CN109414475A

CN109414475A - 新型肽和肽模拟物

Info

Publication number: CN109414475A
Application number: CN201780041505.4A
Authority: CN
Inventors: 科林·格林; 金易林; 布拉德福德·杜夫特
Original assignee: Medical Treatment Co Ltd; Oakland University
Current assignee: Medical Treatment Co Ltd; Oakland University
Priority date: 2016-05-03
Filing date: 2017-05-02
Publication date: 2019-03-01
Also published as: EP3452072A4; US20200129582A1; WO2017192620A3; WO2017192620A2; US20180008664A1; JP2019522041A; CA3022763A1; EP3452072A2

Abstract

提供了用于治疗或预防血管及其它疾病、病症和状况的包含间隙连接通道或半通道阻滞剂或抑制剂的化合物和组合物、及其使用方法。具体地，本公开内容提供了具有可用于调节间隙连接通讯和半通道开放及其它活性的药代动力学和药效学性质的肽和肽模拟物，其中本文描述的肽和肽模拟物是间隙连接通道抑制剂。进一步公开了肽和肽模拟物的序列。

Description

新型肽和肽模拟物

相关申请

本专利申请要求于2016年5月3日提交、名称为NOVEL PEPTIDES ANDPEPTIDOMIMETICS的美国临时申请序列号62/331,416的优先权，所述美国临时申请的内容以引用的方式并入本文，如同全文阐述一样。

技术领域

本发明涉及肽和肽模拟物。

背景技术

下述包括可用于理解本发明的信息。它并非承认本文中具体或隐含地提及或引用的任何信息、出版物或文件对于目前描述或请求保护的本发明是现有技术或必要的。

本文所述的所有美国专利、美国专利申请公开、外国专利、外国和PCT公开的申请、文章及其它文件、本文指出的参考文献和出版物、以及在此发布的任何一个或多个专利中引用的作为参考文献列出的所有那些，在此以引用的方式全文并入。

间隙连接是促进细胞-细胞通讯的细胞膜结构。它们由细胞间通道簇组成，所述细胞间通道直接连接两个相邻细胞的细胞质，并且允许各种分子、离子和电脉冲直接在它们之间通过。间隙连接通道对于分子量<≈1SpekDa的物质是可渗透的。渗透性取决于连接蛋白类型和渗透分子的电荷。这些通道在彼此接触的几乎所有动物细胞中发现，并且在身体的基本上所有组织中表达，除了成熟的骨骼肌和移动细胞类型例如精子和红细胞之外。它们表现为紧密堆积的颗粒的簇(或斑)，其中每个颗粒是单个间隙连接通道。可以存在许多间隙连接斑/细胞，其中每个斑含有几个到数千个细胞间通道单元。

细胞间间隙连接通道通过两个半通道(half-channel)(称为“连接子”或“半通道(hemichannel)”)的头对头对接形成，其中一个细胞膜中的半通道与相对膜中的另一个半通道对接，以形成单个间隙连接通道。每个间隙连接半通道是六角形排列在水性孔周围、六个四次跨膜整合膜蛋白(称为“连接蛋白”)的组装。所有连接蛋白都由四个高度保守的α-螺旋跨膜区段组成，所述跨膜区段由两个细胞外环和一个细胞内环分开。氨基末端和羧基末端细胞内定位。细胞外环识别并且区分相邻的连接蛋白细胞外环，并且可以在通道内腔和细胞外空间之间形成不可渗透的密封(White TW等人(1994)Journal of Cell Biology125:879-892)。已鉴定了人连接蛋白家族的二十一个成员。它们的主要不同之处在于它们的细胞内环和羧基末端的序列，其中每个连接蛋白具有基于其推定分子量(以千道尔顿计)的名称。例如，连接蛋白26是26kD的蛋白质。

除促进细胞-细胞通讯之外，连接蛋白43间隙连接蛋白似乎也在急性损伤应答和一些慢性疾病中起重要作用，其中蛋白质表达在前者中下降而在后者中上升。也可能牵涉间隙连接半通道。在与邻近细胞对接之前，连接蛋白43半通道由一些人报道为具有低开放概率，因为开放通道构成大的相对非特异性的膜孔，而连接蛋白43半通道被说成在静止条件下被严格控制(Bukauskas FF等人(2000)Proceedings of the National Academy ofSciences 97:2556-2561；Contreras JE等人(2003)Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 100:11388-11393)，它们也被报道响应许多损伤特征性因子而开放，所述因子包括促炎细胞因子(Retamal MA等人(2007)Journal of the Society forNeuroscience 27:13781-13792)、代谢抑制(John SA等人(1999)Journal of BiologicalChemistry 274:236-240；Contreras JE等人(2002)Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 99:495-500)、Ca²⁺浓度(细胞质Ca²⁺浓度的增加或细胞外浓度的降低)(Li H等人(1996)Journal of Cell Biology 134:1019-1030；Thimm J等人(2005)Journal of Biological Chemistry 280:10646-10654；De Vuyst E等人(2009)CellCalcium 46:176-187)、以及感染性材料如革兰氏阳性细菌细胞壁蛋白(肽聚糖或脂多糖(lip polysaccharide))(Robertson J等人(2010)Biochemical Journal 432:133-143)。间隙连接通道和蛋白质已关于各种病理状况进行讨论，所述病理状况包括脊髓损伤(O'Carroll SJ等人(2008)Cell Communication&Adhesion 15:27-42；O'Carroll SJ等人(2013)Neuroscience research 75:256-267；Tonkin RS等人(2014)Frontiers inMolecular Neuroscience 7:102)、早产儿缺血和窒息(Davidson JO等人(2012)Annals ofNeurology 71:121-132；Davidson JO等人(2014)PloS One 9:e96558)、感染(Eugenin EA等人(2011)The Journal of Neuroscience 31:9456-9465)、脑型疟疾(Zhang J等人(2013)Connexin-Based Therapeutic Approaches to Inflammation in the CentralNervous System.In:Connexin Cell Communication Channels(Oviedo-Orta,E.等人，编辑)，第273-306页：CRC Press)、以及视网膜缺血再灌注损伤(Danesh-Meyer HV等人(2012)Brain 135:506-520)。据报道，通过炎性体途径，半通道开放也可能在慢性炎症中起作用(Kim Y等人(2016)Adv Protein Chem Struct Biol 104:1-37)。关于综述，参见Danesh-Meyer HV等人(2015)Prog Retin Eye Res.51:41-68(连接蛋白43上调和半通道开放牵涉继发性损害的各个方面，包括神经胶质细胞活化、水肿和血管完整性的丧失)。还参见Vinken,M(2015)Arch Toxicol.89(1):143-145。因此，虽然间隙连接允许离子和代谢产物在细胞之间的移动，所述移动对于细胞存活是至关重要的(Krysko DV等人(2005)Apoptosis 10:459-469)，但是大的、相对非选择性的、未对接的半通道孔的开放具有通过以下来驱动细胞死亡的能力：降低在损伤部位处的离子和代谢梯度(Takeuchi H等人(2006)Journal of Biological Chemistry 281:21362-21368)、妥协细胞渗透调节的能力(Quist AP等人(2000)Journal of Cell Biology 148:1063-1074；Rodriguez-Sinovas A等人(2007)Progress in Biophysics and Molecular Biology 94:219-232；Danesh-Meyer HV等人(2012)Brain 135:506-520)，并且促进二次损害的传播(Davidson JO等人(2013a)Current Drug Targets 14:36-46；Decrock E等人(2015)Cellular andMolecular Life Sciences 72:2823-2851。

小化合物如醇(庚醇、辛醇)、麻醉剂(氟烷和乙烷)、脂肪酸(油酰胺)、抗疟疾药物(奎宁衍生物)、甘草次酸及其衍生物、甘珀酸，已显示阻滞连接蛋白通道，但由于脱靶效应，这些化合物在其治疗应用中受限制。关于综述，参见Bodendiek SB和Raman G(2010)Current Medicinal Chemistry 17:4191-4230。还测试了其它更具体的抗连接蛋白方法。例如，连接蛋白43寡脱氧核苷酸反义物已局部应用，以在小鼠上的皮肤损伤(Qiu,C.等人(2003)Current Biology,13:1967-1703)、新生小鼠烧伤(Coutinho P等人.BritishJournal of Plastic Surgery 58:658-667)、以及啮齿类动物脊髓损伤(Cronin M等人(2008)Molecular and Cellular Neurosciences 39:152-160)中减少肿胀、炎症、并改善功能愈后。在同情使用病例中，连接蛋白43反义物已证实在非愈合性眼部烧伤中的功效(Ormonde S等人.(2012)Journal of Membrane Biology 245:381-388)。其它方法已集中于匹配连接蛋白细胞外环(例如间隙26、间隙27、肽5)(Evans WH(2015)Biochem Soc Trans43:450-459)、或连接蛋白43蛋白的细胞内区域的一部分的肽(例如间隙19、ACT-1)(D'Hondt C等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 432:707-712)。然而，如果后面两种肽要成为有效的，则它们需要跨越细胞膜。假设间隙26和间隙27作用于连接蛋白43半通道门控(在Wang N,De Bock M,Decrock E,Bol M,Gadicherla A,Bultynck G,Leybaert L(2013)Connexin targeting peptides as inhibitors of voltage-and intracellularCa2+-triggered Cx43hemichannel opening.Neuropharmacology 75:506-516中综述)。肽5(VDCLSRPTEKT)源自连接蛋白43的细胞外环2序列，并由O’Carroll等人(2008)，同上介绍，并且据报道具有浓度依赖性作用。参见Davidson JO等人.(2012)同上；Davidson JO等人.(2014)，同上；Danesh-Meyer HV等人。(2012)同上.

本领域仍然需要可用于治疗疾病、病症和状况，包括眼部和CNS疾病、病症和状况的新治疗剂，所述疾病、病症和状况可以通过半通道和间隙连接调节得到改善。特别需要跨越与炎症、水肿和/或氧化性应激相关的血管疾病、病症和状况的整个范围的新治疗剂。基于新间隙连接和半通道调节剂的发现，此类治疗剂在本文中进行描述且请求保护。

发明内容

本文描述且请求保护的本发明具有许多属性和实施例，包括但不限于本发明内容中阐述或描述或提及的那些。它并不预期是概括所有的，并且本文描述且请求保护的本发明并不限于本发明内容中鉴定的特征或实施例或者受本发明内容中鉴定的特征或实施例限制，所述特征或实施例仅包括用于说明性而非限制性目的。

本发明提供了具有药代动力学和药效学性质的肽和肽模拟物的生产，所述药物动力学和药效学性质可用于调节本文所述的间隙连接通讯和半通道开放及其它活性，以及它们在治疗其中间隙连接活性和/或半通道开放和半通道活性的调节是治疗上有益的疾病、病症和状况中的用途。

本文描述且请求保护的本发明涉及与间隙连接和间隙连接半通道蛋白结合的肽和肽模拟物。申请人的发明还涉及用于治疗、预防和改善血管疾病、病症和状况的效应的药物、组合物和方法，以及包含此类化合物和组合物的制品和试剂盒。在一个方面，本发明涉及用于控制间隙连接蛋白通道活性的化合物。在另一个方面，本发明涉及控制间隙连接半通道活性的化合物。

在一个实施例中，本文描述的肽和肽模拟物是间隙连接通道抑制剂。在一个实施例中，间隙连接包含连接蛋白43蛋白。在一个实施例中，间隙连接包含连接蛋白45蛋白。在另一个实施例中，本文所述的肽和肽模拟物是间隙连接半通道开放的抑制剂。在一个实施例中，间隙连接半通道包含连接蛋白43蛋白。在一个实施例中，间隙连接半通道包含连接蛋白45蛋白。在其它实施例中，间隙连接和半通道包含连接蛋白25、连接蛋白26、连接蛋白29(连接蛋白30.2)、连接蛋白30、连接蛋白30.3、连接蛋白31、连接蛋白31.1、连接蛋白31.3、连接蛋白31.9、连接蛋白32、连接蛋白36、连接蛋白37、连接蛋白40、连接蛋白40.1、连接蛋白46、连接蛋白46.6(连接蛋白47)、连接蛋白50、连接蛋白58、连接蛋白59、连接蛋白62蛋白，并且本文所述的肽和肽模拟物是这些间隙连接通道和相应的半通道中的一种或多种的抑制剂。

在另一个方面，本发明涉及控制表面暴露的间隙连接半通道的开放的化合物。在另一个方面，本发明涉及用于持续控制半通道开放的化合物。在另一个方面，本发明涉及用于封闭半通道的化合物。在另外一个方面，本发明涉及用于调节半通道开放的化合物。

在一个方面，本文提供的发明包括化合物。在另一个方面，本发明包括包含这些化合物中的一种或多种或者基本上由这些化合物中的一种或多种组成的组合物，本发明的基本和新型特征是如本文所述的调节间隙连接和/或半通道功能或活性的能力。该化合物可用于治疗间隙连接和/或半通道相关病症。

在非限制性优选实施例中分离或基本上纯的本发明的化合物包括下述肽：“Ala1”ADCFLSRPTEKT(SEQ.ID.NO:1)、“Ala4”VDCALSRPTEKT(SEQ.ID.NO:2)、“Ala6”VDCFLARPTEKT(SEQ.ID.NO:3)、“Ala9”VDCFLSRPAEKT(SEQ.ID.NO:4)、“Ala12”VDCFLSRPTEKA(SEQ.ID.NO:5)、“Mod-1/Ala10”CFLSRPTAKT(SEQ.ID.NO:6)、“Mod-1/Ala4”CALSRPTEKT(SEQ.ID.NO:7)、“Mod-1/Ala6”CFLARPTEKT(SEQ.ID.NO:8)、“Mod-1/Ala9”CFLSRPAEKT(SEQ.ID.NO:9)和“Mod-1/Ala12”CFLSRPTEKA(SEQ.ID.NO:10)。在显示为SEQ.ID.NO:1-10的上述肽中的任何和所有中，分开或以任何组合一起，缬氨酸(V)可以被丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和苯丙氨酸(F)取代；天冬氨酸(Asp)可以被谷氨酸(E)取代；半胱氨酸(C)可以被丝氨酸(S)取代；苯丙氨酸(P)可以被丙氨酸(A)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)取代；亮氨酸(L)可以被异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)取代；丝氨酸(S)可以被丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)和缬氨酸(V)，优选丙氨酸取代；精氨酸(R)可以被赖氨酸(L)或谷氨酰胺(Q)取代；脯氨酸(P)无法被取代；苏氨酸(T)可以被丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)和甘氨酸(G)取代；谷氨酸(E)可以被丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)和天冬酰胺(N)取代；赖氨酸(K)可以被精氨酸(R)取代，所有这些都是SEQ.ID.NO:1-8类似物。在显示为SEQ.ID.NO:1-8的上述肽中的任何和所有中，分开或以任何组合一起，任何氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸，然而，条件是肽不是L-Val L-Asp L-Cys L-Phe L-LeuL-Ser L-Arg L-Pro L-Thr L-Glu L-Lys L-Thr。含有D-氨基酸的显示为SEQ.ID.NO:1-8的上述肽中的任何也是SEQ.ID.NO:1-8类似物。

在非限制性优选实施例中是分离的或基本上纯的本发明的化合物还包括根据下式I的化合物：

R₁Val Asp Cys X₁Leu Ser Arg Pro X₂X₃Lys X₄

其中R₁不存在，或者选自H、含有1至20个碳原子的线性或分支、饱和或不饱和烃链的酰基、酰胺、氨基甲酸酯、脲、PEG或羟烷基淀粉；X₁是Phe或选自以下的氨基酸：Ala、Ile、Leu、Val、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸和/或Trp、Tyr、Met、Ile、Leu和/或Ser、Asn、Cys、Gln、Thr、Asp、Glu、Arg、His、Lys、Pro和/或Nva或Nle、和/或叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、7-氨杂色氨酸、4-氟苯丙氨酸、N-甲基-甲硫氨酸、N-甲基-缬氨酸、N-甲基-丙氨酸、肌氨酸、N-甲基-叔丁基甘氨酸、N-甲基-亮氨酸、N-甲基-苯基甘氨酸、N-甲基-异亮氨酸、N-甲基-色氨酸、N-甲基-7-氨杂色氨酸、N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-4-氟苯丙氨酸、N-甲基-苏氨酸、N-甲基-酪氨酸、N-甲基-缬氨酸和N-甲基-赖氨酸、和/或前述任一种的D-对映体；X₂是Thr或选自以下的氨基酸：Ser、Asn、Ala、Ile、Leu、Val、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸、Asp、Glu、Lys、Met、His、Pro、Gln、Arg、Ser、Nva或Nle；X₃是Glu、Ala、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸、Asp、Lys、Gln、Gly、His、Arg、Asn、Met、Pro、Ser、Thr、Nva或Nle；并且X₄是Thr或选自以下的氨基酸：Ser、Asn、Ala、Ile、Leu、Val、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸、Asp、Glu、Lys、Met、His、Pro、Gln、Arg、Ser、Nva或Nle；然而，条件是X₁、X₂、X₃和X₄不同时分别为Phe、Thr、Glu和Thr，并且肽R₁ValAsp Cys X₁Leu Ser Arg Pro X₂X₃Lys X₄肽不是L-Val L-Asp L-Cys L-Phe L-Leu L-SerL-Arg L-Pro L-Thr L-Glu L-Lys L-Thr。

本发明还包括式I的化合物，其中X₁是Phe，并且X₂、X₃和/或X₄中的一个或多个不分别为Thr、Glu和Thr。本发明还包括式I化合物，其中X₂是Thr，并且X₁、X₃和/或X₄中的一个或多个不分别为Phe、Glu和Thr。本发明还包括式I化合物，其中X₃是Glu，并且X₁、X₂和/或X₄中的一个或多个不分别为Phe、Thr和Thr。本发明还包括式I化合物，其中X₄是Thr，并且X₁、X₂和/或X₃中的一个或多个不分别为Phe、Thr和Glu。

在非限制性优选实施例中是分离的或基本上纯的本发明的化合物还包括根据下式II的化合物：

R₁Y₁Asp Cys X₁Leu Z₁Arg Pro X₂X₃Lys X₄

其中Y₁是Val、Ala或选自以下的氨基酸：Ile、Leu、Met、Phe、Thr、Cys、Tyr、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸、Nva、Nle、叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、7-氨杂色氨酸、4-氟苯丙氨酸、N-甲基-甲硫氨酸、N-甲基-缬氨酸、N-甲基-丙氨酸、肌氨酸、N-甲基-叔丁基甘氨酸、N-甲基-亮氨酸、N-甲基-苯基甘氨酸、N-甲基-异亮氨酸、N-甲基-色氨酸、N-甲基-7-氨杂色氨酸、N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-4-氟苯丙氨酸、N-甲基-苏氨酸、N-甲基-酪氨酸、N-甲基-缬氨酸和N-甲基-赖氨酸、和/或前述任一种的D-对映体；Z₁是Ser、Ala或选自以下的氨基酸：Asn、Thr、Cys、Gly、Asp、Glu、Lys、Gln、Gly、Pro、His和Arg；并且其中R₁、X₁、X₂、X₃和X₄如上文对于式I所述；然而，条件是Y₁、X₁、Z₁、X₂、X₃和X₄不同时分别为Val、Phe、Ser、Thr、Glu和Thr，并且肽R₁Y₁Asp Cys X₁Leu Z₁Arg Pro X₂X₃Lys X₄肽不是L-Val L-Asp L-Cys L-Phe L-Leu L-Ser L-Arg L-Pro L-Thr L-Glu L-Lys L-Thr。

本发明还包括式II化合物，其中Y₁是Val，并且X₁、Z₁、X₂、X₃和/或X₄中的一个或多个不分别为Phe、Ser、Thr、Glu和Thr。本发明还包括式I化合物，其中X₁是Phe，并且Y₁、Z₁、X₂、X₃和/或X₄中的一个或多个不分别为Val、Ser、Thr、Glu和Thr。本发明还包括式I化合物，其中X₂是Thr，并且Y₁、X₁、Z₁、X₃和/或X₄中的一个或多个不分别为Val、Phe、Ser、Glu和Thr。本发明还包括式I化合物，其中X₃是Glu，并且Y₁、X₁、Z₁、X₂和/或X₄中的一个或多个不分别为Val、Phe、Ser、Thr和Thr。本发明还包括式I化合物，其中X₄是Thr，并且Y₁、X₁、Z₁、X₂和/或X₃中的一个或多个不分别为Val、Phe、Ser、Thr和Glu。

在非限制性优选实施例中是分离的或基本上纯的本发明的化合物还包括根据下式III的化合物：

R₁Ile Asp Cys X₁Ile Ser Arg Pro X₂X₃Lys X₄

其中R₁不存在，或者选自H、含有1至20个碳原子的线性或分支、饱和或不饱和烃链的酰基、酰胺、氨基甲酸酯、脲、PEG或羟烷基淀粉；X₁是Phe或选自以下的氨基酸：Ala、Ile、Leu、Val、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸和/或Trp、Tyr、Met、Ile、Leu和/或Ser、Asn、Cys、Gln、Thr、Asp、Glu、Arg、His、Lys、Pro和/或Nva或Nle、和/或叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、7-氨杂色氨酸、4-氟苯丙氨酸、N-甲基-甲硫氨酸、N-甲基-缬氨酸、N-甲基-丙氨酸、肌氨酸、N-甲基-叔丁基甘氨酸、N-甲基-亮氨酸、N-甲基-苯基甘氨酸、N-甲基-异亮氨酸、N-甲基-色氨酸、N-甲基-7-氨杂色氨酸、N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-4-氟苯丙氨酸、N-甲基-苏氨酸、N-甲基-酪氨酸、N-甲基-缬氨酸和N-甲基-赖氨酸、和/或前述任一种的D-对映体；X₂是Thr或选自以下的氨基酸：Ser、Asn、Ala、Ile、Leu、Val、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸、Asp、Glu、Lys、Met、His、Pro、Gln、Arg、Ser、Nva或Nle；X₃是Glu、Ala、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸、Asp、Lys、Gln、Gly、His、Arg、Asn、Met、Pro、Ser、Thr、Nva或Nle；并且X₄是Thr或选自以下的氨基酸：Ser、Asn、Ala、Ile、Leu、Val、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸、Asp、Glu、Lys、Met、His、Pro、Gln、Arg、Ser、Nva或Nle；然而，条件是X₁、X₂、X₃和X₄不同时分别为Phe、Thr、Glu和Thr，并且肽R₁IleAsp Cys X₁Ile Ser Arg Pro X₂X₃Lys X₄肽不是L-Ile L-Asp L-Cys L-Phe L-Ile L-SerL-Arg L-Pro L-Thr L-Glu L-Lys L-Thr、或任何天然存在的连接蛋白肽序列。

本发明还包括式III化合物，其中X₁是Phe，并且X₂、X₃和/或X₄中的一个或多个不分别为Thr、Glu和Thr。本发明还包括式III化合物，其中X₂是Thr，并且X₁、X₃和/或X₄中的一个或多个不分别为Phe、Glu和Thr。本发明还包括式III化合物，其中X₃是Glu，并且X₁、X₂和/或X₄中的一个或多个不分别为Phe、Thr和Thr。本发明还包括式III化合物，其中X₄是Thr，并且X₁、X₂和/或X₃中的一个或多个不分别为Phe、Thr和Glu。

在非限制性优选实施例中是分离的或基本上纯的本发明的化合物还包括根据下式IV的化合物：

R₁Y₁Asp Cys X₁ILe Z₁Arg Pro X₂X₃Lys X₄

其中Y₁是Ile、Val、Leu、Ala、Met和/或Phe或选自以下的氨基酸：Ile、Leu、Met、Phe、Thr、Cys、Tyr、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸、Nva、Nle、叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、7-氨杂色氨酸、4-氟苯丙氨酸、N-甲基-甲硫氨酸、N-甲基-缬氨酸、N-甲基-丙氨酸、肌氨酸、N-甲基-叔丁基甘氨酸、N-甲基-亮氨酸、N-甲基-苯基甘氨酸、N-甲基-异亮氨酸、N-甲基-色氨酸、N-甲基-7-氨杂色氨酸、N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-4-氟苯丙氨酸、N-甲基-苏氨酸、N-甲基-酪氨酸、N-甲基-缬氨酸和N-甲基-赖氨酸、和/或前述任一种的D-对映体；Z₁是Ser、Ala或选自以下的氨基酸：Asn、Thr、Cys、Gly、Asp、Glu、Lys、Gln、Gly、Pro、His和Arg；并且其中R₁、X₁、X₂、X₃和X₄如上文对于式III所述；然而，条件是Y₁、X₁、Z₁、X₂、X₃和X₄不同时分别为Val、Phe、Ser、Thr、Glu和Thr，并且肽R₁Y₁Asp Cys X₁Ile Z₁Arg Pro X₂X₃Lys X₄肽不是L-Ile L-Asp L-Cys L-Phe L-Ile L-Ser L-Arg L-Pro L-Thr L-Glu L-Lys L-Thr、或任何天然存在的连接蛋白肽序列。

在非限制性优选实施例中是分离的或基本上纯的本发明的化合物还可以包括或排除根据下表1的12种氨基肽：

表1：

在非限制性优选实施例中是分离的或基本上纯的本发明的其它实施例还包括氨基酸序列VDCFVSRPTEKT(SEQ ID NO:31)，其可用作例如由连接蛋白50、62、37、46.6、26、32或31.9中任一种组成的间隙连接通道和/或半通道的阻滞剂；氨基酸序列VDCFISRPTEKT(SEQ ID NO:32)，其可用作例如由连接蛋白46或30中任一种组成的间隙连接通道和/或半通道的阻滞剂。

在非限制性优选实施例中是分离的或基本上纯的本发明的其它实施例还包括氨基酸序列ITCNLSRPSEKT(SEQ ID NO:33)，其可用作例如由连接蛋白29(30.2)或31.3中任一种组成的间隙连接通道和/或半通道的阻滞剂；氨基酸序列VDCYVSRPTEKS(SEQ ID NO:34)，其可用作例如由连接蛋白40.1组成的间隙连接通道和/或半通道的阻滞剂；氨基酸序列VECYVSRPTEKT(SEQ ID NO:35)，其可用作例如由连接蛋白36组成的间隙连接通道和/或半通道的阻滞剂；氨基酸序列IDCFVSRPTEKT(SEQ ID NO:36)，其可用作例如由连接蛋白59组成的间隙连接通道和/或半通道的阻滞剂；氨基酸序列VDCYISRPTEKK(SEQ ID NO:37)，其可用作例如由连接蛋白30.3组成的间隙连接通道和/或半通道的阻滞剂；氨基酸序列VDCFISKPSEKN(SEQ ID NO:38)，其可用作例如由连接蛋白31.1组成的间隙连接通道和/或半通道的阻滞剂；氨基酸序列VDCYIARPTEKK(SEQ ID NO:39)，其可用作例如由连接蛋白31组成的间隙连接通道和/或半通道的阻滞剂；氨基酸序列VDCFISKPTEKT(SEQ ID NO:40)，其可用作例如由连接蛋白25组成的间隙连接通道和/或半通道的阻滞剂；和氨基酸序列IDCFVSRPTEKT(SEQ ID NO:41)，其可用作例如由连接蛋白58和连接蛋白59中任一种组成的间隙连接通道和/或半通道的阻滞剂。

在非限制性优选实施例中是分离的或基本上纯的本发明的其它实施例还包括氨基酸序列VNCYVSRPTEKN(SEQ ID NO:42)，将是同种型特异性的，并且可用作例如由连接蛋白40组成的间隙连接通道的阻滞剂和/或用作由连接蛋白40组成的半通道的半通道阻滞剂。其序列和活性类似物，包括具有基团例如上文所述R₁的那些、以及可用于例如增加分子量且保护其免受蛋白水解酶影响的其它，对于解决血管疾病、病症和状况，包括特征至少部分在于微血管渗漏的那些和癌症治疗，将是特别重要的。

在非限制性优选实施例中是分离的或基本上纯的本发明的其它实施例还包括氨基酸序列IDCFISRPTEKT(SEQ ID NO:43)，将是同种型特异性的，并且可用作例如由连接蛋白45组成的间隙连接通道的阻滞剂和/或用作由连接蛋白45组成的半通道的半通道阻滞剂。其序列和活性类似物，包括具有基团例如上文所述R₁的那些、以及可用于例如增加分子量且保护其免受蛋白水解酶影响的其它，对于解决心脏疾病、病症和状况，包括特征至少部分在于血管损伤和/或渗漏的那些，以及解决来自心肌梗塞和心脏病发作的血管枯死(vessel dieback)的治疗，将是特别重要的。

本发明的其它实施例包括用匹配两个连接蛋白细胞外环1和2的区域的肽的组合治疗显示增加的功效(图3、表2)，超过通常用作黄金标准对照通道阻滞剂的甘珀酸的功效。

本发明的其它实施例包括组合物和治疗，其包含连接蛋白半通道阻滞剂VCYDKSFPISHVR(SEQ ID NO:44)与本文所述的任何一种或多种肽的组合，包括根据式I或式II的那些，也可用作连接蛋白43半通道阻滞组合。

本发明的其它实施例包括组合物和治疗，其包含连接蛋白半通道阻滞剂VCYDKSFPISHVR(SEQ ID NO:44)与本文所述的任何一种或多种肽的组合，包括根据式III或式IV的那些，也可用作连接蛋白半通道阻滞组合。

这些序列可以作为独立实体或连接的分开或一起递送。因此，本发明还包括例如与连接蛋白43半通道阻滞剂VDCFLSRPTEKT(SEQ ID NO:45)连接的连接蛋白43半通道阻滞剂VCYDKSFPISHVR(SEQ ID NO:44)，其形式为例如VDCFLSRPTEKT–X–VCYDKSFPISHVR(SEQ IDNO:46)，其中X是一个或多个连接甘氨酸或其它非功能性接头，其具有足够的柔性用于组合肽分别与连接蛋白43半通道上的其结合位点中的两个相互作用。

本发明还包括例如组合的序列，其同时针对组织中的多种连接蛋白同种型具有功能，并且可以作为独立实体或连接的分开或一起递送。例如，连接蛋白43半通道阻滞剂VDCFLSRPTEKT(SEQ ID NO:47)可以与连接蛋白40半通道阻滞剂VNCYVSRPTEKN(SEQ ID NO:48)连接，其形式为VDCFLSRPTEKT–X–VNCYVSRPTEKN(SEQ ID NO:49)，其中X是一个或多个连接甘氨酸或其它非功能性接头，使得组合肽能够与由连接蛋白43或连接蛋白40组成的半通道相互作用。

本发明还包括例如该或组合的四种肽连接蛋白同种型阻滞剂序列，并且它们不形成三级结构，并且连接提供线性结构的保留。在一个实施例中，制备用于血管内皮连接蛋白40、43和37的肽，包括：VDCFVSRPTEKN(SEQ ID NO:50)；VDCFLSRPTEKN(SEQ ID NO:51)；和VDCFVSRPTEKT(SEQ ID NO:52)。

在本发明范围内包括的是这些化合物的活性类似物和保守变体，包括其截短，优选1或2个氨基酸的N末端截短。

在一个非限制性实施例中，本发明范围内的肽，包括SEQ.ID.NO:1-52和式I-II内的序列的一个或多个氨基酸，可以以L-或D-构型。在其它实施例中，本发明范围内的肽的一个或多个氨基酸是天然存在的非遗传编码的氨基酸。在另外其它实施例中，本发明范围内的肽的一个或多个氨基酸是氨基酸类似物或合成氨基酸。

在另一个非限制性实施例中，可以修饰N末端氨基酸以含有甲酰基、包含甲酰基的基团、羧酸酯(优选醛酯，例如羧乙基、羧甲基等)、或包含羧酸酯的基团。目前优选用甲酰基、羧乙基和羧甲基的修饰。

在另一个实施例中，本发明范围内的化合物，包括SEQ.ID.NO:1-52和式I-II内的序列中的一个或多个氨基酸，取代来自相似氨基酸类别或亚类的另一个氨基酸，主要基于氨基酸侧链的化学和物理性质。例如，一个或多个亲水或极性氨基酸可以取代另一个亲水或极性氨基酸。同样地，一个或多个疏水或非极性氨基酸可以取代另一个疏水或非极性氨基酸。在进行此类取代时，极性氨基酸还可以细分为具有酸性、碱性或亲水侧链的氨基酸，并且非极性氨基酸还可以细分为具有芳香族或疏水侧链的氨基酸。非极性氨基酸还可以进一步细分以包括脂肪族氨基酸。

还在本发明的范围内的是本发明的化合物，其已进行修饰以改善其生物药物性质。在某些实施例中，本发明的化合物被修饰，例如，以提供增加的稳定性、增加的对蛋白水解失活的抗性、降低至不存在的免疫原性、增加的循环寿命包括改变的血清半衰期和改变的治疗半衰期、以及低毒性。本发明的化合物的修饰形式包括前药形式，其代表性例子在本文其它地方描述。通过其可以修饰本发明的化合物的方法还包括例如通过PEG化，通过化学衍生化，以及通过与肽或脂质的融合或缀合。经修饰的化合物包括经修饰的肽半通道试剂，包括例如经修饰的SEQ ID NO:1-10中的任一种，以及经修饰的类似物及其变体(例如，保守变体)。

其它实施例包括选自SEQ.ID.NO:1至10的肽，以及根据式I和/或式II的肽，其不包括C末端苏氨酸。其它实施例包括选自SEQ.ID.NO:1至10的肽，以及根据式I和/或式II的肽，其不包括N末端缬氨酸。其它实施例包括选自SEQ.ID.NO:1至10的肽，以及根据式I和/或式II的肽，其不包括N末端缬氨酸或C末端苏氨酸。

其它实施例包括选自SEQ.ID.NO:11至52的肽，其具有去除的C末端氨基酸，即单一C末端截短。其它实施例包括选自SEQ.ID.NO:11至52的肽，其具有去除的第一和/或第二N末端氨基酸，即单一或双重N末端截短。

在一些实施例中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的肽或肽模拟物中的一种或多种以及药学可接受的载体或赋形剂。在一些实施例中，本发明提供了用于就本文描述或提及的一种或多种疾病、病症或状况预防或治疗哺乳动物的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含一种或多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂，任选地连同试剂和/或使用说明书，其中所述一种或多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂包含本文所述的肽或肽模拟物中任一种的至少10个连续氨基酸的序列。

本发明还包括包含以下或基本上由以下组成的药物组合物：肽片段试剂和药学可接受的载体、以及本文描述或提及的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物中的一种或多种。在一个实施例中，药物组合物包含SEQ ID NOS:1-52中的任一个或基本上由其组成。在另一个实施例中，药物组合物包含选自式I或式II的序列或者基本上由组成。在本发明范围内包括的是药物组合物，其包括这些化合物的一种或多种活性类似物和保守变体，包括其截短，优选如所述的1-或2-氨基酸N末端截短、或1-氨基酸C末端截短。

在另一个实施例中，本发明包括包含以下或基本上由以下组成的药物组合物：本发明的化合物，包括类似物、变体、截短等，其已进行修饰以改善其生物药物性质。在某些实施例中，本发明的化合物被修饰，例如，以提供增加的稳定性、增加的对蛋白水解失活的抗性、降低至不存在的免疫原性、增加的半衰期或循环寿命、以及低毒性。通过其可以修饰本发明的化合物的方法包括例如通过PEG化，通过化学衍生化，以及通过与肽或脂质的融合或缀合。

本发明包括药物组合物，其包含本文描述或提及的一种或多种药学可接受的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物，用于治疗心血管病症，例如急性冠状动脉综合征、心力衰竭、缺血性心脏病等，以及特征至少部分在于缺血和/或氧化性应激的相关的心血管疾病、病症和状况，以及相关的病症和状况。某些优选的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物在本文中被鉴定为SEQ.ID.NO:1至52。SEQ.ID.NO:1-10是特别优选的连接蛋白43间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。描述了用于其它连接蛋白的其它特别优选的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。

本发明包括其形式适合于或适于治疗受试者的心血管疾病、病症或状况的药物组合物。本发明包括其形式适合于或适于治疗眼部疾病、病症或状况的受试者的药物组合物，所述眼部疾病、病症或状况包括视网膜疾病、病症和状况，以及特征全部或部分在于血管损伤或渗漏的其它眼部疾病、病症和状况，包括例如特征在于脉络膜新血管形成、损伤、渗漏、水肿和/或炎症的疾病、病症和状况。

在一个实施例中，本发明提供了连接蛋白间隙连接或连接蛋白半通道化合物，其充当连接蛋白间隙连接或连接蛋白半通道拮抗剂或阻滞剂。在一个实施例中，本发明提供了通过向患者序贯施用多个剂量的连接蛋白间隙连接或连接蛋白半通道拮抗剂或阻滞剂，用于治疗血管生成性眼病症的方法。本发明的方法包括以每6、7、8或更多周一次的频率，向患者施用多个剂量的连接蛋白间隙连接或连接蛋白半通道拮抗剂或阻滞剂。

本发明的方法可用于治疗血管生成性眼病症，例如湿性年龄相关性黄斑变性、干性年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞和角膜新生血管化。

本发明提供了包括随着时间过去，向患者序贯施用多个剂量的连接蛋白间隙连接或连接蛋白半通道拮抗剂或阻滞剂的方法。特别地，本发明的方法包括向患者序贯施用单个初始剂量的连接蛋白间隙连接或连接蛋白半通道拮抗剂或阻滞剂，随后为一个或多个第二剂量的连接蛋白间隙连接或连接蛋白半通道拮抗剂或阻滞剂，随后为通过一个或多个第三剂量的连接蛋白间隙连接或连接蛋白半通道拮抗剂或阻滞剂。因此，根据本发明的方法，在紧接在前的剂量后2至4周施用每个第二剂量的连接蛋白间隙连接或连接蛋白半通道拮抗剂或阻滞剂，并且在紧接在前的剂量后至少8周施用每个第三剂量。此类给药方案的优点在于，对于大多数治疗过程(即，第三剂量)，与在整个治疗过程自始至终需要每月一次施用的用于血管生成性眼病症的先前给药方案相比，其允许更不频繁的给药(例如，每8周一次)。参见例如，[雷珠单抗]，Genentech,Inc的处方信息。

如本文使用的，表述“血管生成性眼病症”意指由血管生长或增殖或血管渗漏引起或者与其相关的任何眼疾病。可使用本发明的方法治疗的血管生成性眼病症的非限制性例子包括年龄相关性黄斑变性(例如，湿性AMD、渗出性AMD等)、干性AMD、视网膜静脉阻塞(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO；例如，CRVO后的黄斑水肿)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、脉络膜新生血管形成(CNV；例如近视CNV)、虹膜新生血管形成、新生血管性青光眼、青光眼术后纤维化、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、视盘新生血管形成、角膜新血管形成、视网膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、血管翳、翼状胬肉、血管性视网膜病变和糖尿病性视网膜病变。

在一个实施例中，所述疾病、病症或状况与炎症，例如血管或微血管炎症相关。在另一个实施例中，所述疾病、病症或状况与缺血和/或氧化性应激，例如血管或微血管缺血和/或氧化性应激相关。在另一个实施例中，所述疾病、病症或状况与水肿，例如与血管或微血管损伤或渗漏相关的水肿相关。

在一个实施例中，所述疾病、病症或状况与赘生物，即当细胞分裂超过它们应该时产生的异常组织团块或当它们应该死亡时不死亡相关。如本文使用的，赘生物也称为肿瘤并且可以是良性的(不是癌症)或恶性的(癌症)。

在某些实施例中，心血管疾病、病症或状况是急性冠状动脉综合征。例如，急性冠状动脉综合征可选自ST段抬高心肌梗塞、非ST段抬高心肌梗塞和不稳定型心绞痛。在其它实施例中，心血管疾病、病症或状况是缺血性心脏病。在其它实施例中，心血管疾病、病症或状况是心力衰竭(任何形式)。例如，心力衰竭可以是收缩性或舒张性心力衰竭。心力衰竭可以来源于左心室收缩功能障碍。心力衰竭也可能是右心室梗塞、肺动脉高压、慢性重度三尖瓣关闭不全、或致心律失常性右心室发育不良的结果。心力衰竭也可以是舒张性LV功能障碍的结果。在另一个实施例中，心血管疾病、病症或状况是缺血性心脏病。连接蛋白40、43和45间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物可特别用于治疗心血管疾病、病症或状况。

在一个方面，本发明包括可用于就受试者中的一种或多种本文描述或提及的疾病、病症或状况预防和/或治疗受试者的药物组合物，包括肠胃外递送形式和制剂，以及其它递送形式包括用于通过输注、注射和滴注递送的形式，以及延迟、缓慢、延长或控制释放组合物、装置和基质，其包含以下或基本上由以下组成：单独或与另一种心血管治疗剂组合的治疗有效量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物、以及药学可接受的载体。在某些优选的实施例中，药物组合物配制用于静脉内施用，包括通过输注或作为推注。用于其它施用途径的其它制剂也在本发明的范围内，包括例如用于经鼻、经肺、经颊、经直肠、透皮和经口递送的制剂。

在另一个方面，本发明的组合物包含约0.01至约100毫克、约100至约500毫克、或约500至约1000毫克或更多的本发明的化合物，例如间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物或类似物，包括SEQ.ID.NO:1-52中的一个或多个和根据式I至II中任一个的肽。本文描述了其它剂量，并且包括范围为至少约100纳克的剂量，包括例如至少约200微克或毫克、600微克或毫克、2000微克或毫克、6000微克或毫克以及至少约10,000微克或毫克。剂量浓度包括至少约0.1摩尔/升的浓度，包括例如至少约0.3、1.0、3.0和10.0摩尔/L。剂量浓度还包括0.1微摩尔或毫摩尔/L、0.3微摩尔或毫摩尔/L、1.0微摩尔或毫摩尔/L、3.0微摩尔或毫摩尔/L和10.0微摩尔/毫摩尔/L的浓度。剂量浓度可等价于0.1、0.3、1、3和10至100mg/mL，以及1-10、10-20、20-50、50-100、100-500和500-1000毫克/kg(mg/kg)的可施用的重量剂量。还在本发明内的是范围为0.1至5.0μg/kg和0.1至10.0g/kg的其它剂量。这些组合物和量可以作为单一剂量或多个剂量提供。

间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物(或者包含间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的药物制剂)可以通过任何已知的递送系统和/或施用方法施用于患者。在某些实施例中，通过眼部、眼内、玻璃体内或结膜下注射，向患者施用间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。在其它实施例中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物可以通过局部施用(例如，经由含有间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的滴眼液或其它液体、凝胶、软膏或流体)施用于患者，并且可以直接施加于眼。其它可能的施用途径包括例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口。

本发明还包括治疗患有或处于患有如本文提及的疾病、病症或状况的风险中的患者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种本文所述的化合物或药物组合物。在一个非限制性实施例中，疾病、病症或状况与血管损伤、血管渗漏、水肿、炎症、缺血和/或氧化性应激相关。在一个实施例中，所述疾病、病症或状况是急性冠状动脉综合征，例如ST段抬高心肌梗塞、非ST段抬高心肌梗塞或不稳定型心绞痛。在另一个实施例中，心血管疾病、病症或状况是心力衰竭。在其它实施例中，心血管疾病、病症或状况是缺血性心脏病。在另一个实施例中，心血管疾病、病症或状况是稳定型心绞痛。

本发明包括治疗受试者的方法，所述受试者患有本文描述或提及的疾病、病症或状况或者处于发展本文描述或提及的疾病、病症或状况的风险中，或者处于本文描述或提及的疾病、病症或状况进展的风险中，所述方法包括治疗有效量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和药学可接受的载体。在一个实施例中，药物组合物中的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物包含选自SEQ.ID.NO:1-52的序列或基本上由其组成。在另一个实施例中，药物组合物中的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物包含选自式I或式II的序列或者基本上由其组成。间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物还包括本文所述的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的活性类似物、变体、截短和经修饰的形式。

在另一个方面，本发明包括通过降低受试者中的间隙连接通道和/或半通道活性，来治疗和/或预防与受试者中的炎症、缺血和/或氧化性应激相关的心血管或眼部疾病、病症或状况的方法。这可以通过例如向受试者施用组合物来实现，所述组合物包含治疗有效量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物，例如间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物，其包含选自SEQ.ID.NO:1-52的序列或肽或者基本上由其组成，所述肽包含以下或基本上由以下组成：根据式I至II中任一个的肽、或其类似物，变体，截短或修饰，如例如所描述的。在某些实施例中，例如，每天以单一剂量或分份剂量或者通过连续或定期释放施用约0.01至约100、500或1000纳克或毫克或更多(例如，至少约100纳克或毫克、至少约500纳克或毫克、或者至少约1000纳克或毫克)的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物或类似物。

在一个实施例中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物以单一剂量施用。在另一个实施例中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物以多于一个剂量施用。在另外一个实施例中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物经过一段时间，例如预定的时间段连续施用或释放。在另外一个实施例中，心血管治疗剂或眼部药物(例如VEGF拮抗剂)与间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物一起施用或共施用。此类其它心血管治疗剂包括硝酸盐、β阻滞剂、钙通道阻滞剂(特别是用于稳定或不稳定型心绞痛，但在β阻滞剂的情况下也用于心力衰竭)、利尿药、血管扩张剂、正性肌力药、ACE抑制剂和醛固酮拮抗剂例如螺内酯(特别是用于心力衰竭)、血液稀释治疗剂(例如阿司匹林、肝素、华法林)和硝酸甘油(特别是用于MI)。

本发明还提供了用于对有此需要的患者执行血管成形术的方法，其包括在血管成形术操作过程中，向患者施用间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。在一个进一步的实施例中，该方法包括或还包括在血管成形术操作之前，向患者施用间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。在一个进一步的实施例中，该方法包括或还包括在血管成形术操作之后，向患者施用间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。在其它实施例中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物在血管成形术操作之前、期间和/或之后以任何组合施用于患者。

还提供了用于增加在心区不适的首次症状之后，在此期间血栓溶解治疗将是有效的时间的方法，其包含在下述症状中的一种或多种发作后，施用治疗有效量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物：胸痛持续时间超过15分钟、休息时胸痛、最小用力后胸痛、恶心、呼吸短促、心悸或头晕。

在另一个方面，治疗的受试者是哺乳动物，优选人。其它哺乳动物包括驯养动物和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如犬、马和猫。

本发明还包括制造物品，其包含含有本文所述的化合物或药物组合物中的一种或多种的包装材料。然后本发明还包括制造物品，其包含含有本文所述的化合物或药物组合物中的一种或多种的包装材料，连同用于在受试者中或在受试者上使用的说明书，以便预防和/或治疗如本文所指出的疾病、病症或状况。在一个实施例中，在说明书中提及的血管疾病、病症或状况与炎症、血管生成和/或血管渗漏、缺血和/或氧化性应激相关。在另一个实施例中，在说明书中提及的疾病、病症或状况是心血管疾病、病症或状况。在一个实施例中，在说明书中提及的疾病、病症或状况是血管生成性眼病症。说明书可以是电子的和/或与网站相关。

本发明还包括制备药剂用于预防或治疗本文提及的疾病、病症或状况的一种或多种的方法，其包括将治疗有效量的本文提及的化合物，例如间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物或类似物或变体、以及药学可接受的载体聚集在一起。在一个实施例中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物包含选自SEQ.ID.NO:1至52的序列。在另一个实施例中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物是选自式I-II中的一种或多种的化合物。在一个实施例中，药剂配制用于肠胃外施用。在一个实施例中，药剂配制用于眼部施用。在另一个实施例中，药剂配制用于局部施用。在另一个实施例中，药剂配制用于经口施用。

用如本文所述的一种或多种化合物或药物组合物治疗如本文提供的受试者可以包括其同时、分开、序贯或持续施用。

可用于预防和/或治疗本文提及或描述的疾病、病症或状况的药物组合物还以组合制剂的形式提供，例如，作为两种或更多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物、类似物或变体的混合物。

术语“组合制剂”不仅包括化合物的物理组合，还包括作为“部分试剂盒(kit ofparts)”提供的化合物，其意义在于如上定义的组合配偶体可以独立地给药或通过使用不同的固定组合用显著量的组合配偶体(a)和(b)给药，即同时、分开或序贯地。然后，试剂盒的各部分可以例如同时施用或按时间顺序交错施用，即在不同的时间点并且对于部分试剂盒的任何部分具有相同或不同的时间间隔。

在另一个方面，本发明包括用于向患有或处于发展本文描述或提及的疾病、病症或状况的风险中的受试者，施用治疗有效量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物或类似物或变体的方法，单独或与另一种治疗剂组合，在延迟释放制剂、缓释制剂、延长释放制剂、控释制剂和/或重复作用制剂中配制。

在某些其它方面，本发明还涉及使用此类组合物治疗患有或处于所述疾病、病症和状况的风险中的受试者的方法。

在其它方面，本发明包括用于预防和/或治疗患有或怀疑患有或倾向于或处于特征全部或部分在于血管损伤或渗漏的任何疾病、病症和/或状况的受试者的方法和组合物。

根据一个方面，本发明涉及停止或降低心血管或眼部疾病的症状或者提供来自心血管或眼部疾病的症状的缓解的方法。

本发明包括制造物品，其包含含有如本文所述的一种或多种剂型的包装材料，其中所述包装材料具有标签，所述标签指示所述剂型可以用于患有或怀疑患有或倾向于本文描述或提及的任何疾病、病症和/或状况的受试者。

本发明包括在可用于预防和/或治疗心血管或眼部病症的剂型制造中，使用治疗有效量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的方法。此类剂型包括例如经口递送形式和制剂，以及其它递送形式包括用于通过输注、注射和滴注递送的形式，以及例如包括缓释、延长释放和延迟释放组合物、贮库和基质的组合物和装置。此类剂型包括用于治疗如本文公开的受试者的那些剂型。

下文提供了本发明的这些及其它方面，其并不限于本发明内容中的信息或受本发明内容中的信息限制。

附图说明

该专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。

图1。显示了(图1A)未经处理的对照中具有DAPI标记的核(蓝色)的连接蛋白43(红色)的免疫标记图像(上图)。对VDCFLSRPTEKT(肽5；500μM)暴露2小时(中图)或6小时(下图)后连接蛋白43的分布。白色箭头突出显示了从膜朝向细胞中心扩展的细胞质流的模式。对肽5暴露6小时后，沿着细胞间界面片段化的连接蛋白43斑。比例尺＝30μm。(图1B)每个细胞的连接蛋白43斑总面积的定量表示为用肽5或LaCl₃或CBX(500μM)处理2或6小时后未经处理的对照的百分比。在用CBX处理2小时和6小时后，与未经处理的对照相比，每个细胞的连接蛋白43标记的显著减少是显而易见的。值代表平均值±S.E.M(单因素ANOVA，Dunnett事后检验)。(图1C)在未经处理的对照和用肽5(50-500μM)处理6小时之间，不存在连接蛋白43标记中的显著差异**p＝0.0043，***p<0.0001。条代表平均值±S.E.M(n＝3)。单因素ANOVATukey多重比较检验。肽5改变ARPE-19细胞中连接蛋白43间隙连接斑的分布。

图2。显示了数据和显微镜图像，其证实在体外hCMVEC细胞的刮除负载测定中，具有单丙氨酸取代的VDCFLSRPTEKT(肽5)类似物与天然肽5并无显著不同。偶联的间隙连接通道之间的正LY染料转移表示为未经处理的对照的百分比。在暴露于CBX 2小时后，与未经处理的对照相比，LY染料转移显著减少。针对未经处理的对照相比较，天然肽5及其具有单丙氨酸取代(Ala-1至Ala-12)的类似物也显著减弱LY染料转移。这些类似物与天然肽5并无显著不同，并且仅CBX对照比天然肽5更显著地减弱LY染料转移。用于所有治疗组的浓度为100μM。**p<0.005，****p<0.0001。所有值都代表平均值±平均值的标准误。针对对照或天然肽5的单因素ANOVA，Dunnett多重比较检验。

图3。显示了条形图，其证实VDCFLSRPTEKT(肽5)中丙氨酸的单个取代影响肽在体外保护免受缺血性损伤诱导的来自hCMVEC细胞的ATP释放影响的功能。总细胞外ATP释放的定量呈现为每个治疗组的损伤对照的百分比。用CBX、LaCl3和天然肽5(全部为100μM)处理显著减少ATP释放，针对损伤对照****p<0.0001。Ala-2、Ala-3、Ala-5、Ala-7、Ala-8和Ala-11(全部为100μM)与天然肽5(100μM)显著不同，但不针对损伤，指示在位点VDCFLSRPTEKT处含有丙氨酸取代的这些肽的功能丧失。*p<0.03，**p<0.01，***p＝0.0002。当针对天然肽5相比较时，对于Ala-1、Ala-4、Ala-6、Ala-9、Ala-10、Ala-12未观察到显著差异。所有值都代表平均值±平均值的标准误。针对损伤或天然肽5的单因素ANOVA，Dunnett比较检验。

图4。显示了条形图，其证实VDCFLSRPTEKT(肽5)的截短序列在体外显示了针对缺血性损伤诱导的来自hCMVEC细胞的ATP释放的改变功效。总细胞外ATP释放的定量呈现为每个治疗组的损伤对照的百分比。用天然肽5(100μM)和Mod-1处理显著减少ATP释放，针对损伤对照****p<0.0001。相比之下，与天然肽5(100μM)相比，用Mod-2、Mod-3、Mod-4、Mod-5和Mod-6(全部为100μM)处理后观察到显著更大的ATP释放，这指示具有这些修饰的功能丧失。与天然肽相比，*p＝0.0231和****p<0.0001。n＝8个孔，4个独立实验。针对损伤或天然肽5的单因素ANOVA，Dunnett多重比较检验。

图5。显示了显微镜图像，其显示(A)VDCFLSRPTEKT(肽5)和SRPTEKT基序在体外hCMVEC细胞的刮除负载测定中对荧光黄染料转移的作用。(图5A)对照中的阳性LY转移在肽5和SRPTEKT中减少。(图5B)显示了偶联的间隙连接通道之间的正LY染料转移的条形图表示为未经处理的对照的百分比。在暴露于CBX 2小时后，与未经处理的对照相比，LY染料转移显著减少。SRPTEKT显著减少了与天然肽5可比较的LY染料转移。用于所有治疗组的浓度为100μM。**p＝0.0057(Pep5)，**p＝0.0028****p<0.0001。不存在与乱序肽的显著差异。所有值都代表平均值±SEM。针对损伤或天然肽5的单因素ANOVA，Dunnett比较检验。

图6。显示了总结竞争测定的图和数据，所述竞争测定使用源自连接蛋白43的细胞外环的合成肽和VDCFLSRPTEKT(肽5)。(图6A)源自连接蛋白43的合成细胞外环。(图6B)响应模拟的缺血性损伤从hCMVEC细胞释放的总细胞外ATP表示为每个处理组的损伤对照的百分比。在2小时的模拟缺血性损伤后，存在从hCMVEC细胞释放的总ATP中的显著增加。ATP释放在等摩尔浓度的天然肽5和EL2c中显著增加，指示肽5功能丧失。CBX、肽5和细胞外环以100μM的浓度使用。****p<0.0001。在损伤与肽5之间的总ATP释放中存在显著差异。对于100μM天然肽5存在总ATP释放中的显著减少。所有值都代表平均值±平均值的标准误。针对损伤或天然肽5的单因素ANOVA，Dunnett比较检验。

具体实施方式

本发明的实践可以包括或采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的各种常规技术，所述技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中充分说明，并且包括但不限于，仅作为例子，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)和Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第三版(Sambrook和Russel，2001)，在本文中共同地且个别地称为“Sambrook”；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编辑，1987)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir&C.C.Blackwell，编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller&M.P.Calos，编辑，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，编辑，1987，包括直到2001年的补充)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人，编辑，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人，编辑，1991)；TheImmunoassay Handbook(D.Wild，编辑，Stockton Press NY，1994)；BioconjugateTechniques(Greg T.Hermanson，编辑，Academic Press，1996)；Methods ofImmunological Analysis(R.Masseyeff,W.H.Albert和N.A.Staines，编辑，Weinheim:VCHVerlags gesellschaft mbH,1993)，Harlow和Lane(1988)Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Publications,New York，以及Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY(在本文中共同地且个别地称为Harlow和Lane)，Beaucage等人，编辑，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley&Sons,Inc.,New York,(2000)；以及Agrawal，编辑，Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Synthesisand Properties Humana Press Inc.,New Jersey,(1993)。

应理解，本发明并不限于本文所述的特定方法、方案、构建体和试剂，并且像这样可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不预期限制本发明的范围，所述本发明的范围仅受所附权利要求的限制。如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物”是对一种或多种此类肽的提及，并且包括现在已知或以后开发的其等价物。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等价的任何方法、装置和材料均可以用于本发明的实践或测试，但现在描述了优选的方法、装置和材料。预期提及本文公开的一系列数目(例如1至12)还引入对该范围内的所有相关数目(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9.5、10、11和12)、以及该范围内的有理数的任何范围(例如2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)的提及，并且因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围都明确地公开。这些仅是特别预期的例子，并且所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合都视为在本专利申请中以类似方式明确陈述。当在本文中使用时，下述术语具有下述含义。

本文描述且请求保护的本发明涉及连接蛋白间隙连接和连接蛋白半通道，包括连接蛋白25、连接蛋白26、连接蛋白29(连接蛋白30.2)、连接蛋白30、连接蛋白30.3、连接蛋白31、连接蛋白31.1、连接蛋白31.3、连接蛋白31.9、连接蛋白32、连接蛋白36、连接蛋白37、连接蛋白40、连接蛋白40.1、连接蛋白43、连接蛋白45、连接蛋白46、连接蛋白46.6(连接蛋白47)、连接蛋白50、连接蛋白58、连接蛋白59、连接蛋白62及其它。

使用各种连接蛋白模拟肽，如实例中所示，人连接蛋白的细胞外环的肽序列类似物已显示在临床前模型(包括人微血管内皮细胞)中预防内皮细胞损失并且减少血管通透性，其中证实本发明的肽化合物可以抑制半通道介导的来自内皮细胞的ATP释放。还证实了肽序列特异性以及对半通道介导的ATP释放的抑制和间隙连接的解偶联的敏感性。SRPTEKT基序对于功能是关键的，但其本身在所使用的浓度下不足以抑制半通道。然而，在高浓度下工作时，SRPTEKT基序单独将间隙连接通讯减少至与VDCFLSRPTEKT可比较的程度。肽的剂量依赖性作用模式的理解也支持它们作为用于疾病、病症和状况的治疗的开发，包括例如视网膜损伤和疾病、心血管疾病和肿瘤性癌症。

本文提供的化合物(例如肽和蛋白质)中使用的氨基酸可以是遗传编码的氨基酸、天然存在的非遗传编码的氨基酸或合成的氨基酸。上述任一种的L-和D-对映体两者均可以用于化合物中。下述缩写在本文中可以用于下述遗传编码的氨基酸(及其残基)：丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；和缬氨酸(Val，V)。

未经遗传编码且可存在于本发明的活性化合物中的某些常见的氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(b-Ala)及其它ω-氨基酸，例如3-氨基丙酸(Dap)、2,3-二氨基丙酸(Dpr，Z)、4-氨基丁酸等等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；甲基甘氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle，J)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2,3-二氨基丁酸(Dab)；2,3-二氨基丁酸(Dbu)；对氨基苯丙氨酸(Phe(pNH₂))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)；3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸(BztAla，B)；和高丝氨酸(hSer)。考虑的另外氨基酸类似物包括磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、他汀、α-甲基-丙氨酸、对苯甲酰基-苯丙氨酸、炔丙基甘氨酸和肌氨酸。涵盖在本发明的范围内的肽可以具有以L-或D-构型的任何前述氨基酸、或者本文描述或本领域已知的任何其它氨基酸，无论是目前还是将来，同时保留生物活性。

可彼此取代的氨基酸一般位于相似的类别或亚类内。如本领域技术人员已知的，主要取决于氨基酸侧链的化学和物理性质，氨基酸可以置于不同的类别内。例如，一些氨基酸一般被视为亲水或极性氨基酸，而其它氨基酸被视为疏水或非极性氨基酸。极性氨基酸包括具有酸性、碱性或亲水侧链的氨基酸，并且非极性氨基酸包括具有芳香族或疏水侧链的氨基酸。非极性氨基酸还可以进一步细分以包括脂肪族氨基酸。如本文使用的氨基酸类别的定义如下：

“非极性氨基酸”指具有这样的侧链的氨基酸，所述侧链在生理pH下不带电荷，不是极性的并且一般被水溶液排斥。遗传编码的疏水性氨基酸的例子包括Ala、Ile、Leu、Met、Trp、Tyr和Val。非遗传编码的非极性氨基酸的例子包括t-BuA、Cha和Nle。

“芳香族氨基酸”指具有侧链的非极性氨基酸，所述侧链含有具有共轭π-电子系统(芳香族基团)的至少一个环。芳香族基团还可以被取代基团取代，所述取代基团例如烷基、烯基、炔基、羟基、磺酰基、硝基和氨基以及其它基团。遗传编码的芳香族氨基酸的例子包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常见的非遗传编码的芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸、3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。

“脂肪族氨基酸”指具有饱和或不饱和线性、分支或环状烃侧链的非极性氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸的例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非编码脂肪族氨基酸的例子包括Nle。

“极性氨基酸”指具有这样的侧链的亲水性氨基酸，所述侧链在生理pH下带电荷或不带电荷，并且具有其中由两个原子共同分享的电子对通过原子之一更紧密地保持在一起的键。极性氨基酸一般是亲水性的，意指它们具有含有被水溶液吸引的侧链的氨基酸。遗传编码的极性氨基酸的例子包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和丝氨酸。非遗传编码的极性氨基酸的例子包括瓜氨酸、高半胱氨酸、N-乙酰基赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。

“酸性氨基酸”指侧链pK值小于7的亲水性氨基酸。由于氢离子的损失，酸性氨基酸通常具有在生理pH下带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸(天冬氨酸盐)和谷氨酸(谷氨酸盐)。

“碱性氨基酸”指侧链pK值大于7的亲水性氨基酸。碱性氨基酸通常具有由于与水合氢离子结合而在生理pH下带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非遗传编码的碱性氨基酸的例子包括鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸和高精氨酸。

“可电离的氨基酸”指可以在生理pH下带电的氨基酸。此类可电离的氨基酸包括酸性和碱性氨基酸，例如D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-羟赖氨酸、D-鸟氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-羟赖氨酸或L-鸟氨酸。

如本领域技术人员将了解的，上述分类法不是绝对的。几种氨基酸显示出多于一种的特征性质，并且因此可以包括在多于一个类别中。例如，酪氨酸具有非极性芳环和极性羟基两者。因此，酪氨酸具有可称为非极性、芳香族和极性的几种特征。然而，非极性环是占优势的，并且因此酪氨酸一般被视为非极性的。类似地，除能够形成二硫键之外，半胱氨酸还具有非极性特征。因此，尽管并未严格分类为疏水性或非极性氨基酸，但在许多情况下，半胱氨酸可以用于对肽赋予疏水性或非极性。

在一些实施例中，由本发明考虑的极性氨基酸包括例如精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、高半胱氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、苏氨酸和结构上相关的氨基酸。在一个实施例中，极性氨基是可电离的氨基酸，例如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟赖氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。

可以利用的极性或非极性氨基酸残基的例子包括例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等等。

如本文使用的，“心血管病症”是涉及氧化性应激和/或缺血、或者可以至少部分地通过氧化性应激和/或缺血表征的任何心血管疾病、病症或状况。

在生理过程期间，分子经历涉及还原和氧化反应的化学变化。具有不成对电子的分子可以与能够捐赠电子的分子组合。电子的捐赠被称为氧化，而电子的获得被称为还原。还原和氧化可以致使还原的分子不稳定并且使其与其它分子自由反应，以对细胞和亚细胞组分如膜、蛋白质和DNA造成损害。如本文使用的，“氧化性应激”在一个例子中指反应性氧化剂物种(ROS)的过量产生，导致氧化性应激/亚硝化应激，该过程是细胞损伤的重要介质。触发许多信号传导途径的活性的氧化还原失衡的重要方面包括例如转录因子活性，该过程在与缺血/再灌注损伤有关的心血管疾病中普遍存在。反应性氧化剂物种可以源于各种源，例如一氧化氮(NO)合酶(NOS)、黄嘌呤氧化酶(XO)、环加氧酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD(P)H)氧化酶同种型和金属催化的反应。这些包括自由基，例如超氧阴离子(O₂ ^·-)、羟基自由基(HO·)、脂质自由基(ROO^-)和一氧化氮(NO)。其它活性氧物种，例如过氧化氢(H₂O₂)、过氧亚硝酸盐(ONOO^-)和次氯酸(HOCl)，虽然不是自由基，但具有促成氧化性应激的氧化效应。

“缺血”是当血流和氧在身体的特定部分中减少时发生的状况。例如，当心脏或视网膜是靶向的身体部分时，心脏或视网膜缺血是这种状况的名称。

眼部病症包括例如血管生成性眼病症，例如由血管生长或增殖或血管渗漏引起或者与之相关的任何眼疾病、病症或状况。可使用本发明的方法治疗的非限制性例子包括年龄相关性黄斑变性(例如，湿性AMD、渗出性AMD等)、干性AMD、视网膜静脉阻塞(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO；例如，CRVO后的黄斑水肿)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、脉络膜新生血管形成(CNV；例如近视CNV)、虹膜新生血管形成、新生血管性青光眼、青光眼术后纤维化、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、视盘新生血管形成、角膜新血管形成、视网膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、血管翳、翼状胬肉、血管性视网膜病变和糖尿病性视网膜病变。

本领域熟悉例如通过聚合物缀合或糖基化的肽修饰。术语“间隙连接通道阻滞剂或抑制剂化合物”和“半通道阻滞剂或抑制剂化合物”包括经修饰的肽，包括与聚合物例如PEG缀合的肽，并且可以包含半胱氨酸、赖氨酸或其它残基的一种或多种另外的衍生化。另外，半通道肽试剂可以包含接头或聚合物，其中所述接头或聚合物与之缀合的氨基酸可以是根据本发明的非天然氨基酸，或可以利用本领域已知的技术与天然编码的氨基酸缀合，例如与赖氨酸或半胱氨酸偶联。

本文描述的关于本发明的化合物的氨基酸的取代、缺失、修饰或添加，例如，SEQID NO:1-52或者例如如在式I和II中定义的其它肽，预期也指融合、变体、片段、缀合等中相应位置的取代、缺失、修饰或添加。

术语“间隙连接通道阻滞剂或抑制剂化合物”和“半通道阻滞剂或抑制剂化合物”还涵盖连接的同二聚体、异二聚体、同多聚体和异多聚体，包括但不限于与相同或不同的非天然编码的氨基酸侧链、天然编码的氨基酸侧链经由非天然编码的氨基酸侧链直接连接，或经由接头间接连接的那些。示例性接头包括小有机化合物，各种长度的水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)或聚葡聚糖或各种长度的多肽。

术语“接头”在本文中用于指通常由于化学反应而形成的基团或键，并且通常是共价键合。解稳定的键合意指键合在水中是基本上稳定，并且在有用的Ph值下不与水反应，包括但不限于在生理条件下延长的时间段，甚至可能无限期。水解不稳定或可降解的键合意指键合可在水或水溶液包括例如血液中降解。酶促不稳定或可降解的键合意指键合可以被一种或多种酶降解。如本领域理解的，PEG和相关聚合物可以包括聚合物主链中或聚合物主链与聚合物分子的一个或多个末端官能团之间的接头基团中的可降解键合。例如，通过PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键合一般在生理条件下水解以释放试剂。其它可水解降解的键合包括但不限于碳酸酯键合；来源于胺和醛反应的亚胺键合；通过醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯键合；其为酰肼和醛的反应产物的腙(hydrozone)键合；其为醛和醇的反应产物的缩醛键合；其为甲酸酯和醇的反应产物的原酸酯键合；由胺基包括但不限于(在聚合物如PEG的末端处)和肽的羧基形成的肽键合；以及由亚磷酰胺基团(包括但不限于在聚合物的末端处)和寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键合。

当在本文中使用时，术语“活性的”或“生物活性的”意指可以影响与生物有关的生物系统、途径、分子或相互作用的任何物理或生物化学性质的任何物质，所述生物包括但不限于病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人。特别地，如本文使用的，生物活性分子包括但不限于预期用于治愈、减轻、治疗或预防人或其它动物中本文描述或提及的疾病、病症和状况的任何物质。

如本文使用的，术语“水溶性聚合物”指可溶于水性溶剂的任何聚合物。水溶性聚合物与间隙连接通道阻滞剂或抑制剂化合物或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的键合可以导致变化，包括但不限于增加或调节的血清半衰期、或相对于未经修饰的形式增加或调节的治疗半衰期、调节的免疫原性、调节的物理结合特征例如聚集和多聚体形成、改变的受体结合、以及改变的受体二聚化或多聚化。水溶性聚合物可以具有或不具有其自身的生物活性，并且可以用作接头用于将间隙连接通道或半通道阻滞剂或抑制剂化合物与其它物质附着。合适的聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、单C1-C10烷氧基或其芳氧基衍生物(在美国专利号5,252,714中描述)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙醚马来酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物包括硫酸葡聚糖、聚丙二醇、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物包括但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺等等、或其混合物。此类水溶性聚合物的例子包括但不限于聚乙二醇和血清白蛋白。

如本文使用的，术语“聚亚烷基二醇”或“聚(烯烃二醇)”指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。术语“聚亚烷基二醇”和/或“聚乙二醇”包括线性和分支聚合物两者，以及0.1kDa至100kDa或更高的平均分子量。其它示例性实施例在例如商业供应商目录中，例如Shearwater Corporation的目录“Polyethylene Glycol andDerivatives for Biomedical Applications”(2001)中列出。

如本文使用的，术语“经修饰的血清半衰期”意指经修饰的间隙连接通道或半通道阻滞剂或抑制剂化合物相对于其未经修饰的形式的循环半衰期增加。通过在间隙连接通道或半通道阻滞剂或抑制剂化合物施用后的不同时间点采集血液样品，并且测定每个样品中该分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。增加的血清半衰期期望地具有至少约两倍，但较小的增加可能是有用的，例如当它允许令人满意的给药方案或避免毒性效应时。在一些实施例中，增加为至少约三倍、至少约五倍、或至少约十倍或更多。

如本文使用的，术语“经修饰的治疗半衰期”意指治疗有效量的经修饰的间隙连接通道或半通道阻滞剂或抑制剂化合物相对于其未经修饰的形式的半衰期增加。通过在施用后的不同时间点测量分子的药代动力学和/或药效学特性来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期期望地允许特定有益的给药方案、特定的有益总剂量或避免不期望的效应。在一些实施例中，增加的治疗半衰期来源于增加的效力、经修饰的分子与其靶结合的增加或减少、分子通过酶(例如蛋白酶)分解的增加或减少、或者未经修饰的分子的另一参数或作用机制的增加或减少。

当应用于肽时，术语“分离的”指示该肽不含与它在天然状态下与之结合的细胞或其它生物组分中的至少一些，或者肽已浓缩至大于其体内或体外生产的浓度的水平。它可以处于同质的或基本上同质的状态。分离的物质可以处于干燥或半干燥状态，或者在溶液包括但不限于水溶液中。它可以是药物组合物的组分，所述药物组合物包含另外的药学可接受的载体和/或赋形剂。纯度和同质性通常使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层析进行测定。

“基本上纯的”意指间隙连接通道或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的纯度，其中存在至少70％的间隙连接通道或半通道阻滞剂或抑制剂化合物，更优选至少80％，且甚至更优选增加到至少90％、95％或99％。特别优选的纯度为至少95％。“基本纯的”意指组合物对于所需的间隙连接通道或半通道阻滞剂或抑制剂化合物为至少为90％或更纯的。其为制剂中存在的主要物种的肽也是基本上纯化的。

如本文使用的，术语“有效量”指待施用的间隙连接通道或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的量，其将在一定程度上缓解待治疗的疾病、病症或状况的一种或多种症状。含有本文所述的间隙连接通道或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的组合物可以施用用于预防性、增强和/或治疗性处理。

如本文使用的，“受试者”指任何哺乳动物，包括人、驯养动物和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如犬、马、猫、绵羊、猪、牛等。在本文中优选的哺乳动物是人，包括成人、儿童和老年人。优选的运动动物是马和犬。优选的宠物动物是犬和猫。

如本文使用的，“预防”意指全部或部分地预防，改善或控制，减少、减轻或降低，或者阻止或停止。

如本文使用的，关于本发明的化合物或组合物的“治疗有效量”指足以诱导所需生物学、药学或治疗结果的量。该结果可以是疾病或病症或状况的一种或多种体征、症状或原因的减轻，或者生物系统的任何其它所需改变。在本发明中，例如，结果将涉及以下的一种或多种症状的治疗、预防和/或减少：心血管或眼部病症，包括例如血管生成性、炎性或水肿性眼部状况，或急性冠状动脉综合征，例如缺血性心脏病，以及例如涉及缺血和/或氧化性应激的任何眼部心血管病症、疾病或状况。

如本文使用的，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指治疗性处理和预防性或预防措施两者。

“类似物”或“肽类似物”指具有与模板肽的那些类似的性质的化合物，并且可以是非肽药物。包括基于肽的化合物的“肽模拟物”(也称为“模拟肽”)也包括此类非肽基化合物，例如肽类似物。与治疗上有用的肽在结构上类似的肽模拟物可以用于产生等价或增强的治疗或预防效应。一般地，肽模拟物与范例多肽(即，具有生物学或药理学功能或活性的多肽)在结构上相同或相似，但也可以具有任选地被选自以下的键合替换的一个或多个肽键合：例如，-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和–CH2SO-。模拟物可以完全由天然氨基酸或氨基酸的非天然类似物组成，或者是部分天然肽氨基酸和部分氨基酸的非天然类似物的嵌合分子。模拟物还可以包含任何量的天然氨基酸保守取代，只要这些取代也基本上不改变模拟活性。

一般而言，术语“肽”指经由肽键合连接的两个或更多个个别氨基酸(无论是否天然存在的)的任何聚合物，如当与一个氨基酸(或氨基酸残基)的α-碳键合的羧酸基团的羧基碳原子变得与相邻氨基酸的α-碳键合的氨基的氨基氮原子共价结合时发生的那样。这些肽键键合和包含其原子(即α-碳原子、羧基碳原子(及其取代基氧原子)和氨基氮原子(及其取代基氢原子))形成蛋白质的“多肽主链”。另外，如本文使用的，术语“多肽”和“肽”可以互换使用。类似地，蛋白质片段、类似物、衍生物和变体在本文中可以被称为“肽”或“肽试剂”。术语肽的“片段”指包含少于肽的所有氨基酸残基的多肽。

如本文使用的，“同时”用于意指本发明的一种或多种试剂同时施用，而术语“组合”用于意指如果不同时或在物理组合中施用，则它们在它们两者均可用于在治疗上起作用的时帧内“序贯地”施用。因此，“序贯”施用可以允许一种试剂在另一种试剂后几分钟(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、30)分钟或数小时、数天、数周或数个月内施用，条件是例如间隙连接通道或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和另一种眼部或心血管治疗剂同时以有效量存在。组分的一次或多次施用之间的时间延迟将根据组分的确切性质、它们之间的相互作用及其各自的半衰期而变化。

半通道肽试剂

本文所述的本发明的间隙连接通道和半通道阻滞剂或抑制剂化合物能够调节微血管病症的一种或多种症状。优选地，微血管病症是血管生成性眼病症或眼部损伤或心血管病症，但是其它预期如本文所述，包括特征在于炎症、水肿和/或血管损伤或渗漏的那些。

在非限制性优选实施例中分离或基本上纯的本发明的化合物包括ADCFLSRPTEKT(SEQ.ID.NO:1)、VDCALSRPTEKT(SEQ.ID.NO:2)、VDCFLARPTEKT(SEQ.ID.NO:3)、VDCFLSRPAEKT(SEQ.ID.NO:4)、VDCFLSRPTEKA(SEQ.ID.NO:5)、CFLSRPTAKT(SEQ.ID.NO:6)、CALSRPTEKT(SEQ.ID.NO:7)、CFLARPTEKT(SEQ.ID.NO:8)、CFLSRPAEKT(SEQ.ID.NO:9)和CFLSRPTEKA(SEQ.ID.NO:10)。在显示为SEQ.ID.NO:1-10的上述肽中的任何和所有中，分开或以任何组合一起，缬氨酸(V)可以被丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和苯丙氨酸(F)取代；天冬氨酸(Asp)可以被谷氨酸(E)取代；半胱氨酸(C)可以被丝氨酸(S)取代；苯丙氨酸(P)可以被丙氨酸(A)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)取代；亮氨酸(L)可以被异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)取代；丝氨酸(S)可以被丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)和缬氨酸(V)，优选丙氨酸取代；精氨酸(R)可以被赖氨酸(L)或谷氨酰胺(Q)取代；脯氨酸(P)无法被取代；苏氨酸(T)可以被丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)和甘氨酸(G)取代；谷氨酸(E)可以被丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)和天冬酰胺(N)取代；赖氨酸(K)可以被精氨酸(R)取代，所有这些都是SEQ.ID.NO:1-8类似物。在显示为SEQ.ID.NO:1-8的上述肽中的任何和所有中，分开或以任何组合一起，任何氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸，然而，条件是肽不是L-Val L-Asp L-Cys L-Phe L-Leu L-Ser L-ArgL-Pro L-Thr L-Glu L-Lys L-Thr。含有D-氨基酸的显示为SEQ.ID.NO:1-8的上述肽中的任何也是SEQ.ID.NO:1-8类似物。

R₁Val Asp Cys X₁Leu Ser Arg Pro X₂X₃Lys X₄

R₁Y₁Asp Cys X₁Leu Z₁Arg Pro X₂X₃Lys X₄

其中Y₁是Val、Ala或选自以下的氨基酸：Ile、Leu、Met、Phe、Thr、Cys、Tyr、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸、Nva、Nle、叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、7-氨杂色氨酸、4-氟苯丙氨酸、N-甲基-甲硫氨酸、N-甲基-缬氨酸、N-甲基-丙氨酸、肌氨酸、N-甲基-叔丁基甘氨酸、N-甲基-亮氨酸、N-甲基-苯基甘氨酸、N-甲基-异亮氨酸、N-甲基-色氨酸、N-甲基-7-氨杂色氨酸、N-甲基-苯丙氨酸、N-甲基-4-氟苯丙氨酸、N-甲基-苏氨酸、N-甲基-酪氨酸、N-甲基-缬氨酸和N-甲基-赖氨酸、和/或前述任一种的D-对映体；Z₁是Ser、Ala或选自以下的氨基酸：Asn、Thr、Cys、Gly、Asp、Glu、Lys、Gln、Gly、Pro、His和Arg；并且其中R₁、X₁,X₂、X₃和X₄如上文对于式I所述；然而，条件是₁,X₁,Z₁、X₂、X₃和X₄不同时分别是Val、Phe、Ser、Thr、Glu和Thr，并且肽R₁Y₁Asp Cys X₁Leu Z₁Arg Pro X₂X₃Lys X₄肽不是L-Val L-Asp L-Cys L-Phe L-Leu L-SerL-Arg L-Pro L-Thr L-GluL-Lys L-Thr。

在非限制性优选实施例中是分离的或基本上纯的本发明的其它实施例还包括氨基酸序列IDCFISRPTEKT(SEQ ID NO:43)，将是同种型特异性的，并且可用作例如由连接蛋白45组成的间隙连接通道的阻滞剂和/或用作由连接蛋白45组成的半通道的半通道阻滞剂。其序列和活性类似物，包括具有基团例如上文所述R₁的那些、以及可用于例如增加分子量且保护其免受蛋白水解酶影响的其它，对于解决心脏疾病、病症和状况，包括特征至少部分在于血管损伤和/或渗漏的那些，以及解决来自心肌梗塞和心脏病发作的血管枯死的治疗，将是特别重要的。

R₁Ile Asp Cys X₁Ile Ser Arg Pro X₂X₃Lys X₄

R₁Y₁Asp Cys X₁ILe Z₁Arg Pro X₂X₃Lys X₄

在非限制性优选实施例中是分离的或基本上纯的本发明的化合物还可以包括或排除根据表1的12种氨基肽。

在某些实施例中，R₁可以是细胞内化转运蛋白。本发明的细胞内化转运蛋白可以是本领域已知或新近发现的任何内化序列、或其保守变体。细胞内化转运蛋白和序列的非限制性例子包括触角足序序列、TAT、HIV-Tat、Penetratin、Antp-3A(Antp突变体)、BuforinII、Transportan、MAP(模型两亲性肽)、K-FGF、Ku70、Prion、pVEC、Pep-1、SynB1、Pep-7、HN-1、BGSC(双-胍-亚精胺-胆固醇和BGTC(双胍-Tren-胆固醇))。

示例性细胞内化肽的序列在下表4中提供。

表4

表4列出了示例性细胞内化转运蛋白的序列。

在一些实施例中，连接蛋白、泛连接蛋白和/或钙粘蛋白调节剂肽与转运肽融合，以增加渗透到靶细胞内。在一些实施例中，转运肽可以是用于细胞渗透的病毒包衣的部分。在一些实施例中，转运肽可以在羧基或氨基末端处与连接蛋白和/或钙粘蛋白调节剂肽融合。转运肽可以选自下述肽之一：ANTP、HIV-TAT、Transportan、Buforin II、Tat、Penetratin、MAP、K-FGF、Ku70、Prion、pVEC、Pep-1、SynB1、Pep-7、RGD或HN-1。

在本发明的一个实施例中，连接蛋白43调节剂肽的氨基酸序列可以选自本文列出的任何肽SEQ ID、或其保守变体。在本发明的一个进一步的实施例中，连接蛋白43调节剂肽可以包含SEQ ID NO:54-71的氨基酸序列。在本发明的另一个实施例中，连接蛋白43调节剂肽还包含细胞内化转运蛋白。在一个进一步的实施例中，连接蛋白43调节剂肽可以在氨基末端处与细胞内化转运蛋白连接。

本发明还包括例如组合的序列，其同时针对组织中的多种连接蛋白同种型具有功能，并且可以作为独立实体或连接的分开或一起递送。例如，连接蛋白43半通道阻滞剂VDCFLSRPTEKT(SEQ ID NO:47)可以与连接蛋白40半通道阻滞剂VNCYVSRPTEKN(SEQ ID NO:48)连接，其形式为VDCFLSRPTEKT–X–VNCYVSRPTEKN(SEQ ID NO:49)，其中X是一个或多个连接甘氨酸或其它非功能性接头，使得组合肽能够与由连接蛋白43、连接蛋白40或连接蛋白45组成的半通道相互作用。

本发明还包括例如该或组合的四种肽连接蛋白同种型阻滞剂序列，并且它们不形成三级结构，并且连接提供线性结构的保留。在一个实施例中，制备用于血管内皮连接蛋白40、43、45和37的肽，包括：VDCFVSRPTEKN(SEQ ID NO:50)；VDCFLSRPTEKN(SEQ ID NO:51)；和VDCFVSRPTEKT(SEQ ID NO:52)。

在一个非限制性实施例中，本发明范围内的肽，包括SEQ.ID.NO:1-52和式I-IV内的序列的一个或多个氨基酸，可以以L-或D-构型。在其它实施例中，本发明范围内的肽的一个或多个氨基酸是天然存在的非遗传编码的氨基酸。在另外其它实施例中，本发明范围内的肽的一个或多个氨基酸是氨基酸类似物或合成氨基酸。

在另一个实施例中，本发明范围内的化合物，包括SEQ.ID.NO:1-52和式I-IV内的序列中的一个或多个氨基酸，取代来自相似氨基酸类别或亚类的另一个氨基酸，主要基于氨基酸侧链的化学和物理性质。例如，一个或多个亲水或极性氨基酸可以取代另一个亲水或极性氨基酸。同样地，一个或多个疏水或非极性氨基酸可以取代另一个疏水或非极性氨基酸。在进行此类取代时，极性氨基酸还可以细分为具有酸性、碱性或亲水侧链的氨基酸，并且非极性氨基酸还可以细分为具有芳香族或疏水侧链的氨基酸。非极性氨基酸还可以进一步细分以包括脂肪族氨基酸。

其它实施例包括选自SEQ.ID.NO:1至10的肽，以及根据式I、式II、式III和/或式IV中任一的肽，其不包括C末端苏氨酸。其它实施例包括选自SEQ.ID.NO:1至10的肽，以及根据式I和/或式II的肽，其不包括N末端缬氨酸。其它实施例包括根据式III和/或式IV的肽，其不包括N末端异亮氨酸。其它实施例包括选自SEQ.ID.NO:1至10的肽，以及根据式I和/或式II的肽，其不包括N末端缬氨酸或C末端苏氨酸。其它实施例包括根据式III和/或式IV的肽，其不包括N末端异亮氨酸或C末端苏氨酸。

本发明的方法可用于治疗血管生成性眼病症，例如年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞和角膜新生血管化。

如本文使用的，表述“血管生成性眼病症”意指由血管生长或增殖或血管渗漏引起或者与其相关的任何眼疾病。可使用本发明的方法治疗的血管生成性眼病症的非限制性例子包括年龄相关性黄斑变性(例如，湿性AMD、渗出性AMD等)、视网膜静脉阻塞(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO；例如，CRVO后的黄斑水肿)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、脉络膜新生血管形成(CNV；例如近视CNV)、虹膜新生血管形成、新生血管性青光眼、青光眼术后纤维化、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、视盘新生血管形成、角膜新血管形成、视网膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、血管翳、翼状胬肉、血管性视网膜病变和糖尿病性视网膜病变。

还在本发明的范围内的是本发明的化合物，其已进行修饰以改善其生物药物性质。在某些实施例中，本发明的化合物被修饰，例如，以提供增加的稳定性、增加的对蛋白水解失活的抗性、降低至不存在的免疫原性、增加的循环寿命包括改变的血清半衰期和改变的治疗半衰期、以及低毒性。通过其可以修饰本发明的化合物的方法包括例如通过PEG化，通过化学衍生化，以及通过与肽或脂质的融合或缀合。经修饰的化合物包括经修饰的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。

本发明设想了本发明治疗性肽的前药形式。“前药”是治疗性肽的经修饰的形式，其包括可逆的化学修饰，所述化学修饰可以在递送至患者后在生理条件下通过酶促或非酶促催化反应可靠地去除，以将前药转换为亲本肽。此类修饰可以增强化学稳定性、改变水溶性、延长生物半衰期、拓宽治疗指数、改善药效学和/或改善生物利用度，例如同时保存亲本治疗性肽的药理学性质。此类修饰还可以允许亲本肽在其到达生物区室后释放，在所述生物区室中它可以发挥所需效应。“前药”是这样的化合物，其可以包括一种或多种专门的无毒保护基团，其以瞬时方式作用以改变或消除亲本肽中的某些限制性质，所述保护基团可以通过酶促或化学切割去除。任何合适的保护基团可以用于生成本发明的肽前药。此类专门修饰包括在亲本肽的氨基和/或羧基末端的任一或两者处一个或多个氨基酸残基的包含。允许另外的N末端或C末端氨基酸或氨基酸序列的有效体内去除的切割位点优选包括在此类前药分子中。还设想了除添加一个或多个N末端和/或C末端氨基酸残基之外的修饰。例如，可以使用用于前药转换的二酮哌嗪和二酮吗啉(DKP和DMP)策略(参见例如，Application of Peptide-Badsed Prodrug Chemistry in Drug Development,Springer,Ed.De,Arnab(2012))，其中前药在由化合物固有的化学不稳定性驱动的生理条件下缓慢转换为母体药物，而无需任何酶促切割。为了改善稳定性，可以通过生物可逆地掩蔽N末端和/或C末端氨基酸来保护本发明的亲本肽免于外肽酶介导的水解。

本发明的前药的例子是其中亲本肽包括附加至亲本肽的N末端和/或C末端的一个或多个另外的氨基酸残基的前药。本发明的化合物还包括本发明的试剂的前药形式。例如，前药形式包括具有附着至例如包括SEQ.ID.No:1-10的肽或式I-IV中任一种的肽的N末端的一至16个氨基酸残基的前药。

根据本发明的前药的进一步例子包括这样的前药，其中亲本肽的氨基被酰化、烷基化、磷酸化、二十烷酰化、丙氨酰化、戊基氨基羰基化、(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)-甲氧基羰基化、四氢呋喃基化、吡咯烷基甲基化、新戊酰氧基甲基化或叔丁基化等等；化合物，其中亲本肽的羟基被酰化、烷基化、磷酸化、乙酰化、棕榈酰化、丙酰化、新戊酰化、琥珀酰化、富马酰化、丙氨酰化或二甲基氨基甲基羰基化等等；以及其中亲本肽的羧基被酯化或酰胺化(例如乙基酯化、苯基酯化、羧甲基酯化、二甲氨基甲基酯化、新戊酰氧基甲基酯化、乙氧基羰氧基乙基酯化、邻苯二甲酰基酯化、(5-甲基-2-外-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基酯化、环己氧基羰基乙基酯化或甲基酰胺化等等)的化合物等等。

还设想了其它前药形式，包括含有对一个或多个氨基酸残基的化学修饰的前药形式，所述氨基酸残基不位于亲本肽的N末端或C末端处。如本领域技术人员应了解的，可以利用任何合适的化学修饰，所述化学修饰可以在生理条件下去除，以产生本发明的化合物的药学活性形式。

其它实施例包括本发明的化合物的肽模拟物。

在实例中提供了间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的心脏保护活性的说明。

使用本领域已知的方法进行间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物、以及经修饰的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的合成。其为肽例如SEQ.ID.NO:1-52的本发明的化合物可以通过固态化学肽合成来制备。其它化合物，例如融合肽，也可以通过常规重组技术来制备，使用例如Sambrook&Maniaitis中描述的标准程序。本发明的肽及其它化合物可以是经化学修饰的。这可以增强它们对肽酶及其它酶的抗性，通过肾的限制性清除等。制备此类经修饰的化合物的方法是本领域已知的。

使用的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的精确序列将取决于其改善心血管病症的一种或多种症状或效应的能力。在实例中提供了用于确定此类效应的手段。

用于制备本发明的药物组合物的合适的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物包括SEQ.ID.NO:1-52。用于制备本发明的药物组合物的其它合适的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物包括式I-IV内的肽。本文描述了用于制备药物组合物的其它合适的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物，并且包括例如前述化合物的类似物、变体、截短和修饰(包括融合)。

间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物活性可以通过任何方便和常规的方法，包括例如如实例中所述，根据其序列和所需活性加以选择。

治疗剂

用于预防和/或治疗本文描述或提及的疾病、病症或状况，例如急性冠状动脉综合征或血管生成性眼部病症，以及涉及炎症、缺血和/或氧化性应激的相关疾病、病症和状况的本发明的组合物和方法，还包括与一种或多种其它治疗剂串联或组合(例如，以物理组合，作为组合制剂提供)的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的施用。心血管治疗剂包括硝酸盐、β阻滞剂、钙通道阻滞剂(特别是用于稳定或不稳定型心绞痛，但在β阻滞剂的情况下也用于心力衰竭)、利尿药、血管扩张剂、正性肌力药、ACE抑制剂和醛固酮拮抗剂例如螺内酯(特别是用于心力衰竭)、血液稀释治疗剂(例如阿司匹林、肝素、华法林)和硝酸甘油(特别是用于MI)。眼部治疗剂包括抗VEGF化合物。

用如本文所述的一种或多种化合物或药物组合物如本文提供的治疗受试者可以包括其急性或持续施用，并且在组合的情况下，其同时、分开或序贯施用，如本文进一步描述的。

本发明的试剂可以施用于需要治疗的受试者，例如患有本文提到的任何疾病、病症或状况的受试者。因此可以改善受试者的状况。所述试剂可以用于制造药剂，以治疗本文提到的任何疾病、病症或状况。因此，根据本发明，提供了通过其可以治疗心血管病症的制剂。

本发明的试剂可以施用于需要治疗的受试者，例如患有急性冠状动脉综合征或者本文提到的任何疾病或状况的受试者。因此可以改善受试者的状况。因此，化合物可以用于通过疗法治疗受试者的身体。它们可以用于制造药剂，以治疗本文提到的任何状况。

剂型和制剂及施用

本发明的化合物可以以分离的或者基本上或基本纯的形式存在。应理解产物可以与载体或稀释剂混合，所述载体或稀释剂不干扰产物的预期目的，并且仍然被认为是分离的或基本上纯的。本发明的产物还可以是基本上或基本纯化的形式，优选包含以下或基本上由以下组成：约80％、85％或90％，例如至少约95％、至少约98％或至少约99％的化合物或制剂的干质量。

根据预期的施用途径，本发明的药物产物、药物组合物、组合制剂和药剂可以例如采取溶液、悬浮液、滴注、持续释放制剂或粉末的形式，并且通常含有约0.1％-95％的活性成分，优选约0.2％-70％。其它合适的制剂包括基于注射和输注的制剂。其它有用的制剂包括持续释放制剂，包括例如控释、缓释或延迟释放制剂。

本发明的方面包括含有一种或多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的受控或其它剂量、剂型、制剂、组合物和/或装置。本发明包括例如用于至少经口施用、透皮施用、局部应用、眼部递送栓剂递送、经粘膜递送、注射(包括皮下施用、真皮下施用、肌内施用、长效施用和静脉内施用，包括经由推注、缓慢静脉内注射和静脉内滴注递送)、输注装置(包括可植入的输注装置，主动和被动两者)、通过吸入或吹入施用、经颊施用和舌下施用的剂量和剂型。应了解，在适用或期望时，本文所述的特别是用于静脉内施用的任何剂型、组合物、制剂或装置，可以以通过本文考虑或通常采用的任何其它途径施用的剂型、组合物、制剂或装置利用。例如，可以使用适合于肠胃外施用的剂型肠胃外施用一个或多个剂量，其可以掺入关于适合于经口施用的剂型所述的特征或组合物，或者以持续剂型例如经修饰的释放、延长释放、延迟释放、缓释或重复作用剂型递送。

优选地，将本发明的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物与药学可接受的载体或稀释剂组合，以产生药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。合适的稀释剂和赋形剂还包括例如水、盐水、右旋糖、甘油等等及其组合。另外，需要时，还可以存在物质如润湿剂或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂。

术语“药学可接受的载体”指任何有用的载体、赋形剂或稳定剂，其在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒，并且包括不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的药物载体。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。生理学可接受的载体通常是水性pH缓冲溶液。生理学可接受的载体的其它例子包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如Tween、聚乙二醇(PEG)和普流尼克。

还可以存在药学可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。

合适的载体材料包括通常用作用于局部施用的乳膏、洗剂、凝胶、乳液或涂剂的基质的任何载体或媒介物。例子包括乳化剂、惰性载体包括烃基质、乳化基质、无毒溶剂或水溶性基质。特别合适的例子包括普流尼克、HPMC、CMC及其它基于纤维素的成分、羊毛脂、硬石蜡、液体石蜡、黄软石蜡或白软石蜡、白蜂蜡、黄蜂蜡、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、二甲硅油、乳化蜡、异丙基肉豆蔻酸酯、微晶蜡、油醇和硬脂醇。

在本发明的制剂中还可以包括辅助试剂，例如酪蛋白、明胶、白蛋白、胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素或聚乙烯醇。

本发明的剂型、制剂、装置和/或组合物可以配制为优化生物利用度，并且将血浆浓度维持在治疗范围内，包括延长的时期。持续递送制剂，例如受控递送制剂，也优化了在作用部位处的药物浓度，并且例如最小化用药不足和用药过度的时期。

可用于本发明中的剂型、装置和/或组合物可以提供用于定期施用，包括每天一次施用，用于间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的低剂量控释和/或低剂量长期体内释放。

适合于经口施用的剂型的例子包括但不限于片剂、胶囊、锭剂或类似形式，或任何液体形式如糖浆剂、水溶液、乳液等等，其能够提供治疗有效量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。

适合于透皮施用的剂型的例子包括但不限于透皮贴剂、透皮绷带等等。适合于局部施用可用于本发明中的化合物和制剂的剂型的例子是任何洗剂、棒、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、凝胶等，无论是直接还是经由中间体(intermed)施加于皮肤。

适合于栓剂施用可用于本发明中的化合物和制剂的剂型的例子包括插入身体孔口内的任何固体剂型，特别是经直肠、阴道和尿道插入的那些。

适合于透粘膜递送可用于本发明中的化合物和制剂的剂型的例子包括用于灌肠剂、阴道栓剂、卫生棉条、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫、雾化溶液、粉末和类似制剂的储存溶液，除活性成分之外，其还含有如本领域已知为适当的此类载体。

适合于注射可用于本发明中的化合物和制剂的剂型的例子包括经由推注递送，例如通过静脉内注射、皮下、真皮下和肌内施用或经口施用的单次或多次施用。

适合于长效施用可用于本发明中的化合物和制剂的剂型的例子包括活性剂或固体形式的丸剂或小圆柱体，或者其中活性剂包裹在可生物降解的聚合物、微乳液、脂质体的基质中或被微囊化的固体形式。

可用于本发明中的化合物和制剂的输注装置的例子包括含有一种或多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和/或预复合的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的输注泵，以对于所需数目的剂量或稳态施用所需的量，并且包括可植入的药物泵。

可用于本发明中的化合物和制剂的可植入输注装置的例子包括任何固体形式，其中活性剂包封在或分散在可生物降解的聚合物或合成的聚合物如硅酮、硅橡胶、硅化橡胶或类似聚合物各处。

适合于吸入或吹入可用于本发明中的化合物和制剂的剂型的例子包括包含在药学可接受的水性或有机溶剂中的溶液和/或悬浮液、或其混合物和/或粉末的组合物。

适合于经颊施用可用于本发明中的化合物和制剂的剂型的例子包括锭剂、片剂等等，包含在药学可接受的水性或有机溶剂中的溶液和/或悬浮液、或其混合物和/或粉末的组合物。

适合于舌下施用可用于本发明中的化合物和制剂的剂型的例子包括锭剂、片剂等等，包含在药学可接受的水性或有机溶剂中的溶液和/或悬浮液、或其混合物和/或粉末的组合物。

用于递送可用于本发明中的化合物和制剂的受控药物制剂的例子可在例如以下中找到：Sweetman,S.C.(编辑)Martindale.The Complete Drug Reference，第33版，Pharmaceutical Press,Chicago,2002，第2483页；Aulton,M.E.(编辑)Pharmaceutics.TheScience of Dosage Form Design.Churchill Livingstone,Edinburgh,2000，第734页；以及Ansel,H.C.,Allen,L.V.和Popovich,N.G.Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems，第7版，Lippincott 1999，第676页。用于制造药物递送系统的赋形剂在本领域技术人员已知的各种出版物中描述，包括例如Kibbe,E.H.Handbook ofPharmaceutical Excipients，第3版，American Pharmaceutical Association,Washington,2000，第665页。USP还提供了经修饰释放的经口剂型的例子，包括配制为片剂或胶囊的那些。参见例如，United States Pharmacopeia 23/National Formulary 18,TheUnited States Pharmacopeial Convention,Inc.,Rockville MD,1995(下文称为“USP”)，其也描述了确定延长释放和延迟释放片剂和胶囊的药物释放能力的特定测试。FDA已提供了有关延长释放剂型分析的进一步指导。参见Guidance for Industry.Extended releaseoral dosage forms:development,evaluation,and application of in vitro/in vivocorrelations.Rockville,MD:Center for Drug Evaluation and Research,Food andDrug Administration(1997)。

可用于本发明的方法中的剂型的进一步例子包括但不限于经修饰释放(MR)的剂型包括延迟释放(DR)形式；延效(PA)形式；控释(CR)形式；延长释放(ER)形式；定时释放(TR)形式；和长效(LA)形式。在大多数情况下，这些术语用于描述经口施用的剂型，然而这些术语可适用于本文所述的任何剂型、制剂、组合物和/或装置。这些制剂实现在药物施用后延迟的总药物释放一定时间，和/或在施用后间歇地以小等分试样的药物释放，和/或以由递送系统控制的受控速率缓慢的药物释放，和/或以不改变的恒定速率的药物释放，和/或比通常制剂显著更长时期的药物释放。

本发明的经修饰释放的剂型包括具有基于时间、过程和/或位置的药物释放特征的剂型，其设计为实现通过常规或立即释放形式不提供的治疗或方便目的。参见例如，Bogner,R.H.U.S.Pharmacist 22(Suppl.):3-12(1997)；Scale-up of oral extended-release drug delivery systems:part I,an overview,Pharmaceutical Manufacturing2:23-27(1985)。本发明的延长释放剂型包括例如如由美国食品与药物管理局(FDA)限定的剂型，其允许将给药频率减少至由常规剂型所呈现的那种，所述常规剂型例如溶液或立即释放剂型。参见例如，Bogner,R.H.(1997)同上。本发明的重复作用剂型包括例如含有两个单一剂量药剂的形式，一个用于立即释放，并且第二个用于延迟释放。例如，可以制备双层片剂，其中一层药物用于立即释放，而第二层设计为随后作为第二剂量或以延长释放方式释放药物。本发明的靶向释放剂型包括例如这样的制剂，其促进药物释放，并且针对在身体区域、组织或部位中分离或浓缩药物用于吸收或药物作用。

还可用于本发明中的是含有一种或多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和/或预复合的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的经包被的珠、颗粒或微球体，其可以用于实现一种或多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和/或预复合的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的经修饰释放，通过将药物掺入经包被的珠、颗粒或微球体内。在此类系统中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和/或预复合的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物分布到珠、丸剂、颗粒或其它微粒系统上。参见Ansel,H.C.,Allen,L.V.和Popovich，N.G.,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippincott 1999，第232页。

已描述了用于制造适合于药物递送的微球体的方法。参见例如，Arshady,R.Polymer Eng Sci 30:1746-1758(1989)；还参见Arshady,R.,Polymer Eng Sci 30:905-914(1990)；还参见：Arshady R.,Polymer Eng Sci 30:915-924(1990)。各种包被系统是商购可得的。例如，Aquacoat^TM[FMC Corporation,Philadelphia]和Surerelease^TM[Colorcon]；Aquacoat水性聚合物分散体。Philadelphia:FMC Corporation,1991；Surerelease水性控释包被系统。West Point,PA:Colorcon,1990；Butler,J.等人，PharmTech 22:122-138(1998)；Yazici,E.等人，Pharmaceut Dev Technol 1:175-183(1996)。

包衣厚度和所用包被材料类型中的变化影响在其下体液能够穿透包衣以溶解间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的速率。一般地，包衣越厚，对渗透的抗性越强，并且间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的释放和溶解越延迟。参见Madan,P.L.U.S.Pharmacist 15:39-50(1990)。这提供了不同的所需持续或延长释放速率以及经包被的珠靶向胃肠道的所需区段。可用于水不溶性释放-减慢中间层(待施加于丸剂、球状体或片剂核心)的成膜聚合物的例子包括乙基纤维素、聚乙酸乙烯酯、RS、 RL等。( RS和 RL各自为甲基丙烯酸铵共聚物。释放速率不仅可以通过在其中掺入合适的水溶性成孔剂，如乳糖、甘露醇、山梨糖醇等加以控制，还可以通过施加的包衣的厚度加以控制。可以配制多片剂，所述多片剂包括小球状体形压缩小片，其可以具有3至4mm的直径，并且可以放置在明胶胶囊壳中，以提供所需模式的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物释放。每个胶囊可以含有8-10个小片，一些未经包被用于间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的立即释放，并且另一些经包被用于延长释放。

许多方法可以用于生成适合于经口施用于人及其它哺乳动物的一种或多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的经修饰释放的剂型。可用于实现经修饰释放的药物递送的两种基本机制包括药物和赋形剂的改变溶解或扩散。在该上下文中，例如，可以同时或连续地采用四个过程。这些过程如下：(i)装置的水合作用(例如，基质的膨胀)；(ii)水扩散到装置内；(iii)药物的受控或延迟溶解；以及(iv)溶解或增溶的药物离开装置的受控或延迟扩散。

为了配制一系列剂量值，可以使用细胞培养测定和动物研究。此类化合物的剂量优选位于这样的剂量内，所述剂量对于至少50％的群体治疗上有效，并且在该水平上显示出很小的毒性或无毒性。

在本发明的方法和组合物中采用的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物各自的有效剂量可以根据许多因素而变化，包括所采用的特定间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物，心血管治疗组合配偶体(如果存在的话)、施用模式、施用频率、待治疗的状况、待治疗状况的严重程度、施用途径、待治疗的患者亚群的需要或个别患者的需要，所述不同需要可能是由于年龄、性别、体重、对患者特异性的相关医学状况。

合适的剂量可以是约0.001至约1或约10mg/kg体重，例如约0.01至约0.5mg/kg体重。然而，合适的剂量可以是约0.001至约0.1mg/kg体重，例如约0.01至约0.05mg/kg体重。1至100、100-200、200-300、300-400和400-500毫克的剂量是适当的，如约500-750微克和约750-1000微克的剂量一样。其它有用的剂量包括每剂量约300至约1000皮摩尔、以及每剂量约0.05至约0.2纳摩尔。另外其它剂量也在下述权利要求内。

例如，在某些实施例中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物组合物可以以约0.01纳摩尔(mM)或0.05nM至约200nM的最终浓度施用。优选地，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物组合物以约0.1nM至约150nM的最终浓度施用，更优选地，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物组合物以约1nM至约100nM的最终浓度应用，且更优选地，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物组合物以约10-20nM至约100-150nM的最终浓度施用。另外，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物给药量包括例如约0.1-1、1-2、2-3、3-4或4-5毫克(mg)、约5至约10mg、约10至约15mg、约15至约20mg、约20至约30mg、约30至约40mg、约40至约50mg、约50至约75mg、约75至约100mg、约100mg至约250mg、以及250mg至约500mg。如上文指出的，还提供了500至约1000毫克或更多的给药量。其它剂量包括范围为至少约100纳克的剂量，包括例如至少约200纳克、600纳克、2000纳克、6000纳克和至少约10,000纳克或更多。剂量浓度包括至少约0.1摩尔/升的浓度，包括例如至少约0.3、1.0、3.0和10.0nMoles/L。剂量浓度还包括0.1nMoles/L、0.3nMoles/L、1.0nMoles/L、3.0nMoles/L和10.0nMoles/L的浓度。这些剂量浓度等价于0.1、0.3、1、3、11μg/L和0.4、1.0、4.0、10和39微克/kg(μg/kg)的可施用的重量剂量。还在本发明内的是范围为0.1至5.0μg/kg和0.1至10.0μg/kg的其它剂量。另外，约0.4、1.0、4.0、10和39μg/kg的剂量在本发明内。至少约0.4、1.0、4.0、10和39μg/kg的剂量也在本发明内。

本文描述的每种试剂每天约1纳克(ng)/kg至约1mg/kg体重的另外其它剂量水平。在某些实施例中，每种主题化合物的剂量一般在以下范围内：约1ng至约1微克/kg体重、约1ng至约0.1微克/kg体重、约1ng至约10ng/kg体重、约10ng至约0.1微克/kg体重、约0.1微克至约1微克/kg体重、约20ng至约100ng/kg体重、约0.001mg至约0.01mg/kg体重、约0.01mg至约0.1mg/kg体重、或约0.1mg至约1mg/kg体重。在某些实施例中，每种主题化合物的剂量一般在以下范围内：约0.001mg至约0.01mg/kg体重、约0.01mg至约0.1mg/kg体重、约0.1mg至约1mg/kg体重。如果使用多于一种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物，则每种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的剂量无需在与另一种相同的范围内。

方便地，如果输注，则间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物施用至少约0.5至1小时、至少约1-2小时、至少约2-4小时、至少约4-6小时、至少约6-8小时、至少约8-10小时、至少约12小时、或至少约24小时。

如本文指出的，例如组合施用的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的剂量、或与任一或两者组合施用的其它治疗剂，可以从当单独给予时施用的剂量下调。

几种试剂的组合使用可以减少任何个别试剂的所需剂量，因为不同试剂的效应的开始和持续时间可以是互补的。在一个优选的实施例中，两种或更多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的组合使用具有加性效应、协同效应或超加性效应。

在一些情况下，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物与另一种治疗剂的组合、或者与任一或两者组合施用的其它试剂具有加性效应。在其它情况下，该组合可以具有大于加性的效应。此类效应在本文中称为“超加性”效应，并且可以是由于协同或加强的相互作用。

在另一个优选的实施例中，与当所述试剂单独施用时的频率相比，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和另一种治疗剂的组合使用减少了其中施用所述试剂的频率。因此，这些组合允许使用比先前实现所需治疗目标所需的更低和/或更少剂量的每种试剂。

剂量可以在单一或分开的施加中施用。剂量可以施用一次，或施加可以重复。通常，除多次单一施用之外或代替多次单一施用，施用可以是通过输注。

需要时，一种或多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和另一种心血管治疗剂可以通过相同或不同的途径施用。本发明的各种试剂可以在治疗过程期间的不同时间分开施用，或者以分开的或单一的组合形式同时施用。

在本发明的一个方面，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物在一种组合物中施用，并且另一种心血管治疗剂在第二组合物中施用。在一个实施例中，在包含另一种治疗剂的第二组合物之前，施用包含间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的第一组合物。在一个实施例中，在包含另一种心血管治疗剂的第二组合物之后，施用包含间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的第一组合物。在一个优选的实施例中，在包含另一种治疗剂的第二组合物之前和之后，施用包含间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的第一组合物。在一个实施例中，在包含间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物试剂的第一组合物之前和之后，施用包含另一种治疗剂的第二组合物。在一个实施例中，包含间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的第一组合物与包含另一种治疗剂的第二组合物大约同时施用。

经过一段时间，在一些情况下约1-2小时、约2-4小时、约4-6小时、约6-8或约24小时或更长时间，单独或连同另一种治疗剂一起，包含间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的制剂的递送，也可以例如使用缓释制剂或贮库制剂以及透皮制剂和装置来实现。

改善蛋白质和肽的经口生物利用度的策略范围从通过修饰其亲脂性和酶敏感性来改变其物理化学性质，到使用被胃肠道中的内源性转运载体系统识别的转运载体分子来添加新型功能性，和/或将其包含在特别适合的药物载体系统中。市售的基于聚合物的系统在靶向特定器官/组织的控制释放及其递送蛋白质和肽的能力方面吸引了相当大的关注。它们可以将蛋白质有效递送到靶位点，并且因此增加治疗益处，同时最小化副作用。与基于聚合物的载体(例如聚合物微粒、纳米颗粒、水凝胶或贴剂)的蛋白质结合是改善经口蛋白质生物利用度的有用方法。基于聚合物的载体可以保护蛋白质免受胃肠环境的影响，并且允许调节物理化学和蛋白质释放性质，并且因而调节生物学行为。此外，从改善经口吸收的角度来看，载体的主要效应是增加上皮膜通透性，从而导致更高的生物利用度。

通过影响在其下间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物从剂型中释放的速率，和/或通过减慢剂型通过胃肠道的渡越时间，可以实现本发明的化合物和制剂的剂型，延长的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的作用(参见Bogner,R.H.,USPharmacist 22(Suppl.):3-12(1997))。来自固体剂型的药物释放速率可以通过下述技术进行修改，所述技术一般基于下述：1)通过使用屏障包衣控制生物流体对药物的接近来修改药物溶出；2)控制来自剂型的药物扩散速率；以及3)药物物质或其药物屏障与部位特异性生物流体之间的化学反应或相互作用。本文还提供了通过其实现这些目标的系统。在一种方法中，采用消化作为释放机制，将间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物包被或包裹在缓慢消化或分散到肠道内的物质中。间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的利用速率是可分散材料的消化速率的函数。因此，取决于受试者消化材料的能力，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的释放速率以及因此的有效性因受试者而异。

本发明的化合物和制剂的另一种形式的缓释剂型是任何合适的渗透系统，其中例如乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸丙酸纤维素的半透膜用于控制间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的释放。这些可以用肠溶漆的水性分散体包被而不改变释放速率。此类渗透系统的一个例子是渗透泵装置，例如由Alza Inc.(U.S.A.)开发的Oros^TM装置。

可用于本发明的方法中的其它装置利用整体基质，包括例如缓慢侵蚀或亲水聚合物基质，在其中压缩或包埋一种或多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。

包含可用于本发明中的化合物和制剂的整体基质装置包括使用例如分散在可溶性基质中的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物形成的那些，当基质溶解或膨胀时，所述基质变得越来越可用；例子包括亲水胶体基质，例如羟丙纤维素(BP)或羟丙基纤维素(USP)；羟丙基甲基纤维素(HPMC；BP，USP)；甲基纤维素(MC；BP，USP)；羧甲基纤维素钙(钙CMC；BP，USP)；丙烯酸聚合物或羧基聚亚甲基(卡波普)或卡波姆(BP，USP)；或者线性糖醛酸聚糖(glycuronan)聚合物，例如海藻酸(BP，USP)，例如由海藻酸(海藻酸盐)-明胶水胶体凝聚层系统配制成微粒的那些，或者其中脂质体已通过用聚-L-赖氨酸膜包被海藻酸进行包封的那些。当聚合物膨胀时，发生间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物释放，形成基质层，所述基质层控制水性流体扩散到核心内，并且因此控制来自系统的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的扩散速率。

在此类系统中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物释放的速率取决于凝胶内通道的弯曲性质和包裹流体的粘度，使得可以实现与脉冲释放组合的不同的释放动力学，例如零级或一级。在这种凝胶没有交联的情况下，聚合物链之间存在较弱的非永久性结合，其依赖二次键合。利用这种装置，可实现间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的高负载，并且有效共混是频繁的。装置可以含有20–80％的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物(w/w)，连同可以增强间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物扩散的凝胶改性剂；此类改性剂的例子包括可以增强水合速率的糖，可以影响交联含量的离子，以及影响聚合物电离水平的pH缓冲剂。亲水基质装置还可以含有一种或多种pH缓冲剂、表面活性剂、抗衡离子、润滑剂如硬脂酸镁(BP，USP)和助流剂例如胶体二氧化硅(USP；胶体无水二氧化硅，BP)，加上间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和亲水基质。

包含可用于本发明中的化合物和制剂的整体基质装置还包括使用例如溶解于不溶性基质中的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物颗粒形成的那些，当溶剂通常通过通道进入基质，并溶解间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物颗粒时，从所述基质中间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物变得可用。例子包括用脂质基质或不溶性聚合物基质形成的系统，包括由以下形成的制剂：巴西棕榈蜡(BP；USP)；中链甘油三酯，如分馏椰子油(BP)或饱和甘油三酯培养基(PhEur)；或纤维素乙醚或乙基纤维素(BP，USP)。脂质基质简单且易于制造，并且掺入下述粉末组分的共混物：脂质(20-40％疏水性固体w/w)，其在释放过程期间保持完整；间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物，例如通道形成剂，例如氯化钠或糖，其从制剂中浸出，形成溶剂通过其进入的水性微通道(毛细管)，并且间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物通过其被释放。在该系统中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物包埋在惰性不溶性聚合物中，并且通过水性流体的浸出而释放，所述水性流体通过颗粒之间形成的毛细管扩散到装置的核心内，并且间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物由其扩散离开装置。释放速率受压缩程度、粒度以及赋形剂的性质和相对含量(w/w)控制。此类装置的一个例子是Ferrous Gradumet(Martindale第33版，1360.3)。合适的不溶性基质的另一个例子是惰性塑料基质。通过该方法，将间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物用惰性塑料材料如聚乙烯、聚乙酸乙烯酯或聚甲基丙烯酸酯制粒，然后将粒化的混合物压制成片剂。一旦摄入，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物就通过扩散从惰性塑料基质中缓慢释放。参见例如，Bodmeier,R.&Paeratakul,O.,J Pharm Sci 79:32-26(1990)；Laghoueg,N.等人，Int J Pharm 50:133-139(1989)；Buckton,G.等人，Int J Pharm 74:153-158(1991)。片剂的压缩产生基质或塑料形式，其在间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的浸出并且通过其通过胃肠道的过程中保持其形状。可以将间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的间隙释放部分压缩到片剂的表面上。间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物消耗的惰性片剂基质随粪便排出。这类成功剂型的例子是Gradumet(Abbott；参见例如，Ferro-Gradumet,Martindale第33版，第1860.4页)。

可用于本发明的方法中的整体基质装置的进一步例子包括在悬挂附着物中掺入聚合物基质的本发明的组合物和制剂。参见例如，Scholsky,K.M.和Fitch，R.M.,JControlled Release 3:87-108(1986)。在这些装置中，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物可以借助于酯键合附着至通过水性乳液聚合制备的聚(丙烯酸酯)酯胶乳颗粒。本发明的整体基质装置的再进一步的例子包括这样的剂型，其中间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物通过不稳定的化学键与生物相容性聚合物结合，例如由取代的酸酐制备的聚酐(其自身通过使酰氯与药物反应制备：甲基丙烯酰氯和甲氧基苯甲酸的钠盐)已用于形成具有第二聚合物(Eudragit RL)的基质，其在胃液中水解时释放药物。参见Chafi,N.等人，Int J Pharm 67:265-274(1992)。

还可以通过微囊化制备一种或多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的经修饰释放形式。微胶囊化是通过在待封装的物质周围形成“壁”材料的薄包衣，固体、液体或甚至气体可以通过其封装成微观尺寸的颗粒的方法，如美国专利3,488,418；3,391,416和3,155,590中公开的。明胶(BP，USP)通常用作微胶囊化制剂中的成壁材料，但也可以使用合成聚合物如聚乙烯醇(USP)、乙基纤维素(BP，USP)、聚氯乙烯及其它材料。参见例如，Zentner,G.M.等人，J Controlled Release 2:217-229(1985)；Fites,A.L.等人，JPharm Sci 59:610-613(1970)；Samuelov,Y.等人，JPharm Sci 68:325-329(1979)。通过改变核心-壁比率、用于包被的聚合物或微胶囊化方法，可以获得不同速率的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物释放。参见例如：Yazici,E.,Oner，等人，PharmaceutDev Technol；1:175-183(1996)。

其它有用的方法包括其中将间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物掺入以储库和基质装置形式的聚合物胶体颗粒或微囊(微粒、微球体或纳米颗粒)内的方法。参见：Douglas,S.J.，等人，C.R.C.Crit Rev Therap Drug Carrier Syst 3:233-261(1987)；Oppenheim,R.C.,Int J Pharm 8:217-234(1981)；Higuchi,T.,J Pharm Sci 52:1145-1149(1963)。

适合于透皮递送的药物制剂是本领域技术人员已知的，并且在参考文献例如Ansel等人(同上)中描述。已知通过经皮途径增强药物递送的方法包括化学皮肤渗透增强剂，其通过可逆地损坏或以其它方式改变角质层的物理化学性质来增加皮肤渗透性，以降低其对药物扩散的抵抗力。参见Shah,V.,Peck,C.C.和Williams,R.L.，Skin penetrationenhancement:clinical pharmacological and regulatory considerations,In:Walters,K.A.和Hadgraft,J.(编辑)Pharmaceutical skin penetrationenhancement.New York:Dekker,(1993)。适合于配制在透皮药物递送系统中的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的皮肤渗透增强剂可以选自下述列表：丙酮、月桂氮酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇、油酸、聚乙二醇、丙二醇和十二烷基硫酸钠。进一步的皮肤渗透增强剂可以在本领域技术人员已知的出版物中找到。参见例如，Osborne,D.W.,&Henke,J.J.,Pharm Tech 21:50-66(1997)；Rolf,D.,“Pharm Tech 12:130-139(1988)。除化学手段之外，存在增强本发明的化合物和制剂的透皮药物递送和渗透的物理方法。这些包括离子电渗疗法和超声促渗疗法。适合于通过离子电渗疗法或超声促渗疗法施用的制剂可以是凝胶、乳膏或洗剂的形式。

本发明的透皮递送、方法或制剂可以尤其利用整体递送系统、药物浸渍的粘合剂递送系统(例如，来自3M的Latitude^TM药物粘合剂系统(drug-in-adhesive system))、主动转运装置和膜-受控系统。本发明的透皮递送剂型包括用间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物取代透皮递送系统中提及的双氯芬酸或它的其它药学可接受的盐的那些，所述透皮递送系统例如在美国专利号6,193,996和6,262,121中公开。

其它剂型包括适于栓剂或其它肠胃外使用的经口剂型的变体。例如，当以栓剂的形式经直肠施用时，这些组合物可以通过将一种或多种本发明的化合物和制剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂例如可可脂、合成甘油酯或聚乙二醇，其在常温下是固体，但在直肠腔中液化和/或溶解，以释放间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。栓剂一般是用于插入身体孔口包括直肠、阴道和偶尔尿道内的固体剂型，并且可以是长效或缓释的。栓剂包括基质，其可以包括但不限于材料例如海藻酸，其延长药学可接受的活性成分经过几小时(5-7)的释放。

可用于本发明中的化合物和制剂的透粘膜施用可以利用任何粘膜，但通常利用鼻、颊、阴道和直肠组织。适合于本发明的化合物和制剂的鼻施用的制剂可以以液体形式例如鼻喷雾剂、滴鼻剂施用，或通过经由雾化器的气溶胶施用，包括间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的水性或油性溶液。其中载体是固体的用于鼻施用的制剂包括具有例如小于约100微米，优选更少，最优选每天一次或两次小于约50微米的粒度的粗粉末，所述粗粉末以其中采取嗅出的方式施用，即通过鼻道从握住靠近鼻子的粉末容器中快速吸入。溶液中的组合物可以通过使用惰性气体来雾化，并且此类雾化溶液可以直接从雾化装置呼吸，或者雾化装置可以附着到面罩、塞子或间歇性间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物可以经口或经鼻从以适当方式递送制剂的装置施用。制剂可以例如在盐水中制备为水溶液，采用苄醇或其它合适防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或本领域已知的其它增溶剂或分散剂的溶液。

可以根据常规方法通过将一定量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物成分溶解或悬浮于稀释剂中来制备组合物。间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的量为每毫升稀释剂0.1mg至1000mg。在一些实施例中，提供了100mg和200mg间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的剂型。仅作为例子，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的量范围可以为约1mg至约750mg或更多(例如，约1mg、约10mg、约25mg、约50mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约400mg、约500mg、约600mg、约750mg、约800mg、约1000mg和约1200mg)。其它剂量包括范围为至少约100纳克的剂量，包括例如至少约200纳克、600纳克、2000纳克、6000纳克和至少约10,000纳克或更多。剂量浓度包括至少约0.1摩尔/升的浓度，包括例如至少约0.3、1.0、3.0和10.0nMoles/L。剂量浓度还包括0.1nMoles/L、0.3nMoles/L、1.0nMoles/L、3.0nMoles/L和10.0nMoles/L的浓度。这些剂量浓度等价于0.1、0.3、1、3、11μg/L和0.4、1.0、4.0、10和39微克/kg(μg/kg)的可施用的重量剂量。还在本发明内的是范围为0.1至5.0μg/kg和0.1至10.0μg/kg的其它剂量。另外，约0.4、1.0、4.0、10和39μg/kg的剂量在本发明内。至少约0.4、1.0、4.0、10和39μg/kg的剂量也在本发明内。这些范围内的其它量也可以使用且特别加以考虑，尽管其间的每个数目未明确陈述。

间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物可以以适合于每天一次给药的形式提供且施用。可以加入乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐缓冲液，允许最终组合物的pH为约5.0至约9.5；任选地，还可以加入碳水化合物或多元醇张力剂(tonicifier)和选自以下的防腐剂：间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯和苯酚。需要时，也可以存在注射用水、张力调节剂(tonicifyingagent)例如氯化钠以及其它赋形剂。对于肠胃外施用，制剂是等渗的或基本上等渗的，以避免在施用部位处的刺激和疼痛。

当关于氢离子浓度或pH使用时，术语缓冲液、缓冲剂溶液和缓冲溶液指系统，特别是水溶液抵抗在加入酸或碱或者用溶剂稀释时的pH变化的能力。在加入酸或碱时经历pH的小变化的缓冲溶液的特征是弱酸和弱酸的盐、或弱碱和弱碱的盐的存在。前一种系统的一个例子是乙酸和乙酸钠。只要加入的羟基离子的量不超过缓冲系统中和它的能力，pH的变化就是轻微的。

将制剂的pH维持在大约5.0至约9.5的范围内可以增强本发明的肠胃外制剂的稳定性。其它pH范围例如包括约5.5至约9.0，或约6.0至约8.5，或约6.5至约8.0，或优选约7.0至约7.5。

使用的缓冲液可以选自下述任一种，例如，乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或谷氨酸盐缓冲液，最优选的缓冲液是磷酸盐缓冲液。载体或赋形剂也可以用于促进本发明的组合物和制剂的施用。载体和赋形剂的例子包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖(如乳糖、葡萄糖或蔗糖)、或各类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、聚乙二醇和生理学相容的溶剂。可以包括稳定剂，但一般不需要。然而，如果包括的话，则可用于本发明的实践的稳定剂的例子是碳水化合物或多元醇。多元醇包括此类化合物如山梨糖醇、甘露醇、甘油、木糖醇和聚丙二醇/乙二醇共聚物，以及分子量为200、400、1450、3350、4000、6000和8000的各种聚乙二醇(PEG)。碳水化合物包括例如甘露糖、核糖、海藻糖、麦芽糖、肌醇、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或乳糖。

也可以使用或包括等渗剂或维持等渗性的试剂。

美国药典(USP)陈述必须将抑菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂加入多剂量容器中包含的制剂中。它们必须在使用时以足够的浓度存在，以预防在用皮下注射针和注射器、或使用其它侵入性递送手段例如笔式注射器抽取一部分内容物时无意中引入制剂内的微生物繁殖。抗微生物剂应该进行评估，以确保与配方的所有其它组分的相容性，并且其活性应该在总配方中进行评估，以确保在一种制剂中有效的特定试剂在另一种中并非无效的。发现特定试剂在一种制剂中有效但在另一种制剂中无效则并不罕见。虽然用于本发明的实践中的防腐剂范围可以为0.005至1.0％(w/v)，但每种防腐剂(单独或与其它组合)的优选范围是：苯甲醇(0.1-1.0％)、或间甲酚(0.1-0.6％)、或苯酚(0.1-0.8％)、或者对羟基苯甲酸甲酯(0.05-0.25％)与对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯(0.005％-0.03％)的组合。对羟基苯甲酸酯是对羟基苯甲酸的低级烷基酯。每种防腐剂的详细描述在"Remington's Pharmaceutical Sciences"以及Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,，第1卷，1992,Avis等人中阐述。出于这些目的，间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物可以肠胃外施用(包括皮下注射、静脉内、肌内、真皮内注射或输注技术)、或通过以剂量单位制剂的吸入喷雾剂施用，所述剂量单位制剂含有常规无毒的药学可接受的载体、佐剂和媒介物。

需要时，肠胃外制剂可以用增稠剂如甲基纤维素增稠。制剂可以油包水或油包水的乳化形式制备。可以采用广泛多样的药学可接受的乳化剂中的任一种，包括例如阿拉伯胶粉、非离子表面活性剂或离子表面活性剂。还可能期望向药物制剂中加入合适的分散剂或悬浮剂。这些可以包括例如水性悬浮液，例如合成和天然树胶，例如，黄蓍胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。

其它成分可以存在于可用于本发明的肠胃外药物制剂中是可能的。此类另外的成分可以包括润湿剂、油(例如植物油，例如芝麻、花生或橄榄)、镇痛剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力改性剂、金属离子、含油媒介物、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸，例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，此类另外的成分不应该不利地影响本发明的药物制剂的总体稳定性。关于药物制剂，还参见Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,，第1卷，第2版，Avis等人，编辑，Mercel Dekker,New York,N.Y.1992。

肠胃外施用的合适途径包括肌内、静脉内、皮下、腹膜内、皮下、真皮内、关节内、鞘内等等。粘膜递送也是允许的。剂量和给药方案将取决于受试者的重量和健康。

除实现延长的药物作用的上述手段之外，还可以通过例如使用机械控制的药物输注泵，来控制间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物递送的速率和持续时间。

间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物可以以长效注射剂的形式施用，所述长效注射剂可以以这样的方式配制，以便允许间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的持续释放。可以将间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物压缩成丸剂或小圆柱体并且皮下或肌内植入。丸剂或圆柱体可以另外包被有合适的可生物降解的聚合物，以便提供所需的释放概况。间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物可以可替代地是微丸剂化的(micropelleted)。使用生物可接受的聚合物的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物微丸剂可以设计为允许操纵释放速率，以提供所需的释放概况。可替代地，可以通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的微囊化基质来制备可注射的储库形式。取决于间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物与聚合物的比率，以及所采用的特定聚合物的性质，可以控制间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物释放的速率。还可以通过将间隙结合通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物包裹在脂质体中来制备储库可注射制剂，所述脂质体的例子包括单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由各种磷脂例如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱形成。还可以通过将间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物包埋在与身体组织相容的微乳液中来制备储库可注射制剂。例如，参考美国专利号6,410,041和6,362,190。

可植入的输注装置可以采用惰性材料，例如上文列出的可生物降解的聚合物或合成硅酮，例如，由Dow-Corning Corporation制造的弹性(cylastic)、硅橡胶或其它聚合物。聚合物可以装载有间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和任何赋形剂。可植入的输注装置还可以包括医疗装置的包衣或一部分，其中所述包衣包含装载有间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和任何赋形剂的聚合物。此类可植入的输注装置可以如美国专利号6,309,380中公开的进行制备，通过用含有聚合物的体内生物相容且可生物降解或生物可吸收或生物腐食性(bioerodibleerodible)的液体或凝胶溶液包被装置，其中所述溶液包含所需给药量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和任何赋形剂。将溶液转化为粘附于医疗装置的膜，从而形成可植入的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物可输送的医疗装置。如美国专利号6,120,789中公开的，还可以通过原位形成含有固体基质的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物来制备可植入的输注装置。如本领域中已知的，可植入的输注装置可以是被动的或主动的。

在本发明的方法中还有用的是微乳液，即由亲水相、亲脂相、至少一种表面活性剂(SA)和至少一种辅助表面活性剂(CoSA)组成的流体和稳定的同质溶液。合适的表面活性剂的例子包括甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯，以及聚乙二醇(PEG)单酯和二酯。辅助表面活性剂，有时也称为“共表面活性剂”，是具有疏水特性的化学化合物，预期促使水相和油相在微乳液中相互溶解。合适的辅助表面活性剂的例子包括乙基二甘醇、丙二醇的月桂酸酯、聚甘油的油酸酯和相关的化合物。

还可以使用各种聚合物递送间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物，以通过以下增强生物利用度：增加对粘膜表面的粘附、降低间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物通过水解或酶促降解的降解速率、以及增加间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物相对于颗粒大小的表面积。合适的聚合物可以是天然的或合成的，并且可以是可生物降解的或不可生物降解的。低分子量活性剂，例如间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的递送，可以通过聚合物系统的扩散或降解而发生。代表性的天然聚合物包括蛋白质，例如玉米醇溶蛋白、改性玉米醇溶蛋白、酪蛋白、明胶、谷蛋白、血清白蛋白和胶原，多糖例如纤维素、葡聚糖和聚透明质酸。合成聚合物一般是优选的，由于降解和释放概况的更佳特征。代表性的合成聚合物包括聚磷腈、聚(乙烯醇)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚亚烷基、聚丙烯酰胺、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基酯、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚乙烯基卤化物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物。合适的聚丙烯酸酯的例子包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷基酯)。合成的经修饰的天然聚合物包括纤维素衍生物，例如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯和硝酸纤维素。合适的纤维素衍生物的例子包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧甲基纤维素、三乙酸纤维素和硫酸纤维素钠盐。上述聚合物各自可以得自商业源，例如SigmaChemical Co.,St.Louis,Mo.、Polysciences,Warrenton,Pa.、Aldrich Chemical Co.、Milwaukee,Wis.、Fluka,Ronkonkoma,N.Y.和BioRad,Richmond,Calif.，或可以使用标准技术从得自这些供应商的单体合成。

上述聚合物可以分开表征为可生物降解的、不可生物降解的和生物粘附的聚合物。代表性的合成可降解聚合物包括多羟基酸如聚乳酸、聚乙交酯及其共聚物、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、聚酐、聚原酸酯及其共混物和共聚物。代表性的天然可生物降解的聚合物包括单独或与合成聚合物组合的多糖例如海藻酸盐、葡聚糖、纤维素、胶原及其化学衍生物(化学基团的取代、添加，例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化和由本领域技术人员常规制备的其它修饰)，以及蛋白质例如白蛋白、玉米醇溶蛋白及其共聚物和共混物。不可生物降解的聚合物的例子包括乙烯乙酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯基苯酚及其共聚物和混合物。亲水性聚合物和水凝胶趋于具有生物粘附性质。含有羧基的亲水性聚合物(例如聚[丙烯酸])趋于显示出最佳的生物粘附性质。当需要在软组织上的生物粘附性时，具有最高浓度的羧基的聚合物是优选的。各种纤维素衍生物，例如海藻酸钠、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素和甲基纤维素也具有生物粘附性质。这些生物粘附材料中的一些是水溶性的，而其它的是水凝胶。聚合物如乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)、乙酸偏苯三酸纤维素(CAT)、乙酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)、乙酸邻苯二甲酸羟丙基纤维素(HPCAP)、乙酸邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAP)和乙酸邻苯二甲酸甲基纤维素(MCAP)，可以用于增强它们与之复合的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的生物利用度。当它们的光滑表面侵蚀时，其羧基暴露在外表面上的快速生物可侵蚀的聚合物，例如聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐和聚原酸酯，也可以用于生物粘附的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物递送系统。另外，含有不稳定键的聚合物，例如聚酐和聚酯，因其水解反应性而众所周知。它们的水解降解速率一般可以通过聚合物主链中的简单变化而改变。在降解时，这些材料也在其外表面上暴露羧基，并且也可以用作B型利钠肽信号肽片段试剂递送系统。

可以增强一种或多种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的生物利用度或吸收的其它试剂可以通过促进或抑制跨肠粘膜的转运起作用。例如，增加血流量的试剂，例如血管扩张剂，可以通过增加对胃肠道的血流量来增加经口施用的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的吸收速率。血管扩张剂构成可以增强间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的生物利用度的另一类试剂。

增强可用于本发明中的组合物和制剂的生物利用度的其它机制包括反向主动转运机制的抑制。例如，现在认为肠上皮细胞中存在的主动转运机制之一是p-糖蛋白转运机制，其促进已在上皮细胞内扩散或转运的物质反向转运回到肠腔内。这种p-糖蛋白介导的主动转运系统的抑制促使更少的药物被转运回腔内，并且因此增加跨越肠上皮的净药物转运并增加血液中最终可用的药物量。各种p-糖蛋白抑制剂是本领域众所周知且了解的。这些包括水溶性维生素E；聚乙二醇；泊洛沙姆包括普流尼克F-68；聚环氧乙烷；聚氧乙烯蓖麻油衍生物，包括Cremophor EL和Cremophor RH 40；白杨素，(+)-紫杉叶素；柚皮素；地奥司明；槲皮素；等等。

因此，虽然递送期将取决于所需状况和试剂两者以及所需的疗效，但提供了约0.5-1小时、约1-2小时、约2-4小时、约4-6小时、约6-8小时或约24小时或更长时间的连续或缓释递送。根据本发明，这通过在连同药学可接受的载体或媒介物一起的制剂中包含单独或连同另一种心血管治疗剂一起的间隙结合通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物来实现，特别是以用于连续或缓释施用的制剂的形式。

如指出的，本发明的一种或多种试剂可以在受试者中或受试者上的手术之前、期间、之后立即施用，所述手术例如血管成形术操作或其它物理干预例如支架。它们优选例如在手术之前和/或手术期间或在手术后约24、约12、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2小时内，或例如在约60、约45、约30、约15、约10、约5、约4、约3、约2、约1分钟内施用。

本文所述的施用途径和剂量预期仅作为指导，因为熟练的医师将考虑对于任何特定患者和状况的最佳施用途径和剂量。

治疗患有或处于心血管病症的风险中的受试者的任何方法都可以利用本文所述的任何剂量、剂型、制剂和/或组合物的施用。

药物组合物

本发明涉及用于预防和/或治疗心血管病症的药物组合物及其使用方法，其中所述组合物包含单独或连同另一种心血管治疗剂一起的治疗有效量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。

相应地，在一个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗心血管病症的组合物，其包含以下或基本上由以下组成：单独或连同另一种心血管治疗剂一起的至少一种间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。在一个优选的实施例中，组合物还包含药学可接受的载体或媒介物。

试剂盒、药剂和制造物品

间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物也可以用于制造用于预防和/或治疗心血管病症以及相关病症和状况的药剂。

在一个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗心血管病症的试剂盒，其包含所述的一种或多种组合物或制剂。例如，本发明包括包含组合物的试剂盒，所述组合物包含单独或与一种或多种心血管治疗剂组合的治疗有效量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。例如，试剂盒可以包括包含有效量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和/或下述中的一种或多种的组合物：硝酸盐、β阻滞剂、钙通道阻滞剂(特别是用于稳定或不稳定型心绞痛，但在β阻滞剂的情况下也用于心力衰竭)、利尿药、血管扩张剂、正性肌力药、ACE抑制剂和醛固酮拮抗剂例如螺内酯(特别是用于心力衰竭)、血液稀释治疗剂(例如阿司匹林、肝素、华法林)和硝酸甘油(特别是用于MI)。试剂盒还可以包括包含以下或基本上由以下组成的组合物：间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物，单独或者与例如一种或多种抗血栓溶解疗法(例如，链激酶抑制剂、抗血小板治疗剂，例如氯吡格雷)组合(例如，以物理组合，作为组合制剂提供)。试剂盒还可以包括单独或组合(例如，以物理组合，作为组合制剂提供)的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物。

还提供了制造物品，其包含含有如本文所述的本发明的组合物或制剂(以任何剂量或剂量形式或装置)和用于治疗受试者的说明书的容器。例如，在另一个方面，本发明包括制造物品，其包含含有单独或与一种或多种其它心血管治疗剂组合的治疗有效量的间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物的容器。

制造和稳定性

可以使用本领域已知的化学制造本发明的多肽。在一个方面，本发明的制剂包含本发明的多肽的盐，例如本发明的多肽的钠盐。在一个实施例中，制剂可以包含例如具有SEQ.ID.NO:1-52中任何一个的多肽的钠盐。

在一些实施例中，本发明的制剂是基本上纯的。基本上纯的意指制剂包含小于约10％、5％或1％，且优选小于约0.1％的任何氨基酸或非氨基酸杂质。在一些实施例中，总杂质包括连接蛋白43调节多肽的代谢产物不超过15％。在一些实施例中，总杂质包括连接蛋白43调节多肽的代谢产物不超过12％。在一些实施例中，总杂质包括连接蛋白43调节多肽的代谢产物不超过11％。在其它实施例中，总杂质包括连接蛋白43调节多肽的代谢产物不超过10％。

在一些实施例中，可以使用选自阴离子交换HPLC(AEX-HPLC)或质谱法的方法测量本发明的制剂的纯度。质谱法可以包括LC/MS或LC/MS/MS。在一些实施例中，测定可以包括AEX-HPLC和LC/MS两者。

通过将抗连接蛋白调节多肽溶解于制剂媒介物中，使用无菌处理制备包含本发明的连接蛋白调节多肽的无菌组合物。在一个实施例中，制剂也可以通过过滤灭菌。用于制造本发明的制剂的赋形剂广泛用于药物产物中并且符合药典标准。在一个实施例中，本公开内容的药物组合物包含本文所述的化合物和包含无菌赋形剂的药学可接受的载体。在一个实施例中，药物组合物包含选自SEQ ID NO:1-10、21、25、27-30、46、49、50和51的化合物；并且药学可接受的载体包括无菌赋形剂。在一个实施例中，无菌赋形剂是本文所述赋形剂的灭菌形式。

在一个方面，本发明涉及间隙连接通道和/或半通道阻滞剂或抑制剂化合物和任选的另一种抗心血管治疗剂的持续施用。在一个实施例中，所述药剂施用至少约0.5小时、约1-24小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时、至少约12小时或至少约24小时。

治疗患有或怀疑患有或倾向于本文提及或描述的疾病、病症和/或状况的受试者的任何方法均可以利用本文描述的任何剂量、剂型、制剂、组合物和/或装置的施用。

通过参考下述非限制性实验部分将获得本发明的更好理解，所述实验部分是说明性的而不预期以任何方式限制本发明或权利要求。如所述的，该数据支持本文所述的化合物和组合物用于治疗心血管疾病、病症和状况的用途。

实例

方法

细胞培养

人脑微血管内皮(hCMVEC)细胞(ABMGood，(O'Carroll等人，2015,Journal ofneuroinflammation 12:131)在M199培养基(Gibco)中生长，所述培养基补充有10％FCS 1μg/mL氢化可的松(Sigma)、3μg/mL人FGF(Peprotech)、10μg/mL人EGF(Peprotech)、10μg/mL肝素(Sigma)、2mM Glutamax(Gibco)和80μM丁酰基cAMP(Sigma)，并且在1μg/cm²胶原I(Gibco)包被的T25或T75烧瓶中培养。ARPE-19细胞在DMEM/F:12、10％FCS和1％抗生素抗真菌剂(Thermo fisher scientific)中培养。所有细胞生长至80-90％汇合；使用TrypLEExpress(Life technologies)进行胰蛋白酶消化；以1:3–1:5比率分开，并且在37℃、95％O₂和5％CO₂下培养，除非另有说明。

肽和化学试剂

对于间隙连接的细胞刮除负载–染料偶联测定、诱导的蛋白质分布变化和半通道阻滞的ATP释放研究，合成纯度>95％的连接蛋白43模拟肽(肽5，序列VDCFLSRPTEKT)(Auspep，澳大利亚)，并且以10mM的储备浓度溶解于miliQ H₂O中。对于竞争测定，根据由制造商(Auspep，澳大利亚)供应的纯度，定制合成细胞外环匹配肽，并且以1mM的储备浓度溶解于miliQ H₂O中。对于肽5序列取代研究，在School of Chemical Sciences,Universityof Auckland生成肽。使用Fmoc固相合成制备肽。Fmoc-Thr(tBu)-OH或Fmoc-Ala-OH预装载到HMPP接头，并且附着到内部制备的氨甲基PS树脂2.1(使用DIC的DMF溶液)。这随后为经由自动化Tribute Fmoc-SPPS，分别使用含有0.1M 6-Cl-HOBt和HBTU和NMM的5％哌嗪的交替脱保护和偶联反应。使用TFA的树脂切割提供粗产物，其经历经由半制备型RP-HPLC的纯化。肽以高纯度(>95％)和良好的产率(17％-46％)获得。所有丙氨酸取代的类似物都是miliQH₂O可溶的(表5)。

表5.连接蛋白43的单丙氨酸取代的肽以研究肽5序列特异性。丙氨酸取代以下划线标记。

实例1：截短的肽5基序的合成

为了确定对于功能必需的肽5的基序，进一步的六个截短的肽(表2)以95％的纯度合成，并且以10mM的储备浓度溶解于miilQ H₂O中(ChinaPeptide Co Ltd,Shanghai，中国；www.chinapeptide.org)。

表2.连接蛋白43肽的截短的肽

截短的肽	序列
		修饰1	CFLSRPTEKT
修饰2	LSRPTEKT
		修饰3	SRPTEKT
修饰4	VDCFLSRPTE
		修饰5	VDCFLSRP
修饰6	VDCFLS

肽5的乱序序列(RFKPSLCTTDEV)用作肽对照(Auspep，澳大利亚)(尽管该序列与细胞骨架蛋白具有同源性，并且可能具有非特异性效应)。将非特异性半通道抑制剂氯化镧(LaCl₃，Sigma)(Mylvaganam等人，2014,Frontiers in physiology 5:172)以1mM的储备浓度溶解于miliQ H₂O中。甘珀酸(CBX，Sigma)，连接蛋白通道的非特异性抑制剂，以及间隙连接通道的广谱抑制剂(Salameh和Dhein，2005,Biochim Biophys Acta 1719:36-58)，以10mM的储备浓度溶解于miliQ H₂O中。

实例2：关于功能的肽5基序的确定

为了确定对于功能必需的肽5的基序，六个截短的肽(表2)以95％的纯度合成，并且以10mM的储备浓度溶解于miilQ H₂O中(ChinaPeptide Co Ltd,Shanghai，中国；www.chinapeptide.org)。

肽5的乱序序列(RFKPSLCTTDEV)用作肽对照(Auspep，澳大利亚)(尽管该序列与细胞骨架蛋白具有同源性，并且可能具有非特异性效应)。将非特异性半通道抑制剂氯化镧(LaCl₃，Sigma)(Mylvaganam等人，2014)以1mM的储备浓度溶解于miliQ H₂O中。甘珀酸(CBX，Sigma)，连接蛋白通道的非特异性抑制剂，以及间隙连接通道的广谱抑制剂(Salameh和Dhein，2005)，以10mM的储备浓度溶解于miliQ H₂O中。

刮除加载测定

将hCMVEC细胞以每孔0.4x 10⁶个细胞的密度在1μg/cm²胶原I(Gibco)12孔板中铺平板，并且培养过夜。将hCMVEC的汇合单层在溶解于培养基中的肽5(5-100μM)中预温育2小时或24小时。浓度为100μM的CBX用作阳性对照。细胞用不含Ca²⁺或Mg²⁺的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次。细胞然后在0.05％荧光黄(LY)(Sigma)中温育，所述荧光黄是通过偶联的间隙连接通道转移的荧光染料(el-Fouly等人，1987,Experimental cell research 168:422-430)，+/-溶解于PBS中的肽5，并且用10号碳钢手术刀片(Swann-Morton，英国)刮伤。在37℃下在95％O₂和5％CO₂中无光照的5分钟温育后，去除0.05％LY溶液。细胞用含有Ca²⁺或Mg²⁺的PBS冲洗四次，然后在室温下在pH 7.4的PBS中的4％多聚甲醛(PFA)中固定10分钟。然后在荧光成像前将细胞在PBS中洗涤3次，以去除PFA。荧光图像使用Nikon TE2000E倒置荧光显微镜(10x放大率，0.3数值孔径)进行显现，并且使用Digital Sight CCD相机和Eclipse Net软件(Nikon)进行捕获。获取来自三个独立实验的每个孔内的三个图像用于分析，并且由设盲的观察者手动计数显示来自已加载那些的染料摄取的细胞总数目。

免疫细胞化学和Cx43斑的定量

使ARPE-19细胞生长直至在8孔玻璃室-载玻片(BD Falcon)中汇合。ARPE-19细胞的汇合单层以50至500μM肽5、500μM LaCl₃和500μM CBX的最终浓度在培养基中温育2或6小时。将细胞在pH 7.4的4％PFA(ProSciTech)中在室温下固定10分钟，用PBS中的0.05％Triton-X100渗透化处理，并且在10％正常山羊血清中温育，以阻滞非特异性标记。在每次固定、渗透化处理和封闭步骤之间，细胞用含有0.1mM CaCl₂的PBS冲洗三次。将连接蛋白43多克隆兔抗体(C6219，Sigma，1:2000)施加过夜，随后为山羊抗兔Alexa 568二抗(Invitrogen，1:200)45分钟。将核用DAPI(Invitrogen)以10,000倍稀释度复染5分钟，并且用Citifluor^TM封固剂固定。在Olympus FV1000直立式共聚焦激光扫描显微镜和OlympusFV10-ASW 4.0软件上，使用油浸镜头(60x放大率，1.35数值孔径)使图像显现且捕获。图像采集和分析软件(版本5.3.0.1，Molecular Devices)中的Transfluor特点用于定量每个图像的连接蛋白43斑的总面积。结果代表平均值±标准误，并且使用单因素ANOVA和Tukey多重比较检验进行统计检验。

体外缺血-再灌注ATP测定

在实验前一天，将人脑内皮细胞(hCMVEC)以0.025x 10⁶个细胞/孔的密度在胶原包被的12孔板(1μg/cm²)中铺平板。将细胞在培养基中温育过夜。模拟缺氧-缺血的脑中的细胞间隙的离子浓度和酸碱移位的缺氧、酸性、离子移位林格氏损伤溶液(Bondarenko和Chesler，2001,Current medicinal chemistry 17:4191-4230)用于触发半通道开放。损伤溶液含有(以mM计)：38NaCl、13NaHCO₃、3Na-葡糖酸盐、65K-葡糖酸盐、38NMDG-Cl、1NaH₂PO₄和1.5MgCl₂。将损伤溶液在95％N₂、5％CO₂气体(20L/分钟)中鼓泡5分钟，并且在使用前将pH调整至6.6。标准林格溶液含有(以mM计)：124NaCl、3KCl、26NaHCO₃、26NaHCO₃、1NaH₂PO₄、1.3CaCl₂、1.5MgCl₂和10葡萄糖，并且在使用前将pH调整至7.4(Bondarenko和Chesler，2001)。在缺血损伤模型中，将hCMVEC细胞在500μL损伤溶液+/-肽5(100μM)(O'Carroll等人，2008,Cell communication&adhesion 15:27-42；Danesh-Meyer等人，2012,Brain:ajournal of neurology 135:506-520；Davidson等人，2012,Annals of neurology 71:121-132；Davidson等人，2013,Experimental neurology 248:301-308；Davidson等人，2014,PloS one 9:e96558；Davidson等人，2015,J Cereb Blood Flow Metab)、或+/-细胞外环序列(表5)、或以100μM的最终浓度溶解于损伤溶液(500μL)中的经修饰的肽(表2、3)中温育2小时。对于阴性对照，将hCMVEC细胞仅在500μL标准林格溶液中温育2小时。对于阳性对照，将hCMVEC细胞仅在500μL标准林格溶液中温育2小时。所有温育都在37℃下在95％O₂和5％CO₂中进行。在每次实验结束时，取出样品并立即置于冰上。使用荧光素/荧光素酶生物发光反应(ATP Determination Kit，Molecular Probes)测定样品中ATP的浓度，并且使用发光板阅读器(VICTOR X，Perkin Elmer#2030-0010)检测。在每个实验中从ATP标准(0至500nM)生成标准曲线，以将生物发光单位转换为ATP浓度。处理组具有2个孔/实验的样本大小，并且经过十次重复读数一式三份地测量每个样品中的ATP浓度。数据呈现为相对于损伤或损伤-再灌注阳性对照的平均值±标准误。使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验来测试样品之间的统计学显著差异。

单丙氨酸取代的肽和截短的肽测定

如上所述，使用hCMVEC细胞中的缺血损伤模型评价表5和2中列出的肽，并且收集培养基用于ATP释放测量。对于这些实验，使用标准的100μM浓度，其略高于已知诱导半通道阻滞的5–50μM(O'Carroll等人，2008)。这是为了确保关于可能具有减少的功能效力的肽的任何结果仍然落入可测量的范围内。

竞争性肽结合测定

使用竞争测定来测定连接蛋白43蛋白上的肽5相互作用位点。将细胞外环序列(Auspep，澳大利亚)以1mM的储备浓度溶解于miliQ H₂O中(表3)。将细胞外环序列与天然肽5以1:1的比率(100μM)混合，其在实验前在室温下放置1小时，以允许竞争性结合发生。1小时温育后，将细胞外环序列和肽5混合物溶解在损伤溶液中，并且使用上述缺血-再灌注模型暴露于hCMVEC细胞2小时。然后收集细胞外培养基用于ATP测量。除了未用于进一步研究的EL2a序列之外，所有细胞外环肽都可溶于miliQ H₂O中。

表3.用于竞争测定中的连接蛋白43的细胞外环序列

*EL2a序列未用于本研究中。

刮除加载测定

将hCMVEC细胞以每孔0.4x 10⁶个细胞的密度在1μg/cm²胶原I(Gibco)12孔板中铺平板，并且培养过夜。将hCMVEC的汇合单层在溶解于培养基中的肽5(5-100μM)中预温育2小时或24小时。浓度为100μM的CBX用作阳性对照。细胞用不含Ca²⁺或Mg²⁺的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次。细胞然后在0.05％荧光黄(LY)(Sigma)中温育，所述荧光黄是通过偶联的间隙连接通道转移的荧光染料(el-Fouly等人，1987)，+/-溶解于PBS中的肽5，并且用10号碳钢手术刀片(Swann-Morton，英国)刮伤。在37℃下在95％O₂和5％CO₂中无光照的5分钟温育后，去除0.05％LY溶液。细胞用含有Ca²⁺或Mg²⁺的PBS冲洗四次，然后在室温下在pH 7.4的PBS中的4％多聚甲醛(PFA)中固定10分钟。然后在荧光成像前将细胞在PBS中洗涤3次，以去除PFA。荧光图像使用Nikon TE2000E倒置荧光显微镜(10x放大率，0.3数值孔径)进行显现，并且使用Digital Sight CCD相机和Eclipse Net软件(Nikon)进行捕获。获取来自三个独立实验的每个孔内的三个图像用于分析，并且由设盲的观察者手动计数显示来自已加载那些的染料摄取的细胞总数目。

免疫细胞化学和Cx43斑的定量

体外缺血-再灌注ATP测定

在实验前一天，将人脑内皮细胞(hCMVEC)以0.025x 10⁶个细胞/孔的密度在胶原包被的12孔板(1μg/cm²)中铺平板。将细胞在培养基中温育过夜。模拟缺氧-缺血的脑中的细胞间隙的离子浓度和酸碱移位的缺氧、酸性、离子移位林格氏损伤溶液(Bondarenko和Chesler，2001)用于触发半通道开放。损伤溶液含有(以mM计)：38NaCl、13NaHCO₃、3Na-葡糖酸盐、65K-葡糖酸盐、38NMDG-Cl、1NaH₂PO₄和1.5MgCl₂。将损伤溶液在95％N₂、5％CO₂气体(20L/分钟)中鼓泡5分钟，并且在使用前将pH调整至6.6。标准林格溶液含有(以mM计)：124NaCl、3KCl、26NaHCO₃、26NaHCO₃、1NaH₂PO₄、1.3CaCl₂、1.5MgCl₂和10葡萄糖，并且在使用前将pH调整至7.4(Bondarenko和Chesler，2001)。在缺血损伤模型中，将hCMVEC细胞在500μL损伤溶液+/-肽5(100μM)(O'Carroll等人，2008，Danesh-Meyer等人，2012，Davidson等人，2012，Davidson等人，2013b，Davidson等人，2014，Davidson等人，2015)、或+/-细胞外环序列(表5)、或以100μM的最终浓度溶解于损伤溶液(500μL)中的经修饰的肽(表2、3)中温育2小时。对于阴性对照，将hCMVEC细胞仅在500μL标准林格溶液中温育2小时。对于阳性对照，将hCMVEC细胞仅在500μL标准林格溶液中温育2小时。所有温育都在37℃下在95％O₂和5％CO₂中进行。在每次实验结束时，取出样品并立即置于冰上。使用荧光素/荧光素酶生物发光反应(ATP Determination Kit，Molecular Probes)测定样品中ATP的浓度，并且使用发光板阅读器(VICTOR X，Perkin Elmer#2030-0010)检测。在每个实验中从ATP标准(0至500nM)生成标准曲线，以将生物发光单位转换为ATP浓度。处理组具有2个孔/实验的样本大小，并且经过十次重复读数一式三份地测量每个样品中的ATP浓度。数据呈现为相对于损伤或损伤-再灌注阳性对照的平均值±标准误。使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验来测试样品之间的统计学显著差异。

单丙氨酸取代的肽和截短的肽测定

竞争性肽结合测定

使用竞争测定来测定连接蛋白43蛋白上的肽5相互作用位点。将细胞外环序列(Auspep，澳大利亚)以1mM的储备浓度溶解于miliQ H₂O中(表3)。将细胞外环序列与天然肽5以1:1的比率(100μM)混合，其在实验前在室温下放置1小时，以允许竞争性结合发生。1小时温育后，将细胞外环序列和肽5混合物溶解在损伤溶液中，并且使用上述缺血-再灌注模型暴露于hCMVEC细胞2小时。然后收集细胞外培养基用于ATP测量。除了EL2a序列之外，所有细胞外环肽都可溶于miliQ H₂O中。

结果

高浓度的肽5促使来自ARPE-19膜的连接蛋白43斑的内化

低浓度(5-50μM)的肽5特异性地抑制半通道，但高浓度(500μM)抑制半通道和间隙连接通道功能两者(O'Carroll等人，2008)。发明人使ARPE-19细胞(在细胞间边界处具有连接蛋白43的高内源性表达的细胞系(Hutnik等人，2008,Investigative ophthalmology&visual science 49:800-806))暴露于肽5(500μM)，并且确定其对连接蛋白43间隙连接斑的分布和数目的作用(图1)。图1显示了在基础条件下细胞间接触之间以规则的砖样图案标记的免疫荧光连接蛋白43斑(图1A)。另外，在核周区域也可见连接蛋白43标记，其最可能代表高尔基体中的连接蛋白43的细胞内库(Das Sarma等人，2001,Journal of cell science114:4013-4024。暴露于肽5(500μM)2小时后，连接蛋白43斑沿着细胞间接触可见，但显示从膜朝向细胞中心扩展的细胞质流模式(图1A)。在质膜正下方的细胞内区域也可见点状连接蛋白43标记(图1A)。在暴露于肽5(500μM)6小时后，沿着细胞间界面的连接蛋白43斑被片段化(图1A)。

本发明人还令人惊讶地确定了在暴露于肽5后，每个细胞的总连接蛋白43标记是否减少。在用肽5(50-500μM)的2小时或6小时处理后，未观察到每个细胞的连接蛋白43标记中的显著差异(p>0.1)。同样地，LaCl3(500μM)与2或6小时(p>0.1)处理后的对照并无显著不同(图1B，C)。相比之下，相对于对照，CBX(500μM)在2小时暴露后使总连接蛋白43表达显著减少30.0±8.2％(p＝0.0043)，并且在6小时后显著减少53.4±8.1％(p<0.0001)(图2)。

丙氨酸取代不改变肽5介导的间隙连接解偶联

图2总结了在体外天然和经修饰的肽5对间隙连接通讯的作用。相比之下，LY阳性hCMVEC细胞指示通过间隙连接通道的细胞间LY转移，其在用CBX和肽5处理后减少(图2A)。与对照相比，CBX和天然肽5使LY阳性细胞显著减少至16.3±1.1％(p<0.0001)和56.2±2.6％(p<0.0001)(图2A)。当与天然肽5相比较时，LY阳性细胞与丙氨酸修饰中没有显著差异(p>0.9)(图2B)。

肽5介导的半通道阻滞是经由精确的序列特异性机制

为了确定肽5介导的半通道阻滞机制，发明人将丙氨酸系统地取代成肽5(表5)，以确定哪些氨基酸对于功效是重要的。CBX和LaCl3对照将ATP显著减弱至分别为损伤对照(100±3.6％)的9.1±10.1％(p<0.0001)和47.8±13.6％(p<0.0001)(图3)。在用天然肽5处理后，ATP释放显著减少至损伤对照的44.6±7.7％(p<0.0001)(图3)。用丙氨酸取代Ala-2、Ala-3、Ala-4、Ala-5、Ala-6、Ala-7、Ala-8和Ala-11观察到功能丧失，因为它们与损伤对照并无显著不同(p>0.9)(图3)。相比之下，Ala-4、Ala-9、Ala-10和Ala-12取代将ATP释放显著降低至分别为损伤对照的60.7±4.3％(p＝0.0098)、62.4±12.4％、(p＝0.0154)、62.0±9.0％(p＝0.0137)、61.2±9.8％(p＝0.02)(图3)，这指示这些肽保留了功效。因此，Ala-4、Ala-9、Ala-10和Ala-12取代的肽与天然肽5并无显著不同(p>0.09)。当与损伤对照或天然肽5相比较时，Ala-1并无显著不同。

SRPTEKT基序对于肽5介导的半通道的抑制至关重要，但其本身是无效的

为了确定肽5的功能区，在ATP半通道测定中测试截短的肽5序列(表2、图4)。天然肽5序列将ATP显著减少至损伤对照(100±3.7％)的47.3±5.1％(p<0.0001)。肽mod-2、mod-3、mod-4、mod-5和mod-6肽与损伤对照并无显著不同，指示功能丧失(图4)。换言之，mod-2、mod-3、mod-4、mod-5和mod-6在其抑制ATP释放的能力方面明显较不有效，与天然肽5相比较，分别为28.4±9.8％(p＝0.0231)、59.2±8.8％(p<0.0001)、43.9±8.8％(p<0.0001)、59.6±11.5％(p<0.0001)和68.8±9.8％(p<0.0001)。有趣的是，mod-1(49.1±7.1％)与损伤对照显著不同(p<0.0001)，但与天然肽5并无显著不同(p>0.9)，显示其保留的功能。

这些结果指示肽5介导的ATP释放抑制是序列特异性的，并且保守的SRPTEKT区域似乎对于肽5功能是重要的，但其本身对于半通道抑制是无效的。本发明人还令人惊讶地确定SRPTEKT序列其本身在较高浓度下是否可以在刮除负载测定中抑制间隙连接通讯(图5)。CBX(甘珀酸)显著降低LY染料转移至未经处理的对照(100±4.5％的15.3±1.8％(p<0.0001)(图5)。与未经处理的对照相比，LY染料转移显著减少至分别为用肽5和SRPTEKT处理的79.4±3.9％(p＝0.0057)和77.6±4.8％(p＝0.0028)(图5)。相对于未经处理的对照，用乱序肽不存在显著差异(p＝0.37)。

作用位点竞争测定

为了确定作用位点，针对天然肽5测试源自连接蛋白43蛋白的细胞外环1和2的合成肽片段(表3)。因为肽片段的一部分与天然肽5序列竞争性结合，所以观察到肽5功能的丧失，并且当与单独的肽5相比时，半通道介导的ATP释放更大。图6证实CBX和肽5将ATP释放显著减少至分别为损伤对照(100±3.5％)的13.4±4.8％(p<0.0001)和54.1±4.4％(p<0.0001)。与肽5组合的区段EL1完全、EL1a、EL1b和EL1c和EL2b序列将ATP显著减少至分别为损伤对照的3.2±6.7％(p<0.0001)、60.1±6.2％(p<0.0001)、29.3±5.5％(p<0.0001)、40.1±7.0％(p<0.0001)和75.5±7.4％(p＝0.0302)(图6)。令人惊讶的是，本发明人已发现，与肽5组合的EL1完全和EL1b序列显著更有效，与单独的肽5相比为50.8±7.9％(p<0.0001)和24.8±8.8％(p＝0.0334)(图6)。相比之下，EL2c完全取消了肽5功能，因为它与损伤对照并无显著不同(p＝0.5615)，并且ATP释放比单独的肽5明显高58.9±8.8％(p<0.0001)。这些结果指示EL2c序列很可能是肽5的作用位点。

实例3：间隙连接和/或连接蛋白通道调节肽的制剂

本发明提供了含有一种或多种间隙连接和/或连接蛋白通道调节肽的制剂。本发明提供了间隙连接和/或连接蛋白通道调节肽的水性制剂，其适合于治疗用途并且在正常使用的贮存条件下保持稳定延长时间段。该制剂可用于治疗其中用间隙连接和/或连接蛋白调节肽的治疗将提供治疗益处的状况。对于局部施用，可以将一至两滴这些制剂每天一至六次递送至受影响的区域。

对于连接蛋白调节肽的施用，连接蛋白43调节肽(调节剂)可以以约8μM至约20μM的最终浓度存在于制剂中，并且可替代地，连接蛋白43调节剂以约10μM至20μM的最终浓度、或约10至约15μM的最终浓度存在。在某些其它实施例中，连接蛋白43调节剂以约10μM的最终浓度存在。在另外一个实施例中，连接蛋白43调节剂以约1-15μM的最终浓度存在。在其它实施例中，连接蛋白43调节剂以下述存在：约20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、10-200μM、200-300μM、300-400μM、400-500μM、500-600μM、600-700μM、700-800μM、800-900μM、900-1000或1000-1500μM、或1500μM–2000μM、2000μM-3000μM、3000μM-4000μM、4000μM-5000μM、5000μM-6000μM、6000μM-7000μM、7000μM-8000μM、8000μM-9000μM、9000μM–10,000μM、10,000μM–11,000μM、11,000μM–12,000μM、12,000μM–13,000μM、13,000μM–14,000μM、14,000μM–15,000μM、15,000μM–20,000μM、20,000μM–30,000μM、30,000μM–50,000μM或更大，或在任何两个所述剂量之间的任何范围或子范围，或落入约20μM至约50,000μM的范围内的任何剂量。

对于连接蛋白43调节剂的施用，连接蛋白调节剂是本文描述的任何肽序列。在一些实施例中，连接蛋白调节剂可以是肽SEQ ID NO:1。

每种调节肽每天约1纳克(ng)/kg至约1mg/kg体重的另外其它剂量水平。在某些实施例中，主题化合物的剂量一般在以下范围内：约1ng至约1微克/kg体重、约1ng至约0.1微克/kg体重、约1ng至约10ng/kg体重、约10ng至约0.1微克/kg体重、约0.1微克至约1微克/kg体重、约20ng至约100ng/kg体重、约0.001mg至约0.01mg/kg体重、约0.01mg至约0.1mg/kg体重、或约0.1mg至约1mg/kg体重。在某些实施例中，每种主题化合物的剂量一般在以下范围内：约0.001mg至约0.01mg/kg体重、约0.01mg至约0.1mg/kg体重、约0.1mg至约1mg/kg体重。如果使用多于一种间隙连接和/或连接蛋白通道调节肽，则每种抗连接蛋白试剂的剂量无需在与另一种相同的范围内。例如，一种间隙连接和/或连接蛋白通道调节剂的剂量可以为约0.01mg至约10mg/kg体重，并且另一种间隙连接和/或连接蛋白通道调节剂的剂量可以为约0.1mg至约1mg/kg体重，0.1至约10、0.1至约20、0.1至约30、0.1至约40、或约0.1至约50mg/kg体重。剂量也可以是约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、24.0、25.0、26.0、27.0、28.0、29.0、30.0、31.0、32.0、33.0、34.0、35.0、36.0、37.0、38.0、39.0、40.0、41.0、42.0、43.0、44.0、45.0、46.0、47.0、48.0、49.0、50.0、52.5、55.0、57.5、60.0、62.5、65.0、67.5、70.0、72.5、75.0、77.5、80.0、82.5、85.0、87.5、90.0、92.5、95.0、97.5或约100.0mg/kg体重，或在任何两个所述剂量之间的任何范围或子范围，或落入约0.1至约100mg/kg体重的范围内的任何剂量。

任选地，制剂可以包括粘度增强剂，以增加制剂在受影响的施用部位中的停留时间。作为非限制性例子，羟丙基甲基纤维素可以用作本发明的粘度增强剂。

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本文描述且请求保护的本发明具有许多属性和实施例，包括但不限于本详细公开中阐述或描述或提及的那些。它并不预期是概括所有的，并且本文描述且请求保护的本发明并不限于本详细公开中鉴定的特征或实施例或者受本发明内容中鉴定的特征或实施例限制，所述特征或实施例仅包括用于说明性而非限制性目的。本领域普通技术人员将容易认识到，许多组分和参数可以改变或修改至一定程度、或者取代已知的等价物，而不背离本发明的范围。应该了解，此类修改和等价物在本文中引入，如同个别阐述一样。本发明还包括本说明书中个别或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。

本文参考或提到的所有专利、出版物、科学论文、网站及其它文件和材料指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且每个此类参考的文件和材料在此以引用的方式并入，其程度如同其已个别地以引用的方式全文并入或在本文中全文阐述一样。申请人保留将来自任何此类专利、出版物、科学论文、网站、可电子获得的信息、以及其它参考的材料或文件的任何和所有材料和信息实际并入本说明书内的权利。本说明书中对任何专利申请、专利和出版物的提及不是，也不应被视为承认或任何形式的暗示它们构成有效现有技术或在全世界任何国家构成公知常识的一部分。

本文描述的具体方法和组合物是优选实施例的代表，并且是示例性的而不意欲作为对本发明范围的限制。考虑本说明书后，其它目的、方面和实施例将被本领域技术人员想到，并且涵盖在如由权利要求范围限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员显而易见的是，无需背离本发明的范围和精神，可以进行本文公开的本发明的各种取代和修改。本文说明性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开为必需的任何一种或多种元件，或一种或多种限制的情况下进行实践。因此，例如，在本文的每种情况下，在本发明的实施例或实例中，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一个在说明书中都可以替换为其它两个术语中的任一。同样地，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛而且没有限制地理解。本文说明性描述的方法和过程可以适当地以不同的步骤顺序进行实践，并且它们不必限制于本文或权利要求中指出的步骤顺序。同样如本文和附加权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物。该专利决不能被解释为限制于本文具体公开的具体实施例或实施例或方法。该专利决不能被解释为受由专利商标局的任何审查者或任何其它官员或雇员进行的任何陈述限制，除非此类陈述由申请人以回答的书面形式特别地而没有限定或保留明确地采用。此外，提供标题、小标题等以增强读者对该文件的理解，并且不应将其理解为限制本发明的范围。本文提及的本发明的方面、实施例或组分的任何例子都被视为非限制性的。

已采用的术语和表达作为描述性而非选择性的术语使用，并且在此类术语和表达的使用中不预期排除所示和所述特征的任何等价物或其部分，但应认识到在如要求保护的本发明范围内的各种修改是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施例和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用公开的本文概念的修改和变化，并且此类修改和变化被视为在如由附加权利要求限定的本发明的范围内。

本发明已在本文中得到广泛和一般地描述。属于一般公开内容的更窄的种类和亚一般分类中的每一种也可形成本发明的部分。这包括本发明的一般描述，条件或负面限制是从种类中去除任何主题，不管删除的材料是否在本文中具体引用。

其它实施例在下述权利要求内。此外，当本发明的特征或方面按照Markush组进行描述时，本领域技术人员将认识到本发明因此也按照Markush组的任何个别成员或成员亚组进行描述。

Claims

1.一种药物组合物，其包含选自SEQ ID NO:1-52的化合物和药学可接受的载体。

2.一种药物组合物，其包含根据式I的化合物和药学可接受的载体。

3.一种药物组合物，其包含根据式II的化合物和药学可接受的载体。

4.一种药物组合物，其包含根据式III的化合物和药学可接受的载体。

5.一种药物组合物，其包含根据式IV的化合物和药学可接受的载体。

6.一种分离的化合物，其选自SEQ ID NO:1-52。

7.一种分离的化合物，其根据式I加以选择。

8.一种分离的化合物，其根据式II加以选择。

9.一种分离的化合物，其根据式III加以选择。

10.一种分离的化合物，其根据式IV加以选择。

11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述化合物选自SEQ ID NO:1-10、21、25、27-30、46、49、50和51；并且所述药学可接受的载体包括无菌赋形剂。