JP5701375B2

JP5701375B2 - 血管新生促進用ペプチド及びその使用

Info

Publication number: JP5701375B2
Application number: JP2013502459A
Authority: JP
Inventors: ダエホチョ; サイクバン; ジョンミンパク; サンヨンユン; サンユンキム; ハラムリー; ユリムパク; ジュアソン
Original assignee: Samsung Life Public Welfare Foundation
Current assignee: Samsung Life Public Welfare Foundation
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2031-03-25
Also published as: CN104072580A; JP2013523720A; KR20110108080A; CN104072584B; EP3087994A1; CN102883736B; CN104072580B; US20130137637A1; CN102883736A; CN104072584A; EP2552470A4; EP2552470A2; KR101335203B1; EP2552470B1; WO2011119009A3; US9938320B2; US20170166609A1; EP3085379A1; US9610318B2; WO2011119009A2

Description

本出願は、本明細書に参考文献として含まれる２０１０年３月２６日出願の韓国特許出願第１０−２０１０−００２７３７４号に対する優先権を主張する。

本発明は、血管新生を促進するペプチド及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、血管新生を促進するペプチド、並びに血管新生促進及び血管新生関連疾患の予防又は治療に関する前記ペプチドの使用に関する。

血管供給の発達は、生理学的及び病理学的過程の基本要件である。活発に成長する組織、例えば胚や腫瘍は、適切な血液供給を必要とする。これらは血管新生と呼ばれる過程で新たな血管形成を促進するプロ血管新生因子を産生することにより、その必要性が満たされる。血管形成は、下記段階を全て又はほとんど含む複雑ながらも規則的な生物学的イベントである。ａ）内皮細胞（ＥＣ）が既存のＥＣから増殖するか、又は始原細胞から分化する。ｂ）ＥＣが移動して癒合してコード（cord）様構造を形成する。c）次いで、血管コードは管生成を経て中心管腔（lumen）を有する管を形成する。ｄ）既存のコード又は管が出芽して二次管を形成する。ｅ）原始血管叢はさらに再形成及び再成形を行う。f）内皮周囲細胞が集まって内皮管を覆い、管に維持機能及び調節機能を提供する。ここで、前記細胞には、小さな毛細血管のための血管周囲細胞、より大きな血管のための平滑筋細胞、心臓の心筋細胞が含まれる（Hanahan, D., Science, 1997, 277, 48（非特許文献1）; Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics., 2002, 3, 513（非特許文献2））。

血管発達の過程は厳密に調節されている。従来、周辺細胞により産生される分泌因子の多くは、ＥＣの分化、増殖、移動、及びコード様構造への癒合を調節することが示されている。現在までに報告されている血管新生促進因子は、大きくいくつかの群に分類される。これらのほとんどは、細胞成長を誘導する誘導因子、免疫活性を有するサイトカイン、ホルモン又は脂質産物である（Bussolino F et al., Trends. Biochem. Sci., 22(7), pp251-256, 1997（非特許文献3））。

血管内皮細胞増殖因子（VEGF）は、血管新生の刺激及び血管透過性の誘導に関与する重要な因子として同定されている（Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25, 1997（非特許文献4））。マウスのＶＥＧＦ遺伝子の性状が確認され、この胚形成における発現パターンが分析されている。有窓内皮に隣接する上皮細胞、例えば脈絡叢及び腎糸球体において持続的なＶＥＧＦの発現が観察されている。このデータは内皮細胞の成長と分化の多機能性調節因子としてのＶＥＧＦの役割と一致する（Breier, G. et al., Development, 1992, 114, 521（非特許文献5））。

ＶＥＧＦは血管性組織（例えば、肺、心臓、胎盤、及び固形腫瘍）における全ての血管形成に関係する（Binetruy-Tourniere et al., EMBO J. 2000, 19, 1525（非特許文献6））。例えば、ＶＥＧＦは腫瘍関連血管形成を刺激することにより、固形腫瘍の成長及び転移の促進に関係する（Lu et al., J. Biol. Chem. 2003, 278, 43496（非特許文献7））。また、ＶＥＧＦの発現は、特に血管性組織の修復に必須であるので、ＶＥＧＦは血管組織の修復を促すのに使用することが提案されている。

実際に、Ｃｈｅｎらは米国特許第５，０７３，４９２号（１９９１年１２月１７日）（特許文献1）において、適当な環境にＶＥＧＦ、エフェクター、及び血清由来因子を加える過程を含む方法であって、このような環境下で内皮細胞の成長を相乗的に増強させる方法を開示している。また、血管内皮細胞増殖因子ＣサブユニットＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応技術により調製されている。このＤＮＡは、ヘテロ二量体又はホモ二量体として存在し得るタンパク質をコードする。このタンパク質は哺乳動物血管内皮細胞分裂促進因子であり、欧州特許出願第９２３０２７５０．２号（１９９２年９月３０日）（特許文献2）に記載されているように、それ自体で血管の発生と修復を促進するのに有用なことが知られている。

このようにＶＥＧＦが大きく進歩しているにもかかわらず、実際に動物を対象とした試験においては、他のタンパク質と同様に分子が大きすぎて血管関門を通過できず、半減期が短くて短期間で消滅するという欠点が明らかになった。近年、血管内皮細胞に特異的に作用する、すなわち血管形成過程に関与する重要な遺伝子を発見し、その遺伝子を用いて血管新生が関わる様々な疾患を治療する方法に適用すべく研究が盛んに行われているが、未だ成果がない現状である。

米国特許第５，０７３，４９２号欧州特許出願第９２３０２７５０．２号

Hanahan, D., Science, 1997, 277, 48 Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics., 2002, 3, 513 Bussolino F et al., Trends. Biochem. Sci., 22(7), pp251-256, 1997 Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25, 1997 Breier, G. et al., Development, 1992, 114, 521 Binetruy-Tourniere et al., EMBO J. 2000, 19, 1525 Lu et al., J. Biol. Chem. 2003, 278, 43496

そこで、本発明者らは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を代替できるペプチドを見出す研究を行った。その過程で様々な新規ペプチドを合成し、それらの残基を置換、追加、及び欠失させて効果的な誘導体を選別する過程を繰り返し、血管新生促進効果を有する新規ペプチドを合成し、本発明を完成するに至った。

本発明は、一般式（Ｉ）又は（II）で表されるアミノ酸配列を有する血管新生促進用の単離されたペプチドを提供することを目的とする。
（Ｉ）［Ｎ末端−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｃ末端］
（II）［Ｃ末端−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｎ末端］
ここで、Ｘ１は不在であるか又はリジンであり、Ｘ２は不在であるか又はアラニンもしくはグルタミンであり、Ｘ３はグリシン又はプロリンであり、Ｘ４は不在であるか又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ５は酸性アミノ酸であり、Ｘ６はセリンである。

また、本発明は、一般式（III）で表されるアミノ酸配列を有する血管新生促進用ペプチドを提供することを目的とする。
（III）［Ｎ末端−Ｘ１Ｘ２Ｘ５Ｘ６−Ｃ末端］
ここで、Ｘ１はアスパラギンであり、Ｘ２はグルタミンであり、Ｘ５は酸性アミノ酸であり、Ｘ６はセリンである。

また、本発明は、皮弁再生、創傷及び熱傷治癒、人工皮膚移植及び移植用人工血管製造における血管新生促進のための前記ペプチドの使用を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血（acute posterior ischemia）、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患、及び虚血症からなる群から選択された血管新生関連疾患の予防又は治療における前記ペプチドの使用を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は、一般式（Ｉ）又は（II）で表されるアミノ酸配列を有する単離されたペプチドを提供する。
（Ｉ）［Ｎ末端−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｃ末端］
（II）［Ｃ末端−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｎ末端］
ここで、Ｘ１は不在であるか又はリジンであり、Ｘ２は不在であるか又はアラニンもしくはグルタミンであり、Ｘ３はグリシン又はプロリンであり、Ｘ４は不在であるか又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ５は酸性アミノ酸であり、Ｘ６はセリンである。

また、上記目的を達成するために、本発明は、一般式（III）で表されるアミノ酸配列を有する血管新生促進用の単離されたペプチドを提供する。
（III）［Ｎ末端−Ｘ１Ｘ２Ｘ５Ｘ６−Ｃ末端］
ここで、Ｘ１はアスパラギンであり、Ｘ２はグルタミンであり、Ｘ５は酸性アミノ酸であり、Ｘ６はセリンである。

さらに、上記目的を達成するために、本発明は、前記ペプチドを有効成分として含有する血管新生促進組成物を提供する。

さらに、上記目的を達成するために、本発明は、前記ペプチドを有効成分として含有する、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患、及び虚血症からなる群から選択された血管関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

さらに、上記目的を達成するために、本発明は、治療剤又は診断剤に用いられる、本発明のペプチドからなる群から選択されたペプチドを提供する。

さらに、上記目的を達成するために、本発明は、血管新生促進用製剤を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。

さらに、上記目的を達成するために、本発明は、血管新生が必要な個体に本発明のペプチドを有効量投与して血管新生を促進する方法を提供する。

さらに、上記目的を達成するために、本発明は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患、及び虚血症からなる群から選択された血管新生関連疾患の予防又は治療用製剤の製造における本発明のペプチドの使用を提供する。

さらに、上記目的を達成するために、本発明は、血管新生関連疾患の予防又は治療が必要な個体に本発明のペプチドを有効量投与し、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患、及び虚血症からなる群から選択された血管新生関連疾患を予防又は治療する方法を提供する。

以下、本発明の内容をより詳細に説明する。

本発明に使用されたアミノ酸はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に従って次のように記載される。

アルギニン（Arginine）：Ｒ
ヒスチジン（Histidine）：Ｈ
リジン（Lysine）：Ｋ
アスパラギン酸（Aspartic acid）：Ｄ
グルタミン酸（Glutamic acid）：Ｅ
セリン（Serine）：Ｓ
トレオニン（Threonine）：Ｔ
アスパラギン（Asparagine）：Ｎ
グルタミン（Glutamine）：Ｑ
システイン（Cysteine）：Ｃ
グリシン（Glycine）：Ｇ
プロリン（Proline）：Ｐ
アラニン（Alanine）：Ａ
イソロイシン（Isoleucine）：Ｉ
ロイシン（Leucine）：Ｌ
メチオニン（Methionine）：Ｍ
フェニルアラニン（Phenylalanine）：Ｆ
トリプトファン（Tryptophan）：Ｗ
チロシン（Tyrosine）：Ｙ
バリン（Valine）：Ｖ

本発明は、一般式（Ｉ）又は（II）で表されるアミノ酸配列を有する血管新生促進用ペプチドを提供する。
（Ｉ）［Ｎ末端−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｃ末端］
（II）［Ｃ末端−Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６−Ｎ末端］

一般式（Ｉ）又は（II）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、次のように特定される。Ｘ１は不在であるか又はリジンであり、Ｘ２は不在であるか又はアラニンもしくはグルタミンであり、Ｘ３はグリシン又はプロリンであり、Ｘ４は不在であるか又は塩基性アミノ酸であり、Ｘ５は酸性アミノ酸であり、Ｘ６はセリンである。

本発明のペプチドは、非極性アミノ酸−Ｘ−酸性アミノ酸−セリンを基本構造とし、選択的に非極性アミノ酸と酸性アミノ酸の間のＸに塩基性アミノ酸が挿入されてもよく、非極性アミノ酸の前にリジン及び／又は（アラニン又はグルタミン）が追加された配列（一般式（Ｉ））をさらに含んでもよい。また、本発明のペプチドは、前記アミノ酸配列が逆に配列された配列（一般式（II））を含んでもよい。

本発明は、一般式（III）で表されるアミノ酸配列を有する血管新生促進用ペプチドを提供する。
（III）［Ｎ末端−Ｘ１Ｘ２Ｘ５Ｘ６−Ｃ末端］

一般式（III）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、次のように特定される。Ｘ１はアスパラギンであり、Ｘ２はグルタミンであり、Ｘ５は酸性アミノ酸であり、Ｘ６はセリンである。

本発明の一般式（III）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、アスパラギン−グルタミン−酸性アミノ酸−セリンを基本構造とする。

配列一般式（Ｉ）〜（III）からなる群から選択されたいずれかの構造を有するペプチドの血管新生促進効果は、本発明において初めて明らかにされたものである。

配列一般式（Ｉ）〜（III）からなる群から選択されたいずれかの一般式で表されるアミノ酸配列を有するペプチドにおいて、塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン又はリジンであることが好ましい。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸でもよい。

本発明のペプチドは、配列一般式（Ｉ）〜（III）からなる群から選択された一般式で表されるアミノ酸配列を有するいずれかであるが、配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。

本発明のペプチドは、血管新生促進効果を有する。配列一般式（Ｉ）〜（III）からなる群から選択されたいずれかの一般式で表されるアミノ酸配列を含むものであればその長さは特に限定されないが、配列一般式（Ｉ）〜（III）からなる群から選択された一般式で表されるアミノ酸配列を含み、４〜５０個のアミノ酸から構成されたものが好ましく、４〜３０個のアミノ酸から構成されたものがより好ましい。配列一般式（Ｉ）〜（III）からなる群から選択された一般式で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることがより好ましい。本発明のペプチドは、配列番号１〜４からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドであることが最も好ましい。

また、本発明のペプチドは、Ｃ末端がアミド化したペプチドでもよい。前記ペプチドを生体内でタンパク質分解酵素から保護して安定性を向上させるために、Ｎ末端及びＣ末端を修飾するか、または様々な保護基で保護する。すなわち、前記ペプチドのＣ末端は安定性を向上させるために修飾してもよい。前記修飾は、特にこれらに限定されるものではないが、ヒドロキシ基（-OH）又はアミノ基（-NH₂）であることが好ましい。Ｃ末端のアミド化とは、ペプチドのＣ末端をアミノ基（-NH₂）で修飾することを意味する。

また、前記ペプチドのＮ末端は、安定性を向上させるために修飾することができる。前記修飾は、特にこれらに限定されるものではないが、アセチル（Acetyl）基、フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）基、ホルミル（Formyl）基、パルミトイル（Palmitoyl）基、ミリスチル（Myristyl）基、ステアリル（Stearyl）基、及びポリエチレングリコール（PEG）からなる群から選択される基によるものであることが好ましい。

本発明のペプチドは、この分野で周知の方法により製造することができる。例えば、前記ペプチドは、自動ペプチド合成機により合成することができ、遺伝子操作技術により産生することができる。例えば、遺伝子操作により融合パートナーと本発明のペプチドを含む融合タンパク質をコードする融合遺伝子を製造し、その後融合遺伝子を宿主微生物に形質移入させ、宿主微生物において融合タンパク質を発現させ、適当なタンパク質分解酵素又は化合物を用いて融合タンパク質から本発明のペプチドを切断及び単離することができる。このために、第Ｘａ因子（Factor Xa）やエンテロキナーゼなどのタンパク質分解酵素またはＣＮＢｒやヒドロキシルアミンなどの化合物により切断されるアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を、融合パートナーと本発明のペプチドの遺伝子間に挿入してもよい。例えば、ＣＮＢｒにより切断される部位を与えるために、リーディングフレームが一致するメチオニンコドンを含有する制限酵素部位（例えば、AflIII、BsmI、BspHI、BspLU11I、NcoI、NdeI、NsiI、Ppu10I、SphI又はStyI）又はそれらのアイソシゾマー（isoschizomer）部位を、制限酵素により切断されるように融合パートナーの３'末端に挿入してもよい。また、リーディングフレームに連結される制限酵素部位を本発明のペプチドの遺伝子の５'末端に挿入して融合パートナーと本発明のペプチドの遺伝子を連結してもよく、これは制限酵素により切断される。

他の例として、ヒドロキシルアミンにより切断される部位を与えるために、融合パートナー遺伝子と本発明のペプチドの遺伝子間にアスパラギン−グリシンをコードするＤＮＡ配列を挿入してもよい。例えば、両遺伝子を融合させる場合、リーディングフレームが一致するアスパラギンコドンを含む制限酵素部位又はそれらのアイソシゾマー部位を、融合パートナー３'末端に挿入してもよく、これは制限酵素により切断され、よってこの酵素に適合した末端又は平滑（blunt）末端を生成する。また、リーディングフレームが連結されグリシンのコドンを含む制限酵素部位を、本発明のペプチドの遺伝子の５'末端に挿入して融合パートナー遺伝子と本発明のペプチドの遺伝子を連結してもよく、これは制限酵素により切断される。本発明による遺伝子構造物は、この分野において常用される発現ベクター例えばプラスミド、ウイルス、又はビヒクル（vehicle）に挿入され、これはクローニング用の構造遺伝子の宿主細胞への挿入（insertion）または取り込み（incorporation）を可能にする。

本発明の一実施例においては、自動ペプチド合成機を用いて配列番号１〜４のアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて純粋単離した。

本発明のペプチドは、ヒト又は動物において血管新生（angiogenesis）を促進する効果がある。

本発明のアミノ酸配列を有するペプチドの血管新生促進効果は、本発明において初めて明らかにされたものである。

本発明の血管新生促進効果は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC, Human Umbilical Vein Endothelial Cell）を用いた実験で確認されている。

本発明の一実施例においては、本発明のペプチドでのＨＵＶＥＣの処理が、ＨＵＶＥＣの増殖を促進するかを実験した。その結果、本発明のペプチド処理がＨＵＶＥＣの増殖を促進することが確認された（実施例２）。

本発明の他の実施例においては、本発明のペプチドがＨＵＶＥＣの移動（migration）に及ぼす影響を実験した。孔（pore）を有するポリカーボネートフィルターを敷いたチャンバーを備えたプレートのチャンバー下部に本発明のペプチドを入れ、チャンバー上部にＨＵＶＥＣを接種し、培養して下部に移動した細胞の数を測定して対照群と比較した。その結果、本発明のペプチドがＨＵＶＥＣの移動を促進することが確認された（実施例３）。

本発明の他の実施例においては、本発明のペプチドがＨＵＶＥＣの脈管形成（tube formation）に及ぼす影響を実験した。プレートにマトリゲル（Matrigel）を注入して固化させ、その後、本発明のペプチドとＨＵＶＥＣをバッファーに混合して添加し、ＨＵＶＥＣがマトリゲル内に血管を形成しているかを観察した。その結果、本発明のペプチドがＨＵＶＥＣの血管形成を促進することが確認された（実施例４）。

本発明の他の実施例においては、本発明のペプチドの血管新生促進能力を調べるためにインビボマトリゲルプラグアッセイ（in vivo Matrigel plug assay）を行った。本発明のペプチドとマトリゲルの混合物をマウスに皮下注射し、１週間後に固化したマトリゲルプラグを摘出して血管形成の程度を測定した。その結果、本発明のペプチドの投与は対照群に比べて血管形成がはるかに優れることが確認された（実施例５）。

このように本発明のペプチドは、血管細胞の増殖、移動及び分化を促進して血管新生を促進する。よって、本発明においては、本発明のペプチドを有効成分として含有する血管新生促進用組成物を提供する。また、本発明は、治療剤及び診断剤のためのペプチドを提供する。さらに、本発明は、血管新生促進用製剤の製造のための本発明のペプチドの使用を提供する。さらに、本発明は、血管新生が必要な個体に本発明のペプチドを有効量投与して血管新生を促進する方法を提供する。

また、本発明においては、本発明のペプチドを有効成分として含有する血管新生関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。また、本発明は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患、及び虚血症からなる群から選択された血管新生関連疾患の予防又は治療用製剤の製造における本発明のペプチドの使用を提供する。さらに、本発明は、血管新生関連疾患の予防又は治療が必要な個体に本発明のペプチドを有効量投与し、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患、及び虚血症からなる群から選択された血管新生関連疾患を予防又は治療する方法を提供する。

本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含む組成物を提供する。本発明の組成物は、生物学的に活性のある他の製剤、例えば生物学的に活性のある化合物、他のペプチドなどと組み合わせて投与してもよい。また、本発明の組成物は、血管内皮細胞（EC）に分化する能力を有する細胞をさらに含んでもよい。前記血管内皮細胞に分化する能力を有する細胞は、胚芽幹細胞、中間葉幹細胞又は造血幹細胞であることが好ましい。

本発明の血管新生促進用組成物は、皮弁再生、創傷及び熱傷治癒、人工皮膚移植又は移植用人工血管製造用であることが好ましいが、これらに限定されるものではない。前記血管関連疾患とは、様々な原因による血管異常により血液や酸素が正常に供給されなくて発生したり、悪化する疾病をいう。これは、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症梗塞、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患及び虚血症からなる群から選択されることが好ましいが、これらに限定されるものではない。

心筋梗塞、狭心症などの心血管疾患は、血管が詰まったり、狭くなることにより誘発される。血流により酸素と栄養が適切に供給できなければ、身体組織及び臓器機能障害が誘発される。このような血管機能障害が心筋に発生すると、心臓の拍動が止まって心筋梗塞や狭心症が発生する。手や足の先に発生すると、虚血性肢疾患（ischemic limb disease）になる。この場合、患者は苦痛が大きいので、向精神性の鎮痛剤を服用する。ひどい場合、足の切断や死亡に至る。

虚血性心不全は、血管が詰まったり、狭くなることが原因となり、血液が十分に供給されず酸素が不足することにより発生する。

糖尿病性神経障害（足部潰瘍）は、糖尿病の合併症で最も多いものであり、糖尿病患者の５０％以上が発病する。糖尿病患者の血管に存在する高濃度の血糖は、細胞の機能損傷を引き起こし、これは足部の微細血管と神経細胞の死滅をもたらす。

糖尿病性網膜症は、糖尿病による毛細血管壁の病変（厚くなった基底膜、血管壁細胞の減少、内皮細胞の過度な増殖）で毛細血管が狭くなり、結局は閉塞して網膜微小血管の循環障害が起こることにより発生する。

創傷とは、外科的切開、消化管潰瘍、熱傷、裂傷、及び皮膚潰瘍（例えば、褥瘡）などの皮膚組織の損傷である。創傷の通常の治療は、救急処置後に損傷部位が自然回復力により治癒されるのを待つというものであるが、時間が長くかかる。一般に、創傷の治癒は細胞増殖に影響され、これは新たな結合組織及び上皮組織の形成をもたらす。創傷の治癒には、細胞の増殖、分化を促進したり、刺激することが効果的である。

脱毛は様々な理由により発生するが、毛根が周辺血管を介して血液から栄養分を十分に供給されると発毛及び養毛を助けることが知られている。

前記疾病は、様々な原因による血管異常により血液や酸素が正常に供給されなくて発生したり、悪化する疾病であり、血管を移植したり、バイパス血管を新生させるなどの方法で症状を緩和、改善することができる。よって、本発明のペプチドを有効成分として含む組成物は、これらの疾病の症状を改善したり、治療するために、血管新生又は移植用人工血管製造に利用される。

本発明による薬学的組成物は、本発明のペプチドを単独で含んでもよく、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば経口投与用担体又は非経口投与用担体をさらに含んでもよい。経口投与用担体は、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などを含んでもよい。また、非経口投与用担体は、水、オイル、生理食塩水（saline）、水性グルコース、及びグリコールなどを含んでもよく、安定化剤及び保存剤を含んでもよい。安定化剤の例としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、及びアスコルビン酸などの抗酸化剤が挙げられる。保存剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、及びクロロブタノールが挙げられる。薬学的に許容される担体のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示されている。

本発明の薬学的組成物は、ヒトをはじめとする哺乳動物にいかなる方法で投与してもよい。例えば、経口又は非経口的に投与してもよい。非経口的投与は、これらに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管外、舌下又は直腸内投与であってもよい。局所投与は、これらに限定されるものではないが、クリーム、軟膏、ゲル及び経皮パッチであってもよい。

本発明の薬学的組成物は、前述したように経口投与用又は非経口投与用製剤の形態に製造してもよい。

経口投与用製剤の場合、本発明の組成物は、当業界に公知の方法を用いて、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、及び糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁液などに剤形化してもよい。例えば、経口用製剤は、活性成分を固体賦形剤と配合してこれを粉砕し、適当な補助剤を添加して顆粒混合物に加工することにより、錠剤又は糖衣錠剤を得てもよい。適当な賦形剤の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、及びマルチトールなどを含む糖類、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、及びジャガイモ澱粉などを含む澱粉類、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びヒドロキシプロピルメチルセルロースを含むセルロース類、ならびにゼラチン及びポリビニルピロリドンなどの充填剤が挙げられる。また、必要であれば、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムを崩壊剤として含んでもよい。さらに、本発明の薬学的組成物は、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、及び防腐剤を含んでもよい。

非経口投与用製剤の場合は、当業界に公知の方法を用いて、注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟膏剤、オイル剤、保湿剤、ゲル剤、点眼剤、エアゾール及び鼻腔吸入剤の形態に剤形化することができる。

好ましい滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される溶媒又は懸濁液のいずれか一つでもよい。薬学的に許容される担体又はビヒクルの例としては、食塩水、緩衝食塩水、等張食塩水（例えば、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウム又はその混合物）、リンゲル液、グルコース、水、滅菌水、グリセリン、エタノール及びその混合物が挙げられる。１，３−ブタンジオール及び滅菌固定化油を溶媒又は懸濁媒質として用いることが好ましい。オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の製造に用いられてもよい。

点眼剤は、水溶性眼用溶液、非水溶性眼用溶液又は眼用エマルジョンであってもよい。本発明の点眼剤は、滅菌された精製水、生理食塩水などの水溶性溶媒、綿実油、大豆油などの植物油などの非水溶性溶媒に、本発明のペプチドを溶解又は懸濁させて製造する。この場合、等張剤、ｐＨ調節剤、粘性化剤、懸濁剤、エマルジョン化剤、保存剤及びそれに類似する薬学的受容可能な添加剤を添加してもよい。詳細には、前記等張剤としては、塩化ナトリウム、ホウ酸、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、Ｄ−マンニトール及びブドウ糖が挙げられる。粘性化剤の特定例としては、ホウ酸、無水硫酸ナトリウム、塩酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、硝酸、酢酸カリウム、炭酸ナトリウム及びホウ砂（borax）が挙げられる。ｐＨ調節剤の特定例としては、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、コンドロイチン硫酸ナトリウム、及びポリビニルピロリドンが挙げられる。懸濁剤の特定例としては、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン、及び水素化ヒマシ油などが挙げられる。エマルジョン化剤の特定例としては、卵黄レシチン及びポリソルベート８０が挙げられるが、これらに限定されるものではない。保存剤の特定例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、フェニルエチルアルコール、及びパラオキシ安息香酸エステルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの剤形はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，１９７５．ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒに記載されている。

本発明の薬学的組成物は、０．００１〜９９．９９９重量％及び９９．９９９〜０．０００１重量％の薬学的に許容可能な担体を含むことが好ましい。

本発明において、量（amount）という用語は、個体に薬物を伝達する量、又は血管新生促進効果及び血管新生関連疾患の予防もしくは治療効果が哺乳動物などの個体に現れる量を意味し、前記哺乳動物は、好ましくはヒトを含む哺乳動物を意味し、これは動物由来の細胞、器官及び組織であってもよい。前記個体は、疾病の治療を必要とする患者であってもよい。

本発明の組成物の総有効量は、単回投与量（single dose）で患者に投与してもよく、複数回投与量（multiple dose）で長期間投与される分割治療方法（fractionated treatment protocol）により投与してもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えてもよい。本発明のペプチドの総容量は、好ましくは１日体重１ｋｇ当たり約０．０００１μｇ〜５００ｍｇ、最も好ましくは０．０１μｇ〜１００ｍｇである。しかし、前記ペプチドの容量は、投与経路及び治療回数だけでなく、治療が必要な個体の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率など様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定される。よって、これらを考慮すると、当該分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の組成物の特定の用途に沿った適切な有効投与量を決定することができるであろう。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏するものであれば、その剤形、投与経路及び投与方法が特に限定されるものではない。

前述したように、本発明は、新規ペプチド、これを有効成分として含有する血管新生促進用組成物を提供する。本発明のペプチドは、血管新生促進効果に優れ、本発明の薬学的組成物は、ＶＥＧＦに比べてその血管新生促進効果に優れ、分子量がはるかに小さいので血管及び組織内への浸透がＶＥＧＦに比べて容易である。従って、前記ペプチドを含む組成物は、血管新生関連疾患の予防及び／又は治療、皮弁再生、創傷及び熱傷治癒、人工皮膚移植及び移植用人工血管製造に有用である。
[本発明1001]
一般式（Ｉ）又は（II）で表されるアミノ酸配列を有する単離されたペプチド：
（Ｉ）［Ｎ末端−Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6−Ｃ末端］
（II）［Ｃ末端−Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6−Ｎ末端］
ここで、
Ｘ1は不在であるか又はリジンであり、
Ｘ2は不在であるか又はアラニンもしくはグルタミンであり、
Ｘ3はグリシン又はプロリンであり、
Ｘ4は不在であるか又は塩基性アミノ酸であり、
Ｘ5は酸性アミノ酸であり、かつ
Ｘ6はセリンである。
[本発明1002]
一般式（III）で表されるアミノ酸配列を有する血管新生促進用の単離されたペプチド：
（III）［Ｎ末端−Ｘ1Ｘ2Ｘ5Ｘ6−Ｃ末端］
ここで、
Ｘ1はアスパラギンであり、
Ｘ2はグルタミンであり、
Ｘ5は酸性アミノ酸であり、かつ
Ｘ6はセリンである。
[本発明1003]
配列番号1〜4で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列を含むものである、本発明1001の単離されたペプチド。
[本発明1004]
配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むものである、本発明1002の単離されたペプチド。
[本発明1005]
Ｃ末端がアミド化されたペプチドを含むものである、本発明1001又は1002の単離されたペプチド。
[本発明1006]
本発明1001又は1002のペプチドを有効成分として含有する、血管新生促進組成物。
[本発明1007]
皮弁再生、創傷及び熱傷治癒、人工皮膚移植及び移植用血管製造からなる群から選択された血管新生促進のためのものである、本発明1006の組成物。
[本発明1008]
本発明1001又は1002のペプチドを有効成分として含有する、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血（acute posterior ischemia）、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患、及び虚血症からなる群から選択された血管新生関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
[本発明1009]
治療剤又は診断剤の使用のための、本発明1001又は1002の単離されたペプチド。
[本発明1010]
血管新生促進用製剤を製造するための、本発明1001又は1002のペプチドの使用。
[本発明1011]
本発明1001又は1002のペプチドの有効量を血管新生促進が必要な個体に投与して血管新生を促進する方法。
[本発明1012]
糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患、及び虚血症からなる群から選択された血管新生関連疾患の予防又は治療用製剤の製造のための、本発明1001又は1002のペプチドの使用。
[本発明1013]
本発明1001又は1002のペプチドの有効量を血管新生関連疾患の予防又は治療が必要な個体に投与して血管新生関連疾患を予防又は治療する方法であって、前記血管新生関連疾患が、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患、及び虚血症からなる群から選択されたものである、方法。

本発明のペプチドの血管内皮細胞（EC）の増殖促進効果を比較した図である（No：陰性対照群，VEGF：陽性対照群，Pep_7〜10：配列番号1〜4で表される本発明のペプチド）。本発明のペプチドの血管内皮細胞の移動促進効果を比較した図である（No：陰性対照群，VEGF：陽性対照群，Pep_7〜10：配列番号1〜4で表される本発明のペプチド）。本発明のペプチドにより血管内皮細胞の管形成が促進されることを示す写真である（No：陰性対照群，VEGF：陽性対照群，Pep_7〜10：配列番号1〜4で表される本発明のペプチド）。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明の内容を限定するものではない。

実施例１
ペプチドの調製
表１に記載したアミノ酸配列を有するペプチドを自動ペプチド合成機（Milligen 9050, Millipore, 米国）を用いて合成し、Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（Waters Associates, USA）を用いてこれらの合成されたペプチドを純粋単離した。カラムはＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＢＥＨ３００Ｃ１８（2.1×100mm, 1.7um, Waters Co, USA）を用いた。

（表１）調製されたペプチドのアミノ酸配列

実施例２
ＨＵＶＥＣ増殖に対する効果
実施例１で製造したペプチド４種の血管形成に及ぼす影響を調べるために、ヒト血管を構成する細胞であるヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC, Human Umbilical Vein Endothelial Cell）を本発明のペプチドで処理して細胞が増殖するか否かを測定した。

ＨＵＶＥＣは、２％のウシ胎児血清（FBS）を含むＥＢＭ−２（Endothelial Cell Basal Medium-2, Clonetics Co., San Diego, 米国）培地を用いて培養した。培養されたＨＵＶＥＣを９６ウェルプレートに１ウェル当たり１０００個の細胞が注入されるように分注した。２４時間培養し、その後本発明のペプチド４種を各ウェルに添加してさらに４８時間培養した。陽性対照群と陰性対照群として、それぞれ、本発明のペプチドの代わりにＶＥＧＦを処理した細胞と、いかなる処理もしない細胞を、同一条件で培養した。培養終了後にＣｙＱＵＡＮＴｋｉｔ（invitrogen, 米国）を用いて細胞増殖の程度を測定した。

その結果、表２及び図１に示すように、本発明のペプチドは優れたＨＵＶＥＣの増殖促進効果を示した。一部のペプチドは、陽性対照群であるＶＥＧＦより、その効果がはるかに優れていることが確認された。

（表２）細胞増殖促進効果

実施例３
ＨＵＶＥＣ移動（migration）効果
実施例１で製造したペプチド４種の血管形成に及ぼす影響を調べるために、ＨＵＶＥＣが移動するか否かを測定した。

孔（pore）を有するポリカーボネートフィルターを敷いたチャンバーを備えた２４ウェルプレート（Corning Costar, 米国）のチャンバー下部を０．５ｍｇ／ｍｌの１型コラーゲン（collagen type 1）１０ｍｌでコーティングした。チャンバー下部に本発明のペプチド４種を添加したＥＢＭ−２培地を入れ、ＨＵＶＥＣをチャンバー上部に１ウェル当たり細胞１×１０^５個ずつ接種した。３７℃で１０時間培養し、その後ポリカーボネートフィルターの下面に浸透した細胞をメタノールで固定してヘマトキシリンで染色し、顕微鏡でその数を測定した。

表３及び図２に示すように、本発明のペプチドがＨＵＶＥＣの移動を促進した。一部のペプチドの場合、陽性対照群であるＶＥＧＦに比べても、その効果がはるかに優れていることが確認された。

（表３）細胞移動促進効果

実施例４
ＨＵＶＥＣの脈管形成（tube formation）促進効果
ＨＵＶＥＣの脈管形成に対する本発明のペプチドの影響を調べた。

２％のウシ胎児血清（FBS）を含むＥＧＭ−２培地でＨＵＶＥＣを培養し、これをＦＢＳを含まない培地で１２時間無血清培養した。２４ウェルプレートにマトリゲル（BD Biosciences, 米国）を１５０μｌずつ、気泡が生じないように均一に敷いて固めた。１％のＦＢＳを含む培地に本発明のペプチドを混合させて細胞を懸濁し、その後１ウェル当たり細胞１×１０^５個ずつ接種し、３７℃で培養した。１８時間後に顕微鏡でＨＵＶＥＣの脈管（tube）が形成されているか否かを確認した。

その結果、図３に示すように、本発明のペプチドがＨＵＶＥＣの脈管形成を促進することが確認された。

実施例５
血管形成促進効果
本発明のペプチドの血管新生促進能力をインビボマトリゲルプラグアッセイ（in vivo Matrigel plug assay）で調べた。

成長因子が除去されたマトリゲル（growth factor reduced Matrigel, BD Biosciences, 米国）に本発明のペプチドをそれぞれ混合した混合物６００μｌを７週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。陽性対照群として、血管形成を誘導することが知られた血管内皮細胞成長因子であるＶＥＧＦ（R&D systems, 米国）をマウスに注射した。１週間後にマウスを屠殺し、固まったマトリゲルプラグを摘出してプラグ内の血管形成の程度を定量化した。定量は、Ｄｒａｂｋｉｎ'ｓｒｅａｇｅｎｔｋｉｔ（sigma, 米国）を用いて、ヘモグロビン量を測定することにより行った。

その結果、マトリゲルに本発明のペプチドを混合して注射したものは、対照群に比べて血管形成がはるかに優れていることが確認された。

本発明の新規ペプチドは、血管新生促進に非常に優れた効果を有する。本発明のペプチドは、ＶＥＧＦに比べて血管新生促進効果に優れ、分子量がはるかに小さいので血管及び組織内への浸透がＶＥＧＦに比べて容易である。従って、前記ペプチドを含む組成物は、血管新生関連疾患の予防及び／又は治療、皮弁再生、創傷及び熱傷治癒、人工皮膚移植及び移植用人工血管製造に有用である。

Claims

配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたペプチド。
Ｃ末端がアミド化されたペプチドである、請求項１に記載の単離されたペプチド。
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する、血管新生促進組成物。
皮弁再生、創傷及び熱傷治癒、人工皮膚移植又は移植用血管製造のためのものである、請求項３に記載の組成物。
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血（acute posterior ischemia）、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患、及び虚血症からなる群から選択された血管新生関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
治療剤又は診断剤の使用のための、請求項１に記載の単離されたペプチド。
血管新生促進用製剤を製造するための、請求項１に記載のペプチドの使用。
糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性足部潰瘍、肺高血圧、虚血性心筋症、虚血性脳疾患、心不全、急性後肢虚血、褥瘡、慢性潰瘍、脱毛又は白毛症、肥満による心血管疾患、及び虚血症からなる群から選択された血管新生関連疾患の予防又は治療用製剤の製造のための、請求項１に記載のペプチドの使用。
請求項１に記載のペプチドを含む組成物。