TW201521759A - 具有溶栓、抗栓和自由基清除三重活性的化合物，其製備方法、組合物和應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及具有溶栓、抗栓和自由基清除三重活性的化合物、其製備方法、組合物和應用。所述化合物為通式I代表： □ 其中：T、Q、R1和R2如說明書中所定義。本發明的化合物同時具有溶血栓、清除自由基和血栓靶向/抗血栓三種功能。本發明還涉及包含所述化合物的藥物組合物、所述化合物的製備方法以及其奈米結構。

Description

具有溶栓、抗栓和自由基清除三重活性的化合物，其製備方法、組合物和應用
本發明涉及同時具有溶血栓、清除自由基和血栓靶向/抗血栓三種功能的新穎化合物及其製備方法和用途。本發明進一步涉及以連接臂將具有兩個C1-4烷基的四氫異喹啉類化合物與溶血栓寡肽連接在一起形成的新穎二元綴合物。本發明還涉及包含所述化合物的藥物組合物、所述化合物的製備方法以及其奈米結構。
血栓性疾病，例如中風/腦梗塞，其發病率居各種疾病之首，近年有漸增趨勢，嚴重威脅人類健康。血栓性疾病的藥物治療是血栓治療的重點和熱點。目前臨床應用的血栓藥物存在許多局限性，尋找安全有效的血栓新藥是藥物研究的熱點之一。
根據現有的研究表明，3S-1,1-二甲基-6,7-二羥基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸除了具有抗血小板聚集和抗血栓活性外，也具有清除自由基活性。另外，在2008年1月30日申請的公告號為CN101497651B的中國專利中公開了十種具有溶血栓活性的四氫異喹啉類化合物，包括 “3S-6,7-1,2,3,4-四氫-6,7-二羥基異喹啉-3-醯基-Pro-Ala-Lys；3S-6,7-1,2,3,4-四氫-6,7-二羥基異喹啉-3-醯基-Arg-Pro-Ala-Ly；3S-6,7-1,2,3,4-四氫-6,7-二羥基異喹啉-3-醯基-Ala-Arg-Pro-Ala-Lys；3S-6,7-1,2,3,4-四氫-6,7-二羥基異喹啉-3-醯基-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys；3S-6,7-1,2,3,4-四氫-6,7-二羥基異喹啉-3-醯基-Gln-Arg-Pro-Ala-Lys；3S-2-[Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-四氫-6,7-二羥基異喹啉-3-羧酸；3S-2-[Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-四氫-6,7-二羥基異喹啉-3-羧酸；3S-2-[Ala-Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-四氫-6,7-二羥基異喹啉-3-羧酸；3S-2-[Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-四氫-6,7-二羥基異喹啉-3-羧酸；3S-2-[Gln-Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-四氫-6,7-二羥基異喹啉-3-羧酸”，以下簡稱為“具溶血栓活性的6,7-二羥基異喹啉”。然而此等6,7-二羥基異喹啉溶血栓的有效劑量較高，其抗血拴與清除自由基的作用未經披露或驗證，治療中風的療效也僅僅顯示在中風發作時，對中風發作30分鐘以上的療效未經披露或驗證。
因此，為了能在臨床上有效且安全的治療血栓性疾病，仍需要一種同時具有溶血栓、抗血栓與清除自由基的活性，又能有效跨越血腦屏障，以及可以在低劑量下達到前述效果的新穎化合物。
本發明的第一個目的是提供通式I的化合物：
其中，T代表具有至少兩個連接用基團的連接臂；Q代表具溶血栓活性 肽；R1和R2在本發明的一個具體實例中，連接臂T的至少一個連接用基團為胺基，且其餘連接用基團為羧基或胺基。
在本發明的一個較佳具體實例中，連接臂可為天然胺基酸，例如L-Lys、L-Asp或L-Glu。
在本發明的一個更佳具體實例中，連接臂可為L-Lys。
在本發明的較佳具體實例中，可用于本發明的具溶血栓活性肽可為含PA(Pro-Ala)序列、PAK(Pro-Ala-Lys)序列、AKP(Ala-Lys-Pro)序列或KAP(Lys-Ala-Pro)序列的寡肽或包含以PAK序列、AKP序列或KAP序列為結構單元的重複序列肽。
在本發明的一個具體實例中，具溶血栓活性寡肽可為含PA(Pro-Ala)序列、PAK序列、AKP序列或KAP序列的三肽至八肽，較佳為含PA序列的三肽。在更佳的實施例中，含PA序列的三肽具有以下通式Q1或Q2：Pro-Ala-AA (Q1)
AA-Ala-Pro (Q2)其中AA選自由L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu所構成的群組。
在本發明的較佳具體實例中，R1和R2皆為甲基。
在本發明的一個較佳具體實例中，通式I化合物中的R1和R2皆為甲基、連接臂為L-Lys、L-Asp或L-Glu，且具溶血栓活性肽為含PA(Pro-Ala)序列的三肽，例如，其可具有以下通式Ia(例如圖1中的5Aa-p化合 物)，Ib(例如圖2中的5Ba-p化合物)，Ic(例如圖3中的5Ca-p化合物)，Id(例如圖4中的5Da-p化合物)，Ie(例如圖5中的5Ea-p化合物)，If(例如圖6中的5Fa-p化合物)，Ig(例如圖7中的5Ga-p化合物)或Ih(例如圖8中的5Ha-p化合物)：
其中AA選自由L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu所構成的群組。
本發明的第二個目的是提供一種藥物組合物，其包含前述本發明的化合物，及藥學上可接受的載劑。
在本發明的藥物組合物的一個較佳具體實例中，所述化合物可形成奈米球結構。
在本發明的一個較佳具體實例中，本發明藥物組合物可作為溶血栓藥物，清除NO自由基藥物或血栓靶向/抗血栓藥物。
在本發明的另一個較佳具體實例中，本發明藥物組合物也可作為治療中風或腦梗藥物，更佳用於治療發病超過4小時、6小時和24小時的中風或腦梗，且以連續給藥方式來治療。
本發明的第三個目的是提供式I化合物的製備方法，包括以 下步驟：(1)提供通式II化合物：
其中R1和R2代表C1-4烷基，且R1和R2可為相同或不同；(2)提供具有至少兩個連接用基團的連接臂T、以及具溶血栓活性肽Q，其中所述連接臂具有第一連接用基團與第二連接用基團；(3)在適當反應條件下，連接通式II化合物的羧基與所述連接臂T的第一連接用基團，形成通式IM-1化合物： ；以及 (4)在適當反應條件下，連接所述具溶血栓活性肽Q與通式IM-1化合物，其中所述具溶血栓活性肽Q的一端與所述連接臂T的第二連接用基團相連接，形成通式I化合物。
在本發明的一個具體實例中，連接臂T的第一連接用基團為胺基，用以與通式II化合物的羧基進行縮合反應；且第二連接用基團為羧基或胺基，用以與具溶血栓活性肽Q的N端或C端進行連接。可用于本發明製備方法的連接臂T以及具溶血栓活性肽Q與前述用於本發明式I化合物中的定義相同。
在較佳具體實例中，本發明製備方法中的連接臂可為 L-Lys、L-Asp或L-Glu，更佳為L-Lys；具溶血栓活性肽可為含PA(Pro-Ala)序列的三肽、PAK(Pro-Ala-Lys)序列、AKP(Ala-Lys-Pro)序列或KAP(Lys-Ala-Pro)序列的寡肽，或包含以PAK序列、AKP序列或KAP序列為結構單元的重複序列肽，更佳為具有以下通式Q1或Q2的三肽：Pro-Ala-AA (Q1)
AA-Ala-Pro (Q2)其中AA選自由L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu所構成的群組。
在又一較佳具體實例中，本發明製備方法中的通式II化合物的R1和R2皆為甲基，連接臂為L-Lys、L-Asp或L-Glu，且具溶血栓活性肽為含PA(Pro-Ala)序列的三肽。在更佳具體實例中，本發明製備方法可用以形成上述通式Ia-h化合物。
本發明的化合物或藥物組合物在大鼠體內活性試驗中表明，在低劑量下即具有優異的溶血栓和抗血栓活性，並可有效地保護中風大鼠的神經功能，能夠在臨床上有效且安全的治療血栓性疾病。
圖1為依據本發明的一個實施例，合成本發明化合物Ia的合成路線；圖2為依據本發明的一個實施例，合成本發明化合物Ib的合成路線；圖3為依據本發明的一個實施例，合成本發明化合物Ic的合成路線；圖4為依據本發明的一個實施例，合成本發明化合物Id的合成路線； 圖5為依據本發明的一個實施例，合成本發明化合物Ie的合成路線；圖6為依據本發明的一個實施例，合成本發明化合物If的合成路線；圖7為依據本發明的一個實施例，合成本發明化合物Ig的合成路線；圖8為依據本發明的一個實施例，合成本發明化合物Ih的合成路線；圖9為依據本發明的一個實施例，測定本發明化合物5Aa-p奈米結構的透射電鏡照片。
本發明利用連接臂將具有兩個C1-4烷基的四氫異喹啉類化合物(即通式II化合物)與溶血栓寡肽連接在一起形成同時具有溶血栓、清除自由基和血栓靶向/抗血栓三種功能的新穎二元綴合物，以下簡稱為“本發明的新穎二元綴合物”。
因為通式II化合物的1位引入了兩個C1-4烷基和3位引入了連接臂，“本發明的新穎二元綴合物”與先前已知的“具溶血栓活性的6,7-二羥基異喹啉”相比具有四方面的優勢：1)通式II化合物的1位引入的兩個C1-4烷基的位阻效應使得羧肽酶和氨肽酶都不容易接近從而不容易水解“本發明的新穎二元綴合物”中的溶血栓寡肽；2)通式II化合物的1位引入的兩個C1-4烷基的疏水性貢獻使得“本發明的新穎二元綴合物”能更好地跨越血腦屏障；3)通式II化合物的1位引入的兩個C1-4烷基的給電子貢獻使得“本發明的新穎二元綴合物”的還原能力能滿足清除自由基的需要；4)通式II化合物的3位引入的連接臂使得“本發明的新穎二元綴合物”的分子可有效地締合從而形成粒徑在20-210nm之間的奈米球，更佳在20-100nm之間，這種穩定的奈米結構，有助於“本發明的新穎二元綴合物”在血液迴圈中不被巨噬細胞吞 噬，從而可以安全地向血栓形成部位傳輸，最終跨越血腦屏障。綜上所述，“本發明的新穎二元綴合物”能夠形成奈米結構，達成跨越血腦屏障的功效；除了溶血拴與抗血栓以外，還能夠有效清除OH、NO和超氧陰離子等自由基；且只需低劑量即能有效溶血栓，具有良好的臨床應用前景。
當用於本文，”連接用基團”意指能夠進行縮合反應的官能基，例如羧基或胺基。
當用於本文，”連接臂”意指具有所述連接用基團，可用以將通式II化合物與具溶血栓活性肽Q連接的分子。連接臂的至少一個連接用基團為胺基，且其餘連接用基團為羧基或胺基。根據本發明，連接臂可為天然胺基酸，例如L-Lys、L-Asp或L-Glu。
引入的連接臂使得“本發明的新穎二元綴合物”可形成不被巨噬細胞吞噬的穩定奈米球結構，其可安全地向血栓形成部位傳輸，最終跨越血腦屏障。尤其是以L-Lys作為連接臂，使得“本發明的新穎二元綴合物”的分子可更有效地締合從而形成粒徑在20-210nm之間的奈米球，更佳在20-100nm之間，這種穩定的奈米結構，有助於“本發明的新穎二元綴合物”在血液迴圈中不被巨噬細胞吞噬，從而可以安全地向血栓形成部位傳輸，最終跨越血腦屏障。
當用於本文，”寡肽”是指分子量在1000道爾頓(D)以下的小分子肽，一般由3至8個胺基酸組成。
當用於本文，”具溶血栓活性肽”意指具有增加血管通透性和溶栓作用的寡肽溶栓劑，包括P6A(ARPAK)、P6A代謝產物、及相關的衍生物。先前的研究曾經披露，在數種溶血栓寡肽(包括Ala-Arg-Pro-Ala-Lys, Gly-Arg-Pro-Ala-Lys,Gln-Arg-Arg-Pro-Ala-Lys和Pro-Ala-Lys)中，Pro-Ala-Lys既是活性好的最短的序列，也是最穩定的序列。在通式II化合物的3位通過連接臂引入Pro-Ala-AA序列三肽，可使“本發明的新穎二元綴合物”獲得更好的穩定性和更強的溶血栓活性。
舉例來說，可用于本發明的含PAK序列、AKP序列或KAP序列的寡肽可為PAK、RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys)、ARPAK(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys)、GRPAK(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys)、QRPAK(Gln-Arg-Pro-Ala-Lys)、AKP、KAP、KPAK(Lys-Pro-Ala-Lys)、PAKP(Pro-Ala-Lys-Pro)、AKPAK(Ala-Lys-Pro-Ala-Lys)或PAKPA(Pro-Ala-Lys-Pro-Ala)。
舉例來說，可用于本發明的以PAK序列、AKP序列或KAP序列為結構單元的重複序列肽可為在中國專利申請公佈號CN101190941的申請案中公佈的一系列具有溶血栓活性的肽，包含以PAK為結構單元合成的重複序列肽(PAK)2、(PAK)3、(PAK)4、(PAK)5和(PAK)6；以AKP為結構單元合成的重複序列肽(AKP)2、(AKP)3、(AKP)4、(AKP)5和(AKP)6；及以KPA為結構單元合成的重複序列肽(KPA)2、(KPA)3、(KPA)4、(KPA)5和(KPA)6。
當用於本文，“C1-4烷基”意指含有碳數為1-4的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基。當本發明通式I化合物中的R1和R2皆為甲基時，做為起始物的通式II化合物是在三氟醋酸(TFA)和無水硫酸鎂存在下，由3,4-二羥基-L-苯丙氨酸與丙酮發生Pictet-Spengler縮合得到的，其優點是更容易製備。
本發明藥物組合物可為任何一種臨床可接受的適宜製劑。優 選為注射製劑(粉針、凍乾粉針、水針、輸液等)；其中，藥學上可接受的載劑可為甘露醇(mannitol)、水、林格氏注射液(Ringer’s solution)、或生理食鹽水注射液(isotonic sodium chloride solution)等。
本發明化合物的奈米球粒徑在20-210nm之間，更佳是在20-100nm之間，使其能更好地跨越血腦屏障。
穩定的奈米結構，有助於使本發明的化合物在血液迴圈中不被巨噬細胞吞噬，從而可以安全地向血栓形成部位傳輸，最終跨越血腦屏障。本發明藥物組合物可作為溶血栓藥物，用於治療心肌梗塞(Mmyocardial infarction)、中風(Ischemic stroke)、靜脈栓塞(Deep vein thrombosis)、肺栓塞(Pulmonary embolism)、周邊動脈阻塞性疾病(Peripheral arterial occlusive disease)、靜脈導管阻塞(occluded central vascular access devices)、動靜脈廔管及分流管阻塞(Clotted arteriovenous fistula and shunts)、和頸動脈狹窄(Carotid Stenosis)等疾病。本發明藥物組合物亦可作為清除NO自由基藥物，用於治療神經退化疾病(Neurodegenerative diseases)、心血管疾病(Cardiovascular disease)、精神疾病、及用於治療高地綜合症(Altitude sickness)、糖尿病、類風濕性關節炎、創傷性腦損傷(Traumatic brain injury)、癌症、X染色體易裂症(Fragile X syndrome)、鐮刀型紅血球疾病(Sickle Cell Disease)、扁平苔蘚(Lichen planus)、白斑病(Vitiligo)、或慢性疲勞症候群(Chronic fatigue syndrome)等疾病。本發明藥物組合物還可作為血栓靶向/抗血栓藥物，用於治療血小板增多症(Thrombocytosis)、骨髓增生性疾病(myeloproliferative disease)、真性紅細胞增多症(Polycythemia vera)、或布卡綜合征(Budd-Chiari syndrome)等疾病。
本發明藥物組合物/化合物同時具有清除OH、NO和超氧陰離子等自由基、溶血栓、和抗血栓/血栓靶向的功能，因此能夠在患者中風4小時之後仍然保持療效，即不受使用tPA的3小時治療黃金期的限制；不會造成tPA樣的全身出血反應；和能夠清除缺血再灌注過程中產生的大量OH,NO和超氧陰離子等自由基，使患者在治療時腦神經組織免受損傷。因為在通式II化合物的1位引入了兩個C1-4烷基和3位引入了連接臂，使“本發明的新穎二元綴合物”與先前已知的“具溶血栓活性的6,7-二羥基異喹啉”相比，在低劑量下即可顯示更好的溶血栓活性，與獨特的清除自由基與抗血栓活性，在稍高的劑量下則可以對4小時以上的中風顯示優秀的療效。
在公告號為CN101497651B的中國專利中，“具溶血栓活性的6,7-二羥基異喹啉”在10nmol/kg劑量下顯示有溶血栓的療效。然而，本發明化合物在0.1nmol/kg下即顯現良好的溶血栓與抗血栓效果；且在1μmol/kg、2.5μmol/kg、5μmol/kg劑量下，分別對中風4、6、24小時後有明顯好的治療作用。
在本發明的化合物製備方法中，可先將具溶血栓活性肽Q合成好，然後再與連接臂T的第二連接用基團相連接；或者是可將具溶血栓活性肽Q中的胺基酸依預定序列逐次單個或多個與連接臂T相連接，例如，可先將具溶血栓活性肽Q中一端的第一個胺基酸與連接臂T的第二連接用基團相連接，然後將剩下的胺基酸依序逐次單個或多個接上。
本發明製備方法可由以下更詳細的說明來進一步瞭解。
通式II化合物可參照以下合成路線取得： 其中R1和R2代表C1-4烷基，且R1和R2可為相同或不同。舉例來說，可先將3,4-二羥基-L-苯丙氨酸(SM-1)與通式SM-2化合物溶解在三氟醋酸(TFA)中，在無水硫酸鎂存在下，將3,4-二羥基-L-苯丙氨酸與丙酮進行Pictet-Spengler縮合而得到通式II化合物。
在一較佳實施例中，本發明製備方法中的連接臂為L-Lys，且具溶血栓活性肽為含PA(Pro-Ala)序列的三肽，例如，先將通式II化合物的羧基與L-Lys的其中一個N端相接合，然後將含PA序列的三肽與L-Lys連接臂上剩下的N端或C端接合。在部分實施例中，當通式II化合物中的R1和R2皆為甲基(即3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-羧酸)，連接臂為L-Lys，且具溶血栓活性肽為含PA(Pro-Ala)序列的三肽，本發明製備方法可形成上述的化合物Ia,Ib,Ic，或Id。
當依據本發明製備方法來形成本發明化合物Ia時，可以參照圖1中揭示的合成路徑。
在如圖1所示的實施例中，是先將含PA序列的三肽合成好後再與L-Lys連接臂相連接，其中AA選自L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu殘基(分別為5Aa-p化合物)，且反應條件如下：i)Acetone,TFA,MgSO4；ii)HCl.Lys(Boc)-OBzl,DCC,HOBt,NMM；iii)4M HCl/EA冰浴；iv)DCC, HOBt,NMM,v)乙醇，Pd/C；4M HCl/EA，冰浴；vi)乙醇，Pd/C；vii)2M NaOH。在另一個實施例中，可先將含PA序列三肽中的一個胺基酸(例如AA)與L-Lys連接臂相連接，然後再將含PA序列三肽中剩下的兩個胺基酸(例如Pro-Ala)與AA連接。
舉例來說，在一個用以形成本發明化合物Ia的實施例中，本發明製備方法可包括以下步驟：1)在三氟醋酸(TFA)和無水硫酸鎂存在下3,4-二羥基-L-苯丙氨酸與丙酮發生Pictet-Spengler縮合，生成3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-羧酸；2)在二環己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基苯并三氮唑(HOBt)存在下3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-羧酸在無水N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中與HCl‧Lys(Boc)-OBzl縮合為3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys(Boc)-OBzl，縮合反應中隨時用N-甲基嗎啉(NMM)調節pH=9；3)在氯化氫的乙酸乙酯溶液中將3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys(Boc)-OBzl脫除Boc得到3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys-OBzl；4)在DCC和HOBt存在下Boc-Pro在無水四氫呋喃中與Tos‧Ala-OBzl縮合為Boc-Pro-Ala-OBzl；5)在乙醇中將Boc-Pro-Ala-OBzl氫解為Boc-Pro-Ala；6)DCC和HOBt存在下Boc-Pro-Ala在無水四氫呋喃中與AA-OBzl縮合為Boc-Pro-Ala-AA-OBzl(AA選自L-Ala,Gly,L-Phe,L-Val,L-Leu,L-Ile,L-Trp,L-Ser,L-Thr,L-Tyr,L-Lys(Z),L-Pro,L-Asn和L-Gln殘基)； 7)在乙醇中將步驟6的Boc-Pro-Ala-AA-OBzl氫解為Boc-Pro-Ala-AA；8)在DCC和HOBt存在下3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys-OBzl在無水DMF中與步驟6的Boc-Pro-Ala-AA縮合為3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys(Boc-Pro-Ala-AA)-OBzl(AA的定義與步驟6相同)；9)在DCC和HOBt存在下3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys-OBzl在無水DMF中與Boc-AA(OBzl)縮合為3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys[Boc-AA(OBzl)]-OBzl(AA選自L-Asp,L-Glu殘基)；10)在氯化氫的乙酸乙酯溶液中將3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys[Boc-AA(OBzl)]-OBzl脫除Boc得到3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys[AA(OBzl)]-OBzl(AA的定義與步驟9相同)；11)在DCC和HOBt存在下3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys[AA(OBzl)]-OBzl在無水DMF中與Boc-Pro-Ala縮合為3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys[Boc-Pro-Ala-AA(OBzl)]-OBzl(AA的定義與步驟9相同)；12)通過氫解和脫Boc將3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys(Boc-Pro-Ala-AA)-OBzl(AA的定義與步驟6相同)和3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys[Boc-Pro-Ala-AA(OBzl)]-OBzl(AA的定義與步驟9相同)脫保護得到3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲醯-Lys(Pro-Ala-AA)。
當依據本發明製備方法來形成本發明化合物Ib時，可以參照圖2中揭示的合成路徑，其中AA選自L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe, Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu殘基(分別為5Ba-p化合物)，且反應條件如下：i)Acetone,TFA,MgSO4；ii)HCl.Lys(Boc)-OBzl,DCC,HOBt,NMM；iii)乙醇，Pd/C；iv)DCC,HOBt,NMM,v)乙醇，Pd/C；4M HCl/EA，冰浴；vi)乙醇，Pd/C；vii)4M HCl/EA，冰浴。
當依據本發明製備方法來形成本發明化合物Ic時，可以參照圖3中揭示的合成路徑，其中AA選自L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu殘基(分別為5Ca-p化合物)，且反應條件如下：i)Acetone,TFA,MgSO4；ii)HCl.Boc-Lys-OBzl,DCC,HOBt,NMM；iii)4M HCl/EA冰浴；iv)DCC,HOBt,NMM,v)乙醇，Pd/C；4M HCl/EA，冰浴；vi)乙醇，Pd/C；vii)乙醇，Pd/C。
當依據本發明製備方法來形成本發明化合物Id時，可以參照圖4中揭示的合成路徑，其中AA選自L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu殘基(分別為5Da-p化合物)，且反應條件如下：i)Acetone,TFA,MgSO4；ii)HCl.Boc-Lys-OBzl,DCC,HOBt,NMM；iii)乙醇，Pd/C；iv)DCC,HOBt,NMM,v)乙醇，Pd/C；4M HCl/EA，冰浴；vi)乙醇，Pd/C；vii)乙醇，Pd/C。
在另一較佳實施例中，本發明製備方法中的連接臂為L-Asp，且具溶血栓活性肽為含PA(Pro-Ala)序列的三肽，例如，先將通式II化合物的羧基與L-Asp的N端相接合，然後將含PA序列的三肽與L-Asp連接臂上剩下的其中一個C端接合。在部分實施例中，當通式II化合物中的R1和R2皆為甲基(即3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-羧酸)，連接臂為L-Asp，且具溶血栓活性肽為含PA(Pro-Ala)序列的三肽時， 本發明製備方法可形成上述的化合物Ie或If。
當依據本發明製備方法來形成本發明化合物Ie時，可以參照圖5中揭示的合成路徑，其中AA選自L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu殘基(分別為5Ea-p化合物)，且反應條件如下：i)Acetone,TFA,MgSO4；ii)HCl.Asp(OCH3)-OBzl,DCC,HOBt,NMM；iii)乙醇，Pd/C；iv)DCC,HOBt,NMM,v)乙醇，Pd/C；2M NaOH，冰浴；vi)乙醇，Pd/C；vii)4M HCl/EA，冰浴。
當依據本發明製備方法來形成本發明化合物If時，可以參照圖6中揭示的合成路徑，其中AA選自L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu殘基(分別為5Fa-p化合物)，且反應條件如下：i)Acetone,TFA,MgSO4；ii)HCl.Asp(OBzl)-OCH3,DCC,HOBt,NMM；iii)2M NaOH,iv)DCC,HOBt,NMM,v)乙醇，Pd/C；2M NaOH，冰浴；vi)乙醇，Pd/C；vii)4M HCl/EA，冰浴。
在又一較佳實施例中，本發明製備方法中的連接臂為L-Glu，且具溶血栓活性肽為含PA(Pro-Ala)序列的三肽，例如，先將通式II化合物與L-Glu的N端相接合，然後將含PA序列的三肽與L-Glu連接臂上剩下的其中一個C端接合。在部分實施例中，當通式II化合物中的R1和R2皆為甲基(即3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-羧酸)，連接臂為L-Glu，且具溶血栓活性肽為含PA(Pro-Ala)序列的三肽時，本發明製備方法可形成上述的化合物Ig或Ih。
當依據本發明製備方法來形成本發明化合物Ig時，可以參照圖7中揭示的合成路徑，其中AA選自L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe, Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu殘基(分別為5Ga-p化合物)，且反應條件如下：i)Acetone,TFA,MgSO4；ii)HCl.Glu(OCH3)-OBzl,DCC,HOBt,NMM；iii)乙醇，Pd/C；iv)DCC,HOBt,NMM；v)乙醇，Pd/C；2M NaOH，冰浴；vi)乙醇，Pd/C；vii)4M HCl/EA，冰浴。
當依據本發明製備方法來形成本發明化合物Ih時，可以參照圖8中揭示的合成路徑，其中AA選自L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu殘基(分別為5Ha-p化合物)，且反應條件如下：i)Acetone,TFA,MgSO4；ii)HCl.Glu(OBzl)-OCH3,DCC,HOBt,NMM；iii)乙醇，Pd/C；iv)DCC,HOBt,NMM；v)乙醇，Pd/C；2M NaOH，冰浴；vi)乙醇，Pd/C；vii)4M HCl/EA，冰浴。
本發明的化合物或藥物組合物在大鼠體內活性試驗中表明，在低劑量下即具有優異的溶血栓和抗血栓活性，並可有效地保護中風大鼠的神經功能，能夠在臨床上有效且安全的治療血栓性疾病。
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
實施例1-68例示依據圖1的製備方法，製造本發明的5Aa-p化合物。
實施例1 液相接肽反應通法
將N端保護的胺基酸用無水四氫呋喃(THF)溶解，得到的溶液加入N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，冰浴，緩慢加入用無水THF溶解的N,N-二環己基碳二亞胺(DCC)，0℃攪拌15分鐘得到反應液(I)。羧端保護的胺基酸也用無水THF溶解，用N-甲基嗎啉(NMM)調pH 9，然後與反應液(I)混合，用N-甲基嗎啉維持pH 9，室溫攪拌10小時，TLC監測反應進程。原料點消失後，反應混合物過濾，濾液減壓濃縮，得到粘稠狀物質用乙酸乙酯或二氯甲烷溶解，得到的溶液依次用5% NaHCO3水溶液洗，5% KHSO4水溶液洗，飽和NaCl水溶液洗，乙酸乙酯或二氯甲烷相加入無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得目標化合物。
實施例2 脫Boc通法
將Boc保護的肽用少量的無水乙酸乙酯溶解，冰浴攪拌下加入氯化氫的乙酸乙酯溶液(4M)。TLC顯示原料點消失後，反應溶液用水泵反復抽乾，除淨氯化氫氣體，殘留物用石油醚或無水乙醚反復研磨，得到目標化合物。
實施例3 脫苄酯基通法
將多肽苄酯用CH3OH溶解，冰浴攪拌下緩慢滴加NaOH的水溶液(2M)，冰浴維持反應液溫度在0℃，TLC顯示原料消失。反應液用1M的鹽酸調至中性，減壓除去甲醇，繼續用1M的鹽酸酸化至pH 2，溶液用乙酸乙酯萃取，合併的乙酸乙酯相用飽和NaCl水溶液洗滌至中性，用無水Na2SO4乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到目標化合物。
實施例4 脫苄氧羰基或苄酯基通法
將具有苄氧羰基或苄酯保護的肽用適量的乙醇溶解，加入鈀碳(反應物 量的10%)，通入氫氣室溫氫解。反應結束後過濾，減壓濃縮，得到目標化合物。
實施例5 製備Boc-Pro
將5.75g(50mmol)L-Pro用1mL水溶解，在冰浴攪拌下緩慢滴加25mL NaOH水溶液(2M)，得到溶液(I)。將13.08g(60mmol)(Boc)2O用25mL二氧六環溶解，得到溶液(II)。將溶液(II)滴加至冰浴攪拌下的溶液(I)中，冰浴下緩慢滴加NaOH水溶液(2M)調節pH 9，混合物冰浴下攪拌。30分鐘後，檢測反應混合物的pH值，並用NaOH水溶液(2M)使pH值保持9，並用水泵抽出反應生成的氣體。攪拌48小時，TLC(二氯甲烷：甲醇，20：1)監測反應完全。反應混合物減壓濃縮除去二氧六環，殘留物用5mL水溶解，以飽和硫酸氫鉀水溶液調節pH 2，將水溶液用乙酸乙酯萃取三次，合併的乙酸乙酯相用5%KHSO4洗滌3次，並以飽和NaCl水溶液洗滌至中性，分出的乙酸乙酯層加入無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯-石油醚重結晶，得10.2g(95%)標題化合物，為無色晶體。ESI-MS(m/e)：214[M-H]-.
實施例6 製備Boc-Pro-Ala-OBzl
按照實施例1的方法，由4.3g(20.0mmol)Boc-Pro和8.45g(24.0mmol)Tos．Ala-OBzl得到5.19g(68%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：377[M+H]+.
實施例7 製備Boc-Pro-Ala
按照實施例4的方法，由5.19g(13.8mmol)Boc-Pro-Ala-OBzl制得3.59g(91%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：285[M-H]-.
實施例8 製備Boc-Pro-Ala-Ala-OBzl
按照實施例1的方法，由3.00g(10.49mmol)Boc-Pro-Ala和3.26g(12.03mmol)Tos．Ala-OBz得到3.04g(68%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：448[M+H]+.
實施例9 製備Boc-Pro-Ala-Ala
按照實施例3的方法，由4.47g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Ala-OBzl得到3.21g(90%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：356[M-H]-.
實施例10 製備Boc-Pro-Ala-Val-OBzl
按照實施例1的方法由3.00g(10.49mmol)Boc-Pro-Ala和3.58g(12.01mmol)Tos．Val-OBzl得到3.28g(69%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：476[M+H]+.
實施例11 製備Boc-Pro-Ala-Val
按照實施例3的方法，由4.75g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Val-OBzl得到3.54g(92%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：384[M-H]-.
實施例12 製備Boc-Pro-Ala-Trp-OBzl
按照實施例1的方法由3.00g(10.49mmol)Boc-Pro-Ala和3.97g(12.01mmol)HCl．Trp-OBzl得到3.65g(65%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：563[M+H]+.
實施例13 製備Boc-Pro-Ala-Trp
按照實施例3的方法，由5.62g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Trp-OBzl得到4.21g(89%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：471[M-H]-.
實施例14 製備Boc-Pro-Ala-Tyr-OBzl
按照實施例1的方法由3.15g(11mmol)Boc-Pro-Ala和4.43g(10mmol)Tos．Tyr-OBzl得到3.73g(69%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：540[M+H]+.
實施例15 製備Boc-Pro-Ala-Tyr
按照實施例3的方法，由5.39g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Tyr-OBzl得到4.13g(92%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：448[M-H]-.
實施例16製備Boc-Pro-Ala-Phe-OBzl
按照實施例1的方法由3.00g(10.0mmol)Boc-Pro-Ala和2.92g(11.0mmol)Tos．Phe-OBzl得到3.82g(66%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：524[M+H]+.
實施例17 製備Boc-Pro-Ala-Phe
按照實施例3的方法，由5.23g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Phe-OBzl得到3.94g(91%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：432[M-H]-.
實施例18製備Boc-Pro-Ala-Gly-OBzl
按照實施例1的方法由3.15g(11mmol)Boc-Pro-Ala和3.37g(10mmol)Tos．Gly-OBzl得到2.90g(67%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：434[M+H]+.
實施例19 製備Boc-Pro-Ala-Gly
按照實施例3的方法，由4.33g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Gly-OBzl得到2.98g(87%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：342[M-H]-.
實施例20製備Boc-Pro-Ala-Ser-OBzl
按照實施例1的方法由3.15g(11mmol)Boc-Pro-Ala和3.67g(10mmol) Tos．Ser-OBzl得到2.92g(63%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：464[M+H]+.
實施例21 製備Boc-Pro-Ala-Ser
按照實施例3的方法，由4.63g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Ser-OBzl得到3.28g(88%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：372[M-H]-.
實施例22 製備Boc-Pro-Ala-Ile-OBzl
按照實施例1的方法由3.15g(11mmol)Boc-Pro-Ala和3.93g(10mmol)Tos．Ile-OBzl得到3.33g(65%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：490[M+H]+.
實施例23 製備Boc-Pro-Ala-Ile
按照實施例3的方法，由4.89g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Ile-OBzl得到3.67g(91%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：398[M-H]-.
實施例24 製備Boc-Pro-Ala-Thr-OBzl
按照實施例1的方法由3.15g(11mmol)Boc-Pro-Ala和3.81g(10mmol)Tos．Thr-OBzl得到3.39g(71%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：478[M+H]+.
實施例25 製備Boc-Pro-Ala-Thr
按照實施例3的方法，由4.77g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Thr-OBzl得到3.56g(91%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：386[M-H]-.
實施例26 製備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
按照實施例1的方法由3.15g(11mmol)Boc-Pro-Ala和4.06g(10mmol)HCl．Lys(Z)-OBzl得到4.15g(65%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)： 639[M+H]+.
實施例27 製備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)
按照實施例3的方法，由6.39g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl得到4.71g(86%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：547[M-H]-.
實施例28 製備Boc-Pro-Ala-Leu-OBzl
按照實施例1的方法由3.15g(11mmol)Boc-Pro-Ala和3.93g(10mmol)Tos．Leu-OBzl得到3.37g(69%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：490[M+H]+.
實施例29 製備Boc-Pro-Ala-Leu
按照實施例3的方法，由4.89g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Leu-OBzl得到3.67g(91%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：398[M-H]-.
實施例30 製備Boc-Pro-Ala-Gln-OBzl
按照實施例1的方法由3.15g(11mmol)Boc-Pro-Ala和2.73g(10mmol)HCl．Gln-OBzl得到3.23g(63%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：505[M+H]+.
實施例31 製備Boc-Pro-Ala-Gln
按照實施例3的方法，由5.04g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Gln-OBzl得到3.73g(90%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：413[M-H]-.
實施例32 製備Boc-Pro-Ala-Asn-OBzl
按照實施例1的方法由3.15g(11mmol)Boc-Pro-Ala和2.59g(10mmol)HCl．Asn-OBzl得到3.04g(61%)標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：491[M+H]+.
實施例33 製備Boc-Pro-Ala-Asn
按照實施例3的方法，由4.90g(10mmol)Boc-Pro-Ala-Asn-OBzl得到3.67g(92%)標題化合物。ESI-MS(m/e)：399[M-H]-.
實施例34 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-羧酸(1)
將5.0g(25mmol)3,4-二羥基-L-苯丙氨酸用250mL丙酮溶解。向得到的溶液中加入6.0g(30mmol)無水硫酸鎂。30分鐘後，冰浴下加入25mL三氟醋酸(TFA)，之後室溫攪拌96h，TLC(二氯甲烷/甲醇，1：1)顯示原料點消失。反應液過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用丙酮溶解繼續減壓濃縮，反復3次。殘留物加200mL無水乙醚，大量無色固體析出，抽濾得到5.8g(95%)標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：238[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=6.61(s,1H),6.45(s,1H),3.70(dd,J=3.9,11.4Hz,1H),2.76(dd,J=11.7,15.3Hz,1H),2.62(m,1H),1.41(s,3H),1.32(s,3H).
實施例35 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc)-OBzl(2)
按照實施例1的方法，將1.19g(5.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-羧酸用10mL無水DMF溶解。向得到的溶液中加入675mg(5.00mmol)N-羥基苯并三氮唑(HOBt)。10分鐘後，冰浴下加入1.20g(5.83mmol)二環己基羰二亞胺(DCC)與5mL無水DMF的溶液，得到反應液(I)。把2.83g(5.53mmol)HCl．Lys(Boc)-OBzl溶於15mL無水DMF並攪拌30分鐘，得到反應液(II)。冰浴攪拌下，將反應液(II)加入反應液(I)中，然後室溫攪拌12h，並隨時用N-甲基嗎啉(NMM)調節 pH=9，TLC(二氯甲烷/甲醇，10：1)顯示3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-羧酸消失。反應混合物過濾除二環己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮除去DMF。殘留物用150mL乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液洗三次和飽和NaCl水溶液洗三次。乙酸乙酯溶液用無水Na2SO4乾燥，過濾，濾液減壓濃縮至乾，殘留物經柱層析純化(二氯甲烷/甲醇，50：1)，得到327mg(59%)標題化合物，為淺粉色粉末。ESI-MS(m/e)：556[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=8.64(s,1H),8.52(s,1H),8.14(d,J=7.5Hz,1H),7.36(m,5H),6.74(m,1H),6.57(s,1H),6.37(s,1H),5.14(m,2H),4.30(m,1H),3.55(m,2H),3.32(m,2H),2.88(m,2H),2.57(d,J=3.9Hz,1H),2.27(m,1H),2.15(s,1H),1.69(m,4H),1.36(s,9H),1.33(s,3H),1.25(s,3H).
實施例36 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl(3A)
按照實施例2通法，從1.50g(2.73mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc)-OBzl得到1.01g(82%)標題化合物，為淺粉色固體，直接用於下一步反應。ESI-MS(m/e)：456[M+H]+
實施例37 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Ala)-OBzl(4Aa)
按照實施例1的方法，從482mg(1.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和424mg(1.20mmol)Boc-Pro-Ala-Ala得到302mg(38%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：795[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.15(s,1H),8.89 (s,2H),8.11(m,1H),7.94(m,1H),7.85(m,1H),7.76(m,1H),7.44-7.31(m,5H),6.66(s,1H),6.47(s,1H),5.14(m,2H),4.25(m,1H),4.23(m,3H),4.12(m,1H),3.66(m,1H),3.12(m,2H),2.96(m,2H),2.89-2.91(m,2H),2.11-2.08(m,1H),1.77(m,5H),1.59(s,3H),1.47-1.27(m,17H),1.27-1.08(m,7H).
實施例38 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Val)-OBzl(4Ab)
按照實施例1的方法，從964mg(2.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和924mg(2.40mmol)Boc-Pro-Ala-Val得到604mg(37%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：823[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.18(s,1H),8.93(m,2H),8.05(m,2H),7.42(m,5H),6.66(s,1H),6.47(s,1H),5.16(s,1H),4.37-4.28(m,3H),4.11(m,3H),3.06-2.89(m,5H),2.75(m,6H),2.04(s,1H),1.91(m,1H),1.79(m,5H),1.62(s,3H),1.49(s,3H),1.39(m,7H),1.32(m,3H),1.21(m,4H),0.82(m,6H).
實施例39 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Trp)-OBzl(4Ac)
按照實施例1的方法，從482mg(1.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和567mg(1.20mmol)Boc-Pro-Ala-Trp得到318mg(35%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：910[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.51(s,1H),9.26(m,2H),8.98(m,2H),8.05(d,1H,J=7.2Hz),7.94(m,1H),7.78(d,1H,J=7.2Hz),7.54(m,1H),7.38(m,5H),7.31(d,1H,J=4.5Hz),7.24(m,1H),7.11(t,1H,J=4.5Hz),7.05(t,1H,J=4.5Hz),6.67(s,1H),6.52(s,1H),5.15(s,2H), 4.44(m,1H),4.35(m,2H),4.07(m,2H),3.23(m,1H),3.17(m,5H),2.86(m,1H),1.97(m,2H),1.76-1.70(m,8H),1.31(s,3H),1.24(s,3H),1.93-1.79(m,9H),1.16(m,4H).
實施例40 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Tyr)-OBzl(4Ad)
按照實施例1的方法，從964mg(2.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和1077mg(2.40mmol)Boc-Pro-Ala-Tyr得到549mg(31%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：887[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.17(m,1H),9.02(m,1H),8.73(m,1H),8.51(m,1H),8.09(m,1H),7.97(m,1H),7.73(m,1H),7.40(m,5H),6.96(m,2H),6.61(m,3H),6.48(s,1H),5.16(s,2H),4.23(m,2H),4.07(m,2H),3.88(m,1H),3.01(m,3H),2.74(m,3H),2.02(m,2H),1.74(m,5H),1.46(s,3H),1.36-1.24(m,16H),1.16(m,3H),0.87(m,1H).
實施例41 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Pro)-OBzl(4Ae)
按照實施例1的方法，從964mg(2.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和957mg(2.40mmol)Boc-Pro-Ala-Pro得到607mg(37%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：821[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.54(m,1H),9.23(s,1H),9.11(m,1H),8.96(s,1H),8.05(m,1H),7.85(m,1H),7.40(m,5H),6.67(s,1H),6.48(s,1H),5.16(m,2H),4.54(m,1H),4.38(m,2H),4.24(m,1H),4.10(m,2H),3.55(m,1H),3.17(m,3H),3.05(m,3H),2.94(m, 1H),1.96(m,2H),1.79(m,7H),1.64(s,3H),1.51(s,3H),1.38-1.32(m,13H),1.20(m,4H).
實施例42 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Phe)-OBzl(4Af)
按照實施例1的方法，從964mg(2.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和1039mg(2.40mmol)Boc-Pro-Ala-Phe得到626mg(36%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：871[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.24(s,1H),9.09(m,2H),8.96(s,1H),8.01-7.93(m,3H),7.38(m,5H),7.21(m,5H),6.67(s,1H),6.49(s,1H),5.17(s,2H),4.38(m,3H),4.09(m,2H),3.28(m,4H),2.88(m,2H),2.79(m,5H),1.99(m,2H),1.74(m,8H),1.50(m,3H),1.32(m,14H),1.16(m,4H).
實施例43 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Gly)-OBzl(4Ag)
按照實施例1的方法，從482mg(1.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和412mg(1.20mmol)Boc-Pro-Ala-Gly得到304mg(39%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：781[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.39(s,1H),8.97(m,2H),8.24-8.14(m,2H),7.79(m,1H),7.41(m,5H),6.66(s,1H),6.47(s,1H),5.16(s,2H),4.35(m,2H),4.21(m,2H),3.71-3.66(m,2H),3.03(m,3H),2.89-2.76(m,1H),2.07(m,1H),1.81-1.77(m,6H),1.62(s,3H),1.50(s,3H),1.38(m,7H),1.32(m,8H),1.23(m,4H).
實施例44 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹 啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Ser)-OBzl(4Ah)
按照實施例1的方法，從965mg(2.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和896mg(2.40mmol)Boc-Pro-Ala-Ser得到454mg(29%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：811[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.48(m,1H),9.23(s,2H),8.96(m,1H),8.19(m,1H),7.40(m,5H),6.67(s,1H),6.48(s,1H),5.16(m,2H),4.92(m,1H),4.31(m,3H),4.13(m,3H),3.53(m,2H),3.16(m,3H),3.04-2.81(m,4H),2.08(m,1H),1.78(m,5H),1.63(s,3H),1.51(s,3H),1.39-1.32(m,14H),1.22(m,3H).
實施例45 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Ile)-OBzl(4Ai)
按照實施例1的方法，從482mg(1.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和479mg(1.20mmol)Boc-Pro-Ala-Ile得到310mg(37%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：837[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=8.84-8.68(m,2H),8.37(s,1H),7.99-7.87(m,3H),7.39(m,4H),6.60(s,1H),6.39(s,1H),5.14(m,2H),4.32(m,2H),4.17(m,2H),3.65(m,1H),3.54(m,1H),3.17(m,1H),2.96(m,2H),2.68(m,3H),2.11(m,1H),1.74-1.68(m,7H),1.31-1.21(m,11H),1.17(m,5H),1.08(m,1H),0.82(m,8H).
實施例46 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Thr)-OBzl(4Aj)
按照實施例1的方法，從964mg(2.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和929mg(2.40mmol) Boc-Pro-Ala-Thr得到495mg(30%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：825[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.18(s,1H),8.91(s,2H),8.27(m,1H),7.64(m,1H),7.41(m,6H),6.65(s,1H),6.48(s,1H),5.16(s,2H),4.35(m,3H),4.23(m,3H),3.07(m,3H),2.72(m,1H),1.83-1.76(m,5H),1.61(s,3H),1.48(s,3H),1.38-1.32(m,14H),1.23(m,3H),1.11(m,3H).
實施例47 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-OBzl(4Ak)
按照實施例1的方法，從964mg(2.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和1209mg(2.40mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)得到750mg(30%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：987[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=8.68(s,1H),8.56(s,1H),8.16(m,1H),8.04(m,1H),7.78(m,1H),7.68(m,1H),7.34(m,10H),6.58(s,1H),6.37(s,1H),5.14(s,2H),4.98(s,2H),4.29(m,2H),4.09(m,3H),3.56(m,3H),3.01(m,4H),2.62(m,1H),2.40(m,1H),2.27(m,1H),2.15(s,1H),2.06(m,1H),2.01(s,1H),1.78(m,6H),1.38-1.31(m,18H),1.17(m,10H).
實施例48 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Leu)-OBzl(4Al)
按照實施例1的方法，從482mg(1.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和479mg(1.20mmol)Boc-Pro-Ala-Leu得到301mg(36%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：837[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=8.69-8.57(m,2H),8.18-8.06(m,2H),7.85(m,1H),7.69(m,5H),6.58(s,1H),6.37(s,1H), 5.14(m,2H),4.25-4.11(m,5H),3.63-3.55(m,1H),3.17(s,2H),3.04-2.98(m,2H),2.64-2.59(m,1H),2.15-2.07(m,1H),1.78-1.67(m,5H),1.36(m,14H),1.28(m,4H),1.19(m,6H).
實施例49 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Gln)-OBzl(4Am)
按照實施例1的方法，從965mg(2.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和994mg(2.40mmol)Boc-Pro-Ala-Gln得到665mg(39%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：852[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.3-9.1(m,4H),8.16(m,1H),7.96(m,2H),7.83(m,1H),7.44-7.38(m,7H),6.89(s,1H),6.86(s,1H),6.56(s,1H),5.17(s,2H),4.4-4.1(m,6H),3.17(m,4H),2.98-2.83(m,2H),2.08(m,4H),1.91(m,1H),1.64(s,3H),1.51(s,3H),1.38-1.31(m,17H),1.22-1.20(m,4H).
實施例50 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Asn)-OBzl(4An)
按照實施例1的方法，從965mg(2.01mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl和960mg(2.40mmol)Boc-Pro-Ala-Asn得到636mg(38%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：838[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.26(s,1H),9.04(m,2H),8.31(m,1H),8.03(m,1H),7.57(m,1H),7.44(m,6H),6.90(m,1H),6.68(s,1H),6.49(s,1H),5.16(s,2H),4.45-4.40(m,3H),4.14(m,2H),3.42(m,5H),3.17(m,3H),2.89-2.82(m,1H),2.09(m,1H),1.90(m,1H),1.79-1.74(m,6H),1.64(s,3H),1.52(s,3H),1.39-1.32(m,15H),1.22(m,3H).
實施例51 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys[Boc-Pro-Ala-Asp(OBzl)]-OBzl(4Ao)
按照實施例1的方法，從870mg(1.24mmol)化合物3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys[Asp(OBzl)]-OBzl和429mg(2.48mmol)Boc-Pro-Ala得到403mg(35%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：929[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=8.32(m,1H),8.10(m,1H),7.96(m,1H),7.36(m,10H),6.60(s,1H),6.39(s,1H),5.14(s,2H),5.06(s,2H),4.57(m,1H),4.32(m,1H),4.23(m,1H),4.11(m,2H),3.74(m,1H),3.55(m,1H),3.34-3.28(m,2H),3.00(m,2H),2.89(s,1H),2.81(m,1H),2.73(m,2H),2.58(m,1H),2.16-2.06(m,1H),1.91(s,2H),1.75(m,5H),1.40-1.32(m,22H),1.17(m,3H).
實施例52 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys[Boc-Pro-Ala-Glu(OBzl)]-OBzl(4Ap)
按照實施例1的方法，從530mg(0.75mmol)化合物3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys[Glu(OBzl)]-OBzl和256mg(0.90mmol)Boc-Pro-Ala得到269mg(38%)標題化合物，為淺黃色粉末。ESI-MS(m/e)：943[M+H]+；1HNMR(300MHz,DMSO-d 6)δ/ppm=9.26(s,1H),9.10(m,1H),8.97(s,1H),8.79-7.88(m,3H),7.36(m,10H),6.67(s,1H),6.48(s,1H),5.14(s,2H),5.06(s,2H),4.35(m,1H),4.23(m,2H),4.10(m,1H),3.83(s,1H),3.34(m,5H),2.83(m,1H),2.72(m,1H),2.34(m,2H),1.78(m,10H),1.51(s,3H),1.36-1.31(m,14H),1.21(m,3H).
實施例53 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Ala)(5Aa)
先按照實施例4的方法，從300mg(0.38mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Ala)-OBzl脫苄酯。再按照實施例2的方法，脫Boc，得到266mg(78%)標題化合物，為無色粉末。Mp 207.2-209.4℃；=-4.5(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：630[M-H]-；IR(KBr)：3221.1,3057.2,2983.8,2943.3,2362.8,1660.7,1546.9,1533.4,1448.5,1379.1,1240.2,1049.3,867.9,659.7；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.79(s,1H),6.68(s,1H),4.36-4.29(m,5H),3.32-3.12(m,6H),1.89(m,4H),1.70(s,3H),1.57(s,3H),1.48(m,2H),1.33(m,9H).
實施例54 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Val)(5Ab)
按照實施例53的方法，從300mg(0.36mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Val)-OBzl得到187mg(81%)標題化合物，為無色粉末。Mp 195.8-197.9℃；=-3.5(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：630[M-H]-；IR(KBr)：3221.1,3062.9,2970.4,1658.8,1546.9,1533.4,1450.5,1384.9,1240.2,1047.4,991.41,866.04,671.2；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=8.13(m,1H),6.79(s,1H),6.68(s,1H),4.36-4.29(m,4H),3.89(m,1H),3.36(m,2H),3.23(m,2H),3.08(m,2H),1.89(m,4H),1.70(s,3H),1.57(s,3H),1.48(m,1H),1.37(m,6H),1.32(m,2H),0.89(m,6H).
實施例55 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Trp)(5Ac)
按照實施例53的方法，從300mg(0.33mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Trp)-OBzl得到180mg(76%)標題化合物，為淺粉色粉末。Mp 205.1-207.9℃；=-1.3(c=0.25, CH3OH)；ESI-MS(m/e)：718[M-H]-；IR(KBr)：3221.2,3059.1,2981.9,2941.4,1660.7,1533.4,1448.5,1388.7,1240.2,867.9,748.4,630.7；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=7.50(d,J=7.8Hz,1H),7.39(d,J=7.8Hz,1H),7.12(t,J=7.2Hz,1H),7.05(t,J=7.2Hz,1H),6.74(s,1H),6.62(s,1H),4.38(m,1H),4.35(m,1H),4.27(m,1H),4.18(m,2H),3.24(m,2H),3.16(m,3H),3.06(m,3H),1.83(m,1H),1.68(m,4H),1.47(m,3H),1.37(m,2H),1.25(m,3H),1.21(m,3H).
實施例56 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Tyr)(5Ad)
按照實施例53的方法，從303mg(0.34mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Tyr)-OBzl得到174mg(74%)標題化合物，為淺黃色粉末。Mp 200.5-202.8℃；=-2.3(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：695[M-H]-；IR(KBr)：3215.3,3055.2,2983.8,2947.2,1658.8,1548.8,1523.8,1448.5,1384.9,1238.3,1163.1,657.7；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.98(m,2H),6.92(m,3H),6.65(s,1H),4.34-4.26(m,6H),3.27(m,2H),3.15(m,1H),3.08(m,1H),2.96(m,2H),2.85(m,12H),1.89(m,5H),1.70(s,3H),1.51(m,3H),1.33(m,3H),1.25(m,4H).
實施例57 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Pro)(5Ae)
按照實施例53的方法，從301mg(0.36mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Pro)-OBzl得到179mg(78%)標題化合物，為淺黃色粉末。Mp 204.8-205.4℃；=-5.0(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：629[M-H]-；IR(KBr)：3244.3,3070.7,2980.1, 2947.2,1662.6,1639.5,1554.6,1450.5,1379.1,1246.1,1201.6,1047.3,995.3,871.8,657.7；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.78(s,1H),6.68(s,1H),4.57(m,1H),4.39-4.33(m,5H),3.74(m,1H),3.60(m,1H),3.26(m,2H),3.17(m,1H),3.04(m,2H),2.19(m,3H),1.85(m,5H),1.69(m,4H),1.54(m,6H),1.36(m,6H).
實施例58 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Phe)(5Af)
按照實施例53的方法，從300mg(0.34mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Phe)-OBzl得到183mg(78%)標題化合物，為淺黃色粉末。Mp 175.8-178.2℃；=-3.3(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：679[M-H]-；IR(KBr)：3215.3,3049.5,2949.2,1662.6,1539.2,1454.3,1394.5；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=7.26(m,3H),7.14(m,2H),6.77(s,1H),6.65(s,1H),4.39-4.33(m,3H),4.03(m,3H),3.42(m,1H),3.37(m,1H),3..29(m,2H),3.17(m,1H),3.09(m,4H),2.95(m,3H),1.91(m,5H),1.74(s,3H),1.53(s,3H),1.33(m,6H).
實施例59 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Gly)(5Ag)
按照實施例53的方法，從300mg(0.38mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Gly)-OBzl得到193mg(85%)標題化合物，為無色粉末。Mp 196.4-199.5℃；=-3.0(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：588[M-H]-；IR(KBr)：3223.1,3062.9,2983.8,1630.2,1552.7,1537.3,1448.5,1382.9,1244.1,1049.3,1006.8,869.9,661.6；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.77(s,1H),6.67(s,1H),4.34-4.28(m,4H), 3.78(s,2H),3.30(m,2H),3.15(m,3H),1.92(m,3H),1.70(s,3H),1.55(s,3H),1.33(m,6H).
實施例60 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Ser)(5Ah)
按照實施例53的方法，從300mg(0.37mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Ser)-OBzl得到181mg(79%)標題化合物，為淺黃色粉末。Mp 195.6-197.4℃；=-3.8(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：619[M-H]-；IR(KBr)：3228.8,3061.0,2981.9,2943.4,1732.1,1662.6,1550.71533.3,1448.5,1384.9,1244.1,1159.2,1049.3,869.9,657.7,518.8；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.78(s,1H),6.67(s,1H),4.41-4.26(m,5H),3.74(m,2H),3.25-3.13(m,6H),1.91(m,3H),1.69(s,3H),1.55(m,3H),1.46(m,2H),1.37(m,6H).
實施例61 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Ile)(5Ai)
按照實施例53的方法，從302mg(0.36mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Ile)-OBzl得到181mg(78%)標題化合物，為無色粉末。Mp 175.6-178.4℃；=-3.3(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：645[M-H]-；IR(KBr)：3224.9,3057.2,2970.4,2758.2,2497.8,2360.87,1656.9,1535.3,1454.3,1388.7,1244.1,1159.1,1037.7,871.8,659.6；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.79(s,1H),6.68(s,1H),4.42(m,1H),4.35(m,1H),4.29(m,1H),4.18(m,1H),3.92(d,J=1.2Hz,1H),3.31(m,2H),3.19(m,2H),3.10(m,3H),2.34(m,1H),2.12(m,1H),1.74(m,4H),1.57(m,3H),1.36(m,6H),1.21(m,2H),0.84(m,9H).
實施例62 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Thr)(5Aj)
按照實施例53的方法，從300mg(0.36mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Thr)-OBzl得到175mg(76%)標題化合物，為淺黃色粉末。Mp 194.8-197.5℃；=-2.8(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：633[M-H]-；IR(KBr)：3236.5,3066.8,2933.7,1660.7,1548.8,1533.4,1450.8,1381.0,1240.2,1157.3,1049.3,869.9,669.3；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.81(s,1H),6.71(s,1H),4.43-4.31(m,4H),4.11(m,2H),3.33(m,2H),3.24(m,1H),3.24(m,2H),3.21(m,1H),3.18(m,1H),3.09(m,1H),1.94(m,3H),1.74(s,3H),1.58(s,3H),1.51(m,2H),1.23(m,1H),1.19(m,1H),1.14(m,3H).
實施例63 製備3S-6,7-二羥基1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Lys)(5Ak)
按照實施例53的方法，從305mg(0.31mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys[Boc-Pro-Ala-LysI(Z)]-OBzl得到152mg(75%)標題化合物，為深黃色粉末。Mp 185.6-188.1℃；=-1.8(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：660[M-H]-；IR(KBr)：3853.7,3738.1,2956.8,2349.3,2017.5,1668.4,1537.3,1400.3,1257.6,1043.5,871.8,671.2.；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.80(s,1H),6.69(s,1H),4.45(m,1H),4.35(m,1H),4.29(m,1H),4.18(m,2H),3.73(m,2H),3.22-3.13(m,8H),3.09(m,4H),2.95(m,1H),1.93(m,6H),1.74(m,9H),1.58(m,6H),1.47(m,2H),1.32-1.27(m,16H),1.18(m,2H).
實施例64 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹 啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Leu)(5Al)
按照實施例53的方法，從300mg(0.36mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Leu)-OBzl得到178mg(77%)標題化合物，為無色粉末。Mp 189.7-192.7℃；=-3.5(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：645[M-H]-；IR(KBr)：3224.9,3064.9,2956.8,1660.7,1548.8,1535.3,1448.5,1381.0,1242.2,1049.3,997.2,869.9,669.3；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.78(s,1H),6.68(s,1H),4.38-4.29(m,3H),4.13(m,2H),3.31(m,3H),3.21(m,1H),3.08(m,2H),1.89(m,4H),1.70(s,3H),1.57(m,4H),1.46(m,5H),1.32(m,6H),1.32(m,1H),1.16(m,6H).
實施例65 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Gln)(5Am)
按照實施例53的方法，從300mg(0.35mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Gln)-OBzl得到184mg(79%)標題化合物，為無色粉末。Mp 181.3-183.3℃；=-3.0(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：660[M-H]-；IR(KBr)：3213.4,3059.1,2981.9,2943.4,2362.8,1739.8,1662.6,1548.8,1537.3,1450.5,1375.3,1244.1,1047.2,871.8,659.7；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.80(s,1H),6.69(s,1H),4.40-4.29(m,5H),3.33(m,3H),3.17(m,3H),1.90(m,2H),1.69(s,3H),1.55(s,3H),1.43(m,2H),1.31(m,8H).
實施例66 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Asn)(5An)
按照實施例53的方法，從302mg(0.36mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Boc-Pro-Ala-Asn)-OBzl得到174mg (78%)標題化合物，為無色粉末。Mp 202.5-204.7℃；=-2.3(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：646[M-H]-；IR(KBr)：3207.6,3059.1,2943.3,1674.2,1537.3,1448.5,1381.0,1247.9,642.3；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.78(s,1H),6.67(s,1H),4.48(m,1H),4.42-4.29(m,4H),3.29(m,2H),3.16(m,4H),2.65(m,2H),1.90(m,2H),1.69(s,3H),1.55(s,3H),1.31(m,6H).
實施例67 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Asp)(5Ao)
按照實施例53的方法，從300mg(0.32mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-[Boc-Pro-Ala-Asp(OBzl)]-OBzl得到174mg(83%)標題化合物，為無色粉末。Mp 207.1-209.7℃；=-3.5(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：647[M-H]-；IR(KBr)：3383.3,3061.0,2360.9,1670.3,1550.8,1448.5,1400.3,1246.3,873.8,611.4；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.76(s,1H),6.66(s,1H),4.52(m,1H),4.37-4.281(m,4H),3.27(m,4H),3.13(m,1H),3.05(m,1H),2.76(m,2H),1.97(m,1H),1.90(m,1H),1.71(s,3H),1.55(s,3H),1.43(m,2H),1.31(m,6H).
實施例68 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(Pro-Ala-Glu)(5Ap)
按照實施例53的方法，從301mg(0.32mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys[Boc-Pro-Ala-Glu(OBzl)]-OBzl得到173mg(82%)標題化合物，為無色粉末。Mp 194.7-196.1℃；=-2.3(c=0.25,CH3OH)；ESI-MS(m/e)：661[M-H]-；IR(KBr)：3053.3,2945.3,2370.5,2320.4,1651.1,1546.9,1533.4,1448.5,1388.8,1240.2,1165.0,1045.4,644.2；1HNMR(300MHz,D2O)δ/ppm=6.78(s,1H),6.67(s,1H),4.42-4.28(m,5H), 3.29(m,2H),3.13(m,3H),2.99(m,1H),2.38(m,2H),2.29(m,1H),1.90(m,5H),1.69(s,3H),1.55(s,3H),1.31(m,6H).
對照例1 製備3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys(6)
按照實施例4的方法，從1.00g(2.03mmol)3S-6,7-二羥基-1,1-二甲基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-甲醯基-Lys-OBzl得到620mg(85%)標題化合物，為淺粉色固體。此化合物6做為對照組用於以下實驗例中。ESI-MS(m/e)：363[M-H]-.
實驗例1 評價本發明化合物5Aa-p靜脈給藥的溶栓活性
1)評價方法
將200-220g雄性SD大鼠用20%烏拉坦溶液(6mL/kg,i.p.)進行麻醉。麻醉大鼠仰臥位固定，分離右頸總動脈，於近心端夾動脈夾，近心端和遠心端分別穿入手術線，將遠心端的手術線於皮毛用止血鉗夾緊，在遠心端插管，鬆開動脈夾，放出約1mL動脈血並裝在1mL的EP管中。往垂直固定的玻璃管(長15mm，內徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封)中注入0.1mL大鼠動脈血液，往管內迅速插入一支不銹鋼質料的血栓固定螺栓。該血栓固定螺旋用直徑為0.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長12mm，含15個螺圈，螺圈的直徑為1.0mm，托柄與螺旋相連，長7.0mm，呈問號型。血液凝固40min後，打開玻璃管底部的膠塞，用鑷子固定血栓固定螺旋的托柄，從玻璃管中取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱重。
旁路插管由3段構成，中段為聚乙烯膠管，長60mm，內徑3.5mm，兩端為相同的聚乙烯管，長100mm，內徑1mm，外徑2mm，該管的一端拉 成尖管(用於插入大鼠頸動脈或靜脈)，外徑1mm，另一端的外部套一段長7mm，外徑3.5mm的聚乙烯管(加粗，用於插入中段的聚乙烯膠管內)。3段管的內壁均矽烷化。將血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯膠管內，膠管的兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)備用。
分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠心端分別穿入手術線，結紮遠心端，在暴露的左頸外靜脈上小心地剪一斜口，將上面製備好的旁路管道的尖管由斜口插入左頸外靜脈開口的近心端，同時遠離旁路管中段(含精確稱重的血栓固定螺旋)內血栓固定螺旋的托柄。用注射器通過另一端的尖管推入準確量的肝素生理鹽水(50IU/kg)，此時注射器不撤離聚乙烯管，用止血鉗夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動脈的近心端用動脈夾止血，在離動脈夾不遠處將右頸總動脈小心地剪一斜口。從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動脈斜口的近心端。旁路管道的兩端都用4號手術縫線與動靜脈固定。
用頭皮針將生理鹽水，尿激酶的生理鹽水溶液或不同濃度化合物的生理鹽水溶液通過旁路管的中段(含精確稱重的血栓固定螺旋)，刺入遠離血栓固定螺旋的近靜脈處，打開動脈夾，使血流通過旁路管道從動脈流向靜脈，此即大鼠動靜脈旁路溶栓模型，緩慢將注射器中的液體注入到血液中(約6min)，使生理鹽水，尿激酶或本發明的化合物通過血液迴圈，按靜脈-心臟-動脈的順序作用到血栓上。從開始注射時計時，1h後從旁路管道中取出血栓固定螺旋，精確稱重。計算每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋給藥前後的品質差，統計並評價化合物的體內溶栓活性。血栓減重用均值和標準差 (±SD)表示。
2)給藥方法和劑量
靜脈注射給藥。空白對照為生理鹽水，給藥劑量為3mL/kg。陽性對照為尿激酶，劑量為20000U/kg，相當於1.68mg/kg。本發明化合物5Aa-p的劑量為0.1nmol/kg。
3)評價結果
溶栓活性用血栓減重(±SD mg)表示，結果列入表1。資料表明，在0.1nmol/kg劑量下靜脈給藥化合物5Aa-p能夠有效地溶解血栓(與生理鹽水比p<0.01)，其中化合物5Aa,5Af,5Ag,5Ak,5Ao的溶栓活性與劑量為20000U/kg的尿激酶相當。在溶栓活性較好的5Aa,5Ad,5Af,5Ag,5Ak中5Ak的溶栓活性最強，因而進一步評價劑量依賴關係。
實驗例2 評價本發明化合物5Ak靜脈給藥溶血栓活性的量效關係
按照實驗例1的方法靜脈注射給藥。空白對照為生理鹽水，給藥劑量為3mL/kg。陽性對照為尿激酶，給藥劑量為20000U/kg，相當於1.68mg/kg。5Ak選取0.1nmol/kg(高)，0.01nmol/kg(中)和0.001nmol/kg(低)三個劑量。結果列入表2。資料表明5Ak表現出明顯的量效關係。
實驗例3 評價本發明化合物5Aa-p靜脈給藥的抗栓活性
1)評價方法
插管由3段構成，中段長80mm，內徑3.5mm，兩端為相同的聚乙烯管，長100mm，內徑1mm，外徑2mm，該管的一端拉成尖管(用於插入大鼠頸動脈或靜脈)，3段管的內壁均矽烷化。將提前稱重的長60mm的絲線放入中段聚乙烯粗管內，粗管的兩端分別與兩根聚乙烯細管的未拉細端相套(其中一段將絲線壓住0.5mm固定)。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)備用。
將200-220g雄性SD大鼠用20%烏拉坦溶液(6mL/kg,i.p.)進行麻醉。麻醉大鼠仰臥位固定，分離出大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠心端分別穿入手術線，結紮遠心端，在暴露的左頸外靜脈上小心地剪一斜口，將上面製 備好的旁路管道的未壓線端尖管由斜口插入左頸外靜脈開口的近心端，用注射器通過另一端的尖管推入準確量的肝素生理鹽水(50IU/kg)，然後換注射器，由同樣方法推入準確量的藥物，此時注射器不撤離聚乙烯管，分離右頸總動脈，於近心端夾動脈夾，近心端和遠心端分別穿入手術線，結紮遠心端，在離動脈夾不遠處將右頸總動脈小心地剪一斜口。從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動脈斜口的近心端。旁路管道的兩端都用4號手術縫線與動靜脈固定。打開動脈夾，使血流通過旁路管道從動脈流向靜脈，此即大鼠動靜脈旁路抗栓模型。從開始迴圈時計時，15min後從旁路管道中取出掛有血栓的絲線，精確稱重，絲線前後的品質差即為血栓濕重，統計並評價化合物的體內抗栓活性。血栓濕重用均值和標準差(±SD)表示。
2)給藥方法和劑量
靜脈給藥。空白對照為生理鹽水，給藥劑量為1mL/kg。陽性對照為阿司匹林，給藥劑量為9mg/kg。本發明化合物5Aa-p的劑量為0.1nmol/kg。
3)結果
抗栓活性用血栓濕重(±SD mg)表示，結果列入表3。資料表明，在0.1nmol/kg劑量下靜脈給藥化合物5Ak能夠有效地抑制血栓形成(與生理鹽水比p<0.001)，其中活性好的5Ak進一步評價劑量依賴關係。
實驗例4 評價本發明化合物5Ak靜脈給藥抗血栓活性的量效關係
1)評價方法
同實驗例3的方法。
2)給藥方法和劑量
靜脈給藥。空白對照為生理鹽水，給藥劑量為3mL/kg。陽性對照為阿司匹林，給藥劑量為9mg/kg。5Ak選取0.1nmol/kg(高)，0.01nmol/kg(中)和0.001nmol/kg(低)三個劑量。
3)結果
結果列入表4，5Ak表現出明顯的量效關係。
實驗例5 評價本發明化合物5Ak對中風大鼠的治療作用
為了考察化合物5Aa-p對中風大鼠的治療作用，選擇化合物5Ak為代 表，按照以下方法考察對中風大鼠的治療作用。
1)評價方法
SD雄性大鼠(280-300g)隨機分為UK陽性對照組，劑量為20000IU/kg。生理鹽水空白對照組，化合物對照組PAK劑量為5μmol/kg和化合物5Ak組，劑量為1μmol/kg(高)，0.1μmol/kg(中)和0.01μmol/kg(低)。大鼠用10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，從頸部正中略偏右部豎直開約2cm長切口，沿胸鎖乳突肌內側緣分離出右頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。用無創動脈夾分別夾閉頸內動脈開口處和頸總動脈近心端，在頸外動脈剪一小口，結紮頸外動脈遠心端，鬆開頸總動脈近心端的動脈夾，取10μL血，取血之後再用無創動脈夾夾閉頸總動脈近心端。將取得的10μL血裝入1mL EP管中，在常溫下放置30分鐘使血液凝固，然後轉移至-20℃冰箱中放置1小時，使血液凝塊結實。1小時結束後取出血液凝塊，加入1mL生理鹽水用鋼鏟把血液凝塊搗成大小均一的細小血栓，然後把細小血栓混懸液轉移至1mL注射器內備用。鬆開大鼠頸內動脈夾的同時，將上述1mL注射器內的血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動脈向近心端經過頸內動脈注入大鼠的大腦，然後結紮頸外動脈近心端，打開頸內動脈和頸總動脈處得動脈夾，恢復血流。然後分離大鼠頸總靜脈，注入UK劑量為20000IU/kg，生理鹽水或化合物5Ak組，劑量為1μmol/kg。結紮靜脈，傷口處滴加3滴青黴素，縫合傷口，等待動物甦醒。
大鼠甦醒24小時後按Zealonga方法評定神經功能缺損程度。0分表示無任何神經功能缺失體徵、1分表示未損傷側前肢不能伸展、2分表示向未損傷側行走、3分表示向未損傷側轉圈成追尾狀行走、4分表示意識障礙無 自主行走、5分表示死亡。將以上各組評分結果進行統計學比較，並作t檢驗。
大鼠甦醒24小時Zealonga方法評定神經功能缺損程度後，用烏拉坦麻醉後迅速斷頭取腦，將腦組織置於-20℃冰箱2小時後，從前額極開始行約2mm冠狀連續切片，共5片，然後置於2%TTC溶液中37℃避光孵育30min，並觀察腦切片的顏色變化，正常組織被TTC染成紅色，而缺血組織呈白色。然後用數碼相機照相，經圖像計軟體處理，計算冠狀切片中梗死體積和正常組織的面積，統計各組的梗死體積百分比值，並做t檢驗。
2)評價結果
大鼠甦醒後Zealonga方法評分資料見表5，大鼠大腦梗死體積百分比資料見表6。
表5和表6的資料說明，化合物5Ak能夠有效地防止腦缺血的大鼠出現運動障礙和大腦組織梗死。5Ak的這種功能具有劑量依賴關係。
實驗例6 評價本發明化合物5Aa-p清除自由基的活性
1)清除羥自由基活性
11.316mg DMPO(二甲基吡啶N-氧化物，Sigma)溶解於1mL純淨水中得到濃度為0.1M的DMPO溶液，2.78g FeSO4．7H2O溶解於1mL的純淨水制濃度為10mM的溶液。30%醫用H2O2稀釋到0.2%。
先測2.5μL FeSO4．7H2O溶液+2.5μL DMPO溶液+5μL H2O2溶液+5μL水的OH信號峰的第一個峰的高度，重複6次，該峰的高度就是已知的OH信號峰的高度。再測2.5μL FeSO4．7H2O溶液+2.5μL DMPO溶液+5μL H2O2溶液+5μL化合物5Aa-p之一溶液的OH信號峰的第一個峰的高度，重複6次。該峰的高度就是5Aa-p清除已知的OH信號峰的高度的殘留。
清除率=(已知的OH信號峰的高度-加5Aa-p之後的OH信號峰高度)/已知的OH信號峰的高度
2)清除NO自由基活性
7.325mg MGD(N-甲基-葡萄糖胺二硫代甲酸，Sigma)溶解于1mL純淨水得到濃度為25mM的MGD溶液，3.475g FeSO4．7H2O溶解於1mL的 純淨水制濃度為12.5mM的溶液，25mg SNAP(亞硝基乙醯青黴胺)溶解在1mL純淨水得到的濃度為110μM的綠色母液稀釋100倍得到1μM的SNAP溶液。
先測5μLMGD溶液+5μL FeSO4．7H2O溶液+5μLSNAP+5μL水的NO信號第一個峰高度，重複6次。該峰的高度就是已知的NO信號峰的高度。再測5μLMGD溶液+5μL FeSO4．7H2O溶液+5μLSNAP+5μL化合物5Aa-p溶液之一的NO信號峰的第一個峰的高度，重複6次。該峰的高度就是5Aa-p清除已知的NO信號峰的高度的殘留。
清除率=(已知的NO信號峰的高度-加5Aa-p之後的NO信號峰高度)/已知的NO信號峰的高度。
3)清除超氧陰離子自由基活性
0.3g黃嘌呤溶解於1mL純淨水得到濃度為0.5M的黃嘌呤溶液(乳白色，大量不溶)，市售黃嘌呤氧化酶原液稀釋10倍得到黃嘌呤氧化酶溶液，飽和DETAPAC溶液稀釋20倍得到濃度為0.9mM的溶液，11.316mg DMPO溶解於1mL純淨水得到濃度為0.1M的DMPO溶液。
5μL DMPO溶液+5μL DETAPAC溶液+5μL黃嘌呤溶液+5μL黃嘌呤氧化酶溶液+5μL化合物5Aa-p溶液
先測5μL DMPO溶液+5μL DETAPAC溶液+5μL黃嘌呤溶液+5μL黃嘌呤氧化酶溶液+5μL水的超氧陰離子信號第一個峰高度，重複6次。該峰的高度就是已知的超氧陰離子信號峰的高度。再測5μL DMPO溶液+5μL DETAPAC溶液+5μL黃嘌呤溶液+5μL黃嘌呤氧化酶溶液+5μL化合物5Aa-p溶液之一的超氧陰離子信號峰的第一個峰的高度，重複6次。 該峰的高度就是5Aa-p清除已知的超氧陰離子信號峰的高度的殘留。
清除率=(已知的超氧陰離子信號峰的高度-加5Aa-p之後的超氧信號峰高度/已知的超氧陰離子信號峰的高度。
結果如表7。資料表明，5Aa-p清除三種自由基活性的EC50為0.4-0.7mM，有明確的自由基清除活性。
實驗例7 測定本發明化合物5Aa-p的透射電鏡
將樣品用三蒸水分別配成1×10-7M，1×10-9M，1×10-11M的溶液，吸取微量(約10μL)滴於銅網表面，銅網下面襯濾紙，自然晾乾，在透射電子顯微鏡(JEOL,JEM-1230)下觀察其形態及粒徑，並用照片記錄。
在水溶液中本發明化合物5Aa-p可自組裝成直徑在20-210nm之間的奈米球，其中絕大多數粒徑在20-100nm之間，這些奈米球串連形成的不同形狀的奈米網，奈米項鍊等，現以體內濃度1×10-9M(理論血藥濃度)為例，列舉各化合物的電鏡圖(圖9)。在圖9中，本發明化合物5Aa-p對應的圖號分別為5a,5b,5c,5d,5e,5f,5g,5h,5i,5j,5k,5l,5m,5n,5o和5p。
實驗例8 大鼠中風4小時後接受1μmol/kg 5Ak連續治療6次的試驗
療效用神經功能評分表示，評分越低療效越好。雄性SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，劑量為400mg/kg體重，使麻醉。于頸部正中縱行切口，分離出右側頸總動脈主幹(約3cm長)。于舌骨水準分離結紮頸外動脈各分支，於頸膨大處分離出頸內動脈。用無創動脈夾分別夾閉頸內動脈開口處和頸總動脈近心端，並結紮頸外動脈遠端。於頸外動脈主幹處插入裝有0.5mL血栓塊生理鹽水懸浮液的導管，在鬆開頸內動脈夾的同時，將導管內的0.5mL血栓塊生理鹽水懸浮液緩慢從頸外動脈向近心端經過頸內動脈注入大腦中動脈。之後，結紮頸外動脈近心端，打開頸內動脈和頸總動脈處的動脈夾，恢復血流，縫合傷口。並肌肉注射2萬IU的青黴素，預防感染。4小時之後把化合物5Ak(劑量為1μmol/kg,n=10)的生理鹽水溶液，連續輸6天，觀察7天，每天自身對照，按Zealonga方法評定神經功能缺損程度。0分表示無任何神經功能缺失體徵，1分表示未損傷側前肢不能伸展，2分表示 向未損傷側行走，3分表示向未損傷側轉圈成追尾狀行走，4分表示意識障礙無自主行走，5分表示死亡。試驗結果見表8。結果說明，大鼠中風4小時之後每天接受1次劑量為1μmol/kg 5Ak治療，連續治療6次，無死亡，10只大鼠有8只好轉為無任何神經功能缺失體徵，有2只殘留輕微的神經功能缺失體徵。可見，在1μmol/kg劑量下，5Ak對中風4小時有確切治療作用。
實驗例9 大鼠中風6小時後接受1μmol/kg 5Ak連續治療6次的試驗
療效用神經功能評分表示，評分越低療效越好。雄性SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，劑量為400mg/kg體重，使麻醉。于頸部正中縱行切口，分離出右側頸總動脈主幹(約3cm長)。于舌骨水準分離結紮頸外動脈各分支，於頸膨大處分離出頸內動脈。用無創動脈夾分別夾閉頸內動脈開口處和頸總動脈近心端，並結紮頸外動脈遠端。於頸外動脈主幹處插入裝有0.5 mL血栓塊生理鹽水懸浮液的導管，在鬆開頸內動脈夾的同時，將導管內的0.5mL血栓塊生理鹽水懸浮液緩慢從頸外動脈向近心端經過頸內動脈注入大腦中動脈。之後，結紮頸外動脈近心端，打開頸內動脈和頸總動脈處的動脈夾，恢復血流，縫合傷口。並肌肉注射2萬IU的青黴素，預防感染。6小時之後把化合物5Ak(劑量為1μmol/kg,n=10)的生理鹽水溶液，連續輸6天，觀察7天，每天自身對照，按Zealonga方法評定神經功能缺損程度。0分表示無任何神經功能缺失體徵，1分表示未損傷側前肢不能伸展，2分表示向未損傷側行走，3分表示向未損傷側轉圈成追尾狀行走，4分表示意識障礙無自主行走，5分表示死亡。試驗結果見表9。結果說明，大鼠中風6小時之後每天接受1次劑量為1μmol/kg 5Ak治療，連續治療6次，除1只意外死亡，9只大鼠有6只好轉為無任何神經功能缺失體徵，有3只殘留輕微的神經功能缺失體徵。可見，在1μmol/kg劑量下，5Ak對中風6小時有確切治療作用。
實驗例10 大鼠中風24小時後接受1μmol/kg 5Ak連續治療6次的試驗
療效用神經功能評分表示，評分越低療效越好。雄性SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，劑量為400mg/kg體重，使麻醉。于頸部正中縱行切口，分離出右側頸總動脈主幹(約3cm長)。于舌骨水準分離結紮頸外動脈各分支，於頸膨大處分離出頸內動脈。用無創動脈夾分別夾閉頸內動脈開口處和頸總動脈近心端，並結紮頸外動脈遠端。於頸外動脈主幹處插入裝有0.5mL血栓塊生理鹽水懸浮液的導管，在鬆開頸內動脈夾的同時，將導管內的0.5mL血栓塊生理鹽水懸浮液緩慢從頸外動脈向近心端經過頸內動脈注入大腦中動脈。之後，結紮頸外動脈近心端，打開頸內動脈和頸總動脈處的動脈夾，恢復血流，縫合傷口。並肌肉注射2萬IU的青黴素，預防感染。24小時之後把化合物5Ak(劑量為1μmol/kg,n=10)的生理鹽水溶液，連續輸6天，觀察7天，每天自身對照，按Zealonga方法評定神經功能缺損程度。0分表示無任何神經功能缺失體徵，1分表示未損傷側前肢不能伸展，2分表示向未損傷側行走，3分表示向未損傷側轉圈成追尾狀行走，4分表示意識障礙無自主行走，5分表示死亡。試驗結果見表10。結果說明，大鼠中風24小時之後，2只死亡，剩餘8只每天接受1次劑量為1μmol/kg 5Ak治療，連續治療6次，無死亡，8只大鼠有3只好轉為無任何神經功能缺失體徵，有4只殘留輕微的神經功能缺失體徵，有1只殘留明顯的神經功能缺失體徵。可見，在1μmol/kg劑量下，5Ak對中風24小時仍然有確切治療作用。
實驗例11 大鼠中風6小時後接受2.5μmol/kg 5Ak連續治療6次的試驗
療效用神經功能評分表示，評分越低療效越好。雄性SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，劑量為400mg/kg體重，使麻醉。于頸部正中縱行切口，分離出右側頸總動脈主幹(約3cm長)。于舌骨水準分離結紮頸外動脈各分支，於頸膨大處分離出頸內動脈。用無創動脈夾分別夾閉頸內動脈開口處和頸總動脈近心端，並結紮頸外動脈遠端。於頸外動脈主幹處插入裝有0.5mL血栓塊生理鹽水懸浮液的導管，在鬆開頸內動脈夾的同時，將導管內的0.5mL血栓塊生理鹽水懸浮液緩慢從頸外動脈向近心端經過頸內動脈注入大腦中動脈。之後，結紮頸外動脈近心端，打開頸內動脈和頸總動脈處的動脈夾，恢復血流，縫合傷口。並肌肉注射2萬IU的青黴素，預防感染。6小時之後把化合物5Ak(劑量為2.5μmol/kg,n=10)的生理鹽水溶液，連續 輸6天，觀察7天，每天自身對照，按Zealonga方法評定神經功能缺損程度。0分表示無任何神經功能缺失體徵，1分表示未損傷側前肢不能伸展，2分表示向未損傷側行走，3分表示向未損傷側轉圈成追尾狀行走，4分表示意識障礙無自主行走，5分表示死亡。試驗結果見表11。結果說明，9只大鼠中風6小時之後，每天接受1次劑量為2.5μmol/kg 5Ak治療，連續治療6次，無死亡，9只大鼠有7只好轉為無任何神經功能缺失體徵，有1只殘留輕微的神經功能缺失體徵。可見，在2.5μmol/kg劑量下，5Ak對中風6小時的治療作用明顯比1μmol/kg劑量好。
實驗例12 大鼠中風24小時後接受2.5μmol/kg 5Ak連續治療6次的試驗
療效用神經功能評分表示，評分越低療效越好。雄性SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，劑量為400mg/kg體重，使麻醉。于頸部正中縱行切口，分離出右側頸總動脈主幹(約3cm長)。于舌骨水準分離結紮頸外動脈各分 支，於頸膨大處分離出頸內動脈。用無創動脈夾分別夾閉頸內動脈開口處和頸總動脈近心端，並結紮頸外動脈遠端。於頸外動脈主幹處插入裝有0.5mL血栓塊生理鹽水懸浮液的導管，在鬆開頸內動脈夾的同時，將導管內的0.5mL血栓塊生理鹽水懸浮液緩慢從頸外動脈向近心端經過頸內動脈注入大腦中動脈。之後，結紮頸外動脈近心端，打開頸內動脈和頸總動脈處的動脈夾，恢復血流，縫合傷口。並肌肉注射2萬IU的青黴素，預防感染。24小時之後把化合物5Ak(劑量為2.5μmol/kg,n=10)的生理鹽水溶液，連續輸6天，觀察7天，每天自身對照，按Zealonga方法評定神經功能缺損程度。0分表示無任何神經功能缺失體徵，1分表示未損傷側前肢不能伸展，2分表示向未損傷側行走，3分表示向未損傷側轉圈成追尾狀行走，4分表示意識障礙無自主行走，5分表示死亡。試驗結果見表12。結果說明，大鼠中風24小時之後，3只死亡，剩餘7只每天接受1次劑量為2.5μmol/kg 5Ak治療，連續治療6次，2只死亡，3只好轉為無任何神經功能缺失體徵，有1只殘留輕微的神經功能缺失體徵，有1只殘留明顯的神經功能缺失體徵。可見，在2.5μmol/kg劑量下，5Ak對中風24小時仍然有一定治療作用。
實驗例13 大鼠中風24小時後接受5μmol/kg 5Ak連續治療6次的試驗
療效用神經功能評分表示，評分越低療效越好。雄性SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，劑量為400mg/kg體重，使麻醉。于頸部正中縱行切口，分離出右側頸總動脈主幹(約3cm長)。于舌骨水準分離結紮頸外動脈各分支，於頸膨大處分離出頸內動脈。用無創動脈夾分別夾閉頸內動脈開口處和頸總動脈近心端，並結紮頸外動脈遠端。於頸外動脈主幹處插入裝有0.5mL血栓塊生理鹽水懸浮液的導管，在鬆開頸內動脈夾的同時，將導管內的0.5mL血栓塊生理鹽水懸浮液緩慢從頸外動脈向近心端經過頸內動脈注入大腦中動脈。之後，結紮頸外動脈近心端，打開頸內動脈和頸總動脈處的動脈夾，恢復血流，縫合傷口。並肌肉注射2萬IU的青黴素，預防感染。24小時之後把化合物5Ak(劑量為5μmol/kg,n=10)的生理鹽水溶液，連續輸6天，觀察7天，每天自身對照，按Zealonga方法評定神經功能缺損程度。0分表示無任何神經功能缺失體徵，1分表示未損傷側前肢不能伸展，2分表示向未損傷側行走，3分表示向未損傷側轉圈成追尾狀行走，4分表示意識障礙無自主行走，5分表示死亡。試驗結果見表13。結果說明，大鼠中風24小時之後，1只死亡，剩餘10只每天接受1次劑量為5μmol/kg 5Ak治療，連續治療6次，無死亡，7只好轉為無任何神經功能缺失體徵，有3只殘留輕微 的神經功能缺失體徵。可見，在5μmol/kg劑量下，5Ak對中風24小時有確切治療作用，比2.5μmol/kg劑量下的療效明顯好。
根據實驗結果表明，本發明的化合物能夠形成奈米結構，達成跨越血腦屏障的功效；除了溶血拴與抗血栓以外，還能夠有效清除OH,NO和超氧陰離子等自由基；且只需低劑量即能有效溶血栓，在稍高的劑量下則可以對4小時以上的中風顯示優秀的療效，具有良好的臨床應用前景。

Claims (18)

  1. 一種通式I代表的化合物， 其中：T代表具有至少兩個連接用基團的連接臂；Q代表具溶血栓活性肽；R1和R2代表C1-4烷基，其中R1和R2可為相同或不同。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的化合物，其中至少一個所述連接用基團為胺基，且其餘連接用基團為羧基或胺基。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的化合物，其中所述連接臂為L-Lys、L-Asp或L-Glu。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的化合物，其中所述具溶血栓活性肽選自由含PA(Pro-Ala)序列、PAK(Pro-Ala-Lys)序列、AKP(Ala-Lys-Pro)序列或KAP(Lys-Ala-Pro)序列的寡肽，或包含以PAK序列、AKP序列或KAP序列為結構單元的重複序列肽所構成的群組。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的化合物，其中所述含PA(Pro-Ala)序列的寡肽為三肽，且具有以下通式Q1或Q2：Pro-Ala-AA (Q1) AA-Ala-Pro (Q2)其中AA選自由L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu所構成的群組
  6. 如申請專利範圍第1項所述的化合物，其中R1和R2皆為甲基。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的化合物，其中所述連接臂為L-Lys、 L-Asp或L-Glu，且所述具溶血栓活性肽為含PA(Pro-Ala)序列的三肽。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的化合物，具有以下通式Ia,Ib,Ic,Id,Ie,If,Ig，或Ih： 其中AA選自由L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu所構成的群組。
  9. 一種藥物組合物，其包含如申請專利範圍第1至8項任一項所述的化合物，及藥學上可接受的載劑。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的藥物組合物，其中所述化合物可形成奈米球結構。
  11. 如申請專利範圍第9項所述的藥物組合物，作為溶血栓藥物、清除NO自由基藥物或抗血栓藥物。
  12. 如申請專利範圍第9項所述的藥物組合物，作為治療中風或腦梗藥物。
  13. 一種如申請專利範圍第1項所述通式I化合物的製備方法，所述製備方法包括以下步驟：(1)提供通式II化合物： 其中R1和R2代表C1-4烷基，且R1和R2可為相同或不同；(2)提供具有至少兩個連接用基團的連接臂T、以及具溶血栓活性肽Q，其中所述連接臂具有第一連接用基團與第二連接用基團；(3)在適當反應條件下，連接通式II化合物的羧基與所述連接臂T的第一連接用基團，形成通式IM-1化合物： ；以及 (4)在適當反應條件下，連接所述具溶血栓活性肽Q與通式IM-1化合物，其中所述具溶血栓活性肽Q的一端與所述連接臂T的第二連接用基團相連接，形成通式I化合物。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的製備方法，其中所述第一連接用基團為胺基，且所述第二連接用基團為羧基或胺基。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的製備方法，其中所述連接臂為L-Lys、L-Asp或L-Glu。
  16. 如申請專利範圍第13項所述的製備方法，其中所述具溶血栓活性肽選自由含PA(Pro-Ala)序列、PAK(Pro-Ala-Lys)序列、AKP(Ala-Lys-Pro)序列或KAP(Lys-Ala-Pro)序列的寡肽，或包含以PAK序列、AKP序列或KAP序列為結構單元的重複序列肽所構成的群組。
  17. 如申請專利範圍第16項所述的製備方法，其中所述含PA(Pro-Ala)序列的寡肽為三肽，且具有以下通式Q1或Q2：Pro-Ala-AA (Q1) AA-Ala-Pro (Q2)其中AA選自由L-Ala,L-Val,L-Trp,L-Tyr,L-Pro,L-Phe,Gly,L-Ser,L-Ile,L-Thr,L-Lys,L-Leu,L-Gln,L-Asn,L-Asp，和L-Glu所構成的群組。
  18. 如申請專利範圍第13項所述的製備方法，其中R1和R2皆為甲基。
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