WO2014194809A1 - 具有溶栓、抗栓和自由基清除三重活性的新型化合物、其合成、纳米结构和应用 - Google Patents

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赵明
吴建辉
王玉记
冯琦琦
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Definitions

  • the present invention relates to novel compounds having both thrombolytic, scavenging free radical and thrombus targeting/antithrombotic functions, as well as methods for their preparation and use.
  • the invention further relates to novel binary conjugates formed by linking a tetrahydroisoquinoline compound having two CM alkyl groups to a thrombolytic oligopeptide by a tether.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition comprising the compound, a process for the preparation of the compound, and nanostructures thereof. Background technique
  • thrombootic diseases such as stroke/cerebral infarction
  • Drug therapy for thrombotic diseases is the focus and hotspot of thrombotherapy.
  • Finding safe and effective new thrombus drugs is one of the hotspots of drug research.
  • 3S-1,1-dimethyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid has anti-platelet aggregation and antithrombotic In addition to activity, it also has scavenging free radical activity.
  • tetrahydroisoquinoline compounds having thrombolytic activity including "3 S-6, 7-1, 2, 3, are disclosed in Chinese Patent No. CN101497651B, filed on January 30, 2008.
  • a first object of the invention is to provide a compound of formula I:
  • T represents at least two connecting arms connecting group
  • Q represents a peptide having thrombolytic activity
  • ⁇ R n R 2 Representative --4 alkyl, wherein R n R 2 may be the same or different.
  • At least one of the linking groups of the tether T is an amino group, and the remaining linking groups are a carboxyl group or an amino group.
  • the tether can be a natural amino acid, such as L-Lys, L-Asp or L-Glu.
  • the connecting arm can be L-Lys.
  • the thrombolytic active peptide useful in the present invention may be a PA-containing (Pro-Ala) sequenced PAK (Pro-Ala-Lys) sequence, AKP (Ala-Lys-Pro).
  • PAK Pro-Ala-Lys
  • AKP Al-Lys-Pro
  • the thrombolytic active oligopeptide may be a tripeptide to octapeptide comprising a PA CPro-Ala) sequence, a PAK sequence, an AKP sequence or a KAP sequence, preferably a tripeptide comprising a PA sequence.
  • the tripeptide containing the PA sequence has the following formula Q1 or Q2:
  • AA is selected from the group consisting of L-Ala, L-VaK L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L a group consisting of -Gln, L-Asn, L-Asp, and L-Glu.
  • both are methyl.
  • the linking arm is L-Lys, L-Asp or L-Glu
  • the thrombolytic active peptide is a tripeptide containing a PA (Pro-Ala) sequence, for example, it may have the following La (e.g., 5Aa-p compound in Figure 1), lb (; e.g., 5Ba-p compound in Figure 2), Ic (e.g., 5Ca-p compound in Figure 3), Id (e.g., 5Da in Figure 4) p compound), Ie (for example, 5Ea-p compound in Fig. 5), If (for example, 5Fa-p compound in Fig. 6), Ig (such as 5Ga-p compound in Fig. 7) or Ih (for example, 5Ha-p compound in 8):
  • La e.g., 5Aa-p compound in Figure 1
  • lb e.g., 5Ba-p compound in Figure 2
  • Ic e.g., 5Ca-p
  • AA is selected from the group consisting of L-Ala, L-Vak L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L a group consisting of -Gln, L-Asn, L-Asp, and L-Glu.
  • a second object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the aforementioned compound of the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the compound in a preferred embodiment, can form a nanosphere structure.
  • the pharmaceutical composition of the invention acts as a thrombolytic drug, a NO free radical drug or a thrombotargeting/antithrombotic drug.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be used as a medicament for treating stroke or cerebral infarction, more preferably for treating stroke or cerebral infarction with an onset of more than 4 hours, 6 hours and 24 hours, and Continuous administration to treat.
  • a third object of the present invention is to provide a process for the preparation of a compound of formula I comprising the steps of:
  • ⁇ and R 2 represent d- 4 alkyl, and! ⁇ and R 2 may be the same or different;
  • a compound of the formula IM-1 is formed by linking a carboxyl group of the compound of the formula II with a first linking group of the linking arm T under appropriate reaction conditions:
  • the first linking group of the linking arm T is an amino group for performing a condensation reaction with a carboxyl group of the compound of the formula II; and the second linking group is a carboxyl group or an amino group for The N-terminus or C-terminus of the thrombolytic active peptide Q is ligated.
  • the tether T and the thrombolytic active peptide Q which can be used in the preparation method of the present invention are the same as defined above for the compound of the formula I of the present invention.
  • the tether in the preparation method of the present invention may be L-Lys, L-Asp or L-Glu, more preferably L-Lys; and the thrombolytic active peptide may be PA-containing (Pro-Ala) a sequence of a tripeptide, a PAK (Pro-Ala-Lys) sequence, an AKP (Ala-Lys-Pro) sequence or an oligopeptide of a KAP (Lys-Ala-Pro) sequence, or comprising a PAK sequence, an AKP sequence or a KAP sequence
  • the repeat peptide of the structural unit is more preferably a tripeptide having the following formula Q1 or Q2:
  • AA is selected from the group consisting of L-Ala, L-Vak L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L a group consisting of -Gln, L-Asn, L-Asp, and L-Glu.
  • the compound of formula II in the process of the invention is prepared! ⁇ and R 2 are both methyl, the linking arm is L-Lys, L-Asp or L-Glu, and the thrombolytic active peptide is a tripeptide containing a PA (Pro-Ala) sequence.
  • the process of the invention can be used to form the above compounds of formula Ia-h.
  • the compound or pharmaceutical composition of the present invention shows that it has excellent thrombolytic and antithrombotic activity at low doses in an activity test in rats, and can effectively protect the nerve function of a rat in a stroke, and can be clinically effective and Safe treatment of thrombotic diseases.
  • Figure 1 is a synthetic route for the synthesis of the compound la of the present invention in accordance with one embodiment of the present invention
  • Figure 2 is a synthetic route for the synthesis of the compound lb of the present invention in accordance with one embodiment of the present invention
  • Figure 3 is a synthetic route for the synthesis of the compound Ic of the present invention, in accordance with one embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a synthetic route for the synthesis of the compound Id of the present invention in accordance with one embodiment of the present invention
  • Figure 5 is a synthetic route for the synthesis of the compound Ie of the present invention, in accordance with one embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a synthetic route for the synthesis of the compound If of the present invention, in accordance with one embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a synthetic route for the synthesis of the compound Ig of the present invention, in accordance with one embodiment of the present invention.
  • Figure 8 is a synthetic route for the synthesis of the compound Ih of the present invention, in accordance with one embodiment of the present invention.
  • Figure 9 is a transmission electron micrograph of the nanostructure of the compound 5Aa-p of the present invention, in accordance with one embodiment of the present invention. detailed description
  • the present invention utilizes a tether to link a tetrahydroisoquinoline compound having two CM alkyl groups (ie, a compound of formula II) to a thrombolytic oligopeptide to form a thrombolytic, scavenging free radical, and thrombus targeting/antibody.
  • a novel binary conjugate of three functions of thrombus hereinafter referred to as "the novel binary conjugate of the present invention.
  • the novel binary conjugate of the invention and the previously known "thrombolytic activity 6,7" -Dihydroxyisoquinoline has four advantages compared to: "1) The steric hindrance effect of the two CM alkyl groups introduced at the 1-position of the compound of formula II makes it difficult for carboxypeptidase and aminopeptidase to be easily accessible and thus not easy Hydrolysis of the thrombolytic oligopeptides in "the novel binary conjugates of the invention”; 2) the hydrophobic contribution of the two CM alkyl groups introduced at the 1-position of the compound of formula II such that "the novel binary conjugates of the invention”"Better crossing the blood-brain barrier; 3) The electron donating contribution of the two CM alkyl groups introduced at the 1-position of the compound of formula II allows the "reduction of the novel binary conjugate of the invention” to satisfy free radical scavenging The need for;
  • the novel binary conjugate of the present invention is capable of forming a nanostructure to achieve an effect across the blood-brain barrier; in addition to hemolysis and antithrombotic, it is also effective in removing OH, NO and superoxide anion. Base; and only need low dose to effectively dissolve thrombus, has a good clinical application prospects.
  • linking group means a functional group capable of undergoing a condensation reaction, such as a carboxyl group or an amino group.
  • linker arm means a molecule having the linking group which can be used to link a compound of formula II with a thrombolytic active peptide Q. At least one linking group of the linking arms is an amino group, and the remaining linking groups are a carboxyl group or an amino group.
  • the tether can be a natural amino acid such as L-Lys, L-Asp or L-Glu.
  • the introduced tether enables the "inventive novel binary conjugate” to form a stable nanosphere structure that is not engulfed by macrophages, which can be safely transported to the thrombotic site, eventually crossing the blood-brain barrier.
  • L-Lys is used as a tether, such that the molecules of the "innovative binary conjugate of the invention” can be more efficiently associated to form nanospheres having a particle size between 20 and 210 nm, more preferably at 20- Between 100 nm, this stable nanostructure contributes to "the novel binary conjugate of the present invention” is not engulfed by macrophages in the blood circulation, so that it can be safely transported to the thrombotic site, eventually crossing the blood. Brain barrier.
  • oligopeptide refers to a small molecule peptide having a molecular weight of less than 1000 Daltons (D), typically consisting of 3 to 8 amino acids.
  • thrombolytic active peptide means an oligopeptide thrombolytic agent having increased vascular permeability and thrombolytic effect, These include P6A (ARPAK), P6A metabolites, and related derivatives.
  • PARPAK P6A
  • Previous studies have revealed several thrombolytic oligopeptides (including Ala-Arg-Pro-Ala-Lys, Gly-Arg-Pro-Ala-Lys, Gln-Arg-Arg-Pro-Ala-Lys and Pro-Ala) In -Lys), Pro-Ala-Lys is both the shortest active sequence and the most stable sequence.
  • the introduction of the Pro-Ala-AA sequence tripeptide via the tether at the 3 position of the compound of formula II allows for better stability and greater thrombolytic activity of the "modern binary conjugates of the invention".
  • an oligopeptide which can be used in the present invention containing a PAK sequence, an AKP sequence or a KAP sequence can be PAK, RPAK (Arg-Pro-Ala-Lys), ARPAK (Ala-Arg-Pro-Ala-Lys), GRPAK (Gly-Arg-Pro-Ala-Lys) , QRPAK (Gln-Arg-Pro-Ala-Lys), AKP, KAP, KPAK (Lys-Pro-Ala-Lys), PAKP (Pro-Ala-Lys-Pro) ⁇ AKPAK (Ala-Lys-Pro-Ala-Lys) or PAKPA (Pro-Ala-Lys-Pro-Ala) »
  • a repeat peptide which can be used in the present invention as a structural unit of a PAK sequence, an AKP sequence or a KAP sequence can be a series of thrombolytically active peptides disclosed in the application of Chinese Patent Application Publication No.
  • CN101190941 including Repeated peptides (PAK) 2 , (PAK) 3 , (PAK) 4 , (PAK) 5 and (PAK) 6 synthesized with PAK as a structural unit; repeat peptide (AKP) 2 synthesized with AKP as a structural unit; (AKP) 3 , (AKP) 4 , (AKP) 5 and (AKP) 6 ; and repeat peptides synthesized by KPA as structural units (KPA) 2 , (KPA) 3 , (KPA) 4 , (KPA) 5 And (KPA) 6 .
  • d- 4 alkyl means an alkyl group having a carbon number of 1-4, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl. Base, tert-butyl.
  • the compound of the formula II as a starting material is 3,4-dihydroxy- in the presence of trifluoroacetic acid (TFA) and anhydrous magnesium sulfate.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the Pictet-Spengler condensation of L-phenylalanine with acetone has the advantage of being easier to prepare.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be any clinically acceptable suitable preparation.
  • it is an injection preparation (powder needle, lyophilized powder needle, water needle, infusion solution, etc.); wherein, the pharmaceutically acceptable carrier can be mannitol na nn itol), water, Ringer's solution ⁇ Or isotonic sodium chloride solution or the like.
  • the nanospheres of the compounds of the invention have a particle size between 20 and 210 nm, more preferably between 20 and 100 nm, which allows them to better cross the blood-brain barrier.
  • the stable nanostructure helps to prevent the compounds of the present invention from being phagocytized by macrophages in the blood circulation, thereby being safely transported to the thrombotic site and eventually across the blood-brain barrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a thrombolytic drug for treating myocardial infarction, Ischemic stroke, deep vein thrombosis, pulmonary embolism, peripheral arterial obstructive disease, and peripheral arterial obstructive disease (Peripheral arterial). Occlusive disease), occluded central vascular access devices, arteriovenous fistula and shunts, and carotid stenosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be used as a drug for removing NO radicals, for treating neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases, mental diseases, and for treating altitude sickness, diabetes, Rheumatoid arthritis, Traumatic brain injury, cancer, X-chromatosis (Fragile X syndrome), Sickle Cell Disease, Lichen planus, Vitiligo, or Chronic fatigue syndrome.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be used as a thrombus-targeting/antithrombotic drug for treating thrombocytopenia (Thrombocytosis myeloproliferative disease, polycythemia vera, or Buka syndrome). Chiari syndrome) and other diseases.
  • the pharmaceutical composition/compound of the present invention simultaneously has the functions of scavenging free radicals, thrombolytics, and antithrombotic/thrombus targeting such as OH, NO and superoxide anion, and thus can maintain the therapeutic effect after the patient has a stroke for 4 hours, that is, is not used.
  • the 3-hour treatment of tPA is limited by the golden phase; it does not cause tPA-like systemic hemorrhagic reactions; and it can eliminate a large number of free radicals such as OH, NO and superoxide anion generated during ischemia-reperfusion, so that patients can treat cranial nerves during treatment. Tissue is protected from damage.
  • the "inventive novel binary conjugate” is previously known as "thrombolytic-active 6" Compared with 7-dihydroxyisoquinoline, it shows better thrombolytic activity at low doses, with unique scavenging free radical and antithrombotic activity, and can be used for more than 4 hours at slightly higher doses. Stroke shows excellent results.
  • the thrombolytically active 6,7-dihydroxyisoquinoline showed a thrombolytic effect at a dose of 10 nmol/kg.
  • the compounds of the present invention exhibited good thrombolytic and antithrombotic effects at 0.1 nmol/kg; and at doses of 1 ⁇ 1/13 ⁇ 4, 2.5 ⁇ /kg, 5 ⁇ 1/13 ⁇ 4, respectively, after 4, 6, and 24 hours of stroke, respectively.
  • the thrombolytic active peptide Q can be synthesized first, and then linked to the second linking group of the tether; or the amine in the thrombolytic active peptide Q can be used.
  • the base acid is sequentially or singly linked to the tether in a predetermined sequence.
  • the first amino acid having one end of the thrombolytic active peptide Q can be first linked to the second linking group of the tether. Then, the remaining amino acids are sequentially connected one by one or more.
  • ⁇ and R 2 may be the same or different.
  • 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (; SM-1) and a compound of the formula SM-2 can be first dissolved in trifluoroacetic acid (TFA) in the presence of anhydrous magnesium sulfate.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the Pictet-Spengler condensation of 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine with acetone affords the compound of formula II.
  • the tether in the preparation method of the present invention is L-Lys
  • the thrombolytic active peptide is a tripeptide containing a PA (Pro-Ala) sequence
  • the carboxyl group of the compound of the formula II is first One of the N-termini of L-Lys is joined, and then the tripeptide containing the PA sequence is joined to the remaining N-terminus or C-terminus of the L-Lys linker.
  • ⁇ and R 2 are both methyl (ie 3S-6J-dihydroxy-1,1-dimethyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-formyl-carboxylic acid), linked
  • the arm is L-Lys
  • the thrombolytic active peptide is a tripeptide containing a PA (Pro-Ala) sequence, and the preparation method of the present invention can form the above compound la, lb, Ic, or Id.
  • the synthetic route disclosed in Fig. 1 can be referred to.
  • the PA sequence containing the PA sequence is synthesized and then linked to the L-Lys linker, wherein AA is selected from the group consisting of L-Ala, L-VaK L-Trp, L- Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, and L-Glu residues (5Aa-p compound, respectively), and the reaction conditions are as follows: i) Acetone, TFA, MgS0 4 ; ii) HCl .
  • an amino acid (eg, AA) in the PA-containing tripeptide may be first linked to the L-Lys linker, and then the remaining two amines in the PA-containing tripeptide may be A base acid (such as Pro-Ala) is attached to AA.
  • the preparation method of the present invention may comprise the following steps:
  • Boc-Pro-Ala-AA-OBzl (AA selected from L-Ala, Gly, L-Phe, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Tyr,
  • AA is selected from the group consisting of L-Ala, L-VaK L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe , Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, and L-Glu residues (5Ba-p compounds, respectively),
  • the reaction conditions are as follows: i) Acetone, TFA, MgS04; ii) HCl.
  • Lys(Boc)-OBzl DCC, HOBt, NMM; iii) ethanol, Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM, v) ethanol, Pd/C; 4M HCl/EA, ice bath; vi) ethanol, Pd/C; vii) 4M HCl/EA, ice bath.
  • AA is selected from the group consisting of L-Ala, L-Vak L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe , Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, and L-Glu residues (5Ca-p compounds, respectively), and the reaction conditions were as follows: i) Acetone, TFA, MgS0 4; ii) HCl Boc-Lys-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) 4M HCl / EA ice bath; iv) DCC, HOBt, NMM , v) ethanol. , Pd/C; 4M HCl/EA, ice bath; vi) ethanol, Pd/C
  • AA is selected from the group consisting of L-Ala, L-Vak L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe , Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, and L-Glu residues (5Da-p compounds, respectively),
  • the reaction conditions are as follows: i) Acetone, TFA, MgS0 4 ; ii) HCl - Boc-Lys-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) ethanol, Pd/C; Iv) DCC, HOBt, NMM, v) ethanol, Pd/C; 4M HCl/EA, ice bath; vi) ethanol, Pd/C; vii) ethanol, Pd/C; vii) ethanol, Pd/C; vii) ethanol, Pd/C; vii) ethanol
  • the tether in the preparation method of the present invention is L-Asp
  • the thrombolytic active peptide is a tripeptide containing a PA (Pro-Ala) sequence, for example, the carboxyl group of the compound of the formula II is first Engagement with the N-terminus of L-Asp, and then the PA sequence containing the PA sequence is ligated to one of the remaining C-termini on the L-Asp linker.
  • R1 and R2 in the compound of Formula II are methyl (ie, 3S-6J-dihydroxy-1,1-dimethyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquine
  • the linking arm is L-Asp and the thrombolytic active peptide is a tripeptide containing a PA (Pro-Ala) sequence
  • the preparation method of the present invention can form the above compound Ie or If .
  • AA is selected from the group consisting of L-Ala, L-VaK L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe , Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, and L-Glu residues (5Ea-p compounds, respectively),
  • the reaction conditions are as follows: i) Acetone, TFA, MgS04 ; ii) HC1.
  • AA is selected from the group consisting of L-Ala, L-Vak L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe , Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, and L-Glu residues (5Fa-p compounds, respectively),
  • the reaction conditions are as follows: i) Acetone, TFA, MgS04; ii) HC1.
  • the tether in the preparation method of the present invention is L-Glu
  • the thrombolytic active peptide is a tripeptide containing a PA (; Pro-Ala) sequence
  • a compound of the formula II is first The N-terminus of L-Glu is joined, and then the tripeptide containing the PA sequence is ligated to one of the remaining C-termini on the L-Glu linker.
  • R1 and R2 in the compound of formula II are both methyl (S ⁇ 3S-6J-dihydroxy-1,1-dimethyl-1,2,3,4-tetrahydro-iso
  • the linking arm is L-Glu and the thrombolytic active peptide is a tripeptide containing a PA (Pro-Ala) sequence
  • the preparation method of the present invention can form the above compound Ig or Ih.
  • AA is selected from the group consisting of L-Ala, L-VaK L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe , Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, and L-Glu residues (5Ga-p compounds, respectively),
  • the reaction conditions are as follows: i) Acetone, TFA, MgS04; ii) HC1.
  • AA is selected from the group consisting of L-Ala, L-Vak L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe , Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, and L-Glu residues (5Ha-p compounds, respectively),
  • the reaction conditions are as follows: i) Acetone, TFA, MgS04 ; ii) HC1.
  • the compound or pharmaceutical composition of the present invention shows that it has excellent thrombolytic and antithrombotic activity at low doses in an activity test in rats, and can effectively protect the nerve function of a rat in a stroke, and can be clinically effective and Safe treatment of thrombotic diseases.
  • Examples 1-68 illustrate the preparation of the 5Aa-p compound of the present invention according to the preparation method of Figure 1.
  • N-terminal protected amino acid was dissolved in anhydrous tetrahydrofuran (CTHF), and the resulting solution was added to N-hydroxybenzotriazole (HOBt), and the mixture was added to an ice bath, and hydrazine, ⁇ -dicyclohexyl carbon 2 dissolved in anhydrous THF was slowly added. Imine (DCC), 0. C was stirred for 15 minutes to obtain a reaction liquid (1).
  • the carboxy-terminal protected amino acid was also dissolved in anhydrous THF, adjusted to pH 9 with N-methylmorpholine (NMM), then mixed with reaction solution 1, maintained at pH 9 with N-methylmorpholine, stirred at room temperature for 10 hours, TLC Monitor the progress of the reaction.
  • the Boc-protected peptide was dissolved in a small amount of anhydrous ethyl acetate, and a solution of hydrogen chloride in ethyl acetate (4M) was then evaporated. After the disappearance of the starting point of the TLC, the reaction solution was repeatedly drained with a water pump to remove the hydrogen chloride gas, and the residue was repeatedly ground with petroleum ether or anhydrous diethyl ether to obtain the target compound.
  • the benzyl ester of the polypeptide was dissolved in CH 3 OH, and an aqueous solution of NaOH (2 M) was slowly added dropwise with stirring in an ice bath. The temperature of the reaction solution was maintained at 0 ° C in an ice bath, and the material disappeared by TLC. The reaction mixture was neutralized with 1M aqueous HCl. MeOH was evaporated, and then evaporated to EtOAc EtOAc EtOAc EtOAc. The aqueous Na 2 SO 4 was dried, filtered, and the filtrate was evaporated.
  • Example 4 Debenzyloxycarbonyl or benzyl ester-based method The peptide protected with benzyloxycarbonyl or benzyl ester was dissolved in an appropriate amount of ethanol, palladium on carbon (10% of the amount of the reactant) was added, and hydrogen gas was introduced at room temperature to hydrogenolysis. After completion of the reaction, the mixture was filtered and concentrated under reduced pressure to give the title compound.
  • Example 12 Preparation of Boc-Pro-Ala-Trp-OBzl 3.60 g (65%) of the title compound was obtained as a colorless powder from 3.30 g (10.49 mmol) of Boc-Pro-Ala and 3.97 g (12.01 mmol) of HCl 'Trp-OBzl. ESI-MS (m/e): 563 [M + H] + .
  • Example 13 Preparation of Boc-Pro-Ala-Trp
  • DCU dicyclohexylurea
  • the filtrate was concentrated under reduced pressure to remove DMF.
  • the residue was dissolved in 150 mL of ethyl acetate.
  • the resulting solution was successively washed three times with saturated aqueous NaCl, and washed three times with saturated aqueous NaHC0 3.
  • the ethyl acetate solution was dried over anhydrous Na 2 S0 4, filtered and the filtrate was concentrated to dryness under reduced pressure, the residue was purified by column chromatography (dichloromethane / methanol, 50: 1), to give 327mg (59%) of the title compound, It is a light pink powder.
  • Example 36 Preparation of 38-6,7-dihydroxy-1,1-dimethyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-formyl-1 ⁇ -08 2 1 (3A) According to the general procedure of Example 2, from 1.50 g (2.73 mmol) of 3S-6J-dihydroxy-1,1-dimethyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline
  • Example 45 Preparation of 38-6,7-dihydroxy-1,1-dimethyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-formyl-Lys (Boc-Pro-Ala-Ile) )-OBzl (4Ai) According to the method of Example 1, from 482 mg (1.01 mmol) of 3S-6J-dihydroxy-1,1-dimethyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-formyl-Lys - OBzl and 479 mg (1.20 mmol) of Boc-Pro-Ala-Ile gave 310 mg (37%) of the title compound as pale yellow powder.
  • Example 1 According to the method of Example 1, from 482 mg (1.01 mmol) of 3S-6J-dihydroxy-1,1-dimethyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-formyl-Lys - OBzl and 479 mg (1.20 mmol) of Boc-Pro-Ala-Leu gave 301 mg (36%) of the title compound as pale yellow powder.
  • Example 4 First, according to the method of Example 4, from 300 mg (0.38 mmol) of 3S-6J-dihydroxy-1,1-dimethyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-formyl- Lys (Boc-Pro-Ala-Ala)-OBzl debenzyl ester. Further, according to the method of Example 2, Boc was removed to give 266 mg (78%) of the title compound as a colorless powder.
  • 200-220 g male SD rats were anesthetized with 20% urethane solution (6 mL/kg, i.p.).
  • the anesthetized rats were fixed in the supine position, the right common carotid artery was separated, the arterial clip was clamped at the proximal end, and the proximal and distal ends were respectively inserted into the surgical line.
  • the distal end of the surgical line was clamped to the fur with a hemostatic forceps. Intubate the heart, loosen the arterial clip, and release about 1 mL of arterial blood and place it in a 1 mL EP tube.
  • a 0.1 mL rat arterial blood into a vertically fixed glass tube (15 mm long, 2.5 mm inner diameter, 5.0 mm outer diameter, sealed with a rubber stopper at the bottom of the tube), and quickly insert a stainless steel thrombus fixing bolt into the tube.
  • the thrombus-fixed helix is wound with a 0.2 mm diameter stainless steel wire.
  • the helix is 12 mm long and contains 15 coils. The diameter of the coil is 1.0 mm.
  • the handle is connected to the helix and is 7.0 mm long, which is question mark.
  • the rubber stopper at the bottom of the glass tube was opened, and the handle of the thrombus-fixed helix was fixed with forceps, and the thrombus-packed thrombus-fixed helix was taken out from the glass tube and accurately weighed.
  • the bypass cannula consists of 3 segments, the middle section is a polyethylene hose, the length is 60 mm, the inner diameter is 3.5 mm, the ends are the same polyethylene tube, the length is 100 mm, the inner diameter is l mm, the outer diameter is 2 mm, one end of the tube Pulled into a cannula (for insertion into the rat carotid artery or vein), with a diameter of 1 mm, and the outer sleeve of the other end is a 7 mm long polyethylene tube with an outer diameter of 3.5 mm (bold for insertion into the middle section) Inside the polyethylene hose).
  • the inner walls of the 3-segment tubes are all silanized.
  • the thrombus-wrapped thrombus-fixed helix is placed in the middle-stage polyethylene hose, and the two ends of the hose are respectively sleeved with the thickened ends of the two polyethylenes.
  • the tube was filled with heparin physiological saline solution (50 IU/kg) through a tip end with a syringe.
  • the left external jugular vein of the rat was isolated, and the proximal and distal ends were inserted into the surgical line, the distal end was ligated, and a oblique opening was carefully cut on the exposed left external jugular vein to prepare the bypass tube prepared above.
  • the tip of the cannula is inserted into the proximal end of the left external jugular vein opening by the oblique opening, while away from the middle of the bypass tube (including the accurately weighed thrombus-fixed helix).
  • a syringe was used to push an accurate amount of heparin saline (50 IU/kg) through the tip of the other end. At this time, the syringe was not withdrawn from the polyethylene tube, and the hemostasis was used to clamp the hose between the syringe and the polyethylene tube.
  • the arterial clip was used to stop the blood at the proximal end of the right common carotid artery, and the right common carotid artery was carefully cut into a slanted mouth not far from the artery.
  • the syringe was withdrawn from the tip of the polyethylene tube and the tip of the polyethylene tube was inserted into the proximal end of the oblique portion of the artery. Both ends of the bypass duct are fixed with the No. 4 surgical suture and the arteriovenous.
  • a physiological saline solution of urokinase or a physiological saline solution of a different concentration of compound is passed through the middle section of the bypass tube (containing a precisely-weighed thrombus-fixed helix), and is inserted into the proximal vein away from the thrombus-fixed helix.
  • Arterial clamp allowing blood flow from the artery to the vein through the bypass duct, which is the rat arteriovenous bypass thrombolysis model, slowly injecting the liquid in the syringe into the blood (about 6 min), making saline, urokinase or
  • the compounds of the present invention act on the thrombus in the order of the vein, the heart and the artery, through blood circulation. From the time of starting the injection, the helix fixation screw was taken out from the bypass line after l h, and accurately weighed. The mass difference before and after thrombus fixation in each rat bypass line was calculated, and the in vivo thrombolytic activity of the compound was evaluated and evaluated. Thrombosis weight loss is expressed as mean and standard deviation ( ⁇ SD).
  • the blank control was saline and the dose was 3 mL/kg.
  • the positive control was urokinase at a dose of 20000 U/kg, equivalent to 1.68 mg/kg o
  • the dose of the compound of the invention 5Aa-p was 0.1 nmol/kg.
  • the thrombolytic activity was expressed as thrombocytopenia ⁇ SD mg) and the results are shown in Table 1.
  • Table 1 The data showed that intravenous administration of compound 5Aa-p at a dose of Ol nmol/kg was effective in lysing thrombus (p ⁇ 0.01 vs. saline), in which the thrombolytic activity and dose of compounds 5Aa, 5Af, 5Ag, 5Ak, 5Ao were The urokinase of 20000 U/kg is equivalent.
  • the 5Ak had the strongest thrombolytic activity in 5Aa, 5Ad, 5Af, 5Ag, 5Ak with good thrombolytic activity, and thus the dose-dependent relationship was further evaluated.
  • n 10 ; a) p ⁇ 0.01 vs. saline; b) p ⁇ 0.01 vs. saline, and Compound 6, PAK and 6 + PAK The ratio was p ⁇ 0.05, and the ratio of urokinase to p>0.05.
  • the administration was intravenously administered in accordance with the method of Experimental Example 1.
  • the blank control was saline and the dose was 3 mL/kg.
  • the positive control was urokinase at a dose of 20000 U/kg, equivalent to 1.68 mg/kg.
  • 5Ak selected 0.1 nmol/kg (height), 0.01 nmol/kg (; medium;) and 0.001 nmol/kg (fS) three doses. The results are shown in Table 2. The data shows that 5Ak exhibits a significant dose-response relationship.
  • Urokinase 20000 U/kg 25.61 ⁇ 3.87
  • n 10; a) p ⁇ 0.01 vs. saline and 0.01 nmol/kg 5Ak; b) p ⁇ 0.01 vs. saline and 0.001 nmol/kg 5Ak; c) p>0.05 vs. saline.
  • the cannula consists of 3 segments, the middle section is 80 mm long, the inner diameter is 3.5 mm, the ends are the same polyethylene tube, the length is 100 mm, the inner diameter is 1 mm, the outer diameter is 2 mm, and one end of the tube is drawn into a pointed tube (for insertion) Rat carotid artery or vein), the inner wall of the 3-segment tube was silanized.
  • the 60 mm long wire weighed in advance was placed in the middle polyethylene thick tube, and the two ends of the thick tube were respectively sleeved with the unrimmed ends of the two polyethylene thin tubes (one of which was fixed by pressing the wire 0.5 mm).
  • the tube was filled with heparin saline solution (50 IU/kg) through a tip end with a syringe.
  • 200-220 g male SD rats were anesthetized with 20% urethane solution (6 mL/kg, ip).
  • the anesthetized rats were fixed in the supine position, and the left external jugular vein of the rat was isolated.
  • the proximal and distal ends were inserted into the surgical line, the distal end of the distal end was ligated, and a oblique opening was carefully cut on the exposed left external jugular vein.
  • Intravenous administration The blank control was saline and the dose was 1 mL/kg.
  • the positive control was aspirin and the dose was 9 mg/kg.
  • the dose of the compound of the present invention 5Aa-p was 0.1 nmol/kg.
  • Antithrombotic activity was expressed as thrombus wet weight ⁇ SD mg) and the results are shown in Table 3.
  • the data showed that intravenous administration of compound 5Ak at an O.l nmol/kg dose was effective in inhibiting thrombus formation (p ⁇ 0.001 vs. physiological saline), and a good activity of 5Ak was further evaluated in a dose-dependent manner.
  • n 10; 5Aa-p ( i.v. ) : O.l nmol/kg; Aspirin: 9 mg/kg
  • Intravenous administration The blank control was saline and the dose was 3 mL/kg.
  • the positive control was aspirin and the dose was 9 mg/kg.
  • 5Ak was selected at 0.1 nmol/kg (height), 0.01 nmol/kg (middle) and 0.001 nmol/kg (low).
  • n 10; a) p ⁇ 0.01 vs. saline and 0.01 nmol/kg 5Ak; b) p ⁇ 0.01 vs. saline and 0.001 nmol/kg 5Ak; c) p>0.05 vs. saline.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery. A small opening was made in the external carotid artery. The distal end of the external carotid artery was ligated, and the artery clamp of the proximal common carotid artery was loosened. Blood, after taking blood, use the non-invasive arterial clip to clamp the proximal common carotid artery. The obtained 10 ⁇ blood was placed in a 1 mL EP tube, allowed to stand at room temperature for 30 minutes to coagulate the blood, and then transferred to a -20 ° C refrigerator for 1 hour to make the blood clot firm.
  • the blood clot was removed, and 1 mL of physiological saline was added to smash the blood clot into small-sized blood clots of uniform size, and then the small thrombus suspension was transferred to an I mL syringe for use.
  • the thrombus suspension in the above 1 mL syringe was slowly injected from the rat external carotid artery to the proximal end through the internal carotid artery into the rat brain, and then the external carotid artery was ligated. At the end, open the internal carotid artery and the common carotid artery to obtain an arterial clip to restore blood flow.
  • the rat common carotid vein was then isolated and injected into the UK at a dose of 20000 IU/kg, saline or compound 5Ak at a dose of 1 ⁇ 1/13 ⁇ 4.
  • the vein was ligated, and 3 drops of penicillin were added to the wound to suture the wound and wait for the animal to wake up.
  • Rats were awakened 24 hours later and the degree of neurological deficit was assessed by Zealonga method. 0 points means no signs of neurological deficit, 1 point means that the forelimbs of the uninjured side can not stretch, 2 points means walking to the uninjured side, 3 points means turning to the uninjured side, and 4 points means that the consciousness is not walking autonomously. 5 points indicate death.
  • the scores of the above groups were statistically compared and t-tested.
  • Rats were awakened 24 hours after the Zealonga method to assess the degree of neurological deficit. After anesthesia with urethane, the brain was quickly decapitated, and the brain tissue was placed in a refrigerator at -20 °C for 2 hours. A 2 mm coronal continuous section was taken from the forehead. A total of 5 tablets were then incubated in 2% TTC solution at 37 °C for 30 min in the dark, and the color changes of the brain sections were observed. Normal tissues were stained red by TTC, while the ischemic tissue was white. Then, a digital camera was taken and processed by an image meter software to calculate the infarct volume and the area of normal tissue in the coronal section, and the percentage of infarct volume in each group was counted, and a Z test was performed.
  • the Zealonga method scores after the recovery of the rats are shown in Table 5.
  • the percentage of cerebral infarct volume in rats is shown in Table 6.
  • Urokinase 20000 IU/kg 1.30 ⁇ 0.95a
  • n 9; a) p ⁇ 0.05 with normal saline and 0.1 ⁇ /kg 5Ak; b) p ⁇ 0.05 with normal saline and 0.01 ⁇ /kg 5Ak; c) ratio with physiological saline and 5 ⁇ /kg PAK 0.05.
  • Urokinase 20000 IU/kg 4.60 ⁇ 2.09
  • n 7; a) p ⁇ 0.01 compared with saline, p ⁇ 0.05 with 0.1 ⁇ /kg 5Ak, p>0.05 with urokinase; b) p ⁇ 0.05 with normal saline and 0.1 ⁇ /kg 5Ak; c ) p>0.05 compared with physiological saline.
  • the height of the peak of the ⁇ signal peak of 2.5 ⁇ L FeS0 4 -7H 2 0 solution + 2.5 ⁇ L DMPO solution + 5 ⁇ L H 2 0 2 solution + 5 ⁇ water repeat 6 times, the height of the peak is The height of the known ⁇ signal peak.
  • the height of the first peak of the OH signal peak of a solution of 2.5 ⁇ FeS0 4 -7H 2 0 solution + 2.5 ⁇ DMPO solution + 5 ⁇ 3 ⁇ 40 2 solution + 5 ⁇ of compound 5Aa-p was repeated 6 times.
  • the height of this peak is the residue of the height of the known OH signal peak by 5Aa-p.
  • MGD N-methyl-glucosamine dithiocarbamate, Sigma
  • MGD N-methyl-glucosamine dithiocarbamate, Sigma
  • 3.475 g of FeS0 4 -7H 2 0 was dissolved in 1 mL of purified water.
  • 25 mg SNAP (; nitrosoacetylpenicillamine;) was diluted 100-fold in a green mother liquor of 110 ⁇ dissolved in 1 mL of purified water to obtain a 1 ⁇ solution of SNAP.
  • 0.3 g of astragalus was dissolved in 1 mL of purified water to obtain a 0.5 M solution of Astragalus membranaceus (milk, large amount of insoluble).
  • the commercially available xanthine oxidase stock solution was diluted 10 times to obtain xanthine oxidase solution, saturated DETAPAC solution.
  • a solution of 0.9 mM was obtained by diluting 20 times, and 11.316 mg of DMPO was dissolved in 1 mL of purified water to obtain a DMPO solution having a concentration of 0.1 M.
  • the first peak height of 5 ⁇ L DMPO solution + 5 ⁇ L DETAPAC solution + 5 xanthine solution + 5 ⁇ xanthine oxidase solution +5 water superoxide anion signal repeat 6 times.
  • the height of this peak is the height of the known superoxide anion signal peak.
  • the height of this peak is the residue at which 5Aa-p clears the height of the known superoxide anion signal peak.
  • EC 50 X SD compound concentration is Xx lO - 4 M.
  • the sample was mixed with three distilled water to form a solution of 1 X 10- 7 M, 1 X 10- 9 M, 1 x 10- 11 M, and a small amount (about 10 ⁇ ) was dropped onto the surface of the copper mesh.
  • the filter paper was dried naturally, and its morphology and particle size were observed under a transmission electron microscope (JEOL, JEM-1230) and recorded in photographs.
  • the compound 5Aa-p of the present invention can self-assemble into nanospheres with a diameter of 20-210 nm, most of which are between 20-100 nm, and these nanospheres are connected in series to form different shapes of nanometers. Nets, nano-necks, etc., now with an in vivo concentration of 1 X 10- 9 M (theoretical blood concentration), an electron micrograph of each compound is shown (Fig. 9).
  • the compounds of the present invention 5Aa-p correspond to the numbers 5a, 5b, 5c, 5d, 5e, 5f, 5g, 5h, 5i, 5j, 5k, 51, 5m, 5n, 5o and 5p, respectively.
  • the efficacy was expressed by a neurological function score, and the lower the score, the better the efficacy.
  • Male Sprague-Dawley rats were intraperitoneally injected with 10% chloral hydrate solution at a dose of 400 mg/kg body weight for anesthesia.
  • a longitudinal incision was made in the middle of the neck to separate the trunk of the right common carotid artery (about 3 cm long).
  • the branches of the external carotid artery were ligated at the level of the hyoid bone, and the internal carotid artery was separated at the neck enlargement.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery, and the distal end of the external carotid artery was ligated.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery. While releasing the internal carotid artery clamp, the 0.5 mL thrombus physiological saline suspension in the catheter was slowly moved from the external carotid artery to the proximal heart. The end is injected into the middle cerebral artery through the internal carotid artery.
  • the proximal end of the external carotid artery is ligated, and the arterial clip at the internal carotid artery and the common carotid artery is opened to restore blood flow and suture the wound.
  • 0 points means no signs of neurological deficit
  • 1 point means that the uninjured side of the forelimb can not stretch
  • 2 points means walking to the uninjured side
  • 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail
  • 4 points means that the consciousness is not autonomous walking.
  • 5 points indicate death.
  • the test results are shown in Table 8. The results showed that after 4 hours of stroke in rats, the dose was 1 ⁇ /kg 5Ak per day, 6 consecutive treatments, no death, 8 of 10 rats improved to no signs of neurological deficit, and 2 remained. Mild signs of neurological deficits. It can be seen that at a dose of 1 ⁇ /kg, 5Ak has a definite therapeutic effect on stroke for 4 hours.
  • the efficacy was expressed by a neurological function score, and the lower the score, the better the efficacy.
  • Male Sprague-Dawley rats were intraperitoneally injected with 10% chloral hydrate solution at a dose of 400 mg/kg body weight for anesthesia.
  • a longitudinal incision was made in the middle of the neck to separate the trunk of the right common carotid artery (about 3 cm long).
  • the branches of the external carotid artery were ligated at the level of the hyoid bone, and the internal carotid artery was separated at the neck enlargement.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery, and the distal end of the external carotid artery was ligated.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery. While releasing the internal carotid artery clamp, the 0.5 mL thrombus physiological saline suspension in the catheter was slowly moved from the external carotid artery to the proximal heart. The end is injected into the middle cerebral artery through the internal carotid artery.
  • the proximal end of the external carotid artery is ligated, and the arterial clip at the internal carotid artery and the common carotid artery is opened to restore blood flow and suture the wound.
  • 0 points means no signs of neurological deficit
  • 1 point means that the uninjured side of the forelimb can not stretch
  • 2 points means walking to the uninjured side
  • 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail
  • 4 points means that the consciousness is not autonomous walking.
  • 5 points indicate death.
  • the test results are shown in Table 9. The results showed that after 6 hours of stroke in rats, the patient received 1 dose of 1 ⁇ /kg 5Ak per day for 6 consecutive treatments, except for one accidental death. Six of the nine rats were improved to have no signs of neurological deficit. Three residual signs of neurological deficit remained. It can be seen that at a dose of 1 ⁇ /kg, 5Ak has a definite therapeutic effect on stroke for 6 hours.
  • the efficacy was expressed by a neurological function score, and the lower the score, the better the efficacy.
  • Male Sprague-Dawley rats were intraperitoneally injected with 10% chloral hydrate solution at a dose of 400 mg/kg body weight for anesthesia.
  • a longitudinal incision was made in the middle of the neck to separate the trunk of the right common carotid artery (about 3 cm long).
  • the branches of the external carotid artery were ligated at the level of the hyoid bone, and the internal carotid artery was separated at the neck enlargement.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery, and the distal end of the external carotid artery was ligated. Insert a 0.5 mL thrombus saline suspension into the trunk of the external carotid artery, and loosen the internal carotid artery clamp while placing 0.5 mL of the catheter. The thrombus block physiological saline suspension is slowly injected from the external carotid artery to the proximal end through the internal carotid artery into the middle cerebral artery.
  • the proximal end of the external carotid artery was ligated, and the arterial clip at the internal carotid artery and the common carotid artery was opened to restore blood flow and suture the wound. And intramuscular injection of 20,000 IU of penicillin to prevent infection.
  • 0 points means no signs of neurological deficit
  • 1 point means that the uninjured side of the forelimb can not stretch
  • 2 points means walking to the uninjured side
  • 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail
  • 4 points means that the consciousness is not autonomous walking.
  • 5 points indicate death.
  • the test results are shown in Table 10. The results showed that after 24 hours of stroke in rats, 2 died, and the remaining 8 received 1 dose of 1 ⁇ /kg 5Ak per day, 6 consecutive treatments, no death, and 3 of 8 rats improved to no nerves. Signs of loss of function, 4 residual slight signs of neurological deficit, and 1 residual significant signs of neurological deficit. It can be seen that at a dose of 1 ⁇ /kg, 5Ak still has a definite therapeutic effect on stroke for 24 hours.
  • the efficacy was expressed by a neurological function score, and the lower the score, the better the efficacy.
  • Male Sprague-Dawley rats were intraperitoneally injected with 10% chloral hydrate solution at a dose of 400 mg/kg body weight for anesthesia.
  • a longitudinal incision was made in the middle of the neck to separate the trunk of the right common carotid artery (about 3 cm long).
  • the branches of the external carotid artery were ligated at the level of the hyoid bone, and the internal carotid artery was separated at the neck enlargement.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery, and the distal end of the external carotid artery was ligated.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery. While releasing the internal carotid artery clamp, the 0.5 mL thrombus physiological saline suspension in the catheter was slowly moved from the external carotid artery to the proximal heart. The end is injected into the middle cerebral artery through the internal carotid artery.
  • the proximal end of the external carotid artery was ligated, and the arterial clip at the internal carotid artery and the common carotid artery was opened to restore blood flow and suture the wound. And intramuscular injection of 20,000 IU of penicillin to prevent infection.
  • 0 points means no signs of neurological deficit
  • 1 point means that the uninjured side of the forelimb can not stretch
  • 2 points means walking to the uninjured side
  • 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail
  • 4 points means that the consciousness is not autonomous walking.
  • 5 points indicate death.
  • the test results are shown in Table 11. The results showed that 9 rats received a dose of 2.5 mol/kg 5Ak per day after 6 hours of stroke, 6 consecutive treatments, no death, and 7 of 9 rats improved to no signs of neurological deficit. One patient had a slight sign of neurological deficit. It can be seen that at a dose of 2.5 ⁇ /kg, 5Ak is centered. The 6-hour treatment of wind was significantly better than the 1 ⁇ /kg dose.
  • the efficacy was expressed by a neurological function score, and the lower the score, the better the efficacy.
  • Male Sprague-Dawley rats were intraperitoneally injected with 10% chloral hydrate solution at a dose of 400 mg/kg body weight for anesthesia.
  • a longitudinal incision was made in the middle of the neck to separate the trunk of the right common carotid artery (about 3 cm long).
  • the branches of the external carotid artery were ligated at the level of the hyoid bone, and the internal carotid artery was separated at the neck enlargement.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery, and the distal end of the external carotid artery was ligated.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery. While releasing the internal carotid artery clamp, the 0.5 mL thrombus physiological saline suspension in the catheter was slowly moved from the external carotid artery to the proximal heart. The end is injected into the middle cerebral artery through the internal carotid artery.
  • the proximal end of the external carotid artery is ligated, and the arterial clip at the internal carotid artery and the common carotid artery is opened to restore blood flow and suture the wound.
  • 0 points means no signs of neurological deficit
  • 1 point means that the uninjured side of the forelimb can not stretch
  • 2 points means walking to the uninjured side
  • 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail
  • 4 points means that the consciousness is not autonomous walking.
  • 5 points indicate death.
  • the test results are shown in Table 12. The results showed that after 24 hours of stroke in rats, 3 died, and the remaining 7 received 1 dose of 2.5 ⁇ /kg 5Ak per day, 6 consecutive treatments, 2 deaths, and 3 were better without any signs of neurological deficit. One had a slight residual neurological deficit and one had a significant residual neurological deficit. It can be seen that at a dose of 2.5 mol/kg, 5Ak still has a certain therapeutic effect on stroke for 24 hours.
  • the efficacy was expressed by a neurological function score, and the lower the score, the better the efficacy.
  • Male SD rats were intraperitoneally injected with 10% chloral hydrate The solution was administered at a dose of 400 mg/kg body weight.
  • a longitudinal incision was made in the middle of the neck to separate the trunk of the right common carotid artery (about 3 cm long).
  • the branches of the external carotid artery were ligated at the level of the hyoid bone, and the internal carotid artery was separated at the neck enlargement.
  • the non-invasive arterial clip was used to clamp the opening of the internal carotid artery and the proximal end of the common carotid artery, and the distal end of the external carotid artery was ligated.
  • a catheter containing 0.5 mL of thrombus saline suspension was inserted into the trunk of the external carotid artery. While releasing the internal carotid artery clamp, the 0.5 mL thrombus physiological saline suspension in the catheter was slowly moved from the external carotid artery to the proximal heart. The end is injected into the middle cerebral artery through the internal carotid artery.
  • the proximal end of the external carotid artery was ligated, and the arterial clip at the internal carotid artery and the common carotid artery was opened to restore blood flow and suture the wound. And intramuscular injection of 20,000 IU of penicillin to prevent infection.
  • 0 points means no signs of neurological deficit
  • 1 point means that the uninjured side of the forelimb can not stretch
  • 2 points means walking to the uninjured side
  • 3 points means turning to the uninjured side to form a trailing trail
  • 4 points means that the consciousness is not autonomous walking.
  • 5 points indicate death.
  • the test results are shown in Table 13. The results showed that after 24 hours of stroke in rats, 1 died, the remaining 10 received 1 dose of 5 mol/kg 5Ak per day, 6 consecutive treatments, no death, 7 improved to no signs of neurological deficit, Three residual signs of neurological deficit remained. It can be seen that at the dose of 5 mol/kg, 5Ak has a definite therapeutic effect on stroke for 24 hours, which is significantly better than the dose of 2.5 ⁇ /kg.
  • the compound of the present invention can form a nanostructure and achieve the effect of crossing the blood-brain barrier; in addition to hemolysis and antithrombotic, it can effectively remove free radicals such as OH, NO and superoxide anion; That is, it can effectively dissolve thrombus, and at a slightly higher dose, it can show excellent curative effect on strokes of more than 4 hours, and has good clinical application prospects.

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Abstract

本发明提供了具有溶栓、抗栓和自由基清除三重活性的化合物，其由通式I表示。其中，T为具有至少两个连接用基团的连接臂，Q为具溶栓活性的肽，R1和R2为C1-4垸基，R1和R2可相同或不同。本发明还提供了所述化合物的制备方法、用途以及包含所述化合物的药物组合物。

Description

具有溶栓、 抗栓和自由基清除三重活性的新型化合物、 其合成、 纳米结构和应用 技术领域
本发明涉及同时具有溶血栓、 清除自由基和血栓靶向 /抗血栓三种功能的新颖化合物及 其制备方法和用途。 本发明进一步涉及以连接臂将具有两个 CM烷基的四氢异喹啉类化合 物与溶血栓寡肽连接在一起形成的新颖二元缀合物。 本发明还涉及包含所述化合物的药物 组合物、 所述化合物的制备方法以及其纳米结构。 背景技术
血栓性疾病， 例如中风 /脑梗塞， 其发病率居各种疾病之首， 近年有渐增趋势， 严重威 胁人类健康。 血栓性疾病的药物治疗是血栓治疗的重点和热点。 目前临床应用的血栓药物 存在许多局限性， 寻找安全有效的血栓新药是药物研究的热点之一。
根据现有的研究表明， 3S-1,1-二甲基 -6,7-二羟基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-羧酸除了具有抗 血小板聚集和抗血栓活性外， 也具有清除自由基活性。 另外， 在 2008年 1月 30日申请的 公告号为 CN101497651B的中国专利中公开了十种具有溶血栓活性的四氢异喹啉类化合物， 包括 " 3 S-6,7- 1 ,2,3 ,4-四氢 -6,7-二羟基异喹啉 -3-酰基 -Pro-Ala-Lys； 3S-6J-1 ,2,3 ,4-四氢 -6,7-二 羟基异喹啉 -3-酰基 -Arg-Pro-Ala-Ly； 3S-6,7-l,2,3,4-四氢 -6,7-二羟基异喹啉 -3-酰基 -Ala-Arg-Pro-Ala-Lys; 3S-6,7-l,2,3,4-四氢 -6,7-二羟基异喹啉 -3-酰基 -Gly-Arg-Pro-Ala-Lys; 3S-6,7-l,2,3,4-四氢 -6,7-二羟基异喹啉 -3-酰基 -Gln-Arg-Pro-Ala-Lys； 3S-2-[Pro-Ala-Lys]- 1,2,3,4-四氢 -6,7-二羟基异喹啉 -3-羧酸； 3S-2-[Arg-Pro-Ala-Lys]-l,2,3,4-四氢 -6,7-二羟基异喹 啉 -3-羧酸； 3S-2-[Ala-Arg-Pro-Ala-Lys]-l,2,3,4-四氢 -6,7-二羟基异喹啉 -3-羧酸； 3S-2-[Gly-Arg- Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-四氢 -6,7-二羟基异喹啉 -3-羧酸； 3S-2-[Gln-Arg- Pro-Ala-Lys]- 1,2,3, 4-四 氢 -6,7-二羟基异喹啉 -3-羧酸" ， 以下简称为 "具溶血栓活性的 6,7-二羟基异喹啉"。然而这 些 6,7-二羟基异喹啉溶血栓的有效剂量较高， 其抗血拴与清除自由基的作用未经披露或验 证， 治疗中风的疗效也仅仅显示在中风发作时， 对中风发作 30分钟以上的疗效未经披露或 验证。
因此， 为了能在临床上有效且安全的治疗血栓性疾病， 仍需要一种同时具有溶血栓、 抗血栓、 与清除自由基的活性， 又能有效跨越血脑屏障， 以及可以在低剂量下达到前述效 果的新颖化合物。 本发明的第一个目的是提供通式 I的化合物:
Figure imgf000003_0001
其中， T代表具有至少两个连接用基团的连接臂； Q代表具溶血栓活性肽； R n R2代 表^— 4烷基， 其中 R n R2可为相同或不同。
在本发明的一个具体实施例中， 连接臂 T的至少一个连接用基团为氨基， 且其余连接 用基团为羧基或氨基。
在本发明的一个优选具体实施例中， 连接臂可为天然氨基酸， 例如 L-Lys、 L-Asp 或 L-Glu。
在本发明的一个更优选具体实施例中， 连接臂可为 L-Lys。
在本发明的优选具体实施例中， 可用于本发明的具溶血栓活性肽可为含 PA (； Pro-Ala)序 歹 PAK (Pro-Ala-Lys)序列、 AKP (Ala-Lys-Pro)序列或 KAP (Lys-Ala-Pro)序列的寡肽或包含 以 PAK序列、 AKP序列或 KAP序列为结构单元的重复序列肽所构成的群组。
在本发明的一个具体实施例中，具溶血栓活性寡肽可为含 PA CPro-Ala)序列、 PAK序列、 AKP序列或 KAP序列的三肽至八肽， 优选为含 PA序列的三肽。 在更优选的实施例中， 含 PA序列的三肽具有以下通式 Q1或 Q2:
Pro-Ala- AA (Q1)
AA-Ala-Pro (Q2)
其中 AA选自由 L-Ala、 L-VaK L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn、 L-Asp、 和 L-Glu所构成的群组。
在本发明的优选具体实施例中， 和 皆为甲基。
在本发明的一个优选具体实施例中， 通式 I化合物中的！^和 R2皆为甲基、 连接臂为 L-Lys、 L-Asp或 L-Glu， 且具溶血栓活性肽为含 PA (Pro-Ala)序列的三肽， 例如， 其可具有 以下通式 la (例如图 1中的 5Aa-p化合物)、 lb (；例如图 2中的 5Ba-p化合物)、 Ic (例如图 3 中的 5Ca-p化合物 )、 Id (例如图 4中的 5Da-p化合物 )、 Ie (例如图 5中的 5Ea-p化合物 )、 If (例如图 6中的 5Fa-p化合物 )、 Ig (；例如图 7中的 5Ga-p化合物；)或 Ih (；例如图 8中的 5Ha-p 化合物)：
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000004_0002
Figure imgf000004_0003
Figure imgf000004_0004
Figure imgf000005_0001
其中 AA选自由 L-Ala、 L-Vak L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp、 和 L-Glu所构成的群组。
本发明的第二个目的是提供一种药物组合物， 其包含前述本发明的化合物， 及药学上 可接受的载剂。
在本发明的药物组合物的一个优选具体实施例中， 所述化合物可形成纳米球结构。 在本发明的一个优选具体实施例中， 本发明药物组合物可作为溶血栓药物， 清除 NO 自由基药物或血栓靶向 /抗血栓药物。
在本发明的另一个优选具体实施例中， 本发明药物组合物也可作为治疗中风或脑梗药 物， 更优选用于治疗发病超过 4小时、 6小时和 24小时的中风或脑梗， 且以连续给药方式 来治疗。
本发明的第三个目的是提供式 I化合物的制备方法， 包括以下步骤：
( 1 ) 提供通式 II化合物：
Figure imgf000005_0002
其中！^和 R2代表 d— 4烷基， 且！^和 R2可为相同或不同；
(2) 提供具有至少两个连接用基团的连接臂 T、 以及具溶血栓活性肽 Q， 其中所述连 接臂具有第一连接用基团与第二连接用基团；
( 3 )在适当反应条件下，连接通式 II化合物的羧基与所述连接臂 T的第一连接用基团， 形成通式 IM-1化合物：
Figure imgf000005_0003
(4) 在适当反应条件下， 连接所述具溶血栓活性肽 Q与通式 IM-1化合物， 其中所述 具溶血栓活性肽 Q的一端与所述连接臂 T的第二连接用基团相连接， 形成通式 I化合物。
在本发明的一个具体实施例中， 连接臂 T的第一连接用基团为氨基， 用以与通式 II化 合物的羧基进行缩合反应； 且第二连接用基团为羧基或氨基， 用以与具溶血栓活性肽 Q的 N端或 C端进行连接。 可用于本发明制备方法的连接臂 T以及具溶血栓活性肽 Q与前述用 于本发明式 I化合物中的定义相同。
在优选具体实施例中， 本发明制备方法中的连接臂可为 L-Lys、 L-Asp或 L-Glu， 更优 选为 L-Lys; 具溶血栓活性肽可为含 PA (Pro-Ala)序列的三肽、 PAK (Pro-Ala-Lys)序列、 AKP (Ala-Lys-Pro)序列或 KAP (Lys -Ala -Pro)序列的寡肽， 或包含以 PAK序列、 AKP序列或 KAP 序列为结构单元的重复序列肽， 更优选为具有以下通式 Q1或 Q2的三肽：
Pro-Ala- AA (Q1)
AA-Ala-Pro (Q2)
其中 AA选自由 L-Ala、 L-Vak L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys, L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp、 和 L-Glu所构成的群组。
在又一优选具体实施例中， 本发明制备方法中的通式 II化合物的！^和 R2皆为甲基， 连接臂为 L-Lys、 L-Asp或 L-Glu， 且具溶血栓活性肽为含 PA (Pro-Ala)序列的三肽。 在更优 选具体实施例中， 本发明制备方法可用以形成上述通式 Ia-h化合物。
本发明的化合物或药物组合物在大鼠体内活性试验中表明， 在低剂量下即具有优异的 溶血栓和抗血栓活性， 并可有效地保护中风大鼠的神经功能， 能够在临床上有效且安全的 治疗血栓性疾病。 附图说明
图 1为依据本发明的一个实施例， 合成本发明化合物 la的合成路线；
图 2为依据本发明的一个实施例， 合成本发明化合物 lb的合成路线；
图 3为依据本发明的一个实施例， 合成本发明化合物 Ic的合成路线；
图 4为依据本发明的一个实施例， 合成本发明化合物 Id的合成路线；
图 5为依据本发明的一个实施例， 合成本发明化合物 Ie的合成路线；
图 6为依据本发明的一个实施例， 合成本发明化合物 If的合成路线；
图 7为依据本发明的一个实施例， 合成本发明化合物 Ig的合成路线；
图 8为依据本发明的一个实施例， 合成本发明化合物 Ih的合成路线；
图 9为依据本发明的-一个实施例， 测定本发明化合物 5Aa-p纳米结构的透射电镜照片。 具体实施方式
以下结合附图及实施例详细说明本发明的技术方案， 但本发明的保护范围包括但是不 限于此。
本发明利用连接臂将具有两个 CM烷基的四氢异喹啉类化合物 (即通式 II化合物)与溶血 栓寡肽连接在一起形成同时具有溶血栓、 清除自由基和血栓靶向 /抗血栓三种功能的新颖二 元缀合物， 以下简称为 "本发明的新颖二元缀合物" 。
因为通式 II化合物的 1位引入了两个 d— 4烷基和 3位引入了连接臂， "本发明的新颖 二元缀合物"与先前已知的 "具溶血栓活性的 6,7-二羟基异喹啉"相比具有四方面的优势： 1)通式 II化合物的 1位引入的两个 CM烷基的位阻效应使得羧肽酶和氨肽酶都不容易接近 从而不容易水解 "本发明的新颖二元缀合物"中的溶血栓寡肽； 2)通式 II化合物的 1位引 入的两个 CM烷基的疏水性贡献使得 "本发明的新颖二元缀合物"能更好地跨越血脑屏障； 3)通式 II化合物的 1位引入的两个 CM烷基的给电子贡献使得"本发明的新颖二元缀合物" 的还原能力能满足清除自由基的需要； 4)通式 II化合物的 3位引入的连接臂使得 "本发明 的新颖二元缀合物"的分子可有效地缔合从而形成粒径在 20-210 nm之间的纳米球，更优选 在 20-100 nm之间， 这种稳定的纳米结构， 有助于 "本发明的新颖二元缀合物"在血液循环 中不被巨噬细胞吞噬， 从而可以安全地向血栓形成部位传输， 最终跨越血脑屏障。 综上所 述， "本发明的新颖二元缀合物"能够形成纳米结构， 达成跨越血脑屏障的功效； 除了溶 血拴与抗血栓以外， 还能够有效清除 OH、 NO和超氧阴离子等自由基； 且只需低剂量即能 有效溶血栓， 具有良好的临床应用前景。
当用于本文， "连接用基团"意指能够进行缩合反应的官能基， 例如羧基或氨基。 当用于本文， "连接臂"意指具有所述连接用基团， 可用以将通式 II化合物与具溶血 栓活性肽 Q连接的分子。 连接臂的至少一个连接用基团为氨基， 且其余连接用基团为羧基 或氨基。 根据本发明， 连接臂可为天然氨基酸， 例如 L-Lys、 L-Asp或 L-Glu。
引入的连接臂使得 "本发明的新颖二元缀合物"可形成不被巨噬细胞吞噬的稳定纳米 球结构， 其可安全地向血栓形成部位传输， 最终跨越血脑屏障。 尤其是以 L-Lys 作为连接 臂， 使得"本发明的新颖二元缀合物"的分子可更有效地缔合从而形成粒径在 20-210 nm之 间的纳米球， 更优选在 20-100 nm之间， 这种稳定的纳米结构， 有助于 "本发明的新颖二元 缀合物"在血液循环中不被巨噬细胞吞噬， 从而可以安全地向血栓形成部位传输， 最终跨 越血脑屏障。
当用于本文， "寡肽"是指分子量在 1000道尔顿 (D)以下的小分子肽， 一般由 3至 8 个氨基酸组成。
当用于本文， "具溶血栓活性肽"意指具有增加血管通透性和溶栓作用的寡肽溶栓剂， 包括 P6A (ARPAK) 、 P6A代谢产物、 及相关的衍生物。 先前的研究曾经披露， 在数种溶 血栓寡肽 （包括 Ala-Arg-Pro-Ala-Lys, Gly-Arg-Pro-Ala-Lys, Gln-Arg-Arg-Pro-Ala-Lys 和 Pro-Ala-Lys) 中， Pro-Ala-Lys既是活性好的最短的序列， 也是最稳定的序列。 在通式 II化 合物的 3位通过连接臂引入 Pro-Ala-AA序列三肽， 可使 "本发明的新颖二元缀合物"获得 更好的稳定性和更强的溶血栓活性。
举例来说， 可用于本发明的含 PAK序列、 AKP序列或 KAP序列的寡肽可为 PAK、 RPAK(Arg-Pro-Ala-Lys) , ARPAK (Ala-Arg-Pro-Ala-Lys) , GRPAK (Gly-Arg-Pro-Ala-Lys) , QRPAK (Gln-Arg-Pro-Ala-Lys) 、 AKP 、 KAP 、 KPAK (Lys-Pro-Ala-Lys) 、 PAKP (Pro-Ala-Lys-Pro)^ AKPAK (Ala-Lys-Pro-Ala-Lys)或 PAKPA (Pro-Ala-Lys-Pro-Ala) »
举例来说， 可用于本发明的以 PAK序列、 AKP序列或 KAP序列为结构单元的重复序 列肽可为在中国专利申请公布号 CN101190941的申请案中公布的一系列具有溶血栓活性的 肽， 包含以 PAK为结构单元合成的重复序列肽 (PAK)2、 （PAK)3、 （PAK)4、 （PAK)5和 (PAK)6 ; 以 AKP 为结构单元合成的重复序列肽 (AKP)2、 (AKP)3, (AKP)4, (AKP)5和 (AKP)6 ; 及以 KPA为结构单元合成的重复序列肽 (KPA)2、 （KPA)3、 （KPA)4、 （KPA)5和 (KPA)6。
当用于本文， " d—4烷基"意指含有碳数为 1-4的烷基， 例如甲基、 乙基、 正丙基、 异 丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。 当本发明通式 I化合物中的 和 皆为甲基时， 做为起始物的通式 II化合物是在三氟醋酸 (TFA)和无水硫酸镁存在下，由 3,4-二羟基 -L-苯丙 氨酸与丙酮发生 Pictet-Spengler缩合得到的， 其优点是更容易制备。
本发明药物组合物可为任何一种临床可接受的适宜制剂。 优选为注射制剂 （粉针、 冻 干粉针、 水针、 输液等） ； 其中， 药学上可接受的载剂可为甘露醇 nannitol)、 水、 林格氏 注射液 (Ringer's solution) ^ 或生理食盐水注射液 (isotonic sodium chloride solution)等。
本发明化合物的纳米球粒径在 20-210 nm之间， 更优选是在 20-100 nm之间， 使其能更 好地跨越血脑屏障。
稳定的纳米结构， 有助于使本发明的化合物在血液循环中不被巨噬细胞吞噬， 从而可 以安全地向血栓形成部位传输， 最终跨越血脑屏障。 本发明药物组合物可作为溶血栓药物， 用于治疗心肌梗塞 (Mmyocardial infarction) , 中风 (Ischemic stroke) ^ 静脉栓塞 (Deep vein thrombosis) ^ 肺栓塞 (Pulmonary embolism) ^ 周边动脉阻塞性疾病 (Peripheral arterial occlusive disease), 静脉导管阻塞 (occluded central vascular access devices), 动静脉瘻管及分流管阻塞 (Clotted arteriovenous fistula and shunts) ^和颈动脉狭窄 (Carotid Stenosis)等疾病。本发明药物 组合物亦可作为清除 NO自由基药物， 用于治疗神经退化疾病 (Neurodegenerative diseases)、 心血管疾病 (Cardiovascular disease)、 精神疾病、 及用于治疗高地综合症 (Altitude sickness )、 糖尿病、 类风湿性关节炎、 创伤性脑损伤 (Traumatic brain injury), 癌症、 X染色体易裂症 (Fragile X syndrome)、 镰刀型红血球疾病 (Sickle Cell Disease)、 扁平苔藓 (Lichen planus)、 白 斑病 (Vitiligo)、或慢性疲劳症候群 (Chronic fatigue syndrome)等疾病。本发明药物组合物还可 作为血栓靶向 /抗血栓药物， 用于治疗血小板增多症 (Thrombocytosis 骨髓增生性疾病 (myeloproliferative disease)、 真性红细胞增多症（Polycythemia vera)、 或布卡综合征 (Budd-Chiari syndrome)等疾病。
本发明药物组合物 /化合物同时具有清除 OH、 NO和超氧阴离子等自由基、 溶血栓、 和 抗血栓 /血栓靶向的功能， 因此能够在患者中风 4小时之后仍然保持疗效， 即不受使用 tPA 的 3小时治疗黄金期的限制； 不会造成 tPA样的全身出血反应； 和能够清除缺血再灌注过 程中产生的大量 OH、 NO和超氧阴离子等自由基， 使患者在治疗时脑神经组织免受损伤。 因为在通式 II化合物的 1位引入了两个 d— 4烷基和 3位引入了连接臂， 使 "本发明的新颖 二元缀合物"与先前已知的 "具溶血栓活性的 6,7-二羟基异喹啉"相比， 在低剂量下即可显 示更好的溶血栓活性， 与独特的清除自由基与抗血栓活性， 在稍高的剂量下则可以对 4小 时以上的中风显示优秀的疗效。
在公告号为 CN101497651B 的中国专利中， "具溶血栓活性的 6,7-二羟基异喹啉"在 10 nmol/kg剂量下显示有溶血栓的疗效。 然而， 本发明化合物在 0.1 nmol/kg下即显现良好 的溶血栓与抗血栓效果； 且在 1μηιο1/1¾、 2.5 μηιοΐ/kg, 5 μηιο1/1¾剂量下， 分别对中风 4、 6、 24小时后有明显好的治疗作用。
在本发明的化合物制备方法中， 可先将具溶血栓活性肽 Q合成好， 然后再与连接臂 Τ 的第二连接用基团相连接； 或者是可将具溶血栓活性肽 Q中的胺基酸依预定序列逐次单个 或多个与连接臂 Τ相连接， 例如， 可先将具溶血栓活性肽 Q中一端的第一个胺基酸与连接 臂 Τ的第二连接用基团相连接， 然后将剩下的胺基酸依序逐次单个或多个接上。
本发明制备方法可由以下更详细的说明来进一步了解。
通式 II化合物可参照以下合成路线取得：
Figure imgf000009_0001
SM-1 11
其中 和 代表 d— 4烷基， 且！^和 R2可为相同或不同。 举例来说， 可先将 3,4-二羟 基 -L-苯丙氨酸 (； SM-1)与通式 SM-2化合物溶解在三氟醋酸 (TFA)中， 在无水硫酸镁存在下， 将 3,4-二羟基 -L-苯丙氨酸与丙酮进行 Pictet-Spengler缩合而得到通式 II化合物。 在一优选实施例中， 本发明制备方法中的连接臂为 L-Lys， 且具溶血栓活性肽为含 PA (Pro-Ala)序列的三肽， 例如， 先将通式 II化合物的羧基与 L-Lys的其中一个 N端相接合， 然后将含 PA序列的三肽与 L-Lys连接臂上剩下的 N端或 C端接合。 在部分实施例中， 当 通式 II化合物中的！^和 R2皆为甲基 (即 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异喹啉 -3-甲 酰基-羧酸)， 连接臂为 L-Lys， 且具溶血栓活性肽为含 PA (Pro-Ala)序列的三肽， 本发明制备 方法可形成上述的化合物 la, lb, Ic,或 Id。
当依据本发明制备方法来形成本发明化合物 la时， 可以参照图 1中公开的合成路径。 在如图 1所示的实施例中，是先将含 PA序列的三肽合成好后再与 L-Lys连接臂相连接， 其中 AA选自 L-Ala、 L-VaK L-Trp, L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly, L-Ser、 L-Ile、 L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp、 和 L-Glu残基（分别为 5Aa-p化合物)， 且反应条件如下： i) Acetone, TFA, MgS04; ii) HCl . Lys(Boc)-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) 4M HCl/EA 冰浴； iv) DCC， HOBt, NMM, v) 乙醇， Pd/C; 4M HCl/EA, 冰浴； vi) 乙醇， Pd/C; vii) 2M NaOH。 在另一个实施例中， 可先将含 PA序列三肽中的一个胺基酸 (；例如 AA)与 L-Lys 连接臂相连接， 然后再将含 PA序列三肽中剩下的两个胺基酸 (例如 Pro-Ala)与 AA连接。
举例来说， 在一个用以形成本发明化合物 la的实施例中， 本发明制备方法可包括以下 步骤：
1) 在三氟醋酸 (TFA)和无水硫酸镁存在下 3,4-二羟基 -L-苯丙氨酸与丙酮发生 Pictet-Spengler缩合， 生成 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基-羧酸；
2)在二环己基碳二亚胺 (DCC)和 N-羟基苯并三氮唑 (HOBt)存在下 3S-6J-二羟基 -1,1-二 甲基 -1,2,3,4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基 -羧酸在无水 Ν,Ν-二甲基甲酰胺（DMF)中与
HCl'Lys(Boc)-OBzl 缩合为 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-甲酰 -Lys(Boc)-OBzl, 缩合反应中随时用 N-甲基吗啉 （NMM) 调节 pH=9;
3)在氯化氢的乙酸乙酯溶液中将 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-甲酰 -Lys(Boc)-OBzl 脱除 Boc 得到 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3, 4-四氢异喹啉 -3-甲酰 -Lys-OBzl;
4) 在 DCC 和 HOBt 存在下 Boc-Pro 在无水四氢呋喃中与 Tos*Ala-OBzl 缩合为 Boc-Pro-Ala-OBzl;
5)在乙醇中将 Boc-Pro-Ala-OBzl氢解为 Boc-Pro-Ala;
6) DCC 和 HOBt存在下 Boc-Pro-Ala在无水四氢呋喃中与 AA-OBzl 缩合为 Boc- Pro-Ala-AA-OBzl (AA选自 L-Ala, Gly, L-Phe, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Tyr,
L-Lys(Z), L-Pro, L-Asn和 L-Gln残基）；
7)在乙醇中将步骤 6的 Boc-Pro-Ala-AA-OBzl氢解为 Boc-Pro-Ala-AA; 8) 在 DCC 和 HOBt 存在下 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-甲酰 -Lys-OBzl在无水 DMF 中与步骤 6 的 Boc-Pro-Ala-AA缩合为 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-甲酰 -Lys(Boc-Pro-Ala-AA)-OBzl (AA的定义与步骤 6相同）；
9) 在 DCC 和 HOBt 存在下 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-甲酰 -Lys-OBzl在无水 DMF中与 Boc-AA(OBzl)缩合为 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异 喹啉 -3-甲酰 -Lys[Boc-AA(OBzl)]-OBzl (AA选自 L-Asp, L-Glu残基)；
10)在氯化氢的乙酸乙酯溶液中将 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-甲酰 -Lys[Boc-AA(OBzl)]-OBzl脱除 Boc得到 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-甲 酰 -Lys[AA(OBzl)]-OBzl (AA的定义与步骤 9相同）；
11) 在 DCC 和 HOBt 存在下 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-甲酰
-Lys[AA(OBzl)]-OBzl 在无水 DMF 中与 Boc-Pro-Ala 缩合为 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-甲酰 -Lys[Boc-Pro-Ala-AA(OBzl)]-OBzl (AA的定义与步骤 9相同）；
12) 通过氢解和脱 Boc 将 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-甲酰 -Lys(Boc-Pro-Ala-AA)-OBzl (AA的定义与步骤 6相同)和 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4- 四氢异喹啉 -3-甲酰 -Lys[Boc-Pro-Ala-AA(OBzl)]-OBzl (AA的定义与步骤 9相同）脱保护得 到 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢异喹啉 -3-甲酰 -Lys(Pro -Ala-AA)。
当依据本发明制备方法来形成本发明化合物 lb时， 可以参照图 2中公开的合成路径， 其中 AA选自 L-Ala、 L-VaK L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp,和 L-Glu残基（分别为 5Ba-p化合物)， 且反应条件如下： i) Acetone, TFA, MgS04; ii) HCl . Lys(Boc)-OBzl， DCC, HOBt, NMM; iii) 乙醇， Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM, v) 乙醇， Pd/C; 4M HCl/EA, 冰浴； vi) 乙醇， Pd/C; vii) 4M HCl/EA, 冰浴。
当依据本发明制备方法来形成本发明化合物 Ic时， 可以参照图 3中公开的合成路径， 其中 AA选自 L-Ala、 L-Vak L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp, 和 L-Glu残基（分别为 5Ca-p化合物)， 且反应条件如下： i) Acetone, TFA, MgS04; ii) HCl . Boc-Lys-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) 4M HCl/EA 冰浴； iv) DCC， HOBt, NMM, v) 乙醇， Pd/C; 4M HCl/EA, 冰浴； vi) 乙醇， Pd/C; vii) 乙醇， Pd/C o
当依据本发明制备方法来形成本发明化合物 Id时， 可以参照图 4中公开的合成路径， 其中 AA选自 L-Ala、 L-Vak L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp, 和 L-Glu残基（分别为 5Da-p化合物)， 且反应条件如下： i) Acetone, TFA, MgS04; ii) HCl - Boc-Lys-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) 乙醇， Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM, v) 乙醇， Pd/C; 4M HCl/EA, 冰浴； vi) 乙醇， Pd/C; vii)乙醇， Pd/C。
在另一优选实施例中， 本发明制备方法中的连接臂为 L-Asp， 且具溶血栓活性肽为含 PA (Pro-Ala)序列的三肽， 例如， 先将通式 II化合物的羧基与 L-Asp的 N端相接合， 然后将 含 PA序列的三肽与 L-Asp连接臂上剩下的其中一个 C端接合。 在部分实施例中， 当通式 II化合物中的 R1和 R2皆为甲基 (即 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基 -羧酸 )， 连接臂为 L-Asp， 且具溶血栓活性肽为含 PA (Pro-Ala)序列的三肽时， 本发明制备方 法可形成上述的化合物 Ie或 If。
当依据本发明制备方法来形成本发明化合物 Ie时， 可以参照图 5中公开的合成路径， 其中 AA选自 L-Ala、 L-VaK L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp, 和 L-Glu残基（分别为 5Ea-p化合物)， 且反应条件如下： i) Acetone, TFA， MgS04; ii) HC1 . Asp(OCH3)-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) 乙醇， Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM, v) 乙醇， Pd/C; 2M NaOH,冰浴； vi) 乙醇， Pd/C; vii) 4M HCl/EA, 冰浴。
当依据本发明制备方法来形成本发明化合物 If时， 可以参照图 6中公开的合成路径， 其中 AA选自 L-Ala、 L-Vak L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp, 和 L-Glu残基（分别为 5Fa-p化合物)， 且反应条件如下： i) Acetone, TFA， MgS04; ii) HC1 . Asp(OBzl)-0 CH3， DCC, HOBt, NMM; iii) 2M NaOH, iv) DCC, HOBt, NMM, v) 乙醇， Pd/C; 2M NaOH, 冰浴； vi) 乙醇， Pd/C; vii) 4M HCl/EA, 冰浴。
在又一优选实施例中，本发明制备方法中的连接臂为 L-Glu，且具溶血栓活性肽为含 PA (； Pro-Ala)序列的三肽， 例如， 先将通式 II化合物与 L-Glu的 N端相接合， 然后将含 PA序列 的三肽与 L-Glu连接臂上剩下的其中一个 C端接合。 在部分实施例中， 当通式 II化合物中 的 R1和 R2皆为甲基 (S卩 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基 -羧酸 )， 连 接臂为 L-Glu， 且具溶血栓活性肽为含 PA (Pro-Ala)序列的三肽时， 本发明制备方法可形成 上述的化合物 Ig或 Ih。
当依据本发明制备方法来形成本发明化合物 Ig时， 可以参照图 7中公开的合成路径， 其中 AA选自 L-Ala、 L-VaK L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp, 和 L-Glu残基（分别为 5Ga-p化合物)， 且反应条件如下： i) Acetone, TFA， MgS04; ii) HC1 . Glu(0 CH3)-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) 乙醇， Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM; v) 乙醇， Pd/C; 2M NaOH,冰浴； vi) 乙醇， Pd/C; vii) 4M HCl/EA, 冰浴。 当依据本发明制备方法来形成本发明化合物 Ih时， 可以参照图 8中公开的合成路径， 其中 AA选自 L-Ala、 L-Vak L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp、 和 L-Glu残基（分别为 5Ha-p化合物)， 且反应条件如下： i) Acetone, TFA， MgS04; ii) HC1 . Glu(0 Bzl)-OCH3， DCC， HOBt, NMM; iii) 乙醇， Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM; v) 乙醇， Pd/C; 2M NaOH, 冰浴； vi) 乙醇， Pd/C; vii) 4M HC1/EA, 冰浴。
本发明的化合物或药物组合物在大鼠体内活性试验中表明， 在低剂量下即具有优异的 溶血栓和抗血栓活性， 并可有效地保护中风大鼠的神经功能， 能够在临床上有效且安全的 治疗血栓性疾病。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而更为 清楚。 但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。 本领域技术人员 应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例 1-68例示依据图 1的制备方法， 制造本发明的 5Aa-p化合物。
实施例 1液相接肽反应通法
将 N端保护的氨基酸用无水四氢呋喃 CTHF)溶解， 得到的溶液加入 N-羟基苯并三氮唑 (HOBt), 冰浴， 缓慢加入用无水 THF溶解的 Ν,Ν-二环己基碳二亚胺 (DCC)， 0 。C搅拌 15 分钟得到反应液(1)。 羧端保护的氨基酸也用无水 THF溶解， 用 N-甲基吗啉 (NMM)调 pH 9， 然后与反应液①混合， 用 N-甲基吗啉维持 pH 9， 室温搅拌 10小时， TLC监测反应进程。 原料点消失后， 反应混合物过滤， 滤液减压浓缩， 得到粘稠状物质用乙酸乙酯或二氯甲烷 溶解， 得到的溶液依次用 5% NaHC03水溶液洗， 5% KHS04水溶液洗， 饱和 NaCl水溶液 洗， 乙酸乙酯或二氯甲烷相加入无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液减压浓缩得目标化合物。
实施例 2脱 Boc通法
将 Boc保护的肽用少量的无水乙酸乙酯溶解， 冰浴搅拌下加入氯化氢的乙酸乙酯溶液 (4M)。 TLC 显示原料点消失后， 反应溶液用水泵反复抽干， 除净氯化氢气体， 残留物用石 油醚或无水乙醚反复研磨， 得到目标化合物。
实施例 3脱苄酯基通法
将多肽苄酯用 CH3OH溶解，冰浴搅拌下缓慢滴加 NaOH的水溶液 (2M)，冰浴维持反应 液温度在 0 °C， TLC显示原料消失。 反应液用 1M的盐酸调至中性， 减压除去甲醇， 继续 用 1M的盐酸酸化至 pH 2， 溶液用乙酸乙酯萃取， 合并的乙酸乙酯相用饱和 NaCl水溶液洗 涤至中性， 用无水 Na2S04干燥， 过滤， 滤液减压浓缩得到目标化合物。
实施例 4脱苄氧羰基或苄酯基通法 将具有苄氧羰基或苄酯保护的肽用适量的乙醇溶解， 加入钯碳 (反应物量的 10%)， 通入 氢气室温氢解。 反应结束后过滤， 减压浓缩， 得到目标化合物。
实施例 5制备 Boc-Pro
将 5.75 g (50 mmol) Z-Pro用 1 mL水溶解，在冰浴搅拌下缓慢滴加 25 mL NaOH水溶液 (2M), 得到溶液 (1)。 将 13.08 g (60 mmoll·lBoc)2O用25 mL二氧六环溶解， 得到溶液 (11)。 将溶液 (II)滴加至冰浴搅拌下的溶液 (I)中， 冰浴下缓慢滴加 NaOH水溶液 (2M)调节 pH 9， 混合物冰浴下搅拌。 30分钟后， 检测反应混合物的 pH值， 并用 NaOH水溶液 (2M)使 pH 值保持 9， 并用水泵抽出反应生成的气体。 搅拌 48小时， TLC (二氯甲烷:甲醇， 20: 1)监测 反应完全。 反应混合物减压浓缩除去二氧六环， 残留物用 5 mL水溶解， 以饱和硫酸氢钾水 溶液调节 pH 2， 将水溶液用乙酸乙酯萃取三次， 合并的乙酸乙酯相用 5%KHS04洗涤 3次， 并以饱和 NaCl水溶液洗涤至中性， 分出的乙酸乙酯层加入无水硫酸钠干燥。 过滤， 滤液减 压浓缩， 残留物用乙酸乙酯-石油醚重结晶， 得 10.2 g (95%)标题化合物， 为无色晶体。 ESI-MS (m/e): 214 [M - H]".
实施例 6制备 Boc-Pro-Ala-OBzl
按照实施例 1的方法， 由 4.3 g (20.0 mmol) Boc-Pro和 8.45 g (24.0 mmol) Tos Ala-OBzl 得到 5.19 g (68%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 377 [M + H]+.
实施例 7制备 Boc-Pro-Ala
按照实施例 4的方法， 由 5.19 g (13.8 mmol) Boc-Pro-Ala-OBzl制得 3.59 g (91%)标题 化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 285 [M - H]".
实施例 8制备 Boc-Pro-Ala-Ala-OBzl
按照实施例 1的方法， 由 3.00 g ( 10.49 mmol) Boc-Pro-Ala和 3.26 g ( 12.03 mmol) Tos'Ala-OBz得到 3.04 g (68%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 448 [M + H]+. 实施例 9制备 Boc-Pro-Ala-Ala
按照实施例 3的方法， 由 4.47 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala-Ala-OBzl得到 3.21 g (90%)标题 化合物。 ESI-MS (m/e): 356 [M - H]-.
实施例 10制备 Boc-Pro-Ala-Val-OBzl
按照实施例 1 的方法由 3.00 g (10.49 mmol) Boc-Pro-Ala和 3.58 g (12.01 mmol) Tos'Val-OBzl得到 3.28 g (69%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 476 [M + H]+. 实施例 11 制备 Boc-Pro-Ala-Val
按照实施例 3的方法， 由 4.75 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala- Val-OBzl得到 3.54 g (92%)标题 化合物。 ESI-MS (m/e): 384 [M - H]- .
实施例 12制备 Boc-Pro-Ala-Trp-OBzl 按照实施例 1 的方法由 3.00 g (10.49 mmol) Boc-Pro-Ala和 3.97 g (12.01 mmol) HCl'Trp-OBzl得到 3.65 g (65%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 563 [M + H]+. 实施例 13制备 Boc-Pro-Ala-Trp
按照实施例 3的方法， 由 5.62 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala-Trp-OBzl得到 4.21 g (89%)标题 化合物。 ESI-MS (m/e): 471 [M - H]- .
实施例 14制备 Boc-Pro-Ala-Tyr-OBzl
按照实施例 1的方法由 3.15 g (11 mmol) Boc-Pro-Ala和 4.43 g (10 mmol) Tos Tyr-OBzl 得到 3.73 g (69%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 540 [M + H]+.
实施例 15制备 Boc-Pro-Ala-Tyr
按照实施例 3的方法， 由 5.39 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala-Tyr-OBzl得到 4.13 g (92%)标题 化合物。 ESI-MS (m/e): 448 [M - H]— .
实施例 16制备 Boc-Pro-Ala-Phe-OBzl
按照实施例 1 的方法由 3.00 g (10.0 mmol) Boc-Pro-Ala 和 2.92 g (11.0 mmol) Tos Phe-OBzl得到 3.82 g (66%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 524 [M + H]+. 实施例 17制备 Boc-Pro-Ala-Phe
按照实施例 3的方法， 由 5.23 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala-Phe-OBzl得到 3.94 g (91%)标题 化合物。 ESI-MS (m/e): 432 [M - H]".
实施例 18制备 Boc-Pro-Ala-Gly-OBzl
按照实施例 1的方法由 3.15 g (11 mmol) Boc-Pro-Ala和 3.37 g (10 mmol) Tos Gly-OBzl 得到 2.90 g (67%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 434 [M + H]+.
实施例 19制备 Boc-Pro-Ala-Gly
按照实施例 3的方法， 由 4.33 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala-Gly-OBzl得到 2.98 g (87%)标题 化合物。 ESI-MS (m/e): 342 [M - H]— .
实施例 20制备 Boc-Pro-Ala-Ser-OBzl
按照实施例 1的方法由 3.15 g (11 mmol) Boc-Pro-Ala和 3.67 g (10 mmol) Tos Ser-OBzl 得到 2.92 g (63%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 464 [M + H]+.
实施例 21 制备 Boc-Pro-Ala-Ser
按照实施例 3的方法， 由 4.63 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala-Ser-OBzl得到 3.28 g (88%)标题 化合物。 ESI-MS (m/e): 372 [M - H]- .
实施例 22制备 Boc-Pro-Ala-Ile-OBzl
按照实施例 1的方法由 3.15 g (11 mmol) Boc-Pro-Ala和 3.93 g (10 mmol) Tos Ile-OBzl 得到 3.33 g (65%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 490 [M + H]+. 实施例 23制备 Boc-Pro-Ala-Ile
按照实施例 3的方法， 由 4.89 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala-Ile-OBzl得到 3.67 g (91%)标题 化合物。 ESI-MS (m/e): 398 [M - H]- .
实施例 24制备 Boc-Pro-Ala-Thr-OBzl
按照实施例 1的方法由 3.15 g (11 mmol) Boc-Pro-Ala和 3.81 g (10 mmol) Tos Thr-OBzl 得到 3.39 g (71%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 478 [M十 H]+.
实施例 25制备 Boc-Pro-Ala-Thr
按照实施例 3的方法， 由 4.77 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala-Thr-OBzl得到 3.56 g (91%)标题 化合物。 ESI-MS (m/e): 386 [M - H]- .
实施例 26制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
按照实施例 1 的方法由 3.15 g (11 mmol) Boc-Pro-Ala 和 4.06 g (10 mmol) HCl Lys(Z)-OBzl得到 4.15 g (65%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 639 [M + H]+. 实施例 27制备 Boc-Pro- Ala- Lys(Z)
按照实施例 3的方法， 由 6.39 g (10 mmol) Boc-PiO-Ala-Lys(Z)-OBzl得到 4.71 g (86%) 标题化合物。 ESI-MS (m/e): 547[M - H]-.
实施例 28制备 Boc-Pro-Ala-Leu-OBzl
按照实施例 1的方法由 3.15 g (11 mmol) Boc-Pro-Ala禾口 3.93 g (10 mmol) Tos Leu-OBzl 得到 3.37 g (69%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 490 [M + H]+.
实施例 29制备 Boc-Pro-Ala-Leu
按照实施例 3的方法， 由 4.89 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala-Leu-OBzl得到 3.67 g (91%)标题 化合物。 ESI-MS (m/e): 398 [M - H]- .
实施例 30制备 Boc-Pro-Ala-Gln-OBzl
按照实施例 1的方法由 3.15 g (11 mmol) Boc-Pro-Ala和 2.73 g (10 mmol) HCl Gln-OBzl 得到 3.23 g (63%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 505 [M + H]+.
实施例 31制备 Boc-Pro-Ala-Gln
按照实施例 3的方法， 由 5.04 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala-Gln-OBzl得到 3.73 g (90%)标题 化合物。 ESI-MS (nVe): 413 [M - H]".
实施例 32制备 Boc-Pro-Ala-Asn-OBzl
按照实施例 1的方法由 3.15 g (11 mmol) Boc-Pro-Ala和 2.59 g (10 mmol) HCl Asn-OBzl 得到 3.04 g (61%)标题化合物， 为无色粉末。 ESI-MS (m/e): 491 [M + H]+.
实施例 33制备 Boc-Pro-Ala-Asn
按照实施例 3的方法，由 4.90 g (10 mmol) Boc-Pro-Ala-Asn-OBzl得到 3.67 g (92%)标题 化合物。 ESI-MS (m/e): 399 [M - H]- .
实施例 34制备 3S-6，7-二羟基 -1,1-二甲基 -1，2，3，4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基 -羧酸（1) 将 5.0 g (25 mmol) 3,4-二羟基 - -苯丙氨酸用 250 mL丙酮溶解。向得到的溶液中加入 6.0 g PO mmol)无水硫酸镁。 30分钟后， 冰浴下加入 25 mL三氟醋酸（TFA)， 之后室温搅拌 96 h， TLC (二氯甲烷 /甲醇， 1 : 1) 显示原料点消失。 反应液过滤， 滤液减压浓缩， 残留物用丙 酮溶解继续减压浓缩， 反复 3次。残留物加 200 mL无水乙醚， 大量无色固体析出， 抽滤得 到 5.8 g (95%)标题化合物， 为无色固体。 ESI-MS (m/e): 238 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- e) 5/ppm = 6.61 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 3.70 (dd, J= 3.9, 11.4 Hz, 1H), 2.76 (dd, J= 11.7, 15.3 Hz, 1H), 2.62 (m, 1H), 1.41 (s, 3H), 1.32 (s, 3H).
实施例 35 制备 3S-6，7-二羟基 -1,1-二甲基 -1，2，3，4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基-
Lys(Boc)-OBzl (2)
按照实施例 1的方法，将 1.19 g (5.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢 -异喹 啉 -3-甲酰基-羧酸用 10 mL无水 DMF溶解。 向得到的溶液中加入 675 mg (5.00 mmol) N-羟 基苯并三氮唑（HOBt)。 10分钟后，冰浴下加入 1.20 g (5.83 mmol) 二环己基羰二亚胺（DCC) 与 5 mL无水 DMF的溶液， 得到反应液（1)。 把 2.83 g (5.53 mmol) HCl ys(Boc)-OBzl溶于 15 mL无水 DMF并搅拌 30分钟， 得到反应液（11)。 冰浴搅拌下， 将反应液（II)加入反应 液 中， 然后室温搅拌 12 h， 并随时用 N-甲基吗啉（NMM)调节 pH=9， TLC (；二氯甲烷 /甲醇， 10: 1) 显示 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基 -羧酸消失。 反应 混合物过滤除二环己基脲（DCU)。 滤液减压浓缩除去 DMF。 残留物用 150 mL乙酸乙酯溶 解。 得到的溶液依次用饱和 NaHC03水溶液洗三次和饱和 NaCl水溶液洗三次。 乙酸乙酯溶 液用无水 Na2S04干燥， 过滤， 滤液减压浓缩至干， 残留物经柱层析纯化 (二氯甲烷 /甲醇， 50: 1)，得到 327mg (59%)标题化合物，为浅粉色粉末。 ESI-MS (m/e): 556 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- e) δ/ppm = 8.64 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.14 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.36 (m, 5H), 6.74 (m, 1H), 6.57 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 5.14 (m, 2H), 4.30 (m, 1H), 3.55 (m, 2H), 3.32 (m, 2H), 2.88(m, 2H), 2.57 (d, J= 3.9 Hz, 1H), 2.27 (m, 1H), 2.15 (s, 1H), 1.69 (m, 4H), 1.36(s, 9H), 1.33 (s, 3H), 1.25 (s, 3H).
实施例 36制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基-1^-0821 (3A) 按照实施例 2通法，从 1.50 g (2.73 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异喹啉
-3-甲酰基 -LyS(BOc -OBZl得到 1.01 g (82%)标题化合物，为浅粉色固体，直接用于下一步反 应。 ESI-MS(m/e): 456[M+H]+.
实施例 37 制备 3S-6，7-二羟基 -1,1-二甲基 -1，2，3，4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基-
Lys(Boc-Pro-Ala-Ala)-OBzl (4Aa)
按照实施例 1的方法， 从 482 mg (1.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 424 mg (1.20 mmol) Boc-Pro-Ala-Ala得到 302 mg (38%)标题化 合物， 为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 795 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm =
9.15 (s, IH), 8.89 (s, 2H), 8.11 (m, IH), 7.94 (m,lH), 7.85 (m, IH), 7.76 (m,lH), 7.44-7.31 (m, 5H), 6.66 (s, IH), 6.47 (s, IH), 5.14 (m,2H), 4.25 (m, IH), 4.23 (m, 3H), 4.12 (m, IH), 3.66 (m, IH), 3.12 (m, 2H), 2.96 (m, 2H), 2.89-2.91 (m, 2H), 2.11-2.08 (m, IH), 1.77 (m,5H), 1.59 (s, 3H), 1.47-1.27 (m,17H), 1.27-1.08 (m, 7H).
实施例 38 制备 3S-6，7-二羟基 -1,1-二甲基 -1，2，3，4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基- Lys(Boc-Pro-Ala-Val)-OBzl (4Ab)
按照实施例 1的方法， 从 964 mg (2.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 924 mg (2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Val得到 604 mg (37%)标题化 合物，为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 823 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 9.18 (s, IH), 8.93 (m,2H), 8.05 (m, 2H), 7.42 (m, 5H), 6.66 (s, IH), 6.47 (s, IH), 5.16 (s,lH), 4.37-4.28 (m, 3H), 4.11 (m, 3H), 3.06-2.89 (m, 5H), 2.75 (m, 6H), 2.04 (s, IH), 1.91 (m, IH), 1.79 (m, 5H), 1.62 (s, 3H), 1.49 (s,3H), 1.39 (m, 7H), 1.32 (m, 3H), 1.21 (m, 4H), 0.82 (m, 6H). 实施例 39 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基-
Lys(Boc-Pro-Ala-Trp)-OBzl (4Ac)
按照实施例 1的方法， 从 482 mg (1.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 567 mg (1.20 mmol) Boc-Pro-Ala-Trp得到 318 mg (35%)标题化 合物，为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 910 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 9.51 (s, IH), 9.26 (m, 2H), 8.98 (m, 2H), 8.05 (d, IH, J=7.2Hz), 7.94 (m, IH), 7.78 (d, IH, J=7.2Hz), 7.54 (m, IH), 7.38 (m, 5H), 7.31 (d, IH, J=4.5Hz), 7.24 (m, IH), 7.11 (t, IH, J=4.5Hz), 7.05 (t, IH, J=4.5Hz), 6.67 (s, IH), 6.52 (s, IH), 5.15 (s, 2H), 4.44 (m, IH), 4.35 (m, 2H), 4.07 (m, 2H), 3.23 (m, IH), 3.17 (m, 5H), 2.86 (m, IH), 1.97 (m, 2H), 1.76-1.70 (m, 8H), 1.31 (s, 3H), 1.24 (s, 3H), 1.93-1.79 (m, 9H), 1.16 (m, 4H).
实施例 40 制备 3S-6，7-二羟基 -1,1-二甲基 -1，2，3，4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基-
Lys(Boc-Pro-Ala-Tyr)-OBzl (4Ad)
按照实施例 1的方法， 从 964 mg (2.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 1077 mg (2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Tyr得到 549 mg (31%)标题化 合物，为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 887 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 9.17 (m, IH), 9.02 (m, IH), 8.73 (m, IH), 8.51 (m, IH), 8.09 (m, IH), 7.97 (m, IH), 7.73 (m, IH), 7.40 (m, 5H), 6.96 (m, 2H), 6.61 (m, 3H), 6.48 (s, IH), 5.16 (s, 2H), 4.23 (m, 2H), 4.07 (m, 2H), 3.88 (m, IH), 3.01 (m, 3H), 2.74 (m, 3H), 2.02 (m, 2H), 1.74 (m, 5H), 1.46 (s, 3H), 1.36-1.24 (m, 16H):
1.16 (m, 3H), 0.87 (m, IH).
实施例 41 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Boc-Pro-Ala-Pro)-OBzl (4Ae)
按照实施例 1的方法， 从 964 mg (2.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 957 mg (2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Pro得到 607 mg (37%)标题化 合物，为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 821 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 9.54 (m, IH), 9.23 (s, IH), 9.11 (m, IH), 8.96 (s, IH), 8.05 (m, IH), 7.85 (m, IH), 7.40 (m, 5H), 6.67 (s, IH), 6.48 (s, IH), 5.16 (m, 2H), 4.54 (m, IH), 4.38 (m, 2H), 4.24 (m, IH), 4.10 (m, 2H), 3.55 (m, IH), 3.17 (m, 3H), 3.05 (m, 3H), 2.94 (m, IH), 1.96 (m, 2H), 1.79 (m, 7H), 1.64 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.38-1.32 (m, 13H), 1.20 (m, 4H).
实施例 42 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Boc-Pro-Ala-Phe)-OBzl (4Af)
按照实施例 1的方法， 从 964 mg (2.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 1039 mg (2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Phe得到 626 mg (36%)标题化 合物，为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 871 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 9.24 (s, IH), 9.09 (m, 2H), 8.96 (s, IH), 8.01-7.93 (m, 3H), 7.38 (m, 5H), 7.21 (m, 5H), 6.67 (s, IH), 6.49 (s, IH), 5.17 (s, 2H), 4.38 (m, 3H), 4.09 (m, 2H), 3.28 (m, 4H), 2.88 (m, 2H), 2.79 (m, 5H), 1.99 (m, 2H), 1.74 (m, 8H), 1.50 (m, 3H), 1.32 (m, 14H), 1.16 (m, 4H).
实施例 43 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Boc-Pro-Ala-Gly)-OBzl (4Ag)
按照实施例 1的方法， 从 482 mg (1.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 412 mg (1.20 mmol) Boc-Pro-Ala-Gly得到 304 mg (39%)标题化 合物，为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 781 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 9.39 (s, IH), 8.97 (m, 2H), 8.24-8.14 (m, 2H), 7.79 (m, IH), 7.41 (m, 5H), 6.66 (s, IH), 6.47 (s, IH), 5.16 (s,2H), 4.35 (m, 2H), 4.21 (m, 2H), 3.71-3.66 (m, 2H), 3.03 (m, 3H), 2.89-2.76 (m, IH), 2.07 (m, IH), 1.81-1.77 (m,6H), 1.62 (s,3H), 1.50 (s, 3H), 1.38 (m,7H), 1.32 (m, 8H), 1.23 (m, 4H). 实施例 44 制备 3S-6，7-二羟基 -1,1-二甲基 -1，2，3，4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基-
Lys(Boc-Pro-Ala-Ser)-OBzl (4Ah)
按照实施例 1的方法， 从 965 mg (2.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 896 mg (2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Ser得到 454 mg (29%)标题化 合物，为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 811 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 9.48 (m, IH), 9.23 (s, 2H), 8.96 (m, IH), 8.19 (m, IH), 7.40 (m, 5H), 6.67 (s, IH), 6.48 (s, IH), 5.16 (m, 2H), 4.92 (m, IH), 4.31 (m, 3H), 4.13 (m, 3H), 3.53 (m, 2H), 3.16 (m, 3H), 3.04-2.81 (m, 4H), 2.08 (m, IH), 1.78 (m, 5H), 1.63 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.39-1.32 (m, 14H), 1.22 (m, 3H).
实施例 45 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Boc-Pro-Ala-Ile)-OBzl (4Ai) 按照实施例 1的方法， 从 482 mg (1.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 479 mg (1.20 mmol) Boc-Pro-Ala-Ile得到 310 mg (37%)标题化合 物， 为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 837 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 8.84-8.68 (m, 2H), 8.37 (s, IH), 7.99-7.87 (m, 3H), 7.39 (m, 4H), 6.60 (s, IH), 6.39 (s, IH), 5.14 (m, 2H), 4.32 (m, 2H), 4.17 (m, 2H), 3.65 (m, IH), 3.54 (m, IH), 3.17 (m, IH), 2.96 (m, 2H), 2.68 (m, 3H), 2.11 (m, IH), 1.74-1.68 (m, 7H), 1.31-1.21 (m, 11H), 1.17 (m, 5H), 1.08 (m, IH), 0.82 (m, 8H).
实施例 46 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Boc-Pro-Ala-Thr)-OBzl (4Aj)
按照实施例 1的方法， 从 964 mg (2.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 929 mg (2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Thr得到 495 mg (30%)标题化 合物，为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 825 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 9.18 (s, IH), 8.91 (s, 2H), 8.27 (m, 1H),7.64 (m, IH), 7.4 l(m, 6H), 6.65 (s, IH), 6.48 (s, IH), 5.16 (s, 2H), 4.35 (m, 3H), 4.23 (m, 3H), 3.07 (m, 3H), 2.72 (m, IH), 1.83-1.76 (m, 5H), 1.61 (s, 3H), 1.48 (s, 3H), 1.38-1.32 (m, 14H), 1.23 (m, 3H), 1.11 (m, 3H).
实施例 47 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-OBzl (4Ak)
按照实施例 1的方法， 从 964 mg (2.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 1209 mg (2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Lys(Z)得到 750 mg (30%)标题 化合物， 为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 987 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 8.68 (s, IH), 8.56 (s, IH), 8.16 (m, IH), 8.04 (m, IH), 7.78 (m, IH), 7.68 (m, IH), 7.34 (m, 10H), 6.58 (s, IH), 6.37 (s, IH), 5.14 (s, 2H), 4.98 (s, 2H), 4.29 (m, 2H), 4.09 (m, 3H), 3.56 (m, 3H), 3.01 (m, 4H), 2.62 (m, IH), 2.40 (m, IH), 2.27 (m, IH), 2.15 (s, IH), 2.06 (m, IH), 2.01 (s, IH), 1.78 (m, 6H), 1.38-1.31 (m, 18H), 1.17 (m, 10H).
实施例 48 制备 3S-6，7-二羟基 -1,1-二甲基 -1，2，3，4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基-
Lys(Boc-Pro-Ala-Leu)-OBzl (4A1)
按照实施例 1的方法， 从 482 mg (1.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 479 mg (1.20 mmol) Boc-Pro-Ala-Leu得到 301 mg (36%)标题化 合物， 为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 837 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 8.69-8.57 (m, 2H), 8.18-8.06 (m, 2H), 7.85 (m, IH), 7.69 (m, 5H), 6.58 (s, IH), 6.37 (s, IH), 5.14 (m, 2H), 4.25-4.11 (m, 5H), 3.63-3.55 (m, IH), 3.17 (s, 2H), 3.04-2.98 (m, 2H), 2.64-2.59 (m, IH), 2.15-2.07 (m, IH), 1.78-1.67(m, 5H), 1.36 (m, 14H), 1.28 (m, 4H), 1.19 (m, 6H).
实施例 49 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Boc-Pro-Ala-Gln)-OBzl (4Am) 按照实施例 1的方法， 从 965 mg (2.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 994 mg (2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Gln得到 665 mg (39%)标题化 合物， 为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 852 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 9.3-9.1 (m, 4H), 8.16 (m, IH), 7.96 (m, 2H), 7.83 (m, IH), 7.44-7.38 (m, 7H), 6.89 (s, IH), 6.86 (s, IH), 6.56 (s, IH), 5.17 (s, 2H), 4.4-4.1 (m, 6H), 3.17 (m, 4H), 2.98-2.83 (m, 2H), 2.08 (m, 4H), 1.91 (m, IH), 1.64 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.38-1.31 (m, 17H), 1.22-1.20 (m, 4H).
实施例 50 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Boc-Pro-Ala-Asn)-OBzl (4An)
按照实施例 1的方法， 从 965 mg (2.01 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢-异 喹啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl和 960 mg (2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Asn得到 636 mg (38%)标题化 合物，为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 838 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- 6) δ/ppm = 9.26 (s, IH), 9.04 (m, 2H), 8.31 (m, IH), 8.03 (m, IH), 7.57 (m, IH), 7.44 (m, 6H), 6.90 (m, IH), 6.68 (s, IH), 6.49 (s, IH), 5.16 (s, 2H), 4.45-4.40 (m, 3H), 4.14 (m, 2H), 3.42 (m, 5H), 3.17 (m, 3H), 2.89-2.82 (m, IH), 2.09 (m, IH), 1.90 (m, IH), 1.79-1.74 (m,6H), 1.64 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 1.39-1.32 (m, 15H), 1.22 (m, 3H).
实施例 51 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys[Boc-Pro-Ala-Asp(OBzl)]-OBzl (4Ao)
按照实施例 1的方法， 从 870 mg ( 1.24 mmol)化合物 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4- 四氢-异喹啉 -3-甲酰基 -Lys[Asp(OBzl)]-OBzl和 429 mg (2.48 mmol) Boc-Pro-Ala得到 403 mg (35%) 标题化合物， 为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 929 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- e) δ/ppm = 8.32 (m, IH), 8.10 (m, IH), 7.96 (m, IH), 7.36 (m, 10H), 6.60 (s, IH), 6.39 (s: IH), 5.14 (s, 2H), 5.06 (s, 2H), 4.57 (m, IH), 4.32 (m, IH), 4.23 (m, IH), 4.11 (m, 2H), 3.74 (m, IH), 3.55 (m, IH), 3.34-3.28 (m, 2H), 3.00 (m, 2H), 2.89 (s, IH), 2.81 (m, IH), 2.73 (m, 2H), 2.58 (m, IH), 2.16-2.06 (m, IH), 1.91 (s, 2H), 1.75 (m, 5H), 1.40-1.32 (m, 22H), 1.17 (m, 3H). 实施例 52 制备 3S-6，7-二羟基 -1,1-二甲基 -1，2，3，4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基-
Lys [Boc-Pro-Ala-Glu(OBzl)】 -OBzl (4Ap)
按照实施例 1 的方法，从 530 mg (0.75 mmol)化合物 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4- 四氢-异喹啉 -3-甲酰基 -Lys[Glu(OBzl)]-OBzl和 256 mg (0.90 mmol) Boc-Pro-Ala得到 269 mg (38%) 标题化合物， 为浅黄色粉末。 ESI-MS (m/e): 943 [M + H]+; ^MR (300 MHz, DMSO- δ/ppm = 9.26 (s, IH), 9.10 (m, IH), 8.97 (s, IH), 8.79-7.88 (m,3H), 7.36 (m, 10H), 6.67 (s, IH), 6.48 (s, IH), 5.14 (s, 2H), 5.06 (s, 2H), 4.35 (m, IH), 4.23 (m, 2H), 4.10 (m, IH), 3.83 (s, IH), 3.34 (m, 5H), 2.83 (m, IH), 2.72 (m, IH), 2.34 (m, 2H), 1.78 (m, 10H), 1.51 (s, 3H), 1.36-1.31 (m, 14H), 1.21 (m,3H).
实施例 53 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Ala) (5Aa)
先按照实施例 4的方法，从 300 mg (0.38 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢 -异喹啉 -3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Ala)-OBzl脱苄酯。 再按照实施例 2的方法， 脱 Boc， 得 到 266 mg (78%)标题化合物， 为无色粉末。 Mp 207.2-209.4 °C; [α] ο = -4.5 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 630 [M - H] ； IR(KBr): 3221.1, 3057.2, 2983.8, 2943.3, 2362.8, 1660.7, 1546.9, 1533.4, 1448.5, 1379.1, 1240.2, 1049.3, 867.9, 659.7； ^MR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.79 (s, IH), 6.68 (s, IH), 4.36-4.29 (m, 5H), 3.32-3.12 (m, 6H), 1.89 (m, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.57 (s, 3H), 1.48 (m, 2H), 1.33 (m, 9H).
实施例 54 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Val) (5Ab)
按照实施例 53的方法， 从 300 mg (0.36 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢- 异喹啉—3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Val)-OBzl得到 187 mg (81%)标题化合物， 为无色粉末。 Mp 195.8-197.9 °C; [a] ^ = -3.5 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 630 [M - H]"; IR(KBr):
3221.1, 3062.9, 2970.4, 1658.8, 1546.9, 1533.4, 1450.5, 1384.9, 1240.2, 1047.4, 991.41, 866.04, 671.2； toMR (300 MHz, D20) δ/ppm = 8.13 (m, IH), 6.79 (s, IH), 6.68 (s, IH), 4.36-4.29 (m,
4H), 3.89 (m, IH), 3.36 (m, 2H), 3.23 (m, 2H), 3.08 (m, 2H), 1.89 (m, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.57 (s, 3H), 1.48 (m, IH), 1.37 (m, 6H), 1.32 (m, 2H), 0.89 (m, 6H).
实施例 55 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Trp) (5Ac)
按照实施例 53的方法， 从 300 mg (0.33 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢- 异喹啉 -3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Trp)-OBzl得到 180 mg (76%)标题化合物，为浅粉色粉末。 Mp 205.1-207.9 °C; [α] ^ = -1.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 718 [M - H]- ; IR(KBr):
3221.2, 3059.1, 2981.9, 2941.4, 1660.7, 1533.4, 1448.5, 1388.7, 1240.2,867.9, 748.4, 630.7； iHNMR (300 MHz, D20) δ/ppm = 7.50 (d, J=7.8Hz, IH), 7.39 (d, J=7.8Hz, IH), 7.12 (t, J=7.2Hz: IH), 7.05 (t, J=7.2Hz, IH), 6.74 (s, IH), 6.62 (s, IH), 4.38 (m, IH), 4.35 (m, IH), 4.27 (m, IH), 4.18 (m, 2H), 3.24 (m, 2H), 3.16 (m, 3H), 3.06 (m, 3H),1.83 (m, IH), 1.68 (m, 4H), 1.47 (m, 3H), 1.37 (m, 2H), 1.25 (m, 3H), 1.21 (m, 3H).
实施例 56 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Tyr) (5Ad)
按照实施例 53的方法， 从 303 mg (0.34 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢- 异喹啉 -3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Tyr)-OBzl得到 174 mg (74%)标题化合物，为浅黄色粉末。 Mp 200.5-202.8。C; [α] ^ = -2.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 695 [M - H]— ; IR(KBr):
3215.3, 3055.2, 2983.8, 2947.2, 1658.8, 1548.8, 1523.8, 1448.5, 1384.9, 1238.3, 1163.1, 657.7； 'HNMR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.98 (m, 2H), 6.92 (m, 3H), 6.65(s, IH), 4.34-4.26 (m, 6H), 3.27 (m, 2H), 3.15 (m, IH), 3.08 (m, IH), 2.96 (m, 2H), 2.85 (m, 12H), 1.89 (m, 5H), 1.70 (s, 3H), 1.51 (m, 3H), 1.33 (m, 3H), 1.25 (m, 4H).
实施例 57 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Pro) (5Ae)
按照实施例 53的方法， 从 301 mg (0.36 mmol) 3S-6J-二羟基 -1 ,1-二甲基 -1 ,2,3,4-四氢- 异喹啉 -3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Pro)-OBzl得到 179 mg (78%)标题化合物，为浅黄色粉末。 Mp 204.8-205.4 °C; [α] ^ = -5.0 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 629 [M - H]"; IR(KBr): 3244.3, 3070.7, 2980.1 , 2947.2, 1662.6, 1639.5, 1554.6, 1450.5, 1379.1 , 1246.1 , 1201.6, 1047.3, 995.3, 871.8, 657.7； ^MR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.78 (s, IH), 6.68 (s, IH), 4.57 (m, IH), 4.39-4.33 (m, 5H), 3.74 (m, IH), 3.60 (m, IH), 3.26 (m, 2H), 3.17 (m, IH), 3.04 (m, 2H), 2.19 3H), 1.85 (m, 5H), 1.69 (m, 4H), 1.54 (m, 6H), 1.36 (m, 6H).
实施例 58 制备 3S-6，7-二羟基 -1,1-二甲基 -1，2，3，4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Phe) (5Af)
按照实施例 53的方法， 从 300 mg (0.34 mmol) 3S-6J-二羟基 -1 ,1-二甲基 -1 ,2,3,4-四氢- 异喹啉—3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Phe)-OBzl得到 183 mg (78%)标题化合物， 为浅黄色粉 末。 Mp 175.8-178.2。C; [α] ^ = -3.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 679 [M - H]- ; IR(KBr): 3215.3, 3049.5, 2949.2, 1662.6, 1539.2, 1454.3, 1394.5； ^MR (300 MHz, D20) δ/ppm = 7.26 (m, 3H), 7.14 (m, 2H), 6.77 (s, IH), 6.65 (s, IH), 4.39-4.33 (m, 3H), 4.03 (m, 3H), 3.42 (m, IH), 3.37 (m, IH), 3..29 (m, 2H), 3.17 (m, IH), 3.09 (m, 4H), 2.95 (m, 3H), 1.91 (m, 5H), 1.74 (s, 3H), 1.53 (s, 3H), 1.33 (m, 6H).
实施例 59 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Gly) (5Ag)
按照实施例 53的方法， 从 300 mg (0.38 mmol) 3S-6J-二羟基 -1 ,1-二甲基 -1 ,2,3,4-四氢- 异喹啉 -3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Gly)-OBzl得到 193 mg (85%)标题化合物， 为无色粉末。
Mp 196.4-199.5。C; [a] ^ = -3.0 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 588 [M - H]— ; IR(KBr):
3223.1 , 3062.9, 2983.8, 1630.2, 1552.7, 1537.3, 1448.5, 1382.9, 1244.1, 1049.3, 1006.8, 869.9, 661.6； toMR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.77 (s, IH), 6.67 (s, IH), 4.34-4.28 (m, 4H), 3.78 (s, 2H), 3.30 (m, 2H), 3.15 (m, 3H), 1.92 (m, 3H), 1.70 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.33 (m, 6H).
实施例 60制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala
-Ser) (5Ah)
按照实施例 53的方法， 从 300 mg (0.37 mmol) 3S-6J-二羟基 -1 ,1-二甲基 -1 ,2,3,4-四氢- 异喹啉 -3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Ser)-OBzl得到 181 mg (79%)标题化合物，为浅黄色粉末。 Mp 195.6-197.4。C; [a] ^ = -3.8 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 619 [M - H]"; IR(KBr):
3228.8, 3061.0, 2981.9, 2943.4, 1732.1, 1662.6, 1550.7 1533.3, 1448.5, 1384.9, 1244.1, 1159.2, 1049.3, 869.9, 657.7, 518.8； ^MR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.78 (s, IH), 6.67 (s, IH), 4.41-4.26 (m, 5H), 3.74 (m, 2H), 3.25-3.13 (m, 6H), 1.91 (m, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.55 (m, 3H), 1.46 (m, 2H), 1.37 (m, 6H).
实施例 61 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Ile) (5Ai)
按照实施例 53的方法， 从 302 mg (0.36 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢- 异喹啉 -3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Ile)-OBzl得到 181 mg (78%)标题化合物， 为无色粉末。 Mp 175.6-178.4。C; [α] ^ = -3.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 645 [M - H]— ; IR(KBr):
3224.9, 3057.2, 2970.4, 2758.2, 2497.8, 2360.87, 1656.9, 1535.3, 1454.3, 1388.7, 1244.1, 1159.1, 1037.7, 871.8, 659.6； ^MR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.79 (s, IH), 6.68 (s, IH), 4.42 (m, IH), 4.35 (m, IH), 4.29 (m, IH), 4.18 (m, IH), 3.92 (d, J=1.2Hz, IH), 3.31 (m, 2H), 3.19 (m, 2H), 3.10 (m, 3H), 2.34 (m, IH), 2.12 (m, IH), 1.74 (m, 4H), 1.57 (m, 3H), 1.36 (m, 6H), 1.21 (m, 2H), 0.84 (m, 9H).
实施例 62 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Thr) (5Aj)
按照实施例 53的方法， 从 300 mg (0.36 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢- 异喹啉 -3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Thr)-OBzl得到 175 mg (76%)标题化合物， 为浅黄色粉 末。 Mp 194.8-197.5。C; [α] ^ = -2.8 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 633 [M - H]— ; IR(KBr):
3236.5, 3066.8, 2933.7, 1660.7, 1548.8, 1533.4, 1450.8, 1381.0, 1240.2, 1157.3, 1049.3, 869.9, 669.3； toMR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.81 (s, IH), 6.71 (s, IH), 4.43-4.31 (m, 4H), 4.11 (m, 2H), 3.33 (m, 2H), 3.24 (m, IH), 3.24 (m, 2H), 3.21 (m, IH), 3.18 (m, IH), 3.09 (m, IH), 1.94 (m, 3H), 1.74 (s, 3H), 1.58 (s, 3H), 1.51 (m, 2H), 1.23 (m, IH), 1.19 (m, IH), 1.14 (m, 3H).
实施例 63 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基-
Lys(Pro-Ala-Lys) (5Ak)
按照实施例 53的方法， 从 305mg (0.31 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢- 异喹啉—3-甲酰基 -Lys[Boc-Pro-Ala-LysI(Z)]-OBzl得到 152 mg (75%)标题化合物， 为深黄色 粉末。 Mp 185.6-188.1。C; [α] ^ = -1.8 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 660 [M - H]- ; IR(KBr): 3853.7, 3738.1, 2956.8, 2349.3, 2017.5, 1668.4, 1537.3, 1400.3, 1257.6, 1043.5, 871.8, 671.2.； iHNMR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.80 (s, IH), 6.69 (s, IH), 4.45 (m, IH), 4.35 (m, IH), 4.29 (m, IH), 4.18 (m, 2H), 3.73 (m, 2H), 3.22-3.13 (m, 8H), 3.09 (m, 4H), 2.95 (m, IH), 1.93 (m, 6H), 1.74 (m, 9H), 1.58 (m, 6H), 1.47 (m, 2H), 1.32-1.27 (m, 16H), 1.18 (m, 2H). 实施例 64 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Leu) (5A1)
按照实施例 53的方法， 从 300 mg (0.36 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢- 异喹啉—3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Leu)-OBzl得到 178 mg (77%)标题化合物， 为无色粉末。 Mp 189.7-192.7。C; [α] ^ = -3.5 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 645 [M - H]— ; IR(KBr):
3224.9, 3064.9, 2956.8, 1660.7, 1548.8, 1535.3, 1448.5, 1381.0,1242.2, 1049.3, 997.2, 869.9, 669.3； iHNMR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.78 (s, 1H), 6.68 (s,lH), 4.38-4.29 (m, 3H), 4.13 (m, 2H), 3.31 (m, 3H), 3.21 (m, 1H), 3.08 (m, 2H), 1.89 (m, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.57 (m, 4H), 1.46 (m, 5H), 1.32 (m, 6H), 1.32 (m, 1H), 1.16 (m, 6H).
实施例 65 制备 3S-6，7-二羟基 -1,1-二甲基 -1，2，3，4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基-
Lys(Pro-Ala-Gln) (5Am)
按照实施例 53的方法， 从 300 mg (0.35 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢- 异喹啉 -3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Gln)-OBzl得到 184 mg (79%)标题化合物， 为无色粉末。 Mp 181.3-183.3 °C; [α] ^ = -3.0 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 660 [M - H]—; IR(KBr): 3213.4, 3059.1, 2981.9, 2943.4, 2362.8, 1739.8, 1662.6, 1548.8, 1537.3, 1450.5, 1375.3, 1244.1, 1047.2, 871.8, 659.7； ^MR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.80 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 4.40-4.29 (m, 5H), 3.33 (m, 3H), 3.17 (m, 3H), 1.90 (m, 2H), 1.69 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.43 (m, 2H), 1.31 (m, 8H).
实施例 66 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Asn) (5An)
按照实施例 53的方法， 从 302 mg (0.36 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢- 异喹啉 -3-甲酰基 -Lys(Boc-Pro-Ala-Asn)-OBzl得到 174 mg (78%)标题化合物， 为无色粉末。 Mp 202.5-204.7 °C; [α] ^ = -2.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 646 [M - H]-; IR(KBr):
3207.6, 3059.1, 2943.3, 1674.2, 1537.3, 1448.5, 1381.0, 1247.9, 642.3； ^MR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.78 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 4.48 (m, 1H), 4.42-4.29 (m, 4H), 3.29 (m, 2H), 3.16 (m, 4H), 2.65 (m, 2H), 1.90 (m, 2H), 1.69 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.31 (m, 6H).
实施例 67 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro- Ala-Asp) (5Ao)
按照实施例 53的方法， 从 300 mg (0.32 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢- 异喹啉 -3-甲酰基 -Lys-[Boc-Pro-Ala-Asp(OBzl)]-OBzl得到 174 mg (83%)标题化合物， 为无 色粉末。 Mp 207.1-209.7。C; [α] ^ = -3.5 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 647 [M - H]— ; IR(KBr): 3383.3, 3061.0, 2360.9, 1670.3, 1550.8, 1448.5, 1400.3, 1246.3, 873.8, 611.4; ^MR
(300 MHz, D20) δ/ppm = 6.76 (s, 1H), 6.66 (s, 1H), 4.52 (m, 1H), 4.37-4.281 (m, 4H), 3.27 (m, 4H), 3.13 (m, IH), 3.05 (m, IH), 2.76 (m, 2H), 1.97 (m, IH), 1.90 (m, IH), 1.71 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.43 (m,2H), 1.31 (m, 6H).
实施例 68 制备 38-6，7-二羟基-1，1-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-甲酰基- Lys(Pro-Ala-Glu) (5Ap)
按照实施例 53的方法， 从 301 mg (0.32 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢- 异喹啉 -3-甲酰基 -Lys[Boc-Pro-Ala-Glu(OBzl)]-OBzl得到 173 mg (82%)标题化合物， 为无色 粉末。 Mp 194.7-196.1。C; [α] ^ = -2.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 661 [M - H]— ; IR(KBr):
3053.3, 2945.3, 2370.5, 2320.4, 1651.1, 1546.9, 1533.4, 1448.5, 1388.8, 1240.2, 1165.0, 1045.4, 644.2； iHNMR (300 MHz, D20) δ/ppm = 6.78 (s, IH), 6.67 (s, IH), 4.42-4.28 (m, 5H), 3.29 (m, 2H), 3.13 (m, 3H), 2.99 (m, IH), 2.38 (m, 2H), 2.29 (m, IH), 1.90 (m, 5H), 1.69 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.31 (m, 6H).
对照例 1 制备 3S-6，7-二羟基 -1,1-二甲基 -1，2，3，4-四氢-异喹啉 -3-甲酰基 -Lys (6)
按照实施例 4的方法，从 1.00 g (2.03 mmol) 3S-6J-二羟基 -1,1-二甲基 -1,2,3,4-四氢 -异喹 啉 -3-甲酰基 -Lys-OBzl得到 620 mg (85%)标题化合物， 为浅粉色固体。 此化合物 6做为对 照组用于以下实验例中。 ESI-MS(m/e): 363[M - H]_ .
实验例 1 评价本发明化合物 5Aa-p静脉给药的溶栓活性
1)评价方法
将 200 - 220 g雄性 SD大鼠用 20%乌拉坦溶液 (6 mL/kg, i.p.)进行麻醉。 麻醉大鼠仰卧 位固定， 分离右颈总动脉， 于近心端夹动脉夹， 近心端和远心端分别穿入手术线， 将远心 端的手术线于皮毛用止血钳夹紧， 在远心端插管， 松开动脉夹， 放出约 l mL动脉血并装在 1 mL的 EP管中。 往垂直固定的玻璃管 (；长 15 mm, 内径 2.5 mm, 外径 5.0 mm, 管底用胶 塞密封;)中注入 0.1 mL大鼠动脉血液， 往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该 血栓固定螺旋用直径为 0.2 mm的不锈钢丝绕成， 螺旋部分长 12 mm, 含 15个螺圈， 螺圈 的直径为 1.0 mm， 托柄与螺旋相连， 长 7.0 mm， 呈问号型。 血液凝固 40 min后， 打开玻璃 管底部的胶塞， 用镊子固定血栓固定螺旋的托柄， 从玻璃管中取出被血栓包裹的血栓固定 螺旋， 精确称重。
旁路插管由 3段构成， 中段为聚乙烯胶管， 长 60 mm， 内径 3.5 mm， 两端为相同的聚 乙烯管， 长 100 mm, 内径 l mm， 夕卜径 2 mm， 该管的一端拉成尖管 (；用于插入大鼠颈动脉 或静脉)， 夕卜径 l mm， 另一端的外部套一段长 7 mm， 外径 3.5 mm的聚乙烯管 (加粗,用于插 入中段的聚乙烯胶管内 )。 3 段管的内壁均硅烷化。 将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚 乙烯胶管内， 胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。 用注射器通过尖管端将管中注 满肝素生理盐水溶液 (50 IU/kg)备用。 分离大鼠的左颈外静脉， 近心端和远心端分别穿入手术线， 结扎远心端， 在暴露的左 颈外静脉上小心地剪一斜口， 将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开口 的近心端， 同时远离旁路管中段 （含精确称重的血栓固定螺旋） 内血栓固定螺旋的托柄。 用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水（50 IU/kg) ， 此时注射器不撤离聚 乙烯管， 用止血钳夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。 在右颈总动脉的近心端用动脉夹止 血， 在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。 从聚乙烯管的尖部拔出注射器， 将 聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。 旁路管道的两端都用 4号手术缝线与动静脉固定。
用头皮针将生理盐水， 尿激酶的生理盐水溶液或不同浓度化合物的生理盐水溶液通过 旁路管的中段 (含精确称重的血栓固定螺旋 )， 剌入远离血栓固定螺旋的近静脉处， 打开动脉 夹， 使血流通过旁路管道从动脉流向静脉， 此即大鼠动静脉旁路溶栓模型， 缓慢将注射器 中的液体注入到血液中 (约 6 min), 使生理盐水， 尿激酶或本发明的化合物通过血液循环， 按静脉一心脏一动脉的顺序作用到血栓上。 从开始注射时计时， l h后从旁路管道中取出血 栓固定螺旋， 精确称重。 计算每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差， 统计 并评价化合物的体内溶栓活性。 血栓减重用均值和标准差 （ ± SD) 表示。
2)给药方法和剂量
静脉注射给药。 空白对照为生理盐水， 给药剂量为 3 mL/kg。 阳性对照为尿激酶， 剂量 为 20000 U/kg, 相当于 1.68 mg/kg o 本发明化合物 5Aa-p的剂量为 0.1 nmol/kg。
3)评价结果
溶栓活性用血栓减重 ± SD mg)表示， 结果列入表 1。 数据表明， 在 O.l nmol/kg剂 量下静脉给药化合物 5Aa-p 能够有效地溶解血栓 (与生理盐水比 p<0.01)， 其中化合物 5Aa、 5Af、 5Ag、 5Ak、 5Ao的溶栓活性与剂量为 20000 U/kg的尿激酶相当。 在溶栓活性较好的 5Aa、 5Ad、 5Af、 5Ag、 5Ak中 5Ak的溶栓活性最强， 因而进一步评价剂量依赖关系。
表 1 本发明化合物 5Aa-p静脉给药的溶栓活性
化合物 血栓减重 化合物 血栓减重
生理盐水 9.25士 1.59 尿激酶 18.95士 2.73a
5Aa 19.35士 2.76b 5Ai 16.00士 2.03a
5Ab 17.12士 1.64a 5Aj 15.23士 2.45a
5Ac 16.23士 2.81a 5Ak 19.38 ± 2.81 b
5Ad 18.11士 2.48b 5A1 14.65士 2.86a
5Ae 13.63 ± 1.92a 5Am 16.65士 2.52a
5Af 17.92士 1.69 b 5An 16.44士 2.32a
5Ag 18.98士 2.14 b 5Ao 15.86 ± 2.21 a
5Ah 17.10士 1.79a 5Ap 16.03士 2.14a
6 13.87士 3.07a PAK 14.17士 1.84a
6 + PAK 15.37士 3.00a
n= 10; a)与生理盐水比 p<0.01 ; b) 与生理盐水比 p<0.01,与化合物 6、 PAK及 6 + PAK 比 p<0.05， 与尿激酶比 p>0.05。
实验例 2评价本发明化合物 5Ak静脉给药溶血栓活性的量效关系
按照实验例 1的方法静脉注射给药。 空白对照为生理盐水， 给药剂量为 3 mL/kg。 阳性 对照为尿激酶，给药剂量为 20000 U/kg,相当于 1.68 mg/kg。 5Ak选取 0.1 nmol/kg (高)， 0.01 nmol/kg (；中;)和 0.001 nmol/kg (fS)三个剂量。结果列入表 2。数据表明 5Ak表现出明显的量 效关系。
表 2本发明化合物 5Ak溶栓的量效关系
_ 化合物 栓减重 ± SD mg)
生理盐水， 3 mL/kg 10.55 ± 2.52
尿激酶， 20000 U/kg 25.61 ± 3.87
5Ak， 0.1 nmol/kg 21.61士 4.62a
5Ak, 0.01 nmol/kg 14.62士 2.46 b
5Ak, 0.001 nmol/kg 11.73 ± 2.15 c
n= 10; a)与生理盐水及 0.01 nmol/kg 5Ak比 p<0.01 ; b) 与生理盐水及 0.001 nmol/kg 5Ak 比 p<0.01 ; c) 与生理盐水比 p>0.05。
实验例 3评价本发明化合物 5Aa-p静脉给药的抗栓活性
1)评价方法
插管由 3段构成， 中段长 80 mm， 内径 3.5 mm， 两端为相同的聚乙烯管， 长 100 mm, 内径 l mm， 外径 2 mm， 该管的一端拉成尖管 (用于插入大鼠颈动脉或静脉)， 3段管的内壁 均硅烷化。 将提前称重的长 60 mm的丝线放入中段聚乙烯粗管内， 粗管的两端分别与两根 聚乙烯细管的未拉细端相套 （其中一段将丝线压住 0.5 mm固定） 。 用注射器通过尖管端将 管中注满肝素生理盐水溶液 (50 IU/kg)备用。
将 200 - 220 g雄性 SD大鼠用 20%乌拉坦溶液 (6 mL/kg, i.p.)进行麻醉。 麻醉大鼠仰卧 位固定， 分离出大鼠的左颈外静脉， 近心端和远心端分别穿入手术线， 结扎远心端， 在暴 露的左颈外静脉上小心地剪一斜口， 将上面制备好的旁路管道的未压线端尖管由斜口插入 左颈外静脉开口的近心端， 用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水 （50 IU/kg) ， 然后换注射器， 由同样方法推入准确量的药物， 此时注射器不撤离聚乙烯管， 分 离右颈总动脉， 于近心端夹动脉夹， 近心端和远心端分别穿入手术线， 结扎远心端， 在离 动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。 从聚乙烯管的尖部拔出注射器， 将聚乙烯管 的尖部插入动脉斜口的近心端。 旁路管道的两端都用 4号手术缝线与动静脉固定。 打开动 脉夹， 使血流通过旁路管道从动脉流向静脉， 此即大鼠动静脉旁路抗栓模型。 从开始循环 时计时， 15 min后从旁路管道中取出挂有血栓的丝线， 精确称重， 丝线前后的质量差即为 血栓湿重， 统计并评价化合物的体内抗栓活性。血栓湿重用均值和标准差（ ± SD)表示。 2)给药方法和剂量
静脉给药。 空白对照为生理盐水， 给药剂量为 l mL/kg。 阳性对照为阿司匹林， 给药剂 量为 9 mg/kg。 本发明化合物 5Aa-p的剂量为 0.1 nmol/kg。
3) 结果
抗栓活性用血栓湿重 ± SD mg)表示， 结果列入表 3。 数据表明， 在 O.l nmol/kg剂 量下静脉给药化合物 5Ak能够有效地抑制血栓形成 (；与生理盐水比 p<0.001)，其中活性好的 5Ak进一步评价剂量依赖关系。
表 3 本发明化合物 5Aa-p静脉给药体内抗栓实验
化合物 栓湿重 （ 士 SD mg) 化合物 栓湿重 ( 士 SD mg)
NS 65.40士 2.73 Aspirin 46.95士 5.21a
5Aa 54.04士 6.43a 5Ai 56.12士 5.55a
5Ab 54.17士 6.61a 5Aj 50.56士 3.96a
5Ac 52.93士 3.96a 5Ak 51.93士 2.74a
5Ad 51.91士 4.97a 5A1 54.20士 3.93a
5Ae 57.20士 6.43a 5Am 58.14士 2.30a
5Af 54.01士 4.25a 5An 55.11士 4.76a
5Ag 54.28士 3.57a 5Ao 48.34士 3.29a
5Ah 50.67士 3.71a 5Ap 49.97士 6.32a
n= 10； 5Aa-p ( i.v. ) ： O.l nmol/kg; Aspirin: 9 mg/kg
a) 与 NS比， p<0.001。
实验例 4评价本发明化合物 5Ak静脉给药抗血栓活性的量效关系
1)评价方法
同实验例 3的方法。
2)给药方法和剂量
静脉给药。 空白对照为生理盐水， 给药剂量为 3 mL/kg。 阳性对照为阿司匹林， 给药剂 量为 9 mg/kg。 5Ak选取 0.1 nmol/kg (高）， 0.01 nmol/kg (中)和 0.001 nmol/kg (低）三个剂量。
3) 结果
结果列入表 4， 5Ak表现出明显的量效关系。
表 4本发明化合物 5Ak体内抗栓实验量效关系
化合物 栓湿重 （ 士 SD mg)
NS 63.46 ± 3.67
Aspirin 45.62士 2.60
5Ak， 0.1 nmol/kg 52.16士 2.02a
5Ak， 0.01 nmol/kg 57.34士 3.73b
5Ak， 0.001 nmol/kg 61.91士 3.27c
n = 10; a)与生理盐水及 0.01 nmol/kg 5Ak比 p<0.01 ; b) 与生理盐水及 0.001 nmol/kg 5Ak 比 p<0.01 ; c) 与生理盐水比 p>0.05。
实验例 5评价本发明化合物 5Ak对中风大鼠的治疗作用 为了考察化合物 5Aa-p对中风大鼠的治疗作用， 选择化合物 5Ak为代表， 按照以下方 法考察对中风大鼠的治疗作用。
1)评价方法
SD雄性大鼠 (280-300 g)随机分为 UK阳性对照组， 剂量为 20000 IU/kg。 生理盐水空白 对照组， 化合物对照组 PAK剂量为 5 μηιοΐ/kg和化合物 5Ak组， 剂量为 1 mol/kg(高)， 0.1 μηιοΐ/kg (中）和 0.01 μηιοΐ/kg (低）。 大鼠用 10%水合氯醛（400 mg/kg)腹腔注射麻醉， 从颈 部正中略偏右部竖直开约 2 cm长切口， 沿胸锁乳突肌内侧缘分离出右颈总动脉 (CCA)， 颈 外动脉 (ECA)和颈内动脉 (ICA)。 用无创动脉夹分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心 端， 在颈外动脉剪一小口， 结扎颈外动脉远心端， 松开颈总动脉近心端的动脉夹， 取 ΙΟ μί 血， 取血之后再用无创动脉夹夹闭颈总动脉近心端。 将取得的 10 μ 血装入 1 mL EP管中， 在常温下放置 30分钟使血液凝固，然后转移至 -20 °C冰箱中放置 1小时， 使血液凝块结实。 1小时结束后取出血液凝块， 加入 1 mL生理盐水用钢铲把血液凝块捣成大小均一的细小血 栓， 然后把细小血栓混悬液转移至 I mL注射器内备用。 松开大鼠颈内动脉夹的同时， 将上 述 1 mL注射器内的血栓混悬液缓慢从大鼠颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大鼠的大 脑， 然后结扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处得动脉夹， 恢复血流。 然后分 离大鼠颈总静脉，注入 UK剂量为 20000 IU/kg,生理盐水或化合物 5Ak组，剂量为 1 μηιο1/1¾。 结扎静脉， 伤口处滴加 3滴青霉素， 缝合伤口， 等待动物苏醒。
大鼠苏醒 24小时后按 Zealonga方法评定神经功能缺损程度。 0分表示无任何神经功能 缺失体征、 1分表示未损伤侧前肢不能伸展、 2分表示向未损伤侧行走、 3分表示向未损伤 侧转圈成追尾状行走、 4分表示意识障碍无自主行走、 5分表示死亡。将以上各组评分结果 进行统计学比较， 并作 t检验。
大鼠苏醒 24小时 Zealonga方法评定神经功能缺损程度后， 用乌拉坦麻醉后迅速断头 取脑，将脑组织置于 -20 °C冰箱 2小时后，从前额极开始行约 2 mm冠状连续切片，共 5片， 然后置于 2%TTC溶液中 37 °C避光孵育 30 min,并观察脑切片的颜色变化，正常组织被 TTC 染成红色， 而缺血组织呈白色。 然后用数码相机照相， 经图像计软件处理， 计算冠状切片 中梗死体积和正常组织的面积， 统计各组的梗死体积百分比值， 并做 Z检验。
2)评价结果
大鼠苏醒后 Zealonga方法评分数据见表 5， 大鼠大脑梗死体积百分比数据见表 6。
表 5大鼠苏醒后 24 h Zealonga方法评分
化合物 神经功能评分 ( 士 SD)
生理盐水 2.90士 0.99
尿激酶， 20000 IU/kg 1.30士 0.95a
5Ak, 1 μιηοΐ/kg 1.10士 0.74a 5Ak， 0.1 μηιοΐ/kg 1.40士 1.07b
5Ak, 0.01 μηιοΐ/kg 2.30士 0.95c
PAK, 5 μηιοΐ/kg 2.20士 1.60
n=9; a) 与生理盐水及 0.1 μηιοΐ/kg 5Ak比 p<0.05; b) 与生理盐水及 0.01 μηιοΐ/kg 5Ak比 p<0.05; c)与生理盐水及 5 μηιοΐ/kg PAK比 p>0.05。
表 6大鼠大脑梗死体积百分比(％)
化合物 梗死体积比 士 SD %)
生理盐水 22.99 ± 5.08
尿激酶， 20000 IU/kg 4.60士 2.09
5Ak, 1 μιηοΐ/kg 3.44士 1.99a
5Ak, 0.1 μιηοΐ/kg 9.88士 2.52b
5Ak， 0.01 μηιοΐ/kg 18.05 ± 5.77e
PAK, 5 μηιοΐ/kg 18.36 ± 7.38
n=7; a) 与生理盐水比较 p<0.01， 与 0.1 μηιοΐ/kg 5Ak比 p<0.05， 与尿激酶比 p>0.05; b) 与生理盐水及 0.1 μηιοΐ/kg 5Ak比 p<0.05; c)与生理盐水比 p>0.05。
表 5和表 6的数据说明， 化合物 5Ak能够有效地防止脑缺血的大鼠出现运动障碍和大 脑组织梗死。 5Ak的这种功能具有剂量依赖关系。
实验例 6评价本发明化合物 5Aa-p清除自由基的活性
1)清除羟自由基活性
11.316 mg DMPO (；二甲基吡啶 N-氧化物， Sigma)溶解于 1 mL纯净水中得到浓度为 0.1
M的 DMPO溶液， 2.78 g FeS04-7H20溶解于 1 mL的纯净水制浓度为 10 mM的溶液。 30% 医用 H202稀释到 0.2%。
先测 2.5 μL FeS04-7H20溶液 + 2.5 μL DMPO溶液+ 5 μL H202溶液+ 5 μΐ^水的 ΟΗ信号 峰的第一个峰的高度， 重复 6次， 该峰的高度就是已知的 ΟΗ信号峰的高度。 再测 2.5 μ FeS04-7H20溶液 + 2.5 μ DMPO溶液+ 5 μ ¾02溶液+ 5 μ 化合物 5Aa-p之一溶液的 OH 信号峰的第一个峰的高度， 重复 6次。 该峰的高度就是 5Aa-p清除已知的 OH信号峰的高 度的残留。
清除率 = (已知的 OH信号峰的高度-加 5Aa-p之后的 OH信号峰高度) /已知的 OH信 号峰的高度。
2)清除 NO自由基活性
7.325 mg MGD (N-甲基-葡萄糖胺二硫代甲酸， Sigma)溶解于 1 mL纯净水得到浓度为 25 mM的 MGD溶液， 3.475 g FeS04-7H20溶解于 1 mL的纯净水制浓度为 12.5 mM的溶液， 25 mg SNAP (；亚硝基乙酰青霉胺;)溶解在 1 mL纯净水得到的浓度为 110 μΜ的绿色母液稀释 100倍得到 1 μΜ的 SNAP溶液。
先测 5 μLMGΌ溶液 + 5 FeS04-7H20溶液 + 5 LSNAP + 5 μL水的 NO信号第一个 峰高度， 重复 6次。该峰的高度就是已知的 NO信号峰的高度。再测 5 LMGD溶液 + 5 FeS04-7H20溶液 + 5 LSNAP + 5 μL化合物 5Aa-p溶液之一的 NO信号峰的第一个峰的高 度， 重复 6次。 该峰的高度就是 5Aa-p清除已知的 NO信号峰的高度的残留。
清除率 = (已知的 NO信号峰的高度 -加 5Aa-p之后的 NO信号峰高度) /已知的 NO信 号峰的高度。
3)清除超氧阴离子自由基活性
0.3 g黄嘌吟溶解于 1 mL纯净水得到浓度为 0.5 M的黄嘌吟溶液 (乳白色， 大量不溶)， 市售黄嘌吟氧化酶原液稀释 10倍得到黄嘌吟氧化酶溶液， 饱和 DETAPAC溶液稀释 20倍 得到浓度为 0.9 mM的溶液， 11.316 mg DMPO溶解于 1 mL纯净水得到浓度为 0.1 M的 DMPO溶液。
5 μL DMPO溶液 + 5 μL DETAPAC溶液 + 5 黄嘌吟溶液 + 5μί黄嘌吟氧化酶溶液 + 5μί化合物 5Aa-p溶液。
先测 5 μL DMPO溶液 + 5 μL DETAPAC溶液 + 5 黄嘌吟溶液 + 5μί黄嘌吟氧化酶溶 液 +5 水的超氧阴离子信号第一个峰高度， 重复 6次。 该峰的高度就是已知的超氧阴离 子信号峰的高度。再测 5 μL DMPO溶液 + 5 μL DETAPAC溶液 + 5 μL黄嘌吟溶液 + 5μL黄 嘌吟氧化酶溶液 + 5 μL化合物 5Aa-p溶液之一的超氧阴离子信号峰的第一个峰的高度， 重 复 6次。 该峰的高度就是 5Aa-p清除已知的超氧阴离子信号峰的高度的残留。
清除率 = (已知的超氧阴离子信号峰的高度 -加 5Aa-p之后的超氧信号峰高度 /已知的 超氧阴离子信号峰的高度。
结果如表 7。 数据表明， 5Aa-p清除三种自由基活性的 EC5Q为 0.4 - 0.7 mM, 有明确的 自由基清除活性。
表 7本发明化合物 5Aa-p清除自由基的 EC:
清除以下自由基的 EC50( 士 SD> ( 10- 4 M)
•NO OH 超氧阴离子自由基
5Aa 5.99 ±0.38 4.59 ±0.66 4.77 ±0.56
5Ab 5.32 ±0.73 4.71 ±0.71 4.71 ±0.34
5Ac 4.63士 0.92 3.78 ±0.85 3.66 ±0.71
5Ad 4.53 ±0.41 3.69 ±0.32 3.54 ±0.71
5Ae 6.17 ±0.88 4.66士 0.47 4.81 ±0.45
5Af 5.68士 0.95 5.44士 0.43 4.85 ±0.31
5Ag 6.09士 0.95 4.22 ±0.61 4.67士 0.94
5Ah 5.23士 0.85 4.13 ±0.73 4.01 ±0.72
5Ai 5.27士 0.90 4.95 ±0.61 4.52士 0.64
5Aj 5.10 ±0.75 4.16 ±0.28 4.17 ±0.95
5Ak 4.99 ±0.89 4.22士 0.82 3.63士 0.94
5A1 5.03 ±0.41 4.89 ±0.32 4.14 ±0.97
5Am 6.47 ±0.88 4.66士 0.77 3.71 ±0.45 5An 6.59 ± 0.89 5.72士 0.72 3.83士 0.94
5Ao 4.73 ± 0.99 3.96 ± 0.48 4.35士 0.65
5Ap 4.77士 0.91 4.0士 0.51 4.20士 0.73
n = 6， EC50= X士 SD化合物浓度为 Xx lO— 4M。
实验例 7测定本发明化合物 5Aa-p的透射电镜
将样品用三蒸水分别配成 1 X 10- 7 M， 1 X 10- 9 M， 1 x 10- 11 M的溶液， 吸取微量（约 10 μΐ^)滴于铜网表面， 铜网下面衬滤纸， 自然晾干， 在透射电子显微镜 (JEOL, JEM- 1230)下观 察其形态及粒径， 并用照片记录。
在水溶液中本发明化合物 5Aa-p可自组装成直径在 20-210 nm之间的纳米球， 其中绝 大多数粒径在 20-100 nm之间， 这些纳米球串连形成的不同形状的纳米网， 纳米项链等， 现 以体内浓度 1 X 10- 9 M (理论血药浓度） 为例， 列举各化合物的电镜图 (图 9)。 在图 9中， 本发明化合物 5Aa-p对应的图号分别为 5a、 5b、 5c、 5d、 5e、 5f、 5g、 5h、 5i、 5j、 5k、 51、 5m、 5n、 5o和 5p。
实验例 8大鼠中风 4小时后接受 1 μιηοΐ/kg 5Ak连续治疗 6次的试验
疗效用神经功能评分表示，评分越低疗效越好。雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶 液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支， 于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹 分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于颈外动脉主干处插 入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的 0.5 mL 血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。 之后， 结 扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹， 恢复血流， 缝合伤口。 并肌肉 注射 2万 IU的青霉素， 预防感染。 4小时之后把化合物 5Ak (；剂量为 1 mol/kg, n = 10) 的 生理盐水溶液， 连续输 6天， 观察 7天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺 损程度。 0分表示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向 未损伤侧行走， 3 分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5 分表示死亡。试验结果见表 8。结果说明，大鼠中风 4小时之后每天接受 1次剂量为 1 μιηοΐ/kg 5Ak治疗， 连续治疗 6 次， 无死亡， 10只大鼠有 8只好转为无任何神经功能缺失体征， 有 2只残留轻微的神经功能缺失体征。 可见， 在 1 μηιοΐ/kg剂量下， 5Ak对中风 4小时有确切 治疗作用。
表 8 大鼠中风 4小时后接受 1 mol/kg 5Ak治疗的疗效
每天神经功能评分 （Mean ± SD)及得分 大鼠数目
评分时间
0分 1 分 2分 3分 4分 5分 第一天 3只 5只 1只 1只 0只 0只 第二天 5只 4只 1只 0只 0只 0只 第三天 3只 6只 1只 0只 0只 0只 第四天 8只 1只 1只 0只 0只 0只 第五天 6只 4只 0只 0只 0只 0只 弟八天 8只 2只 0只 0只 0只 0只 实验例 9大鼠中风 6小时后接受 1 μιηοΐ/kg 5Ak连续治疗 6次的试验
疗效用神经功能评分表示，评分越低疗效越好。雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶 液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支， 于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹 分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于颈外动脉主干处插 入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的 0.5 mL 血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。 之后， 结 扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹， 恢复血流， 缝合伤口。 并肌肉 注射 2万 IU的青霉素， 预防感染。 6小时之后把化合物 5Ak (；剂量为 1 mol/kg, n = 10) 的 生理盐水溶液， 连续输 6天， 观察 7天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺 损程度。 0分表示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向 未损伤侧行走， 3 分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5 分表示死亡。试验结果见表 9。结果说明，大鼠中风 6小时之后每天接受 1次剂量为 1 μιηοΐ/kg 5Ak治疗， 连续治疗 6 次， 除 1只意外死亡， 9只大鼠有 6只好转为无任何神经功能缺失 体征， 有 3只残留轻微的神经功能缺失体征。 可见， 在 1 μηιοΐ/kg剂量下， 5Ak对中风 6小 时有确切治疗作用。
表 9 大鼠中风 6小时后接受 1 mol/kg 5Ak治疗的疗效
Figure imgf000034_0001
实验例 10大鼠中风 24小时后接受 1 μιηοΐ/kg 5Ak连续治疗 6次的试验
疗效用神经功能评分表示，评分越低疗效越好。雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶 液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支， 于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹 分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于颈外动脉主干处插 入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的 0.5 mL 血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。 之后， 结 扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹， 恢复血流， 缝合伤口。 并肌肉 注射 2万 IU的青霉素，预防感染。 24小时之后把化合物 5Ak (；剂量为 1 mol/kg, η = 10) 的 生理盐水溶液， 连续输 6天， 观察 7天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺 损程度。 0分表示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向 未损伤侧行走， 3 分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5 分表示死亡。 试验结果见表 10。 结果说明， 大鼠中风 24小时之后， 2只死亡， 剩余 8只每 天接受 1次剂量为 1 μιηοΐ/kg 5Ak治疗， 连续治疗 6 次， 无死亡， 8只大鼠有 3只好转为无 任何神经功能缺失体征， 有 4只残留轻微的神经功能缺失体征， 有 1只残留明显的神经功 能缺失体征。 可见， 在 1 μηιοΐ/kg剂量下， 5Ak对中风 24小时仍然有确切治疗作用。
表 10 大鼠中风 24小时后接受 1 mol/kg 5Ak治疗的疗效
Figure imgf000035_0001
实验例 11大鼠中风 6小时后接受 2.5 μιηοΐ/kg 5Ak连续治疗 6次的试验
疗效用神经功能评分表示，评分越低疗效越好。雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶 液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支， 于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹 分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于颈外动脉主干处插 入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的 0.5 mL 血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。 之后， 结 扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹， 恢复血流， 缝合伤口。 并肌肉 注射 2万 IU的青霉素，预防感染。 6小时之后把化合物 5Ak (；剂量为 2.5 μηιοΐ/kg, n = 10) 的 生理盐水溶液， 连续输 6天， 观察 7天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺 损程度。 0分表示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向 未损伤侧行走， 3 分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5 分表示死亡。 试验结果见表 11。 结果说明， 9只大鼠中风 6小时之后， 每天接受 1次剂量 为 2.5 mol/kg 5Ak治疗， 连续治疗 6 次， 无死亡， 9只大鼠有 7只好转为无任何神经功能 缺失体征， 有 1只残留轻微的神经功能缺失体征。 可见， 在 2.5 μηιοΐ/kg剂量下， 5Ak对中 风 6小时的治疗作用明显比 1 μιηοΐ/kg剂量好。
表 11 大鼠中风 6小时后接受 2.5 mol/kg 5Ak治疗的疗效
Figure imgf000036_0001
实验例 12大鼠中风 24小时后接受 2.5 μιηοΐ/kg 5Ak连续治疗 6次的试验
疗效用神经功能评分表示，评分越低疗效越好。雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶 液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支， 于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹 分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于颈外动脉主干处插 入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的 0.5 mL 血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。 之后， 结 扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹， 恢复血流， 缝合伤口。 并肌肉 注射 2万 IU的青霉素，预防感染。 24小时之后把化合物 5Ak (；剂量为 2.5 μηιοΐ/kg, n = 10) 的 生理盐水溶液， 连续输 6天， 观察 7天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺 损程度。 0分表示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向 未损伤侧行走， 3 分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5 分表示死亡。 试验结果见表 12。 结果说明， 大鼠中风 24小时之后， 3只死亡， 剩余 7只每 天接受 1次剂量为 2.5 μιηοΐ/kg 5Ak治疗， 连续治疗 6 次， 2只死亡， 3只好转为无任何神 经功能缺失体征， 有 1只残留轻微的神经功能缺失体征， 有 1只残留明显的神经功能缺失 体征。 可见， 在 2.5 mol/kg剂量下， 5Ak对中风 24小时仍然有一定治疗作用。
表 12 大鼠中风 24小时后接受 2.5 mol/kg 5Ak治疗的疗效
Figure imgf000036_0002
实验例 13大鼠中风 24小时后接受 5 μιηοΐ/kg 5Ak连续治疗 6次的试验
疗效用神经功能评分表示，评分越低疗效越好。雄性 SD大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶 液， 剂量为 400 mg/kg体重， 使麻醉。于颈部正中纵行切口， 分离出右侧颈总动脉主干 (约 3 cm长)。于舌骨水平分离结扎颈外动脉各分支， 于颈膨大处分离出颈内动脉。用无创动脉夹 分别夹闭颈内动脉开口处和颈总动脉近心端， 并结扎颈外动脉远端。 于颈外动脉主干处插 入装有 0.5 mL血栓块生理盐水悬浮液的导管，在松开颈内动脉夹的同时，将导管内的 0.5 mL 血栓块生理盐水悬浮液缓慢从颈外动脉向近心端经过颈内动脉注入大脑中动脉。 之后， 结 扎颈外动脉近心端， 打开颈内动脉和颈总动脉处的动脉夹， 恢复血流， 缝合伤口。 并肌肉 注射 2万 IU的青霉素， 预防感染。 24小时之后把化合物 5Ak (；剂量为 5 μιηοΐ/kg, n = 10) 的 生理盐水溶液， 连续输 6天， 观察 7天， 每天自身对照， 按 Zealonga方法评定神经功能缺 损程度。 0分表示无任何神经功能缺失体征， 1分表示未损伤侧前肢不能伸展， 2分表示向 未损伤侧行走， 3 分表示向未损伤侧转圈成追尾状行走， 4分表示意识障碍无自主行走， 5 分表示死亡。 试验结果见表 13。 结果说明， 大鼠中风 24小时之后， 1只死亡， 剩余 10只 每天接受 1次剂量为 5 mol/kg 5Ak治疗， 连续治疗 6 次， 无死亡， 7只好转为无任何神经 功能缺失体征， 有 3只残留轻微的神经功能缺失体征。 可见， 在 5 mol/kg剂量下， 5Ak对 中风 24小时有确切治疗作用， 比 2.5 μιηοΐ/kg剂量下的疗效明显好。
表 13 大鼠中风 24小时后接受 5 mol/kg 5Ak治疗的疗效
Figure imgf000037_0001
根据实验结果表明， 本发明的化合物能够形成纳米结构， 达成跨越血脑屏障的功效； 除了溶血拴与抗血栓以外， 还能够有效清除 OH、 NO和超氧阴离子等自由基； 且只需低剂 量即能有效溶血栓， 在稍高的剂量下则可以对 4小时以上的中风显示优秀的疗效， 具有良 好的临床应用前景。

Claims

权利要求书
Figure imgf000038_0001
其中， T代表具有至少两个连接用基团的连接臂； Q代表具溶血栓活性肽； R n R2代 表 — 4烷基， 其中 和1 2可为相同或不同。
2、 如权利要求 1所述的化合物， 其中至少一个所述连接用基团为氨基， 且其余连接用 基团为羧基或氨基。
3、 如权利要求 2所述的化合物， 其中所述连接臂为 L-Lys、 L-Asp或 L-Glu。
4、 如权利要求 1所述的化合物， 其中所述具溶血栓活性肽选自由含 PA CPro-Ala)序列、 PAK (Pro-Ala-Lys)序列、 AKP (Ala-Lys-Pro)序列或 KAP (Lys -Ala -Pro)序列的寡肽， 或包含 以 PAK序列、 AKP序列或 KAP序列为结构单元的重复序列肽所构成的群组。
5、 如权利要求 4所述的化合物， 其中所述含 PA (Pro-Ala)序列的寡肽为三肽， 且具有 以下通式 Q1或 Q2:
Pro-Ala- AA (Q1)
AA-Ala-Pro (Q2)
其中 AA选自由 L-Ala、 L-VaK L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp, 和 L-Glu所构成的群组。
6、 如权利要求 1所述的化合物， 其中 R n R2皆为甲基。
7、 如权利要求 6所述的化合物， 其中所述连接臂为 L-Lys、 L-Asp或 L-Glu， 且所述具 溶血栓活性肽为含 PA (Pro-Ala)序列的三肽。
8、 如权利要求 7所述的化合物， 具有以下通式 Ia、 Ib、 Ic、 Id、 Ie、 If、 Ig、 或 Ih:
Figure imgf000038_0002
Figure imgf000039_0001
其中 AA选自由 L-Ala、 L-Vak L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp,和 L-Glu所构成的群组。
9、 一种药物组合物， 其包含如权利要求 1至 8任一项所述的化合物， 及药学上可接受 的载剂。
10、 如权利要求 9所述的药物组合物， 其中所述化合物可形成纳米球结构。
11、如权利要求 9所述的药物组合物， 作为溶血栓药物、清除 NO自由基药物或抗血栓 药物。
12、 如权利要求 9所述的药物组合物， 作为治疗中风或脑梗药物。
13、 一种如权利要求 1所述通式 I化合物的制备方法， 所述制备方法包括以下步骤： ( 1 ) 提供通式 II化合物:
Figure imgf000040_0001
其中！^和 R2代表 d— 4烷基， 且！^和 R2可为相同或不同；
(2) 提供具有至少两个连接用基团的连接臂 T、 以及具溶血栓活性肽 Q， 其中所述连 接臂具有第一连接用基团与第二连接用基团；
( 3 )在适当反应条件下，连接通式 II化合物的羧基与所述连接臂 T的第一连接用基团， 形成通式 IM-1化合物：
Figure imgf000040_0002
(IM-1) ； 以及
(4) 在适当反应条件下， 连接所述具溶血栓活性肽 Q与通式 IM-1化合物， 其中所述 具溶血栓活性肽 Q的一端与所述连接臂 T的第二连接用基团相连接， 形成通式 I化合物。
14、 如权利要求 13所述的制备方法， 其中所述第一连接用基团为氨基， 且所述第二连 接用基团为羧基或氨基。
15、 如权利要求 14所述的制备方法， 其中所述连接臂为 L-Lys、 L-Asp或 L-Glu。
16、 如权利要求 13所述的制备方法， 其中所述具溶血栓活性肽选自由含 PA (Pro-Ala) 序列、 PAK (Pro-Ala-Lys)序歹 AKP (Ala-Lys-Pro)序列或 KAP (Lys -Ala -Pro)序列的寡肽， 或 包含以 PAK序列、 AKP序列或 KAP序列为结构单元的重复序列肽所构成的群组。
17、 如权利要求 16所述的制备方法， 其中所述含 PA (Pro-Ala)序列的寡肽为三肽， 且 具有以下通式 Q1或 Q2:
Pro-Ala- AA (Q1)
AA-Ala-Pro (Q2)
其中 AA选自由 L-Ala、 L-VaK L-Trp、 L-Tyr, L-Pro、 L-Phe、 Gly、 L-Ser、 L-Ile、 L-Thr、 L-Lys、 L-Leu、 L-Gln、 L-Asn 、 L-Asp、 和 L-Glu所构成的群组。
18、 如权利要求 13所述的制备方法， 其中 R n R2皆为甲基。
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