KR102204781B1 - 혈전 용해, 항혈전 및 라디칼 소거능의 3가지 활성을 갖는 신규한 화합물, 및 이의 합성, 나노-구조 및 용도 - Google Patents

혈전 용해, 항혈전 및 라디칼 소거능의 3가지 활성을 갖는 신규한 화합물, 및 이의 합성, 나노-구조 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102204781B1
KR102204781B1 KR1020157035673A KR20157035673A KR102204781B1 KR 102204781 B1 KR102204781 B1 KR 102204781B1 KR 1020157035673 A KR1020157035673 A KR 1020157035673A KR 20157035673 A KR20157035673 A KR 20157035673A KR 102204781 B1 KR102204781 B1 KR 102204781B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ala
pro
compound
lys
boc
Prior art date
Application number
KR1020157035673A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160016863A (ko
Inventor
시치 펭
밍 쟈오
지안후이 우
유지 왕
치치 펭
Original Assignee
상하이 루모사 테라퓨틱스 여우시안공시
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상하이 루모사 테라퓨틱스 여우시안공시 filed Critical 상하이 루모사 테라퓨틱스 여우시안공시
Publication of KR20160016863A publication Critical patent/KR20160016863A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102204781B1 publication Critical patent/KR102204781B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/22—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C07D217/24—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

Figure 112015123436751-pct00051
I
본 발명에는 일반식 (I)로 표시되는 혈전 용해, 항혈전 및 라디칼 소거능의 3가지 활성을 갖는 새로운 화합물이 제공되고, T는 2 이상의 연결용 기를 갖는 연결암이고, Q는 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드이며, 및 R1 및 R2는 C1 -4 알킬기이고, 상기 R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 또한, 본 발명에는 상기 화합물의 제조 방법 및 용도, 및 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

Description

혈전 용해, 항혈전 및 라디칼 소거능의 3가지 활성을 갖는 신규한 화합물, 및 이의 합성, 나노-구조 및 용도{NEW COMPOUNDS HAVING TRIPLE ACTIVITIES OF THROMBOLYSIS, ANTITHROMBOTIC AND RADICAL SCAVENGING, AND SYNTHESIS, NANO-STRUCTURE AND USE THEREOF}
본 발명은 혈전 용해, 자유 라디칼 소거능 및 혈전-표적화/항혈전 기능을 동시에 구비하는 신규한 화합물과 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 연결암(linking arm)을 통해 혈전 용해 올리고펩티드와 2개의 C1 -4 알킬기를 갖는 테트라하이드로이소퀴놀린 화합물이 연결되어 형성된 신규한 이원 결합물(conjugate)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물, 상기 화합물의 제조방법 및 나노구조에 관한 것이다.
혈전성 질환, 예컨대 뇌졸중/경색의 발생률은 다양한 질환에서 1위를 차지한다. 최근 상기 질환의 발생률이 증가하는 추세에 있고, 상기 질환은 인간의 건강에 심각한 위협이 된다. 혈전성 질환의 약물 치료가 혈전증 치료의 포커스이자 핫스팟이다. 현재, 임상적으로 적용된 혈전성 약물에는 많은 제한이 있고, 안전하고 효과적인 새로운 혈전 약물의 서치가 연구 핫스팟 중 하나이다.
본 연구에 따르면, 항-혈소판 응집 및 항-혈전 활성에 더하여, 3S-1,1-디메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로 이소퀴놀린-3-카복실산은 또한 자유 라디칼 소거 활성을 갖는다. 또한, 2008년 1월 30일에 출원된 중국특허공고 CN101497651B에 혈전 용해 활성을 갖는 10개의 테트라하이드로이소퀴놀린 화합물이 개시되었다. 이러한 테트라하이드로이소퀴놀린 화합물은 3S-6,7-1,2,3,4-테트라하이드로-6,7-디하이드록시-이소퀴놀린-3-아실-Pro-Ala-Lys, 3S-6,7-1,2,3,4-테트라하이드로-6,7-디하이드록시-이소퀴놀린-3-아실-Arg-Pro-Ala-Lys, 3S-6,7-1,2,3,4-테트라하이드로-6,7-디하이드록시-이소퀴놀린-3-아실-Ala-Arg-Pro-Ala-Lys, 3S-6,7-1,2,3,4-테트라하이드로-6,7-디하이드록시-이소퀴놀린-3-아실-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys, 3S-6,7-1,2,3,4-테트라하이드로-6,7-디하이드록시-이소퀴놀린-3-아실-Gln-Arg-Pro-Ala-Lys, 3S-2-[Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-테트라하이드로-6,7-디하이드록시-이소퀴놀린-3-카복실산, 3S-2-[Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-테트라하이드로-6,7-디하이드록시-이소퀴놀린-3-카복실산, 3S-2-[Ala-Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-테트라하이드로-6,7-디하이드록시-이소퀴놀린-3-카복실산, 3S-2-[Gly-Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-테트라하이드로-6,7-디하이드록시-이소퀴놀린-3-카복실산, 및 3S-2-[Gln-Arg-Pro-Ala-Lys]-1,2,3,4-테트라하이드로-6,7-디하이드록시-이소퀴놀린-3-카복실산을 포함한다. 상기 화합물들은 "혈전 용해 활성을 갖는 6,7-디하이드록시-이소퀴놀린"으로 약칭하였다. 그러나, 이러한 혈전 용해 활성을 갖는 6,7-디하이드록시-이소퀴놀린의 효과적인 복용량은 더 높고, 항-혈전 활성 및 자유 라디칼 소거 활성은 개시 또는 검증되지 않았다. 또한, 뇌졸중 치료에 대한 효능은 단지 뇌졸중 발생 시기에만 효과적인 것으로 입증되었다. 증후군 발생 30분을 넘어서는 뇌졸중 치료에 대한 효능이 개시 또는 검증되지 않았다.
따라서, 임상 시험에서 효과적으로 안전하게 혈전성 질환을 치료하기 위해서는, 혈전 용해, 항-혈전, 및 자유 라디칼 소거 활성을 동시에 갖고, 혈액-뇌장벽(BBB)을 효율적으로 통과하고, 저용량에서 상기 설명된 효과를 달성할 수 있는 신규한 화합물이 요구된다.
본 발명의 제1 측면은 식 I을 갖는 화합물을 제공하는 것으로:
Figure 112015123436751-pct00001
(I)
상기 T는 2 이상의 연결용 기(groups)를 갖는 연결암(linking arm)을 나타내고, Q는 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드를 나타내고, R1 및 R2는 C1 -4 알킬기를 나타내고, 상기 R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이하다.
본 발명의 일 양태에서, 연결암 T의 하나 이상의 연결용 기는 아미노기이고 나머지 연결용 기는 카복실기 또는 아미노기이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 연결암 T는 천연 아미노산, 예컨대 L-Lys, L-Asp, 또는 L-Glu일 수 있다.
본 발명의 더욱 바람직한 양태에서, 연결암은 L-Lys일 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명에 사용되는 혈전성 활성을 갖는 펩티드는 PA(Pro-Ala) 시퀀스, PAK(Pro-Ala-Lys) 시퀀스, AKP(Ala-Lys-Pro) 시퀀스 또는 KAP(Lys-Ala-Pro) 시퀀스를 갖는 올리고펩티드, 또는 PAK 시퀀스, AKP 시퀀스 또는 KAP 시퀀스의 반복 유닛을 포함하는 펩티드로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 일 양태에서, 혈전 용해 활성을 갖는 올리고펩티드는 PA(Pro-Ala) 시퀀스, PAK 시퀀스, AKP 시퀀스 또는 KAP 시퀀스를 포함하는 트리펩티드 내지 옥타펩티드, 바람직하게는 PA 시퀀스를 갖는 트리펩티드일 수 있다. 더욱 바람직한 양태에서, 상기 트리펩티드는 하기 표시된 화학식 Q1 또는 Q2를 가지며:
Pro-Ala-AA (Q1)
AA-Ala-Pro (Q2)
상기 AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn , L-Asp, 및 L-Glu로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 양태에서, R1 및 R2 모두는 메틸기이다.
바람직한 양태에서, 식 I의 R1 및 R2는 메틸기이고, 연결암은 L-Lys, L-Asp, 또는 L-Glu이고, 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드는 PA(Pro-Ala) 시퀀스를 포함하는 트리펩티드이다. 예를 들어, 화합물은 식 Ia (예컨대 도 1의 화합물 5Aa-p), Ib (예컨대 도 2의 화합물 5Ba-p), Ic (예컨대 도 3의 화합물 5Ca-p), Id (예컨대 도 4의 화합물 5Da-p), Ie (예컨대 도 5의 화합물 5Ea-p), If (예컨대 도 6의 화합물 5Fa-p), Ig (예컨대 도 7의 화합물 5Ga-p), 또는 Ih (예컨대 도 8의 화합물 5Ha-p)를 가질 수 있고:
Figure 112019017909000-pct00061
Ia
Figure 112019017909000-pct00062
Ib
Figure 112015123436751-pct00004
Ic
Figure 112015123436751-pct00005
Id
Figure 112019017909000-pct00063
Ie
Figure 112019017909000-pct00064
If
Figure 112019017909000-pct00065
Ig
Figure 112019017909000-pct00066
Ih
상기 AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn , L-Asp, 및 L-Glu로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 제2 측면은 상기 설명된 본 발명의 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 화합물은 나노구형 구조의 형태일 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 약학 조성물은 혈전 용해 약물, NO 자유 라디칼 소거 약물, 또는 혈전-표적화/항혈전 약물로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 약학 조성물은 뇌졸중 또는 뇌경색의 치료 약물로 사용될 수 있고, 더욱 바람직하게는 증후군 발병 4시간, 6시간, 및 24시간 이후 뇌졸중 또는 뇌경색의 치료 약물로 사용될 수 있으며, 연속적인 투여를 통한 치료 약물로 사용될 수 있다.
본 발명의 제3 측면은 식 I을 갖는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(1) 식 II를 갖는 화합물을 제공하는 단계로서:
Figure 112015123436751-pct00010
(II)
상기 R1 및 R2는 C1 -4 알킬기이고, R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이하다.
(2) 2 이상의 연결용 기를 갖는 연결암 T, 및 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드 Q를 제공하는 단계로서, 상기 연결암은 제1 연결용 기 및 제2 연결용 기를 갖는다.
(3) 적당한 반응 조건 하에서, 식 II를 갖는 화합물의 카복실기를 연결암 T의 제1 연결용 기와 연결하여 식 IM-1을 갖는 화합물을 형성하는 단계; 및
Figure 112015123436751-pct00011
(IM-1)
(4) 적당한 반응 조건 하에서 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드 Q를 식 IM-1을 갖는 화합물과 연결하되, 상기 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드 Q의 일단은 연결암 T의 제2 연결용 기와 연결되어 식 I을 갖는 화합물을 형성하는 단계.
본 발명의 일 양태에서, 연결암 T의 제1 연결용 기는 축합 반응에서 식 II의 화합물의 카복실기에 결합하는데 사용되는 아미노기이다. 또한, 제2 연결용 기는 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드 Q의 N-말단 또는 C-말단에 결합하는데 사용되는 카복실기 또는 아미노기이다. 본 발명의 제조방법에서 사용된 연결암 T 및 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드 Q의 정의는 상기 식 I을 갖는 화합물의 정의와 동일하다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 제조방법에서 연결암은 L-Lys, L-Asp, 또는 L-Glu, 더욱 바람직하게는 L-Lys일 수 있다. 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드는 PA(Pro-Ala) 시퀀스를 포함하는 트리펩티드, PAK(Pro-Ala-Lys) 시퀀스, AKP(Ala-Lys-Pro) 시퀀스 또는 KAP(Lys-Ala-Pro) 시퀀스를 포함하는 올리고펩티드, 또는 PAK 시퀀스, AKP 시퀀스 또는 KAP 시퀀스를 포함하는 반복 시퀀스를 갖는 펩티드일 수 있고, 더욱 바람직하게는 하기 표시된 식 Q1 또는 Q2를 갖는 트리펩티드일 수 있으며:
Pro-Ala-AA (Q1)
AA-Ala-Pro (Q2)
상기 AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn , L-Asp, 및 L-Glu로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 식 II를 갖는 화합물의 R1 및 R2 모두는 메틸기이고, 연결암은 L-Lys, L-Asp, 또는 L-Glu이고, 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드는 PA(Pro-Ala) 시퀀스를 포함하는 트리펩티드이다. 본 발명의 더욱 바람직한 양태에서, 본 발명의 제조방법은 상기 식 Ia-h를 갖는 화합물을 형성하는데 사용될 수 있다.
래트(rat)에서의 체내 시험은 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물이 저용량에서 우수한 혈전 용해 및 항혈전 활성을 갖고, 뇌졸중에 걸린 래트의 신경 기능을 효과적으로 보호할 수 있으며, 따라서 임상 시험에서 혈전성 질환을 효과적이고 안전하게 치료할 수 있음을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 일 양태에 따른 화합물 Ia의 합성 도식이다.
도 2는 본 발명의 일 양태에 따른 화합물 Ib의 합성 도식이다.
도 3은 본 발명의 일 양태에 따른 화합물 Ic의 합성 도식이다.
도 4는 본 발명의 일 양태에 따른 화합물 Id의 합성 도식이다.
도 5는 본 발명의 일 양태에 따른 화합물 Ie의 합성 도식이다.
도 6은 본 발명의 일 양태에 따른 화합물 If의 합성 도식이다.
도 7은 본 발명의 일 양태에 따른 화합물 Ig의 합성 도식이다.
도 8은 본 발명의 일 양태에 따른 화합물 Ih의 합성 도식이다.
도 9는 본 발명의 일 양태에 따른 화합물 5Aa-p의 나노구조체의 TEM 사진을 나타낸다.
첨부된 도면 및 실시예와 관련하여 하기 제공되는 상세한 설명은 본 발명의 기술적 방안을 설명하기 위해 사용된다. 그러나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것이 아닌 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본 발명에서, 2개의 C1-4 알킬기를 갖는 테트라하이드로이소퀴놀린 화합물(즉, 식 II의 화합물) 및 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드는 연결암을 통해 연결되어 혈전 용해, 자유 라디칼 소거, 및 혈전-표적화/항혈전 활성의 3가지 기능을 동시에 구비하는 신규한 이원 결합물을 형성한다. 상기 결합물은 하기에서 "본 발명의 신규한 이원 결합물"로 약칭된다.
2개의 C1-4 알킬기가 식 II를 갖는 화합물의 포지션 1에 도입되었고 연결암이 포지션 3에 도입되었기 때문에, "본 발명의 신규한 이원 결합물"은, "혈전 용해 활성을 갖는 6,7-디하이드록시이소퀴놀린"과 비교하여 하기와 같은 4개의 이점을 갖는다. 1) 식 II를 갖는 화합물의 포지션 1에 도입된 C1-4 알킬기 2개의 입체 장애 효과가 카복시펩티다아제 및 아미노펩티다아제의 접근을 차단할 수 있고, 따라서 "본 발명의 신규한 이원 결합물"의 혈전 용해성 올리고펩티드는 쉽게 가수분해되지 않을 수 있다; 2) 식 II를 갖는 화합물의 포지션 1에 도입된 C1-4 알킬기 2개의 소수성 기여는 "본 발명의 신규한 이원 결합물"이 혈액-뇌장벽을 더욱 효율적으로 통과하도록 할 수 있다; 3) 식 II를 갖는 화합물의 포지션 1에 도입된 C1-4 알킬기 2개의 전자 공여성 효과는 "본 발명의 신규한 이원 결합물"의 환원 능력이 자유 라디칼 소거에 대한 요구를 만족시키도록 할 수 있다; 4) 식 II를 갖는 화합물의 포지션 3에 도입된 연결암은 "본 발명의 신규한 이원 결합물"이 효과적으로 서로 응집하여 20-210 nm, 바람직하게는 20-100 nm 범위의 직경을 갖는 나노구형의 구조체를 형성하도록 할 수 있다. 이 안정한 나노구조체는 "본 발명의 신규한 이원 결합물"이 혈액 순환에서 대식세포에 의해 집어 삼켜지지 않게 도울 수 있고, 따라서 혈전 형성 부위로 안전하게 이동될 수 있고 최종적으로 혈액-뇌혈관을 통과할 수 있다. 요약하면, "본 발명의 신규한 이원 결합물"은 혈액-뇌장벽을 통과하는 기능을 달성하는 나노구조체를 형성할 수 있다. 혈전 용해 및 항혈전 기능에 더하여, "본 발명의 신규한 이원 결합물"은 또한 OH, NO, 및 슈퍼옥사이드 음이온의 자유 라디칼을 효과적으로 소거할 수 있고, 저용량에서 효과적인 혈전 용해를 달성할 수 있고, 이에 의해 임상 적용에 대해 우수한 전망을 제공한다.
본원에서 사용된, "연결용 기"는 축합 반응을 수행할 수 있는 작용기, 예컨대 카복실기 또는 아미노기를 의미한다.
본원에서 사용된, "연결암"은 식 II를 갖는 화합물을 혈전 용해 활성을 갖는 올리고펩티드 Q와 연결할 수 있는 연결용 기를 갖는 분자를 의미한다. 연결암 중 하나 이상의 연결용 기는 아미노기이고, 나머지 연결용 기는 카복실기 또는 아미노기이다. 본 발명에 따르면, 연결암은 천연 아미노산, 예컨대 L-Lys, L-Asp, 또는 L-Glu일 수 있다.
도입된 연결암은 "본 발명의 신규한 이원 결합물"이 대식세포에 의해 휩싸이지 않는 안정한 나노구형 구조를 형성하도록 한다. 나노구형 구조는 혈전 형성 부위로 안전하게 이동될 수 있고 최종적으로 혈액-뇌장벽을 통과할 수 있다. 구체적으로, 연결암이 L-Lys일 때, "본 발명의 신규한 이원 결합물"은 효과적으로 서로 응집하여 20-210 nm, 바람직하게는 20-100 nm 범위의 직경을 갖는 나노구형의 구조체를 형성할 수 있다. 상기 안정한 나노구조체는 혈전 형성 부위로의 안전한 이동 및 최종적인, 혈액-뇌장벽 통과가 가능하도록, "본 발명의 신규한 이원 결합물"이 혈액 순환에서 대식세포에 의해 집어 삼켜지지 않게 보호되도록 도울 수 있다.
본원에서 사용된, "올리고펩티드"는 1000 달톤(D) 이하의 분자량을 갖고 일반적으로 3 내지 8의 아미노산으로 이루어진 작은 펩티드 분자를 의미한다.
본원에서 사용된, "혈전 용해 활성을 갖는 펩티드"는 혈관 투과성 및 혈전 용해를 증가시키는 기능을 갖는 올리고펩티드 혈전 용해제를 의미하며, P6A(ARPAK), P6A의 대사산물, 및 관련 유도체를 포함한다. 이전 연구는 Pro-Ala-Lys가 우수한 활성을 갖는 가장 짧은 시퀀스이고, 또한 Ala-Arg-Pro-Ala-Lys, Gly-Arg-Pro-Ala-Lys, Gln-Arg-Arg-Pro-Ala-Lys 및 Pro-Ala-Lys를 포함하는 몇몇 혈전 용해성 올리고펩티드 중 가능 안정한 시퀀스라고 개시한 바 있다. 연결암을 통해 식 II를 갖는 화합물의 포지션 3에 Pro-Ala-AA 시퀀스를 갖는 트리펩티드의 도입은 "본 발명의 신규한 이원 결합물"이 더욱 향상된 안정성 및 강해진 혈전 용해 활성을 갖도록 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 사용된 PAK, AKP, 또는 KAP의 시퀀스를 포함하는 올리고펩티드는 PAK, RPAK (Arg-Pro-Ala-Lys), ARPAK (Ala-Arg-Pro-Ala-Lys), GRPAK (Gly-Arg-Pro-Ala-Lys), QRPAK (Gln-Arg-Pro-Ala-Lys), AKP, KAP, KPAK (Lys-Pro-Ala-Lys), PAKP (Pro-Ala-Lys-Pro), AKPAK (Ala-Lys-Pro-Ala-Lys), 또는 PAKPA (Pro-Ala-Lys-Pro-Ala)일 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 사용된 PAK 시퀀스, AKP 시퀀스 또는 KAP 시퀀스의 반복 유닛을 갖는 펩티드는 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드로서 중국특허공고 CN101190941에 설명된 펩티드들 중 임의의 것일 수 있으며, PAK 시퀀스의 반복 유닛을 갖는 펩티드, 예컨대 (PAK)2, (PAK)3, (PAK)4, (PAK)5 및 (PAK)6; AKP 시퀀스의 반복 유닛을 갖는 펩티드, 예컨대 (AKP)2, (AKP)3, (AKP)4, (AKP)5 및 (AKP)6; 및 KPA 시퀀스의 반복 유닛을 갖는 펩티드, 예컨대 (KPA)2, (KPA)3, (KPA)4, (KPA)5 및 (KPA)6를 포함한다.
본원에서 사용된, "C1-4 알킬기"는 1-4 탄소를 갖는 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 또는 sec-부틸, tert-부틸을 의미한다. 식 I을 갖는 화합물의 R1 및 R2 모두가 메틸기일 때, 출발 물질로 사용된 식 II를 갖는 화합물은 트리플루오로아세테이트(TFA) 및 무수 마그네슘 설페이트의 존재 하에서 3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌 및 아세톤의 Pictet-Spengler 축합에 의해 수득될 수 있다. 장점은 용이한 제조이다.
본 발명에서, 약학 조성물은 임의의 임상적으로 허용 가능하고 적합한 제제일 수 있다. 바람직하게는, 제제는 주사 가능한 제제(분말주사, 동결건조분말주사, 액체주사, 수액, 등)이다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 만니톨, 물, 링거액, 또는 등장성 염화 나트륨 용액 등일 수 있다.
본 발명에 따른 화합물의 나노구형 구조는 20-210 nm, 및 더욱 바람직하게는, 20-100 nm의 직경을 가지며, 이에 의해 화합물은 혈액-뇌장벽을 더욱 효율적으로 통과할 수 있다.
안정한 나노구조체는 본 발명의 화합물이 대식세포에 의해 집어 삼켜지지 않도록 도울 수 있고, 이에 의해 화합물은 혈전증 형성 부위로 안전하게 이동될 수 있고 결국 혈액-뇌장벽을 통과할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 심근경색(myocardial infarction), 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke), 심부정맥 혈전증(deep vein thrombosis), 폐색전증(pulmonary embolism), 말초동맥 폐색증(peripheral arterial occlusive disease), 정맥도관 폐색(occluded central vascular access devices), 동정맥루공 및 지름술 폐색(clotted arteriovenous fistula and shunts), 경동맥 협착증(carotid stenosis) 등의 치료를 위한 혈전 용해 약물로써 사용될 수 있다. 이 발명의 약학 조성물은 또한 신경변성질환(neurodegenerative diseases), 심혈관계질환(cardiovascular disease), 정신질환(mental illness), 고도병(altitude sickness), 당뇨병(diabetes), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 암(cancer), 취약 X 증후군(fragile x syndrome), 용혈빈혈(sickle cell disease), 편평태선(lichen planus), 백반증(vitiligo), 만성 피로 증후군(chronic fatigue syndrome) 등의 치료를 위한 NO 자유 라디칼 소거 약물로써 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 혈소판 증가증(thrombocytosis), 골수증식질환(myeloproliferative disease), 진성다혈구증(polycythemia vera), 버드-키아리 증후군(budd-chiari syndrome) 등의 치료를 위한 혈전-표적화/항혈전 약물로써 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물/화합물은 OH, NO 및 슈퍼옥사이드 음이온 자유 라디칼 소거, 혈전 용해, 및 혈전-표적화/항혈전 기능을 동시에 구비한다. 따라서, 이들은 뇌졸중 증후군 발병 4시간 이후에도 환자에게 치료 효과가 유지될 수 있으며, 즉 이들의 사용은 tPA의 치료 가능 시간 3시간에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 약학 조성물/화합물의 사용은 tPA와 같은 전신 출혈 반응을 초래하지 않을 것이며, 허혈-재관류 과정 동안 다량의 OH, NO, 및 슈퍼옥사이드 음이온의 자유 라디칼을 소거하여 치료 시 환자의 뇌 조직 손상을 방지할 수 있다. 2개의 C1 -4 알킬기 및 연결암이 식 II를 갖는 화합물의 포지션 1 및 3에 각각 도입되어, "본 발명의 신규한 이원 결합물"은 "혈전 용해 활성을 갖는 6,7-디하이드록시이소퀴놀린"과 비교하여, 낮은 투여량에서의 항혈전 활성, 독특한 자유 라디칼 소거능 및 더욱 향상된 혈전 용해 활성뿐만 아니라, 더 높은 투여량에서 뇌졸중 발병 4시간 이후 뇌졸중 치료에 대해 우수한 치료 효과를 나타낸다.
발행된 중국특허 CN101497651B에서, "혈전 용해 활성을 갖는 6,7-디하이드록시이소퀴놀린"은 10 nmol/kg의 투여량에서 혈전 용해 활성을 갖는 것으로 나타났다. 그러나, 본 발명의 화합물은 0.1 nmol/kg의 투여량에서 우수한 혈전 용해 및 항혈전 활성을 갖는다. 또한, 본 발명의 화합물은 뇌졸중 발병 4, 6, 및 24시간 이후의 뇌졸중 치료에서 각각 1, 2.5, 및 5 μmol/kg의 투여량에서 상당한 치료 효과를 갖는다.
본 발명의 화합물의 제조방법에서, 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드 Q는 먼저 제조된 다음 연결암 T의 연결을 위한 제2 연결용 기에 결합될 수 있으며, 또는 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드 Q의 하나 이상의 아미노산이 미리 정해진 순서에 따라 연결암 T에 순차적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 혈전 용해성 펩티드 Q의 일단에 있는 첫 번째 아미노산이 연결암 T의 제2 연결용 기에 결합되고, 이후 나머지 하나 이상의 아미노산이 순차적으로 이에 결합된다.
본 발명의 제조방법은 더 많은 이해를 위해 하기에서 더욱 상세하게 설명된다.
식 II의 화합물은 하기 합성 루트에 따라 제조될 수 있다:
Figure 112015123436751-pct00012
상기 R1 및 R2 모두는 C1 -4 알킬기이고 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌(SM-1) 및 화합물 SM-2가 TFA에 용해되고, 3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌 및 화합물 SM-2는 무수 마그네슘 설페이트의 존재 하에서 식 II를 갖는 화합물을 수득하기 위해 Pictet-Spengler 축합을 거친다.
바람직한 양태에서, 발명의 제조방법에서 연결암은 L-Lys이고, 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드는 PA(Pro-Ala) 시퀀스를 갖는 트리펩티드이다. 예를 들어, 화합물 II의 카복실기는 L-Lys의 N-말단에 연결되고, 이후 PA 시퀀스를 포함하는 트리펩티드가 L-Lys 연결암의 C-말단 또는 나머지 N-말단에 연결된다. 일부 양태에서, R1 및 R2 모두가 메틸기(즉, 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-카복실산)이고, 연결암은 L-Lys이고, 및 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드는 PA(Pro-Ala) 시퀀스를 포함하는 트리펩티드일 때, 화합물 Ia, Ib, Ic, 또는 Id가 본 발명의 제조방법에 따라 제조될 수 있다.
화합물 Ia가 본 발명의 제조방법에 따라 제조될 경우, 도 1에 개시된 합성 루트가 참고될 수 있다.
도 1에 제시된 양태에서, PA 시퀀스를 포함하는 트리펩티드는 먼저 합성된 이후 L-Lys 연결암에 결합되며, AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, 및 L-Glu 잔기(화합물 5Aa-p에 각각 대응)로부터 선택된다. 반응 조건은 하기에 나열된다: i) 아세톤, TFA, MgSO4; ii) HCl, Lys(Boc)-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) 4M HCl/EA, 얼음 욕조(ice bath); iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; 4M HCl/EA, 얼음 욕조(ice bath); vi) EtOH, Pd/C; vii) 2M NaOH. 다른 양태에서, PA 시퀀스를 포함하는 트리펩티드의 아미노산 하나(예컨대 AA)가 L-Lys 연결암에 결합되고, 이후 PA 시퀀스를 포함하는 트리펩티드의 나머지 두 개의 아미노산(예컨대 Pro-Ala)이 AA에 결합된다.
예를 들어, 화합물 Ia를 형성하는 양태에서, 본 발명의 제조방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
1) TFA 및 무수 마그네슘 설페이트의 존재 하에서, 3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌 및 아세톤이 Pictet-Spengler 축합을 거쳐 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-카복실산을 수득한다;
2) 디사이클로헥실 카보디이미드(DCC) 및 N-하이드록시벤조트리아졸 트리아졸(HOBt)의 존재 하에서, 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-카복실산 및 HClㆍLys(Boc)-OBzl을 무수 N,N-디메틸포름아미드(DMF)에서 축합하여 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc)-Obzl을 형성하였다. 축합 반응에서, 혼합물을 pH=9로 지속적으로 조정하기 위해 N-메틸모르폴린(NMM)이 사용되었다;
3) HCl의 에틸 아세테이트 용액에서 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc)-OBzl로부터 Boc를 제거하여 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl를 형성하였다;
4) DCC 및 HOBt의 존재 하에서, Boc-Pro를 TosㆍAla-Obzl과 무수 THF에서 축합하여 Boc-Pro-Ala-OBzl을 형성하였다;
5) EtOH에서, Boc-Pro-Ala-OBzl을 수소 첨가 분해하여 Boc-Pro-Ala를 형성하였다;
6) DCC 및 HOBt의 존재 하에서, Boc-Pro-Ala를 AA-Obzl과 무수 THF에서 축합하여 Boc-Pro-Ala-AA-OBzl을 형성하였다(AA는 L-Ala, Gly, L-Phe, L-Val, L-Leu, L-Ile, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Tyr, L-Lys(Z), L-Pro, L-Asn, 및 L-Gln 잔기로부터 선택된다);
7) EtOH에서, 단계 6의 Boc-Pro-Ala-AA-OBzl을 수소 첨가 분해하여 Boc-Pro-Ala-AA를 형성하였다;
8) DCC 및 HOBt의 존재 하에서, 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl을 단계 6의 Boc-Pro-Ala-AA와 무수 DMF에서 축합하여 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-AA)-OBzl(AA의 정의는 단계 6에 기재된 바와 같음)을 형성하였다;
9) DCC 및 HOBt의 존재 하에서, 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl을 Boc-AA(OBzl)과 무수 DMF에서 축합하여 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys[Boc-AA(OBzl)]-OBzl(AA는 L-Asp, L-Glu 잔기로부터 선택됨)을 형성하였다;
10) HCl의 에틸 아세테이트 용액에서, Boc를 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys[Boc-AA(OBzl)]-OBzl로부터 제거하여 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys[AA(OBzl)]-OBzl(AA의 정의는 단계 9에 기재된 바와 같음)을 형성하였다;
11) DCC 및 HOBt의 존재 하에서, 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys[AA(OBzl)]-OBzl을 Boc-Pro-Ala와 무수 DMF에서 축합하여 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys[Boc-Pro-Ala-AA(OBzl)]-OBzl(AA의 정의는 단계 9에 기재된 바와 같음)을 형성하였다;
12) 수소 첨가 분해 및 Boc의 제거 후, 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-AA)-OBzl(AA의 정의는 단계 6에 기재된 바와 같음) 및 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys[Boc-Pro-Ala-AA(OBzl)]-OBzl(AA의 정의는 단계 9에 기재된 바와 같음)은 모두 탈보호되어 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-AA)를 수득하였다.
본 발명의 제조방법에 따라 본 발명의 화합물 Ib가 제조되는 경우, 도 2에 개시된 합성 루트가 참고될 수 있으며, AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, 및 L-Glu 잔기(화합물 5Ba-p에 각각 대응)로부터 선택된다. 반응 조건은 하기에 나열된다: i) 아세톤, TFA, MgSO4; ii) HCl, Lys(Boc)-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) EtOH, Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; 4M HCl/EA, 얼음 욕조(ice bath); vi) EtOH, Pd/C; vii) 4M HCl/EA, 얼음 욕조(ice bath).
본 발명의 제조방법에 따라 본 발명의 화합물 Ic가 제조되는 경우, 도 3에 개시된 합성 루트가 참고될 수 있으며, AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, 및 L-Glu 잔기(화합물 5Ca-p에 각각 대응)로부터 선택된다. 반응 조건은 하기에 나열된다: i) 아세톤, TFA, MgSO4; ii) HCl, Boc-Lys-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) 4M HCl/EA 얼음 욕조(ice bath); iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; 4M HCl/EA, 얼음 욕조(ice bath); vi) EtOH, Pd/C; vii) EtOH, Pd/C.
본 발명의 제조방법에 따라 본 발명의 화합물 Id가 제조되는 경우, 도 4에 개시된 합성 루트가 참고될 수 있으며, AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, 및 L-Glu 잔기(화합물 5Da-p에 각각 대응)로부터 선택된다. 반응 조건은 하기에 나열된다: i) 아세톤, TFA, MgSO4; ii) HCl, Boc-Lys-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) EtOH, Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; 4M HCl/EA, 얼음 욕조(ice bath); vi) EtOH, Pd/C; vii) EtOH, Pd/C.
다른 바람직한 양태에서, 연결암은 L-Asp이고, 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드는 PA(Pro-Ala) 시퀀스를 포함하는 트리펩티드이다. 예를 들어, 식 II를 갖는 화합물의 카복실기는 L-Asp의 N-말단에 연결되고, 이후 PA 시퀀스를 포함하는 트리펩티드가 L-Asp 연결암의 나머지 C-말단 중 하나에 연결된다. 일부 양태에서, 식 II를 갖는 화합물의 R1 및 R2 모두가 메틸기(즉, 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-카복실산)이고, 연결암은 L-Asp이고, 및 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드는 PA(Pro-Ala) 시퀀스를 포함하는 트리펩티드일 때, 본 발명의 제조방법은 상기 화합물 Ie 또는 If를 형성할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 본 발명의 화합물 Ie가 제조되는 경우, 도 5에 개시된 합성 루트가 참고될 수 있으며, AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, 및 L-Glu 잔기(화합물 5Ea-p에 각각 대응)로부터 선택된다. 반응 조건은 하기에 나열된다: i) 아세톤, TFA, MgSO4; ii) HCl, Asp(OCH3)-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) EtOH, Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; 2M NaOH, 얼음 욕조(ice bath); vi) EtOH, Pd/C; vii) 4M HCl/EA, 얼음 욕조(ice bath).
본 발명의 제조방법에 따라 본 발명의 화합물 If가 제조되는 경우, 도 6에 개시된 합성 루트가 참고될 수 있으며, AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, 및 L-Glu 잔기(화합물 5Fa-p에 각각 대응)로부터 선택된다. 반응 조건은 하기에 나열된다: i) 아세톤, TFA, MgSO4; ii) HCl, Asp(OBzl)-OCH3, DCC, HOBt, NMM; iii) 2M NaOH, iv) DCC, HOBt, NMM, v) EtOH, Pd/C; 2M NaOH, 얼음 욕조(ice bath); vi) EtOH, Pd/C; vii) 4M HCl/EA, 얼음 욕조(ice bath).
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 연결암은 L-Glu이고, 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드는 PA(Pro-Ala) 시퀀스를 포함하는 트리펩티드이다. 예를 들어, 식 II를 갖는 화합물의 카복실기는 L-Glu의 N-말단에 연결되고, 이후 PA 시퀀스를 포함하는 트리펩티드가 연결암 L-Glu의 나머지 C-말단 중 하나에 연결된다. 일부 양태에서, 식 II를 갖는 화합물의 R1 및 R2 모두가 메틸기(즉, 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-카복실산)이고, 연결암은 L-Glu이고, 및 혈전 용해 활성을 갖는 펩티드는 PA(Pro-Ala) 시퀀스를 포함하는 트리펩티드일 때, 본 발명의 제조방법은 상기 화합물 Ig 또는 Ih를 형성할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 본 발명의 화합물 Ig가 제조되는 경우, 도 7에 개시된 합성 루트가 참고될 수 있으며, AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, 및 L-Glu 잔기(화합물 5Ga-p에 각각 대응)로부터 선택된다. 반응 조건은 하기에 나열된다: i) 아세톤, TFA, MgSO4; ii) HCl, Glu(OCH3)-OBzl, DCC, HOBt, NMM; iii) EtOH, Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM; v) EtOH, Pd/C; 2M NaOH, 얼음 욕조(ice bath); vi) EtOH, Pd/C; vii) 4M HCl/EA, 얼음 욕조(ice bath).
본 발명의 제조방법에 따라 본 발명의 화합물 Ih가 제조되는 경우, 도 8에 개시된 합성 루트가 참고될 수 있으며, AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, 및 L-Glu 잔기(화합물 5Ha-p에 각각 대응)로부터 선택된다. 반응 조건은 하기에 나열된다: i) 아세톤, TFA, MgSO4; ii) HCl, Glu(OBzl)-OCH3, DCC, HOBt, NMM; iii) EtOH, Pd/C; iv) DCC, HOBt, NMM; v) EtOH, Pd/C; 2M NaOH, 얼음 욕조(ice bath); vi) EtOH, Pd/C; vii) 4M HCl/EA, 얼음 욕조(ice bath).
본 발명의 화합물 및 약학 조성물의 래트(rat)에서의 체내 시험은 본 발명의 화합물 및 약학 조성물이 저용량에서 우수한 혈전 용해 및 항혈전 활성을 갖고, 뇌졸중에 걸린 래트의 신경 기능을 효과적으로 보호할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 화합물 및 약학 조성물은 임상 시험에서 혈전성 질환을 효과적이고 안전하게 치료할 수 있다.
하기 구체적인 실시예와 관련하여 본 발명이 설명될 것이며, 본 발명의 장점과 특징은 그 설명에 의해 더욱 명확해질 것이다. 이러한 실시예는 단지 예시적인 것으로서, 결코 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 본 기술 분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않는 한 본 발명의 기술 방안의 세부 내용과 형식에서 수정 또는 대체가 이루어질 수 있고, 이러한 수정 또는 교체는 본 발명의 보호 범위 내에 있는 것으로 의도되는 것을 이해할 수 있다.
실시예 1-68은 본 발명의 화합물 5Aa-p 제조에 대한 도 1의 제조방법을 설명한다.
실시예 1: 액상에서 펩티드를 합성하기 위한 일반적인 공정
보호된 N-말단을 갖는 아미노산을 무수 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시키고, 수득된 용액에 N-하이드록시벤조트리아졸 트리아졸(HOBt)을 첨가하였다. 상기 용액을 냉욕시킨다. 여기에 무수 THF에 용해된 N,N-디사이클로헥실 카보디이미드(DCC)를 천천히 첨가하고, 이후 0 ℃에서 15분간 교반하여 반응 용액 (I)을 수득하였다. 또한 N-메틸모르폴린(NMM)으로 pH를 9로 조정하면서 보호된 C-말단을 갖는 아미노산을 무수 THF에 용해시키고, 이후 N-메틸모르폴린(NMM)으로 pH 9를 유지하면서 반응 용액 (I)과 혼합하였다. 반응 혼합물을 10시간 동안 상온에서 교반하였고, 반응 공정은 TLC로 모니터링하였다. TLC로 표시된 바와 같이 출발 물질 스팟이 소실될 때까지, 반응 혼합물을 여과하고 여과액을 감압 하에서 농축하였다. 수득된 점성 농축물을 에틸 아세테이트(EA) 또는 디클로로메탄에 용해시키고, 수득된 용액을 순차적으로 5% NaHCO3 수용액, 5% KHSO4 수용액, 및 포화 NaCl 수용액으로 세척하였다. EA 또는 디클로로메탄 상(phase)은 무수 마그네슘 설페이트로 건조, 여과하고 여과액을 감압 하에서 농축하여 목적으로 하는 화합물을 수득하였다.
실시예 2: Boc를 제거하기 위한 일반적인 공정
Boc 보호된 펩티드를 소량의 무수 에틸 아세테이트에 용해시키고, 이에 HCl의 에틸 아세테이트 용액(4M)을 첨가하고 TLC로 표시되는 바와 같이 출발 물질 스팟이 소실될 때까지 얼음 욕조 상에서 교반하였다. 반응 용액은 반복적으로 워터 펌프로 건조시켰으며, 또한 HCl 가스를 완전히 제거하였다. 잔류물은 반복적으로 석유 에테르 또는 무수 에테르로 분쇄하여 목적으로 하는 화합물을 수득하였다.
실시예 3: 벤질 에스테르기를 제거하기 위한 일반적인 공정
벤질 에스테르기 보호된 폴리펩티드를 CH3OH로 용해시키고, 이에 NaOH 수용액(2M)을 천천히 적가하고 얼음 욕조 상에서 교반하였으며, 반응 용액은 TLC에 나타나는 바와 같이 출발 물질 스팟이 소실될 때까지 0 ℃에서 유지시켰다. 반응 용액을 1M HCl을 이용하여 중성으로 조정하였고, 감압하여 MeOH를 제거하였다. 반응 용액을 1M HCl을 이용하여 pH 2로 산성화시키고 이후 EA로 추출하였다. 결합된 EA 상(phase)은 포화 NaCl 수용액으로 세척하여 중화시키고, 무수 Na2SO4로 건조, 및 여과하였다. 여과액은 감압 하에서 농축하여 목적으로 하는 화합물을 수득하였다.
실시예 4: 카보벤즈옥시기 또는 벤질 에스테르기를 제거하기 위한 일반적인 공정
카보벤즈옥시기 또는 벤질 에스테르기 보호된 펩티드를 적당량의 EtOH에 용해시키고, 이에 Pd/C(반응물의 10%)를 첨가하고, 여기에 수소를 도입하여 상온에서 수소 첨가 분해 반응을 수행하였다. 반응 후, 반응 혼합물을 여과한 다음 감압 하에서 농축하여 목적으로 하는 화합물을 수득하였다.
실시예 5: Boc - Pro 의 제조
5.75 g(50 mmol) L-Pro를 1 mL 물에 용해시켰다. 이에 25 mL NaOH 수용액(2M)을 적가하고 얼음 욕조 상에서 천천히 교반하여 용액 (I)을 수득하였다. 13.08 g(60 mmol) (Boc)2O를 25 mL 디옥산에 용해시켜 용액 (II)를 수득하였다. 용액 (II)를 용액 (I)에 적가하고 얼음 욕조 상에서 교반하였으며, 이후 NaOH 수용액(2M)을 적가하여 pH 9로 조정하고, 혼합물을 얼음 욕조 상에서 교반하였다. 30분 후, 혼합물의 pH 값을 측정하였고, NaOH 수용액(2M)을 사용하여 pH 값을 9로 유지시켰다. 워터 펌프는 생성 가스를 추출하는데 사용되었다. 48시간 동안 교반한 후, TLC 모니터링(CH2Cl2: MeOH 20:1)은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 혼합물은 감압 하에서 농축하여 디옥산을 제거하였다. 잔류물은 5 mL 물에 용해시키고, 이후 포화 KHSO4 수용액을 이용하여 pH 2로 조정하였다. 수용액은 EA로 3회 추출하였다. 결합된 EA 상(phase)은 5% KHSO4로 3회 세척하였고, 이후 포화 NaCl 수용액으로 세척하여 중화시켰다. 분리된 EA 층은 무수 황산 나트륨을 첨가하여 건조시킨 다음 여과하였다. 여과액은 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물은 EA-석유 에테르로 재결정하여 표제 화합물 10.2 g(95%)을 무색 결정으로서 수득하였다. ESI-MS (m/e): 214 [M-H]-.
실시예 6: Boc-Pro-Ala-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 4.3 g(20.0 mmol) Boc-Pro 및 8.45 g(24.0 mmol) TosㆍAla-OBzl로부터 표제 화합물 5.19 g(68%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 377 [M + H]+.
실시예 7: Boc-Pro-Ala의 제조
실시예 4의 방법에 따라, 5.19 g(13.8 mmol) Boc-Pro-Ala-OBzl로부터 표제 화합물 3.59 g(91%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 285 [M-H]-.
실시예 8: Boc-Pro-Ala-Ala-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.00 g(10.49 mmol) Boc-Pro-Ala-OBzl 및 3.26 g(12.03 mmol) TosㆍAla-OBzl로부터 표제 화합물 3.04 g(68%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 448 [M + H]+.
실시예 9: Boc-Pro-Ala-Ala의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 4.47 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Ala-OBzl로부터 표제 화합물 3.21 g(90%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 356 [M-H]-.
실시예 10: Boc-Pro-Ala-Val-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.00 g(10.49 mmol) Boc-Pro-Ala 및 3.58 g(12.01 mmol) TosㆍVal-OBzl로부터 표제 화합물 3.28 g(69%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 476 [M + H]+.
실시예 11: Boc-Pro-Ala-Val의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 4.75 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Val-OBzl로부터 표제 화합물 3.54 g(92%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 384 [M-H]-.
실시예 12: Boc-Pro-Ala-Trp-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.00 g(10.49 mmol) Boc-Pro-Ala 및 3.97 g(12.01 mmol) HClㆍTrp-OBzl로부터 표제 화합물 3.65 g(65%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 563 [M + H]+.
실시예 13: Boc-Pro-Ala-Trp의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 5.62 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Trp-OBzl로부터 표제 화합물 4.21 g(89%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 471 [M-H]-.
실시예 14: Boc-Pro-Ala-Tyr-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.15 g(11 mmol) Boc-Pro-Ala 및 4.43 g(10 mmol) TosㆍTyr-OBzl로부터 표제 화합물 3.73 g(69%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 540 [M + H]+.
실시예 15: Boc-Pro-Ala-Tyr의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 5.39 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Tyr-OBzl로부터 표제 화합물 4.13 g(92%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 448 [M-H]-.
실시예 16: Boc-Pro-Ala-Phe-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.00 g(10.0 mmol) Boc-Pro-Ala 및 2.92 g(11.0 mmol) TosㆍPhe-OBzl로부터 표제 화합물 3.82 g(66%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 524 [M + H]+.
실시예 17: Boc-Pro-Ala-Phe의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 5.23 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Phe-OBzl로부터 표제 화합물 3.94 g(91%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 432 [M-H]-.
실시예 18: Boc-Pro-Ala-Gly-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.15 g(11 mmol) Boc-Pro-Ala 및 3.37 g(10 mmol) TosㆍGly-OBzl로부터 표제 화합물 2.90 g(67%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 434 [M + H]+.
실시예 19: Boc-Pro-Ala-Gly의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 4.33 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Gly-OBzl로부터 표제 화합물 2.98 g(87%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 342 [M-H]-.
실시예 20: Boc-Pro-Ala-Ser-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.15 g(11 mmol) Boc-Pro-Ala 및 3.67 g(10 mmol) TosㆍSer-OBzl로부터 표제 화합물 2.92 g(63%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 464 [M + H]+.
실시예 21: Boc-Pro-Ala-Ser의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 4.63 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Ser-OBzl로부터 표제 화합물 3.28 g(88%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 372 [M-H]-.
실시예 22: Boc-Pro-Ala-Ile-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.15 g(11 mmol) Boc-Pro-Ala 및 3.93 g(10 mmol) TosㆍIle-OBzl로부터 표제 화합물 3.33 g(65%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 490 [M + H]+.
실시예 23: Boc-Pro-Ala-Ile의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 4.89 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Ile-OBzl로부터 표제 화합물 3.67 g(91%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 398 [M-H]-.
실시예 24: Boc-Pro-Ala-Thr-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.15 g(11 mmol) Boc-Pro-Ala 및 3.81 g(10 mmol) TosㆍThr-OBzl로부터 표제 화합물 3.39 g(71%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 478 [M + H]+.
실시예 25: Boc-Pro-Ala-Thr의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 4.77 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Thr-OBzl로부터 표제 화합물 3.56 g(91%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 386 [M-H]-.
실시예 26: Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.15 g(11 mmol) Boc-Pro-Ala 및 4.06 g(10 mmol) HClㆍLys(Z)-OBzl로부터 표제 화합물 4.15 g(65%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 639 [M + H]+.
실시예 27: Boc-Pro-Ala-Lys(Z)의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 6.39 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl로부터 표제 화합물 4.71 g(86%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 547 [M-H]-.
실시예 28: Boc-Pro-Ala-Leu-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.15 g(11 mmol) Boc-Pro-Ala 및 3.93 g(10 mmol) TosㆍLeu-OBzl로부터 표제 화합물 3.37 g(69%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 490 [M + H]+.
실시예 29: Boc-Pro-Ala-Leu의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 4.89 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Leu-OBzl로부터 표제 화합물 3.67 g(91%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 398 [M-H]-.
실시예 30: Boc-Pro-Ala-Gln-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.15 g(11 mmol) Boc-Pro-Ala 및 2.73 g(10 mmol) HClㆍGln-OBzl로부터 표제 화합물 3.23 g(63%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 505 [M + H]+.
실시예 31: Boc-Pro-Ala-Gln의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 5.04 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Gln-OBzl로부터 표제 화합물 3.73 g(90%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 413 [M-H]-.
실시예 32: Boc-Pro-Ala-Asn-OBzl의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 3.15 g(11 mmol) Boc-Pro-Ala 및 2.59 g(10 mmol) HClㆍAsn-OBzl로부터 표제 화합물 3.04 g(61%)을 무색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 491 [M + H]+.
실시예 33: Boc-Pro-Ala-Asn의 제조
실시예 3의 방법에 따라, 4.90 g(10 mmol) Boc-Pro-Ala-Asn-OBzl로부터 표제 화합물 3.67 g(92%)을 제조하였다. ESI-MS (m/e): 399 [M-H]-.
실시예 34: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-카복실산 (1)의 제조
5.0 g(25 mmol) 3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌을 250 mL 아세톤에 용해시키고, 이후 6.0 g(30 mmol) 무수 마그네슘 설페이트를 수득된 용액에 첨가하였다. 30분 후, 이에 25 mL TFA를 얼음 욕조 상에서 첨가하였다. 혼합물은 TLC(CH2Cl2: MeOH 1:1)에 의해 나타나는 바와 같이 출발 물질 스팟이 소실될 때까지 상온에서 96시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 농축하고 잔류물을 아세톤에 용해시키고 계속해서 감압 하에서 농축하는 것을 3회 실시하였다. 200 mL 무수 에테르를 잔류물에 첨가하여 다량의 무색 고체를 침전시켰다. 흡인 여과 후, 표제 화합물 5.8 g(95%)를 무색 고체로서 수득하였다. ESI-MS (m/e): 238 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 6.61 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 3.70 (dd, J = 3.9, 11.4 Hz, 1H), 2.76 (dd, J = 11.7, 15.3 Hz, 1H), 2.62 (m, 1H), 1.41 (s, 3H), 1.32 (s, 3H).
실시예 35: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc)-OBzl (2)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 1.19 g(5.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-카복실산을 10 mL의 무수 DMF에 용해시켰다. 675 mg(5.00 mmol) N-하이드록시벤조트리아졸 트리아졸(HOBt)을 수득된 용액에 첨가하였다. 10분 후, 이에 1.20 g(5.83 mmol) 디사이클로헥실 카보디이미드(DCC) 용액과 5 mL 무수 DMF를 얼음 욕조 상에서 첨가하여 반응 용액(I)을 수득하였다. 2.83 g(5.53 mmol) HClㆍLys(Boc)-OBzl을 15 mL 무수 DMF에 용해시키고 이후 30분간 교반하여 반응 용액 (II)를 수득하였다. 얼음 욕조 상에서 교반하면서 반응 용액 (II)를 반응 용액 (I)에 첨가하였다. TLC(CH2Cl2: MeOH 10:1)에 의해 나타나는 바와 같이 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-카복실산이 소실될 때까지 반응 혼합물을 상온에서 12시간 동안 교반하였고, 필요한 경우 MMM을 이용하여 pH=9로 조정하였다. 반응 혼합물을 여과하여 디사이클로헥실우레아(DCU)를 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축하여 DMF를 제거하였다. 잔류물을 150 mL EA에 용해시켰다. 수득된 용액은 순차적으로 포화 NaHCO3 수용액으로 3회, 및 이후 포화 NaCl 수용액으로 3회 세척하였다. EA 용액을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 농축 건조시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2: MeOH, 50:1)로 정제하여 표제 화합물 327 mg(59%)을 밝은 핑크색 분말로서 수득하였다. ESI-MS (m/e): 556 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 8.64 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.14 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.36 (m, 5H), 6.74 (m, 1H), 6.57 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 5.14 (m, 2H), 4.30 (m, 1H), 3.55 (m, 2H), 3.32 (m, 2H), 2.88(m, 2H), 2.57 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 2.27 (m, 1H), 2.15 (s, 1H), 1.69 (m, 4H), 1.36(s, 9H), 1.33 (s, 3H), 1.25 (s, 3H).
실시예 36: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl (3A)의 제조
실시예 2의 방법에 따라, 1.50 g(2.73 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc)-Obzl로부터 표제 화합물 1.01 g(82%)을 밝은 핑크색 고체로서 제조하였으며, 다음 반응에서 직접 사용하였다. ESI-MS (m/e): 456 [M + H]+.
실시예 37: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Ala)-OBzl (4Aa)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 482 mg(1.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 424 mg(1.20 mmol) Boc-Pro-Ala-Ala로부터 표제 화합물 302 mg(38%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 795 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.15 (s, 1H), 8.89 (s, 2H), 8.11 (m, 1H), 7.94 (m,1H), 7.85 (m, 1H), 7.76 (m,1H), 7.44-7.31 (m, 5H), 6.66 (s, 1H), 6.47 (s, 1H), 5.14 (m,2H), 4.25 (m, 1H), 4.23 (m, 3H), 4.12 (m, 1H), 3.66 (m, 1H), 3.12 (m, 2H), 2.96 (m, 2H), 2.89-2.91 (m, 2H), 2.11-2.08 (m, 1H), 1.77 (m,5H), 1.59 (s, 3H), 1.47-1.27 (m,17H), 1.27-1.08 (m, 7H).
실시예 38: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Val)-OBzl (4Ab)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 964 mg(2.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 924 mg(2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Val로부터 표제 화합물 604 mg(37%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 823 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.18 (s, 1H), 8.93 (m,2H), 8.05 (m, 2H), 7.42 (m, 5H), 6.66 (s, 1H), 6.47 (s, 1H), 5.16 (s,1H), 4.37-4.28 (m, 3H), 4.11 (m, 3H), 3.06-2.89 (m, 5H), 2.75 (m, 6H), 2.04 (s, 1H), 1.91 (m, 1H), 1.79 (m, 5H), 1.62 (s, 3H), 1.49 (s,3H), 1.39 (m, 7H), 1.32 (m, 3H), 1.21 (m, 4H), 0.82 (m, 6H).
실시예 39: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Trp)-OBzl (4Ac)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 482 mg(1.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 567 mg(1.20 mmol) Boc-Pro-Ala-Trp로부터 표제 화합물 318 mg(35%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 910 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.51 (s, 1H), 9.26 (m, 2H), 8.98 (m, 2H), 8.05 (d, 1H, J=7.2Hz), 7.94 (m, 1H), 7.78 (d, 1H, J=7.2Hz), 7.54 (m, 1H), 7.38 (m, 5H), 7.31 (d, 1H, J=4.5Hz), 7.24 (m, 1H), 7.11 (t, 1H, J=4.5Hz), 7.05 (t, 1H, J=4.5Hz), 6.67 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.44 (m, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.07 (m, 2H), 3.23 (m, 1H), 3.17 (m, 5H), 2.86 (m, 1H), 1.97 (m, 2H), 1.76-1.70 (m, 8H), 1.31 (s, 3H), 1.24 (s, 3H), 1.93-1.79 (m, 9H), 1.16 (m, 4H).
실시예 40: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Tyr)-OBzl (4Ad)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 964 mg(2.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 1077 mg(2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Tyr로부터 표제 화합물 549 mg(31%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 887 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.17 (m, 1H), 9.02 (m, 1H), 8.73 (m, 1H), 8.51 (m, 1H), 8.09 (m, 1H), 7.97 (m, 1H), 7.73 (m, 1H), 7.40 (m, 5H), 6.96 (m, 2H), 6.61 (m, 3H), 6.48 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.23 (m, 2H), 4.07 (m, 2H), 3.88 (m, 1H), 3.01 (m, 3H), 2.74 (m, 3H), 2.02 (m, 2H), 1.74 (m, 5H), 1.46 (s, 3H), 1.36-1.24 (m, 16H), 1.16 (m, 3H), 0.87 (m, 1H).
실시예 41: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Pro)-OBzl (4Ae)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 964 mg(2.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 957 mg(2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Pro로부터 표제 화합물 607 mg(37%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 821 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.54 (m, 1H), 9.23 (s, 1H), 9.11 (m, 1H), 8.96 (s, 1H), 8.05 (m, 1H), 7.85 (m, 1H), 7.40 (m, 5H), 6.67 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 5.16 (m, 2H), 4.54 (m, 1H), 4.38 (m, 2H), 4.24 (m, 1H), 4.10 (m, 2H), 3.55 (m, 1H), 3.17 (m, 3H), 3.05 (m, 3H), 2.94 (m, 1H), 1.96 (m, 2H), 1.79 (m, 7H), 1.64 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.38-1.32 (m, 13H), 1.20 (m, 4H).
실시예 42: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Phe)-OBzl (4Af)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 964 mg(2.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 1039 mg(2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Phe로부터 표제 화합물 626 mg(36%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 871 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.24 (s, 1H), 9.09 (m, 2H), 8.96 (s, 1H), 8.01-7.93 (m, 3H), 7.38 (m, 5H), 7.21 (m, 5H), 6.67 (s, 1H), 6.49 (s, 1H), 5.17 (s, 2H), 4.38 (m, 3H), 4.09 (m, 2H), 3.28 (m, 4H), 2.88 (m, 2H), 2.79 (m, 5H), 1.99 (m, 2H), 1.74 (m, 8H), 1.50 (m, 3H), 1.32 (m, 14H), 1.16 (m, 4H).
실시예 43: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Gly)-OBzl (4Ag)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 482 mg(1.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 412 mg(1.20 mmol) Boc-Pro-Ala-Gly로부터 표제 화합물 304 mg(39%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 781 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.39 (s, 1H), 8.97 (m, 2H), 8.24-8.14 (m, 2H), 7.79 (m, 1H), 7.41 (m, 5H), 6.66 (s, 1H), 6.47 (s, 1H), 5.16 (s,2H), 4.35 (m, 2H), 4.21 (m, 2H), 3.71-3.66 (m, 2H), 3.03 (m, 3H), 2.89-2.76 (m, 1H), 2.07 (m, 1H), 1.81-1.77 (m,6H), 1.62 (s,3H), 1.50 (s, 3H), 1.38 (m,7H), 1.32 (m, 8H), 1.23 (m, 4H).
실시예 44: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Ser)-OBzl (4Ah)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 965 mg(2.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 896 mg(2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Ser로부터 표제 화합물 454 mg(29%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 811 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.48 (m, 1H), 9.23 (s, 2H), 8.96 (m, 1H), 8.19 (m, 1H), 7.40 (m, 5H), 6.67 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 5.16 (m, 2H), 4.92 (m, 1H), 4.31 (m, 3H), 4.13 (m, 3H), 3.53 (m, 2H), 3.16 (m, 3H), 3.04-2.81 (m, 4H), 2.08 (m, 1H), 1.78 (m, 5H), 1.63 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.39-1.32 (m, 14H), 1.22 (m, 3H).
실시예 45: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Ile)-OBzl (4Ai)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 482 mg(1.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 479 mg(1.20 mmol) Boc-Pro-Ala-Ile로부터 표제 화합물 310 mg(37%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 837 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 8.84-8.68 (m, 2H), 8.37 (s, 1H), 7.99-7.87 (m, 3H), 7.39 (m, 4H), 6.60 (s, 1H), 6.39 (s, 1H), 5.14 (m, 2H), 4.32 (m, 2H), 4.17 (m, 2H), 3.65 (m, 1H), 3.54 (m, 1H), 3.17 (m, 1H), 2.96 (m, 2H), 2.68 (m, 3H), 2.11 (m, 1H), 1.74-1.68 (m, 7H), 1.31-1.21 (m, 11H), 1.17 (m, 5H), 1.08 (m, 1H), 0.82 (m, 8H).
실시예 46: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Thr)-OBzl (4Aj)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 964 mg(2.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 929 mg(2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Thr로부터 표제 화합물 495 mg(30%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 825 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.18 (s, 1H), 8.91 (s, 2H), 8.27 (m, 1H),7.64 (m, 1H), 7.41(m, 6H), 6.65 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.35 (m, 3H), 4.23 (m, 3H), 3.07 (m, 3H), 2.72 (m, 1H), 1.83-1.76 (m, 5H), 1.61 (s, 3H), 1.48 (s, 3H), 1.38-1.32 (m, 14H), 1.23 (m, 3H), 1.11 (m, 3H).
실시예 47: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys[Boc-Pro-Ala-Lys(Z)]-OBzl (4Ak)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 964 mg(2.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 1209 mg(2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Lys(Z)로부터 표제 화합물 750 mg(30%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 987 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 8.68 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.16 (m, 1H), 8.04 (m, 1H), 7.78 (m, 1H), 7.68 (m, 1H), 7.34 (m, 10H), 6.58 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 4.98 (s, 2H), 4.29 (m, 2H), 4.09 (m, 3H), 3.56 (m, 3H), 3.01 (m, 4H), 2.62 (m, 1H), 2.40 (m, 1H), 2.27 (m, 1H), 2.15 (s, 1H), 2.06 (m, 1H), 2.01 (s, 1H), 1.78 (m, 6H), 1.38-1.31 (m, 18H), 1.17 (m, 10H).
실시예 48: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Leu)-OBzl (4Al)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 482 mg(1.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 479 mg(1.20 mmol) Boc-Pro-Ala-Leu로부터 표제 화합물 301 mg(36%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 837 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 8.69-8.57 (m, 2H), 8.18-8.06 (m, 2H), 7.85 (m, 1H), 7.69 (m, 5H), 6.58 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 5.14 (m, 2H), 4.25-4.11 (m, 5H), 3.63-3.55 (m, 1H), 3.17 (s, 2H), 3.04-2.98 (m, 2H), 2.64-2.59 (m, 1H), 2.15-2.07 (m, 1H), 1.78-1.67(m, 5H), 1.36 (m, 14H), 1.28 (m, 4H), 1.19 (m, 6H).
실시예 49: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Gln)-OBzl (4Am)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 965 mg(2.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 994 mg(2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Gln로부터 표제 화합물 665 mg(39%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 852 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.3-9.1 (m, 4H), 8.16 (m, 1H), 7.96 (m, 2H), 7.83 (m, 1H), 7.44-7.38 (m, 7H), 6.89 (s, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 5.17 (s, 2H), 4.4-4.1 (m, 6H), 3.17 (m, 4H), 2.98-2.83 (m, 2H), 2.08 (m, 4H), 1.91 (m, 1H), 1.64 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.38-1.31 (m, 17H), 1.22-1.20 (m, 4H).
실시예 50: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Asn)-OBzl (4An)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 965 mg(2.01 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl 및 960 mg(2.40 mmol) Boc-Pro-Ala-Asn로부터 표제 화합물 636 mg(38%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 838 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.26 (s, 1H), 9.04 (m, 2H), 8.31 (m, 1H), 8.03 (m, 1H), 7.57 (m, 1H), 7.44 (m, 6H), 6.90 (m, 1H), 6.68 (s, 1H), 6.49 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.45-4.40 (m, 3H), 4.14 (m, 2H), 3.42 (m, 5H), 3.17 (m, 3H), 2.89-2.82 (m, 1H), 2.09 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.79-1.74 (m,6H), 1.64 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 1.39-1.32 (m, 15H), 1.22 (m, 3H).
실시예 51: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys[Boc-Pro-Ala-Asp(OBzl)]-OBzl (4Ao)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 870 mg(1.24 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys[Asp(OBzl)]-OBzl 및 429 mg(2.48 mmol) Boc-Pro-Ala로부터 표제 화합물 403 mg(35%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 929 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 8.32 (m, 1H), 8.10 (m, 1H), 7.96 (m, 1H), 7.36 (m, 10H), 6.60 (s, 1H), 6.39 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 5.06 (s, 2H), 4.57 (m, 1H), 4.32 (m, 1H), 4.23 (m, 1H), 4.11 (m, 2H), 3.74 (m, 1H), 3.55 (m, 1H), 3.34-3.28 (m, 2H), 3.00 (m, 2H), 2.89 (s, 1H), 2.81 (m, 1H), 2.73 (m, 2H), 2.58 (m, 1H), 2.16-2.06 (m, 1H), 1.91 (s, 2H), 1.75 (m, 5H), 1.40-1.32 (m, 22H), 1.17 (m, 3H).
실시예 52: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys[Boc-Pro-Ala-Glu(OBzl)]-OBzl (4Ap)의 제조
실시예 1의 방법에 따라, 530 mg(0.75 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys[Glu(OBzl)]-OBzl 및 256 mg(0.90 mmol) Boc-Pro-Ala로부터 표제 화합물 269 mg(38%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. ESI-MS (m/e): 943 [M + H]+; 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ/ppm = 9.26 (s, 1H), 9.10 (m, 1H), 8.97 (s, 1H), 8.79-7.88 (m,3H), 7.36 (m, 10H), 6.67 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 5.06 (s, 2H), 4.35 (m, 1H), 4.23 (m, 2H), 4.10 (m, 1H), 3.83 (s, 1H), 3.34 (m, 5H), 2.83 (m, 1H), 2.72 (m, 1H), 2.34 (m, 2H), 1.78 (m, 10H), 1.51 (s, 3H), 1.36-1.31 (m, 14H), 1.21 (m,3H).
실시예 53: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Ala) (5Aa)의 제조
먼저, 벤질 에스테르기를 실시예 4의 방법에 따라 300 mg(0.38 mmol)의 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Ala)-OBzl로부터 제거하였다. 다음, Boc를 실시예 2의 방법에 따라 제거하여 표제 화합물 266 mg(78%)을 무색 분말로서 제공하였다. p 207.2-209.4 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00013
=-4.5 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 630 [M-H]-; IR(KBr): 3221.1, 3057.2, 2983.8, 2943.3, 2362.8, 1660.7, 1546.9, 1533.4, 1448.5, 1379.1, 1240.2, 1049.3, 867.9, 659.7; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.79 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 4.36-4.29 (m, 5H), 3.32-3.12 (m, 6H), 1.89 (m, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.57 (s, 3H), 1.48 (m, 2H), 1.33 (m, 9H).
실시예 54: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Val) (5Ab)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 300 mg(0.36 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Val)-OBzl로부터 표제 화합물 187 mg(81%)을 무색 분말로서 제조하였다. Mp 195.8-197.9 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00014
=-3.5 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 630 [M-H]-; IR(KBr): 3221.1, 3062.9, 2970.4, 1658.8, 1546.9, 1533.4, 1450.5, 1384.9, 1240.2, 1047.4, 991.41, 866.04, 671.2; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 8.13 (m, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 4.36-4.29 (m, 4H), 3.89 (m, 1H), 3.36 (m, 2H), 3.23 (m, 2H), 3.08 (m, 2H), 1.89 (m, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.57 (s, 3H), 1.48 (m, 1H), 1.37 (m, 6H), 1.32 (m, 2H), 0.89 (m, 6H).
실시예 55: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Trp) (5Ac)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 300 mg(0.33 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Trp)-OBzl로부터 표제 화합물 180 mg(76%)을 밝은 핑크색 분말로서 제조하였다. Mp 205.1-207.9 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00015
=-1.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 718 [M-H]-; IR(KBr): 3221.2, 3059.1, 2981.9, 2941.4, 1660.7, 1533.4, 1448.5, 1388.7, 1240.2,867.9, 748.4, 630.7; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 7.50 (d, J=7.8Hz, 1H), 7.39 (d, J=7.8Hz, 1H), 7.12 (t, J=7.2Hz, 1H), 7.05 (t, J=7.2Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.27 (m, 1H), 4.18 (m, 2H), 3.24 (m, 2H), 3.16 (m, 3H), 3.06 (m, 3H),1.83 (m, 1H), 1.68 (m, 4H), 1.47 (m, 3H), 1.37 (m, 2H), 1.25 (m, 3H), 1.21 (m, 3H).
실시예 56: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Tyr) (5Ad)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 303 mg(0.34 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Tyr)-OBzl로부터 표제 화합물 174 mg(74%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. Mp 200.5-202.8 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00016
=-2.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 695 [M-H]-; IR(KBr): 3215.3, 3055.2, 2983.8, 2947.2, 1658.8, 1548.8, 1523.8, 1448.5, 1384.9, 1238.3, 1163.1, 657.7; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.98 (m, 2H), 6.92 (m, 3H), 6.65(s, 1H), 4.34-4.26 (m, 6H), 3.27 (m, 2H), 3.15 (m, 1H), 3.08 (m, 1H), 2.96 (m, 2H), 2.85 (m, 12H), 1.89 (m, 5H), 1.70 (s, 3H), 1.51 (m, 3H), 1.33 (m, 3H), 1.25 (m, 4H).
실시예 57: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Pro) (5Ae)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 301 mg(0.36 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Pro)-OBzl로부터 표제 화합물 179 mg(78%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. Mp 204.8-205.4 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00017
=-5.0 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 629 [M-H]-; IR(KBr): 3244.3, 3070.7, 2980.1, 2947.2, 1662.6, 1639.5, 1554.6, 1450.5, 1379.1, 1246.1, 1201.6, 1047.3, 995.3, 871.8, 657.7; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.78 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 4.57 (m, 1H), 4.39-4.33 (m, 5H), 3.74 (m, 1H), 3.60 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.17 (m, 1H), 3.04 (m, 2H), 2.19 (m, 3H), 1.85 (m, 5H), 1.69 (m, 4H), 1.54 (m, 6H), 1.36 (m, 6H).
실시예 58: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Phe) (5Af)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 300 mg(0.34 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Phe)-OBzl로부터 표제 화합물 183 mg(78%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. Mp 175.8-178.2 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00018
=-3.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 679 [M-H]-; IR(KBr): 3215.3, 3049.5, 2949.2, 1662.6, 1539.2, 1454.3, 1394.5; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 7.26 (m, 3H), 7.14 (m, 2H), 6.77 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 4.39-4.33 (m, 3H), 4.03 (m, 3H), 3.42 (m, 1H), 3.37 (m, 1H), 3..29 (m, 2H), 3.17 (m, 1H), 3.09 (m, 4H), 2.95 (m, 3H), 1.91 (m, 5H), 1.74 (s, 3H), 1.53 (s, 3H), 1.33 (m, 6H).
실시예 59: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Gly) (5Ag)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 300 mg(0.38 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Gly)-OBzl로부터 표제 화합물 193 mg(85%)을 무색 분말로서 제조하였다. Mp 196.4-199.5 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00019
=-3.0 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 588 [M-H]-; IR(KBr): 3223.1, 3062.9, 2983.8, 1630.2, 1552.7, 1537.3, 1448.5, 1382.9, 1244.1, 1049.3, 1006.8, 869.9, 661.6; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.77 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 4.34-4.28 (m, 4H), 3.78 (s, 2H), 3.30 (m, 2H), 3.15 (m, 3H), 1.92 (m, 3H), 1.70 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.33 (m, 6H).
실시예 60: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Ser) (5Ah)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 300 mg(0.37 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Ser)-OBzl로부터 표제 화합물 181 mg(79%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. Mp 195.6-197.4 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00020
=-3.8 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 619 [M-H]-; IR(KBr): 3228.8, 3061.0, 2981.9, 2943.4, 1732.1, 1662.6, 1550.7 1533.3, 1448.5, 1384.9, 1244.1, 1159.2, 1049.3, 869.9, 657.7, 518.8; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.78 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 4.41-4.26 (m, 5H), 3.74 (m, 2H), 3.25-3.13 (m, 6H), 1.91 (m, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.55 (m, 3H), 1.46 (m, 2H), 1.37 (m, 6H).
실시예 61: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Ile) (5Ai)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 302 mg(0.36 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Ile)-OBzl로부터 표제 화합물 181 mg(78%)을 무색 분말로서 제조하였다. Mp 175.6-178.4 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00021
=-3.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 645 [M-H]-; IR(KBr): 3224.9, 3057.2, 2970.4, 2758.2, 2497.8, 2360.87, 1656.9, 1535.3, 1454.3, 1388.7, 1244.1, 1159.1, 1037.7, 871.8, 659.6; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.79 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 4.42 (m, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.29 (m, 1H), 4.18 (m, 1H), 3.92 (d, J=1.2Hz, 1H), 3.31 (m, 2H), 3.19 (m, 2H), 3.10 (m, 3H), 2.34 (m, 1H), 2.12 (m, 1H), 1.74 (m, 4H), 1.57 (m, 3H), 1.36 (m, 6H), 1.21 (m, 2H), 0.84 (m, 9H).
실시예 62: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Thr) (5Aj)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 300 mg(0.36 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Thr)-OBzl로부터 표제 화합물 175 mg(76%)을 밝은 노란색 분말로서 제조하였다. Mp 194.8-197.5 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00022
=-2.8 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 633 [M-H]-; IR(KBr): 3236.5, 3066.8, 2933.7, 1660.7, 1548.8, 1533.4, 1450.8, 1381.0, 1240.2, 1157.3, 1049.3, 869.9, 669.3; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.81 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 4.43-4.31 (m, 4H), 4.11 (m, 2H), 3.33 (m, 2H), 3.24 (m, 1H), 3.24 (m, 2H), 3.21 (m, 1H), 3.18 (m, 1H), 3.09 (m, 1H), 1.94 (m, 3H), 1.74 (s, 3H), 1.58 (s, 3H), 1.51 (m, 2H), 1.23 (m, 1H), 1.19 (m, 1H), 1.14 (m, 3H).
실시예 63: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Lys) (5Ak)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 305 mg(0.31 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys[Boc-Pro-Ala-LysI(Z)]-OBzl로부터 표제 화합물 152 mg(75%)을 어두운 노란색 분말로서 제조하였다. Mp 185.6-188.1 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00023
=-1.8 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 660 [M-H]-; IR(KBr): 3853.7, 3738.1, 2956.8, 2349.3, 2017.5, 1668.4, 1537.3, 1400.3, 1257.6, 1043.5, 871.8, 671.2.; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.80 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.29 (m, 1H), 4.18 (m, 2H), 3.73 (m, 2H), 3.22-3.13 (m, 8H), 3.09 (m, 4H), 2.95 (m, 1H), 1.93 (m, 6H), 1.74 (m, 9H), 1.58 (m, 6H), 1.47 (m, 2H), 1.32-1.27 (m, 16H), 1.18 (m, 2H).
실시예 64: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Leu) (5Al)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 300 mg(0.36 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Leu)-OBzl로부터 표제 화합물 178 mg(77%)을 무색 분말로서 제조하였다. Mp 189.7-192.7 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00024
=-3.5 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 645 [M-H]-; IR(KBr): 3224.9, 3064.9, 2956.8, 1660.7, 1548.8, 1535.3, 1448.5, 1381.0,1242.2, 1049.3, 997.2, 869.9, 669.3; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.78 (s, 1H), 6.68 (s,1H), 4.38-4.29 (m, 3H), 4.13 (m, 2H), 3.31 (m, 3H), 3.21 (m, 1H), 3.08 (m, 2H), 1.89 (m, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.57 (m, 4H), 1.46 (m, 5H), 1.32 (m, 6H), 1.32 (m, 1H), 1.16 (m, 6H).
실시예 65: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Gln) (5Am)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 300 mg(0.35 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Gln)-OBzl로부터 표제 화합물 184 mg(79%)을 무색 분말로서 제조하였다. Mp 181.3-183.3 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00025
=-3.0 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 660 [M-H]-; IR(KBr): 3213.4, 3059.1, 2981.9, 2943.4, 2362.8, 1739.8, 1662.6, 1548.8, 1537.3, 1450.5, 1375.3, 1244.1, 1047.2, 871.8, 659.7; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.80 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 4.40-4.29 (m, 5H), 3.33 (m, 3H), 3.17 (m, 3H), 1.90 (m, 2H), 1.69 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.43 (m, 2H), 1.31 (m, 8H).
실시예 66: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Asn) (5An)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 302 mg(0.36 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Boc-Pro-Ala-Asn)-OBzl로부터 표제 화합물 174 mg(78%)을 무색 분말로서 제조하였다. Mp 202.5-204.7 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00026
=-2.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 646 [M-H]-; IR(KBr): 3207.6, 3059.1, 2943.3, 1674.2, 1537.3, 1448.5, 1381.0, 1247.9, 642.3; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.78 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 4.48 (m, 1H), 4.42-4.29 (m, 4H), 3.29 (m, 2H), 3.16 (m, 4H), 2.65 (m, 2H), 1.90 (m, 2H), 1.69 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.31 (m, 6H).
실시예 67: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Asp) (5Ao)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 300 mg(0.32 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys[Boc-Pro-Ala-Asp(OBzl)]-OBzl로부터 표제 화합물 174 mg(83%)을 무색 분말로서 제조하였다. Mp 207.1-209.7 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00027
= -3.5 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 647 [M-H]-; IR(KBr): 3383.3, 3061.0, 2360.9, 1670.3, 1550.8, 1448.5, 1400.3, 1246.3, 873.8, 611.4; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.76 (s, 1H), 6.66 (s, 1H), 4.52 (m, 1H), 4.37-4.281 (m, 4H), 3.27 (m, 4H), 3.13 (m, 1H), 3.05 (m, 1H), 2.76 (m, 2H), 1.97 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.71 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.43 (m,2H), 1.31 (m, 6H).
실시예 68: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys(Pro-Ala-Glu) (5Ap)의 제조
실시예 53의 방법에 따라, 301 mg(0.32 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys[Boc-Pro-Ala-Glu(OBzl)]-OBzl로부터 표제 화합물 173 mg(82%)을 무색 분말로서 제조하였다. Mp 194.7-196.1 ℃; [α]
Figure 112015123436751-pct00028
=-2.3 (c = 0.25, CH3OH); ESI-MS (m/e): 661 [M-H]-; IR(KBr): 3053.3, 2945.3, 2370.5, 2320.4, 1651.1, 1546.9, 1533.4, 1448.5, 1388.8, 1240.2, 1165.0, 1045.4, 644.2; 1HNMR (300 MHz, D2O) δ/ppm = 6.78 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 4.42-4.28 (m, 5H), 3.29 (m, 2H), 3.13 (m, 3H), 2.99 (m, 1H), 2.38 (m, 2H), 2.29 (m, 1H), 1.90 (m, 5H), 1.69 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 1.31 (m, 6H).
비교예 1: 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys (6)의 제조
실시예 4의 방법에 따라, 1.00 g(2.03 mmol) 3S-6,7-디하이드록시-1,1-디메틸-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-아실-Lys-OBzl로부터 표제 화합물 620 mg(85%)을 밝은 핑크색 고체로서 제조하였다. 이 화합물 6을 하기 실험예에서 대조군으로 사용하였다. ESI-MS(m/e): 363[M-H]-.
실험예 1: 정맥 내 투여를 통한 본 발명의 화합물 5Aa-p의 혈전 용해 활성 평가
1) 평가 방법
200-220 g의 수컷 SD 래트를 20% 우레탄 용액(6 mL/kg, ip)으로 마취시켰다. 마취된 래트를 앙와위로 고정시키고, 우측 총경동맥을 분리하여, 근위 말단에 동맥 클립으로 클램프를 끼우고, 근위 말단 및 원위 말단에 각각 봉합실을 삽입하였다. 원위 말단의 봉합실은 피부/모피에서 지혈 클램프로 단단히 클립핑하였다. 원위 말단에서 캐뉼러 삽입을 수행하였고, 동맥 클램프를 느슨하게 하여, 약 1 ml의 동맥혈을 1 mL EP 바이알로 배출시켰다. 0.1 mL의 래트 동맥혈을 수직으로 고정된 유리 튜브(길이 15 mm, 내경 2.5 mm 및 외경 5.0 mm, 바닥은 고무 마개로 밀봉)에 주입하고, 스테인레스강으로 이루어진 혈전 고정 나사를 즉시 삽입하였다. 혈전 고정 나사는, 직경 0.2 mm를 갖는 스테인레스강 와이어의 코일링에 의해 형성되고, 각각 직경 1.0 mm를 갖는 15개의 코일을 포함하는 길이 12 mm의 나선 부위 및 나선 부위에 연결되고 물음표 유사 형상을 갖는 길이 7.0 mm의 스템을 가졌다. 혈액 응고 40분 후, 유리 튜브의 바닥에 있는 고무 마개를 제거하여, 혈전 고정 나사의 스템을 겸자를 이용하여 고정시키고, 혈전으로 감싸진 혈전 고정 나사를 조심스럽게 유리 튜브로부터 취하여 정확하게 무게를 측정하였다.
바이패스 캐뉼러는 3개의 부로 구성되었다. 중간부는 60 mm의 길이 및 3.5 mm의 내경을 갖는 폴리에틸렌 튜브였다. 양 말단부는 100 mm의 길이, 1 mm의 내경 및 2 mm의 외경을 갖는 유사한 폴리에틸렌 튜브였고, 이 중 하나의 말단부는 잡아당겨 1.0 mm의 외경(래트 경동맥 또는 정맥 내 삽입에서 사용)을 갖는 뾰족한 끝을 형성하였고, 다른 말단부는 7 mm의 길이 및 3.5 mm의 외경(중간부의 폴리에틸렌 튜브 내 삽입에서 두께 보완, 사용)을 갖는 폴리에틸렌 튜브에 끼워졌다. 3단 캐뉼러의 내벽은 모두 실릴레이트화하였다. 혈전으로 감싸진 혈전 고정 나사를 중간부의 폴리에틸렌 튜브에 넣고, 튜브의 양 말단부를 2개의 폴리에틸렌 튜브의 두께 보강 말단부에 끼웠다. 주사기를 이용하여 뾰족한 끝 말단부를 통해 캐뉼러를 생리식염수 중의 헤파린 용액(50 IU/kg)으로 충전하였고 사용을 위해 준비해 두었다.
래트의 좌측 외경정맥을 분리하고 근위 말단 및 원위 말단에 각각 봉합실을 삽입하고, 원위 말단을 결찰시켰다. 노출된 좌측 외경정맥에서 조심스럽게 절개가 이루어졌고, 상기 기재된 바와 같이 제조된 바이패스 캐뉼러의 뾰족한 끝을 좌측 외경정맥 내 절개의 근위 말단에 삽입하였으며, 바이패스 캐뉼러의 중간부(정확하게 무게를 잰 혈전 고정 나사를 포함) 내 혈전 고정 나사의 스템으로부터 멀리 떨어지게 하였다. 주사기를 사용하여 다른 말단부에서 뾰족한 끝을 통해 정확한 양의 헤파린 생리식염수(50 IU/kg)를 주입하였다. 이때, 주사기를 폴리에틸렌 튜브에서 빼지 않고, 지혈 클램프를 사용하여 주사기와 폴리에틸렌 튜브 사이의 튜브를 클램핑하였다. 동맥 클립으로 우측 총경동맥의 근위 말단을 클램핑하여 지혈하고, 클립에서 가까운 총경동맥에 걸쳐 조심스럽게 절개하였다. 뾰족한 끝을 통해 폴리에틸렌 튜브에서 주사기를 뽑아내고, 이후 폴리에틸렌 튜브의 뾰족한 끝을 동맥 절개의 근위 말단에 삽입하였다. 바이패스 캐뉼러의 양 말단부는 #4 봉합실을 이용하여 동맥 또는 정맥에 고정시켰다.
식염수, 식염수 중의 우로키나제 또는 식염수 중의 다양한 농도의 화합물을 바이패스 캐뉼러의 중간부(정확하게 무게를 잰 혈전 고정 나사를 포함)를 통해 근위 정맥 위치로 이동시키고 혈전 고정 나사로부터 멀리 떨어지도록 두피침이 사용되었다. 이후 동맥 클립을 제거하여 혈액이 동맥에서 정맥으로 바이패스 캐뉼러를 통해 흐르게 하였다. 따라서, 래트 동정맥 바이패스 혈전 용해 모델이 구축되었다. 주사기 중의 용액은 혈액 내로 천천히 주입(약 6분)되어, 생리식염수, 우로키나제(양성 대조군), 또는 본 발명의 화합물이 정맥-심장-동맥의 순서로 혈액 순환을 통해 혈전에서 작용할 수 있도록 하였다. 상기 과정은 주사 시작에서 시간을 재어, 1시간 후 혈전 고정 나사를 바이패스 캐뉼러로부터 제거하고 정확하게 무게를 측정하였다. 투입 전과 후의 래트 바이패스 캐뉼러에서의 혈전 고정 나사 무게 차이는 화합물의 생체 내 혈전 용해 활성을 측정하기 위해 결정되었다. 혈전의 무게 감소는 평균값 및 표준 편차(
Figure 112015123436751-pct00029
)로 나타내었다.
2) 투여 방법 및 용량
투여 방법은 정맥 내 투여이다. 블랭크 대조군은 생리식염수였고, 용량은 3 mL/kg이었다. 양성 대조군은 우로키나제였고, 용량은 20000 U/kg이었으며, 이는 1.68 mg/kg과 동일한 것이었다. 본 발명의 화합물 5Aa-p의 용량은 0.1 nmol/kg이었다.
3) 측정 결과
혈전 용해 활성은 혈전의 무게 감소로 표시하였고(
Figure 112015123436751-pct00030
mg), 표 1에 결과를 나열하였다. 데이터는 정맥 내 투여를 통한 0.1 nmol/kg의 용량에서 화합물 5Aa-p가 효과적으로 혈전을 용해할 수 있음을 나타내었다(생리식염수 대비 p<0.01). 화합물 5Aa, 5Af, 5Ag, 5Ak, 및 5Ao의 혈전 용해 활성은 20000 U/kg 용량의 우로키나제의 활성과 유사하였다. 더 높은 혈전 용해 활성을 갖는 화합물, 5Aa, 5Ad, 5Af, 5Ag 및 5Ak 중에서, 화합물 5Ak가 가장 높은 혈전 용해 활성을 보였으며, 따라서 이의 용량 의존적 관계를 추가 실험하였다.
정맥 내 투여를 통한 화합물 5Aa-p의 혈전 용해 활성
화합물 혈전 무게 감소 화합물 혈전 무게 감소
생리식염수 9.25 ± 1.59 우로키나제 18.95 ± 2.73a
5Aa 19.35 ± 2.76b 5Ai 16.00 ± 2.03a
5Ab 17.12 ± 1.64a 5Aj 15.23 ± 2.45a
5Ac 16.23 ± 2.81a 5Ak 19.38 ± 2.81b
5Ad 18.11 ± 2.48b 5Al 14.65 ± 2.86a
5Ae 13.63 ± 1.92a 5Am 16.65 ± 2.52a
5Af 17.92 ± 1.69b 5An 16.44 ± 2.32a
5Ag 18.98 ± 2.14b 5Ao 15.86 ± 2.21 a
5Ah 17.10 ± 1.79a 5Ap 16.03 ± 2.14a
6 13.87 ± 3.07a PAK 14.17 ± 1.84a
6 + PAK 15.37 ± 3.00a
n=10;
a) 생리식염수 대비 p<0.01;
b) 생리식염수 대비 p<0.01; 화합물 6, PAK 및 화합물 6+PAK 대비 p<0.05; 우로키나제 대비 p>0.05
실험예 2: 정맥 내 투여를 통한 본 발명의 화합물 5Ak의 혈전 용해 활성에 대한 용량-영향 관계 평가
실험예 1의 방법에 따라 정맥 내 투여를 실시하였다. 블랭크 대조군은 생리식염수였고, 용량은 3 mL/kg이었다. 양성 대조군은 우로키나제였고, 용량은 20000 U/kg이었으며, 이는 1.68 mg/kg과 동일한 것이었다. 화합물 5Ak의 높은 용량, 중간 용량 및 낮은 용량은 각각 0.1 nmol/kg, 0.01 nmol/kg, 및 0.001 nmol/kg이었다. 결과는 표 2에 나열하였다. 데이터는 화합물 5Ak의 분명한 용량-영향 관계를 나타내었다.
본 발명의 화합물 5Ak의 혈전 용해에 대한 용량-영향 관계
화합물 혈전 무게 감소
(
Figure 112015123436751-pct00031
±SD mg)
생리식염수, 3 mL/kg 10.55 ± 2.52
우로키나제, 20000 U/kg 25.61 ± 3.87
5Ak, 0.1 nmol/kg 21.61 ± 4.62a
5Ak, 0.01 nmol/kg 14.62 ± 2.46 b
5Ak, 0.001 nmol/kg 11.73 ± 2.15 c
n=10;
a) 생리식염수 및 0.01 nmol/kg 5Ak 대비 p<0.01;
b) 생리식염수 및 0.001 nmol/kg 5Ak 대비 p<0.01;
c) 생리식염수 대비 p>0.05
실험예 3. 정맥 내 투여를 통한 본 발명의 화합물 5Aa-p의 혈정 용해 활성 평가
1) 평가 방법
캐뉼러는 3단으로 구성되었다. 중간부는 80 mm의 길이 및 3.5 mm의 내경을 가졌다. 양 말단부는 100 mm의 길이, 1 mm의 내경 및 2 mm의 외경을 갖는 유사한 폴리에틸렌 튜브였고, 이 중 하나의 말단부는 잡아당겨 뾰족한 끝(래트 경동맥 또는 정맥 내 삽입에서 사용)을 형성하였다. 3단 캐뉼러의 내벽은 모두 실릴레이트화하였다. 미리 계량한, 길이 60 mm의 스레드를 폴리에틸렌 튜브의 중간부에 위치시켰다. 넓은 튜브의 양 말단부를 2개의 폴리에틸렌 튜브의 좁혀지지 않은 말단부에 각각 끼웠다(스레드의 0.5 mm가 스레드를 고정하기 위하여 단부 중 하나에 의해 억제됨). 주사기를 이용하여 뾰족한 끝 말단부를 통해 캐뉼러를 생리식염수 중의 헤파린 용액(50 IU/kg)으로 충전하였고 사용을 위해 준비해 두었다.
200-220 g의 수컷 SD 래트를 20% 우레탄 용액(6 mL/kg, ip)으로 마취시켰다. 마취된 래트를 앙와위로 고정시키고, 좌측 외경정맥을 분리하고 근위 말단 및 원위 말단에 각각 봉합실을 삽입하고, 원위 말단을 결찰시켰다. 노출된 좌측 외경정맥에서 조심스럽게 절개가 이루어졌고, 상기 기재된 바와 같이 제조된 바이패스 캐뉼러의 스레드 억제가 없는 뾰족한 끝 말단부를 좌측 외경정맥 내 열린 절개의 근위 말단에 삽입하였다. 주사기를 사용하여 다른 말단부에서 뾰족한 끝을 통해 정확한 양의 헤파린 생리식염수(50 IU/kg)를 주입하였다. 이후, 주사기를 대체하여, 정확한 양의 약물을 같은 방법으로 주입하였다. 이때, 주사기를 에틸렌 튜브에서 빼지 않고, 우측 총경동맥을 분리하고, 동맥 클립으로 근위 말단을 클립핑하였다. 우측 총경동맥은 근위 및 원위 말단에 각각 봉합실이 삽입되고, 원위 말단은 결찰되었다. 동맥 클립에서 가까운 우측 총경동맥에 걸쳐 조심스럽게 절개가 이루어졌다. 뾰족한 끝을 통해 폴리에틸렌 튜브에서 주사기를 뽑아내고, 이후 폴리에틸렌 튜브의 뾰족한 끝을 동맥 절개의 근위 말단에 삽입하였다. 바이패스 캐뉼러의 양 말단부는 #4 봉합실을 이용하여 동맥 또는 정맥에 고정시켰다. 이후 동맥 클립을 제거하여 혈액이 동맥에서 정맥으로 바이패스 캐뉼러를 통해 흐르게 하였다. 따라서, 래트 동정맥 바이패스 혈전 용해 모델이 구축되었다. 상기 과정은 순환 시작에서 시간을 재어, 15분 후 혈전이 부착된 스레드를 바이패스 캐뉼러로부터 취하여 정확하게 무게를 측정하였다. 전과 후의 스레드 무게 차이는 혈전의 젖은 무게로서 결정되었고, 화합물의 생체 내 항혈전 활성을 측정하기 위해 통계학적으로 분석 및 사용되었다. 혈전의 습중량은 평균값 및 표준 편차(
Figure 112015123436751-pct00032
)로 나타내었다.
2) 약물 투여 방법 및 용량
약물 투여 방법은 정맥 내 투여이다. 블랭크 대조군은 생리식염수였고, 용량은 1 mL/kg이었다. 양성 대조군은 아스피린이었고, 용량은 9 mg/kg이었다. 본 발명의 화합물 5Aa-p의 용량은 0.1 nmol/kg이었다.
3) 결과
항혈전 활성은 혈전의 습중량 감소로 표시하였고(
Figure 112015123436751-pct00033
), 표 3에 결과를 나열하였다. 데이터는 정맥 내 투여를 통한 0.1 nmol/kg에서 화합물 5Aak의 용량이 효과적으로 혈전의 형성을 억제할 수 있음을 나타내었고(생리식염수 대비 p<0.001), 따라서 더 높은 활성을 갖는 5Ak의 용량 의존적 관계를 추가 실험하였다.
정맥 내 투여를 통한 본 발명의 화합물 5Aa-p의 생체 내 항혈전 실험
화합물 혈전 습중량
(
Figure 112015123436751-pct00034
±SD mg)		 화합물 혈전 습중량
(
Figure 112015123436751-pct00035
±SD mg)
NS 65.40 ± 2.73 아스피린 46.95 ± 5.21a
5Aa 54.04 ± 6.43a 5Ai 56.12 ± 5.55a
5Ab 54.17 ± 6.61a 5Aj 50.56 ± 3.96a
5Ac 52.93 ± 3.96a 5Ak 51.93 ± 2.74a
5Ad 51.91 ± 4.97a 5Al 54.20 ± 3.93a
5Ae 57.20 ± 6.43a 5Am 58.14 ± 2.30a
5Af 54.01 ± 4.25a 5An 55.11 ± 4.76a
5Ag 54.28 ± 3.57a 5Ao 48.34 ± 3.29a
5Ah 50.67 ± 3.71a 5Ap 49.97 ± 6.32a
n=10; 5Aa-p(i.v.): 0.1 nmol/kg; 아스피린: 9 mg/kg;
a) NS 대비 p<0.001.
실험예 4. 정맥 내 투여를 통한 본 발명의 화합물 5 Ak 의 항혈전 활성에 대한 용량-영향 관계 평가
1) 평가 방법
방법은 실험예 3과 동일하였다.
2) 약물 투여 방법 및 용량
약물 투여 방법은 정맥 내 투여이다. 블랭크 대조군은 생리식염수였고, 용량은 3 mL/kg이었다. 양성 대조군은 아스피린이었고, 용량은 9 mg/kg이었다. 화합물 5Ak의 높은 용량, 중간 용량 및 낮은 용량은 각각 0.1 nmol/kg, 0.01 nmol/kg, 및 0.001 nmol/kg이었다.
3) 결과
결과는 표 4에 나열하였고, 화합물 5Ak는 분명한 용량-영향 관계를 보였다.
본 발명의 화합물 5Ak의 항혈전 활성에 대한 생체 내 용량-영향 관계
화합물 혈전 습중량 (
Figure 112015123436751-pct00036
±SD mg)
NS 63.46 ± 3.67
아스피린 45.62 ± 2.60
5Ak, 0.1 nmol/kg 52.16 ± 2.02a
5Ak, 0.01 nmol/kg 57.34 ± 3.73b
5Ak, 0.001 nmol/kg 61.91 ± 3.27c
n＝10;
a) 생리식염수 및 0.01 nmol/kg 5Ak 대비 p<0.01;
b) 생리식염수 및 0.001 nmol/kg 5Ak 대비 p<0.01;
c) 생리식염수 대비 p>0.05.
실험예 5. 뇌졸중 래트에서 본 발명의 화합물 5Ak의 치료학적 효능 평가
뇌졸중에 걸린 래트에서 화합물 5Aa-p의 치료학적 효능을 평가하기 위해, 화합물 5Ak가 대표 물질로 선택되었고 뇌졸중 래트에서의 치료학적 효능을 하기 방법에 따라 평가하였다.
1) 평가 방법
SD 수컷 래트(280-300 g)을 무작위로 20000 IU/kg 용량의 UK 양성 대조군, 생리식염수를 이용한 블랭크 대조군, 5 μmol/kg 용량의 PAK를 이용한 화합물 대조군, 및 1 μmol/kg(고), 0.1 μmol/kg(중간), 및 0.01 μmol/kg(저) 용량의 화합물 5Ak군으로 분류하였다. 10% 클로랄 수화물 용액(400 mg/kg)을 래트에 복강 내 주사하여 마취시켰다. 경부 중앙 근처의 우측 사이드에 약 2 cm 길이의 수직 절개가 이루어졌고, 우측 총경동맥(CCA), 외경동맥(ECA) 및 내경동맥(ICA)을 흉쇄유돌근 내측의 가장자리를 따라 분리하였다. 내경동맥의 절개와 총경동맥의 근위 말단을 각각 비침습적 동맥 클립으로 클립핑하였다. 외경동맥에서 작은 절개가 이루어졌고, 외경동맥의 원위 말단을 결찰시켰다. 총경동맥의 근위 말단에서 동맥 클립을 해제하고, 10 ㎕의 혈액을 빼내었다. 혈액을 빼낸 후, 총경동맥의 근위 말단을 다시 비침습적 동맥 클립으로 클립핑하였다. 빼낸 10 ㎕의 혈액은 1 mL EP 바이알에 넣고 상온에서 30분간 보관하여 혈액이 응고되도록 하였고 이후 -20 ℃ 냉장고로 옮겨 1시간 동안 고체 응집이 형성되도록 하였다. 1시간 경과 후, 혈전을 취하여, 여기에 1 mL 생리식염수를 첨가하고, 이후 혈전을 강(steel) 주걱을 이용하여 비교적 균일한 미세혈전으로 부수었다. 이후 사용을 위해 미세혈전 현탁액을 1 mL 주사기로 옮겼다. 래트의 내경동맥 상의 클립이 해제되었을 때, 주사기 내 1 mL 혈전 현탁액이 래트의 외경동맥에서 이의 근위 말단으로 천천히 주입되었고, 이후 내경동맥을 통해 래트의 뇌에 주입되었다. 이어서, 외경동맥의 근위 말단을 결찰시키고, 내경동맥 및 총경동맥 상의 동맥 클립을 해제하여, 혈류가 회복되었다. 총경정맥을 분리하고, 이후 20000 IU/kg 용량의 UK, 생리식염수, 또는 1 μmol/kg 용량의 화합물 5Ak를 주입하였다. 정맥을 결찰시켰다. 페니실린 3 방울을 상처에 적가하였다. 상처를 꿰매고, 동물이 깨어나기를 기다렸다.
래트가 깨어난 지 24시간 후, Zealonga 방법으로 신경 기능 손상 정도를 평가하였다. 0점은 아무런 신경 기능 결실이 없는 증후를 나타내고, 1점은 손상되지 않은 쪽 앞다리를 펼 수 없는 증후를 나타내며, 2점은 손상되지 않은 쪽으로 보행하는 증후를 나타내고, 3점은 손상되지 않은 쪽으로 몸을 말아 꼬리를 쫓는 형상으로 보행하는 증후를 나타내며, 4점은 의식 장애로 비자발적으로 보행하는 증후를 나타내고, 5점은 사망을 나타냈다. 평가 결과는 통계적으로 분석되고 t-테스트가 실시되었다.
래트가 깨어난 지 24시간 후 Zealonga 방법으로 신경 기능 손상 정도를 평가한 다음, 우레탄으로 마취시킨 다음 즉시 두부를 절단하여 뇌를 적출하였다. 뇌 조직은 -20 ℃ 냉장고에서 2시간 동안 보관하였고, 전전두극으로부터 약 2 mm의 관상 연속 절편 총 5개를 자른 후 2%의 TTC 용액에 담아 37 ℃에서 30분 동안 차광 배양하였다. 뇌 절편의 색상 변화를 관찰하였다: 정상적인 뇌 조직은 TTC에 의해 적색으로 염색되었고, 허혈성 뇌 조직은 백색을 띠었다. 디지털 카메라로 촬영하고 이미지 통계 소프트웨어로 처리하여, 관상 절편 중 뇌 조직 내 경색의 부피와 정상 뇌 조직 부위의 면적을 계산하였다. 각 그룹의 뇌경색 부피의 비율을 통계적으로 계산하고 t테스트를 실시하였다.
2) 평가 결과
래트가 깨어난 후 Zealonga 방법에 따라 평가된 데이터는 표 5에 나열하였다. 뇌경색 부피 퍼센트는 표 6에 나열하였다.
래트가 깨어난 지 24시간 후 Zealonga 방법에 따른 평가
화합물 신경 기능 점수
(
Figure 112015123436751-pct00037
±SD)
생리식염수 2.90 ± 0.99
우로키나제, 20000 IU/kg 1.30 ± 0.95a
5Ak, 1 μmol/kg 1.10 ± 0.74a
5Ak, 0.1 μmol/kg 1.40 ± 1.07b
5Ak, 0.01 μmol/kg 2.30 ± 0.95c
PAK, 5 μmol/kg 2.20 ± 1.60
n＝9;
a) 생리식염수 및 0.1 μmol/kg 5Ak 대비 p<0.05;
b) 생리식염수 및 0.01 μmol/kg 5Ak 대비 p<0.05;
c) 생리식염수 및 5 μmol/kg PAK 대비 p>0.05
래트의 뇌경색 부피 퍼센트
화합물 경색 부피 퍼센트 (
Figure 112015123436751-pct00038
±SD %)
생리식염수 22.99 ± 5.08
우로키나제, 20000 IU/kg 4.60 ± 2.09
5Ak, 1 μmol/kg 3.44 ± 1.99a
5Ak, 0.1 μmol/kg 9.88 ± 2.52b
5Ak, 0.01 μmol/kg 18.05 ± 5.77c
PAK, 5 μmol/kg 18.36 ± 7.38
n=7;
a) 생리식염수 대비 p<0.01, 0.1 μmol/kg 5Ak 대비 p<0.05, 우로키나제 대비 p>0.05;
b) 생리식염수 및 0.1 μmol/kg 5Ak 대비 p<0.05;
c) 생리식염수 대비 p>0.05.
표 5 및 6의 데이터는 화합물 5Ak가 뇌 허혈 래트를 이상 운동증 및 뇌경색으로부터 효과적으로 보호할 수 있음을 제시하였다. 화합물 5Ak의 이러한 기능은 농도 의존적이었다.
실험예 6. 본 발명의 화합물 5Aa-p의 자유 라디칼 소거 활성 평가
1) 하이드록실 자유 라디칼 소거 활성
11.316 mg DMPO(디메틸피리딘-N-옥사이드, Sigma)를 1 mL의 순수한 물에 용해시켜 0.1 M DMPO 용액을 수득하였다. 2.78 g FeSO4ㆍ7H2O를 1 mL의 순수한 물에 용해시켜 10 mM 용액을 수득하였다. 30% 의료 H2O2를 0.2%로 희석하였다.
2.5 μL FeSO4ㆍ7H2O 용액 + 2.5 μL DMPO 용액 + 5 μL H2O2 용액 + 5 μL 물의 OH 시그널의 첫 번째 피크 높이를 측정하였고 6번 반복하였다. 이 피크 높이는 OH 시그널의 알려진 피크 높이로 정의하였다. 2.5 μL FeSO4ㆍ7H2O 용액 + 2.5 μL DMPO 용액 + 5 μL H2O2 용액 + 화합물 5Aa-p 중 하나의 5 μL 용액의 OH 시그널의 첫 번째 피크 높이를 측정하였고 6번 반복하였다. 이 피크 높이는 화합물 5Aa-p 중 하나에 의해 소거된 OH 시그널의 잔여 피크 높이로 정의하였다.
소거 비율 = (OH 시그널의 알려진 피크 높이 - 화합물 5Aa-p의 OH 시그널의 잔여 피크 높이) / OH 시그널의 알려진 피크 높이
2) NO 라디칼 소거 활성
7.325 mg MGD(N-메틸-글루카민 디티오카바메이트, Sigma)를 1 mL의 순수한 물에 용해시켜 25 mM MGD 용액을 수득하였다. 3.475 g FeSO4ㆍ7H2O를 1 mL의 순수한 물에 용해시켜 12.5 mM 용액을 수득하였다. 25 mg SNAP(S-니트로소-아세틸 페니실라민)를 1 mL의 순수한 물에 용해시켜 110 μM 녹색 모액을 수득하였고, 100배 희석하여 1 μM SNAP 용액을 얻었다.
5 μL MGD 용액 + 5 μL FeSO4ㆍ7H2O 용액 + 5 μL SNAP 용액 + 5 μL 물의 NO 시그널의 첫 번째 피크 높이를 측정하였고 6번 반복하였다. 이 피크 높이는 NO 시그널의 알려진 피크 높이로 정의하였다. 5 μL MGD 용액 + 5 μL FeSO4ㆍ7H2O 용액 + 5 μL SNAP 용액 + 화합물 5Aa-p 중 하나의 5 μL 용액의 NO 시그널의 첫 번째 피크 높이를 측정하였고 6번 반복하였다. 이 피크 높이는 화합물 5Aa-p 중 하나에 의해 소거된 NO 시그널의 잔여 피크 높이로 정의하였다.
소거 비율 = (NO 시그널의 알려진 피크 높이 - 화합물 5Aa-p의 NO 시그널의 잔여 피크 높이) / NO 시그널의 알려진 피크 높이
3) 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거 활성
0.3 g 크산틴을 1 mL의 순수한 물에 용해시켜 0.5 M 크산틴 용액(우유 백색, 주로 불용성)을 수득하였다. 크산틴 옥시다제의 시판되는 원료 용액을 10배 희석하여 크산틴 옥시다제 용액을 제조하였다. 포화 DETAPAC 용액을 20배 희석하여 0.9 mM 용액을 제조하였다. 11.316 mg DMPO를 1 mL의 순수한 물에 용해시켜 0.1 M DMPO 용액을 수득하였다.
5 μL DMPO 용액 + 5 μL DETAPAC 용액 + 5 μL 크산틴 용액 + 5 μL 크산틴 옥시다제 용액 + 5 μL 화합물 5Aa-p 용액
5 μL DMPO 용액 + 5 μL DETAPAC 용액 + 5 μL 크산틴 용액 + 5 μL 크산틴 옥시다제 용액 + 5 μL 물의 슈퍼옥사이드 음이온 시그널의 첫 번째 피크 높이를 측정하였고 6번 반복하였다. 이 피크 높이는 슈퍼옥사이드 음이온 시그널의 알려진 피크 높이로 정의하였다. 5 μL DMPO 용액 + 5 μL DETAPAC 용액 + 5 μL 크산틴 용액 + 5 μL 크산틴 옥시다제 용액 + 화합물 5Aa-p 중 하나의 5 μL 용액의 슈퍼옥사이드 음이온 시그널의 첫 번째 피크 높이를 측정하였고 6번 반복하였다. 이 피크 높이는 화합물 5Aa-p 중 하나에 의해 소거된 슈퍼옥사이드 음이온 시그널의 잔여 피크 높이로 정의하였다.
소거 비율 = (슈퍼옥사이드 음이온 시그널의 알려진 피크 높이 - 화합물 5Aa-p의 슈퍼옥사이드 음이온 시그널의 잔여 피크 높이) / 슈퍼옥사이드 음이온 시그널의 알려진 피크 높이
결과는 표 7에 나열하였다. 데이터는 3가지 자유 라디칼 소거 활성에 대한 화합물 5Aa-p의 EC50이 0.4-0.7 mM였음을 나타내었다. 화합물 5Aa-p는 명백한 자유 라디칼 소거 활성을 가진다.
자유 라디칼 소거 활성에 대한 화합물 5Aa-p의 EC50

화합물		 하기 자유 라디칼 소거 EC50 (
Figure 112015123436751-pct00039
±SD ×10-4 M)
ㆍNO ㆍOH 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼
5Aa 5.99 ± 0.38 4.59 ± 0.66 4.77 ± 0.56
5Ab 5.32 ± 0.73 4.71 ± 0.71 4.71 ± 0.34
5Ac 4.63 ± 0.92 3.78 ± 0.85 3.66 ± 0.71
5Ad 4.53 ± 0.41 3.69 ± 0.32 3.54 ± 0.71
5Ae 6.17 ± 0.88 4.66 ± 0.47 4.81 ± 0.45
5Af 5.68 ± 0.95 5.44 ± 0.43 4.85 ± 0.31
5Ag 6.09 ± 0.95 4.22 ± 0.61 4.67 ± 0.94
5Ah 5.23 ± 0.85 4.13 ± 0.73 4.01 ± 0.72
5Ai 5.27 ± 0.90 4.95 ± 0.61 4.52 ± 0.64
5Aj 5.10 ± 0.75 4.16 ± 0.28 4.17 ± 0.95
5Ak 4.99 ± 0.89 4.22 ± 0.82 3.63 ± 0.94
5Al 5.03 ± 0.41 4.89 ± 0.32 4.14 ± 0.97
5Am 6.47 ± 0.88 4.66 ± 0.77 3.71 ± 0.45
5An 6.59 ± 0.89 5.72 ± 0.72 3.83 ± 0.94
5Ao 4.73 ± 0.99 3.96 ± 0.48 4.35 ± 0.65
5Ap 4.77 ± 0.91 4.0 ± 0.51 4.20 ± 0.73
n = 6, EC50 = X ± SD; 화합물 농도는 X×10-4M였다
실험예 7. 본 발명의 화합물 5Aa-p의 TEM 관찰
증류수를 이용하여 각각 1 × 10-7 M, 1 × 10-9 M, 1 × 10-11 M 용액으로 샘플을 제조하였다. 소량의 용액(약 10 ㎕)을 취하여 공기 건조를 위해, 밑에 놓인 여과지를 구비한 구리 그리드의 표면 상에 적하하였다. 이후 투과 전자 현미경(JEOL, JEM-1230) 하에서 형태 및 입자 크기를 관찰하였고 사진으로 기록하였다.
수용액에서, 화합물 5Aa-p는 20-210 nm 사이의 직경을 갖는 나노구형 구조로 자기조립될 수 있고, 여기서 직경은 주로 20-100 nm 사이였다. 이러한 나노구는 나노넷 또는 나노 네크리스 등의 다양한 형태로 결합되었다. 예를 들어, 생체 내 농도가 1 × 10-9 M(이론적 혈중 약물 농도)일 때, TEM 사진을 각각 (도 9)에 도시하였다. 도 9에서, 화합물 5Aa-p는 각각 도면 번호 5a, 5b, 5c, 5d, 5e, 5f, 5g, 5h, 5i, 5j, 5k, 5l, 5m, 5n, 5o, 및 5p에 대응하였다.
실험예 8: 뇌졸중 발생 4시간 이후 1 μmol/kg 5Ak로 뇌졸중 래트에서 6회 연속 치료한 실험
치료학적 효능은 신경 기능 점수로 평가하였다. 점수가 낮을수록 치료 효능이 높은 것이었다. 수컷 SD 래트에 10% 클로랄 수화물 용액을 400 mg/kg 체중 투여량으로 복강 주사하여 마취시켰다. 경부 중앙에서 수직 절개가 이루어졌고, 우측 총경동맥 주간(약 3 cm 길이)을 분리하였다. 설골 레벨에서 외경동맥의 각 분기를 분리 및 결찰하고, 내경동맥을 경부의 팽윤 부분에서 분리하였다. 비침습적 동맥 클립을 이용하여 내경동맥의 절개 및 총경동맥의 근위 말단을 각각 클립핑하였고, 외경동맥 원위 말단을 결찰시켰다. 외경동맥 주간 부위에 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액을 포함하는 카테터를 삽입하였다. 내경동맥의 클립이 해제될 때, 카테터 내 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액이 외경동맥에서 이의 근위 말단으로 천천히 이동하였고, 이후 내경동맥을 통해 뇌의 동맥에 주입되었다. 이어서, 내경동맥의 근위 말단을 결찰시키고, 내경동맥 및 총경동맥 상의 동맥 클립을 해제하여, 혈류가 회복되었다. 상처를 봉합한 후, 20,000 IU 페니실린을 근육 내 주사하여 감염을 예방하였다. 4시간 후, 생리식염수 중의 화합물 5Ak(용량 1 μmol/kg，n = 10)를 연속 6일 동안 주입하고 7일 동안 관찰하였다. 매일 자체적으로 대조하고, Zealonga 방법으로 신경 기능 손상 정도를 평가하였다. 0점은 아무런 신경 기능 결실이 없는 증후를 나타내고, 1점은 손상되지 않은 쪽 앞다리를 펼 수 없는 증후를 나타내며, 2점은 손상되지 않은 쪽으로 보행하는 증후를 나타내고, 3점은 손상되지 않은 쪽으로 몸을 말아 꼬리를 쫓는 형상으로 보행하는 증후를 나타내며, 4점은 의식 장애로 비자발적으로 보행하는 증후를 나타내고, 5점은 사망을 나타냈다. 평가 결과는 표 8에 나열하였다. 데이터는 뇌졸중 발생 4시간 이후 매일 1회 1 μmol/kg 5Ak를 이용한 연속적인 6일간의 치료를 받은 래트에서, 사망이 발생하지 않았음을 나타냈다. 10마리 래트 중 8마리가 신경학적 결실이 없는 정도로 개선되었다. 2마리의 래트만이 경미한 신경학적 결실을 가졌다. 따라서, 1 μmol/kg 5Ak의 복용량은 뇌졸중 발생 4시간 이후 확실한 치료 효과를 갖는다.
뇌졸중 발생 4시간 이후 1 μmol/kg 5Ak 치료를 받은 래트의 치료 효과
평가
시간		 매일 신경 기능 점수 (Mean ± SD) 및 각 점수에 대한 래트의 수
0점 1점 2점 3점 4점 5점
1st day 3 5 1 1 0 0
2nd day 5 4 1 0 0 0
3rd day 3 6 1 0 0 0
4th day 8 1 1 0 0 0
5th day 6 4 0 0 0 0
6th day 8 2 0 0 0 0
실험예 9: 뇌졸중 발생 6시간 이후 1 μ mol /kg 5 Ak 로 뇌졸중 래트에서 6회 연속 치료한 실험
치료학적 효능은 신경 기능 점수로 평가하였다. 점수가 낮을수록 치료 효능이 높은 것이었다. 수컷 SD 래트에 10% 클로랄 수화물 용액을 400 mg/kg 체중 투여량으로 복강 주사하여 마취시켰다. 경부 중앙에서 수직 개방 절개가 이루어졌고, 우측 총경동맥 주간(약 3 cm 길이)을 분리하였다. 설골 레벨에서 외경동맥의 각 분기를 분리 및 결찰하고, 내경동맥을 경부의 팽윤 부분에서 분리하였다. 비침습적 동맥 클립을 이용하여 내경동맥의 절개 및 총경동맥의 근위 말단을 각각 클립핑하였고, 외경동맥 원위 말단을 결찰시켰다. 외경동맥 주간 부위에 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액을 포함하는 카테터를 삽입하였다. 내경동맥의 클립이 해제될 때, 카테터 내 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액이 외경동맥에서 이의 근위 말단으로 천천히 이동하였고, 이후 내경동맥을 통해 뇌의 동맥에 주입되었다. 이어서, 내경동맥의 근위 말단을 결찰시키고, 내경동맥 및 총경동맥 상의 동맥 클립을 해제하여, 혈류가 회복되었다. 상처를 봉합한 후, 20,000 IU 페니실린을 근육 내 주사하여 감염을 예방하였다. 6시간 후, 생리식염수 중의 화합물 5Ak(용량 1 μmol/kg，n = 10)를 연속 6일 동안 주입하고 7일 동안 관찰하였다. 매일 자체적으로 대조하고, Zealonga 방법으로 신경 기능 손상 정도를 평가하였다. 0점은 아무런 신경 기능 결실이 없는 증후를 나타내고, 1점은 손상되지 않은 쪽 앞다리를 펼 수 없는 증후를 나타내며, 2점은 손상되지 않은 쪽으로 보행하는 증후를 나타내고, 3점은 손상되지 않은 쪽으로 몸을 말아 꼬리를 쫓는 형상으로 보행하는 증후를 나타내며, 4점은 의식 장애로 비자발적으로 보행하는 증후를 나타내고, 5점은 사망을 나타냈다. 평가 결과는 표 9에 나열하였다. 데이터는 뇌졸중 발생 6시간 이후 매일 1회 1 μmol/kg 5Ak를 이용한 연속적인 6일간의 치료를 받은 래트에서, 단지 1마리의 래트만이 뜻하지 않게 죽었음을 나타내었다. 9마리 래트 중 6마리는 아무런 신경 기능 결실 없이 회복되었다. 3마리의 래트만이 경미한 신경 기능 결실을 가졌다. 따라서, 1 μmol/kg 5Ak의 복용량은 뇌졸중 발생 6시간 이후 확실한 치료 효과를 갖는다.
뇌졸중 발생 6시간 이후 1 μmol/kg 5Ak 치료를 받은 래트의 치료 효과
평가
시간		 매일 신경 기능 점수 (Mean ± SD) 및 각 점수에 대한 래트의 수
0점 1점 2점 3점 4점 5점
1st day 0 4 4 2 0 0
2nd day 0 7 2 1 0 0
3rd day 1 6 2 1 0 0
4th day 4 4 1 0 0 1
5th day 7 2 0 0 0 0
6th day 6 3 0 0 0 0
실험예 10: 뇌졸중 발생 24시간 이후 1 μ mol /kg 5 Ak 로 뇌졸중 래트에서 6회 연속 치료한 실험
치료학적 효능은 신경 기능 점수로 평가하였다. 점수가 낮을수록 치료 효능이 높은 것이었다. 수컷 SD 래트에 10% 클로랄 수화물 용액을 400 mg/kg 체중 투여량으로 복강 주사하여 마취시켰다. 경부 중앙에서 수직 절개가 이루어졌고, 우측 총경동맥 주간(약 3 cm 길이)을 분리하였다. 설골 레벨에서 외경동맥의 각 분기를 분리 및 결찰하고, 내경동맥을 경부의 팽윤 부분에서 절개하였다. 비침습적 동맥 클립을 이용하여 내경동맥의 절개 및 총경동맥의 근위 말단을 각각 클립핑하였고, 외경동맥 원위 말단을 결찰시켰다. 외경동맥 주간 부위에 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액을 포함하는 카테터를 삽입하였다. 내경동맥의 클립이 해제될 때, 카테터 내 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액이 외경동맥에서 이의 근위 말단으로 천천히 이동하였고, 이후 내경동맥을 통해 뇌의 동맥에 주입되었다. 이어서, 내경동맥의 근위 말단을 결찰시키고, 내경동맥 및 총경동맥 상의 동맥 클립을 해제하여, 혈류가 회복되었다. 상처를 봉합한 후, 20,000 IU 페니실린을 근육 내 주사하여 감염을 예방하였다. 24시간 후, 생리식염수 중의 화합물 5Ak(용량 1 μmol/kg，n = 10)를 연속 6일 동안 주입하고 7일 동안 관찰하였다. 매일 자체적으로 대조하고, Zealonga 방법으로 신경 기능 손상 정도를 평가하였다. 0점은 아무런 신경 기능 결실이 없는 증후를 나타내고, 1점은 손상되지 않은 쪽 앞다리를 펼 수 없는 증후를 나타내며, 2점은 손상되지 않은 쪽으로 보행하는 증후를 나타내고, 3점은 손상되지 않은 쪽으로 몸을 말아 꼬리를 쫓는 형상으로 보행하는 증후를 나타내며, 4점은 의식 장애로 비자발적으로 보행하는 증후를 나타내고, 5점은 사망을 나타냈다. 평가 결과는 표 10에 나열하였다. 데이터는 2마리의 래트가 뇌졸중 발생 24시간 후 죽었음을 나타냈다. 매일 1회 1 μmol/kg 5Ak를 이용한 연속적인 6일간의 치료를 받은 나머지 8마리 래트에서, 사망이 발생하지 않았다. 8마리 래트 중 3마리는 아무런 신경 기능 결실 없이 회복되었다. 4마리 래트는 경미한 신경 기능 결실을 가졌고, 1마리 래트는 분명한 신경 기능 결실을 가졌다. 따라서, 1 μmol/kg 5Ak의 복용량은 여전히 뇌졸중 발생 24시간 이후 확실한 치료 효과를 갖는다.
뇌졸중 발생 24시간 이후 1 μmol/kg 5Ak 치료를 받은 래트의 치료 효과
평가
시간		 매일 신경 기능 점수 (Mean ± SD) 및 각 점수에 대한 래트의 수
0점 1점 2점 3점 4점 5점
1st day 1 4 0 2 1 0
2nd day 2 3 3 1 0 0
3rd day 3 2 3 0 0 0
4th day 2 3 3 0 0 0
5th day 4 3 1 0 0 0
6th day 3 4 1 0 0 0
실험예 11: 뇌졸중 발생 6시간 이후 2.5 μ mol /kg 5 Ak 로 뇌졸중 래트에서 6회 연속 치료한 실험
치료학적 효능은 신경 기능 점수로 평가하였다. 점수가 낮을수록 치료 효능이 높은 것이었다. 수컷 SD 래트에 10% 클로랄 수화물 용액을 400 mg/kg 체중 투여량으로 복강 주사하여 마취시켰다. 경부 중앙에서 수직 절개가 이루어졌고, 우측 총경동맥 주간(약 3 cm 길이)을 분리하였다. 설골 레벨에서 외경동맥의 각 분기를 분리 및 결찰하고, 내경동맥을 경부의 팽윤 부분에서 분리하였다. 비침습적 동맥 클립을 이용하여 내경동맥의 절개 및 총경동맥의 근위 말단을 각각 클립핑하였고, 외경동맥 원위 말단을 결찰시켰다. 외경동맥 주간 부위에 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액을 포함하는 카테터를 삽입하였다. 동시에 내경동맥의 클립이 해제될 때, 카테터 내 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액이 외경동맥에서 이의 근위 말단으로 천천히 이동하였고, 이후 내경동맥을 통해 뇌의 동맥에 주입되었다. 이어서, 내경동맥의 근위 말단을 결찰시키고, 내경동맥 및 총경동맥 상의 동맥 클립을 해제하여, 혈류가 회복되었다. 상처를 봉합한 후, 20,000 IU 페니실린을 근육 내 주사하여 감염을 예방하였다. 6시간 후, 생리식염수 중의 화합물 5Ak(용량 2.5 μmol/kg，n = 10)를 연속 6일 동안 주입하고 7일 동안 관찰하였다. 매일 자체적으로 대조하고, Zealonga 방법으로 신경 기능 손상 정도를 평가하였다. 0점은 아무런 신경 기능 결실이 없는 증후를 나타내고, 1점은 손상되지 않은 쪽 앞다리를 펼 수 없는 증후를 나타내며, 2점은 손상되지 않은 쪽으로 보행하는 증후를 나타내고, 3점은 손상되지 않은 쪽으로 몸을 말아 꼬리를 쫓는 형상으로 보행하는 증후를 나타내며, 4점은 의식 장애로 비자발적으로 보행하는 증후를 나타내고, 5점은 사망을 나타냈다. 평가 결과는 표 11에 나열하였다. 데이터는 뇌졸중 발생 6시간 이후 매일 1회 2.5 μmol/kg 5Ak를 이용한 연속적인 6일간의 치료를 받은 9마리 래트에서, 사망이 발생하지 않았음을 나타내었다. 9마리 래트 중 7마리는 아무런 신경 기능 결실 없이 회복되었다. 1마리의 래트만이 경미한 신경 기능 결실을 가졌다. 따라서, 2.5 μmol/kg 5Ak의 복용량은 1 μmol/kg 5Ak보다 뇌졸중 발생 6시간 이후 확실히 더 나은 치료 효과를 갖는다.
뇌졸중 발생 6시간 이후 2.5 μmol/kg 5Ak 치료를 받은 래트의 치료 효과
평가
시간		 매일 신경 기능 점수 (Mean ± SD) 및 각 점수에 대한 래트의 수
0점 1점 2점 3점 4점 5점
1st day 1 7 0 1 0 0
2nd day 3 4 2 0 0 0
3rd day 6 2 1 0 0 0
4th day 6 3 0 0 0 0
5th day 5 4 0 0 0 0
6th day 7 2 0 0 0 0
실험예 12 : 뇌졸중 발생 24시간 이후 2.5 μ mol /kg 5 Ak 로 뇌졸중 래트에서 6회 연속 치료한 실험
치료학적 효능은 신경 기능 점수로 평가하였다. 점수가 낮을수록 치료 효능이 높은 것이었다. 수컷 SD 래트에 10% 클로랄 수화물 용액을 400 mg/kg 체중 투여량으로 복강 주사하여 마취시켰다. 경부 중앙에서 수직 절개가 이루어졌고, 우측 총경동맥 주간(약 3 cm 길이)을 분리하였다. 설골 레벨에서 외경동맥의 각 분기를 분리 및 결찰하고, 내경동맥을 경부의 팽윤 부분에서 절개하였다. 비침습적 동맥 클립을 이용하여 내경동맥의 절개 및 총경동맥의 근위 말단을 각각 클립핑하였고, 외경동맥 원위 말단을 결찰시켰다. 외경동맥 주간 부위에 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액을 포함하는 카테터를 삽입하였다. 내경동맥의 클립이 해제될 때, 카테터 내 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액이 외경동맥에서 이의 근위 말단으로 천천히 이동하였고, 이후 내경동맥을 통해 뇌의 동맥에 주입되었다. 이어서, 내경동맥의 근위 말단을 결찰시키고, 내경동맥 및 총경동맥 상의 동맥 클립을 해제하여, 혈류가 회복되었다. 상처를 봉합한 후, 20,000 IU 페니실린을 근육 내 주사하여 감염을 예방하였다. 24시간 후, 생리식염수 중의 화합물 5Ak(용량 2.5 μmol/kg，n = 10)를 연속 6일 동안 주입하고 7일 동안 관찰하였다. 매일 자체적으로 대조하고, Zealonga 방법으로 신경 기능 손상 정도를 평가하였다. 0점은 아무런 신경 기능 결실이 없는 증후를 나타내고, 1점은 손상되지 않은 쪽 앞다리를 펼 수 없는 증후를 나타내며, 2점은 손상되지 않은 쪽으로 보행하는 증후를 나타내고, 3점은 손상되지 않은 쪽으로 몸을 말아 꼬리를 쫓는 형상으로 보행하는 증후를 나타내며, 4점은 의식 장애로 비자발적으로 보행하는 증후를 나타내고, 5점은 사망을 나타냈다. 평가 결과는 표 12에 나열하였다. 데이터는 3마리의 래트가 뇌졸중 발생 24시간 후 죽었음을 나타냈다. 매일 1회 2.5 μmol/kg 5Ak를 이용한 연속적인 6일간의 치료를 받은 나머지 7마리 래트에서, 2마리 래트가 죽었다. 3마리 래트는 아무런 신경 기능 결실 없이 회복되었다. 1마리 래트는 경미한 신경 기능 결실을 가졌고, 1마리 래트는 분명한 신경 기능 결실을 가졌다. 따라서, 2.5 μmol/kg 5Ak의 복용량은 여전히 뇌졸중 발생 24시간 이후 확실한 치료 효과를 갖는다.
뇌졸중 발생 24시간 이후 2.5 μmol/kg 5Ak 치료를 받은 래트의 치료 효과
평가
시간		 매일 신경 기능 점수 (Mean ± SD) 및 각 점수에 대한 래트의 수
0점 1점 2점 3점 4점 5점
1st day 1 4 1 0 1 0
2nd day 3 2 1 1 0 0
3rd day 3 2 1 0 0 1
4th day 2 2 1 1 0 0
5th day 4 0 1 0 0 1
6th day 3 1 1 0 0 0
실험예 13: 뇌졸중 발생 24시간 이후 5 μ mol /kg 5 Ak 로 뇌졸중 래트에서 6회 연속 치료한 실험
치료학적 효능은 신경 기능 점수로 평가하였다. 점수가 낮을수록 치료 효능이 높은 것이었다. 수컷 SD 래트에 10% 클로랄 수화물 용액을 400 mg/kg 체중 투여량으로 복강 주사하여 마취시켰다. 경부 중앙에서 수직 절개가 이루어졌고, 우측 총경동맥 주간(약 3 cm 길이)을 분리하였다. 설골 레벨에서 외경동맥의 각 분기를 분리 및 결찰하고, 내경동맥을 경부의 팽윤 부분에서 절개하였다. 비침습적 동맥 클립을 이용하여 내경동맥의 절개 및 총경동맥의 근위 말단을 각각 클립핑하였고, 외경동맥 원위 말단을 결찰시켰다. 외경동맥 주간 부위에 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액을 포함하는 카테터를 삽입하였다. 내경동맥의 클립이 해제될 때, 카테터 내 생리식염수 중의 0.5 mL 혈전 현탁액이 외경동맥에서 이의 근위 말단으로 천천히 이동하였고, 이후 내경동맥을 통해 뇌의 동맥에 주입되었다. 이어서, 내경동맥의 근위 말단을 결찰시키고, 내경동맥 및 총경동맥 상의 동맥 클립을 해제하여, 혈류가 회복되었다. 상처를 봉합한 후, 20,000 IU 페니실린을 근육 내 주사하여 감염을 예방하였다. 24시간 후, 생리식염수 중의 화합물 5Ak(용량 5 μmol/kg，n = 10)를 연속 6일 동안 주입하고 7일 동안 관찰하였다. 매일 자체적으로 대조하고, Zealonga 방법으로 신경 기능 손상 정도를 평가하였다. 0점은 아무런 신경 기능 결실이 없는 증후를 나타내고, 1점은 손상되지 않은 쪽 앞다리를 펼 수 없는 증후를 나타내며, 2점은 손상되지 않은 쪽으로 보행하는 증후를 나타내고, 3점은 손상되지 않은 쪽으로 몸을 말아 꼬리를 쫓는 형상으로 보행하는 증후를 나타내며, 4점은 의식 장애로 비자발적으로 보행하는 증후를 나타내고, 5점은 사망을 나타냈다. 평가 결과는 표 13에 나열하였다. 데이터는 1마리의 래트가 뇌졸중 발생 24시간 후 죽었음을 나타낸다. 매일 1회 5 μmol/kg 5Ak를 이용한 연속적인 6일간의 치료를 받은 나머지 10마리 래트에서, 사망이 발생하지 않았다. 7마리 래트는 아무런 신경 기능 결실 없이 회복되었다. 3마리 래트는 경미한 신경 기능 결실을 가졌다. 따라서, 5 μmol/kg 5Ak의 복용량은 뇌졸중 발생 24시간 이후 확실한 치료 효과를 갖고, 2.5 μmol/kg의 복용량보다 분명히 더 나은 효과를 갖는다.
뇌졸중 발생 24시간 이후 5 μmol/kg 5Ak 치료를 받은 래트의 치료 효과
평가
시간		 매일 신경 기능 점수 (Mean ± SD) 및 각 점수에 대한 래트의 수
0점 1점 2점 3점 4점 5점
1st day 0 5 4 0 1 0
2nd day 2 6 2 0 0 0
3rd day 2 6 2 0 0 0
4th day 5 5 0 0 0 0
5th day 6 4 0 0 0 0
6th day 7 3 0 0 0 0
상기 실험 결과에 따르면, 본 발명의 화합물은 나노구조를 형성하여 혈액-뇌 장벽을 통과하는 기능을 달성할 수 있다. 혈전 용해 및 항혈전 기능에 더하여, 이러한 화합물은 또한 OH, NO, 슈퍼옥사이드 음이온 및 다른 자유 라디칼을 효과적으로 제거할 수 있다. 또한, 효과적인 혈전 용해에 단지 낮은 용량이 요구되었다. 더 높은 용량은 뇌졸중 발생 4시간 이상을 지나 뇌졸중을 치료하는데 있어서 우수한 효과를 입증할 수 있다. 따라서, 이러한 화합물은 임상 적용에 우수한 전망을 갖는다.

Claims (18)

  1. 식 Ia의 화합물로서:
    Figure 112020082644910-pct00081
    Ia
    상기 AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn, L-Asp, 및 L-Glu로 이루어진 군에서 선택되는, 화합물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 AA는 L-Lys인, 화합물.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 혈전 용해용, 항혈전용, 뇌졸중 치료용 또는 뇌경색 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 화합물의 형태는 나노구형 구조인, 약학 조성물.
  5. 제 3항에 있어서, NO 자유 라디칼 소거 약물로 사용되는 약학 조성물.
  6. 하기 단계를 포함하는, 제 1항의 식 Ia을 갖는 화합물의 제조방법:
    (1) 식 1을 갖는 화합물을 제공하는 단계:
    Figure 112020082644910-pct00082
    (1);
    (2) 연결암 L-Lys, 및
    Pro-Ala-AA 시퀀스를 포함하는 펩티드 Q를 제공하는 단계로서, 상기 AA는 L-Ala, L-Val, L-Trp, L-Tyr, L-Pro, L-Phe, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Thr, L-Lys, L-Leu, L-Gln, L-Asn , L-Asp, 및 L-Glu로 이루어진 군에서 선택되는 단계;
    (3) 상기 식 1을 갖는 화합물의 카복실기를 L-Lys의 α-아미노기와 연결하는 단계; 및
    (4) 상기 Pro-Ala-AA 시퀀스를 포함하는 펩티드 Q를 연결하는 단계로서, 미리 정해진 반응 조건 하에, 상기 Pro-Ala-AA 시퀀스를 포함하는 펩티드 Q의 C-말단을 상기 L-Lys의 ε-아미노기와 연결하여 상기 식 Ia를 갖는 화합물을 형성하는 단계.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
KR1020157035673A 2013-06-05 2014-06-03 혈전 용해, 항혈전 및 라디칼 소거능의 3가지 활성을 갖는 신규한 화합물, 및 이의 합성, 나노-구조 및 용도 KR102204781B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310225330.6 2013-06-05
CN201310225330 2013-06-05
PCT/CN2014/079098 WO2014194809A1 (zh) 2013-06-05 2014-06-03 具有溶栓、抗栓和自由基清除三重活性的新型化合物、其合成、纳米结构和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160016863A KR20160016863A (ko) 2016-02-15
KR102204781B1 true KR102204781B1 (ko) 2021-01-20

Family

ID=52007559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157035673A KR102204781B1 (ko) 2013-06-05 2014-06-03 혈전 용해, 항혈전 및 라디칼 소거능의 3가지 활성을 갖는 신규한 화합물, 및 이의 합성, 나노-구조 및 용도

Country Status (24)

Country Link
US (5) US9890193B2 (ko)
EP (1) EP3006454B1 (ko)
JP (1) JP6510500B2 (ko)
KR (1) KR102204781B1 (ko)
CN (1) CN104231046B (ko)
AU (1) AU2014277416B2 (ko)
BR (1) BR112015027164B1 (ko)
CA (1) CA2914004C (ko)
CY (1) CY1123976T1 (ko)
DK (1) DK3006454T3 (ko)
ES (1) ES2847934T3 (ko)
HR (1) HRP20210566T1 (ko)
HU (1) HUE053351T2 (ko)
LT (1) LT3006454T (ko)
MX (1) MX362902B (ko)
PH (1) PH12015502684A1 (ko)
PL (1) PL3006454T3 (ko)
PT (1) PT3006454T (ko)
RS (1) RS61606B1 (ko)
RU (1) RU2660901C2 (ko)
SI (1) SI3006454T1 (ko)
TW (1) TWI633889B (ko)
WO (1) WO2014194809A1 (ko)
ZA (1) ZA201507237B (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106608905B (zh) * 2015-10-22 2020-10-16 彭莉 四氢异喹啉-3-甲酰-k(grpak)rgdv,其合成,活性及应用
CN106608902A (zh) * 2015-10-22 2017-05-03 彭莉 二羟基二甲基四氢异喹啉-3-甲酰-Lys(Lys),其合成,活性及应用
JP6663774B2 (ja) 2016-03-30 2020-03-13 東京エレクトロン株式会社 基板搬送方法及び基板処理システム
EP4034115A4 (en) * 2019-09-25 2023-12-06 Lumosa Therapeutics Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THROMBOLYTIC PEPTIDE-TETRAHYDROISOCINOLINE CONJUGATE
CN115843258A (zh) * 2020-05-15 2023-03-24 辛希克斯 肽支架、其生产方法及其作为可溶性支持物的用途
BR112023018812A2 (pt) 2021-03-22 2023-10-31 Lumosa Therapeutics Co Ltd D0009 para tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico agudo
CN115403653A (zh) * 2022-05-19 2022-11-29 首都医科大学 D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)-乳酰-Pro-Ala-Lys,其合成及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101190941A (zh) 2006-11-30 2008-06-04 首都医科大学 具有溶血栓活性的多肽、其制备方法及应用
CN101497651A (zh) 2008-01-30 2009-08-05 首都医科大学 具有溶血栓活性的化合物、其制备方法、其应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5222632B2 (ko) * 1972-08-22 1977-06-18
WO2002059117A1 (en) 2001-01-23 2002-08-01 Eli Lilly And Company Piperazine- and piperidine-derivatives as melanocortin receptor agonists
CA2473036A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Paul Leslie Ornstein Melanocortin receptor agonists
US7629319B2 (en) * 2002-12-23 2009-12-08 Janssen Pharmaceutica N.V. Heteroaryl peptidomimetics as thrombin receptor antagonists
CN101190895B (zh) 2006-11-30 2010-05-26 首都医科大学 N-[(3s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰基]氨基酸、其制备方法及应用
CN101200493B (zh) 2006-12-11 2011-11-09 首都医科大学 （3s）-n-（l-氨基酰）-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、其制备方法及应用
CN102241740B (zh) * 2008-01-30 2014-02-19 首都医科大学 具有溶血栓活性的化合物、其制备方法、其应用
CN101899084B (zh) 2009-05-26 2012-09-05 首都医科大学 (3s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸三肽缀合物及其制备方法和应用
CN102120727B (zh) 2010-01-07 2013-08-28 首都医科大学 N-[(3s)-n-氨基酰-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰基]氨基酸及其合成方法和应用
CN102127097A (zh) 2010-01-15 2011-07-20 首都医科大学 N-（3s-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰基）氨基酸铜络合物及其制备方法和应用
CN102477068B (zh) 2010-11-30 2013-07-24 首都医科大学 用于制备溶血栓药物的氨基酸衍生物及其制备方法和应用
EP3309148A1 (en) * 2011-10-14 2018-04-18 Bristol-Myers Squibb Company Substituted tetrahydroisoquinoline compounds as factor xia inhibitors
CN103145797B (zh) 2011-12-07 2015-05-20 首都医科大学 [(3s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酰基]-Lys修饰的RGD四肽,其合成和在医学中的应用
CN103450338B (zh) 2012-05-29 2016-08-24 首都医科大学 杂环羧酸修饰的胸腺五肽，其制备，抗肿瘤作用和应用
CN103450330B (zh) * 2012-06-01 2016-05-25 首都医科大学 二羟基四氢异喹啉-3-甲酰氨基酸、其合成、抗血栓作用和应用
CN102887941A (zh) * 2012-09-05 2013-01-23 永光制药有限公司 Pak/咪唑啉/rgd三元缀合物及其制备方法和用途
CN105884905A (zh) * 2012-09-05 2016-08-24 上海晟顺生物科技有限公司 同时具溶血栓、清除自由基和血栓靶向功能的新颖化合物及其制备方法和用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101190941A (zh) 2006-11-30 2008-06-04 首都医科大学 具有溶血栓活性的多肽、其制备方法及应用
CN101497651A (zh) 2008-01-30 2009-08-05 首都医科大学 具有溶血栓活性的化合物、其制备方法、其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20160083423A1 (en) 2016-03-24
DK3006454T3 (da) 2021-04-12
KR20160016863A (ko) 2016-02-15
RU2660901C2 (ru) 2018-07-11
PL3006454T3 (pl) 2021-06-28
HRP20210566T1 (hr) 2021-06-25
US20210355163A1 (en) 2021-11-18
HUE053351T2 (hu) 2021-06-28
TW201521759A (zh) 2015-06-16
LT3006454T (lt) 2021-04-12
EP3006454A4 (en) 2016-11-30
PH12015502684B1 (en) 2016-03-07
BR112015027164A2 (pt) 2017-07-25
WO2014194809A1 (zh) 2014-12-11
JP6510500B2 (ja) 2019-05-08
ES2847934T3 (es) 2021-08-04
JP2016521696A (ja) 2016-07-25
MX362902B (es) 2019-02-22
US20180134748A1 (en) 2018-05-17
US20200055895A1 (en) 2020-02-20
BR112015027164B1 (pt) 2023-03-21
AU2014277416A1 (en) 2015-12-24
CN104231046A (zh) 2014-12-24
EP3006454B1 (en) 2021-01-13
PT3006454T (pt) 2021-01-29
ZA201507237B (en) 2019-11-27
CN104231046B (zh) 2017-05-03
AU2014277416B2 (en) 2018-02-22
US10351594B2 (en) 2019-07-16
CA2914004A1 (en) 2014-12-11
MX2015015924A (es) 2016-04-06
RS61606B1 (sr) 2021-04-29
SI3006454T1 (sl) 2021-04-30
TWI633889B (zh) 2018-09-01
CA2914004C (en) 2022-01-25
US20230312644A1 (en) 2023-10-05
EP3006454A1 (en) 2016-04-13
CY1123976T1 (el) 2022-05-27
RU2015147247A (ru) 2017-05-05
PH12015502684A1 (en) 2016-03-07
US9890193B2 (en) 2018-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102204781B1 (ko) 혈전 용해, 항혈전 및 라디칼 소거능의 3가지 활성을 갖는 신규한 화합물, 및 이의 합성, 나노-구조 및 용도
JP6212123B2 (ja) 血栓溶解、フリーラジカル捕捉および血栓へのターゲティング機能を兼ねる新規化合物およびその製造方法と用途
JP2015529209A5 (ko)
CN108948146B (zh) 1R-甲基-β-四氢咔啉酰-K(ARPAK)-RGDV,其合成,活性和应用
CN108929372B (zh) 1R-甲基-β-四氢咔啉酰-K(GRPAK)-RGDV,其合成,活性和应用
CN106608905B (zh) 四氢异喹啉-3-甲酰-k(grpak)rgdv,其合成,活性及应用
CN108948155B (zh) 1R-甲基-β-四氢咔啉酰-K(QRPAK)-RGDV,其合成,活性和应用
CN108948145B (zh) 1R-甲基-β-四氢咔啉酰-K(PAK)-RGDV,其合成,活性和应用
CN107474106B (zh) 4’,7-二氧乙酰-apak-异黄酮，其合成,活性和应用
CN107459553B (zh) 左旋维c-2-氧乙酰-pak,其合成,活性和应用
CN110577584A (zh) 1S-甲基-β-四氢咔啉酰-K(RPAK)-RGDV,其合成,活性和应用
CN110577575A (zh) 1S-甲基-β-四氢咔啉酰-K(ARPAK)-RGDV,其合成,活性和应用
CN107459556A (zh) 左旋维c-2-氧乙酰-pakpak,其合成,活性和应用

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant