DSG2-衍生肽
本發明提供用於抑制血管生成擬態及血管生成相關疾病之肽。特定而言，本發明提供Dsg2衍生肽及其在抑制、預防或治療血管生成擬態及血管生成依賴性或血管生成相關疾病方面之應用。
橋粒係上皮組織、心肌組織及其他組織之間細胞間黏著連接之主要類型之一。此等橋粒含有稱為橋粒鈣黏蛋白之跨膜醣蛋白，即橋粒膠蛋白(Dsc)及橋粒核心醣蛋白(Dsg)。每一者以至少三種不同的遺傳同種型出現，其顯示組織特異性表現模式。 Dsg2在所有形成橋粒之組織中遍在表現。Dsg2之細胞外結構域含有4個鈣黏蛋白重複結構域(EC1-4)，各自長度為約110個胺基酸。細胞外重複結構域EC1含有細胞黏著識別(CAR)位點，其提供細胞間黏著。因此，已鑑別Dsg2為跨膜細胞黏著分子。另外，最近研究顯示，Dsg2並非僅為簡單的細胞間黏著分子。Dsg2參與血管生成之促進、細胞凋亡之信號傳導且係MMP之受質。 Dsg2在調節EMT方面起重要作用。其已顯示：(1)使用肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF)觸發EMT顯示除Dsg2以外之大多橋粒黏著組分下調。(2)經Dsg2轉染之上皮細胞展現類間質形態且在HGF/SF處理下顯示更強遷移及入侵能力。(3)針對Dsg2之EC2結構域之抗體在活體外顯著阻斷HGF/SF誘導之EMT。此外，本發明者已確定，針對Dsg2之EC2結構域之抗體抑制癌細胞之入侵，該等癌細胞包括MCF7人類乳癌細胞、LNCaP人類前列腺癌細胞及KM12人類結腸癌細胞。儘管不希望受任一特定理論束縛，但本發明者提出Dsg2可在細胞中用於促進EMT。US 20040229811教示藉由在哺乳動物中抑制表現dsc之細胞及/或表現dsg之細胞之黏著來治療癌症。WO 99/57149表明，可使用源自Dsg2之EC2結構域之細胞黏著識別(CAR)位點作為治療癌症及/或抑制轉移之調節劑。US 20120276082揭示Dsg2之拮抗劑，其中該拮抗劑調節Dsg2之EC2結構域之功能。 已暗示，Dsg2參與諸如癌症之人類疾病，該Dsg2在若干上皮源惡性腫瘤(包括基底細胞癌(BCC)、鱗狀細胞癌(SCC)、胃癌、黑色素瘤、轉移性前列腺癌及膀胱癌)中高度表現。
本發明係基於Dsg2衍生肽之開發，該Dsg2衍生肽用於抑制EMT及/或血管生成擬態及治療及/或預防血管生成相關疾病。本發明之肽可衍生自Dsg2之位置500至604 (IEPVQTICHDA EYVNVTAEDL DGHPNSGPFS FSVIDKPPGMAEKWKIARQESTSVLLQQSEKKLGRSEIQFLISDNQGFSCPEKQVLTLTVCECLHGSGCREAQH (SEQ ID NO: 136))之胺基酸殘基且其可經進一步修飾。 本發明提供包含下式(I)之胺基酸序列之合成肽： MX1
EX2
WX3
IX4
R (SEQ ID NO:1) 其中 X1
係A、T或S； X2
係K、R或H； X3
係K、R、N、H或Q；且 X4
係A、V、I、G、L或P； 或其變體肽或其修飾肽。 在一些實施例中，在式(I)中，X1
係A或T；X2
係K或R；X3
係K、R或N且X4
係A、V或I。在一些其他實施例中，本發明之肽包含SEQ ID NO: 2至37之任一者之胺基酸序列。 在一些實施例中，本發明之變體肽具有與SEQ ID NO: 1之序列至少70%、80%、90%、95%、98%、99%之胺基酸序列一致性。在一些實施例中，本發明之變體肽具有一或多個取代、缺失或插入。在另一實施例中，本發明之變體肽具有保守變化。 在一些實施例中，本發明之變體肽包含選自由SEQ ID NO: 45至63組成之群之胺基酸序列。 在一些實施例中，本發明之修飾肽可包括(但不限於)一或多個連接至本發明之肽之N-末端、C-末端或N-末端及C-末端二者之非天然或修飾胺基酸、環肽及合成聚胺基酸聚合物(例如，聚離胺酸(polyK)、聚L-天冬胺酸(polyD)、聚-L-精胺酸(polyR)、聚L-麩胺酸(polyE))。在一些實施例中，本發明之修飾肽包含選自由以下各項組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 64至67及SEQ ID NO: 68至125。 本發明亦提供包含選自由SEQ ID NO:126至134組成之群之胺基酸序列之合成肽或其變體肽或其修飾肽。在一個實施例中，修飾肽係SEQ6之反向序列，其包含SEQ132之胺基酸序列：VSTSEQRAIKWKEAM (SEQ ID NO:135)。 本發明亦提供包含本發明之肽或其變體肽或其修飾肽之醫藥組合物。 本發明亦提供在個體中抑制EMT及/或血管生成擬態且治療及/或預防血管生成依賴性或血管生成相關疾病之方法，其包含將本發明之肽或其肽變體或修飾肽投與個體。另外，本發明提供本發明之肽或其肽變體或修飾肽之用途，其用於製造在個體中抑制EMT及/或血管生成擬態且治療及/或預防血管生成依賴性或血管生成相關疾病之藥劑。
在以下說明中，使用多個術語且提供以下定義以促進理解所主張之標的物。在本文中未明確定義之術語係根據其通常的普通含義使用。 除非另外規定，否則一(a或an)意指「一或多」。 在本申請案通篇中，術語「約」係用於指示值包括固有誤差差異。 如本文中所使用，片語「合成肽」出於本發明標的物之目的係指藉由胺基酸之已知化學反應或藉由如上文所述生物材料之分離及純化所製備之肽。 如本文中所使用，術語「天然的」係指物體可在自然界中發現之事實。舉例而言，存在於可自自然界中之來源分離之來源中之蛋白質。 如本文中所使用，術語「投與(administer、administering或to administer)係指藥劑之給予或供給，包括活體內投與以及直接離體投與組織。 術語「胺基酸殘基」或「胺基酸」或「殘基」可互換使用，係指納入蛋白質、多肽或肽中之胺基酸，包括(但不限於)天然胺基酸及可以與天然胺基酸類似之方式發揮功能的天然胺基酸之已知類似物。本文中用於胺基酸之縮寫是習用之彼等縮寫：A=Ala=丙胺酸；R=Arg=精胺酸；N=Asn=天冬醯胺；D=Asp=天冬胺酸；C=Cys=半胱胺酸；Q=Gln=麩醯胺酸；E=Glu=麩胺酸；G=Gly=甘胺酸；H=His=組胺酸；I=Ile=異白胺酸；L=Leu=白胺酸；K=Lys=離胺酸；M=Met=甲硫胺酸；F=Phe=苯丙胺酸；P=Pro=脯胺酸；S=Ser=絲胺酸；T=Thr=蘇胺酸；W=Trp=色胺酸；Y=Tyr=酪胺酸；V=Val=纈胺酸。胺基酸可為L-胺基酸或D-胺基酸。胺基酸可由合成胺基酸替代，該合成胺基酸經改變以增加肽之半衰期或提高肽之功效，或提高肽之生物利用度。為彼此之保守取代之胺基酸之組如下。 丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)； 天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)； 天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)； 精胺酸(R)、離胺酸(K)； 異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；及 苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。 如本文中所使用，術語「肽」係指兩個或更多個胺基酸以化學方式連接在一起之分子。肽可指多肽、蛋白質或肽模擬物。本發明之肽可包含D-胺基酸、D-胺基酸與L-胺基酸之組合及多種「設計者」胺基酸(例如，β-甲基胺基酸、C-α-甲基胺基酸及N-α-甲基胺基酸等)以賦予特殊性質。合成胺基酸包括針對離胺酸之鳥胺酸及針對白胺酸或異白胺酸之正白胺酸。另外，肽可具有肽模擬鍵(例如，酯鍵)以製備具有新穎性質之肽。 如本文中所用，術語「環肽模擬物」或「環狀多肽模擬物」係指肽模擬物，其具有一或多種環狀特徵(例如，環、橋連部分及/或內部連接)作為其結構之部分。 如本文中所使用，術語「醫藥上可接受的」係指適於投與人類及/或動物而無過度不良副作用(例如，毒性、刺激及/或過敏反應)且與合理效益/風險比相稱之化合物及組合物。 如本文中所使用，術語「個體」及「患者」可互換使用且將理解為係指溫血動物、尤其哺乳動物。在此術語之範疇及意義內之動物之非限制性實例包括天竺鼠、狗、貓、大鼠、小鼠、馬、山羊、牛、綿羊、動物園動物、非人類靈長類動物及人類。 如本文中所使用，術語「有效量」係指當以發明性概念之方式使用時，肽化合物足以展現可檢測治療效應而無過量不良副作用(例如，毒性、刺激及過敏反應)且與合理效益/風險比相稱之量。 如本文中所使用，術語「治療有效量」係指標的Dsg2肽在投與哺乳動物或另一個體用於治療疾病時，足以實現此疾病之該治療之量。 如本文中所使用，術語「治療(treatment、treating及諸如此類)」涵蓋哺乳動物(尤其人類)之疾病之任何治療，且包括：(a)在可易患該疾病但尚未診斷為患有該疾病之個體中預防疾病發生；(b)抑制疾病，亦即阻止其發展；及(c)緩解疾病，亦即引起疾病消退。 在一態樣中，本發明提供包含下式(I)之胺基酸序列之合成肽： MX1
EX2
WX3
IX4
R (SEQ ID NO:1) 其中 X1
係A、T或S； X2
係K、R或H； X3
係K、R、N、H或Q；且 X4
係A、V、I、G、L或P； 或其變體肽或其修飾肽。 在一些實施例中，在式(I)中，X1
係A或T；X2
係K或R；X3
係K、R或N且X4
係A、V或I。在一些其他實施例中，本發明之肽包含選自由以下各項組成之群之胺基酸序列：
在一些實施例中，變體肽之任一胺基酸殘基可自該等肽之相應殘基改變，同時仍編碼維持對EMT、血管生成擬態或血管生成相關疾病之抑制活性之肽。在一個實施例中，肽之變體具有與SEQ ID NO:1之序列至少70%、80%、90%、95%、98%、99%之胺基酸序列一致性。 「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為當比對兩個序列時，與參考(親本)多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基之百分比。為測定胺基酸一致性%，比對序列，且若需要，引入空位以達成最大序列一致性%。測定一致性百分比之胺基酸序列比對程序為熟習此項技術者所熟知。通常使用可公開獲得之電腦軟體(例如，BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign (DNASTAR)軟體)來比對肽序列。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。 在一些實施例中，本發明之肽變體包括其中序列中特定位置之殘基已由其他胺基酸取代之變體，且進一步包括在親本肽/多肽之兩個殘基之間插入額外一或多個殘基之可能性以及自親本序列缺失一或多個殘基或將一或多個殘基添加至親本序列之可能性。本發明涵蓋任一胺基酸取代、插入或缺失。在某些情況下，取代係如本文中所述之保守取代。 保守變化通常導致所得蛋白質之結構及功能之較小變化。舉例而言，本發明之肽包含一或多種以下保守胺基酸取代：將脂肪族胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸)用另一脂肪族胺基酸替代；用蘇胺酸替代絲胺酸；用絲胺酸替代蘇胺酸；將酸性殘基(例如，天冬胺酸及麩胺酸)用另一酸性殘基替代；將具有醯胺基之殘基(例如，天冬醯胺及麩醯胺酸)用另一具有醯胺基之殘基替代；將鹼性殘基(例如，離胺酸及精胺酸)與另一鹼性殘基交換；及將芳香族殘基(例如，苯丙胺酸及酪胺酸)用另一芳香族殘基替代。 在一些其他實施例中，本發明之肽變體(胺基酸取代)包含選自由以下各項組成之群之胺基酸序列：
在一些其他實施例中，本發明之肽變體(胺基酸缺失)包含選自由以下各項組成之群之胺基酸序列： SEQ12 MAEKWKIARQESTS (SEQ ID NO:45)； SEQ13 MAEKWKIARQEST (SEQ ID NO:46)； SEQ14 MAEKWKIARQES (SEQ ID NO:47)； SEQ15 MAEKWKIARQE (SEQ ID NO:48)； SEQ16 MAEKWKIARQ (SEQ ID NO:49)； SEQ18 MAEKWKIA (SEQ ID NO:50)； SEQ19 MAEKWKI (SEQ ID NO:51)； SEQ20 AEKWKIARQESTSV (SEQ ID NO:52)； SEQ21 EKWKIARQESTSV (SEQ ID NO:53)； SEQ22 KWKIARQESTSV (SEQ ID NO:54)； SEQ23 WKIARQESTSV (SEQ ID NO:55)； SEQ24 KIARQESTSV (SEQ ID NO:56)； SEQ25 IARQESTSV (SEQ ID NO:57)； SEQ26 ARQESTSV (SEQ ID NO:58)； SEQ27 RQESTSV (SEQ ID NO:59)； SEQ28 AEKWKIARQESTS (SEQ ID NO:60)； SEQ29 EKWKIARQEST (SEQ ID NO:61)； SEQ30 KWKIARQES (SEQ ID NO:62)；及 SEQ31 WKIARQE (SEQ ID NO:63)。 在一些實施例中，本發明之修飾肽可包含一或多種非天然胺基酸用於修飾。「非天然胺基酸殘基」係指除彼等天然胺基酸殘基以外之殘基，其能夠以共價方式結合多肽鏈中之毗鄰胺基酸殘基。非天然胺基酸包括(但不限於)高-離胺酸、高-精胺酸、高-絲胺酸、鈴蘭胺酸、2-胺基己二酸、3-胺基己二酸、β-丙胺酸、胺基丙酸、2-胺基丁酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-胺基庚二酸、第三丁基甘胺酸、2,4-二胺基異丁酸、鎖鏈素、2.2'-二胺基庚二酸、2,3-二胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺、高脯胺酸、羥基離胺酸、別-羥基離胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸、異鎖鏈素、別-異白胺酸、N-甲基丙胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基戊基甘胺酸、N-甲基纈胺酸、萘丙胺酸、正纈胺酸、正白胺酸、鳥胺酸、瓜胺酸、戊基甘胺酸、六氫菸鹼酸及硫代脯胺酸。修飾胺基酸包括天然及非天然胺基酸，其可逆地或不可逆地經化學封阻或在其N-末端胺基或其側鏈基團上經修飾，如(例如) N-甲基化之D胺基酸及L胺基酸、經化學修飾成另一官能基之側鏈官能基。舉例而言，修飾胺基酸包括甲硫胺酸亞碸；甲硫胺酸碸；天冬胺酸-(β-甲基酯)(天冬胺酸之修飾胺基酸)；N-乙基甘胺酸(甘胺酸之修飾胺基酸)；或丙胺酸甲醯胺及丙胺酸之修飾胺基酸。 在一些實施例中，本發明之修飾肽包含選自由以下各項組成之群之胺基酸序列： MR9 DF: MAEKWKIAR (SEQ ID NO:64)； CMR9C DF: CMAEKWKIARC (SEQ ID NO:65)； MR9D6 DF: MAEKWKIARDDDDDD (SEQ ID NO:66)；及 CMR9D6C DF: CMAEKWKIARDDDDDDC (SEQ ID NO:67)。 在一個實施例中，修飾肽係呈環狀形式。一種修飾係基於胺基酸之交聯以產生環狀結構。蛋白質中之環狀區域含有剛性域，其降低構象撓性及旋轉自由度，從而產生結合至靶蛋白質之極高親和性。多種環化多肽之方法可為熟習此項技術者所用且以引用方式併入本文中。通常，利用多肽之特定胺基酸側鏈及/或羧基或胺基末端之化學反應性使多肽之兩個位點交聯以產生環狀分子。在一種方法中，使兩個半胱胺酸殘基之硫醇基藉由與二溴二甲苯之反應交聯。 在一些實施例中，呈環狀形式之本發明之修飾肽包含選自由以下各項組成之群之胺基酸序列： CMR9C DF: CMAEKWKIARC (SEQ ID NO:65)；及 CMR9D6C DF: CMAEKWKIARDDDDDDC (SEQ ID NO:67)。 在另一實例性方法中，側鏈胺基及末端胺基與二琥珀醯亞胺戊二酸酯交聯。在其他方式中，環化係藉由在多肽上之兩個位點之間形成硫醚橋連基團來實現。一種化學方法依賴於在多肽之N-末端納入N-氯乙醯基修飾之胺基酸，隨後與內部半胱胺酸殘基之硫醇側鏈自發反應。酶法依賴於(1)半胱胺酸與(2)脫氫丙胺酸或脫氫丁胺酸基團之間之反應，該反應由羊毛硫抗生素(lantibiotic)合成酶催化，以產生硫醚橋連基團。脫氫官能基亦可藉由氧化在轉譯期間納入之含硒胺基酸側鏈以化學方式生成。 在一個實施例中，本發明之修飾肽包含連接至本發明之肽之N-末端、C-末端或N-末端及C-末端二者之合成聚胺基酸聚合物(例如，聚離胺酸(polyK)、聚L-天冬胺酸(polyD)、聚-L-精胺酸(polyR)、聚L-麩胺酸(polyE)或聚麩醯胺酸(PolyQ))。在一些實施例中，對SEQ17之修飾係藉由添加聚-精胺酸(R)或聚-天冬胺酸(D)以獲得多種合成肽SEQ74至SEQ131來進行。在另一實施例中，合成聚胺基酸包含1至12個聚胺基酸，較佳3至8個聚胺基酸。在一些實施例中，合成聚胺基酸包含1至12個K殘基、1至12個D殘基、1至12個R殘基、1至12個Q殘基或1至12個E殘基或其組合。在一些實施例中，合成聚胺基酸包含3至7個R殘基或3至7個D殘基或其組合。在一些實施例中，修飾肽係具有選自由以下各項組成之群之合成聚胺基酸聚合物之本發明之肽：
在另一態樣中，本發明提供包含選自由以下各項組成之群之胺基酸序列之合成肽：
或其變體肽或其修飾肽。 在一個實施例中，修飾肽係SEQ6之反向序列，其包含SEQ132之胺基酸序列：VSTSEQRAIKWKEAM (SEQ ID NO:136)。 SEQ2至SEQ11之變體肽包括具有如本文中所述之胺基酸序列一致性及如本文中所述之胺基酸取代、添加或缺失之肽。修飾肽包括具有非天然胺基酸修飾、環狀修飾及合成聚胺基酸聚合物修飾之肽。 本發明之肽可衍生自來自Dsg2之位置500至604 (IEPVQTICHDA EYVNVTAEDL DGHPNSGPFS FSVIDKPPGM AEKWKIARQESTSVLLQQSEKKLGRSEIQFLISDNQGFSCPEKQVLTLTVCECLHGSGCREAQH (SEQ ID NO:137))之胺基酸殘基且其可經進一步修飾。本文所闡述之肽亦可藉由化學合成或使用重組DNA技術製造來製備。舉例而言，肽可藉由如業內已知之使用疊氮化物、醯氯、酸酐、化合物酸酐、DCC、活化酯、伍德沃德氏試劑K (Woodward's reagent K)、羰基咪唑、脫氧、DCC/HONB、BOP試劑等之方法獲得。另外，其可使用自動化肽合成器藉由化學合成製備。 在此一化學反應後，肽可分離並藉由已知純化方法純化。此等純化方法之實例可包括溶劑萃取、蒸餾、管柱層析、液相層析、再結晶及諸如此類之組合。 此外，可使用宿主細胞(例如，大腸桿菌(E. coli
))中之重組表現系統將本文所闡述之肽表現為具有特定酶裂解位點之融合蛋白(例如，腸激酶)。接下來，將細胞打碎並離心且所得漿液含有肽。然後可將肽加載於特定親和管柱(例如，Ni2+或麩胱甘肽管柱)上以經溶析。溶析後，使所純化之肽經受特定酶裂解反應。然後，藉由HPLC或離子交換層析將肽自所得混合物純化。涉及習用及分析化學、分子生物學及細胞生物學技術之方法在許多公開已知之參考文獻中詳細闡述。 在另一態樣中，本發明提供包含本發明之肽或其變體肽或其修飾肽之醫藥組合物。 本發明提供能夠抑制EMT及/或血管生成擬態且治療及/或預防血管生成依賴性或血管生成相關疾病之醫藥組合物，其包含本發明之肽或其變體肽或其修飾肽及至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。較佳將本發明之肽與其他組分(例如，載劑)組合於組合物(例如，醫藥組合物)中。該等組合物當在醫學治療或預防血管生成相關疾病之方法中投與時有用。醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用之劑量及濃度下對接受者無毒。其可為固體、半固體或液體。本發明之醫藥組合物可呈以下形式：錠劑、丸劑、粉末、菱形錠劑、小藥囊、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳液、溶液或糖漿。 在一些實施例中，本發明提供在個體中抑制EMT及/或血管生成擬態且治療及/或預防血管生成依賴性或血管生成相關疾病之方法，其包含將本發明之肽或其肽變體或修飾肽投與個體。因此，本發明提供本發明之肽或其肽變體或修飾肽之用途，其用於製造在個體中抑制EMT及/或血管生成擬態且治療及/或預防血管生成依賴性或血管生成相關疾病之藥劑。 在本說明書通篇中使用血管生成來闡述生物過程，其導致血管之發展或生物體中組織之血管供應增加。持久、未經調節之血管生成存在於眾多疾病狀態、腫瘤轉移及內皮細胞之異常生長中且支持在該等病狀中所見之病理損傷。已將因未經調節之血管生成所產生之不同的病理狀態一起分為血管生成依賴性或血管生成相關疾病。旨在控制血管生成過程之療法可導致該等疾病之消除或減輕。 藉由本發明治療、改善或預防之疾病或病症包括以下各項：黃斑退化、年齡相關性黃斑退化、贅瘤形成、內部惡性腫瘤(例如，眼癌或眼部癌、直腸癌、結腸癌、子宮頸癌、前列腺癌、乳癌及膀胱癌)；良性及惡性腫瘤，包括多種癌症，例如肛門癌及口腔癌、胃癌、直腸癌、肝癌、胰臟癌、肺癌、子宮頸癌、子宮體癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、腎癌、口/咽癌、食道癌、喉癌、腎臟癌、腦/中樞神經系統癌(brain/ens)(例如，神經膠質瘤)、頭頸癌、喉癌、皮膚黑色素瘤、急性淋巴球性白血病、急性骨髓性白血病、尤恩氏肉瘤(Ewing's Sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、基底細胞癌及鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、絨毛膜癌、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、血管內皮瘤、威爾姆氏瘤(Wilms Tumor)、神經胚細胞瘤、淋巴瘤、神經纖維瘤、結節性硬化症(該等病狀各自產生良性皮膚腫瘤)、血管瘤、淋巴管生成、橫紋肌肉瘤、視網膜母細胞瘤、骨肉瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、沙眼、化膿性肉芽腫、血源性腫瘤(例如，白血病、多種急性或慢性骨髓腫瘤性疾病之任一者(其中發生白血球之無限增殖，通常伴隨貧血、凝血受損以及淋巴結、肝及脾之增大))；牛皮癬、痤瘡、酒渣、疣、濕疹、神經纖維瘤、史德格-韋伯症候群(Sturge-Weber syndrome)、皮膚之靜脈性潰瘍、結節性硬化症、慢性發炎性疾病、關節炎、狼瘡、硬皮症、糖尿病視網膜病變、早產之視網膜病變、角膜移植物排斥、新血管青光眼及晶狀體後纖維組織增生、流行性角膜結膜炎、維生素A缺乏、接觸鏡超戴症、特應性角膜炎、上緣角膜炎、翼狀胬肉、乾燥性角膜炎、休格倫氏症候群(Sjogren's)、泡性角結膜炎(phylectenulosis)、梅毒、分枝桿菌感染(Mycobacteria infections)、脂質變性、化學燒傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純皰疹感染、帶狀皰疹感染、原生動物感染、莫倫氏潰瘍(Mooren's ulcers)、特芮安氏角膜邊緣變性(Terrien's marginal degeneration)、邊緣性角質層分離、創傷、類風濕性關節炎、全身性狼瘡、多動脈炎、韋格納類肉瘤病(Wegener's sarcoidosis)、鞏膜炎、斯-瓊森二氏病(Stevens-Johnson disease)、類天皰瘡、放射狀角膜切開術、角膜移植物排斥、糖尿病視網膜病變、黃斑水腫、黃斑退化、鐮狀細胞貧血症、肉狀瘤、彈性假黃瘤、佩吉特氏病(Pagefs disease)、靜脈阻塞、動脈阻塞、頸動脈阻塞疾病、慢性眼色素層炎/玻璃體炎、萊姆病(Lyme disease)、全身性紅斑狼瘡、Bale氏病、貝歇氏病(Behcet's disease)、引起視網膜炎或脈絡膜炎之感染、假定眼部組織胞漿菌病、貝斯特氏病(Best's disease)、近視、視窩、斯塔加特病(Stargardt's disease)、睫狀體平坦部炎、慢性視網膜脫離、黏性過大症候群、弓蟲症、創傷、雷射後併發症、皮膚發紅(踝之新血管形成)、由纖維血管或纖維組織之異常增殖所引起之疾病(包括所有形式之增殖性玻璃體視網膜病變，無論是否與糖尿病相關)、新血管疾病、血管翳、糖尿病黃斑水腫、血管視網膜病變、視網膜變性、視網膜之發炎性疾病、增殖性玻璃體視網膜病變、與皮膚發紅相關之疾病(踝之新血管形成)、由纖維血管或纖維組織之異常增殖所引起之疾病(包括所有形式之增殖性玻璃體視網膜病變)、克隆氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎、類肉瘤病、骨關節炎、發炎性腸病、皮膚病灶、Osler-Weber-Rendu三氏病或遺傳性出血性血管擴張、骨關節炎、類肉瘤病、皮膚病灶、後天免疫缺失症候群及小腸阻塞。 在一些實施例中，血管生成依賴性或血管生成相關疾病係贅瘤形成(包括惡性腫瘤或癌症)、黃斑退化(包括年齡相關性黃斑退化)、新血管疾病、血管視網膜病變或視網膜變性。 本發明之血管生成抑制肽用於治療、改善或預防良性及惡性腫瘤，其包括多種癌症，尤其例如子宮頸癌、肛門癌、口腔癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、直腸癌、肝癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮體癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、腎癌、腦癌(例如，神經膠質瘤)、頭頸癌、眼癌或眼部癌、喉癌、黑色素瘤、急性淋巴球性白血病、急性骨髓性白血病、尤恩氏肉瘤、卡波西氏肉瘤、基底細胞癌及鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、絨毛膜癌、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、血管內皮瘤、威爾姆氏瘤、神經胚細胞瘤、口/咽癌、食道癌、喉癌、腎臟癌及淋巴瘤。另外，本發明化合物尤其可有效治療諸如神經纖維瘤、結節性硬化症(該等症狀各自產生良性皮膚腫瘤)、血管瘤及淋巴管生成之病狀。 血管生成在實體腫瘤形成及轉移中顯著。 已發現血管生成因子與若干實體腫瘤相關，例如橫紋肌肉瘤、視網膜母細胞瘤、尤恩氏肉瘤、神經胚細胞瘤及骨肉瘤。沒有血液供應提供營養並去除細胞廢物，腫瘤無法擴增。其中血管生成重要之腫瘤包括實體腫瘤及良性腫瘤，例如聽神經瘤、神經纖維瘤、沙眼及化膿性肉芽腫。預防血管生成可停止該等腫瘤之生長及因腫瘤之存在而對動物造成之損傷。 應注意，血管生成已與血源性腫瘤相關，例如白血病、多種急性或慢性骨髓腫瘤性疾病之任一者(其中發生白血球之無限增殖，通常伴隨貧血、血凝受損及淋巴結、肝及脾之增大)。據信，血管生成在導致白血病類腫瘤之骨髓異常中起重要作用。 血管生成在腫瘤轉移之兩個階段中重要。其中血管生成刺激重要之第一階段係在腫瘤之血管形成中，其容許腫瘤細胞進入血流並循環遍及全身。腫瘤細胞離開原發位點並遷入繼發性轉移位點後，在新腫瘤可生長並擴大之前必然發生血管生成。因此，預防或控制血管生成可導致預防腫瘤轉移，並可能將腫瘤生長限制在原發位點。 兒童期最頻發之血管生成疾病之一係血管瘤。在大多數情形下，該等腫瘤為良性且在無介入之情況下消退。在更嚴重之情形下，腫瘤進展至大的海綿狀及浸潤性形式並產生臨床併發症。血管瘤之全身形式多發血管瘤具有高死亡率。＜}存在用目前所用治療劑無法治療之治療抵抗性血管瘤。 在本說明中通篇使用血管生成疾病、血管生成病症及血管生成皮膚病症闡述由於組織中之血管形成增加而發生或導致該組織中血管形成增加之病症、通常皮膚病症或皮膚相關病症。＜}主要或次要特徵為血管形成增加之任何皮膚病症出於本發明之目的視為血管生成皮膚病症且適於利用根據本發明之化合物治療。 本發明亦涵蓋治療、改善或預防以下疾病之方法：血管生成皮膚病症(例如，牛皮癬、痤瘡、酒渣、疣、濕疹、血管瘤、淋巴管生成、神經纖維瘤、史德格-韋伯症候群、皮膚之靜脈性潰瘍、結節性硬化症、慢性發炎性疾病及關節炎)以及發炎(例如，慢性發炎性疾病，包括關節炎、狼瘡及硬皮症)，此等方法包含將治療有效量之一或多種所揭示化合物投與需要此治療之患者。 與新血管形成相關之疾病包括視神經盤新血管形成、虹膜新血管形成、視網膜新血管形成、脈絡膜新血管形成、角膜新血管形成及玻璃體內新血管形成。 由血管生成介導之疾病之一個實例係眼部新血管疾病。此疾病之特徵在於新血管入侵至眼結構(例如，視網膜或角膜)中。其係失明最常見病因且涉及約20種眼疾。在年齡相關性黃斑退化中，隨著視網膜色素上皮下纖維血管組織之增殖，脈絡膜微血管穿過Bruch氏膜中之缺陷向內生長引起相關視力問題。 與慢性發炎及關節炎相關之疾病可藉由本發明之肽、組合物及方法治療、改善或預防。具有慢性發炎症狀之疾病包括發炎性腸病(例如，克隆氏病及潰瘍性結腸炎)、牛皮癬、類肉瘤病、類風濕性關節炎、骨關節炎、狼瘡及硬皮症。血管生成係該等慢性發炎性疾病共有之關鍵要素。慢性發炎依賴於微血管芽之持續形成以維持發炎性細胞之流入。發炎性細胞之流入及存在產生肉芽腫，且因此維持慢性發炎性狀態。 欲以單一劑量或分開劑量投與人類或另一哺乳動物宿主之本發明肽之總日劑量可呈(例如)每天約0.0001至約750 mg/kg體重，且更通常約1至約300 mg/kg體重之量。在一些實施例中，醫藥組合物係藉由注射投與眼中，使得本發明之肽以以下劑量給予：每次注射約0.1 mg與約50 mg之間、更佳每次注射約0.3 mg與約40 mg之間、最佳每次注射約0.5 mg與約30 mg之間、約1 mg與約30 mg之間、約3 mg與約30 mg之間、約5 mg與約30 mg之間、約8 mg與約30 mg之間、約10 mg與約30 mg之間、約15 mg與約30 mg之間、約20 mg與約30 mg之間、約0.5 mg與約25 mg之間、約0.5 mg與約20 mg之間、約0.5 mg與約15 mg之間、約0.5 mg與約10 mg之間、約0.5 mg與約5 mg之間或約0.5 mg與約3 mg之間。此外，醫藥組合物係藉由滴眼劑投與眼，使得將單滴含有以下濃度之本發明肽之溶液施加至眼：約10 mg/ml與約600 mg/ml之間、更佳約20 mg/ml與約500 mg/ml之間、最佳約30 mg/ml與約400 mg/ml之間、約30 mg/ml與約350 mg/ml之間、約30 mg/ml與約300 mg/ml之間、約30 mg/ml與約250 mg/ml之間、約30 mg/ml與約200 mg/ml之間、約30 mg/ml與約150 mg/ml之間、約30 mg/ml與約100 mg/ml之間、約30 mg/ml與約50 mg/ml之間、約50 mg/ml與約400 mg/ml之間、約100 mg/ml與約400 mg/ml之間、約150 mg/ml與約400 mg/ml之間、約200 mg/ml與約400 mg/ml之間、約250 mg/ml與約400 mg/ml之間、約300 mg/ml與約400 mg/ml之間或約350 mg/ml與約400 mg/ml之間。 治療有效量之本發明醫藥組合物之投與定義為達成期望結果所需之劑量及持續時間段下有效之量。舉例而言，肽之治療活性量可根據諸如以下之因素變化：個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及藥物在個體中引發期望反應之能力。可對劑量方案進行調整以提供最佳治療反應。舉例而言，可每日投與若干分開劑量或者該劑量可依照治療情形之緊急程度所示按比例減少。 醫藥組合物可經由諸如以下之任一方便或適宜途徑投與需要其之個體：藉由非經腸(包括(例如)動脈內、靜脈內、肌內、皮下)、局部(包括皮內、經皮、皮下等)、經口、經鼻、黏膜(包括舌下)或腔內途徑。因此，組合物可以多種形式調配，包括溶液、懸浮液、乳液及固體形式，且通常經調配以適於所選投與途徑，例如調配為適於非經腸投與之可注射調配物，用於經口攝取之膠囊、錠劑、囊片、酏劑，呈適於藉由吸入(例如，藉由鼻內吸入或經口吸入)投與之氣溶膠形式或適於局部投與之軟膏劑、乳膏劑、凝膠或洗劑。 舉例而言，用於非經腸注射之醫藥組合物包含醫藥上可接受之無菌水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及在即將使用之前重構成為無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。適宜水性及非水性載劑、稀釋劑、溶劑或媒劑之實例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇及諸如此類)、羧甲基纖維素及其適宜混合物、植物油(例如，橄欖油)以及可注射有機酯(例如，油酸乙酯)。舉例而言，可藉由使用諸如卵磷脂等包覆材料、藉由在分散劑之情形下維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。該等組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。 舉例而言，與本發明之肽相容使用之經口劑型或單位劑量可包括肽及非藥物組分或賦形劑，以及其他可視為成分或包裝之不可再用之材料之混合物。口服組合物可包括液體、固體及半固體劑型之至少一種。在一些實施例中，提供包含有效量之肽之口服劑型，其中該劑型包含丸劑、錠劑、膠囊、凝膠、糊劑、飲劑及糖漿之至少一種。在一些情形下，提供口服劑型，其經設計及構形以達成肽二聚體在個體小腸中之延遲釋放。 舉例而言，局部投與包括投與皮膚或黏膜，包括肺及眼之表面。用於局部肺投與之組合物(包括用於吸入及鼻內之彼等)可涉及呈水性及非水性調配物之溶液及懸浮液，且可製備為可加壓或不加壓之乾粉。在不加壓粉末組合物中，可使用呈精細分散形式之活性成分與較大尺寸之醫藥上可接受之惰性載劑之混合物，該惰性載劑包含具有(例如)直徑高達100微米之尺寸的顆粒。適宜惰性載劑包括糖，例如乳糖。 局部投與之另一形式係投與眼。本發明之化合物係在醫藥上可接受之眼用媒劑中遞送，使得化合物維持與眼表面接觸足夠時間段以使化合物穿透眼之角膜及內部區域，如例如前房、後房、玻璃體、水樣液、玻璃樣液、角膜、虹膜/睫狀體、晶狀體、脈絡膜/視網膜及鞏膜。醫藥上可接受之眼用媒劑可係(例如)軟膏劑、植物油或封裝材料。或者，本發明之化合物可直接注射至玻璃樣液及水樣液中。 本發明之肽亦可以脂質體形式來投與。如業內已知，脂質體通常係源自磷脂或其他脂質物質。脂質體係藉由分散於水性介質中之單層或多層水合液晶來形成。可使用任何能夠形成脂質體之生理上可接受且可代謝之無毒脂質。除本發明之化合物外，呈脂質體形式之本發明組合物可含有穩定劑、防腐劑、賦形劑及諸如此類。較佳脂質係呈天然及合成形式二者之磷脂及磷脂醯膽鹼(卵磷脂)。形成脂質體之方法為業內已知。 本說明書中所提及之任何先前出版物(或源自其之資訊)或任何已知內容不會且不應視為承認或認可或以任何形式表明該先前出版物(或源自其之資訊)或已知內容形成本說明書相關之技術領域中之普通常識之部分。 現將參考以下具體實例闡述本發明，該等具體實例不應理解為以任何方式限制本發明之範疇。實例 實例 1 本發明之肽之 EMT 分析
將MDCK細胞(800個細胞/孔)接種至96孔板上並在37℃及5% CO2
下培育，以成為10%亞鋪滿。然後藉由添加具有細胞分散因子HGF (R&D system，2.5 ng/ml)之培養基觸發EMT並添加所測試之肽(SEQ2 - SEQ31)以阻斷EMT。為量測核間距離，使用直立顯微鏡以×50放大率捕獲隨機影像。核間距離係自一個細胞核之中心至相鄰/毗鄰細胞核之中心量測。兩個細胞核之間之距離係藉由使用ImageJ軟體來量測。 將肽SEQ1至SEQ11自Dsg2之位置500至604之胺基酸殘基片段化，其顯示於下圖1 (A)中。此外，進行EMT分析以證明該等肽片段之EMT抑制能力。如在圖1 (B)中所顯示，SEQ6顯示在抑制EMT方面之有利效應。因此，針對SEQ6進行肽缺失研究。合成肽SEQ12至SEQ31係藉由缺失一部分SEQ6之序列獲得。合成肽SEQ12至SEQ31之序列及其對EMT之抑制效應顯示於圖2中。實例 2 本發明之肽之血管生成擬態研究
將人類神經膠母細胞瘤細胞(U-87)接種於經基質膠塗佈之孔上(6×103
個細胞/孔，於96孔板中)。然後將所測試之肽(SEQ17、SEQ32-SEQ38或PBS對照)分別添加至孔中並培育數天。對於管之定量，對每一孔隨機拍攝三個視野並計數管之數目用於統計。 根據圖2，SEQ17顯示在抑制EMT方面之有利效應。進行SEQ17之丙胺酸篩選。SEQ32-SEQ38之合成肽序列係自SEQ17之丙胺酸取代合成肽獲得。神經膠母細胞瘤(GBM)極具侵襲性且基本上無法治癒。其惡性之特徵在於旺盛的微血管增殖。最近證據已顯示，腫瘤細胞展示驅動血液灌注之血管生成擬態(VM) (一種獨立於內皮細胞血管生成之替代微血管循環)之能力。在血管生成擬態研究中，使用神經膠母細胞瘤細胞系(U-87)測定SEQ17色胺酸殘基(W，Dsg2胺基酸位置544)藉助阻斷基質膠觸發之管結構作出之貢獻。與充滿管之PBS對照相比，SEQ17及SEQ32-SEQ38之肽顯示阻斷U-87管網絡化之強效能(參見圖3 (A))。使用每一治療組中之3個隨機選擇視野藉由計數管來定量(參見圖3 (B))。(平均管數目± SD)實例 3 本發明之肽之 HUVEC 管形成分析 ( 血管生成分析 )
收集饑餓過夜之人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)並用內皮細胞生長培養基調整至1.5 × 104
個細胞/孔(於96孔板中)且然後在經基質膠塗佈之孔上接種細胞。不同肽及其藉由D-形式非天然胺基酸及/或藉由添加N-末端及C-末端胱胺酸環化之修飾形式；以及，SEQ132與肽主鏈SEQ6反方向(反向修飾)：(SEQ17、SEQ78、SEQ97、MR9 DF、CMR9C、CMR9C DF、MR9D6 DF、CMR9D6C DF及SEQ132)或對照PBS添加至孔中並在37℃下培育5小時。藉助直立顯微鏡以×40放大率對每一孔進行拍攝。藉由使用ImageJ軟體對總管長度進行定量。培養於基質膠上之HUVEC細胞證明，合成肽可抑制血管生成且結果顯示於圖4 (A)至(D)中。實例 4 大鼠經 雷射誘導之脈絡膜新血管形成模型
用氯胺酮鹽酸鹽/甲苯噻嗪鹽酸鹽(7:1，v/v)之混合物藉由以1 mL/kg肌內注射至大腿肌肉中使動物完全麻醉。將Mydrin®
-P眼用溶液(Santen Pharmaceutical Co., Ltd.)滴注至眼中以使瞳孔擴大。使用Slit Lamp SL-130 (Carl Zeiss Meditec AG)及Multicolor Laser Photocoagulator MC-300 (NIDEK Co., Ltd.)，使用雷射(波長：532nm)輻照每隻動物之右眼。然後使用微注射器(MS-N10, Ito Corporation)及33G針(Ito Corporation)將肽給藥調配物注射至右眼之玻璃體中。雷射輻照後14天，將4% FITC-聚葡萄糖溶液以1 mL/動物之體積投與尾靜脈。然後藉由麻醉劑之過量投藥使動物安樂死。去除眼球並將其固定於4%多聚甲醛-磷酸鹽緩衝液中12-24小時。在立體顯微鏡(EZ-4, Leica Microsystems)下製備脈絡膜鋪片。然後製備大鼠眼脈絡膜鋪片用於藉由共焦顯微鏡(NIKON ECLIPSE TE2000-U)拍攝。將使用軟體ImageJ (國立衛生研究院(NIH)，USA)來量測具有高螢光黃強度之經雷射誘導之新血管形成位點之面積(單位：像素)。 藉由532 nm波長之雷射輻照大鼠之眼並用肽(SEQ97)、Eylea或PBS以靜脈內方式處理。14天後，然後將以靜脈內方式注射4% FITC-聚葡萄糖溶液，以藉助螢光黃血管造影鑑別視網膜區域中流體之洩漏。圖5 (A)顯示PBS處理之對照、Eylea (200 μg/5 μl)及SEQ97 (500 μg/5 μl)之螢光黃血管造影照片。處理(PBS、Eylea或SEQ97) 14天後，拍攝脈絡膜新血管形成位點之照片並用ImageJ軟體來定量。(n=10) Eylea與SEQ97二者顯著抑制大鼠眼脈絡膜新血管形成(參見圖5 (B))。(使用StatLight 4號進行統計學分析)
圖1 (A)及(B)顯示本發明之肽之EMT分析。(A)，來自Dsg2細胞外結構域aa500-604 (SEQ1)之SEQ2-SEQ11之基於序列之設計的示意圖。(B)，HGF (肝細胞生長因子)誘導之EMT (上皮-間質轉變)受合成肽SEQ5、SEQ6、SEQ8及SEQ10抑制。 圖2 (A)及(B)顯示EMT分析中SEQ6之肽缺失研究。(A)，SEQ6缺失合成肽SEQ12-SEQ31之示意圖。肽SEQ12-SEQ31之序列。(B)，HGF (肝細胞生長因子)誘導之EMT (上皮-間質轉變)受合成肽SEQ12-SEQ31抑制。此外，SEQ15及SEQ17顯示與SEQ6相似之優良抑制能力。 圖3 (A)及(B)顯示使用U87細胞之血管生成擬態研究，其測定SEQ17色胺酸殘基(W，Dsg2胺基酸位置544)對阻斷U87細胞之管形成之功能的貢獻。SEQ32-SEQ38能夠阻斷血管生成擬態。(A)，神經膠母細胞瘤(GBM)極具侵襲性且基本上無法治癒。其惡性之特徵在於旺盛的微血管增殖。最近證據已顯示，腫瘤細胞展示驅動血液灌注之血管生成擬態(VM) (一種獨立於內皮細胞血管生成之替代微血管循環)之能力。在血管生成擬態研究中，使用神經膠母細胞瘤細胞系(U-87)測定SEQ17色胺酸殘基(W，Dsg2胺基酸位置544)藉助阻斷基質膠觸發之管結構作出之貢獻。與充滿管之PBS對照相比，SEQ17及SEQ32-SEQ38之肽顯示阻斷U-87管網絡化之強效能。(B)，使用每一治療組中之3個隨機選擇視野藉由計數管來定量。(平均管數目± SD) 圖4 (A)至(C)顯示本發明之肽之HUVEC管形成分析。(A)，培養於基質膠上之HUVEC細胞證明，合成肽SEQ17、SEQ78及SEQ97抑制血管生成。(B)，將MR9及衍生自MR9之三種肽(MR9；MR9 DF：非天然胺基酸肽，9個胺基酸殘基係D形式；CMR9C：環肽，藉由N及C末端胱胺酸環化；及CMR9C DF：具有非天然胺基酸之環肽)處理至HUVEC細胞之基質膠誘導之血管系統。該等肽可顯示分解40% - 80%管結構之潛在能力。(C)，SEQ132肽(SEQ6之反向序列)在HUVEC管形成分析中顯示抑制HUVEC管結構之強效能。(D)，將MR9D6及衍生自MR9D6之兩種肽(MR9D6；MR9D6 DF：非天然胺基酸肽，15個胺基酸殘基係D形式；及CMR9D6C DF：環肽，藉由N及C末端胱胺酸環化且所有胺基酸係非天然D-形式)處理至HUVEC細胞之基質膠誘導之血管系統。與PBS處理之對照相比，該等PBS溶解之肽可顯示使95體積%之管結構崩潰之極其有效之能力。 圖5 (A)及(B)顯示動物模型研究(大鼠脈絡膜新血管形成模型)。(A)，PBS治療之對照、Eylea (200 μg/5 μl)及SEQ97 (500 μg/5 μl)之螢光黃血管造影照片。(B)，Eylea及SEQ97顯著抑制大鼠眼脈絡膜新血管形成。