JP7112753B2 - Dsg2由来ペプチド - Google Patents
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Description
MX1EX2WX3IX4R(配列番号1)
(式中、
X1はA、T又はSであり、
X2はK、R又はHであり、
X3はK、R、N、H又はQであり、
X4は、A、V、I、G、L又はPである)のアミノ酸配列を含む合成ペプチド又はその変異体ペプチド又はその修飾ペプチドを提供する。
アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
アルギニン(R)、リシン(K);
イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);及び、
フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
MX1EX2WX3IX4R(配列番号1)
(式中、
X1はA、T又はSであり、
X2はK、R又はHであり、
X3はK、R、N、H又はQであり、
X4は、A、V、I、G、L又はPである)のアミノ酸配列を含む合成ペプチド又はその変異体ペプチド又はその修飾ペプチドを提供する。
SEQ12 MAEKWKIARQESTS(配列番号45)、
SEQ13 MAEKWKIARQEST(配列番号46)、
SEQ14 MAEKWKIARQES(配列番号47)、
SEQ15 MAEKWKIARQE(配列番号48)、
SEQ16 MAEKWKIARQ(配列番号49)、
SEQ18 MAEKWKIA(配列番号50)、
SEQ19 MAEKWKI(配列番号51)、
SEQ20 AEKWKIARQESTSV(配列番号52)、
SEQ21 EKWKIARQESTSV(配列番号53)、
SEQ22 KWKIARQESTSV(配列番号54)、
SEQ23 WKIARQESTSV(配列番号55)、
SEQ24 KIARQESTSV(配列番号56)、
SEQ25 IARQESTSV(配列番号57)、
SEQ26 ARQESTSV(配列番号58)、
SEQ27 RQESTSV(配列番号59)、
SEQ28 AEKWKIARQESTS(配列番号60)、
SEQ29 EKWKIARQEST(配列番号61)、SEQ30 KWKIARQES(配列番号62)
、及び、
SEQ31 WKIARQE(配列番号63)、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
MR9 DF:MAEKWKIAR(配列番号64)、
CMR9C DF:CMAEKWKIARC(配列番号65)、
MR9D6 DF:MAEKWKIARDDDDDD(配列番号66)、及び、
CMR9D6C DF:CMAEKWKIARDDDDDDC(配列番号67)、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
CMR9C DF:CMAEKWKIARC(配列番号65)、及び、
CMR9D6C DF:CMAEKWKIARDDDDDDC(配列番号67)、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
SEQ2 IEPVQTICHDAEYVN(配列番号126)、
SEQ3 AEYVNVTAEDLDGHP(配列番号127)、
SEQ4 LDGHPNSGPFSFSVI(配列番号128)、
SEQ5 SFSVIDKPPGMAEKW(配列番号129)、
SEQ6 MAEKWKIARQESTSV(配列番号130)、
SEQ7 ESTSVLLQQSEKKLG(配列番号131)、
SEQ8 EKKLGRSEIQFLISD(配列番号132)、
SEQ9 FLISDNQGFSCPEKQ(配列番号133)、
SEQ10 CPEKQVLTLTVCECL(配列番号134)、及び、
SEQ11 VCECLHGSGCREAQH(配列番号135)、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む合成ペプチド又はその変異体ペプチド又は修飾ペプチドを提供する。
MDCK細胞(800細胞/ウェル)を96ウェルプレートに蒔き、10%のサブコンフルエントになるまで37℃及び5%CO2でインキュベートした。次いで、EMTを、細胞分散因子HGF(R&D system、2.5ng/ml)を含む培養培地を添加することによって誘発し、EMTを阻止するため試験するペプチドを添加した(SEQ2~SEQ31)。核間距離を測定するため、正立顕微鏡を使用して無作為の画像を50倍の倍率でキャプチャーした。核間距離は、1つの核の中心から近隣の/近接する核の中心までを測定した。2つの核間の距離を、ImageJソフトウェアを使用して測定した。
ヒト膠芽腫細胞(U-87)をマトリゲル被覆ウェル(96ウェルプレート中の6×103細胞/ウェル)に蒔いた。次いで、試験したペプチド(SEQ17、SEQ32~SEQ38、又はPBS対照)をそれぞれウェルに添加し、数日間インキュベートした。チューブの定量のため各ウェルを3つの視野について無作為に撮影し、統計のためチューブの数を数えた。
一晩飢餓状態にしたヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を収集し、内皮細胞増殖培地で1.5×104細胞/ウェル(96ウェルプレートにおいて)に調整した後、マトリゲル被覆ウェルに細胞を蒔いた。種々のペプチド、並びにD形非天然アミノ酸、及び/又はN末端及びC末端のシスチンを付加することによる環状化によるそれらの修飾形態;また、SEQ132は、ペプチド骨格SEQ6の方向の反転である(レトロ修飾):(SEQ17、SEQ78、SEQ97、MR9 DF、CMR9C、CMR9C DF、MR9D6 DF、CMR9D6C DF及びSEQ132)又は対照PBSをウェルに添加し、37℃で5時間インキュベーションした。各ウェルを、正立顕微鏡によって40倍の倍率で撮影した。チューブの合計の長さを、ImageJソフトウェアを使用することにより定量した。マトリゲル上で培養されたHUVEC細胞は、合成ペプチドが血管形成を阻害することができることを実証し、その結果を図4(A)~(D)に示す。
ケタミン塩酸塩/キシラジン塩酸塩(7:1、体積/体積)の混合物1mL/kgの大腿筋への筋肉内注射によって動物を完全に麻酔にかけた。Mydrin(商標)-P眼科用液(参天製薬株式会社)を眼に滴下して瞳孔を散大させた。細隙灯SL-130(Carl Zeiss Meditec AG)及び多色レーザー光凝固装置MC-300(NIDEK Co., Ltd.)を使用することによって、レーザー(波長:532nm)を使用して各動物の右眼に照射した。次いで、マイクロシリンジ(MS-N10、株式会社伊東商会)及び33G針(株式会社伊東商会)を使用して、ペプチド投薬製剤を右眼の硝子体に注入した。レーザー照射の14日後、4%FITC-デキストラン溶液を動物1匹当たり1mLの量で尾静脈に投与した。次いで、動物を麻酔薬の過剰投与によって安楽死させた。眼球を摘除し、12時間~24時間、4%パラホルムアルデヒド-リン酸緩衝液中で固定した。実体顕微鏡(EZ-4、Leica Microsystems)下で脈絡膜のフラットマウント(flat mounts)を作製した。その後、共焦点顕微鏡(株式会社ニコンのECLIPSE TE2000-U)による写真撮影のためラット眼の脈絡膜フラットマウントを作製した。高いフルオレセイン強度を有するレーザー誘導性血管新生部位(単位:ピクセル)の区域を測定するため、ソフトウェアImageJ(国立保健研究所(NIH)、米国)を使用する。
Claims (14)
- SEQ13 MAEKWKIARQEST(配列番号46)、
SEQ14 MAEKWKIARQES(配列番号47)、
SEQ15 MAEKWKIARQE(配列番号48)、
SEQ16 MAEKWKIARQ(配列番号49)、
MR9 DF:MAEKWKIAR(配列番号64)、
CMR9C DF:CMAEKWKIARC(配列番号65)、
MR9D6 DF:MAEKWKIARDDDDDD(配列番号66)、
CMR9D6C DF:CMAEKWKIARDDDDDDC(配列番号67)、
SEQ74 RRRMAEKWKIAR(配列番号68)、
SEQ75 RRRRMAEKWKIAR(配列番号69)、
SEQ76 RRRRRMAEKWKIAR(配列番号70)、
SEQ77 RRRRRRMAEKWKIAR(配列番号71)、
SEQ78 RRRRRRRMAEKWKIAR(配列番号72)、
SEQ79 MAEKWKIARDDD(配列番号73)、
SEQ80 RRRMAEKWKIARDDD(配列番号74)、
SEQ81 RRRRMAEKWKIARDDD(配列番号75)、
SEQ82 RRRRRMAEKWKIARDDD(配列番号76)、
SEQ83 RRRRRRMAEKWKIARDDD(配列番号77)、
SEQ84 RRRRRRRMAEKWKIARDDD(配列番号78)、
SEQ85 MAEKWKIARDDDD(配列番号79)、
SEQ86 RRRMAEKWKIARDDDD(配列番号80)、
SEQ87 RRRRMAEKWKIARDDDD(配列番号81)、
SEQ88 RRRRRMAEKWKIARDDDD(配列番号82)、
SEQ89 RRRRRRMAEKWKIARDDDD(配列番号83)、
SEQ90 RRRRRRRMAEKWKIARDDDD(配列番号84)、
SEQ91 MAEKWKIARDDDDD(配列番号85)、
SEQ92 RRRMAEKWKIARDDDDD(配列番号86)、
SEQ93 RRRRMAEKWKIARDDDDD(配列番号87)、
SEQ94 RRRRRMAEKWKIARDDDDD(配列番号88)、
SEQ95 RRRRRRMAEKWKIARDDDDD(配列番号89)、
SEQ96 RRRRRRRMAEKWKIARDDDDD(配列番号90)、
SEQ97 MAEKWKIARDDDDDD(配列番号91)、
SEQ98 RRRMAEKWKIARDDDDDD(配列番号92)、
SEQ99 RRRRMAEKWKIARDDDDDD(配列番号93)、
SEQ100 RRRRRMAEKWKIARDDDDDD(配列番号94)、
SEQ101 RRRRRRMAEKWKIARDDDDDD(配列番号95)、
SEQ102 RRRRRRRMAEKWKIARDDDDDD(配列番号96)、
SEQ103 DDDMAEKWKIAR(配列番号97)、
SEQ104 DDDDMAEKWKIAR(配列番号98)、
SEQ105 DDDDDMAEKWKIAR(配列番号99)、
SEQ106 DDDDDDMAEKWKIAR(配列番号100)、
SEQ107 MAEKWKIARRRR(配列番号101)、
SEQ108 DDDMAEKWKIARRRR(配列番号102)、
SEQ109 DDDDMAEKWKIARRRR(配列番号103)、
SEQ110 DDDDDMAEKWKIARRRR(配列番号104)、
SEQ111 DDDDDDMAEKWKIARRRR(配列番号105)、
SEQ112 MAEKWKIARRRRR(配列番号106)、
SEQ113 DDDMAEKWKIARRRRR(配列番号107)、
SEQ114 DDDDMAEKWKIARRRRR(配列番号108)、
SEQ115 DDDDDMAEKWKIARRRRR(配列番号109)、
SEQ116 DDDDDDMAEKWKIARRRRR(配列番号110)、
SEQ117 MAEKWKIARRRRRR(配列番号111)、
SEQ118 DDDMAEKWKIARRRRRR(配列番号112)、
SEQ119 DDDDMAEKWKIARRRRRR(配列番号113)、
SEQ120 DDDDDMAEKWKIARRRRRR(配列番号114)、
SEQ121 DDDDDDMAEKWKIARRRRRR(配列番号115)、
SEQ122 MAEKWKIARRRRRRR(配列番号116)、
SEQ123 DDDMAEKWKIARRRRRRR(配列番号117)、
SEQ124 DDDDMAEKWKIARRRRRRR(配列番号118)、
SEQ125 DDDDDMAEKWKIARRRRRRR(配列番号119)、
SEQ126 DDDDDDMAEKWKIARRRRRRR(配列番号120)、
SEQ127 MAEKWKIARRRRRRRR(配列番号121)、
SEQ128 DDDMAEKWKIARRRRRRRR(配列番号122)、
SEQ129 DDDDMAEKWKIARRRRRRRR(配列番号123)、
SEQ130 DDDDDMAEKWKIARRRRRRRR(配列番号124)、および
SEQ131 DDDDDDMAEKWKIARRRRRRRR(配列番号125)、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、合成ペプチド又はその修飾ペプチドであって、
前記修飾ペプチドが、ホモ-リシン、ホモ-アルギニン、ホモ-セリン、アゼチジンカルボン酸、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、ターシャリー-ブチルグリシン、2,4-ジアミノイソ酪酸、デスモシン、2,2’-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、アロ-ヒドロキシリシン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルアラニン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルペンチルグリシン、N-メチルバリン、ナフタアラニン(naphthalanine)、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、シトルリン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、及びチオプロリンからなる群から選択される1以上の非天然起源のアミノ酸修飾、
環状修飾、または、
ペプチドのN末端、C末端、もしくはN末端とC末端の両方に連結された合成ポリアミノ酸ポリマーを含む、合成ペプチド又はその修飾ペプチド。 - 前記合成ポリアミノ酸ポリマーが、ポリリシン(ポリK)、ポリL-アスパラギン酸(ポリD)、ポリL-アルギニン(ポリR)、ポリL-グルタミン酸(ポリE)である、請求項1に記載の合成ペプチド又はその修飾ペプチド。
- 前記合成ポリアミノ酸ポリマーが、1個~12個のK、D、R若しくはE、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の合成ペプチド又はその修飾ペプチド。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の合成ペプチド又はその修飾ペプチドを含む医薬組成物。
- 被験体において、EMT及び/又は血管擬態を阻害するとともに、血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患を治療及び/又は予防する医薬の製造における、請求項1~3のいずれか一項に記載の合成ペプチド又は修飾ペプチドの使用。
- 前記合成ペプチド又は修飾ペプチドが、非経口、局所、又は経口の経路によって投与される、請求項5に記載の使用。
- 前記局所投与が眼に対するものである、請求項6に記載の使用。
- 前記血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患が、新生物、黄斑変性、血管性網膜症又は網膜変性である、請求項5に記載の使用。
- 前記新生物が悪性腫瘍又は癌である、請求項8に記載の使用。
- 前記悪性腫瘍又は癌が、膠芽腫、子宮頸癌、肛門癌、口腔癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、子宮頸部癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、腎臓癌、脳腫瘍、頭頸部癌、眼癌又は眼球の癌、咽喉癌、黒色腫、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞癌及び扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、絨毛癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、口/咽頭癌、食道(esophageal)癌、喉頭癌、腎臓癌及びリンパ腫である、請求項9に記載の使用。
- 前記血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患が、乾癬、座瘡、酒渣、疣贅、湿疹、血管腫、リンパ脈管新生、神経線維腫症、スタージ-ウェーバー症候群、皮膚の静脈性潰瘍、結節性硬化症、慢性炎症性疾患及び関節炎、又は炎症である、請求項5に記載の使用。
- 前記血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患が、視神経円板血管新生、虹彩血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、又は硝子体内血管新生である、請求項5に記載の使用。
- 前記血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患が、眼性血管新生疾患又は黄斑変性である、請求項5に記載の使用。
- 前記黄斑変性が加齢黄斑変性である、請求項13に記載の使用。
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