CN109789180A - Kif13b衍生的肽和抑制血管生成的方法 - Google Patents

Kif13b衍生的肽和抑制血管生成的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109789180A
CN109789180A CN201780052792.9A CN201780052792A CN109789180A CN 109789180 A CN109789180 A CN 109789180A CN 201780052792 A CN201780052792 A CN 201780052792A CN 109789180 A CN109789180 A CN 109789180A
Authority
CN
China
Prior art keywords
xaa
arg
peptide
val
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780052792.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109789180B (zh
Inventor
山田香里
阿斯拉尔·马利克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Illinois
Original Assignee
University of Illinois
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Illinois filed Critical University of Illinois
Publication of CN109789180A publication Critical patent/CN109789180A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109789180B publication Critical patent/CN109789180B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供了一种由驱动蛋白衍生的血管生成抑制肽和一个或多个运载组成部分和/或稳定化组成部分构成的构建物，还提供了用于抑制血管生成和治疗以血管供应过量为特征的疾病或病症的方法。

Description

KIF13B衍生的肽和抑制血管生成的方法
简介
本申请要求2016年9月2日提交的美国临时专利申请系列号62/383,070和2017年5月24日提交的62/510,536的优先权利益，所述临时申请的内容整体通过参考并入本文。
本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号为HL060678、R01HL045638、P01HL077806、R01HL090152、R01HL118068和R01HL125350的政府支持下做出。美国政府在本发明中具有一定权利。
背景技术
血管内皮生长因子(VEGF)通过在新血管形成后增加营养物血液供应，在癌症的转移和生长中发挥关键作用。VEGF通过内皮细胞(EC)表面定位的高亲和力酪氨酸激酶受体VEGFR2(即Flk-1)的活化发出信号。不良的血管生长和维护在心肌梗塞、中风和与神经变性和肥胖症相关的障碍中引起局部缺血，而过量的血管生长对于癌症的转移和生长、炎性障碍和与糖尿病和黄斑变性相关的视网膜血管疾病来说是必不可少的。因此，血管生成是这些疾病的关键治疗靶点。抗VEGF抗体和激酶抑制剂阻止VEGFR2信号传导和EC迁移。VEGF阻断也在癌症患者中延长了在单一疗法或组合疗法中的存活期；然而，所述反应是可变的，并且某些患者难治或及时获得耐药性。
VEGF165结合到VEGFR2诱导VEGFR2同源二聚化、自磷酸化和VEGFR2的内化。所述内化的VEGFR2发生泛素化并在溶酶体中降解。VEGF除了连接受体之外，还传导新合成的VEGFR2从高尔基体向质膜的极化转运的信号，以连续恢复细胞表面受体池，用于下一轮的VEGF结合和受体活化循环。这由下述发现所证实，即抑制VEGFR2转运在小鼠耳中阻止了VEGF介导的新血管形成并在体内人工基质胶(MATRIGEL)塞中阻止了血管形成。对VEGFR2向EC表面运输的需求在向外芽生的顶端EC中特别重要，所述顶端EC在血管向外生长时形成丝状伪足，而紧靠所述顶端细胞下方的柄EC对VEGF做出响应经历增加的增殖。因此，VEGFR2在顶端细胞中的集中对于EC在新形成的血管中的定向迁移来说是必需的。就此而言，已显示KIF13B(驱动蛋白家族成员13B)对VEGF做出响应沿着微管单向运输VEGFR2(Yamada等，(2014)J.Cell Sci.127:4518-30)。此外，通过剥夺KIF13B抑制VEGFR2转运废止了EC迁移和芽生血管生成；然而，EC存活和增殖不受影响(Yamada等，(2014)J.Cell Sci.127:4518-30)。KIF13B的尾部具有多个用于货物(cargo)结合的结构域。除了VEGFR2之外，KIF13B还运输极性决定因子例如PIP3。这些货物通常通过桥蛋白例如半人马蛋白-α结合KIF13B的不同区域。
内部内皮血-视网膜屏障的丧失和由此引起的黄斑水肿和损伤是老年人群中眼部障碍和失明的主因。目前，这些也被称为老年性黄斑变性(AMD)的病症是不可治愈的。此外，AMD的新生血管形式的特征在于血管从脉络膜生长，其穿过玻璃膜进入到视网膜下区域中。阻止新生血管性AMD的共同根本病因的一些有效疗法受到限制，所述疗法的目的是通过破坏脉络膜中产生的新血管来阻止视力丧失。尽管当前的使用皮质甾类和抗VEGF药剂的玻璃体内注射的治疗有效地延迟眼病的发展，但它们不能完全消除失明的风险。因此，需要用于治疗眼病并阻止视力丧失的新的、更强力的疗法或组合治疗方法。
发明内容
本发明提供了一种构建物，其包含16至65个氨基酸的肽，所述肽具有氨基酸序列Thr-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Glu-Arg-Xaa4-Xaa5-Leu-Ile-Xaa6-Arg-Xaa7-Xaa8-Val-Xaa9(SEQ IDNO：1)，并被可操作地连接到(a)一个或多个运载组成部分，(b)一个或多个稳定化组成部分，或(c)(a)与(b)的组合，其中Xaa1是Pro、Ala或Glu，Xaa2是Val、Ala或Ser，Xaa3是Asp或Asn，Xaa4是Leu或Val，Xaa5是Phe或Tyr，Xaa6是Leu或Val，Xaa7是Val、Ala或Thr，Xaa8是Thr或Ala，并且Xaa9是Gln或Arg。在某些实施方式中，所述一个或多个运载组成部分包含细胞穿透肽(例如SEQ ID NO：4-60的肽)、脂质、维生素B12或其组合。在其他实施方式中，所述一个或多个稳定化组成部分包括肽、翻译后修饰(例如N-端乙酰化和/或C-端酰胺化)、非天然氨基酸残基(例如D-氨基酸残基)、大分子(例如聚乙二醇、聚唾液酸、羟乙基淀粉、白蛋白或免疫球蛋白片段)或其组合。在某些实施方式中，所述构建物包含氨基酸序列TPVDERLFLIVRVTVQ(SEQ ID NO：3)。示例性的构建物是SRGTPVDERLFLIVRVTVQLSHP-NH2(SEQID NO：113)。还提供了含有所述肽的药物组合物和用于在对象中抑制血管生成和治疗以血管供应过量为特征的疾病或病症(例如炎性疾病、癌症或视网膜血管病变)的方法。
附图说明
图1示出了KIF13B的结构域和所使用的截短的结构域的示意图。将未知功能的结构域(DUF)C1[1202-1240个氨基酸(aa)]、C2(1221-1260aa)、C3(1241-1281aa)、C4(1226-1251aa)、C5(1238-1260aa)、C6(1238-1254aa)、C7(1261-1281aa)、C8(1251-1268aa)和C9(1235-1252aa)作为重组蛋白在细菌中表达，并通过拉下测定法测试与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的结合。O、X和三角形分别指示结合、不结合、和部分或不稳定的结合。结合区用虚线框指明。
图2显示了源自于KIF13B的肽抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管生成。人工基质胶柱的苏木精和曙红染色增补有4.4nmol/L VEGF、50ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、60U肝素和0.8×108IFU慢病毒(载体对照、DUF2或DUF2C5或CT)，并s.c.注射到C57BL6小鼠中。数据被表示为平均值±SEM。对于载体对照、DUF2、DUF2C5和CT来说分别为N＝4、4、5和5。*P<0.05(单向方差分析)。CT，KIF13B的1528-1826位残基。
图3显示了DUF2C5抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞(EC)迁移。DUF2C5的抑制效应的特异性通过在TRANSWELL迁移测定法中由不同刺激物引起的EC迁移来确定。朝向2.2nmol/L VEGF、50ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或1μmol/L鞘氨醇-1-磷酸(S1P)迁移的HUVEC通过苏木精染色可视化，并对迁移的细胞的数目进行计数。数据被表示为平均值±SEM。N＝3。*P<0.05(单向方差分析和Bonferroni多重比较检验)。
图4A和图4B显示了DUF2C5在体内抑制血管生成和肿瘤生长。图4A，人类肺癌H460异种移植物在具有重度联合免疫缺损的小鼠中的研究。小鼠每周三次通过尾静脉用10mg/kg DUF2C5(具有C-端酰胺化)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)i.v.处理，并在图中示出了肿瘤尺寸。图4B，在PBS处理的对照和肽处理的肿瘤中，肿瘤中血管的数目。数据被表示为平均值±SEM。在每个组中N＝8。*P<0.05，**P<0.01(t-检验)。
图5A和图5B示出了DUF2C5处理对激光诱导的CNV的效应。图5A，在激光光凝术后通过玻璃体内注射DUF2C5 0.5μg、2μg和10μg，来测试DUF2C5的剂量依赖性效应。新血管形成通过ILB4染色的面积来评估，并在图中作图(在每个组中N＝5只小鼠，并且在每只小鼠中引起4个激光烧伤)。星号指示p<0.05，单向ANOVA。图5B，在CNV模型中测试DUF2C5作为滴眼液的效果。在激光光凝术后，将小鼠每天用对照肽(2μg/眼)或DUF2C5(2μg/眼)处理共2周。新血管形成通过ILB4染色的面积来评估，并在图中作图(在每个组中N＝7只小鼠，并且在每只小鼠中引起4个激光烧伤)。星号指示p<0.05，t-检验。
发明详述
VEGFR2向内皮细胞质膜的递送是血管生成的关键决定因素。VEGFR2信号传导的有效性取决于它在内皮细胞表面处的定位。这在其中存在VEGFR2从高尔基体向VEGFR2的细胞表面池的连续循环的芽生顶端细胞中是明显的。因此，VEGFR2向细胞表面的运输为每一轮通过VEGF的连接所需。已显示分子马达驱动蛋白KIF13B将VEGFR2运输到细胞表面(Yamada等，(2014)J.Cell Sci.127:4518-30)。现在已发现了驱动蛋白衍生的血管生成抑制性(KAI)肽(在实施例中被命名为DUF2C5)，其负显性抑制有缺陷的血管生成。所述KAI肽阻止VEGFR2向细胞表面转运，这是VEGF诱导的内皮细胞芽生特有的特征，因为KAI不影响由SIP或bFGF诱导的内皮细胞迁移。此外，所述KAI肽在体外抑制VEGF诱导的毛细血管网络形成并在体内抑制新血管形成。有利的是，所述KAI肽基于其氨基酸组成是阳离子性的，是水溶性的(>10mg/mL)，并且由于其阳离子性本质是可透过细胞的。此外，所述KAI肽本身对内皮细胞无毒，并且用所述肽i.v.处理的小鼠不经历任何不幸的效应。
因此，本发明提供了一种含有所述KAI肽的肽构建物，以及使用该构建物治疗与血管生成相关的疾病例如癌症和糖尿病视网膜病的方法。出于本发明的目的，术语“构建物”在本文中用于指称已通过重组、化学和/或酶学技术进行修饰，以包含增强所述肽的摄入、稳定性和/或溶解性的一个或多个组成部分的KAI肽。具体来说，所述一个或多个组成部分中的至少一者不天然与所述KAI肽相伴。理想情况下，本发明的构建物是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列并被可操作地连接到1、2、3、4或更多个运载组成部分的KAI肽。或者，本发明的构建物是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列并被可操作地连接到1、2、3、4或更多个稳定化组成部分的KAI肽。此外，本发明的构建物是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列并被可操作地连接到一个或多个运载组成部分和一个或多个稳定化组成部分的KAI肽。在某些实施方式中，单一修饰(N-乙酰化)可以起到运载组成部分和稳定化组成部分两者的作用。
当在本文中使用时，术语“肽”广泛地指称通过肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的序列。应该理解，该术语不暗示特定长度的氨基酸聚合物，它也不打算暗示或分辨所述肽是使用重组技术、化学或酶法合成生产的还是天然存在的。本发明的构建物的KAI肽由至少16、17、18、19、20、21、22、23、24、25至65个氨基酸残基构成，包括其中可衍生的所有范围。倘若与VEGFR2受体的结合得以保留，在6至16个氨基酸残基范围内的更短的肽也可以考虑。理想情况下，所述KAI肽为VEGFR2转运提供了最小的结合位点，并且对其他受体酪氨酸激酶(例如PDGFRα、PDGFRβ和EGFR)不表现出显著的亲和力。具体来说，所述KAI肽包含氨基酸序列Thr-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Glu-Arg-Xaa4-Xaa5-Leu-Ile-Xaa6-Arg-Xaa7-Xaa8-Val-Xaa9(SEQ ID NO：1)或由所述氨基酸序列构成，其中Xaa1是Pro、Ala或Glu，Xaa2是Val、Ala或Ser，Xaa3是Asp或Asn，Xaa4是Leu或Val，Xaa5是Phe或Tyr，Xaa6是Leu或Val，Xaa7是Val、Ala或Thr，Xaa8是Thr或Ala，并且Xaa9是Gln或Arg。更优选地，所述KAI肽包含氨基酸序列Thr-Pro-Xaa1-Asp-Glu-Arg-Xaa2-Xaa3-Leu-Ile-Xaa4-Arg-Val-Xaa5-Val-X aa6(SEQ ID NO：2)或由所述序列构成，其中Xaa1是Val、Ala或Ser，Xaa2是Leu或Val，Xaa3是Phe或Tyr，Xaa4是Leu或Val，Xaa5是Thr或Ala，并且Xaa6是Gln或Arg。本发明的示例性KAI肽在本文中陈述在SEQ IDNO：3和SEQ ID NOs:80-93中(参见表4)。最优选地，所述KAI肽包含氨基酸序列Thr-Pro-Val-Asp-Glu-Arg-Leu-Phe-Leu-Ile-Val-Arg-Val-Thr-Val-Gln(在本文中也使用常规的单字母缩写称为TPVDERLFLIVRVTVQ)(SEQ ID NO：3)或由所述序列构成。
当在本文中使用时，“运载组成部分”是指促进穿越脂质双层、胶团、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、糖类或有机或无机分子。附连到另一个分子的运载组成部分促进所述分子穿越膜，例如从细胞外空间进入细胞内空间，或从胞浆溶质进入到细胞器内。在某些情况下，运载组成部分促进跨越血脑屏障。在某些实施方式中，运载组成部分被共价连接到所述KAI肽的氨基端。在其他实施方式中，运载组成部分被共价连接到所述KAI肽的羧基端。理想情况下，所述运载组成部分是细胞穿透肽、脂质、维生素B12或其组合。
细胞穿透肽(CPP)，也被称为肽转导结构域(PTD)，是已被报道穿越细胞膜的多种类型的肽。该家族的代表性成员例如转录的反式激活物(TAT)肽和穿膜肽，最初作为具有所提出的膜透过性的天然存在的蛋白质内的区段被鉴定到。在某些情况下，所述运载组成部分是被共价结合或融合到所述KAI肽的细胞穿透肽。在某些实施方式中，所述共价连键是肽键。例如，所述细胞穿透肽可以是具有约5至约50个氨基酸例如约5至约10个氨基酸、约10至约15个氨基酸、约15至约20个氨基酸、约20至约25个氨基酸、约25至约30个氨基酸、约30至约40个氨基酸或约40至约50个氨基酸的长度的肽。
细胞穿透肽在本领域中是公知的，并被例如Bechara & Sagan(2013)FEBSLett.587:1693-1702；Copolovici等，(2014)ACS Nano8(3):1972-94；和Guidotti等，(2017)Trends Pharmacol.Sci.38(4):406-24描述。在本发明中使用的示例性细胞穿透肽包括但不限于表1中列出的肽。
表1
正如在实施例6中所描述的，所述DUF2C5肽本身可以穿过细胞膜。所述DUF2C5肽的增强的细胞穿透归因于3个N-端氨基酸残基Ser-Arg-Gly(SEQ ID NO：58)。因此，在某些情况下，所述细胞穿透肽源自于本源KIF13B蛋白序列。源自于KIF13B序列的细胞穿透肽优选地具有氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3(SEQ ID NO：59)，其中Xaa1是Ser或Asn，Xaa2是Lys或Arg，并且Xaa3是Gly或Val。更优选地，所述细胞穿透肽具有氨基酸序列Ser-Xaa1-Gly(SEQ IDNO：60)，其中Xaa1是Lys或Arg。最优选地，所述细胞穿透肽具有氨基酸序列Ser-Arg-Gly(SEQ ID NO：58)。
可选地或此外，所述KAI肽可以包含脂质以促进细胞穿透。当在本文中使用时，脂质一般是指可溶于有机溶剂的水不溶性分子。在某些实施方式中，脂质是脂肪酸，其包含带有酰基的脂族烃链，其中所述脂族链是饱和烷基或具有一个或多个双键的不饱和烷基。典型的脂肪酸包括但不限于月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。脂肪酸被连接或可以被连接到酰基载体例如甘油、鞘氨醇、胆甾醇等。
脂质也可以根据它们的极性被分类成不同的脂质类型。脂质可以是非极性或极性脂质。这些非极性脂质的实例是单、二或三酰基甘油(甘油酯)、脂肪酸的烷基酯、和脂肪醇。极性脂质具有极性头部基团并表现出表面活性，例如脂肪胺、磷脂酸(例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等)、磷脂、糖脂(糖基磷脂酰肌醇)等。在某些形式下，所述脂质被附连或连接到核苷、核苷酸、核酸、氨基酸、蛋白质或糖类。可以附连到所述KAI肽的示例性脂质包括N-肉豆蔻酰基、棕榈酰基和糖基磷脂酰肌醇(参见例如Thompson & Okuyama(2000)Prog.LipidRes.39:19-39；Bauman & Menon(2002)，《脂质、脂蛋白和膜的生物化学》(Biochemistry oflipids,lipoproteins and membranes)，第4版，pp.37-54，Nance & Vance主编，Elsevier，Amsterdam)。优选地，所述KAI肽在N-端氨基酸残基处被肉豆蔻酰化、硬脂酰化或棕榈酰化。更优选地，所述KAI肽在N-端氨基酸残基处被肉豆蔻酰化。
当在本文中使用时，脂质也可以是甾类，一种基于氢化1,2-环戊烯并菲的在C-10、C-13和C-17碳原子处具有取代基的四环化合物。典型的甾类包括但不限于胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、雌甾酮、孕酮、睾酮、雄甾酮、炔诺酮、胆甾醇、地高辛等。本文中所描述的甾类或甾醇可以附连到核苷、核苷酸、核酸、氨基酸、蛋白质、糖类、寡糖、多糖和其他脂质，或者被这些物质修饰。
此外，脂质也可以包括由异戊二烯单元C5H8构成的类异戊二烯。类异戊二烯化合物包括各种不同的天然存在的和合成的萜烯，其可以是直链的，或者更通常是环状的，包括二环、三环和多环。示例性的类异戊二烯化合物包括例如香叶醇、香茅醛、姜烯、β-檀香醇(santanol)、β-杜松烯(cadiene)、母菊苷、古巴烯、莰烯、紫杉醇、类胡萝卜素、甾类等。类异戊二烯可以被附连到其他分子，包括但不限于核苷、核苷酸、核酸、氨基酸、蛋白质、糖类、寡糖和多糖。例如，异戊二烯化的肽可以通过将类异戊二烯脂质单元法呢基(C15)或香叶基香叶基(C20)通过半胱氨酸的硫醚键附连在所述KAI肽的羧基端处或其附近来制备。也设想了使用可逆水相脂质化技术(REAL)。参见Mahajan等，(2014)IndianJ.Pharmaceut.Ed.Res.48:34-47。
在胃肠道中存在用于摄入饮食分子的特异性摄入机制。在维生素B12的情况下，特异性结合蛋白被释放到肠道中，它在肠道腔中结合到它的配体。哺乳动物具有用于相对大的维生素B12分子的吸收和细胞摄入的运输机制，其依赖于复合到被称为内在因子的天然存在的转运蛋白。利用这种运输机制，将维生素B12通过酸水解的丙酰胺侧链的羧基偶联到黄体生成激素释放激素的D-Lys-6-类似物，并显示出将所述黄体生成激素释放激素类似物递送到血液中(参见US 5,428,023和US5,807,832)。同样地，US 5,574,018教导了将维生素B12通过在维生素B12的核糖组成部分的伯羟基位点处共价键合，偶联到红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子和复合干扰素。此外，US 2011/0092416教导了将维生素B12偶联到有治疗活性的多肽例如胰岛素、酪氨酸-酪氨酸肽(PYY)、神经肽Y(NPY)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，其中所述多肽被共价附连到维生素B12的核糖组成部分的伯(5′)羟基的二羧酸衍生物。此外，WO 2016/187512教导了将维生素B12偶联到GLP-1的12位处的叠氮基赖氨酸，并且随后与内在因子的复合保护了这种肽免于蛋白酶降解。因此，在某些实施方式中，所述KAI肽被偶联到维生素B12。
或者，所述KAI肽可以包含其他修饰以促进细胞摄入。例如，将给定的肽环化和/或将选定的酰胺键的氮甲基化，可以提高它的膜透过性和/或生物利用度。这些修饰在被明智而审慎地做出时，据认为对膜内部的低介电环境作出响应促进分子内氢键的形成(Bockus等，(2013)Curr.Top.Med.Chem.13:821–836；Rezai等，(2006)J.Am.Chem.Soc.128:14073–14080；White等，(2011)Nat.Chem.Biol.7:810–817)。除了透过性之外，环化还可以提高稳定性。事实上，已发现环化形式的DUF2C5是稳定的并结合到VEGFR2，而对照环状肽不结合。因此，在某些实施方式中，将本发明的KAI肽环化。所述KAI肽可以头与尾环化、头/尾与侧链环化、或侧链与侧链环化。环化通常通过内酰胺化、内酯化和基于硫化物的桥接来实现。
也已提出用各种不同的无机材料转运蛋白质货物，包括二氧化硅、碳纳米管、量子点和金纳米粒子(Du等，(2012)Curr.Drug Metab.13:82–92；Malmsten(2013)Curr.Opin.Colloid Interface Sci.18:468–480)。此外，N-甲基化可用于降低氢键形成的可能性。
当在本文中使用时，“稳定化组成部分”是指减少所述KAI肽的蛋白水解、降低其肾清除率、提高其口服生物利用度、增加其与VEGFR2的结合和/或延长其半衰期的多肽、多核苷酸、糖类或有机或无机分子。在某些实施方式中，稳定化组成部分被共价连接到所述KAI肽的氨基端。在其他实施方式中，稳定化组成部分被共价连接到所述KAI肽的羧基端。理想情况下，所述稳定化组成部分是肽、翻译后修饰、非天然氨基酸残基、大分子或其组合。
在某些实施方式中，所述稳定化组成部分可以是源自于本源KIF13B蛋白序列的肽。源自于所述KIF13B序列的稳定化组成部分优选地具有例如氨基酸序列Leu-Ser-His-Pro(SEQ ID NO：61)或Leu-Ser-His-Pro-Ala-Asp(SEQ ID NO：62)。
血液/血浆、肝或肾中的大量蛋白水解酶从N-和/或C-端分解肽序列。N-或/和C-端的翻译后修饰通常可以提高肽的稳定性。例如，N-乙酰化和C-酰胺化可以提高对蛋白水解的抗性。例如，N-端乙酰化的生长抑素类似物据报道比本源肽稳定得多(Adessi & Soto(2002)Curr.Med.Chem.9(9):963–78)。同样地，N-乙酰化的GLP-1的7-34形式已显示出比未保护的肽稳定得多(John等，(2008)Eur.J.Med.Res.13(2):73–8)。此外，N-乙酰化和C-酰胺化当与氨基酸替换联合使用时，提高EFK17肽对内肽酶消化的抗性(Stroemstedt等，(2009)Antimicrob.Agents Chemother.53(2):593–602)。此外，具有附连到N-端酪氨酸残基的己烯酰基的替莫瑞林，具有比天然生长激素释放激素长得多的半衰期(Ferdinandi等，(2007)Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.100(1):49–58)。在某些实施方式中，所述KAI肽包括N-乙酰化和/或C-酰胺化作为稳定化组成部分。
将天然氨基酸残基用非天然残基替换可以降低蛋白水解酶的底物识别和结合亲和性并提高稳定性。例如，在健康志愿者中，用D-Arg代替血管升压素的L-Arg的实例将这种肽的半衰期从人类中的10–35分钟提高到3.7小时(Agerso等，(2004)Br.J.Clin.Pharmacol.58(4):352–8)。同样地，用D-氨基酸替换L-氨基酸将生长抑素的体内半衰期从几分钟提高到1.5小时(Harris(1994)Gut 35(3):S1-4)。天然氨基酸的修饰也可以通过引入空间位阻来提高肽的稳定性。例如，促性腺激素释放激素具有非常短的半衰期(数分钟)，而其中一个Gly被叔丁基-d-Ser代替并且另一个Gly被乙酰胺替换的布舍瑞林，在人类中具有长得多的半衰期。伊帕瑞林这种五肽具有2′-萘基丙氨酸和D构型的苯丙氨酸并且C-端L-丙氨酸被2-氨基异丁酸代替，导致在人类中约2小时的提高的终末半衰期(Raun等，(1998)Eur.J.Endocrinol.139(5):552–61；Gobburu等，(1999)Pharm.Res.16(9):1412–6)。
偶联到大分子(例如聚乙二醇(PEG)或白蛋白)是提高肽的稳定性并减少肾清除率的有效策略。例如，将结合白蛋白的小分子共价附连到肽，可以通过所述高度结合性小分子与白蛋白发生间接相互作用，来减少肾小球过滤、提高蛋白水解稳定性并延长半衰期。利拉鲁肽是一种通过γ-l-谷氨酰基间隔物连接到16碳脂肪酸残基的GLP-1类似物。所述脂蛋白结合到白蛋白，由此降低蛋白水解和肾清除率，并将半衰期从几分钟提高到8小时(Hou等，(2012)J.Cereb.Blood Flow Metab.32(12):2201–10；Levy Odile等，(2014)PLoS One 9(2):e87704；Lindgren等，(2014)Biopolymers 102(3):252–9)。
将肽偶联到大的合成或天然聚合物或糖类可以提高它们的分子量和流体力学体积，从而减少它们的肾清除率。常用于肽偶联的聚合物是PEG、聚唾液酸(PSA)和羟乙基淀粉(HES)。一个实例是peginesatide，一种PEG化的合成肽，其在健康志愿者中具有18.9小时的消除半衰期(Bronson等，(2013)Annu.Rep.Med.Chem.48:471–546)。当在本文中使用时，“聚乙二醇”或“PEG”是通式为H-(O-CH2-CH2)n-OH的聚醚化合物。PEG也被称为聚乙烯氧化物(PEO)或聚氧乙烯(POE)，取决于它们的分子量，PEO、PEE或POG当在本文中使用时是指氧化乙烯的寡聚物或聚合物。这三个名称在化学上是同义的，但PEG倾向于指称分子质量低于20,000Da的寡聚物和聚合物，PEO指称分子质量高于20,000Da的聚合物，并且POE指称任何分子质量的聚合物。所述聚合物组成部分优选为水溶性(两亲或亲水的)、无毒且药物惰性的。适合用作稳定化组成部分的聚合物分子包括聚乙二醇(PEG)、PEG的均聚物或共聚物、PEG的单甲基取代的聚合物(mPEG)或聚氧乙烯甘油(POG)。也涵盖了出于半衰期延长的目的而制备的PEG，例如单活化的烷氧基封端的聚亚烷基氧化物(POA)例如单甲氧基封端的聚乙二醇(mPEG)，也考虑到了双活化的聚乙烯氧化物(二元醇)或其他PEG衍生物。出于本发明的目的，通常选择分子量实质上在约200Da至约40,000Da或约200Da至约60,000Da的范围内变化的适合的聚合物。在某些实施方式中，使用分子量为200至2,000或200至500的PEG。
也可以利用具有不同几何形状的PEG：支链PEG具有发源于中央核心基团的3至10个PEG链；星状PEG具有发源于中央核心基团的10至100个PEG链；蜂窝状PEG具有通常接枝在聚合物骨架上的多个PEG链。PEG也可以是直链的。通常包括在PEG的名称中的数字指示了它们的平均分子量(例如具有n＝9的PEG将具有大约400道尔顿的平均分子量，并且将被标注为PEG 400)。当在本文中使用时，“PEG化”是将PEG结构共价偶联到本发明的KAI肽的行为，所述KAI肽然后被称为“PEG化的KAI肽”。在某些实施方式中，PEG化侧链的PEG是分子量为约200至约40,000的PEG。
血浆蛋白质例如白蛋白和免疫球蛋白(IgG)片段在人类中具有19–21天的长的半衰期(Pollaro&Heinis(2010)Med.Chem.Comm.1(5):319–24)。由于高的MW(67–150kDa)，这些蛋白质具有低的肾清除率，并且它们结合到新生儿Fc受体(FcRn)降低了被血管上皮通过胞饮作用消除。将KAI肽共价连接到白蛋白或IgG片段可以降低肾清除率并延长半衰期。例如，白蛋白-艾塞那肽-4偶联物(CJC-1134-PC)在人类中具有～8天的半衰期，并且被FDA批准的药物阿必鲁肽是融合到人类白蛋白的DPPIV抗性GLP-1二聚体，其具有6–7天的半衰期，因此能够每周给药用于2型糖尿病的治疗(Pratley等，(2014)Lancet DiabetesEndocrinol.2(4):289–97)。
当所述运载组成部分和/或稳定化组成部分是肽时，所述肽可以通过肽键容易地直接附连或偶联到所述KAI肽。然而，在所述运载组成部分和/或稳定化组成部分不是肽的情况下，所述运载组成部分和/或稳定化组成部分可以通过其他常规连键例如二硫化物、酰胺、肟、噻唑烷、脲和羰基连键或Diels-Alder或Hüisgen 1,3-偶极环加成反应附连到所述KAI肽(Lu等，(2010)Bioconjug.Chem.21:187–202；Roberts等，(2002)Adv.DrugDeliv.Rev.54:459-76；WO 2008/101017)。
或者，本发明的构建物可以包括连接物以将运载组成部分和/或稳定化组成部分联结或连接到所述KAI肽。出于本发明的目的，连接物是具有任何各种不同的氨基酸序列的肽。作为间隔肽的连接物可以具有柔性本质，尽管不排除其他化学连键。连接物肽可以具有约1至约40个氨基酸的长度，例如约1至约5个氨基酸、约5至约10个氨基酸、约10至约20个氨基酸、约20至约30个氨基酸或约30至约个氨基酸的长度。这些连接物可以使用合成的编码连接物的寡核苷酸产生，以偶联所述蛋白质。可以使用具有一定程度的柔性的肽连接物。所述连接肽事实上可以具有任何氨基酸序列，其中在某些实施方式中，所述连接物肽将具有产生总体上柔性的肽的序列。小氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸的使用，可用于产生柔性肽。这些序列的产生对于本领域技术人员来说是常规技术。各种不同的连接物是可商购的，并且被认为适于使用。
可用于将运载组成部分和/或稳定化组成部分联结或连接到所述KAI肽的示例性柔性连接物包括甘氨酸聚合物(G)n(例如其中n是1至约20的整数)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、GSGGSn(SEQ ID NO：63)和GGGSn(SEQ ID NO：64)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域中已知的其他柔性连接物。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是特别感兴趣的，因为这两种氨基酸都是相对松散的，因此可以充当组分之间的中性系链。在某些实施方式中使用甘氨酸聚合物。参见Scheraga(1992)Rev.Computational Chem.11173-142。示例性的柔性连接物包括但不限于GG、GGG、GGS、GGSG(SEQ ID NO：65)、GGSGG(SEQ ID NO：66)、GSGSG(SEQ ID NO：67)、GSGGG(SEQ ID NO：68)、GGGSG(SEQ ID NO：69)、GSSSG(SEQ ID NO：70)等。
非肽连接物组成部分也可用于将运载组成部分和/或稳定化组成部分联结或连接到所述KAI肽。所述连接物分子通常长约6-50个原子。所述连接物分子也可以是例如芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。根据本公开，可以使用可结合到肽的其他连接物分子。
本文中提供了包含可操作地连接、偶联或联结到一个或多个运载组成部分和/或一个或多个稳定化组成部分的KAI肽的示例性构建物。参见例如实施例7-8和SEQ ID NO：94-138。然而，不背离本发明的范围，所述构建物也涵盖在SEQ ID NO：1的KAI肽中具有一个或多个缺失、添加和/或替换的KAI肽，其保留所述肽的至少一种功能性质。例如，可以对SEQID NO：1的KAI肽进行修饰，使得所述氨基酸序列具有一个或多个保守氨基酸替换、氨基酸插入、氨基酸缺失、羧基端截短或氨基端截短。在某些实施方式中，本领域技术人员可以通过靶向据信对活性不重要的区域，来鉴定所述KAI肽的可以被改变而不破坏活性的适合区域。在其他实施方式中，甚至是对生物活性或结构来说重要的氨基酸残基也可以进行保守氨基酸替换，而不破坏其生物活性或对所述肽的结构没有不利影响。例如，在一个或多个事件中，可以将Arg用Lys代替和/或可以将Thr用Ser代替。在一个实施方式中，变体KAI肽与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％的氨基酸序列一致性。通常，变体KAI肽表现出与SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的KAI肽基本上相同或更高的结合亲和性，例如至少0.75X、0.8X、0.9X、1.0X、1.25X或1.5X的结合亲和性。在某些实施方式中，KAI肽或其变体具有约10pM至约1μM、或者更优选地约10pM至约100nM、或者最优选地约10pM至约10nM范围内的KD值。
在某些实施方式中，所述肽被糖基化、磷酸化、硫酸化、酰胺化、羧化或乙酰化。例如，C-端可以用酰胺化、添加肽醇和醛、添加酯、添加对硝基苯胺和硫酯进行修饰。N-端和氨基酸侧链可以通过PEG化、乙酰化、甲酰化、添加脂肪酸、添加苯甲酰基、添加溴代乙酰基、添加焦谷氨酰基、琥珀酰化、添加四丁氧基羰基和添加3-巯基丙基、酰化、生物素化、磷酸化、硫酸化、糖基化、引入马来酰亚胺基、螯合组成部分、发色团和荧光团进行修饰。
所述KAI肽和构建物可以使用重组DNA技术重组合成。因此，在另一方面，本发明提供了编码本发明的KAI肽或构建物的多核苷酸。在相关方面，本发明提供了带有编码所述KAI肽或构建物的多核苷酸的载体，特别是表达载体。在某些实施方式中，所述载体提供促进所述KAI肽或构建物在真核或原核细胞中的重组合成的复制、转录和/或翻译调控序列。因此，本发明还提供了用于所述KAI肽或构建物的重组表达的宿主细胞以及收获和纯化由所述宿主细胞产生的KAI肽或构建物的方法。重组多肽的生产和纯化对于本领域技术人员来说是常规操作。所述KAI肽或构建物可以通过本领域中已知的任何任何的方法来纯化，包括但不限于凝胶过滤和亲和纯化。当本发明的KAI肽或构建物以融合蛋白的形式生产时，在进一步分析之前可以任选地使用蛋白酶将所述融合组成部分(或表位标签)切掉。
或者，本发明的KAI肽或构建物可以有利地通过本领域中已知的任何化学合成技术来合成，特别是固相合成技术，例如使用可商购的自动化肽合成仪。参见例如Stewart和Young，1984，《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Synthesis)第二版，Pierce ChemicalCo.；Tarn等，(1983)J.Am.Chem.Soc.105:6442；Merrifield(1986)Science232:341-347；以及US 5,424,398。此外，也设想了重组和化学合成技术的组合。
除了KAI肽和构建物之外，本发明还涵盖了结合试剂例如抗体、抗体片段或适体，其特异性结合SEQ ID NO：1的KAI肽、SEQ ID NO：2的肽或SEQ ID NO：3的肽，并且不结合到相似或相关的蛋白例如VEGFR1。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛的意义上可互换使用，并且包括单克隆抗体(例如全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们表现出所需生物活性即可)，并且也可以包括某些抗体片段。抗体可以是嵌合的、人类的、人源化的和/或亲和成熟的。“抗体片段”包括完整抗体的仅仅一部分，其中所述部分优选地保留当存在于完整抗体中时通常与该部分相关的至少一种功能，优选大多数或所有功能，特别是结合到所述KAI肽的功能。
KAI肽结合试剂可以通过任何适合的常规方法来生产。例如，在所述结合试剂是抗体的情况下，将所述KAI肽用于免疫例如小鼠或兔，并通过常规流程产生单克隆或多克隆抗体。这些抗体的片段例如Fab片段、双特异性scFv片段、Fd片段和通过Fab表达文库产生的片段，也可以被产生并用作KAI肽结合试剂。KAI肽结合试剂可用于治疗疾病的免疫治疗方法中以及所述KAI肽的检测和纯化中。
许多疾病(被表征为“血管生成疾病”)由引起血管供应过量的持续的不受调控或异常的血管生成驱动。例如，眼的新血管形成已被暗示是失明的最常见病因。在某些现有的病症例如关节炎中，新形成的毛细血管侵入关节并破坏软骨。在糖尿病中，在视网膜中形成的新的毛细血管侵入玻璃体，出血，并引起失明。实体肿瘤的生长和转移也是依赖于血管生成的(Folkman(1986)Cancer Res.46:467-473；Folkman(1989)J.Natl.Cancer Inst.82:4-6)。例如，已显示增大到超过2mm的肿瘤必须获得它们自身的血液供应，并且通过诱导新毛细血管的生长做到这一点。一旦这些新的血管被包埋在肿瘤内之后，它们为肿瘤细胞提供了进入循环并转移到远处位点例如肝、肺和骨骼的手段(Weidner等，(1991)N.Engl.J.Med.324(1):1-8)。
血管生成据信参与刺激和抑制内皮细胞这种毛细血管的主要细胞的生长的分子的复杂相互作用。在正常条件下，这些分子似乎将微血管系统长期维持在沉寂状态(即无毛细血管生长的状态)。然而，在必要时(例如在伤口修复期间)，这些细胞可以在短期内经历快速的增殖和更新。尽管血管生成在正常条件下是高度受控的过程，但许多病症(被表征为“血管生成疾病”)由持续的不受调控的血管生成驱动。换句话说，不受调控的血管生成可能直接引起特定的病理状况或加重现有的病理状况。
正如在本文中所证实的，含有所述KAI肽的构建物具有抗血管生成活性。作为血管生成抑制剂，这些肽和构建物可用于在以血管供应过量为特征的对象中抑制血管生成并治疗疾病或病症。具体来说，本发明的KAI肽和构建物可用于治疗原发和转移实体肿瘤两者，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰腺、肝、胆囊和胆管、小肠、泌尿道(包括肾、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括宫颈、子宫和卵巢以及绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺(包括甲状腺、肾上腺和垂体腺)和皮肤的癌，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤(包括从骨骼和软组织产生的肉瘤以及卡波斯肉瘤)和脑、神经、眼和脑膜的肿瘤(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤和脑膜瘤)。这些肽和构建物也可用于治疗由造血恶性肿瘤例如白血病引起的实体肿瘤(即绿色瘤、浆细胞瘤和蕈样肉芽肿的斑块和肿瘤和皮肤T-细胞淋巴瘤/白细胞)，以及用于治疗淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金淋巴瘤两者)。此外，所述KAI肽和构建物在单独或与放疗和/或其他化学治疗剂相组合使用时，可用于预防来自于上述肿瘤的转移肿瘤。
所述KAI肽和构建物的其他用途包括治疗和预防自体免疫疾病例如类风湿性、免疫和变性关节炎，皮肤病例如银屑病，血管疾病例如血管瘤和动脉粥样硬化斑块内的毛细血管增殖，肺纤维化，Osler-Webber综合征，心肌血管生成，哮喘，斑块新血管形成，毛细血管扩张，血友病关节，血管纤维瘤，眼病和创面肉芽。其他用途包括治疗以内皮细胞的过量或异常刺激为特征的疾病，包括但不限于肠粘连、克罗恩病、动脉粥样硬化、硬皮病和增生性瘢痕、即瘢痕疙瘩。另一种用途是通过抑制排卵和胎盘的建立而作为避孕剂。本发明的KAI肽和构建物也可用于治疗具有血管生成作为病理结果的疾病，例如猫抓病(Rocheleminutesalia quintosa)和溃疡(幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori))。本发明的KAI肽和构建物通过在手术、特别是用于治疗可切除肿瘤的手术之前给药，也可用于减少出血。
符合本发明的治疗方法，通过向患有以过量或异常的血管供应为特征的疾病或病症的对象给药有效量的所述KAI肽、构建物或含有它们的药物组合物来进行。当在本文中使用时，术语“给药”是指将药剂递送到患者的过程。给药的过程可以随着一种或多种药剂和所需的效果而变。给药可以通过适合于所述治疗药剂的任何手段来实现，例如通过口、肠胃外、粘膜、肺、表面、基于导管、直肠、颅内、脑室内、脑内、阴道内或子宫内递送。肠胃外递送可以包括例如皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、和注射到器官的组织特别是肿瘤组织中。粘膜递送可以包括例如鼻内递送。口或鼻内递送可以包括推进剂的给药。肺递送可以包括药剂的吸入。基于导管的递送可以包括通过基于离子电渗导管的递送。口服递送可以包括包衣丸剂的递送或液体通过口的给药。给药通常也可以包括使用可药用载体的递送，所述可药用载体例如缓冲剂、多肽、肽、多糖偶联物、脂质体和/或脂质。基因治疗方案也被认为是给药，其中治疗药剂是当在患者中表达为转录本或肽时能够实现治疗目的的多核苷酸。
在某些实施方式中，本发明提供了一种通过向需要治疗的对象给药有效量的KAI肽或含有它的构建物来治疗眼部疾病或病症的方法。具体来说，所述KAI肽或构建物可用于治疗眼部疾病例如早产儿的视网膜病、角膜移植物排斥、晶状体后纤维增生症、新生血管性青光眼、虹膜红变、增殖性糖尿病视网膜病、缺血性视网膜病、眼内新血管形成、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、脉络膜新血管形成、糖尿病黄斑水肿、糖尿病视网膜缺血、新生血管性老年性黄斑变性(AMD)、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、色素性视网膜炎、虹膜红变、与血管生成相关的视力缺损或视力丧失(失明)、成视网膜细胞瘤、葡萄膜炎和角膜移植物新血管形成、与感染或手术干预相关的眼中的血管生成、和眼的其他异常新血管形成病症。
在特定实施方式中，本发明提供了一种通过向需要治疗的对象给药有效量的KAI肽或含有它的构建物来治疗黄斑变性、包括湿性和干性黄斑变性的方法。当异常的血管在黄斑后方生长时，发生湿性黄斑变性。这些血管是脆弱的并可能泄漏体液和血液，引起黄斑的瘢痕形成并提高快速严重损伤的可能性。玻璃膜通常在脉络膜小疣沉积物附近破裂。这是发生新血管生长或新血管形成的场所。中央视力可能在短时期内，有时在数天内变得失真或完全丧失。
“治疗”患有疾病或病症的患者意味着实现下述结果中的一者或多者：(a)减轻所述疾病的严重性；(b)停止所述疾病或病症的发展；(c)抑制所述疾病或病症的恶化；(d)在以前患过所述疾病或病症的患者中限制或阻止所述疾病或病症的复发；(e)引起所述疾病或病症的减退；(f)改善或消除所述疾病或病症的症状；和(g)提高存活。尽管所述对象可以是任何哺乳动物物种，但在某些实施方式中，所述待治疗的对象是人类，并且所述疾病或病症是炎性疾病、癌症或视网膜血管病变。
血管生成或血管供应的程度可以使用本领域中已知的、例如在本文中描述的方法来确定，并且可以定性或定量进行。例如，可以利用癌症或肿瘤生长的分子或细胞标志物。血管生成的程度也可以通过测量生物样品中内皮细胞增殖的量或血管生长的程度来确定。这些方法既可用于鉴定需要治疗的对象也可用于监测治疗效能。
所述KAI肽或含有它的构建物理想情况下作为药物组合物给药，所述药物组合物含有所述KAI肽或构建物和可药用赋形剂。适合的制剂描述在本领域技术人员公知且可以容易地获得的大量来源中。例如，《Remington药物学科学与实践》(Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy)(Alfonso R.Gennaro主编，第20版，Lippingcott Williams &Wilkins:Philadelphia,PA,2000)描述了可以与本发明相结合使用的制剂。所述KAI肽或构建物可以被并入到常规的系统性剂型例如片剂、胶囊、软明胶胶囊、酏剂或可注射制剂中。所述剂型也可以包含必要的生理上可接受的赋形剂、载体材料、润滑剂、缓冲剂、表面活性剂、抗细菌剂、增量剂(例如甘露糖醇)、抗氧化剂(抗坏血酸或亚硫酸氢钠)等。可接受的制剂材料优选地在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒。
所述药物组合物可以含有用于改变、维持或保留例如组合物的pH、渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或透过的制剂材料。适合的制剂材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)，抗微生物剂，抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)，缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)，增量剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)，螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))，络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)，填充剂，单糖、二糖和其他糖类(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)，蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)，着色剂、调味剂和稀释剂，乳化剂，亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)，低分子量多肽，成盐平衡离子(例如钠)，防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)，溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)，糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)，悬浮剂，表面活性剂或润湿剂(例如PLURONICS、PEG、失水山梨糖醇酯、聚山梨酸酯例如聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80、Triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆甾醇或tyloxapal)，稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)，渗透压增强剂(例如碱金属卤化物优选为氯化钠或氯化钾、甘露糖醇或山梨糖醇)，递送介质，稀释剂，和/或药用辅料。
药物组合物中的主要介质或赋形剂在本质上可以是水性或非水性的。例如，适合的介质或赋形剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊液，并可能增补有在用于肠胃外给药的组合物中常见的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性介质。药物组合物可以包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其可以进一步包含山梨糖醇或其适合的替代物。通过将所选的具有所需纯度的组合物与任选的配制剂混合，可以将药物组合物制备成冻干饼或水溶液的形式用于储存。此外，所述KAI肽或构建物可以使用适合的赋形剂例如蔗糖配制成冻干物。
所述KAI肽或构建物可以被并入到适合于眼部给药的药物组合物中。通常，所述组合物包含可药用眼科赋形剂。所述眼科赋形剂可以是缓冲剂、渗透压调节剂、润湿剂和/或抗氧化剂。所述缓冲剂可以是硼酸和/或磷酸。所述渗透压调节剂可以提供等渗环境，并且可以包括氯化钠、氯化钾、氯化镁和/或硼酸。抗氧化剂包括例如焦亚硫酸钠和EDTA。所述抗氧化剂可用于帮助使所述组合物稳定。润湿剂包括聚乙烯醇(PVA)和聚山梨酸酯80，可以允许所述组合物遍布眼睛。其他眼科赋形剂包括苯扎氯铵(BAK)、乙二胺四乙酸(EDTA)、碳酸钠、氯丁醇、甘油、葡聚糖70、丙二醇和聚乙二醇例如PEG-400。所述眼科赋形剂可以是软膏，例如矿物油、白凡士林、白软膏或羊毛脂。与水性介质相似，凡士林和矿物油可以在软膏制剂中充当介质以增加眼部接触时间。这些成分可能有助于在眼球表面上方形成闭合薄膜，并通过增强黏蛋白和水性层来改进泪膜的组成。所述眼科赋形剂可以提供黏蛋白样性质和/或减少由蒸发造成的水性层损失。所述眼科赋形剂可以起到载体例如可药用载体的作用。
无菌性通常通过常规的用于水性制剂的眼科防腐剂例如氯丁醇、苯扎氯胺、鲸蜡基氯化吡啶、苯基汞盐、硫柳汞等来维持，并且以无毒性的量使用，所述量通常在以所述水性溶液的重量计约0.001％至约0.1％之间变化。用于软膏的常规防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和丙酯。典型的软膏基料包括白凡士林和矿物油。为了进一步说明本发明，提供了下述非限制性实例。
所述药物组合物可以通过快速浓注给药，或通过输注或通过植入装置连续给药。所述药物组合物也可以通过其上吸附或包封有所需分子的膜、海绵或另一种适合的材料的植入，局部地给药。在使用植入装置的情况下，所述装置可以被植入到任何适合的组织或器官中，并且所述所需分子的递送可以通过扩散、定时释放丸剂或连续给药进行。
所述制剂可以存在于单剂容器或多剂容器例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在使用之前用无菌液体载体例如注射用水调制。即用型注射溶液和悬液可以从无菌粉剂、颗粒剂、片剂等制备。应该理解，除了上面具体提到的成分之外，本发明的制剂可以包含本领域中常规的与所讨论的制剂类型相关的其他试剂。
在一个实施方式中，所述KAI肽或构建物在持续释放制剂中递送，所述制剂提供延长的释放和延长的半衰期。适合于使用的持续释放系统包括但不限于扩散受控、溶剂受控和化学受控的系统。扩散受控系统包括例如储库装置，其中将所述KAI肽或构建物包封在装置内，使得所述KAI肽或构建物的释放由通过扩散阻挡层的渗透来控制。常见的储库装置包括例如膜、胶囊、微胶囊、脂质体和中空纤维。单片式(基质)装置是第二种类型的扩散受控系统，其中将所述KAI肽或构建物分散或溶解在控制速率的基质(例如聚合物基质)中。所述KAI肽或构建物均匀分散在整个控制速率的基质中，并且释放速率由通过所述基质的扩散来控制。适合用于所述单片式基质装置的聚合物包括天然存在的聚合物、合成聚合物和合成改性的天然聚合物，以及聚合物衍生物。
本发明的KAI肽或构建物也可以以脂质体递送系统例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡的形式给药。脂质体可以由各种不同的磷脂例如胆甾醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。在某些实施方式中，所述制剂包括具有KAI肽或构建物的脂质体，所述KAI肽或构建物与所述脂质体的表面结合或被包封在所述脂质体内。可以对预先形成的脂质体进行修饰，以与所述KAI肽或构建物结合。例如，阳离子型脂质体通过静电相互作用与所述KAI肽或构建物结合。可选地，可以向预先形成的脂质体添加附连到亲脂性化合物例如胆甾醇的KAI肽或构建物，由此胆甾醇变得与所述脂质体膜结合。或者，所述KAI肽或构建物可以在脂质体形成期间与所述脂质体结合。
固体脂质纳米粒子(SLN)也可以用作胶体递送系统例如脂质乳液、脂质体和聚合物纳米粒子的可选体药物递送系统。可以使用用于SLN的配制、制备方法、除菌和冻干的各种不同脂质基质、表面活性剂和其他赋形剂。载体的捕获效率及其对各种不同组合物的物理参数、肽释放和释放机制的影响，被综述并讨论在Manjunath等，(2005)Methods FindExp Clin Pharmacol 27(2):127中。
所述KAI肽或构建物的眼给药可以使用眼内植入物、玻璃体内注射、系统性给药、表面施用、纳米粒子、微粒、滴眼液、生物粘附性凝胶或血纤蛋白密封剂、调节上皮细胞屏障复合物的渗透性的多糖、增强角膜药物递送的肽、粘膜给药例如使用生物载体聚合物的给药、水性眼科喷雾剂和电动力眼喷雾治疗来进行。
所述KAI肽或构建物的治疗有效和最适剂量范围可以使用本领域中已知的方法来确定。构成“有效量”或“治疗有效量”的KAI肽或构建物的量，可以随着所述疾病的严重性、待治疗患者的状况、体重或年龄、给药频率或给药途径而变，但可以由本领域普通技术人员按常规确定。临床医生可以确定给药剂量或途径以获得最佳治疗效果。取决于上面提高的因素，典型的剂量在约0.1μg/kg直至约100mg/kg体重或更高的范围内。在某些实施方式中，剂量可以在0.1μg/kg直至约100mg/kg或1μg/kg直至约100mg/kg或5μg/kg直至约100mg/kg体重的范围内。可以被给药的药物制剂可以包含量为例如1-10,000mg、10-1000mg、50-900mg、100-800mg或200-500mg的KAI肽或构建物。
为了增强治疗，本文公开的KAI肽或构建物可以与至少一种另外的治疗剂相组合使用，以便治疗癌症、肿瘤或其他增殖性障碍。所述另外的药剂可以与所述KAI肽或构建物相组合或轮流给药。所述药物可以形成统一组合物的一部分，或者可以作为分开的组合物提供，用于在同时或不同时间给药。所述第二种治疗剂可以包括但不限于类视黄醇、干扰素、抗肿瘤药、辐射、抗有丝分裂剂例如靶向细胞骨架元件的药剂(包括微管调节剂、鬼臼毒素或长春花生物碱)、抗代谢物药物、嘌呤类似物、烷化剂、靶向DNA的药物例如蒽环类药物、靶向拓扑异构酶的药物、激素和激素激动剂或拮抗剂、靶向肿瘤细胞中的信号转导的药物包括抗体衍生物、潜在影响肿瘤的转移的药物例如基质金属蛋白酶抑制剂、基因疗法和反义药剂、抗体治疗剂、皮质甾类、甾类类似物、消炎药和止吐药。第二种治疗剂的实例公开在表2中。
表2
此外，用于治疗眼部疾病或病症的KAI肽或构建物的给药可以与其他程序例如植入式望远镜、激光光凝术和黄斑转位手术相组合。
本发明的KAI肽、构建物或组合物的效能可以使用目标疾病或病症的任何适合的模型来评估。具体来说，可以使用本领域中已知的血管生成测定法。参见例如US 2003/0077261，其中描述了大鼠主动脉环、牛、小鼠和人的血管生成测定法。可以使用例如在US2003/0077261中所描述的环微血管生成的定量，其中使用与OLYMPUS BX60显微镜相连的数字视频摄像机对环培养物进行摄像，并使用Image Pro Plus软件选择性测量和检测生成区域。可以使用在Paris等人的US2003/0077261中描述的内皮细胞迁移测定法，其中使用改良的Boyden仓室测定法(BD BioCoat人工基质胶侵入仓室)评估人脑成年内皮细胞的迁移。可以使用例如在US 2003/0077261中所描述的裸小鼠肿瘤异种移植物模型，其中将A-549(人类肺腺癌)和U87-MG(人类成胶质细胞瘤)细胞植入到8周龄雌性裸小鼠中。在用KAI肽或构建物治疗之前、之后和期间测量所述动物中生长的肿瘤。在每个体内抗肿瘤研究的结束日，摘取肿瘤并对微血管进行定量。
本发明通过下述非限制性实施例更详细描述。
实施例1：材料和方法
抗体和试剂。使用了针对KIF13B(Sigma,St.Louis,MO)、VEGFR2的细胞外结构域(Fitzgerald,Acton,MA)、E-标签(Abcam,Cambridge,MA)、在KIF13B中VEGFR2结合位点分析的基础上的von Willebrand因子(Millipore,Temecula,CA)和CD31(Abcam)的抗体。第二抗体是辣根过氧化物酶偶联的驴抗兔抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)、ALEXA-594偶联的抗兔抗体(Life Technologies,Carlsbad,CA)。还使用了WST-1(Roche,Basel,Switzerland)和末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)试剂盒(Life Technologies)。
质粒。人类KIF13B cDNA购自Kazusa DNA Institute(Chiba,Japan)。带有His-标签和S-标签的截短的突变体按照标准方法在细菌中表达。慢病毒和重组蛋白如Yamada等所述来生产((2014)J.Cell Sci.127:4518-30)。
肽。肽由Pierce Biotechnology(Rockford,IL)定制合成，其具有通过反相高效液相色谱和质谱术确认的95％的纯度。将批量生产的肽在玻璃小瓶中分成等分试样(每个小瓶25mg)，并在赋形剂中保持在-20℃下。在酸性条件下(通过添加<10％无菌乙酸)溶解在无菌水中之后，通过添加无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)来调节pH，并将在无菌PBS中的10mg/mL的肽分成等分试样并保持在-20℃冰箱中。一旦融化后，肽溶液在2至3天内使用。
细胞培养。将人类原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)(Lonza,Walkersville,NJ)在0.1％明胶(Sigma)包被的培养皿上，维持在增补有10％FBS的EGM-2(Lonza)中。将第4～6次传代细胞用于实验。在用VEGF165刺激之前，将HUVEC在增补有0.1％BSA(Sigma)的EBM-2(Lonza)中血清饥饿2小时。重组人类VEGF165(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)以50ng/ml(2.2nmol/l)的浓度使用。HEK 293T/17(ATCC)和人类成纤维细胞Detroit 551(ATCC,Manassas,VA)维持在增补有10％FBS的DMEM(Life Technologies)中。H460细胞来自于ATCC并维持在增补有10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(Life Technologies)中。
血管生成测定法。胶原蛋白侵入测定法如以前所述来进行(Kang等，(2011)J.Biol.Chem.286:42017-26)。在人工基质胶(BD Biosciences,San Jose,CA)上的体外毛细血管网络形成和刮伤愈合测定法如以前所述来进行(Humtsoe等，(2010)Mol.CellBiol.30:1593-1606)。血纤蛋白凝胶芽生测定法如Nakatsu&Hughes所述来进行((2008)Methods Enzymol.443:65-82)。将VEGF(2.2nmol/L)刺激用于所有体外血管生成测定法。Transwell迁移测定法如Kaplan等人所述((2011)Free Radical Res.45:1124-35)，使用VEGF(4.4nmol/L)、鞘氨醇-1-磷酸(S1P)(1μmol/L)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(50ng/mL)，在存在或不存在不同浓度的驱动蛋白衍生的血管生成抑制剂(DUF2C5；KIF13B的1238-1260位残基)的情况下进行。
体外结合。将KIF13B的截短的突变体如以前所述在BL21(DE3)或Rosetta-gami中表达并纯化(Yamada等，(2014)J.Cell Sci.127:4518-30；Yamada等，(2007)Biochemistry46:10039-45)。结合测定法使用S-树脂，在0.5％TRITON-X100和1％牛血清白蛋白中，在4℃下进行，并使用抗VEGFR2抗体通过western印迹来分析。
增殖、存活性和毒性测定法。HUVEC的VEGF诱导增殖和存活性如以前所述通过WST-1测定法(Roche)来评估(Cai等，(2006)Microvasc.Res.71:20-31；Jones等，(2005)Br.J.Pharmacol.145:1093-102)。将HUVEC在减料培养基中培养(增补有0.1％胎牛血清和EC增补剂的EBM2，但不含VEGF、表皮生长因子、胰岛素样生长因子和成纤维细胞生长因子)。然后将HUVEC在含有和不含DUF2C5(1、3和10μmol/L)的情况下用VEGF(2.2nmol/L)或用阴性对照肽(CT23，3μmol/L)刺激48小时，以96孔板格式通过WST-1测定法测试VEGF诱导的增殖。在生长培养基中温浴过夜后，在存在和不存在DUF2C5(1、3和10μmol/L)的情况下评估HUVEC的存活性。在生长培养基中，在存在和不存在DUF2C5的情况下温浴48小时后，通过TUNEL测定法(Invitrogen)来测量凋亡。作为阳性对照，在所述凋亡测定法中也使用50ng/mL的肿瘤坏死因子(TNF)-α。
内皮通透性测定法。通过荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖跨过HUVEC单层的泄漏，来评估VEGF诱导的内皮通透性的提高。将Transwells(具有0.4-μm孔眼直径)用合生的HUVEC包被。在血清饥饿后，将细胞用DUF2C5或CT23(10μmol/L)预处理。然后将细胞用VEGF刺激，并在各个不同时间点使用荧光读板器PHERASTAR(BMG Biotech,Cary,NC)测量荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖的跨内皮通透性。
人工基质胶塞血管形成测定法和小鼠异种移植物模型。对于用于评估小鼠EC的血管形成的人工基质胶塞测定法来说，如以前所述使用C57BL6雄性小鼠(JacksonLaboratory)(Yang & Proweller(2011)J.Biol.Chem.286:13741-53)。将增补有4.4nmol/lVEGF、50ng/ml bFGF、60U肝素和0.8×108IFU慢病毒的人工基质胶皮下注射到腹部中。在注射后4天，收集人工基质胶。
对于小鼠异种移植物模型来说，如以前所述将人类肺癌H460(3×106个细胞)在麻醉下s.c.接种到具有重度联合免疫缺损的免疫缺陷的BALBc小鼠(Jackson Laboratory)的右胁中(Eklund等，(2013)Mol.Oncol.7:259-82；Yamada等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99:14098-103)。在发展出可触知的肿瘤后，小鼠每周三次通过经尾静脉i.v.注射接受200μL PBS或DUF2C5肽(10mg/kg，溶解在200μL PBS中)。每周三次使用卡尺测量肿瘤尺寸。在治疗期后，将肿瘤固定并石蜡包埋，用于使用抗VEGFR2抗体的免疫组织学分析，以评估肿瘤血管生成。所述小鼠在伊利诺伊大学动物房(University ofIllinois Animal Care facility)饲养在无病原体条件下，并按照学术指导准则处理。
出生后视网膜血管生成。新生C57B小鼠如以前所述，在出生当天(出生后第0天)和随后若干天(出生后第1至4天)每天在眼睑下s.c.给药肽(DUF2C5或CT23，10mg/kg，溶解在PBS中)或PBS介质(Chavala等，(2013)J.Clin.Invest.123:4170-81)。在出生后第6天，如以前所述分离视网膜并用抗CD31抗体(Abcam)染色(Pitulescu等，(2010)Nat.Protoc.5:1518-34)。
图像获取流程。用于本研究的显微镜是带有63×油浸物镜的ZEISS共聚焦显微镜LSM 880META和带有PLAN-NEOFLUAR 5×物镜、20×物镜和40×油浸物镜的ZEISS AXIOVERT相差显微镜。对于同一组实验中的所有样品来说，所有荧光图像在相同条件和设置下获取。
统计分析。将t-检验用于组间比较。为了分析两个以上的组，使用GraphPad Prism软件版本5(GraphPad Software,San Diego,CA)进行单向方差分析和事后Bonferroni多重比较。
激光诱导的CNV。新血管性老年性黄斑变性(AMD)通过血管从脉络膜穿过玻璃膜进入视网膜下区域的生长来表征。激光诱导的脉络膜新血管形成(CNV)的小鼠模型是渗出形式的AMD的沿用已久的模型。玻璃膜被激光束的破坏促进新的脉络膜血管生长到视网膜中，从而模拟了AMD的病理状况。
激光光凝术使用图像引导的激光系统(Micron IV,Phoenix ResearchLaboratories,Pleasanton,CA)，在C57B小鼠上在麻醉下产生。通过波长为532nm的绿色氩激光脉冲，以50μm的固定直径、70ms的持续时间和210-250mW的功率水平在右眼中在距视神经相等的距离处一个接一个地产生4个激光烧伤。在激光斑点处的气泡外观用于指示玻璃膜的破裂并作为激光诱导的CNV的证明。这个程序只在每只小鼠的右眼处进行。
脉络膜新血管形成在第7和14天通过眼部相干断层扫描术(OCT)和荧光素血管造影术来评估。进行荧光素血管造影术和OCT是为了对视网膜血管结构进行成像，与在临床上日常用于患者的程序相似。荧光素血管造影通过i.p注射0.5％荧光素来进行。
所述实验在第14天，在获取OCT和血管造影术的图像后结束。取下眼镜，并将脉络膜/巩膜的平坦固定的制备物用于使用ALEXA 594标记的来自于Bandeiraenasimplicifolia的凝集素(B4)染色，以用于CNV区域的尸检分析。使用MetaMorph软件，使用CNV的凝集素B4染色的共聚焦图像，来定量血管渗漏和CNV的面积。将数据作图并使用Prism6(Graph Pad,San Diego CA)进行统计分析。
实施例2：抑制血管生成的KIF13B衍生的肽的鉴定
使用重组蛋白，鉴定了KIF13B上介导与VEGFR2的相互作用的结合位点。KIF13B具有马达、叉头结合、膜结合的鸟苷酸激酶结合性杆、2个未知功能的结构域(DUF)(DUF3694)和富含脯氨酸和细胞骨架结合的蛋白质的富含甘氨酸的结构域。所述DUF在Pfam数据库上从氨基酸序列相似性鉴定。以前已显示，DUF3694的两个结构域在体外直接结合重组VEGFR2(Yamada等，(2007)Biochemistry46:10039-45)。为了确定抑制VEGFR2转运的特异性肽序列，对第二个DUF3694结构域(DUF2，KIF13B的1112-1281位残基)进行了进一步分析。这是基于该结构域的稳定性和与KIF13B用于其他货物的结合位点不同的序列(Horiguchi等，(2006)J.Cell Biol.174:425–436；Hanada等，(2000)J.Biol.Chem.275:28774–2878)。将DUF2分成3个部分，DUF2A(1111-1167位残基)、DUF2B(1168-1216位残基)和DUF2C(1217-1281位残基)，并将每个部分在细菌中作为重组蛋白表达。VEGFR2在HUVEC中丰富地表达；因此，将来自于HUVEC的细胞裂解液与珠子上的这些重组蛋白温浴，并使用抗VEGFR2抗体确定VEGFR2结合。这项分析表明DUF2C特异性结合VEGFR2，而DUF2A和DUF2B和单独的珠子不能结合。
为了试验KIF13B的截短的突变体的生物活性，将DUF2C通过慢病毒载体在HUVEC中表达。DUF2C的表达足以在体外减少VEGF诱导的毛细血管网络的形成，然而载体感染的对照HUVEC在VEGF存在下，在人工基质胶塞中形成特征性的毛细血管网络。胶原蛋白侵入系统(Kang等，(2011)J.Biol.Chem.286:42017–42026)被用作另一种血管生成测定法来测试所述肽。在用对照慢病毒、FLAG-DUF2C或FLAG-DUF2感染后，将HUVEC接种在胶原蛋白凝胶上。监测细胞对促血管生成刺激物S1P和VEGF做出响应在凝胶中的侵入直至24小时。只有DUF2C或整个DUF2序列的表达显著减少HUVEC在胶原蛋白凝胶中的侵入、侵入的距离和形成的空腔数目。然而，在各个组之间侵入芽的厚度没有差异。
为了鉴定VEGFR2上的最小结合位点，将DUF2C进一步截短(DUF2C1-9)(图1)。其中，KIF13B的1238至1260位残基(即DUF2C5或C5肽)包括了核心结合序列，正如通过使用来自于HUVEC裂解物的内源VEGFR2的拉下结合测定法所确定的。与C5相比，截短的C6、C8和C9肽表现出与VEGFR2的部分或不稳定的结合。C5肽的稳定性归因于4-6个C-端残基。因此，用另一个肽、一个或多个翻译后修饰、一个或多个非天然氨基酸残基、大分子例如PEG或其组合代替这些C-端残基，预期将使所述KAI肽稳定。
在表达KIF13B的截短突变体或载体对照的HUVEC中，评估了在二维毛细血管网络形成测定法中的生物活性。将HUVEC用编码FLAG-C2、-C3、-C5、-C8、-C9的慢病毒或载体感染。此外，将不结合到VEGFR2的KIF13B的C-端区域(1528至1826位残基)用作阴性对照(CT)。结合VEGFR2的截短的突变体C2、C3和C5的表达显著减少了VEGF诱导的网络形成，而载体感染的对照HUVEC和表达CT的HUVEC在VEGF存在下在人工基质胶上形成毛细血管网络。弱结合VEGFR2的DUF2C8和DUF2C9不显著减少网络形成。
为了在体内研究KIF13B在介导血管生成中的作用，在小鼠中使用表达KIF13B的截短突变体的慢病毒进行了人工基质胶塞测定法。在VEGF、bFGF和肝素存在下将高滴度的慢病毒与人工基质胶一起s.c.注射到C57BL小鼠中。有趣的是，DUF2C5或全长DUF2的表达显著减少血管数目，而载体对照或CT的表达没有显著效果(图2)。这些结果表明，含有KIF13B对VEGFR2的最小结合位点的肽在体外和体内血管生成测定法两者中抑制血管生成。
实施例3：DUF2C5肽阻止肿瘤血管生成
蛋白质BLAST搜索揭示出DUF2C5不与任何其他蛋白质序列重叠。使用竞争性结合测定法，确定了在HUVEC中DUF2C5是否与内源KIF13B竞争VEGFR2的结合。在对照细胞中VEGFR2与KIF13B免疫共沉淀，而与DUF2C5预温浴阻止了VEGFR2与KIF13B的相互作用。由于KIF13B与VEGFR2的相互作用对于VEGFR2向细胞表面的转运是必需的，因此随后研究了在不存在或存在DUF2C5的情况下VEGFR2的细胞表面表达。将血清饥饿的HUVEC与DUF2C5肽(3、10μmol/L)或PBS对照预温浴，然后将所述细胞用VEGF刺激指定的时间。如以前所述将细胞表面定位的VEGFR2用针对VEGFR2的细胞外结构域的抗体染色(Yamada等，(2007)Biochemistry 46:10039-45)。在对照细胞中，在VEGF刺激之前在细胞表面上检测到VEGFR2，VEGFR2在刺激后1小时消失，并且细胞表面池被新合成的VEGFR2的运输恢复。然而，初始的VEGFR2细胞表面积累和内化，不受DUF2C5的预温浴影响；也就是说，DUF2C5只在VEGF刺激后阻止细胞表面VEGFR2的恢复。
为了研究DUF2C5的特异性，设计了不结合到VEGFR2的阴性对照肽。由于KIF13B的C-端区不结合VEGFR2(Yamada等，(2007)Biochemistry 46:10039-45)，因此合成了被称为CT23的C-端23个氨基酸的肽(KIF13B的1650至1672位残基)。首先，使用拉下测定法确认了肽与VEGFR2的相互作用。固定化在链亲合素珠子上的生物素-DUF2C5肽将VEGFR2从HUVEC裂解物拉下，而单独的珠子或珠子上的CT23不与VEGFR2相互作用。
接下来，确定了所述肽被HUVEC的EC摄入。DUF2C5和CT23两者都被设计成具有高的pI(分子不带净电荷时的pH)，pI分别为12.1和10.4；因此，在中性pH下，两种肽具有对细胞摄入来说重要的正电荷(Jones等，(2005)Br.J.Pharmacol.145:1093–1102)。合成带有生物素标签的DUF2C5和CT23，并使用链亲合素-ALEXA 418可视化。在与肽温浴2小时后，显示出HUVEC将DUF2C5和CT23肽两者内化，正如通过流式细胞术所定量的。
随后通过WST-1测定法确定DUF2C5对VEGF诱导的增殖的影响。这项分析表明DUF2C5在3和10μmol/L的浓度下抑制VEGF诱导的增殖，而3μmol/L的CT23没有效果。也使用合生HUVEC单层确定了VEGF诱导的内皮通透性的提高。这项分析显示，DUF2C5抑制VEGF诱导的通透性提高，而CT23不抑制。也使用WST-1测定法，在与DUF2C5(1、3、10μmol/L)温浴24小时后试验了HUVEC的存活性。即使是最高的10μmol/L的DUF2C5浓度也不改变细胞存活性。在与DUF2C5(10μmol/L)、PBS介质或TNF-α(50ng/mL；作为阳性对照)温浴后，只有TNF-α诱导凋亡。
使用刮伤愈合测定法确定EC对DUF2C5做出响应的迁移。对照HUVEC(PBS介质或CT23)对VEGF做出响应迁移并封闭伤口；然而，在DUF2C5存在下，VEGF诱导的HUVEC的迁移被显著延迟。也使用TRANSWELL迁移测定法来确定DUF2C5对EC迁移的抑制效应是否特异性针对VEGF。将HUVEC置于含有或不含DUF2C5或CT23的TRANSWELL室中。DUF2C5抑制VEGF诱导的EC迁移但不改变S1P-或bFGF诱导的迁移(图3)。PBS和CT23对由所有刺激物诱导的EC迁移没有影响。
在人工基质胶塞中评估了VEGF诱导的网络形成的变化。DUF2C5以浓度依赖性方式阻止VEGF诱导的网络形成，而CT23没有效果。还通过HUVEC在珠子上的三维培养确定了VEGF诱导的EC芽生(Nakatsu & Hughes(2008)Methods Enzymol.443:65–82)。对照细胞和CT23(1μmol/L)处理的细胞表现出长芽(例如大约13-16个芽)和多个分支点(例如大约4-6个分支)的形成，而DUF2C5(1μmol/L)处理显著减少了每个珠子的分支点结构(大约2个分支)和芽(大约6个芽)的数目。
为了确定在体内癌症模型中VEGFR2转运是否调控血管生成，使用了肿瘤移植小鼠模型(Eklund等，(2013)Mol.Oncol.7:259–282)。研究使用肺癌来进行，因为它的肿瘤生长依赖于血管生成。具有重度联合免疫缺损并s.c.异种移植有人类肺癌H460的小鼠每周三次通过i.v.注射接受PBS或DUF2C5肽(10mg/kg)；这种剂量是基于本文中描述的体外试验的剂量模式。DUF2C5抑制肿瘤生长，而PBS处理的对照肿瘤继续生长(图4A)。使用抗VEGFR2和抗von Willebrand因子抗体通过免疫组织化学可视化的肿瘤中的血管揭示出在PBS处理的对照肿瘤中大量的血管供应，而DUF2C5处理显著减少肿瘤血管数目(图4B)。然而，DUF2C5不直接影响所述癌细胞的存活性。然而，在DUF2C5处理的小鼠中TUNEL阳性肿瘤细胞的数目增加(PBS，～300个TUNE阳性肿瘤细胞/mm2；DUF2C5，～1750个TUNEL阳性肿瘤细胞/mm2)。
为了研究在另一个模型中DUF2C5是否也减少血管生成，也在出生后视网膜血管生成的模型中试验了DUF2C5的效果。从出生后第0天到第4天，每天注射将肽DUF2C5或CT23，并在第6天确定视网膜血管生成。与在肿瘤中的抗血管生成效应相反，DUF2C5对视网膜中的发育性血管生成没有影响。
实施例4：在激光诱导的CNV中DUF2C5阻止肿瘤血管生成
使用C57B WT小鼠(7周龄)进行激光诱导的CNV程序。在激光光凝术后，通过玻璃体内注射给药一次DUF2C5(0.5μg、2μg或10μg in，在2μL PBS中)或PBS介质(2μL)治疗。使用OCT、荧光素血管造影术和ALEXA 594-ILB4染色来评估新血管形成。与PBS对照相比，DUF2C5治疗显著抑制新血管形成(图5A)。
随后试验了DUF2C5作为滴眼液的效果。使用不抑制血管生成的对照肽CT23作为阴性对照。在激光烧伤后，将小鼠每日用对照肽(2μg/眼)或DUF2C5(2μg/眼)治疗。通过OCT、荧光素血管造影术和ILB4染色来评估新血管形成。有趣的是，DUF2C5的每日治疗显著抑制新血管形成，而对照肽没有任何效果(图5B)。合在一起，通过玻璃体内注射以及滴眼液，DUF2C5肽显示出显著的AMD抑制。
实施例5：DUF2C5的特异性
BLAST搜索分析揭示出DUF2C5的肽序列是KIF13B特有的，并且在任何其他蛋白质中没有发现。此外，DUF2C5的序列在哺乳动物KIF13B中高度保守。DUF2C5与VEGFR2的激酶结构域相互作用并且不与其他受体例如Tie2和Par1相互作用。为了进一步试验DUF2C5的特异性，使用固定化在链亲合素珠子上的DUF2C5或对照肽(CT23)进行蛋白质的拉下，然后对结合蛋白质进行质谱分析。该分析检测到KIF13B、VEGFR2和辅助受体NRP1的存在(命中数分别为28、11和5)。没有发现Tie2、Par1、S1PR1和FGFR。KIF13B的其他货物(例如CentA、hDlg)也没有发现。由于激酶结构域的相似性，也鉴定到一些受体酪氨酸激酶(即PDGFRα、PDGFRβ和EGFR)(命中数分别为6、5和1)，然而这些激酶不与对照肽相互作用。然后通过使用BIACORE(UIC,RRC)的表面等离子体共振(SPR)，使用亲和素包被的芯片上的DUF2C5和CT23以及激酶的重组胞浆结构域(Fisher Scientific)，试验了每种受体酪氨酸激酶的亲和性。VEGFR2以5.5±2.2nM的KD值非常紧密地结合到DUF2C5，然而它不结合到CT23。BIACORE还揭示，PDGFRβ以可忽略的KD显示出非常弱地结合到DUF2C5，而PDGFRα和EGFR不结合到DUF2C5。这些数据指示了DUF2C5对VEGFR2的高度特异性。
实施例6：药物递送
使用与DY633荧光探针(Pierce)共价偶联的合成肽，试验了DUF2C5肽的递送。将DY633-DUF2C5(10mg/kg体重)、DY633-CT23或单独的DY633经尾静脉静脉内(i.v.)注射到带有H460肿瘤的SCID小鼠中。1小时后，将肿瘤切下并在OCT中快速冷冻。将肿瘤的冷冻切片用vWF共染色，以可视化肿瘤中的内皮细胞。这项分析证实了DY633标记的两种肽都存在于肿瘤中的vWF阳性内皮细胞中，而单独的染料没有检测到。这些数据指示了DUF2C5肽成功递送到肿瘤位点中。
值得注意的是，DUF2C5肽的细胞穿透归因于三个N-端氨基酸残基Ser-Arg-Gly。因此，用其他带电荷的残基(例如细胞穿透肽)、脂质、维生素B12或其组合代替这些残基，预期同样地促进所述KAI肽运输到细胞中。
实施例7：DUF2C5肽的截短
为了进一步确定参与结合到VEGFR2的KIF13B残基，试验了DUF2C5肽的截短区段与VEGFR2的结合(表3)，并与DUF2C5和该区域侧翼的肽的结合进行比较(图1)。使用来自于HUVEC裂解物的内源VEGFR2，使用拉下结合测定法，该分析的结果表明具有序列TPVDERLFLIVRVTVQ(SEQ ID NO：3)的肽足以结合VEGFR2。值得注意的是，DUF2C5肽的环化形式也被制备，并显示出结合到VEGFR2。
表3
实施例8：KAI直系同源物
KIF13B在大量物种中具有直系同源物，所述物种包括但不限于其他非哺乳动物例如斑马鱼和鸟，以及哺乳动物包括灵长动物、犬科动物、牛科动物和啮齿动物。智人(Homosapiens)KAI肽TPVDERLFLIVRVTVQ(SEQ ID NO：3)的直系同源物提供在表4中。
表4
*源自于GENBANK登记号：1NP_056069，2XP_001154346，3XP_002805344，4XP_534562，5XP_002689518，6NP_001074646，7NP_998791，8XP_004935945，9NP_001261000，10XP_021520839，11XP_004046891，12XP_004707777，13XP_019491694，14XP_017907342，15XP_019588675和16XP_015440561。相对于智人(Homo sapiens)KAI肽。
值得注意的是，在SEQ ID NO：3的智人(Homo sapiens)KAI肽与哺乳动物肽直系同源物之间存在高度序列一致性，即大约75-100％。事实上，正如在本文中描述的，智人(Homosapiens)DUF2C5肽(与相应的小鼠DUF2C5肽享有82.6％序列一致性)在激光诱导的脉络膜新血管形成的小鼠模型中，在体内有效地抑制新血管形成。因此，本发明包括了包含TPVDERLFLIVRVTVQ(SEQ ID NO：3)的智人(Homo sapiens)KAI肽以及具有氨基酸序列Thr-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Glu-Arg-Xaa4-Xaa5-Leu-Ile-Xaa6-Arg-Xaa7-Xaa8-Val-Xaa9(SEQ ID NO：1)的KAI肽直系同源物的构建物，其中Xaa1是Pro、Ala或Glu，Xaa2是Val、Ala或Ser，Xaa3是Asp或Asn，Xaa4是Leu或Val，Xaa5是Phe或Tyr，Xaa6是Leu或Val，Xaa7是Val、Ala或Thr，Xaa8是Thr或Ala，并且Xaa9是Gln或Arg。具体来说，本发明包括了包含具有氨基酸序列Thr-Pro-Xaa1-Asp-Glu-Arg-Xaa2-Xaa3-Leu-Ile-Xaa4-Arg-Val-Xaa5-Val-Xaa6(SEQ ID NO：2)的哺乳动物KAI肽直系同源物的构建物，其中Xaa1是Val、Ala或Ser，Xaa2是Leu或Val，Xaa3是Phe或Tyr，Xaa4是Leu或Val，Xaa5是Thr或Ala，并且Xaa6是Gln或Arg。
与本文中公开的智人(Homo sapiens)DUF2C5肽相同，KAI肽直系同源物可以用一个或多个运载组成部分和/或一个或多个稳定化组成部分修饰。因此，本发明的构建物可以具有表5中列出的示例性构建物的结构。
表5
*Myr，肉豆蔻酰化；NH2，酰胺化；PEG，PEG化；叠氮基-B12，赖氨酸的叠氮化和维生素B12偶联。
因此，本发明包括具有下述序列的构建物：
(S/N)-(K/R)-(G/V)-T-(P/A/E)-(V/A/S)-(D/N)-ER-(L/V)-(F/Y)-LI-(V/L)-R-(V/A)-(T/A)-V-(Q/R)-LSHP(SEQ ID NO：131)；
S-(K/R)-GTP-(V/A/S)-DER-(L/V)-(F/Y)-LI-(V/L)-RV-(T/A)-VQLS HP(SEQ IDNO：132)；
肉豆蔻酰基-TP-(A/V)-DER-(L/V)-FLI-(V/L)-RV-(T/A)-VQLSHP-NH2(SEQ IDNO：133)；
肉豆蔻酰基-TP-(A/V)-DER-(L/V)-FLI-(V/L)-RV-(T/A)-VQ-NH2(SEQ ID NO：134)；
S-(K/R)-GTP-(V/A)-DER-(L/V)-FLI-(V/L)-RV-(T/A)-VQ-PEG化(SEQ ID NO：135)；
RQIKIWFQNRRMKWKKTP-(A/V)-DER-(L/V)-FLI-(V/L)-RV-(T/A)-VQ-NH2(SEQ IDNO：136)；
RQIKIWFQNRRMKWKKTP-(A/V)-DER-(L/V)-FLI-(V/L)-RV-(T/A)-VQ-PEG化(SEQ IDNO：137)；或
S-K(叠氮基-B12)-GTP-(V/A)-DER-(L/V)-FLI-(V/L)-RV-(T/A)-VQLSHP-NH2(SEQID NO：138)。
序列表
<110> 伊利诺伊大学理事会（The Board of Trustees of the University ofIllinois）
<120> KIF13B衍生的肽和抑制血管生成的方法
<130> UIC0069WO
<150> US 62/383,070
<151> 2016-09-02
<150> US 62/510,536
<151> 2017-05-24
<160> 138
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa表示Pro、Ala或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa表示Val、Ala或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa表示Asp或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa表示Phe或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa表示Val、Ala或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa表示Thr或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa表示Gln或Arg
<400> 1
Thr Xaa Xaa Xaa Glu Arg Xaa Xaa Leu Ile Xaa Arg Xaa Xaa Val Xaa
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa表示Val、Ala或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa表示Phe或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa表示Thr或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa表示Gln或Arg
<400> 2
Thr Pro Xaa Asp Glu Arg Xaa Xaa Leu Ile Xaa Arg Val Xaa Val Xaa
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Phe Arg Glu Lys Leu Ala Tyr Ile Ala Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys
1 5 10 15
Pro
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro
1 5 10 15
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Pro Arg Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg
1 5 10 15
His Leu
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
Arg Lys Arg
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg
1 5 10 15
Asp Val
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg
1 5 10 15
<210> 16
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg
1 5 10 15
Arg Glu Arg Gln Ser Arg
20
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His
1 5
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
1 5 10 15
Arg Leu Leu Arg Lys
20
<210> 19
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His
1 5 10 15
Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala
20 25 30
<210> 20
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Lys Gly Ser Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met Ser Met Lys Ile Arg Pro
1 5 10 15
Phe Phe Pro Gln Gln
20
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Lys Thr Arg Tyr Tyr Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro
1 5 10 15
Phe Asn Arg Leu
20
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Arg Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Arg Ala Val Arg Met Lys Ile Arg Pro
1 5 10 15
Leu Val Thr Gln
20
<210> 23
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro
20
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu
1 5 10
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Asn Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His
1 5 10 15
Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala
20 25 30
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu
1 5 10
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 29
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 30
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met
1 5
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr
1 5 10 15
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 36
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 40
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp
1 5 10 15
Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro
20 25
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg
1 5
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 46
Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe
1 5 10
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 47
Ala Trp Ser Phe Arg Val Ser Tyr Arg Gly Ile Ser Tyr Arg Arg Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 48
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 49
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 50
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 51
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 51
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 52
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 52
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Thr Leu
20 25
<210> 53
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 53
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Ile Leu
20
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 54
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly
1 5 10
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 55
Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Thr Leu
1 5 10
<210> 56
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 56
Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
1 5 10 15
Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro
20 25 30
Val Asp
<210> 57
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 57
Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr
1 5 10 15
Val Thr Gly Lys Gly Asp Pro Lys Pro Asp
20 25
<210> 58
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 58
Ser Arg Gly
1
<210> 59
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa表示Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa表示Lys或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa表示Gal或Val
<400> 59
Xaa Xaa Xaa
1
<210> 60
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa表示Lys或Arg
<400> 60
Ser Xaa Gly
1
<210> 61
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 61
Leu Ser His Pro
1
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa表示Gln或Arg
<400> 62
Leu Ser His Pro Ala Asp
1 5
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 63
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 64
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 64
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 65
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 65
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 66
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 67
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 68
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 68
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 69
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 70
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 71
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 71
Ser Arg Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 72
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 72
Arg Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr
1 5 10 15
Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 73
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 73
Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val
1 5 10 15
Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 74
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 74
Arg Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr
1 5 10 15
Val Gln Leu Ser
20
<210> 75
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 75
Arg Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr
1 5 10 15
Val Gln
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 76
Ser Arg Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr
<210> 77
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 77
Val Arg Val Thr Val Gln Leu Ser His Pro Ala Asp Met Gln Leu Val
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 78
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 78
Pro Gln Leu Ser Arg Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile
1 5 10 15
Val Arg
<210> 79
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 79
Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
Leu Ser His Pro Ala Asp Met Gln Leu Val Leu Arg Lys Arg
20 25 30
<210> 80
<211> 16
<212> PRT
<213> 黑猩猩（Pan troglodytes）
<400> 80
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 81
<211> 16
<212> PRT
<213> 猕猴（Macaca mulatta）
<400> 81
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 82
<211> 16
<212> PRT
<213> 狼（Canis lupus）
<400> 82
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Tyr Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 83
<211> 16
<212> PRT
<213> 家牛（Bos Taurus）
<400> 83
Thr Pro Val Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 84
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 84
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 85
<211> 16
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 85
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val Ala Val Gln
1 5 10 15
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 原鸡（Gallus gallus）
<400> 86
Thr Ala Ala Asp Glu Arg Val Tyr Leu Ile Val Arg Ala Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 87
<211> 16
<212> PRT
<213> 斑马鱼（Danio rerio）
<400> 87
Thr Glu Ala Asn Glu Arg Val Tyr Leu Ile Leu Arg Thr Thr Val Arg
1 5 10 15
<210> 88
<211> 16
<212> PRT
<213> 大猩猩（Gorilla gorilla）
<400> 88
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 89
<211> 16
<212> PRT
<213> 小马岛猬（Echinops telfairi）
<400> 89
Thr Pro Ser Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 90
<211> 16
<212> PRT
<213> 大蹄蝠（Hipposideros armiger）
<400> 90
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> 山羊（Capra hircus）
<400> 91
Thr Pro Val Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 92
<211> 16
<212> PRT
<213> 中华菊头蝠（Rhinolophus sinicus）
<400> 92
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 93
<211> 16
<212> PRT
<213> 太平洋狐蝠（Pteropus alecto）
<400> 93
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 94
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 94
Ser Arg Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 95
<211> 23
<212> PRT
<213> 黑猩猩（Pan troglodytes）
<400> 95
Ser Arg Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 96
<211> 23
<212> PRT
<213> 猕猴（Macaca mulatta）
<400> 96
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 97
<211> 23
<212> PRT
<213> 狼（Canis lupus）
<400> 97
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Tyr Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 98
<211> 23
<212> PRT
<213> 家牛（Bos Taurus）
<400> 98
Ser Lys Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 99
<211> 23
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 99
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 100
<211> 23
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 100
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val
1 5 10 15
Ala Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 101
<211> 23
<212> PRT
<213> 原鸡（Gallus gallus）
<400> 101
Ser Lys Gly Thr Ala Ala Asp Glu Arg Val Tyr Leu Ile Val Arg Ala
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 102
<211> 23
<212> PRT
<213> 斑马鱼（Danio rerio）
<400> 102
Asn Arg Val Thr Glu Ala Asn Glu Arg Val Tyr Leu Ile Leu Arg Thr
1 5 10 15
Thr Val Arg Leu Ser His Pro
20
<210> 103
<211> 23
<212> PRT
<213> 猫头鹰猴（Aotus nancymaae）
<400> 103
Ser Lys Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 104
<211> 23
<212> PRT
<213> 大猩猩（Gorilla gorilla）
<400> 104
Ser Arg Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 105
<211> 23
<212> PRT
<213> 小马岛猬（Echinops telfairi）
<400> 105
Ser Arg Gly Thr Pro Ser Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 106
<211> 23
<212> PRT
<213> 大蹄蝠（Hipposideros armiger）
<400> 106
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 107
<211> 23
<212> PRT
<213> 山羊（Capra hircus）
<400> 107
Ser Lys Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 108
<211> 23
<212> PRT
<213> 中华菊头蝠（Rhinolophus sinicus）
<400> 108
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 109
<211> 23
<212> PRT
<213> 太平洋狐蝠（Pteropus alecto）
<400> 109
Ser Arg Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 110
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 酰胺化
<400> 110
Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
Leu Ser His Pro
20
<210> 111
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 酰胺化
<400> 111
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
Leu Ser His Pro
20
<210> 112
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 酰胺化
<400> 112
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val Ala Val Gln
1 5 10 15
Leu Ser His Pro
20
<210> 113
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 酰胺化
<400> 113
Ser Arg Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 114
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 酰胺化
<400> 114
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 115
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 酰胺化
<400> 115
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val
1 5 10 15
Ala Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 116
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 酰胺化
<400> 116
Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 117
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 酰胺化
<400> 117
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val Thr Val Gln
1 5 10 15
<210> 118
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 酰胺化
<400> 118
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val Ala Val Gln
1 5 10 15
<210> 119
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> PEG化
<400> 119
Ser Arg Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln
<210> 120
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> PEG化
<400> 120
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln
<210> 121
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> PEG化
<400> 121
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val
1 5 10 15
Ala Val Gln
<210> 122
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> 酰胺化
<400> 122
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
20 25 30
<210> 123
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> 酰胺化
<400> 123
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val Thr Val Gln
20 25 30
<210> 124
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> 酰胺化
<400> 124
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val Ala Val Gln
20 25 30
<210> 125
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> PEG化
<400> 125
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val Thr Val Gln
20 25 30
<210> 126
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> PEG化
<400> 126
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val Thr Val Gln
20 25 30
<210> 127
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> PEG化
<400> 127
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val Ala Val Gln
20 25 30
<210> 128
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 叠氮基赖氨酸-维生素B12
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 酰胺化
<400> 128
Ser Lys Gly Thr Pro Val Asp Glu Arg Leu Phe Leu Ile Val Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 129
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 叠氮基赖氨酸-维生素B12
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 酰胺化
<400> 129
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val
1 5 10 15
Thr Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 130
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 叠氮基赖氨酸-维生素B12
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 酰胺化
<400> 130
Ser Lys Gly Thr Pro Ala Asp Glu Arg Val Phe Leu Ile Leu Arg Val
1 5 10 15
Ala Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 131
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa表示Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa表示Arg或Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa表示Gly或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa表示Pro、Ala或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa表示Val、Ala或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa表示Asp或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa表示Phe或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa表示Val或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa表示Val或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa表示Thr或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Xaa表示Gln或Arg
<400> 131
Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Glu Arg Xaa Xaa Leu Ile Xaa Arg Xaa
1 5 10 15
Xaa Val Xaa Leu Ser His Pro
20
<210> 132
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa表示Lys或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa表示Val、Ala或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa表示Phe或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa表示Val或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa表示Thr或Ala
<400> 132
Ser Xaa Gly Thr Pro Xaa Asp Glu Arg Xaa Xaa Leu Ile Xaa Arg Val
1 5 10 15
Xaa Val Gln Leu Ser His Pro
20
<210> 133
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa表示Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa表示Val或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa表示Thr或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 酰胺化
<400> 133
Thr Pro Xaa Asp Glu Arg Xaa Phe Leu Ile Xaa Arg Val Xaa Val Gln
1 5 10 15
Leu Ser His Pro
20
<210> 134
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa表示Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa表示Thr或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 酰胺化
<400> 134
Thr Pro Xaa Asp Glu Arg Xaa Phe Leu Ile Xaa Arg Val Xaa Val Gln
1 5 10 15
<210> 135
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa表示Lys或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa表示Val或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa表示Thr或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> PEG化
<400> 135
Ser Xaa Gly Thr Pro Xaa Asp Glu Arg Xaa Phe Leu Ile Xaa Arg Val
1 5 10 15
Xaa Val Gln
<210> 136
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Xaa表示Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa表示Thr或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> 酰胺化
<400> 136
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Thr Pro Xaa Asp Glu Arg Xaa Phe Leu Ile Xaa Arg Val Xaa Val Gln
20 25 30
<210> 137
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Xaa表示Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa表示Thr或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> PEG化
<400> 137
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Thr Pro Xaa Asp Glu Arg Xaa Phe Leu Ile Xaa Arg Val Xaa Val Gln
20 25 30
<210> 138
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 叠氮基赖氨酸-维生素B12
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa表示Val或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa表示Leu或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa表示Thr或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 酰胺化
<400> 138
Ser Lys Gly Thr Pro Xaa Asp Glu Arg Xaa Phe Leu Ile Xaa Arg Val
1 5 10 15
Xaa Val Gln Leu Ser His Pro
20

Claims (13)

1.一种构建物，其包含16至65个氨基酸的肽，所述肽包含氨基酸序列Thr-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Glu-Arg-Xaa4-Xaa5-Leu-Ile-Xaa6-Arg-Xaa7-Xaa8-Val-Xaa9(SEQ ID NO：1)，并被可操作地连接到
(a)一个或多个运载组成部分，
(b)一个或多个稳定化组成部分，或
(c)(a)和(b)的组合，
其中Xaa1是Pro、Ala或Glu；Xaa2是Val、Ala或Ser；Xaa3是Asp或Asn；Xaa4是Leu或Val；Xaa5是Phe或Tyr；Xaa6是Leu或Val；Xaa7是Val、Ala或Thr；Xaa8是Thr或Ala；并且Xaa9是Gln或Arg。
2.权利要求1的构建物，其中所述一个或多个运载组成部分包括细胞穿透肽、脂质、维生素B12，或其组合。
3.权利要求2的构建物，其中所述细胞穿透肽包含SEQ ID NO：4-60的肽。
4.权利要求1的构建物，其中所述一个或多个稳定化组成部分包括肽、翻译后修饰、非天然氨基酸残基、大分子，或其组合。
5.权利要求4的构建物，其中所述翻译后修饰包括N-端乙酰化或C-端酰胺化。
6.权利要求4的构建物，其中所述非天然氨基酸残基包括D-氨基酸残基。
7.权利要求4的构建物，其中所述大分子包括聚乙二醇、聚唾液酸、羟乙基淀粉、白蛋白或免疫球蛋白片段。
8.权利要求1的构建物，其中所述构建物包含氨基酸序列TPVDERLFLIVRVTVQ(SEQ IDNO：3)。
9.权利要求8的构建物，其中所述构建物是SRGTPVDERLFLIVRVTVQLSHP-NH2(SEQ ID NO：113)。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1的构建物和可药用赋形剂。
11.一种用于抑制血管生成的方法，所述方法包括将细胞或组织与有效量的权利要求1的构建物相接触，从而在所述细胞或组织中抑制血管生成。
12.一种在对象中治疗以血管供应过量为特征的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的权利要求1的构建物，从而治疗所述疾病或病症。
13.权利要求12的方法，其中所述疾病或病症是炎性疾病、癌症或视网膜血管病变。
CN201780052792.9A 2016-09-02 2017-08-31 Kif13b衍生的肽和抑制血管生成的方法 Active CN109789180B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662383070P 2016-09-02 2016-09-02
US62/383,070 2016-09-02
US201762510536P 2017-05-24 2017-05-24
US62/510,536 2017-05-24
PCT/US2017/049584 WO2018045155A1 (en) 2016-09-02 2017-08-31 Kif13b-derived peptide and method of inhibiting angiogenesis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109789180A true CN109789180A (zh) 2019-05-21
CN109789180B CN109789180B (zh) 2023-09-08

Family

ID=61301682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780052792.9A Active CN109789180B (zh) 2016-09-02 2017-08-31 Kif13b衍生的肽和抑制血管生成的方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11299524B2 (zh)
EP (1) EP3506919A4 (zh)
JP (1) JP7269649B2 (zh)
CN (1) CN109789180B (zh)
AU (1) AU2017318610B2 (zh)
BR (1) BR112019004203A2 (zh)
CA (1) CA3074120A1 (zh)
IL (1) IL264809B (zh)
SG (2) SG10202101243YA (zh)
WO (1) WO2018045155A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019199790A2 (en) * 2018-04-10 2019-10-17 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Anti-angiogenin peptides, compositions, and methods of use
CN113773394B (zh) * 2020-06-10 2023-10-27 山东大学 一种融合肽及在制备抗肿瘤制剂中的应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4966848A (en) * 1988-02-08 1990-10-30 The General Hospital Corporation Isolation, purification, characterization, cloning and sequencing of N α-acetyltransferase
US5223421A (en) * 1989-10-25 1993-06-29 The General Hospital Corporation Identification of methionine Nα-acetyltransferase
US5837218A (en) * 1995-09-15 1998-11-17 Resolution Pharmaceuticals Inc. Non-receptor cell mediated imaging agents
US20060040262A1 (en) * 2002-12-27 2006-02-23 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
US20060084799A1 (en) * 2003-09-24 2006-04-20 Williams Lewis T Human cDNA clones comprising polynucleotides encoding polypeptides and methods of their use
US20070010434A1 (en) * 2002-09-16 2007-01-11 Genetech, Inc. Novel compositions and methods for the treatment of immune related diseases
MX2008002028A (es) * 2005-08-11 2008-03-27 Amylin Pharmaceuticals Inc Polipeptidos hibridos con propiedades de seleccion.
CN106011233A (zh) * 2010-08-13 2016-10-12 莫尔豪斯医学院 中风的生物标记
WO2016164762A1 (en) * 2015-04-08 2016-10-13 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same
US20170020926A1 (en) * 2014-04-01 2017-01-26 Rubius Therapeutics, Inc. Methods and compositions for immunomodulation
CN111295454A (zh) * 2017-07-10 2020-06-16 康奈尔大学 靶向染色体不稳定性和下游胞质dna信号传导以治疗癌症

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2739621B1 (fr) * 1995-10-05 1997-12-05 Centre Nat Rech Scient Peptides utilisables comme vecteurs pour l'adressage intracellulaire de molecules actives
CZ20011671A3 (cs) 1998-11-13 2001-10-17 Cyclacel Limited Peptidová nosná skupina pro transport
EP3139944B1 (en) * 2014-04-30 2019-02-13 Mackay Memorial Hospital Dsg2-derived short peptide for use in treating ocular angiogenic diseases

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4966848A (en) * 1988-02-08 1990-10-30 The General Hospital Corporation Isolation, purification, characterization, cloning and sequencing of N α-acetyltransferase
US5223421A (en) * 1989-10-25 1993-06-29 The General Hospital Corporation Identification of methionine Nα-acetyltransferase
US5837218A (en) * 1995-09-15 1998-11-17 Resolution Pharmaceuticals Inc. Non-receptor cell mediated imaging agents
US20070010434A1 (en) * 2002-09-16 2007-01-11 Genetech, Inc. Novel compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US20060040262A1 (en) * 2002-12-27 2006-02-23 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
US20060084799A1 (en) * 2003-09-24 2006-04-20 Williams Lewis T Human cDNA clones comprising polynucleotides encoding polypeptides and methods of their use
MX2008002028A (es) * 2005-08-11 2008-03-27 Amylin Pharmaceuticals Inc Polipeptidos hibridos con propiedades de seleccion.
CN106011233A (zh) * 2010-08-13 2016-10-12 莫尔豪斯医学院 中风的生物标记
US20170020926A1 (en) * 2014-04-01 2017-01-26 Rubius Therapeutics, Inc. Methods and compositions for immunomodulation
WO2016164762A1 (en) * 2015-04-08 2016-10-13 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same
CN111295454A (zh) * 2017-07-10 2020-06-16 康奈尔大学 靶向染色体不稳定性和下游胞质dna信号传导以治疗癌症

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAORI H YAMADA等: "Antiangiogenic therapeutic potential of peptides derived from the molecular motor KIF13B that transports VEGFR2 to Plasmalemma in Endothelial Cells", 《AM J PATHOL》 *
KAORI H YAMADA等: "KIF13B regulates angiogenesis through Golgi to plasma membrane trafficking of VEGFR2", 《J CELL SCI》 *
LUYKX JJ等: "kinesin-like protein KIF13B [Homo sapiens]", 《NCBI GENBANK DATABASE》 *
T HANADA等: "GAKIN, a novel kinesin-like protein associates with the human homologue of the Drosophila discs large tumor suppressor in T lymphocytes", 《J BIOL CHEM》 *
石笑等: "不同浓度血管内皮细胞生长因子对人牙周膜干细胞内皮向分化的影响", 《口腔医学》 *
陈意坤等: "KIF4A对巨噬细胞血管生成相关因子表达的调节作用", 《山东大学学报(医学版)》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3506919A1 (en) 2019-07-10
AU2017318610B2 (en) 2021-12-09
BR112019004203A2 (pt) 2019-06-25
EP3506919A4 (en) 2020-04-15
JP7269649B2 (ja) 2023-05-09
JP2019533638A (ja) 2019-11-21
US20190169241A1 (en) 2019-06-06
SG10202101243YA (en) 2021-03-30
AU2017318610A1 (en) 2019-04-04
US11299524B2 (en) 2022-04-12
CA3074120A1 (en) 2018-03-08
SG11201901393VA (en) 2019-03-28
CN109789180B (zh) 2023-09-08
WO2018045155A1 (en) 2018-03-08
IL264809B (en) 2021-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103648518B (zh) 局部缺血的组合治疗
JP6931011B2 (ja) 血管新生およびリンパ管新生依存性疾患の処置のための生体模倣ペプチドおよび生分解性送達プラットフォーム
US11879002B2 (en) Bi-specific therapeutic proteins, in vivo methods of use thereof and encoding nucleic acids thereof
JP5917437B2 (ja) Ａｄｐリボシルトランスフェラーゼ融合バリアントタンパク質
EP3238746B1 (en) High-density lipoprotein, and delivery of drug to posterior segment of eye by ocular instillation of said cytophilic peptide-fused high-density lipoprotein
US9233162B2 (en) High affinity VEGF-receptor antagonists
US20040235732A1 (en) Method for modulating angiogenesis using prokineticin receptor antagonists
CN109789180A (zh) Kif13b衍生的肽和抑制血管生成的方法
JP7112753B2 (ja) Ｄｓｇ２由来ペプチド
US20220143130A1 (en) Peptides Having Immunomodulatory Properties
JP2020518678A (ja) ギャップ結合細胞間コミュニケーションモジュレータ及び糖尿病性眼疾患の治療のためのそれらの使用
US20220257711A1 (en) PEPTOID-PEPTIDE HYBRID, NMEG-aCGRP, AND ITS USE IN CARDIOVASCULAR DISEASES
JP2023537318A (ja) 中枢神経系障害の処置のためのキメラタンパク質および使用方法
JP2020518675A (ja) ノリン誘発性の遺伝子発現および疾患を処置するためのその使用
EP3407846B1 (en) Composition comprising a semaphorin 3c or variant thereof for use in treating age-related macular degeneration
WO2007069536A1 (ja) 網膜新生血管に対する薬物効果の新規評価システム
WO2023097111A2 (en) Methods and compositions for treating calcinosis associated conditions
KR20090057074A (ko) 혈관형성 억제 및 혈관형성 관련 질환 치료 방법
JP2020517714A (ja) 処置方法および新規構築物
Baid Lens epithelium derived growth factor (1-326): a new protein drug for retinal diseases
CN109414475A (zh) 新型肽和肽模拟物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant