剤、ポリペプチド、ペプチド、多糖複合体、リポソーム、および／または脂質などの薬学的に許容し得る担体との送達も含み得る。遺伝子治療プロトコルはまた、治療薬が患者への転写物またはペプチドとして発現された場合に治療目的を達成することができるポリヌクレオチドである投与と見なされる。

ある態様において、本発明は、治療を必要とする対象に有効量のＫＡＩペプチドまたはそれを含むコンストラクトを投与することによる、眼の疾患または病気の処置方法を提供する。特に、ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトは、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、後水晶体線維症、血管新生緑内障、黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜浮腫、新生血管加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜中心静脈閉塞症、分枝網膜静脈閉塞症、網膜色素変性症、虹彩血管新生、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎および角膜移植片血管新生に関連する視覚障害または視覚喪失（失明）、感染または外科的介入に関連する眼の血管新生、ならびにその他の眼の異常血管新生状態などの眼疾患の治療に有用である。

特定の態様において、本発明は、処置を必要とする対象に有効量のＫＡＩペプチドまたはそれを含むコンストラクトを投与することによって、滲出性および乾性黄斑変性を含む黄斑変性を処置する方法を提供する。滲出性黄斑変性症は、異常な血管が黄斑の後ろに成長すると起こる。これらの血管は壊れやすく、体液および血液を漏出させる可能性があり、その結果、黄斑の瘢痕化をもたらし、急速で深刻な損傷の潜在性を高める。ブルッフの膜は、通常ドルーゼン鉱床の近くで分解する。これが、新しい血管の成長、すなわち血管新生が起こる場所である。中心視力は短期間で、時には数日以内に、歪んだり完全に失われたりすることがある。

疾患または病気を有する対象を「処置する」とは、以下のうちの１つ以上を達成することを意味する：（ａ）疾患の重症度を軽減すること、（ｂ）疾患または病気の進行を阻止すること、（ｃ）疾患または病気の悪化を防ぐこと、（ｄ）以前に疾患または病気を患ったことのある患者における疾患または病気の再発を制限または防止すること、（ｅ）疾患または病気の後退を引き起こすこと、（ｆ）疾患または病気の症状を改善または排除すること、（ｇ）生存期間を改善すること。対象は哺乳類であり得、特定の態様では、処置される対象はヒトであり、疾患または病気は炎症性疾患、がん、または網膜血管症である。

血管新生または血管分布の程度は、本明細書に記載されているものなどの当技術分野で公知の方法を使用して決定することができ、定性的または定量的に行うことができる。例えば、がんまたは腫瘍増殖の分子マーカーまたは細胞マーカーを利用することができる。血管新生の程度はまた、生物学的サンプル内の内皮細胞増殖の量または血管増殖の程度を測定することによって決定され得る。かかる方法は、処置を必要とする対象を同定すること、および治療効果について監視することの両方において有用である。

ＫＡＩペプチドまたはそれを含有するコンストラクトは、理想的には、ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含有する薬学的組成物として投与される。適切な製剤は、よく知られておりそして当業者に容易に入手可能である多くの情報源に記載されている。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro, editor, 20^th ed. Lippingcott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000)は、本発明に関連して使用できる製剤を記載している。ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトは、錠剤、カプセル剤、軟ゼラチンカプセル剤、エリキシル剤または注射用製剤などの従来の全身投薬形態に組み込むことができる。投薬形態はまた、必要な生理学的に許容し得る賦形剤、担体材料、潤滑剤、緩衝剤、界面活性剤、抗菌剤、増量剤（マンニトールなど）、酸化防止剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）などを含み得る。許容される製剤材料は、好ましくは使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒性である。

医薬組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶解または放出速度、該組成物の吸着または浸透を修飾、維持または保存するための製剤材料を含有し得る。適切な製剤材料としては、限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗菌剤、酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、クエン酸トリス塩酸、リン酸塩または他の有機酸など）、増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；フィラー；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶剤（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０などのポリソルベート、Ｔｒｉｔｏｎ、トリメタミン、レシチン、コレステロール、またはチロキサパール）；安定性向上剤（スクロースまたはソルビトールなど）；等張化剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、またはソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；および／または補佐薬を含む。

医薬組成物中の主要なビヒクルまたは賦形剤は、本質的に水性または非水性のいずれであってもよい。例えば、適切なビヒクルまたは賦形剤は、注射用水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であり得、おそらく非経口投与用の組成物に一般的な他の物質を補充したものであり得る。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水はさらなる例示的なビヒクルである。医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝液を含むことができ、それはさらにソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。医薬組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意の製剤化剤と混合することによって貯蔵用に調製することができる。さらに、ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトは、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方することができる。

ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトは、点眼に適した医薬組成物に組み込むことができる。典型的には、組成物は薬学的に許容し得る眼科用賦形剤を含む。眼科用賦形剤は、緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、および／または抗酸化剤であり得る。緩衝剤は、ホウ酸および／またはリン酸であり得る。等張化剤は、等張環境を提供し得、および塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、および／またはホウ酸を含み得る。酸化防止剤としては、例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを含む。酸化防止剤は、組成物を安定化させるのを助けるために使用され得る。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）およびポリソルベート８０を含む湿潤剤は、組成物を眼の上に広げることを可能にし得る。他の眼科用賦形剤としては、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ピューリット、クロロブタノール、グリセリン、デキストラン７０、プロピレングリコール、およびＰＥＧ－４００などのポリエチレングリコールを含む。眼科用賦形剤は、鉱油、白色ワセリン、白色軟膏またはラノリンなどの軟膏であり得る。水性ビヒクルと同様に、ペトロラタムおよび鉱油は、眼の接触時間を増加させるための軟膏製剤中のビヒクルとして役立ち得る。これらの成分は、眼球の表面上に閉塞性フィルムを形成するのを助け、そしてムチン層および水性層を増強することによって涙液フィルムの組成を改善することができる。眼科用賦形剤は、ムチン様特性を提供し得、および／または蒸発による水層の損失を減少させ得る。眼科用賦形剤は、薬学的に許容し得る担体などの担体として機能することができる。

無菌状態は典型的には水性製剤のために従来の眼科用防腐剤、例えばクロルブタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジウム、フェニル水銀塩、チメロサールなどにより維持され、無毒であり、および一般に水溶液の約０．００１から約０．１重量％まで変動する量で使用される。軟膏のための従来の防腐剤はメチルおよびプロピルパラベンを含む。典型的な軟膏基剤は、白色ワセリンおよび鉱油を含む。以下の非限定的な例は本発明をさらに説明するために提供される。

医薬組成物は、ボーラス注射によって、または注入によって連続的に、あるいは移植装置によって投与することができる。医薬組成物はまた、所望の分子が吸収または封入されている膜、スポンジまたは他の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植装置が使用される場合、装置は任意の適切な組織または臓器に移植されてもよく、所望の分子の送達は拡散、時限放出ボーラス、または連続投与を介してもよい。

製剤は、単位投与量または複数投与量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに入れてもよく、使用前に滅菌液体担体の状態のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件、例えば注射用水に保存してもよい。即席注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、錠剤などから調製され得る。特に上述した成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤の種類を考慮して当技術分野において慣用の他の薬剤を含むことができることを理解されたい。

一実施態様において、ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトは、徐放性製剤で送達され、それは持続放出および半減期の延長をもたらす。使用に適した徐放性システムには、拡散制御、溶媒制御および化学制御のシステムが含まれるが、これらに限定されない。拡散制御システムは、例えば、ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトの放出が拡散障壁を通る透過によって制御されるように、ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトが装置内に封入されている貯蔵装置を含む。慣用の貯蔵装置には、例えば、膜、カプセル、マイクロカプセル、リポソーム、および中空繊維が含まれる。モノリシック（マトリクス）デバイスは、ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトが律速マトリクス（例えばポリマーマトリクス）中に分散または溶解している、第２の種類の拡散制御システムである。ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトは律速マトリクス全体に均一に分散されており、放出速度はマトリクスを通る拡散によって制御される。モノリシックなマトリクスデバイスにおける使用に適したポリマーは、天然に存在するポリマー、合成ポリマーおよび合成的に修飾された天然ポリマー、ならびにポリマー誘導体を含む。

本発明のＫＡＩペプチドまたはコンストラクトはまた、小型単層ベシクル、大型単層ベシクルおよび多層ベシクルなどのリポソーム送達系の形態で投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどのさまざまなリン脂質から形成されることができる。特定の態様において、製剤は、リポソームの表面と会合しているかまたはリポソーム内に封入されたＫＡＩペプチドまたはコンストラクトを有するリポソームを含む。予め形成されたリポソームは、ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトと会合するように修飾されることができる。例えば、カチオン性リポソームは、静電相互作用を介してＫＡＩペプチドまたはコンストラクトと会合する。あるいは、コレステロールなどの親油性化合物に結合したＫＡＩペプチドまたはコンストラクトを予め形成されたリポソームに添加することができ、それによってコレステロールがリポソーム膜と会合するようになる。あるいは、リポソームの製剤中にＫＡＩペプチドまたはコンストラクトをリポソームと会合させることができる。

固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）も、脂質エマルジョン、リポソーム、およびポリマーナノ粒子などのコロイド状送達システムに対する代替の薬物送達システムとして使用され得る。ＳＬＮの製剤、調製方法、滅菌および凍結乾燥に使用されるさまざまな脂質マトリクス、界面活性剤、および他の賦形剤を使用することができる。担体の捕捉効率および種々の組成物の物理的パラメータ、ペプチド放出、および放出機構に対するその効果は、Manjunath, et al. (2005) Methods Find Exp Clin Pharmacol 27(2):127においてよく調査され、議論されている。

ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトの点眼は、眼内インプラント、硝子体内注射、全身投与、局所適用、ナノ粒子、ミクロ粒子、点眼剤、生体接着性ゲルまたはフィブリンシーラント、上皮細胞バリア複合体の透過性を調節するための多糖類を用いて行われ得、ペプチドは、角膜薬物送達、バイオベクターポリマーを使用する投与などの粘膜投与、水性眼科用スプレーおよび電気力学的眼科用スプレー処置を増強する。

ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトについての治療上有効で最適な投与量範囲は、当該分野で公知の方法を使用して決定され得る。「有効量」または「治療上有効量」を構成するＫＡＩペプチドまたはコンストラクトの量は、処置される患者の疾患の重症度、状態、体重、または年齢、投与頻度に応じて変わり得るが、当業者によって日常的に決定され得る。臨床医は、最適な治療効果を得るために投与量または投与経路を滴定することができる。典型的な投与量は、上記の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ体重以上の範囲である。ある態様において、投与量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、または５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲であり得る。投与することができる医薬製剤は、例えば、１～１０，０００ｍｇ、１０～１０００ｍｇ、５０～９００ｍｇ、１００～８００ｍｇ、または２００～５００ｍｇの量のＫＡＩペプチドまたはコンストラクトを含み得る。

処置を強化するために、本明細書に開示されたＫＡＩペプチドまたはコンストラクトは、がん、腫瘍または他の増殖性疾患を治療するために少なくとも１つの追加の治療薬と組み合わせて使用することができる。追加の薬剤は、ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトと組み合わせてまたは交互に投与することができる。薬物は、同じ組成物の一部を形成してもよく、または同時にもしくは異なる時間に投与するための別々の組成物として提供されてもよい。第２の治療薬は、レチノイド、インターフェロン、抗新生物薬、放射線、微小管調節薬を含む細胞骨格要素を標的とするものなどの抗有糸分裂薬、ポドフィロトキシンまたはビンカアルカロイド、代謝拮抗薬、プリン類似体、アルキル化剤、アントラサイクリン薬などのＤＮＡを標的とする薬物、トポイソメラーゼを標的とする薬物、ホルモンおよびホルモンアゴニストまたはアンタゴニスト、抗体誘導体を含む腫瘍細胞におけるシグナル伝達を標的とする薬物、マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤などの腫瘍の転移に影響を与える可能性のある薬物、遺伝子治療およびアンチセンス剤、抗体治療薬、コルチコステロイド、ステロイド類似体、抗炎症薬、および制吐薬を含み得るがこれらに限定されない。第２の治療薬の例は、表２に開示されている。

さらに、眼の疾患または病気を処置するためのＫＡＩペプチドまたはコンストラクトの投与は、埋め込み型遠眼鏡、レーザー光凝固術および黄斑転位手術などの他の手順と組み合わせることができる。

本発明のＫＡＩペプチド、コンストラクトまたは組成物の有効性は、関心のある疾患または病気の任意の適切なモデルを使用して評価することができる。特に、当該分野で公知の血管新生アッセイが使用され得る。例えば、ラット大動脈輪、ウシ、マウスおよびヒトの血管新生アッセイが記載されている、米国特許出願公開第２００３／００７７２６１号を参照されたい。例えば、ＵＳ２００３／００７７２６１に記載されているような環微小血管伸長の定量化を使用することができ、そこではＯＬＹＭＰＵＳ ＢＸ６０顕微鏡に連結されたデジタルビデオカメラを用いて環培養を撮影し、伸長領域をImage Pro Plusソフトウェアで選択的に測定および検出する。Parisらの米国特許出願公開第２００３／００７７２６１号に記載されている内皮細胞移動アッセイがヒト脳成人内皮細胞の移動が改良ボイデンチャンバーアッセイ（BD BioCoat MATRIGEL Invasion Chamber）を使用して評価される場合に使用され得る。Ａ－５４９（ヒト肺腺癌）およびＵ８７－ＭＧ（ヒト神経膠芽腫）細胞が８週齢の雌性ヌードマウスに移植される、例えば米国特許出願公開第２００３／００７７２６１号に記載されるようなヌードマウス腫瘍異種移植モデルを使用することができる。動物で増殖した腫瘍は、ＫＡＩペプチドまたはコンストラクトによる処置の前後、および治療中に測定されている。各インビボ抗腫瘍試験の終了日に、腫瘍を摘出し、微小血管を定量する。

本発明は以下の非限定的例によってより詳しく記載される。

例１：材料および方法
抗体および薬剤 ＫＩＦ１３Ｂ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメイン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、マサチューセッツ州アクトン）、Ｅタグ（Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ＫＩＦ１３Ｂ中のＶＥＧＦＲ２結合部位の分析に基づくフォンウィルブランド因子（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カリフォルニア州テメキュラ）、およびＣＤ３１（Ａｂｃａｍ）に対する抗体を使用した。二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ロバ抗ウサギ（Jackson ImmunoResearch、ペンシルベニア州ウェストグローブ）、ＡＬＥＸＡ－５９４接合抗ウサギ（Life Technologies、カリフォルニア州カールスバッド）であった。ＷＳＴ－１（Roche、スイス・バーゼル）および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニックエンドラベリング（TUNEL）キット（Life Technologies）も使用した。

プラスミド ヒトＫＩＦ１３Ｂ ｃＤＮＡは、上総ＤＮＡ研究所（日本・千葉）から調達された。切断型変異体を、標準的な方法に従って、ＨｉｓタグおよびＳタグを有する細菌中で発現された。レンチウイルスおよび遺伝子組み換えタンパク質は、Ｙａｍａｄａ（(2014) J. Cell Sci. 127:4518-30）らによって記載のとおり生産された。

ペプチド ペプチドはPierce Biotechnology（イリノイ州ロオクフォード）によって９５％純度にて委託合成され、それは逆相高性能液体クロマトグラフィーおよび質量分析器によって確認された。バルクペプチドをガラスバイアル（バイアルあたり２５ｍｇ）に等分し、賦形剤中に－２０℃で保存した。（＜１０％の滅菌酢酸を添加することによって）酸性条件下で滅菌水に溶解した後、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加することによってｐＨを調整し、滅菌ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍＬのペプチドを等分し、－２０℃の冷凍庫に保った。解凍したら、ペプチド溶液を２～３日以内に使用した。

細胞培養 ヒト原臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ、ニュージャージー州ウォーカーズビル）を、０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）被覆培養皿上の１０％ＦＢＳを補充したＥＧＭ－２（Ｌｏｎｚａ）中で維持した。継代培養４～６を実験に使用した。ＶＥＧＦ^１６５で刺激する前に、ＨＵＶＥＣを０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＥＢＭ－２（Ｌｏｎｚａ）中で２時間血清飢餓状態にした。遺伝子組換えヒトＶＥＧＦ^１６５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州オーバーン）を５０ｎｇ／ｍｌ（２．２ｎｍｏｌ／ｌ）で使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣ）、およびヒト線維芽細胞デトロイト５５１（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。Ｈ４６０細胞はＡＴＣＣ製で、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（Life Technologies）中で維持した。

血管新生アッセイ コラーゲン浸潤アッセイを以前に記載されているようにして行った（Kangら、(2011) J. Biol. Chem. 286:42017-26）。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）上でのインビトロ毛細管ネットワーク形成および引っかき傷治癒アッセイを以前に記載されたように実施した（Humtsoeら、 (2010) Mol. Cell Biol. 30:1593-1606）。フィブリンゲル発芽アッセイは、Nakatsu＆Hughes（(2008) Methods Enzymol. 443:65-82）に記載されているように行った。ＶＥＧＦ（２．２ｎｍｏｌ／Ｌ）刺激を全てのインビトロ血管新生アッセイに使用した。トランスウェル移動アッセイは、Kaplanら（(2011) Free Radical Res. 45:1124-35）に記載のように、ＶＥＧＦ（４．４ｎｍｏｌ／Ｌ）、スフィンゴシン－１－ホスフェート（Ｓ１Ｐ）（１μｍｏｌ／Ｌ）、または塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（５０ｎｇ／ｍＬ）をキネシン由来血管新生阻害剤（ＤＵＦ２Ｃ５； ＫＩＦ１３Ｂの残基１２３８－１２６０）の存在下または非存在下で様々な濃度で使用して行った。

インビトロ結合 ＫＩＦ１３Ｂの切断型変異体をＢＬ２１（ＤＥ３）またはＲｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ中において発現させ、以前に記載されたように精製した（Yamada, et al. (2014) J. Cell Sci. 127:4518-30; Yamada, et al. (2007) Biochemistry 46:10039-45）。結合アッセイは、４℃で０．５％ＴＲＩＴＯＮ－Ｘ１００および１％ウシ血清アルブミン中のＳ－樹脂を用いて行い、抗ＶＥＧＦＲ２抗体を用いたウエスタンブロッティングによって分析した。

増殖、生存率、および毒性アッセイ。 ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘発増殖および生存率は、以前に記載されているように（Cai, et al. (2006) Microvasc. Res. 71:20-31; Jones, eta l. (2005) Br. J. Pharmacol. 145:1093-102）、ＷＳＴ－１アッセイ（Roche）によって評価した。ＨＵＶＥＣを低減血清培地（０．１％ウシ胎児血清を補充したＥＢＭ２、およびＶＥＧＦ、上皮成長因子、インスリン様成長因子、および線維芽細胞成長因子を除くＥＣ補充）で培養した。次いで、ＨＵＶＥＣを、ＤＵＦ２Ｃ５（１、３、および１０μｍｏｌ／Ｌ）、または陰性対照ペプチド（ＣＴ２３、３μｍｏｌ／Ｌ）を伴いおよび伴わず、ＶＥＧＦ（２．２ｎｍｏｌ／Ｌ）で４８時間刺激して、９６ウェルフォーマットでのＷＳＴ－１アッセイによってＶＥＧＦ誘発増殖を試験した。増殖培地中で一晩インキュベートした後、ＤＵＦ２Ｃ５（１、３、および１０μｍｏｌ／Ｌ）を用いておよび用いずに、ＨＵＶＥＣの生存率を評価した。増殖培地中でＤＵＦ２Ｃ５を用いておよび用いずに４８時間インキュベートした後、ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってアポトーシスを測定した。陽性対照として、５０ｎｇ／ｍＬの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αもアポトーシスアッセイに使用した。

内皮透過性アッセイ 内皮透過性のＶＥＧＦ誘発増加は、ＨＵＶＥＣ単層膜にわたるフルオレセインイソチオシアネート－デキストランの漏出によって評価された。トランスウェル（孔径０．４μｍを有する）を合流ＨＵＶＥＣで被覆した。血清飢餓後、細胞をＤＵＦ２Ｃ５またはＣＴ２３（１０μｍｏｌ／Ｌ）で前処理した。その後、細胞をＶＥＧＦで刺激し、さまざまな時点で、経内皮のフルオレセインイソチオシアネート－デキストラン透過性を蛍光プレートリーダーＰＨＥＲＡＳＴＡＲ（ＢＭＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ノースカロライナ州カーリー）を用いて測定した。

ＭＡＴＲＩＧＥＬプラグ血管形成アッセイおよびマウス異種移植モデル マウスＥＣの血管形成を評価するために使用されるＭＡＴＲＩＧＥＬプラグアッセイのために、Ｃ５７ＢＬ６オス（Jackson Laboratory）を以前に記載されたように使用した（Yang & Proweller (2011) J. Biol. Chem. 286:13741-53)）。４．４ｎｍｏｌ／ｌのＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、６０Ｕのヘパリン、および０．８×１０^８ＩＦＵのレンチウイルスを補充したＭＡＴＲＩＧＥＬを腹部に皮下注射した。注射の４日後、ＭＡＴＲＩＧＥＬを採取した。

マウス異種移植片モデルについては、ヒト肺癌Ｈ４６０（３×１０^６細胞）皮下注射が、（Eklund, et al. (2013) Mol. Oncol. 7:259-82; Yamada, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:14098-103）に記載のように、重症複合免疫不全症の免疫不全ＢＡＬＢｃマウス（Jackson Laboratory）の右側腹部に麻酔下に接種された。触診可能な腫瘍が発生した後、マウスに２００μＬのＰＢＳまたはペプチドＤＵＦ２Ｃ５（２００μＬのＰＢＳに溶解した１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを週に３回尾静脈注射によって静脈内投与した。キャリパーを用いて腫瘍サイズを週に３回測定した。処置期間後、腫瘍を固定し、腫瘍血管新生の評価のために抗ＶＥＧＦＲ２抗体を用いた免疫組織学的分析のためにパラフィン包埋された。マウスをイリノイ大学の動物管理施設内の病原体のない状態で飼育し、施設のガイドラインに従って処置した。

出生後の網膜血管新生 新生仔のＣ５７Ｂマウスにペプチド（ＤＵＦ２Ｃ５またはＣＴ２３、１０ｍｇ／ｋｇをＰＢＳに溶解）またはＰＢＳビヒクルを誕生日（出生後第０日）およびそれに続く日（出生後第１～４日）に毎日、既に記載されているように（Chavala, et al. (2013) J. Clin. Invest. 123:4170-81）まぶたに皮下注射した。出生後６日目に、網膜を単離し、以前に記載されているように（Pitulescu, et al. (2010) Nat. Protoc. 5:1518-34）抗ＣＤ３１抗体（Ａｂｃａｍ）で染色した。

画像取得プロトコル。この試験に使用した顕微鏡は、６３倍油浸対物レンズを有するＺＥＩＳＳ共焦点ＬＳＭ ８８０ ＭＥＴＡ、およびＰＬＡＮ－ＮＥＯＦＬＵＡＲ ５倍対物レンズ、２０倍対物レンズ、および４０倍油浸対物レンズを有するＺＥＩＳＳ ＡＸＩＯＶＥＲＴ位相差顕微鏡であった。すべての蛍光画像は、同じ一連の実験においてすべてのサンプルについて同じ条件および設定で撮影された。

統計分析。ｔ検定をグループ間比較に使用した。３つ以上のグループを分析するために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５（GraphPadソフトウェア、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、一元配置分散分析および事後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較を行った。

レーザー誘発ＣＮＶ。血管新生加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、脈絡膜からの血管の成長を特徴とし、それはブルッフ膜を通って網膜下領域に入る。レーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のマウスモデルは、浸出性形態のＡＭＤの十分に確立されたモデルである。レーザー光線によるブルッフ膜の崩壊は、網膜への新しい脈絡膜血管の増殖を促進し、したがってＡＭＤの病理学的条件を模倣する。

レーザー光凝固は、麻酔下でＣ５７Ｂマウスに画像誘導レーザーシステム（Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州プレザントン）を使用して誘発した。視神経から等しい距離にある４つのレーザー熱傷を、波長５３２ｎｍ、固定直径５０μｍ、持続時間７０ｍｓ、および２１０～２５０ｍＷの出力レベルを有する緑色アルゴンレーザーパルスによって、右眼に１つずつ誘発させた。レーザースポットでの泡の出現は、ブルッフ膜の破裂を示し、レーザー誘発ＣＮＶの確認として役立つ。この手順は各マウスの右眼でのみ行った。

７日目および１４日目に、脈絡膜血管新生を眼球コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）およびフルオレセイン血管造影によって評価した。フルオレセイン血管造影およびＯＣＴを、患者に臨床的に日常的に使用される手順と同様に、網膜血管系を画像化するために実施した。フルオレセイン血管造影図は、０．５％フルオレセインの腹腔内注射によって行われた。

実験は、ＯＣＴおよび血管造影の画像を撮影した後の１４日目に終了した。眼球を撮影し、脈絡膜／強膜のフラットマウント調製物を、ＣＮＶ領域の死後分析のためにBandeiraena simplicifoliaからのＡＬＥＸＡ ５９４標識レクチン（Ｂ４）で染色するために使用した。MetaMorphソフトウェアを使用してレクチンＢ４についてのＣＮＶ染色の共焦点画像を使用して、血管漏出およびＣＮＶの面積を定量した。データをプロットし、Ｐｒｉｓｍ６（Graph Pad、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて統計的に分析した

例２：ＫＩＦ１３Ｂ由来ペプチド阻害血管新生の同定
遺伝子組換えタンパク質を用いて、ＶＥＧＦＲ２との相互作用を媒介するＫＩＦ１３Ｂ上の結合部位を同定した。ＫＩＦ１３Ｂは、モーター、フォークヘッド関連、膜関連グアニル酸キナーゼ－結合茎、２つの未知の機能ドメイン（ＤＵＦ）（ＤＵＦ３６９４）、およびプロリンリッチおよび細胞骨格関連タンパク質グリシンリッチドメインを持っている。ＤＵＦは、Ｐｆａｍデータベース上のアミノ酸配列類似性から同定された。ＤＵＦ３６９４の両方のドメインがインビトロで遺伝子組換えＶＥＧＦＲ２に直接結合することが以前に示されている（Yamada, et al. (2007) Biochemistry 46:10039-45）。ＶＥＧＦＲ２輸送を阻害する特定のペプチド配列を定義するために、第二のＤＵＦ３６９４ドメイン（ＤＵＦ２、ＫＩＦ１３Ｂの残基１１１２～１２８１）のさらなる分析を実施した。これは、このドメインの安定性およびＫＩＦ１３Ｂの他のカーゴに対する結合部位とは異なる配列に基づいていた（(Horiguchi, et al. (2006) J. Cell Biol. 174:425-436; Hanada, et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:28774-2878）。ＤＵＦ２を３つの部分、ＤＵＦ２Ａ（残基１１１１～１１６７）、ＤＵＦ２Ｂ（残基１１６８～１２１６）、およびＤＵＦ２Ｃ（残基１２１７～１２８１）に分け、そして各部分を細菌中の遺伝子組換えタンパク質として発現させた。ＶＥＧＦＲ２はＨＵＶＥＣにおいて豊富に発現され、したがって、ＨＵＶＥＣからの細胞溶解物をビーズ上のこれらの遺伝子組換えタンパク質と共にインキュベートし、抗ＶＥＧＦＲ２抗体を用いてＶＥＧＦＲ２結合を決定した。この分析は、ＤＵＦ２ＣがＶＥＧＦＲ２に特異的に結合するのに対して、ＤＵＦ２ＡおよびＤＵＦ２Ｂならびにビーズ単独では結合できなかったことを示した。

ＫＩＦ１３Ｂの切断型変異体の生物活性を試験するために、ＤＵＦ２ＣをＨＵＶＥＣにおいてレンチウイルスベクターによって発現させた。ＤＵＦ２Ｃの発現は、インビトロでのＶＥＧＦ誘発性毛細血管網形成を減少させるのに十分であったが、ベクター感染対照ＨＵＶＥＣは、ＶＥＧＦの存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬプラグ中に特徴的な毛細血管網を形成した。コラーゲン浸潤系（Kang, et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:42017-42026）をペプチドを試験するための別の血管新生アッセイとして使用した。対照レンチウイルス、ＦＬＡＧ－ＤＵＦ２Ｃ、またはＦＬＡＧ－ＤＵＦ２で感染させた後、ＨＵＶＥＣをコラーゲンゲル上に播種した。ゲル中の血管新生促進刺激Ｓ１ＰおよびＶＥＧＦに応答した細胞浸潤を２４時間までモニターした。ＤＵＦ２ＣまたはＤＵＦ２配列全体の発現のみが、ＨＵＶＥＣのコラーゲンゲルへの侵入、侵入距離および形成された内腔の数を有意に減少させた。しかしながら、芽の侵入する厚さは、グループ間で違いはなかった。

ＶＥＧＦＲ２上の最小結合部位を同定するために、ＤＵＦ２Ｃをさらに切断した（ＤＵＦ２Ｃ１－９）（図１）。これらのうち、ＫＩＦ１３Ｂの残基１２３８～１２６０（すなわち、ＤＵＦ２Ｃ５またはＣ５ペプチド）は、ＨＵＶＥＣ溶解物由来の内因性ＶＥＧＦＲ２を用いてプルダウン結合アッセイによって決定されたコア結合配列を含んでいた。Ｃ５と比較して、切断型Ｃ６、Ｃ８、およびＣ９ペプチドはＶＥＧＦＲ２と部分的または不安定な結合を示した。Ｃ５ペプチドの安定性は、４～６個のＣ末端残基に起因していた。したがって、これらのＣ末端残基を別のペプチド、１つ以上の翻訳後修飾、１つ以上の非天然アミノ酸残基、ＰＥＧなどの巨大分子、またはそれらの組み合わせで置換することは、ＫＡＩペプチドを安定化すると予想される。

二次元キャピラリーネットワーク形成アッセイにおける生物活性は、ＫＩＦ１３Ｂ切断型変異体を発現するＨＵＶＥＣまたはベクター対照において評価した。ＨＵＶＥＣをＦＬＡＧ－Ｃ２、－Ｃ３、－Ｃ５、－Ｃ８、－Ｃ９、またはベクターをコードするレンチウイルスに感染させた。加えて、ＶＥＧＦＲ２に結合するように結合しないＫＩＦ１３ＢのＣ末端領域（残基１５２８～１８２６）を陰性対照（Ｃ_Ｔ）として使用した。ＶＥＧＦＲ２に結合する切断型変異体Ｃ２、Ｃ３、およびＣ５の発現は、ＶＥＧＦ誘発ネットワーク形成を有意に減少させたが、一方ベクター感染対照ＨＵＶＥＣおよびＣ_Ｔ発現ＨＵＶＥＣは、ＶＥＧＦの存在下でＭＡＴＲＩＧＥＬ上に毛細管ネットワークを形成した。ＶＥＧＦＲ２に弱く結合するＤＵＦ２Ｃ８およびＤＵＦ２Ｃ９はネットワーク形成を有意に減少させなかった。

インビボでの血管形成の媒介におけるＫＩＦ１３Ｂの役割に取り組むために、ＫＩＦ１３Ｂのレンチウイルス発現短縮型変異体を使用してマウスでＭＡＴＲＩＧＥＬプラグアッセイを実施した。高力価のレンチウイルスをＭＡＴＲＩＧＥＬでＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびヘパリンの存在下でＣ５７ＢＬマウスに皮下注射した。興味深いことに、ＤＵＦ２Ｃ５または完全長ＤＵＦ２の発現は血管数を有意に減少させたが、ベクター対照またはＣ_Ｔの発現は有意な効果を示さなかった（図２）。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ２に対するＫＩＦ１３Ｂの最小結合部位を含有するペプチドが、インビトロおよびインビボの両方の血管新生アッセイにおいて血管新生を阻害することを示している。

例３：ＤＵＦ２Ｃ５ペプチドは腫瘍血管新生を妨げる
タンパク質ＢＬＡＳＴ検索は、ＤＵＦ２Ｃ５が他のタンパク質配列と重複しないことを明らかにした。競合結合アッセイを使用して、ＤＵＦ２Ｃ５がＨＵＶＥＣにおいて内因性ＫＩＦ１３ＢとＶＥＧＦＲ２の結合について競合したかどうかを決定した。対照細胞においてＶＥＧＦＲ２はＫＩＦ１３Ｂと免疫共沈降したが、ＤＵＦ２Ｃ５とのプレインキュベーションはＶＥＧＦＲ２とＫＩＦ１３Ｂとの相互作用を妨げた。ＫＩＦ１３ＢとＶＥＧＦＲ２との相互作用は、細胞表面へのＶＥＧＦＲ２の輸送に必要であるので、続いてＤＵＦ２Ｃ５の非存在下または存在下でのＶＥＧＦＲ２の細胞表面発現を調べた。血清飢餓ＨＵＶＥＣをＤＵＦ２Ｃ５ペプチド（３、１０μｍｏｌ／Ｌ）またはＰＢＳ対照とプレインキュベートし、次いで細胞を指示された時間ＶＥＧＦで刺激した。細胞表面局在ＶＥＧＦＲ２を、記載されているように（Yamada, et al. (2007) Biochemistry 46:10039-45）、ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインに対する抗体によって染色した。対照細胞においては、ＶＥＧＦ刺激前にＶＥＧＦＲ２が細胞表面に検出され、ＶＥＧＦＲ２は刺激後１時間で消失し、細胞表面プールは新たに合成されたＶＥＧＦＲ２の輸送によって回復した。しかしながら、初期のＶＥＧＦＲ２細胞表面の蓄積および内在化は、ＤＵＦ２Ｃ５のプレインキュベーションによって影響されなかった。すなわち、ＤＵＦ２Ｃ５は、ＶＥＧＦ刺激後の細胞表面ＶＥＧＦＲ２の回復を妨げるだけであった。

ＤＵＦ２Ｃ５の特異性を調べるために、ＶＥＧＦＲ２に結合しない陰性対照ペプチドを設計した。ＫＩＦ１３ＢのＣ末端領域はＶＥＧＦＲ２と結合しないため（Yamada, et al. (2007) Biochemistry 46:10039-45）、ＣＴ２３と呼ばれるＣ末端の２３アミノ酸ペプチド（ＫＩＦ１３Ｂの残基１６５０～１６７２）が合成された。最初に、ペプチドのＶＥＧＦＲ２との相互作用をプルダウンアッセイを用いて確認した。ストレプトアビジンビーズ上に固定化されたビオチン－ＤＵＦ２Ｃ５ペプチドはＨＵＶＥＣ溶解物からＶＥＧＦＲ２を引き下げたが、ビーズ単独またはビーズ上のＣＴ２３はＶＥＧＦＲ２と相互作用しなかった。

次に、ＨＵＶＥＣによるペプチドのＥＣ取り込みを決定した。ＤＵＦ２Ｃ５およびＣＴ２３の両方は、それぞれｐＩ１２．１および１０．４の高いｐＩ（分子が正味電荷を帯びないｐＨ）を有するように設計された。したがって、中性ｐＨでは、両方のペプチドが細胞取り込みに重要な正電荷を持っている（Jones, et al. (2005) Br. J. Pharmacol. 145:1093-1102）。ＤＵＦ２Ｃ５およびＣＴ２３をビオチンタグを用いて合成し、ストレプトアビジン－ＡＬＥＸＡ４１８を用いて可視化した。ペプチドと共に２時間インキュベートした後、ＨＵＶＥＣは、フローサイトメトリーによって定量化されるようにＤＵＦ２Ｃ５およびＣＴ２３ペプチドの両方を内在化することが示された。

ＶＥＧＦ誘発増殖に対するＤＵＦ２Ｃ５の効果は、続いてＷＳＴ－１アッセイによって決定された。この分析は、ＤＵＦ２Ｃ５が３および１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＶＥＧＦ誘発増殖を阻害するのに対して、３μｍｏｌ／ＬのＣＴ２３は効果がないことを示した。内皮透過性におけるＶＥＧＦ誘発性増加もまた、合流ＨＵＶＥＣ単層を用いて決定された。この分析は、ＤＵＦ２Ｃ５がＶＥＧＦによる透過性の増加を抑制したのに対し、ＣＴ２３は抑制しなかったことを示した。ＷＳＴ－１アッセイを使用して、２４時間ＤＵＦ２Ｃ５（１、３、１０μｍｏｌ／Ｌ）と共にインキュベートした後、ＨＵＶＥＣ生存率も試験した。１０μｍｏｌ／Ｌの最高ＤＵＦ２Ｃ５濃度でさえ細胞生存率を変えることができなかった。ＤＵＦ２Ｃ５（１０μｍｏｌ／Ｌ）、ＰＢＳビヒクルまたはＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ；陽性対照として）と共にインキュベートした後、ＴＮＦ－αのみがアポトーシスを誘発した。

ＤＵＦ２Ｃ５に応答したＥＣ移動は、スクラッチ創傷治癒アッセイを使用して決定された。対照ＨＵＶＥＣ（ＰＢＳビヒクルまたはＣＴ２３）は、ＶＥＧＦに応答して移動して創傷を閉じた。しかし、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘発移動はＤＵＦ２Ｃ５の存在下で著しく遅延した。また、ＴＲＵＳＷＥＬＬ移動アッセイは、ＥＣ移動に対するＤＵＦ２Ｃ５の阻害効果がＶＥＧＦに特異的であるかどうかを決定するために使用された。ＨＵＶＥＣはＤＵＦ２Ｃ５またはＣＴ２３のある、またはなしのＴＲＡＮＳＷＥＬＬチャンバーに入れられた。ＤＵＦ２Ｃ５は、ＶＥＧＦ誘発のＥＣ移動を阻害したが、Ｓ１ＰまたはｂＦＧＦ誘発の移動を変化させなかった（図３）。ＰＢＳおよびＣＴ２３は、全ての刺激によって誘発されたＥＣの移動に影響を及ぼさなかった。

ＶＥＧＦ誘発ネットワーク形成アッセイにおける変化を、ＭＡＴＲＩＧＥＬプラグにおいて評価された。ＤＵＦ２Ｃ５は濃度依存的にＶＥＧＦ誘発ネットワーク形成を妨げたが、ＣＴ２３は効果がなかった。ビーズ上でのＨＵＶＥＣの三次元培養によって、ＶＥＧＦ誘発のＥＣ発芽もまた決定した（Nakatsu & Hughes (2008) Methods Enzymol. 443:65-82）。対照細胞およびＣＴ２３（１μｍｏｌ／Ｌ）処理細胞は、長い芽（例えば、約１３～１６個の芽）および複数の分岐点（例えば、約４～６個の分岐）の形成を示したが、ＤＵＦ２Ｃ５（１μｍｏｌ／Ｌ）処置は、ビーズあたりの分岐点構造（約２個の分岐）および芽（約６個の芽）の数を著しく減少させた。

ＶＥＧＦＲ２輸送が血管新生をインビボ癌モデルで調節するかどうかを決定するために、腫瘍移植マウスモデルを使用した（Eklund, et al. (2013) Mol. Oncol. 7:259-282）。肺癌は腫瘍増殖のための血管新生に依存するため、試験は肺癌を使用して行われた。重症複合免疫不全症のマウスにヒト肺癌Ｈ４６０を異種移植し、ＰＢＳまたはペプチドＤＵＦ２Ｃ５（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを週に３回静脈内投与した。この投与量は、本明細書に記載のインビトロ試験投与計画に基づいている。ＤＵＦ２Ｃ５は腫瘍増殖を阻害したが、ＰＢＳ処置対照腫瘍は増殖し続けた（図４Ａ）。抗ＶＥＧＦＲ２抗体および抗フォンビルブラント因子抗体を用いた免疫組織化学によって可視化された腫瘍の血管は、ＰＢＳ処置対照腫瘍において広範な血管分布を明らかにしたが、ＤＵＦ２Ｃ５処置は腫瘍血管数を有意に減少させた（図４Ｂ）。しかしながら、ＤＵＦ２Ｃ５はがん細胞の生存率に直接影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＴＵＮＥＬ陽性腫瘍細胞数は、ＤＵＦ２Ｃ５処置マウスにおいて増加した（ＰＢＳ、～３００ＴＵＮＥＬ陽性腫瘍細胞／ｍｍ^２；ＤＵＦ２Ｃ５、～１７５０ＴＵＮＥＬ陽性腫瘍細胞／ｍｍ^２）。

ＤＵＦ２Ｃ５がまた別のモデルにおいて血管新生を減少させるかどうかを検討するために、ＤＵＦ２Ｃ５の効果を出生後網膜血管新生のモデルにおいても試験した。ペプチドＤＵＦ２Ｃ５またはＣＴ２３を出生後０日目から４日目まで毎日注射し、６日目に網膜血管新生を測定した。腫瘍における抗血管新生効果とは対照的に、ＤＵＦ２Ｃ５は網膜の発達血管新生に効果を有さなかった。

例４：ＤＵＦ２Ｃ５はレーザー誘発ＣＮＶにおいて腫瘍血管新生を妨げる
レーザー誘発ＣＮＶ手順は、Ｃ５７Ｂ ＷＴマウス（７週齢）を用いて実施した。レーザー光凝固術後、ＤＵＦ２Ｃ５（２μLのＰＢＳ中０．５μｇ、２μｇ、または１０μｇ）またはＰＢＳビヒクル（２μＬ）による処置を硝子体内注射により１回投与した。ＯＣＴ、フルオレセイン血管造影、およびＡＬＥＸＡ ５９４－ＩＬＢ４による染色が血管新生の評価に使用された。ＰＢＳ対照と比較して、ＤＵＦ２Ｃ５処置は血管新生を有意に阻害した（図５Ａ）。

点眼剤としてのＤＵＦ２Ｃ５の効果を続いて試験した。血管新生を阻害しない対照ペプチドＣＴ２３を陰性対照として使用した。レーザー熱傷後、マウスを対照ペプチド（２μｇ／目）またはＤＵＦ２Ｃ５（２μｇ／目）のいずれかで毎日処置した。血管新生は、ＯＣＴ、フルオレセイン血管造影、およびＩＬＢ４による染色によって評価した。 興味深いことに、ＤＵＦ２Ｃ５の毎日の処置は血管新生を有意に阻害したが、対照ペプチドは効果を示さなかった（図５Ｂ）。まとめると、ペプチドＤＵＦ２Ｃ５は、硝子体内注射および点眼剤を介してＡＭＤの有意な阻害を示した。

例５：ＤＵＦ２Ｃ５Ｂ特異性
ＢＬＡＳＴ検索分析は、ＤＵＦ２Ｃ５のペプチド配列がＫＩＦ１３Ｂに特異的であり、他のいかなるタンパク質にも見出されないことを明らかにした。さらに、ＤＵＦ２Ｃ５の配列は哺乳動物のＫＩＦ１３Ｂにおいて高度に保存されている。ＤＵＦ２Ｃ５はＶＥＧＦＲ２のキナーゼドメインと相互作用し、Ｔｉｅ２やＰａｒ１などの他の受容体とは相互作用していない。ＤＵＦ２Ｃ５の特異性をさらに試験するために、ストレプトアビジンビーズに固定化したＤＵＦ２Ｃ５または対照ペプチド（ＣＴ２３）を用いてタンパク質のプルダウンを行い、続いて結合タンパク質の質量分析を行った。この分析は、ＫＩＦ１３Ｂ、ＶＥＧＦＲ２、および共受容体ＮＲＰ１の存在を検出した（ヒット数はそれぞれ２８、１１、および５であった）。Ｔｉｅ２、Ｐａｒ１、Ｓ１ＰＲ１、およびＦＧＦＲは見出されなかった。ＫＩＦ１３Ｂの他のカーゴ（例えば、ＣｅｎｔＡ、ｈＤｌｇ）もまた見出されなかった。いくつかの受容体チロシンキナーゼ（すなわち、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＥＧＦＲ）もまた、キナーゼドメインの類似性のために同定された（ヒット数はそれぞれ６、５、および１であった）が、これらのキナーゼは対照ペプチドと相互作用しなかった。続いて、各受容体チロシンキナーゼの親和性を、アビジンコートチップ上のＤＵＦ２Ｃ５およびＣＴ２３、およびキナーゼの遺伝子組換えサイトゾルドメイン（Fisher Scientific）を用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ（ＵＩＣ、ＲＲＣ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験した。ＶＥＧＦＲ２は、５．５±２．２ｎＭのＫ_Ｄ値でＤＵＦ２Ｃ５に非常に強く結合したが、ＣＴ２３には結合しなかった。ＢＩＡＣＯＲＥはまた、ＰＤＧＦＲβがごくわずかなＫ_ＤでＤＵＦ２Ｃ５に対して非常に弱い結合を示すのに対して、ＰＤＧＦＲαおよびＥＧＦＲはＤＵＦ２Ｃ５に結合しないことを明らかにした。これらのデータは、ＶＥＧＦＲ２に対するＤＵＦ２Ｃ５の高度な特異性を示す。

例６：薬物送達
ＤＵＦ２Ｃ５ペプチドの送達を、ＤＹ６３３蛍光プローブ（Ｐｉｅｒｃｅ）と共有接合させた合成ペプチドを用いて試験した。ＤＹ６３３－ＤＵＦ２Ｃ５（１０ｍｇ／ｋｇ体重）、ＤＹ６３３－ＣＴ２３またはＤＹ６３３単独を、Ｈ４６０腫瘍を有するＳＣＩＤマウスに尾静脈を介して静脈内（i.v.）注射した。１時間後、腫瘍を解剖し、ＯＣＴ中で瞬間凍結した。腫瘍の内皮細胞を可視化するために、腫瘍の凍結切片をｖＷＦで共染色した。この分析は、両方のＤＹ６３３標識ペプチドが腫瘍中のｖＷＦ陽性内皮細胞に見出されたが、染料単独は検出されなかったことを実証した。これらのデータは、腫瘍部位へのＤＵＦ２Ｃ５ペプチドの送達が成功したことを示している。

特に、ＤＵＦ２Ｃ５ペプチドの細胞透過は、３つのＮ末端アミノ酸残基、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙに起因していた。したがって、これらの残基を他の荷電残基（例えば、細胞透過性ペプチド）、脂質、ビタミンＢ_１２、またはそれらの組み合わせと置き換えることは、同様に、ＫＡＩペプチドの細胞内への輸送を容易にすると期待される。

例７：ＤＵＦ２Ｃ５Ｂペプチドの切断
ＶＥＧＦＲ２への結合に関与するＫＩＦ１３Ｂ残基をさらに明確にするために、ＤＵＦ２Ｃ５ペプチドの切断をＶＥＧＦＲ２への結合について試験し（表３）、ＤＵＦ２Ｃ５およびこの領域に隣接するペプチドの結合と比較した（図１）。ＨＵＶＥＣ溶解物由来の内因性ＶＥＧＦＲ２を用いたプルダウン結合アッセイを使用して、この分析の結果は、配列ＴＰＶＤＥＲＬＦＬＩＶＲＶＴＶＱ（配列番号３）を有するペプチドがＶＥＧＦＲ２結合に十分であることを示した。特に、環状型のＤＵＦ２Ｃ５ペプチドも調製され、ＶＥＧＦＲ２に結合することが示された。

例８：ＫＡＩオーソログ
ＫＩＦ１３Ｂは、ゼブラフィッシュおよび鳥のような他の非哺乳動物、および霊長類、イヌ、ウシおよびげっ歯類を含む哺乳類を含むがこれらに限定されない多くの種のオーソログを有する。ホモサピエンスＫＡＩペプチドのオーソログ、ＴＰＶＤＥＲＬＦＬＩＶＲＶＴＶＱ（配列番号３）を表４に提供する。

特に、配列番号３のホモサピエンスＫＡＩペプチドと哺乳動物ペプチドオーソログとの間には、高度の、すなわち約７５～１００％の配列同一性が存在する。実際、本明細書に記載されるように、ホモサピエンスＤＵＦ２Ｃ５ペプチド（対応するマウスＤＵＦ２Ｃ５ペプチドと８２．６％の配列同一性を共有する）は、レーザー誘発脈絡膜血管新生のマウスモデルにおいてインビボで血管新生を阻害することに有効であった。したがって、本発明は、ＴＰＶＤＥＲＬＦＬＩＶＲＶＴＶＱのホモサピエンスＫＡＩペプチド（配列番号３）を含むコンストラクト、ならびにアミノ酸配列：Ｔｈｒ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｘａａ_３－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｘａａ_４－Ｘａａ_５－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｘａａ_６－Ａｒｇ－Ｘａａ_７－Ｘａａ_８－Ｖａｌ－Ｘａａ_９（配列番号１）を有するＫＡＩペプチドオーソログを含み、ここで、Ｘａａ_１はＰｒｏ、ＡｌａまたはＧｌｕ；Ｘａａ_２はＶａｌ、ＡｌａまたはＳｅｒ；Ｘａａ_３はＡｓｐまたはＡｓｎ；Ｘａａ_４はＬｅｕまたはＶａｌ；Ｘａａ_５はＰｈｅまたはＴｙｒ；Ｘａａ_６はＬｅｕまたはＶａｌ；Ｘａａ_７はＶａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒ；Ｘａａ_８はＴｈｒまたはＡｌａならびにＸａａ_９はＧｌｎまたはＡｒｇである。特に、本発明は、アミノ酸配列：Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ_１－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｘａａ_２－Ｘａａ_３－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｘａａ_４－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｘａａ_５－Ｖａｌ－Ｘａａ_６（配列番号：２）を有する哺乳動物ＫＡＩペプチドオーソログを含むコンストラクトを含み、ここで、Ｘａａ_１はＶａｌ、ＡｌａまたはＳｅｒ；Ｘａａ_２はＬｅｕまたはＶａｌ；Ｘａａ_３はＰｈｅまたはＴｙｒ；Ｘａａ_４はＬｅｕまたはＶａｌ；Ｘａａ_５はＴｈｒまたはＡｌａ；ならびにＸａａ_６はＧｌｎまたはＡｒｇである。

本明細書に開示されるホモサピエンスＤＵＦ２Ｃ５ペプチドを用いた場合のように、ＫＡＩペプチドオーソログは、１つ以上の担体部分および／または１つ以上の安定化部分で修飾することができる。このように、本発明のコンストラクトは、表５に列挙される例示的コンストラクトの構造を有し得る。

したがって、本発明は以下の配列を有するコンストラクトを含む：
（Ｓ／Ｎ）－（Ｋ／Ｒ）－（Ｇ／Ｖ）－Ｔ－（Ｐ／Ａ／Ｅ）－（Ｖ／Ａ／Ｓ）－（Ｄ／Ｎ）－ＥＲ－（Ｌ／Ｖ）－（Ｆ／Ｙ）－ＬＩ－（Ｖ／Ｌ）－Ｒ－（Ｖ／Ａ）－（Ｔ／Ａ）－Ｖ－（Ｑ／Ｒ）－ＬＳＨＰ（配列番号：１３１）；
Ｓ－（Ｋ／Ｒ）－ＧＴＰ－（Ｖ／Ａ／Ｓ）－ＤＥＲ－（Ｌ／Ｖ）－（Ｆ／Ｙ）－ＬＩ－（Ｖ／Ｌ）－ＲＶ－（Ｔ／Ａ）－ＶＱＬＳＨＰ（配列番号：１３２）；
ミリストイル－ＴＰ－（Ａ／Ｖ）－ＤＥＲ－（Ｌ／Ｖ）－ＦＬＩ－（Ｖ／Ｌ）－ＲＶ－（Ｔ／Ａ）－ＶＱＬＳＨＰ－ＮＨ_２（配列番号：１３３）；
ミリストイル－ＴＰ－（Ａ／Ｖ）－ＤＥＲ－（Ｌ／Ｖ）－ＦＬＩ－（Ｖ／Ｌ）－ＲＶ－（Ｔ／Ａ）－ＶＱ－ＮＨ_２（配列番号：１３４）；
Ｓ－（Ｋ／Ｒ）－ＧＴＰ－（Ｖ／Ａ）－ＤＥＲ－（Ｌ／Ｖ）－ＦＬＩ－（Ｖ／Ｌ）－ＲＶ－（Ｔ／Ａ）－ＶＱ－ＰＥＧ化（配列番号：１３５）；
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＴＰ－（Ａ／Ｖ）－ＤＥＲ－（Ｌ／Ｖ）－ＦＬＩ－（Ｖ／Ｌ）－ＲＶ－（Ｔ／Ａ）－ＶＱ－ＮＨ_２（配列番号：１３６）；
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＴＰ－（Ａ／Ｖ）－ＤＥＲ－（Ｌ／Ｖ）－ＦＬＩ－（Ｖ／Ｌ）－ＲＶ－（Ｔ／Ａ）－ＶＱ－ＰＥＧ化（配列番号：１３７）；または
Ｓ－Ｋ（アジド－Ｂ_１２）－ＧＴＰ－（Ｖ／Ａ）－ＤＥＲ－（Ｌ／Ｖ）－ＦＬＩ－（Ｖ／Ｌ）－ＲＶ－（Ｔ／Ａ）－ＶＱＬＳＨＰ－ＮＨ_２（配列番号：１３８）。

Claims (14)

1. アミノ酸配列:
   SRGTPVDERLFLIVRVTVQLSHP (配列番号71)、
   RGTPVDERLFLIVRVTVQLSHP (配列番号72)、
   GTPVDERLFLIVRVTVQLSHP (配列番号73)、
   RGTPVDERLFLIVRVTVQLS (配列番号74)、または
   RGTPVDERLFLIVRVTVQ (配列番号75)
   からなるペプチドを含むコンストラクトであって、
   ここで、前記ペプチドが、細胞透過性を増強する1以上の担体部分と作動可能に連結されているか、または前記担体部分と作動可能に連結されていない、前記コンストラクト。
2. 1以上の担体部分が、アンテナペディアペプチド、細胞透過性ペプチド、TAT(転写のトランス活性化因子)、トランスポータン、またはポリアルギニンを含む、請求項1に記載のコンストラクト。
3. 1以上の担体部分が、アンテナペディア配列を含む、請求項2に記載のコンストラクト。
4. 前記担体部分が、RQIKIWFQNRRMKWKKを含むかまたはこれからなる細胞透過性ペプチドである、請求項3に記載のコンストラクト。
5. 前記ペプチドが、1以上の脂肪酸の付加を含む;または前記ペプチドが、ラウリン酸(C12)、ミリスチン酸(C14)、パルミチン酸(C16)、もしくはステアリン酸(C18)から選択される1以上の脂肪酸の付加を含む、請求項1に記載のコンストラクト。
6. 前記ペプチドが、N-末端アミノ酸においてミリスチル化、ステアリル化、もしくはパルミトイル化されている;または前記ペプチドが、N-末端アミノ酸においてミリスチル化されている、請求項5に記載のコンストラクト。
7. 前記ペプチドが、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、アミノ化、カルボキシル化、またはアセチル化されている、請求項1～6のいずれか一項に記載のコンストラクト。
8. C末端が、アミド化、ペプチドアルコールもしくアルデヒドの付加、エステルの付加、p-ニトロアニリンもしくチオエステルの付加、またはエピトープタグで修飾されている、請求項7に記載のコンストラクト。
9. N-末端および/または側鎖が、PEG化、アセチル化、ホルミル化、脂肪酸の付加、ベンゾイルの付加、ブロモアセチルの付加、ピログルタミルの付加、スクシニル化、テトラブチルオキシカルボニルの付加もしくは3-メルカプトプロピルの付加、アシル化(例として、リポペプチド)、ビオチン化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、またはマレイミド基、キレート部分、発色団、もしくは蛍光団の導入によって修飾されている、請求項7に記載のコンストラクト。
10. 前記コンストラクトが、SRGTPVDERLFLIVRVTVQLSHP-NH₂(配列番号113)である、請求項1に記載のコンストラクト。
11. 請求項1～10のいずれか一項に記載のコンストラクトおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。
12. 血管新生を阻害するための方法における使用のための、請求項11に記載の医薬組成物であって、前記方法が、前記コンストラクトの有効量で細胞または組織に接触し、それによって前記細胞または組織内の血管新生を阻害することを含む、前記医薬組成物。
13. 過剰な血管分布を特徴とする対象における疾患または病気を処置する方法における使用のための、請求項11に記載の医薬組成物であって、
    前記方法が、有効量の前記コンストラクトを対象に投与し、それによって疾患または病気を処置することを含み、
    前記疾患または病気が、炎症性疾患、がん、または網膜血管症である、前記医薬組成物。
14. アミノ酸配列TPVDERLFLIVRVTVQ(配列番号3)からなるペプチドを含むコンストラクトであって、
    ここで、前記ペプチドが、細胞透過性を増強する1以上の担体部分と作動可能に連結されているか、または前記担体部分と作動可能に連結されていない、前記コンストラクト。

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