ES2847934T3 - Nuevos compuestos que tienen actividades triples de trombólisis, antitrombóticos y captadores de radicales, y síntesis, nanoestructura y uso de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula I: **(Ver fórmula)** en donde T representa un brazo conector que tiene al menos dos grupos para la conexión; Q representa un péptido que tiene actividad trombolítica; y R1 y R2 representan grupos alquilo C1-C4, en donde R1 y R2 son iguales o diferentes; en donde al menos uno de los grupos para la conexión es un grupo amino y los grupos restantes para la conexión son grupos carboxilo o grupos amino; y en donde el péptido que tiene actividad trombolítica se selecciona entre un grupo que consiste en un oligopéptido que contiene una secuencia PA (Pro-Ala), una secuencia PAK (Pro-Ala-Lys), una secuencia AKP (Ala-Lys-Pro) o una secuencia KAP (Lys-Ala-Pro), y un péptido que tiene unidades repetidas de la secuencia PAK, la secuencia AKP o la secuencia KAP.
Description
DESCRIPCIÓN
Nuevos compuestos que tienen actividades triples de trombólisis, antitrombóticos y captadores de radicales, y síntesis, nanoestructura y uso de los mismos
Antecedentes
Campo técnico
La presente invención se refiere a un nuevo compuesto que tiene simultáneamente funciones trombolíticas, captadoras de radicales libres y dirigidas a trombos/antitrombóticas, así como un método de preparación y usos del mismo. La presente invención se refiere adicionalmente a un nuevo producto conjugado binario formado por el acoplamiento de un oligopéptido trombolítico y un compuesto de tetrahidroisoquinolina que tiene dos grupos alquilo C1-C4 a través de un brazo conector. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el compuesto, un método de preparación y una nanoestructura del compuesto.
Descripción de la técnica relacionada
La tasa de incidencia de enfermedades trombóticas, tales como accidente cerebrovascular/infarto, ocupa el primer lugar en una variedad de enfermedades. Hay una tendencia creciente en la tasa de incidencia de las enfermedades en los últimos años, y las enfermedades se convierten en una seria amenaza para la salud humana. El tratamiento farmacológico de las enfermedades trombóticas es el foco y el punto clave del tratamiento de la trombosis. Actualmente, existen muchas limitaciones en los fármacos trombóticos aplicados clínicamente, y la búsqueda de un nuevo fármaco contra el trombo seguro y eficaz es uno de los puntos críticos de la investigación.
Según la presente investigación, además de las actividades antiplaquetarias y antitrombóticas, el ácido 3S-1,1-dimetil-6,7-dihidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico también tiene actividad de captación de radicales. Además, en la publicación de patente china CN101497651 B, presentada el 30 de enero de 2008 se describieron 10 compuestos de tetrahidroisoquinolina con actividad trombolítica. Estos compuestos de tetrahidroisoquinolina incluyen 3S-6,7-1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxi-isoquinolin-3-acil-Pro-Ala-Lys, 3S-6,7-1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxiisoquinolin-3-acil-Arg-Pro-Ala-Lys, 3S-6,7-1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxi-isoquinolin-3-acil-Ala-Arg-Pro-Ala-Lys, 3S-6,7-1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxi-isoquinolin-3-acil-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys, 3S-6,7-1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxiisoquinolin-3-acil-Gln-Arg-Pro-Ala-Lys, ácido 3S-2-[Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxi-isoquinolin-3-carboxílico, ácido 3S-2-[Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxi-isoquinolin-3-carboxílico, ácido 3S-2-[Ala-Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxiisoquinolin-3-carboxílico, ácido 3S-2-[Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxi-isoquinolin-3-carboxílico y ácido 3S-2-[Gln-Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxiisoquinolin-3-carboxílico. Los compuestos anteriores se abrevian como "6,7-dihidroxi-isoquinolinas que tienen actividad trombolítica". Sin embargo, las dosis efectivas de estas 6,7-dihidroxi-isoquinolinas que tienen actividad trombolítica son más altas, y la actividad antitrombótica y la actividad captadora de radicales libres no fueron descritas ni verificadas. Además, se demostró que la eficacia en el tratamiento del accidente cerebrovascular es efectiva solo en el momento de inicio del accidente cerebrovascular. En cuanto al tratamiento del accidente cerebrovascular más allá de los 30 minutos desde el inicio del síndrome, la eficacia no se divulgó ni se verificó. Por lo tanto, para el tratamiento eficaz y seguro de las enfermedades trombóticas en la práctica clínica, se necesita un compuesto novedoso que tiene simultáneamente actividades trombolíticas, antitrombóticas y de captación de radicales libres, puede cruzar eficazmente la barrera hematoencefálica (BHE) y puede lograr los efectos descritos a una dosis baja.
Compendio
La presente invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo a título informativo.
El primer aspecto de la presente invención consiste en proporcionar un compuesto que tiene la fórmula I:
en donde T representa un brazo conector que tiene al menos dos grupos para la conexión, Q representa un péptido que tiene actividad trombolítica, Ri y R2 representa grupos alquilo C1-C4, donde Ri y R2 puede ser igual o diferente. En una realización de la presente invención, al menos uno del grupo para la conexión del brazo conector T es un grupo amino, y los grupos restantes para la conexión son el grupo carboxilo o el grupo amino.
En una realización preferida de la presente invención, el brazo conector T puede ser un aminoácido natural, tal como L-Lys, L-Asp o L-Glu.
En una realización más preferida de la presente invención, el brazo conector puede ser L-Lys.
En una realización preferida de la presente invención, el péptido que tiene actividad trombótica utilizado en la presente invención se selecciona entre un grupo que consiste en un oligopéptido que tiene una secuencia PA (Pro Ala), una secuencia PAK (Pro-Ala-Lys), una Secuencia AKP (Ala-Lys-Pro) o una secuencia KAP (Lys-Ala-Pro), o un péptido que comprende unidades repetidas de la secuencia PAK, la secuencia AKP o la secuencia KAP.
En una realización de la presente invención, el oligopéptido que tiene actividad trombolítica puede ser un tripéptido a octapéptido que contiene una secuencia PA (Pro-Ala), una secuencia PAK, una secuencia AKP o una secuencia KAP, preferiblemente un tripéptido que contiene la secuencia PA. En una realización más preferida, el tripéptido tiene una fórmula química de Qi o q 2 que se muestra a continuación:
Pro-Ala-AA (Qi)
AA-Ala-Pro (Q2)
en donde AA se selecciona entre un grupo que consiste en L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-IIe, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp y L-Glu.
En una realización preferida, R1 y R2 son ambos grupos metilo.
En una realización preferida, los R1 y R2 de la fórmula I son grupos metilo, el brazo conector es L-Lys, L-Asp o L-Glu, y el péptido que tiene actividad trombolítica es un tripéptido que contiene una secuencia PA (Pro-Ala). Por ejemplo, el compuesto puede tener la fórmula la (tal como el compuesto 5Aa-p en la Fig.1), Ib (tal como el compuesto 5Ba-p en la Fig.2), Ic (tal como el compuesto 5Ca-p en la Fig.3), Id (tal como el compuesto 5Da-p en la Fig.4), le (tal como el compuesto 5Ea-p en la Fig.5), If (tal como el compuesto 5Fa-p en la Fig.6), Ig (tal como el compuesto 5Ga-p en la Fig.7), o Ih (tal como el compuesto 5Ha-p en la Fig.8):
en donde AA se selecciona entre un grupo que consiste en L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-IIe, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Aspy L-Glu.
El segundo aspecto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la presente invención descrito anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización preferida de la presente invención, los compuestos pueden estar en forma de estructura nanoesférica.
En una realización preferida de la presente invención, la composición farmacéutica se puede utilizar como un fármaco trombolítico, un fármaco captador de radicales libres de NO o un fármaco dirigido a trombos/antitrombótico. En otra realización preferida de la presente invención, la composición farmacéutica se puede utilizar como fármaco en el tratamiento del accidente cerebrovascular o infarto cerebral, más preferiblemente, en el tratamiento del accidente cerebrovascular o infarto cerebral después de 4 horas, 6 horas y 24 horas desde el inicio del síndrome. y tratamiento mediante administraciones sucesivas.
El tercer aspecto de la presente invención es proporcionar un método de preparación de los compuestos que tienen la fórmula I. El método comprende las siguientes etapas:
(1) proporcionar un compuesto que tiene la fórmula II:
en donde R1 y R2 son grupos alquilo C1-4 y R1 y R2 son iguales o diferentes.
(2) proporcionando el brazo conector T que tiene al menos dos grupos para la conexión, y el péptido Q tiene actividad trombolítica, teniendo el brazo conector un primer grupo para la conexión y un segundo grupo para la conexión.
(3) acoplar el grupo carboxilo del compuesto que tiene la fórmula II con el primer grupo para la conexión del brazo conector T para formar un compuesto que tiene la fórmula IM-1:
en condiciones de reacción apropiadas; y
(4) acoplar el péptido Q que tiene actividad trombolítica al compuesto que tiene la fórmula IM-1 en las condiciones de reacción adecuadas, en donde un extremo terminal del péptido Q que tiene actividad trombolítica se acopla al segundo grupo para la conexión del brazo conector T para formar el compuesto que tiene la fórmula I.
En una realización de la presente invención, el primer grupo para la conexión del brazo conector T es un grupo amino que se utiliza para acoplarse al grupo carboxilo del compuesto de fórmula II en una reacción de condensación. Además, el segundo grupo para la conexión es un grupo carboxilo o un grupo amino que se utiliza para acoplarse al extremo N-terminal o C-terminal del péptido Q que tiene actividad trombolítica. Las definiciones del brazo conector T y el péptido Q que tiene actividad trombolítica utilizadas en el método de preparación de la invención son las mismas que las definiciones del compuesto que tiene la fórmula I anterior.
En una realización preferida de la presente invención, el brazo conector en el presente método de preparación puede ser L-Lys, L-Asp o L-Glu, y más preferiblemente L-Lys. El péptido que tiene actividad trombolítica puede ser un tripéptido que contiene una secuencia PA (Pro-Ala), un oligopéptido que contiene una secuencia PAK (Pro-Ala-Lys), una secuencia AKP (Ala-Lys-Pro) o una secuencia KAP (Lys-Ala-Pro), o un péptido que tiene una secuencia repetida que contiene la secuencia PAK, la secuencia AKP o la secuencia KAP, y más preferiblemente un tripéptido que tiene una fórmula de Q1 o Q2 que se muestra a continuación:
Pro-Ala-AA (Q1)
AA-Ala-Pro (Q2)
en donde AA se selecciona entre un grupo que consiste en L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-IIe, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp y L-Glu.
En otra realización preferida de la presente invención, los R1 y R2 del compuesto que tiene la fórmula II son ambos grupos metilo, el brazo conector es L-Lys, L-Asp o L-Glu, y el péptido que tiene actividad trombolítica es un tripéptido que contiene una secuencia PA (Pro-Ala). En una realización más preferida de la presente invención, el método de preparación de la presente invención se puede utilizar para formar los compuestos que tienen las anteriores fórmulas la-h.
Las pruebas en vivo en ratas mostraron que los compuestos o las composiciones farmacéuticas de la presente invención tienen excelentes actividades trombolíticas y antitrombóticas a dosis bajas y pueden proteger eficazmente la función neurológica de las ratas con accidente cerebrovascular, por lo que pueden tratar enfermedades trombóticas de forma eficaz y segura en la práctica clínica.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un esquema de síntesis del compuesto Ia según una realización de la presente invención;
La FIG. 2 es un esquema de síntesis del compuesto Ib según una realización de la presente invención; La FIG. 3 es un esquema de síntesis del compuesto Ic según una realización de la presente invención; La FIG. 4 es un esquema de síntesis del compuesto Id según una realización de la presente invención; La FIG. 5 es un esquema de síntesis del compuesto. le según una realización de la presente invención; La FIG. 6 es un esquema de síntesis del compuesto. If según una realización de la presente invención; La FIG. 7 es un esquema de síntesis del compuesto. Ig según una realización de la presente invención; La Fig.8 es un esquema de síntesis del compuesto Ih según una realización de la presente invención; y La FIG. 9 muestra fotografías TEM de nanoestructuras de compuestos. 5Aa-p según una realización de la presente invención.
Descripción detallada
La descripción detallada proporcionada a continuación con relación a los dibujos y realizaciones adjuntos se utiliza para ilustrar la solución técnica de la presente invención.
En la presente invención, los compuestos de tetrahidroisoquinolina que tienen dos grupos alquilo C1 -C4 (es decir, el compuesto de fórmula II) y el péptido que tiene actividad trombolítica se acoplan mediante un brazo conector para formar un conjugado binario novedoso que tiene simultáneamente funciones triples de actividades trombolíticas, captadoras de radicales libres y dirigidas a trombos/antitrombóticas. El producto conjugado anterior se abrevia como "el nuevo producto conjugado binario de la presente invención" a continuación.
Dado que se introdujeron dos grupos alquilo C7C4 en la posición 1 y se introdujo un brazo conector en la posición 3 del compuesto de fórmula II, "el nuevo producto conjugado binario de la presente invención" tiene las siguientes cuatro ventajas, en comparación con "la 6,7-dihidroxiisoquinolina que tiene actividad trombolítica". 1) El efecto de impedimento estérico de los dos grupos alquilo C1 -C4 introducidos en la posición 1 del compuesto que tiene la fórmula II pueden bloquear el enfoque de la carboxipeptidasa y la aminopeptidasa, por lo que el oligopéptido tromobolítico del "nuevo producto conjugado binario de la presente invención" no se hidrolizará fácilmente; 2) la contribución hidrófoba de los dos grupos alquilo C1-C4 introducidos en la posición 1 del compuesto que tiene la fórmula II pueden permitir que "el nuevo producto conjugado binario de la presente invención" cruce la barrera hematoencefálica con mejor eficacia; 3) el efecto donante de electrones de los dos grupos alquilo C1 -C4 introducidos en la posición 1 del compuesto que tiene la fórmula II pueden permitir que la capacidad reductora del "nuevo producto conjugado binario de la presente invención" satisfaga la necesidad de captación de radicales libres; 4) el brazo conector introducido en la posición 3 del compuesto que tiene la fórmula II puede permitir que "el nuevo producto conjugado binario de la presente invención" se agregue de manera eficaz para formar estructuras nanoesféricas que tienen un diámetro de 20 a 210 nm, preferiblemente en un intervalo de 20-100 nm. Esta nanoestructura estable puede ayudar al "nuevo producto conjugado binario de la presente invención" a no ser engullido por macrófagos en la circulación sanguínea, por lo que puede ser transportado de forma segura hacia el sitio de formación del trombo y finalmente cruzar la barrera hematoencefálica. En resumen, "el nuevo producto conjugado binario de la presente invención" puede formar una nanoestructura para lograr la función de cruzar la barrera hematoencefálica. Además de las funciones trombolíticas y antitrombóticas, "el nuevo producto conjugado binario de la presente invención" también puede eliminar eficazmente los radicales libres de los aniones OH, NO y superóxido, y puede lograr una trombólisis eficaz a dosis bajas, lo que brinda buenas perspectivas de aplicación clínica.
Como se utiliza en la presente memoria, "grupo conector" significa un grupo funcional, tal como un grupo carboxilo o un grupo amino, capaz de realizar una reacción de condensación.
Como se utiliza en la presente memoria, "brazo conector" significa una molécula que tiene los grupos para la conexión, capaz de acoplar el compuesto que tiene la fórmula II con el oligopéptido Q que tiene actividad trombolítica. Al menos un grupo para la conexión del brazo conector es un grupo amino, y los grupos restantes para la conexión son grupos carboxilo o grupos amino. Según la invención, el brazo conector puede ser un aminoácido natural, tal como L-Lys, L-Asp o L-Glu.
El brazo conector introducido permite que "el nuevo producto conjugado binario de la presente invención" forme una estructura nanoesférica estable que no sea engullida por macrófagos. La estructura nanoesférica puede transportarse de manera segura hacia el sitio de formación del trombo y finalmente cruzar la barrera hematoencefálica. Especialmente, cuando el brazo conector es L-Lys, "el nuevo producto conjugado binario de la presente invención" puede agregarse eficazmente para formar estructuras nanoesféricas que tienen un diámetro de 20-210 nm, preferiblemente en un intervalo de 20-100 nm. La nanoestructura estable puede ayudar a evitar que "el nuevo producto conjugado binario de la presente invención" sea engullido por macrófagos en la circulación sanguínea, para permitir su transporte seguro hacia el sitio de formación del trombo y, finalmente, cruzar la barrera hematoencefálica.
Como se utiliza en la presente memoria, un "oligopéptido" significa una pequeña molécula de péptido que tiene un
peso molecular por debajo de 1000 Dalton (D) y que normalmente consta de 3 a 8 aminoácidos.
Como se utiliza en la presente memoria, un "péptido que tiene actividad trombolítica" significa un agente trombolítico oligopéptido que tiene funciones de aumento de la permeabilidad vascular y trombólisis, incluyendo P6A (ARPAK), metabolitos de P6A y derivados relacionados. Un estudio anterior ha revelado que Pro-Ala-Lys era la secuencia más corta con buena actividad, y también la secuencia más estable entre varios oligopéptidos tromobolíticos, incluidos Ala-Arg-Pro-Ala-Lys, Gly-Arg-Pro-Ala-Lys, Gln-Arg-Arg-Pro-Ala-Lys y Pro-Ala-Lys. La introducción de un tripéptido que tiene la secuencia Pro-Ala-AA en la posición 3 del compuesto que tiene la fórmula II a través del brazo conector puede permitir que "el nuevo producto conjugado binario de la presente invención" obtenga una mejor estabilidad y una actividad trombolítica más fuerte.
Por ejemplo, un oligopéptido que contiene la secuencia de PAK, AKP o KAP utilizado en la presente invención puede ser PAK, RPAK (Arg-Pro-Ala-Lys), ARPAK (Ala-Arg-Pro-Ala-Lys), GRPAK (Gly-Arg-Pro-Ala-Lys), QRPAK (Gln-Arg-Pro-Ala-Lys), AKP, KAP, KPAK (Lys-Pro-Ala-Lys), PAKP (Pro-Ala-Lys-Pro), AKPAK (Ala-Lys-Pro-Ala-Lys) o PAKPA (Pro-Ala-Lys-Pro-Ala).
Por ejemplo, el péptido que tiene unidades repetidas de la secuencia PAK, la secuencia AKP o la secuencia KAP utilizada en la presente invención puede ser cualquiera de los péptidos que se describen en la publicación de patente china CN101190941 como péptido que tiene actividad trombolítica, incluyendo un péptido que tiene unidades repetidas de la secuencia PAK, tal como (PAK)2 , (PAK)3, (PAK)4, (PAK)5 y (PAK)6 ; un péptido que tiene unidades repetidas de la secuencia de AKP, tal como (AKP)2 , (AKP)3, (AKP)4, (AKP)5 y (AKP)6 ; y un péptido que tiene unidades repetidas de la secuencia KPA, tal como (KPa )2 , (KPA)3 , (KPA)4, (KpA)5 y (KPA)a.
Como se utiliza en la presente memoria, "grupo alquilo C1-C4" significa un grupo alquilo que tiene 1-4 carbonos, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo o sec-butilo, terc-butilo. Cuando R1 y R2 del compuesto que tiene la fórmula I son ambos grupos metilo, el compuesto que tiene la fórmula II, utilizado como material de partida, se puede obtener por condensación Pictet-Spengler de 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina y acetona en presencia de trifluoroacetato (TFA) y sulfato de magnesio anhidro. La ventaja es una preparación más sencilla.
En la presente invención, una composición farmacéutica puede ser cualquier formulación clínicamente aceptable y adecuada. Preferiblemente, las formulaciones son formulaciones inyectables (polvo para inyectables, polvo liofilizado para inyectables, líquido para inyectables, infusión, etc.). El portador farmacéuticamente aceptable puede ser manitol, agua, solución de Ringer o solución isotónica de cloruro de sodio, etc.
La estructura nanoesférica de los compuestos de acuerdo con la presente invención tiene un diámetro de 20 a 210 nm y más preferiblemente de 20 a 100 nm, por lo que los compuestos pueden cruzar la barrera hematoencefálica de manera más eficiente.
La nanoestructura estable puede ayudar a que los compuestos de la presente invención no sean engullidos por macrófagos, por lo que los compuestos pueden transportarse de forma segura hacia el sitio de formación de la trombosis y finalmente cruzar la barrera hematoencefálica. La composición farmacéutica de la presente invención se puede utilizar como fármacos trombolíticos en el tratamiento de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular isquémico, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, enfermedad oclusiva arterial periférica, dispositivos de acceso vascular central ocluidos, fístula y derivaciones arteriovenosas coaguladas, estenosis carotídea, etc. La composición farmacéutica de esta invención también se puede utilizar como un fármaco captador de radicales libres de No en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades mentales, mal de altura, diabetes, artritis reumatoide, lesión cerebral traumática, cáncer, síndrome de x frágil, enfermedad de células falciformes, liquen plano, vitíligo, síndrome de fatiga crónica, etc. La composición farmacéutica de la presente invención también se puede utilizar como fármaco antitrombótico/dirigido a trombos en el tratamiento de trombocitosis, enfermedad mieloproliferativa, policitemia vera, síndrome de Budd-Chiari, etc.
Las composiciones/compuestos farmacéuticos de la presente invención tienen simultáneamente funciones de captación de radicales libres aniónicos de OH, No y superóxido, trombolíticas, así como dirigidas a trombos/antitrombóticas. Por consiguiente, pueden seguir siendo terapéuticamente eficaces en pacientes más allá de las 4 horas desde el inicio de los síntomas del accidente cerebrovascular, es decir, su uso no está limitado por la ventana de tratamiento de 3 horas del tPA. Además, el uso de las composiciones/compuestos farmacéuticos de la presente invención no provocará reacciones de hemorragia sistémica como lo hace el tPA, y puede eliminar la enorme cantidad de radicales libres de aniones OH, NO y superóxido durante el proceso de isquemia-reperfusión para prevenir daños en el tejido cerebral de los pacientes en tratamiento. Dado que los dos grupos alquilo C1 -C4 y el brazo conector se introducen respectivamente en las posiciones 1 y 3 de los compuestos que tienen la fórmula II, en comparación con "la 6,7-dihidroxiisoquinolina que tiene actividad trombolítica", "el nuevo producto conjugado binario de la presente invención" muestra un mejor actividad trombolítica, de captación de radicales libres únicos y actividad antitrombótica a una dosis baja, así como un excelente efecto terapéutico en el tratamiento del accidente cerebrovascular más allá de las 4 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular con una dosis más alta.
En la Patente China emitida, Núm. CN101497651 B, se demostró que "la 6,7-dihidroxiisoquinolina que tiene actividad trombolítica" tiene actividad trombolítica a una dosis de 10 nmoles/kg. Sin embargo, los compuestos de la presente invención tienen una buena actividad trombolítica y antitrombótica a una dosis de 0,1 nmoles/kg. Además, los compuestos de la presente invención tienen un efecto terapéutico significativo en el tratamiento del accidente cerebrovascular más allá de las 4, 6 y 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular a una dosis de 1,2, 5 y 5 ^moles/kg, respectivamente.
En el método de preparación de los compuestos de la presente invención, el péptido Q que tiene actividad trombolítica puede prepararse primero y a continuación, acoplarse al segundo grupo para la conexión del brazo conector T, alternativamente, uno o más de los aminoácidos del péptido Q que tiene actividad trombolítica se puede acoplar secuencialmente al brazo conector T en un orden predeterminado. Por ejemplo, el primer aminoácido en un extremo terminal del péptido trombolítico Q se acopla al segundo grupo para la conexión del brazo conector T, y a continuación, uno o más del resto de los aminoácidos se acoplan secuencialmente al mismo.
El método de preparación de la presente invención se describe con más detalle a continuación para una mayor comprensión.
El compuesto de fórmula II se puede preparar mediante la siguiente ruta de síntesis:
donde Ri y R2 son ambos grupos alquilo Ci-C4 y pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, la 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (SM-1) y el compuesto s M-2 se disuelven en TFA, y la 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina y SM-2 se someten a condensación de Pictet-Spengler para obtener el compuesto que tiene la fórmula II en presencia de sulfato de magnesio anhidro.
En una realización preferida, el brazo conector en el método de preparación de la invención es L-Lys, y el péptido que tiene actividad trombolítica es un tripéptido que tiene una secuencia de PA (Pro-Ala). Por ejemplo, el grupo carboxilo del compuesto II se acopla a un extremo N-terminal de L-Lys, y a continuación, el tripéptido que contiene la secuencia PA se acopla al resto N-terminal o al C-terminal del brazo conector L-Lys. En algunas realizaciones, cuando los R1 y R2 son ambos un grupo metilo (es decir, ácido 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acilcarboxílico), el brazo conector es L-Lys, y el péptido que tiene actividad trombolítica es el tripéptido que contiene la secuencia Pa (Pro-Ala), el compuesto Ia, Ib, Ic o Id se puede obtener de acuerdo con el método de preparación de la presente invención.
Cuando el compuesto se prepara según el método de preparación de la presente invención, se puede hacer referencia a la ruta de síntesis descrita en la Fig. 1.
En la realización que se muestra en la Fig.1, primero se sintetiza el tripéptido que contiene la secuencia de PA y a continuación, se acopla al brazo conector de L-Lys, en donde el AA se selecciona entre restos L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-IIe, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp y L-Glu (respectivamente correspondiente a compuestos 5Aa-p). Las condiciones de reacción se enumeran a continuación: i) Acetona, TFA, MgSO4; ii) HCl, Lys(Boc)-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) HCl/AE 4 M, baño de hielo; iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; HCl/AE 4 M, baño de hielo; vi) EtOH, Pd/C; vii) NaOH 2M. En otra realización, un aminoácido del tripéptido que contiene la secuencia PA (tal como AA) se acopla al brazo conector de L-Lys, y a continuación, los dos aminoácidos restantes (tales como Pro-Ala) del tripéptido que contienen la secuencia Pa se acoplan a AA.
Por ejemplo, en una realización para formar el compuesto Ia, el método de preparación de la presente invención puede incluir las siguientes etapas:
1) En presencia de TFA y sulfato de magnesio anhidro, la 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina y la acetona se someten a condensación de Pictet-Spengler para obtener ácido 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico;
2) En presencia de diciclohexil carbodiimida (DCC) y N-hidroxibenzotriazol triazol (HOBt), ácido 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-carboxílico y HCKys(Boc)-OBzl, se condensaron en N,Ndimetilformamida (DMF) anhidra, para formar 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys(Boc)-Obzl. En la reacción de condensación, se utilizó N-metilmorfolina (NMM) para ajustar constantemente la mezcla a pH = 9;
3) Eliminar Boc de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys(Boc)-OBzl en una solución de acetato de etilo de HCl para obtener 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys-OBzl;
4) En presencia de DCC y HOBt, se condensó Boc-Pro con Tos^Ala-Obzl, en THF anhidro, para formar Boc-Pro-Ala-OBzl;
5) En EtOH, el Boc-Pro-Ala-OBzl se hidrogenolizó para formar Boc-Pro-Ala;
6) En presencia de DCC y HOBt, Boc-Pro-Ala se condensó con AA-Obzl, en THF anhidro, para formar Boc-Pro-Ala-AA-OBzl (AA se selecciona entre restos de L-Ala, Gly, L-Phe, L-Val, L-Leu, L-IIe, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-Lys (Z), L-Pro, L-Asn y L-Gln);
7) En EtOH, el Boc-Pro-Ala-AA-OBzl de la etapa 6 se hidrogenolizó para formar Boc-Pro-Ala-AA;
8) En presencia de DCC y HOBt, se condensó 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys-OBzl con Boc-Pro-Ala-AA de la etapa 6, en DMF anhidro, para formar 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-AA)-OBzl (la definición de AA es la misma que en la etapa 6);
9) En presencia de DCC y HOBt, se condensó 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys-OBzl con Boc-AA(OBzl), en DMF anhidra, para formar 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys [Boc-AA (OBzl)]-OBzl (AA se selecciona entre restos de L-Asp, L-Glu);
10) En una solución en acetato de etilo de HCl, se eliminó Boc de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys [Boc-AA (OBzl)]-OBzl para formar 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro isoquinolin-3-acil-Lys [Aa (OBzl)]-OBzl (la definición de AA es la misma que en la etapa 9);
11) En presencia de DCC y HOBt, se condensó 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys [AA(OBzl)]-OBzl con Boc-Pro-Ala, en DMF anhidro, para formar 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys[Boc-Pro-Ala-AA(OBzl)]-OBzl (la definición de AA es la misma que en la etapa 9);
12) Después de la hidrogenolisis y la captación de Boc, tanto 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-AA)-OBzl (la definición de AA es la misma que en la etapa 6) como 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-acil-Lys [Boc-Pro-Ala-AA(OBzl)]-OBzl (la definición de AA es la misma que en la etapa 9) se desprotegieron para obtener 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-acil-Lys(Pro-Ala-AA).
Cuando el compuesto Ib de la presente invención se prepara de acuerdo con el método de preparación de la presente invención, se puede hacer referencia a la ruta de síntesis que se muestra en la Fig.2, en donde AA se selecciona entre restos de L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-IIe, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp y L-Glu (respectivamente correspondientes a compuestos 5Ba-p). Las condiciones de reacción se enumeran a continuación: i) Acetona, TFA, MgSO4; ii) HCl, Lys(Boc)-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) EtOH, Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; HCl/AE 4 M, baño de hielo; vi) EtOH, Pd/C; vii) HCl/AE 4 M, baño de hielo.
Cuando el compuesto Ic de la presente invención se prepara de acuerdo con el método de preparación de la presente invención, se puede hacer referencia a la ruta de síntesis mostrada en la Fig.3, en donde AA se selecciona entre un resido de L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-IIe, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp y L-Glu (respectivamente correspondientes a compuestos 5Ca-p). Las condiciones de reacción se enumeran a continuación: i) Acetona, TFA, MgSO4; ii) HCl, Boc-Lys-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) HCl/AE 4 M, baño de hielo; iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; HCl/AE 4 M, baño de hielo; vi) EtOH, Pd/C; vii) EtOH, Pd/C.
Cuando el compuesto Id de la presente invención se prepara de acuerdo con el método de preparación de la presente invención, se puede hacer referencia a la ruta de síntesis que se muestra en la Fig. 4, en donde AA se selecciona entre restos de L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-IIe, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp y L-Glu (respectivamente correspondientes a compuestos 5Da-p). Las condiciones de reacción se enumeran a continuación: i) Acetona, TFA, MgSO4; ii) HCl, Boc-Lys-OBzl, dCC, HOBt, NMM; iii) EtOH, Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; HCl/AE 4 M, baño de hielo; vi) EtOH, Pd/C; vii) EtOH, Pd/C.
En otra realización preferida, el brazo conector es L-Asp, y el péptido que tiene actividad trombolítica es un tripéptido que contiene una secuencia PA (Pro-Ala). Por ejemplo, el grupo carboxilo del compuesto que tiene la fórmula II se acopla al extremo N-terminal de L-Asp, y a continuación, el tripéptido que contiene la secuencia PA se acopla a uno de los restantes extremos N-terminales del brazo conector de L-Asp. En algunas realizaciones, cuando los R1 y R2 del compuesto que tiene la fórmula II son ambos un grupo metilo (es decir, ácido 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acilcarboxílico), el brazo conector es L-Asp, y el péptido que tiene actividad trombolítica es el tripéptido que contiene la secuencia PA (Pro-Ala), el método de preparación de la presente invención puede formar los compuestos le o If anteriores.
Cuando el compuesto Ie de la presente invención se prepara de acuerdo con el método de preparación de la presente invención, se puede hacer referencia a la ruta de síntesis mostrada en la Fig.5, en donde AA se selecciona
entre restos de L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-IIe, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp y L-Glu (respectivamente correspondientes a compuestos 5Ea-p). Las condiciones de reacción se enumeran a continuación: i) Acetona, TFA, MgSO^ ii) HCl, Asp(OCH3)-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) EtOH, Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; NaOH 2 M, baño de hielo; vi) EtOH, Pd/C; vii) HCl/AE 4 M, baño de hielo.
Cuando compuesto If de la presente invención se prepara de acuerdo con el método de preparación de la presente invención, se puede hacer referencia a la ruta de síntesis mostrada en la Fig.6, en donde AA se selecciona entre L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-IIe, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp y L-Glu (respectivamente correspondientes a compuestos 5Fa-p). Las condiciones de reacción se enumeran a continuación: i) Acetona, TFA, MgSO4; ii) HCl, Asp(OBzl)-OCH3 , DCC, HOBt, NMM; iii) NaOH 2 M, iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; NaOH 2 M, baño de hielo; vi) EtOH, Pd/C; vii) HCl/AE 4 M, baño de hielo.
En otra realización preferida de la presente invención, el brazo conector es L-Glu y el péptido que tiene actividad trombolítica es un tripéptido que contiene una secuencia PA (Pro-Ala). Por ejemplo, el grupo carboxilo del compuesto que tiene la fórmula II se acopla al extremo N-terminal de L-Glu, y a continuación, el tripéptido que contiene la secuencia PA se acopla a uno de los restantes extremos N-terminales del brazo conector de L-Glu. En algunas realizaciones, cuando los R1 y R2 del compuesto que tiene la fórmula II son ambos grupos metilo (es decir, ácido 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acilcarboxílico), el brazo conector es L-Glu, y el péptido que tiene actividad trombolítica es el tripéptido que contiene la secuencia PA (Pro-Ala), el método de preparación de la presente invención puede formar los compuestos Ig o Ih anteriores.
Cuando compuesto Ig de la presente invención se prepara de acuerdo con el método de preparación de la presente invención, se puede hacer referencia a la ruta de síntesis mostrada en la Fig. 7, en donde AA se selecciona entre restos de L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-IIe, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp y L-Glu (respectivamente correspondientes a compuestos 5Ga-p). Las condiciones de reacción se enumeran a continuación: i) Acetona, TFA, MgSO4; ii) HCl, Glu(OCHa )-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) EtOH, Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM; v) EtOH, Pd/C; NaOH 2 M, baño de hielo; vi) EtOH, Pd/C; vii) HCl/AE 4 M, baño de hielo.
Cuando compuesto Ih de la presente invención se prepara de acuerdo con el método de preparación de la presente invención, se puede hacer referencia a la ruta de síntesis mostrada en la Fig.8, en donde AA se selecciona entre restos de L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-IIe, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp y L-Glu (respectivamente correspondientes a compuestos 5Ha-p). Las condiciones de reacción se enumeran a continuación: i) Acetona, TFA, MgSO4; ii) HCl, Glu(OBzl)-OCH3, DCC, HOBt, NMM; iii) EtOH, Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM; v) EtOH, Pd/C; NaOH 2 M, baño de hielo; vi) EtOH, Pd/C; vii) HCl/AE 4 M, baño de hielo.
Las pruebas in vivo en ratas de los compuestos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención muestran que los compuestos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención tienen una excelente actividad trombolítica y antitrombótica a dosis bajas y pueden proteger eficazmente las funciones neurológicas de las ratas con accidente cerebrovascular. Por tanto, los compuestos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden tratar de forma eficaz y segura las enfermedades trombóticas en la práctica clínica.
La presente invención se describirá ahora en relación con los siguientes ejemplos específicos, y las ventajas y características de la misma resultarán evidentes a la vista de la descripción.
Los Ejemplos 1-68 ilustran los métodos de preparación de la Fig. 1 para preparar compuestos 5Aa-p de la presente invención.
Ejemplo 1: Procedimiento general de síntesis de péptidos en fase líquida
Se disolvió un aminoácido que tenía un extremo N-terminal protegido en tetrahidrofurano anhidro (THF) y la solución obtenida se añadió a N-hidroxibenzotriazol triazol (HOBt). A esto se le añadió lentamente la solución de N,N-diciclohexil carbodiimida (DCC) disuelta en THF anhidro en un baño de hielo, y a continuación, se agitó a 0°C durante 15 minutos para obtener la solución de reacción (I). También se disolvió un aminoácido que tenía un extremo C-terminal protegido en THF anhidro mientras se ajustaba a pH 9 mediante N-metilmorfolina (NMM), y a continuación, se mezcló con la solución de reacción (I) mientras se mantenía a pH 9 mediante N-metilmorfolina (NMM). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 horas y el progreso de la reacción se controló mediante TLC. Hasta que desapareció la mancha de material de partida como se muestra mediante TLC, la mezcla de reacción se filtró y el producto filtrado se concentró a presión reducida. El producto concentrado viscoso obtenido se disolvió con acetato de etilo (AE) o diclorometano, la solución obtenida se lavó secuencialmente con una solución acuosa de NaHCO3 al 5%, solución acuosa KHSO45% y solución acuosa saturada de NaCl. La fase de AE o diclorometano se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el producto filtrado se concentró a presión reducida para obtener el compuesto objetivo.
Ejemplo 2: Procedimiento general para eliminar Boc
El péptido protegido con Boc se disolvió con una pequeña cantidad de acetato de etilo anhidro, se añadió una solución de acetato de etilo de HCl (4 M) y se agitó en un baño de hielo hasta que la mancha del material de partida desapareció como se muestra mediante TLC. La solución de reacción se secó repetidamente mediante una bomba de agua y también se eliminó completamente el gas HCl. El residuo se trituró con éter de petróleo o éter anhidro repetidamente para obtener los compuestos objetivo.
Ejemplo 3: Procedimiento general para eliminar el grupo éster bencílico
El polipéptido con el grupo éster bencílico protegido se disolvió mediante CH3OH, se añadió gota a gota una solución acuosa de NaOH (2 M) y se agitó en un baño de hielo, la solución de reacción se mantuvo a 0°C hasta que la mancha del material de partida desapareció como se muestra mediante TLC. La solución de reacción se ajustó a neutralidad con HCl 1 M y el MeOH se eliminó a presión reducida. La solución de reacción se aciduló a pH 2 con HCl 1 M y a continuación, se extrajo con AE. La fase de AE combinada se lavó con una solución acuosa saturada de NaCl hasta neutralidad, se secó con Na2SO4 anhidro y se filtró. El producto filtrado producto se concentró a presión reducida para obtener los compuestos objetivo.
Ejemplo 4: Procedimiento general para eliminar el grupo carbobenzoxi o el grupo éster bencílico
El péptido protegido con el grupo carbobenzoxi o el grupo éster bencílico se disolvió en una cantidad adecuada de EtOH, se añadió Pd/C (10% de reaccionantes) y se introdujo hidrógeno para realizar la reacción de hidrogenolisis a temperatura ambiente. Después de la reacción, la mezcla de reacción se filtró y a continuación, se concentró a presión reducida para obtener el compuesto objetivo.
Ejemplo 5: Preparación de Boc-Pro
Se disolvieron 5,75 g (50 mmoles) de L-Pro en 1 mL de agua. Se añadieron gota a gota 25 mL de solución acuosa de NaOH (2 M) y se agitó lentamente en un baño de hielo para obtener la solución (I). Se disolvieron 13,08 g (60 mmoles) de (Boc)2O en 25 mL de dioxano para obtener la solución (II). Se añadió gota a gota la solución (II) a la solución (I) y se agitó en un baño de hielo, y a continuación, se añadió gota a gota una solución acuosa de NaOH (2 M) para ajustar el pH 9, y la mezcla se agitó en un baño de hielo. Después de 30 minutos, se midió el valor de pH de la mezcla y se utilizó una solución acuosa de NaOH (2 M) para mantener el valor de pH en 9. Se utilizó una bomba de agua para extraer el gas generado. Después de agitar durante 48 horas, el control mediante TLC (CH2Ch:MeOH 20:1) mostró que se había completado la reacción. La mezcla se concentró a presión reducida para eliminar el dioxano. El residuo se disolvió en 5 mL de agua y a continuación, se ajustó a pH 2 con una solución acuosa saturada de KHSO4. La solución acuosa se extrajo con AE 3 veces. La fase de AE combinada se lavó con KHSO4 al 5% 3 veces y a continuación, se lavó con una solución acuosa saturada de NaCl hasta neutralidad. La capa de AE separada se secó añadiendo sulfato de sodio anhidro y a continuación, se filtró. El producto filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se recristalizó con AE-éter de petróleo para obtener 10,2 g (95%) del compuesto del título en forma de un cristal incoloro. ESI-MS (m/e): 214 [M-H].
Ejemplo 6: Preparación de Boc-Pro-Ala-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 5,19 g (68%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 4,3 g (20,0 mmoles) de Boc-Pro y 8,45 g (24,0 mmoles) de Tos-Ala-OBzl. ESI-EM (m/e): 377 [M H]+ .
Ejemplo 7: Preparación de Boc-Pro-Ala
Siguiendo el método del Ejemplo 4, se prepararon 3,59 g (91%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 5,19 g (13,8 mmoles) de Boc-Pro-Ala-OBzl. ESI-EM (m/e): 285 [M-H]- .
Ejemplo 8: Preparación de Boc-Pro-Ala-Ala-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 3,04 g (68%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,00 g (10,49 mmoles) de Boc-Pro-Ala-OBzl y 3,26 g (12,03 mmoles) de Tos-Ala-OBzl. ESI-EM (m/e): 448 [M H]+ .
Ejemplo 9: Preparación de Boc-Pro-Ala-Ala
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 3,21 g (90%) del compuesto del título a partir de 4,47 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Ala-OBzl. ESI-e M (m/e): 356 [M-H]- .
Ejemplo 10: Preparación de Boc-Pro-Ala-Val-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 3,28 g (69%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,00 g (10,49 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 3,58 g (12,01 mmoles) de TosVal-OBzl. ESI-EM (m/e): 476 [M H]+.
Ejemplo 11: Preparación de Boc-Pro-Ala-Val
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 3,54 g (92%) del compuesto del título a partir de 4,75 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Val-OBzl. ESI-EM (m/e): 384 [M-H]-.
Ejemplo 12: Preparación de Boc-Pro-Ala-Trp-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 3,65 g (65%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,00 g (10,49 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 3,97 g (12,01 mmoles) de HClTrp-OBzl. ESI-EM (m/e): 563 [M H]+.
Ejemplo 13: Preparación de Boc-Pro-Ala-Trp
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 4,21 g (89%) del compuesto del título a partir de 5,62 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Trp-OBzl. ESI-EM (m/e): 471 [M-H]-.
Ejemplo 14: Preparación de Boc-Pro-Ala-Tyr-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 3,73 g (69%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,15 g (11 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 4,43 g (10 mmoles) de TosTyr-OBzl. ESI-MS (m/e): 540 [M H]+.
Ejemplo 15: Preparación de Boc-Pro-Ala-Tyr
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 4,13 g (92%) del compuesto del título a partir de 5,39 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Tyr-OBzl. ESI-EM (m/e): 448 [M-H]-.
Ejemplo 16: Preparación de Boc-Pro-Ala-Phe-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 3,82 g (66%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,00 g (10,0 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 2,92 g (11,0 mmoles) de TosPhe-OBzl. ESI-MS (m/e): 524 [M H]+.
Ejemplo 17: Preparación de Boc-Pro-Ala-Phe
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 3,94 g (91%) del compuesto del título a partir de 5,23 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Phe-OBzl. ESI-EM (m/e): 432 [M-H]-.
Ejemplo 18: Preparación de Boc-Pro-Ala-Gly-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 2,90 g (67%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,15 g (11 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 3,37 g (10 mmoles) de TosGly-OBzl. ESI-EM (m/e): 434 [M H]+.
Ejemplo 19: Preparación de Boc-Pro-Ala-Gly
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 2,98 g (87%) del compuesto del título a partir de 4,33 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Gly-OBzl. ESI-MS (m/e): 342 [M-H]-.
Ejemplo 20: Preparación de Boc-Pro-Ala-Ser-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 2,92 g (63%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,15 g (11 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 3,67 g (10 mmoles) de TosSer-OBzl. ESI-EM (m/e): 464 [M H]+.
Ejemplo 21: Preparación de Boc-Pro-Ala-Ser
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 3,28 g (88%) del compuesto del título a partir de 4,63 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Ser-OBzl. ESI-EM (m/e): 372 [M-H]-.
Ejemplo 22: Preparación de Boc-Pro-Ala-Ile-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 3,33 g (65%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,15 g (11 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 3,93 g (10 mmoles) de TosIle-OBzl. ESI-MS (m/e): 490 [M HJ+.
Ejemplo 23: Preparación de Boc-Pro-Ala-Ile
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 3,67 g (91%) del compuesto del título a partir de 4,89 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Ile-OBzl. ESI-EM (m/e): 398 [M-H]-.
Ejemplo 24: Preparación de Boc-Pro-Ala-Thr-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 3,39 g (71%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,15 g (11 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 3,81 g (10 mmoles) de TosThr-OBzl. ESI-EM (m/e): 478 [M H]+.
Ejemplo 25: Preparación de Boc-Pro-Ala-Thr
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 3,56 g (91%) del compuesto del título a partir de 4,77 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Thr-OBzl. ESI-EM (m/e): 386 [M-H]-.
Ejemplo 26: Preparación de Boc-Pro-Ala-Lys (Z)-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 4,15 g (65%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,15 g (11 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 4,06 g (10 mmoles) de HClLys (Z)-OBzl. ESI-MS (m/e): 639 [M H]+.
Ejemplo 27: Preparación de Boc-Pro-Ala-Lys (Z)
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 4,71 g (86%) del compuesto del título a partir de 6,39 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl. ESI-EM (m/e): 547 [M-H]-.
Ejemplo 28: Preparación de Boc-Pro-Ala-Leu-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 3,37 g (69%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,15 g (11 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 3,93 g (10 mmoles) de TosLeu-OBzl. ESI-MS (m/e): 490 [M H]+.
Ejemplo 29: Preparación de Boc-Pro-Ala-Leu
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 3,67 g (91%) del compuesto del título a partir de 4,89 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Leu-OBzl. ESI-EM (m/e): 398 [M-H]-.
Ejemplo 30: Preparación de Boc-Pro-Ala-Gln-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 3,23 g (63%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,15 g (11 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 2,73 g (10 mmoles) de HClGln-OBzl. ESI-MS (m/e): 505 [M H]+.
Ejemplo 31: Preparación de Boc-Pro-Ala-Gln
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 3,73 g (90%) del compuesto del título a partir de 5,04 g (10 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Gln-OBzl. ESI-EM (m/e): 413 [M-H]-.
Ejemplo 32: Preparación de Boc-Pro-Ala-Asn-OBzl
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 3,04 g (61%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 3,15 g (11 mmoles) de Boc-Pro-Ala y 2,59 g (10 mmoles) de HClAsn-OBzl. ESI-EM (m/e): 491 [M H]+.
Ejemplo 33: Preparación de Boc-Pro-Ala-Asn
Siguiendo el método del Ejemplo 3, se prepararon 3,67 g (92%) del compuesto del título a partir de 4,90 g (10
mimóles) de Boc-Pro-Ala-Asn-OBzl. ESI-EM (m/e): 399 [M-H]".
Ejemplo 34: Preparación de ácido 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-carboxílico (1) Se disolvieron 5.0 g (25 mimóles) de 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina en 250 mL de acetona y a continuación, se añadieron 6,0 g (30 mmoles) de sulfato de magnesio anhidro a la solución obtenida. Después de 30 minutos, se añadieron 25 mL de TFA en un baño de hielo. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 96 horas hasta que desapareció la mancha del material de partida como se muestra mediante TLC (CH2Ch:MeOH 1:1). La solución de reacción se filtró. El producto filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se disolvió en acetona y continuó concentrándose a presión reducida durante 3 veces. Se añadieron 200 mL de éter anhidro al residuo para precipitar una cantidad masiva de sólido incoloro. Después de la filtración con succión, se obtuvieron 5,8 g (95%) del compuesto del título en forma de un sólido incoloro. ESI-EM (m/e): 238 [M H]+; RMN H1 (300 MHz, DMSO-cfe) 5/ppm = 6,61 (s, 1H), 6,45 (s, 1H), 3,70 (dd, J = 3,9, 11,4 Hz, 1H), 2,76 (dd, J = 11,7, 15,3 Hz, 1H), 2,62 (m, 1H), 1,41 (s, 3H), 1,32 (s, 3H).
Ejemplo 35: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc)-OBzl (2) Siguiendo el método del Ejemplo 1, se disolvieron 1,19 g (5,01 mmoles) de ácido 3S-6,7-dihidroxi-1,1-diimetiM,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-carboxílico en 10 mL de DMF anhidra. Se añadieron 675 mg (5,00 mmoles) de N-hidroxibenzotriazol triazol (HOBt) a la solución obtenida. Después de 10 minutos, se añadió una solución de 1,20 g (5,83 mmoles) de diciclohexil carbodiimida (DCC) y 5 mL de DMF anhidra en un baño de hielo para obtener la solución de reacción (I). Se disolvieron 2,83 g (5,53 mmoles) de HClLys(Boc)-OBzl en 15 mL de DMF anhidra y a continuación, se agitó durante 30 minutos para obtener la solución de reacción (II). La solución de reacción (II) se añadió a la solución de reacción (I) mientras se agitaba en un baño de hielo. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas y se ajustó a pH = 9 utilizando MMM cuando fue necesario hasta que el ácido 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-carboxílico desapareció como se muestra mediante TLC (CH2Cl2:MeOH 10:1). La mezcla de reacción se filtró para eliminar la diciclohexilurea (DCU). El producto filtrado se concentró a presión reducida para eliminar la DMF. El residuo se disolvió en 150 mL de AE. La solución obtenida se lavó secuencialmente con una solución acuosa saturada de NaHCO3 3 veces y a continuación, con solución acuosa saturada de NaCl 3 veces. La solución de AE se secó con Na2SO4 anhidro y se filtró. El producto filtrado se concentró hasta sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (CH2Cl2:MeOH, 50:1) para obtener 327 mg (59%) del compuesto del título en forma de un polvo de color rosa claro. ESI-MS (m/e): 556 [M H]+; RMN H1 (300 MHz, DMSO-cfe) 5/ppm = 8,64 (s, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,14 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,36 (m, 5H), 6,74 (m, 1H), 6,57 (s, 1H), 6,37 (s, 1H), 5,14 (m, 2H), 4,30 (m, 1H), 3,55 (m, 2H), 3,32 (m, 2H), 2,88 (m, 2H), 2,57 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 2,27 (m, 1H), 2,15 (s, 1H), 1,69 (m, 4H), 1,36 (s, 9 H), 1,33 (s, 3H), 1,25 (s, 3H).
Ejemplo 36: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl (3A) Siguiendo el método del Ejemplo 2, se prepararon 1,01 g (82%) del compuesto del título en forma de un sólido rosa claro a partir de 1,50 g (2,73 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc)-Obzl, que se utilizó directamente en la siguiente reacción. ESI-MS (m/e): 456 [M H]+.
Ejemplo 37: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Ala)-OBzl (4Aa)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 302 mg (38%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 482 mg (1,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 424 mg (1,20 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Ala. ESI-MS (m/e): 795 [M H]+; RMN H1 (300 MHz, DMSO-cfe) 5/ppm = 9,15 (s, 1H), 8,89 (s, 2H), 8,11 (m, 1H), 7,94 (m, 1H), 7,85 (m, 1H), 7,76 (m, 1H), 7,44-7,31 (m, 5H), 6,66 (s, 1H), 6,47 (s, 1H), 5,14 (m, 2H), 4,25 (m, 1H), 4,23 (m, 3H), 4,12 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 3,12 (m, 2H), 2,96 (m, 2H), 2,89-2,91 (m, 2H), 2,11-2,08 (m, 1H), 1,77 (m, 5H), 1,59 (s, 3H), 1,47-1,27 (m, 17H), 1,27-1,08 (m, 7H).
Ejemplo 38: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Val)-OBzl (4Ab)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 604 mg (37%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 964 mg (2,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 924 mg (2,40 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Val. ESI-MS (m/e): 823 [M H]+; RMN H1 (300 MHz, DMSO-cfe) 5/ppm = 9,18 (s, 1H), 8,93 (m, 2H), 8,05 (m, 2H), 7,42 (m, 5H), 6,66 (s, 1H), 6,47 (s, 1H), 5,16 (s , 1H), 4.37-4.28 (m, 3H), 4.11 (m, 3H), 3.06-2.89 (m, 5H), 2.75 (m, 6H), 2.04 (s, 1H), 1.91 (m, 1H), 1,79 (m, 5H), 1,62 (s, 3H), 1,49 (s, 3H), 1,39 (m, 7H), 1,32 (m, 3H), 1,21 (m, 4H), 0,82 (m, 6H).
Ejemplo 39: Preparación de 3S-6,7-dihidroxM,1-dimetiM,2,3,4-tetrahidro-isoqumoMn-3-acN-Lys(Boc-Pro-Ala-Trp)-OBzl (4Ac)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 318 mg (35%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 482 mg (1,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 567 mg (1,20 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Trp. ESI-MS (m/e): 910 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-de) 8/ppm = 9,51 (s, 1H), 9,26 (m, 2H), 8,98 (m, 2H), 8,05 (d, 1 H, J= 7,2 Hz), 7,94 (m, 1H), 7,78 (d, 1 H, J= 7,2 Hz),
7,54 (m, 1H), 7,38 (m, 5H), 7,31 (d, 1 H, J = 4,5 Hz), 7,24 (m, 1H), 7,11 (t, 1 H, J= 4,5Hz), 7,05 (t, 1H, J = 4,5Hz),
6,67 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,15 (s, 2H), 4,44 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 4,07 (m, 2H), 3,23 (m, 1H), 3,17 (m, 5H), 2,86 (m,
1H), 1,97 (m, 2H), 1,76-1,70 (m, 8H), 1,31 (s, 3H), 1,24 (s, 3H), 1,93-1,79 (m, 9H), 1,16 (m, 4H).
Ejemplo 40: Preparación de 3S-6,7-dihidroxM,1-dimetiM,2,3,4-tetrahidro-isoqumoMn-3-acN-Lys(Boc-Pro-Ala-Tyr)-OBzl (4Ad)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 549 mg (31%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 964 mg (2,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 1077 mg (2,40 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Tyr. ESI-EM (m/e): 887 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-d6) 8/ppm = 9,17 (m, 1H), 9,02 (m, 1H), 8,73 (m, 1H), 8,51 (m, 1H), 8,09 (m, 1H), 7,97 (m, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,40 (m,
5H), 6,96 (m, 2H), 6,61 (m, 3H), 6,48 (s, 1H), 5,16 (s, 2H), 4,23 (m, 2H), 4,07 (m, 2H), 3,88 (m, 1H), 3,01 (m, 3H),
2.74 (m, 3H), 2,02 (m, 2H), 1,74 (m, 5H), 1,46 (s, 3H), 1,36-1,24 (m , 16H), 1,16 (m, 3H), 0,87 (m, 1H).
Ejemplo 41: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Pro)-OBzl (4Ae)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 607 mg (37%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 964 mg (2,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 957 mg (2,40 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Pro. ESI-MS (m/e): 821 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-d6) 8/ppm = 9,54 (m, 1H), 9,23 (s, 1H), 9,11 (m, 1H), 8,96 (s, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,85 (m, 1H), 7,40 (m , 5H), 6,67 (s,
1H), 6,48 (s, 1H), 5,16 (m, 2H), 4,54 (m, 1H), 4,38 (m, 2H), 4,24 (m, 1H), 4,10 (m, 2H), 3,55 (m, 1H), 3,17 (m, 3 3,05 (m, 3H), 2,94 (m, 1H), 
1,96 (m, 2H), 1,79 (m, 7H), 1,64 (s, 3H), 1,51 (s, 3H), 1,38-1,32 (m, 13H), 1,20 (m, 4H).
Ejemplo 42: Preparación de 3S-6,7-dihidroxM,1-dimetiM,2,3,4-tetrahidro-isoqumoMn-3-acN-Lys(Boc-Pro-Ala-Phe)-OBzl (4Af)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 626 mg (36%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 964 mg (2,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 1039 mg (2,40 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Phe. ESI-EM (m/e): 871 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-d6) 8/ppm = 9,24 (s, 1H), 9,09 (m, 2H), 8,96 (s, 1H), 8,01-7,93 (m, 3H), 7,38 (m, 5H), 7,21 (m, 5H), 6,67 (s,
1H), 6,49 (s, 1H), 5,17 (s, 2H), 4,38 (m, 3H), 4,09 (m, 2H), 3,28 (m, 4H), 2,88 (m, 2H), 2,79 (m, 5H), 1,99 (m, 2H),
1.74 (m, 8 H), 1,50 (m, 3H), 1,32 (m, 14H), 1,16 (m, 4H).
Ejemplo 43: Preparación de 3S-6,7-dihidroxM,1-dimetiM,2,3,4-tetrahidro-isoqumoMn-3-acN-Lys(Boc-Pro-Ala-Gly)-OBzl (4Ag)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 304 mg (39%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 482 mg (1,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 412 mg (1,20 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Gly. ESI-MS (m/e): 781 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-d6) 8/ppm = 9,39 (s, 1H), 8,97 (m, 2H), 8,24-8,14 (m, 2H), 7,79 (m, 1H), 7,41 (m, 5H), 6,66 (s, 1H), 6,47 (s, 1H), 5,16
(s, 2H), 4,35 (m, 2H), 4,21 (m, 2H), 3,71-3,66 (m, 2H), 3,03 (m, 3H), 2,89-2,76 (m, 1H), 2,07 (m, 1H), 1,81-1,77 (m,
6H), 1,62 (s, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,38 (m, 7H), 1,32 (m, 8 H), 1,23 (m, 4H).
Ejemplo 44: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Ser)-OBzl (4Ah)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 454 mg (29%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 965 mg (2,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 896 mg (2,40 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Ser. ESI-MS (m/e): 811 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-d6) 8/ppm = 9,48 (m, 1H), 9,23 (s, 2H), 8,96 (m, 1H), 8,19 (m, 1H), 7,40 (m, 5H), 6,67 (s, 1H), 6,48 (s , 1H), 5,16 (m,
2H), 4,92 (m, 1H), 4,31 (m, 3H), 4,13 (m, 3H), 3,53 (m, 2H), 3,16 (m, 3H), 3,04-2,81 (m, 4H), 2,08 (m, 1H), 1,78 (m,
5H), 1,63 (s, 3H), 1,51 (s, 3H), 1,39-1,32 (m, 14H), 1,22 (m, 3H).
Ejemplo 45: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Ile)-OBzl (4Ai)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 310 mg (37%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 482 mg (1,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 479 mg (1,20 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Ile. ESI-MS (m/e): 837 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-da) 6/ppm = 8,84-8,68 (m, 2H), 8,37 (s, 1H), 7,99-7,87 (m, 3H), 7,39 (m, 4H), 6,60 (s, 1H), 6,39 (s, 1H) , 5,14 (m, 2H), 4,32 (m, 2H), 4,17 (m, 2H), 3,65 (m, 1H), 3,54 (m, 1H), 3,17 (m, 1H), 2,96 (m, 2H), 2,68 (m, 3H), 2,11 (m, 1H), 1,74 1,68 (m, 7H), 1,31-1,21 (m, 11H), 1,17 (m, 5H), 1,08 (m, 1H), 0,82 (m, 8H).
Ejemplo 46: Preparación de 3S-6,7-dihidroxM,1-dimetiM,2,3,4-tetrahidro-isoqumoMn-3-acN-Lys(Boc-Pro-Ala-Thr)-OBzl (4Aj)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 495 mg (30%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 964 mg (2,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 929 mg (2,40 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Thr. ESI-MS (m/e): 825 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-d6) 6/ppm = 9,18 (s, 1H), 8,91 (s, 2H), 8,27 (m, 1H), 7,64 (m, 1H), 7,41 (m, 6H), 6,65 (s, 1H), 6,48 (s , 1H), 5,16 (s, 2H), 4,35 (m, 3H), 4,23 (m, 3H), 3,07 (m, 3H), 2,72 (m, 1H), 1,83-1,76 (m, 5H), 1,61 (s, 3H), 1,48 (s, 3H), 1,38-1,32 (m, 14H), 1,23 (m, 3H), 1,11 (m, 3H).
Ejemplo 47: Preparación de 3S-6,7-dihidroxM,1-dimetiM,2,3,4-tetrahidro-isoqumoMn-3-acN-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-OBzl (4Ak)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 750 mg (30%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 964 mg (2,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 1209 mg (2,40 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Lys (Z). ESI-MS (m/e): 987 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-d6) 6/ppm = 8,68 (s, 1H), 8,56 (s, 1H), 8,16 (m, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,78 (m, 1H), 7,68 (m, 1H), 7,34 (m , 10H), 6,58 (s, 1H), 6,37 (s, 1H), 5,14 (s, 2H), 4,98 (s, 2H), 4,29 (m, 2H), 4,09 (m, 3H), 3,56 (m, 3H), 3,01 (m, 4H), 2,62 (m, 1H), 2,40 (m, 1H), 2,27 (m, 1H), 2,15 (s, 1H), 2,06 (m, 1H), 2,01 (s, 1H), 1,78 (m, 6H), 1,38-1,31 (m, 18 H), 1,17 (m, 10 H).
Ejemplo 48: Preparación de 3S-6,7-dihidroxM,1-dimetiM,2,3,4-tetrahidro-isoqumoMn-3-acN-Lys(Boc-Pro-Ala-Leu)-OBzl (4AI)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 301 mg (36%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 482 mg (1,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 479 mg (1,20 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Leu. ESI-MS (m/e): 837 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-d6) 6/ppm = 8,69-8,57 (m, 2H), 8,18-8,06 (m, 2H), 7,85 (m, 1H), 7,69 (m, 5H), 6,58 (s, 1H), 6,37 (s, 1H) , 5,14 (m, 2H), 4,25-4,11 (m, 5H), 3,63-3,55 (m, 1H), 3,17 (s, 2H), 3,04-2,98 (m, 2H), 2,64-2,59 (m, 1H) , 2,15-2,07 (m, 1H), 1,78-1,67 (m, 5H), 1,36 (m, 14H), 1,28 (m, 4H), 1,19 (m, 6H).
Ejemplo 49: Preparación de 3S-6,7-dihidroxM,1-dimetiM,2,3,4-tetrahidro-isoqumoMn-3-acN-Lys(Boc-Pro-Ala-Gln)-OBzl (4Am)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 665 mg (39%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 965 mg (2,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 994 mg (2,40 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Gln. ESI-MS (m/e): 852 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-d6) 6/ppm = 9,3-9,1 (m, 4H), 8,16 (m, 1H), 7,96 (m, 2H), 7,83 (m, 1H), 7,44-7,38 (m, 7H), 6,89 (s, 1H) , 6,86 (s, 1H), 6,56 (s, 1H), 5,17 (s, 2H), 4,4-4,1 (m, 6H), 3,17 (m, 4H), 2,98-2,83 (m, 2H), 2,08 (m , 4H), 1,91 (m, 1H), 1,64 (s, 3H), 1,51 (s, 3H), 1,38-1,31 (m, 17H), 1,22-1,20 (m, 4H).
Ejemplo 50: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Asn)-OBzl (4An)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 636 mg (38%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 965 mg (2,01 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl y 960 mg (2,40 mmoles) de Boc-Pro-Ala-Asn. ESI-MS (m/e): 838 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz, DMSO-d6) 6/ppm = 9,26 (s, 1H), 9,04 (m, 2H), 8,31 (m, 1H), 8,03 (m, 1H), 7,57 (m, 1H), 7,44 (m, 6H), 6,90 (m , 1H), 6,68 (s, 1H), 6,49 (s, 1H), 5,16 (s, 2H), 4,45-4,40 (m, 3H), 4,14 (m, 2H), 3,42 (m, 5H), 3,17 (m, 3H), 2,89-2,82 (m, 1H), 2,09 (m, 1H), 1,90 (m, 1H), 1,79-1,74 (m, 6H), 1,64 (s, 3H), 1,52 (s, 3H), 1,39-1,32 (m, 15H), 1,22 (m, 3H).
Ejemplo 51: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys[Boc-Pro-Ala-Asp (OBzl)]-OBzl (4Ao)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 403 mg (35%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 870 mg (1,24 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys [Asp(OBzl)]-OBzl y 429 mg (2,48 mmoles) de Boc-Pro-Ala. ESI-MS (m/e): 929 [M H]+ ; RMN H1 (300 MHz,
DMSO-CÍ6) 5/ppm = 8,32 (m, 1H), 8,10 (m, 1H), 7,96 (m, 1H), 7,36 (m, 10 H), 6,60 (s, 1H), 6,39 (s, 1H), 5,14 (s , 2H), 5,06 (s, 2H), 4,57 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,23 (m, 1H), 4,11 (m, 2H), 3,74 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,34-3,28 (m, 2H), 3,00 (m, 2H), 2,89 (s, 1H), 2,81 (m, 1H), 2,73 (m, 2H), 2,58 (m, 1H), 2,16-2,06 (m, 1H), 1,91 (s, 2H), 1,75 (m, 5H), 1,40-1,32 (m, 22H), 1,17 (m, 3H).
Ejemplo 52: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys [Boc-Pro-Ala-Glu (OBzl)]-OBzl (4Ap)
Siguiendo el método del Ejemplo 1, se prepararon 269 mg (38%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 530 mg (0,75 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys [Glu (OBzl)] -OBzl y 256 mg (0,90 mmoles) de Boc-Pro-Ala. ESI-MS (m/e): 943 [M H]+; RMN H1 (300 MHz, DMSO-CÍ6) 5/ppm = 9,26 (s, 1H), 9,10 (m, 1H), 8,97 (s, 1H), 8,79-7,88 (m, 3H), 7,36 (m, 10 H), 6,67 (s, 1H), 6,48 (s, 1H), 5,14 (s, 2H), 5,06 (s, 2H), 4,35 (m, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,10 (m, 1H), 3,83 (s, 1H), 3,34 (m, 5H), 2,83 (m, 1H), 2,72 (m, 1H), 2,34 (m, 2H), 1,78 (m, 10 H), 1,51 (s, 3H), 1,36-1,31 (m, 14H), 1,21 (m, 3H).
Ejemplo 53: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Ala) (5Aa)
En primer lugar, el grupo éster bencílico se eliminó de 300 mg (0,38 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1 -dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Ala)-OBzl siguiendo el método del Ejemplo 4. A continuación, se eliminó el Boc siguiendo el método del Ejemplo 2 para proporcionar 266 mg (78%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro, p 207,2-209,4°C;
25
[a ]D =-4.5
(c = 0,25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 630 [M-H]- ; IR (KBr): 3221,1, 3057,2, 2983,8, 2943,3, 2362,8, 1660,7, 1546,9, 1533,4, 1448,5, 1379,1, 1240,2, 1049,3, 867,9, 659,7; RMN H1 (300 MHz, D2O) 5/ppm = 6,79 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 4,36-4,29 (m, 5H), 3,32-3,12 (m, 6H), 1,89 (m, 4H), 1,70 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 1,48 (m, 2H), 1,33 (m, 9 H).
Ejemplo 54: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Val) (5Ab)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 187 mg (81%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 300 mg (0,36 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Val)-OBzl. Pf 195,8-197,9°C;
[a]D =-3.5
(c = 0,25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 630 [M-H]- ; IR (KBr): 3221,1, 3062,9, 2970,4, 1658,8, 1546,9, 1533,4, 1450,5, 1384,9, 1240,2, 1047,4, 991,41, 866,04, 671,2; RMN H1 (300 MHz, D2O) 5/ppm = 8,13 (m, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 4,36-4,29 (m, 4H), 3,89 (m, 1H), 3,36 (m, 2H), 3,23 (m, 2H), 3,08 (m, 2H), 1,89 (m, 4H), 1,70 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 1,48 (m, 1H), 1,37 (m, 6H), 1,32 (m, 2H), 0,89 (m, 6H).
Ejemplo 55: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Trp) (5Ac)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 180 mg (76%) del compuesto del título en forma de un polvo rosa claro a partir de 300 mg (0,33 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Trp)-OBzl. Pf 205,1-207,9°C;
[0] d =-1.3 (C = 0.25, CH3OH);
(c = 0,25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 718 [M-H]- ; IR (KBr): 3221,2, 3059,1, 2981,9, 2941,4, 1660,7, 1533,4, 1448,5, 1388,7, 1240,2,867,9, 748,4, 630,7; RMN H1 (300 MHz, D2O) 5/ppm = 7,50 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 7,39 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 7,12 (t, J= 7,2 Hz, 1H), 7,05 (t, J= 7,2 Hz, 1H), 6,74 (s, 1H), 6,62 (s, 1H), 4,38 (m, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,27 (m, 1H), 4,18 (m, 2H), 3,24 (m, 2H), 3,16 (m, 3H), 3,06 (m, 3H), 1,83 (m, 1H), 1,68 (m, 4H), 1,47 (m, 3H), 1,37 (m, 2H), 1,25 (m, 3H), 1,21 (m, 3H).
Ejemplo 56: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Tyr) (5Ad)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 174 mg (74%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 303 mg (0,34 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Tyr)-OBzl. Pf 200,5-202,8°C;
25
[a]o =-2.3
(c = 0,25, CHaOH); ESI-EM (m/e): 695 [M-H]- ; IR (KBr): 3215,3, 3055,2, 2983,8, 2947,2, 1658,8, 1548,8, 1523,8, 1448.5, 1384,9, 1238,3, 1163,1, 657,7; RMN H1 (300 MHz, D2O) 6/ppm = 6,98 (m, 2H), 6,92 (m, 3H), 6,65 (s, 1H), 4,34-4,26 (m, 6H), 3,27 (m, 2H), 3,15 (m, 1H), 3,08 (m, 1H), 2,96 (m, 2H), 2,85 (m, 12H), 1,89 (m, 5H), 1,70 (s, 3H), 1,51 (m, 3H), 1,33 (m, 3H), 1,25 (m, 4H).
Ejemplo 57: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Pro) (5Ae)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 179 mg (78%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 301 mg (0,36 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Pro)-OBzl. Pf 204,8-205,4°C;
25
[a]» =-5.0
(c = 0,25, CH3OH); ESI-EM (m/e): 629 [M-H]- ; IR (KBr): 3244,3, 3070,7, 2980,1, 2947,2, 1662,6, 1639,5, 1554,6, 1450.5, 1379,1, 1246,1, 1201,6, 1047,3, 995,3, 871,8, 657,7; RMN H1 (300 MHz, D2O) 6/ppm = 6,78 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 4,57 (m, 1H), 4,39-4,33 (m, 5H), 3,74 (m, 1H), 3,60 (m, 1H), 3,26 (m, 2H), 3,17 (m, 1H), 3,04 (m, 2H), 2,19 (m, 3H), 1,85 (m, 5H), 1,69 (m, 4H), 1,54 (m, 6H), 1,36 (m, 6H).
Ejemplo 58: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Phe) (5Af)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 183 mg (78%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 300 mg (0,34 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Phe)-OBzl. Pf 175,8-178,2°C;
25
[a]n =-3.3
(c = 0,25, CH3OH); ESI-EM (m/e): 679 [M-H]- ; IR (KBr): 3215,3, 3049,5, 2949,2, 1662,6, 1539,2, 1454,3, 1394,5; RMN H1 (300 MHz, D2O) 6/ppm = 7,26 (m, 3H), 7,14 (m, 2H), 6,77 (s, 1H), 6,65 (s, 1H), 4,39-4,33 (m, 3H), 4,03 (m, 3H), 3,42 (m, 1H), 3,37 (m, 1H), 3,29 (m, 2H), 3,17 (m, 1H), 3,09 (m, 4H), 2,95 (m, 3H), 1,91 (m, 5 H ), 1,74 (s, 3H), 1,53 (s, 3H), 1,33 (m, 6H).
Ejemplo 59: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Gly) (5Ag)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 193 mg (85%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 300 mg (0,38 mmoles) de S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Gly)-OBzl. Pf 196,4-199,5°C;
25
[a]D =-3.0
(c = 0,25, CH3OH); ESI-EM (m/e): 588 [M-H]- ; IR (KBr): 3223,1, 3062,9, 2983,8, 1630,2, 1552,7, 1537,3, 1448,5, 1382,9, 1244,1, 1049,3, 1006,8, 869,9, 661,6; RMN H1 (300 MHz, D2O) 6/ppm = 6,77 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 4,34-4,28 (m, 4H), 3,78 (s, 2H), 3,30 (m, 2H), 3,15 (m, 3H), 1,92 (m, 3H), 1,70 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,33 (m, 6H).
Ejemplo 60: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Ser) (5Ah)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 181 mg (79%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 300 mg (0,37 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Ser)-OBzl. Pf 195,6-197,4°C;
25
[a]D =-3.8
(c = 0,25, CH3OH); ESI-EM (m/e): 619 [M-H]-; IR (KBr): 3228,8, 3061,0, 2981,9, 2943,4, 1732,1, 1662,6, 1550,7 1533,3, 1448,5, 1384,9, 1244,1, 1159,2, 1049,3, 869,9, 657,7, 518,8; RMN H1 (300 MHz, D2O) 6/ppm = 6,78 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 4,41-4,26 (m, 5H), 3,74 (m, 2H), 3,25-3,13 (m, 6H), 1,91 (m, 3H), 1,69 (s, 3H), 1,55 (m, 3H), 1,46 (m, 2H), 1,37 (m, 6H).
Ejemplo 61: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Ile) (5Ai)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 181 mg (78%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 302 mg (0,36 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Ile)-OBzl. Pf 175,6-178,4°C;
25
[a]D =-3.3
(c = 0,25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 645 [M-H]- ; IR (KBr): 3224,9, 3057,2, 2970,4, 2758,2, 2497,8, 2360,87, 1656,9, 1535.3, 1454,3, 1388,7, 1244,1, 1159,1, 1037,7, 871,8, 659,6; RMN H1 (300 MHz, D2O) 6/ppm = 6,79 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,29 (m, 1H), 4,18 (m, 1H), 3,92 (re, J= 1,2 Hz, 1H), 3,31 (m, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,10 (m, 3H), 2,34 (m, 1H), 2,12 (m, 1H), 1,74 (m, 4H), 1,57 (m, 3H), 1,36 (m, 6H), 1,21 (m, 2H), 0,84 (m, 9 H).
Ejemplo 62: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Thr) (5Aj)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 175 mg (76%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo claro a partir de 300 mg (0,36 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Thr)-OBzl. Pf 194,8-197,5°C;
25
[a p =-2.8
(c = 0,25, CH3OH); ESI-EM (m/e): 633 [M-H]- ; IR (KBr): 3236,5, 3066,8, 2933,7, 1660,7, 1548,8, 1533,4, 1450,8, 1381.0, 1240,2, 1157,3, 1049,3, 869,9, 669,3; RMN H1 (300 MHz, D2O) 6/ppm = 6,81 (s, 1H), 6,71 (s, 1H), 4,43-4,31 (m, 4H), 4,11 (m, 2H), 3,33 (m, 2H), 3,24 (m, 1H), 3,24 (m, 2H), 3,21 (m, 1H), 3,18 (m, 1H), 3,09 (m, 1H), 1,94 (m, 3H), 1,74 (s, 3H), 1,58 (s, 3H), 1,51 (m, 2H), 1,23 (m, 1H), 1,19 (m, 1H), 1,14 (m, 3H).
Ejemplo 63: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Lys) (5Ak)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 152 mg (75%) del compuesto del título en forma de un polvo de color amarillo oscuro a partir de 305 mg (0,31 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys [Boc-Pro-Ala-Lys(Z)] -OBzl. Pf 185,6-188,1 °C;
25
[a] n =-1.8
(c = 0,25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 660 [M-H]' ; IR (KBr): 3853,7, 3738,1, 2956,8, 2349,3, 2017,5, 1668,4, 1537,3, 1400.3, 1257,6, 1043,5, 871,8, 671,2 .; RMN H1 (300 MHz, D2O) 6/ppm = 6,80 (s, 1H), 6,69 (s, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,29 (m, 1H), 4,18 (m, 2H), 3,73 (m, 2H), 3,22-3,13 (m, 8H), 3,09 (m, 4H), 2,95 (m, 1H), 1,93 (m, 6H), 1,74 (m, 9H), 1,58 (m, 6H), 1,47 (m, 2H), 1,32-1,27 (m, 16H), 1,18 (m, 2H).
Ejemplo 64: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Leu) (5AI)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 178 mg (77%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 300 mg (0,36 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Leu)-OBzl. Pf 189,7-192,7°C;
[a]D =-3.5
(c = 0,25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 645 [M-H]- ; IR (KBr): 3224,9, 3064,9, 2956,8, 1660,7, 1548,8, 1535,3, 1448,5, 1381.0, 1242,2, 1049,3, 997,2, 869,9, 669,3; RMN H1 (300 MHz, D2O) 6/ppm = 6,78 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 4,38-4,29 (m, 3H), 4,13 (m, 2H), 3,31 (m, 3H), 3,21 (m, 1H), 3,08 (m, 2H), 1,89 (m, 4H), 1,70 (s, 3H), 1,57 (m, 4H), 1,46 (m, 5H), 1,32 (m, 6H), 1,32 (m, 1H), 1,16 (m, 6H).
Ejemplo 65: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Gln) (5Am)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 184 mg (79%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 300 mg (0,35 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Gln)-OBzl. Pf 181,3-183,3°C;
25
[a]D =-3.0
(c = 0,25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 660 [M-H]- ; IR (KBr): 3213,4, 3059,1, 2981,9, 2943,4, 2362,8, 1739,8, 1662,6, 1548,8, 1537,3, 1450,5, 1375,3, 1244,1, 1047,2, 871,8, 659,7; RMN H1 (300 MHz, D2O) 6/ppm = 6,80 (s, 1H), 6,69 (s, 1H), 4,40-4,29 (m, 5H), 3,33 (m, 3H), 3,17 (m, 3H), 1,90 (m, 2H), 1,69 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,43 (m, 2H), 1,31 (m, 8 H).
Ejemplo 66: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Asn) (5An)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 174 mg (78%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 302 mg (0,36 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetr âhidro-isoquinoMn-3-acil-Lys(Boc-Pro-Ala-Asn)-OBzl. Pf 202,5-204,7°C;
25
[a]D =-2.3
(c = 0,25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 646 [M-H]- ; IR (KBr): 3207,6, 3059,1, 2943,3, 1674,2, 1537,3, 1448,5, 1381,0, 1247,9, 642,3; RMN H1 (300 MHz, D2O) 5/ppm = 6,78 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 4,48 (m, 1H), 4,42-4,29 (m, 4H), 3,29 (m, 2H), 3,16 (m, 4H), 2,65 (m, 2H), 1,90 (m, 2H), 1,69 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,31 (m, 6H).
Ejemplo 67: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Asp) (5Ao)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 174 mg (83%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 300 mg (0,32 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-[Boc-Pro-Ala-Asp (OBzl)] -OBzl. Pf 207,1-209,7°C;
25
[a]» = -3.5
(c = 0,25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 647 [M-H]- ; IR (KBr): 3383,3, 3061,0, 2360,9, 1670,3, 1550,8, 1448,5, 1400,3, 1246,3, 873,8, 611,4; RMN H1 (300 MHz, D2O) 5/ppm = 6,76 (s, 1H), 6,66 (s, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,37-4,281 (m, 4H), 3,27 (m, 4H), 3,13 (m, 1H), 3,05 (m, 1H), 2,76 (m, 2H), 1,97 (m, 1H), 1,90 (m, 1H), 1,71 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,43 (m, 2H), 1,31 (m, 6H).
Ejemplo 68: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys(Pro-Ala-Glu) (5Ap)
Siguiendo el método del Ejemplo 53, se prepararon 173 mg (82%) del compuesto del título en forma de un polvo incoloro a partir de 301 mg (0,32 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys [Boc-Pro-Ala-Glu (OBzl)]-OBzl. Pf 194,7-196,1°C;
25
[а ] » =-2.3
(c = 0,25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 661 [M-H]- ; IR (KBr): 3053,3, 2945,3, 2370,5, 2320,4, 1651,1, 1546,9, 1533,4, 1448,5, 1388,8, 1240,2, 1165,0, 1045,4, 644,2; RMN H1 (300 MHz, D2O) 5/ppm = 6,78 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 4,42 4,28 (m, 5H), 3,29 (m, 2H), 3,13 (m, 3H), 2,99 (m, 1H), 2,38 (m, 2H), 2,29 (m, 1H), 1,90 (m, 5H), 1,69 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,31 (m, 6H).
Ejemplo Comparativo 1: Preparación de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys (б)
Siguiendo el método del Ejemplo 4, se prepararon 620 mg (85%) del compuesto del título en forma de un sólido rosa claro a partir de 1,00 g (2,03 mmoles) de 3S-6,7-dihidroxi-1,1-dimetil-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-acil-Lys-OBzl. Este compuesto 6 se utilizó como grupo de control en los siguientes ejemplos experimentales. ESI-EM (m/e): 363 [M-H]-.
Ejemplo Experimental 1: Evaluación de la actividad trombolítica de los compuestos 5Aa-p de la presente invención mediante administración intravenosa
1) Método de evaluación
Se anestesiaron ratas macho SD de 200-220 g con solución de uretano al 20% (6 mL/kg, ip). Las ratas anestesiadas se fijaron en posición supina y se separó la arteria carótida común derecha, se pinzó en el extremo proximal con una grapa arterial y se penetró con una sutura en los extremos proximal y distal, respectivamente. La sutura en el extremo distal se sujeta firmemente con una pinza hemostática en la piel/pelaje. Se realizó la canulación en el extremo distal, se aflojó la pinza arterial y se descargó aproximadamente 1 mL de sangre arterial en un vial EP de 1 mL. Se inyectaron 0,1 mL de sangre arterial de rata en un tubo de vidrio fijado verticalmente (15 mm de longitud, con un diámetro interno de 2,5 mm y un diámetro externo de 5,0 mm, sellado con un tapón de goma en la parte inferior), en el cual se insertó inmediatamente un tornillo de inmovilización de trombos de acero inoxidable. El tornillo de inmovilización de trombos, formado por enrollamiento de un alambre de acero inoxidable de 0,2 mm de diámetro, tenía una parte en espiral de 12 mm de longitud, incluidas 15 espiras de 1,0 mm de diámetro cada una y un vástago de 7,0 mm de longitud que estaba conectado a la parte espiral y tenía una forma similar a un signo de interrogación. Cuarenta minutos después de la coagulación de la sangre, se retiró el tapón de goma en la parte inferior del tubo de vidrio, se fijó el vástago del tornillo de inmovilización de trombos con unas pinzas y se extrajo con cuidado el tornillo de inmovilización de trombos envuelto en el trombo del tubo de vidrio y se pesó con precisión.
Una cánula de derivación estaba compuesta por 3 segmentos. El segmento medio era un tubo de polietileno que tenía una longitud de 60 mm y un diámetro interno de 3,5 mm. Los segmentos en ambos extremos eran tubos de polietileno similares que tenían una longitud de 100 mm, un diámetro interno de 1 mm y un diámetro externo de 2 mm, de uno de los cuales se tiró para formar una punta, con un diámetro externo de 1,0 mm (utilizado en la inserción en la arteria o vena carótida de rata), el otro extremo del cual estaba envainado mediante un tubo de polietileno que tenía una longitud de 7 mm y un diámetro externo de 3,5 mm (engrosado, utilizado para insertar en el tubo de polietileno del segmento medio). La pared interior de la cánula de 3 segmentos estaba completamente sililada. El tornillo de inmovilización de trombos envuelto en trombo se colocó en el tubo de polietileno del segmento medio, y ambos extremos del tubo envainaron los extremos engrosados de dos tubos de polietileno. La cánula se cargó con una solución de heparina en solución salina normal (50 UI/kg) a través del extremo de la punta utilizando un inyector y se dejó lista para su uso.
La vena yugular externa izquierda de la rata se separó y se penetró con una sutura en los extremos proximal y distal, respectivamente, y se ligó el extremo distal. Se hizo con cuidado una incisión en la vena yugular externa izquierda expuesta, y la punta de la cánula de derivación preparada como se describió anteriormente se insertó en el extremo proximal de la incisión en la vena yugular externa izquierda, lejos del vástago del tornillo de inmovilización de trombos en el segmento medio de la cánula de derivación (que alojaba el tornillo de inmovilización de trombos pesado con precisión). Se inyectó una cantidad precisa de heparina en solución salina (50 UI/kg) a través de la punta en el otro extremo utilizando un inyector. En ese momento, sin sacar el inyector del tubo de polietileno, se pinzó el tubo entre el inyector y el tubo de polietileno con una pinza hemostática. El flujo sanguíneo se detuvo pinzando el extremo proximal de la arteria carótida común derecha con una grapa arterial, y se realizó una incisión cuidadosamente a través de la arteria carótida común cerca de la grapa. Se extrajo el inyector del tubo de polietileno a través de la punta y a continuación, se insertó la punta del tubo de polietileno en el extremo proximal de la incisión de la arteria. Ambos extremos de la cánula de derivación se fijaron a la arteria o vena con suturas del núm. 4.
Se utilizó una aguja en el cuero cabelludo para hacer pasar solución salina, una uroquinasa en solución salina o concentraciones variadas de los compuestos en solución salina a través de la sección media de la cánula de derivación (que acomodaba el tornillo de inmovilización de trombos pesado con precisión) hasta una posición en la vena proximal y lejos del tornillo de inmovilización de trombos. A continuación, se retiró la grapa de la arteria para permitir que la sangre fluyera desde la arteria a la vena a través de la cánula de derivación. Por tanto, se estableció un modelo de trombólisis de derivación arteriovenosa de rata. La solución en el inyector se inyectó lentamente a la sangre (aproximadamente 6 min), permitiendo que la solución salina normal, la uroquinasa (control positivo) o los compuestos de la presente invención actuaran sobre el trombo a través de la circulación sanguínea en el orden vena-corazón-arteria. El proceso se programó al comienzo de la inyección, y el tornillo de inmovilización de trombos se retiró de la cánula de derivación después de 1 hora y se pesó con precisión. Se determinó la diferencia en la masa del tornillo de inmovilización de trombos en la cánula de derivación de rata antes y después de la administración para evaluar la actividad trombolítica in vivo de los compuestos. La reducción de peso del trombo se expresó mediante los valores medios y la desviación típica (x ± DT).
2) Método de administración y dosis
El método de administración es la inyección intravenosa. El control de blanco fue solución salina normal y la dosis fue de 3 mL/kg. El control positivo fue uroquinasa, y la dosis fue de 20000 U/kg, lo que equivale a 1,68 mg/kg. La dosis de compuestos 5Aa-p de la presente invención fue de 0,1 nmoles/kg.
3) Resultados de evaluación
La actividad trombolítica se expresó mediante la reducción de peso del trombo (x ± DT mg), y los resultados se enumeraron en la Tabla 1. Los datos mostraron que los compuestos 5Aa-p a una dosis de 0,1 nmoles/kg por vía intravenosa podría lisar eficazmente el trombo. (p<0,01 en comparación con solución salina normal). Las actividades trombolíticas de los compuestos. 5Aa, 5Af, 5Ag, 5Ak, y 5Ao fueron comparables a los de la uroquinasa a una dosis de 20000 U/kg. Entre los compuestos con mayor actividad trombolítica, 5Aa, 5Ad, 5Af, 5Ag y 5Ak, el compuesto 5Ak mostró la actividad trombolítica más alta, por lo que se evaluó adicionalmente su relación dependiente de la dosis.
Tabla 1: Actividad trombolítica de los com uestos 5Aa- mediante in ección intravenosa.
Ejemplo Experimental 2: Evaluación de la relación dosis-efecto para la actividad trombolítica del compuesto 5Ak de la presente invención mediante administración intravenosa
La administración mediante inyección intravenosa se realizó de acuerdo con el método del ejemplo 1. El control de blanco fue solución salina normal y la dosis fue de 3 mL/kg. El control positivo fue uroquinasa, y la dosis fue de 20000 U/kg, lo que equivale a 1,68 mg/kg. Las dosis altas, medias y bajas del compuesto. 5Ak fueron 0,1 nmoles/kg, 0,01 nmoles/kg y 0,001 nmoles/kg, respectivamente. Los resultados se enumeran en la Tabla 2. Los datos mostraron una obvia relación dosis-efecto del compuesto. 5Ak.
Tabla 2: Relación dosis-efecto ara la trombólisis del com uesto 5Ak de la resente invención
Ejemplo experimental 3: Evaluación de la actividad antitrombótica de los compuestos 5Aa-p de la presente invención mediante administración intravenosa
1) Método de evaluación
Una cánula estaba compuesta por 3 segmentos. El segmento medio tenía una longitud de 80 mm y un diámetro interno de 3,5 mm. Los segmentos en ambos extremos eran tubos de polietileno similares que tenían una longitud de 100 mm, un diámetro interno de 1 mm y un diámetro externo de 2 mm, uno de cuyos extremos se extrajo para formar una punta (utilizada para su inserción en la arteria o vena carótida de rata), la pared interna de la cánula de 3 segmentos estaba completamente sililada. El hilo pesado previamente de 60 mm de longitud se colocó en el segmento medio del tubo de polietileno. Ambos extremos del tubo más ancho envainaron los extremos no estrechos de dos tubos de polietileno, respectivamente (0,5 mm de la rosca se sujetaron mediante uno de los segmentos para fijar la rosca). La cánula se llenó con una solución de heparina en solución salina normal (50 UI/kg) a través del extremo de la punta utilizando un inyector y se dejó lista para su uso.
Se anestesiaron ratas macho SD de 200-220 g con solución de uretano al 20% (6 mL/kg, ip). Las ratas anestesiadas se fijaron en posición supina y se separó la vena yugular externa izquierda y se penetró con una sutura en los extremos proximal y distal respectivamente, y se ligó el extremo distal. Se realizó con cuidado una incisión en la vena yugular externa izquierda expuesta, y se insertó el extremo de la punta sin sujetar el hilo de la cánula de derivación preparada como se describe anteriormente en el extremo proximal de la incisión abierta en la vena
yugular externa izquierda. Se inyectó una cantidad precisa de heparina en solución salina normal (50 Ul/kg) a través de la punta del otro extremo utilizando un inyector. A continuación, se reemplazó el inyector y se inyectó una cantidad precisa de medicamento de la misma manera. En ese momento, sin retirar el inyector del tubo de etileno, se separó la arteria carótida común derecha y se sujetó el extremo proximal con una grapa arterial. Se penetró la arteria carótida común derecha con una sutura en los extremos proximal y distal, respectivamente, y se ligó el extremo distal. Se cortó cuidadosamente una incisión a través de la arteria carótida común derecha cerca de la grapa arterial. Se extrajo el inyector del tubo de polietileno a través de la punta y a continuación, se insertó la punta del tubo de polietileno en el extremo proximal de la incisión de la arteria. Ambos extremos de la cánula de derivación se fijaron a la arteria o vena con suturas del num. 4. A continuación, se retiró la grapa de la arteria para permitir que la sangre fluyera desde la arteria a la vena a través de la cánula de derivación. De este modo, se estableció un modelo de trombólisis de derivación arteriovenosa de rata. El proceso se cronometró desde el comienzo de la circulación, el hilo anclado al trombo se extrajo de la cánula de derivación después de 15 minutos y se pesó con precisión. La diferencia en la masa del hilo antes y después se determinó como el peso húmedo del trombo, que se analizó estadísticamente y se utilizó para evaluar las actividades antitrombóticas in vivo de los compuestos. El peso húmedo del trombo se expresó como valor medio y desviación típica (x ± DT).
2) Método de administración del fármaco y dosis
El método de administración del fármaco es la inyección intravenosa. El control de blanco fue solución salina normal y la dosis fue de 1 mL/kg. El control positivo fue aspirina y la dosis fue de 9 mg/kg. La dosis de compuestos 5Aa-p de la presente invención fue de 0,1 nmoles/kg.
3) Resultados
Las actividades antitrombóticas se expresaron como el peso húmedo del trombo (x ± DT), y los resultados se enumeraron en la Tabla 3. Los datos mostraron que la dosis del compuesto 5Aa-p a 0,1 nmoles/kg mediante administración intravenosa puede inhibir eficazmente la formación de trombos (p<0,001, en comparación con solución salina normal), y por tanto se evaluó más a fondo la relación dependiente de la dosis de 5Ak con mayor actividad.
Tabla 3: El experimento antitrombótico in vivo de compuesto 5Aa-p de la presente invención mediante administración intravenosa
Ejemplo experimental 4: evaluación de la relación dosis-efecto para la actividad antitrombótica del compuesto 5Ak de la presente invención mediante administración intravenosa
1) Método de evaluación
El método fue el mismo que en el ejemplo 3.
2) Método y dosis de administración del fármaco
El método de administración del fármaco es la inyección intravenosa. El control de blanco fue solución salina normal y la dosis fue de 3 mL/kg. El control positivo fue aspirina y la dosis fue de 9 mg/kg. Las dosis altas, medias y bajas
del compuesto, 5Ak fueron 0,1 nmoles/kg, 0,01 nmoles/kg y 0,001 nmoles/kg respectivamente.
3) Resultados
Los resultados se enumeraron en la Tabla 4, y el compuesto 5Ak mostró una relación obvia dosis-efecto.
Tabla 4: Relación dosis-efecto in vivo ara la actividad antitrombótica del com uesto 5Ak de la resente invención
Ejemplo experimental 5: evaluación del efecto terapéutico del compuesto 5Ak de la presente invención en ratas con apoplejía
Para evaluar el efecto terapéutico de compuestos 5Aa-p en ratas con accidente cerebrovascular, el compuesto 5Ak fue seleccionado como representativo y su efecto terapéutico en ratas con accidente cerebrovascular se evaluó mediante el método siguiente.
1) Método de evaluación
Se dividieron aleatoriamente ratas macho DT (280-300 g) en un grupo de control positivo para UK a una dosis de 20000 UI/kg, un grupo de control de blanco con solución salina normal, un grupo de control de compuesto con PAK a una dosis de 5 pmoles/kg y un grupo de compuesto 5Ak a una dosis de 1 pmol/kg (alta), 0,1 pmoles/kg (media) y 0,01 pmoles/kg (baja). Se inyectó intraperitonealmente una solución de hidrato de cloral al 10% (400 mg/kg) en ratas para la anestesia. Se realizó una incisión vertical de aproximadamente 2 cm de longitud en el lado derecho cerca del centro del cuello, y se separaron la arteria carótida común derecha (ACC), la arteria carótida externa (ACE) y la arteria carótida interna (ACI) a lo largo del margen. del lado interno de los músculos esternocleidomastoideos. La incisión en la arteria carótida interna y el extremo proximal de la arteria carótida común se sujetaron respectivamente con grapas arteriales no invasivas. Se hizo una pequeña incisión en la arteria carótida externa y se ligó el extremo distal de la arteria carótida externa. Se liberó la grapa arterial en el extremo proximal de la arteria carótida común y se extrajeron 10 pl de sangre. Después de la extracción de sangre, el extremo proximal de la arteria carótida común se sujetó nuevamente con una grapa arterial no invasiva. La sangre de 10 pl extraída se colocó en un vial EP de 1 mL y se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 min para permitir la coagulación de la sangre y a continuación, se transfirió a un refrigerador a -20°C durante 1 hora para permitir la formación de coagulación sólida. Una hora más tarde, se extrajeron los coágulos de sangre, se añadió 1 mL de solución salina normal y a continuación, se rompieron los coágulos de sangre para proporcionar microtrombos relativamente uniformes con una espátula de acero. La suspensión de microtrombos se transfirió a continuación, a un inyector de 1 mL para su uso. Cuando se soltó la grapa de la arteria carótida interna de la rata, se inyectó lentamente la suspensión de trombo de 1 mL en el inyector desde la arteria carótida externa de la rata hasta su extremo proximal, y a continuación, se inyectó en el cerebro de la rata a través de la arteria carótida interna. Posteriormente, se ligó el extremo proximal de la arteria carótida externa, se liberaron las grapas arteriales de la arteria carótida interna y la arteria carótida común y se restauró el flujo sanguíneo. Se separó la vena yugular común y a continuación, se le inyectó UK a la dosis de 20000 UI/kg, solución salina normal o compuesto 5Ak a la dosis de 1 pmol/kg. Se ligó la vena. Se dejaron caer 3 gotas de penicilina sobre la herida. Se cosió la herida y se esperó que despertaran los animales.
Veinticuatro horas después de que las ratas se despertaran, se evaluó el grado de daño en la función neural mediante el método de Zealonga. Una puntuación de 0 indica que no hay señales de pérdida en la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado sano no se pueden estirar, 2 indica desplazamiento hacia el lado no dañado, 3 indica persecución de la cola en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica desplazamiento involuntario con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados de la evaluación se analizaron estadísticamente y se sometieron a la prueba t.
Después de que las ratas estuvieran despiertas durante 24 horas y se evaluara su grado de daño en la función
neural mediante el método de Zealonga, se las anestesió con uretano seguido de decapitación inmediata y extracción del cerebro. Los tejidos cerebrales se mantuvieron en un refrigerador a -20°C durante 2 horas, y se cortaron sucesivamente secciones coronales de aproximadamente 2 mm desde el extremo prefrontal para un total de 5 secciones y a continuación, se colocaron en una solución de TTC al 2% para incubar sin luz a 37°C durante 30 min. Se observó el cambio de color en las secciones del cerebro: los tejidos cerebrales normales se tiñeron de rojo mediante TTC, mientras que los tejidos cerebrales isquémicos aparecieron en blanco. Las fotografías se tomaron utilizando una cámara digital y se procesaron con soporte lógico de estadísticas de imágenes, y se calculó el volumen de infarto en los tejidos cerebrales y el área de tejidos cerebrales normales en las secciones coronales. La proporción del volumen de infarto cerebral de cada grupo se calculó estadísticamente y se sometió a la prueba t.
2) Resultado de la evaluación
Los datos evaluados según el método de Zealonga después de que las ratas se despertaron se enumeraron en la Tabla 5. Los porcentajes de volumen de infarto cerebral se enumeraron en la Tabla 6.
Tabla 5: Evaluación or el método Zealon a 24 horas des ués de ue las ratas se des ertaron
Tabla 6: Porcentae de volumen de infarto cerebral en ratas
Los datos mostrados en las Tablas 5 y 6 sugirieron que el compuesto 5Ak puede prevenir eficazmente la aparición de discinesia e infarto cerebral en ratas con isquemia cerebral. Esta función del compuesto 5Ak dependía de la dosis.
Ejemplo experimental 6: Evaluación de la actividad de captación de radicales libres de los compuestos 5Aap de la presente invención
1) actividad captadora de radicales libres de hidroxilo
Se disolvieron 11,316 mg de DMPO (dimetilpiridina-N-óxido, Sigma) en 1 mL de agua pura para obtener una solución 0,1 M de DMPO. Se disolvieron 2,78 g de FeSO4-7H2O en 1 mL de agua pura para obtener una solución 10 mM. Se diluyó H2O2 médica al 30% hasta 0,2%.
Se midió la primera altura de pico de la señal de OH de solución de 2,5 pL de FeSO4 -7H2O solución de 2,5 pL de DMPO solución de 5 pL de H2O2 + 5 pL de agua y se repitió 6 veces. Esta altura de pico se define como la altura de pico conocida de la señal de OH. La primera altura de pico de la señal de OH de solución de 2,5 pL de FeSO4"7H2O solución de 2,5 pL de DMPO solución de 5 pL de H2O2 + solución de 5 pL de uno de los compuestos 5Aa-p se midió y repitió 6 veces. Esta altura de pico se define como la altura de pico residual de la señal de OH captada por uno de los compuestos 5Aa-p.
Razón de captación = (altura de pico conocida de la señal de OH - altura de pico residual de la señal de OH de los compuestos 5Aa-p)/altura de pico conocida de la señal de OH
2) actividad captadora de radicales NO
Se disolvieron 7,325 mg de MGD (ditiocarbamato de N-metil-glucamina, Sigma) en 1 mL de agua pura para obtener una solución de MGD 25 mM. Se disolvieron 3,475 g de FeSO4"7H2O en 1 mL de agua pura para obtener una solución de 12,5 mM. Se disolvieron 25 mg de SNAP (S-nitroso-acetil penicilamina) en 1 mL de agua pura para obtener un líquido madre de color verde 110 pM, que se diluyó 100 veces para obtener una solución de SNAP 1 pM. Se midió la primera altura de pico de la señal de NO de solución de 5 pL de MGD solución de 5 pL de FeSO4 -7H2O solución de 5 pL de SNAP 5 pL de agua y se repitió 6 veces. Esta altura de pico se define como la altura de pico conocida de la señal de NO. Se midió la primera altura de pico de la señal de NO de la solución de 5 pL de MGD solución 5 pL de FeSO4 -7H2O solución de 5 pL de SNAP solución de 5 pL de uno de los compuestos 5Aa-p y repitió 6 veces. Esta altura de pico se define como la altura de pico residual de la señal de NO captada por uno de los compuestos 5Aa-p.
Razón de captación = (altura de pico conocida de la señal de NO - altura de pico residual de la señal de NO de compuestos 5Aa-p)/altura de pico conocida de la señal de NO
3) actividad captadora de radicales aniónicos superóxido
Se disolvieron 0.3 g de xantina en 1 mL de agua pura para obtener una solución de xantina 0,5 M (color blanco como la leche, en gran parte insoluble). La solución bruta de xantina oxidasa disponible comercialmente se diluyó 10 veces para obtener una solución de xantina oxidasa. La solución saturada de DETAPAC se diluyó 20 veces para obtener una solución 0,9 mM. Se disolvieron 11,316 mg de DMPO en 1 mL de agua pura para obtener una solución 0,1 M de DMPO.
solución de 5 pL de DMPO solución de 5 pL de DETAPAC solución de 5 pL de xantina solución de 5 pL de xantina oxidasa solución de 5 pL de compuestos 5Aa-p
Se midió la primera altura de pico de la señal del anión superóxido de solución de 5 pL de DMPO solución de 5 pL de DETAPAC solución de 5 pL de xantina solución de 5 pL de xantina oxidasa 5 pL de agua y se repitió 6 veces. Esta altura de pico se define como la altura de pico conocida de la señal del anión superóxido. Se midió la primera altura de pico de la señal del anión superóxido de solución de 5 pL de DMPO solución de 5 pL DETAPAC solución de 5 pL de xantina solución de 5 pL de xantina oxidasa solución de 5 pL de uno de los compuestos 5Aa-p y repitió 6 veces. Esta altura de pico se define como la altura de pico residual de la señal del anión superóxido captada por uno de los compuestos 5Aa-p.
Razón de captación = (altura de pico conocida de la señal del anión superóxido - altura del pico residual de la señal del anión superóxido de los compuestos 5Aa-p)/altura de pico conocida de la señal del anión superóxido.
Los resultados se enumeraron en la Tabla 7. Los datos mostraron que la CE50 de los compuestos 5Aa-p para tres actividades de captación de radicales libres fue de 0,4 - 0,7 mM. Los compuestos 5Aa-p tienen una evidente actividad captadora de radicales libres.
Tabla 7: CE50 de los com uestos 5Aa- ara la actividad de ca tación de radicales libres
Ejemplo experimental 7: Observaciones TEM del compuesto 5Aa-p de la presente invención
Las muestras se prepararon en forma de solución 1 * 10-7 M, 1 * 10-9 M, 1 * 10-11 M con agua destilada, respectivamente. Se tomó una pequeña cantidad (aproximadamente 10 |jl) de la solución y se dejó caer sobre la superficie de una rejilla de cobre con un papel de filtro colocado debajo, para secar al aire. La morfología y el tamaño de las partículas se observaron a continuación, con un microscopio electrónico de transmisión (JEOL, JEM-1230) y se registraron en fotografías.
En solución acuosa, los compuestos 5Aa-p se pueden autoensamblar en una estructura nanoesférica que tiene un diámetro entre 20-210 nm, en donde el diámetro estaba mayoritariamente entre 20-100 nm. Estas nanoesferas se acoplaron a varias formas de nanorred o nano collar, etc. Por ejemplo, cuando la concentración in vivo era 1 * 10"9 M (concentración teórica de fármaco en sangre), se mostraron respectivamente las fotografías TEM (Fig. 9). En la Fig.9, los compuestos 5Aa-p correspondían respectivamente a las figuras número 5a, 5b, 5c, 5d, 5e, 5f, 5g, 5h, 5i, 5j, 5k, 5l, 5m, 5n, 5o y 5p.
Ejemplo Experimental 8: Experimento de tratamiento sucesivo con 1 pmol/kg de 5Ak 6 veces en ratas con accidente cerebrovascular después de 4 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular
El efecto terapéutico se evaluó mediante puntuaciones funcionales neurológicas. Cuanto menor fue la puntuación, mejor fue el efecto terapéutico. Se inyectó una solución de hidrato de cloral al 10% por vía intraperitoneal en ratas SD macho a una dosis de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se realizó una incisión longitudinal en el centro del cuello y se separó el tronco de la arteria carótida común derecha (aproximadamente 3 cm de longitud). Cada una de las ramas de la arteria carótida externa se separó y se ligó al nivel del hioides, y la arteria carótida interna se separó de la parte hinchada del cuello. La incisión de la arteria carótida interna y el extremo proximal de la arteria carótida común se sujetaron respectivamente con grapas arteriales no invasivas, y se ligó el extremo distal de la arteria carótida externa. Se insertó un catéter que contenía 0,5 mL de suspensión de trombo en solución salina normal en el tronco de la arteria carótida externa. Cuando se soltó la grapa de la arteria carótida interna, la suspensión de trombo de 0,5 mL en solución salina normal en el catéter fluyó lentamente desde la arteria carótida externa hasta su extremo proximal, y a continuación, se inyectó en las arterias del cerebro a través de la arteria carótida interna. Posteriormente, se ligó el extremo proximal de la arteria carótida interna, se liberaron las grapas arteriales de la arteria carótida interna y la arteria carótida común y se restauró el flujo sanguíneo. Después de suturar la herida, se inyectaron por vía intramuscular 20.000 UI de penicilina para prevenir infecciones. Cuatro horas después, se infundió el compuesto 5Ak en solución salina normal (a la dosis de 1 jmol/kg, n = 10) durante 6 días consecutivos y se observó durante 7 días. Se realizó una autocomparación todos los días y se evaluó el grado de déficit neurológico mediante el método de Zealonga. Una puntuación de 0 indica que no hay señales de pérdida en la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado sano no se pueden estirar, 2 indica desplazamiento hacia el lado no dañado, 3 indica persecución de la cola en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica desplazamiento involuntario con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados de la evaluación se enumeraron en la Tabla 8. Los datos mostraron que en ratas que recibieron un tratamiento sucesivo
de 6 días con 1 pmol/kg de 5Ak una vez al día después de 4 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular, no se produjo ninguna muerte. Ocho de las diez ratas mejoraron hacia ningún déficit neurológico. Solo 2 ratas tuvieron ligeros déficits neurológicos. Por tanto, la dosis de 1 pmol/kg de 5Ak tiene un efecto terapéutico definido después de 4 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular.
Tabla 8: Efecto terapéutico de ratas que recibieron un tratamiento de 1 pmol/kg de 5Ak después de 4 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular
Ejemplo Experimental 9: Experimento de tratamiento sucesivo con 1 pmol/kg de 5Ak 6 veces en ratas con accidente cerebrovascular después de 6 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular
El efecto terapéutico se evaluó mediante puntuaciones funcionales neurológicas. Cuanto menor fue la puntuación, mejor fue el efecto terapéutico. Se inyectó intraperitonealmente una solución de hidrato de cloral al 10% en ratas SD macho a una dosis de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se realizó una incisión abierta longitudinal en el centro del cuello y se separó el tronco de la arteria carótida común derecha (aproximadamente 3 cm de longitud). Cada una de las ramas de la arteria carótida externa se separó y se ligó al nivel del hioides, y la arteria carótida interna se separó en la parte hinchada del cuello. La incisión en la arteria carótida interna y el extremo proximal de la arteria carótida común se sujetaron respectivamente con grapas arteriales no invasivas, y se ligó el extremo distal de la arteria carótida externa. Se insertó un catéter que contenía 0,5 mL de suspensión de trombo en solución salina normal en el tronco de la arteria carótida externa. Cuando se soltó la grapa de la arteria carótida interna, la suspensión de trombo de 0,5 mL en solución salina normal en el catéter fluyó lentamente desde la arteria carótida externa hasta su extremo proximal, y a continuación, se inyectó en las arterias del cerebro a través de la arteria carótida interna. Posteriormente, se ligó el extremo proximal de la arteria carótida interna, se liberaron las grapas arteriales de la arteria carótida interna y la arteria carótida común y se restauró el flujo sanguíneo. Después de suturar la herida, se inyectaron por vía intramuscular 20.000 UI de penicilina para prevenir infecciones. Después de 6 horas, se infundió el compuesto 5Ak en solución salina normal (a la dosis de 1 pmol/kg, n = 10) consecutivamente durante 6 días y se observó durante 7 días. Se realizó una autocomparación todos los días y se evaluó el grado de déficit neurológico mediante el método de Zealonga. Una puntuación de 0 indica que no hay señales de pérdida en la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado sano no se pueden estirar, 2 indica desplazamiento hacia el lado no dañado, 3 indica persecución de la cola en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica desplazamiento involuntario con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados de la evaluación se enumeran en la Tabla 9. Los datos mostraron que en ratas que recibieron un tratamiento sucesivo de 6 días con 1 pmol/kg de 5Ak una vez al día después de 6 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular, solo una rata murió accidentalmente. Seis de las nueve ratas se recuperaron sin déficits neurológicos. Solo 3 ratas tenían ligeros déficits neurológicos. Por tanto, la dosis de 1 pmol/kg de 5Ak tiene un efecto terapéutico definido después de 6 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular.
Tabla 9: Efecto terapéutico de ratas que recibieron un tratamiento de 1 pmol/kg de 5Ak después de 6 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular
Ejemplo Experimental 10: Experimento de tratamiento sucesivo con 1 pmol/kg de 5Ak 6 veces en ratas con accidente cerebrovascular después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular.
El efecto terapéutico se evaluó mediante puntuaciones funcionales neurológicas. Cuanto menor fue la puntuación, mejor fue el efecto terapéutico. Se inyectó una solución de hidrato de cloral al 10% por vía intraperitoneal en ratas SD macho a una dosis de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se realizó una incisión longitudinal en el centro del cuello y se separó el tronco de la arteria carótida común derecha (aproximadamente 3 cm de longitud). Se separaron y ligaron cada una de las ramas de la arteria carótida externa al nivel del hioides, y se disecó la arteria carótida interna en la parte hinchada del cuello. Las incisiones en la arteria carótida interna y el extremo proximal de la arteria carótida común se sujetaron respectivamente con grapas arteriales no invasivas, y se ligó el extremo distal de la arteria carótida externa. Se insertó un catéter que contenía 0,5 mL de suspensión de trombo en solución salina normal en el tronco de la arteria carótida externa. Cuando se soltó la grapa de la arteria carótida interna, la suspensión de trombo de 0,5 mL en solución salina normal en el catéter fluyó lentamente desde la arteria carótida externa hasta su extremo proximal, y a continuación, se inyectó en las arterias del cerebro a través de la arteria carótida interna. Posteriormente, se ligó el extremo proximal de la arteria carótida interna, se liberaron las grapas arteriales de la arteria carótida interna y la arteria carótida común y se restauró el flujo sanguíneo. Después de suturar la herida, se inyectaron por vía intramuscular 20.000 UI de penicilina para prevenir infecciones. Después de 24 horas, se infundió el compuesto 5Ak en solución salina normal (a la dosis de 1 pmol/kg, n = 10) consecutivamente durante 6 días y se observó durante 7 días. Se realizó una autocomparación todos los días y se evaluó el grado de déficit neurológico mediante el método de Zealonga. Una puntuación de 0 indica que no hay señales de pérdida en la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado sano no se pueden estirar, 2 indica desplazamiento hacia el lado no dañado, 3 indica persecución de la cola en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica desplazamiento involuntario con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados de la evaluación se enumeraron en la Tabla 10. Los datos sugirieron que 2 ratas murieron después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular. En las 8 ratas restantes que recibieron un tratamiento sucesivo de 6 días utilizando 1 pmol/kg de 5Ak una vez al día, no se produjo ninguna muerte. Tres de las 8 ratas se recuperaron sin déficits neurológicos. Cuatro ratas tuvieron déficits neurológicos leves y una rata tuvo déficits neurológicos evidentes. Por tanto, la dosis de 1 pmol/kg de 5Ak todavía tiene un efecto terapéutico definido después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular.
Tabla 10: Efecto terapéutico de ratas que recibieron un tratamiento de 1 pmol/kg de 5Ak después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular
Ejemplo experimental 11: Experimento de tratamiento sucesivo con 2,5 pmoles/kg de 5Ak 6 veces en ratas con accidente cerebrovascular después de 6 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular.
El efecto terapéutico se evaluó mediante puntuaciones funcionales neurológicas. Cuanto menor fue la puntuación, mejor fue el efecto terapéutico. Se inyectó una solución de hidrato de cloral al 10% por vía intraperitoneal en ratas SD macho a una dosis de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se realizó una incisión longitudinal en el centro del cuello y se separó el tronco de la arteria carótida común derecha (aproximadamente 3 cm de longitud). Se separaron y ligaron cada una de las ramas de la arteria carótida externa al nivel del hioides, y se separó la arteria carótida interna en la parte hinchada del cuello. La incisión en la arteria carótida interna y el extremo proximal de la arteria carótida común se sujetaron respectivamente con grapas arteriales no invasivas y se ligó el extremo distal de la arteria carótida externa. Se insertó un catéter que contenía 0,5 mL de suspensión de trombo en solución salina normal en el tronco de la arteria carótida externa. Al mismo tiempo, cuando se soltó la grapa de la arteria carótida
interna, la suspensión de trombo de 0,5 mL en solución salina normal en el catéter fluyó lentamente desde la arteria carótida externa hasta su extremo proximal, y a continuación, se inyectó en las arterias del cerebro a través de la arteria carótida interna. Posteriormente, se ligó el extremo proximal de la arteria carótida interna, se liberaron las grapas arteriales de la arteria carótida interna y la arteria carótida común y se restauró el flujo sanguíneo. Después de suturar la herida, se inyectaron por vía intramuscular 20.000 UI de penicilina para prevenir infecciones. Después de 6 horas, se infundió el compuesto 5Ak en solución salina normal (a la dosis de 2,5 pmoles/kg, n = 10) consecutivamente durante 6 días y se observó durante 7 días. Se realizó una autocomparación todos los días y se evaluó el grado de déficit neurológico mediante el método de Zealonga. Una puntuación de 0 indica que no hay señales de pérdida en la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado sano no se pueden estirar, 2 indica desplazamiento hacia el lado no dañado, 3 indica persecución de la cola en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica desplazamiento involuntario con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados de la evaluación se enumeraron en la Tabla 11. Los datos mostraron que en nueve ratas que recibieron un tratamiento sucesivo de 6 días con 2,5 pmoles/kg de 5Ak una vez al día después de 6 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular, no se produjo ninguna muerte. Siete de las nueve ratas mejoraron hacia ningún déficit neurológico. Una rata tuvo ligeros déficits neurológicos. Por tanto, la dosis de 2,5 pmoles/kg de 5Ak obviamente tiene un mejor efecto terapéutico que 1 pmol/kg de 5Ak después de 6 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular.
Tabla 11: Efecto terapéutico de ratas que recibieron un tratamiento de 2,5 pmoles/kg de 5Ak después de 6 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular
Ejemplo experimental 12: Experimento de tratamiento sucesivo con 2,5 pmoles/kg de 5Ak 6 veces en ratas con accidente cerebrovascular después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular.
El efecto terapéutico se evaluó mediante puntuaciones funcionales neurológicas. Cuanto menor fue la puntuación, mejor fue el efecto terapéutico. Se inyectó una solución de hidrato de cloral al 10% por vía intraperitoneal en ratas SD macho a una dosis de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se realizó una incisión longitudinal en el centro del cuello y se separó el tronco de la arteria carótida común derecha (aproximadamente 3 cm de longitud). Se separaron y ligaron cada una de las ramas de la arteria carótida externa al nivel del hioides, y se separó la arteria carótida interna en la parte hinchada del cuello. La incisión en la arteria carótida interna y el extremo proximal de la arteria carótida común se sujetaron respectivamente con grapas arteriales no invasivas, y se ligó el extremo distal de la arteria carótida externa. Se insertó un catéter que contenía 0,5 mL de suspensión de trombo en solución salina normal en el tronco de la arteria carótida externa. Cuando se soltó la grapa de la arteria carótida interna, la suspensión de trombo de 0,5 mL en solución salina normal en el catéter fluyó lentamente desde la arteria carótida externa hasta su extremo proximal, y a continuación, se inyectó en las arterias del cerebro a través de la arteria carótida interna. Posteriormente, se ligó el extremo proximal de la arteria carótida interna, se liberaron las grapas arteriales de la arteria carótida interna y la arteria carótida común y se restauró el flujo sanguíneo. Después de suturar la herida, se inyectaron por vía intramuscular 20.000 UI de penicilina para prevenir infecciones. Después de 24 horas, se infundió compuesto 5Ak en solución salina normal (dosis de 2,5 pmoles/kg, n = 10) consecutivamente durante 6 días y se observó durante 7 días. Se realizó una autocomparación todos los días y se evaluó el grado de déficit neurológico mediante el método de Zealonga. Una puntuación de 0 indica que no hay señales de pérdida en la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado sano no se pueden estirar, 2 indica desplazamiento hacia el lado no dañado, 3 indica persecución de la cola en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica desplazamiento involuntario con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados de la evaluación se enumeraron en la Tabla 12. Los datos muestran que 3 ratas murieron después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular. En el resto, siete ratas recibieron un tratamiento sucesivo de 6 días con 2,5 pmoles/kg de 5Ak una vez al día, dos ratas murieron. Tres ratas se recuperaron sin déficits neurológicos. Una rata tuvo ligeros déficits neurológicos y una rata tuvo déficits neurológicos evidentes. Por tanto, la dosis de 2,5 pmoles/kg de 5Ak todavía tiene cierto efecto terapéutico después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular.
Tabla 12: Efecto terapéutico de las ratas que recibieron un tratamiento de 2,5 pmoles/kg de 5Ak después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular
Ejemplo experimental 13: Experimento de tratamiento sucesivo con 5 pmoles/kg de 5Ak 6 veces en ratas con accidente cerebrovascular después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular.
El efecto terapéutico se evaluó mediante puntuaciones funcionales neurológicas. Cuanto menor fue la puntuación, mejor fue el efecto terapéutico. Se inyectó una solución de hidrato de cloral al 10% por vía intraperitoneal en ratas SD macho a una dosis de 400 mg/kg de peso corporal para la anestesia. Se realizó una incisión longitudinal en el centro del cuello y se separó el tronco de la arteria carótida común derecha (aproximadamente 3 cm de longitud). Se separaron y ligaron cada una de las ramas de la arteria carótida externa al nivel del hioides, y se separó la arteria carótida interna en la parte hinchada del cuello. La incisión en la arteria carótida interna y el extremo proximal de la arteria carótida común se sujetaron respectivamente con grapas arteriales no invasivas, y se ligó el extremo distal de la arteria carótida externa. Se insertó un catéter que contenía 0,5 mL de suspensión de trombo en solución salina normal en el tronco de la arteria carótida externa. Cuando se soltó la grapa de la arteria carótida interna, la suspensión de trombo de 0,5 mL en solución salina normal en el catéter fluyó lentamente desde la arteria carótida externa hasta su extremo proximal, y a continuación, se inyectó en las arterias del cerebro a través de la arteria carótida interna. Posteriormente, se ligó el extremo proximal de la arteria carótida interna, se liberaron las grapas arteriales de la arteria carótida interna y la arteria carótida común y se restauró el flujo sanguíneo. Después de suturar la herida, se inyectaron por vía intramuscular 20.000 UI de penicilina para prevenir infecciones. Después de 24 horas, se infundió el compuesto 5Ak en solución salina normal (a la dosis de 5 pmoles/kg, n = 10) consecutivamente durante 6 días y se observó durante 7 días. Se realizó una autocomparación todos los días y se evaluó el grado de déficit neurológico mediante el método de Zealonga. Una puntuación de 0 indica que no hay señales de pérdida en la función neural, 1 indica que las extremidades delanteras del lado sano no se pueden estirar, 2 indica desplazamiento hacia el lado no dañado, 3 indica persecución de la cola en círculos hacia el lado no dañado, 4 indica desplazamiento involuntario con alteración de la conciencia, y 5 indica muerte. Los resultados de la evaluación se enumeran en la Tabla 13. Los datos muestran que una rata murió después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular. En el resto, diez ratas recibieron un tratamiento sucesivo de 6 días con 5 pmoles/kg de 5Ak una vez al día, no se produjo ninguna muerte. Siete ratas se recuperaron sin déficits neurológicos. Tres ratas tuvieron ligeros déficits neurológicos. Por tanto, la dosis de 5 pmoles/kg de 5Ak tiene un efecto terapéutico definido después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular, y obviamente mejor que la dosis de 2,5 pmoles/kg.
Tabla 13: Efecto terapéutico de ratas que recibieron tratamiento con 5 pmoles/kg de 5Ak después de 24 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular
Según los resultados experimentales, los compuestos de la presente invención pueden formar nanoestructuras para lograr las funciones de cruzar la barrera hematoencefálica. Además de las funciones trombolíticas y antitrombóticas,
estos compuestos también pueden captar eficazmente OH, NO, superóxido aniónico y otros radicales libres. Además, solo se necesitaba una dosis baja para una trombólisis eficaz. Una dosis más alta puede demostrar un efecto excelente en el tratamiento del accidente cerebrovascular después de 4 horas desde el inicio del accidente cerebrovascular. Por tanto, estos compuestos tienen buenas perspectivas de aplicación clínica.
Claims (14)
1. Un compuesto de fórmula I:
en donde T representa un brazo conector que tiene al menos dos grupos para la conexión;
Q representa un péptido que tiene actividad trombolítica; y
Ri y R2 representan grupos alquilo Ci-C4, en donde Ri y R2 son iguales o diferentes;
en donde al menos uno de los grupos para la conexión es un grupo amino y los grupos restantes para la conexión son grupos carboxilo o grupos amino; y
en donde el péptido que tiene actividad trombolítica se selecciona entre un grupo que consiste en un oligopéptido que contiene una secuencia PA (Pro-Ala), una secuencia PAK (Pro-Ala-Lys), una secuencia AKP (Ala-Lys-Pro) o una secuencia KAP (Lys-Ala-Pro), y un péptido que tiene unidades repetidas de la secuencia PAK, la secuencia AKP o la secuencia KAP.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el brazo conector es L-Lys, L-Asp o L-Glu.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligopéptido que tiene la secuencia PA (Pro-Ala) es un tripéptido que tiene la siguiente fórmula Q1 o Q2:
Pro-Ala-AA (Q1)
AA-Ala-Pro (Q2)
en donde AA se selecciona entre un grupo que consiste en L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp y L-Glu.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde Ri y R2 son ambos grupos metilo.
5. El compuesto de la reivindicación 4, en donde el brazo conector es L-Lys, L-Asp o L-Glu, y el péptido que tiene actividad trombolítica es un tripéptido que tiene una secuencia PA (Pro-Ala).
6. El compuesto de la reivindicación 5, en donde el compuesto tiene la siguiente fórmula la, Ib, le, Id, le, If, Ig o Ih:
en donde AA se selecciona entre un grupo que consiste en L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Aspy L-Glu.
7. El compuesto de la reivindicación 6, en donde el compuesto tiene la siguiente fórmula Ia:
en donde AA es L-Lys.
8. Una composición farmacéutica, que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un portador farmacéuticamente aceptable.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, en donde el compuesto está en forma de estructura nanoesférica.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso como fármaco trombolítico, fármaco captador de radicales libres de NO o fármaco antitrombótico.
11. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso como fármaco en el tratamiento de un accidente cerebrovascular o infarto cerebral.
12. Un método de preparación del compuesto que tiene la fórmula I de la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:
(1) proporcionar un compuesto que tiene la siguiente fórmula II:
en donde Ri y R2 representan grupos alquilo C1-C4 y Ri y R2 son iguales o diferentes;
(2) proporcionar el brazo conector T que tiene al menos dos grupos para la conexión, y el péptido Q tiene actividad trombolítica, teniendo el brazo conector un primer grupo para la conexión y un segundo grupo para la conexión;
(3) acoplar el grupo carboxilo del compuesto que tiene la fórmula II con el primer grupo para la conexión del brazo conector T para formar un compuesto que tiene la siguiente fórmula IM-1:
en condiciones de reacción apropiadas; y
(4) acoplar el péptido Q que tiene actividad trombolítica al compuesto que tiene la fórmula IM-1 en condiciones de reacción apropiadas, en donde un extremo terminal del péptido Q que tiene actividad trombolítica se acopla al segundo grupo para la conexión del brazo conector T para formar el compuesto que tiene la fórmula I.
13. El método de preparación de la reivindicación 12, en donde el primer grupo para la conexión es un grupo amino y el segundo grupo para la conexión es un grupo carboxilo o un grupo amino.
14. El método de preparación de la reivindicación 12, en donde el péptido que tiene actividad trombolítica se selecciona entre un grupo que consiste en un oligopéptido que tiene una secuencia PA (Pro-Ala), una secuencia PAK (Pro-Ala-Lys), una secuencia AKP (Ala-Lys-Pro) o una secuencia KAP (Lys-Ala-Pro), y un péptido que tiene unidades repetidas de la secuencia PAK, la secuencia AKP o la secuencia KAP.
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