JP5917437B2 - Ａｄｐリボシルトランスフェラーゼ融合バリアントタンパク質 - Google Patents

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Description

本発明は、新規のＣ３様Ｒｈｏキメラアンタゴニスト、及び、網膜を含む損傷したほ乳類の中枢神経系におけるニューロンの修復及びニューロンの生存の促進やガン細胞の増殖の抑制のためのその使用方法に関する。
［関連出願の相互参照］
本出願は米国特許出願第１１／６４３，９４０号（２００６年１２月２２日提出）の一部継続出願であり、前記の米国特許出願第１１／６４３，９４０号は米国特許出願第１０／９０２，８７８号（２００４年８月２日提出）及び米国特許出願第１０／９０２，９５９号（２００４年８月２日提出）の一部継続出願であり、更に米国仮特許出願６０／５０６，１６２号（２００３年９月２９日提出）の優先権を主張する。前記の米国特許出願第１０／９０２，８７８号及び米国特許出願第１０／９０２，９５９号の両出願は、カナダ特許出願第２，３４２，９７０号（２００１年４月１２日提出）、カナダ特許出願第２，３６２，００４号（２００１年１１月１３日提出）、カナダ特許出願第２，３６７，６３６号（２００２年１月１５日提出）、の優先権を主張する。この全ての記載内容は参照により本明細書中で完全に援用される。
脊髄の外傷性損傷は恒久的な機能障害となる。脊髄の損傷に付随する欠損の殆どは、中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷である軸索の損失に起因する。同様に、脳梗塞、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、認知症、プリオン病、パーキンソン病、アルツハイマー症、多発性硬化症、外傷性脳損傷、黄斑変性症、及び緑内障といった他のＣＮＳの疾病は、軸索の損失や退縮に付随する。多くの眼病を含むこれらＣＮＳ疾病に共通することは、軸索の標的との接合が失われ、細胞が死滅することである。病気に冒された、或いは病的なニューロン集団からの軸索の成長を刺激する能力は、失われた神経機能の修復や、細胞死からの防御を促すであろうし、損傷の拡大を制限できる。例えば、白質に於ける梗塞に続いて軸索は損傷し、失われ、神経細胞大は生存していたとしても、灰白質の梗塞により多くのニューロンや非ニューロン細胞（グリア細胞）が死ぬ。損傷した軸索からの軸索発芽誘発に効果を有する脅威は幾つかのタイプの梗塞に対しても同様に脅威となる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， ２００２， ＰＮＡＳ ９９：９０３１−９０３６）。しばしば、ニューロン保護薬剤
が梗塞の後の損傷の制限する潜在的な化合物として試験された。成長促進及びニューロン保護を示す化合物は特に梗塞や神経再生病の良い候補である。
例えば神経病変などにより切断した軸索の再生を刺激する薬剤としての、種々のＲｈｏアンタゴニストの使用が提案されている（カナダ特許出願２，３０４，９８１号（ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）及びカナダ特許出願２，３００，８７８号（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ）参照）。これらの特許出願明細書は、軸索の再生に使用するための既存のトランス−４アミノ（アルキル）−１−ピリジルカラボモイルシクロヘキサン複合体又はＲｈｏキナーゼインヒビターから選択される薬剤と同様、例えばキメラＣ３タンパク質と言った既存のＲｈｏアンタゴニストの使用を提案する。Ｃ３はＲｈｏをＡＤＰ−リボシレーションにより不活化するが、それは細胞に対して非毒性である（Ｄｉｌｌｏｎ ａｎｄ Ｆｅｉｇ， １９９５， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ Ｐａｒｔ．Ｂ，２５６：１７４−１８４）。
Ｒｈｏアンタゴニストによる治療は末梢神経の軸索成長率の増幅にも用いられ、それにより、例えば、切断された肢を再接着することにも効果を有する。加えて、Ｒｈｏは悪性腫
瘍や転移ガンの治療への標的（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０６：５３２−５３５）や高血圧の治療標的（Ｕｅｈａｔａ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，３８９：９９０）として重要であり、ＲｈｏＡについては心臓保護作用が報告されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ， ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１５：１８８６−１８８４）。
軸索再生の為の、Ｒｈｏ及びＲｈｏキナーゼを含む、細胞内シグナル機能を標的とすることは提案されている（カナダ特許出願第２，３０４，９８１号）。クロストリジウム ボ
ツリヌムＣ３エクソトランスフェラーゼ（本明細書では単にＣ３として引用される）は損傷した軸索の再形成と出芽を刺激することが出来る；Ｃ３はクロストリジウム ボツリヌ
ムから精製された毒物である（Ｗｉｌｄｅ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：１６４７８）。クロストリジウム ボツリヌムからのＣ３ファミリー複合
体はＲｈｏをＡＤＰ−リボシレーションの過程により不活化し、よってＲｈｏ機能又は効果のアンタゴニストとして（Ｒｈｏアンタゴニスト）作用する。
Ｃ３タンパク質は再生促進に効果を有するが、Ｃ３は容易に細胞内に浸透せず、効果を有するためには大量の投与量で投与しなければならないことが言及されている。機能上の回復を促進するのに必要な大量の投与量のＣ３組み換え体は、in vivoで再生促進をするた
めのＣ３の使用の実質的な制約または制限を提供する。組織培養の研究では、抑制薬剤下、成長を抑制するのに使われる最小量のＣ３は25 μg/mlであることが実証されている（
Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． １９９９、 Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９： ７５３７−７５４７）。もし細胞が粉砕されていなければ、この投与量ですら有効量ではない。マウス２０ｇに対し少なくとも４０μｇのＣ３が損傷したマウスの脊髄又はラットの視神経の処方に必要であると推測される（カナダ特許出願第２，３２５，８４２号）。成人ヒトの扱いに必要と思われる処方量を重量に対する投与量が等しいとして計算すると（ラットやマウスの実験に使われた投与量から拡大すると）損傷したヒトの脊髄に適用するのには１２０ｍｇ／ｋｇのＣ３が必要である。必要量の大量の組み換えＣ３タンパク質は、大規模なタンパク質精製と費用の点で、製造の上で重大な問題を引き起こす。それはまた最小有効量に必要な投与量であっても大量のタンパク質であり、検査することが出来る投与量の幅を制限する。
損傷したＣＮＳを促進するＣ３の使用に際する他の関連する制限は、それは容易に生体細胞の細胞膜を透過しないことである。
Ｃ３の生物学的効果が試験／分析されたいくつかの組織培養研究に於いて、それは細胞に直接マイクロインジェクションされるか（Ｒｉｄｌｅｙ ａｎｄ Ｈａｌｌ，１９９２，Ｃｅｌｌ，７０： ３８９−３９９）、または細胞膜を破壊するまで細胞を粉砕することに
より適用された（Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． ， １９９９、 Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １９： ７５３７−７５４７）。なぜなら損傷した軸索はすぐにその環境から物質を取り上げ始めるため、Ｉｎ ｖｉｖｏでの軸索損傷の場合、Ｃ３タンパクは容易に細胞に入
りやすい。不完全な脊髄の障害（ＳＣＩ）の後、運動系の可塑性は脊髄の電気回路を含む皮質及び皮質下のレベルによる、。この可塑性は側副及びシナプスの強化又は弱化の軸索又は樹状発芽による。さらに、いくつかの腹側両面線維は、背骨の中枢パターン発生器を通した移動のパターンの開始とコントロールにとって重要であるので、いくつかの腹側両面線維の補償が移動性能における著しい違いに変換されるかもしれない事が示されている。
これは、補償された脊髄皮質側枝の認識は脊髄損傷後に起き、機能的な修復に貢献することが良く確認されている。予備の線維の再組織化と出芽の過程は、Ｃ３様タンパク質が非損傷ニューロンに入ることが出来るようにする処理により増幅されるであろう。これは軸索の自然発生的な可塑性と機能的な回復を助けるのが知られている樹枝状の改造を高めるであろう。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣ３を輸送する他の方法は、受容体が仲介するメカニズに利用
される組み換えタンパク質の作成を含む（Ｂｏｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２５６： ２９７−３０６）。この方法の難点は、治療を要
するセルが、必要な受容体を発現しなければならないということである。 最後に、組織
培地へのＣ２ＩＩ結合タンパク質の添加により、Ｃ２１Ｎ−Ｃ３溶融毒素と共に、受容体を介した飲食作用によりＣ３の利用が可能になる（Ｂａｒｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ６６： １３６４）。このシステム
の難点は、セルの中のＣ３の多くが膜分画の中で抑えられるということである。 より重
要なのは、輸送が起きるためには、別々に２個の異なったタンパク質を加えなければならないことであり、それは、生体内の病気の治療にこのシステムを適用するのを難しくする。
現在、眼疾患を有する人々の病変退行を止めることの出来る治療法を見つける必要性が有る。網膜のニューロンはＣＮＳから派生し、例えば、加齢性黄斑病変 （ＡＭＤ）のよう
な、ＣＮＳの他の領域で効果の有る治療に対応することが期待されている。今日、最も研究の進んでいる治療の形態はＡＭＤの湿性形態及び、 標的特異的新血管形成に対処する
。病気に冒された患者の１０〜１５％に起こる、網膜下新血管膜のレーザー光凝固は、中心窩外脈絡膜血管新生を激しく発現す る、黄斑変性に伴う個人に利益をもたらす。
ドライＡＭＤに対する、酸化亜鉛（８０ｍｇ；高濃度の亜鉛は目の組織、特に網膜、色素上皮および脈絡膜に存在する）と同様、ビタミンＣ（５００ｍｇ）、ビタミンＥ（４００ＩＵ）、ベータカロチン（１５ｍｇ）などの抗酸化剤の一日あたりの大量の投与は、一つの目の中における、中間体サイズのドルーセン、大型ドルーセン、または、非中央地図状萎縮、または進行性黄斑変性症の進行の危険性を若干減少させる。現在、これらの眼病を、視神経を保護する化合物で処置する必要性が有る。また、現在、急性の眼性萎縮症をもつ人々の治療が必要である。眼性萎縮症または視神経の麻痺は不可逆的な視神経の細胞死の原因になり、永久的な視覚機能障害を引き起こす。この疾病は、ＡＭＤのための現在の治療に反応しないものと見られている。Ｃ３様タンパク質は、前記の細胞死や前記疾病の進行を減少させる可能性が有る。
したがって、新規のＣ３様タンパク質が、Ｒｈｏ活性の抑制が必要な種々の病気に有用であると期待されていた。それ故に、化合物、治療の方法、及び剤形に対して、Ｒｈｏ活性の抑制が必要である病気を治療又は抑止するための必要性が存在する。また、腫瘍細胞の中に進入し、低投与量でＲｈｏを迅速に不活性化する能力を有する、Ｃ３様タンパク質組成物が供給されることが望まれていた。
［本発明の要約］
本発明は、新規のキメラＣ３様Ｒｈｏアンタゴニスト、及び、網膜を含む損傷したほ乳類の中枢神経系におけるニューロンの修復及びニューロンの生存の促進や、ガン細胞の増殖の抑制のためのその使用方法に関する。
一つの態様では新規のＲｈｏキメラアンタゴニストはポリペプチドを含有する組成物と同様に供給される。他の態様では、これらのポリペプチドを用いる治療法及び本発明の組成物は本発明のポリペプチド及び生成物の使用と同様に供給される。
１つの態様では、本発明のポリペプチドは、例えばＣ３様融合タンパク、及びＣ３キメラ融合タンパク質といった、連結した、又は融合したタイプのタンパク （ポリペプチド）
である。本発明のポリペプチドの例としては配列番号４、配列番号６、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、配列番号３７
、及び配列番号１０、およびそれらのアナログまたはバリアントが含まれる。他の様態では、本発明のポリペプチドは配列番号４、配列番号６、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、配列番号３７および配列番号１０を含み、これらのポリペプチドはＮ末端が２０アミノ酸短くなっているか、又はこれらのポリペプチドはＣ末端で１０アミノ酸短くなっているか、これらのポリペプチドはＮ末端で２０アミノ酸Ｃ末端が１０アミノ酸短くなっている。他の態様では本発明のポリペプチドはここで開示されたポリペプチドの全てを含む。他の態様では本発明のポリペプチドはＰＥＧ化されている。
他の態様では、本発明のポリペプチドは配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号７８及び配列番号７９を含む。
さらなる態様では、本発明のポリペプチドは輸送剤としてのアミノ酸配列と共有結合しており、レセプター非依存性の機構又はレセプター依存性の機構による摂取を促進する。一つの態様では前記輸送剤は配列番号３、配列番号４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号 ５０、配列番号５１、配列番号５２
、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号 ６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配
列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号 ７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番
号７５、配列番号７６及び／又は配列番号７７を含む。
さらなる態様では本発明のポリペプチドは、ポリペプチド性細胞膜輸送部分を含む細胞透過性融合タンパク質複合体であり、本発明の薬学組成物は、本発明のポリペプチド性細胞膜輸送部分及び実質的に精製されたポリペプチドを含む細胞透過性融合タンパク複合体である。他の態様では、ポリペプチド性細胞膜輸送部分は５から約５０アミノ酸が供給されたタンパク質を含む。
本発明は又、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物に関する。一つの態様では、前記医薬組成物は薬学的に許容される担体を含む。一つの態様では、前記医薬組成物は無菌状態、無菌可能、又は滅菌されている。さらなる様態では、前記医薬組成物は単位投与量毎のバイアル瓶であるか、又は単位投与量の整数倍である。更に他の態様では前記医薬組成物は乾燥、凍結乾燥されているか、脱水した基質を含有するか、又は凍結乾燥した基質中の融合タンパク質を含有する。さらに、本発明の医薬組成物は組織接着物質、及び／又はフィブリンを含有しても良く、例えばティーセル（登録商標）のようなフィブリンシーリング剤でも良い。
本発明の組成物に用いられる、薬学的に許容される担体はポリ（エチレン−ビニル酢酸）共重合体、ＰＶＡ、部分的に加水分解されたポリ（エチレン−ビニル酢酸共重合体）、ポリ（エチレン−酢酸ビニル−ビニルアルコール共重合体）、架橋ポリ（エチレン−酢酸ビニル）、部分的に加水分解された架橋ポリ（エチレン−酢酸ビニル共重合体）、架橋ポ
リ（エチレン−酢酸ビニル−ビニルアルコール共重合体）、ポリ−Ｄ、Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、ＰＧＡ、乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ（無水物）、ポリカプロラクトンとポリエチレングリコールの共重合体、ポリ乳酸とポリエチレ ングリコールの共重合体、ポリエ
チレングリコール；およびこれらの組み合わせ及び混合物が例示されるが、これらに限定されない。
他の態様では、薬学的に許容される担体は水溶性ゼラチン、水溶性タンパク質、重合体か
らなる担体、交差結合した薬剤やそれらの組み合わせである。他の態様では、前記薬学的に許容される担体は基質である。
更に他の態様では、薬学的に許容される担体は、水、薬学的に許容される緩衝塩、薬学的に許容される緩衝液、薬学的に許容される抗酸化剤、アスコルビン酸、１種乃至複数の低分子量の薬学的に許容されるポリペプチド、約２から約１０アミノ酸残基を含むペプチド、１種乃至複数の薬学的に許容されるタンパク質、１種乃至複数の薬学的に許容されるアミノ酸、ヒト必須アミノ酸、１種乃至複数の薬学的に許容される炭化水素、１種乃至複数の薬学的に許容される炭化水素派生物質、非還元糖、グルコース、スクロース、ソルビトール、トレハロース、マンニトール、マルトデキストリン、デキストリン、シクロデキストリン、薬学的に許容されるコーティング剤、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、二価金属イオン用のキレート剤、三価金属イオン用のキレート剤、グルタチオン、薬学的に許容される非特異的血清アルブミン、及び／又はそれらの組み合わせを含む。
本発明はまた、ポリペプチド又は本発明のポリペプチドや組成物を被療者に投与することを含む治療法に関する。一つの態様では、医療的に効果の有る量のポリペプチドや組成物が投与される。他の態様では前記被療者がそのような治療を必要とする。いくつかの態様では、前記被療者は哺乳類、特にヒトでも良い。一つの態様では、本発明のポリペプチドや組成物は注射による投与でも良い。
一つの態様では、本発明は哺乳類神経系修復の分野（例えば中枢神経系（ＣＮＳ）損傷部位、損傷した網膜の修復や末梢神経系（ＰＮＳ）損傷部位の修復）軸索再生および軸索発芽、神経突起成長、神経防護作用の活動、神経変性および虚血性傷害、および／または衝撃的に損傷を受けた神経系の治療に関連する。本発明の一態様では軸索繊維の損傷の場合、神経軸索の再生をすること、末梢神経及び中枢神経系の他の病気において神経突起成長を刺激することである。本発明の他の態様は末梢神経系でのニューロン再生を促進することである。
以下の治療方法は被療者の黄斑病変の処理方法を提供する：被療者の眼内部の黄斑病変を伴う、網膜下の新血管形成及び／又は新生血管組織の増殖の比率を抑制又は減少させる方法；被療者の眼内部の黄斑病変に伴う細胞死から網膜フォトレセプターを保護する方法；及び／又は被療者の転移性腫瘍性ガン細胞の制御を外れた増殖、拡散、又は転移の防止又は抑制。他の態様では、本発明は、切除端における、被療者のガンの腫瘍の切除部位に近接した宿主細胞又は、転移性の腫瘍性細胞の、制御できない増殖、拡散、移動を抑制又は制止する方法に関する。投与は被療者に残る切除部位の、切除部位の表面に直接行われるか、切除部位の表面の下、又は切除部位の中に行われる。及び、投与は腫瘍の摘出又は除去に先行するか、除去に引き続くか、或いはそれらの両方で行われる。
更なる態様では、被療者の宿主組織中の悪性細胞からの腫瘍の成長を防止する方法が提供される。ポリペプチド、融合タンパク質、又は本発明の組成物は同時に、少なくとも２種の悪性細胞の移動、悪性細胞の増殖、血管新成又は菅状構造形成又は悪性細胞に近接する毛細血管ネットワークの成長、及び悪性細胞からの活性メタロプロテイナーゼの分泌を抑えるか抑止する可能性がある。被療者の第一のガンの腫瘍や、ガンの残留する腫瘍細胞から成る第２の腫瘍の切除や除去をした部位に近位の宿主組織の切除端の中の成長の防止の方法もまた提供される。投与は、被療者に残存する、切除端の表面又は切除端の表面下に直接的に、または、切除端に近位の組織にされるものでもよく、そして、最初の腫瘍切除又は除去に対して時間を空けて前に或いは後にされてもよく、または前及び後の両方でもよく、前記融合タンパク質は、残存腫瘍細胞遊走、残存腫瘍細胞増殖、血管形成もしくは管状構造形成、又は残存腫瘍細胞近隣の毛細血管ネットワークの成長、及び腫瘍と残留腫瘍細胞からの活性メタロプロテイナーゼの分泌の少なくとも２つを同時に防ぐか或いは妨げる。一つの態様では、ガンは、乳がん、脳腫瘍、結腸ガン、皮膚ガン、腎臓ガン、肝臓
ガンである。他の態様では、ガンは例えば、膠腫瘍、ニューロン腫瘍、松果体腫瘍、髄膜腫瘍、神経鞘の腫瘍、リンパ腫、先天異常の腫瘍といった脳腫瘍や、肺ガン、乳がん、黒色腫、腎臓ガン、消化管の腫瘍などに由来する脳に位置する転移性の腫瘍である。更なる態様では、前記ガンは、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、毛様細胞性星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、粘液乳頭型脳室上衣腫、上衣下腫、脈絡叢乳頭腫、神経芽細胞腫、神経節芽細胞腫、神経節細胞腫、および髄芽腫、松果体芽細胞腫及び松果体細胞腫、髄膜腫、髄膜血管周囲細胞腫、髄膜肉腫、シュワン腫（神経鞘腫）、神経繊維腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫の一次及び二次サブタイプ、非ホジキンリンパ腫の一次及び二次サブタイプ、頭蓋咽頭腫、類表皮嚢胞、類皮嚢胞、及び膠質嚢胞からなる群から選ばれる脳腫瘍である。
一つの態様では、治療効果の有る量は，１ｃｃあたり約０．００１μｇから約５０μｇ、又は１立方センチメートルあたり約０．０００１μｇから約１００μｇの融合タンパク質、又は、１ｍｌあたり約１μｇの融合タンパク質、１ｍｌあたり約１０μｇから約５０μｇの融合タンパク質である。投与は、注射のそば、一時的な適用の近く、または、移植のそばであってもよい。一つの態様では、投与は関節内、眼内、鼻腔内、神経内、皮膚内、骨内、舌下、口内、局所的、膀胱内、クモ膜下腔内、静脈内、腹膜内で、頭蓋内で、筋肉内で、皮下であり、噴霧化及び吸入により、腫瘍へ直接適用することにより、病変部位へ直接適用することにより、腫瘍切除後に残った縁の上又は中に直接適応することにより、腸より、胃カメラを用いた手法と共に腸より、及び／又はＥＣＲＰによるものであってもよい。
他の態様では、黄斑変性症を防ぐか処理する方法及び／又はガンを防ぐか処理する方法と同様に秘術者の脊髄損傷を処理する方法が提供される。
本発明は、脊髄損傷，黄斑変性症及び／又はガン（例えば乳がん、脳腫瘍、大腸ガン、皮膚ガン、腎臓ガン、肝臓ガン）の処理のための、ポリペプチド及び本発明の組成物使用法にも関する。一つの態様では、被療者の軸索や神経突起の再生又は成長が促進される。他の態様では，本発明は脊髄損傷，黄斑変性症、及び／又はガン（例えば乳がん、脳腫瘍、大腸ガン、皮膚ガン、腎臓ガン、肝臓ガン）の治療等のための薬剤の加工におけるポリペプチド及び本発明の組成物の使用に関する。
一つの態様では、被療者は神経疾病又は神経変性疾病を有するものであってもよい。これらの例に限定されることなく、前記疾患は、スタルガルト病，リーバー先天性黒内症、ベスト病，先天性脈絡膜欠如，網膜分離症，バルデー・ビードル症候群，前方虚血性視覚神経障害、プルチェル網膜症、視神経炎、視神経円盤浮腫、コーツ病及び／又はレーバー粟粒性動脈瘤（免疫性で末梢性神経障害）、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、シャルコー・マリー・ティース病、巨大軸索神経障害、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性の筋萎縮症、進行性の延髄遺伝性筋萎縮症、ヘルニア性、破裂性あるいは脱出性の椎間板症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸部出口破壊症候群、アクリルアミド、ガンマ−ジケトン（シンナー中毒者の神経障害）、二硫化炭素、ダプソン、ダニ、ポルフィリン症、グレインバレー症候群、ハンチントン舞踏病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、認知症、プリオン病および緑内障を含む。他の態様では、被療者は、脳梗塞、手術、梗塞症、感染、毒物への暴露、悪性腫瘍または腫瘍随伴性症候群から生じる神経系損害を有する。
本発明のこれら及び他の態様は、関連する明細書及び添付した図面に基づき明らかになるであろう。
参照は現在、添付の図面によって行われ、それは図例の手段で１つの態様として示される。そしてそれらは以下の通りである：
本発明の配列番号４３の融合タンパク質、及び配列番号４３，配列番号６の不活性バリアントの活性の欠失を、ＮＧ１０８細胞を用いたバイオアッセイにより表した図であり、ここでＮＧ１０８細胞は配列番号４３により培養され、神経突起伸長を加速した（バー４２、おおよそ４０％の神経細胞成長を示す）；及び、配列番号６で処理したＮＧ−１０８細胞の神経突起伸長（カラム４２、おおよそ４０％の神経突起成長を示す）および、ここで、ＮＧ−１０８細胞の神経突起成長、はコントロール（カラム４０、おおよそ神経突起成長の１２％を示す）と同様である。 （Ａ）ＷＴＣ３エクソザイムのＮ末端配列、配列番号１０及び配列番号４３を示す図であり、ここで、イタリック体で示されたアミノ酸残基は、ＷＴＣ３エクソザイムの内在性アミノ酸残基シグナルペプチドであり、太字は改変されたものである。（Ｂ）バリアントの略図である。（Ｃ）配列番号４４の二量体化を示す勾配ゲルである。（Ｄ）配列番号１０の強化された安定性を示す勾配ゲルである。（Ｅ）バリアント（配列番号４４）の代表的な精製を示す勾配ゲルである。 配列番号１０のバリアント（配列番号１３−２２）の短くなった配列を示す図であり、ここで、タンパク質配列のうち強調した部分は新規のトランケート配列 配列番号１０バリアントを精製するために消去されたアミノ酸伸長部であり、ここにおいて灰色で強調されたアミノ酸は配列番号１０のＮ末端又はＣ末端から削除され、下線部を引いたアミノ酸は膜輸送配列を示す。 分子量標準（レーン１）、精製したＰＥＧ−ＢＡ−２２０バリアント（レーン３）、ＰＥＧ−ＢＡ−２２５バリアント（レーン４）、ＰＥＧ−ＢＡ−２３０バリアント（レーン５）、ＰＥＧ−ＢＡ−２３１バリアント（レーン６及び７）であるＮｕＰＡＧＥゲルの図であり、ここで図４Ｂは標準分子量（レーン１），精製したＰＥＧ−ＢＡ−２３０バリアント（レーン３）、ＰＥＧ−ＢＡ−２３１バリアント（レーン４）、ＰＥＧ−ＢＡ−２３５バリアント（レーン５）、ＰＥＧ−ＢＡ−２３６バリアント（レーン６）及びＰＥＧ−ＢＡ−２４０バリアント（レーン８）であるＮｕＰＡＧＥゲルの図である。 緑内障網膜に於ける配列番号１０の神経保護作用を示す図である。＊Ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡ）。 成熟ラットＨ＆Ｅ染色法を成熟ラットに用い、３日間光に曝し、１μｇの配列番号１０の存在下、５日後に測定した光受容体の生存率を図示したものである。 ０．０１μｇの２回の注射後の光受容体の生存率が配列番号１０により増加することを示した図である。 Ｒｄ１配列番号１０の硝子体内への注入が、マウスの核膜外層を保護することを示す図である。 図９Ａは１００ミクロン中のＴＵＮＥＬラベルされた光受容体の全量を表す図である。ここで図９ＢはＲｄ１マウス網膜に於ける、配列番号１０の減少が光受容体細胞の細胞死を示す。 配列番号１０の硝子体内への注入がネズミ網膜における生理的な血管形成を阻害することを示す図である。 配列番号１０の局所的な投与が病マウス角膜の血管形成を減少させることを示す図である。 配列番号１０の硝子体内への注入によりレーザーにより誘導されたマウスの網膜下の新血管形成が減少することを示す図である。 Ａ−Ｃ：ＣＴβ抗体で染色した視神経部位の写真であり、病変部位（矢印）へ遠心方向に再生する軸索を明らかになる。（Ａ）非処理動物の２週間後の微細病変、（Ｂ）配列番号４４処理動物、（Ｃ）配列番号４３処理動物、（Ｄ−Ｅ）はコントロールと比較した、２週間後の微細病変の再生定量化で（Ｄ）配列番号４４処理動物、（Ｅ）配列番号４３処理動物。スケールバー：Ａ−Ｃ＝１００μｍ，スチューデントｔ検定による＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５。 （Ａ）ＣＴβ抗体で染色した視神経部位の写真であり、配列番号４３処理動物及びＰＢＳコントロールにおける２週間後の病変部位（矢印）の遠心方向への軸索再生が明らかになる。配列番号４３及びＰＢＳは視神経損傷の４日後に硝子帯に注入した。スケールバー＝１００μｍ（Ｂ）配列番号４３処理動物のコントロールと比較した場合の再生の定量評価；及び（Ｃ）即座の治療又は遅延し他治療後の各々の処理群の最長軸索の平均の比較。スチューデントｔ検定において＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５。 視神経損傷の１週間前に後戻りしてラベルしたＲＧＣの図である。配列番号４３又は賦形剤は視神経切断後に硝子体に注入し、軸索切断の７又は１４日後に用意した網膜の全裁標本の後戻りしてラベルされたＲＧＣの数を数えた。 硝子体内注入の２４時間後の、成熟ラット（ＥＬＩＳＡ）網膜内での図５で述べられた低分子量ＰＥＧ−ＢＡバリアントのレベルの図である。 ラットにおけるＰＥＧ−ＢＡ−バリアントの眼球内注入の２４時間後のＲｈｏＡ ＡＤＰ−リボシレーションの図である。 硝子体内注入の後の配列番号１０対ＢＡ−２３１（配列番号１０のＰＥＧ化したバリアント）におけるレチナール存在の経時変化の図である。 眼球内注入の２４時間及び４８時間後における、成熟ラットの網膜内の、高分子量ＰＥＧ−ＢＡバリアントのレベルの図である。 ＢＡバリアントの眼球内注入２４及び４８時間後のＲｈｏＡ ＡＤＰ−リボシレーリョンを示す分子量シフトを明らかにするＳＤＳゲルである。 ＨＥＣ１Ｂヒト子宮内膜腺ガン細胞の増殖において、融合タンパク質、配列番号４３を含む本発明の組成物の効果を表す図であり、ここでは、トリチウム化したチミジン取り込みにより測定し、賦形剤（１０）はリン酸緩衝生理食塩水であり、配列番号４３を１μｇ／ｍｌ（１１），１０μｇ／ｍｌ（１２）及び５０μｇ／ｍｌ（１３）の濃度で用い、ガン細胞増殖は投与量に依存する方式で減少した。 融合タンパク質配列番号４３を含む本発明の組成物の効果を、ＳＫ−ＭＥＬ−１ヒト黒色腫細胞の増殖により表す図であり、トリチウム化チミジン取り込みにより測定した；賦形剤はリン酸緩衝生理食塩水であり、配列番号４３を１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、及び５０μｇ／ｍｌの濃度で用い、ガン細胞増殖は投与量に依存する方式で減少した。 （Ａ） ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商品名）マトリックス内で培養した、ＨＵＶＥＣ内皮細胞の管状形態の図であり、ここでこの分析は血管形成のための細胞培養分析であり、管状形態形成は本発明の融合タンパク質を含まないコントロールでも見られる。（Ｂ） ＭＡＴＲＩＧＥＬマトリックス中で培養したＨＵＶＥＣ内皮細胞の管形成の減少の図であり、ここで培養液は融合タンパク質配列番号４３を含む本発明の組成物で処理し、ボックス３１出示されるように血管形成の阻害を論証するより少ない管を持つ。 融合タンパク質配列番号４３を含む本発明の組成物により、ＴＫ−１０ヒト肝臓ガン細胞の成長阻害を示し、スルフォダミンＢ（ＳＲＢ）成長阻害分析により測定され、ここで配列番号４３は０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度で用いられ、用いた全ての濃度においてガン細胞増殖は減少し、ガン細胞増殖の減少は投与量に依存し、１００μｇ／ｍｌの融合タンパク質の濃度において本発明の組成物はガン細胞の細胞死を引き起こす。 配列番号４３を含む本発明の組成物による、ＨＯＰ−６２非小細胞ガン肺ガン細胞の成長抑制の図であり、スルフォダミンＢ（ＳＲＢ）成長阻害分析により測定され、ここで配列番号４３は０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度で用いられ、用いた全ての濃度においてガン細胞増殖は減少し、ガン細胞増殖の減少は投与量に依存した。 融合タンパク質配列番号４３を含む本発明の組成物によるＳＦ−２８６ＣＮＳガン細胞の成長抑制を示し、スルフォダミンＢ（ＳＲＢ）成長阻害分析により測定され、ここで配列番号４３は０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度で用いられ、用いた全ての濃度においてガン細胞増殖は減少し、ガン細胞増殖の減少は投与量に依存した。 １０μｇ／ｍｌの配列番号１０とともにインキュベートした後の、本発明の融合タンパク質及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の投与から、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後及び２４時間後の活性化したＲｈｏＡの度合いの減少を示した図である。 配列番号４３を含むの組成物によるＣａｋｉ−１肝臓ガン細胞の成長抑制（参照とした賦形剤コントロールに対する成長の度合い（％））を示す図であり、成長率（％）はＳＲＢ分析で測定し相対的な融合タンパク質の濃度は０．１，、１、１０及び１００である。 ラット大動脈輪における血管形成の減少を示す図であり、ここでラット大動脈は１ｍｍの小さな輪に切り、固化したＥＣｍａｔｒｉｘ（商標）（ｍａｔｒｉｇｅｌ社製）で被覆した大動脈輪を配列番号１０無し（コントロール）又は１０μｇ／ｍＬの配列番号１０で０日から７−８日インキュベートし、配列番号１０を含む培地（パネル２及び４）又は含まない培地（パネル１及び３）を４日目に補充した。（Ａ）位相差コントラスト倒立顕微鏡下で２５倍（上段パネル）１００倍（下段パネル）の倍率で観察した輪からの血管形成（Ｂ）血管の長さを測定し、平均±ＳＥＭを報告した（結果は少なくとも３回分析製た３回の独立した実験の代表値である。記号＊はコントロールの輪からの有意差を表す。） 配列番号１０ＡＤＰ−リボシレートＲｈｏＡを示す図であり、準融合性のＨＵＶＥＣは、配列番号１０（０〜２５μｇ／ｍＬ、上段パネル）又は１０μｇ／ｍＬの配列番号１０（０．５−８ｈの様々な時間、下段パネル）の異なった濃度で２４時間の間処理され、ＲｈｏＡ ＡＤＰ−リボシレーションはＲｈｏＡを用いたウエスタンブロットで分析した。 配列番号１０がＨＵＶＥＣにおける管の形成を減少させることを示す図であり、ＨＵＶＥＣは、配列番号１０無し（コントロール）、又は１０μｇ／ｍＬもしくは５０μｇ／ｍＬの配列番号１０又は血管新生阻害剤のトラニラストを含む固化したＥＣｍａｔｒｉｘ（商標）に播種し、細胞はまた１０μＭ又は５０μＭのＲＯＣＫ阻害剤ファスジルと共にインキュベートし、毛細血管様の構造が６時間から２０時間のインキュベーションの間に可視化した。（Ａ）位相差コントラスト倒立顕微鏡下で４０倍の倍率で撮影した写真（Ｂ）管の長さの定量は非処理細胞±ＳＥＭからの長さの百分率で説明する（写真及び定量化は少なくとも各々３回分析した２つの独立した実験の代表値である記号＊及び＊＊は非処理細胞との有意差（ｐ(０．０５）及び顕著な有意差（ｐ(０．０１）を表す。） 配列番号１０が高濃度でＨＵＶＥＣの増殖に影響を与えることを示す図であり、ＨＵＶＥＣは９６穴プレート（ｃｏｌｌａｇｅｎＩコート済み）に入れ、０から１００μｇ／ｍＬ（又はμＭ）の配列番号１０、ファスジル又はトラニラストと共に２４時間又は７２時間の間インキュベートし、４時間から２４時間培養した細胞を洗い、検査する化合物を含まない新鮮な培地を補給し７２時間ごまで放置し、処理の終わり（７２時間後）にアラーマーブルーを加え、４時間インキュベートし蛍光を測定した。増殖は非処理細胞からの百分率（０μｇ／ｍＬ）(Ｓ．Ｄ．であり３回の分析をした２つの独立した実験の代表値である。 配列番号１０はＶＥＧＦ−依存性ＨＵＶＥＣ移動を修飾することが出来、（Ａ）ＨＵＶＥＣは配列番号１０、ファスジル又はトラニラストを含む２４穴フィブロネクチンコート済みトランスウェルチャンバーに播種し、１０ｎｇ／ｍＬの検査する化合物を含む又は含まないＶＥＧＦで２０時間移動を刺激し、移動した細胞は蛍光強度をカルセイン−ＡＭをプローブとして用いて測定し、（Ｂ）ＨＵＶＥＣは移動が始まる前に予め５０μｇ／ｍＬの配列番号１０で２４時間前処理した（結果はＶＥＧＦ(ＳＥＭで刺激しなかった非処理細胞に対する百分率で表し、２回の測定をした４つの独立した実験の代表値である；記号＊及び＊＊＊は各々非処理細胞＋ＶＥＧＦ（コントロールＶＥＧＦ）に対しての有意差（ｐ(０．０５）及び顕著な有意差（ｐ(０．００１）を表す；記号＃＃＃は非処理細胞−ＶＥＧＦ（コントロール−ＶＥＧＦ）からの顕著な有意差を表す）。 ラット脊髄中への細胞新入生Ｃ３の侵入及び分布の分析結果である；（Ａ）ラットの脊髄への配列番号１０の侵入の野生タイプＣ３（配列番号１）との比較を開示し、配列番号１０は傷のない硬膜及び手術により開いた硬膜両方の打撲傷後のウエスタンブロットにより検出された。 ラット脊髄中への細胞新入生Ｃ３の侵入及び分布の分析結果である；（Ｂ）脊髄に沿った配列番号１０の分布を開示した。 ラット脊髄中への細胞新入生Ｃ３の侵入及び分布の分析結果である；（Ｃ）打撲を与えた投与の２４時間後の免疫組織化学的配列番号１０（５０ｕｇ）侵入の検出を開示した。 ラットの打撲後の配列番号１０による時間及び投与量依存性Ｒｈｏ不活化を示す（Ａ）硬膜外にＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）成熟雌ラットの穏やかな打撲（１０ｇ ｘ ２５ｍｍ）に引き続き即座に異なる投薬量の配列番号１０を投与し、活性化のあるＲｈｏ強度をＳＣＩ後２４時間後に測定した（Ｂ）Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）中の５０μＭの配列番号１０の後脊髄を異なる回数損傷し（２時間から７日間）、損傷後３時間後に組織を集め、Ｒｈｏ強度を測定した。 マウスの機能的恢復を促進する、配列番号１０による遅い処理を示す図である、（Ａ）成熟雌ＢＡｌｂ／ｃマウスの椎弓手術及びＳＣ片側切断の後、１μｇの配列番号１０入りＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）を脊髄に即座に投与した。 マウスの機能的恢復を促進する、配列番号１０による遅い処理を示す図である、（Ｂ）処理はＳＣＩの２４時間のに遅延した。 マウスの機能的恢復を促進する、配列番号１０による遅い処理を示す図である、（Ｃ）処理はＳＣＩの７２時間後に遅延した；各々の治療グループはそれぞれのコントロールを用意し（Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）のみ）、多様性を２回数え、遅延した手術は２４時間から７２時間の処理を必要とし（代表的な処理投与が許容される）、初めの脊髄損傷を０日と考え、改良した１７ポイントマウスのためのＢｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ−Ｂａｓｓｏスケール（ＢＢＢスケール）を用いて運動性回復を１６日間測定した。 配列番号１０は脊髄に局所的に投与された場合に耐性をを持つ事を示した図である。（Ａ）各々のラットの体重（配列番号１０又は賦形剤）は手術の直前及び８週間毎の全ての週に測定した。 配列番号１０は脊髄に局所的に投与された場合に耐性をを持つ事を示した図である。（Ｂ）及び（Ｃ）ラット脊髄の椎弓手術及び処理のの３ヶ月後の形態を示し（Ｂ）賦形剤（Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標））処理ラットの脊髄長手方向切断面。 配列番号１０は脊髄に局所的に投与された場合に耐性をを持つ事を示した図である。（Ｂ）及び（Ｃ）ラット脊髄の椎弓手術及び処理のの３ヶ月後の形態を示し（Ｃ）５０μｇの配列番号１０処理ラットの脊髄長手方向切断面を示し；椎弓手術は行われるが硬膜は傷を付けず放置した；嘴骨は左側でバーは４００μｍを示す。 配列番号１０がラットの脊髄打撲の後の運動機能の促進をする事を示す図である。（Ａ）各々のラットの体重を各週、８週目まで、手術前に測定したことを示す図である（配列番号１０，ｎ＝１１又は賦形剤，ｎ＝１２）。 配列番号１０がラットの脊髄打撲の後の運動機能の促進をする事を示す図である。（Ｂ）椎弓手術及び穏やかな脊髄打撲（ＮＹＵインパクター、５０ｍｍの高さから１０ｇの重りを落とした）を実行し、ＳＣＩのすぐ後に脊髄硬膜に配列番号１０（１５μｇ）のみ又は賦形剤の入ったＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）を投与した成熟雄ラット。賦形剤及び配列番号１０を処方したラットのＢＢＢスコアは８週目まで毎週２重盲検定を行った。 配列番号１０がラットの脊髄打撲の後の運動機能の促進をする事を示す図である。（Ｃ）賦形剤処理群対配列番号１０処理群における足底配置又は足踏み（ＢＢＢスコアは９から１１）で支持された重量に達したラットの割合の経時変化を開示した。 配列番号１０が打撲傷を与えたラット脊髄に対する神経保護を示す（Ａ）１ｃｍの損傷に於ける予備の灰白質及び白質はルキソールファストブルーで染色し横断面を電子化したシステムで解析し、分析は損傷及び治療の８週間後に実行した。 配列番号１０が打撲傷を与えたラット脊髄に対する神経保護を示す（Ｂ）全損傷部位は２ｃｍの脊髄の予備の組織から曲線から生じた割合（％）を各々のラットで計算する事により得た。 配列番号１０はラットの打撲後の異痛症の発展に全く影響がない事を示す図であり、前足を引っ込めるＶｏｎ Ｆｒｅｙテストは配列番号１０又は重篤な打撲症を与えた雌ラットに賦形剤処理後６週間後に行った。 配列番号１０修飾したカドヘリン分布及び発現を示す図であり、ＨＵＶＥＣは８穴コラーゲン−Ｉコーとしたチャンバースライドに播種し、Ａ） 穴毎に２ｘ１０3細胞又は２ｘ１０4 細胞播種し、配列番号１０無し（コントロール）又は２５μｇ／ｍＬの配列番号１０のもとでインキュベートした；以下の細胞固定及び透過性においてカドヘリンの分布はマウスモノクローナルパン−カドヘリン及びＦＩＴＣ−有望２次抗体を用いた蛍光顕微鏡のもと可視化し；写真は４００倍の倍率で撮影し少なくとも３回の計測をした２つの独立した実験の代表値を用いた；薄い矢印は細胞−細胞連絡のカドヘリンを指し、大きな矢印はカドヘリンの無い細胞連絡を指す；Ｂ）準融合性のＨＵＶＥＣは０、１０又は２５μｇ／ｍＬの配列番号１０でインキュベートし、タンパク質は抽出され、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、マウスモノクローナル パン−カドヘリン抗体を用いて免疫検出された；細胞外調節キナーゼリプロービング（ｒｅｐｒｏｂｉｎｇ）は特異的細胞外調節キナーゼ１／２抗体を用いる事により、ゲルローディングコントロールにより同じメンブレン上に行った。；以下の免疫ブロットの数は非処理細胞からの相対的な発現を代表し、少なくとも３回の分析をした２つの独立した実験の代表値である。 配列番号１０がオクルディン分布と発現型を修飾した図であり、ＨＵＶＥＣは８穴コラーゲンＩコート済みチャンバースライドに播種したＡ）各穴に２ｘ１０4細胞入れ配列番号１０の無い状況（コントロール）又は２５μｇ／ｍＬの配列番号１０下でインキュベートした；引き続き細胞を固定しオクルディン分布をウサギポリクローナルオクルディン及びＦＩＴＣ融合二次抗体を用いて蛍光顕微鏡下で可視化した；写真は４００倍の倍率で撮影し、少なくとも２回の分析をした３回の独立した実験の代表値を用いた細い矢印は細胞−細胞連絡を示しＢ）準融合性のＨＵＶＥＣは２５μｇ／ｍＬの配列番号１０で２４時間又は４８時間インキュベートし、タンパク質を抽出し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに通し、同じオクリディン抗体を用いて免疫検出した；細胞外調節キナーゼリプロービング異的細胞外調節キナーゼ１／２抗体を用いる事により、ゲルローディングコントロールにより同じメンブレン上に行った。；免疫ブロットの下の数字は非処理細胞の相対的な発現を表し、これは少なくとも２回分析した２つの独立した実験の代表値である。
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、例えば，Ｃ３様融合タンパク質及びＣ３キメラ融合タンパク質を含む、複合、或いは融合タイプのタンパク質（ポリペプチド）に関する。本発明の融合タイプタンパク質は抗ガン化合物について論じられるのと同様に、特に、軸索の再生を促進する用途や神経保護について論じられるであろう。融合タンパク質が他の状況で同様に活用されるのが理解されるであろう。
本発明は特に哺乳類の神経系の修復（例えば中枢神経系（ＣＮＳ）病変部位、損傷した網膜の修復、又は末梢神経系（ＰＮＳ）病変部位）、軸索再生及び軸索発芽、神経突起成長、神経防護作用活性及び、神経変性や虚血症損傷からの防護に関する。
本発明は神経系の外傷の処理に有用である。特に本発明の方法及び組成物は、枝状の及び中心部の静脈／動脈閉塞、外傷、黄斑浮腫、閉塞隅角緑内障、解放隅角緑内障、加齢性黄
斑変性症、網膜色素変性症、網膜剥離、レーザー治療（レーザー光治療を含む）に伴う損傷、糖尿病性網膜症、及び外科的な光誘起医原性網膜症に伴う損傷を治療するのに有用である。他の態様では、本発明の方法及び組成物はスタルガルト病、レーバー先天性黒内障、ベスト病、先天性脈絡膜欠如、網膜分離症、バルデー・ビードル症候群、前部虚血性視神経症、プルチェル網膜症、視神経炎、視神経円板浮腫、コーツ病及び／又はレーバー粟粒性動脈瘤に伴う損傷を処理するのに有用である。本発明は脊髄損傷、免疫性の又は末梢性の神経障害、多発性硬化症、パーキンソン筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー症、外傷性脳損傷、シャルコー・マリー・ツース病、巨大軸索神経障害、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮症、進行性眼球型遺伝性筋萎縮症、ヘルニア状の、破裂性の又は脱肛性の椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸郭出口破壊症候群、アクリルアミド、ガンマ−ジケトン（シンナー中毒者の神経障害）、二硫化炭素、ダプソン、ダニ、ポルフィリン症、グライン−バリー症候群、ハンチントン舞踏病、及び、脳梗塞、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、認知症、プリオン病及び緑内障といった軸索の損失や後退に伴う他の疾病のような疾病や状態を処理するのに有用である。
緑内障は白内障に続き、世界中で２番目に多い失明原因である。５千万人以上の人々が緑内障に冒されていると推定されており、７百万人以上の人々がこの病気を原因とする両側性失明（両目）である（Ｑｕｉｇｌｅｙ ＨＡ． 緑内障： Ｍａｃｒｏｃｏｓｍ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ Ｔｈｅ Ｆｒｉｅｄｅｎｗａｌｄ Ｌｅｃｔｕｒｅ． Ｉｎｖｅｓｔ．
Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ２００５； ４６： ２６６３−２６７０）
。緑内障は、視野の喪失や不可逆的な失明を導く進行性の視神経変性により特徴づけられている。原発性開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、先天性緑内障を含む、幾つかの種類の緑内障がある。全てのタイプの緑内障に共通する特徴は、網膜神経節細胞（ＲＧＣｓ）の死である。大量のＴＧＣｓの損失があった場合、患者は段階的で進行的な視野の悪化を経験し、通常片目がもう片方より状態が悪い。視野損失は通常周辺より始まり、進展して中央の視野を含むようになる。この疾病の後期には、患者はまた夜間の視界において、困難を伴うことに気がつくであろう。
眼圧の上昇は緑内障の進展のもう一つの主なリスク要因である。開放隅角緑内障及び閉塞隅角緑内障はこの疾病の最も一般的な病形であり、しばしば、高い眼圧を伴う。現在の緑内障の標準的な治療法は薬剤（例えば、プロスタグランジン治療）、及び／又は手術により眼圧を下げることである。しかしながら、これらの処理は危険性や副作用を伴う（Ｌｅｅ ＤＡ，ＨｉｇｇｉｎｂｏｔｈａｍＥＪ． 緑内障及びその治療： ａ ｒｅｖｉｅｗ．
Ａｍ． Ｊ． Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ． Ｐｈａｒｍ． ２００５； ６２： ６９１−６００）。顕著な割合の患者は圧力を低下させる薬剤が良く応答しているにも関わらず視野の損失を経験し続ける。さらに北アメリカのおよそ２５％ から３０％の患者は「正常眼圧
緑内障」を患っており、高眼圧が存在しないのに視神経変性が起きる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ
ＤＲ． Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｎｏｒｍａｌ Ｔｅｎｓｉｏｎ 緑内障 Ｓｔｕｄｙ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． ２００３； １４： ８６−９０）。従って、現在の緑内障への治療戦略は不十分であり、疾患の進行を遅らせる新しいアプローチが緊急に必要とされている。
本発明は脊髄損傷を処理するのに有用である。脊椎動物では脊髄及び脳は中枢神経系（ＣＮＳ）を形成する。脊椎は体の長手方向の軸に沿って延長し、脊椎管で囲まれる。ヒトでは脊髄は８つの頸部、１２の胸分節、５つの腰部、５つの仙骨分節、１無いし２つの尾骨分節に分けられる。中心灰白質は、側方向の突起（前角及び後角）と共に神経細胞の細胞体により形成され、周囲の白質は有髄神経繊維束により形成される。求心性の（上向性又は感覚に関する）神経経路及び、遠心性の（下向き又はエフェクターの）神経経路は白質を走る。脊髄の遠心性の経路はまたビラミッド型である（随意運動のため）又は錐体外路
である（非随意運動及び筋緊張の分布のため）。ピラミッド型繊維は主に錐体側索路を渡り、精髄の様々な領域の前角及び後角の中の細胞へ錐体前策路を横切ること無しに小さい割合で走る。
脊髄及び脳は２つのタイプの細胞で形成された：神経細胞又はニューロン及びグリア細胞である。グリアル細胞は乏突起膠細胞又は星状細胞でありえる。乏突起膠細胞は神経軸索のミエリン鞘を形成し、星状細胞は神経細胞又はニューロンに栄養を供給し、分泌された神経伝達物質を吸収し、血液脳関門を形成する。ミエリンは脂肪の絶縁性の鞘で、らせん型の形状で神経を囲む。この被服物は神経に沿う電気インパルスの支障のない伝導を保証する。
ミエリン鞘は多発性硬化症、軸索周囲性脳炎、広汎性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、視神経脊髄炎、ＳＭＯＮ（亜急性脊髄視束神経炎）、先天性脱髄疾患（大脳白質萎縮症）、および、神経に関するベーチェット病、および川崎病と言った、神経系の一般的な免疫介在性の炎症のような多くの病気により攻撃され破壊される。この損傷は、多くの輸送機能の損失を伴う電気伝導封鎖や神経症を導く。例えば事故の結果としての脊髄への損傷、は神経繊維の影響する伝導昨日の廃止の存続を導く。少なくとも１つの領域の完全な廃絶が原因である麻痺は対麻痺を伴う脊髄横断障害と呼ばれる。このことは、影響を受けた部位のもとの全ての領域に対する感覚機能（例えば、温感、痛覚又は圧覚）、運動機能（随意運動及び非随意運動）の損失及び栄養機能（例えば膀胱及び腸の機能）の損失を意味する。神経繊維は再生能力に乏しいため、随意運動の麻痺及び感覚の完全消失は恒久的である。
一つの態様では、本発明は、例えば神経系損傷を持つ患者の、神経突起伸張、成長、又は再生の増加が望まれている所での処方計画に用いることが出来る。他の態様では、外傷的損傷（例えば脊髄外傷、脊髄損傷、又は他のＣＮＳ経路損傷を含むがこれに限られない）、外科的神経損傷、梗塞症の二次的損傷、感染症、毒性薬剤に対する暴露、悪性腫瘍、腫瘍随伴症候群、又は種々の型の中枢神経系の退行性損傷を患う患者の治療が含まれる。そのような損傷の例は萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺及びん致傷を含むがこれに限定されない。
本発明の一つの態様は、脊髄が損傷した場合に傷ついた部位の神経軸索の再生を促進することや、末梢神経系及び中枢神経系の他の病変における神経の成長を刺激する事である。
本発明の一つの態様では末梢神経系の神経再生を促進する事である。末梢神経系には中枢神経系（脳や脊髄）に属したり外側に伸びたりし、四肢や臓器を支える、神経及びニューロンからなる。しかしながら、中枢神経系と異なり、ＰＮＳ（末梢神経系）は骨や血液脳関門に守られておらず、毒や機械的損傷に曝されたままである。末梢神経系は体性神経系及び自律神経系に分けられる。
本発明はまた、網膜色素変性症、黄斑変性症、眼性虚血性神経障害、といった眼疾患の治療にも有用である。網膜要素の変性は部分的或いは全体的な失明を引き起こす。黄斑変性症は眼内の網膜の黄斑部の変性である。黄斑の変性は急激な視力低下の原因となり、最終的には急性視力損失に至る。滲出型黄斑変性症は網膜中の異常な血管成長に関与し、血液を漏れ出させ、光受容体細胞の損傷の原因となる。
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は臨床的に認識出来る、目に関して失明を引き起こす症候の集まりである。
黄斑変性症は網膜中央、又は黄斑に影響する一群の疾病を含む。２つの基本的なタイプの黄斑変性症があり、「滲出型」及び「乾燥型」である。滲出黄斑変性症では、新生血管の
異常な成長が存在する。これらの新生血管は壊れ、流体を漏れ出させ、網膜中央部の損傷の原因となる。この型の黄斑変性症はしばしば加齢に伴う。おおよそ９０％の黄斑変性症は乾燥黄斑変性症である。乾燥黄斑変性症ではドルーセと呼ばれる沈殿物の堆積、及び光受容体細胞の細胞死により視力が損失する。この過程により網膜は薄くなり乾燥する。
ＡＭＤの症候にはドルーセンの存在、色素の凝集及び／又は脱落、網膜色素の上皮剥離、地形的萎縮、網膜下の新血管形成、及び皿上瘢痕を含む網膜領域上皮の攪乱が含まれる。加齢性黄斑変性症は、現在、特に５５歳以上の人々の、治癒しない失明の主原因である。おおよそ６５歳以上の４人に１人は加齢性黄斑変性症の兆候を持ち、７５歳以上の７％のは視力喪失を伴う進行性の黄斑変性症を有する。
ドルーセンを有し、片目において合併症を患う患者は他方の目では合併症を患わない。合併症は網膜色素上皮萎縮、脈絡膜血管新生、漿液性網膜剥離、及び出血性網膜剥離からなる群から選ばれる１つ又は２つ以上を含む。ドルーセンはコントラス感度に影響するかもしれず、人が暗がりの中で読書したり、夜間、細かいところが見え安全に自動車を運転したりするのに十分な視力を減ずる恐れがある。これらの兆候の全てがＡＭＤが存在していると考えられるのに必要ではなく、ドルーセン単独で直接視力喪失に伴うわけではない。黄斑変性症の正確な原因はまだ知られておらず、要因が同定され続けている。要因の集合的な結果は光受容細胞と網膜下組織の攪乱となる。ここで、網膜下組織は、直接下に存在し光受容細胞を支持する網膜色素上皮、及び下に位置し網膜色素上皮に栄養を与える脈絡膜を含む。
網膜及び黄斑はフリーラジカルや一重項酸素といった酸素による酸化障害にさらされることがある。黄斑はポリ不飽和脂肪酸を含み、可視光及び近紫外光である高エネルギーの青色光を含む光に曝され、青色光は三重項酸素を一重項酸素に感光性を与え、酸化薬剤は黄斑中のポリ不飽和脂肪酸、ＤＮＡ、タンパク質、脂質、及び炭水化物にダメージを与える事が出来る。黄斑変性症の病状に含まれる可能性のある要因は、低濃度コレステロールリポタンパク質（ＬＤＬ）の血清濃度の上昇である。低濃度リポタンパク質コレステロールは酸化薬剤により酸化されＬＤＬを形成し、ＬＤＬはアテローム斑にみられる。これらの酸化された産物は健康な網膜色素上皮に堆積する可能性があり、ネクローシスまたは昨日組織の死の原因となる。ＬＤＬコレステロールは網膜や網膜下組織の血管中にアテローム斑を形成し低酸素症を誘発し新生血管形成の原因となる。無競争エストロゲン置換両方を受けた更年期以降の女性は加齢性黄斑変性症による新血管形成の危険性が減少する可能性がある。血中のエストロゲン高濃度リポプロテインコレステロール（ＨＤＬ）の量を増やす可能性があり、脂溶性抗酸化物の輸送と代謝において生産の変化を起こす可能性があり、網膜、網膜下組織及び血管において、酸化ＬＤＬコレステロールの堆積の限界をもうける。
進展した黄斑変性症の要因及び指示要因は黄斑中の光受容細胞の下層に存在する脈絡膜細胞の新生血管形成である。健康な成熟した目の脈管構造は通常不活発で、新規血管の発達において血管形成の陽性及び陰性の仲介物の間でホメオスタシスの状態にある。黄斑変性症は特に発達した時期において、黄斑の下に位置する脈絡膜において新規血管の病的な成長によって特徴づけられる。網膜下の脈絡膜中の新生血管形成による血管は視覚を遮る流体を漏らし盲目に導く可能性がある。
一つの態様では、滲出型黄斑変性症のような網膜の近位に生じる新生血管は、新生血管精製阻害活性を有する本発明の融合タンパク質を有する本発明の組成物の投与により新生血管の割合を減少するように治療する事も可能である。
他の態様では、滲出型黄斑変性症のような網膜の近位に生じる新生血管を示す目の疾病は、本発明の融合タンパク質を含有する本発明の組成物の投与により、光受容細胞の細胞死を防ぐか減少させるように治療されても良い。
疾病の結果としての、網膜近傍の新生血管形成、特に脈絡膜近傍の新生血管形成は患者の網膜中の光受容細胞の細胞死を導く可能性がある。網膜中の光受容細胞の細胞死は他の細胞死の機構と同様に、新生血管形成の結果としての病気に引き続き生産される。
進行した乾燥黄斑変性症はドルーセンの堆積と光受容細胞の死を含む。ドルーセン沈殿の機構は知られてないが、細胞からのエクソサイトーシスは細胞外空間へ排出される機構のようである。本発明の他の態様は、活性薬剤のアミノ酸配列と共有結合する輸送薬剤のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する細胞透過性融合タンパク質受容体による、ドルーセン沈殿の抑制及び光受容細胞の細胞死の防止を含み、前記活性薬剤のアミノ酸配列はＡＤＰリボシルトランスフェラーゼＣ３又は、ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を保持したその断片からなり、前記輸送薬剤のアミノ酸配列は、例えばＣ３ＡＰＬＴ等の融合タンパク質である活性薬剤の細胞内摂取を促進させる。
一つの態様では、本発明のクロストリジウム・ボツルニムＣ３エクソトランスフェラーゼ単位はＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を、クロストリジウム・ボツルニムＣ３エクソトランスフェラーゼの５０％から５００％の範囲で示すタンパク質を含む。細胞膜侵入後の本発明の融合タンパク質による細胞中のＲｈｏ不活性化はエクソサイトーシスをブロック又は阻害し、よってドルーセンを形成する細胞残骸又は細胞残骸物質からの放出をブロック又は阻害する。本発明の融合タンパク質は障害に誘導されたＣＮＳ中の細胞の障害誘導性細胞死を阻害する可能性がある。
新生血管形成は元々存在していた血管からの血管形成の複合化した過程である。この過程は生化学的及び細胞学的事象を含み（１）新生血管形成刺激による内皮細胞（ＥＣｓ）の活性化（２）細胞外マトリックスの崩壊、活性化した内皮細胞の周囲の組織への侵入、および血管新生刺激源への移動及び（３）内皮細胞の増殖及び分化を含み、新規血管を形成する。脈絡膜中の血管新生は、フィブロブラスト成長因子（ｂＦＧＦ）のようなサイトカイン成長因子により誘導される可能性がある。網膜細胞の低酸素症はそのような成長因子の発現を誘導する可能性があり、ここで、低酸素症は細胞残渣又は、網膜や網膜下細胞の酸化損傷、又は酸化したＬＤＬコレステロールの堆積により、網膜色素上皮中のドルーセン堆積を引き起こす可能性がある。
血管形成の制御は血管形成の刺激因子や阻害因子により高度に規制されている。健康なヒトや動物では、血管形成は特殊な制限された状況で起きる。例えば、血管形成は、通常、傷の治癒や黄体、子宮内膜及び胎盤の形成の間観察される。本発明の他の態様は、活性化薬剤のアミノ酸配列と共有結合した輸送薬剤のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する細胞透過性融合タンパク質による、細胞透過性融合タンパク質複合体による血管形成の阻害を含み、ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼＣ３又は、ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を残したその断片からなり、前記輸送薬剤のアミノ酸配列は、例えば配列番号８又は配列番号１０等の融合タンパク質である活性薬剤の細胞内摂取を促進させる。一つの態様では、クロストリジウム・ボツルニムＣ３エクソトランスフェラーゼ単位の機能的なアナログは、クロストリジウム・ボツルニムＣ３エクソトランスフェラーゼの５０％から５００％の範囲又はそれ以上の範囲でＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を示すタンパク質を含む。
Ｒｈｏファミリータンパク質はガンとの関連で研究されてきた。Ｒａｓ（及び２次標的としてのＲｈｏＢ）は翻訳後修飾を阻害する転移ガンの分子による標的である。しかしながら、これらの治療上の研究はＲａｓに焦点を絞っており、Ｒｈｏファミリーメンバーの中のＲｈｏＢに限られる。
ＲｈｏＡ及びＲｈｏＢのタンパク質レベルの上昇は大腸ガン、乳ガン及び肺ガンで発見された。ＲｈｏＡ及びＲｈｏＢレベルは頭部や頸部の扁平上皮ガンからの５μｍ切片において、これらのタンパク質に直接作用するポリクローナル後退を用いてＶｅｃｔａ Ｓｔａ
ｉｎ ｋｉｔ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いた画像解析による可視化により発見され
た。「非腫瘍性病変」領域の近傍をコントロールとして用いた。Ｒｈｏタンパク質レベルは腫瘍の進展により増加するが、ＲｈｏＢレベルは体内のガン腫や高分化型腫瘍に比べ浸潤性腫瘍において減少する。
ＲｈｏＡ及びＲｈｏＢの過剰発現は、通常の組織に比べ胸部腺ガンや肺腺ガンでより起こりやすく、Ｒｈｏタンパク質の発現は星状細胞腫瘍で減少し、逆にグレードＩＩからＩＶの悪性腫瘍に関する。
Ｒｈｏは細胞の移動及び運動性の規制に関与する。ＲｈｏＡバリアント構成物を拡散導入したＭＭ１ラット肝臓ガン細胞（Ｖａｌ１４又はＶａｌ１４Ｉｌｅ４１）は構造的にＲｈｏを活性化する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの浸潤分析において、中皮ガン細胞層へ浸潤出来た
播種した細胞の割合は形質転換したＲｈｏＡＶａｌ１４の発現レベルに相関性がある。これらの活性化したＲｈｏ形質転換細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏの分析で、腹膜空洞に用いられ
、模造の形質転換体が２〜８であるのに対し、６〜１０の移植片は腫瘍小節になる。これらの結果は活性Ｒｈｏが腫瘍原性に関わりがあることを示している。
ヒト１例、マウス１例の２つの転移性黒色腫モデル系と比較した遺伝子発現の総合的な研究、およびマクロアレイによる共有された遺伝子発現の刺激の比較により、ＲｈｏＣ発現が転移のレベルを上昇させる際に変えられると結論づけられた（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ， ４０６： ５３２−５３５）。さらに、遺伝子発現が実験的に操作された場合、ＲｈｏＣ過剰発現はヒト黒色腫細胞ラインを誘導し、低い転移潜在性から高い転移潜在性へ切り替えられた。
しかしながら、ＲｈｏＡの過剰発現は観察されておらず、ドミナント・ネガティブバリアント（Ｎ１９ＲｈｏＡ）は転移能を減少させた。
ヒト乳ガンへの転移の傾向が相関する発現を有する７０の遺伝子が同定された（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ， ４１５：５３０−５３６）。Ｒｈｏ遺伝子はまだ見つかっていないが、予後指標としての、疾病マーカーの値は必ずしも治療の標的としての値に関わらない。Ｒｈｏファミリーのシグナルの場合、転写レベルの測定単独のみでは明らかでない、酵素活性及びタンパク質−タンパク質相互作用の複雑な制御が存在する。
ガンでは細胞増殖の調節機構が異常になっている。組み替えＣ３エクソザイムによりＲｈｏ不活性化後にＥＬ４ネズミＴリンパ腫細胞の細胞死が起きる。ＮＩＨ３ｔ３細胞において、Ｒｈｏキナーゼ阻害因子Ｙ−２７６３２は特に固定依存性増殖を阻害する。一つの態様ではＲｈｏ不活性化により腫瘍細胞の増殖は阻害される可能性があり、本発明は、細胞増殖の減少又は停止、又は、ポリペプチド性細胞輸送部分及びクロストリジウム・ボリヌムＣ３エクソトランスフェラーゼ単位又はその機能的アナログを含む細胞浸透性融合タンパク質複合体によるアポトーシスの誘導を含む。
本発明の他の態様は、ポリペプチド細胞膜輸送部分及びクロストリジウム・ボリヌムＣ３エクソトランスフェラーゼ単位又はそれらの機能的アナログを含む細胞膜透過性融合タンパク質複合体を含む効果的な量の医薬組成物により、細胞増殖の減少又は停止を含むか、アポトーシスの誘導を含む。
転移ガン細胞は高度に移動性がある。Ｒｈｏの不活性化は幾つかの細胞タイプにおいて細
胞移動を防ぐ。Ｃ３トランスフェラーゼ及びＲｈｏキナーゼ阻害因子Ｙ−２７６３２はＨＴ２９ヒト大腸ガン細胞による細胞侵入ブロックする。ｖ−Ｃｒｋ−誘導ラットフィブロブラスト３Ｙ１細胞系統では、Ｃ３及びＹ−２７６３２はｖ−Ｃｒｋを阻害し、細胞の運動性を減少させる。
ドキソルビシン、放射又はタキソールで処理されたＲｈｏ Ｂ ＋／−中のＲｈｏＢ −／
−細胞、又はＲｈｏＢ−／− ＭＥＦ細胞におけるアポトーシスの減少はＲｈｏＢタンパ
ク質の欠失に原因がある。他の態様では、Ｒｈｏによる血管新生は細胞移動及び転移を減少する可能性がある。一つの態様では、ポリペプチド性細胞膜輸送部分及びクロストリジウム・ボリヌムＣ３エクソトランスフェラーゼ単位又はそれらの機能的アナログを有する細胞透過性融合タンパク質複合体により本発明は細胞移動の抑制を含む。
侵襲的な腫瘍細胞は、細胞外マトリックスを分解させるプロテアーゼを分泌する事により、腫瘍細胞を取り囲む細胞外マトリックスを分解出来る性質を有する。プロテアーゼの一つの主要なクラスはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）である。腫瘍細胞は異なるタイプのＭＭＰを生産する事が出来、ＭＭＰはしばしば酵素前駆体として作られ切断され活性化へ向け放出される。ＭＭＰ−１はコラーゲンマトリックスを切断する。ＭＭＰ−２は肺癌細胞の侵入の重要な役割を果たす。ＭＭＰ−９はまた腫瘍細胞の侵入に関わる。他の態様では、本発明はＭＭＰ発現、ＭＭＰプロセッシング又は腫瘍細胞からのＭＭＰ分泌、ポリペプチド性細胞膜移動部分及びクロストリジウム・ボツリヌムＣ３エクストランスフェラーゼユニット、又はその機能的アナログを含む細胞浸透性融合タンパク複合体による阻害を含む。
脳は高度に機能的な局在をしている：例えば各々の特有の解剖学的領域は特有の機能を実行する。患者の脳の中の腫瘍の位置（及び脳の病変）は組織のタイプや腫瘍のタイプよりも重要になる可能性がある。脳の重要な部分の比較的小さな腫瘍又は病変は、より大きい、脳の比較的重要性の低い領域にあるより大きい病変よりも壊滅的である。脳の表面にある病変は外科的に比較的容易に切除する事が出来る可能性があるが、同程度のサイズであるが脳の奥深くに位置する腫瘍は、深い腫瘍へのアクセスが、深い腫瘍へ接近又はアクセスし取り除くために間にある組織を多くの致命的な構造を切り取る事などにより破壊する事が必要である可能性があるため、外科的に比較的容易には切除できない恐れがある。加えて、脳の良性腫瘍は患者にとって危険な物である可能性がある。良性腫瘍は重要な領域に成長し、周囲の脳の組織や機能に重大な損害を与えるかもしれない。良性腫瘍は外科的切除で治療できるかも知れないが、腫瘍を深部の組織から取り除く事は不可能である。もし検査を受けていない良性腫瘍が成長したら、体積が増加し頭蓋内の圧力が増加する可能性がある。もしそのような状況が処理されないまま放置されたら、脳の生命に関わる構造は圧縮され、患者の死の原因後なる。ＣＮＳ（中枢神経系）悪性腫瘍の発生は１０万人に約８〜１６例である。脳の一時的悪性腫瘍の予後は惨憺たるものであり、平均生存率は１年以内であり、外科的切除が続く。脳腫瘍は特に神経膠腫の場合、外科的切除の後元の病巣より約２センチメートル内に再発する。
ここに記載した組成物及び方法を使用して治療する事が可能な脳腫瘍の代表例は、未分化星状腫のような神経膠腫、多形性膠芽腫、毛様細胞性星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫、粘液乳頭型脳室上衣腫、上衣下腫、脈絡叢乳頭腫、神経芽細胞腫のような神経細胞腫、神経節芽細胞腫、神経節細胞腫、髄芽腫、松果体芽細胞腫や松果体細胞腫のような松果体の腫瘍、髄膜腫や髄膜血管周囲細胞腫といった髄膜の腫瘍、髄膜肉腫、神経鞘腫（神経線維鞘）や神経繊維腫といった神経鞘の腫瘍、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫といったリンパ腫、ホジキンリンパ腫の１次及び２次サブタイプ、（及び１次及び２次を含む多くのサブタイプ）、頭蓋咽頭腫のような悪性腫瘍、類表皮嚢胞、皮様類皮嚢腫、コロイド嚢胞、一般的には肺、胸、黒色腫、腎臓及び消化管の腫瘍である実質的に全ての腫瘍から派生する可能性があり、脳の中に位置する転移性腫瘍、に使用する事が可能である。
本発明の医薬組成物の投薬技術の例は目の後部を含む目への薬剤投与の開示を有する。例えば米国特許出願第５，７０７，６４３号は、硝子体の中の胸膜に切開を通して挿入される分解可能な強膜プラグに関する。眼中への薬剤の投与に関して、硝子帯への拡散による網膜の治療のため、プラグは硝子体の中に薬剤を放出する。
眼中への他の投与の技術は米国特許出願第５，４４３，５０５号に開示され、扁平部炎又は外科的に誘導された血管の無い領域と言った、目の血管の無い領域の上の脈絡膜上腔に位置する移植を開示する。他の態様は部分的な無血管領域に渡る強膜弁の部分的な厚さを形成し、移植片を残りの強膜ベッドに挿入し、会う良いに穴を形成し、弁を閉じるように縫合する事を含む。薬剤は硝子体領域及び眼内構造物中に拡散する。他の態様は無血管部位の上に部分的な厚みのある強膜フラップを作ること、任意にその中に穴を空け、残りの強膜ベッドに移植片を挿入すること、および縫合し、フラップを閉じることを含有する。
他の目への薬剤投与の運搬アプローチは薬剤タンパク質配列をコードするｃＤＮＡと共に網膜のニューロンを形質転換することである。そのような形態の投与がＦｉｓｃｈｅｒら（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ２００４， ２４：８７２６−２７４０）により開
示されており、彼らはＣ３を網膜神経節ニューロンに核酸導入し、及び細胞の生存率上昇、及び網膜神経節ニューロン細胞軸索の再生増加を発見した。他の態様はトランケートした断片を細胞に形質導入する事、又は本明細書の図４で報告されているバリアントである。
目への薬剤投与のための他の送達アプローチは、直接注射である。目の後部については、硝子体内注射が、硝子体に薬を送達するのに用いられた。この事は、眼内注射による種々の薬剤で黄斑変性症を治療することに関する米国特許第５，６３２，９８４号に関係する。目への薬剤投与のために、薬剤は望ましくはマイクロカプセルとして注射される。目の後ろの部分への眼内注射は、硝子体、網膜全体、脈絡膜、および対面する強膜を通して薬の拡散させることであってもよい。これに加え、米国特許第５，７７０，５８９号は、見たところでは薬の投与のために硝子体内に硝子体液に抗炎症薬を注射することによって黄斑変性症を治療することに関するものである。注射は、薬が後ろの部分に送達される間、目への損害を最小にするために、扁平部を通して管理されることができる。
別の送達アプローチは、外科的手法によるものである。例えば、米国特許第５，７６７，０７９号は、効果量の成長因子を例えば目の異常部位に置くことによるＴＧＦ−βの投与によって、黄斑円孔と黄斑変性症を含む眼科疾患を治療することに関するものである。
黄斑と網膜を扱う際に、目への薬の投与のために、前記成長因子が直接適用される前に、推定されるように、無血管域の目の前方セグメントの上に強膜への投与によって、または、硝子体、網膜と脈絡膜を通しての外科的治療を経た網膜の後の強膜の投与によって、中心硝子体切徐術または完全な扁平部硝子体切徐術を含む外科的治療が行われ、劇的な、非常に浸潤的な、技術は通常、部分的な視力損失がすでに起こったか、差し迫った脅威が存在する所で適当である。
薬の目への投与のためのもう一つの送達アプローチは、装置とカニューレの使用によるものである。例えば、米国特許第５，２７３，５３０号は、網膜内送達やサンプルの回収とそれらのための装置に関するものである。直接的な眼内注射技術とは異なり、この特許で明らかにされる方法は、扁平部切除の使用を避けて、その代わりに眼窩外側のを迂回して挿入経路を使うものである。曲がったハンドルと環部を有する先端のある装置は、カニューレが、硝子体を通過することなく、後方強膜を通して挿入され、そして、網膜下スペースに挿入される。環状部は、望ましい深さに侵入を規制するために規定されている。装置は、強膜域、脈絡域、網膜下域、網膜域と硝子体域を含む目のあらゆる部分に調節可能であることが記載されている。
目への薬剤の投与のためのもう一つの送達アプローチは、強膜内注射によるものである。例えば、米国特許第６，３９７，８４９号は、網膜組織上に広がる強膜の外面上の場所を通して目の強膜層に、治療又は診断に効果的な量で注入することを含む強膜内注射の方法を開示する。注射状況により、材料は強膜層内に沈着物を形成することができ、脈絡膜および／または網膜のような下にある組織層に拡散することができ、および／または材料は強膜層を通して、そして、下にある層に推進することができる。強膜が網膜を含み目全体とともに動くので、強膜上の沈殿部位は網膜下に位置する点に対して比較的一定のままであり、同時に、黄斑の上に広がるサイトで強膜に材料を沈澱させることにより、目が部位特異的送達をするように眼窩の範囲内で動き、よって材料を黄斑斑と周囲の組織に送達させる。注射手順は、針を使わない小片／溶液と同様にカニューレまたは針を使用する。好ましい態様において、カニューレは目と比較して回転方向で強膜に挿入され、強膜の表面に対して直角ではない。
目への薬剤投与のためのもう一つの送達アプローチは米国特許第６，２９９，８９５号で開示され、カプセルを眼球周辺のテノン嚢下スペースに挿入しすることを含む、生物学的活性分子を目に送達する方法を開示し、前記カプセルは細胞由来の生物学的活性分子を含んでいる芯と周囲の生物学的適合性の被服物を含み、そして、前記被服物は生物学的に活性分子が目に拡散されるのを助け、送達される生物学的活性分子の適用量は１日につき、患者一人につき、片目に対して５０ｐｇから１０００ｎｇである。生物学的活性分子は抗血管新生因子であってよく、そして、第２の生物学上活性分子またはペプチドはカプセルから目に共同して送達されてもよい。前記方法は、黄斑変性症を含む目の障害を治療する有用な処方として開示される。
本発明の組成物で役に立つことがありえる目への薬の投与のための他の送達アプローチは、周知の技術である。例えば、米国特許第５，３９９，１６３号は、流体注入剤に圧力をかけることによって噴射式注射を提供する方法を明らかにする；米国特許第５，３８３，８５１号は、針を用いない注入装置を明らかにする；米国特許第５，３１２，３３５号は、針を用いない注入システムを明らかにする；米国特許第５，０６４，４１３号は、注入装置を明らかにする；米国特許第４，９４１，８８０号は、薬物の非侵襲的な射出をするためのアンプルを明らかにする；米国特許第４，７９０，８２４号は、非侵襲性の皮下注射装置を明らかにする；米国特許第４，５９６，５５６号は、圧力により操作される皮下注射装置を明らかにする；米国の特許第４，４８７，６０３号は、制御された率で薬物を調剤するために、移植可能マイクロ注入ポンプを明らかにする；米国特許第４，４８６，１９４号は、皮膚を通して治療薬を管理する治療的な装置を明らかにする；米国特許第４，４４７，２３３号は、薬物を正確な注入率で送達するための薬剤注入ポンプを明らかにする；米国特許第４，４４７，２２４号は、連続薬送出のための可変流量移植可能な注入装置を明らかにする；米国特許第４，４３９，１９６号は、マルチチャンバーコンパートメントを持っている浸透圧薬物送達システムを明らかにする；そして、米国特許第４，４７５，１９６号は、浸透圧薬物送達システムを明らかにする。
腫瘍切除部分への薬の投与のためのもう一つの送達アプローチは、腫瘍の外科的除去の後、手術部位に薬を注入すること、又はフィブリンマトリックス中に含み送達することを含む。
ここで用いられる「Ｒｈｏアンタゴニスト」が含む用語はＣ３様タンパク質を含むＣ３タンパク質を含むが、これに限定されない。
用語「Ｃ３タンパク質」は、ボツリヌス菌、セレウス菌または黄色ブドウ球菌から分離さ
れるＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３または組み換え型ＡＤＰリボース転移酵素に言及する。
ここで用いられる用語の「Ｃ３様タンパク質」、「ＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３−様タンパク質」、「ＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３類似物」、「Ｃ３様転移酵素」または「Ｃ３キメラタンパク質」は、生物学的活性がＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３と類似している（例えば、同じ、本質的に同様な）全てのタンパク質またはポリペプチドに言及する。Ｃ３様タンパク質の例として、配列番号：１、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：７８と配列番号：７９を含むがこれに限定されない。
用語「神経損傷サイト」は、外傷性神経損傷の部位または病気に起因する神経損傷に言及する。神経損傷サイトは、一つの神経（例えば座骨神経または視神経）からなる可能性や、又は、多くの神経から成る神経路（例えば脊髄の損傷を受けた部位）である可能性がある。神経損傷サイトは、中枢神経系または末梢神経系、または、修復を必要としているあらゆるサイトである可能性でもよい。脳と視神経を含むＣＮＳで脳梗塞に起因する損傷の結果として、神経損傷サイトができる可能性がある。手術や、脳腫瘍除去、またはガン障害の後の治療の結果として、神経損傷サイトは、脳内である可能性がある。神経損傷サイトは、脳梗塞、パーキンソン病、アルツハイマー症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、糖尿病または他のタイプのあらゆる神経変性病気からでも生じる可能性がある。
ここで使われるように、「実質的に精製される」という用語は８０％以上の純度、望ましくは９０％以上の純度、より望ましくは９５％を超える純度を持っている製剤を意味する。より詳しくは、「実質的に精製される」という用語は、その国の環境で、タンパク質と関係している汚染物質を実質的に含まないということを意味する。
ここに使われるように、用語「ＰＥＧ化またはＰＥＧ−バリアントは、ＰＥＧ ｍｏｅｉ
ｔｙが組織で薬の保持能を増やすためにＣ３融合タンパク質に共有結合して付けられる変性に関するものである。ＰＥＧ化されたＣ３融合タンパク質は、配列番号：１０又はこの出願で記述されるトランケートバリアントを含んでも良い。例として、Ｃ３融合構成の長さにおける変化からの異なる分子量のＰＥＧバリアントを含み、そして、ＰＥＧの分子量の違いが使われる。
ここに使われるように、用語「送達薬剤」は貨物部分と輸送部分から成っている薬剤に関する。貨物部分の例は、ＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３とＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３類似物を含む。輸送部分の例は、例えば配列番号：２とその類似物からなる。
「ポリヌクレオチド」は、一般的に全てのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドに言及し、それらは修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡであるかでもよく、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡでもよい。「ポリヌクレオチド」は、一重鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混成ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、一本鎖と二本鎖地方の混合物であるＲＮＡ、一重鎖でも良いＤＮＡとＲＮＡを含む複合分子、より一般的に、二本鎖、あるいは、一本鎖−二本鎖領域の混成のものを含むがこれに限定されない。更に「ポリヌクレオチド」はＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡ両方から成っている３本鎖領域言及する。用語、ポリヌクレオチドはまた、安定化又は他の目的のため修飾された骨格を有する、一つ又はそれ以上の修飾された塩基を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾された」塩基は、例えば、イノシンのようなトリチル化された塩基通常ではない塩基を含む。種々の修飾が、ＤＮＡとＲＮＡになされた；従って、「ポリヌクレオチド」はウイルスや細胞に特有のＤＮＡとＲＮＡの化学形と同様に、自然界に典型的に見られる、化学的に、酵素的に、または、代謝的に修飾されたポリヌクレオチドの形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、線形及び末端が閉じた分子を含むが、これに限定されるものではない。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドを包含する。
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわちペプチド等量式）によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸から成るあらゆるペプチドまたはタンパク質にも言及する。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーとして参照される短い鎖、及び、通常、タンパク質と呼ばれるより長い鎖の両方に言及する。上記で述べたように、ポリペプチドは２０の遺伝子によりコード化されたアミノ酸以外のアミノ酸を含む可能性がある。
この発明の組成の細胞膜輸送を強化しているペプチド（また、「輸送部分」または「輸送薬剤」と呼ばれる）は１または複数のプロリンリッチ領域を含んでもよく、それらの各々は同じであるか異なる配列のアミノ酸でも良く、それらの各々は一つのペプチド結合又は複数のペプチド結合により共有結合しても良く、そして、非−プロリンリッチなアミノ酸配列が１０以上のアミノ酸から成るとき、それぞれが同じ又は異なってもよい一つ以上の非−プロリンの豊富なアミノ酸配列各々から成っていてもよい。
ここに使われるように、「ニューロンが他の細胞との新しい接続をするのを助けるために」または「ニューロンが新しい細胞接続を作るのを助ける」ことは細胞（例えばニューロン）または組織を本発明の薬剤送達組成物、接合体、融合タンパク質、ポリペプチドまたは医薬組成物で治療する上で、ニューロンが例えば新しい樹状突起、新しい軸索または新しい神経突起（すなわち細胞芽）を成長させることや、既存の樹状突起、軸索または神経突起（すなわち細胞芽）は、より大きな範囲に増大させることを促進することを意味する。
ここに使われるように、用語「ベクター」は外来性のＤＮＡまたはＲＮＡ断片が挿入されて、それから外来性のＤＮＡまたはＲＮＡ分子のどちらの発現度または拡大が宿主細胞で伝播される、自立的に複製するＤＮＡまたはＲＮＡ分子に言及する。用語「ベクター」は１つの有機体からもう一つへＤＮＡ配列を移すのに用いられることができるプラスミド（例えば、線形化しているかしていないか）を含有するが、これに限られない。
用語「薬学的に許容されるキャリア」、そして、「アジュバンド」、そして、「生理的に許容できる賦形剤」および類似物は、この発明の化合物と共に、患者に施される可能性があり、そして、その薬理学的活性を破壊しない許容できるキャリアまたはアジュバンドに言及するものと理解される。さらにここに使われるように、「薬学的に許容される担体」または「製薬キャリア」は当業者に知られているものであり、そして、０．０１−０．１Ｍの、望ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％の食塩水を含むがこれに限定されない。その上、そのような薬学的に許容される担体は、水性であるか非水溶解決、懸濁液、エマルジョン類であってもよい。非水溶溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）やエチルオレイン酸のような注射可能な有機エステル類である。水溶性担体は、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョン類または懸濁液、およびこれらの食塩水又は緩衝液媒体を含む。非経口賦形剤は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖、ブドウ糖と塩化ナトリウム、リンゲル液と不揮発性油の乳化液を含む。静脈内溶媒は、流体で栄養を含む補充液、電解質補充液（例えばリンゲルのブドウ糖に基づくそれら）、などを含む。防腐剤と他の添加物が存在してもよく、例えば、抗菌物質、酸化防止剤、担体薬剤、不活性ガスなどであってもよい。
ここに使われるように、「医薬組成物」は薬学的に許容できる希釈剤、防腐剤、溶解剤、乳化剤、アジュバンドおよび／又はキャリアと共に治療的に効果的な量（服用）の薬剤を意味する。ここで用いられる「治療的に効果的な量」は、治療的な影響を所定の状態と投
与療法に提供するこれらの量に言及する。
そのような組成物は液体または凍結乾燥されたか、さもなければ乾燥製剤で、いろいろな緩衝液内容物（例えばトリス−ＨＣｌ．、酢酸、リン酸塩）の希釈剤、ｐＨおよびイオン強化剤、添加物（例えば表面にアルブミンまたはゼラチンを加え吸収を防ぐ）と洗剤（例えばＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、プルロニックＦ６８、胆汁酸塩類）を含む。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる可溶性薬剤（例えばグリセロール、ポリエチレングリセロール）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、異性重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、かさ高い物質または等張化修飾剤（例えばラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールなどのポリマーのタンパク質への共有結合、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、その他、であってよく、または、リポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単層または多層賦形材、赤血球ゴースト、またはスフェロプラストに加えられても良い。
そのような組成物は、物理的な状態、可溶性、安定性、生体内放出率と生体内クリアランスの率に影響する。制御されたまたは徐放組成物は、親油性デポー（例えば脂肪酸、ワックス、油）中の製剤を含む。また本発明は、ポリマー（例えばポロキソマーまたはポロキソマイン）でおおわれている微粒子の組成物であると理解される。本発明の組成物の他の実施例は、非経口で、肺で、鼻で、口の経路を含む種々の投与経路のために、微粒子の形、保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤または浸透性エンハンサーを採用する。１つの実施例において、非経口的に、ガンを経由して、経粘膜的に、経皮的に、筋内に、静注で、皮内に、皮下に、腹膜内に、脳室内で、頭蓋内に、腫瘍内に、または、より望ましくは、医薬組成物は中枢神経系（ＣＮＳ）損傷部位または末梢神経系（ＰＮＳ）損傷部位に直接、投与される。
加えて、用語「薬学的に効果的量」または「治療的に効果的量」は、例えば、神経損傷を有する患者を治療するのに効果的な量（服用）に言及する。ここで「薬学的に効果的な量」が望ましい治療的な影響を与えている量と解釈されることがよく理解されており、そして、１回の服用において、または、あらゆる投薬量または経路ででも、単独で、または、他の治療剤と結合してとられる。本発明の場合、「薬学的に効果的量」が本発明のＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３の量またはＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３アナログ（例えば融合タンパク質）として理解されてもよく、これらは、例えばはニューロン軸索成長の抑制を抑え（例えば、全体的または、部分的に）、軸索成長を容易にし、細胞アポトーシスを防ぎ、Ｒｈｏ活性を抑えて、傷ついた軸索の再生を助長し、または、ニューロンが他の細胞との新しい接続を形成するのを助ける可能性がある。
例えばＣ３またはＣ３類似タンパク質のような活性薬剤の治療的に効果的な量または投薬量は、体重あたり０．００１から３０ｍｇ／ｋｇであってよく、本発明の他の範囲は、およそ０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ、およそ０．０２５〜１０ｍｇ／ｋｇ、およそ０．３〜２０ｍｇ／ｋｇ、およそ０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、およそ１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、５〜６ｍｇ／ｋｇと２０〜５０ｍｇ／ｋｇを含んでよい。他の態様では、活性のある薬剤の治療に効果的な量または投薬量は合計で０．００１から５０ｍｇの範囲でよく、本発明の他の範囲はおよそ０．０１〜１０ｍｇ、およそ０．３〜３ｍｇ、およそ３ 〜１０ｍｇ、およそ６ｍｇ、およそ９ｍｇ、およそ１０〜２０ｍｇ、およそ２０〜３０ｍｇ、およそ３０〜４０ｍｇ及び、およそ４０〜５０ｍｇの範囲を含んでも良い。
加えて、当業者は、本発明の医薬組成物が静脈であるか皮下の投与のために策定されると理解できるであろう。例えば、およそ２５、およそ４０、およそ６０、およそ１００、およそ１５０、およそ２００、およそ３００またはおよそ５００マイクログラムの活性のある薬剤が含まれている一回の服用バイアルが生産されてもよい。
当業者は特定の要因が、被療者を効果的に扱うのに必要な投薬量に影響を与える可能性が有ることを認識する可能性が有り、これらの特定な要因は、被療者の病気または障害のひどさ、以前の治療、被療者の総体的な健康及び／または年齢、他の病気の存在を含むが、これらに限定されない。さらに、治療的に効果的な量の活性化合物による被療者の治療は、一回の治療または一連の治療を含んでもよい。一例では、被療者は、およそ１〜１０週の間で、週当たり１回、およそ０．３〜１０ｍｇの範囲で、活性のある薬剤で治療され、または替わりに、２〜８週の間で、およそ３〜７週の間で、または、およそ４、５または６週の間治療される。被療者は、１週につき１回より多く、例えば１週につき２、３、４または５回以上、活発な化合物でも扱われる可能性がある。別の例では、被療者は代わりに、およそ０．３〜１０ｍｇの範囲で１週につき２回、硝子体内注射によっておよそ１〜１０週の間で治療され、替わりに、２〜８週の間で、およそ３〜７週の間で、または、およそ４、５または６週の間治療されてもよい。治療のために使われる活性のある化合物の効果的な投薬量が特定の治療のコースの上で増減するかもしれないとも認識されるであろう。
ここに使われるように、用語「被療者」は治療が必要な患者を意味する。１つの態様において、被療者は哺乳類ある。他の態様において、被療者は人間である。
加えて、例えばＨＩＶ Ｔａｔタンパク質のサブドメイン、アンテナペディアのホメオド
メインのような輸送薬剤は、ＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３またはＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３類似物を含むポリペプチドが、複数回繰り返される可能性がある。輸送薬剤領域は、ＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３またはＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３類似物のアミノ末端領域の、または、両領域のカルボキシ末端領域であってもよい。輸送薬剤領域の繰り返しは、望ましい細胞によって、ＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３またはＡＤＰリボース転移酵素Ｃ３類似物の取り込みに影響を及ぼす可能性がある（例えば、増加する）。
異種融合は、異種ポリペプチドから本発明のポリペプチドの融合によって作られる新しいポリペプチドを含む。そのようなポリペプチドは、細菌のポリペプチド（ベータラクトマーゼ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素、または例えば大腸菌ｔｒｐローカスによってコード化される酵素）、イーストタンパク質、ウィルスタンパク質、ファージタンパク質、ウシ血清アルブミン、走化性ポリペプチド、免疫グロブリン定常部（または他の免疫グロブリン領域）、アルブミンまたはフェリチンを含む可能性が有るが、これらに限定されない。
ここに記述される本発明のポリペプチドはに対して、当業者に知られている方法で測定される少なくとも５０％の同一性があるタンパク質とポリペプチド（例えば、方法はＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， １９８１， Ａｄ． Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．， ２：４８２−４８９； またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ４８： ４４３−４５３によって説明される）は本発明に含まれる。一つの態様では本発明のポリペプチドはここに記述したポリペプチドに対して、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、望ましくは、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、より望ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性を有する。一つの態様では、同一性は少なくとも５、または少なくとも２０の隣接するアミノ酸領域にわたる。
特に明記しない限り、本発明において利用される組み換えＤＮＡ技術は標準的な手法であり、当業者に知られている。それらの技術の例は、例えば、Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９８４）、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ
ｅｔ ａｌ． （ｅｄｉｔｏｒｓ）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ 及び、 Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８，現在までのアップデートを含む）
を情報源とする文献で説明され、参照によってここに取り入れられる。
ＲｈｏＧＴＰアーゼは、タンパク質のＲｈｏ、ＲａｃとＣｄｃ４２ファミリーのメンバーを含む。本発明は、ＲｈｏクラスのＲｈｏファミリーに関係する。Ｒｈｏタンパク質は、異なる遺伝子によってコードされる異なるバリアントから成る。例えば、ＰＣ−１２細胞（褐色細胞腫細胞系）は、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢとＲｈｏＣを表す。Ｃ３ファミリータイプのＲｈｏアンタゴニストは、全てのタイプのＲｈｏ（例えばＲｈｏＡ、Ｒｈｏ Ｂその他
）を機能させないので、細胞の中のＲｈｏタンパク質を不活性化するために効果的である。対照的に、例えば病気にかかった細胞へのドミナントネガティブＲｈｏＡファミリーの導入などの遺伝子治療技術は、その特定のＲｈｏＡファミリーを機能させない可能性がある。
リボース化活性を保持する組み換え型Ｃ３タンパク質またはＣ３タンパク質は、開示された送達系にも効果的で、この発明でもカバーされる。そのうえ、ＲｈｏキナーゼはＲｈｏを活性化する、の良く知られた標的であり、そして、少なくとも神経突起または軸索成長に関して、Ｒｈｏキナーゼを不活性化することはＲｈｏを不活性化するのと同じ影響を持つ。
本発明のタンパク質は、細菌の細胞抽出物から、または、組み換え型技術を用いることにより準備されてもよい。一般に、本発明に準じるＣ３タンパク質は、適当な発現媒体中のＣ３をコードするＤＮＡ断片の全部または一部で、宿主細胞の形質転換（トランスフェクション、形質導入または感染）によって生産することができる。適当な発現媒体は、当業者に知られており、例えば：プラスミド、ウィルス小片とファージが含まれるがこれらに限定されない。昆虫細胞にはバキュロウイルス発現ベクターが適当である。発現媒体の全て、またはその部分は、宿主細胞ゲノムに結合することができる。いくつかの状況では、誘導可能な発現ベクターを使用することは、望ましい。
発現媒体を宿している宿主細胞は、選ばれた遺伝子の活性化、選ばれた遺伝子の抑制、形質転換体の選択または選ばれた遺伝子の増幅の必要性に適応した、従来の栄養培地で培養されることができる。１つの発現システムは、ｐＭＡＭｎｅｏ発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）でトランスフェクトされたマウス３Ｔ３
線維芽細胞宿主細胞である。
分子生物学の分野の当業者は、多種多様な発現システムの全てが、組み換え型タンパク質を提供するのに用いることができると理解されるであろう。使われる正確な宿主細胞は、本発明はきわめて重大でない。Ｃ３タンパク質とＣ３様タンパク質は、原核ホスト（例えば大腸菌またはＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で、または、真核生物ホスト（例えば、サッカ
ロミセス属またはピキア属；哺乳類の細胞、例えばＣＯＳ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｂ
ＨＫ、２９３またはヒーラー細胞；または昆虫細胞）で生産される可能性がある。
タンパク質とポリペプチドは、植物細胞によっても生産される可能性がある。植物細胞として、ウィルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスとタバコモザイク病ウイルス）とプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）が適当である。そのような細胞は、広範囲にわたるソース（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ， Ｍｄ．）から入手可能である。変化転換またはトランスフェクションの方法と発現媒体の選択は、選ばれる宿主系に依存する。
Ｃ３ポリペプチドは、融合タンパク質として生産することが出来る。例えば、発現ベクターは、ｌａｃＺ融合タンパク質をつくるのに用いられる可能性がある。ｐＧＥＸベクターは、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）による融合タンパク質として外来のポリペプチドを発現するのに用いることができる。一般に、そのような融合タンパク質は溶解性で、溶出に引き続き、グルタチオン−アガロースビーズの吸着による、溶解した細胞からの精製により簡単に精製することが出来る。クローンされた目標遺伝子産物がＧＳＴ部分から自由になるように、ｐＧＥＸベクターはトロンビンまたは因子Ｘａのプロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。融合タンパク質を作るもう一つの戦略は、Ｈｉｓタグシステムを使用することである。
昆虫細胞の発現システムでは、スポドプテラ・フルギベルダ細胞中で育つ、（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヘドローシスウイルスＡｃＮＰＶ）が、外来
遺伝子を発現するベクトルとして使われる。Ｃ３コード配列はウイルスの必須ではない領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローンをつくられることができ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれることができる。Ｃ３タンパク質またはＣ３様タンパク質（ポリペプチド）をコードしている遺伝子の成功した挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活化と、非閉塞型組み換えウイルス（すなわちポリヘドリン遺伝子によってコード化されるタンパク性のコートが不足しているウイルス）の生産に終わる。これらの組み換え型ウイルスは、それから、挿入された遺伝子が発現されるスポドプテラ・フルギベルダ細胞に感染させるのに用いられる。
哺乳類の宿主細胞において、いくつかのウィルスベースの発現システムを利用することができる。アデノウイルスが発現媒体ベクターとして使われるケースでは、Ｃ３の核酸配列は、アデノウイルス転写／翻訳コントロール複合体（例えば遅いプロモーターや三部のリーダー配列）に結紮することができる。このキメラ遺伝子は、その後、試験管内、或いは生体内の組み換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入されることができる。ウィルスゲノム（例えば領域ＥｌまたはＥ３）の必須ではない領域への挿入は、感染したホストで生存出来て、Ｃ３遺伝子産物を発現することができる組み換え型ウイルスになる。
特定の開始シグナルは、挿入された核酸配列の効果的な翻訳のためにも必要である。これらの信号は、ＡＴＧ開始コドンと隣接した配列を含む。これらの外生の翻訳制御シグナルと開始コドンは、自然物及び合成のいろいろな起源でありえる。発現の効率は、例えば適切な転写エンハンサー因子または転写ターミネータ、その他の包含によって強化されるかもしれない。
そのうえ、宿主細胞は、挿入された配列の発現力を調整する、または、特定の、望ましい型の遺伝子産物を修正し、そして、処理するように選択されても良い。タンパク質製品のそのような修正（例えばグリコシル化）と処理（例えば切断）は、タンパク質の機能にとって重要である可能性がある。異なる宿主細胞には、タンパク質と遺伝子産物の翻訳後処理と修正のために特徴のある特定のメカニズムがある。適当な細胞系またはホストシステムは、発現される異種タンパク質の正しい修正と処理を確実にするために選ばれることができる。このためには、遺伝子産物の主要な転写、グリコシル化とリン酸化の適当な処理のための細胞機構を備えている真核生物宿主細胞を使うことができる。
あるいは、Ｃ３タンパク質は、安定してトランスフェクションする哺乳類の細胞系によって生産されることができる。哺乳類の細胞の安定したトランスフェクションにふさわしいいくつかのベクターは、一般者が利用できる；そのような細胞系を造る方法も、一般に公開されている。ある例では、Ｃ３タンパク質をコードしているｃＤＮＡは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む発現ベクターでクローンをつくる。プラスミドの融合
と、及び、それによって、Ｃ３またはＣ３様タンパク質をコードする遺伝子の宿主細胞染色体への統合は、０．０１−３００μＭ（マイクロモル）のメトトレキサートを細胞培養培地（Ａｕｓｕｂｅｌら、上記参照）に含むことによって選択される。この優性選択は、大部分の細胞タイプで達成される。組み換えタンパク質発現は、ＤＨＦＲにより仲介されるトランスフェクションされた遺伝子の増幅によって増やされる可能性がある。遺伝子増幅を支えている細胞系を選ぶ方法は、当業者に知られている；そのような方法は、徐々に増加している濃度のメトトレキサートを含んだ、培地中の、一般に拡張された培養液を含む。この目的のために一般的に用いられるＤＨＦＲを含む発現ベクターは、ｐＣＶＳＥＩＩ−ＤＨＦＲとｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）を含む。上述の宿主細胞または、望ましくは、ＤＨＦＲが不足するＣＨＯ細胞系（例えばＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞、ＡＴＣＣアクセッション
番号ＣＲＬ ９０９６）の全ては、安定してトランスフェクションする細胞系またはＤＨ
ＦＲによって仲介される遺伝子増幅のＤＨＦＲに好まれる宿主細胞の一つである。
いくつかの他の選択システムが以下に限定されることなく使われる可能性があり、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含み、そして、それぞれ、ｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ細胞で使用されることができる。そのうえ、ミコフェノール酸の耐性を与えるｇｐｔ；アミノグリコシド系Ｇ−４１８に対する抵抗性を与えるｎｅｏ；そして、ハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏが使われてもよい。
あるいは、どんな融合タンパク質でも、発現されている融合タンパク質に特有の抗体を利用することによって、すぐに精製することができる。例えばＪａｎｋｎｅｃｈｔら（（１９８１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８８， ８９７２，）
に記載の系はヒト細胞系で発現される非変性融合タンパク質の迅速な精製を可能にする。この系では、遺伝子のオープン・リーディング・フレームが６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに並進的に融和するように、注目する遺伝子をワクシニア組み換えプラスミドにサブクローンする。組み換え型ワクシニアウイルスに感染している細胞からの抽出物はＮｉ２＋ニトリロ酢酸アガロースカラムにロードされ、そして、ヒスチジンタグを付けたタンパク質はイミダゾールを含むバッファで選択的に溶出される。
あるいは、Ｃ３、Ｃ３様、タンパク質又はそれらの部分（断片）は免疫グロブリンＦｃ領域に融合することができる。そのような融合タンパク質は、タンパク質Ａカラムを使って、すぐに精製されることができる。
本発明の組成物の相対的な効果的Ｒｈｏアンタゴニスト活性を決定するために、組織培養生物検定システムを使うことがでる。例えば、およそ０．０１からおよそ１０ｇ／ｍｌ（１ミリグラムに対するマイクログラム）の範囲の濃度の配列番号８のような融合タンパク質が有用であり、細胞に対し毒性が無い。
化合物は、例えば以下の手法のうちの１つにより、Ｒｈｏアンタゴニストであることが確かめられる：
ａ） 細胞は上記のような成長抑制基質の上で培養されて、候補のＲｈｏアンタゴニスト
にさらされる；
ｂ） ステップａの細胞を均質化し、そして、プルダウン分析評価を実行する。この分析
評価は、ＧＳＴ−Ｒｈｏｔｅｋｔｉｎ がＧＴＰ結合Ｒｈｏと結合する能力に基づく。領
域（ＧＳＴ−ＲＢＤ）と結合している、組み換え型ＧＳＴ−ＲｈｏｔｅｋｔｉｎまたはＧＳＴ ｒｈｏｔｅｋｔｉｎは、ａ）のように培養され細胞から作られた細胞均質液に加え
られる。抑制基質がＲｈｏを活性化すること、及び、この活性化されたＲｈｏＧＳＴ−ＲＢＤによりプルダウンされることが観察される。上のａまたはｂに記載されたように細胞が培養されるとき、ＲｈｏアンタゴニストはＲｈｏの活性化を妨害し、したがって、効果
的ＲｈｏアンタゴニストはＲｈｏの検出を妨害する。
ｃ このプルダウン分析評価のための交互の方法は、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質で使
われ、プルダウンの分析評価のおとりとしてのＲｈｏ−ＧＡＰは活性化される。
化合物がＲｈｏアンタゴニストであることを確認するもう一つの方法は、以下の通りである：生細胞に添加されるとき、効果領域のＡＤＰリボシル化によりＲｈｏを不活性化するアンタゴニストはＲｈｏの分子量変動を見つけることによって特定されることがでる。細胞を均質にすることによりＲｈｏアンタゴニストで細胞の処理した後、そして、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって細胞均質液中のタンパク質を分離することにより、分子量シフトを検出することが出来る。タンパク質はニトロセルロース紙に転写され、そして、Ｒｈｏはウエスタンブロット法技術によってＲｈｏに特有の抗体で検出できる。
本発明と共益して用いられる可能性のある他の輸送薬剤が当業者に知られている。例えば、本発明のポリペプチドはＨＩＶ Ｔａｔタンパク質のサブドメイン又はアンテナペディアのホメオドメインのような輸送薬剤を含む可能性がある。輸送配列は、塩基性アミノ酸（例えばポリアルギニン配列）からなる領域を含む可能性がある。輸送薬剤のポリペプチドは複数回繰り返される可能性がある。輸送薬剤は、アミノ末端領域に、または、カルボキシ末端領域に、または、複合体の両方の領域に位置する可能性がある。輸送薬剤の重複は、細胞によって接合体の取り込みに影響を及ぼす（例えば、増加する）可能性がある。
一つの態様において、輸送薬剤は、レセプターから独立したメカニズムにより活性化した薬剤の取り込みを容易にする。別の態様では、輸送配列は配列番号４５−５１を含むが、これらに限られない。本発明に包含されている他の輸送薬剤は、アンテナペディアタンパク質ホメオドメインの第３へリックス（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（商標）；ＴＡＴ 配列番
号５２）、シラプロリン複合体、ガンマ−アミノ−Ｌ−プロリンオリゴマー、ポリアルギニン（配列番号５４）、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ５５−５６）、Ｐｅｐ−１ （配列番号５７）、Ｓ４１３−ＰＶ （配列番号５８）、 ＶＰ２２タンパク質、 ＭＡＯ （Ｍｏｄｅｌ ｓｕｎｔｈｉｃタンパク質； 配列番号５９）、ＳｙｎＢ１ （配列番号６０）、Ｓｙｎ Ｂ３ （配列番号６１）、Ｓｙｎ Ｂ５ （配列番号６２）、ｂ−ＦＧＦ、ＦＧＦ−４シグナル配列 （配列番号６３）、ｐＶＥＣ （配列番号６４）、ＳＡＰスイート・アロー・ペプチド、ｈＣＴ（９−３２）−ｂｒ ヒトカルシトニン、ｂＰｒＰｐ （プリオンタンパク質Ｎ末端、 配列番号６５）； ＢａｇＰペプチド、マイコバクテリウム細胞・エントリー・タンパク質（Ｍｃｅ１Ａ）、合成ペプチドＹＴＡ２及びＹＴＡ４、配列番号６６、Ｃ１０５Ｙ（α１−アンチトリプシンのアミノ酸３５９−３７４と一致する；配列番号６７）、ＴＰ１０、ｄｙｎｏｒｐｈｉｎｓ Ａ及びＢ；そして、Ｄｉａｔｏｓペプチドベクター（Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）；配列番号６８−７７）を含むが、これに限定されるものではない。
他の文献で試験された他の輸送配列は（すなわち、リポーター配列を用いることによりそれらは働くことを示す）が知られている。１つの輸送ペプチドである１２の構造単位ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３）、はプロリンに富んでいる。それはＧＳＴ−ＭＴＳ融合タンパク質として作られて、カポジＦＧＦ信号配列のｈ領域に由来する。もう一つの例は、精子フェルチニンアルファペプチド（ＨＰＩＱＩＡＡＦＬＡＲＩＰＰＩＳＳＩＧＴＣＩＬＫ）である（配列番号４）。しかし、プロリン（Ｐｒｏ）残基のアルファへリックス破壊傾向が一般的な規則でない点に注意されなければならず、精子フェルチリンアルファの推定融合ペプチドから、アルファはリポソームの存在下で高いアルファへリックスの含有量を示す。しかし、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ配列は、フェルチリンの効果的な融合特性のために必要である。テストされた配列番号８の融合タンパク質は、効果的輸送ペプチドを作るために２つのプロリンを持つ必要条件に適合する。したがって、効果的輸送の働きをするヘリックス破壊傾向があるプロリンの豊富な配列及びランダムな配列はＣ３に融和するならば効果的であるだろう。
図１に関し、配列番号４３融合タンパク質の変異体の意図的な不活性化、例えば配列番号６（ヌクレオチド配列は、配列番号５と一致する）の不活性化は、すなわち、ＮＧ−１０８細胞で生物検定によって分析するのと同様、図示される。本発明（配列番号４３）の活性融合タンパク質とともに培養されるＮＧ−１０８細胞は、神経突起の成長促進を示し、その神経突起の成長は配列番号４３の存在の結果である。しかし、故意的に不活性な変異体配列番号６で扱われる細胞の神経突起成長は、添加されたタンパク質で処理されていないコントロール細胞とどうようである。対照群への類似性は、故意に不活性化した変異体タンパク質配列番号６が神経突起成長の刺激に関して不活性なことを証明する。
本発明（配列番号４３）の融合タンパク質の注射は、一回の注射の後に視神経の圧迫によって誘導される網膜神経節細胞（ＲＧＣｓ）の細胞死を防ぐことができる（実質的に観察される率を減少させる）。軸索切断または視神経の軸索切断の後、賦形材（リン酸塩で緩衝された食塩水）の注入により細胞は死ぬ。配列番号６（配列番号４３を故意に不活性化した変異体）が目に注射された時は、それはＲＧＣｓの細胞死を防ぐことができない。配列番号４３の一回の注射は細胞死を防ぎ、そして、生存している細胞の数はコントロールのそれ（非軸索切断された網膜）と同様である。結果は、本発明の融合タンパク質としての配列番号４３が網膜ニューロンの細胞死を防ぐことができることを証明している；配列番号４３の神経保護的な活性は、Ｃ３融合タンパク質の酵素の活性が保持されることを必要とする。
黄斑変性症のための治療が必要な患者への、本発明の融合タンパク質を有する医薬組成物の投与は、哺乳類宿主の片目の中の、網膜下の新血管形成に伴う血管形成、黄斑下部の脈絡膜新血管形成、黄斑の近位にある網膜下の脈絡膜の新生血管組織の増殖を実質的に減らす、或いは防ぐことができる。一つの態様では、本発明はは黄斑変性症の治療方法に関するものである。他の態様では、本発明の組成物は、網膜下の新血管形成の率と黄斑変性症に関連した新生血管組織の激増を妨げるか、大幅に減らすことに役立つ。この方法は、目で黄斑変性症の更なる開始または進行を防ぐ予防治療として有効でありえる。他の態様では、この方法は斑点でドルーセンの堆積と細胞死を防ぐ予防治療として有効でありえる。他の態様では、細胞死を規制する細胞内の機構に働きかけることによって、この方法は患者の眼中の光受容細胞の細胞死を防ぐことも出来る（これらの光受容細胞は、ここで光受容器と参照される）。この方法は、黄斑変性症の視野を不明瞭にする徴候を示さない目で、特に他方の目が黄斑変性症の視野を不明瞭にする徴候を示す患者の目において、黄斑変性症の開始または進行を防ぐために役立つこともありえる。
本発明の他の態様では、黄斑変性症の治療の方法は、本発明のポリペプチドを治療的に効果的な量で目に近位の組織へ注射または移植することによるものを含む。そのうえ、本発明は注射可能な投与にふさわしい無菌の医薬組成物の投与、および、注射可能な使用（例えば、無菌で、滅菌可能で、血液の等張液）に適した、本発明のポリペプチド及びキャリアを含み、そのようなポリペプチドまたは医薬組成物は平均的な患者の目の、網膜下の新血管形成、黄斑の基礎をなす脈絡膜の新血管形成、及び、網膜下の脈絡膜に近位から黄斑への新血管組織の増殖、からなるグループと関連する血管形成の開始を防いだり、遅らせることができ、統計学的に関連した人口の平均的な患者が目の視力損失の始まりを遅らせる。
視力喪失の開始の遅れは前記アンタゴニストに起因することが出来、前記量のポリペプチドを投与しない、統計的に関連する患者の中の或る平均的な患者において、開始の平均的な遅れは視力損失の開始の平均的な時間に対して測定され、平均的な視力喪失の開始の遅れは少なくとも１ヶ月であることを含み、より好ましくは少なくとも６ヶ月であることを含み、より好ましくは６ヶ月より長期であることを含む。
配列番号８（対応するヌクレオチド配列は、配列番号７と一致する）または配列番号１０のような本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物による血管形成の抑制は、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏのシステムで評価することができ、それは腫瘍の成長における新血管形成の研究に対し、例えば、内皮細胞を基底膜の抽出物の存在下で培養することを含む系で血管形成、及び哺乳類の眼中の新血管形成及び新血管細胞の増殖のモデルとして、有用でもある。
実験的な状況の下で、血管形成または血管の毛細管形成に付随する毛細管様構造または毛細管は、顕微鏡下で見ることができる。配列番号８又は配列番号１０と言った本発明の融合タンパク質による、血管形成の進行、菅状毛細血管ネットワークの形成、又は腫瘍関連の血管形成の過程や進行の混乱の抑制効果は、マトリゲル（商標）分析評価において管状構造の消失に続くことによって観察される。
マトリゲル（商標）マトリックス（ＢＤバイオサイエンス社）はＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出され、可溶化された基底膜調合剤であり、そして、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質が豊富な腫瘍である。その主要構成要素は、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとエンタクチンである。室温でＢＤ マトリゲル（商標）マトリックスは重合化し、哺乳類の細胞基底膜に擬態す
ることができる生物学的活性基材を生産し、ここで、試験管内で、細胞は生体内状況に類似した方法でふるまうことができる。マトリゲル（商標） Ｍａｔｒｉｘは、生理的に関
連した環境を細胞形態学、生化学機能、移動または侵入と遺伝子発現の研究に提供することができる。
マトリゲル分析法では、マトリゲル（およそ１２．５ｍｇ／ｍＬ）は約４℃で解凍される。マトリックス（およそ５０マイクロリットル（ｕＬ））は９６穴プレートの各穴に加えられる、そして、約３７℃で約１０分間、固まらせられる。固体のマトリゲルを含んでいるウェルは１ウェルにつきおよそ１５，０００セルの濃度でヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）と共に約３０分間インキュベートした。細胞が接着した時は、培養液を除去して、配列番号８のような本発明の融合タンパク質を補われた新しい培養液で取り替えられ、そして、およそ約６〜８時間、３７℃でインキュベートした。コントロールのウェルは、培養液のみでインキュベートした。成長や、管の形成は例えば、およそ５０Ｘの倍率による顕微鏡検査によって視覚化することにより分析された。血管形成から派生した毛管のネットワークの相対的な平均長さ（Ｙｘ）は、本発明の融合タンパク質（ｘ）を含む医薬組成物の評価において観察され、ノーザン・イクリプス・ソフトウェアを使用して定量化することができる。
配列番号１０（配列番号４３のトランケートバリアント）の構造
配列番号１０は、配列番号９の対応するヌクレオチド配列とともに、配列番号４３（図２）の派生物である。配列番号４３はＧＳＴ配列が不足した配列番号８の派生物である。
Ｃ３エクソエンザイムは、他の細菌の毒素に特有の特定の受容体結合と移動領域を占有しない。それゆえに、細胞取り込みは遅くて非特性であり、主に飲細胞運動によって促進される。配列番号４４は、Ｃ３細胞外酵素をレセプターから独立した形式で原形質膜の交差するのを容易にするプロリンの豊富な輸送配列に結合することによって得られる融合タンパク質である。この設計された融合タンパク質は、神経突起成長分析評価によってｉｎ
ｖｉｔｒｏでテストされるとき、Ｃ３より１００倍以上効率的であることが示される。
Ｃ３調合液の純度と収率を向上させるため、配列番号４４はＧＳＴ融合タンパク質ｐＧＥＸ−４Ｔのベクトルから取り除かれて、ｐＥＴベクターに移される。結果として生じる融合タンパク質、配列番号４３は、標準的なクロマトグラフィステップを使用した高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）によって精製される。精製されたタンパク質は
９５％以上の純度で、エンドトキシン（２単位／ｍｇ未満）が少なく、−７０℃で２年以上安定であり、配列番号４４と比較して、高いグリコヒドラーゼ活性と神経細胞成長活性を示す。
更なるバリアントを製造しているｃＧＭＰのための最終産物を安定させるため、配列番号１０が造られる。１５アミノ酸配列は、Ｃ３シグナル配列の８残基および、痕跡的なマルチプルクローニングサイトに由来する７つのアミノ酸を含み、配列番号４のＮ末端から除去される。結果として生じる配列番号１０のＮ末端は、Ｃ．ボツリヌス菌の野生シグナル配列内在性切断の後で、ＷＴ酵素のそれとほとんど同一である。ＷＴ Ｃ３細胞外酵素（
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ エントリーＰ１５８７９）のＮ−終点の配列の配列番号１０及び
配列番号４３は、イタリック体で示されるアミノ酸残基はＷＴ Ｃ３細胞外酵素シグナル
ペプチドの内在性切断を表し、太字で表されたものは設計されたものであることが図２Ａで示される。更に、バリアントの略図は、図２Ｂに示される。
配列番号１０は、その先行する配列番号４４より安定である。配列番号４４は研究室スケールで生産されたが、４℃の保存で数週間後ですら劣化した形跡はないが、大スケールで生産された配列番号４４では同様ではない。サイズ除外ＨＰＬＣまたは非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、配列番号４４が自発的に、還元剤のジチオスレイトール（図２Ｃ）に敏感だった二量体を形成したことを示した。とりわけ、プレキャスト１２％の勾配ゲル（非還元）は配列番号４４の二量体化を示しており：レーン１＝ Ｂｉｏ−ＲａｄＴＭ 低分子量タンパク質基準、レーン２＝−８０℃の保存から取り出した研究室−スケールの配列番号４４、レーン３＝４℃で５日間保存した研究室スケールの配列番号４４、レーン４＝４℃で０．５ｍＭのＤＴＴの存在下５日間保存した研究室スケールの配列番号４４は図２Ｃに示される。
これらのデータは、分子間ジスルフィド結合がＮ末端で一つのシステイン残基を通して起こっていることを示唆する。二量体化が配列番号４４の機能的な活性に影響するとは見られていないので、その除去は、還元剤の必要性を取り除くことにより、大規模な精製プロセスをかなり容易にする。これに加えて、高密度バイオリアクター発酵からの配列番号４４の精製に引き続き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で第２の主要なバンドが存在し、それは細菌の溶解物（図２Ｄ）のＮ末端切断によるものであり、大規模なスペクトル分析によって確かめられる。より詳しくは、プレキャスト１２％勾配ゲル（減少方向へ）で、配列番号１０の強化された安定性が見られ、そこで、レーン１＝ Ｂｉｏ−ＲａｄＴＭ 低分子量タンパク質基準、レーン２＝−８０℃で保存されていた研究室スケール配列番号４４、レーン３＝４℃で８週間保存されていた研究室スケールの配列番号４４、レーン４＝４℃で１０週間貯蔵されたバイオリアクター生産の配列番号４４、レーン５＝−８０℃の貯蔵から取り出されたバイオリアクター生産された配列番号１０、および、レーン６＝４℃で２週間貯蔵されていたバイオリアクター生産された配列番号１０（図２Ｄ）。
このように、Ｎ末端をトランケートしたバリアントの配列番号１０は、２−８℃の保存により変性や二量体化を示さないように作られた。長期テストにより、１８ヶ月以上の−７０℃および２−８℃の保存に於いてすらこのバリアントは完全な活性及び安定性を保持することが立証された（データーは示していない）。
精製されたタンパク質は９５％以上の純度で、エンドトキシンが少ない（２単位／ｍｇ以下）（図２Ｅ）。プレキャスト１２％勾配ゲル（減少）は代表的なバリアント（配列番号４４）の精製を図２Ｅで示す。ここでレーン１＝Ｂｉｏ−ＲａｄＴＭ ｌｏｗ−範囲分子
量タンパク質基準、レーン２＝細胞溶解物原液、レーン３＝ポリ−ミニＰ処理後の上澄み、レーン４＝硫酸アンモニウム処理した再懸濁ペレット、レーン５＝ＰＤ−１０脱塩カラム処理物、レーン６＝ＳＰ−ＸＬ処理物、レーン７＝ＳＰ−ＸＬ溶出液ピーク、レーン８＝Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５溶出液ピーク、レーン９＝ＨｉＰｒｅｐ脱塩溶出液、レーン１０＝Ｑ−セファロース溶出液、およびレーン１１＝最終濃縮済み貯蔵物。
大スケールで製造された配列番号１０は、その全物質、配列番号４３及び４４と機能的に交換可能であり、同等又は良い酵素活性及び生物活性を有するが、エンドトキシンのような少量の不純物を有する。
トランケート配列番号１０バリアントの構造
配列番号１０のバリアントは輸送ペプチド配列を含まず、Ｎ末端又はＣ末端の連続するアミノ酸残基の群を削除することにより派生させた。バリアントは図３に図示した。バリアントは標準分子生物学的手法を用いて、配列番号１０をコードするｃＤＮＡの先端をＮ末端領域かＣ末端領域のどちらかを切り取り、輸送配列をそのままにして、部位特異的な変異により作りだした。ここで開示される、トランケートバリアントの活性はここで説明される手法のどれかを用いることにより変化し、例えば、例９〜１３及び１８に記載されている。理論に縛られないことを望むが、トランケートバリアントは細胞により容易に埋没するであろうと信じられている。本発明の一態様では、したがって、生物学的に活性のある配列番号１０のより短いトランケート断片は必要に応じて投与される。
加えて、配列番号１０バリアントの物理的性質を表１に開示した。
欠失ミュータントやバリアントはポリメラーゼ鎖反応やｐＥＴ９ａベクターへのサブクローンにより準備した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（ストラテジーン社）を用いた部位特異的突然変異生成により２種の織り後ヌクレオチドが設計された。ボリメラーゼ鎖反応が適当なバリアントプライマーセット（表２参照）を用いて行われた。サイクルプログラムは以下の通りである：９５°Ｃ ３０秒、９５°Ｃ３０秒、５５° Ｃ１分、６８°Ｃ１０分を１８サイクル、及び４°Ｃで保持。
トランケートバリアントのプライマーは、Ｂｉｏ Ｓ＆Ｔで合成され、凍結乾燥した粉末
で供給された。再懸濁の後、分光学的測定によりプライマー濃度を変えた。突然変異生成反応は上記のプライマーをＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットにより提供される取扱説明書に従い行った。０．８％アガロースゲル上での反応の分析をもとに、反応が成功したかどうかを解析した。
製造者の取扱説明書に従い、１μＬのこの生産物を用いて、ＤｐｎＩ消化及びＸＬ−１ブルースーパーコンピテント細胞の形質転換を行った。それぞれの形質転換からの３クローンをプラスミドのミニプレップを得るため一晩培養した。トランケート配列番号１０バリアントのそれぞれから一つのＤＮＡサンプルをＤＮＡ配列解析に送った。配列データはＮＣＢＩのＢｌａｓｔ２分析ソフトウェアで解析され、ＭＤ４３−１以外は予想されたＣ３バリアントコード配列と１００％の配列である事が分かった。
確かめられたそれぞれのＤＮＡサンプルは、製造業者の取扱説明書に従ったプラスミドＤＮＡと共に、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（１ショットのＢＬ２１（ＤＥ３）：ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質転換するのに使用した。それぞれのクローンからの３つのコロニーはミニスケール誘導分析のため、３０ μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する分
注されたＬＢ培地に移された。タンパク質ゲルが実行され、クーマシーで染色し、スキャン濃度測定機を用いて定量化した。
各々のトランケートバリアントのうち、最も良く発現するクローンを大型培養での発現と精製のため接種した。最初に、ブドウ糖を含む０．５ｌのＬ培地のフラスコに研究用細胞銀行（ＲＣＢ）の２本のバイアルを接種し、一晩培養した。始動培地は、１０倍に薄められ、各々５００ｍｌの培地を含む８本のフラスコに分けられた。フラスコは３７℃でイン
キュベートし、バリアントのの発現を増加させるために、１時間２０分後にイソプロピルチオ−Ｂ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、加えた。更に４時間後に細胞を遠心分離により集菌し、必要になるまで、−８０℃で貯蔵した。集菌した培地のサンプルはトランケート型ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０のために分析される。次に、細胞ペレットを融解し、抽出培養液中で超音波破砕した。ＳＰ−セファロース Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗカラム（１ｍｌ）（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦ、ファルマシア社）を通し、これらの生抽出物を約９０％の純度に精製した。得られたタンパク溶液は、限外濾過で集結されて、次に、冷凍の前に０．２マイクロメータろ過膜を通した。分割量は、タンパク濃度を決定するためにＡ２８０によって分析されて、−ポリアクリルアミドゲルＳＤＳでサンプルにかけ、クーマシーブルーで染色し、スキャンし濃度計測をすることによって、濃度を決定した。生物学的活性は、蛍光ベースの酵素（グルコヒドラーゼ）分析と細胞ベースの神経突起伸長分析の両方を使用し評価した。
Ｃ３バリアントの生物学的活性は、Ｃ３バリアントのε−ＮＡＤの加水分解の結果生産されるε−ＡＤＰリボースの生成を測定する、グリコヒドラーゼ活性を用いて決定された。Ｃ３バリアントのグリコヒドラーゼ活性はε−ＮＡＤ＋を、選択された波長で１０倍高い蛍光強度の分子であるε−ＡＤＰ−リボースに変換する。ε−ＡＤＰ−リボースの蛍光強度は既知のε−ＡＭＰ濃度の標準蛍光曲線を用いることにより形作られるε−ＡＤＰの量により測定されてきた。ε−ＡＭＰ及びε−ＡＤＰ−リボースの蛍光強度は３０５ｎｍでの反応の刺激化及び４１０ｎｍでの放出の記録を測定する事により測定される。活性の単位は３７℃３０分で作られるＡＤＰリボースのナノモルにより定義される。測定は少なくとも１２μｇのＣ３変異タンパク質及び少なくとも１８０分のインキュベート時間まで直線状である。この測定は的確であり、正確であり、再現可能である。この分析は７０℃でのインキュベーション後の酵素活性の減少を測定するのに有用である事が知られており、上手く設計された安定性検定に用いられる場合、安定性の指標になると考えられている。Ｃ３バリアントの生物活性を測定に用いる事の出来る他の方法は文献に記載されている。（例えば、Ｗｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７７： ３２８２０−３２８２９を参照）
Ｃ３バリアントの生物活性はＮＧ１０８細胞神経突起のバイオアッセイによっても測定する事が出来る。このバイオアッセイの手順はＮＧ−１０８細胞を４時間、Ｃ３バリアントを含む１分割量の緩衝化した溶液と共にインキュベーションする事を含む。同時に他の同一のバイオアッセイをＣ３バリアントの替わりに配列番号１０を用いてポジティブコントロールとして行った。細胞はパラフォルムアルデヒドで固定し、クレシルバイオレットで染色し、各々のウェルの中の、細胞体の長さよりも長い神経突起を持つ細胞の濃度を、顕微鏡下で数を数える事により測定した。表３に示した結果は少なくとも２回の独立した実験による３回の測定をもとにする。
これらのデータは実証された最小の機能を持つサイズはＮ末端トランケート配列番号１０で２１２アミノ酸、そしてＣ末端トランケート配列番号１０で２２４アミノ酸である事を示す。期待される両端からのアミノ酸の二重欠失はちょうど２０４アミノ酸残基以上の機能的なバリアントを生産するであろう。本発明に含まれる、二重欠失バリアントの例はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ７８及び７９のものを含むが、これに限られない。
配列番号１０のＰＥＧ化したバリアント
配列番号１０分子は化学的に修飾され、ポリエチレングリコール部位が生物的な居住的性質を増幅させている（表４）。ＰＥＧ化とはＰＥＧ構造を、他の大きな分子、例えば治療に用いるタンパク質又はポリペプチド（これらはよって“ＰＥＧ化”と引用される）に共有結合する行為である。当業者には知られているように、種々のタンパク質又はポリペプチド、ポリ（エチレングリコール）が血液により運搬されるタンパク質の清掃率を遅らせる。このことは長期に素養する薬学的効果及び／又は毒性の減少を引き起こすであろうし、しがたって、より長い投与間隔が許容されるであろう。例えば、例９〜１３及び１８で記載したように、ここで開示したＰＥＧ化バリアントの活性はここで記載されたあらゆる方法を用いて確かめる事が出来る。
ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤを用いた配列番号１０のＰＥＧ化と精製
予め秤量され、封入された分割量で、商業的に使用可能になっているｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド薬剤（Ｎｅｃｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を用いて配列番号１０のＮ末
端ＰＥＧ化を実施する事が出来る。標準的な反応は（クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５中の）配列番号１０を脱気したＯ．１Ｍクエン酸ナトリウム−ＮａＯＨ、ｐＨ５．０の０．５Ｍ ＥＤＴＡ中で最終濃度３．３ｍｇ／ｍＬまで薄める事により開始する。ＰＥＧ化反応の開始に先立ってｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ薬剤は新鮮なＭｉｌｌｉＱ水で望ましい濃度まで溶解される。ＰＥＧ化の程度は反応時間、ｐＨ、及び配列番号１０に対するｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ薬剤の割合を用いて制御される。例えば、Ｎ末端のモノ−ＰＥＧ化には各々１：１の割合とｐＨ５．５であることが望ましい。同時にジ−ＰＥＧ化又はマルチ−ＰＥＧ化はより高い配列番号１０に対するｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ 薬剤割合を用いて生成される （２．４ ｋＤａ ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤには １３０：１ ； ６．３ ｋＤａ ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤには２０：１；及び ２１ ｋＤａ ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ には２：１）。
ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ溶液の１分取量を、配列番号１０溶液に加え、穏やかに混ぜ、各３０分の間隔で逆転で３７℃で１時間インキュベートした。１時間後に、そして、２時間後に再び、新鮮な１分取量のＰＥＧ化試薬のを補った。反応液は３時間後までインキュベートされ、そしてその後、それらは８５Ｌの１Ｍのナトリウムシアノボロハイドライド［Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３］の追加により止められ、シッフ塩基中間体を減少させ、２級アミン結合を安定させるために室温で一晩インキュベートして放置した。最適環境の下で、配列番号１０からＰＥＧ化配列番号１０へ〜 ２５ ％の転換効率が得られることができた（表５参照）。
ＰＥＧ化された配列番号１０を精製するのにＳＰ−セファロースＦａｓｔ−Ｆｌｏｗ １ｍｌ（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦ、ファルマシア社）の陽イオン交換カラムを用いた。一方で、反応していない、非ＰＥＧ化配列番号１０は、樹脂と強固に結合する。ＰＥＧ化された配列番号１０は（結合したＰＥＧ部分の数に依存して）は、樹脂と強く結合しない。結合緩衝液は、０．０５ＭのＨＥＰＥＳ、０．０７５ＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ ７．５から成る。溶出は、０−０．１６Ｍ ＮａＣｌの線形的勾配を用い、ＮａＣｌの段階的な追加によって実行された。種々のＰＥＧ化された形態を含んでいるＦＰＬＣ分画は、プールされて、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ−１０を用いて濃縮され、それから、５ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ ６．５に対して（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ １０ｋＤａ１文取量の透析カセットを使用して透析した。クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル類の分析により、３回の精製全てにおいて、精製された濃縮サンプルのいくつかがまだ少量の反応していない配列番号１０を含むことが分かった。したがって、濃縮したサンプルは、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦ １ｍｌカラムを用いてＦＰＬＣによって再精製された。６ｋＤａのサンプルが２つのよく切り離されたピーク（図５Ａと図Ｂ）を示し、２ｋＤａのＰＥＧｙｌａｔｅｄサンプルのｒｅ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎからの溶出プロフィールは半分解されたピークを示した。３つの精製物からのフラクションはＮｕＰＡＧＥゲル上で分析され、純粋な断片はプールされた。
本発明の融合タンパク質を有する医薬組成物の抗転移特性
本発明の他の態様では、例えば注射や局所的投与、被覆による方法やここに記載する他の方法で、哺乳類の腫瘍の近位の細胞または最初の腫瘍に、治療の必要性に対応して、融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することが出来、そして、哺乳類の転移性腫瘍の遊走を抑制することが出来、哺乳類の最初の腫瘍の部位に起源を持つ腫瘍細胞に対し、最初の腫瘍が残る組織に機能的に関連し近位にある哺乳類の健康的あるいは正常な組織の部位に、投与することが出来る。
例えば、本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物は、哺乳類の腎臓に近位の組織に投与するか、あるいは肝臓ガンを含む肝臓組織に投与することが出来、転移性の肝臓ガン細胞が肝臓の腫瘍から、第一の腫瘍が残る同じ肝臓の健康な組織に遊走するのを防ぐことが出来る。
他の態様では、本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することが出来、例えば注射で、塗布によりまたはここに記載する他の手法で、治療の必要のある哺乳類の最初の腫瘍の近くまたは腫瘍を含む組織に、投与することが出来、哺乳類の転移性腫瘍の遊走を抑制することが出来、哺乳類の最初の腫瘍の部位に起源を持つ腫瘍細胞に対し、最初の腫瘍が残る組織に機能的に切り離されたまたは遠位にある哺乳類の健康的あるいは正常な組織の部位に、投与することが出来る。
例えば、本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物は、脳腫瘍を含む脳の組織に投与ることができて、転移性脳腫瘍細胞が、例えば肝臓、脾臓または肺組織のような体のどこかほかの健康な組織に遊走することを防ぐことが出来る。
他の態様では、治療が必要な患者に、本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物の投与の後、悪性腫瘍細胞の転移性の遊走は、防がれるか、抑制されて、実質的に二次腫瘍の形成を防がれ、患者の悪性ガンの蔓延を大幅に減じるあるいは防ぐことが出来る。
配列番号４３のような本発明の融合タンパク質が細胞運動性を減らすことができる証明
抗転移の薬剤としての本発明の融合タンパク質（例えば配列番号４４）を含む医薬組成物の治療的な効果は、示される試験管内の二次元の細胞侵入分析評価によって、例えば量的に立証される。そのような分析法では、悪性細胞の転移の遊走能力の抑制は、購入されたボイデンチャンバーを用いることにより測られることができまる。ボイデンチャンバーは２つのコンパートメントを持ち、上下のコンパートメントが膜によって切り離されている。細胞遊走の範囲は、上の方のコンパートメントの中の細胞の総数の表面被覆により測定され、下のコンパートメントに遊走する細胞のその総数の分画を数える。成長因子は、細胞遊走を強化するために、下のコンパートメントに加えることができる。このモデルは、哺乳類の生体内ガン細胞移動モデルとして有効である。
哺乳類の血液と等張である無菌のリン酸緩衝食塩水中の本発明の融合タンパク質（例えば配列番号４３）を含む医薬組成物の腫瘍細胞の遊走を妨げる能力を試すために、配列番号４３を含む組成物は異なる濃度の配列番号４３で上のコンパートメントに加えられる。
融合タンパク質組成物の存在下で、下のコンパートメントに遊走する細胞の総数の分画は、数えられて、融合タンパク質がゼロ濃度である対象群と比較される。対照群において移動するガン細胞の数は本発明の組成物で治療されていないガン患者の遊走のモデルとなる。本発明の組成物の一画分の存在下、遊走するガン細胞の数は、本発明の組成物の一分取量で処理されたガン患者のモデルとなる。
後者と対照実験の遊走細胞の数の違いは、パーセントで表されることができて、１００％（すなわち転移細胞の移動の完全な抑制）から５％まで、望ましくは１００％からおよそ５０％まで、より望ましくは約１００％からおよそ７５％まで、そして、最も望ましくは、およそ１００％からおよそ９０％にわたることができる。最初のコントロール賦形剤が最初のコントロール賦形剤と同じ可能性のある第２のコントロール賦形剤と比較されるとき、０％の量が観察されることができる。このパーセントの計算は、式＝｛（対照群中の細胞遊走の数−融合タンパク質の存在下遊走する細胞の数）÷（対照群中の細胞遊走の数）｝×１００％を解くことによってされる。
抗転移薬剤としての本発明の融合タンパク質（例えば配列番号４４）を含む医薬組成物の治療的な効果は、少なくとも質的に示されることができ、一つの態様では、試験管内の三次元細胞侵入分析評価によることができる。
そのような分析法では、悪性細胞の転移性遊走能力の抑制は、融合タンパク質を含まないキャリア賦形剤を対照群のキャリア賦形剤として処理したマトリゲル（商標）マトリックスを通して遊走する悪性細胞の能力と比較した、キャリア賦形剤に本発明の融合タンパク質を含んだ本発明の薬学的に許容される剤形で細胞を治療した後、マトリゲル（商標）マトリックスを通って遊走した悪性細胞の相対的な能力、における変化により測定出来る。一つの態様では、本発明の融合タンパク質は、細胞の遊走率の縮小としての抑制変化を生じるか、または、時間的に離れた細胞の遊走の縮小として、組織マトリックスモデル中の転移性腫瘍細胞の遊走の抑制をすることが出来る。
モデルマトリックスを遊走する悪性西郷の距離の相対的変化は、融合タンパク質＋賦形剤の存在下での前記細胞の遊走の距離と、融合タンパク質が存在しない条件で対照群賦形剤の存在下での前記細胞の遊走の距離の違いに等しい。
先記相対的変化はパーセントで表されることができ、およそ１００％（転移細胞の遊走の完全な抑制）からおよそ５％の範囲にわたることができ、望ましくは１００％からおよそ５０％まで、より望ましくは、およそ１００％からおよそ７５％まで、最も望ましくは、１００％からおよそ９０％までの範囲である。０％の量は、最初の対照群賦形剤が最初の対照群賦形剤と同じ可能性のある第２の対照群賦形剤と比較されるとき観察されることができる。
１つの態様では、互いにアミノ酸配列において異なる２つの融合タンパク質ＡとＢの有効性の比較と、例えばそれらおのおのの、配列により強化される細胞膜細胞膜貫通のような、はＡ及びＢに起因する腫瘍細胞の抑制や遊走の割合の異なった観察結果を提供するかもしれない。抑制の相対的な違い（Ａによる１００％に対するＢによる８０％のような吸収率、またはＡはＢより良いと言ったような質的な違い）は腫瘍タイプは腫瘍タイプで同じことであるかもしれないし、腫瘍タイプと腫瘍タイプによって変わるかもしれない。
一つの態様では、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１種類の腫瘍細胞の転移の遊走を実質的に（１００％）抑制することができる。
他の態様では、この発明の融合タンパク質は、少なくとも２種類の腫瘍細胞の転移の移動を大幅に抑制することができる（１００％）。
一つの有用な分析評価は、人工基底膜（マトリゲル（商標））中を遊走する浸潤ガン細胞において観察された能力に基づく。この分析法では、異なるガン細胞タイプの能力の変化、おのおのは本発明の組成物とともに治療しない場合のマトリゲル（商標）中を遊走する異なった能力、および、異なった転移性浸潤は、本発明の融合タンパク質を０．１ｇ／ｍｌから１００ｇ／ｍｌの範囲の濃度または投与量に露出されることにより評価される。好ましい濃度範囲は、組織１立方センチメートル（ｃｃ）当たり約０．０００１マイクログラムの融合タンパク質から、組織１立方センチメートルあたり約１００マイクログラムである。
マトリゲル（商標）マトリックス（ＢＤバイオサイエンス社）はＥＣＭタンパク質が豊富な腫瘍であるＥＨＳマウス肉腫から抽出された可溶化された基底膜調合剤である。その主要構成要素は、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタク
チンである。室温で、（哺乳類の細胞基底膜に擬態することができる生物学上活性基材材を生産するＢＤマトリゲル（商標）マトリックスは重合し、生物学的に活性のあるマトリックス物質を生産し、それは哺乳類の細胞基底膜を模倣することが出来、ここで細胞はｉｎ ｖｉｖｏ環境と同様の方法でｉｎ ｖｉｔｒｏで振る舞うことが出来る。マトリゲル（商標）マトリックスは、生理的に関連した環境を細胞形態学、生化学機能、遊走または侵入及び遺伝子発現などの研究に提供することができる。
本発明（例えば配列番号４３）の融合タンパク質が、悪性細胞の表現型の複数の側面に影響を及ぼす事が出来るという挙動は、細胞を増殖、成長させることに強調する、トリチウム化されたチミジン編入をモニターすることによって示すことができ、そこで、媒体が細胞に持っていかれる、細胞培養培地に加えられたトリチウム化したチミジンは細胞に取り込まれ、各々の細胞がＤＮＡを合成するのに使われる、チミジン三リン酸塩プールの一部となる。
トリチウム化チミジンは、細胞の各々で、ＤＮＡ高分子に共有結合して取り込まれる。成長していない細胞、または、アポトーシスまたはネクローシスにより細胞死した細胞では、トリチウム化チミジンは細胞に取り込まれないか、又は、細胞溶解を通して細胞媒体に放出されることもない。
トリチウム化チミジン編入が、細胞成長、細胞分裂、細胞停止と細胞死に関する配列番号４３のような本発明の融合タンパク質の影響の全体的な尺度として使われることができる。配列番号４３が３Ｈチミジンの減少を誘導する細胞系は、ヒト子宮体がん細胞系ＨＥＣ １Ｂ、ヒト結腸直腸ガン細胞系ＣａＣｏ２、ヒト黒色腫ガン細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−２、及びＣＮＳガン細胞系Ａ−１７２を含む。
表６のデータは、本発明（配列番号４３）の融合タンパク質を含む組成物の投薬量の変化の影響を例示し、８つのヒトガン細胞系（ＨＥＣ １Ｂ、Ｃａｃｏ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−
１、ＨＴ１０８０、ＭＣＦ７、ＳＷ４８０、２９３Ｓ及びＡ１７２）にトリチウム化チミジンを編入した３つのヒトガン細胞の代表例を施す。配列番号４３の投与量は、１ミリリットルにつきおよそ１マイクログラムから、１ミリリットルにつきおよそ１０マイクログラム、１ミリリットルにつきおよそ５０マイクログラム（μｇ／ｍＬ）５０倍で変動する。
トリチウム化されたチミジンの編入によって測定された融合タンパク質（ＢＡ０７）の投与に関するヒト腫瘍細胞系の反応データ。
細胞系が示すこれらのヒト腫瘍が融合タンパク質の存在下で細胞増殖を減らしたことが予想外に観察される。表６は、１００％の対照群の値と比較した、成長のパーセントを示す。
腫瘍細胞系は、トリチウム化されたチミジン編入に関して３つの別々のグループに分けられることができる。配列番号４３を含む本発明の組成物はＨＥＣ １Ｂ細胞系においては
っきりした影響を示し、それは子宮内膜癌細胞系であり、１ｕｇ／ｍＬ未満の５０％の抑制集中（ＩＣ５０）に関連した増殖の抑制である。抑制に加えて、配列番号４３のより高い濃度で抑制を増やす投与量−反応の影響がある。
表６で示されるように、Ｃａｃｏ２とＳＫ−ＭＥＬ−１細胞系は、各々の細胞系の細胞にトリチウム化チミジン編入の低いレベルで明示されるように、融合タンパク質は細胞増殖に対する抑制的な影響を示す。
方法の例として、本発明の医薬組成物は、配列番号１０（３０ｍｇ／ｍＬの貯蔵液または希釈溶液）を、例えばフィブリン接着剤またはコラーゲンゲルのような組織接着剤である、生体内で治療的に許容できる基材を形成することができる流動可能なキャリア成分に混ぜることによって準備することができる。
１つの態様では、本発明の医薬組成物は、配列番号１０（３０ｍｇ／ｍＬの貯蔵液または希釈液）とキットの４つの構成要素を混ぜることによって準備することが出来る：
Ｔｉｓｓｅｅｌ（フィブリンシーラント）による
凍結乾燥されたトロンビン；
トロンビンを再結合する１ｍＬのＣａＣｌ２再結合緩衝溶液；
凍結乾燥されたフィブリノゲン；そして、
フィブリノゲンを再構成する１ｍＬの緩衝液。
フィブリンシーラントは、フィブリノゲン濃縮物、塩化カルシウム及びトロンビンの３つの基本的な構成要素を有している。他の構成要素を、ゲル構造の特性に影響を及ぼすために加えてもよい。
加えられた組成物は、溶解性組成物からフィブリンゲルが形作られるのに要する時間、形作られるタンパク質ネットワークのサイズとゲルの強度を調整するのに用いることが出来ても良く、そして、プロテアーゼ阻害剤は体に施された後、ジェルの除去を遅くする。
いくつかの異なる商業的な調合剤が、キットとして使われる。これらの限定されない例は、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ／Ｔｉｓｓｅｅｌ（Ｉｍｍｕｎｏ社、ウィーン、（現在バクスターによって上市されている））、Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ Ｐ（ヘキスト、西ドイツ）及びＨｅｍａｓｅｅｌ（Ｈａｅｍａｃｕｒｅ社、カークランド、ケベック）を含む。
フィブリンをゲル化させるために、可溶性トロンビンとフィブリノゲンは、塩化カルシウム存在下で混ぜられる。構成要素が混ぜられると、フィブリノゲン分子がフィブリンモノマーを形成するためにトロンビンによって裂かれるので、フィブリン接着性ジェルが形成される。フィブリンモノマーポリメラーゼは自発的にフィブリンの三次元ネットワークを形作り、凝固化カスケードの最期に共通の経路に擬態する反応、すなわちフィブリノゲンのフィブリンシーラントに転換する。商業的な準備に大切なことはフィブリノゲンとトロンビン成分を使用まで分けた状態で保つことである、そのため、重合化は体への適用の前か後に望ましいタイミングで制御することができる。
今日、生物学的接着剤としてのフィブリンのそのような使用は、広く受け入れられており、多くの外科的領域で応用例が見つかっている。ＨｅｍａｓｅｅｌまたはＴｉｓｓｅｅｌ ＶＨは、腹部の鈍いか又は深い外傷による、心肺バイパス及び脾臓損傷を含む手術の手術で、縫合、結紮と焼灼を含む従来の外科的技術によって出血を制御するとき、止血の添加物として使われる。これらのフィブリンゲル類の作用は、心肺バイパスと脾臓の修復を必要としている外科的手技において出血を止めるのにも用いられる。Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標） ＶＨは、人工肛門形成の終了の添加物として効果的なシーラントであることが示された。
上記及び、米国特許第 ７，１４１，４２８号で言及されるように、それらの全内容はこ
こに参照として取り入れられ、フィブリンシーラントはフィブリノゲン濃縮物、塩化カルシウム及びトロンビンの３つの基本的な構成要素を有する。他の構成要素は、塊り構造の時間と作られるタンパク質ネットワークのサイズに影響を及ぼすために加えられることができる。通常、構成要素が混ぜられるとき、フィブリノゲン分子がフィブリンモノマーを形成するためにトロンビンの作用を通して分解され、フィブリン凝塊は形成される。そして、重合化は自発的に、フィブリンの三次元ネットワークを作り、水素結合により大きく保持される。
これは自然血液凝固カスケードの最後の段階に相当し、凝固率は使われるトロンビンの濃度に依存する。抗張力を向上させるために、フィブリン鎖の間の共有結合クロスリンクはシーラント組成物中のＦａｃｔｏｒ ＸＩＩＩを含むことによって供給される。カルシウ
ムイオンの存在下、トロンビンはＦａｃｔｏｒ ＸＩＩＩａにＦａｃｔｏｒ ＸＩＩＩを起動させる。トロンビンと起動するＦａｃｔｏｒ ＸＩＩＩａは、フィブリンのクロス結合
に触媒作用を及ぼして、塊の強度を増やす。フィブリン塊の強度はフィブロネクチンの構成への追加によってさらに改善される。そして、フィブロネクチンがクロスリンクされて、作られるフィブリンネットワークに結合する。
傷治癒の間、塊物質は段階的な溶解を経て、完全に吸収される。フィブリン分解による早すぎるフィブリン塊の崩壊を防ぐため、フィブリンシーラント組成物はプラスミノゲン活性剤抑制剤またはプラスミン抑制剤（例えばアプロチニン）を含んでも良い。
そのような抑制剤は、フィブリノゲン組成物のあらゆる残存プラスミノゲンを原因とする線維素溶解活性を減らす。同様に、組成物はヒアルロン酸（または他のポリサッカライド）を含んでもよく、そして、これらは周囲の組織で常に存在するヒアルロニダーゼによってヒアルロン酸の酸成分の分解を防ぐ（すなわち、期間を延長する）ために、一つ以上のフラボノイド（または他のポリサッカライドのための対応する抑制剤）のようなヒアルロニダーゼ抑制剤を含んでも良い。ヒアルロン酸は、上記のように、クロスリンクされても良く市販されている、Ｈｙｌａｎ（Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ、Ｒｉｔｃｈｆｉｅｌｄ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡから入手可能な）。ヒアルロン酸組成物には、ゲル類、溶液、その他の形が例えばあるかもしれない。
フィブリン塊は薬学的に活性物質の投与に使われてもよい。薬、例えば抗生物質、成長因子等の薬剤を、その他を取り入れることによって、組織接着剤に、それは組織接着剤の使用に作られるフィブリンネットワークに入れられる。制御可能に組成物が放出されている間、薬が投与部位に保たれることがそれらによって確実とされる。
ヒトのプラズマフィブリノゲン／Ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩＩから準備されるフィブリンシー
ラント製品は、商業的に利用できる。１つの製品は、Ｔｉｓｓｅｅｌフィブリンシーラントと呼ばれている組織接着剤である（バクスターハイランドＩｍｍｕｎｏ社；Ｔｉｓｓｕｃｏｌ／Ｔｉｓｓｅｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏ社、ウィーン）。もう一つの製品は、Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ Ｐ（ヘキスト、西ドイツ）である。冷凍剤形のフィブリン接着剤の１例は、２
つの注射器システムで送達されるＯｍｒｉｘ（ニューヨーク、米国）製のＥｖｉｃｅｌ（商標）である。
１つの態様では、本発明の医薬組成物を形成する／送達するのに用いられるフィブリンシーラントはバクスターヘルスケア社によって製造される、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ、２コンポーネントフィブリンシーラント、蒸気過熱済みキット（ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ Ｆｉｂｒｉｎ Ｓｅａｌａｎｔ）である。ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨ フィブリンシーラントキットは、主な活性成分としてフィブリノゲン（密封剤タンパク質濃縮）とトロンビンを含む。
それは、また、塩化カルシウム溶液及びフィブリン溶解阻害剤溶液（アプロチニン、ウシ）を含む。２つの再構成要素、シーラータンパク質溶液及びトロンビン溶液を混ぜて局所的に投与した。シーラータンパク質溶液及びトロンビン溶液は弾力のある教会に迅速に固まる溶液である。トロンビンは、フィブリンに濃縮シーラータンパク質をフィブリノゲンに変える非常に特異的なプロテアーゼである。大部分のトロンビンは、形成されるフィブリンによって吸着される。過剰なトロンビンは、あったとしても、血液中でプロテアーゼ阻害剤によって不活性化される。線維素溶解阻害溶液（アプロチニン）は、フィブリンの早い分解を防ぐ多価プロテアーゼ阻害剤である。
本発明の医薬組成物を製剤し／送達するのに用いることができる他のフィブリンシーラントは、Ｃｅｂｕｓ（商標）、Ａｔｅｌｅｓ（商標）およびＰｒｏｌｅｕｓ（商標）（ＰｌａｓｍａＳｅａｌ社）；Ｖｉｖｏｓｔａｔ（Ｖｉｖｏｌｕｔｉｏｎ社）；ＣｒｙｏｓＳｅａｌ ＦＳ（登録商標）（サーモジェネシス社）；ＣｏＳｅａｌ（商標）（Ａｎｇｉｏｔ
ｅｃｈ社）；Ｄｕｒａｓｅａｌ（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ Ｓｕｒｇｉｃａｌ社）；Ｐｏｌｉ
ｐｈａｓｅ（登録商標）（アバロン メディカル社）；Ｂｉｏｇｌｕｅ（登録商標）（Ｃ
ｒｙｏｌｉｆｅ社）；Ａｖｉｔｅｎｅ Ｆｌｏｕｒ（商標）（Ｄａｖｏｌ社）；Ｄｅｒｍ
ａｂｏｎｄ（商標）（ジョンソン・アンド・ジョンソン社）；Ｈｅｍａｓｅｅｌ、Ｈｅｍａｓｅｅｌ−ＨＭＮおよびＨｅｍａｓｅｅｌ−トロンビン（Ｈａｅｍａｃｕｒｅ社）；Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ−Ｐ（登録商標）（アベンティス社）；Ｆｉｂｒｏｃａｐｓ（登録商標）（Ｐｒｏｆｉｂｒｉｘ社）；そして、Ｃｒｏｓｓｅａｌ（商標）、Ｅｖｉｃｅｌ（商標）とＴｈｒｏｍｂｉｎ（Ｏｍｒｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）である。
あるいは、本発明の方法と組成物で使われるてもよい他のフィブリンシーラントは、米国の特許で記述され、米国特許第ＲＥ３９，２９８号、米国特許第ＲＥ３９，３２１号、米国特許第４，４２７，６５０号、米国特許第４，４２７，６５１号、米国特許第４，４１４，９７６号、米国特許第４，６４０，８３４号、米国特許第５，２９０，５５２号、米国特許第５，６０７，６９４号、米国特許第５，７１４，３７０号、米国特許第５，７５０，６５７号、米国特許第５，７７３，４１８号、米国特許第５，９６２，４０５号、米国特許第５，９６２，４２０号、米国特許第６，１１７，４２５号、米国特許第６，１６２，２４１号、米国特許第６，２６２，２３６号、米国特許第６，７８０，４１１号、米国特許出願第２００５／０２７１６４６号、およびヨーロッパ特許第０ ８０４ ２５７号で、ここに示した全てが全て参照に取り入れられる。組織接着性製剤は米国特許第７，１４１，４２８号でも記述されている。そして、その全ては完全に参照によって取り入れられる。
これらの組織接着剤が例として名が挙げられるが、制限するものではない理解されるべきである。フィブリンまたはコラーゲンジェルのようなどんな薬学的に許容できる組織接着剤でも本発明の方法と組成物で使われるかもしれないと認識する必要がある。
Ｔｉｓｓｅｅｌ ＶＨの構成要素
Ｔｉｓｓｅｅｌ ＶＨは、４つの別々のバイアルに以下の物質を含む
１．（ヒト）密封タンパク質濃縮液、蒸気加熱済み、凍結乾燥
２．線維素溶解阻害剤溶液（ウシ）
３．トロンビン（ヒト）、蒸気加熱済み，凍結乾燥
４．塩化カルシウム溶液
蒸気加熱した濃縮シーラータンパク質（ヒト）は、プールしたヒトプラズマから作られる、無菌の、非発熱性の、凍結乾燥させた、蒸気加熱した粉の調合剤として製剤される。線維素溶解抑制溶液（ウシ）は、カリクレイン抑制剤３，０００単位（ＫＩＵ／ｍＬ）のプラスミンを含むプロテアーゼの阻害剤であるアプロチニン、を含んでいる無菌の、非発熱性の溶液として製剤される。フィブリン溶解阻害溶液中の凍結乾燥された濃縮シーラータンパク質の再構成後、生じたフィブリン溶解阻害剤溶液は以下を含む：
全タンパク質：１００ − ０１３０ ｍｇ／ｍＬ；
フィブリノゲン：７５ − ０１１５ ｍｇ／ｍＬ；
フィブリン溶解抑制剤：２２５０ − ３７５０ＫＩＵ／ｍｌ；及び、
賦形剤
蒸気加熱されたトロンビン（ヒト由来）は無菌の、非発熱性の、凍結乾燥、蒸気加熱した粉として、貯め置かれたヒト血漿より製剤された。塩化カルシウム溶液は、４０モル／ｍＬのＣａＣｌ２を含んだ、無菌の、非発熱性溶液として調整された。塩化カルシウム溶液中の凍結乾燥したトロンビンの再構成の後、結果としてトロンビン溶液は以下のものを含む；
トロンビン（ヒト）：４００ − ６００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ
塩化カルシウム：３６ − ０４４ ｍｏｌ／ｍＬ
賦形剤：表４参照
シーラータンパク質溶液とトロンビン溶液はそれから、ＤＵＰＬＯＪＥＣＴ Ｐｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎとＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎシステムを用いて結合され、あるいは、ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨフィブリンシーラントの用途のためＦＤＡによってクリアにされた同等物の
送達装置によりフィブリンシーラントが形成される。ＴＩＳＳＥＥＬ ＶＨフィブリンシ
ーラントは０．５、１．０、２．０と５．０ｍＬの４つの異なるキットサイズで供給される。そして、以下に明らかにされる構成要素が含まれる。
米国公認のプラズマ収集センターから得られるソースプラズマは、濃縮シーラータンパク質とＦＥＩＢＡバルクパウダーとしてトロンビンの開始材料を生産するのに用いられる。濃縮シーラータンパク質を得るために、ソースプラズマに由来する寒冷沈降物は、洗われ、緩衝液に溶かされ、濾過され、凍結乾燥される。フィブリン溶解阻害溶液は、バイエル社から得られる無菌の、非発熱性のアプロチニンバルク溶液から作られる。トロンビンはＦＥＩＢＡバルクパウダーを溶かして、プロトロンビンを活性化するため溶液を塩化カルシウムと共にインキュベートし、トロンビンにし、引き続き、限外濾過／珪藻土濾過、除菌濾過及び凍結乾燥が続く。塩化カルシウム溶液は、米国Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ＵＳＰ）にリストされる仕様に従って、塩化カルシウムから準備される。
濃縮シーラータンパク質及びトロンビンはプールされたヒト血漿から作られる。これらの製造において使われる二段階蒸気熱処理は、相当程度のウィルス減少が可能であることが示された。他のフィブリンシーラントが当業者に知られていて、本発明において使うことができる。例えば、フィブリンシーラントは米国特許第ＲＥ ３９，２９９等で記述され
ると、米国特許第６，１６２，２４１号、米国特許第６，７８０，４１１号、米国特許第５，７７３，４１８号、米国特許第５，２９０，５５２号、米国特許第５，６０７，６９４号、米国特許第４，４１４，９７６号（米国特許第４，４２７，６５０号と米国特許第４，４２７，６５１号）に記載され、参照によってここに取り入れられる。
本発明は、種々の態様で、以下の非限定的な例によってさらに例示される。
〔実施例１〕
マトリゲル分析評価実験
典型的なマトリゲル分析評価実験からのデータ、例えば配列番号８のように設計される融合タンパク質を含む医薬組成物の、血管新生に派生する毛細血管の長さへの効果に関する
データは、表７に要約されている。これらのデータは、ネットワーク形成が用いた投与量と剤形の状態下で、コントロール賦形材により生産される抑制に対しておよそ１３％〜２０％抑制される。ここで０抑制は１００％の成長を提供する。
血管形成に対するこの影響は、より高い融合タンパク質の投与量を用いることにより、そして、前記細胞をマトリゲルに添加するのに先立ち、配列番号８を用いてＨＵＶＥＣ細胞をプリインキュベートすることにより、強化することが出来る。
活性薬剤のアミノ酸配列に共有結合していて、活性薬剤のアミノ酸配列がＡＤＰリボース転移酵素活性を保っている輸送を助けるアミノ酸配列を含有する、本発明のポリペプチドを含む組成物の抗血管新生効果は、前記組成物を本発明の方法により投与した時、哺乳類宿主の網膜下の新生血管形成及び眼中の新生血管組織の増殖の速度を抑制するか、又は実質的に減少することに有用である可能性がある。
〔実施例２〕
配列番号４３及び配列番号１０の準備
配列番号４３はポリメラーゼ連鎖反応によって準備され、配列番号１０の製造のために、ｐＥＴ９ａベクターにサブクローンされる。２つのオリゴヌクレオチドは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（ストラタジーン）キットを使用し、部位特異的突然変異誘発法によりアミノ酸３−１７を削除するように設計した。ポリメラーゼ連鎖反応は、５０ｎｇのｐＥＴ９ａ−Ｃ３−バリアント、４２塩基の変異体プライマー：プライマー：２０２９Ｆ ５’−ＧＧ
Ａ ＧＡＴ ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＴＣ Ｇ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＡＴ ＡＣＴ ＴＡＣ
ＣＡＧ ＧＡＧ−３（配列番号１１）；および、プライマー、２０２９Ｒ ５’−ＣＴＣ
ＣＴＧ ＧＴＡ ＡＧＴ ＡＴＴ ＴＧＡ ＡＴＡ ＡＧＣ Ｃ＊ＧＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＴＡＴ
ＡＴＣ ＴＣＣ−３’（配列番号配列番号１２）を用いてサーモサーキュラーを用いて行った。シンボル（＊）は４５のヌクレオチド欠失が起こった接合点を示す。
ＤｐｎＩ消化は製造者の使用説明書に従ってされ、この製品の１μＬはＸＬ１−Ｂｌｕｅ
Ｓｕｐｅｒコンピテント細胞（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するのに用いられた。これらのプレートはそれから、３７℃で一晩中インキュベートされた。推定される配列番号１０のクローンが選択され、これらのプラスミドＤＮＡはＱｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ−Ｐｒｅｐキットを使用して増幅、精製された。精製されたプラスミドは、制限消化分析によって分析される。３候補のクローンからのＤＮＡは、Ｔ７及びＴ７Ｔプライマーを用い、ＢｉｏＳ＆Ｔ（Ｌａｃｈｉｎｅ、ケベック）で配列を決定された。変異体ＡＪＣ３１１−２は突然変異を含むことが確かめられ、そして、ＤＮＡはＢＬ２１（ＤＥ３）（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）細胞を形質転換し、研究細胞バンク（ＲＣＢ）に準備される。
精製された配列番号１０は、大腸菌から準備される。最初に、ブドウ糖を入れた．５Ｌルーリア培地のフラスコに、研究細胞バンク（ＲＣＢ）の２つのバイアルを接種し、一晩培養した。スターター培地を、１０倍に希釈し、各々５００ｍＬの成長培地が入るように８つのフラスコへ分けられた。フラスコは３７℃でインキュベートされ、１時間２０分後に、イソプロピルチオ−Ｂ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を配列番号１０の発現を増やすために加えた。更に４時間後に、細胞を遠心分離によって集菌し、使用まで−８０℃で保存した。
集められた培養液のサンプルの配列番号１０の含有量を分析した。次に、細胞を解凍し、一次回復を受けさせ、ここで、研究室スケールの工程で配列番号１０を生産するための一次回復とは、抽出緩衝液中の超音波処理である。
粗抽出液は、プラスに帯電したポリマーで処理し核酸を取り除き、硫酸アンモニウムで処理し若干のタンパク質を取り除き、量を減らした。過剰な塩は除去した。
タンパク質は、４つのクロマトグラフィカラムを通過させることによりさらに精製した。最終的な精製及び分離過程は、結果として精製されたタンパク質溶液（限外濾過を使うことが出来る）の濃縮、タンパク質溶液の濾過（例えば、タンパク質溶液を滅菌に有用な０．２マイクロメートルの濾過膜を通す）、無菌の管に溶液を施すこと、タンパク質溶液を凍結させること、タンパク質を粉の形で製剤化するために凍結したタンパク質を凍結乾燥することにより構成される。配列番号１０を精製した後、この融合タンパク質の、生産されたタンパク質、その純度、その力価、その生物学的活性（例えば神経突起成長に関するＡＤＰリボース転移酵素活性）を分析した。純度は、クーマシーブルーで染色されたＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて濃度を精査することにより測定した。配列番号１０の活性は、ＮＧ１０８細胞を用いて４時間の神経突起成長を見ることにより決定された。生物検定の手順は、配列番号１０を含む１分取量の緩衝液を用いて、４時間、ＮＧ−１０８細胞をインキュベーションすることを含む。同時、そうでなければ同様の生物検定がポジティブコントロールとして行われ、ここでは、配列番号８が配列番号１０の代わりに使われる。前記細胞はそれから、パラホルムアルデヒドで固定され、クレシルバイオレットで染色され、顕微鏡下で、そして、細胞体より長い神経突起を示した各々のウェルの細胞の割合（％）が測定された。各々のデータポイントは、３回測定した中から決定した。
〔実施例３〕
配列番号１０融合タンパク質の準備
配列番号１０は、細胞貫通Ｃ３細胞外酵素バリアント（配列番号４４）に由来する。配列番号４４は、発現を改良し、ＧＳＴ融合タグを除くために、ｐＧＥＸ−４ＴのベクターからｐＥＴ９ａベクターへ転換される。結果として生じるバリアント（配列番号４３）は、Ａｋｔａ ＥｘｐｌｏｒｅｒＴＭ（アマシャムＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、モントリオール
、ＱＣ）を使ってＦＰＬＣによって精製される。ｃＧＭＰ製造のための強力な方法を得るために、領域に誘導された突然変異生成は、Ｎ末端で痕跡的な残りを取り除き、プロテアーゼに敏感な残りを除くために使用され、配列番号１０を得る。
配列番号４４または１０は、当業者に知られている標準的な技術を使用して精製される。例えば、配列番号４４または１０は、４Ｌのフラスコで成長する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で発現する。ＩＰＴＧによる誘導の後、細胞は超音波処理により抽出され、ポリエチレンイミンと硫酸アンモニウムで沈殿するあるいは、濾過し、核酸の大半を取り除いた。溶解物は、中性ｐＨでＳＰＸＬコラムを通した。抽出したバリアントは、このステップの後、８５％以上の純度であることが分かった。更なる不純物の除去は、ゲル濾過（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ７５、アマシャムバイオサイエンス社、モントリオール、ＱＣ）と陰イオン交換ステップ（Ｑ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、アマシャムバイオサイエンス社、モントリオール、ＱＣ）によって達成される。最終的な精製ステップは、除菌濾過に引き続く限外濾過によってなされる。
精製された画分は、−７０℃で保存される。Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓ
ａｔｅ分析；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ ＱＣＬ−１０００キットによって評価される残
留エンドトキシンは、２ＥＵ／ｍｇより低濃度である。タンパク質濃度は、ＵＶ分光学（Ａ２８０）又はブラッドフォード反応（クーマシー（登録商標）プラス試薬、ピアス社）を使って評価され、タンパク質完全性及び固有性は、還元剤の追加の有無にかかわらず、４−１２％のアクリルアミド勾配ゲル（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−トリス；ｉｎ ｖｉｔｒｏゲン、バーリントン、オンタリオ州）のクーマシー染色を使用して確立される。バリアントのグリコヒドラーゼ活性は、ＮＡＤのＡＤＰリボースとニコチンアミドの間の切断を定量化する蛍光分析評価で測定される（ＬａｓｋｏとＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ、２００６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４０６：５１２−５２０）。神経細胞成長活性は、ＮＧ−１０８細胞を用い、神経突起成長分析評価によって評価される。
〔実施例４〕
血管形成の抑制の決定のための一般的な方法
図３３を参照し、新しい血管の形成は、基底膜（Ｍａｔｉｇｅｌ）の基盤の存在下で、成長する内皮細胞による細胞培養モデルにより研究される。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、トリピニゼーションによって貯蔵培養液収集され、ＥＢＭ−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、ＦＢＳ、ヒドロコルチゾン、ｈＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、ＧＡ−１０００、ヘパリンを含む成長培地中に再懸濁される。マトリゲル（商標）（１２．５ｍｇ／ｍＬ）は４°Ｃで解凍され、そして、５０ｍＬのマトリゲル（商標）は９６穴プレートの各々のウェルに加えら、そして、３７℃で１０分間固化される。１５，０００の細胞／ウェルの濃度の成長培地中の細胞が各々のウェルに加えられ、６時間付着させる。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の本発明の融合タンパク質（例えば配列番号８）は１０ｍｇ／ｍｌくらいでウェルに加えられ、そして、他のウェルにはＰＢＳはコントロールとして加えられる。培養組織は、更に６〜８時間成長させておかれる。チューブの成長は５０Ｘの倍率で顕微鏡検査によって視覚化されることができ、そして、毛管のネットワークの平均長さはノーザンエクリプスソフトウェアを使用して定量化される。この発明（例えば配列番号８）の融合タンパク質によるマトリゲル（商標）分析評価の細胞の処理は、管形成（図３３を参照）を減らす。
〔実施例５〕
凍結乾燥製剤
薬学的に許容できる緩衝塩を含むに溶かしたおよび／またはすぐに水に溶ける薬学的に許容できる炭水化物（望ましくは薬学的に許容できる非還元糖またはシクロデキストリン）を含む、薬学的に許容できる等張性水性媒体に溶解した、配列番号８のような融合タンパク質を含む本発明の組成物の１投与量を含む溶液は、無菌状態下で無菌濾過され（例えば０．２ミクロンフィルタによって）、濾過水は滅菌された小びんに置かれ、濾過水は凍結され、凍結水溶液は、薬学的に許容できる凍結乾燥装置で減圧され無菌的に凍結乾燥され、融合タンパク質を含んだ乾燥マトリックスは小びんに放置され、小びんは無菌の不活性気体の下で大気圧に戻され、小びんは無菌のストッパー（例えば波形キャップと共に）で封をされる。密封された小びんはその内容と投薬量についてのラベルが付けられ、単位剤形として溶液に融合タンパク質マトリックスを再構成するために凍結乾燥された融合タンパク質が入っている最初の小びんに移すのに必要な量で注射のために滅菌された水が入っている第２の密封された無菌の小びんと共に、キットに置かれる。もう一つの態様では、融合タンパク質は高緊張の水性媒体から成る水性媒体の初期量、不毛な濾過される解釈、小びんに満たされる濾過水に溶かされることができて、乾燥基材を形成するために凍結乾燥されることができる。この乾燥基材は、素より多い無菌水（静脈注射や注入によって例えば注射の等張性溶液をつくるのに十分なより大きなボリューム）量で溶かされることができるか、再構成されることができる。あるいは、高緊張の溶液がかなり薄められるように、高緊張の溶液が等張性水性媒体のより大きな量が入っている点滴バッグへの注入により投与に使うことができる。任意で、単位剤形にマトリックスを再構成するために適当な量で無菌の水量が入っている小びんは、凍結乾燥されたタンパク質によるキットとして配布される。望ましくは、再構成された構成は、等張性溶液を含む。融合タンパク質は静脈配達や注入のために使われることができ、および／またはこの製剤で目に組織の近位または組織に、注射により送達することができる。
〔実施例６〕
この発明の融合タンパク質の網膜の相対的な細胞保護能力を決定する一般的な手順
視覚のシステムでは、網膜神経節細胞は、視神経損傷の後細胞死を起こす。損傷の割合（すなわち死ぬ細胞の数）、そして、細胞死の率は、軸索損傷の目への近さに依存する。ＲＧＣ生存に関してのＲｈｏの不活化の結果を検査のために、Ｃ３転移酵素（配列番号８と配列番号４３）の２つの細胞膜を透過している派生物（すなわち浸透性細胞膜）が使われる。同様に、配列番号１０（図３）またはＰＥＧ化したＢＡバリアント（４Ａと４Ｂ図）のトランケート・バージョンを使うことができる。
ラットは、２−３％のイソフルレン下で麻酔された。ＲＧＣｓは、フルオロ・ゴールド（フルオロクローム社、デンバー、コロラド）で、上丘から逆行的にラベルされた。ラットの右中脳は骨に小さな円形の穴を作ることにより露出し、そして、皮質の吸引、上丘の上に横たわる軟膜物質の除去が続く。Ｇｅｌｆｏａｍの小さな部分は２％のフルオロ・ゴールドを含む水性媒体に浸され、そして、１０％のＤＭＳＯは右の上丘の表面に投与される。フルオロ・ゴールド投与の７日後に、左の視神経は、目から１ｍｍの所で横に切断される。視神経は外科手術的に軌道骨の上縁をおおっている皮膚の切開を作ることによって眼窩の中で接続される。そして、眼窩上静脈を無傷のままにするように注意する。局所的な切除または涙腺の反転の後、上外眼筋は、後引筋とともに露出され、６−０で絹縫合される。
視神経は露出され、そして、視神経を露出させている間、周囲の鞘は血管を切ることを避けるために縦に切られる。視神経軟膜は傷つけられ、視神経はそれを取り除くために穏やかに動く、それから、はさみは目から１ｍｍで綺麗に切除するために視神経の下にわずかに触れる程度にすべり込ませられる。サイトカインレベルの研究のために使われる動物において、ミクロクラッシュ障害が使われる。これらの研究のために、軟膜は無傷のままにされ、そして、視神経はさやから持ち上げて出されて、６０秒の間１０．０の縫合を持って締めつけによって眼球から１ｍｍで押しつぶされる。
麻酔された動物は、視神経を切断した直後と４日後に、水性緩衝液中の配列番号８または配列番号４３の一回の注射を受けた。眼内注射は、ガラスのマイクロピペットに付けられた１０μｌの注射器でなされた。穴は、視神経円板からおよそ４ｍｍの上鼻網膜で、５μｌの融合タンパク質（例えば配列番号４３）または緩衝液対照群を注射するためのガラスのピペットの導入の前に、３０ｇの針で作られた。針は、硝子体スペースに溶液の散布をさせるために、ゆっくり撤収される。強膜は、それから組織接着剤（Ｉｎｄｅｒｍｉｌ、Ｔｙｃｏ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ、マンスフィールド、ＵＳＡ）で封をされる。世話は、白内障形成とＲＧＣｓの結果として生じる増加した生き残りを避けるために注射の間、レンズに損傷を与えないためにされる。皮膚は閉じられ、そして、網膜脈管構造の健全性は術後検眼鏡検査によって検査される。傷つけられた脈管構造のラットまたは白内障のラットは、実験の結果に含まれない。
フルオロ・ゴールドでラベルした網膜は、軸索切断の７または１４日後に数える準備ができる。動物に４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を注ぎ、そして、それらの目は角膜穿刺の後、取り出されて、４％のＰＦＡで後固定される。目は、それから、１時間、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ですすがれる。切り傷は４つの網膜四半部で各々の目でなされ、そして、網膜は取り出されて、ガラスの滑り面に平らに載せられる。過剰な硝子体は、紙芯で離れて吸い取られる。カバーグラスはマウントした網膜の上のスライドに置かれ、そして、ＲＧＣｓが紫外線吸収フィルター（３６５／４２０）で調べられる。
ラベルされたＲＧＣｓは、０．１１２５ｍｍ ｘ ０．３７５ｍｍの長方形のフィールド領域を提供するため、顕微鏡の１つの目の視野で、長方形挿入物を用いて、２０Ｘ拡大の顕微鏡の下で数えられた。網膜の４つの標準的な長方形の領域は、ディスクから１及び２ｍｍで数えられる。各々の領域のラベルをつけられた細胞の数は０．０４１２５（長方形の領域をｍｍ２で数えた）だけ分けられ、そして、各々の網膜のための平均密度はＲＧＣｓ／ｍｍとして計算される。細胞数は、同じ調査者ブラインド治療へ導かれる。軸索切断の後、フルオロ・ゴールドは内皮細胞とミクログリアル細胞にも存在する。これらの形態学によって同定される細胞は、ＲＧＣのカウントを実行される。統計はＥｘｃｅｌで実行され、そして、治療を受けた動物からの結果はＴ−テストによって対照群の結果と比較される。
ＦＰＬＣ精製された配列番号８の一回の注射は神経保護的であり、軸索切断の７日後のすべてのＲＧＣを救出し、そして、ＦＰＬＣ精製された配列番号４３の一回の注射は神経保護的であり、軸索切断の７日後のすべてのＲＧＣを救出する。配列番号４３注射の後のＲＧＣ細胞生存がそのＲｈｏリボース化活性以外の配列番号４３の特性のため、増加されるかもしれないかどうか決定するために、配列番号６の影響は、ＲＧＣ細胞生存に関してテストされる。変異体タンパク質（配列番号６）はＦＰＬＣによって精製され、そして、配列番号４３のために使用される方法で軸索切断の直後に１ｕｇの注射がされる。配列番号６の管理の後の細胞生存数は、単独で軸索切断の後で細胞生存数とかなり異ならず、配列番号４３の影響と、かなり異なる。したがって、他の影響（データは示されず）以外から、配列番号４３の神経保護的な活性は、Ｒｈｏ融合タンパク質とこのように不活化でＡＤＰリボース転移酵素の存在による。
虚血は、食塩水の眼内注入によって眼圧を上げることにより、アルビノのルイスラットの網膜でもたらすことができる（ＵｎｏｋｉとＬａＶａｉｌ（Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ． ｓｃｉ． ３５：９０７、１９９４）。ＲＧＣｓの生存率は、先に述べたように、網膜全載標本で逆行的にフルオロゴールドでラベルされたＲＧＣｓを数えることによって評価することができる。
〔実施例７〕
緑内障モデルのＲＧＣｓの神経保護
神経保護治療としてのＲｈｏ不活化の有効性は、緑内障の臨床前モデルで試験されることができる。例えば、ケーシーＥｙｅ研究所（ポートランド、オレゴン）でＪ．モリソン博士と協力者によって開発されるブラウンドブラットの眼性高血圧のモデルのような、目の高血圧動物モデル（それは多くの類似点をヒト緑内障と共有する）を使うことが出来る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．， ６４： ８５−９６）。眼圧（ＩＯＰ）は、目の内側の液圧の測定値である。この流体（水様液と呼ばれている）は、循環して、それから特別な流出経路を通して排出される。排水システムがきちんと機能しないならば、緑内障の一般的な形の場合のように、目の内側の圧力は高まる。モリソンモデルは強膜上の静脈に高張の食塩水の注入を含む。そして、水様液流出経路の封鎖に至る。この手順は、目圧の段階的な増加とＲＧＣｓの進行的な死につながる。重要なことに、内部の網膜萎縮、視神経退化と改造することがこのモデルで観察した視神経乳頭は、ヒト緑内障で観察されるものと類似しているということである。このように、モリソンモデルは、齧歯目における緑内障（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２１７−２４０）の最高の臨床前モデルと考えられる。
モリソンモデルは、本発明のＣ３変形が緑内障でＲＧＣ保護を提供するかどうか決定するのに用いられることができる。例えば、本発明はまたは食塩水（対照群）のポリペプチドは、目の高血圧手術に被療者の目の硝子体細胞に注射することができる。注射の後で生存したＲＧＣｓ数は、ポリペプチドが緑内障の目の高血圧ラットモデルでかなりのＲＧＣ神経保護を与えるかどうか決定するために数えられることができる。
〔実施例８〕
光受容体退化のラットモデルで光受容器細胞死を防ぐ有効性を計る手順
動物の取扱いは、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅのカナダの会議のガイドラインに従った。動物は、水と食物を自由に摂取させ、１２時間の明暗サイクル下に置かれた。成体の病原性のない雄と雌のスピローグ−ドーリーラット（８週）が使われた。手術の日に、外科的なチームが治療群に対して盲目的にされる間、動物はそれぞれのグループをランダム化した。術後治療は、再水和のために、皮下に０．９％の食塩水を含む（疼痛管理のためのＢａｙｔｒｉｌと感染を防ぐためのＢｕｐｒｅｎｅｘ）。日毎の点検は、膀胱機能評価と膀胱昨日不全評価を含み、椎弓切除場所の感染の所見と自己消耗の存在の検査がされた。当初研究に割り当てられる動物のどれも、分析から除外されなかった。
ラット（スピローグ−ドーリー）は、右目後眼房に５μｌの食塩水を、または、左目後眼房に５ｕｌ（１ｇ）の配列番号１０をハミルトン注射器／毛細管を使って注射した。注射の後で、ラットをケージに置いて、１または２日の間、恒常的な光（２０００ルクス未満）を浴びせた。アトロピンを日に一度、または、露光期間の間に必要に応じて投与した。ラットは、それから、普通の飼育施設に戻され、さらに５日から７日の間飼われた。両目は集められ結合組織から切り取られ、ブアン液で２４時間固定され、それから、パラフィンに封埋され切片化された。光受容体は、Ｈ＆Ｅ染色（図６）を使用して可視化された。光処理により光受容体を破壊する効果は、受容体層の実質的な薄層化として、中央のパネルで明らかに示される。配列番号１０の対応するレスキュー効果は、１μｇの配列番号１０（右側パネル）で治療された動物において、光受容体細胞の数の増加と結果として生じるより厚い層から明白になる。
光受容体細胞のレスキューは王立軍医大学（ＲＣＳ）のラットで示さた。これらのラットは網膜変性を遺伝的に引き継ぐ（Ｆａｋｔｏｒｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４７：８３， １９９０）。水性緩衝液中の配列番号８の眼内注射は、１０μｌの注射器をガラスのマイクロピペットに付けてなされる。ガラスピペットを導入し１μｇの配列番号８または緩衝液対照群の５μｌを注射する前に、穴は上鼻網膜の視神経円板からおよそ４ｍｍの所に、３０ｇの針を使って作られる。針は硝子体スペースに溶液の拡散をさせるためゆっくり引き抜かれ、そして、強膜は組織接着剤で封をされた。レンズの損傷が白内障形成およびそれに伴うＲＧＣｓの生存率増加を引き起こす可能性が有るので、注射の間、レンズに損傷を与えないように注意される。皮膚は閉じられ、そして、網膜脈管構造の完全性は術後検眼鏡検査によって評価される。障害の起きた血管系を有するラットや白内障を起こしたラットは実験結果に加えなかった。
治療的に治療された、又は無治療のＲＣＳラットの光受容体生存率の評価に役立つ組織学的分析は、麻酔された動物の血管かん流、動物の目のパラフィン包埋、ヘモトキシニンとエオシンによる、または、トルイジンブルーによる厚さ６ミクロンの薄片の染色、のステップからなる。生後５３日の無治療のＲＣＳラットの目で（Ｐ５３）、光受容体細胞を含む外核層は、僅か数層の細胞の厚みが減少した（同じ年齢の通常のラットに見られる厚みのおよそ２０％）。硝子体内投与による配列番号８の治療効果のある投与量（例えば１マイクログラムのタンパク質を含む一回の注射）は、外核層の厚みを復元し、従って、光受容体細胞をレスキューする。
あるいは、ＬａＶａｉｌら（１９９２， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９： １１２４９）の手法の後に、１週間の恒常的な光（１１５−２００フートキャンドル）に暴露したモデルで２〜３ヵ月齢の雄のスピローグ−ドーリーラットを用いて、光受容体細胞のレスキューを示すことができる。配列番号８の水性緩衝液（１ｕｇのタンパク質）は、連続照明の始まりの４８時間前に、網膜下領域に、または、硝子体液に注射されることができる。固定された回復期（通常１０日）に引き続き、組織学的試験と分析が、光受容体細胞の細胞死または損傷、およびレスキューまたは生存率を評価するのに用いられることになっている。
網膜剥離もまた光受容体細胞の細胞死を導く。Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９２， Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， １０８： １４８）によって記載された動物モデルは、ＡＤＰ−リボース化活性を除くように変異されたタンパク質および未処理の対照群の緩衝液対照群の投与と比較して、配列番号８の投与の影響を示すｉｎ ｖｉｔｒｏの網膜細胞の生存率を強化することが出来る。
〔実施例９〕
本発明の融合タンパク質が光受容体変性したトランスジェニックマウスモデルにおいて光受容体の細胞死を防ぐ効果を計測する手順
配列番号１０が網膜神経節細胞に対し神経保護作用があることが示されたように、その神経保護作用の性質は遺伝性網膜変性マウスモデル（ｒｄ）を使っている網膜ニューロンの上でよく研究されている。色素性網膜炎患者に見られるものと同様の遺伝子突然変異を内包するこれらのモデルは、進行性の光受容体細胞損失を示す。これらのｒｄモデルはヒト黄斑変性症において観察される多因子的な性質の変化（例えばドルーセンの蓄積）を示さないが、これらの動物モデルは光受容体治療後の生存率に関しての洞察を提供する。Ｒｄ１突然変異のためのホモ接合のマウスは、錐体光受容体で発現されるｃＧＭＰホスホジエステラーゼのベータサブユニットをコード化しているＰｄｅ６ｂ遺伝子の突然変異により、初期の網膜変性発症を有する。この突然変異は細胞体で第２のメッセンジャーｃＧＭＰの蓄積につながる。そして、これはアポトーシスの細胞死を誘発する。Ｒｄ１マウスにおいて、４週未満間の外核層の完全な消失において、変性は出産後７−９日（Ｐ）ごろ始まる（Ｃｈａｎｇら， ２００２）
グループにつき４匹のマウスに対し、配列番号１０を異なる投与量（０．００１〜０．１ｇ）で右目に二回（出産後の日７と出産後の日１４に）注射し、そして、組織を２１日目に集めた。すべての左の目には食塩水またはＢＡ−３０４（ヌクレオチド配列は、配列番号８０と一致し、；アミノ酸配列は、配列番号８１と一致する；酵素は不活性な変異体）を注射し、外科手術コントロールとして用いた。
図７の結果は、出生後２１日の０．０１μｇのグループのマウス網膜（網膜の中心、中間、周辺）の３つの部位における細胞濃度（平均１００ミクロン長以上）を表す。予想通りに、出生の３週間後に供給されたＲｄ１マウスには、極めて少数の光受容体が残った。外核層（ＯＮＬ）は１層に減少し、そして、外の部分は大部分の動物でほぼ消失した。変性は、網膜を通して非常に均一で、通常のマウスでおよそ２００であるのに対し、ＯＮＬにおいて１００ミクロン長につきおよそ１７の光受容体核が存在した。Ｒｄ１マウスのアポトーシスの始まりの前に０．０１ｇの配列番号１０によって治療することは、網膜のすべての領域において光受容体をレスキューした。神経保護の効果は、網膜周辺でより劇的であり、光受容体生存率を約５０％増加させる。０．００１ｇ未満の投与量および、酵素的に不活性な変異体ＢＡ−３０４（配列番号８１）について保護効果は観察されなかった。０．１ｇの投与量による更なる効果は得られなかった（結果は示していない）。
活発な変性（Ｐ１３−１６）の期間における、配列番号１０の短期的な保護効果が調査された。図８は、０．０５ｇの配列番号１０の１回注射を受けた目において、増加した外核層（ＯＮＬ）の厚さを持つ、同じ動物の網膜の代表的な写真を表す。
光受容体の生存率をアポトーシスの範囲に関連させるため、光受容体数（図８）のために使われる同じ動物のスライドも、ＯＮＬでアポトーシスの範囲を評価するために染色した。１００ミクロン長のＴＵＮＥＬのラベルした光受容体の総数は、数えられて、９Ａ、図に示された。
配列番号１０を注射されたマウス網膜のすべての領域で、アポトーシスを起こした細胞数の顕著な減少が、観察された（図９Ｂ）。
Ｒｄ１マウスの結果は見込みが有り、厳格で速い網膜変性の動物モデルとして、抗アポトーシスの影響を伴う光受容体の神経保護作用を示す。前記疾病の退化の経時変化は、Ｐ１４のあたりのアポトーシスのピークでよく知られている。配列番号１０をピーク期間に注射すると、アポトーシスを起こした光受容体の数は網膜全体を通して約４０％減少する。注射の３日後に検査された全てのマウスにおいて、ビヒクル（生理的食塩水）を注射した対照群の目と比較して、配列番号１０の処理をうけた目は常に、より多くの光受容体の列から出来たより厚いＯＮＬを提示した。退化が活性化している段階のＲｈｏの不活性化は、この厳格な網膜変性モデルで、光受容体のアポトーシスの細胞死を遅くした。
ここで提示される結果は、配列番号１０がいくつかの面白い生物学的活動を示すことを証明する。光受容体アポトーシス抑制と組み合わせられるその強い抗血管新生効果は、ヒト黄斑変性症患者のための、視力の延長につながる可能性が有る。
光受容体退化のいくつかのマウス遺伝子モデル（例えばペリフェリンのｃＧＭＰ フォス
フォジエステラーゼｒｄｓ変異体のβサブユニットのｒｄ変異体）は、上記の投与方法を使用するとこができ、融合タンパク質に関連する（例えば、配列番号８に関連する）光受容体細胞が生体内で生存率を強化する効果を証明するために使用されることができる。
Ｒｄ変異体マウスとｒｄｓ−変異体マウスは、出生の後、２、３週以内に網膜変性を示す。先に述べたように融合タンパク質（例えば配列番号８）の硝子体内注入の後で、組織は上述の組織学的方法によって分析される。
配列番号８を含有する培地で培養されるｒｄ−変異体マウスからの網膜外植片は、Ｃａｆｆｅら（１９９３， Ｃｕｒｒ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．， １２： ７１９）に記載された方法を使用して、外核層の厚みを分析した。このように、マウスの子は出生の４８時間後に細胞核を取り除かれて、プロテイナーゼＫで処理された。この酵素処理の後、網膜色素性上皮（ＲＰＥ）に付属する神経網膜は回復し、マルチウェル培養皿に入れられ、１．２ｍｌの培養基（例えばＲ１６）の中で５％のＣＯ２のもと３７℃で４週間までで暖められる。固定された（例えば４％のパラホルムアルデヒド）切片のオプシンの免疫細胞化学的な染色は、光受容体細胞の変性とレスキューを評価するのに用いられる。ｒｄ−変異体マウスにおいて、外核層（光受容体細胞）は培地において２〜４週後に変性された。培地は、網膜細胞機能（例えば変性からの外核層のレスキュー）に対する影響を成し遂げるために、配列番号８の投与範囲で補われることができる。生存率効果は、上述のモデルで分析される網膜部分の上でＴＵＮＥＬ法を使用して示されることもできる。
〔実施例１０〕
融合タンパク質の網膜の新血管形成を防ぐ有効性を決定する手順
細胞培養分析評価において観察された試験管内の血管抑制作用影響を確かめるために、異なる動物モデルで配列番号１０の目の血管形成をテストされた。調査された最初のモデルは、生まれたばかりのラットの網膜生理的血管形成である。ラット網膜は生まれた時に無血管であり、そして、血管抑制作用薬可能性を評価する機会がある。
出生後４日に同じラットの、一方の目に配列番号１０が注射され、その間、不活性な種類のタンパク質であるＢＡ−３０４（配列番号８１）が反対側の目に注射された。配列番号１０を硝子体内へ０．１ｇで注射した後は、目に不活性タンパク質（図１０）を注射される時に比べ、ラットの子の網膜で顕著に生理的血管形成を妨げた。より低い投与量は血管新生の範囲を減少させなかった、そして、配列番号１０の治療により、網膜血管の周皮細胞被覆率は変わらなかった（結果は示していない）。
病理学的血管形成でＲｈｏ不活化の結果を調査するために、Ｃ５７マウスでアルカリ火傷によって角膜新血管形成を誘発した。動物は、ＢＡ−３０４（配列番号８１）または配列番号１０を生理的食塩水と共に、損傷後３日から８日の間、３回、局所的に投与した。通常、無血管の角膜への新しい血管の侵入は、すべての負傷したマウスで起こった（図１１）。しかし、２μｇ／μＬの度重なる配列番号１０の投与により、角膜の新血管形成がされた領域は顕著に減少した。不活性なタンパク質であるＢＡ−３０４（配列番号８１）は血管の発達に対し全く影響は無かった。
脈絡膜の新血管形成は、ＡＭＤを伴う患者の中心視力損失の大きな原因である。傷ついた領域において、局所的に生じた血管形成要因（例えばＶＥＧＦ）の増加に応じて、血管は網膜下の空間と同様にブルッフの膜とＲＰＥの間で成長する。配列番号１０の使用が目の血管形成の抑制剤として機能するという、原則の証明を完了するために、レーザーによって誘発されたブルッフの膜の断裂が用いられた。この方法は、脈絡膜に端を発する新血管形成の非常に信頼できるモデルを提供する。レーザーによる衝撃は４匹のマウスの両眼に施され、そして、３日後に配列番号１０は右目に注射され、その間、左目には同じ量の不活性タンパク質が投与された。最大限の新生血管反応を含んでいる領域の写真はそれぞれの衝撃ごとに撮られ、そして、血管新生の領域は損傷後１０日後に測定された。
テストされた２種の投与量（１μｇ及び０．２μｇ）において、同じ動物へのＢＡ−３０４（配列番号８１）注射と比較して、配列番号１０は顕著に、レーザー光凝固によって誘発される網膜下血管成長を阻害することが図１２において示される。１μｇで処理された同じ動物の両眼の障害の代表図は図１２に示される。
配列番号１０が前臨床研究で使われるすべてのモデル（ラットとマウス）で血管形成を妨げたので、内皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの研究からの結果はこのように動物モデルで裏付けられた。網膜下の新血管形成の抑制は、配列番号１０が網膜を透過し、脈絡膜血管が発達する領域に達することを明らかに示唆する。さらに、それは一回の投与の後、目で病理学的血管形成に対する、強力で持続された効果を示す。
抑制されていない網膜血管形成は、滲出型黄斑変性症の病理学の一因となりえる。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）生産は網膜の低酸素症によって増加し、そして、網膜の新血管形成はそれによって誘発される。
虚血により誘発された網膜新血管形成のマウスモデルは、出産後齢（Ｐ）７日から１２日の間、哺乳親のもとで、７５％のＯ２にさらされ、その後通常空気中に戻された、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用する。これを達成するため、マウスはＰ７日に体重を測定した後、５日の間、十分な食物と水を備えた酸素室としての役目を果たす、プレキシガラスボックスの中に置かれた。この箱の酸素流速は、５日の間、１．５Ｌ／分で維持した。流速は、１日２回ベックマン酸素分析器（モデルＤ２、アーヴィン カルフォルニア州）を用いて確認した。前記酸素室は、５日間の過酸素環境の間、開かなかった。融合タンパク質（例えば配列番号８）の眼内注射はＰ１２日に実行され、そして、マウスは外気へ移され、それによって低酸素症を誘発する。Ｐ１７日において、マウスは生理的食塩水を用い、引き続き４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦ）を用いて心かん流を施され、そして、それらの目は取り出されて、一晩ＰＦで固定される。その後、両目はすすがれ、段階的なアルコールシリーズ中を通され、それから、放射断面を６μｍの厚さで切断した。視神経頭を通過する断片は、過沃素酸／シッフ試薬とヘマトキシリンで染色される。網膜を通過する３０ｕｍ離れた切片から３００ｕｍのスパンは、評価される。内部を規定する膜の前方の全ての網膜脈管の核は、各々の切片に於いて数えられる。１０の数えられた切片の平均は、新生血管核の数の平均を与えるように一つの目につき一つの切片で決定される。
通常の、操作されていない動物では、制限膜前部の脈管細胞核は観察されない。融合タンパク質の投与は、融合タンパク質がない場合観察される数と比較して、大幅に網膜脈管核の数を減らす。
〔実施例１１〕
配列番号４４または配列番号４３の硝子体内注射は、視神経の再生を刺激する
ＲＧＣ細胞体の治療が生体内に再生を進めるかどうか調べるために、Ｒｈｏアンタゴニストを、視神経円板の１ｍｍ後方における視神経の微細病変の直後に、硝子体に注射してもよい。初の実験で：配列番号４（ｎ ＝ ４）が用いられる。対照群の動物はＰＢＳ注射（ｎ ＝ ５）または微細病変（ｎ ＝ ５）だけを受ける。視神経の軸索再生は、順行性トレーサーＣＴβの注射の後、１４日後に評価した。
微細病変の２週後、実質的に、対照動物（１３Ａ図）においてＣＴβ陽性の軸索は検出されず、多数の軸索が配列番号４４（図１３Ｂ）および配列番号４３で処理したラット（１３Ｃ図）で損傷部位を通して見える。微細衝突損傷モデルは空洞現象を提供せず、明らかに確定した損傷部位を提供し、そして、損傷部位は暗視野顕微鏡検査および／またはＣＴβ染色によって確認される。損傷部位を通過する種々の距離に存在する軸索の数が、それから数えられる。
配列番号４４（図１３Ｄ）または配列番号４３（図１３Ｅ）で処理された動物は、損傷部位から５０、１００と２５０のμｍの距離で、各切片につき対照群よりかなり多くの再生した軸索を有する。配列番号４３を注射された動物の再生は配列番号４４の治療をうけた動物のそれと類似しており、より非常に精製された配列番号４３（１３Ｃ図）で扱われる何匹かの動物のより長い軸索のより大きな数が観察される。配列番号４４は、微細病変形成の４週間後に再生を評価するのにも用いられる。治療が軸索成長に持続する影響を及ぼすかどうか調べるために、処理された視神経の、軸索切断の２週間および４週間後の、最も長い軸索の平均長を、比較することができる。軸索長に関する有意差は２週目と比較した４週目に見つけられておらず（データは示していない）、一回の治療では継続された長期の成長にならないことが示唆された。目で注射の後、配列番号４３の局在性を調べるために、視神経の微細病変形成の後の目に５μｇの配列番号４３を注射した。網膜と視神経のホモジェネートは、３日後のウエスタンブロットのため準備され、抗Ｃ３抗体でプローブされた。隔離されたレーンに通すことにより、配列番号４３特異的バンドは、（組み換え型配列番号４３タンパク質と比較された（データは示していない）。
〔実施例１２〕
配列番号４３による遅れる治療は、障害傷跡を通して再生を刺激する
配列番号４３による遅れる治療が障害傷跡を通してＲＧＣｓの再生を刺激するかどうか究明するために、配列番号４３を視神経の微細病変形成の４日後、硝子体に注射し（ｎ＝８）、そして、再生の度合いを１０日後に調べた。対照群動物には、ＰＢＳ（ｎ＝５）を注射した。多数のＣＴβに対して陽性の軸索が治療をうけた動物で損傷部位であった所において見られ、一方、ＰＢＳの対照群においては（１４Ａ図）ごく少数しか観察されない。配列番号４３で処理された動物は、損傷部位（図１４Ｂ）から５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍおよび５００μｍの距離において、切片に対し、対照群より著しく多数の軸索を再生させる。
切片に対する軸索の数の比較により、配列番号４３の注射を即時治療したものであっても（図１３Ｄ）、遅延して治療したものであっても（図１４Ｂ）、動物の軸索の再生に於いて同様の数が示される。
最も長い軸索の平均は、ＰＢＳ対照群（１４Ｃ図）のものより、即時或いは遅延して、配列番号４３の治療をした動物のほうがより長い。これらの結果は視神経損傷の後、Ｒｈｏアンタゴニスト治療のために治療的な期間の存在を示しており、Ｒｈｏの不活性化によりＲＧＣが軸索が障害傷跡全体で成長させていることを示す。
〔実施例１３〕
配列番号４３の硝子体内注射は、ＲＧＣ生存率を増やす
視神経の損傷の後、ＲＧＣのおよそ半数は、１週後にアポトーシスによって死ぬ。配列番号４３の一回の硝子体内注射がＲＧＣを細胞死から保護するかどうか決定するために、ＲＧＣ生存率は、網膜の全載標本で調べることができる。ＲＧＣは視神経軸索切断の１週前に逆行的にフルオロゴールドでラベルされ、そして、生存しているＲＧＣｓは配列番号４３で処理された動物（７ｄのｎ＝ ７、７日；ｎ＝５、１４日）、または対照群ビヒクルにおいて７日後または１４日後に数えられる（ｎ ＝ ３、７日；ｎ ＝ ４、１４日）。配列番号４３による治療は、軸索切断の１週後、ビヒクルを注射した動物における４０％の生存率（図１５）と比較してＲＧＣを完全にレスキューする。一回の注射後のＲＧＣ生存率は継続されず、そして、ＲＧＣの数は１週後に減少する。しかし、１４日目に、配列番号４３の治療をされた細胞の生存率はまだ大幅に向上し、処理をうけた動物のＲＧＣｓの数は対照群と比較して２倍以上になる。
〔実施例１４〕
Ｒｈｏアンタゴニストの反復送達がＲＧＣの生存率を増加させる
目に於ける軸索切断の２週後のＲＧＣ密度は、１回、２回または、３回の１μｇのＣ３−１１であり、定量化されることができる。以下の配列番号４３の治療計画を実行することが出来る：（ｉ）視神経障害時（０日）の１回の注射；（ｉｉ）２回の注射（神経損傷後の０日後と５日後）；そして、（ｉｉｉ） ３回の注射（０日後、５日後および１０日後）。強膜を通しての穿孔の数は、０日後に実行された注射場所を用いて、全ての注射を同じ部位を用いることにより、最高２箇所に限られる。網膜を通る切断や穿孔のような網膜損傷は齧歯類において、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）およびＦＧＦレセプター−１（ＦＧＦＲ−１）のｍＲＮＡレベルを上昇させる可能性が有り、ＣＮＴＦとｂＦＧＦの両方は視神経障害の後でＲＧＣ生存率または再生を進めることが示されているため、これは重要な問題である。
〔実施例１５〕
Ｒｈｏアンタゴニストの反復送達がＲＧＣの生存率を増加させる
更なるＲｈｏ抑制剤の度重なる注射が軸索再生を強化するかどうか決定するために、実験的なプロトコルを、配列番号４３（１μｇ）の複数の注射を２週期間にわたり実行し確立した。視神経の微細損傷は０日に実行された、そして、治療群は以下の通りである：（ｉ）３回の注射（神経損傷の後、０日後、５日後、１０日後）；（ｉｉ）２回の遅延注射（４日と１０日）；および（ｉｉｉ）２回の初期注射（０日後と５日後）。一回の注射が０日後、または、４日後に実行された時、再生の範囲が類似していることが明らかに分かっているので（Ｂｅｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２５： １１１３−１１２１）、２回注射プロトコルは初期および遅延投与計画に基づいて設計される。
〔実施例１６〕
ＢＡバリアントの活性
ＰＥＧ化バリアントのＧＨ活性は、上述されたように評価された。配列番号１０ ＰＥＧ化バリアントのＲｈｏ ＡＤＰリボシル化能力の半定量的な評価は、培養されたＰＣ−１２細胞（表８）を使って行われる。分子レベルで、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞のＣ３酵素処理はＲｈｏＡの４１ＡｓｎのＡＤＰリボシル化に終わり、そして、不可逆的な不活性化に至る。
表３で示されるように、Ｃ３バリアントのＧＨ活性とＮＧ１０８細胞の神経細胞再生を進める能力の間には相関関係がある。この相関関係は、ＧＨおよびＡＤＰリボシル化活性を失った熱不活性Ｃ３を用いて確かめられ、対応する神経細胞成長を進めることができなかった。類似した発見はｉｎ ｖｉｖｏにもあてはまり、そこで、そのＧＨとＡＤＰリボシル化活性を取り除かれた変異したＣ３のバリアントは視神経損傷に引き続く神経保護作用または神経再生作用を提供することができなかった。
ＡＤＰリボシル化を評価するために、共有結合したＡＤＰリボース基がＳＤＳ−ＰＡＧＥの上でＲｈｏＧＴＰａｓｅの見た目の分子量を増やすという事実を利用することができ、抗Ｒｈｏ抗体を用いウエスタンブロットにより、容易に視覚化することができる。
Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅの見た目の分子量の変動は、ＡＤＰリボース部分のＲｈｏ分子への期待される追加を確かめる。全てのＰＥＧ−配列番号１０バリアントは、ＡＤＰリボシル化されたＲｈｏＡの高分子量バンドを示し、そして、彼らがＰＣ−１２細胞に浸透する能力とともに、それらの先天的なＡＤＰリボシル化活性を保持したことを示した。
〔実施例１７〕
ＰＥＧ化配列番号１０変形の生体内投与
配列番号１０は、緑内障と加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）のいくつかの動物のモデルにおいて、網膜細胞の神経細胞保護作用を提供する。
図１８に関して、スピローグドーリーラットの目の薬物動態学的研究は、眼内に注射された配列番号１０が送達後、１時間以内でピーク濃度で網膜組織の中に速く散布されたことを証明する。タンパク質は２４時間経過するまで網膜でほとんど検出不可能である。数年をかけてゆっくり進行する疾病への実行可能な眼内注射治療を発展させるため、長い耐久性をもち、持続した放出製剤が必要である。これを達成する潜在的手段の一つはＰＥＧ化を通して注射されたタンパク質の生物学的住居時間を長くすることである。この戦略は、近年、滲出性ＡＭＤのために上市されたＰＥＧ化された治療的なアプタマーである、Ｍａｃｕｇｅｎの場合で既に、成功であると証明されている。これを考慮して、配列番号１０のＰＥＧ化した形態が、修飾が網膜存在時間の増加につながるかどうか調べるために、ラット目のＰＫ検査においてテストされた。
ＰＥＧ化された配列番号１０バリアントをテストする実験の第１セットのために、網膜は、５μｌの等張生理的食塩水に希釈された１０ｇのタンパク質の眼内注入（１０μｌハミルトン注射器を用いて後眼房の硝子体液に）の２４時間後に集められた（グループにつき３匹のラット）。対照群の目は、ビヒクル（等張生理的食塩水）を注射される。動物は、過量投与した麻酔により供給され、生理的食塩水をかん流し、目を取り除き、解剖のために処理した。網膜を均質化し、そして、タンパク質は可溶化バッファで抽出した。各々の抽出液のタンパク質濃度は、修正されたラウリー分析評価を使って決定した。バリアントの組織濃度は、機密サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定された。手短に述べると、配列番号１０に特異的なポリクローナル捕獲抗体は、固相をつくるために、マイクロプレートに吸着される。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でプレートをブロックした後に、テストサンプル、標準および品質対照群は被覆段階抗体とともにインキュベートした。そして、それは溶液中でバリアントを捕獲する。同じポリクローナル抗体によるインキュベーションがビオチンに接合した後、ステプタビジン−ＨＲＰとそのサブストレート溶液（テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）／過酸化水素）で検出が実行される。発色現像は結合したＢＡバリアントの量と比例しており、そして、色強度は分光測光法によって定量化される。
ＢＡ−２２０とＢＡ−２２５に対して測定されたタンパク質濃度は配列番号１０のそれに等しく、そして、同様の薬物動態学的プロファイルを反映する。対照的に、ＢＡ−２３１は減少した組織クリアランスと、より長い滞留時間（図１６）を示す。この優れた結果は、配列番号１０のより大きなＰＥＧ付加物の合成につながる。
〔実施例１８〕
配列番号１０とＰＥＧ化バリアントの薬力学的プロファイル
生物学的標的Ｒｈｏに関して、配列番号１０とＰＥＧ化バリアントの薬力学的プロフィールを調査するために、網膜ＲｈｏＡのＡＤＰリボシル化は、ゲルシフト分析評価を用いて可視化される（上述）。図１７を参照して、組織は先に述べたようにＥＬＩＳＡのために集められ、そして、網膜タンパク質はプロテアーゼ阻害剤を含んでいるＲＩＰＡ緩衝液の溶解によって抽出された。核後部抽出物は遠心分離によって得られ、１２．５％のポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ １９７０）によって、分解される（３０μｇのサンプル）。テストされるバリアントの全ては細胞内ＲｈｏをＡＤＰリボシル化することができ、そして、それらが組織と細胞（図１７）に浸透する能力をプラスして生物学的活性を保持したことを示す。
親タンパク質とＰＥＧ化バリアントの間で薬物動態学的プロフィールを比較するために、各々のタンパク質の１０μｇは５μｌの生理的食塩水（グループにつき３匹のラット）の中に注射され、そして、網膜組織をＥＬＩＳＡ分析のために所定の時点に先に述べたように集めた。
網膜クリアランスの比較の経時変化は、ｄｉ−ＰＥＧ−２１ｋＤａ−ＢＡ−２３１を使って調査される。テストされた全ての時点で、このバリアントは親タンパク質（図１８）と比較して、より高い組織保持を示す。このように、ＰＥＧ化が顕著に、目の中の配列番号１０の全体の滞留時間を少なくとも４８時間後まで増やす。
他のより高分子が付加した付加物の薬物動態学的プロフィールは、先に述べたように調査されることもできる（グループにつき３匹のラットにおいて、５μｌの生理的食塩水中の１０μｇのバリアントで）。配列番号１０への２１、３０、および４０ｋＤａのＥＧグループの付加は、非ＰＥＧ化されたバリアント（図１９）と比較して、２４時間および４８時間後の網膜組織レベルが顕著に上昇している。
同じ組織サンプルは、バリアントの生体内生物学的活性を確かめるために、先に述べたようにゲルシフト分析評価にかけることもできる。すべてのテストされたバリアントは、テストされた２つの点で（図２０）、ＲｈｏをＡＤＰリボシル化することができる。
〔実施例１９〕
ＢＡ−２３１の神経保護能力（配列番号１０のＰＥＧ化された変形）
ＢＡ−２３１の潜在的神経保護能力は、網膜変性を遅らせやすいマウス系統で試されることができる。ｒｄｓマウスは、ヒトの光受容体ＲＤＳペリフェリン遺伝子内の突然変異に関連がある遺伝的に自然に起こる網膜色素変性症を有する。生後４ヵ月のものに残っている光受容体のおよそ５０％で、このモデルの変性は、初期の発症と遅い進行を有する。これらのマウスは、網膜変性モデルでＢＡ変形の神経保護の可能性を研究するための、よく特徴づけられた再生可能なｉｎ ｖｉｖｏモデルを述べる。
離乳期（３週）から始め、０．１ｇの配列番号１０またはＢＡ−２３１を、マウス（グループにつき５匹）の右目に注射し、マウスが４ヵ月齢になるまで２または３週ごとに続ける。左目は、対照群を提供するために、同じ日程で度重なる生理的食塩水の注射を施した。イソフルラン麻酔のもと、１μｌの投与量で微量注射器を使って眼内注射を実施した。動物は過量投与による麻酔によって供給され、そして、目を取り出し、パラフィン包埋の前にＢｏｕｉｎ定着剤でインキュベートした。眼球は５μｍの連続切片に切り分けられ、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。視神経の近くでとられる網膜切片の写真を撮り、そして、光受容体計数は状態ごとに６〜８枚の異なる写真／動物で行った。計数は、網膜の各々の半球を１００×１００μｍの長さ（半球につき３〜４の領域）の領域で代表して行った。
下の表（表９）の中で示したように、ＰＥＧ化バリアントは、修飾されていない配列番号１０と比較して、ｒｄｓ変異体マウスの網膜で周辺光受容体の生存率を大幅に向上させる（結果は、各々のマウスの治療された目と対照群の目の間の光受容体生存率のパーセンテージとして表される）。このデータは、増加した目の滞留時間を伴う、ＰＥＧ化した配列番号１０バリアントが、度重なる投与と連続した薬剤暴露を必要とする長期のモデルで神経保護作用を増幅する、治療的に有利な点を与える。
〔実施例２０〕
融合タンパク質配列番号４３がガン細胞の激増を減らすことを証明するために役に立つ、細胞増殖での尺度としてのトリチウム化されたチミジン取り込みのための一般的な方法
細胞株をマイコプラズマについて検査し、研究開始の前にネガティブであることを確認した。細胞株は、ＡＴＣＣから入手した。ＨＥＣ−１Ｂ株は、１０％のＦＢＳと１％のＨＥＰＥＳで補ったＥＭＥＭで培養した。Ｃａｃｏ−２株は、２０％のＦＢＳ、１％のＨＥＰＥＳ、１ｍＭのナトリウムピルビン酸塩と０．１ｍＭの非必須アミノ酸を補ったＥＭＥＭで培養した。ＳＫ−ＭＥＬ−１株は、ＭｃＣｏｙを補給した １０％のＦＢＳと１％のＨＥＰＥＳで培養した。
融合タンパク質の２Ｘ希釈標準溶液１００μｌは、陽性のものとビヒクル対照群の各々の細胞（４×１０3／１００μｌ）を含んだ３組の９６穴マイクロタイタープレートに播種
し、最終量を２００μｌとした。前記プレートは３７℃インキュベーターに湿度１００％で、５％のＣＯ２環境下においた。およそ５４時間のインキュベーションの後、２０μｌのトリチウム化されたチミジン（３Ｈ−チミジン）（ＩＣＮ、モントリオール、カナダ）の量は、１．０Ｃｉを含み、各々に加えられた。３Ｈチミジンは、１０％のＦＢＳで補われるＲＰＭＩ−１６４０で準備される。更に１８時間、培養菌は上述の通り同じ状況で培養された。インキュベーション終了後、細胞はオートメーション化したセル‐ハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ）で集菌し、３Ｈチミジンの分毎のカウント（ｃｐｍ）はマイクロプレートシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ、パッカード）で測定した。
例えば配列番号４３のような本発明の融合タンパク質が悪性細胞の表現型の複数の面に影響を及ぼすことが証明は、増殖し成長する細胞へのトリチウム化チミジン編入をモニターすることによって示されることができ、そこで、細胞培養培地に加えられたトリチウム化チミジンは細胞に取り込まれ、各々の細胞がＤＮＡを合成するときに使う、その中のチミジン三リン酸塩プールの一部になる。
トリチウム化チミジンは、各々の細胞で、ＤＮＡ高分子に共有結合して取り込まれる。成長しない細胞、または、アポトーシスまたはネクローシスに細胞死をする細胞では、トリチウム化されたチミジンは細胞に取り込まれないか、または細胞の溶解により細胞培地に放出される。トリチウム化チミジン編入は、細胞成長、細胞分裂、細胞停滞と細胞死に関する配列番号４３といった本発明の融合タンパク質の影響の全体的尺度として使われることができる。配列番号４３が３Ｈチミジンの減少を誘発する細胞系は、以下を含む：ヒト子宮体がん細胞株ＨＥＣ １Ｂ、ヒト結腸直腸ガン細胞株ＣａＣｏ２、ヒト黒色腫ガン細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２、およびヒトＣＮＳガン細胞株Ａ−１７２（図２１〜２８を参照）。
〔実施例２１〕
配列番号１０はＲｈｏＡをＡＤＰリボシル化する
細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＣ３細胞外酵素処理すると、４１ＡｓｎにおいてＲｈｏＡ、ＢおよびＣがＡＤＰリボシル化され、引き続き、それらの不活性化に至る。共有結合したＡＤＰリボースグループは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの上でＲｈｏＧＴＰａｓｅｓの見た目の分子量を増やし、反Ｒｈｏ抗体を用いたウエスタンブロットですぐに視覚化することができる。配列番号１０（図３０）で扱われるＨＵＶＥＣの抗ＲｈｏＡウエスタンブロットのＲｈｏ ＧＴＰａｓｅの見た目の分子量の変動は、Ｒｈｏ分子に仮想のＡＤＰリボース半分の添加を示す。１μｇ／ｍＬの低さの配列番号１０の濃度と３０分の治療期間は、ＲｈｏＡの完全なＡＤＰリボシル化をもたらすのに十分である。これらの知見は、配列番号１０の比較的低い投与量が洗練されたＨＵＶＥＣの細胞質に能率的に深く入りこむのに十分なことを明らかに証明する。
〔実施例２２〕
配列番号１０は、ＨＵＶＥＣによって試験管内の管形成を減少させる
図３１を参照して、血管形成で合図している経路Ｒｈｏ−ロックの重要性を評価するために、トラニラスト（１０のμｇ／ｍｌと５０μｇ／ｍｌ）が明確な対照群として使われる。トラニラストが主要な血管形成ルート（すなわちＶＥＧＦ経路）のうちの１本をふさぐことが知られている。一つにはて、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ−Ｒに結合することは、ＰＫＣの一部のシグナル経路の開始であるレセプターチロシン自己リン酸化を刺激する。トラニラストは、ＶＥＧＦに依存するＰＫＣ活性化を禁止することによって作用する。図３１Ａは、無治療のＨＵＶＥＣ（Ｃｔｌ）が厚くてよく閉ざされた毛細管のような構造を作ったことを示す。テストされる両方の濃度の配列番号１０は、制御細胞（図３１Ａ）で見られるものと比較して、細い、完全には閉じていない未熟なチューブを生産する。類似した形態は、テストされた両方の濃度で、ＲＯＣＫ抑制剤のファスジルを用いて得られた。予想通りのトラニラストは両方の濃度で、未熟な毛管の構造で特徴づけられる管形成の減少と多くのコロニーでの伸長の欠失を生じた。毛管の長さの測定により、配列番号１０とトラニラストが濃度に依存して管の長さを少なくとも５１％、有意に（ｐ＜０．０５ またはｐ＜０．０ｌ）減少させ、一方ファスジルは高濃度の投与量でのみ（５０ μＭ）管形成を５８％有意に（ｐ＜０．０５）減少させることが明らかになった（図３１Ｂ）。先に提示されるすべての結果は、Ｒｈｏが能力を通して血管形成に従って働き、増殖と移動に対するその効果より大きな範囲で細胞骨格を制御することができることを示唆する。
〔実施例２３〕
配列番号１０は、ラット大動脈輪で血管形成を減少させる
ラット（スピローグ−ドーリー）胸大動脈は、１ｍｍの厚さの小さなリングに切られて、固められたＥＣｍａｔｒｉｘ（マトリゲル（商標））につつまれ、それから孵化された、配列番号１０の非存在下（Ｃｔｌ）または、１０μｇ／ｍＬの配列番号１０の存在下で、０日から７〜８日まで、内皮基礎２培地（ＥＢＭ−２）で、ｈＥＧＦ、ＧＡ−１０００、ＶＥＧＦ、ｈＦＧＦ−Ｂ、ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸およびヘパリン（ＥＧＭ−２からＦＢＳとヒドロコルチゾンを差し引いたものと一致する）を補いインキュベートした。培地の補充は４日目に行った（配列番号１０無し、または有りで）。リングからの血管形成は倒置型位相差顕微鏡を通して２５ Ｘ（上部パネル）または１００ Ｘ（下部のパネル）拡大で観察した。画像はノーザンエクライプソフトウェアを使用して、示された倍率で処理された。低倍率（２５Ｘ）位相差顕微鏡分析は制御リングからの細胞成長の発展を明らかにする（図２９Ａ、パネル１）。より高い倍率（１００Ｘ）では、鎖とコードからなる結合した細長い細胞のよく形成された毛細管のような構造が明らかに見えた（図２９Ａ、パネル３）。対照的に、低倍率の配列番号１０治療をうけたリングの低い拡大図は、制御リングと比較してより少しの細胞成長を示した（図２９Ａ、パネル２）。より高い倍率では、毛管のネットワークは深刻に崩壊し、制御リングのそれらと比較して非常により短くてより細い細管を含んだ（図２９Ａ、パネル４）。
細管の長さは、平均±ＳＥＭ（図２９Ｂ）として測定され、報告された。結果は、三つ組の一つで少なくとも分析される３つの独立した実験を代表する。シンボル＊は制御リングから有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
細管長のこれらの定量分析は、配列番号１０治療に起因する船長の３０％の減少（ｐ＜０．０５）を示した。集団で、これらのデータは、配列番号１０が強力な前の活発なモデルで血管形成の抑制を調停することができることを明らかに証明した。
〔実施例２４〕
配列番号１０は、ＨＵＶＥＣ増殖と遊走に最小の影響を及ぼす
コラーゲンコートしたウェルの上へ撒いたＨＵＶＥＣ培養液において、アラマーブルー染色（図３２）により評価されたように、配列番号１０は、非常に高い投与量（最高１００μｇ／ｍＬ、７２時間）でさえ増殖率に識別できる影響を及ぼさない。これに比べ、Ｒｈｏキナーゼ抑制剤のファスジルはトラニラストと同様、どちらも２４時間または７２時間後のどちらにおいても、ＨＵＶＥＣ細胞の増殖に有意な（ｐ＜０．０１）縮小を生じさせる。配列番号１０は能率的にＲｈｏＡをリボシル化し、したがって、これらの状況下のその活性を妨げ、このシステムにおけるＨＵＶＥＣの増加が、この部分の血管形成配列とともに、ＲｈｏＡ活性を独立して促進する。対照的に、ＨＵＶＥＣ増殖は、おそらくトラニラストによってブロックされるプロテインキナーゼＣを含む標的の活性と同様にＲｈｏキナーゼ活性に依存するようである。
他の細胞機能とＲｈｏ ＧＴＰａｓｅ抑制で混乱することが知られている血管形成プロセ
スの部分は、内皮細胞遊走である。ＨＵＶＥＣ移動に関して配列番号１０の影響を評価するために、細胞は望ましいテスト化合物とともにｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの上部で種をまかれ、そして、移動はそれから挿入物の底面で１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦで誘発される。２０時間の遊走の後、挿入物の膜を通過する細胞は、カルセイン ＡＭの調査につ
いてのラベルし、蛍光を通して調べた。
予想通りに、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（ｐ ＜０．００１）は、未処理の支配細胞と比
較して２．２倍（３３Ａ図）、の有意差（ｐ(０．００１）でＨＵＶＥＣ遊走を刺激する
。トラニラスト（ＶＥＧＦによって誘発された移動を禁止することが知られている明確な対照群）は、１０（４５％、ｐ＜０．０５）と５０（７２％、ｐ＜０．００１）ｇ／ｍＬで有意にＨＵＶＥＣ移動を減少させる。５０のＭ Ｆａｓｕｄｉｌが６６％（ｐ＜ ０．００１）移動を減少させる間、配列番号１０はテストされる両方の濃度でかろうじてＨＵＶＥＣの移動を減少させる。５０ｇ／ｍＬの配列番号１０による２４時間の前処理がＶＥＧＦに依存するＨＵＶＥＣの減少（１７％、ｐ＜０．０５）であった後にのみ、移動は観察された（図３３Ｂ）。ＨＵＶＥＣの増殖と遊走に関してＲｈｏ ＧＴＰａｓｅｓとＲｈｏキナーゼを妨げることの明瞭な違いは、関係する異なった細胞経路があることを示唆する。
結合し、配列番号１０でＲｈｏ不活化を含むこれらの結果は、内皮細胞の増殖とＶＥＧＦに依存する遊走が試験管内でＨＵＶＥＣチューブ形成において減少を管理しているメインイベントでないことを示唆する。おそらく、血管形成プロセスの他のステップは、Ｒｈｏ
ＧＴＰａｓｅまたはＲｈｏキナーゼの抑制の後で影響を受けなければならない。
〔実施例２５〕
ガン細胞の増殖抑制に関して融合タンパク質の影響を示す一般的な方法
細胞タンパク質含有量の試験管内の測定の検査法にしみをつけているスルフォルホルダミンＢ（ＳＲＢ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手可能な））タンパク質は、開
発されて、ｖｉｔｒｏ抗腫瘍ふるい分け（Ｓｋｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０）にお
いて、ＮＣＩで日常的な使用のためにその後採用された。ＳＲＢは細胞タンパク質の塩基性アミノ酸と結合する、そして、比色評価は細胞数に関連がある全体のタンパク質多数の推定を提供する。この分析評価は、死んだ細胞も溶解して、手順の間、取り出されるか、さもなければ比色終点に貢献しないという仮定に基づく。ＳＲＢ分析評価は、細胞の生き残っている分画を過大評価するかもしれない。
ＳＲＢ検査のプロトコル
これらのテストは、ＮＣＩ ６０細胞系制御盤の上で行われる。細胞は、６４０のメディ
アが細胞系ごとにＡＴＣＣ推薦に従って５％の胎児のウシ血清とＬ−グルタミンで補ったＲＭＰＩ−Ｌで大きくなる。対数関数的成長の細胞は、トリプシン処理されて、数えられる。細胞は、成長メディアの１００のμＬで、個々の細胞系の二倍になっている時間に従い、９６穴マイクロプレートで予防接種をされる。マイクロプレートは、指数関数的な成長を再び始めるために、２４ｈ ３７℃、５％のＣＯ２と１００％の相対湿度でインキュ
ベートした。２４ｈの後、各々の細胞系の２枚のプレートは、テスト記事追加（Ｔ０）の時点で細胞系ごとに細胞人口の測定を意味するために、ｉｎ ｓｉｔｕでＴＣＡを固定し
た。ＴＣＡは除去し、そして、プレートは乾くために少なくとも２４ｈ室温でインキュベートした。
この発明の融合タンパク質は、凍結乾燥された粉末として凍結貯蔵される。１０ｍＭのリン酸ナトリウム（緩衝ｐＨ ７．４）でマイクロリットル当たりおよそ４．４２マイクロ
グラムの融合タンパク質で医薬組成物をつくることは、無菌の水で再構成されることができる。服用点ごとに、貯蔵液の連続希釈剤は、２００μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬと０．０２μｇ／ｍＬで融合タンパク質を提供するために５
０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含んでいる完全な媒体で準備される。それらのテスト記希釈剤の１００のμＬの１投与量は、融合タンパク質のために最終的な対数希釈列の投与を成し遂げるために、すでに１００のμＬの培地を含んでいる適当なウェルに加えられる。
融合タンパク質（すなわち薬剤）追加の後、マイクロプレートは３７℃、５％のＣＯ２と１００％の相対湿度で追加時間の間インキュベートした。分析は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を使いウェルの底の細胞中のタンパク質を固定することによって終了した。プレートは乾燥し、それから、１％の酢酸のＳＲＢ溶液０．４％（ｗ／ｖ）を１００μＬ各々のウェルに加えた。プレートは、タンパク質結合染料と共に１０分間室温でインキュベートした。
染色の後、結合しなかった染料は１％の酢酸で洗うことにより除去した、そして、プレートを乾燥した。プレートが穏やかに混ぜられる間、結合染料は１０ｍＭのトリズマ塩基を２００μＬ加えることによって溶かした。染料の量は、５１５ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーにより光学濃度を読むことによって計った。
データは、Ｅｘｃｅｌスプレッドシートで分析した。
Ｔ０ ＝融合タンパク質付加時（０時間）の 平均吸収度；
Ｃ ＝ コントロールにおける（薬を含んでいないテスト項目）平均吸収度；
Ｔｉ ＝融合タンパク質品（希釈剤列の異なる服用点）のための平均吸収度；
ＧＩ ＝成長抑制；
ＴＧＩ ＝全成長抑制；
ＬＣ５０ ＝致死濃度（全個体の５０％致死）；
成長率はそれぞれのテスト項目濃度について計算される：
成長抑制率（％）は、異なる投与量における効果を比較するためにチャートを準備するのに用いられることができる。百分率の成長プロットはプロットされ、点は、＋５０、０と−５０のＰＧ価を横切る用量反応曲線となり、ＧＩ５０、ＴＧＩとＬＣ５０を計算するのに用いられた。ＧＩ５０、または、成長を５０％妨げることに要求される濃度は、融合タンパク質に関連したパラメータである。
〔実施例２６〕
ヒトガン細胞系の細胞増殖の抑制を示すＳＲＢ分析法の特異的な使用
この発明の一つの融合タンパク質、配列番号４３は３ＨチミジンとＮＣＩスクリーンの細胞系のおよそ１０％に対する影響でテストされる６つのヒト腫瘍細胞系のうちの４つに影響を及ぼす。ＳＲＢテストでは、それは細胞増殖抑制特性があるように見える；成長は規制と比較して妨げられる、しかし、タンパク質の全体的な量は時間ゼロ（Ｔｚ）で計られる量と比較して減少しない。これらの結果は、Ｃ３転移酵素が動物にとても有毒でないことを示している生体内データに同意する。観察されたＧＩ５０価は、ナノモルからミクロモルの範囲で、およそ２７ｋＤａの分子量を融合タンパク質与に対して与える（表１０）。
〔実施例２７〕
プルダウンアッセイによるＲｈｏ活性の検出
ＮＧ１０８細胞は、５％の胎児のウシ血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ））の存在下で、細胞培養した。細胞が定着した後（３７℃で３〜６時間）、ＢＡ０５を培地に加えた。細胞を溶解させるために、それらは氷温トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で洗われ、改良したＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭトリスｐＨ ７．２、１％のトリトンＸ−１００、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｇ／ｍｌのロイペプチン、１０のμｇ／ｍｌアプロチニン、１ｍＭのフェニルメチル−スルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ））で溶解する。細胞可溶化物は４℃で１０分間１３，０００ｇで遠心分離により透明化し−８０℃に保った。
ＧＳＴ Ｒｈｏ結合ドメイン（ＧＳＴ−ＲＢＤ）の精製は細胞溶解物を用いて行われ、そ
れらは解凍され、５００ｕＬのＲＩＰＡバッファに１００万細胞が含まれるように再懸濁した。ＧＳＴ Ｒｈｏ結合ドメイン（ＧＳＴ−ＲＢＤ）を作るため、ＰＧＥＸベクター中
でＧＳＴ−ＲＢＤを発現しているバクテリアは、１００のμｌ／ｍｌでアンピシリンを含むでＬ培地（ＬＢ）で育てた。一晩培養したものは、１：１０の割合で３６００ｍｌのＬＢに薄められて、２時間３７℃の条件下、震振細菌培養器で培養した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（０．５ｍＭ）は、２時間インキュベートした培地に加えられた。バクテリアは、それから１５分間５，０００ｇの遠心分離によって集菌した。ペレットは、それから４０ｍｌの溶解バッファ（５０ｍＭのトリス、ｐＨ ７．５、１％の
トリトン−Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｇ／
ｍｌのロイペプチン、１０ｇ／ｍｌのアプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦ）で再懸濁した。超音波処理の後、溶解物は４℃で３０分の間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。
凍った細胞培養は、ＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭのトリスｐＨ ７．２、１％のトリトン
Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｇ／ｍｌロイペプチン、１０ｇ／ｍｌアプロチニン
、１ｍＭＰＭＳＦ）で均質にした。ホモジェネートと細胞可溶化物は、２回の１０分、１３０００ｇ、４℃の遠心分離により清澄化した。それらは、それからＧＳＴ−ＲＢＤをグルタチオン結合アガロースビーズ（シグマ、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、カナダ）に結合させて４℃で５０分インキュベートした。ビーズは、それから４回洗い、サンプル緩衝液で抽出した。組織ホモジェネート中に存在するＧＴＰ結合Ｒｈｏと全体のＲｈｏは、ウエスタンブロットによって検出された。タンパク質はニトロセルロースへ移されて、単クローンＲｈｏＡ抗体（サンタクルス、サンタクルス、カリフォルニア）を使って調べられた。バンドはペルオキシダーゼにリンクされた２次抗体（プロメガ、マディソン、ワイオミング）で視覚化され、そして、ＨＲＰを基礎とする化学蛍光反応（ピアス、ロックフォード、イリノイ）を形成した。デンシトメトリー分析は、各々のバンドで信号の量をはかるために実行された。
〔実施例２８〕
配列番号４３を例証として使用する、どの腫瘍がタンパク質融合治療に最も応じることができるかについて診断するあるいは確定する診断としてのＲｈｏプルダウン分析の使用
腫瘍の全てが取り除かれるとき、腫瘍の生検検体は外科的除去によって哺乳類（例えばヒト患者）の組織からとられ、残存組織を切除された腫瘍の縁に残した。サンプルは、ドライアイス上で、または、液体窒素中で凍らせた。およそ５ｍｍ２の切除された組織のサンプルは、５００ｕＬ ＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭのトリスｐＨ ７．２、１％のトリトンＸ−１００、０．５％のナトリウムｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％のＳＤＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１０ｍｇ／ｍｌアプロチニン、１ｍＭＰＭＳＦ）でホモジェナイズした。ホモジェネート液は、サンプルを更なる分析に提供するために、４℃で１３，０００ｇで２回の１０分遠心分離によって清澄化した。サンプルは、それから、ＧＳＴ−ＲＢＤ結合グルタチオンアガロースビーズと共に、４℃で５０分間インキュベートした。組織ホモジェネート液中に存在するＧＴＰ結合Ｒｈｏと全Ｒｈｏは、ウエスタンブロットによって検出した。
生検サンプルのどの細胞がＲｈｏを活性化させたかについて検出するために、クリオスタット切片を準備した。ＲＢＤ−ＧＳＴの細菌の溶解物は、４℃で３０分間１４０００ｒｐｍの遠心分離にて清澄化した。活性化したＲｈｏは前記切片をＲＢＤ−ＧＳＴを含む細菌溶解物でインキュベートすることにより検出した。生検サンプルクリオ切片は４％ＰＦＡによる後固定の後、細菌溶解物中で一晩インキュベートした。前記切片はそれからＴＢＳで３回洗浄しＢＳＡで１時間室温でブロックし、抗ＧＳＴ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， ミシソーガ、カナダ）および細胞タイプ特異的抗体とともにインキュベートした。脳腫瘍の場合、ニューロンに特有の抗体（ＮｅｕＮ）または星状細胞に特有の抗体（ＧＦＡＰ）は、活性化Ｒｈｏを用いて細胞タイプを見つけるのに用ることができ、腫瘍診断を助ける。切片はＴＢＳで洗われ、そして、ＦＩＴＣ、テキサスレッドまたはローダミン結合２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ミシソーガ、カナダ）とともに室温で２時間インキュベートした。
〔実施例２９〕
メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）活性の減少を見つける一般的な方法
メタロプロテイナーゼ活性は、ザイモグラフィーで検出され、それにより酵素のタンパク質分解活性が非還元状況の下、ポリアクリルアミドゲル中で分離される。メタロプロテイナーゼ活性を見つけるために、Ｃａｋｉ−１大腸癌細胞の成長からの培養基のゼラチン分解活性は、ゼラチンザイモグラフィーによって検出された。Ｃａｋｉ−１細胞は０．１、１．０または１０μｇ／ｍｌの濃度の配列番号４３とともにまたは対照群としての緩衝液とともに２４時間インキュベートした。１分画（２５μＬ）の培地は１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含んでいる７．５％のポリアクリルアミドを伴うＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけられ、ポ
リペプチドを非還元状況の下で切り出した。ＭＭＰ活性を評価するため、ＳＤＳを２．５％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００で、室温で３０分の間インキュベーションすることによって取り除いた。このステップを繰り返し、ｄｄＨ２０での５回すすいだ。次に、ゲルは５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７．６、０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ2と０．０２％（ｖ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５を含んでいるバッファで、３７℃で２０時間インキュベートした。ゲルはクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色され、脱色した。ゼラチン基板の酵素活性は、青い背景の透明なバンドとして見つけられる。これらの実験で、ゼラチナーゼ活性によるＭＭＰ酵素の特性は、ＨＴ−１０８０のようなポジティブコントロールで評価した。
〔実施例３０〕
切除された腫瘍周辺を扱う一般的な方法
薬学的に許容できるクリームで明確に述べられて融合タンパク質（例えば配列番号４３）を含む本発明はの構成は、皮膚から切除部位を治療するのに用いられることができる。例は悪性黒色腫の治療です、そこで、そのようなクリームは腫瘍の切除部位を囲んでいる皮膚に付けられる。一つの態様では、配列番号４３のような融合タンパク質を含有しているクリームのそのような製剤は、腫瘍の切除の前に皮膚に施されることができて、最初の生検の期間の間で、そして、明確な組織学的診断の前に腫瘍を治療するのに用いられることができる。腫瘍部位に投与する場合、クリームは腫瘍の拡散と転移を防ぐことができる。
〔実施例３１〕
第２の腫瘍の予防が融合タンパク質から成っているこの発明の腫瘍余白Ａ構成で成長して、配列番号４３のような、水溶液のような例えばは、外科用接着剤ジェル（例えばフィブリン接着剤またはヒドロゲル）で明確に述べられて、先に述べたように、または、例えば、腫瘍の外科的切除の領域を扱うのに用いられることができる。例は、大腸がんのためのｃｏｌｏｎｅｃｔｏｍｙの後の健康な結腸の治療です。さもなければ腫瘍の削除の前に腫瘍地域を囲んだ健康なコロン組織は、フィブリンシーラントのような外科的なジェルで、腫瘍と関連する組織の除去の後、配列番号４３のような融合タンパク質組成で扱われることができて、残存組織で更なる障害の形成を防ぐために役に立つ。
〔実施例３２〕
哺乳類において臨床前有効性を示す一般的な方法
黒色腫細胞系は、ヌードマウスの最初のグループ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の皮下に移植される。腫瘍はマウスの最初の群れの成長したマウスで、収穫し、マウスの第２の群れの各々のマウス（マウスにつき１つの腫瘍）に、個々に移植した。
配列番号４３と言った融合タンパク質の有効量（腫瘍１ｍＬにつき１０−１００ｕｇの範囲であると推定される）を薬学的に許容できるビヒクルに含んで、本発明の医薬組成物の毎日の注射は、マウスの第２のグループの各々のマウスに施される。対照群動物は、コントロールとしてビヒクルを注射した。腫瘍の発達は測られ、そして、ガンマ免疫タンパク質１０（ＩＰ１０）のような悪性ケラチン生成細胞のマーカーを測定するため、組織学的な検査を実行した。融合タンパク質を含む組成物は、第２のマウス群においてで実質的に腫瘍の成長を防ぐか、妨げる。
〔実施例３３〕
乳がんの再発の防止において挿入された胸装置の表面に投与される融合タンパク質を含む構成の使用
融合タンパク質を含む、本発明の治療的に効果的な量の医薬組成物は、薬剤的に許容できる胸部移植片の表面上をおおう。腫瘍は、任意で、本発明の医薬組成物と共同投与し（手術前および／または手術後に）、患者の胸部組織から切除される。腫瘍の切除によってつ
くられる空所は、少なくとも融合タンパク質を含む医薬組成物でおおわれている胸部移植片で一部を満たされ、そして、切除や移植によって引き起こされる傷は閉じられる。第２の腫瘍の残留する腫瘍端組織の成長は、実質的に妨げられるか、防がれる。
〔実施例３４〕
患者の投与のための医薬組成物の準備
現在の発明の医薬組成物は、配列番号１０（３０ｍｇ／ｍＬの貯蔵液または希釈溶液）とＴｉｓｓｅｅｌ（フィブリンシーラント）キットの４つの構成要素を混ぜ合わせることによって準備されることができる：
凍結乾燥されたトロンビン；
トロンビンを再構成する１ｍＬのＣａＣｌ２／再結合緩衝溶液；
凍結乾燥されたフィブリノゲン；そして、
フィブリノゲンを再構成する１ｍＬの緩衝液。
配列番号１０の貯蔵液は、−２０℃で保存されて、使用の１時間前まで凍らせておかれる。配列番号１０の貯蔵液は、２、３分の間手のひらにバイアルを置き解凍される。１ｍＬの注射器を使い、配列番号１０貯蔵液の０．３ｍＬを取り出され、空のバイアルに注射した。無菌の注射器を使って０．１５ｍＬの無菌の水が加えられた。混和は、それから、穏やかにかき混ぜるによって実行される。１ｍＬの注射器を使って、ＣａＣｌ２溶液（Ｔｉｓｓｅｅｌキットから）の０．３ｍＬを取りだされて、捨てられる。
同じ注射器を使って、適当な配列番号１０から０．３ｍＬで、機能溶液は取りだされ、ＣａＣｌ２小びんに注射されて、穏やかに渦巻くことによって混ざられた。１ｍＬの注射器によるＣａＣｌ２／配列番号１０バイアルの最大量は、取りだされて、トロンビン再構成されたバイアルに注射される。トロンビン溶液は、使用まで３７℃に保たれふ。Ｔｉｓｓｅｅｌ Ｓｅａｌｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅは、使用の前に準備され
なければならず、メーカーの指示に従って再構成されなければならない。トロンビン／配列番号１０とＴｉｓｓｅｅｌ Ｓｅａｌｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ溶液とそれぞれのＤｕｐｌｏｊｅｃｔ注射器は取りだされる、そして、Ｔｉｓｓｅｅｌは塊形成に引き続き投与される。
〔実施例３５〕
硬膜外投与の後の配列番号１０の配布
図３４を参照して、配列番号１０の分布は、通常の負傷したラット脊髄で特徴づけられることができる。脊髄組織中の配列番号１０の浸透と分布は、個々のラット（各々の実験につきｎ＝ ３−５ラット）から得られる組織に対しウエスタンブロット法を使用して評価
した。すべてのブロットにつき、５０μｇのタンパク質は、各々のレーンに詰めた。１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の分離の後、タンパク質をニトロセルロースへ移されて、ブロックし、ポリクローナル抗配列番号１０抗体を使って検査した。バンドはペルオキシダーゼにリンクされた第二の抗体（プロメガ）とＨＲＰに基づく化学蛍光反応で視覚化した（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）。ブロットはレーザーＰｅｒｓｏｎａｌ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＳＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて濃度をスキャンし、そして、バンドイメージはＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア版５．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で分析した。背景サブトラクションの後、ソフトウェアによりバンドイメージの画素密度を測定し、そして、デンシトメトリー価は任意に設定した。
免疫組織化学のために、ＯＣＴに埋め込まれた脊髄を１０μｍの切片に処理し、スーパーフロストガラススライドの上にのせ、４％のＰＦＡで固定した。ブロッキング溶液（５％正常ヤギ血清、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ）中の１時間のインキュベーションの後、配列番号１０はモノクローナル抗体を使って検出し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１時間のインキ
ュベーションの後、視覚化した。スライドは、ツァイスＡｘｉｏｓｋｏｐ ２蛍光顕微鏡
で調べた。組織切片のイメージは、ノーザンＥｃｌｉｐｓｅソフトウェアを使用してとられた。Ｔｉｓｓｅｅｌ中のＰＢＳのみ投与したラットは本実験の抗体特性と背景干渉を評価するコントロールとして使われた。
経時変化実験において、無傷の椎弓切除されたネズミで硬膜の上へ適用されるとき、脊髄組織を透過する配列番号１０（５０μｇ）の能力はＴｉｓｓｅｅｌと結合することにより確かめられる。硬膜は無傷のままにされ、そして、投与部位の１ｃｍの組織は手術の１時間後に集めた。輸送配列を欠く野生型Ｃ３とは対照的に、配列番号１０が速く脊髄（３４Ａ図）に深く入りこむとわかる。Ｔｉｓｓｅｅｌマトリックスからの大量瞬時投与送出は、７日にまだ検出される残余レベルを伴う遅い放出段階につづき、投与の後、最初の２時間の間、最大で一定の脊髄レベルを与えた。
Ｒｈｏは、遍在するタンパク質で、通常細胞の機能に重要である。その全身的な抑制は、重要な副作用を生じる可能性がある。したがって、配列番号１０送達が全体的な露出を制限するために、損傷脊髄を局所的に制限することは好ましい。硬膜外投与の後で、低レベルの配列番号１０は、例えば皮膚と背中筋肉のような投与部位の近くの組織で検出される（５％未満の初期投与量）。しかし、Ｔｉｓｓｅｅｌとともに局所的に投与されるとき、配列番号１０（最高５０μｇ）は前記投与量を使用した場合、傷治癒に対する明白な影響を実施しない。限られた露出は体循環（およそ０．５％の初回量、１時間のＣｍａｘ）で見つかり、そして、タンパク質が器官（示されないデータ）でもそれ自体に集中することはみられない。更なる実験では、腎臓が除去（１時間に組織で見つけられる１％の初回量）に関与することが分かり、そして、タンパク質は投与の後、最初の時間に尿で検出される。配列番号１０は、腎臓で見つかるものより少ない量で、薬の摂取のすぐ直後に肝臓でも検出される。
配列番号１０の背腹分布および頭尾部分布も評価した。送達の２４時間後に、タンパク質は、ラットの挫傷をおい、治療を受けた、無傷あるいは開いた硬膜の、脊髄の背側と腹側で検出された（３４Ａ図）。脊髄外傷は、我々の実験的な状況の下で、配列番号１０の分布に影響を及ぼさないことがわかる。椎弓切除された通常の脊髄に、配列番号１０を５０μｇ投与した２時間後に、普及はおよそ２ｃｍ（図３４Ｂ）をカバーする距離で、投与部位から、尾方向および吻方向に拡散がみられる。免疫組織化学は、挫傷を負う脊髄上への投与の２４時間後に、外因的に送達された配列番号１０が脊髄の灰白質と白質の範囲内で吸収されて、分布することを確認した。免疫染色は、大部分は背面で検出され、硬膜の中で、そして、損傷中央で顕著である。脊髄は、ビヒクル治療をうけている動物から集められ、どんな標識化も示さない（図３４Ｃ）。
〔実施例３６〕
配列番号１０治療による、時間および投与量に依存するＲｈｏ不活性化
図３５を参照して、配列番号１０の治療的な利益は、ＳＣＩの後で起こるＲｈｏの活性化を妨害する能力に依存する。したがって、硬膜外投与の後で脊髄の中で配列番号１０の分布を確立した後に、活性のあるＲｈｏレベルは挫傷を負った脊髄組織で、ＲｈｏＡのウエスタンブロット検出に続き、エフェクター・タンパク質であるロテキンのＲｈｏＡ結合領域で親和性沈殿を用いて測定することが出来る。活性のあるＲｈｏレベルは、プルダウン分析評価を使って、免疫染色しより詳細に測定される。挫傷を負った脊髄の組織の活性のあるＲｈｏレベルの画素密度は、処理した脊髄試料の正常化された活発なＲｈｏ濃度を計算するのに用いた。投与量の反映および可逆性実験のために、結果はグループにつき３〜９匹のラットに対して平均化される。
Ｒｈｏ不活性化に関する投与量−反応曲線は、配列番号１０の最小有効量を測定するため
に得られた。配列番号１０の投与は中程度の挫傷（１０ｇの重量を２５ｍｍの高さから落とした）によって誘導されるＳＣＩの後で、ラットの脊髄上へＴｉｓｓｅｅｌを用いてすぐ投与され、そして、活性のあるＲｈｏレベル（ＧＴＰ結合部位）を損傷の２４時間後に精査した。
先に示されるように、打撲損傷は全てのラットにおいて強いＲｈｏ活性化を生じる。この活性レベルは、異なる状況の下で観察される活性化Ｒｈｏレベルを正常化するのに用いられる。正常ラット脊髄のＧＴＰ結合Ｒｈｏレベルは、打撲を負ったラットにみられるものの約１５％であると見られている。模擬手術（椎弓切除）は、Ｒｈｏ活性化を著しく誘導してはいない。Ｔｉｓｓｅｅｌへの配列番号１０の投与は、通常の無傷であるか椎弓手術されたラット脊髄で見つかる基礎レベルへの打撲損害に起因するＲｈｏ活性化を妨害する。Ｒｈｏ活性化のこの抑制は、配列番号１０の一回１５μｇのの投与量が最大である。１５μｇの投与量は、一貫して強く再生可能なＲｈｏ不活性を提供するため、効力の研究のため選択された。投与量反応曲線の回帰分析（ｒ２＝ ０．９７）によりラット脊髄中の５０％のＲｈｏ不活化のために必要な投与量は約２μｇであることが示される。
薬がどれくらい生体内で治療的なレベルに残ったかについて決定するために、配列番号（５０μｇ）は脊髄損傷なしの硬膜に投与した。傷は再び開けられ、そして、脊髄は配列番号１０投与（２時間、２４時間、２日、４日と７日）の後、異なる時間に配列番号１０送達部位で２等分し傷をつけた。動物は、それから４時間後にサンプルとして供給された。配列番号１０による前処理は、ＳＣＩの最高４日前に、硬膜外投与の後でＲｈｏ活性化を防ぐことができる（図３５Ｂ）。抑制は、Ｔｉｓｓｅｅｌで投与の後、脊髄に配列番号１０の速い吸収を明白に示している２時間の処理前のグループに明らかである。治療的な配列番号１０レベルは配達の後、少なくとも４日の間維持される、一方、投与の７日後は、配列番号１０前処理はＳＣＩの後のＲｈｏの活性化を防がない。配列番号１０によって引き起こされるＲｈｏ ＡＤＰリボシル化が元に戻らない間、細胞のＲｈｏの通常のタンパクターンオーバーは観察されるリバーシブルを説明することができる。
〔実施例３７〕
配列番号１０の遅延治療は、マウスの機能的な回復を改善する
図３６を参照して、細胞浸透性配列番号１０が最適化されたあと、実験は半切除マウスモデルで繰り返され、そして、１μｇが機能的な回復を促進するのに十分な量であることが証明された。ＳＣＩ患者は、損傷から２、３日以内に、通常手術を施し、減圧し、安定させ、脊髄を固定する。したがって、治療的な干渉のために時間の枠を理解することは重要である。マウスのより速い機能的な回復と操作の容易さのため、ＳＣＩの後の配列番号１０送達のための時間枠は、このモデルで調べられた。行動の回復は、修正されたＢＢＢスケールで（Ｄｅｒｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ， ２２：
６５７０−６５７７）、２週間、後肢の運動を記録することによって評価される。即時または遅延した送達の後の配列番号１０の運動機能への影響は、Ｔｉｓｓｅｅｌで送達された１μｇの量を使って比較した。より詳しくは、動物の運動機能は、バソー、ビーティと、ブレスナハン（ＢＢＢ）オープン・フィールド運動率測定を使って１５ｕｇの配列番号１０で治療された１１匹のラットと１２の対照群ラットについて評価された。ＢＢＢスコアは２人の観察者により４分間評価され、そして、運動はもう１人の観察者により、ビデオカメラを使ってテープ記録される。両後ろの四肢のための得点は、平均値をとり、各セッションの得点を得た。ＢＢＢスコアは、別々のシートを使って、毎回ブラインドで登録した。マウスの後肢運動の移動に関する回復は、治療群につき４〜６匹のマウスについて、修正ＢＢＢスコア付けを使って測った。ラットとは対照的に、マウスは足の引きずり現象を示さず、そして、ＢＢＢスケールは２１ポイントのラットスケールから１７ポイントのスケールに修正した。
第２の変わりやすさを計測するため、各々の治療群はそれぞれ対照群を持ち、遅延手術は２４または７２時間に治療されることが望まれる。最初の脊髄損傷は、０日と考えた。
即時の送達を受けた動物のグループは、１回だけの手術を受けて、配列番号１０かＰＢＳを含むＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）で治療された。２４時間以内の初期の外傷後の回復段階の間、急速な改善が、恐らく配列番号１０の神経保護的な効果のため存在する。頻繁な損傷後１６日後、治療をうけている動物は、コントロールのマウス（図３６Ａ）で２−３の関節の動きで掃除すること（６のＢＢＢ）と比較して荷重足底ステップに達した。（１０のＢＢＢ）。
疾病後２４時間の治療をうけた動物に再麻酔をし、皮膚と筋肉を再び開き、そして脊髄の傷ついた表面に治療を施したで。治療が２４時間遅延した場合、改善された機能的回復は治療をうけているマウスでまだ観察される（図３６Ｂ）。配列番号１０治療をうけているマウスは、１６日目に、コントロールのマウスより上の顕著な３ポイントの改善を示す。即座の治療群で観察されたように、それらの動物はまた一貫した、荷重足底ステップに合った。しかし、この実験では、段階がある早めの回復は、即座の治療群の場合のような記録は残さなかった。この影響は、マウスが２４時間以内に２つの全身麻酔を受けたという事実によって隠された。
脊髄半切除の７２時間後に配列番号１０を受けた動物は、遅延した送達と全体的なより良い回復（３６Ｃ図）に向かう傾向の最高３日後に、一過性の重要な改善を示した。しかし、この最初の改善の後、回復の傾斜は少なくなり、そして、最終的な平均的スコアは１６日（３６Ｃ図）後の制御マウスとあまり異ならない。
〔実施例３８〕
Ｒｈｏアンタゴニスト配列番号１０による硬膜外治療は、十分に耐性がある
図３７を参照して、ラットの実験はを行うことが出来、配列番号１０または、図３と４に記載したバリアントによる治療の後、安全性と機能回復の評価をした。ラットの脊髄挫傷の後、機能的な回復を評価するために、合計２５匹の雄の動物に手術を施し、ビヒクル（Ｔｉｓｓｅｅｌ中のＰＢＳ）群または１５ｇの配列番号１０を含むＴｉｓｓｅｅｌの群に２つの治療群に無作為割付けした。手術の後、膀胱機能が戻るまで、１日２回の膀胱の手動圧搾を含む術後ケアが行われた。すべてのラットは、治療群にかかわらず、１０から１５日のうちに自主的な膀胱機能を回復する。体重の分析により、動物のすべての群（配列番号１０とビヒクルを治療されたもの）が通常重くなることが示される（３７Ａ図）。グループ間の有意差はない。もう一セットの実験では、５０μｇの投与量で治療されるラットは、１．５ヵ月の観察間にわたって、通常の体重増加を提示する。
硬膜外投与の長期安全性は、ヒトで必要でありえる手順と同様に、ラットの別々のセットを使い、椎骨椎弓切除の後で、脊髄へのＴｉｓｓｅｅｌ中の配列番号１０の、ラットへの投与で確かめられた。組織は、１０または５０μｇの一回の投与の３ヵ月後に集められた。配列番号１０／Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）で扱われる脊髄の広範囲な組織学的分析は、形態学または細胞変化を示さない（通常の脊髄、偽物操作したコントロール、ビヒクルコントロール、および開けられた／無傷の配列番号１０で処理した硬膜）。図３７Ｂと３７Ｃは、損傷後３ヵ月の、手術に引き続き、ビヒクルと５０μｇの配列番号１０治療をうけた動物における、ラット脊髄の代表的な縦断面を示す。
〔実施例３９〕
配列番号１０による治療は、ラットの運動能力回復を改善する
図３８に関して、ラットの実験は、配列番号１０で、または、図３および４で記述されるバリアント配列で治療の後の、機能的な回復の評価のために行われる。脊髄の圧迫深度は
、打撲損傷の再生率の物指しとして観察された。圧迫深度の違いは、配列番号１０と対照群の間で観察されなかった。
動物は手術を施されて、賦形材（ＰＢＳ）処理群（ｎ＝１２匹）または１５ｇの配列番号１０（ｎ＝１１匹）処理群の２つの治療群に無作為に割付けされた。すべての治療は、フィブリンシーラントで投与された。動物には膀胱機能が戻るまでの１日２回膀胱の手動発現を含む、術後ケアを施した。すべてのラットは、治療群で独立して１０日から１５日の間に自主的な膀胱機能を回復する。打撲傷の１日後に、すべてのラットはＢＢＢスコアで１未満であることを伴う、後肢の弛緩性麻痺を示す。
体重の分析法は、２つの治療群（配列番号１０処理群と賦形材処理群）が通常体重であることを示す（図３８Ａ）。８週間以上の実験において両群の間で体重に違いは無かった（Ｐ＝０．９８、双方向ＡＮＯＶＡの反復計測）。もう一セットの実験では、配列番号１０を５０ｇの投与量で治療されたラットは、１．５ヵ月の観察期間にわたって、通常の体重増加を示した。
ビヒクル／ＰＢＳ処理された動物と比較して、配列番号１０で処理されたラットの運動能力スコアの顕著な改善がみられた。回復は、配列番号１０治療をうけているラットで典型的により速い。損傷から１週間後、治療を受けた動物は、腰、ひざ、および足首の全３つの関節で、運動と関連したＢＢＢスコア＞４を得た。コントロールの動物では、ＢＢＢスコアは２と３の間にあり、２つの関節での運動しか観察されない。コントロールの動物ではＢＢＢスコアは四週目に落ち着くが、処理したラットでは依然良くなり続けている。損傷から５〜６週間後、移動に関する機能の最大の改善が全ラットで達成される。図３８Ｃは、処理されたラット対コントロールのラットによって得られた進捗率および最終スコアの、全体図を与える。全体として、治療をうけているラットはより速く良くなり、それらの後四肢のいくらかの機能的な使用を回復する。足底の配置を支た処理をされたラットの体重のパーセンテージは、６週間後にＢＢＢスコア＞９で、コントロールのものが３５％であるのに対し、７５％に達する。さらに、損傷後６週で、治療をうけているラットは、コントロールのラットのどれと比較しても時折（ＢＢＢ＝１０）であるか、一貫した（ＢＢＢ＝１１）重さを裏づけられた足底のステップを実行しない。対照的に、大多数の対照動物は３つの共同の運動だけを示して、重さ支持なしで広い動作とともに動く （ＢＢＢ
＜９） （図３８Ｃ）。
〔実施例４０〕
ＳＣＩとフィブリンマトリックスへのＲｈｏアンタゴニストの配達
動物の取扱いは、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅのカナダ会議のガイドラインに従った。動物は
、１２時間の明暗サイクルの下、水と食物の自由な摂取のもと飼育した。雌のＢａｌｂ−ｃマウス（４週）を用いた。雌のＢａｌｂ−Ｃマウスは、０．４ｍＬ／ｋｇのｈｙｐｎｏｒｍと５ｍｇ／ｋｇのジアゼパムで麻酔した。椎弓切除の後、背部の半切除はＴ７において、バネハサミを用いて行った。一投与量の配列番号１０（４μＬ中に１μｇ）またはビヒクル（ＰＢＳ）はフィブリンシーラントにて、露出した索状組織に、１５μＬのフィブリノゲン（Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標） ｋｉｔ ＶＨ， Ｂａｘｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オンタリオ）に１５のμＬのトロンビンを混ぜることによって投与した。皮膚と筋肉が縫合される前に、溶液は２、３分の間に重合化した。
イソフルラン麻酔（３−５％）のもとで、ラットのＴ９椎骨において、椎弓切除を行った。ＳＣＩは、ＮＹＵ挫傷衝撃装置を用い、露出した脊髄の上２５ｍｍの高さから、１０ｇの重さのロッドを落とすことにより誘導した。Ｒｈｏ不活化実験で、数匹のラットは、背側部過片側切除により損傷を加えられた。衝撃装置からのロッド速度と圧縮は、記録される。この技術は、再生可能で段階的な方法で、後肢の麻痺を引き起こす。椎弓切除だけのものは、疑似手術として実行される。配列番号１０（異なる濃度で）またはコントロールのビヒクル（ＰＢＳ）は同じ５μＬ量で、１５μＬのトロンビンおよび１５Ｌのフィブリノゲン（ＴｉｓｓｅｅｌキットＶＨ、Ｂａｘｔｅｒ社、オンタリオ）と混ぜ合わせた。テスト化合物投与の後、表面を覆う筋肉と皮膚は縫合された。
形態的な評価のために、ｂｅｈａｖｏｒｉａｌな研究会からのラットは麻酔薬の過剰投与量でサンプルとして供給され、０．９％の食塩水溶液として尾部に注入され、引き続き、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）リン酸塩緩衝液を注入した。Ｔ９に集中している脊髄組織は、脊柱から取り除かれ、一晩、４％のＰＦＡに後固定される。１ｍｍの脊髄の１０の節は、頭部側および尾部側を、パラフィンブロックに埋め込み、予備組領域組織計測のためにミクロトームの上で横断面に沿って切片化した。脊髄組織もまた、集められ、もう一セットの実験のため、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。クリオスタット切片の免疫組織化学実験のために、１ｃｍの脊髄（中心点）は、４％のＰＦＡで後固定されて、３０％の蔗糖溶液に変えた。翌日、組織は冷イソペンタンで瞬間冷凍され、Ｏ．Ｃ．Ｔに包埋された。
ウエスタンブロットとプルダウン分析評価のために、動物は麻酔薬の過剰投与量サンプルとして供給され、０．９％の食塩水だけが注がれた。脊髄組織は、背側と腹側、または頭部から尾側まで異なる区域きに分けられた。組織は食塩水で洗われ、そして、硬膜は取り出された。プルダウンアッセイのため、８ｍｍの脊髄組織は、椎弓切除領域の上に液体窒素を注ぐことにより、凍結された。凍結した脊髄サンプルはＶａｒｉ−Ｍｉｘ ＩＩＩホ
モジェナイザー（Ｄｅｎｔｓｐｌｙ Ｃａｕｌｋ、トロント、カナダ）を用いて均質化さ
れ、ウエスタンブロットのために氷冷ＮＰ−４０溶解バッファで可溶性にされた。
〔実施例４１〕
配列番号１０は挫傷を負うラット脊髄の損傷量を減少させる
図３９で示されるように、配列番号１０またはバリアントタンパク質で処理された脊髄損傷組織の組織学的分析は神経保護作用の測定のため用いることが出来る。
解放フィールド評価をするラット被療者はサンプルとして供給され、組織は組織学のため準備された。
脊髄の灰白質、白質および全切片領域の予備領域は３枚の領域毎の５μｍの横断面切片を用いて測定された。
複数の領域は、中心周辺に集中する２ｃｍの地域に沿って、１ｍｍの間隔でサンプルとした。イメージはＡｘｉｏｓｋｏｐプラス光学顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）と
ＱＩＣＡＭデジタルカメラ（Ｑｉｍａｇｉｎｇ、ＢＣ、カナダ）を使って撮影され、ノーザンエクライプソフトウェア（Ｅｍｐｉｘ、ＯＮ、カナダ）を使用して分析される。灰白色と白質の予備組織節領域は方程式Ｓｓｐ％ ＝（Ｇｓｐ ＋ Ｗｓｐ）／Ｔｓ＊１００を
用いて分析され、ここで、（Ｇｓｐ）と（Ｗｓｐ）は各々、灰白質と白質の予備領域であり、（Ｔｓ）は全脊髄領域である。分析は、治療群に対してブラインドで実行される。
シグナルカスケードとしての、脊髄損傷に引き続く大量の組織の損失は神経細胞やグリア細胞を標的としたアポトーシス性細胞死の引き金となる。この過程を通した細胞損失の範囲は損傷のから数日以内で決定され、大まかに損傷後の機能回復の程度を指定する。その理由のために、配列番号10が神経保護作用の特性を備えているかどうかがそして、挫傷の部位の障害のサイズを評価する。
残存する灰白色と白質の割合（％）は、損傷後二ヶ月に、1cmの障害サイトをおおう2cmの全長の上で、尾部から頭部にむかう、脊髄に沿って1mmの間隔で取られた領域の切片の画
像分析により行われた。機能的回復群からのすべてのラットは、分析に含まれる(n=23)。全損傷部位の有意差がグループ間に存在し、配列番号10治療をうけている動物がコントロール群に対して25%の組織損失減少を提示した。この違いは、頭部から患部中央にかけて顕著で（39A図;25%）、一方変化患部から尾部のサイトでは反応が薄い（10%）。挫傷の2ヵ月後に、対照動物のT9脊髄の多くは、患部中央（39A図）に残っている明白な灰白質と10%未満の白質なしで大きな嚢胞性の空洞によって占められる。対照的に、治療をうけているラットの患部中央の脊髄は、周辺の縁からなる残存白質の平均10%の増加を持つ。処置をしたラットに生じる白質の増加は、中央から４mmの突起が生じる割合が22%に達した。
灰白質は、損傷部位中央から2〜4mmで、治療をうけているラットでもかなり保存される。全体的な有意差は両方の白（P＜0.0001）の障害場所に残っている脊髄組織の範囲で観察
されました、そして、繰り返される2つの方法を使用している治療をうけていて制御ラッ
トの間の灰色の問題（P = 0.038）は分散分析を測る。節約される組織の範囲は、全体の
障害域を表すために各々のラットのためにカーブの下で領域を計算することによって、さらに特徴づける。図39Bは、治療をうけているラットが障害によって占領される地域の25%の減少を示したことを証明する。ヒトと同様に、ラットのSCIの後の障害サイトの嚢胞性
の空洞の形成は一般の出来事である。ルキソールファストブルー染色は、治療をうけているラットが対照動物より小さな空洞現象でより大量の小さいミエリンを示すことを証明する。これは、治療をうけているラット（対照群10.3±0.7mm対治療をうけているもの7.8±0.7mm、P0.01、非対称スチューデントTテスト）（示されないデータ）で、減少した縦の
障害長によっても反映される。ついに、全体の障害域と最終的なBBBスコア間の有意な相
関関係が配列番号10である線形回帰分析(Deming)は、ラット（P=0.02）（示されないデータ）で示した。
〔実施例４２〕
配列番号１０治療はラットの変性症に影響を与えなかった
図４０で述べられたように、配列番号１０またはバリアントタンパク質は、不必要な副作用を見つけるための神経性の痛みの動物モデルをテストされることが出来る。
成長している異常な軸索が脊髄精神的外傷の後、神経障害苦痛の発達に至ることは、知られている。増加している直径のＶｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントに反応した手足禁断は、機
械の刺激に感度を試験するのに用いられる。ラットは上昇した、純度の高い金属スクリーンでプレキシガラスボックスに置かれて、テストの前に６０分の間慣れさせる。フィラメントは、後ろの手足ごとに足底の表面に投与される。フォンフレイフィラメント閾値（力のグラム量）は、４回から撤回３〜４を引き出すのに必要な力として記録される。左右の後肢のためのデータは、平均値にされる。観察者は治療群に対してブラインドにされる。治療群に対して、５〜７匹のラットが評価された。
負傷したラットの感覚の結果に関する配列番号１０の影響が、調べられることができる。ＶｏｎＦｒｅｙテストは、動物がひどい挫傷の６週間後に移動に関する回復の彼らの安定期に達したあと、感度の違いが機械の刺激にあるかどうか確かめるのに用いられる。感覚刺激への足撤回反応は、調整された調査で両後ろの四肢のために測られる。触覚型の異痛症の同じレベルは、独立して彼らの治療群の全ての負傷したラットで発達する。１５または５０ｇのビヒクルまたは配列番号１０治療は、怪我（図４０）の６週間後に、前肢引き込み閾値に影響を及ぼさない。
〔実施例４３〕
配列番号１０はカドヘリンとオクルディンの発現と局在化を修正する
調査されるべき次の血管形成プロセスは細胞間接触点または交差点であり、それらの適当な機能は毛管の細管の形成とメンテナンスのために必要である。細胞間結合の完全性とＲｈｏＧＴＰａｓｅｓの関係は、特に接合部タンパク質カドヘリンとオクルディンの関係で示されている（Ｈｉｒａｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｂｒａｇａ ｅｔ ａｌ．， ２
００２； Ｗｏｊｃｉａｋ−Ｓｔｏｔｈａｒｄ ａｎｄ Ｒｉｄｌｅｙ， ２００３）。ＨＵＶＥＣ培地においてこれらのタンパク質の状態を調べるために、それらはコラーゲンコートのスライドの上へおかれ、そして、２４時間の間配列番号１０（またはコントロールと
してのＰＢＳ）で処理された。スライドはそれから、汎カドヘリン抗体で固定されて、蛍光第二の抗体でインキュベートした。免疫蛍光顕微鏡検査は、コントロールＨＵＶＥＣにおいて、カドヘリンがより高い（２ｘ １０3）細胞種まき密度（図４１Ａ左パネル中の小さな矢）と同様に、それ以下（２ｘ １０3）のために細胞接触地帯に沿って局所化されることを示す。しかし、２５ｇ／ｍＬの配列番号１０の存在下で行われる２４時間のインキュベーションのために、より少ない細カドヘリン染色の胞間領域と同様（図４１Ａ右パネル小矢印）、一般的に膜関連でないカドヘリン染色であるように見え、細胞間ジャンクションは特に高い細胞播種濃度において、崩壊するように見え、細胞間の可視ギャップの結果となる（図４１Ａ、右のパネル、大矢印）。このように、カドヘリン染色が配列番号１０治療をうけているＨＵＶＥＣの細胞細胞接触地域のいくつかでまだ見られることができる間、細胞間境界の完全性は中断される。そして、連続的であるより斑点状に見える。そして、未処理の細胞のそれらと比較される。
更なる、図で示した実施例により、
カドヘリンに対する免疫蛍光シグナルの強度の免疫蛍光強度がコントロールの細胞に比べ配列番号１０処理した細胞で強くなることが明らかになる。
この発見は、配列番号１０により不活性化されたＲｈｏＧＴＰａｓｅがカドヘリンの局地化だけでなく、彼らの発現レベルも変えるかもしれないことを示唆する。この仮説は、１０または２５μｇ／ｍＬの配列番号１０で２４時間処理した扱われた準融合性ＨＵＶＥＣ抽出液上でウエスタンブロット分析を行うことによって調査される。また、免疫検出は汎カドヘリン抗体を使って達成される。細胞抽出物タンパク質の等価量がゲルの各々のレーンにロードされるが、ゲル類から膜へのタンパク質の移動効率は、発現がカドヘリンとＲｈｏ ＧＴＰａｓｅｓから独立しているＥｒｋタンパク質に対する抗体を使ってモニターされる。配列番号１０の両方の濃度は、コントロールの細胞（図４１Ｂ）と比較したカドヘリンのレベルを顕著に減少させる（１０μｇ／ｍＬに対し，〜４０％および２５μｇ／ｍＬに対し〜７０％；ｐ(０．００１）。
類似した実験を、局在化と密着結合タンパク質であるオクルディンの発現に関しての配列番号１０の効果の調査のために行った。オクルディン免疫蛍光シグナルは比較的微弱であるので、高い細胞密度（２ｘ１０4細胞）で播種したＨＵＶＥＣによってのみ調べること
が出来る。調査結果はカドヘリンのそれらと非常に類似していて、オクルディンがコントロールのＨＵＶＥＣの連絡領域の細胞に沿って、連続したバンドにのみ局在化していることが示される（図４２、左パネルの矢印で示される）。
２４時間の２５ｇ／ｍＬの配列番号１０による治療の後で、少しの細胞連絡領域も見え無い。大部分のオクルディンシグナルは、細胞内分布と一致するように見える（図４２Ａ、右パネル）。カドヘリンの場合とは異なり、ＨＵＶＥＣの２４時間の治療に２５ｇ／ｍＬの配列番号１０を付け加え、オクルディンの強さの明らかな減少が、ウェスタンブロットをする事によりわかる（図４２Ｂ、左のパネル）。配列番号１０治療が４８時間まで広げられると、コントロールの細胞と比較して、著しい（〜 ４０ ％； ｐ＜０．００１）オ
クルディンのレベルの減少が、明らかになる（図４２Ｂ、右のパネル）。また、Ｅｒｋロード／移動制御は、同程度の細胞タンパク質レベルがサンプル間にあることを明らかにする。
上述の免疫蛍光検査法実験のために、ＨＵＶＥＣはコラーゲン−Ｉでおおわれている８穴チャンバースライドの上へ播種され、１６〜２４時間付着するのにまかせた。処理剤によるインキュベーションの後、細胞は１０％のホルマリンで固定され、それから、０．２％のトリトンＸ−１００（アクチンとカドヘリン視覚化のために）を３０分間浸透させるか、或いは、１００％の氷温ＭｅＯＨ（オクルディン視覚化のために）で、５分間の固定をした。アクチン染色のために、細胞は４５分間３％のＢＳＡでブロックされ、それから、ローダミン（１／３００）に結合するファロイジンとともに、室温で１時間インキュベートした。カドヘリン染色のために、固定された細胞は１０％のヤギ血清で３０分間ブロックされ、そしてマウス単クローン汎カドヘリン抗体（１／４００）とともに、室温で９０分の間インキュベートした。検出は、室温で１時間、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１／４００）を用いて行った。オクルディン染色のために、細胞は固定されて、カドヘリン検出のためにブロックされ、そしてウサギポリクローナルオクルディン抗体（１／５０）を用いて、室温で１２０分間インキュベートした。発見は、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／４００）を通して行った。ＳｌｏｗＦａｄｅ（登録商標）グリセロール抗褪色剤は、蛍光の褪色を減少させるために用いられた。スライドは、倒置型蛍光顕微鏡（カールツァイス、西ドイツ）を使って調べた。顕微鏡写真は、ノーザン・エクライプ・ソフトウェアを使って撮影された。
カドヘリンの結果と共に、これらのオクルディンのデータは、
配列番号１０が、特に接合部タンパク質カドヘリンとオクルディンに関して、細胞間接触領域の構築の中断することを含み、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＵＶＥＣの菅形成の阻害を仲
介することを示唆した。これらは違って配布される接合部タンパク質であるだけでなくて、彼らの全体的な表現レベルは、かなり減らされるように見える。ここに提示される発見は配列番号１０が主に血管形成の管形成ステップを抑制することを示し、そして、管形成のその配列番号１０によって誘発された縮小は細胞間接触の損失で、そして、接合部分子カドヘリンとオクルディンの下の規制で相関する。
当業者は、所定の実験により認識、或いは確かめることができ、そして、特定の手順に対する多くの等価な例がここに記述される。そのような等価な例はこの発明の範囲内であると考えられて、特許請求の範囲によってカバーされる。
ここに引用されるすべての出版物の内容は、参照によってここに取り入れられる。

Claims (22)

  1. 配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはＰＥＧ化された前記ポリペプチド。
  2. 配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  3. 請求項１または２に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
  4. 前記医薬組成物が、無菌もしくは滅菌可能であるか、または滅菌されている、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 前記医薬組成物がバイアル中に、単位投薬量、または単位投薬量の整数倍の量で含まれる、請求項３または４に記載の医薬組成物。
  6. 前記薬学的に許容されるキャリアが基質を含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 前記基質が脱水または凍結乾燥されている、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 前記医薬組成物が乾燥されたものである、請求項６に記載の医薬組成物。
  9. 前記基質が組織接着剤を含み、前記組織接着剤がフィブリンまたはフィブリンシーラントであり、フィブリンシーラントが、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）、Ｃｅｂｕｓ（商標）、Ａｔｅｌｅｓ（商標）、Ｐｒｏｌｅｕｓ（商標）、Ｖｉｖｏｓｔａｔ（登録商標）、 Ｃ
    ｒｙｏＳｅａｌＦＳ（登録商標）、ＣｏＳｅａｌ（商標）、Ｄｕｒａｓｅａｌ（登録商標）、Ｐｏｌｉｐｈａｓｅ（登録商標）、Ｂｉｏｇｌｕｅ（登録商標）、ＡｖｉｔｅｎｅＦｌｏｕｒ（商標）、Ｄｅｒｍａｂｏｎｄ（商標）、Ｈｅｍａｓｅｅｌ、Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ−Ｐ（登録商標）、Ｆｉｂｒｏｃａｐｓ（登録商標）、Ｃｒｏｓｓｅａｌ（商標）、Ｅｖｉｃｅｌ（商標）、およびトロンビンを含む群から選択される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 治療が必要な被療者における脊髄損傷を治療するための、請求項３〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. ａ）前記被療者が神経疾病または神経変性疾病を有し、前記疾病が、スタルガルト病、レーバー先天性黒内症、ベスト病、先天性脈絡膜欠如、網膜分離症、バルデー・ビードル症候群、前方虚血性視覚神経障害、プルチェル網膜症、視神経炎、視神経円盤浮腫、コーツ病及び／またはレーバー粟粒性動脈瘤、免疫性で末梢性神経障害、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、シャルコー・マリー・ティース病、巨大軸索神経障害、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性の筋萎縮症、進行性の延髄遺伝性筋萎縮症、ヘルニア性、破裂性または脱出性の椎間板症候群、頸部脊椎症、叢疾患、胸部出口破壊症候群、ガンマジケトン（シンナー中毒者の神経障害）、グランバレー症候群、ハンチントン舞踏病、認知症、プリオン病および緑内障からなる群から選択されるか、あるいは、
    ｂ）前記被療者が、脳梗塞、手術、梗塞症、感染症、毒性薬剤への暴露、悪性腫瘍または腫瘍随伴症候群、外傷または事故による損傷を原因とする神経系損傷を有する、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 前記被療者は、外傷性脳損傷を有する、請求項１０に記載の医薬組成物。
  13. 治療が必要な被療者の黄斑変性の治療のための、治療が必要な被療者の目の中の、黄斑変性症に伴う網膜下血管新生および／または新生血管組織の増殖の速度を抑止または減少させるための、あるいは、保護が必要な被療者の眼中の網膜光受容細胞を黄斑変性症に伴う細胞死から保護するための、請求項３〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. ガンを予防または治療するための、被療者のガンの転移性腫瘍細胞の制御されない増殖や拡散や遊走を防止または抑制するための、あるいは、被療者のガンの腫瘍切除部位に近位の宿主組織の切除端において、切除端に存在する転移性腫瘍性細胞の、制御されない増殖、拡散または遊走を防止または抑制するための、請求項３〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物は、前記切除端の表面上に、前記切除端の表面下に、または、被療者体内に残る切除端の近位の組織中に直接投与されるのに適しており、前記ガンが乳ガン、脳腫瘍、大腸ガン、皮膚ガン、腎臓ガン、および肝臓ガンからなる群から選択される、医薬組成物。
  15. 前記医薬組成物は、注射、局所的投与、または移植に適している、請求項３〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 前記被療者は、ヒトである、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  17. 前記被療者において、軸索もしくは神経突起の再生または成長が促進されるか、あるいは、血管新生が抑止される、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 請求項１または２に記載のポリペプチドおよび基質を含むキット。
  19. 前記基質が脱水または凍結乾燥されている、請求項１８に記載のキット。
  20. 前記基質を再構成するのに適切な量の無菌水をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
  21. 前記基質が組織接着剤を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のキット。
  22. 前記組織接着剤がフィブリンまたはフィブリンシーラントである、請求項２１に記載のキット。
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