CN106046146A - 一种血管生成激动剂多肽及应用 - Google Patents

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沈鸿
肖红
李�瑞
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Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及具有血管生成激动剂多肽，能治疗缺血性疾病的多肽。其特征在于，所述多肽的序列为全新序列，具有促进血管生成的作用。用于缺血性脑卒中。本发明的有益效果在于，本发明的序列为GPR124细胞膜表面受体序列蛋白中筛选出的具有血管生成活性的新型小分子多肽，该多肽序列能特异性与整合素结合，具有调节细胞在血管生成过程中粘附和迁移，从而起到治疗缺血性疾病的作用。具有潜在的新药开发价值。

Description

一种血管生成激动剂多肽及应用
技术领域：
本发明涉及药物领域，具体涉及用于治疗心脑血管疾病的血管生成激动剂多肽药物。
背景技术：
血管生成(Angiogenesis)是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，主要包括：激活期血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管形成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化。血管生成是从先存血管产生新血管的过程，血管生成可发生在伤口愈合、子宫内膜周期性变化、肿瘤、心肌梗塞后和糖尿病。
脑卒中(Stroke)是中枢神经系统(CNS)血管相关疾病，具有高发病率、高致残率的特点。脑卒中分为缺血性脑卒中(ischemic stroke)和出血性脑卒中。缺血性脑卒中，又称为脑梗死，是脑血管病中最常见者，约占75％，病死率平均10％～15％，致残率极高。目前，临床上干预缺血性脑卒中的方法很有限。在急性期时间窗内使用抗凝剂的治疗有效率为5％；神经保护类药物在治疗脑卒中的研发期就惨遭失败。
研究发现，血管生成成可以通过多种途径改善缺血性脑卒中引起的脑损伤。首先，新生血管有利于新的侧支循环形成，改善缺血区周围的组织灌流，促进氧和养分进入组织；其次，生长因子，如纤维细胞的生长因子(FGF2)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和其他神经营养因子等，可促进脑损伤区域中内皮细胞的生存，胶质和神经细胞存活，抑制神经细胞凋亡；再次，新生的血管参与切除受损的组织；最后，促血管新生的微环境可以为神经干细胞重塑和迁移提供“血管小境”。因此，促进血管生成能有效治疗缺血性脑卒中，是缺血性脑卒中早期治疗的重要途径。
G-蛋白偶联受体124(G-protein coupled receptor 124，GPR124)是2003年发现的新型细胞膜表面受体。最初，GPR124被确定作为肿瘤血管内皮标记物(Tumorendothelial marker，TEM)，因此又称为TEM5。GPR124因具有较长的细胞外区域与7个跨膜区域的GPCR蛋白水解域GPS(GPCR proteolytic site)，被确认为黏附类G-蛋白偶联受体。
近几年在体研究发现，GPR124在调节CNS血管生成过程中，起着至关重要的作用。首先，GPR124在CNS内皮细胞和周细胞(Pericyte)特异性表达，这样特点说明GPR124具有CNS血管特异性；再次，GPR124通过调节血管生成发芽和细胞迁移的方式，促进特异性CNS血管形成，说明GPR124不仅具有血管生成的作用，而且对血管生成后期，对成熟血管的形成也有作用；其次，GPR12促进血脑屏障的建立。因此，GPR124是特异性介导CNS血管生成的新型内皮细胞受体，可以成为治疗CNS血管相关疾病的新靶点。
研究发现，GPR124可以作用于血管生成：细胞外基质(ECM)上的蛋白酶，如凝血酶、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)能使可溶性TEM5(sTEM5)从GPR124上脱落下来，与整合素αvβ3特异性结合，调节细胞在血管生成过程中粘附和迁移；内皮细胞分化形成小管，sTEM5从GPR124上脱落下来与整合素αvβ3特异性结合，促进内皮细胞向周细胞的迁移和粘附，形成特异性CNS血管，建立BBB。尽管如此，现阶段没有关于sTEM5直接用于治疗缺血性疾病，包括脑卒中的研究。而且，GPR124上脱落下来的可溶性TEM5(sTEM5)分子量较大，短期接触会诱发免疫变态反应，长期接触则会引起抗体中和现象，从而出现药物抵抗。因此，发明人希望能找到具有sTEM5功能，且分子量小的多肽，促进血管生成。最终，将该小分子用于开发成缺血性脑卒中的药物。
发明内容：
本发明目的是针对设计一种血管生成激动剂多肽，具有促进血管生成作用，可以用于治疗缺血性脑卒中。分子量小，特异性强。
本发明技术方案是提供一种血管生成激动剂多肽，序列为FRWPRKGD，其序列为全新的序列。具有促进血管生成作用，用于缺血性脑卒中治疗。所述的多肽，采用化学合成法制备。
本发明的原理是发明人分析了GPR124细胞膜表面受体的不同功能区；根据不同功能区，从GPR124序列蛋白截取出多条多肽序列，并加以修饰；经过初步筛选出能与功能性整合素受体特异性结合的多肽序列；然后进行血管生成的试验，并确定具有血管生成活性的新型小分子多肽；最后，采用在体动物疾病模型试验，验证本发明多肽促进血管生成和治疗缺血性疾病的药用价值。
有益结果：
本发明的有益效果在于，本发明的序列FRWPRKGD为血管生成激动剂多肽，是从GPR124细胞膜表面受体序列蛋白中筛选出的具有血管生成活性的新型小分子多肽。发明人经过大量实验获知本发明的血管生成激动剂多肽能够特异性与整合素结合，具有调节细胞在血管生成过程中粘附和迁移，从而起到治疗缺血性疾病，包括缺血性脑卒中的作用。具有潜在的新药开发价值。
附图说明
图1血管生成激动剂多肽质谱测定结果。
图2血管生成激动剂多肽的高效液相色谱色谱图。
图3血管生成激动剂多肽分子对接模拟图。(A)分子对接图，其中白色框内为血管生成激动剂多肽；(B)分子对接活性位点图，标出受体分子与血管生成激动剂多肽结合的的氨基酸残基：1.Arg精氨酸；2.Gly甘氨酸；3.Asp天冬氨酸；4.Phe苯丙氨酸；5.Trp色氨酸；6.Pro脯氨酸；7.Lys赖氨酸。
具体实施方式
实施例1
多肽的化学合成方法
多肽采用固相化学合成法合成(由Karebay Biochem公司合成)，采用高效液相色谱仪纯化，得到多肽。采用质谱测定如图1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。用RP-HPLC法测定多肽纯度，结果显示，实施例1得到的多肽度为95.12％，符合设计要求。色谱图如图2。
实施例2
多肽与受体分子对接的结果
采用分子对接软件的分子对接函数模块，评价多肽与受体分子对接的程度。方法：(1)受体准备：从Brookheaven蛋白晶体结构数据库(http：//www.rcsb.org/pdb/)，检索到相应蛋白受体的PDB号；(2)配体准备：分析了GPR124细胞膜表面受体的不同功能区；根据不同功能区，从GPR124序列蛋白截取出SEQ ID NO：1的氨基酸序列，以此为配体结构；(3)分子对接：把C-score选项选中，运行docking，进行函数打分。
评价打分结果显示，实施例1的多肽与特异性受体结合的total-score值为10.2526。符合软件规定的特异性结合要求大于4。因此，实施例1多肽能特异性和靶点受体有特异性结合。对接模拟图如图3所示。
实施例3
采用划痕实验评价多肽对血管内皮细胞迁移的影响。先用marker笔在24孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5cm一道，横穿过孔。每孔穿过3条线；将成对数生长的HUVEC细胞，以2.0×105个/孔加入24孔培养板中，培养24h。第二天用10μl枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，以划痕和背后横线的交叉点为固定观察位点；实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物血管生成激动剂多肽和阳性对照多肽sTEM5；空白组加入相同体积的溶剂，每孔设五个复孔；放入37℃、5％CO2培养箱，培养。按0，12，24小时，拍照；测量0，12，24划痕宽度。以不同的时间点，记录每孔三个固定位置处划痕宽度的变化，即为细胞迁移距离。按照公式计算迁移率(migration rate，MR)：迁移率＝实验第0小时的划痕宽度-实验第n小时的划痕宽度，迁移促进率％＝(实验组的迁移率-空白组的迁移率)×100％/空白组的迁移率。
表1 实施例1多肽对人血管内皮细胞迁移的作用
*p＜0.05，**p＜0.01与空白组相比
结果如表1所示，血管生成激动剂多肽能够促进人血管内皮细胞迁移，以40μg/ml的12h的迁移促进率最高，为63.47％。
实施例4
血管生成激动剂多肽对人血管内皮细胞增殖的作用。采用MTT比色法评价多肽人血管内皮细胞增殖的作用。将对数生长的HUVEC细胞，以8.0×104个/孔加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物血管生成激动剂多肽和阳性对照多肽sTEM5；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h后，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育10min，在酶标仪570nm处测定吸光度A值，按公式肿瘤细胞生长抑制率＝(1-实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。结果显示，血管生成激动剂多肽对HUVEC细胞没有细胞增殖作用，即没有细胞毒性。
实施例5
血管生成激动剂多肽对血管内皮细胞管状结构形成的影响。采用血管内皮细胞小管形成试验评价多肽对血管内皮细胞管状结构形成的影响。将10mg/ml Matrigel基质胶加入96孔板内，每孔40μl，于37℃培养箱中聚合1h。再将对数生长的HUVEC细胞，以4000个/100μl/孔加入培养板中，同时，实验孔、阳性药物对照孔分别加入培养基、不同浓度的实验药物血管生成激动剂多肽和阳性对照药物多肽sTEM5；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设三个复孔，在37℃，无血清培养基培养。分别于药物作用6h、9h、12h在显微镜下观察各组管状结构的形成情况，拍照、记录小管形成的数量。
表2 实施例1多肽对小管形成试验的影响
*p＜0.05，**p＜0.01与空白组相比
结果如表2所示：血管生成激动剂多肽能够促进人血管内皮细胞小管形成，当12h时，剂量为5-40μg/ml，小管形成的数量与空白组相比，明显增加，且有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)。
实施例6
血管生成激动剂多肽对大鼠动脉环血管新生的影响。取6-8W的SD雄性大鼠4只，断颈椎处死，取动脉，放入含高抗PBS液中清洗，用眼科手术剪及镊子去除脉管外纤维和脂肪组织；切取0.5～1mm长的动脉环，用含高抗的PBS液清洗数遍；在预冷的96孔细胞培养板中，每孔加入预先融化的5mg/ml Matrigel基质胶60μl(提前12h将10mg/ml Matrigel放入4℃冰箱中融化，使用前用培养基稀释2倍)，将胸主动脉环平行放入胶中包埋，每孔2个动脉环；37℃聚合15min，使胶凝固；每孔加入用的DMEM培养液(含10％FBS，VEGF 5ng/ml)配制的药液100μl，分别为实验孔、阳性药物对照孔分别加入培养基、不同浓度的实验药物血管生成激动剂多肽和阳性对照药物多肽sTEM5；空白组加入相同体积的溶剂，每个浓度至少3个复孔，隔天更换新鲜培养基并加药；第7、8日倒置显微镜下观察动脉环附近内皮细胞和新生血管的生成情况，记录每个动脉环一圈的微血管样结构数。试验得到的结果计算mean±SD，并进行统计T检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。
表3 实施例1多肽对大鼠动脉环血管生成的影响
*p＜0.05，**p＜0.01与空白组相比
结果如表3所示：实施例1多肽能够促进大鼠动脉环血管生成，在剂量为10μg/ml时作用最强，与空白组相比，具有统计学差异(p＜0.05)。
实施例7
血管生成激动剂多肽对大鼠脑梗塞模型的影响。取8-12W的SD雄性大鼠，建立大鼠脑梗塞模型，观察血管生成激动剂多肽对大鼠脑梗塞模型的影响。大鼠麻醉，取颈部右侧旁切口，分离右侧颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，分离ECA主干，在其远端1.5cm处结扎、切断。不打开颈动脉鞘，不分离和结扎翼腭动脉(PPA)。提拉ECA残端的结扎线，用微型血管夹在CCA分出ECA处，将ECA临时夹闭，在血管夹与ECA残端之间结扎一道缝合线，不打紧。使用0.2-0.3mm尼龙线硅胶线支持导管栓子，由ECA残端附近进线，扎紧缝合线，松开血管夹，推动尼龙线进人ICA，进人距ICA和ECA分叉处。约1.8-1.9cm时，有阻挡感，表明栓线已越过大脑中动脉(MCA)，到达大脑前动脉(ACA)的起始部。记录栓塞开始时间，将ECA上缝合线扎紧。栓塞后2h，将尼龙线拔出。以神经行为学评分为评价脑功能缺损程度指标，描述为：0分-无神经功能缺损症状，大鼠被提尾悬空时两前肢向地面伸直；1分-轻微的神经功能缺损，大鼠被提尾悬空时病灶对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直；2分-中度局灶性神经功能缺损，有向瘫痪侧旋转征象；3分-重度局灶性神经功能缺损，有向病灶对侧跌倒征象；4分-无自发活动及认知水平下降。1-3级为模型制作成功。模型建立后将60只模型大鼠机分为6组，治疗组和对照组。各组均于当天(第一天)尼龙线拔出时给予皮下注射相应药物，随后，2次/d，共10d；治疗组皮下注射实施例1多肽，剂量分别为40、20、10、5mg/Kg，对照组尿激酶，剂量为5000U/Kg。造模后第14d观察神经行为学评分，同时，取脑组织，切片、2％TTC染色、孵育、固定后，拍照并使用Image ProPlus6.0图像分析系统计算脑片梗死面积及脑片面积，按照公式计算脑梗塞面积百分比，脑梗塞面积百分比＝(脑片梗死面积/脑片面积)×100％。
表4 实施例1多肽对大鼠脑梗塞模型的影响
*p＜0.05，**p＜0.01与模型组相比
实施例1多肽对大鼠脑梗塞模型结果如表4显示：与模型组相比，实施例1多肽在剂量在5-40mg/Kg时，能够改善脑梗塞模型大鼠的神经行为学评分，具有统计学差异。另外，实施例1多肽能够显著性减少大鼠脑梗塞面积，与模型组相比，具有统计学差异。
结论：实施例1多肽对大鼠脑梗塞模型脑梗塞模型疗效明显，可作为临床大鼠脑梗塞模型脑梗塞有效的候选治疗方法。

Claims (5)

1.一种血管生成激动剂多肽，其特征在于，所述多肽的序列为SEQ ID NO：1。
2.根据权利要求书1所述的多肽，其特征在于，具有促进血管生成的功能。
3.根据权利要求书1所述的多肽，其特征在于，用于治疗缺血性疾病的作用。
4.根据权利要求书3所述的多肽，其特征在于，所述的缺血性疾病为缺血性脑卒中。
5.根据权利要求书1-4任一所述的多肽，其特征在于，可采用重组表达体或化学合成的方法制备。
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